免疫調節因子としてのＢ７−Ｈ３の使用
【課題】免疫系に関連する障害および状態のための治療方法を提供すること。より詳細には、免疫応答の調節におけるＢ７ファミリーリガンドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストの使用を提供すること。
【解決手段】本発明により、リンパ球の活性化を阻害する方法であって、該方法は、該リンパ球とＢ７−Ｈ３アゴニストとを接触させる工程、および該アゴニストが、該リンパ球の活性化を阻害することを可能にする工程を包含する、方法が提供される。
【解決手段】本発明により、リンパ球の活性化を阻害する方法であって、該方法は、該リンパ球とＢ７−Ｈ３アゴニストとを接触させる工程、および該アゴニストが、該リンパ球の活性化を阻害することを可能にする工程を包含する、方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の説明）
（発明の分野）
本開示は、免疫学および臨床免疫学の分野に関し、より詳細には、免疫応答の調節におけるＢ７ファミリーリガンドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
リンパ球活性化は、そのリンパ球と「補助」細胞（Ｔ細胞活性化の場合には抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＢ細胞活性化のためにはヘルパーＴ細胞）との間のいくつかのシグナル伝達事象を必要とする、複数工程プロセスである。リンパ球活性化が生じるためには、休止しているリンパ球に、２つのタイプのシグナルが伝達されなければならない。一次的なタイプ（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｙｐｅ）（刺激）は、免疫応答に特異性を与え、抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の認識の際に、抗原特異的レセプター（Ｔ細胞上のＴｃＲおよび細胞上のＢｃＲ）により媒介される。第二のタイプ（共刺激性）は、上記応答の大きさを担う。このシグナルは、上記リンパ球の表面に発現される「補助」レセプターを介して媒介される。共刺激の要求は、リンパ球活性化が厳密に調節されることを可能にする。次いで、共刺激は、これらの細胞上の、正の共刺激シグナルを妨げる負のシグナルを送達し得る阻害レセプターによって調節される。
【０００３】
多くの証拠が、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー分子に属する多数の構造的に関連しているリガンドおよびレセプターが、リンパ球活性化プロセスの間に使用されるシグナルと相互作用し、かつその均衡を保っていることを示唆している（非特許文献１）。このような構造的に関連する群の１つとしては、Ｂ７ファミリーのリガンド（Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＢ７−Ｈ３）が挙げられ、これらは、この分子の細胞外部分に存在する１つのＩｇ−Ｖ様（「Ｖ」）ドメインおよび１つのＩｇ−Ｃ様（「Ｃ」）ドメインを有する類似のドメイン構造を共有する（非特許文献２）。Ｂ７タンパク質のエキソン欠失研究および結晶学的研究において、レセプター−リガンド相互作用が、上記Ｖドメインを介して生じ（非特許文献３）、他方、上記Ｃドメインは、上記Ｖドメインのための構造的支持体手段として働くことが証明されている。
【０００４】
Ｂ７−１およびＢ７−２は、正のシグナル（それらの低親和性同種レセプターＣＤ２８を介して）または負のシグナル（高親和性レセプターＣＴＬＡ４を介して）のいずれかを送達し得る。ＩＣＯＳ−ＬとＩＣＯＳレセプターとの相互作用が、正のシグナル伝達をもたらすのに対し、ＰＤ−Ｌ１は、そのレセプターであるＰＤ−１を介して負のシグナルを送達する（非特許文献４）。
【０００５】
本開示は、Ｂ７ファミリーリガンドの最も新しいメンバーであるＢ７−Ｈ３により調節される、免疫応答の調節に関する。ヒトＢ７−Ｈ３は、元々、他のＢ７ファミリーメンバーと２０％〜２７％のアミノ酸同一性を共有し、かつ１つのＶドメインおよび１つのＣドメインを有する、Ｂ７様タンパク質として同定された（非特許文献５）。しかし、部分的なＢ７−Ｈ３ ＥＳＴクローンのより詳細な分析は、哺乳動物種における遺伝子エキソンの変化を証明した（非特許文献６）。特に、霊長類において、Ｂ７−Ｈ３ ｃＤＮＡは、２つの形態で存在する：一方は、ＶドメインおよびＣドメインの単一セット（「ＶＣ形態」）をコードし、そして、他方は、ＶドメインおよびＣドメインの二重セット（「ＶＣＶＣ形態」）をコードする。霊長類のＢ３−Ｈ３とは対照的に、齧歯動物のＢ７−Ｈ３ ｃＤＮＡは、ＶＣとして単一形態でのみ存在する。
【０００６】
Ｂ７−Ｈ３ ＶＣは、最初、ヒト（非特許文献７および特許文献１）およびマウス（非特許文献８）の両方において、共刺激リガンドとして特徴付けられた。特に、ヒトＴ細胞のＢ７−Ｈ３ ＶＣによる共刺激が、Ｔ細胞増殖の促進、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導およびγインターフェロン転写物発現の上昇をもたらすことが報告されている。さらに、細胞ベースのアッセイにおける結合実験は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣが、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳまたはＰＤ−１ではない、活性化Ｔ細胞上に発現されるレセプターに結合することを示唆している。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１６８７６号公報
【非特許文献１】Ｆｒａｕｗｉｒｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００２，１０９：２９５−２９９
【非特許文献２】Ｓｈａｒｐｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，２：１１６−１２６
【非特許文献３】Ｏｓｔｒｏｖら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２９０：８１６−８１９
【非特許文献４】Ｃａｒｒｅｎｏら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，２０：２９−５３
【非特許文献５】Ｃｈａｐｏｖａｌら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，２：２６９−２７４
【非特許文献６】Ｓｕｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，１６８：６２９４−６２９７
【非特許文献７】Ｃｈａｐｏｖａｌら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，２：２６９−２７４
【非特許文献８】Ｓｕｎら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：６２９４−６２９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般的に、免疫系に関連する障害および状態のための治療方法を提供する必要が存在する。免疫応答の適切な調節は、上記Ｂ７−Ｈ３経路の操作により達成され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の目的の１つは、免疫応答の調節のための方法および組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、以下の説明において部分的に述べられ、そして、その説明から部分的に理解されるか、または本発明の実施により学習され得る。
【０００９】
本発明は、部分的に、Ｂ７−Ｈ３のＶＣＶＣ形態が、複数の組織にわたって観察されるＢ７−Ｈ３転写物の大部分を占め、他方、Ｂ７−Ｈ３のＶＣ形態は、少量の転写物でしかないという発見および証明に基づく。本発明は、部分的に、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの両方の形態が、Ｂ７−Ｈ３存在下でのＴ細胞増殖の減少およびこれらの細胞によるサイトカイン分泌の減少により証拠付けられるように、リンパ球活性化に対して阻害効果を示すという発見および証明にさらに基づく。本発明は、部分的に、進化学的選択の純化を現在経験しているＢ７−Ｈ３遺伝子内の特定領域の発見になおさらに基づく。
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
リンパ球の活性化を阻害する方法であって、該方法は、該リンパ球とＢ７−Ｈ３アゴニストとを接触させる工程、および該アゴニストが、該リンパ球の活性化を阻害することを可能にする工程を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アゴニストが、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態である、方法。
（項目３）
項目３に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アゴニストが、配列番号１５を含む、方法。
（項目４）
項目２に記載の方法であって、前記可溶性形態が、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＶドメインを含む、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、前記Ｖドメインが、（ａ）配列番号７、または（ｂ）配列番号７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目６）
項目４に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態が、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＣドメインをさらに含む、方法。
（項目７）
項目４に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態が、抗体のＦｃ領域をさらに含む、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態が、（ａ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２２から選択されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２２から選択される配列のうちの少なくとも１つと実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目９）
項目７に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態が、（ａ）配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号１４から選択されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号１４から選択される配列のうちの少なくとも１つと実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目１０）
項目３に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アゴニストが、一次刺激分子に連結される、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態と前記一次刺激分子とが、１００μｍ以下だけ隔てられている、方法。
（項目１２）
項目１に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストが、配列番号１５のアミノ酸をコードする核酸である、方法。
（項目１３）
リンパ球の活性化を促進する方法であって、該方法は、該リンパ球とＢ７−Ｈ３アンタゴニストとを接触させる工程、および該アンタゴニストが、該リンパ球の活性化を促進することを可能にする工程を包含する、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、前記リンパ球が、ヒトリンパ球である、方法。
（項目１５）
項目１３に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストが、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体またはＢ７−Ｈ３レセプターに対する抗体である、方法。
（項目１６）
項目１３に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストが、アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡである、方法。
（項目１７）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記リンパ球が、Ｔ細胞である、方法。
（項目１８）
項目１７に記載の方法であって、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、方法。
（項目１９）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記リンパ球が、哺乳動物中にある、方法。
（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、前記哺乳動物が、免疫障害、癌もしくは感染症のうちの少なくとも１つに罹患しているかまたはその危険がある、方法。
（項目２１）
項目１９に記載の方法であって、前記哺乳動物が、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を用いて処置される、方法。
【００１０】
１つの局面において、本開示は、インビトロ、インビボおよびエキソビボの免疫応答調節方法（ヒトまたは動物の処置方法を含む）を提供する。いくつかの実施形態において、このような方法は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）とＢ７−Ｈ３因子とを接触させる工程を包含し、ここで、このＢ７−Ｈ３因子は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の誘導体（例えば、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態）；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３に対する抗体；（ｃ）Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体；または（ｄ）Ｂ７−Ｈ３ ｍＲＮＡまたはその相補体の少なくとも一部を含む核酸であり得る。特定の実施形態において、上記Ｂ７−Ｈ３因子は、一次的な（ｐｒｉｍａｒｙ）（刺激、抗原特異的）シグナルに連結される。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明の方法は、このような組成物を用いる処置に対して感受性の免疫障害を処置または予防するために使用される。具体的には、このような障害としては、自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病）、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、過剰増殖性免疫障害、癌、免疫抑制障害、種々の感染性疾患などを含む、免疫学的障害が挙げられるが、これらに限定されない。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、リンパ球活性化の阻害を必要としている被験体を同定する工程、およびアゴニストであるＢ７−Ｈ３因子をその被験体に投与する工程を包含する。他の実施形態において、上記方法は、リンパ球活性化の促進を必要としている被験体を同定する工程、およびアンタゴニストであるＢ７−Ｈ３因子をその被験体に投与する工程を包含する。
【００１２】
本発明の方法において使用される抗体は、２つの群（（１）Ｂ７−Ｈ３に対する抗体および（２）Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体）に分類される。これらの抗体は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合し、それにより、Ｂ７−Ｈ３とそのレセプターとの相互作用を遮断するか；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３レセプターに特異的に結合し、それにより、Ｂ７−Ｈ３とのその相互作用を遮断するか；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を実施し得る。所望される効力に依存して、上記抗体は、免疫応答を促進するかまたは阻害するかのいずれかのために、いずれかの形態で使用され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、天然で発現されるＢ７−Ｈ３の生物学的活性に拮抗するために投与される。
【００１３】
本開示は、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態を含有する組成物を含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、全長より短いＢ７−Ｈ３を含み、そして、Ｂ７−Ｈ３の膜貫通ドメインも細胞内ドメインも含まない。さらなる実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＶドメイン、および必要に応じて、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＣドメインを含む。可溶性形態は、少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのＶドメイン、および必要に応じて、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＣドメインを含み得る。なおさらなる実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列および（ｂ）抗体の定常領域由来の第２のアミノ酸配列を含み得る。上記第１のアミノ酸配列は、Ｂ７−Ｈ３細胞外ドメインの全てまたは部分に由来し、そして、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の天然に存在する形態がそのレセプターへ結合するのを競合的に阻害し、そして／または（ｂ）負の共刺激活性を有する。いくつかの実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、配列番号１５において示されるような配列を含む。特定の実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸２３〜２４４もしくは配列番号１２のアミノ酸２３〜４６２と、同一であるかまたは実質的に同一である。例示的実施形態において、上記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、配列番号１２または配列番号１４におけるような配列を含む。
【００１４】
本開示はまた、このような核酸によりコードされる核酸もしくはポリペプチドの治療的な使用または非治療的な使用を含む方法を提供し、ここで、このような核酸のヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５のヌクレオチド配列またはその部分；および（ｂ）少なくとも６０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長または１４０ヌクレオチド長であり、かつ規定される条件下で、（ａ）の核酸に対してこれらにハイブリダイズする核酸から選択され、ここで、この核酸は、負の共刺激活性を有する発現産物をコードする。特定の実施形態において、このような核酸は、配列番号１５におけるようなアミノ酸配列をコードする。例示的実施形態において、上記核酸は、実質的に配列番号１１または配列番号１３におけるような配列を含む。
【００１５】
本発明の方法はまた、免疫応答を増強するために、Ｂ７−Ｈ３の発現を減少するための短い干渉ＲＮＡおよびアンチセンス核酸の使用を包含する。
【００１６】
本発明はまた、任意の上述の核酸を含むベクターおよび任意のこのようなベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００１７】
上述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が、例示および説明にすぎず、そして、特許請求されている本発明を限定するものではないことが、理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（配列の簡単な説明）
配列番号１および配列番号２は、それぞれ、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣの核酸全長配列およびアミノ酸全長配列を示す。
【００１９】
配列番号３および配列番号４は、それぞれ、マウスＢ７−Ｈ３の核酸全長配列およびアミノ酸全長配列を示す。
【００２０】
配列番号５および配列番号６は、それぞれ、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの核酸全長配列およびアミノ酸全長配列を示す。
【００２１】
配列番号７は、ヒトＢ７−Ｈ３のアミノ酸配列（Ｂ７−Ｈ３ ＶＣまたはＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのアミノ酸２８〜１３９）を示す。
【００２２】
配列番号８は、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのＶ１領域とＶ２領域との間（すなわち、配列番号６のアミノ酸２８〜１３９とアミノ酸２４６〜３５７との間）で保存されたアミノ酸を示す。
【００２３】
配列番号９および配列番号１０は、それぞれ、オンコスタチンＭシグナル配列（配列番号１０のアミノ酸１〜２２）、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣの細胞外ドメイン（配列番号１０のアミノ酸２３〜２４４）およびマウスＩｇＧ２ａｍの定常領域（配列番号１０のアミノ酸２４５〜４８２）を含む融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号１１および配列番号１２は、それぞれ、オンコスタチンＭシグナル配列（配列番号１２のアミノ酸１〜２２）、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの細胞外ドメイン（配列番号１２のアミノ酸２３〜４６２）およびマウスＩｇＧ２ａｍの定常領域（配列番号１２のアミノ酸４６３〜７００）を含む融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号１３および配列番号１４は、それぞれ、オンコスタチンＭシグナル配列（配列番号１４のアミノ酸１〜２２）、マウスＢ７−Ｈ３ ＶＣの細胞外ドメイン（配列番号１４のアミノ酸２３〜２４４）およびマウスＩｇＧ２ａｍの定常領域（配列番号１４のアミノ酸２４５〜４８２）を含む融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号１５は、哺乳動物Ｂ７−Ｈ３のＩｇ Ｖ様ドメインにおける保存されたアミノ酸を示す。
【００２７】
配列番号１６〜２２は、哺乳動物Ｂ７−Ｈ３のＩｇ Ｖ様領域における個々の高度に保存された領域を示す。
【００２８】
配列番号２３〜３５は、実施例に記載されるように、Ｂ７−Ｈ３配列の単離のために用いられたＰＣＲプライマーを示す。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
本発明がより容易に理解されるために、本明細書中で、特定の用語が定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して述べられる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリンまたはその部分をいい、そして、供給源、生成方法および他の特性に関わらず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。上記用語としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノ特異的抗体、ポリ特異的抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体およびＣＤＲ移植化抗体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の部分もしくは全体に特異的に結合するかまたは補完的である領域を含む、抗体分子の部分をいう。抗原が大きい場合、抗体は、その抗原の特定部分に結合するのみであり得る。「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的な相互作用を担う抗原分子の部分である。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインからなるいわゆるＦｄ抗体フラグメント）により提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００３１】
用語「抗Ｂ７−Ｈ３抗体」または「Ｂ７−Ｈ３に対する抗体」とは、少なくとも１つのＢ７−Ｈ３形態の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体をいい、これらの抗体としては、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣが挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗Ｂ７−Ｈ３レセプター抗体」および「Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体」とは、Ｂ７−Ｈ３に対するレセプターの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体をいう。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｂ７−Ｈ３」とは、そうでないと言及されなければ、Ｂ７−Ｈ３の任意および全ての形態をいい、これらとしては、ＶＣおよびＶＣＶＣが挙げられるが、これらに限定されない。用語「Ｂ７−Ｈ３因子」とは、Ｂ７−Ｈ３の生物学的活性を調節可能な任意の化合物をいう。用語「調節」およびその同義語は、Ｂ７−Ｈ３の生物学的活性（例えば、Ｂ７−Ｈ３レセプターを発現するリンパ球に対して、天然に発現されるＢ７−Ｈ３により発揮される効力と関連する活性）の減少または増加をいう。生物学的活性の減少または増加は、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多い。このような減少を引き起こすＢ７−Ｈ３因子は、「アンタゴニスト」と呼ばれ、他方、このような増加を引き起こすＢ７−Ｈ３因子は、「アゴニスト」と呼ばれる。Ｂ７−Ｈ３のアンタゴニストが、Ｂ７−Ｈ３レセプターを発現するリンパ球に対して、天然に発現されるＢ７−Ｈ３により発揮される「負の共刺激シグナル」を妨げるのに対し、アゴニストは、このような「負の共刺激シグナル」を増強することが、理解される。従って、Ｂ７−Ｈ３のアンタゴニストは、一般的に、（例えば、細胞増殖および／またはサイトカイン分泌により測定されるように）リンパ球活性化の上昇を引き起こすのに対し、Ｂ７−Ｈ３のアゴニストは、一般的に、リンパ球活性化の減少を引き起こす。
【００３３】
用語「生物学的活性」とは、生物学的な系において、分子により実現される、機能または一連の機能（またはその機能が寄与する効力）をいい、インビボであってもインビトロであってもよい。生物学的活性は、例えば、リンパ球増殖、生存および機能（例えば、サイトカイン分泌）、細胞膜分化マーカーの発現、転写、翻訳もしくは翻訳後レベルの遺伝子発現に対する効力または自己抗体産生に対する効力などによってアッセイされ得る。
【００３４】
用語「共刺激」およびその同義語は、リンパ球活性化を可能にするための応答リンパ球および「補助」細胞（例えば、Ｔ細胞活性化の場合には抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＢ細胞活性化にはヘルパーＴ細胞）上での細胞表面分子のレセプター／リガンド対の間のシグナル伝達事象をいう。用語「負の共刺激」、「負の共刺激シグナル」、「阻害シグナル」、「負の共刺激活性」およびそれらの同義語は、このようなシグナルの非存在下に対して、リンパ球活性化を阻害するシグナル伝達事象をいう。活性化Ｔ細胞が、ヘルパー細胞（すなわち、ＣＤ４＋）、細胞傷害性またはサプレッサ細胞（すなわち、ＣＤ８＋）であり得ることが理解される。負の共刺激活性は、標準の技術を用いて測定され得、そして、実施例に記載されるように限定されない。特に、ここで開示されるＢ７−Ｈ３因子は、リンパ球活性化を阻害し、（ａ）細胞増殖および／または（ｂ）サイトカイン分泌によって測定され得る。
【００３５】
用語「誘導体」、「誘導される」およびそれらの同義語は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関して使用される場合、元の配列の全てもしくは部分と同一であるかまたは実質的に同一である配列をいい、そして、例えば、アミノ酸またはヌクレオチドの置換、欠失もしくは付加、または他の改変によって、その元の配列から実際に得られ得る。
【００３６】
用語「規定される条件下でのハイブリダイゼーション」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件をいい、その条件下で、互いに対して有意に同一または相同性であるヌクレオチド配列は、互いに結合したままである。上記条件は、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド以上の長さであり、かつ少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも８５〜９０％同一である配列が、互いに結合したままであるようなものである。パーセント同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２に記載されるように決定され得る。低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーおよび高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、後続の節において提供される。
【００３７】
用語「免疫学的障害」とは、免疫応答が異常である障害および状態をいう。上記異常応答は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）の異常な増殖、成熟、生存、分化または機能に起因し得る。このような障害としては、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病）、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、過剰増殖性免疫障害および免疫抑制障害が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本開示は、Ｂ７−Ｈ３因子（例えば、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態またはＢ７−Ｈ３に対する抗体もしくはそのレセプターに対する抗体）を含有する組成物を含む方法を提供する。
【００３８】
用語「単離された」とは、その天然の環境から実質的に離れている分子をいう。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来する細胞供給源由来もしくは組織供給源由来の細胞物質または他のタンパク質から、実質的に離れている。用語「単離された」とはまた、単離されたタンパク質が、薬学的組成物として投与されるために充分に純粋であるか、または少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは、少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは、９０〜９５％純粋；そして、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物をいう。本明細書中で使用される場合、用語「単離された」とはまた、実質的にエンドトキシンを含まない（すなわち、エンドトキシンレベルが、５００、３００、２００、１００、５０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１ＥＵ／ｍｌ未満または検出可能レベル未満である）調製物をいう。
【００３９】
用語「哺乳動物」とは、分類された任意の動物（例えば、ヒトを含む）をいう。
【００４０】
用語「一次刺激シグナル（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌ）」とは、免疫応答に特異性を与えるリンパ球に送達される刺激シグナルをいい、そして抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の認識の際に抗原特異的レセプター（Ｔ細胞上のＴｃＲおよび細胞上のＢｃＲ）により媒介される。
【００４１】
用語「処置」、「治療方法」およびそれらの同義語は、治療処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ／ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置を必要としているものとしては、特定の医学的障害を既に有している個体およびその障害の危険がある個体（すなわち、最終的にはその障害を獲得しそうな個体）が挙げられ得る。治療方法は、症状の予防もしくは改善、またはそうでなければ所望される生物学的結果をもたらし、そして、臨床的な徴候（例えば、実施例に記載されるようなＰＡＳＩ）の改善、疾患の発症の遅延、リンパ球および／または抗体の減少／増大されたレベルなどにより評価され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「治療化合物」および「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」とは、障害の臨床的な発現を改善可能であるかまたは所望される生物学的結果を生成するための、任意の化合物をいう。
【００４３】
用語「治療有効用量」および「治療有効量」とは、患者における症状の予防もしくは改善、または所望される生物学的結果（例えば、臨床的な徴候の改善（例えば、実施例に記載されるようなＰＡＳＩ）、疾患の発症の遅延、リンパ球および／または抗体の減少／増大されたレベルなど）をもたらす化合物の量をいう。上記有効量は、後続の節において記載されるように決定され得る。
【００４４】
用語「特異的に結合する」およびその同義語は、２つの分子が、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、高い親和性および低い容量から中程度までの容量により特徴付けられる。非特異的な結合は、通常、中程度から高い容量とともに低い親和性を有する。代表的に、上記結合は、上記親和性定数Ｋａが、１０６Ｍ−１より高いか、または好ましくは、１０８Ｍ−１より高い場合に特異的であると考えられる。必要な場合、非特異的な結合は、結合条件を変化させることによって、特異的な結合に実質的に影響を与えることなく減少され得る。このような条件は、当該分野で公知であり、そして、慣用的な技術を用いる当業者は、適切な条件を選択し得る。上記条件は、通常、タンパク質濃度、その溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、非関連分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して規定される。
【００４５】
熟語「実質的に同一」とは、関連するアミノ酸配列が、所与の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であることを意味する。例として、このような配列は、種々の種由来の改変体であり得るか、またはそれらは、トランケーション、欠失、アミノ酸の置換もしくは付加による所与の配列から誘導され得る。２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、標準的な配列アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム；Ｍｅｙｅｒｓら（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズム；またはＴａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０など）により決定される。このようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよび「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」プログラムに組み込まれている（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照のこと）。このようなプログラムを利用する場合、デフォルトパラメータが使用され得る。例えば、ヌクレオチド配列に対しては、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」プログラムに対して以下の設定が使用され得る：プログラム ＢＬＡＳＴＮ、マッチに対する獲点（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ） ２、ミスマッチに対するペナルティ（ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ）−２、オープンギャップペナルティ（ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）およびエクステンションギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ） それぞれ、５および２、ギャップｘ＿ドロップオフ（ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ） ５０、予測（ｅｘｐｅｃｔ） １０、文字サイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ） １１、フィルタ（ｆｉｌｔｅｒ） オン。アミノ酸配列に対しては、以下の設定が、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」に対して使用され得る：プログラム ＢＬＡＳＴＰ、マトリックス（ｍａｔｒｉｘ） ＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップペナルティおよびエクステンションギャップペナルティ それぞれ、１１および１、ギャップｘ＿ドロップオフ ５０、予測 １０、文字サイズ ３、フィルタ オン。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をいい、そして、適切な場合は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）をいう。上記用語はまた、ヌクレオチドアナログ、および一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含むことが理解されるべきである。ポリヌクレオチドの例としては、プラスミドＤＮＡまたはそのフラグメント、ウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「プラスミドＤＮＡ」とは、環状である二本鎖ＤＮＡをいう。本明細書中で使用される場合、「アンチセンス」とは、配列相補性に起因してｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域の一部に対してハイブリダイズし、それにより、そのｍＲＮＡからの翻訳を干渉し得る核酸をいう。用語「ｓｉＲＮＡ」および「ＲＮＡｉ」とは、ｍＲＮＡの分解を誘導する能力を有し、それにより、遺伝子発現を「サイレンシングする」、二本鎖ＲＮＡである核酸をいう。代表的に、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長（例えば、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長または３０ヌクレオチド長）である。
【００４７】
用語「Ｖドメイン」（単数または複数）とは、特に述べられなければ、起源の種に関わらず、Ｂ７−Ｈ３のタンパク質またはゲノム配列における第１のＩｇ様定常ドメイン（Ｖ１）および／または第２のＩｇ様ドメイン（Ｖ２）（例えば、配列番号１５を含む任意の配列およびそれをコードするヌクレオチド配列）をいう。同様に、用語「Ｃドメイン」（単数または複数）とは、特に述べられなければ、起源の種に関わらず、Ｂ７−Ｈ３のタンパク質またはゲノム配列における第１のＩｇ様定常ドメイン（Ｃ１）および／または第２のＩｇ様定常ドメイン（Ｃ２）（例えば、配列番号１５を含む任意の配列およびそれをコードするヌクレオチド配列）をいう。文脈がそうではないことを要求しなければ、ＶドメインおよびＣドメインとの言及は、タンパク質ドメイン、それらのための核酸配列およびそのコード配列に対応する偽エキソン（ｐｓｅｕｄｏ−ｅｘｏｎ）配列（例えば、齧歯動物ゲノム配列のＣΨおよびＶΨ）を包含することが理解されるべきである。
【００４８】
（２．Ｂ７−Ｈ３因子）
１つの局面において、本発明は、免疫応答の調節におけるＢ７−Ｈ３因子の使用に関する。本発明は、部分的に、Ｂ７−Ｈ３のＶＣＶＣ形態が、複数の組織にわたって観察されるＢ７−Ｈ３転写物の大部分を占め、他方、Ｂ７−Ｈ３のＶＣ形態は、少量の転写物でしかないという発見および実証に基づく。本発明は、部分的に、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの両方の形態が、Ｂ７−Ｈ３存在下での増殖の減少およびＴ細胞によるサイトカイン分泌の減少により証拠付けられるように、Ｔ細胞活性化に対して阻害効果を示すという発見および実証にさらに基づく。本発明は、部分的に、進化学的選択の純化を現在経験しているＢ７−Ｈ３遺伝子内の特定領域の発見になおさらに基づく。
【００４９】
マウス、ヒト、サルおよびハムスターのゲノムのＶエキソンの一部は、Ａｌｉｇｎ ｍｏｄｕｌｅ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０のＣｌｕｓｔａｌＷを用いて配列決定されている。９ヌクレオチド以上の配列が１００％の配列同一性を示す領域を、最も高度に保存されたヌクレオチド部位として選択した。これらの１１個の保存された領域は、配列番号１５に示される。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明の方法において使用される組成物は、天然に存在するＢ７−Ｈ３の生物学的活性に拮抗するかまたは作用するＢ７−Ｈ３因子を含有する。いくつかの実施形態において、上記Ｂ７−Ｈ３因子は、タンパク質性である（すなわち、上記Ｂ７−Ｈ３因子は、ペプチド結合により結合されたアミノ酸を含む）。タンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子としては、Ｂ７−Ｈ３（Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体およびＢ７−Ｈ３レセプターに対する抗体を含む）の可溶性形態が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、本発明の方法において使用される組成物は、非タンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子（例えば、核酸、低分子インヒビターなど）を含有する。特に、ここで開示されるＢ７−Ｈ３因子は、以下：（ａ）リンパ球増殖：および（ｂ）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））分泌のうちの１つ以上により測定される場合、リンパ球活性化を調節する。いくつかの実施形態において、Ｂ７−Ｈ３因子は、そのＢ７−Ｈ３因子が治療的な使用のために適切であるようにする、薬物動態学的特性（例えば、充分に長い循環半減期および／またはタンパク分解性の分解からの良好な保護）を有する。
【００５１】
（２．１ 抗体）
本発明の方法において使用される抗体は、２つの群（（１）Ｂ７−Ｈ３に対する抗体および（２）Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体）に分類される。種々の実施形態において、本発明の方法において使用される抗体は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３レセプター；（ｃ）Ｂ７−Ｈ３中のＶドメイン；（ｄ）Ｂ７−Ｈ３中のＣドメイン；および（ｅ）配列番号１５、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号７を含むポリペプチドのうちの少なくとも１つに、特異的に結合する。このような抗体は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合し、それにより、Ｂ７−Ｈ３とそのレセプターとの相互作用を遮断するか；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３レセプターに特異的に結合し、それにより、Ｂ７−Ｈ３とのその相互作用を遮断するか；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を実施し得る。所望される効力に依存して、上記抗体は、後続の節に記載されるように、免疫応答を（Ｂ７−Ｈ３生物学的活性のアンタゴニストとして）促進するかまたは（Ｂ７−Ｈ３生物学的活性のアゴニストとして）阻害するかのいずれかのために、いずれかの形態で使用され得る。
【００５２】
抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）または抗体ライブラリを用いるファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２；５８１−５９７）によって作製され得る。種々の他の抗体生成技術については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；およびＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編，１９９５を参照のこと。ヒトへの投与のために、抗体は、完全にヒトまたはヒト化であり得る。特定の実施形態において、抗体は、後続の節において記載されるように、変化または改変されたＦｃ領域を有し得る。
【００５３】
（２．２ Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態）
本発明の方法は、リンパ球活性化を阻害するＢ７−Ｈ３の可溶性形態の使用を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、全長より短いＢ７−Ｈ３を含み、かつＢ７−Ｈ３の膜貫通ドメインも細胞内ドメインも含まない。このような可溶性形態はまた、シグナル配列も含まなくてもよい。例示のためのみに、かつ限定することなく、図１Ａに示されるように、ヒトおよびマウスのＢ７−Ｈ３におけるこれらのドメインが示され得る。
【００５４】
特定の実施形態において、可溶性形態は、配列番号１５または配列番号７のようなアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＶドメイン、そして、必要に応じて、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＣドメインを含む。可溶性形態は、少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのＶドメイン、および必要に応じて、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＣドメインを含み得る。
【００５５】
さらなる実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列および（ｂ）抗体の定常領域由来の第２のアミノ酸配列を含み得る。上記第１のアミノ酸配列は、Ｂ７−Ｈ３細胞外ドメインの全てまたは部分に由来し、そして、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の天然に存在する形態がそのレセプターへ結合するのを競合的に阻害し、そして／または（ｂ）負の共刺激活性を有する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、配列番号１５において示されるような配列を含む。特定の実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸２３〜２４４もしくは配列番号１２のアミノ酸２３〜４６２と、同一であるかまたは実質的に同一である。例示的実施形態において、上記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、配列番号１２または配列番号１４におけるような配列を含む。
【００５７】
上記第２のアミノ酸配列は、抗体の定常領域（例えば、Ｆｃ領域）に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記第２のアミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ領域に由来する。関連する実施形態において、上記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または別のＩｇＧアイソタイプであるＩｇＧに由来する。非限定的実施形態において、上記第２の配列は、マウスＩｇＧ２ａｍに由来する。
【００５８】
特定の実施形態において、上記第２のアミノ酸配列は、リンカー配列によって結合されるかまたは結合されずに、上記第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合する。上記リンカー配列の正確な長さおよび配列、ならびに結合される配列に対するその配向は、変化し得る。上記リンカーは、例えば、１つ以上のＧｌｙ−Ｓｅｒを含み得る。上記リンカーは、少なくとも２アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長であり得、そして、所望される特性（例えば、溶解度、長さ、立体化学的分離、免疫原性など）に基づいて選択される。
【００５９】
（２．３ タンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子の誘導体）
タンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子（Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体およびＢ７−Ｈ３レセプターに対する抗体を含む）の誘導体は、置換、付加および／もしくは欠失／トランケーションによりそれらのアミノ酸配列を変化させるか、または機能的な等価体もしくは分子をもたらす化学的な改変を導入することによって、作製され得る。任意のタンパク質の配列における特定のアミノ酸が、そのタンパク質の活性に有害に作用することなく、他のアミノ酸に置換され得ることが、当業者により理解される。
【００６０】
それらの生物学的活性、機能または有用性を認識可能なほどに損うことなく、本発明のタンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子のアミノ酸配列またはそれらをコードするＤＮＡ配列において、種々の変化が作製され得る。このような誘導体の使用は、本発明の範囲内である。具体的な実施形態において、上記誘導体は、機能的に活性である（すなわち、（例えば、配列番号２、配列番号４または配列番号６に示されるような）天然に存在するＢ７−Ｈ３の細胞外ドメインに関連する、１つ以上の活性を示し得る）。上記配列内でのアミノ酸の代わりは、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る（表１を参照のこと）。さらに、種々のアミノ酸が、一般的に、中性アミノ酸（例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン）に置換される（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎら（１９９８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４を参照のこと）。
【００６１】
【表１】
【００６２】
Ｂ７−Ｈ３因子は、他のタンパク質および薬学的因子に、化学的に接続されるかまたは結合され得る。このような改変は、結果としてもたらされる組成物の薬物動態および／または生体分布を変化させるために設計され得る。本発明のＢ７−Ｈ３−Ｉｇおよび抗体はまた、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に述べられるような様式で、グリコシル化され得るか、ＰＥＧ化され得るかまたは別の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）に連結され得る。上記Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇおよび抗体は、ポリマーへの共有結合により化学的に改変されて、例えば、それらの循環半減期を上昇させ得る。例示的なポリマーおよびそれらをペプチドに結合するための方法はまた、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号に示される。
【００６３】
抗体のＦｃ部分を含むＢ７−Ｈ３因子（例えば、Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体）または本発明の方法において使用される抗体は、そのＦｃ領域中でさらに改変されて、エフェクター機能を最小限に抑え得る。このような改変としては、Ｆｃレセプターへの結合を変化させる特定のアミノ酸残基の変化（Ｌｕｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６：３１９−３２４）、またはその定常領域が由来する種の変化が挙げられる。抗体およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体は、重鎖のＣＨ２領域中にエフェクター機能（すなわち、Ｆｃレセプター結合および補体活性化）を低下させる変異を有し得る。例えば、抗体およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体は、変異（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号に記載される変異）を有し得る。上記ＩｇＧ１重鎖またはＩｇＧ２重鎖において、例えば、このような変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長配列中のアミノ酸２３４およびアミノ酸２３７に対応するアミノ酸残基で行われ得る。抗体およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体はまた、免疫グロブリンの２つの重鎖の間のジスルフィド結合を安定化する変異（例えば、Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１０５−１０８に開示されるような、ＩｇＧ４のヒンジ領域の変異）を有し得る。
【００６４】
特定の実施形態において、他のタンパク質由来のアミノ酸配列に対する本発明のＢ７−Ｈ３−Ｉｇのうちのいずれかのさらなる融合が、本発明の方法における使用のために構築され得る。所望され得る融合配列は、Ｂ７−Ｈ３の生物学的活性とは異なる生物学的活性を有するタンパク質（例えば、サイトカイン、増殖因子および分化因子、酵素、ホルモン、他のレセプター成分など）に由来し得る。
【００６５】
上記Ｂ７−Ｈ３因子（タンパク質性および非タンパク質性）はまた、検出可能標識または機能的標識を用いてタグ化され得る。検出可能標識としては、放射標識（例えば、１３１Ｉまたは９９Ｔｃ）が挙げられ、これらの放射標識は、従来の化学を用いて結合され得る。検出可能標識としては、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）および検出可能部分（例えば、ビオチンまたはアビジン）がさらに挙げられる。
【００６６】
誘導体は、当該分野において周知の種々の技術（組み換え法および合成法を含む）により生成され得る（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＢｏｄａｎｓｋｙら（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００６７】
（２．４ 核酸）
本開示はまた、核酸またはこのような核酸によりコードされるポリペプチドの治療的な使用および非治療的な使用を含む方法を提供し、ここで、このような核酸のヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５のヌクレオチド配列またはその部分；および（ｂ）少なくとも６０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長または１４０ヌクレオチド長であり、かつ規定される条件下で、（ａ）の核酸に対してこれらにハイブリダイズする核酸から選択され、ここで、この核酸は、負の共刺激活性を有する発現産物をコードする。
【００６８】
特定の実施形態において、このような核酸は、配列番号１５におけるようなアミノ酸配列をコードする。例示的な実施形態において、上記核酸は、実質的に、配列番号１１または配列番号１３におけるような配列を含む。他の実施形態において、このような核酸としては、それが、少なくとも１つの同義置換を有する（すなわち、その置換を有するコドンは、配列番号１１または配列番号１３におけるのと同じであるかまたは機能的に等価なアミノ酸残基をコードする）という点で、配列番号１１または配列番号１３とは異なるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００６９】
１つの実施形態において、規定される条件は、低いストリンジェンシーの条件である。別の実施形態において、規定される条件は、中程度のストリンジェンシーの条件である。さらに別の実施形態において、規定される条件は、高いストリンジェンシーの条件である。
【００７０】
適切なハイブリダイゼーション条件が、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２節，４節および６節において例示されるように、当業者により容易に選択され得る。さらに、ストリンジェント条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，７章，９章および１１章に記載される。規定される低いストリンジェンシーの条件の非限定的例は、以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルタを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、６時間、４０℃で前処理する。ハイブリダイゼーションを、以下の改変を有する同じ溶液中で実施する：０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ） デキストラン硫酸および５×１０６〜２０×１０６ ３２Ｐ標識されたプローブを使用する。フィルタを、ハイブリダイゼーション混合物中で、１８時間〜２０時間、４０℃でインキュベートし、そして、次いで、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中で、１．５時間、５５℃で洗浄する。この洗浄溶液を、新鮮な溶液に置き換え、そして、さらに１．５時間、６０℃でインキュベートする。フィルタを、ブロット乾燥し、そして、オートラジオグラフィーに曝す。当該分野で周知の低いストリンジェンシーの他の条件が、（例えば、種間（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーションのために用いられるように）使用され得る。
【００７１】
規定される中程度のストリンジェンシーの条件の非限定的例は、以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で、７時間から一晩、５０℃で実施する。フィルタを、１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび５×１０６〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識されたプローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で、１８時間〜３６時間、５０℃でハイブリダイズする。フィルタの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶＰ、０．０１％ Ｆｉｃｏｌｌおよび０．０１％ ＢＳＡを含有する溶液中で、３７℃で１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ中で、５０℃で４５分間洗浄する。当該分野において周知の中程度のストリンジェンシーの他の条件が、使用され得る。
【００７２】
規定される高いストリンジェンシーの条件の非限定的例は、以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で、８時間から一晩、６５℃で実施する。フィルタを、１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび５×１０６〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識されたプローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で、４８時間、６５℃でハイブリダイズする。フィルタの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶＰ、０．０１％ Ｆｉｃｏｌｌおよび０．０１％ ＢＳＡを含有する溶液中で、３７℃で１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ中で、５０℃で４５分間洗浄する。当該分野において周知の高いストリンジェンシーの他の条件が、使用され得る。
【００７３】
Ｂ７−Ｈ３因子は、実質的に純粋な形態または均質な形態で、あるいは、核酸の場合には、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子起源を含まずにまたは実質的に含まずに、それらの天然の環境から得られ得、単離され得、そして／または精製され得る。種々の異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニング系および発現系は、周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、ならびに酵母系およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当該分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞などが挙げられる。一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。例えば、Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇを生成するために適切な他の細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。
【００７４】
適切なベクターが、選択されても構築されてもよく、これらのベクターは、必要に応じて、適切な調節配列（プロモーター配列、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む）を含む。ベクターは、必要に応じて、プラスミドまたはウイルス性（例えば、ファージ）であってもファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの公知の技術およびプロトコールが、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００７５】
核酸は、さらなるポリペプチド配列をコードする他の配列（例えば、マーカーまたはレポーターとして機能する配列）に融合され得る。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の例としては、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性を担う）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコードする）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）および当該分野で公知の他の多くが挙げられる。
【００７６】
本発明の方法はまた、免疫応答を増強するために、Ｂ７−Ｈ３の発現を減少させるための短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を包含する。ｓｉＲＮＡは、Ｈａｎｎｏｎ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４−２５１；ＭｃＭａｎｕｓら（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，３：７３７−７４７；Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４；Ｓｔｅｉｎ（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０８：６４１−６４４；およびＺａｍｏｒｅ（２００１）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，８（９）：７４６−７５０に記載されるような標準的な技術を用いて生成され得る。アンチセンス核酸は、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第１版，Ｃｒｏｏｋｅ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，２００１に記載されるような標準的な技術を用いて生成され得る。
【００７７】
（３．使用方法）
（３．１ 免疫応答の調節方法）
開示されるＢ７−Ｈ３因子は、それらの使用方法に依存して、天然に発現されるＢ７−Ｈ３のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得る。上記Ｂ７−Ｈ３因子は、哺乳動物における（例えば、ヒトにおける）医学的障害を予防、診断または処置するために使用され得る。Ｂ７−Ｈ３因子のインビトロ適用は、例えば、免疫細胞の機能に対する研究、または、例えば、他のＢ７−Ｈ３因子の生物学的活性を試験するための研究のいずれかにおける使用のための活性化リンパ球の調製において、有用であり得る。このような方法は、実施例に詳述されている。
【００７８】
１つの局面において、本発明は、免疫応答の調節におけるＢ７−Ｈ３およびそのアゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。本発明の方法は、リンパ球活性化を調節（すなわち、共刺激または阻害）するために、リンパ球（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）とＢ７−Ｈ３因子とを接触させる工程を包含する。特に、ここで開示されるＢ７−Ｈ３因子は、以下：（ａ）リンパ球増殖；（ｂ）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））分泌のうちの１つ以上により測定される場合、リンパ球活性化を調節する。上記方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボで実施され得る。
【００７９】
上記接触させる工程は、上記リンパ球の活性化前、活性化の間または活性化後に生じ得る。Ｔ細胞活性化は、例えば、（例えば、抗ＣＤ３抗体を用いて；米国特許第６，４０５，６９６号および同第５，３１６，７６３号）そのＴ細胞を、ＴｃＲに結合する抗体またはＴＣＲに物理的に関連するＣＤ３複合体のポリぺプチドのうちの１つに曝すことによって、生じられ得る。あるいは、上記Ｔ細胞は、同種抗原（例えば、ＭＨＣ同種抗原）（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球またはＢ細胞）上で）または抗原性ペプチドのいずれかに曝され得、この抗原性ペプチドは、上記ＡＰＣのいずれかによるタンパク質抗原のプロセシングにより生成され、かつそのＡＰＣの表面上のＭＨＣ分子によって、上記Ｔ細胞に対して提示される。上記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であってもＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。上記Ｂ７−Ｈ３因子は、上記細胞を含む溶液に添加され得るか、または、それは、ＡＰＣ（例えば、ＭＨＣ分子に結合される同種抗原または抗原ペプチドを提示するＡＰＣ）の表面に発現され得る。
【００８０】
さらに、Ｂ７−Ｈ３因子は、障害の危険があるかもしくは障害に対して感受性である被験体、または異常なＢ７−Ｈ３の発現もしくは機能に関連する障害を有する被験体を処置するために使用され得る。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、リンパ球活性化の阻害を必要としている被験体を同定する工程、およびその被験体にＢ７−Ｈ３アゴニストを投与する工程を包含する。他の実施形態において、上記方法は、リンパ球活性化の促進を必要としている被験体を同定する工程、およびその被験体にＢ７−Ｈ３アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００８１】
免疫応答の減少が所望される場合、Ｂ７−Ｈ３因子は、Ｂ７−Ｈ３に関連する免疫応答の減少を促進するために、Ｂ７−Ｈ３のアゴニストとして使用され得る。例えば、Ｂ７−Ｈ３因子は、特定の抗原（例えば、治療用タンパク質）に対する耐性の誘導のために、本発明の方法において使用され得る。１つの実施形態において、抗原とＢ７−Ｈ３因子との同時投与により、特定の抗原に対して耐性が誘導される。例えば、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を受容した患者は、しばしば、このタンパク質に対する抗体を生成し、従って、組み換え第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子と組み合わせた、Ｂ７−Ｈ３アゴニスト（例えば、Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇ、およびＢ７−Ｈ３をコードする核酸またはその機能性フラグメント）の同時投与は、この凝固因子に対する免疫応答のダウンレギュレーションをもたらすと予測される。さらに、例えば、あるタイプのアレルギーまたはアレルギー反応、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病および全身性エリテマトーデス）、組織移植片、皮膚移植片および器官移植片の拒絶反応ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）において、免疫応答レベルの減少が所望され得る。
【００８２】
特定の実施形態において、アゴニスト効果を達成するために、正のシグナル（すなわち、抗原レセプター（例えば、ＴｃＲまたはＢｃＲ）により媒介される）と負のシグナル（すなわち、Ｂ７−Ｈ３）との間の同時提示（ｃｏ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）または結合（すなわち、物理的に近接している）が必要であり得る。これは、支持マトリック上へのＢ７−Ｈ３因子の固定化により達成され得、この支持マトリックスはまた、一次刺激分子（例えば、抗ＣＤ３抗体）を運ぶ。このような場合、好ましい距離は、天然に存在する抗原提示細胞の大きさよりも小さいか、またはそれと匹敵する大きさである（すなわち、１００μｍ未満；より好ましくは、５０μｍ未満；そして最も好ましくは、２０μｍ未満）。あるいは、Ｂ７−Ｈ３因子は、例えば、抗体を介した架橋により、一次刺激分子に結合され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、上記正の（活性化）シグナルおよび上記負の（阻害）シグナルは、固体支持マトリックスまたはキャリアに固定されたリガンドまたは抗体により提供される。種々の実施形態において、上記固体支持マトリックスは、ポリマー（例えば、活性化されたアガロース、デキストラン、セルロース、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ））からなり得る。あるいは、上記固体支持マトリックスは、ケイ素ポリマーまたはプラスチックポリマー（例えば、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン（登録商標）など）に基づき得る。
【００８４】
上記マトリックスは、患者の脾臓に移植され得る。あるいは、上記マトリックスは、患者から得られたＴ細胞のエキソビボインキュベーションのために使用され得、次いで、このＴ細胞は、分離されてその患者に移植して戻される。上記マトリックスはまた、生分解性物質（例えば、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、コラーゲンまたはゼラチン）から作製され得、その結果、それらのマトリックスは、患者の腹膜腔に注射され、そして、注射の後しばらくして溶解する。上記キャリアは、細胞を模倣するように形づくられ得る（例えば、ビーズまたはミクロスフェア）。
【００８５】
特定の環境下では、免疫障害または癌を処置するために、患者の免疫応答を誘発または促進することが所望され得る。上記障害は、本開示方法により処置または予防され、これらの障害としては、微生物（例えば、細菌）、ウイルス（例えば、インフルエンザのような全身性のウイルス感染、ヘルペスまたは帯状ヘルペスのような皮膚疾患、およびＨＩＶ）または寄生生物による感染；ならびに癌（例えば、黒色腫および前立腺癌）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
このような環境において、Ｂ７−Ｈ３因子は、Ｂ７−Ｈ３と関連するダウンレギュレート活性を阻害または減少するために使用され得る。特に、Ｂ７−Ｈ３アンタゴニスト（例えば、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体、ｓｉＲＮＡおよびＢ７−Ｈ３に対するアンチセンス核酸）は、Ｔ細胞活性化の刺激のために使用され得る。種々の実施形態において、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体またはＢ７−Ｈ３レセプターに対する抗体は、１０ｎＭ未満、そしてより好ましくは、５ｎＭ未満、そして最も好ましくは、１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する、Ｂ７−Ｈ３とこのようなレセプターを発現する細胞との結合を阻害する。ＩＣ５０は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定され得る。
【００８７】
本発明の組成物は、治療有効量で投与される。一般的に、治療有効量は、被験体の年齢、状態および性別、ならびにその被験体の医学的状態の重症度とともに、変動し得る。治療有効量のタンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子は、０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。必要な場合、投与量は、その処置の観察される効力に適合するために調節され得る。上記抗体およびＢ７−Ｈ３の可溶性形態は、ボーラス投与として与えられ得る。連続的な輸液もまた、ボーラス投与後に使用され得る。適切な用量およびレジメンが、処置する医師により臨床的な指標に基づいて選択される。
【００８８】
免疫細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）はまた、患者から単離され得、そして、Ｂ７−Ｈ３因子とともにエキソビボでインキュベートされ得る。例えば、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は、被験体または適切なドナーから取り出され得、そして、エキソビボで活性化刺激（上を参照のこと）およびＢ７−Ｈ３因子（可溶性形態であるか固体支持体に結合されているかのいずれか）に曝され得る。次いで、活性化Ｔ細胞を含むＰＢＭＣが、同じ被験体または異なる被験体に導入される。あるいは、単離された細胞は、核酸を用いてトランスフェクトされ得、そして、次いで、このようなトランスフェクトされた細胞は、上記被験体に再導入され得る。このような細胞は、好ましくは、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞）であるが、それらの細胞はまた、別の細胞型であり得、これらの細胞型としては、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイトが挙げられるが、これらに限定されない。造血細胞の使用は、このような細胞が、特に、リンパ系組織（例えば、リンパ節または脾臓）に帰ると予測されているという点で、有利であり得る。さらに、ＡＰＣが使用される場合、外因性Ｂ７−Ｈ３を発現するＡＰＣは、関連するＴ細胞に対して同種抗原または抗原性ペプチドを提示するＡＰＣと同じであり得る。上記Ｂ７−Ｈ３因子は、上記ＡＰＣにより分泌され得るか、またはその表面上に発現され得る。組み換えＡＰＣは、上記被験体に戻される前に、必要に応じて、本発明の抗原または抗原性ペプチドの供給源（例えば、腫瘍、感染性微生物または自己抗原の供給源）に曝され得る。
【００８９】
いくつかの実施形態において、Ｂ７−Ｈ３因子は、本発明の組成物を用いる処置に対して感受性の免疫障害を処置または予防するために使用され、このような障害としては、自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、過剰増殖性免疫障害など）、癌、免疫抑制障害および種々の感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本開示は、Ｂ７−Ｈ３誘導体（例えば、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態またはＢ７−Ｈ３に対する抗体またはそのレセプターに対する抗体）を含有する組成物に関与する方法を提供する。
【００９０】
（３．２ スクリーニング方法）
Ｂ７−Ｈ３因子はまた、治療薬剤を同定するスクリーニング方法に使用され得る。試験される化合物は、例えば、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体または、小有機分子であり得る。そのようなスクリーニングアッセイにおいて、第１の結合混合物は、Ｂ７−Ｈ３−ＩｇとＢ７−Ｈ３レセプターを発現する細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）とを、組み合わせることにより形成される；および第１結合混合物（Ｍ０）の上記２種の間の結合量が測定される。第２結合混合物もまた、Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇと、Ｂ７−Ｈ３レセプターを発現する細胞と試験される薬剤とを組み合わせることにより形成され、そして第２結合混合物（Ｍ１）の結合量が測定される。
【００９１】
第１結合混合物および第２結合混合物の結合量は、例えば、Ｍ１／Ｍ２比を計算することにより比較される。上記試験された化合物は、第１結合混合物と比較して第２結合混合物の結合の減少が観察される場合、免疫応答のＢ７−Ｈ３関連のダウンレギュレーションを調節する能力があると考えられる。結合混合物の処方および最適化は、当該分野の技術レベルの範囲内であり、そのような結合混合物はまた、最適結合を高めるかまたは最適化するのに必要な緩衝液および塩も含み得、そしてさらなるコントロールアッセイが、本発明のスクリーニングアッセイに包含され得る。上記Ｂ７−Ｈ３結合を少なくとも１０％（即ち、Ｍ１／Ｍ２＜０．９）、好ましくは３０％を超えて減少させることがわかっている化合物は、このように同定され得、その後、所望であれば、以下に記載するように他のアッセイまたは動物モデルで障害を改善させる能力に関し、２次的にスクリーニングされ得る。上記結合の強度は、例えば、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、表面プラズモン−ベースの技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）（それらの全ては当該分野で周知の技術である）を用いて測定され得る。
【００９２】
上記試験された化合物は、実施例に記載しているようにインビトロで、または動物モデル（一般的に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｇｅｒｓｈｗｉｎら編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９８１を参照のこと）、例えば、以下のような：ＳＷＲ Ｘ ＮＺＢ（ＳＮＦ１）マウスモデル（Ｕｎｅｒら(１９９８)Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ．Ｄｉｓ．，１１（３）：２３３〜２４０）、ＫＲＮマウス（Ｋ／ＢｘＮ)モデル（Ｊｉら、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、１６９：１３９）；ＮＺＢ Ｘ ＮＺＷ（Ｂ／Ｗ）マウス、ＳＬＥのモデル（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、４４（１０）：２４３５〜２４４５）；マウス実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症のモデル（Ｔｕｏｈｙら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１：１１２６〜１１３０、Ｓｏｂｅｌら（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：２３９３〜２４０１およびＴｒａｕｇｏｔｔ（１９８９）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１９：１１４〜１２９）；ＮＯＤマウス糖尿病モデル（Ｂａｘｔｅｒら、（１９９１）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、９（１）：６１〜６７）など）でさらに試験され得る。
【００９３】
例えば、動物試験により決定された予備的用量およびヒトへの投薬量の倍率決定は、当該分野で受容されている慣例に従って達成される。毒性および治療効力は細胞培養または実験動物、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的効果のある用量）を決定する、標準的な薬学的な手続により決定され得る。毒性と治療効果間の用量の比は治療指標であり、そしてそれは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。大きな治療指標を示す組成物は好ましい。
【００９４】
上記治療的に有効な用量は、初期に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養アッセイまたは動物モデルで決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大半減阻害を達成する治療剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルで処方され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーまたはＥＬＩＳＡにより、測定され得る。任意の特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイによりモニターされ得る。投薬量の例としては、０．１×ＩＣ５０、０．５×ＩＣ５０、１×ＩＣ５０、５×ＩＣ５０、１０×ＩＣ５０、５０×ＩＣ５０および１００×ＩＣ５０である。
【００９５】
上記細胞培養アッセイまたは動物研究から得られるデータは、ヒトの用途の範囲の投薬量を処方するのに使用され得る。１種の動物モデルで達成された治療的に有効な投薬量は、ヒトを含む別の種の動物に使用されるのに、当該分野で公知の変換因子を用いて、変換され得る（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、５０（４）：２１９〜２４４および等価体表面積投薬因子の表２を参照のこと）。
【００９６】
【表２】
【００９７】
（４．薬学的組成物、投与方法および投薬量）
本開示は、Ｂ７−Ｈ３因子を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的な用途および患者への投与に適切であり得る。上記組成物は、典型的には１種以上の本発明の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。上記成句「薬学的に受容可能な賦形剤」は、薬学的投与に適合する如何なるおよび全ての溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。上記組成物はまた、補完的な、付加的なまたは高められた治療的機能を提供する他の活性化合物を含み得る。上記薬学的組成物はまた、投与に関する説明書を有する容器、包装または分配器に含まれ得る。
【００９８】
本発明の薬学的組成物は、意図された投与経路に適合するように処方される。投与を達成する方法は、当業者に公知である。上記投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、膣内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、皮下または経皮であり得る。また、局所的もしくは経口的に投与されるか、または、粘膜を経由して透過することができる組成物を得ることができる。
【００９９】
皮内もしくは皮下適用に用いられる溶液剤もしくは懸濁剤としては、典型的には１種以上の以下の成分：注射用の水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶剤のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗細菌剤；アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸、クエン酸もしくはリン酸のような緩衝液；および塩化ナトリウムもしくはブドウ糖のような張度を調整する薬剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸または苛性ソーダなどの酸または塩基で調整され得る。そのような調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器もしくは多用量のバイアルビンに封入され得る。
【０１００】
注射に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液もしくは滅菌分散剤、および滅菌注射可能な溶液もしくは分散液の即時調合調製物のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水もしくはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合、上記組成物は、滅菌され、容易に注射可能な程度に流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきで、細菌および真菌のような微生物の汚染作用が起こらないよう保存されなければいけない。微生物の上記作用の予防は、種々の抗細菌剤または抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールおよび塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましい。上記キャリアとしては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散剤およびそれらの適切な混合物であり得る。上記適切な流体は、例えばレシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合は必要とされる粒子サイズの維持のより、および／または界面活性剤の使用により、維持され得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延する薬剤を組成物の中に含むことにより達成され得る。
【０１０１】
経口組成物は、一般に不活性な希釈剤または可食性のキャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入され得、または錠剤に打錠され得る。経口投与のために、上記抗体は賦形剤と併用され得るし、かつ錠剤、トローチ剤またはカプセル剤としても使用され得る。薬学的に適合する結合剤および／または薬学的に適合するアジュバント物質は、上記組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、類似する性質の以下の如何なる成分または化合物；微結晶性セルロース、ガム、トラガカントもしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料のような矯味矯臭薬をも、含み得る。
【０１０２】
全身投与はまた、経粘膜または経皮的手段であり得る。経粘膜または経皮投与のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤が、処方物に用いられる。そのような浸透剤は、一般に、当該分野で公知であり、例えば表面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えばロゼンジ、鼻スプレー、吸入器または坐薬の使用を通じて達成され得る。例えば、抗体およびＦｃ部分を含むＩｇ融合タンパク質の場合、組成物は、腸管、口もしくは肺の粘膜を通って透過することができ得る（例えば、米国特許番号第６，０３０．６１３号に記載されているようにＦｃＲｎレセプター媒介経路を経由して）。経皮投与のために、上記活性化合物は、当該分野で一般に公知のように、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤またはクリーム剤に処方され得る。吸入による投与のために、上記抗体は、例えば二酸化炭素のような適切な噴霧剤を含有する加圧容器もしくは加圧ディスペンサーからのエアゾールスプレーまたはネブライザーの形態で送達され得る。
【０１０３】
特定の実施形態では、本明細書で開示されたＢ７−Ｈ３薬剤は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、徐放処方物のような、身体からの早い消失に対する化合物を保護するキャリアを用いて調製される。エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生物適合性ポリマーは、使用され得る。そのような処方物の調製方法は、当業者には明らかである。本明細書で開示する抗体を含有するリポソーム懸濁剤もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許番号４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１０４】
投与の容易なおよび投薬量の均一な投薬単位形態での経口または非経口組成物を処方することは、有利であり得る。本明細書で用いられる用語「投薬単位形態」は、処置される被験体に対して単位投薬量として適切な、物理的な個々の単位をいう；各単位は、所望の治療効果を実現するために計算された所定量の活性化合物を、必要な薬学的キャリアと共に含有する。
【０１０５】
本発明の組成物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的効果のある用量）を決定するための細胞培養または動物実験のような標準的な薬学的な手順により決定され得る。毒性と治療効果間の用量の比は治療指標であり、そしてそれは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。大きな治療指標を示す組成物は好ましい。
【０１０６】
本発明で使用される任意の組成物のために、治療的有効用量は、初期に細胞培養アッセイで推定され得る。適切なバイオアッセイの例としては、ＤＮＡ複製アッセイ、サイトカイン送達アッセイ、転写を基礎にしたアッセイ、結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化を基礎にしたアッセイ、脂肪細胞におけるグルコース取込みを基礎にしたアッセイ、免疫学的アッセイ、例えば、実施例に記載の他のアッセイが挙げられる。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒト用途の範囲の投薬量を処方するのに用いられ得る。用量は、細胞培養または動物モデルで決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大半減阻害を達成する治療剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルで処方され得る。血漿中の循環レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより、測定され得る。特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイでモニターされ得る。上記投薬量は、好ましくは、毒性が殆どないまたは毒性が無い循環濃度の範囲内に入っていることである。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路により変わり得る。
【０１０７】
以下の実施例は、本発明の範囲を決して限定するものではない。当業者は、本発明の精神および範囲を変えることなく実施され得る多くの改変および変化を認識するであろう。そのような改変および変化は、本発明の範囲内に包含される。本出願のいたるところで引用している全ての参考文献、特許および公開特許出願の全内容は、本明細書で参考として援用している。
【実施例】
【０１０８】
（実施例１：Ｂ７−Ｈ３のゲノムＤＮＡの単離）
Ｂ７−Ｈ３ ＲＴ−ＰＣＲを、ヒトＢ７−Ｈ３の開始メチオニンおよび停止コドン（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３０２１０２）を含む領域に対応するオリゴヌクレオチドを用いて、以下のＰＣＲ条件で実施した。
【０１０９】
この研究で用いたＰＣＲ酵素としては、製造業者のプロトコールに従った酵素、ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、およびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。必要な場合、反応条件を、強い増幅のために、最終濃度１Ｍ ベタインおよび３％ＤＭＳＯになるよう、補充した。ａｔｔＢ１／Ｋｏｚａｋを埋め込んだプライマーＰＷ２６４（配列番号２３）およびａｔｔＢ２部位を埋め込んだプライマーＰＷ２６５（配列番号２４）を、脾臓、リンパ節、心臓、肝臓、膵臓および胎盤の第１ｃＤＮＡ鎖をテンプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）として、ヒトＢ７−Ｈ３をコードする配列を増幅するのに用いた。現存のデータベースの記載項目（Ｃｅｌｅｒａ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ、Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に表されている配列に対応するヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣコード領域配列を得た：特にＡＸ３５７９６０、ＡＸ０９７５５０、ＡＸ０４７０７２、ＡＸ０９７５５６、およびＡＸ１３６３６３。ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ形態を、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ Ｃ１〜Ｖ２ドメインの欠失により、ＮＭ＿０２５２４０のコード配列に合わせて構築した。ＰＷ２７０（配列番号２６）およびＰＷ２７１（配列番号２７）を、マウス胚子の第１ｃＤＮＡ鎖からのマウスＢ７−Ｈ３の配列を増幅するのに用いた。９５１ｂｐのサイズのＰＣＲ産物をサブクローンし、全ての分析したクローンには、いかなる擬エキソン配列を包含しない、１００％の正確さを有する真正な７つの予測されたエキソンの正確なスプライシングをはっきりと明らかにした。マウスＢ７−Ｈ３をコードする配列は、現存のデータベース記載事項ＢＣ０１９４３６、ＡＸ３７０３１２、およびＮＭ＿１３３９８３に対応する。プライマーＰＷ２８４（配列番号２９）およびＰＷ２６７（配列番号２５）を、ｃＤＮＡパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ（６９０ｂｐ）およびＶＣＶＣ（１３４４ｂｐ）転写の相対的な寄与を、半定量的に評価するのに用いた。ＺｅｔａｐｒｏｂｅＴＭ ＧＴ メンブレン（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上に、ＤＮＡをアルカリ転写し、そして３２Ｐ末端ラベルしたＰＷ２７８（配列番号２８）を、検出オリゴヌクレオチドとして用いてハイブリダイズしてサザンブロットを行なった（Ｌｉｎｇら、（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：７３００〜７３０８）。
【０１１０】
サルおよびハムスターのゲノムＤＮＡをＣＯＳ細胞株およびＣＨＯ細胞株から単離した（Ｌｉｎｇら、（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６０：３４１〜３５５）。ゲノムＰＣＲをＰＷ３５８（配列番号３０）およびプライマーＰＷ３５９（配列番号３１）をヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３配列で保存されている、ヌクレオチドを基礎にしたプライマーとして実施した（配列番号６のアミノ酸６０〜６６、２１６〜２２１、および２７８〜２８４、４３４〜４３９）。増幅反応を、二重に行い、そして多重のサブクローン化産物を配列決定により分析した。サルゲノムＤＮＡ内のＶ−イントロン−Ｃドメインの配向を、ＰＷ３８１（配列番号３３）およびＰＷ３８４（配列番号３４）を用いて、そしてハムスターのゲノムＤＮＡ内のＶ−イントロン−Ｃドメインの配向を、ＰＷ３５８（配列番号３０）およびＰＷ３７８（配列番号３２）を用いてＰＣＲにより決定した。
【０１１１】
ＤＮＡ分析を、以下のように行なった。１アリコート（０．２５〜０．５μｇ）のプラスミドＤＮＡを、１μｌの５μＭのプライマーおよび３μｌの２倍希釈ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭＢｉｇＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ミックス（バージョン３）と組み合わせた。その容量を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、１０μｌに調整し、そして増幅反応をＰＴＣ−２２５サイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で、２５サイクル（９６℃１０秒、５０℃５秒および６０℃４分）行なった。１０μｌの水を上記反応物に加え、過剰の染料を、９６ウェルのＧ−５０ビーズ入りのＭｉｌｌｉｐｏｒｅろ過プレートでゲルろ過により除去した。サンプルを９０〜９５℃で２分間、加熱変性し、製造業者推奨の条件下で、ＡＢＩ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で、電気泳動を行なった。ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＴＭ ４．１（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、手作業の配列編集を行なった。
【０１１２】
主要な増幅産物の配列決定は、Ｂ７−Ｈ３と異なり、他のＥＳＴおよび特許データベース記載事項と一致する１６０５ｂｐの配列という結果となった。Ｂ７−Ｈ３は、単一のＶドメインおよびＣドメイン（Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ形態）を含有するが、変種クローンは、重複するＶドメインおよびＣドメイン（Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ形態）を含有した。これらのクローンが、Ｂ７−Ｈ３に非依存性の遺伝子産物であるか否かを決定するために、ＶＣＶＣクローンのゲノム構成をヒトゲノムデータベースクエリー（Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により分析した。得られた一致は、染色体１５のゲノム軸ＧＡ＿ｘ２ＨＴＢＬ４ＳＳＴＰ−０４に対応する。これは、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの変種の両方に関して、単一の遺伝子起源を示唆している。図１Ｂは、ヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３遺伝子座の遺伝子構成を示す。集合体は、Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム軸ＧＡ＿ｘ２ＨＴＢＬ４ＳＳＴＰおよびＣｅｌｅｒａマウスゲノム軸ＧＡ＿ｘ５Ｊ８Ｂ７Ｗ７ＮＭ９の選択された部分を基礎にしている。棒状の印は、Ａｌｕ複合体反復およびＳＶＡ複合体反復、単純反復、転写エキソン構造ならびにドメイン名の相対的位置を表している。上記Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのゲノム構成は、リーダードメイン、Ｖ１ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｖ２ドメイン、Ｃ２ドメイン、膜貫通ドメインおよび三つの細胞質ドメインをコードする９個のエキソンを明らかにしている。約１３．５ｋｂのゲノム配列が、ヒトＢ７−Ｈ３座のエキソン１の開始メチオニンを、エキソン９の停止コドンから分離した。ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣのＢ７−Ｈ３座に対するエキソン描写は、エキソン２（Ｖ１）からエキソン５（Ｃ２）までの代替的スプライシングを表しており、この遺伝子産物からのＣ１ドメインおよびＶ２ドメインの欠失を生じた。
【０１１３】
配列分析、アラインメントおよび分子進化系統樹の作製を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩＴＭ バージョン７．１（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＡｌｉｇｎ ｍｏｄｕｌｅ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ）を用いて実行した。霊長類の配列の配列アラインメントおよび系統図分析は、種間Ｖ−イントロン−ｃＤＮＡ配列よりも種内Ｖ−イントロン−ｃＤＮＡ配列のより大きな程度の配列類似性、即ち、ヒトＶ１−イントロン−Ｃ１が、サルＶ−イントロン−Ｃより、ヒトＶ２−イントロン−Ｃ２により類似していることをあきらかにした。実際に、分析されたサルのＣドメイン配列間で、１００％の同一性が観察された。種内クラスタリングは、複製されたエキソンよりも、より高い配列保存が観察される非コード化種内ＶＣイントロン配列のアラインメントにより、さらに支持されている（９７％ 対 ９４％）。保存ヌクレオチドが、４種の全てのイントロン配列に見出されたが、非保存ヌクレオチド対が、齧歯類および霊長類間で排他的に共有されている（データを示していない）ことが見出された。このことは、霊長類および齧歯類伝来の共通の「予備複製された」霊長類ＶＣＶＣ分子について相反している。ヒトＢ７−Ｈ３ Ｖ−イントロン−Ｃドメインのフランキング配列は、そのような配列保存がなく、それは、霊長類における複製が突然変異から非常に近いか、または上記Ｖ−イントロン−Ｃ領域が、突然変異から極度に保護されていることを示唆している。このように、これらのデータは、ヒトおよびサルの種内タンデムＶＣリピートの多重独立性発生のモデルを強く支持する。
【０１１４】
（実施例２．Ｂ７−Ｈ３スプライス変種間の相対的転写寄与）
種々のヒト組織サンプルについてＲＴ−ＰＣＲを行ない、引き続き放射標識したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションを行なった（図２Ａ）。二つの不明瞭なバンドが検出され、一方は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ増幅産物の予測されたサイズと一致する１３４４ｂｐに対応する相対的移動度で移動した。ＶＣ増幅産物の予測されたサイズと一致する６９０ｂｐに対応する微量なバンドもまた、検出された。３つのｃＤＮＡパネルのＲＴ−ＰＣＲは、増幅産物が検出されなかった白血球／ＰＢＬを除いては、試験したいずれの組織にも、このパターンを示した。ハイブリダイズした領域のリン画像定量化は、１２．７：１（脳）と９２．１：１（腎臓）の間の比を示した。いずれの場合にも、より小さいＢ７−Ｈ３ ＶＣ産物へのハイブリダイゼーションンシグナルが、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ産物で見られたシグナルより大きいということはなかった。もし増幅反応が小さい増幅産物に有利だとすると、より小さいＢ７−Ｈ３ ＶＣの存在度を上回るより大きいＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの相対的存在度は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣが、ヒト組織で自然に発現するヒトＢ７−Ｈ３遺伝子産物の主要な転写種であることを示唆している。上記Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ形態の希少性は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ産物（Ｃｈａｐｏｖａｌら、（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：２６９〜２７４）が主要な産物であることを最確的に示している、以前に報告されたノーザンブロットの中で観察された単一の４．１ｋｂのＢ７−Ｈ３バンドと一致する。比較のために、マウスＢ７−Ｈ３のＰＣＲ−サザンブロットは、予測された９５１ｂｐの増幅産物と一致する、約１ｋｂの主要なバンドで調べた全ての組織における発現を示す（図２Ｂ）。他のＢ７−Ｈ３ハイブリダイゼーションシグナルもまた、マウス胎児、心臓および骨格筋組織において検出した。霊長類とは異なり、齧歯類の配列は、推定Ｃ１およびＶ２エキソンのコドン変性に起因して、単一のＶＣ形態のみしか有さない。
【０１１５】
以下に示すように、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ形態およびＶＣＶＣ形態は、インビトロで類似した生物学的活性を有し、これは、上記タンデムに重複したエキソンが、細胞ベースのアッセイで機能的に等価であることを示唆する。そのような機能的な冗長性は、生理学的に有害な効果なしでＣ１〜Ｖ２のエキソンの損失耐性を説明し得る。
【０１１６】
（実施例３．マウスおよびヒトＢ７−Ｈ３の比較ゲノム分析）
ＶＣドメイン断片の重複が、Ｂ７ファミリーのタンパク質の中で、Ｂ７−Ｈ３に特異的であるらしいと仮定して、本発明者らは、次にＢ７−Ｈ３の上記配列が、コドンベース置換を基礎にした他の共刺激リガンドの配列と異なるか否かについて試験した。分子進化の速度を決定する一つの方法は、コドン内の同義部位と非同義部位間との予測される突然変異速度の測定による。齧歯類 対 霊長類のさらなる配列比較を他の公知のリガンド（Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＧＬ５０、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）のＶエキソンおよびＣエキソンに関して行なった。これらのリガンドは、ＶドメインおよびＣドメインが、各分子の細胞外の部分に存在する構造的類似性を共有する。これらの不同性の分子の間の共有構造部分の存在は、これらの分子がＶ配列およびＣ配列を有する祖先配列に由来するという概念を広めてきた。マウスとヒトとの間のＶドメインおよびＣドメインの分岐の相対的速度を決定するために、同義コドンおよび非同義コドンにおけるヌクレオチド置換の相対的頻度を決定した。同義突然変異および非同義突然変異の頻度の計算を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ ＧＣＧ１０．０ Ｄｉｖｅｒｇｅ ｍｏｄｕｌｅ（ＧＣＧ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて実行した。Ｂ７−Ｈ３アラインメントに関して、ヒトＶ１ドメインおよびＣ２ドメインに対応するエキソンは、マウスＶドメインおよびＣドメインと整列化した。調べた全てのＶドメインおよびＣドメインの中で、同義置換 対 非同義突然変異の比は、Ｂ７−Ｈ３のＶドメイン以外は、１より小さかった。上記Ｂ７−Ｈ３分子は、全てのＶドメインの中で最も低いレベル（一部位当りｄＳ＝０．１２９置換）の同義突然変異であり、一方、同時にまた、全てのＣドメインの中で最も低いレベルの非同義突然変異（一部位当りｄＮ＝０．０２６置換）であった。結果として、上記Ｂ７−Ｈ３分子は、共刺激リガンドの中で、Ｖドメインで最も高いｄＮ：ｄＳ比を有し、一方、同時にＣドメインで最も低いｄＮ：ｄＳ比を有する点において異なる。ヒトＶ２ドメインとマウスＶドメインとの間の交差ドメイン分岐比較は、ｄＳ＝０．４３３およびｄＮ＝０．０３７を示し、一方、ヒトＣ１ドメインとマウスＣドメインとではｄＳ＝０．３９３およびｄＮ＝０．０３４を示した。ヒトＶ１とマウスＶとの間で見られる、ヒトＶ２およびマウスＶより低い同義突然変異率は、ヒトＶ１ドメインおよびマウスＶドメインはオルソログであることを意味する。配列進化の線形機序を仮定すると、同一分子の隣接するエキソン間での異なるヌクレオチド置換率は、Ｂ７−Ｈ３のＶドメインとＣドメインとの間で異なる選択プロセスが起こることを示している。
【０１１７】
分子進化の数学的モデルを基礎にして、特定のコード配列に関して同義置換率が、非同義置換率より多い場合は、選択の純正化を反映している。選択の純正化は、生理的な抑制が、遺伝子産物のアミノ酸変化のレベルを制限する時に起こる。選択の純正化は、試験された全てのＢ７ファミリーのＶドメインおよびＣドメインでは、Ｂ７−Ｈ３ Ｖ１ドメインを除いて、明らかである。Ｂ７−Ｈ３ Ｖ１に関して、ｄＳは、Ｂ７−２ ＶのｄＳの半分、かつＰＤ−Ｌ１ ＶのｄＳのおよそ８分の１である。Ｂ７−Ｈ３ Ｖ１ｄＮは低いが、１．１８のｄＮ：ｄＳ比でＢ７−Ｈ３ ＶｄＳのｄＮをまだ上回る。ｄＮ：ｄＳ比が１より大きい場合は、異常であり、早く進化する機能の明確な選択を受けている配列に起因する。Ｂ７−Ｈ３ Ｃ２エキソンは、試験された全てのエキソンの中で最も低い値の０．０６３のｄＮ：ｄＳ比を示し、他の試験された他のＣドメインに見られるレベルの５分の１から１５分の１であることは、注目すべきである。従って、Ｂ７−Ｈ３を含むエキソンは、他の共刺激リガンドに対して異なる様式で容易に積極的に維持された／される。
【０１１８】
（実施例４．Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＶＣＶＣはＴ細胞活性化をダウンレギュレートする）
齧歯類Ｂ７−Ｈ３で観察される上記単一ＶＣ単位を基礎にして、本発明者らは、ヒトで見られるＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびＶＣＶＣ形態が、細胞ベースのアッセイで類似の機能を有するか否かについて決定しようとした。Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのＴ細胞活性化をダウンレギュレートする能力を、増殖およびサイトカイン産生レベルの両方で観察した。この実験を以下のように行なった。
【０１１９】
ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣまたはＶＣＶＣ構築物のエントリーベクターを、ＩＲＥＳ−ＧＦＰをコードする二重シストロンレトロウイルスベクターにクローニングした。受容先のレトロウイルスベクターは、もともとＧＦＰ−ＲＶベクター（Ｒａｎｇａｎａｔｈ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：３８２２〜３８２６）由来であって、ａｔｔＢ１−ｃｃｄＢ−ａｔｔＢ２カセット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧａｔｅｗａｙ組換え用に改変した。ウイルス含有上清を産生し、以前に記載されているように（Ｃａｒｔｅｒら、（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：６３４〜６４３）、ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞を感染するのに用いた。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣをＧＦＰ発現を基礎にして細胞ソーティングにより選択した。同様のＧＦＰレベルを発現しているＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２トランスフェクト体を、細胞アッセイのコントロールとして用いた。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７．１およびＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７．２の産生は、以前に記載されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、６（２）：２１１〜２１４）。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２トランスフェクト体を室温で４分間０．２％パラホルムアルデヒド中で固定し、固定反応を、１Ｍリジン中、室温で４分間クエンチした。細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、培養媒体（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ）に再懸濁し、Ｔ細胞増殖アッセイの抗原提示細胞として用いた。
【０１２０】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、以前に記載（Ｂｌａｉｒら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：１２〜１５）されているように末梢リンパ球から、負の選択により精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）を平底９６ウェルプレート中、可溶性抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ、ＵＣＨＴ１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および種々の濃度の可溶性抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、パラホルムアルデヒド固定したＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲトランスフェクト体（１．２５×１０４細胞／ウェル）と一緒に培養した。増殖を、７２時間のインキュベーション期間のうち最後の５〜１２時間、１ウェルあたり１Ｃｉ[３Ｈ]−チミジンで培養物をパルスすることにより決定した。サイトカイン産生を測定するために、上清を７２時間で収集し、サンプルを多重ＥＬＩＳＡスクリーニング（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｏｓｔｏｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）でアッセイした。
【０１２１】
Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ形態およびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ形態の機能的活性を決定するために、以下の細胞ベースのアッセイを行なった。精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、パラホルムアルデヒド処理したＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲトランスフェクト体で、一定量の可溶性抗ＣＤ３抗体および増加する濃度の可溶性抗ＣＤ２８抗体の存在下で刺激した。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２−ＧＦＰトランスフェクト体の存在下で、抗ＣＤ３で精製Ｔ細胞を活性化すると、増殖は起こらなかった；増殖レベルは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で昂進した（図３Ａ〜３Ｂ）；ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７−１もしくはＢ７−２の存在下で、抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を刺激すると、ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２−ＧＦＰコントロール細胞で得られるレベル（図３Ａ）より上の増殖が起こった。可溶性抗ＣＤ２８抗体は、ＧＦＰコントロールを昂進したが、Ｂ７−１およびＢ７−２の応答を昂進しなかった。反対に、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣまたはＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの存在下でのＴ細胞の刺激は、低下した増殖応答をもたらした（図３Ｂ）。抗ＣＤ３（１ｇ／ｍｌ）および低い共刺激（５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体）で、サイトカイン産生は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ刺激時に有意に減少した。ＩＬ−１０（約８１％）レベル、ＴＮＦ−α（約６９％）レベル、ＩＦＮ−γ（約８５％）レベル、およびＧＭ−ＣＳＦ（約６５％）レベルは、ＧＦＰコントロールと比較して、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣまたはＶＣＶＣのいずれかの培養物で刺激した培養物中で、劇的に減少した（図４）。これらのアッセイ条件では、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１３が、無視し得る量しか検出されなかった。これらの結果は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣも、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣも、共刺激分子として機能するのではないことを示し、かつＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ細胞表面分子が活性化の負のレギュレータとして作用するＴ細胞上のレセプターとかかわりあうことを示唆している。２００ｎｇ／ｍｌ程度の高い濃度の抗ＣＤ２８抗体の添加は、増殖に対するＢ７−Ｈ３の阻害効果を部分的にのみ維持できた。
【０１２２】
（実施例５：Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＶＣＶＣは、Ｔ細胞活性化をダウンレギュレートする。）
Ｂ７−Ｈ３機能をさらに特徴づけるために、Ｔ細胞応答のＢ７−Ｈ３ダウンレギュレーションが、ＴＣＲ／Ｂ７−Ｈ３レセプターの協調的かかわりを要求するか否かを決定するため、単一（ＣＩＳ）または別々の（ＴＲＡＮＳ）表面上で実験を行なった。ＣＩＳビーズは、抗ＣＤ３抗体と、精製した融合タンパク質Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ−ＩｇまたはＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ−Ｉｇとを含有するが、一方、ＴＲＡＮＳビーズは、抗ＣＤ３抗体および、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ−ＩｇまたはＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ−Ｉｇとのいずれかを含有した。
【０１２３】
Ｔ細胞のビーズ刺激を以下のように実施した。抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ−Ｉｇ、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ−ＩｇおよびコントロールＩｇを、ポリウレタン被覆ｔｏｓｙｌ活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）に共有結合した。ビーズを一定濃度（１μｇ、総結合タンパク質の２０％）の部分最適化抗ＣＤ３抗体およびＢ７−Ｈ３−ＩｇまたはコントロールＩｇ（４μｇ、総結合タンパク質の８０％（Ｂｅｎｎｅｔｔら、（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０：７１１〜７１８）で調製した。ビーズは、１０７ビーズあたり、５μｇの結合能を有する。ＣＩＳビーズは、同じビーズに抗ＣＤ３およびＢ７−Ｈ３の両方を含有し、ＴＲＡＮＳビーズは、二つのタイプのビーズからなり、一方は、抗ＣＤ３抗体を含有し、他方はＢ７−Ｈ３−Ｉｇを含有する（Ｂｅｎｎｅｔｔら、（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０：７１１〜７１８）。ＣＩＳおよびＴＲＡＮＳ条件下で、等しいビーズ対細胞比を維持するために、コントロールＩｇＧで被覆されたビーズをＣＩＳ培養物に添加した。タンパク質被覆ビーズを、平底９６ウェルマイクロタイタープレートの精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）に１：１の比で添加した。増殖を、７２時間のインキュベーション期間のうちの最後の６〜１６時間に、一ウェルあたり１Ｃｉ［３Ｈ］−チミジンで培養物をパルスして決定した。
【０１２４】
図５に示すように、増殖阻害は、細胞がＣＩＳビーズで活性化された場合にのみ観察された。まとめると、これらの所見は、Ｂ７−Ｈ３レセプターおよびＴＣＲが、Ｔ細胞活性化のダウンレギュレーションのためには、近接している必要があることを示唆している。これらのデータは、Ｂ７−Ｈ３レセプター経路がＴ細胞応答を調節するために、活性化と阻害の両方のシグナルが同じ細胞から生じなければならないことを示唆している。
【０１２５】
上清中のサイトカインの量を、多重ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて、７２時間で測定した：ＴＮＦ−α（図６Ａ）、ＩＦＮ−γ（図６Ｂ）およびＧＭ−ＣＳＦ（図６Ｃ）。Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのＴ細胞活性化をダウンレギュレーションする能力を、サイトカイン産生レベルで評価した。抗ＣＤ３（１ｇ／ｍｌ）および低い共刺激（５ｎｇ／ｍｌ 抗ＣＤ２８抗体）で、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ刺激の際に、サイトカイン産生は有意に減少した（図６Ａ〜６Ｃ）。ＩＬ−１０（約８１％）レベル、ＴＮＦ−α（約６９％）レベル、ＩＦＮ−γ（約８５％）レベル、およびＧＭ−ＣＳＦ（約６５％）レベルは、ＧＦＰコントロールに対して、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣまたはＶＣＶＣ培養物のいずれかで刺激した培養物中で、劇的に減少した。これらのアッセイ条件では、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６および１Ｌ−１３を無視しうる量でしか検出しなかった。これらの所見は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣも、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのいずれも共刺激分子としては機能しないことを示しており、かつＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ細胞表面分子が活性化の負のレギュレータとして作用するＴ細胞上のレセプターと係わり合いを持つことを示唆している。
【０１２６】
結果は、Ｔ細胞のＴＣＲ／Ｂ７Ｈ３（ＶＣまたはＶＣＶＣ）活性化がＴ細胞応答のダウンレギュレーションをもたらすことを示している。増殖およびサイトカイン産生は、ＴＣＲ単独で活性化された細胞に対して、ＴＣＲ／Ｂ７−Ｈ３活性化Ｔ細胞において減少する。このデータは、Ｔ細胞上のＢ７−Ｈ３レセプターの係わり合いが負のシグナルを送達することを示唆している。結果はまた、ＴＣＲおよびＢ７−Ｈ３レセプター間の物理的近接が、Ｂ７−Ｈ３レセプター経由のＴ細胞活性化を、ダウンレギュレートするために要求され得ることを示唆する。
【０１２７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化をダウンレギュレートするＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびＶＣＶＣの能力は、Ｂ７タンパク質のいずれかによる、ＣＴＬＡ４の係わり合いにより産生される負のシグナルまたはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１タンパク質およびＰＤＬ２タンパク質のいずれかによるＰＤ−１の係わり合いにより産生される負のシグナルを示唆している。さらに、固体マトリックスに結合したＢ７−Ｈ３での実験は、ＴＣＲおよびＢ７−Ｈ３レセプターシグナルの両方が同じ細胞により送達されることを示している。同様な要件が、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１のいずれかによる負のシグナル伝達に関して記載されている（Ｇｒｉｆｆｉｎら、（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４：４４３３；およびＢｅｎｎｅｔｔら、（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０：７１１〜７１８）。最終的に、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ分子の両方が、ＣＤ４ Ｔ細胞応答を調節する能力において重複しているようにみえる。
【０１２８】
（実施例６：乾癬患者における治療有効性）
Ｂ７−Ｈ３により制御される免疫応答の調節は、免疫抑制効果または免疫応答の増強が所望される場合に有用である。Ｂ７−Ｈ３アゴニスト（例えばＢ７−Ｈ３の可溶性形態）は、異常に昂進した免疫応答（例えば、自己免疫障害におけるように、自己抗原に応答することが挙げられる）を含む疾患または状態の重症度および／または症状を、予防または減少させるのに使用され得る。Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストは、一方、例えば癌または免疫抑制障害で起こり得る望ましくない低い免疫応答を有する被験体に投与され得る。
【０１２９】
乾癬は、典型的なＴ細胞媒介性自己免疫疾患であると考えられている。乾癬は、部分的には、活性化された損傷性Ｔ細胞（Ｔｈ１非対称）に産生されるＩＦＮ−γを通して媒介される慢性炎症性皮膚疾患である。
【０１３０】
最も一般的には、可溶性タンパク質が、外来患者に投与され、これは、ゆっくりとした静脈内（ＩＶ）注入で、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ用量での週一回の投与に設定される。アンタゴニストの適切な治療有効用量は、処置する臨床医により選択され、およそ１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇおよび５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１３１】
皮膚Ｔ細胞に対する効果を評価するために、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体、Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体またはＢ７−Ｈ３−Ｉｇを、正規化した疾患重症度（最小ＰＡＳＩ（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）スコア１２）を有する乾癬患者のランダマイズした群に対して、１２週間連続投与した。長期にわたって患者の臨床改善を評価し治療に対する彼等の応答をモニターするために、上記ＰＡＳＩスコアシステムが使用され得る（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎら、（１９７８）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、１５７：２３８〜２４４；およびＭａｒｋｓら、（１９８９）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８９；１２５：２３５〜２４０）。
【０１３２】
要約すれば、ＰＡＳＩスコアの要素は、以下を含む：（１）体表面積（ＢＳＡ）の％としての患部領域；（２）患部領域の程度（スケール１〜１０）；および（３）乾癬変化の程度（紅斑、浸潤、剥離）スケール０〜４）。ＰＡＳＩスコアは以下のように計算する：（（０．１×（紅斑頭部）＋（浸潤頭部）＋（剥離頭部））×（患部頭部の程度））＋（（０．２×（「紅斑体幹部）＋（浸潤体幹部）＋（剥離体幹部））×（患部体幹部の程度））＋（（０．３×（紅斑上部先端）＋（浸潤上部先端）＋（剥離上部先端）×（患部上部先端の程度））＋（（０．４×（紅斑下部先端）＋（浸潤下部先端）＋（剥離下部先端）×（患部下部先端））。最小スコアは０であり、最高スコアが７２である。ＰＡＳＩスコアの減少は効果的処置を暗示している。上記処置を受けた個体の少なくとも５０％がＰＡＳＩスコアの減少および彼等の状態に改善を示すことが理解される。
【０１３３】
本明細書は、本明細書に参考として援用される本明細書で引用される参考文献の教示する観点に照らし、徹底的に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の例証的な実施形態を提供するが、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者は、容易に多くの他の実施形態が本発明により包含されることを容易に認識する。本開示の中の引用された全ての刊行物および特許ならびに登録番号またはデータベース参照番号により同定された配列は、その全体が参考として援用される。参考として援用された物質が、本明細書と矛盾または一致しない範囲まで、本明細書は、如何なるそのような物質にもとってかわる。本明細書中の如何なる参考文献の引用も、そのような参考文献が本発明の先行技術であると承認するものではない。
【０１３４】
他に示さない限り、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される、成分、細胞培養物、処置条件などの量を表現している全ての数値は、全ての例において、用語「約」により改変され得ると理解されるべきである。従って、そうではないと他に示さない限り、数値パラメータは近似であり、本発明で得られるよう求められる所望の性質に大きく依存する。他に示されない限り、一連の要素の前にたつ用語「少なくとも」は、一連の全ての要素に言及していることが理解されるべきである。当業者は、本明細書で記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、単なる慣用実験を用いて認識し、または確認することができる。そのような等価物は以下の特許請求の範囲により包含されていると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトとマウスとのＢ７−Ｈ３配列の比較を示す。推定翻訳ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ遺伝子産物、推定翻訳ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ遺伝子産物および推定翻訳マウスＢ７−Ｈ３遺伝子産物の配列アラインメント。配列アラインメントの上の黒線は、ゲノム配列により区別されたエキソンドメインを示す。ペプチド配列の下の矢印は、交差種増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーにおいて使用される、対応する核酸位置を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトおよびマウスのＢ７−Ｈ３遺伝子座のゲノム構成を示す。構成部分は、Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム軸ＧＡ＿ｘ２ＨＴＢＬ４ＳＳＴＰおよびＣｅｌｅｒａマウスゲノム軸ＧＡ＿ｘ５Ｊ８Ｂ７Ｗ７ＮＭ９の選択された部分に基づく。バーは、Ａｌｕ複合体反復およびＳＶＡ複合体繰反復の相対位置、単純反復（ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｐｅａｔ）の相対位置、転写物のエキソン構造およびドメイン名を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトサンプルに対するＢ７−Ｈ３ ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。第１鎖ヒトｃＤＮＡの３つの別々の群を、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ配列およびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ配列の両方に共通のＰＣＲプライマーを用いて増幅し、そして、Ｖ１ドメインに対するオリゴヌクレオチドを用いて検出した。増幅産物の予測される大きさは、示されるとおりである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウスサンプルに対するＢ７−Ｈ３ ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。成体ｃＤＮＡおよび胎仔ｃＤＮＡからなるマウス群を、Ｂ７−Ｈ３転写物の存在について分析した。約１ｋｂのバンドの主な特異的ハイブリダイゼーションは、マウスＢ７−Ｈ３の単一ＶＣ形態の存在と一致する。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、活性化Ｔ細胞の増殖により測定される場合のＢ７の共刺激効果を実証する。Ｔ細胞のＢ７−Ｈ３活性化は、増幅およびサイトカイン産生の減少をもたらす。図３Ａが、ＧＦＰを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞、Ｂ７−１を発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞、Ｂ７−２を発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞についての増殖アッセイの結果を示すのに対し、図３Ｂは、ＧＦＰを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞またはＢ７−Ｈ３ ＶＣを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞についての増殖アッセイの結果を示す。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２トランスフェクト体（１．２５×１０４細胞／ウェル）を、可溶性抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）および力価測定された濃度の抗ＣＤ２８抗体の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）とともにインキュベートした。増殖を、７２時間目に測定した。抗ＣＤ３非存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞添加ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２トランスフェクト体の応答は、３００ＣＰＭより下であった。
【図４】図４は、活性化Ｔ細胞によるサイトカイン産生に対するＢ７−Ｈ３の阻害効果を実証する。ＧＦＰを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞またはＢ７−Ｈ３ ＶＣを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞（１．２５×１０４細胞／ウェル）を、可溶性抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）および力価測定された濃度の抗ＣＤ２８抗体（０．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）とともにインキュベートした。抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８抗体（０．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２ ＧＦＰ、ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２ Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣまたはＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２ Ｂ７−Ｈ３ ＶＣのうちのいずれかにより刺激されたＴ細胞培養物から、上清を収集した。サイトカイン産生を、多重ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて、７２時間目に測定した。
【図５】図５は、細胞増殖阻害により測定される場合、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣが、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に負のシグナルを送達することを実証する。精製されたＣＤ４＋細胞（１０５細胞／ウェル）を、ＣＩＳミクロスフェアまたはＴＲＡＮＳミクロスフェアにおける抗ＣＤ３抗体（１μｇ／１０７ミクロスフェア）およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ（ＶＣＶＣまたはＶＣ；４μｇ／１０７ミクロスフェア）を用いて活性化した。ＣＩＳミクロスフェアを、４μｇ／１０７ミクロスフェアで、抗ＣＤ３（１μｇ／１０７ミクロスフェア）およびＢ７−Ｈ３（ＶＣＶＣまたはＶＣ）の両方によりコーティングした。ＴＲＡＮＳミクロスフェアは、２つのタイプのミクロスフェア：（ａ）抗ＣＤ３抗体（１μｇ／１０７ミクロスフェア）によりコーティングされたミクロスフェアと、（ｂ）Ｂ７−Ｈ３（ＶＣＶＣまたはＶＣ）によりコーティングされたミクロスフェアとの混合物からなっていた。等しいミクロスフェア対細胞比を維持するために、コントロールのマウスＩｇでコーティングされたミクロスフェアを添加して、５μｇ／１０７ビーズの総タンパク質濃度を達成した。増殖を、７２時間目に測定した。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、サイトカイン分泌阻害により測定される場合、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣが、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に負のシグナルを送達することを実証する。精製されたＣＤ４＋細胞（１０５細胞／ウェル）を、ＣＩＳミクロスフェアまたはＴＲＡＮＳミクロスフェア上にある、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／１０７ミクロスフェア）およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ（ＶＣＶＣまたはＶＣ；４μｇ／１０７ミクロスフェア）を用いて活性化した。ＣＩＳミクロスフェアを、４μｇ／１０７ミクロスフェアにて、抗ＣＤ３（１μｇ／１０７ミクロスフェア）およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ（ＶＣＶＣまたはＶＣ）の両方によりコーティングした。ＴＲＡＮＳミクロスフェアは、２つのタイプのミクロスフェア：（ａ）抗ＣＤ３抗体（１μｇ／１０７ミクロスフェア）によりコーティングされたミクロスフェアと、（ｂ）Ｂ７−Ｈ３（ＶＣＶＣまたはＶＣ）によりコーティングされたミクロスフェアとの混合物からなっていた。等しいミクロスフェア対細胞比を維持するために、コントロールのマウスＩｇでコーティングされたミクロスフェアを添加して、５μｇ／１０７ビーズの総タンパク質濃度を達成した。この上清中のサイトカイン量を、多重ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて７２時間目に測定した：ＴＮＦ−α（図６Ａ）、ＩＦＮ−γ（図６Ｂ）およびＧＭ−ＣＳＦ（図６Ｃ）。
【技術分野】
【０００１】
（発明の説明）
（発明の分野）
本開示は、免疫学および臨床免疫学の分野に関し、より詳細には、免疫応答の調節におけるＢ７ファミリーリガンドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
リンパ球活性化は、そのリンパ球と「補助」細胞（Ｔ細胞活性化の場合には抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＢ細胞活性化のためにはヘルパーＴ細胞）との間のいくつかのシグナル伝達事象を必要とする、複数工程プロセスである。リンパ球活性化が生じるためには、休止しているリンパ球に、２つのタイプのシグナルが伝達されなければならない。一次的なタイプ（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｙｐｅ）（刺激）は、免疫応答に特異性を与え、抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の認識の際に、抗原特異的レセプター（Ｔ細胞上のＴｃＲおよび細胞上のＢｃＲ）により媒介される。第二のタイプ（共刺激性）は、上記応答の大きさを担う。このシグナルは、上記リンパ球の表面に発現される「補助」レセプターを介して媒介される。共刺激の要求は、リンパ球活性化が厳密に調節されることを可能にする。次いで、共刺激は、これらの細胞上の、正の共刺激シグナルを妨げる負のシグナルを送達し得る阻害レセプターによって調節される。
【０００３】
多くの証拠が、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー分子に属する多数の構造的に関連しているリガンドおよびレセプターが、リンパ球活性化プロセスの間に使用されるシグナルと相互作用し、かつその均衡を保っていることを示唆している（非特許文献１）。このような構造的に関連する群の１つとしては、Ｂ７ファミリーのリガンド（Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＢ７−Ｈ３）が挙げられ、これらは、この分子の細胞外部分に存在する１つのＩｇ−Ｖ様（「Ｖ」）ドメインおよび１つのＩｇ−Ｃ様（「Ｃ」）ドメインを有する類似のドメイン構造を共有する（非特許文献２）。Ｂ７タンパク質のエキソン欠失研究および結晶学的研究において、レセプター−リガンド相互作用が、上記Ｖドメインを介して生じ（非特許文献３）、他方、上記Ｃドメインは、上記Ｖドメインのための構造的支持体手段として働くことが証明されている。
【０００４】
Ｂ７−１およびＢ７−２は、正のシグナル（それらの低親和性同種レセプターＣＤ２８を介して）または負のシグナル（高親和性レセプターＣＴＬＡ４を介して）のいずれかを送達し得る。ＩＣＯＳ−ＬとＩＣＯＳレセプターとの相互作用が、正のシグナル伝達をもたらすのに対し、ＰＤ−Ｌ１は、そのレセプターであるＰＤ−１を介して負のシグナルを送達する（非特許文献４）。
【０００５】
本開示は、Ｂ７ファミリーリガンドの最も新しいメンバーであるＢ７−Ｈ３により調節される、免疫応答の調節に関する。ヒトＢ７−Ｈ３は、元々、他のＢ７ファミリーメンバーと２０％〜２７％のアミノ酸同一性を共有し、かつ１つのＶドメインおよび１つのＣドメインを有する、Ｂ７様タンパク質として同定された（非特許文献５）。しかし、部分的なＢ７−Ｈ３ ＥＳＴクローンのより詳細な分析は、哺乳動物種における遺伝子エキソンの変化を証明した（非特許文献６）。特に、霊長類において、Ｂ７−Ｈ３ ｃＤＮＡは、２つの形態で存在する：一方は、ＶドメインおよびＣドメインの単一セット（「ＶＣ形態」）をコードし、そして、他方は、ＶドメインおよびＣドメインの二重セット（「ＶＣＶＣ形態」）をコードする。霊長類のＢ３−Ｈ３とは対照的に、齧歯動物のＢ７−Ｈ３ ｃＤＮＡは、ＶＣとして単一形態でのみ存在する。
【０００６】
Ｂ７−Ｈ３ ＶＣは、最初、ヒト（非特許文献７および特許文献１）およびマウス（非特許文献８）の両方において、共刺激リガンドとして特徴付けられた。特に、ヒトＴ細胞のＢ７−Ｈ３ ＶＣによる共刺激が、Ｔ細胞増殖の促進、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導およびγインターフェロン転写物発現の上昇をもたらすことが報告されている。さらに、細胞ベースのアッセイにおける結合実験は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣが、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳまたはＰＤ−１ではない、活性化Ｔ細胞上に発現されるレセプターに結合することを示唆している。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１６８７６号公報
【非特許文献１】Ｆｒａｕｗｉｒｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００２，１０９：２９５−２９９
【非特許文献２】Ｓｈａｒｐｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，２：１１６−１２６
【非特許文献３】Ｏｓｔｒｏｖら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２９０：８１６−８１９
【非特許文献４】Ｃａｒｒｅｎｏら，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，２０：２９−５３
【非特許文献５】Ｃｈａｐｏｖａｌら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，２：２６９−２７４
【非特許文献６】Ｓｕｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，１６８：６２９４−６２９７
【非特許文献７】Ｃｈａｐｏｖａｌら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，２：２６９−２７４
【非特許文献８】Ｓｕｎら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：６２９４−６２９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般的に、免疫系に関連する障害および状態のための治療方法を提供する必要が存在する。免疫応答の適切な調節は、上記Ｂ７−Ｈ３経路の操作により達成され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の目的の１つは、免疫応答の調節のための方法および組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、以下の説明において部分的に述べられ、そして、その説明から部分的に理解されるか、または本発明の実施により学習され得る。
【０００９】
本発明は、部分的に、Ｂ７−Ｈ３のＶＣＶＣ形態が、複数の組織にわたって観察されるＢ７−Ｈ３転写物の大部分を占め、他方、Ｂ７−Ｈ３のＶＣ形態は、少量の転写物でしかないという発見および証明に基づく。本発明は、部分的に、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの両方の形態が、Ｂ７−Ｈ３存在下でのＴ細胞増殖の減少およびこれらの細胞によるサイトカイン分泌の減少により証拠付けられるように、リンパ球活性化に対して阻害効果を示すという発見および証明にさらに基づく。本発明は、部分的に、進化学的選択の純化を現在経験しているＢ７−Ｈ３遺伝子内の特定領域の発見になおさらに基づく。
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
リンパ球の活性化を阻害する方法であって、該方法は、該リンパ球とＢ７−Ｈ３アゴニストとを接触させる工程、および該アゴニストが、該リンパ球の活性化を阻害することを可能にする工程を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アゴニストが、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態である、方法。
（項目３）
項目３に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アゴニストが、配列番号１５を含む、方法。
（項目４）
項目２に記載の方法であって、前記可溶性形態が、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＶドメインを含む、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、前記Ｖドメインが、（ａ）配列番号７、または（ｂ）配列番号７と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目６）
項目４に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態が、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＣドメインをさらに含む、方法。
（項目７）
項目４に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態が、抗体のＦｃ領域をさらに含む、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態が、（ａ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２２から選択されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２２から選択される配列のうちの少なくとも１つと実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目９）
項目７に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態が、（ａ）配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号１４から選択されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号１０、配列番号１２もしくは配列番号１４から選択される配列のうちの少なくとも１つと実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目１０）
項目３に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アゴニストが、一次刺激分子に連結される、方法。
（項目１１）
項目１０に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態と前記一次刺激分子とが、１００μｍ以下だけ隔てられている、方法。
（項目１２）
項目１に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストが、配列番号１５のアミノ酸をコードする核酸である、方法。
（項目１３）
リンパ球の活性化を促進する方法であって、該方法は、該リンパ球とＢ７−Ｈ３アンタゴニストとを接触させる工程、および該アンタゴニストが、該リンパ球の活性化を促進することを可能にする工程を包含する、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、前記リンパ球が、ヒトリンパ球である、方法。
（項目１５）
項目１３に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストが、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体またはＢ７−Ｈ３レセプターに対する抗体である、方法。
（項目１６）
項目１３に記載の方法であって、前記Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストが、アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡである、方法。
（項目１７）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記リンパ球が、Ｔ細胞である、方法。
（項目１８）
項目１７に記載の方法であって、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、方法。
（項目１９）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記リンパ球が、哺乳動物中にある、方法。
（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、前記哺乳動物が、免疫障害、癌もしくは感染症のうちの少なくとも１つに罹患しているかまたはその危険がある、方法。
（項目２１）
項目１９に記載の方法であって、前記哺乳動物が、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を用いて処置される、方法。
【００１０】
１つの局面において、本開示は、インビトロ、インビボおよびエキソビボの免疫応答調節方法（ヒトまたは動物の処置方法を含む）を提供する。いくつかの実施形態において、このような方法は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）とＢ７−Ｈ３因子とを接触させる工程を包含し、ここで、このＢ７−Ｈ３因子は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の誘導体（例えば、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態）；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３に対する抗体；（ｃ）Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体；または（ｄ）Ｂ７−Ｈ３ ｍＲＮＡまたはその相補体の少なくとも一部を含む核酸であり得る。特定の実施形態において、上記Ｂ７−Ｈ３因子は、一次的な（ｐｒｉｍａｒｙ）（刺激、抗原特異的）シグナルに連結される。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明の方法は、このような組成物を用いる処置に対して感受性の免疫障害を処置または予防するために使用される。具体的には、このような障害としては、自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病）、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、過剰増殖性免疫障害、癌、免疫抑制障害、種々の感染性疾患などを含む、免疫学的障害が挙げられるが、これらに限定されない。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、リンパ球活性化の阻害を必要としている被験体を同定する工程、およびアゴニストであるＢ７−Ｈ３因子をその被験体に投与する工程を包含する。他の実施形態において、上記方法は、リンパ球活性化の促進を必要としている被験体を同定する工程、およびアンタゴニストであるＢ７−Ｈ３因子をその被験体に投与する工程を包含する。
【００１２】
本発明の方法において使用される抗体は、２つの群（（１）Ｂ７−Ｈ３に対する抗体および（２）Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体）に分類される。これらの抗体は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合し、それにより、Ｂ７−Ｈ３とそのレセプターとの相互作用を遮断するか；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３レセプターに特異的に結合し、それにより、Ｂ７−Ｈ３とのその相互作用を遮断するか；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を実施し得る。所望される効力に依存して、上記抗体は、免疫応答を促進するかまたは阻害するかのいずれかのために、いずれかの形態で使用され得る。いくつかの実施形態において、抗体は、天然で発現されるＢ７−Ｈ３の生物学的活性に拮抗するために投与される。
【００１３】
本開示は、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態を含有する組成物を含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、全長より短いＢ７−Ｈ３を含み、そして、Ｂ７−Ｈ３の膜貫通ドメインも細胞内ドメインも含まない。さらなる実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＶドメイン、および必要に応じて、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＣドメインを含む。可溶性形態は、少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのＶドメイン、および必要に応じて、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＣドメインを含み得る。なおさらなる実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列および（ｂ）抗体の定常領域由来の第２のアミノ酸配列を含み得る。上記第１のアミノ酸配列は、Ｂ７−Ｈ３細胞外ドメインの全てまたは部分に由来し、そして、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の天然に存在する形態がそのレセプターへ結合するのを競合的に阻害し、そして／または（ｂ）負の共刺激活性を有する。いくつかの実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、配列番号１５において示されるような配列を含む。特定の実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸２３〜２４４もしくは配列番号１２のアミノ酸２３〜４６２と、同一であるかまたは実質的に同一である。例示的実施形態において、上記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、配列番号１２または配列番号１４におけるような配列を含む。
【００１４】
本開示はまた、このような核酸によりコードされる核酸もしくはポリペプチドの治療的な使用または非治療的な使用を含む方法を提供し、ここで、このような核酸のヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５のヌクレオチド配列またはその部分；および（ｂ）少なくとも６０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長または１４０ヌクレオチド長であり、かつ規定される条件下で、（ａ）の核酸に対してこれらにハイブリダイズする核酸から選択され、ここで、この核酸は、負の共刺激活性を有する発現産物をコードする。特定の実施形態において、このような核酸は、配列番号１５におけるようなアミノ酸配列をコードする。例示的実施形態において、上記核酸は、実質的に配列番号１１または配列番号１３におけるような配列を含む。
【００１５】
本発明の方法はまた、免疫応答を増強するために、Ｂ７−Ｈ３の発現を減少するための短い干渉ＲＮＡおよびアンチセンス核酸の使用を包含する。
【００１６】
本発明はまた、任意の上述の核酸を含むベクターおよび任意のこのようなベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００１７】
上述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が、例示および説明にすぎず、そして、特許請求されている本発明を限定するものではないことが、理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（配列の簡単な説明）
配列番号１および配列番号２は、それぞれ、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣの核酸全長配列およびアミノ酸全長配列を示す。
【００１９】
配列番号３および配列番号４は、それぞれ、マウスＢ７−Ｈ３の核酸全長配列およびアミノ酸全長配列を示す。
【００２０】
配列番号５および配列番号６は、それぞれ、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの核酸全長配列およびアミノ酸全長配列を示す。
【００２１】
配列番号７は、ヒトＢ７−Ｈ３のアミノ酸配列（Ｂ７−Ｈ３ ＶＣまたはＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのアミノ酸２８〜１３９）を示す。
【００２２】
配列番号８は、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのＶ１領域とＶ２領域との間（すなわち、配列番号６のアミノ酸２８〜１３９とアミノ酸２４６〜３５７との間）で保存されたアミノ酸を示す。
【００２３】
配列番号９および配列番号１０は、それぞれ、オンコスタチンＭシグナル配列（配列番号１０のアミノ酸１〜２２）、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣの細胞外ドメイン（配列番号１０のアミノ酸２３〜２４４）およびマウスＩｇＧ２ａｍの定常領域（配列番号１０のアミノ酸２４５〜４８２）を含む融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号１１および配列番号１２は、それぞれ、オンコスタチンＭシグナル配列（配列番号１２のアミノ酸１〜２２）、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの細胞外ドメイン（配列番号１２のアミノ酸２３〜４６２）およびマウスＩｇＧ２ａｍの定常領域（配列番号１２のアミノ酸４６３〜７００）を含む融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号１３および配列番号１４は、それぞれ、オンコスタチンＭシグナル配列（配列番号１４のアミノ酸１〜２２）、マウスＢ７−Ｈ３ ＶＣの細胞外ドメイン（配列番号１４のアミノ酸２３〜２４４）およびマウスＩｇＧ２ａｍの定常領域（配列番号１４のアミノ酸２４５〜４８２）を含む融合ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号１５は、哺乳動物Ｂ７−Ｈ３のＩｇ Ｖ様ドメインにおける保存されたアミノ酸を示す。
【００２７】
配列番号１６〜２２は、哺乳動物Ｂ７−Ｈ３のＩｇ Ｖ様領域における個々の高度に保存された領域を示す。
【００２８】
配列番号２３〜３５は、実施例に記載されるように、Ｂ７−Ｈ３配列の単離のために用いられたＰＣＲプライマーを示す。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
本発明がより容易に理解されるために、本明細書中で、特定の用語が定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して述べられる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリンまたはその部分をいい、そして、供給源、生成方法および他の特性に関わらず、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。上記用語としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノ特異的抗体、ポリ特異的抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体およびＣＤＲ移植化抗体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の部分もしくは全体に特異的に結合するかまたは補完的である領域を含む、抗体分子の部分をいう。抗原が大きい場合、抗体は、その抗原の特定部分に結合するのみであり得る。「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的な相互作用を担う抗原分子の部分である。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインからなるいわゆるＦｄ抗体フラグメント）により提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００３１】
用語「抗Ｂ７−Ｈ３抗体」または「Ｂ７−Ｈ３に対する抗体」とは、少なくとも１つのＢ７−Ｈ３形態の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体をいい、これらの抗体としては、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣが挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗Ｂ７−Ｈ３レセプター抗体」および「Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体」とは、Ｂ７−Ｈ３に対するレセプターの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体をいう。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｂ７−Ｈ３」とは、そうでないと言及されなければ、Ｂ７−Ｈ３の任意および全ての形態をいい、これらとしては、ＶＣおよびＶＣＶＣが挙げられるが、これらに限定されない。用語「Ｂ７−Ｈ３因子」とは、Ｂ７−Ｈ３の生物学的活性を調節可能な任意の化合物をいう。用語「調節」およびその同義語は、Ｂ７−Ｈ３の生物学的活性（例えば、Ｂ７−Ｈ３レセプターを発現するリンパ球に対して、天然に発現されるＢ７−Ｈ３により発揮される効力と関連する活性）の減少または増加をいう。生物学的活性の減少または増加は、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多い。このような減少を引き起こすＢ７−Ｈ３因子は、「アンタゴニスト」と呼ばれ、他方、このような増加を引き起こすＢ７−Ｈ３因子は、「アゴニスト」と呼ばれる。Ｂ７−Ｈ３のアンタゴニストが、Ｂ７−Ｈ３レセプターを発現するリンパ球に対して、天然に発現されるＢ７−Ｈ３により発揮される「負の共刺激シグナル」を妨げるのに対し、アゴニストは、このような「負の共刺激シグナル」を増強することが、理解される。従って、Ｂ７−Ｈ３のアンタゴニストは、一般的に、（例えば、細胞増殖および／またはサイトカイン分泌により測定されるように）リンパ球活性化の上昇を引き起こすのに対し、Ｂ７−Ｈ３のアゴニストは、一般的に、リンパ球活性化の減少を引き起こす。
【００３３】
用語「生物学的活性」とは、生物学的な系において、分子により実現される、機能または一連の機能（またはその機能が寄与する効力）をいい、インビボであってもインビトロであってもよい。生物学的活性は、例えば、リンパ球増殖、生存および機能（例えば、サイトカイン分泌）、細胞膜分化マーカーの発現、転写、翻訳もしくは翻訳後レベルの遺伝子発現に対する効力または自己抗体産生に対する効力などによってアッセイされ得る。
【００３４】
用語「共刺激」およびその同義語は、リンパ球活性化を可能にするための応答リンパ球および「補助」細胞（例えば、Ｔ細胞活性化の場合には抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＢ細胞活性化にはヘルパーＴ細胞）上での細胞表面分子のレセプター／リガンド対の間のシグナル伝達事象をいう。用語「負の共刺激」、「負の共刺激シグナル」、「阻害シグナル」、「負の共刺激活性」およびそれらの同義語は、このようなシグナルの非存在下に対して、リンパ球活性化を阻害するシグナル伝達事象をいう。活性化Ｔ細胞が、ヘルパー細胞（すなわち、ＣＤ４＋）、細胞傷害性またはサプレッサ細胞（すなわち、ＣＤ８＋）であり得ることが理解される。負の共刺激活性は、標準の技術を用いて測定され得、そして、実施例に記載されるように限定されない。特に、ここで開示されるＢ７−Ｈ３因子は、リンパ球活性化を阻害し、（ａ）細胞増殖および／または（ｂ）サイトカイン分泌によって測定され得る。
【００３５】
用語「誘導体」、「誘導される」およびそれらの同義語は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関して使用される場合、元の配列の全てもしくは部分と同一であるかまたは実質的に同一である配列をいい、そして、例えば、アミノ酸またはヌクレオチドの置換、欠失もしくは付加、または他の改変によって、その元の配列から実際に得られ得る。
【００３６】
用語「規定される条件下でのハイブリダイゼーション」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件をいい、その条件下で、互いに対して有意に同一または相同性であるヌクレオチド配列は、互いに結合したままである。上記条件は、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド以上の長さであり、かつ少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも８５〜９０％同一である配列が、互いに結合したままであるようなものである。パーセント同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２に記載されるように決定され得る。低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーおよび高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、後続の節において提供される。
【００３７】
用語「免疫学的障害」とは、免疫応答が異常である障害および状態をいう。上記異常応答は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）の異常な増殖、成熟、生存、分化または機能に起因し得る。このような障害としては、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病）、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、過剰増殖性免疫障害および免疫抑制障害が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本開示は、Ｂ７−Ｈ３因子（例えば、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態またはＢ７−Ｈ３に対する抗体もしくはそのレセプターに対する抗体）を含有する組成物を含む方法を提供する。
【００３８】
用語「単離された」とは、その天然の環境から実質的に離れている分子をいう。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来する細胞供給源由来もしくは組織供給源由来の細胞物質または他のタンパク質から、実質的に離れている。用語「単離された」とはまた、単離されたタンパク質が、薬学的組成物として投与されるために充分に純粋であるか、または少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは、少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは、９０〜９５％純粋；そして、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物をいう。本明細書中で使用される場合、用語「単離された」とはまた、実質的にエンドトキシンを含まない（すなわち、エンドトキシンレベルが、５００、３００、２００、１００、５０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１ＥＵ／ｍｌ未満または検出可能レベル未満である）調製物をいう。
【００３９】
用語「哺乳動物」とは、分類された任意の動物（例えば、ヒトを含む）をいう。
【００４０】
用語「一次刺激シグナル（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌ）」とは、免疫応答に特異性を与えるリンパ球に送達される刺激シグナルをいい、そして抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の認識の際に抗原特異的レセプター（Ｔ細胞上のＴｃＲおよび細胞上のＢｃＲ）により媒介される。
【００４１】
用語「処置」、「治療方法」およびそれらの同義語は、治療処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ／ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置を必要としているものとしては、特定の医学的障害を既に有している個体およびその障害の危険がある個体（すなわち、最終的にはその障害を獲得しそうな個体）が挙げられ得る。治療方法は、症状の予防もしくは改善、またはそうでなければ所望される生物学的結果をもたらし、そして、臨床的な徴候（例えば、実施例に記載されるようなＰＡＳＩ）の改善、疾患の発症の遅延、リンパ球および／または抗体の減少／増大されたレベルなどにより評価され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「治療化合物」および「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」とは、障害の臨床的な発現を改善可能であるかまたは所望される生物学的結果を生成するための、任意の化合物をいう。
【００４３】
用語「治療有効用量」および「治療有効量」とは、患者における症状の予防もしくは改善、または所望される生物学的結果（例えば、臨床的な徴候の改善（例えば、実施例に記載されるようなＰＡＳＩ）、疾患の発症の遅延、リンパ球および／または抗体の減少／増大されたレベルなど）をもたらす化合物の量をいう。上記有効量は、後続の節において記載されるように決定され得る。
【００４４】
用語「特異的に結合する」およびその同義語は、２つの分子が、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。特異的な結合は、高い親和性および低い容量から中程度までの容量により特徴付けられる。非特異的な結合は、通常、中程度から高い容量とともに低い親和性を有する。代表的に、上記結合は、上記親和性定数Ｋａが、１０６Ｍ−１より高いか、または好ましくは、１０８Ｍ−１より高い場合に特異的であると考えられる。必要な場合、非特異的な結合は、結合条件を変化させることによって、特異的な結合に実質的に影響を与えることなく減少され得る。このような条件は、当該分野で公知であり、そして、慣用的な技術を用いる当業者は、適切な条件を選択し得る。上記条件は、通常、タンパク質濃度、その溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、非関連分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して規定される。
【００４５】
熟語「実質的に同一」とは、関連するアミノ酸配列が、所与の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であることを意味する。例として、このような配列は、種々の種由来の改変体であり得るか、またはそれらは、トランケーション、欠失、アミノ酸の置換もしくは付加による所与の配列から誘導され得る。２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、標準的な配列アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３のアルゴリズム；Ｍｅｙｅｒｓら（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７のアルゴリズム；またはＴａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０など）により決定される。このようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよび「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」プログラムに組み込まれている（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照のこと）。このようなプログラムを利用する場合、デフォルトパラメータが使用され得る。例えば、ヌクレオチド配列に対しては、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」プログラムに対して以下の設定が使用され得る：プログラム ＢＬＡＳＴＮ、マッチに対する獲点（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ） ２、ミスマッチに対するペナルティ（ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ）−２、オープンギャップペナルティ（ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）およびエクステンションギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ） それぞれ、５および２、ギャップｘ＿ドロップオフ（ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ） ５０、予測（ｅｘｐｅｃｔ） １０、文字サイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ） １１、フィルタ（ｆｉｌｔｅｒ） オン。アミノ酸配列に対しては、以下の設定が、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」に対して使用され得る：プログラム ＢＬＡＳＴＰ、マトリックス（ｍａｔｒｉｘ） ＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップペナルティおよびエクステンションギャップペナルティ それぞれ、１１および１、ギャップｘ＿ドロップオフ ５０、予測 １０、文字サイズ ３、フィルタ オン。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をいい、そして、適切な場合は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）をいう。上記用語はまた、ヌクレオチドアナログ、および一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含むことが理解されるべきである。ポリヌクレオチドの例としては、プラスミドＤＮＡまたはそのフラグメント、ウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「プラスミドＤＮＡ」とは、環状である二本鎖ＤＮＡをいう。本明細書中で使用される場合、「アンチセンス」とは、配列相補性に起因してｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域の一部に対してハイブリダイズし、それにより、そのｍＲＮＡからの翻訳を干渉し得る核酸をいう。用語「ｓｉＲＮＡ」および「ＲＮＡｉ」とは、ｍＲＮＡの分解を誘導する能力を有し、それにより、遺伝子発現を「サイレンシングする」、二本鎖ＲＮＡである核酸をいう。代表的に、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長（例えば、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長または３０ヌクレオチド長）である。
【００４７】
用語「Ｖドメイン」（単数または複数）とは、特に述べられなければ、起源の種に関わらず、Ｂ７−Ｈ３のタンパク質またはゲノム配列における第１のＩｇ様定常ドメイン（Ｖ１）および／または第２のＩｇ様ドメイン（Ｖ２）（例えば、配列番号１５を含む任意の配列およびそれをコードするヌクレオチド配列）をいう。同様に、用語「Ｃドメイン」（単数または複数）とは、特に述べられなければ、起源の種に関わらず、Ｂ７−Ｈ３のタンパク質またはゲノム配列における第１のＩｇ様定常ドメイン（Ｃ１）および／または第２のＩｇ様定常ドメイン（Ｃ２）（例えば、配列番号１５を含む任意の配列およびそれをコードするヌクレオチド配列）をいう。文脈がそうではないことを要求しなければ、ＶドメインおよびＣドメインとの言及は、タンパク質ドメイン、それらのための核酸配列およびそのコード配列に対応する偽エキソン（ｐｓｅｕｄｏ−ｅｘｏｎ）配列（例えば、齧歯動物ゲノム配列のＣΨおよびＶΨ）を包含することが理解されるべきである。
【００４８】
（２．Ｂ７−Ｈ３因子）
１つの局面において、本発明は、免疫応答の調節におけるＢ７−Ｈ３因子の使用に関する。本発明は、部分的に、Ｂ７−Ｈ３のＶＣＶＣ形態が、複数の組織にわたって観察されるＢ７−Ｈ３転写物の大部分を占め、他方、Ｂ７−Ｈ３のＶＣ形態は、少量の転写物でしかないという発見および実証に基づく。本発明は、部分的に、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの両方の形態が、Ｂ７−Ｈ３存在下での増殖の減少およびＴ細胞によるサイトカイン分泌の減少により証拠付けられるように、Ｔ細胞活性化に対して阻害効果を示すという発見および実証にさらに基づく。本発明は、部分的に、進化学的選択の純化を現在経験しているＢ７−Ｈ３遺伝子内の特定領域の発見になおさらに基づく。
【００４９】
マウス、ヒト、サルおよびハムスターのゲノムのＶエキソンの一部は、Ａｌｉｇｎ ｍｏｄｕｌｅ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０のＣｌｕｓｔａｌＷを用いて配列決定されている。９ヌクレオチド以上の配列が１００％の配列同一性を示す領域を、最も高度に保存されたヌクレオチド部位として選択した。これらの１１個の保存された領域は、配列番号１５に示される。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明の方法において使用される組成物は、天然に存在するＢ７−Ｈ３の生物学的活性に拮抗するかまたは作用するＢ７−Ｈ３因子を含有する。いくつかの実施形態において、上記Ｂ７−Ｈ３因子は、タンパク質性である（すなわち、上記Ｂ７−Ｈ３因子は、ペプチド結合により結合されたアミノ酸を含む）。タンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子としては、Ｂ７−Ｈ３（Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体およびＢ７−Ｈ３レセプターに対する抗体を含む）の可溶性形態が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、本発明の方法において使用される組成物は、非タンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子（例えば、核酸、低分子インヒビターなど）を含有する。特に、ここで開示されるＢ７−Ｈ３因子は、以下：（ａ）リンパ球増殖：および（ｂ）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））分泌のうちの１つ以上により測定される場合、リンパ球活性化を調節する。いくつかの実施形態において、Ｂ７−Ｈ３因子は、そのＢ７−Ｈ３因子が治療的な使用のために適切であるようにする、薬物動態学的特性（例えば、充分に長い循環半減期および／またはタンパク分解性の分解からの良好な保護）を有する。
【００５１】
（２．１ 抗体）
本発明の方法において使用される抗体は、２つの群（（１）Ｂ７−Ｈ３に対する抗体および（２）Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体）に分類される。種々の実施形態において、本発明の方法において使用される抗体は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３レセプター；（ｃ）Ｂ７−Ｈ３中のＶドメイン；（ｄ）Ｂ７−Ｈ３中のＣドメイン；および（ｅ）配列番号１５、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号７を含むポリペプチドのうちの少なくとも１つに、特異的に結合する。このような抗体は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合し、それにより、Ｂ７−Ｈ３とそのレセプターとの相互作用を遮断するか；（ｂ）Ｂ７−Ｈ３レセプターに特異的に結合し、それにより、Ｂ７−Ｈ３とのその相互作用を遮断するか；または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を実施し得る。所望される効力に依存して、上記抗体は、後続の節に記載されるように、免疫応答を（Ｂ７−Ｈ３生物学的活性のアンタゴニストとして）促進するかまたは（Ｂ７−Ｈ３生物学的活性のアゴニストとして）阻害するかのいずれかのために、いずれかの形態で使用され得る。
【００５２】
抗体は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９９）、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）または抗体ライブラリを用いるファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２；５８１−５９７）によって作製され得る。種々の他の抗体生成技術については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；およびＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編，１９９５を参照のこと。ヒトへの投与のために、抗体は、完全にヒトまたはヒト化であり得る。特定の実施形態において、抗体は、後続の節において記載されるように、変化または改変されたＦｃ領域を有し得る。
【００５３】
（２．２ Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態）
本発明の方法は、リンパ球活性化を阻害するＢ７−Ｈ３の可溶性形態の使用を含む。いくつかの実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、全長より短いＢ７−Ｈ３を含み、かつＢ７−Ｈ３の膜貫通ドメインも細胞内ドメインも含まない。このような可溶性形態はまた、シグナル配列も含まなくてもよい。例示のためのみに、かつ限定することなく、図１Ａに示されるように、ヒトおよびマウスのＢ７−Ｈ３におけるこれらのドメインが示され得る。
【００５４】
特定の実施形態において、可溶性形態は、配列番号１５または配列番号７のようなアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＶドメイン、そして、必要に応じて、Ｂ７−Ｈ３の少なくとも１つのＣドメインを含む。可溶性形態は、少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのＶドメイン、および必要に応じて、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＣドメインを含み得る。
【００５５】
さらなる実施形態において、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列および（ｂ）抗体の定常領域由来の第２のアミノ酸配列を含み得る。上記第１のアミノ酸配列は、Ｂ７−Ｈ３細胞外ドメインの全てまたは部分に由来し、そして、（ａ）Ｂ７−Ｈ３の天然に存在する形態がそのレセプターへ結合するのを競合的に阻害し、そして／または（ｂ）負の共刺激活性を有する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、配列番号１５において示されるような配列を含む。特定の実施形態において、上記第１のアミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸２３〜２４４もしくは配列番号１２のアミノ酸２３〜４６２と、同一であるかまたは実質的に同一である。例示的実施形態において、上記Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態は、配列番号１２または配列番号１４におけるような配列を含む。
【００５７】
上記第２のアミノ酸配列は、抗体の定常領域（例えば、Ｆｃ領域）に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記第２のアミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ領域に由来する。関連する実施形態において、上記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または別のＩｇＧアイソタイプであるＩｇＧに由来する。非限定的実施形態において、上記第２の配列は、マウスＩｇＧ２ａｍに由来する。
【００５８】
特定の実施形態において、上記第２のアミノ酸配列は、リンカー配列によって結合されるかまたは結合されずに、上記第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合する。上記リンカー配列の正確な長さおよび配列、ならびに結合される配列に対するその配向は、変化し得る。上記リンカーは、例えば、１つ以上のＧｌｙ−Ｓｅｒを含み得る。上記リンカーは、少なくとも２アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長であり得、そして、所望される特性（例えば、溶解度、長さ、立体化学的分離、免疫原性など）に基づいて選択される。
【００５９】
（２．３ タンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子の誘導体）
タンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子（Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体およびＢ７−Ｈ３レセプターに対する抗体を含む）の誘導体は、置換、付加および／もしくは欠失／トランケーションによりそれらのアミノ酸配列を変化させるか、または機能的な等価体もしくは分子をもたらす化学的な改変を導入することによって、作製され得る。任意のタンパク質の配列における特定のアミノ酸が、そのタンパク質の活性に有害に作用することなく、他のアミノ酸に置換され得ることが、当業者により理解される。
【００６０】
それらの生物学的活性、機能または有用性を認識可能なほどに損うことなく、本発明のタンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子のアミノ酸配列またはそれらをコードするＤＮＡ配列において、種々の変化が作製され得る。このような誘導体の使用は、本発明の範囲内である。具体的な実施形態において、上記誘導体は、機能的に活性である（すなわち、（例えば、配列番号２、配列番号４または配列番号６に示されるような）天然に存在するＢ７−Ｈ３の細胞外ドメインに関連する、１つ以上の活性を示し得る）。上記配列内でのアミノ酸の代わりは、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る（表１を参照のこと）。さらに、種々のアミノ酸が、一般的に、中性アミノ酸（例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン）に置換される（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎら（１９９８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら（１９９８）Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４を参照のこと）。
【００６１】
【表１】
【００６２】
Ｂ７−Ｈ３因子は、他のタンパク質および薬学的因子に、化学的に接続されるかまたは結合され得る。このような改変は、結果としてもたらされる組成物の薬物動態および／または生体分布を変化させるために設計され得る。本発明のＢ７−Ｈ３−Ｉｇおよび抗体はまた、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に述べられるような様式で、グリコシル化され得るか、ＰＥＧ化され得るかまたは別の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）に連結され得る。上記Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇおよび抗体は、ポリマーへの共有結合により化学的に改変されて、例えば、それらの循環半減期を上昇させ得る。例示的なポリマーおよびそれらをペプチドに結合するための方法はまた、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号に示される。
【００６３】
抗体のＦｃ部分を含むＢ７−Ｈ３因子（例えば、Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体）または本発明の方法において使用される抗体は、そのＦｃ領域中でさらに改変されて、エフェクター機能を最小限に抑え得る。このような改変としては、Ｆｃレセプターへの結合を変化させる特定のアミノ酸残基の変化（Ｌｕｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６：３１９−３２４）、またはその定常領域が由来する種の変化が挙げられる。抗体およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体は、重鎖のＣＨ２領域中にエフェクター機能（すなわち、Ｆｃレセプター結合および補体活性化）を低下させる変異を有し得る。例えば、抗体およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体は、変異（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号に記載される変異）を有し得る。上記ＩｇＧ１重鎖またはＩｇＧ２重鎖において、例えば、このような変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長配列中のアミノ酸２３４およびアミノ酸２３７に対応するアミノ酸残基で行われ得る。抗体およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ融合体はまた、免疫グロブリンの２つの重鎖の間のジスルフィド結合を安定化する変異（例えば、Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１０５−１０８に開示されるような、ＩｇＧ４のヒンジ領域の変異）を有し得る。
【００６４】
特定の実施形態において、他のタンパク質由来のアミノ酸配列に対する本発明のＢ７−Ｈ３−Ｉｇのうちのいずれかのさらなる融合が、本発明の方法における使用のために構築され得る。所望され得る融合配列は、Ｂ７−Ｈ３の生物学的活性とは異なる生物学的活性を有するタンパク質（例えば、サイトカイン、増殖因子および分化因子、酵素、ホルモン、他のレセプター成分など）に由来し得る。
【００６５】
上記Ｂ７−Ｈ３因子（タンパク質性および非タンパク質性）はまた、検出可能標識または機能的標識を用いてタグ化され得る。検出可能標識としては、放射標識（例えば、１３１Ｉまたは９９Ｔｃ）が挙げられ、これらの放射標識は、従来の化学を用いて結合され得る。検出可能標識としては、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）および検出可能部分（例えば、ビオチンまたはアビジン）がさらに挙げられる。
【００６６】
誘導体は、当該分野において周知の種々の技術（組み換え法および合成法を含む）により生成され得る（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＢｏｄａｎｓｋｙら（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００６７】
（２．４ 核酸）
本開示はまた、核酸またはこのような核酸によりコードされるポリペプチドの治療的な使用および非治療的な使用を含む方法を提供し、ここで、このような核酸のヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５のヌクレオチド配列またはその部分；および（ｂ）少なくとも６０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長または１４０ヌクレオチド長であり、かつ規定される条件下で、（ａ）の核酸に対してこれらにハイブリダイズする核酸から選択され、ここで、この核酸は、負の共刺激活性を有する発現産物をコードする。
【００６８】
特定の実施形態において、このような核酸は、配列番号１５におけるようなアミノ酸配列をコードする。例示的な実施形態において、上記核酸は、実質的に、配列番号１１または配列番号１３におけるような配列を含む。他の実施形態において、このような核酸としては、それが、少なくとも１つの同義置換を有する（すなわち、その置換を有するコドンは、配列番号１１または配列番号１３におけるのと同じであるかまたは機能的に等価なアミノ酸残基をコードする）という点で、配列番号１１または配列番号１３とは異なるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００６９】
１つの実施形態において、規定される条件は、低いストリンジェンシーの条件である。別の実施形態において、規定される条件は、中程度のストリンジェンシーの条件である。さらに別の実施形態において、規定される条件は、高いストリンジェンシーの条件である。
【００７０】
適切なハイブリダイゼーション条件が、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２節，４節および６節において例示されるように、当業者により容易に選択され得る。さらに、ストリンジェント条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，７章，９章および１１章に記載される。規定される低いストリンジェンシーの条件の非限定的例は、以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルタを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＰＶＰ、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、１％ ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、６時間、４０℃で前処理する。ハイブリダイゼーションを、以下の改変を有する同じ溶液中で実施する：０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ） デキストラン硫酸および５×１０６〜２０×１０６ ３２Ｐ標識されたプローブを使用する。フィルタを、ハイブリダイゼーション混合物中で、１８時間〜２０時間、４０℃でインキュベートし、そして、次いで、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中で、１．５時間、５５℃で洗浄する。この洗浄溶液を、新鮮な溶液に置き換え、そして、さらに１．５時間、６０℃でインキュベートする。フィルタを、ブロット乾燥し、そして、オートラジオグラフィーに曝す。当該分野で周知の低いストリンジェンシーの他の条件が、（例えば、種間（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーションのために用いられるように）使用され得る。
【００７１】
規定される中程度のストリンジェンシーの条件の非限定的例は、以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で、７時間から一晩、５０℃で実施する。フィルタを、１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび５×１０６〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識されたプローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で、１８時間〜３６時間、５０℃でハイブリダイズする。フィルタの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶＰ、０．０１％ Ｆｉｃｏｌｌおよび０．０１％ ＢＳＡを含有する溶液中で、３７℃で１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ中で、５０℃で４５分間洗浄する。当該分野において周知の中程度のストリンジェンシーの他の条件が、使用され得る。
【００７２】
規定される高いストリンジェンシーの条件の非限定的例は、以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で、８時間から一晩、６５℃で実施する。フィルタを、１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび５×１０６〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識されたプローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で、４８時間、６５℃でハイブリダイズする。フィルタの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ ＰＶＰ、０．０１％ Ｆｉｃｏｌｌおよび０．０１％ ＢＳＡを含有する溶液中で、３７℃で１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ中で、５０℃で４５分間洗浄する。当該分野において周知の高いストリンジェンシーの他の条件が、使用され得る。
【００７３】
Ｂ７−Ｈ３因子は、実質的に純粋な形態または均質な形態で、あるいは、核酸の場合には、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子起源を含まずにまたは実質的に含まずに、それらの天然の環境から得られ得、単離され得、そして／または精製され得る。種々の異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニング系および発現系は、周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、ならびに酵母系およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当該分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞などが挙げられる。一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。例えば、Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇを生成するために適切な他の細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。
【００７４】
適切なベクターが、選択されても構築されてもよく、これらのベクターは、必要に応じて、適切な調節配列（プロモーター配列、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む）を含む。ベクターは、必要に応じて、プラスミドまたはウイルス性（例えば、ファージ）であってもファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの公知の技術およびプロトコールが、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００７５】
核酸は、さらなるポリペプチド配列をコードする他の配列（例えば、マーカーまたはレポーターとして機能する配列）に融合され得る。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の例としては、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性を担う）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコードする）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）および当該分野で公知の他の多くが挙げられる。
【００７６】
本発明の方法はまた、免疫応答を増強するために、Ｂ７−Ｈ３の発現を減少させるための短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を包含する。ｓｉＲＮＡは、Ｈａｎｎｏｎ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４−２５１；ＭｃＭａｎｕｓら（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，３：７３７−７４７；Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４；Ｓｔｅｉｎ（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０８：６４１−６４４；およびＺａｍｏｒｅ（２００１）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，８（９）：７４６−７５０に記載されるような標準的な技術を用いて生成され得る。アンチセンス核酸は、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第１版，Ｃｒｏｏｋｅ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，２００１に記載されるような標準的な技術を用いて生成され得る。
【００７７】
（３．使用方法）
（３．１ 免疫応答の調節方法）
開示されるＢ７−Ｈ３因子は、それらの使用方法に依存して、天然に発現されるＢ７−Ｈ３のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得る。上記Ｂ７−Ｈ３因子は、哺乳動物における（例えば、ヒトにおける）医学的障害を予防、診断または処置するために使用され得る。Ｂ７−Ｈ３因子のインビトロ適用は、例えば、免疫細胞の機能に対する研究、または、例えば、他のＢ７−Ｈ３因子の生物学的活性を試験するための研究のいずれかにおける使用のための活性化リンパ球の調製において、有用であり得る。このような方法は、実施例に詳述されている。
【００７８】
１つの局面において、本発明は、免疫応答の調節におけるＢ７−Ｈ３およびそのアゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。本発明の方法は、リンパ球活性化を調節（すなわち、共刺激または阻害）するために、リンパ球（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）とＢ７−Ｈ３因子とを接触させる工程を包含する。特に、ここで開示されるＢ７−Ｈ３因子は、以下：（ａ）リンパ球増殖；（ｂ）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））分泌のうちの１つ以上により測定される場合、リンパ球活性化を調節する。上記方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボで実施され得る。
【００７９】
上記接触させる工程は、上記リンパ球の活性化前、活性化の間または活性化後に生じ得る。Ｔ細胞活性化は、例えば、（例えば、抗ＣＤ３抗体を用いて；米国特許第６，４０５，６９６号および同第５，３１６，７６３号）そのＴ細胞を、ＴｃＲに結合する抗体またはＴＣＲに物理的に関連するＣＤ３複合体のポリぺプチドのうちの１つに曝すことによって、生じられ得る。あるいは、上記Ｔ細胞は、同種抗原（例えば、ＭＨＣ同種抗原）（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球またはＢ細胞）上で）または抗原性ペプチドのいずれかに曝され得、この抗原性ペプチドは、上記ＡＰＣのいずれかによるタンパク質抗原のプロセシングにより生成され、かつそのＡＰＣの表面上のＭＨＣ分子によって、上記Ｔ細胞に対して提示される。上記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であってもＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。上記Ｂ７−Ｈ３因子は、上記細胞を含む溶液に添加され得るか、または、それは、ＡＰＣ（例えば、ＭＨＣ分子に結合される同種抗原または抗原ペプチドを提示するＡＰＣ）の表面に発現され得る。
【００８０】
さらに、Ｂ７−Ｈ３因子は、障害の危険があるかもしくは障害に対して感受性である被験体、または異常なＢ７−Ｈ３の発現もしくは機能に関連する障害を有する被験体を処置するために使用され得る。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、リンパ球活性化の阻害を必要としている被験体を同定する工程、およびその被験体にＢ７−Ｈ３アゴニストを投与する工程を包含する。他の実施形態において、上記方法は、リンパ球活性化の促進を必要としている被験体を同定する工程、およびその被験体にＢ７−Ｈ３アンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００８１】
免疫応答の減少が所望される場合、Ｂ７−Ｈ３因子は、Ｂ７−Ｈ３に関連する免疫応答の減少を促進するために、Ｂ７−Ｈ３のアゴニストとして使用され得る。例えば、Ｂ７−Ｈ３因子は、特定の抗原（例えば、治療用タンパク質）に対する耐性の誘導のために、本発明の方法において使用され得る。１つの実施形態において、抗原とＢ７−Ｈ３因子との同時投与により、特定の抗原に対して耐性が誘導される。例えば、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を受容した患者は、しばしば、このタンパク質に対する抗体を生成し、従って、組み換え第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子と組み合わせた、Ｂ７−Ｈ３アゴニスト（例えば、Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇ、およびＢ７−Ｈ３をコードする核酸またはその機能性フラグメント）の同時投与は、この凝固因子に対する免疫応答のダウンレギュレーションをもたらすと予測される。さらに、例えば、あるタイプのアレルギーまたはアレルギー反応、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病および全身性エリテマトーデス）、組織移植片、皮膚移植片および器官移植片の拒絶反応ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）において、免疫応答レベルの減少が所望され得る。
【００８２】
特定の実施形態において、アゴニスト効果を達成するために、正のシグナル（すなわち、抗原レセプター（例えば、ＴｃＲまたはＢｃＲ）により媒介される）と負のシグナル（すなわち、Ｂ７−Ｈ３）との間の同時提示（ｃｏ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）または結合（すなわち、物理的に近接している）が必要であり得る。これは、支持マトリック上へのＢ７−Ｈ３因子の固定化により達成され得、この支持マトリックスはまた、一次刺激分子（例えば、抗ＣＤ３抗体）を運ぶ。このような場合、好ましい距離は、天然に存在する抗原提示細胞の大きさよりも小さいか、またはそれと匹敵する大きさである（すなわち、１００μｍ未満；より好ましくは、５０μｍ未満；そして最も好ましくは、２０μｍ未満）。あるいは、Ｂ７−Ｈ３因子は、例えば、抗体を介した架橋により、一次刺激分子に結合され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、上記正の（活性化）シグナルおよび上記負の（阻害）シグナルは、固体支持マトリックスまたはキャリアに固定されたリガンドまたは抗体により提供される。種々の実施形態において、上記固体支持マトリックスは、ポリマー（例えば、活性化されたアガロース、デキストラン、セルロース、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ））からなり得る。あるいは、上記固体支持マトリックスは、ケイ素ポリマーまたはプラスチックポリマー（例えば、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン（登録商標）など）に基づき得る。
【００８４】
上記マトリックスは、患者の脾臓に移植され得る。あるいは、上記マトリックスは、患者から得られたＴ細胞のエキソビボインキュベーションのために使用され得、次いで、このＴ細胞は、分離されてその患者に移植して戻される。上記マトリックスはまた、生分解性物質（例えば、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、コラーゲンまたはゼラチン）から作製され得、その結果、それらのマトリックスは、患者の腹膜腔に注射され、そして、注射の後しばらくして溶解する。上記キャリアは、細胞を模倣するように形づくられ得る（例えば、ビーズまたはミクロスフェア）。
【００８５】
特定の環境下では、免疫障害または癌を処置するために、患者の免疫応答を誘発または促進することが所望され得る。上記障害は、本開示方法により処置または予防され、これらの障害としては、微生物（例えば、細菌）、ウイルス（例えば、インフルエンザのような全身性のウイルス感染、ヘルペスまたは帯状ヘルペスのような皮膚疾患、およびＨＩＶ）または寄生生物による感染；ならびに癌（例えば、黒色腫および前立腺癌）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
このような環境において、Ｂ７−Ｈ３因子は、Ｂ７−Ｈ３と関連するダウンレギュレート活性を阻害または減少するために使用され得る。特に、Ｂ７−Ｈ３アンタゴニスト（例えば、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体、ｓｉＲＮＡおよびＢ７−Ｈ３に対するアンチセンス核酸）は、Ｔ細胞活性化の刺激のために使用され得る。種々の実施形態において、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体またはＢ７−Ｈ３レセプターに対する抗体は、１０ｎＭ未満、そしてより好ましくは、５ｎＭ未満、そして最も好ましくは、１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する、Ｂ７−Ｈ３とこのようなレセプターを発現する細胞との結合を阻害する。ＩＣ５０は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて測定され得る。
【００８７】
本発明の組成物は、治療有効量で投与される。一般的に、治療有効量は、被験体の年齢、状態および性別、ならびにその被験体の医学的状態の重症度とともに、変動し得る。治療有効量のタンパク質性Ｂ７−Ｈ３因子は、０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。必要な場合、投与量は、その処置の観察される効力に適合するために調節され得る。上記抗体およびＢ７−Ｈ３の可溶性形態は、ボーラス投与として与えられ得る。連続的な輸液もまた、ボーラス投与後に使用され得る。適切な用量およびレジメンが、処置する医師により臨床的な指標に基づいて選択される。
【００８８】
免疫細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）はまた、患者から単離され得、そして、Ｂ７−Ｈ３因子とともにエキソビボでインキュベートされ得る。例えば、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）は、被験体または適切なドナーから取り出され得、そして、エキソビボで活性化刺激（上を参照のこと）およびＢ７−Ｈ３因子（可溶性形態であるか固体支持体に結合されているかのいずれか）に曝され得る。次いで、活性化Ｔ細胞を含むＰＢＭＣが、同じ被験体または異なる被験体に導入される。あるいは、単離された細胞は、核酸を用いてトランスフェクトされ得、そして、次いで、このようなトランスフェクトされた細胞は、上記被験体に再導入され得る。このような細胞は、好ましくは、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞）であるが、それらの細胞はまた、別の細胞型であり得、これらの細胞型としては、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイトが挙げられるが、これらに限定されない。造血細胞の使用は、このような細胞が、特に、リンパ系組織（例えば、リンパ節または脾臓）に帰ると予測されているという点で、有利であり得る。さらに、ＡＰＣが使用される場合、外因性Ｂ７−Ｈ３を発現するＡＰＣは、関連するＴ細胞に対して同種抗原または抗原性ペプチドを提示するＡＰＣと同じであり得る。上記Ｂ７−Ｈ３因子は、上記ＡＰＣにより分泌され得るか、またはその表面上に発現され得る。組み換えＡＰＣは、上記被験体に戻される前に、必要に応じて、本発明の抗原または抗原性ペプチドの供給源（例えば、腫瘍、感染性微生物または自己抗原の供給源）に曝され得る。
【００８９】
いくつかの実施形態において、Ｂ７−Ｈ３因子は、本発明の組成物を用いる処置に対して感受性の免疫障害を処置または予防するために使用され、このような障害としては、自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、過剰増殖性免疫障害など）、癌、免疫抑制障害および種々の感染性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本開示は、Ｂ７−Ｈ３誘導体（例えば、Ｂ７−Ｈ３の可溶性形態またはＢ７−Ｈ３に対する抗体またはそのレセプターに対する抗体）を含有する組成物に関与する方法を提供する。
【００９０】
（３．２ スクリーニング方法）
Ｂ７−Ｈ３因子はまた、治療薬剤を同定するスクリーニング方法に使用され得る。試験される化合物は、例えば、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体または、小有機分子であり得る。そのようなスクリーニングアッセイにおいて、第１の結合混合物は、Ｂ７−Ｈ３−ＩｇとＢ７−Ｈ３レセプターを発現する細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）とを、組み合わせることにより形成される；および第１結合混合物（Ｍ０）の上記２種の間の結合量が測定される。第２結合混合物もまた、Ｂ７−Ｈ３−Ｉｇと、Ｂ７−Ｈ３レセプターを発現する細胞と試験される薬剤とを組み合わせることにより形成され、そして第２結合混合物（Ｍ１）の結合量が測定される。
【００９１】
第１結合混合物および第２結合混合物の結合量は、例えば、Ｍ１／Ｍ２比を計算することにより比較される。上記試験された化合物は、第１結合混合物と比較して第２結合混合物の結合の減少が観察される場合、免疫応答のＢ７−Ｈ３関連のダウンレギュレーションを調節する能力があると考えられる。結合混合物の処方および最適化は、当該分野の技術レベルの範囲内であり、そのような結合混合物はまた、最適結合を高めるかまたは最適化するのに必要な緩衝液および塩も含み得、そしてさらなるコントロールアッセイが、本発明のスクリーニングアッセイに包含され得る。上記Ｂ７−Ｈ３結合を少なくとも１０％（即ち、Ｍ１／Ｍ２＜０．９）、好ましくは３０％を超えて減少させることがわかっている化合物は、このように同定され得、その後、所望であれば、以下に記載するように他のアッセイまたは動物モデルで障害を改善させる能力に関し、２次的にスクリーニングされ得る。上記結合の強度は、例えば、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、表面プラズモン−ベースの技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）（それらの全ては当該分野で周知の技術である）を用いて測定され得る。
【００９２】
上記試験された化合物は、実施例に記載しているようにインビトロで、または動物モデル（一般的に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｇｅｒｓｈｗｉｎら編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９８１を参照のこと）、例えば、以下のような：ＳＷＲ Ｘ ＮＺＢ（ＳＮＦ１）マウスモデル（Ｕｎｅｒら(１９９８)Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ．Ｄｉｓ．，１１（３）：２３３〜２４０）、ＫＲＮマウス（Ｋ／ＢｘＮ)モデル（Ｊｉら、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、１６９：１３９）；ＮＺＢ Ｘ ＮＺＷ（Ｂ／Ｗ）マウス、ＳＬＥのモデル（Ｒｉｅｍｅｋａｓｔｅｎら、（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、４４（１０）：２４３５〜２４４５）；マウス実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症のモデル（Ｔｕｏｈｙら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１：１１２６〜１１３０、Ｓｏｂｅｌら（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：２３９３〜２４０１およびＴｒａｕｇｏｔｔ（１９８９）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１９：１１４〜１２９）；ＮＯＤマウス糖尿病モデル（Ｂａｘｔｅｒら、（１９９１）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、９（１）：６１〜６７）など）でさらに試験され得る。
【００９３】
例えば、動物試験により決定された予備的用量およびヒトへの投薬量の倍率決定は、当該分野で受容されている慣例に従って達成される。毒性および治療効力は細胞培養または実験動物、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的効果のある用量）を決定する、標準的な薬学的な手続により決定され得る。毒性と治療効果間の用量の比は治療指標であり、そしてそれは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。大きな治療指標を示す組成物は好ましい。
【００９４】
上記治療的に有効な用量は、初期に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養アッセイまたは動物モデルで決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大半減阻害を達成する治療剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルで処方され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーまたはＥＬＩＳＡにより、測定され得る。任意の特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイによりモニターされ得る。投薬量の例としては、０．１×ＩＣ５０、０．５×ＩＣ５０、１×ＩＣ５０、５×ＩＣ５０、１０×ＩＣ５０、５０×ＩＣ５０および１００×ＩＣ５０である。
【００９５】
上記細胞培養アッセイまたは動物研究から得られるデータは、ヒトの用途の範囲の投薬量を処方するのに使用され得る。１種の動物モデルで達成された治療的に有効な投薬量は、ヒトを含む別の種の動物に使用されるのに、当該分野で公知の変換因子を用いて、変換され得る（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、５０（４）：２１９〜２４４および等価体表面積投薬因子の表２を参照のこと）。
【００９６】
【表２】
【００９７】
（４．薬学的組成物、投与方法および投薬量）
本開示は、Ｂ７−Ｈ３因子を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的な用途および患者への投与に適切であり得る。上記組成物は、典型的には１種以上の本発明の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。上記成句「薬学的に受容可能な賦形剤」は、薬学的投与に適合する如何なるおよび全ての溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。上記組成物はまた、補完的な、付加的なまたは高められた治療的機能を提供する他の活性化合物を含み得る。上記薬学的組成物はまた、投与に関する説明書を有する容器、包装または分配器に含まれ得る。
【００９８】
本発明の薬学的組成物は、意図された投与経路に適合するように処方される。投与を達成する方法は、当業者に公知である。上記投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、膣内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、皮下または経皮であり得る。また、局所的もしくは経口的に投与されるか、または、粘膜を経由して透過することができる組成物を得ることができる。
【００９９】
皮内もしくは皮下適用に用いられる溶液剤もしくは懸濁剤としては、典型的には１種以上の以下の成分：注射用の水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶剤のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗細菌剤；アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸、クエン酸もしくはリン酸のような緩衝液；および塩化ナトリウムもしくはブドウ糖のような張度を調整する薬剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸または苛性ソーダなどの酸または塩基で調整され得る。そのような調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器もしくは多用量のバイアルビンに封入され得る。
【０１００】
注射に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液もしくは滅菌分散剤、および滅菌注射可能な溶液もしくは分散液の即時調合調製物のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水もしくはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合、上記組成物は、滅菌され、容易に注射可能な程度に流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきで、細菌および真菌のような微生物の汚染作用が起こらないよう保存されなければいけない。微生物の上記作用の予防は、種々の抗細菌剤または抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールおよび塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましい。上記キャリアとしては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散剤およびそれらの適切な混合物であり得る。上記適切な流体は、例えばレシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合は必要とされる粒子サイズの維持のより、および／または界面活性剤の使用により、維持され得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延する薬剤を組成物の中に含むことにより達成され得る。
【０１０１】
経口組成物は、一般に不活性な希釈剤または可食性のキャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入され得、または錠剤に打錠され得る。経口投与のために、上記抗体は賦形剤と併用され得るし、かつ錠剤、トローチ剤またはカプセル剤としても使用され得る。薬学的に適合する結合剤および／または薬学的に適合するアジュバント物質は、上記組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、類似する性質の以下の如何なる成分または化合物；微結晶性セルロース、ガム、トラガカントもしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料のような矯味矯臭薬をも、含み得る。
【０１０２】
全身投与はまた、経粘膜または経皮的手段であり得る。経粘膜または経皮投与のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤が、処方物に用いられる。そのような浸透剤は、一般に、当該分野で公知であり、例えば表面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えばロゼンジ、鼻スプレー、吸入器または坐薬の使用を通じて達成され得る。例えば、抗体およびＦｃ部分を含むＩｇ融合タンパク質の場合、組成物は、腸管、口もしくは肺の粘膜を通って透過することができ得る（例えば、米国特許番号第６，０３０．６１３号に記載されているようにＦｃＲｎレセプター媒介経路を経由して）。経皮投与のために、上記活性化合物は、当該分野で一般に公知のように、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤またはクリーム剤に処方され得る。吸入による投与のために、上記抗体は、例えば二酸化炭素のような適切な噴霧剤を含有する加圧容器もしくは加圧ディスペンサーからのエアゾールスプレーまたはネブライザーの形態で送達され得る。
【０１０３】
特定の実施形態では、本明細書で開示されたＢ７−Ｈ３薬剤は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、徐放処方物のような、身体からの早い消失に対する化合物を保護するキャリアを用いて調製される。エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生物適合性ポリマーは、使用され得る。そのような処方物の調製方法は、当業者には明らかである。本明細書で開示する抗体を含有するリポソーム懸濁剤もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許番号４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１０４】
投与の容易なおよび投薬量の均一な投薬単位形態での経口または非経口組成物を処方することは、有利であり得る。本明細書で用いられる用語「投薬単位形態」は、処置される被験体に対して単位投薬量として適切な、物理的な個々の単位をいう；各単位は、所望の治療効果を実現するために計算された所定量の活性化合物を、必要な薬学的キャリアと共に含有する。
【０１０５】
本発明の組成物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的効果のある用量）を決定するための細胞培養または動物実験のような標準的な薬学的な手順により決定され得る。毒性と治療効果間の用量の比は治療指標であり、そしてそれは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。大きな治療指標を示す組成物は好ましい。
【０１０６】
本発明で使用される任意の組成物のために、治療的有効用量は、初期に細胞培養アッセイで推定され得る。適切なバイオアッセイの例としては、ＤＮＡ複製アッセイ、サイトカイン送達アッセイ、転写を基礎にしたアッセイ、結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化を基礎にしたアッセイ、脂肪細胞におけるグルコース取込みを基礎にしたアッセイ、免疫学的アッセイ、例えば、実施例に記載の他のアッセイが挙げられる。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒト用途の範囲の投薬量を処方するのに用いられ得る。用量は、細胞培養または動物モデルで決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大半減阻害を達成する治療剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルで処方され得る。血漿中の循環レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより、測定され得る。特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイでモニターされ得る。上記投薬量は、好ましくは、毒性が殆どないまたは毒性が無い循環濃度の範囲内に入っていることである。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路により変わり得る。
【０１０７】
以下の実施例は、本発明の範囲を決して限定するものではない。当業者は、本発明の精神および範囲を変えることなく実施され得る多くの改変および変化を認識するであろう。そのような改変および変化は、本発明の範囲内に包含される。本出願のいたるところで引用している全ての参考文献、特許および公開特許出願の全内容は、本明細書で参考として援用している。
【実施例】
【０１０８】
（実施例１：Ｂ７−Ｈ３のゲノムＤＮＡの単離）
Ｂ７−Ｈ３ ＲＴ−ＰＣＲを、ヒトＢ７−Ｈ３の開始メチオニンおよび停止コドン（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ３０２１０２）を含む領域に対応するオリゴヌクレオチドを用いて、以下のＰＣＲ条件で実施した。
【０１０９】
この研究で用いたＰＣＲ酵素としては、製造業者のプロトコールに従った酵素、ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、およびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。必要な場合、反応条件を、強い増幅のために、最終濃度１Ｍ ベタインおよび３％ＤＭＳＯになるよう、補充した。ａｔｔＢ１／Ｋｏｚａｋを埋め込んだプライマーＰＷ２６４（配列番号２３）およびａｔｔＢ２部位を埋め込んだプライマーＰＷ２６５（配列番号２４）を、脾臓、リンパ節、心臓、肝臓、膵臓および胎盤の第１ｃＤＮＡ鎖をテンプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）として、ヒトＢ７−Ｈ３をコードする配列を増幅するのに用いた。現存のデータベースの記載項目（Ｃｅｌｅｒａ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ、Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に表されている配列に対応するヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣコード領域配列を得た：特にＡＸ３５７９６０、ＡＸ０９７５５０、ＡＸ０４７０７２、ＡＸ０９７５５６、およびＡＸ１３６３６３。ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ形態を、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ Ｃ１〜Ｖ２ドメインの欠失により、ＮＭ＿０２５２４０のコード配列に合わせて構築した。ＰＷ２７０（配列番号２６）およびＰＷ２７１（配列番号２７）を、マウス胚子の第１ｃＤＮＡ鎖からのマウスＢ７−Ｈ３の配列を増幅するのに用いた。９５１ｂｐのサイズのＰＣＲ産物をサブクローンし、全ての分析したクローンには、いかなる擬エキソン配列を包含しない、１００％の正確さを有する真正な７つの予測されたエキソンの正確なスプライシングをはっきりと明らかにした。マウスＢ７−Ｈ３をコードする配列は、現存のデータベース記載事項ＢＣ０１９４３６、ＡＸ３７０３１２、およびＮＭ＿１３３９８３に対応する。プライマーＰＷ２８４（配列番号２９）およびＰＷ２６７（配列番号２５）を、ｃＤＮＡパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ（６９０ｂｐ）およびＶＣＶＣ（１３４４ｂｐ）転写の相対的な寄与を、半定量的に評価するのに用いた。ＺｅｔａｐｒｏｂｅＴＭ ＧＴ メンブレン（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上に、ＤＮＡをアルカリ転写し、そして３２Ｐ末端ラベルしたＰＷ２７８（配列番号２８）を、検出オリゴヌクレオチドとして用いてハイブリダイズしてサザンブロットを行なった（Ｌｉｎｇら、（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：７３００〜７３０８）。
【０１１０】
サルおよびハムスターのゲノムＤＮＡをＣＯＳ細胞株およびＣＨＯ細胞株から単離した（Ｌｉｎｇら、（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６０：３４１〜３５５）。ゲノムＰＣＲをＰＷ３５８（配列番号３０）およびプライマーＰＷ３５９（配列番号３１）をヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３配列で保存されている、ヌクレオチドを基礎にしたプライマーとして実施した（配列番号６のアミノ酸６０〜６６、２１６〜２２１、および２７８〜２８４、４３４〜４３９）。増幅反応を、二重に行い、そして多重のサブクローン化産物を配列決定により分析した。サルゲノムＤＮＡ内のＶ−イントロン−Ｃドメインの配向を、ＰＷ３８１（配列番号３３）およびＰＷ３８４（配列番号３４）を用いて、そしてハムスターのゲノムＤＮＡ内のＶ−イントロン−Ｃドメインの配向を、ＰＷ３５８（配列番号３０）およびＰＷ３７８（配列番号３２）を用いてＰＣＲにより決定した。
【０１１１】
ＤＮＡ分析を、以下のように行なった。１アリコート（０．２５〜０．５μｇ）のプラスミドＤＮＡを、１μｌの５μＭのプライマーおよび３μｌの２倍希釈ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭＢｉｇＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ミックス（バージョン３）と組み合わせた。その容量を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、１０μｌに調整し、そして増幅反応をＰＴＣ−２２５サイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で、２５サイクル（９６℃１０秒、５０℃５秒および６０℃４分）行なった。１０μｌの水を上記反応物に加え、過剰の染料を、９６ウェルのＧ−５０ビーズ入りのＭｉｌｌｉｐｏｒｅろ過プレートでゲルろ過により除去した。サンプルを９０〜９５℃で２分間、加熱変性し、製造業者推奨の条件下で、ＡＢＩ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で、電気泳動を行なった。ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒＴＭ ４．１（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、手作業の配列編集を行なった。
【０１１２】
主要な増幅産物の配列決定は、Ｂ７−Ｈ３と異なり、他のＥＳＴおよび特許データベース記載事項と一致する１６０５ｂｐの配列という結果となった。Ｂ７−Ｈ３は、単一のＶドメインおよびＣドメイン（Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ形態）を含有するが、変種クローンは、重複するＶドメインおよびＣドメイン（Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ形態）を含有した。これらのクローンが、Ｂ７−Ｈ３に非依存性の遺伝子産物であるか否かを決定するために、ＶＣＶＣクローンのゲノム構成をヒトゲノムデータベースクエリー（Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により分析した。得られた一致は、染色体１５のゲノム軸ＧＡ＿ｘ２ＨＴＢＬ４ＳＳＴＰ−０４に対応する。これは、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの変種の両方に関して、単一の遺伝子起源を示唆している。図１Ｂは、ヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３遺伝子座の遺伝子構成を示す。集合体は、Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム軸ＧＡ＿ｘ２ＨＴＢＬ４ＳＳＴＰおよびＣｅｌｅｒａマウスゲノム軸ＧＡ＿ｘ５Ｊ８Ｂ７Ｗ７ＮＭ９の選択された部分を基礎にしている。棒状の印は、Ａｌｕ複合体反復およびＳＶＡ複合体反復、単純反復、転写エキソン構造ならびにドメイン名の相対的位置を表している。上記Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのゲノム構成は、リーダードメイン、Ｖ１ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｖ２ドメイン、Ｃ２ドメイン、膜貫通ドメインおよび三つの細胞質ドメインをコードする９個のエキソンを明らかにしている。約１３．５ｋｂのゲノム配列が、ヒトＢ７−Ｈ３座のエキソン１の開始メチオニンを、エキソン９の停止コドンから分離した。ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣのＢ７−Ｈ３座に対するエキソン描写は、エキソン２（Ｖ１）からエキソン５（Ｃ２）までの代替的スプライシングを表しており、この遺伝子産物からのＣ１ドメインおよびＶ２ドメインの欠失を生じた。
【０１１３】
配列分析、アラインメントおよび分子進化系統樹の作製を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩＴＭ バージョン７．１（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ、Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＡｌｉｇｎ ｍｏｄｕｌｅ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ）を用いて実行した。霊長類の配列の配列アラインメントおよび系統図分析は、種間Ｖ−イントロン−ｃＤＮＡ配列よりも種内Ｖ−イントロン−ｃＤＮＡ配列のより大きな程度の配列類似性、即ち、ヒトＶ１−イントロン−Ｃ１が、サルＶ−イントロン−Ｃより、ヒトＶ２−イントロン−Ｃ２により類似していることをあきらかにした。実際に、分析されたサルのＣドメイン配列間で、１００％の同一性が観察された。種内クラスタリングは、複製されたエキソンよりも、より高い配列保存が観察される非コード化種内ＶＣイントロン配列のアラインメントにより、さらに支持されている（９７％ 対 ９４％）。保存ヌクレオチドが、４種の全てのイントロン配列に見出されたが、非保存ヌクレオチド対が、齧歯類および霊長類間で排他的に共有されている（データを示していない）ことが見出された。このことは、霊長類および齧歯類伝来の共通の「予備複製された」霊長類ＶＣＶＣ分子について相反している。ヒトＢ７−Ｈ３ Ｖ−イントロン−Ｃドメインのフランキング配列は、そのような配列保存がなく、それは、霊長類における複製が突然変異から非常に近いか、または上記Ｖ−イントロン−Ｃ領域が、突然変異から極度に保護されていることを示唆している。このように、これらのデータは、ヒトおよびサルの種内タンデムＶＣリピートの多重独立性発生のモデルを強く支持する。
【０１１４】
（実施例２．Ｂ７−Ｈ３スプライス変種間の相対的転写寄与）
種々のヒト組織サンプルについてＲＴ−ＰＣＲを行ない、引き続き放射標識したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションを行なった（図２Ａ）。二つの不明瞭なバンドが検出され、一方は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ増幅産物の予測されたサイズと一致する１３４４ｂｐに対応する相対的移動度で移動した。ＶＣ増幅産物の予測されたサイズと一致する６９０ｂｐに対応する微量なバンドもまた、検出された。３つのｃＤＮＡパネルのＲＴ−ＰＣＲは、増幅産物が検出されなかった白血球／ＰＢＬを除いては、試験したいずれの組織にも、このパターンを示した。ハイブリダイズした領域のリン画像定量化は、１２．７：１（脳）と９２．１：１（腎臓）の間の比を示した。いずれの場合にも、より小さいＢ７−Ｈ３ ＶＣ産物へのハイブリダイゼーションンシグナルが、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ産物で見られたシグナルより大きいということはなかった。もし増幅反応が小さい増幅産物に有利だとすると、より小さいＢ７−Ｈ３ ＶＣの存在度を上回るより大きいＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの相対的存在度は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣが、ヒト組織で自然に発現するヒトＢ７−Ｈ３遺伝子産物の主要な転写種であることを示唆している。上記Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ形態の希少性は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ産物（Ｃｈａｐｏｖａｌら、（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：２６９〜２７４）が主要な産物であることを最確的に示している、以前に報告されたノーザンブロットの中で観察された単一の４．１ｋｂのＢ７−Ｈ３バンドと一致する。比較のために、マウスＢ７−Ｈ３のＰＣＲ−サザンブロットは、予測された９５１ｂｐの増幅産物と一致する、約１ｋｂの主要なバンドで調べた全ての組織における発現を示す（図２Ｂ）。他のＢ７−Ｈ３ハイブリダイゼーションシグナルもまた、マウス胎児、心臓および骨格筋組織において検出した。霊長類とは異なり、齧歯類の配列は、推定Ｃ１およびＶ２エキソンのコドン変性に起因して、単一のＶＣ形態のみしか有さない。
【０１１５】
以下に示すように、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ形態およびＶＣＶＣ形態は、インビトロで類似した生物学的活性を有し、これは、上記タンデムに重複したエキソンが、細胞ベースのアッセイで機能的に等価であることを示唆する。そのような機能的な冗長性は、生理学的に有害な効果なしでＣ１〜Ｖ２のエキソンの損失耐性を説明し得る。
【０１１６】
（実施例３．マウスおよびヒトＢ７−Ｈ３の比較ゲノム分析）
ＶＣドメイン断片の重複が、Ｂ７ファミリーのタンパク質の中で、Ｂ７−Ｈ３に特異的であるらしいと仮定して、本発明者らは、次にＢ７−Ｈ３の上記配列が、コドンベース置換を基礎にした他の共刺激リガンドの配列と異なるか否かについて試験した。分子進化の速度を決定する一つの方法は、コドン内の同義部位と非同義部位間との予測される突然変異速度の測定による。齧歯類 対 霊長類のさらなる配列比較を他の公知のリガンド（Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＧＬ５０、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）のＶエキソンおよびＣエキソンに関して行なった。これらのリガンドは、ＶドメインおよびＣドメインが、各分子の細胞外の部分に存在する構造的類似性を共有する。これらの不同性の分子の間の共有構造部分の存在は、これらの分子がＶ配列およびＣ配列を有する祖先配列に由来するという概念を広めてきた。マウスとヒトとの間のＶドメインおよびＣドメインの分岐の相対的速度を決定するために、同義コドンおよび非同義コドンにおけるヌクレオチド置換の相対的頻度を決定した。同義突然変異および非同義突然変異の頻度の計算を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ ＧＣＧ１０．０ Ｄｉｖｅｒｇｅ ｍｏｄｕｌｅ（ＧＣＧ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて実行した。Ｂ７−Ｈ３アラインメントに関して、ヒトＶ１ドメインおよびＣ２ドメインに対応するエキソンは、マウスＶドメインおよびＣドメインと整列化した。調べた全てのＶドメインおよびＣドメインの中で、同義置換 対 非同義突然変異の比は、Ｂ７−Ｈ３のＶドメイン以外は、１より小さかった。上記Ｂ７−Ｈ３分子は、全てのＶドメインの中で最も低いレベル（一部位当りｄＳ＝０．１２９置換）の同義突然変異であり、一方、同時にまた、全てのＣドメインの中で最も低いレベルの非同義突然変異（一部位当りｄＮ＝０．０２６置換）であった。結果として、上記Ｂ７−Ｈ３分子は、共刺激リガンドの中で、Ｖドメインで最も高いｄＮ：ｄＳ比を有し、一方、同時にＣドメインで最も低いｄＮ：ｄＳ比を有する点において異なる。ヒトＶ２ドメインとマウスＶドメインとの間の交差ドメイン分岐比較は、ｄＳ＝０．４３３およびｄＮ＝０．０３７を示し、一方、ヒトＣ１ドメインとマウスＣドメインとではｄＳ＝０．３９３およびｄＮ＝０．０３４を示した。ヒトＶ１とマウスＶとの間で見られる、ヒトＶ２およびマウスＶより低い同義突然変異率は、ヒトＶ１ドメインおよびマウスＶドメインはオルソログであることを意味する。配列進化の線形機序を仮定すると、同一分子の隣接するエキソン間での異なるヌクレオチド置換率は、Ｂ７−Ｈ３のＶドメインとＣドメインとの間で異なる選択プロセスが起こることを示している。
【０１１７】
分子進化の数学的モデルを基礎にして、特定のコード配列に関して同義置換率が、非同義置換率より多い場合は、選択の純正化を反映している。選択の純正化は、生理的な抑制が、遺伝子産物のアミノ酸変化のレベルを制限する時に起こる。選択の純正化は、試験された全てのＢ７ファミリーのＶドメインおよびＣドメインでは、Ｂ７−Ｈ３ Ｖ１ドメインを除いて、明らかである。Ｂ７−Ｈ３ Ｖ１に関して、ｄＳは、Ｂ７−２ ＶのｄＳの半分、かつＰＤ−Ｌ１ ＶのｄＳのおよそ８分の１である。Ｂ７−Ｈ３ Ｖ１ｄＮは低いが、１．１８のｄＮ：ｄＳ比でＢ７−Ｈ３ ＶｄＳのｄＮをまだ上回る。ｄＮ：ｄＳ比が１より大きい場合は、異常であり、早く進化する機能の明確な選択を受けている配列に起因する。Ｂ７−Ｈ３ Ｃ２エキソンは、試験された全てのエキソンの中で最も低い値の０．０６３のｄＮ：ｄＳ比を示し、他の試験された他のＣドメインに見られるレベルの５分の１から１５分の１であることは、注目すべきである。従って、Ｂ７−Ｈ３を含むエキソンは、他の共刺激リガンドに対して異なる様式で容易に積極的に維持された／される。
【０１１８】
（実施例４．Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＶＣＶＣはＴ細胞活性化をダウンレギュレートする）
齧歯類Ｂ７−Ｈ３で観察される上記単一ＶＣ単位を基礎にして、本発明者らは、ヒトで見られるＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびＶＣＶＣ形態が、細胞ベースのアッセイで類似の機能を有するか否かについて決定しようとした。Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのＴ細胞活性化をダウンレギュレートする能力を、増殖およびサイトカイン産生レベルの両方で観察した。この実験を以下のように行なった。
【０１１９】
ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣまたはＶＣＶＣ構築物のエントリーベクターを、ＩＲＥＳ−ＧＦＰをコードする二重シストロンレトロウイルスベクターにクローニングした。受容先のレトロウイルスベクターは、もともとＧＦＰ−ＲＶベクター（Ｒａｎｇａｎａｔｈ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：３８２２〜３８２６）由来であって、ａｔｔＢ１−ｃｃｄＢ−ａｔｔＢ２カセット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧａｔｅｗａｙ組換え用に改変した。ウイルス含有上清を産生し、以前に記載されているように（Ｃａｒｔｅｒら、（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：６３４〜６４３）、ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞を感染するのに用いた。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣをＧＦＰ発現を基礎にして細胞ソーティングにより選択した。同様のＧＦＰレベルを発現しているＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２トランスフェクト体を、細胞アッセイのコントロールとして用いた。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７．１およびＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７．２の産生は、以前に記載されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、６（２）：２１１〜２１４）。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２トランスフェクト体を室温で４分間０．２％パラホルムアルデヒド中で固定し、固定反応を、１Ｍリジン中、室温で４分間クエンチした。細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、培養媒体（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ）に再懸濁し、Ｔ細胞増殖アッセイの抗原提示細胞として用いた。
【０１２０】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、以前に記載（Ｂｌａｉｒら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：１２〜１５）されているように末梢リンパ球から、負の選択により精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）を平底９６ウェルプレート中、可溶性抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ、ＵＣＨＴ１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および種々の濃度の可溶性抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、パラホルムアルデヒド固定したＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲトランスフェクト体（１．２５×１０４細胞／ウェル）と一緒に培養した。増殖を、７２時間のインキュベーション期間のうち最後の５〜１２時間、１ウェルあたり１Ｃｉ[３Ｈ]−チミジンで培養物をパルスすることにより決定した。サイトカイン産生を測定するために、上清を７２時間で収集し、サンプルを多重ＥＬＩＳＡスクリーニング（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｏｓｔｏｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）でアッセイした。
【０１２１】
Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ形態およびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ形態の機能的活性を決定するために、以下の細胞ベースのアッセイを行なった。精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、パラホルムアルデヒド処理したＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲトランスフェクト体で、一定量の可溶性抗ＣＤ３抗体および増加する濃度の可溶性抗ＣＤ２８抗体の存在下で刺激した。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２−ＧＦＰトランスフェクト体の存在下で、抗ＣＤ３で精製Ｔ細胞を活性化すると、増殖は起こらなかった；増殖レベルは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で昂進した（図３Ａ〜３Ｂ）；ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２．Ｂ７−１もしくはＢ７−２の存在下で、抗ＣＤ３抗体でＴ細胞を刺激すると、ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２−ＧＦＰコントロール細胞で得られるレベル（図３Ａ）より上の増殖が起こった。可溶性抗ＣＤ２８抗体は、ＧＦＰコントロールを昂進したが、Ｂ７−１およびＢ７−２の応答を昂進しなかった。反対に、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣまたはＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣの存在下でのＴ細胞の刺激は、低下した増殖応答をもたらした（図３Ｂ）。抗ＣＤ３（１ｇ／ｍｌ）および低い共刺激（５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体）で、サイトカイン産生は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ刺激時に有意に減少した。ＩＬ−１０（約８１％）レベル、ＴＮＦ−α（約６９％）レベル、ＩＦＮ−γ（約８５％）レベル、およびＧＭ−ＣＳＦ（約６５％）レベルは、ＧＦＰコントロールと比較して、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣまたはＶＣＶＣのいずれかの培養物で刺激した培養物中で、劇的に減少した（図４）。これらのアッセイ条件では、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１３が、無視し得る量しか検出されなかった。これらの結果は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣも、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣも、共刺激分子として機能するのではないことを示し、かつＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ細胞表面分子が活性化の負のレギュレータとして作用するＴ細胞上のレセプターとかかわりあうことを示唆している。２００ｎｇ／ｍｌ程度の高い濃度の抗ＣＤ２８抗体の添加は、増殖に対するＢ７−Ｈ３の阻害効果を部分的にのみ維持できた。
【０１２２】
（実施例５：Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＶＣＶＣは、Ｔ細胞活性化をダウンレギュレートする。）
Ｂ７−Ｈ３機能をさらに特徴づけるために、Ｔ細胞応答のＢ７−Ｈ３ダウンレギュレーションが、ＴＣＲ／Ｂ７−Ｈ３レセプターの協調的かかわりを要求するか否かを決定するため、単一（ＣＩＳ）または別々の（ＴＲＡＮＳ）表面上で実験を行なった。ＣＩＳビーズは、抗ＣＤ３抗体と、精製した融合タンパク質Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ−ＩｇまたはＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ−Ｉｇとを含有するが、一方、ＴＲＡＮＳビーズは、抗ＣＤ３抗体および、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ−ＩｇまたはＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ−Ｉｇとのいずれかを含有した。
【０１２３】
Ｔ細胞のビーズ刺激を以下のように実施した。抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ−Ｉｇ、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ−ＩｇおよびコントロールＩｇを、ポリウレタン被覆ｔｏｓｙｌ活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）に共有結合した。ビーズを一定濃度（１μｇ、総結合タンパク質の２０％）の部分最適化抗ＣＤ３抗体およびＢ７−Ｈ３−ＩｇまたはコントロールＩｇ（４μｇ、総結合タンパク質の８０％（Ｂｅｎｎｅｔｔら、（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０：７１１〜７１８）で調製した。ビーズは、１０７ビーズあたり、５μｇの結合能を有する。ＣＩＳビーズは、同じビーズに抗ＣＤ３およびＢ７−Ｈ３の両方を含有し、ＴＲＡＮＳビーズは、二つのタイプのビーズからなり、一方は、抗ＣＤ３抗体を含有し、他方はＢ７−Ｈ３−Ｉｇを含有する（Ｂｅｎｎｅｔｔら、（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０：７１１〜７１８）。ＣＩＳおよびＴＲＡＮＳ条件下で、等しいビーズ対細胞比を維持するために、コントロールＩｇＧで被覆されたビーズをＣＩＳ培養物に添加した。タンパク質被覆ビーズを、平底９６ウェルマイクロタイタープレートの精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）に１：１の比で添加した。増殖を、７２時間のインキュベーション期間のうちの最後の６〜１６時間に、一ウェルあたり１Ｃｉ［３Ｈ］−チミジンで培養物をパルスして決定した。
【０１２４】
図５に示すように、増殖阻害は、細胞がＣＩＳビーズで活性化された場合にのみ観察された。まとめると、これらの所見は、Ｂ７−Ｈ３レセプターおよびＴＣＲが、Ｔ細胞活性化のダウンレギュレーションのためには、近接している必要があることを示唆している。これらのデータは、Ｂ７−Ｈ３レセプター経路がＴ細胞応答を調節するために、活性化と阻害の両方のシグナルが同じ細胞から生じなければならないことを示唆している。
【０１２５】
上清中のサイトカインの量を、多重ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて、７２時間で測定した：ＴＮＦ−α（図６Ａ）、ＩＦＮ−γ（図６Ｂ）およびＧＭ−ＣＳＦ（図６Ｃ）。Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのＴ細胞活性化をダウンレギュレーションする能力を、サイトカイン産生レベルで評価した。抗ＣＤ３（１ｇ／ｍｌ）および低い共刺激（５ｎｇ／ｍｌ 抗ＣＤ２８抗体）で、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ刺激の際に、サイトカイン産生は有意に減少した（図６Ａ〜６Ｃ）。ＩＬ−１０（約８１％）レベル、ＴＮＦ−α（約６９％）レベル、ＩＦＮ−γ（約８５％）レベル、およびＧＭ−ＣＳＦ（約６５％）レベルは、ＧＦＰコントロールに対して、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣまたはＶＣＶＣ培養物のいずれかで刺激した培養物中で、劇的に減少した。これらのアッセイ条件では、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６および１Ｌ−１３を無視しうる量でしか検出しなかった。これらの所見は、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣも、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣのいずれも共刺激分子としては機能しないことを示しており、かつＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ細胞表面分子が活性化の負のレギュレータとして作用するＴ細胞上のレセプターと係わり合いを持つことを示唆している。
【０１２６】
結果は、Ｔ細胞のＴＣＲ／Ｂ７Ｈ３（ＶＣまたはＶＣＶＣ）活性化がＴ細胞応答のダウンレギュレーションをもたらすことを示している。増殖およびサイトカイン産生は、ＴＣＲ単独で活性化された細胞に対して、ＴＣＲ／Ｂ７−Ｈ３活性化Ｔ細胞において減少する。このデータは、Ｔ細胞上のＢ７−Ｈ３レセプターの係わり合いが負のシグナルを送達することを示唆している。結果はまた、ＴＣＲおよびＢ７−Ｈ３レセプター間の物理的近接が、Ｂ７−Ｈ３レセプター経由のＴ細胞活性化を、ダウンレギュレートするために要求され得ることを示唆する。
【０１２７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化をダウンレギュレートするＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびＶＣＶＣの能力は、Ｂ７タンパク質のいずれかによる、ＣＴＬＡ４の係わり合いにより産生される負のシグナルまたはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１タンパク質およびＰＤＬ２タンパク質のいずれかによるＰＤ−１の係わり合いにより産生される負のシグナルを示唆している。さらに、固体マトリックスに結合したＢ７−Ｈ３での実験は、ＴＣＲおよびＢ７−Ｈ３レセプターシグナルの両方が同じ細胞により送達されることを示している。同様な要件が、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１のいずれかによる負のシグナル伝達に関して記載されている（Ｇｒｉｆｆｉｎら、（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４：４４３３；およびＢｅｎｎｅｔｔら、（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０：７１１〜７１８）。最終的に、ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣおよびヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ分子の両方が、ＣＤ４ Ｔ細胞応答を調節する能力において重複しているようにみえる。
【０１２８】
（実施例６：乾癬患者における治療有効性）
Ｂ７−Ｈ３により制御される免疫応答の調節は、免疫抑制効果または免疫応答の増強が所望される場合に有用である。Ｂ７−Ｈ３アゴニスト（例えばＢ７−Ｈ３の可溶性形態）は、異常に昂進した免疫応答（例えば、自己免疫障害におけるように、自己抗原に応答することが挙げられる）を含む疾患または状態の重症度および／または症状を、予防または減少させるのに使用され得る。Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストは、一方、例えば癌または免疫抑制障害で起こり得る望ましくない低い免疫応答を有する被験体に投与され得る。
【０１２９】
乾癬は、典型的なＴ細胞媒介性自己免疫疾患であると考えられている。乾癬は、部分的には、活性化された損傷性Ｔ細胞（Ｔｈ１非対称）に産生されるＩＦＮ−γを通して媒介される慢性炎症性皮膚疾患である。
【０１３０】
最も一般的には、可溶性タンパク質が、外来患者に投与され、これは、ゆっくりとした静脈内（ＩＶ）注入で、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ用量での週一回の投与に設定される。アンタゴニストの適切な治療有効用量は、処置する臨床医により選択され、およそ１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇおよび５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１３１】
皮膚Ｔ細胞に対する効果を評価するために、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体、Ｂ７−Ｈ３レセプターに対する抗体またはＢ７−Ｈ３−Ｉｇを、正規化した疾患重症度（最小ＰＡＳＩ（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）スコア１２）を有する乾癬患者のランダマイズした群に対して、１２週間連続投与した。長期にわたって患者の臨床改善を評価し治療に対する彼等の応答をモニターするために、上記ＰＡＳＩスコアシステムが使用され得る（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎら、（１９７８）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、１５７：２３８〜２４４；およびＭａｒｋｓら、（１９８９）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８９；１２５：２３５〜２４０）。
【０１３２】
要約すれば、ＰＡＳＩスコアの要素は、以下を含む：（１）体表面積（ＢＳＡ）の％としての患部領域；（２）患部領域の程度（スケール１〜１０）；および（３）乾癬変化の程度（紅斑、浸潤、剥離）スケール０〜４）。ＰＡＳＩスコアは以下のように計算する：（（０．１×（紅斑頭部）＋（浸潤頭部）＋（剥離頭部））×（患部頭部の程度））＋（（０．２×（「紅斑体幹部）＋（浸潤体幹部）＋（剥離体幹部））×（患部体幹部の程度））＋（（０．３×（紅斑上部先端）＋（浸潤上部先端）＋（剥離上部先端）×（患部上部先端の程度））＋（（０．４×（紅斑下部先端）＋（浸潤下部先端）＋（剥離下部先端）×（患部下部先端））。最小スコアは０であり、最高スコアが７２である。ＰＡＳＩスコアの減少は効果的処置を暗示している。上記処置を受けた個体の少なくとも５０％がＰＡＳＩスコアの減少および彼等の状態に改善を示すことが理解される。
【０１３３】
本明細書は、本明細書に参考として援用される本明細書で引用される参考文献の教示する観点に照らし、徹底的に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の例証的な実施形態を提供するが、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者は、容易に多くの他の実施形態が本発明により包含されることを容易に認識する。本開示の中の引用された全ての刊行物および特許ならびに登録番号またはデータベース参照番号により同定された配列は、その全体が参考として援用される。参考として援用された物質が、本明細書と矛盾または一致しない範囲まで、本明細書は、如何なるそのような物質にもとってかわる。本明細書中の如何なる参考文献の引用も、そのような参考文献が本発明の先行技術であると承認するものではない。
【０１３４】
他に示さない限り、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される、成分、細胞培養物、処置条件などの量を表現している全ての数値は、全ての例において、用語「約」により改変され得ると理解されるべきである。従って、そうではないと他に示さない限り、数値パラメータは近似であり、本発明で得られるよう求められる所望の性質に大きく依存する。他に示されない限り、一連の要素の前にたつ用語「少なくとも」は、一連の全ての要素に言及していることが理解されるべきである。当業者は、本明細書で記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、単なる慣用実験を用いて認識し、または確認することができる。そのような等価物は以下の特許請求の範囲により包含されていると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトとマウスとのＢ７−Ｈ３配列の比較を示す。推定翻訳ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣ遺伝子産物、推定翻訳ヒトＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ遺伝子産物および推定翻訳マウスＢ７−Ｈ３遺伝子産物の配列アラインメント。配列アラインメントの上の黒線は、ゲノム配列により区別されたエキソンドメインを示す。ペプチド配列の下の矢印は、交差種増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーにおいて使用される、対応する核酸位置を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトおよびマウスのＢ７−Ｈ３遺伝子座のゲノム構成を示す。構成部分は、Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム軸ＧＡ＿ｘ２ＨＴＢＬ４ＳＳＴＰおよびＣｅｌｅｒａマウスゲノム軸ＧＡ＿ｘ５Ｊ８Ｂ７Ｗ７ＮＭ９の選択された部分に基づく。バーは、Ａｌｕ複合体反復およびＳＶＡ複合体繰反復の相対位置、単純反復（ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｐｅａｔ）の相対位置、転写物のエキソン構造およびドメイン名を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトサンプルに対するＢ７−Ｈ３ ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。第１鎖ヒトｃＤＮＡの３つの別々の群を、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣ配列およびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣ配列の両方に共通のＰＣＲプライマーを用いて増幅し、そして、Ｖ１ドメインに対するオリゴヌクレオチドを用いて検出した。増幅産物の予測される大きさは、示されるとおりである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウスサンプルに対するＢ７−Ｈ３ ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。成体ｃＤＮＡおよび胎仔ｃＤＮＡからなるマウス群を、Ｂ７−Ｈ３転写物の存在について分析した。約１ｋｂのバンドの主な特異的ハイブリダイゼーションは、マウスＢ７−Ｈ３の単一ＶＣ形態の存在と一致する。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、活性化Ｔ細胞の増殖により測定される場合のＢ７の共刺激効果を実証する。Ｔ細胞のＢ７−Ｈ３活性化は、増幅およびサイトカイン産生の減少をもたらす。図３Ａが、ＧＦＰを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞、Ｂ７−１を発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞、Ｂ７−２を発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞についての増殖アッセイの結果を示すのに対し、図３Ｂは、ＧＦＰを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞またはＢ７−Ｈ３ ＶＣを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞についての増殖アッセイの結果を示す。ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２トランスフェクト体（１．２５×１０４細胞／ウェル）を、可溶性抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）および力価測定された濃度の抗ＣＤ２８抗体の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）とともにインキュベートした。増殖を、７２時間目に測定した。抗ＣＤ３非存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞添加ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２トランスフェクト体の応答は、３００ＣＰＭより下であった。
【図４】図４は、活性化Ｔ細胞によるサイトカイン産生に対するＢ７−Ｈ３の阻害効果を実証する。ＧＦＰを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞またはＢ７−Ｈ３ ＶＣを発現するＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２細胞（１．２５×１０４細胞／ウェル）を、可溶性抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）および力価測定された濃度の抗ＣＤ２８抗体（０．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞／ウェル）とともにインキュベートした。抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８抗体（０．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２ ＧＦＰ、ＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２ Ｂ７−Ｈ３ ＶＣＶＣまたはＣＨＯ．ＨＬＡ−ＤＲ２ Ｂ７−Ｈ３ ＶＣのうちのいずれかにより刺激されたＴ細胞培養物から、上清を収集した。サイトカイン産生を、多重ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて、７２時間目に測定した。
【図５】図５は、細胞増殖阻害により測定される場合、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣが、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に負のシグナルを送達することを実証する。精製されたＣＤ４＋細胞（１０５細胞／ウェル）を、ＣＩＳミクロスフェアまたはＴＲＡＮＳミクロスフェアにおける抗ＣＤ３抗体（１μｇ／１０７ミクロスフェア）およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ（ＶＣＶＣまたはＶＣ；４μｇ／１０７ミクロスフェア）を用いて活性化した。ＣＩＳミクロスフェアを、４μｇ／１０７ミクロスフェアで、抗ＣＤ３（１μｇ／１０７ミクロスフェア）およびＢ７−Ｈ３（ＶＣＶＣまたはＶＣ）の両方によりコーティングした。ＴＲＡＮＳミクロスフェアは、２つのタイプのミクロスフェア：（ａ）抗ＣＤ３抗体（１μｇ／１０７ミクロスフェア）によりコーティングされたミクロスフェアと、（ｂ）Ｂ７−Ｈ３（ＶＣＶＣまたはＶＣ）によりコーティングされたミクロスフェアとの混合物からなっていた。等しいミクロスフェア対細胞比を維持するために、コントロールのマウスＩｇでコーティングされたミクロスフェアを添加して、５μｇ／１０７ビーズの総タンパク質濃度を達成した。増殖を、７２時間目に測定した。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、サイトカイン分泌阻害により測定される場合、Ｂ７−Ｈ３ ＶＣおよびＢ７−Ｈ３ ＶＣＶＣが、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に負のシグナルを送達することを実証する。精製されたＣＤ４＋細胞（１０５細胞／ウェル）を、ＣＩＳミクロスフェアまたはＴＲＡＮＳミクロスフェア上にある、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／１０７ミクロスフェア）およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ（ＶＣＶＣまたはＶＣ；４μｇ／１０７ミクロスフェア）を用いて活性化した。ＣＩＳミクロスフェアを、４μｇ／１０７ミクロスフェアにて、抗ＣＤ３（１μｇ／１０７ミクロスフェア）およびＢ７−Ｈ３−Ｉｇ（ＶＣＶＣまたはＶＣ）の両方によりコーティングした。ＴＲＡＮＳミクロスフェアは、２つのタイプのミクロスフェア：（ａ）抗ＣＤ３抗体（１μｇ／１０７ミクロスフェア）によりコーティングされたミクロスフェアと、（ｂ）Ｂ７−Ｈ３（ＶＣＶＣまたはＶＣ）によりコーティングされたミクロスフェアとの混合物からなっていた。等しいミクロスフェア対細胞比を維持するために、コントロールのマウスＩｇでコーティングされたミクロスフェアを添加して、５μｇ／１０７ビーズの総タンパク質濃度を達成した。この上清中のサイトカイン量を、多重ＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて７２時間目に測定した：ＴＮＦ−α（図６Ａ）、ＩＦＮ−γ（図６Ｂ）およびＧＭ−ＣＳＦ（図６Ｃ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球の活性化を阻害する方法であって、該方法は、該リンパ球とＢ７−Ｈ３アゴニストとを接触させる工程、および該アゴニストが、該リンパ球の活性化を阻害することを可能にする工程を包含する、方法。
【請求項１】
リンパ球の活性化を阻害する方法であって、該方法は、該リンパ球とＢ７−Ｈ３アゴニストとを接触させる工程、および該アゴニストが、該リンパ球の活性化を阻害することを可能にする工程を包含する、方法。
【図１Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ａ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ａ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【公開番号】特開２００７−１９１４８９（Ｐ２００７−１９１４８９Ａ）
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９５１０８（Ｐ２００７−９５１０８）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【分割の表示】特願２００６−５１０１１８（Ｐ２００６−５１０１１８）の分割
【原出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【出願人】（５０２１６１７０４）ワイス (51)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【分割の表示】特願２００６−５１０１１８（Ｐ２００６−５１０１１８）の分割
【原出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【出願人】（５０２１６１７０４）ワイス (51)
【Ｆターム（参考）】
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