免疫賦活能を有する酵母、及び、食品又は飼料
【課題】安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能であり、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率の高い酵母、及び、この酵母を含有する食品又は飼料を提供すること。
【解決手段】細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、対糖収率が７５質量％以上であり、ゲノム数が２倍体以上であることを特徴とする酵母である。前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０のいずれかが好ましい。
【解決手段】細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、対糖収率が７５質量％以上であり、ゲノム数が２倍体以上であることを特徴とする酵母である。前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０のいずれかが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができる酵母、及び、これを含有する食品又は飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫とは、外部から侵入したウイルスや細菌、癌細胞などによる生体への攻撃から、生体が自己を防御する機構である。免疫には、多くの種類の細胞が関与しているが、中でもマクロファージは、全動物種に普遍的に存在しており、免疫応答の特に初期段階での働きを含めてあらゆる段階に関与することから、その重要性が認識されている。
免疫が低下すると、癌、感染症、アレルギー症状などの各種疾患が誘発されることが知られている。一方、免疫が賦活されると、発癌抑制、制癌作用、抗感染症、抗アレルギー作用、更には体調リズムの回復・恒常性維持など様々な効果が期待できる。
【０００３】
そこで、消費者の健康状態を改善することを目的として、免疫賦活作用を有する様々な化合物や微生物が提供されている。例えば、ラクトフェリンの加水分解物を用いるもの（特許文献１参照）、キチン（特許文献２参照）、トレハロース（特許文献３参照）、フコイダン（特許文献４参照）などの糖質を用いるもの、植物由来物質を用いるもの（特許文献５参照）、ペプチド（特許文献６参照）やインターロイキン（特許文献７参照）を用いるもの、核酸を用いるもの（特許文献８参照）、グルタチオン（特許文献９参照）、アミノ酸（特許文献１０参照）、ポリリジン（特許文献１１参照）を用いるもの、腸内細菌（特許文献１２参照）、乳酸菌（特許文献１３参照）、エンテロコッカス属細菌（特許文献１４参照）などの微生物を用いるもの、などが挙げられる。
また、近年では、βグルカンの免疫賦活効果が注目されており、例えば、酵母あるいはキノコ類からβグルカンを精製し、前記βグルカンを用いた免疫賦活方法が提案されている（特許文献１５〜１６参照）。
【０００４】
しかしながら、前記免疫賦活作用を有する化合物を用いて、消費者の免疫を賦活させるためには、その化合物を大量に精製して投与しなければならず、多くの作業工程、労力、及び費用を要する。また、前記免疫賦活作用を有する微生物の中には、性状が明らかではないものがあり、食品用途に適さないものがある。また、前記免疫賦活能を有する微生物は、その微生物自身が食品の製造（発酵など）に直接利用できない場合には、食品に免疫賦活能を付与するために、食品に対して別途添加する必要があった。
【０００５】
ここで、酵母の染色体上の遺伝子のうち、ＭＣＤ４遺伝子、ＧＡＳ１遺伝子、及びＣＷＨ４１遺伝子からなる群のうち、１つ又は２つ以上の遺伝子が破壊された結果、免疫賦活能を有している酵母が開示されている（特許文献１７参照）。前記特許文献１７に開示される酵母によれば、前記特許文献１５、及び１６に記載の技術のように、酵母から特にβグルカンを精製することなく、酵母をそのまま投与した場合であっても、免疫を賦活させることができる。
【０００６】
しかしながら、前記特許文献１７に開示される酵母は、遺伝子組換え技術により、前記特定の遺伝子が破壊されている。近年、遺伝子組換え技術の発達に伴い、安全性が確認された上で数多くの遺伝子組換え食品が認可乃至販売されているが、消費者から見れば、遺伝子組換えされた食物の安全性に対する不安感は依然として高い。したがって、現時点では、前記特許文献１７に開示される酵母を食用として用いることは、実用上難しい。
更に、特許文献１７に開示される酵母は、細胞壁の構造に関わる遺伝子が欠損していることから予期されるように、浸透圧が低い培地では極めて増殖が遅いことが明らかとなった。したがって、前記酵母の培養には、構造が脆くなった細胞壁に負荷を与えないように、例えば、糖を培地中に添加して培地の浸透圧を上げて、培地と酵母の細胞膜内の溶液との浸透圧を等張にしなければならず、培養コストが高くなるなどの問題があった。また、前記酵母を、例えば、パンなどの食品の発酵に用いる場合には、発酵条件が制限されたり、発酵液を等張にするために糖を添加したときに食品の風味が変化してしまったりするなどの問題があった。
【０００７】
一方、突然変異誘発法は、例えば、突然変異誘発剤、紫外線照射、放射線照射などの突然変異誘発要因により、自然変異に比べて高い頻度でＤＮＡに変異を引き起こす方法である。前記突然変異誘発法は、前記遺伝子組換え技術とは異なり、その食物が本来有している塩基配列以外の塩基配列が導入されることがない。したがって、前記突然変異誘発法により遺伝的形質が変化した食物は、現状においても比較的安全性が高いものとして消費者に受け入れられている。
【０００８】
したがって、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能であり、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率の高い酵母などの微生物は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平５−１７８７５９号公報
【特許文献２】特開平６−２７１４７０号公報
【特許文献３】特開２００３−８１８３９号公報
【特許文献４】特開２００１−１８１３０３号公報
【特許文献５】特開平６−５６６８５号公報
【特許文献６】特許第２８７３４３４号公報
【特許文献７】特開２００２−３３９５号公報
【特許文献８】特許第２５２９６０５号公報
【特許文献９】特開平１１−４９６９６号公報
【特許文献１０】特開２０００−２８１５７１号公報
【特許文献１１】特開２００３−１２８５８９号公報
【特許文献１２】特開平６−５６６７８号公報
【特許文献１３】特開平７−２２８５３６号公報
【特許文献１４】特開平１１−９２３８９号公報
【特許文献１５】特開２００１−３５４５７０号公報
【特許文献１６】特開２００３−１８３１７６号公報
【特許文献１７】特開２００６−７５０３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能であり、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率の高い酵母、及びこの酵母を含有する食品又は飼料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、現在食品製造に広く利用されている酵母に対して、エチルメタンスルホン酸を利用した突然変異誘発法により、酵母染色体上に変異を導入したところ、細胞壁のマンナンが少ない酵母を取得することができたこと；この酵母は、細胞壁のマンナンが少ないことにより、菌体表面にβグルカンが露出しているので、特にこの酵母からβグルカンを精製せずに、菌体のまま免疫賦活能試験に供しても、顕著な免疫賦活能が示されたこと；この酵母は、細胞壁のマンナンが少ないにも関わらず、予期しなかったことに低浸透圧に対して高い耐性を示し、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率が高いため、酵母そのものの製造（培養）、並びに、この酵母を含有する食品及び飼料の製造に好適に利用できることを知見した。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、対糖収率が７５質量％以上であり、ゲノム数が２倍体以上であることを特徴とする酵母である。
＜２＞ 酵母がウラシル非要求性である前記＜１＞に記載の酵母である。
＜３＞ 免疫賦活能がマクロファージ活性化能である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の酵母である。
＜４＞ 突然変異誘発法により免疫賦活能を獲得した前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の酵母である。
＜５＞ 突然変異誘発法が、突然変異誘発剤、紫外線照射、及び放射線照射のいずれかを利用する方法である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の酵母である。
＜６＞ 遺伝子組換えされていない前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の酵母である。
＜７＞ ゲノム数が２倍体以上である酵母の親株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の酵母。
＜８＞ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０のいずれかである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の酵母である。
＜９＞ 前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の酵母を含有する食品又は飼料である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能であり、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率の高い酵母、及びこの酵母を含有する食品又は飼料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、変異体１〜４の顕微鏡像である。
【図２】図２は、変異体１〜４のマクロファージ活性化能試験の結果を表す図である。
【図３】図３は、変異体６〜８の顕微鏡像である。
【図４】図４は、変異体６〜８のマクロファージ活性化能試験の結果を表す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、実用菌株、及び変異体６〜８のマクロファージ活性化能試験の結果を表す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実用菌株、及び変異体６〜８のマクロファージ活性化能試験のポジティブコントロールとして用いた、ＬＰＳ刺激したマクロファージの活性化能の結果を表す図である。
【図６Ａ】図６Ａは変異体４、及び変異体６〜８をウラシル添加培地で培養した菌体の育成度合いを表す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは変異体４、及び変異体６〜８をウラシル非添加培地で培養した菌体の育成度合いを表す図である。
【図７】図７は、変異体４、及び変異体６〜８の凝集性を表す図である。
【図８】図８は、野生型２倍体株、実用菌株Ｅ、及び変異体６〜８により製造した食パンを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（酵母）
本発明の酵母は、細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、対糖収率が７５質量％以上であり、ゲノム数が２倍体以上であることを特徴とする。
【００１６】
＜マンナン＞
一般に、マンナンとは、酵母の細胞壁を構成する主要成分のひとつであり、Ｄ−マンノースを主体とする糖鎖である。前記マンナンは、タンパク質と結合したマンナンタンパク質として存在する。酵母の細胞壁においては、細胞膜の外周面に沿ってβグルカン層が形成されており、前記マンナンタンパク質は、前記βグルカンにＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカーという糖脂質を介して結合されている。その結果、マンナンは、βグルカンを覆い隠すようにして、細胞壁の最外層（即ち、菌体表面）に配される。これに対し、本発明の前記酵母においては、細胞壁のマンナンが少ないことにより、マンナンに代えてβグルカンが菌体表面に露出している。
【００１７】
前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ない理由は明らかではないが、例えば、マンナン、マンナンタンパク質、及びＧＰＩアンカーの少なくとも１つが、生合成されていない、生合成はされたが細胞膜外に輸送されない、互いの結合部位に欠損や変異が生じているなどの理由が考えられる。
【００１８】
−マンナンの検出−
前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ないことは、例えば、マンナンに特異的な抗体や、マンナン中のＤ−マンノースやメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドなどに対して特異的に結合するＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）レクチンなどを利用して確認することができる。
具体的には、前記抗体又は前記ＣｏｎＡを、例えば、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）などの蛍光色素により標識し、前記抗体又は前記ＣｏｎＡの菌体表面への結合を、蛍光により検出する（以下、「マンナン染色」と称することがある）。この場合、菌体表面に前記抗体又は前記ＣｏｎＡの結合に由来する蛍光が検出されなければ、細胞壁のマンナンが少ないと判定できる。
前記蛍光の検出は、蛍光顕微鏡下で目視により行ってもよく、例えば、フローサイトメーター、蛍光プレートリーダーなどの装置を用いて定量的に行ってもよい。
【００１９】
また、前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ないことは、例えば、細胞壁中のマンナンの含有量を定量することにより、調べることができる。マンナンの含有量を定量する方法としては、特に制限はないが、例えば、以下の手順により定量できる。
即ち、まず、細胞をガラスビーズで破砕し、遠心によって細胞壁画分を調製し、凍結乾燥する。次に、Ｄａｌｌｉｅｓらの方法（Ｙｅａｓｔ， １４， １９９８， ｐ．１２９７−１３０６）に従い硫酸加水分解を行い、中和した後の上清を凍結乾燥し、ＲＥＺＥＸＴＭ ＲＰＭ−Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ （ＳｈｉｍａｄｚｕＧＬＣ ＬＴＤ）などのカラムを用いＨＰＬＣで解析し、グルコースとマンノースとの比を求めることで、細胞壁中のマンナンの含有量を求めることができる。
【００２０】
細胞壁中のマンナンの含有量としては、βグルカンが菌体表面に露出される程度に少なくなっている限り、特に制限はなく、細胞壁中にマンナンを有さないことがより好ましい。以下、マンナンが少なく、βグルカンが菌体表面に露出されている酵母を「グルカン露出酵母」と称することがある。
【００２１】
−βグルカン−
前記βグルカンとは、酵母の細胞壁を構成する主要成分の１つであり、グルコースがβ１−３型で結合されてなる糖鎖である。
前記βグルカンの平均分子量、及び修飾の態様としては、免疫賦活能を有する限り、特に制限はなく、酵母の種類や培養条件に応じて変化しうる。
【００２２】
前記酵母において、βグルカンが菌体表面に露出していることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、βグルカンに特異的な抗体や、アニリンブルーなどの蛍光試薬を利用して確認することができる。また、電子顕微鏡により、菌体表面のβグルカン線維を観察することにより確認することもできる。
【００２３】
＜免疫賦活能＞
前記免疫賦活能は、自然免疫を賦活する能力である。前記自然免疫とは、生体が備える免疫のうち、生体に先天的に備わっており、事前に抗原に暴露していなくても前記抗原を生体から排除するに際に機能する機構を意味する。前記抗原としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、ウイルスや細菌などの外来の抗原、及び癌細胞などの内来の抗原などが挙げられる。
【００２４】
前記免疫賦活能としては、前記自然免疫を賦活できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食細胞（マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞）、抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多形核白血球（好酸球、好塩基球、肥満細胞）などの活性化能がなど挙げられる。これらの中でも、各種生物に広く存在し、抗原を排除する効果が高い点で、前記マクロファージの活性化能が好ましい。
【００２５】
前記酵母が免疫賦活能を有する理由としては、細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有するβグルカンが菌体表面に露出しているためと考えられている。
【００２６】
−免疫賦活能の評価−
前記酵母が前記免疫賦活能を有することを評価する方法としては、特に制限はなく、自然免疫に関与する前記細胞の種類に応じた従来公知の評価方法の中から、適宜選択することができる。
例えば、前記マクロファージの活性化能の評価は、マクロファージに対して、培地又は緩衝液中で前記酵母を接触させることにより、前記マクロファージを刺激し、刺激前後において前記マクロファージが産生するサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α）など）の量を測定することで行うことができる。
【００２７】
＜浸透圧に対する耐性＞
一般に、酵母を含む一部の微生物や、植物が備える細胞壁は、浸透圧への耐性や細胞形態の維持など、極めて重要な機能を有している。
これに対して、本発明の前記酵母は、前記したように細胞壁のマンナンが少ないので、浸透圧への耐性が失われることが危惧されていた。しかしながら、本発明者らにより製造された酵母は、予期しなかったことに浸透圧への耐性を有していることが、後述する実施例より明らかとなっている。
【００２８】
−浸透圧に対する耐性の評価−
本発明の前記酵母が低浸透圧に対して耐性であることを示す指標としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であることが好ましい。ただし、前記ＹＰＤ液体培地としては、１質量％ イーストエキス，２質量％ ペプトン，２質量％ グルコースの組成のものを用いる。また、前記ＹＰＤ液体培地に用いるイーストエキスとしては、オリエンタル酵母工業（株）製のものを使用し、ペプトンとしては、日本製薬（株）製のものを使用し、グルコースとしては、国産化学（株）製のものを使用することとする。前記浸透圧は、例えば、ソルビトールなどの非発酵性糖類、ＮａＣｌなどにより調節することができる。前記浸透圧は、例えば、浸透圧計Ｆ−２０００（ｒｏｅｂｌｉｎｇ社製）により測定することができる。
【００２９】
本発明における「増殖可能」とは、ＹＰＤ寒天培地（１質量％ イーストエキス、２質量％ ペプトン、２質量％ グルコース、２質量％ 寒天）で培養した前記酵母を、高浸透圧培地であるＹＰＤ液体培地に１白金耳植菌し、適切な条件で一晩振盪培養したときに、対糖収率が７５質量％以上であることを意味する。前記対糖収率とは、１ｇの糖当たりに回収される前記酵母の湿質量をいう。
前記対糖収率は、例えば、前記培養で得た前記酵母の懸濁液を蒸留水で洗浄後、前記酵母の乾燥（ＤＭ）質量を測定し、１ｇの糖当たりに回収される前記酵母の湿質量（水分含有量を６７質量％として）（ｇ）を算出する方法などが挙げられる。
【００３０】
前記酵母は、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であるので、例えば、培地の浸透圧を上げるために糖などを添加する必要がなくなり、培養コストを低減させることができる点で有利である。また、前記酵母を食品に添加する場合には、培養後に低浸透圧の溶液で洗浄しても菌体が破壊されないので、生菌の回収率を高めることができ、食品の製造効率を上げることができる点でも有利である。
【００３１】
＜株＞
本発明の前記酵母が栄養要求性を有するか否かは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、栄養非要求性株が、培養コストを低減させることができる点で好ましい。前記栄養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウラシルなどが挙げられる。
【００３２】
−培地中のウラシル含有量−
スクリーニングが行われる際、酵母がウラシル要求性か否かを判断する場合には、使用するＹＰＤ液体培地に、グルコースの含有量に対して、０．３質量％以上のウラシルを含有させてスクリーニングを行うこととする。即ち、ＹＰＤ液体培地に対するグルコースの含有量が２質量％である場合には、ＹＰＤ液体培地に対するウラシルの含有量は、６×１０−３質量％以上である。
また、スクリーニングが行われる酵母が他の要求性を有している場合には、使用するＹＰＤ液体培地に、その要求される物質を充分量含有させてスクリーニングを行うこととする。
【００３３】
＜酵母の種類＞
前記酵母の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、味噌醤油酵母などが挙げられる。これらの中でも、パン酵母が好ましい。
【００３４】
前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ウイリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属などが挙げられる。
【００３５】
前記酵母の種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｉｔｏａｎａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｌｉｇｅｒａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ、などが挙げられる。
これらの中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓが好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが特に好ましい。
【００３６】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０が好ましく、免疫賦活能が高い点で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０がより好ましく、更に、製造（培養）中の凝集性が低く、対糖収率が高いなど、製造適性が良好な点で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｐ−２１７２９が特に好ましい。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０は、本発明者らにより製造された株であり、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３７】
＜培養方法＞
前記酵母の培養方法としては、特に制限はなく、従来公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バッチ培養、流加培養などが挙げられる。
前記培養は、ジャーファーメンターを用いて好適に行うことができ、このときのジャーファーメンターにおける条件としては、特に制限はなく適宜決定することができるが、例えば、培養温度としては２８℃〜３３℃程度であり、培養時間としては１時間〜１２０時間程度であり、ｐＨとしてはｐＨ４〜ｐＨ７程度であり、通気量としては０ｖｖｍ〜５ｖｖｍ程度であり、攪拌速度としては１００ｒｐｍ〜７００ｒｐｍ程度である。
【００３８】
−流加培養−
前記流加培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＹＰＤ培地で培養した種酵母を３００ｇ〜５００ｇ使用し、所定の培地に播種した後、総添加量が、糖量（蔗糖換算）１，０００ｇ〜２，０００ｇ、尿素１００ｇ〜２００ｇ、リン酸１ナトリウム２０ｇ〜４０ｇの条件にて、２８℃〜３３℃で連続流加する方法などが挙げられる。
【００３９】
＜製造方法＞
前記ゲノム数が２倍体以上の酵母の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食品用途に使用可能な酵母を親株とし、この親株に対して突然変異誘発法により染色体上に変異を誘発することにより製造する方法、食品用途に使用可能な酵母を親株とし、この親株において自然突然変異により染色体上に変異を生じさせる方法、２倍体の野生株に突然変異誘発法を施す方法などが挙げられる。
前記食品用途に使用可能な親株としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前述した＜酵母の種類＞の項目において例示した酵母を利用することができる。
前記ゲノム数が２倍体以上の酵母の親株としては、１倍体の株でもよく、前記１倍体の株を交雑することで、２倍体を得ることができる。
【００４０】
−突然変異誘発法−
前記突然変異誘発法とは、例えば、突然変異誘発剤、紫外線照射、放射線照射などの突然変異誘発要因により、自然突然変異に比べて高い頻度でＤＮＡに変異を引き起こす方法を意味する。前記突然変異誘発法を用いることにより、親株が本来有している塩基配列以外の塩基配列が導入されることなく、染色体上に変異を生じさせることができる。
前記突然変異誘発剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エチルメタンスルホン酸、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシルなどが挙げられる。
前記放射線としては、例えば、Ｘ線、α線、β線、γ線、粒子線などが挙げられる。
前記突然変異誘発法は、前記食品用途に使用可能な酵母が本来有する塩基の中で変異が起こることから、遺伝子組換えとは異なり安全性が高いため、食品に利用できる点で有利である。
【００４１】
前記突然変異誘発法又は前記自然突然変異により変異が生じる遺伝子としては、親株が免疫賦活能を獲得できる限り、特に制限はなく、例えば、ＲＰＳ１２，ＭＲＳ６，ＧＰＢ１，ＲＡＤ１７，ＮＤＤ１，ＳＣＰ１，ＭＣＤ４，ＧＡＳ１，ＣＷＨ４１などの遺伝子が挙げられる。また、これらの遺伝子以外の染色体上の塩基配列が変異していてもよい。
また、前記変異の種類としても、親株が免疫賦活能を獲得できる限り、特に制限はなく、例えば、塩基置換、挿入、欠失、逆位などが挙げられる。
【００４２】
−−１倍体の１次スクリーニング−−
前記突然変異誘発法により得た１倍体変異株から、マンナンの少ない株をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マンナンの少ない株のＳＤＳに対する感受性を利用する方法などが挙げられる。ＳＤＳ添加培地と、ＳＤＳ非添加培地との前記１倍体変異株の増殖を比較して、前記ＳＤＳ添加培地で増殖が遅い株、若しくは死滅する株を選択することで、マンナンの少ない株（グルカン露出酵母）を得ることができる。
【００４３】
−−１倍体の２次スクリーニング−−
グルカン露出酵母１倍体株をスクリーニングする方法として、前記１次スクリーニングで得られた１倍体変異株を、更に前記マンナン染色することで、よりマンナンの少ない株を選択することが好ましい。
【００４４】
−−１倍体の３次スクリーニング−−
前記２次スクリーニングで得られたグルカン露出酵母１倍体株から、免疫賦活能を有する株をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前述した免疫賦活能の評価方法を用いることができる。
【００４５】
−グルカン露出酵母２倍体株の製造−
グルカン露出酵母２倍体株は、前記１倍体の３次スクリーニングで得られた免疫賦活能を有するグルカン露出酵母１倍体株と、１倍体の野生株とを交雑させた株を親株とし、その子孫として得ることができる。
【００４６】
−−免疫賦活能を有するグルカン露出酵母１倍体株−−
前記グルカン露出酵母１倍体株としては、免疫賦活能を有し、マンナンが少ない株であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前述したグルカン露出酵母１倍体株の製造により得られた株が好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５５がより好ましい。
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５５は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４７】
−−２倍体の親株の製造−−
前記グルカン露出酵母２倍体株の親株は、前記グルカン露出酵母１倍体株と、１倍体の野生株とを交雑させることにより得ることができる。前記交雑の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、常法を用いることができる。
ここで、前記グルカン露出酵母１倍体株の形質が、ウラシル要求性かつマンナンが少ない株（以下、「ウラシル（−）・マンナン（−）株」と称することがある。）であり、前記１倍体の野生株が、ウラシル非要求性かつマンナンが正常である株（以下、「ウラシル（＋）・マンナン（＋）株」と称することがある。）である場合、これらを交雑させた２倍体株は、ウラシル要求性、及びマンナンの形質において、ヘテロ型となる。この場合、前記２倍体株は、胞子分離させ、再び１倍体株を得た後、所望の形質を有する前記胞子分離後の１倍体株同士を交雑させることで、ウラシル要求性、及びマンナンの形質において、ホモ型の２倍体株を得ることができる。
【００４８】
−−２倍体の１次スクリーニング−−
前記グルカン露出酵母２倍体株の所望の形質としては、ウラシル非要求性であることが、培養コストを低減させることができる点で好ましい。そのため、１次スクリーニングでは、前記胞子分離後の１倍体株から、ウラシル非要求性かつマンナンが少ない株（以下、「ウラシル（＋）・マンナン（−）株」と称することがある。）をスクリーニングすることが好ましい。
前記１次スクリーニングの方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウラシルを含有していない培地を用い、ウラシル非添加培地で増殖可能な株を選択した後、更に前述した１倍体の１次スクリーニングと同様に、ＳＤＳに対する感受性を利用して、前記ＳＤＳ添加培地で増殖が遅い株、若しくは死滅する株を選択する方法を用いることができる。
前記ウラシルを含有していない培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＤ培地（０．６７質量％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｗ／Ｏ アミノ酸）、２質量％ グルコース、２質量％ 寒天）などが挙げられる。
【００４９】
−−ウラシル非要求性グルカン露出酵母２倍体の製造−−
前記ウラシル（＋）・マンナン（−）株の１倍体から２倍体株を得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ウラシル（＋）・マンナン（−）株の１倍体の接合型を確認し、メイティングマトリクス判定を行うことにより得ることができる。
前記接合型を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記１次スクリーニングで得られた１倍体株と、接合型が既知の株とを共培養し、目視で凝集を確認する方法などが挙げられる。
【００５０】
−−２倍体の２次スクリーニング−−
前記メイティングマトリクス判定により得られた前記ウラシル（＋）・マンナン（−）株の２倍体の中から、更にマンナンの少ないグルカン露出酵母２倍体株を選択するために、２次スクリーニングを行うことが好ましい。
前記２次スクリーニングの方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前述した１倍体の２次スクリーニングと同様の方法を用いることができる。
【００５１】
−−２倍体のマクロファージ活性化能の評価−−
前記２倍体の２次スクリーニングで得られたグルカン露出酵母２倍体株の免疫賦活能を評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前述した１倍体の３次スクリーニングと同様の方法を用いることができる。
【００５２】
＜製造適性の検討＞
前記酵母は、ゲノム数が２倍体以上であることから、１倍体における問題、即ち、１倍体は接合能を有するためコンタミにより性質が変化するといった問題を解消でき、安定した酵母である点、１倍体と比較して優れた増殖能を有する点、１倍体と比較して凝集性が低い点、栄養非要求性であり培養コストを低減させることができる点で、製造において有利である。
前記グルカン露出酵母２倍体の製造適性を検討する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、対糖収率、栄養要求性、凝集性などを指標に検討する方法などが挙げられる。
【００５３】
−対糖収率−
前記対糖収率とは、前述した通りであり、前記対糖収率が高い場合は、前記酵母の収率が高いこと、即ち、増殖能が高いことを示す。
前記対糖収率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７５質量％以上が好ましく、８０質量％以上がより好ましく、９５質量％以上が更に好ましい。前記好ましい範囲内であると製造コストを低減させることができる点で有利である。
【００５４】
−栄養要求性−
前記酵母の栄養要求性は、前述した通り、栄養非要求性であることが、培養コストを低減させることができる点で好ましい。
前記酵母が栄養非要求性であるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウラシルを添加していない培地に前記酵母を接種し、ウラシルを添加していない培地で増殖可能であることを確認する方法などが挙げられる。
【００５５】
−凝集性−
前記酵母は、凝集性を有さないことが好ましい。前記酵母が凝集性を有していると、製造工程でセパレーターに目詰まりするなどの点で問題である。
前記酵母が凝集性を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＹＰＤ液体培地を用い、適切な条件で一晩培養した後、前記酵母を光学顕微鏡で観察することにより確認する方法などが挙げられる。
【００５６】
＜用途＞
前記酵母の用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、食品に添加されて用いられる食品素材、飼料、餌料などとしての用途が好ましく、前記食品素材としての用途が特に好ましい。また、前記酵母は、例えば、パンやビールの発酵など、食品の製造に好適に用いることができる。本発明の酵母を用いることにより、免疫賦活能を有する食品、免疫賦活能を有する飼料、免疫賦活能を有する餌料などが得られる。このとき、前記酵母は、菌体が破砕されない状態のまま使用されてもよいし、破砕された状態で使用されてもよく、また、乾燥された状態で使用されてもよいし、生菌乃至未乾燥の状態で使用されてもよい。
前記破砕の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ダイノミルなどの物理的破砕処理であってもよいし、化学的破砕処理であってもよい。
【００５７】
前記酵母の適用対象としては、自然免疫を有する限り、特に制限はなく、例えば、ヒト、ヒトを除く動物（ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物、鶏、アヒル、七面鳥、ダチョウなどの家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズなどの魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミなどの甲殻類など、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキなどの貝類、ペット動物としてイヌ、ネコなど）などが挙げられる。
【００５８】
（食品又は飼料）
本発明の食品又は飼料は、前記酵母を含有することを特徴とする。
前記食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パン、ビスケットやスコーンなどの製菓、病院食、流動食、水産・食肉加工品、麺類、調味料、ビールやジュースなどの飲料、健康食品、健康飲料などが挙げられる。
前記飼料としては、特に制限はなく、適用対象に応じて適宜選択することができる。前記適用対象としては、特に制限はなく、例えば、前記酵母の用途の項目で例示した適用対象が挙げられる。
前記食品又は飼料は、高い免疫賦活能を有する前記酵母を含有していることにより、高い免疫賦活能を有している。
【実施例】
【００５９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に何ら限定されるものではない。
【００６０】
（実施例１：免疫賦活能を有する２倍体の酵母）
＜グルカン露出酵母１倍体株の製造＞
−自然突然変異体の選択−
突然変異誘発法に供する親株としては、実用パン酵母の１倍体であるＴ−２１株（オリエンタル酵母工業（株）製）のウラシル要求性変異株Ｔ−２１Ｕ株を用いた。
前記Ｔ−２１Ｕ株は、Ｔ−２１株をＹＰＤ液体培地で培養した後、５−フルオロオロチン酸を含む培地（０．７質量％ ＹＥＡＳＴ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ（ＤＩＦＣＯ社製）、２質量％ グルコース、０．１質量％ ５−フルオロオロチン酸、０．０５質量％ ウラシル、２質量％ 寒天）に塗沫し、３０℃で３日間培養して生育させることにより、自然突然変異体として選択された菌株である。
【００６１】
−突然変異誘発法−
ウラシル含有ＹＰＤ液体培地（１質量％ イーストエキス（オリエンタル酵母工業（株）製）、２質量％ ペプトン（日本製薬（株）製）、２質量％ グルコース（国産化学（株）製）、６×１０−３質量％ ウラシル（和光純薬工業（株）製）、以下同じ）を用いて、前記親株（Ｔ−２１Ｕ株）を一晩培養した。培養菌体をエッペンチューブ２本に分注し、遠心分離し集菌した。上清を除去し、滅菌水で２度洗浄し、０．１Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ、以下同じ）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に菌体を懸濁した。３０μＬのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）（和光純薬工業（株）製）を混合し、３０℃で１時間、振とうしながらインキュベートした。菌体を遠心により回収し、上清を捨て、２００μＬの５質量％ チオ硫酸ナトリウムに再懸濁した。懸濁液を新しいチューブに移し、遠心回収、２００μＬの５質量％ チオ硫酸ナトリウムによる洗浄を２度行なった。菌体を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、適度に希釈した後に、ＹＰＤ寒天培地に塗布した。
この突然変異誘発法により得た１倍体の酵母群の中から、マンナンが少なく、免疫賦活能を有する酵母を、下記１次〜３次スクリーニングによりスクリーニングした。
【００６２】
−１倍体の１次スクリーニング−
１次スクリーニングとして、細胞壁変異株の選択を行った。前記細胞壁変異株の選択は、下記３種の寒天培地を用い、各培地に菌体を塗布した後、３０℃で３日間培養し、下記評価方法により行った。
【００６３】
−−培地−−
前記細胞壁変異株の選択に用いた培地は、下記３種の培地である。
（１）ウラシル含有ＹＰＤ寒天培地（１質量％ イーストエキス、２質量％ ペプトン、２質量％ グルコース、６×１０−３質量％ ウラシル、２質量％ 寒天）
（２）ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地（０．２質量％ イーストエキス、０．４質量％ ペプトン、０．４質量％ グルコース、１．２×１０−３質量％ ウラシル、２質量％ 寒天）
（３）ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地
【００６４】
−−評価方法−−
細胞壁変異株の評価方法としては、下記（１）、及び下記（２）を満たす株を選択した。
（１）ウラシル含有ＹＰＤ寒天培地とウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地で増殖が遅く、かつ、
（２）ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地と、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地で増殖が遅い株（あるいは死滅する株）。
【００６５】
−−結果−−
１次スクリーニングを行った結果、３，１２０株の変異体が得られた。
【００６６】
−１倍体の２次スクリーニング−
−−方法−−
２次スクリーニングとして、ＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡによるマンナン染色を行った。コロニーを爪楊枝でかきとり、ＰＢＳ＋１．０Ｍソルビトール溶液に懸濁した。遠心回収し、ＰＢＳ＋１．０Ｍソルビトール溶液で再懸濁した後に、ＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）に混合し、室温、遮光下で３０分間放置した。１回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いてＢｌｕｅ励起光下で菌体を観察した。全体的に観察したときに殆ど蛍光が見られず、撮像した写真上で蛍光が確認できない株を選択した。
【００６７】
−−結果−−
前記２次スクリーニングの結果、前記１次スクリーニングで得た３，１２０株から４株（変異体１〜４）を選択した。
図１は、変異体１〜４の顕微鏡像であって、上段は光学顕微鏡像であり、下段はマンナン染色後に観察された蛍光顕微鏡像である。図１において、変異体１〜４は、蛍光がほとんど観察されず、特に変異体２〜４は、蛍光が全く観察されていない。
【００６８】
なお、変異体１は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１３であり、変異体２は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１４であり、変異体３は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５４であり、変異体４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５５であり、４株とも、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。
【００６９】
−１倍体の３次スクリーニング−
−−方法−−
３次スクリーニングとして、変異体１〜４のマクロファージ活性化能を測定した。変異体１〜４を遠心集菌し、エタノールで処理後、滅菌水で２度洗浄した。更にＲＰＭＩ−１６４０培地で１度洗浄した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、血球計算盤で酵母数をカウントした。酵母濃度が、規定量となるように調製し、サンプルとした。
マクロファージは、培養２日目の細胞を使用した。培養したマクロファージを培養フラスコから回収し、新しい培地で２度洗い、血球計算盤で細胞数をカウントした。マクロファージの細胞濃度が、規定量となるように調製し、活性測定用のマクロファージ培養液とした。
【００７０】
前記マクロファージ培養液を２４穴プレートに分注し、前記サンプルを酵母対マクロファージの細胞数の割合が３０：１になるように混合した。これを３７℃、５％ＣＯ２の条件で、６時間培養した後、培養液をチューブに取り、遠心した。上清を回収し、上清中に含まれるＴＮＦ−αのタンパク量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−α Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して測定した。マクロファージ活性化に対するポジティブコントロールとしては、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、和光純薬工業（株）製）を用いた。
【００７１】
−−結果−−
図２は、変異体１〜４についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。図２において、変異体３、４は、親株（Ｔ２１−Ｕ株）に比べ、非常に強いマクロファージ活性化能（免疫賦活能）を有することが示された。
３次スクリーニングの結果、変異体１〜４の４株の中から、１株（変異体４）を選択し、グルカン露出酵母２倍体の製造に用いた。
【００７２】
＜２倍体株の製造＞
前記変異体４と、実用パン酵母の１倍体であるＴ−１９（オリエンタル酵母工業（株）製）とを交雑し、２倍体の変異体５を製造した。前記変異体５を胞子分離させ、胞子分離した酵母群（以下、「変異体５胞子分離株」と称することがある。）を、下記１次スクリーニングに用いた。
【００７３】
−２倍体の１次スクリーニング−
１次スクリーニングとして、ウラシル非要求性、かつ細胞壁変異株の選択を行った。
【００７４】
−−ウラシル非要求性株の選択−−
−−−方法−−−
ウラシル非要求性株の選択は、ＳＤ培地（０．６７質量％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社））、２質量％ グルコース、２質量％ 寒天）を用い、前記ＳＤ培地に菌体をスポットして生育した菌株を選択した。
【００７５】
−−細胞壁変異株の選択−−
細胞壁変異株の選択は、下記３種の培地を用い、各培地に菌体をスポットし、３０℃で３日間培養した後に、下記評価方法により行った。
【００７６】
−−−培地−−−
前記培地は、下記３種の培地を用いた。
（１） ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地（０．２質量％ イーストエキス、０．４質量％ ペプトン、０．４質量％ グルコース、６×１０−３質量％ ウラシル、２質量％ 寒天）
（２） ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０２質量％ ＳＤＳ寒天培地
（３） ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地
【００７７】
−−−評価方法−−−
細胞壁変異株の評価方法としては、下記（１）、及び下記（２）を満たす株を選択した。
（１）ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地とウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０２質量％ ＳＤＳ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０２質量％ ＳＤＳ寒天培地で増殖が遅く、かつ、
（２）ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０２質量％ ＳＤＳ寒天培地と、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地で増殖が遅い株（あるいは死滅する株）。
【００７８】
−メイティングマトリクス判定−
前記１次スクリーニングにより得られた１倍体株（変異体５胞子分離株）の接合型（α型株、若しくはａ型株）を下記方法により確認し、メイティングマトリクス判定を行った。
【００７９】
−−接合型の確認−−
９６穴プレートにＹＰＤ培地を分注し、爪楊枝を用いて変異体５のセグリガントを接種した後、３０℃で一晩静置培養した。ＹＰＤ培地入りφ１６ｍｍ試験管に、テスター株（接合型が既知の株）であるＸ−２１８０Ａ（ＡＴＣＣ社製）と、Ｘ−２１８０Ｂ（ＡＴＣＣ社製）とをそれぞれ接種し、３０℃で一晩振盪培養した。２４穴プレートにＹＰＤ培地を分注し、セグリガント培養液を添加した。更に、Ｘ−２１８０Ａ又はＸ−２１８０Ｂの培養液を添加し、３０℃で４時間静置培養をした。その後、目視で凝集を観察することで、接合型を確認した。
【００８０】
−２倍体株の造成−
前記α型株と、前記ａ型株とをそれぞれＹＰＤ培地中にて、３０℃で１日間培養することで増殖させた。両菌数を同程度として、両酵母を新たなＹＰＤ培地に入れ、３０℃で１２時間培養した。接合酵母を分離し、ＹＰＤ寒天培地に塗布して、１日間〜２日間、３０℃で振盪培養し、比較的大きなコロニーを２倍体として分離した。分離したコロニーについて、接合性を有していないこと、及び顕微鏡下で１倍体よりも大きくなっていることを観察し、２倍体の造成を確認した。２倍体は、７０株得られた。
なお、これらの株は、ＹＰＤ培地で生育、及び増殖可能であったことから、マンナンが少ないにもかかわらず浸透圧耐性を有することが認められた。
【００８１】
−２倍体の２次スクリーニング−
−−方法−−
２次スクリーニングとして、ＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡによるマンナン染色を行った。マンナン染色は、前記１倍体の２次スクリーニングと同様の方法で行った。なお、２次スクリーニングは再現性を確認するため３回行った。
【００８２】
−−結果−−
前記２次スクリーニングの結果、前記２倍体７０株から３株（変異体６〜８）を選択した。
図３は、変異体６〜８の顕微鏡像であって、上段は光学顕微鏡像であり、下段はマンナン染色後に観察された蛍光顕微鏡像である。
【００８３】
なお、変異体６は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８であり、変異体７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９であり、変異体８は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０であり、３株とも、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。
【００８４】
−マクロファージ活性化能−
前記変異体６〜８のマクロファージ活性化能を下記方法により測定した。
【００８５】
−−サンプル処理−−
対数増殖期（培養１２時間）の変異体６〜８を、遠心集菌し、７０質量％ エタノールで６０分間処理した後、滅菌水で２度洗浄した。更にＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）で１度洗浄した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、血球計算盤で酵母数をカウントした。酵母濃度が、３．０×１０７細胞／ｍＬになるように調製し、サンプルとした。
【００８６】
−−細胞の調製−−
マウスのマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７、ＡＴＣＣ社製）は、培養２日目の細胞を使用した。培養したＲＡＷ２６４．７細胞を培養フラスコから回収し、新しいＲＰＭＩ−１６４０培地で２度洗浄後、血球計算盤で細胞数をカウントした。ＲＡＷ２６４．７細胞の細胞濃度が、１．０×１０６細胞／ｍＬとなるように調製し、活性測定用のＲＡＷ２６４．７細胞培養液とした。
【００８７】
−−マクロファージ活性化能測定−−
ＲＡＷ２６４．７細胞培養液を２４穴プレートに０．２５ｍＬずつ分注し、前記サンプルを酵母対マクロファージの細胞数の割合が３０：１になるように混合した。これを３７℃、５％ＣＯ２下で、６時間培養した後、培養液をチューブに取り、２，０００×ｇで１分間遠心分離を行った。上清を回収し、上清中に含まれるＴＮＦ−αのタンパク量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−α Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して測定した。測定には、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ−６８０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用した。マクロファージ活性化に対するポジティブコントロールとしては、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、和光純薬工業（株）製）０．２μｇ／ｍＬを用いた。
【００８８】
−−結果−−
図４は、変異体６〜８についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。図４中、野生型２倍体株は、実用パン酵母の１倍体であるＴ−１９株と（オリエンタル酵母工業（株）製）、Ｔ−２１株（オリエンタル酵母工業（株）製）とを交雑した株である。
前記野生型２倍体株のＴＮＦ−α濃度が約９００ｐｇ／ｍＬであったのに対し、変異体６は約１，７５０ｐｇ／ｍＬ、変異体７は約２，２５０ｐｇ／ｍＬ、変異体８は２，１００ｐｇ／ｍＬと、いずれも高い活性が確認された。
これらの結果より、変異体６〜８は、野生型２倍体に比べ、ＴＮＦ−α産生誘導能が高く、非常に強いマクロファージ活性化能（免疫賦活能）を有することが示された。
【００８９】
（実施例２：実用菌株とのマクロファージ活性化能の比較）
前記変異体６、前記変異体７、及び前記変異体８のマクロファージ活性化能と、実用菌株Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ（全てオリエンタル酵母工業（株）製）のマクロファージ活性化能とを下記方法により測定し、比較した。
なお、前記実用菌株Ａ〜Ｄのゲノム数は、２倍体の酵母である。
【００９０】
＜サンプル処理＞
ＹＰＤ培地（１質量％ イーストエキス，２質量％ ペプトン，２質量％ グルコース）５ｍＬに、各菌株を１白金耳植菌し、３０℃で２日間振盪培養した。前記培養で得た酵母懸濁液を蒸留水（大塚製薬（株）製）で２回洗浄した後、各菌株の乾燥（ＤＭ）質量を測定した。遠心集菌し、７０質量％ エタノールで６０分間処理した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２度洗浄した後、牛血清（ＣＥＬＬＥＣＴ社製）を１０質量％含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１，０００μｇ（ＤＭ質量）／ｍＬになるように懸濁した。
【００９１】
＜細胞の調製＞
ＲＡＷ２６４．７は、実施例１と同様の方法で培養し、細胞懸濁液を、１．０×１０６細胞／ｍＬとなるように調製した。
【００９２】
＜マクロファージ活性化能測定＞
ＲＡＷ２６４．７細胞培養液を４８穴プレートに０．５ｍＬずつ分注し、３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２の条件化で２時間培養を行った。ＲＡＷ２６４．７細胞の接着を確認した後、培養上清を除去し、前記サンプル１，０００μｇ／ｍＬを０．５ｍＬ添加して、２４時間培養を行った。培養上清回収し、実施例１と同様の方法でＴＮＦ−αのタンパク量を測定した。マクロファージ活性化に対するポジティブコントロールとしては、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、和光純薬工業（株）製）０．００１μｇ／ｍＬを用いた。
【００９３】
＜結果＞
図５Ａは、実用菌株Ａ〜Ｄ、及び変異体６〜８についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。図５Ｂは、ポジティブコントロールとして用いた、ＬＰＳ刺激したマクロファージの活性化能を示す図である。
実用菌株のＴＮＦ−α濃度は、約３００ｐｇ／ｍＬ〜５００ｐｇ／ｍＬであり、野生型２倍体株のＴＮＦ−α濃度は、約６００ｐｇ／ｍＬと同程度であった。
一方、変異体６は約８００ｐｇ／ｍＬ、変異体７は約１，０００ｐｇ／ｍＬ、変異体８は約８００ｐｇ／ｍＬと、いずれも野生型２倍体株と比較して高い活性が確認された。これらの中でも、変異体７が最も高い活性を示した。
これらの結果より、変異体６〜８は、野生型の２倍体株、及び実用菌株と比べ、ＴＮＦ−α産生誘導能が高く、非常に強いマクロファージ活性化能（免疫賦活能）を有することが示された。
【００９４】
（実施例３：製造適性）
変異体６〜８について、下記方法により、製造適正の検討を行った。比較対照としては、１倍体の変異体４を用いた。
【００９５】
＜対糖収率＞
−方法−
ウラシル含有ＹＰＤ寒天培地（組成は、実施例１と同様）で培養した変異体４、及び変異体６〜８を、それぞれ６×１０−３質量％ ウラシルＹＰＤ液体培地５ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養を行った。前記培養で得た各変異体懸濁液を蒸留水で洗浄後、各菌株の乾燥（ＤＭ）質量を測定した。
対糖収率は、酵母の水分含有量を６７質量％として、１ｇの糖当たりに回収される前記各変異体の湿質量（ｇ）より算出した。
結果を下記表１に示す。
【００９６】
【表１】
【００９７】
−結果−
２倍体株である変異体６〜８は、８０質量％以上の対糖収率を示したのに対し、１倍体株である変異体４の対糖収率は、４質量％と非常に低かった（表１）。
これらの結果より、１倍体株である変異体４の増殖能は低く、２倍体株である変異体６〜８は、変異体４と比較して、非常に高い増殖能を有することが認められた。
【００９８】
＜栄養要求性＞
−方法−
ＳＤ培地に２×１０−３質量％ ウラシルを添加した寒天培地（以下、「ウラシル添加培地」と称することがある。）、若しくはウラシルを添加していない寒天培地（以下、「ウラシル非添加培地」と称することがある。）に、変異体４、及び変異体６〜８をそれぞれ塗布し、３０℃で２日間培養後、生育度合を確認した。
【００９９】
−結果−
図６Ａにウラシル添加培地の結果を、図６Ｂにウラシル非添加培地の結果を示す。
これらの結果より、変異体４は、ウラシル添加培地では生育したが、ウラシル非添加培地では生育しなかったことから、ウラシル要求性であることが確認された。
一方、変異体６〜８は、ウラシル添加培地においても、及びウラシル非添加培地においても生育していることが確認されたことから、変異体６〜８はウラシル非要求性株であり、低製造コストで製造可能であることが認められた。
【０１００】
＜凝集性＞
−方法−
変異体４、及び変異体６〜８を、それぞれ６×１０−３質量％ ウラシルＹＰＤ液体培地５ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養を行った。培養後の各変異体の菌体の形態を光学顕微鏡にて４００倍で観察した。
【０１０１】
−結果−
各変異体の顕微鏡像を図７に示す。
１倍体株である変異体４は、凝集性が非常に高かった。変異体８も凝集性が認められたが、その凝集の度合いは、変異体４よりも低かった。変異体４はセパレーターの目詰まりを起こし、製造上問題があったが、変異体８はセパレーターの目詰まり起こさず、製造上問題ないものであった。変異体６〜７は、凝集性が認められなかった。
これらの結果より、２倍体株は、１倍体株と比較して凝集性が低いことから、製造適性に優れることが認められた。
【０１０２】
（実施例４：食パンの製造）
変異体６〜８を使用して、食パンを製造した。比較対照としては、野生型２倍体株を使用した。
【０１０３】
＜圧搾酵母の製造＞
ＹＰＤ液体培地で培養した変異体６〜８、実用菌株Ｅ、及び野生型２倍体株を種酵母として、流加培養を実施した。糖量（蔗糖換算）１，４００ｇ、尿素１４０ｇ、リン酸１ナトリウム２８ｇの条件にて、３０Ｌジャーファーメンターを用いて容量１５Ｌにて連続流加し培養した。流加方法は常法に従った。培養終了後、培養ブロスを分離・水洗・ろ過して圧搾生酵母を得た。
【０１０４】
＜食パンの製造方法＞
食パンは、日本イースト工業会（平成８年８月）を参照し、製造した。即ち、砂糖と、食塩とを、水の一部を用いて溶解し、ミキサーボール中のミリオン（日清製粉（株）製）及びナンバーワン（日清製粉（株）製）に加え、更に残りの水を添加した。次いで、前記したように製造した変異体６〜８、実用菌株Ｅ、及び野生型２倍体株のいずれかの圧搾酵母、及びショートニング（ミヨシ油脂（株）製）をミキサーボールへ添加し、ミキシングを行った。ミキシングは、２８℃にて、製パン用ミキサー（関東混合機工業（株）製）で、低速（Ｌ）１分間、中速（Ｍ）４分間行い、パン生地を捏ね上げた後、更にバッティングを１０回行った。捏ね上げ後、パン生地をビーカーに移し、２８℃の定温器内でパン生地が１，７５０ｍＬになるまでの時間を測定し、第１発酵を行った。５回〜６回パンチすることによりガス抜きした後、ビーカーに戻し、更に２８℃で３０分間第２発酵を行い、ビーカーの目盛りからパン生地の体積を測定した。発酵後、３６０ｇに分割し、丸めを行ってから２８℃で２０分間のベンチタイムをとった。次いで、モルダー（規格用ローフ型）を通し成型し、３８℃、相対湿度８５％のホイロ内で型上２ｃｍになるまでの時間を測定した。ホイロ発酵終了後、２００℃にて２０分間焼成した。焼成後のパンの体積（ｃｍ２）、長さ（ｍｍ）、幅（ｍｍ）、高さ（ｍｍ）、及び質量（ｇ）を測定した。
各材料の配合を表２に示す。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
＜結果＞
第１発酵の時間、ホイロの発酵時間、焼成後のパンの体積、長さ、幅、高さ、及び質量を測定した結果を表３に示す。また、焼成後のパンを図８に示す。
【０１０７】
【表３】
表３、及び図８より、変異体６〜８により得られた食パンは、第１発酵時間、ホイロ発酵時間、体積、長さ、幅、高さ、質量、及び外形において、実用菌株Ｅ、及び野生型２倍体株と全く変わらないものであった。また、変異体６〜８により得られた食パンを食してみたところ、香り、味などの風味、及び食感においても、実用菌株Ｅ、及び野生型の２倍体株と全く変わらないものであった。
【０１０８】
（実施例５：乾燥酵母粉末の製造）
変異体６〜８、及び野生型２倍体株を使用して、乾燥酵母粉末を製造した。
変異体６〜８、及び野生型２倍体株をそれぞれ水に懸濁し、この懸濁液をスプレードライヤー（大川原化工機（株）製）で乾燥減量７質量％未満にまで噴霧乾燥処理をした。このときの熱風温度を１８５℃、排気温度を１００℃、処理量を３ｋｇ／時間とした。
変異体６〜８より得られた乾燥酵母粉末を食してみたところ、香り、味などの風味、及び食感においては、野生型２倍体株の乾燥酵母粉末と全く変わらないものであった。
【０１０９】
（実施例６：スコーンの製造）
変異体６〜８、及び野生型２倍体株を使用して、スコーンを製造した。
薄力粉１００ｇに、４ｇの変異体６〜８、及び野生型２倍体株のいずれか、及びその他、ベーキングパウダー、砂糖、食塩、生クリーム、油脂、牛乳などを適宜加え、２４℃でミキシングし捏ね上げた後、３０℃、相対湿度７５％にて３０分ホイロ発酵を行い、２００℃にて焼成した。充分に発酵したトップの立ったスコーンが製造出来た。
変異体６〜８より得られたスコーンを食してみたところ、香り、味などの風味、及び食感においては、野生型２倍体株のスコーンと全く変わらないものであった。
【０１１０】
（実施例７：ドッグフードの製造）
変異体６〜８を使用して、ドッグフードを製造した。
イヌ用動物実験用飼料ＤＳ−Ａ（オリエンタル酵母工業（株）製）の仕込み原料に仕上がり固形物ペレット中の乾燥含量が３質量％になるように、変異体６〜８のいずれかを加え、攪拌、水を加え捏ね上げ、ペレット状に成型し、乾燥した。通常製品のＤＳ−Ａと同様に製造することが出来た。
【受託番号】
【０１１１】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１３
ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１４
ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５４
ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５５
ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８
ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９
ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の酵母は、優れた免疫賦活能を有し、安全に摂取することができるので、免疫機能が低下した消費者の免疫機能の改善、並びに、癌、アレルギー症状、感染症などの疾患の予防及び治療に、好適に利用することができる。具体的には、前記酵母は、食品素材、飼料、餌料などへの使用や、パンやビールの発酵など、食品の製造に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができる酵母、及び、これを含有する食品又は飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫とは、外部から侵入したウイルスや細菌、癌細胞などによる生体への攻撃から、生体が自己を防御する機構である。免疫には、多くの種類の細胞が関与しているが、中でもマクロファージは、全動物種に普遍的に存在しており、免疫応答の特に初期段階での働きを含めてあらゆる段階に関与することから、その重要性が認識されている。
免疫が低下すると、癌、感染症、アレルギー症状などの各種疾患が誘発されることが知られている。一方、免疫が賦活されると、発癌抑制、制癌作用、抗感染症、抗アレルギー作用、更には体調リズムの回復・恒常性維持など様々な効果が期待できる。
【０００３】
そこで、消費者の健康状態を改善することを目的として、免疫賦活作用を有する様々な化合物や微生物が提供されている。例えば、ラクトフェリンの加水分解物を用いるもの（特許文献１参照）、キチン（特許文献２参照）、トレハロース（特許文献３参照）、フコイダン（特許文献４参照）などの糖質を用いるもの、植物由来物質を用いるもの（特許文献５参照）、ペプチド（特許文献６参照）やインターロイキン（特許文献７参照）を用いるもの、核酸を用いるもの（特許文献８参照）、グルタチオン（特許文献９参照）、アミノ酸（特許文献１０参照）、ポリリジン（特許文献１１参照）を用いるもの、腸内細菌（特許文献１２参照）、乳酸菌（特許文献１３参照）、エンテロコッカス属細菌（特許文献１４参照）などの微生物を用いるもの、などが挙げられる。
また、近年では、βグルカンの免疫賦活効果が注目されており、例えば、酵母あるいはキノコ類からβグルカンを精製し、前記βグルカンを用いた免疫賦活方法が提案されている（特許文献１５〜１６参照）。
【０００４】
しかしながら、前記免疫賦活作用を有する化合物を用いて、消費者の免疫を賦活させるためには、その化合物を大量に精製して投与しなければならず、多くの作業工程、労力、及び費用を要する。また、前記免疫賦活作用を有する微生物の中には、性状が明らかではないものがあり、食品用途に適さないものがある。また、前記免疫賦活能を有する微生物は、その微生物自身が食品の製造（発酵など）に直接利用できない場合には、食品に免疫賦活能を付与するために、食品に対して別途添加する必要があった。
【０００５】
ここで、酵母の染色体上の遺伝子のうち、ＭＣＤ４遺伝子、ＧＡＳ１遺伝子、及びＣＷＨ４１遺伝子からなる群のうち、１つ又は２つ以上の遺伝子が破壊された結果、免疫賦活能を有している酵母が開示されている（特許文献１７参照）。前記特許文献１７に開示される酵母によれば、前記特許文献１５、及び１６に記載の技術のように、酵母から特にβグルカンを精製することなく、酵母をそのまま投与した場合であっても、免疫を賦活させることができる。
【０００６】
しかしながら、前記特許文献１７に開示される酵母は、遺伝子組換え技術により、前記特定の遺伝子が破壊されている。近年、遺伝子組換え技術の発達に伴い、安全性が確認された上で数多くの遺伝子組換え食品が認可乃至販売されているが、消費者から見れば、遺伝子組換えされた食物の安全性に対する不安感は依然として高い。したがって、現時点では、前記特許文献１７に開示される酵母を食用として用いることは、実用上難しい。
更に、特許文献１７に開示される酵母は、細胞壁の構造に関わる遺伝子が欠損していることから予期されるように、浸透圧が低い培地では極めて増殖が遅いことが明らかとなった。したがって、前記酵母の培養には、構造が脆くなった細胞壁に負荷を与えないように、例えば、糖を培地中に添加して培地の浸透圧を上げて、培地と酵母の細胞膜内の溶液との浸透圧を等張にしなければならず、培養コストが高くなるなどの問題があった。また、前記酵母を、例えば、パンなどの食品の発酵に用いる場合には、発酵条件が制限されたり、発酵液を等張にするために糖を添加したときに食品の風味が変化してしまったりするなどの問題があった。
【０００７】
一方、突然変異誘発法は、例えば、突然変異誘発剤、紫外線照射、放射線照射などの突然変異誘発要因により、自然変異に比べて高い頻度でＤＮＡに変異を引き起こす方法である。前記突然変異誘発法は、前記遺伝子組換え技術とは異なり、その食物が本来有している塩基配列以外の塩基配列が導入されることがない。したがって、前記突然変異誘発法により遺伝的形質が変化した食物は、現状においても比較的安全性が高いものとして消費者に受け入れられている。
【０００８】
したがって、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能であり、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率の高い酵母などの微生物は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平５−１７８７５９号公報
【特許文献２】特開平６−２７１４７０号公報
【特許文献３】特開２００３−８１８３９号公報
【特許文献４】特開２００１−１８１３０３号公報
【特許文献５】特開平６−５６６８５号公報
【特許文献６】特許第２８７３４３４号公報
【特許文献７】特開２００２−３３９５号公報
【特許文献８】特許第２５２９６０５号公報
【特許文献９】特開平１１−４９６９６号公報
【特許文献１０】特開２０００−２８１５７１号公報
【特許文献１１】特開２００３−１２８５８９号公報
【特許文献１２】特開平６−５６６７８号公報
【特許文献１３】特開平７−２２８５３６号公報
【特許文献１４】特開平１１−９２３８９号公報
【特許文献１５】特開２００１−３５４５７０号公報
【特許文献１６】特開２００３−１８３１７６号公報
【特許文献１７】特開２００６−７５０３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能であり、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率の高い酵母、及びこの酵母を含有する食品又は飼料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、現在食品製造に広く利用されている酵母に対して、エチルメタンスルホン酸を利用した突然変異誘発法により、酵母染色体上に変異を導入したところ、細胞壁のマンナンが少ない酵母を取得することができたこと；この酵母は、細胞壁のマンナンが少ないことにより、菌体表面にβグルカンが露出しているので、特にこの酵母からβグルカンを精製せずに、菌体のまま免疫賦活能試験に供しても、顕著な免疫賦活能が示されたこと；この酵母は、細胞壁のマンナンが少ないにも関わらず、予期しなかったことに低浸透圧に対して高い耐性を示し、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率が高いため、酵母そのものの製造（培養）、並びに、この酵母を含有する食品及び飼料の製造に好適に利用できることを知見した。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、対糖収率が７５質量％以上であり、ゲノム数が２倍体以上であることを特徴とする酵母である。
＜２＞ 酵母がウラシル非要求性である前記＜１＞に記載の酵母である。
＜３＞ 免疫賦活能がマクロファージ活性化能である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の酵母である。
＜４＞ 突然変異誘発法により免疫賦活能を獲得した前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の酵母である。
＜５＞ 突然変異誘発法が、突然変異誘発剤、紫外線照射、及び放射線照射のいずれかを利用する方法である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の酵母である。
＜６＞ 遺伝子組換えされていない前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の酵母である。
＜７＞ ゲノム数が２倍体以上である酵母の親株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の酵母。
＜８＞ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０のいずれかである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の酵母である。
＜９＞ 前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の酵母を含有する食品又は飼料である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安全性に優れ、菌体のまま摂取しても高い免疫賦活能を奏することができ、入手が容易で安価であり、食品の製造に直接利用可能であり、低い浸透圧でも培養可能であり、更に、培養中の凝集性が低く、対糖収率の高い酵母、及びこの酵母を含有する食品又は飼料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、変異体１〜４の顕微鏡像である。
【図２】図２は、変異体１〜４のマクロファージ活性化能試験の結果を表す図である。
【図３】図３は、変異体６〜８の顕微鏡像である。
【図４】図４は、変異体６〜８のマクロファージ活性化能試験の結果を表す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、実用菌株、及び変異体６〜８のマクロファージ活性化能試験の結果を表す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実用菌株、及び変異体６〜８のマクロファージ活性化能試験のポジティブコントロールとして用いた、ＬＰＳ刺激したマクロファージの活性化能の結果を表す図である。
【図６Ａ】図６Ａは変異体４、及び変異体６〜８をウラシル添加培地で培養した菌体の育成度合いを表す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは変異体４、及び変異体６〜８をウラシル非添加培地で培養した菌体の育成度合いを表す図である。
【図７】図７は、変異体４、及び変異体６〜８の凝集性を表す図である。
【図８】図８は、野生型２倍体株、実用菌株Ｅ、及び変異体６〜８により製造した食パンを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（酵母）
本発明の酵母は、細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、対糖収率が７５質量％以上であり、ゲノム数が２倍体以上であることを特徴とする。
【００１６】
＜マンナン＞
一般に、マンナンとは、酵母の細胞壁を構成する主要成分のひとつであり、Ｄ−マンノースを主体とする糖鎖である。前記マンナンは、タンパク質と結合したマンナンタンパク質として存在する。酵母の細胞壁においては、細胞膜の外周面に沿ってβグルカン層が形成されており、前記マンナンタンパク質は、前記βグルカンにＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカーという糖脂質を介して結合されている。その結果、マンナンは、βグルカンを覆い隠すようにして、細胞壁の最外層（即ち、菌体表面）に配される。これに対し、本発明の前記酵母においては、細胞壁のマンナンが少ないことにより、マンナンに代えてβグルカンが菌体表面に露出している。
【００１７】
前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ない理由は明らかではないが、例えば、マンナン、マンナンタンパク質、及びＧＰＩアンカーの少なくとも１つが、生合成されていない、生合成はされたが細胞膜外に輸送されない、互いの結合部位に欠損や変異が生じているなどの理由が考えられる。
【００１８】
−マンナンの検出−
前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ないことは、例えば、マンナンに特異的な抗体や、マンナン中のＤ−マンノースやメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドなどに対して特異的に結合するＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）レクチンなどを利用して確認することができる。
具体的には、前記抗体又は前記ＣｏｎＡを、例えば、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）などの蛍光色素により標識し、前記抗体又は前記ＣｏｎＡの菌体表面への結合を、蛍光により検出する（以下、「マンナン染色」と称することがある）。この場合、菌体表面に前記抗体又は前記ＣｏｎＡの結合に由来する蛍光が検出されなければ、細胞壁のマンナンが少ないと判定できる。
前記蛍光の検出は、蛍光顕微鏡下で目視により行ってもよく、例えば、フローサイトメーター、蛍光プレートリーダーなどの装置を用いて定量的に行ってもよい。
【００１９】
また、前記酵母において、細胞壁のマンナンが少ないことは、例えば、細胞壁中のマンナンの含有量を定量することにより、調べることができる。マンナンの含有量を定量する方法としては、特に制限はないが、例えば、以下の手順により定量できる。
即ち、まず、細胞をガラスビーズで破砕し、遠心によって細胞壁画分を調製し、凍結乾燥する。次に、Ｄａｌｌｉｅｓらの方法（Ｙｅａｓｔ， １４， １９９８， ｐ．１２９７−１３０６）に従い硫酸加水分解を行い、中和した後の上清を凍結乾燥し、ＲＥＺＥＸＴＭ ＲＰＭ−Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ （ＳｈｉｍａｄｚｕＧＬＣ ＬＴＤ）などのカラムを用いＨＰＬＣで解析し、グルコースとマンノースとの比を求めることで、細胞壁中のマンナンの含有量を求めることができる。
【００２０】
細胞壁中のマンナンの含有量としては、βグルカンが菌体表面に露出される程度に少なくなっている限り、特に制限はなく、細胞壁中にマンナンを有さないことがより好ましい。以下、マンナンが少なく、βグルカンが菌体表面に露出されている酵母を「グルカン露出酵母」と称することがある。
【００２１】
−βグルカン−
前記βグルカンとは、酵母の細胞壁を構成する主要成分の１つであり、グルコースがβ１−３型で結合されてなる糖鎖である。
前記βグルカンの平均分子量、及び修飾の態様としては、免疫賦活能を有する限り、特に制限はなく、酵母の種類や培養条件に応じて変化しうる。
【００２２】
前記酵母において、βグルカンが菌体表面に露出していることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、βグルカンに特異的な抗体や、アニリンブルーなどの蛍光試薬を利用して確認することができる。また、電子顕微鏡により、菌体表面のβグルカン線維を観察することにより確認することもできる。
【００２３】
＜免疫賦活能＞
前記免疫賦活能は、自然免疫を賦活する能力である。前記自然免疫とは、生体が備える免疫のうち、生体に先天的に備わっており、事前に抗原に暴露していなくても前記抗原を生体から排除するに際に機能する機構を意味する。前記抗原としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、例えば、ウイルスや細菌などの外来の抗原、及び癌細胞などの内来の抗原などが挙げられる。
【００２４】
前記免疫賦活能としては、前記自然免疫を賦活できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食細胞（マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞）、抗原提示細胞（マクロファージ、樹状細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多形核白血球（好酸球、好塩基球、肥満細胞）などの活性化能がなど挙げられる。これらの中でも、各種生物に広く存在し、抗原を排除する効果が高い点で、前記マクロファージの活性化能が好ましい。
【００２５】
前記酵母が免疫賦活能を有する理由としては、細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有するβグルカンが菌体表面に露出しているためと考えられている。
【００２６】
−免疫賦活能の評価−
前記酵母が前記免疫賦活能を有することを評価する方法としては、特に制限はなく、自然免疫に関与する前記細胞の種類に応じた従来公知の評価方法の中から、適宜選択することができる。
例えば、前記マクロファージの活性化能の評価は、マクロファージに対して、培地又は緩衝液中で前記酵母を接触させることにより、前記マクロファージを刺激し、刺激前後において前記マクロファージが産生するサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α）など）の量を測定することで行うことができる。
【００２７】
＜浸透圧に対する耐性＞
一般に、酵母を含む一部の微生物や、植物が備える細胞壁は、浸透圧への耐性や細胞形態の維持など、極めて重要な機能を有している。
これに対して、本発明の前記酵母は、前記したように細胞壁のマンナンが少ないので、浸透圧への耐性が失われることが危惧されていた。しかしながら、本発明者らにより製造された酵母は、予期しなかったことに浸透圧への耐性を有していることが、後述する実施例より明らかとなっている。
【００２８】
−浸透圧に対する耐性の評価−
本発明の前記酵母が低浸透圧に対して耐性であることを示す指標としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であることが好ましい。ただし、前記ＹＰＤ液体培地としては、１質量％ イーストエキス，２質量％ ペプトン，２質量％ グルコースの組成のものを用いる。また、前記ＹＰＤ液体培地に用いるイーストエキスとしては、オリエンタル酵母工業（株）製のものを使用し、ペプトンとしては、日本製薬（株）製のものを使用し、グルコースとしては、国産化学（株）製のものを使用することとする。前記浸透圧は、例えば、ソルビトールなどの非発酵性糖類、ＮａＣｌなどにより調節することができる。前記浸透圧は、例えば、浸透圧計Ｆ−２０００（ｒｏｅｂｌｉｎｇ社製）により測定することができる。
【００２９】
本発明における「増殖可能」とは、ＹＰＤ寒天培地（１質量％ イーストエキス、２質量％ ペプトン、２質量％ グルコース、２質量％ 寒天）で培養した前記酵母を、高浸透圧培地であるＹＰＤ液体培地に１白金耳植菌し、適切な条件で一晩振盪培養したときに、対糖収率が７５質量％以上であることを意味する。前記対糖収率とは、１ｇの糖当たりに回収される前記酵母の湿質量をいう。
前記対糖収率は、例えば、前記培養で得た前記酵母の懸濁液を蒸留水で洗浄後、前記酵母の乾燥（ＤＭ）質量を測定し、１ｇの糖当たりに回収される前記酵母の湿質量（水分含有量を６７質量％として）（ｇ）を算出する方法などが挙げられる。
【００３０】
前記酵母は、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であるので、例えば、培地の浸透圧を上げるために糖などを添加する必要がなくなり、培養コストを低減させることができる点で有利である。また、前記酵母を食品に添加する場合には、培養後に低浸透圧の溶液で洗浄しても菌体が破壊されないので、生菌の回収率を高めることができ、食品の製造効率を上げることができる点でも有利である。
【００３１】
＜株＞
本発明の前記酵母が栄養要求性を有するか否かは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、栄養非要求性株が、培養コストを低減させることができる点で好ましい。前記栄養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウラシルなどが挙げられる。
【００３２】
−培地中のウラシル含有量−
スクリーニングが行われる際、酵母がウラシル要求性か否かを判断する場合には、使用するＹＰＤ液体培地に、グルコースの含有量に対して、０．３質量％以上のウラシルを含有させてスクリーニングを行うこととする。即ち、ＹＰＤ液体培地に対するグルコースの含有量が２質量％である場合には、ＹＰＤ液体培地に対するウラシルの含有量は、６×１０−３質量％以上である。
また、スクリーニングが行われる酵母が他の要求性を有している場合には、使用するＹＰＤ液体培地に、その要求される物質を充分量含有させてスクリーニングを行うこととする。
【００３３】
＜酵母の種類＞
前記酵母の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、味噌醤油酵母などが挙げられる。これらの中でも、パン酵母が好ましい。
【００３４】
前記酵母としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ウイリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属などが挙げられる。
【００３５】
前記酵母の種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｉｔｏａｎａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｌｉｇｅｒａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ、などが挙げられる。
これらの中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓが好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが特に好ましい。
【００３６】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０が好ましく、免疫賦活能が高い点で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０がより好ましく、更に、製造（培養）中の凝集性が低く、対糖収率が高いなど、製造適性が良好な点で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｐ−２１７２９が特に好ましい。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０は、本発明者らにより製造された株であり、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３７】
＜培養方法＞
前記酵母の培養方法としては、特に制限はなく、従来公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バッチ培養、流加培養などが挙げられる。
前記培養は、ジャーファーメンターを用いて好適に行うことができ、このときのジャーファーメンターにおける条件としては、特に制限はなく適宜決定することができるが、例えば、培養温度としては２８℃〜３３℃程度であり、培養時間としては１時間〜１２０時間程度であり、ｐＨとしてはｐＨ４〜ｐＨ７程度であり、通気量としては０ｖｖｍ〜５ｖｖｍ程度であり、攪拌速度としては１００ｒｐｍ〜７００ｒｐｍ程度である。
【００３８】
−流加培養−
前記流加培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＹＰＤ培地で培養した種酵母を３００ｇ〜５００ｇ使用し、所定の培地に播種した後、総添加量が、糖量（蔗糖換算）１，０００ｇ〜２，０００ｇ、尿素１００ｇ〜２００ｇ、リン酸１ナトリウム２０ｇ〜４０ｇの条件にて、２８℃〜３３℃で連続流加する方法などが挙げられる。
【００３９】
＜製造方法＞
前記ゲノム数が２倍体以上の酵母の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食品用途に使用可能な酵母を親株とし、この親株に対して突然変異誘発法により染色体上に変異を誘発することにより製造する方法、食品用途に使用可能な酵母を親株とし、この親株において自然突然変異により染色体上に変異を生じさせる方法、２倍体の野生株に突然変異誘発法を施す方法などが挙げられる。
前記食品用途に使用可能な親株としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前述した＜酵母の種類＞の項目において例示した酵母を利用することができる。
前記ゲノム数が２倍体以上の酵母の親株としては、１倍体の株でもよく、前記１倍体の株を交雑することで、２倍体を得ることができる。
【００４０】
−突然変異誘発法−
前記突然変異誘発法とは、例えば、突然変異誘発剤、紫外線照射、放射線照射などの突然変異誘発要因により、自然突然変異に比べて高い頻度でＤＮＡに変異を引き起こす方法を意味する。前記突然変異誘発法を用いることにより、親株が本来有している塩基配列以外の塩基配列が導入されることなく、染色体上に変異を生じさせることができる。
前記突然変異誘発剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エチルメタンスルホン酸、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシルなどが挙げられる。
前記放射線としては、例えば、Ｘ線、α線、β線、γ線、粒子線などが挙げられる。
前記突然変異誘発法は、前記食品用途に使用可能な酵母が本来有する塩基の中で変異が起こることから、遺伝子組換えとは異なり安全性が高いため、食品に利用できる点で有利である。
【００４１】
前記突然変異誘発法又は前記自然突然変異により変異が生じる遺伝子としては、親株が免疫賦活能を獲得できる限り、特に制限はなく、例えば、ＲＰＳ１２，ＭＲＳ６，ＧＰＢ１，ＲＡＤ１７，ＮＤＤ１，ＳＣＰ１，ＭＣＤ４，ＧＡＳ１，ＣＷＨ４１などの遺伝子が挙げられる。また、これらの遺伝子以外の染色体上の塩基配列が変異していてもよい。
また、前記変異の種類としても、親株が免疫賦活能を獲得できる限り、特に制限はなく、例えば、塩基置換、挿入、欠失、逆位などが挙げられる。
【００４２】
−−１倍体の１次スクリーニング−−
前記突然変異誘発法により得た１倍体変異株から、マンナンの少ない株をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マンナンの少ない株のＳＤＳに対する感受性を利用する方法などが挙げられる。ＳＤＳ添加培地と、ＳＤＳ非添加培地との前記１倍体変異株の増殖を比較して、前記ＳＤＳ添加培地で増殖が遅い株、若しくは死滅する株を選択することで、マンナンの少ない株（グルカン露出酵母）を得ることができる。
【００４３】
−−１倍体の２次スクリーニング−−
グルカン露出酵母１倍体株をスクリーニングする方法として、前記１次スクリーニングで得られた１倍体変異株を、更に前記マンナン染色することで、よりマンナンの少ない株を選択することが好ましい。
【００４４】
−−１倍体の３次スクリーニング−−
前記２次スクリーニングで得られたグルカン露出酵母１倍体株から、免疫賦活能を有する株をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前述した免疫賦活能の評価方法を用いることができる。
【００４５】
−グルカン露出酵母２倍体株の製造−
グルカン露出酵母２倍体株は、前記１倍体の３次スクリーニングで得られた免疫賦活能を有するグルカン露出酵母１倍体株と、１倍体の野生株とを交雑させた株を親株とし、その子孫として得ることができる。
【００４６】
−−免疫賦活能を有するグルカン露出酵母１倍体株−−
前記グルカン露出酵母１倍体株としては、免疫賦活能を有し、マンナンが少ない株であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前述したグルカン露出酵母１倍体株の製造により得られた株が好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５５がより好ましい。
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５５は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４７】
−−２倍体の親株の製造−−
前記グルカン露出酵母２倍体株の親株は、前記グルカン露出酵母１倍体株と、１倍体の野生株とを交雑させることにより得ることができる。前記交雑の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、常法を用いることができる。
ここで、前記グルカン露出酵母１倍体株の形質が、ウラシル要求性かつマンナンが少ない株（以下、「ウラシル（−）・マンナン（−）株」と称することがある。）であり、前記１倍体の野生株が、ウラシル非要求性かつマンナンが正常である株（以下、「ウラシル（＋）・マンナン（＋）株」と称することがある。）である場合、これらを交雑させた２倍体株は、ウラシル要求性、及びマンナンの形質において、ヘテロ型となる。この場合、前記２倍体株は、胞子分離させ、再び１倍体株を得た後、所望の形質を有する前記胞子分離後の１倍体株同士を交雑させることで、ウラシル要求性、及びマンナンの形質において、ホモ型の２倍体株を得ることができる。
【００４８】
−−２倍体の１次スクリーニング−−
前記グルカン露出酵母２倍体株の所望の形質としては、ウラシル非要求性であることが、培養コストを低減させることができる点で好ましい。そのため、１次スクリーニングでは、前記胞子分離後の１倍体株から、ウラシル非要求性かつマンナンが少ない株（以下、「ウラシル（＋）・マンナン（−）株」と称することがある。）をスクリーニングすることが好ましい。
前記１次スクリーニングの方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウラシルを含有していない培地を用い、ウラシル非添加培地で増殖可能な株を選択した後、更に前述した１倍体の１次スクリーニングと同様に、ＳＤＳに対する感受性を利用して、前記ＳＤＳ添加培地で増殖が遅い株、若しくは死滅する株を選択する方法を用いることができる。
前記ウラシルを含有していない培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＤ培地（０．６７質量％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｗ／Ｏ アミノ酸）、２質量％ グルコース、２質量％ 寒天）などが挙げられる。
【００４９】
−−ウラシル非要求性グルカン露出酵母２倍体の製造−−
前記ウラシル（＋）・マンナン（−）株の１倍体から２倍体株を得る方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ウラシル（＋）・マンナン（−）株の１倍体の接合型を確認し、メイティングマトリクス判定を行うことにより得ることができる。
前記接合型を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記１次スクリーニングで得られた１倍体株と、接合型が既知の株とを共培養し、目視で凝集を確認する方法などが挙げられる。
【００５０】
−−２倍体の２次スクリーニング−−
前記メイティングマトリクス判定により得られた前記ウラシル（＋）・マンナン（−）株の２倍体の中から、更にマンナンの少ないグルカン露出酵母２倍体株を選択するために、２次スクリーニングを行うことが好ましい。
前記２次スクリーニングの方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前述した１倍体の２次スクリーニングと同様の方法を用いることができる。
【００５１】
−−２倍体のマクロファージ活性化能の評価−−
前記２倍体の２次スクリーニングで得られたグルカン露出酵母２倍体株の免疫賦活能を評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前述した１倍体の３次スクリーニングと同様の方法を用いることができる。
【００５２】
＜製造適性の検討＞
前記酵母は、ゲノム数が２倍体以上であることから、１倍体における問題、即ち、１倍体は接合能を有するためコンタミにより性質が変化するといった問題を解消でき、安定した酵母である点、１倍体と比較して優れた増殖能を有する点、１倍体と比較して凝集性が低い点、栄養非要求性であり培養コストを低減させることができる点で、製造において有利である。
前記グルカン露出酵母２倍体の製造適性を検討する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、対糖収率、栄養要求性、凝集性などを指標に検討する方法などが挙げられる。
【００５３】
−対糖収率−
前記対糖収率とは、前述した通りであり、前記対糖収率が高い場合は、前記酵母の収率が高いこと、即ち、増殖能が高いことを示す。
前記対糖収率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７５質量％以上が好ましく、８０質量％以上がより好ましく、９５質量％以上が更に好ましい。前記好ましい範囲内であると製造コストを低減させることができる点で有利である。
【００５４】
−栄養要求性−
前記酵母の栄養要求性は、前述した通り、栄養非要求性であることが、培養コストを低減させることができる点で好ましい。
前記酵母が栄養非要求性であるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウラシルを添加していない培地に前記酵母を接種し、ウラシルを添加していない培地で増殖可能であることを確認する方法などが挙げられる。
【００５５】
−凝集性−
前記酵母は、凝集性を有さないことが好ましい。前記酵母が凝集性を有していると、製造工程でセパレーターに目詰まりするなどの点で問題である。
前記酵母が凝集性を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＹＰＤ液体培地を用い、適切な条件で一晩培養した後、前記酵母を光学顕微鏡で観察することにより確認する方法などが挙げられる。
【００５６】
＜用途＞
前記酵母の用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、食品に添加されて用いられる食品素材、飼料、餌料などとしての用途が好ましく、前記食品素材としての用途が特に好ましい。また、前記酵母は、例えば、パンやビールの発酵など、食品の製造に好適に用いることができる。本発明の酵母を用いることにより、免疫賦活能を有する食品、免疫賦活能を有する飼料、免疫賦活能を有する餌料などが得られる。このとき、前記酵母は、菌体が破砕されない状態のまま使用されてもよいし、破砕された状態で使用されてもよく、また、乾燥された状態で使用されてもよいし、生菌乃至未乾燥の状態で使用されてもよい。
前記破砕の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ダイノミルなどの物理的破砕処理であってもよいし、化学的破砕処理であってもよい。
【００５７】
前記酵母の適用対象としては、自然免疫を有する限り、特に制限はなく、例えば、ヒト、ヒトを除く動物（ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物、鶏、アヒル、七面鳥、ダチョウなどの家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズなどの魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミなどの甲殻類など、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキなどの貝類、ペット動物としてイヌ、ネコなど）などが挙げられる。
【００５８】
（食品又は飼料）
本発明の食品又は飼料は、前記酵母を含有することを特徴とする。
前記食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パン、ビスケットやスコーンなどの製菓、病院食、流動食、水産・食肉加工品、麺類、調味料、ビールやジュースなどの飲料、健康食品、健康飲料などが挙げられる。
前記飼料としては、特に制限はなく、適用対象に応じて適宜選択することができる。前記適用対象としては、特に制限はなく、例えば、前記酵母の用途の項目で例示した適用対象が挙げられる。
前記食品又は飼料は、高い免疫賦活能を有する前記酵母を含有していることにより、高い免疫賦活能を有している。
【実施例】
【００５９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に何ら限定されるものではない。
【００６０】
（実施例１：免疫賦活能を有する２倍体の酵母）
＜グルカン露出酵母１倍体株の製造＞
−自然突然変異体の選択−
突然変異誘発法に供する親株としては、実用パン酵母の１倍体であるＴ−２１株（オリエンタル酵母工業（株）製）のウラシル要求性変異株Ｔ−２１Ｕ株を用いた。
前記Ｔ−２１Ｕ株は、Ｔ−２１株をＹＰＤ液体培地で培養した後、５−フルオロオロチン酸を含む培地（０．７質量％ ＹＥＡＳＴ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ（ＤＩＦＣＯ社製）、２質量％ グルコース、０．１質量％ ５−フルオロオロチン酸、０．０５質量％ ウラシル、２質量％ 寒天）に塗沫し、３０℃で３日間培養して生育させることにより、自然突然変異体として選択された菌株である。
【００６１】
−突然変異誘発法−
ウラシル含有ＹＰＤ液体培地（１質量％ イーストエキス（オリエンタル酵母工業（株）製）、２質量％ ペプトン（日本製薬（株）製）、２質量％ グルコース（国産化学（株）製）、６×１０−３質量％ ウラシル（和光純薬工業（株）製）、以下同じ）を用いて、前記親株（Ｔ−２１Ｕ株）を一晩培養した。培養菌体をエッペンチューブ２本に分注し、遠心分離し集菌した。上清を除去し、滅菌水で２度洗浄し、０．１Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ、以下同じ）リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に菌体を懸濁した。３０μＬのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）（和光純薬工業（株）製）を混合し、３０℃で１時間、振とうしながらインキュベートした。菌体を遠心により回収し、上清を捨て、２００μＬの５質量％ チオ硫酸ナトリウムに再懸濁した。懸濁液を新しいチューブに移し、遠心回収、２００μＬの５質量％ チオ硫酸ナトリウムによる洗浄を２度行なった。菌体を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、適度に希釈した後に、ＹＰＤ寒天培地に塗布した。
この突然変異誘発法により得た１倍体の酵母群の中から、マンナンが少なく、免疫賦活能を有する酵母を、下記１次〜３次スクリーニングによりスクリーニングした。
【００６２】
−１倍体の１次スクリーニング−
１次スクリーニングとして、細胞壁変異株の選択を行った。前記細胞壁変異株の選択は、下記３種の寒天培地を用い、各培地に菌体を塗布した後、３０℃で３日間培養し、下記評価方法により行った。
【００６３】
−−培地−−
前記細胞壁変異株の選択に用いた培地は、下記３種の培地である。
（１）ウラシル含有ＹＰＤ寒天培地（１質量％ イーストエキス、２質量％ ペプトン、２質量％ グルコース、６×１０−３質量％ ウラシル、２質量％ 寒天）
（２）ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地（０．２質量％ イーストエキス、０．４質量％ ペプトン、０．４質量％ グルコース、１．２×１０−３質量％ ウラシル、２質量％ 寒天）
（３）ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地
【００６４】
−−評価方法−−
細胞壁変異株の評価方法としては、下記（１）、及び下記（２）を満たす株を選択した。
（１）ウラシル含有ＹＰＤ寒天培地とウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地で増殖が遅く、かつ、
（２）ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地と、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地で増殖が遅い株（あるいは死滅する株）。
【００６５】
−−結果−−
１次スクリーニングを行った結果、３，１２０株の変異体が得られた。
【００６６】
−１倍体の２次スクリーニング−
−−方法−−
２次スクリーニングとして、ＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡによるマンナン染色を行った。コロニーを爪楊枝でかきとり、ＰＢＳ＋１．０Ｍソルビトール溶液に懸濁した。遠心回収し、ＰＢＳ＋１．０Ｍソルビトール溶液で再懸濁した後に、ＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）に混合し、室温、遮光下で３０分間放置した。１回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いてＢｌｕｅ励起光下で菌体を観察した。全体的に観察したときに殆ど蛍光が見られず、撮像した写真上で蛍光が確認できない株を選択した。
【００６７】
−−結果−−
前記２次スクリーニングの結果、前記１次スクリーニングで得た３，１２０株から４株（変異体１〜４）を選択した。
図１は、変異体１〜４の顕微鏡像であって、上段は光学顕微鏡像であり、下段はマンナン染色後に観察された蛍光顕微鏡像である。図１において、変異体１〜４は、蛍光がほとんど観察されず、特に変異体２〜４は、蛍光が全く観察されていない。
【００６８】
なお、変異体１は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１３であり、変異体２は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１４であり、変異体３は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５４であり、変異体４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５５であり、４株とも、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。
【００６９】
−１倍体の３次スクリーニング−
−−方法−−
３次スクリーニングとして、変異体１〜４のマクロファージ活性化能を測定した。変異体１〜４を遠心集菌し、エタノールで処理後、滅菌水で２度洗浄した。更にＲＰＭＩ−１６４０培地で１度洗浄した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、血球計算盤で酵母数をカウントした。酵母濃度が、規定量となるように調製し、サンプルとした。
マクロファージは、培養２日目の細胞を使用した。培養したマクロファージを培養フラスコから回収し、新しい培地で２度洗い、血球計算盤で細胞数をカウントした。マクロファージの細胞濃度が、規定量となるように調製し、活性測定用のマクロファージ培養液とした。
【００７０】
前記マクロファージ培養液を２４穴プレートに分注し、前記サンプルを酵母対マクロファージの細胞数の割合が３０：１になるように混合した。これを３７℃、５％ＣＯ２の条件で、６時間培養した後、培養液をチューブに取り、遠心した。上清を回収し、上清中に含まれるＴＮＦ−αのタンパク量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−α Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して測定した。マクロファージ活性化に対するポジティブコントロールとしては、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、和光純薬工業（株）製）を用いた。
【００７１】
−−結果−−
図２は、変異体１〜４についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。図２において、変異体３、４は、親株（Ｔ２１−Ｕ株）に比べ、非常に強いマクロファージ活性化能（免疫賦活能）を有することが示された。
３次スクリーニングの結果、変異体１〜４の４株の中から、１株（変異体４）を選択し、グルカン露出酵母２倍体の製造に用いた。
【００７２】
＜２倍体株の製造＞
前記変異体４と、実用パン酵母の１倍体であるＴ−１９（オリエンタル酵母工業（株）製）とを交雑し、２倍体の変異体５を製造した。前記変異体５を胞子分離させ、胞子分離した酵母群（以下、「変異体５胞子分離株」と称することがある。）を、下記１次スクリーニングに用いた。
【００７３】
−２倍体の１次スクリーニング−
１次スクリーニングとして、ウラシル非要求性、かつ細胞壁変異株の選択を行った。
【００７４】
−−ウラシル非要求性株の選択−−
−−−方法−−−
ウラシル非要求性株の選択は、ＳＤ培地（０．６７質量％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社））、２質量％ グルコース、２質量％ 寒天）を用い、前記ＳＤ培地に菌体をスポットして生育した菌株を選択した。
【００７５】
−−細胞壁変異株の選択−−
細胞壁変異株の選択は、下記３種の培地を用い、各培地に菌体をスポットし、３０℃で３日間培養した後に、下記評価方法により行った。
【００７６】
−−−培地−−−
前記培地は、下記３種の培地を用いた。
（１） ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地（０．２質量％ イーストエキス、０．４質量％ ペプトン、０．４質量％ グルコース、６×１０−３質量％ ウラシル、２質量％ 寒天）
（２） ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０２質量％ ＳＤＳ寒天培地
（３） ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地
【００７７】
−−−評価方法−−−
細胞壁変異株の評価方法としては、下記（１）、及び下記（２）を満たす株を選択した。
（１）ウラシル含有１／５ＹＰＤ寒天培地とウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０２質量％ ＳＤＳ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０２質量％ ＳＤＳ寒天培地で増殖が遅く、かつ、
（２）ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０２質量％ ＳＤＳ寒天培地と、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地とを比較したときに、ウラシル含有１／５ＹＰＤ＋０．０５質量％ ＳＤＳ寒天培地で増殖が遅い株（あるいは死滅する株）。
【００７８】
−メイティングマトリクス判定−
前記１次スクリーニングにより得られた１倍体株（変異体５胞子分離株）の接合型（α型株、若しくはａ型株）を下記方法により確認し、メイティングマトリクス判定を行った。
【００７９】
−−接合型の確認−−
９６穴プレートにＹＰＤ培地を分注し、爪楊枝を用いて変異体５のセグリガントを接種した後、３０℃で一晩静置培養した。ＹＰＤ培地入りφ１６ｍｍ試験管に、テスター株（接合型が既知の株）であるＸ−２１８０Ａ（ＡＴＣＣ社製）と、Ｘ−２１８０Ｂ（ＡＴＣＣ社製）とをそれぞれ接種し、３０℃で一晩振盪培養した。２４穴プレートにＹＰＤ培地を分注し、セグリガント培養液を添加した。更に、Ｘ−２１８０Ａ又はＸ−２１８０Ｂの培養液を添加し、３０℃で４時間静置培養をした。その後、目視で凝集を観察することで、接合型を確認した。
【００８０】
−２倍体株の造成−
前記α型株と、前記ａ型株とをそれぞれＹＰＤ培地中にて、３０℃で１日間培養することで増殖させた。両菌数を同程度として、両酵母を新たなＹＰＤ培地に入れ、３０℃で１２時間培養した。接合酵母を分離し、ＹＰＤ寒天培地に塗布して、１日間〜２日間、３０℃で振盪培養し、比較的大きなコロニーを２倍体として分離した。分離したコロニーについて、接合性を有していないこと、及び顕微鏡下で１倍体よりも大きくなっていることを観察し、２倍体の造成を確認した。２倍体は、７０株得られた。
なお、これらの株は、ＹＰＤ培地で生育、及び増殖可能であったことから、マンナンが少ないにもかかわらず浸透圧耐性を有することが認められた。
【００８１】
−２倍体の２次スクリーニング−
−−方法−−
２次スクリーニングとして、ＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡによるマンナン染色を行った。マンナン染色は、前記１倍体の２次スクリーニングと同様の方法で行った。なお、２次スクリーニングは再現性を確認するため３回行った。
【００８２】
−−結果−−
前記２次スクリーニングの結果、前記２倍体７０株から３株（変異体６〜８）を選択した。
図３は、変異体６〜８の顕微鏡像であって、上段は光学顕微鏡像であり、下段はマンナン染色後に観察された蛍光顕微鏡像である。
【００８３】
なお、変異体６は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８であり、変異体７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９であり、変異体８は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０であり、３株とも、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている。
【００８４】
−マクロファージ活性化能−
前記変異体６〜８のマクロファージ活性化能を下記方法により測定した。
【００８５】
−−サンプル処理−−
対数増殖期（培養１２時間）の変異体６〜８を、遠心集菌し、７０質量％ エタノールで６０分間処理した後、滅菌水で２度洗浄した。更にＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）で１度洗浄した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、血球計算盤で酵母数をカウントした。酵母濃度が、３．０×１０７細胞／ｍＬになるように調製し、サンプルとした。
【００８６】
−−細胞の調製−−
マウスのマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７、ＡＴＣＣ社製）は、培養２日目の細胞を使用した。培養したＲＡＷ２６４．７細胞を培養フラスコから回収し、新しいＲＰＭＩ−１６４０培地で２度洗浄後、血球計算盤で細胞数をカウントした。ＲＡＷ２６４．７細胞の細胞濃度が、１．０×１０６細胞／ｍＬとなるように調製し、活性測定用のＲＡＷ２６４．７細胞培養液とした。
【００８７】
−−マクロファージ活性化能測定−−
ＲＡＷ２６４．７細胞培養液を２４穴プレートに０．２５ｍＬずつ分注し、前記サンプルを酵母対マクロファージの細胞数の割合が３０：１になるように混合した。これを３７℃、５％ＣＯ２下で、６時間培養した後、培養液をチューブに取り、２，０００×ｇで１分間遠心分離を行った。上清を回収し、上清中に含まれるＴＮＦ−αのタンパク量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ−α Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して測定した。測定には、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ Ｍｏｄｅｌ−６８０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用した。マクロファージ活性化に対するポジティブコントロールとしては、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、和光純薬工業（株）製）０．２μｇ／ｍＬを用いた。
【００８８】
−−結果−−
図４は、変異体６〜８についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。図４中、野生型２倍体株は、実用パン酵母の１倍体であるＴ−１９株と（オリエンタル酵母工業（株）製）、Ｔ−２１株（オリエンタル酵母工業（株）製）とを交雑した株である。
前記野生型２倍体株のＴＮＦ−α濃度が約９００ｐｇ／ｍＬであったのに対し、変異体６は約１，７５０ｐｇ／ｍＬ、変異体７は約２，２５０ｐｇ／ｍＬ、変異体８は２，１００ｐｇ／ｍＬと、いずれも高い活性が確認された。
これらの結果より、変異体６〜８は、野生型２倍体に比べ、ＴＮＦ−α産生誘導能が高く、非常に強いマクロファージ活性化能（免疫賦活能）を有することが示された。
【００８９】
（実施例２：実用菌株とのマクロファージ活性化能の比較）
前記変異体６、前記変異体７、及び前記変異体８のマクロファージ活性化能と、実用菌株Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ（全てオリエンタル酵母工業（株）製）のマクロファージ活性化能とを下記方法により測定し、比較した。
なお、前記実用菌株Ａ〜Ｄのゲノム数は、２倍体の酵母である。
【００９０】
＜サンプル処理＞
ＹＰＤ培地（１質量％ イーストエキス，２質量％ ペプトン，２質量％ グルコース）５ｍＬに、各菌株を１白金耳植菌し、３０℃で２日間振盪培養した。前記培養で得た酵母懸濁液を蒸留水（大塚製薬（株）製）で２回洗浄した後、各菌株の乾燥（ＤＭ）質量を測定した。遠心集菌し、７０質量％ エタノールで６０分間処理した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２度洗浄した後、牛血清（ＣＥＬＬＥＣＴ社製）を１０質量％含むＲＰＭＩ−１６４０培地に１，０００μｇ（ＤＭ質量）／ｍＬになるように懸濁した。
【００９１】
＜細胞の調製＞
ＲＡＷ２６４．７は、実施例１と同様の方法で培養し、細胞懸濁液を、１．０×１０６細胞／ｍＬとなるように調製した。
【００９２】
＜マクロファージ活性化能測定＞
ＲＡＷ２６４．７細胞培養液を４８穴プレートに０．５ｍＬずつ分注し、３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２の条件化で２時間培養を行った。ＲＡＷ２６４．７細胞の接着を確認した後、培養上清を除去し、前記サンプル１，０００μｇ／ｍＬを０．５ｍＬ添加して、２４時間培養を行った。培養上清回収し、実施例１と同様の方法でＴＮＦ−αのタンパク量を測定した。マクロファージ活性化に対するポジティブコントロールとしては、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、和光純薬工業（株）製）０．００１μｇ／ｍＬを用いた。
【００９３】
＜結果＞
図５Ａは、実用菌株Ａ〜Ｄ、及び変異体６〜８についてのマクロファージ活性化能試験の結果を示す図である。図５Ｂは、ポジティブコントロールとして用いた、ＬＰＳ刺激したマクロファージの活性化能を示す図である。
実用菌株のＴＮＦ−α濃度は、約３００ｐｇ／ｍＬ〜５００ｐｇ／ｍＬであり、野生型２倍体株のＴＮＦ−α濃度は、約６００ｐｇ／ｍＬと同程度であった。
一方、変異体６は約８００ｐｇ／ｍＬ、変異体７は約１，０００ｐｇ／ｍＬ、変異体８は約８００ｐｇ／ｍＬと、いずれも野生型２倍体株と比較して高い活性が確認された。これらの中でも、変異体７が最も高い活性を示した。
これらの結果より、変異体６〜８は、野生型の２倍体株、及び実用菌株と比べ、ＴＮＦ−α産生誘導能が高く、非常に強いマクロファージ活性化能（免疫賦活能）を有することが示された。
【００９４】
（実施例３：製造適性）
変異体６〜８について、下記方法により、製造適正の検討を行った。比較対照としては、１倍体の変異体４を用いた。
【００９５】
＜対糖収率＞
−方法−
ウラシル含有ＹＰＤ寒天培地（組成は、実施例１と同様）で培養した変異体４、及び変異体６〜８を、それぞれ６×１０−３質量％ ウラシルＹＰＤ液体培地５ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養を行った。前記培養で得た各変異体懸濁液を蒸留水で洗浄後、各菌株の乾燥（ＤＭ）質量を測定した。
対糖収率は、酵母の水分含有量を６７質量％として、１ｇの糖当たりに回収される前記各変異体の湿質量（ｇ）より算出した。
結果を下記表１に示す。
【００９６】
【表１】
【００９７】
−結果−
２倍体株である変異体６〜８は、８０質量％以上の対糖収率を示したのに対し、１倍体株である変異体４の対糖収率は、４質量％と非常に低かった（表１）。
これらの結果より、１倍体株である変異体４の増殖能は低く、２倍体株である変異体６〜８は、変異体４と比較して、非常に高い増殖能を有することが認められた。
【００９８】
＜栄養要求性＞
−方法−
ＳＤ培地に２×１０−３質量％ ウラシルを添加した寒天培地（以下、「ウラシル添加培地」と称することがある。）、若しくはウラシルを添加していない寒天培地（以下、「ウラシル非添加培地」と称することがある。）に、変異体４、及び変異体６〜８をそれぞれ塗布し、３０℃で２日間培養後、生育度合を確認した。
【００９９】
−結果−
図６Ａにウラシル添加培地の結果を、図６Ｂにウラシル非添加培地の結果を示す。
これらの結果より、変異体４は、ウラシル添加培地では生育したが、ウラシル非添加培地では生育しなかったことから、ウラシル要求性であることが確認された。
一方、変異体６〜８は、ウラシル添加培地においても、及びウラシル非添加培地においても生育していることが確認されたことから、変異体６〜８はウラシル非要求性株であり、低製造コストで製造可能であることが認められた。
【０１００】
＜凝集性＞
−方法−
変異体４、及び変異体６〜８を、それぞれ６×１０−３質量％ ウラシルＹＰＤ液体培地５ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養を行った。培養後の各変異体の菌体の形態を光学顕微鏡にて４００倍で観察した。
【０１０１】
−結果−
各変異体の顕微鏡像を図７に示す。
１倍体株である変異体４は、凝集性が非常に高かった。変異体８も凝集性が認められたが、その凝集の度合いは、変異体４よりも低かった。変異体４はセパレーターの目詰まりを起こし、製造上問題があったが、変異体８はセパレーターの目詰まり起こさず、製造上問題ないものであった。変異体６〜７は、凝集性が認められなかった。
これらの結果より、２倍体株は、１倍体株と比較して凝集性が低いことから、製造適性に優れることが認められた。
【０１０２】
（実施例４：食パンの製造）
変異体６〜８を使用して、食パンを製造した。比較対照としては、野生型２倍体株を使用した。
【０１０３】
＜圧搾酵母の製造＞
ＹＰＤ液体培地で培養した変異体６〜８、実用菌株Ｅ、及び野生型２倍体株を種酵母として、流加培養を実施した。糖量（蔗糖換算）１，４００ｇ、尿素１４０ｇ、リン酸１ナトリウム２８ｇの条件にて、３０Ｌジャーファーメンターを用いて容量１５Ｌにて連続流加し培養した。流加方法は常法に従った。培養終了後、培養ブロスを分離・水洗・ろ過して圧搾生酵母を得た。
【０１０４】
＜食パンの製造方法＞
食パンは、日本イースト工業会（平成８年８月）を参照し、製造した。即ち、砂糖と、食塩とを、水の一部を用いて溶解し、ミキサーボール中のミリオン（日清製粉（株）製）及びナンバーワン（日清製粉（株）製）に加え、更に残りの水を添加した。次いで、前記したように製造した変異体６〜８、実用菌株Ｅ、及び野生型２倍体株のいずれかの圧搾酵母、及びショートニング（ミヨシ油脂（株）製）をミキサーボールへ添加し、ミキシングを行った。ミキシングは、２８℃にて、製パン用ミキサー（関東混合機工業（株）製）で、低速（Ｌ）１分間、中速（Ｍ）４分間行い、パン生地を捏ね上げた後、更にバッティングを１０回行った。捏ね上げ後、パン生地をビーカーに移し、２８℃の定温器内でパン生地が１，７５０ｍＬになるまでの時間を測定し、第１発酵を行った。５回〜６回パンチすることによりガス抜きした後、ビーカーに戻し、更に２８℃で３０分間第２発酵を行い、ビーカーの目盛りからパン生地の体積を測定した。発酵後、３６０ｇに分割し、丸めを行ってから２８℃で２０分間のベンチタイムをとった。次いで、モルダー（規格用ローフ型）を通し成型し、３８℃、相対湿度８５％のホイロ内で型上２ｃｍになるまでの時間を測定した。ホイロ発酵終了後、２００℃にて２０分間焼成した。焼成後のパンの体積（ｃｍ２）、長さ（ｍｍ）、幅（ｍｍ）、高さ（ｍｍ）、及び質量（ｇ）を測定した。
各材料の配合を表２に示す。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
＜結果＞
第１発酵の時間、ホイロの発酵時間、焼成後のパンの体積、長さ、幅、高さ、及び質量を測定した結果を表３に示す。また、焼成後のパンを図８に示す。
【０１０７】
【表３】
表３、及び図８より、変異体６〜８により得られた食パンは、第１発酵時間、ホイロ発酵時間、体積、長さ、幅、高さ、質量、及び外形において、実用菌株Ｅ、及び野生型２倍体株と全く変わらないものであった。また、変異体６〜８により得られた食パンを食してみたところ、香り、味などの風味、及び食感においても、実用菌株Ｅ、及び野生型の２倍体株と全く変わらないものであった。
【０１０８】
（実施例５：乾燥酵母粉末の製造）
変異体６〜８、及び野生型２倍体株を使用して、乾燥酵母粉末を製造した。
変異体６〜８、及び野生型２倍体株をそれぞれ水に懸濁し、この懸濁液をスプレードライヤー（大川原化工機（株）製）で乾燥減量７質量％未満にまで噴霧乾燥処理をした。このときの熱風温度を１８５℃、排気温度を１００℃、処理量を３ｋｇ／時間とした。
変異体６〜８より得られた乾燥酵母粉末を食してみたところ、香り、味などの風味、及び食感においては、野生型２倍体株の乾燥酵母粉末と全く変わらないものであった。
【０１０９】
（実施例６：スコーンの製造）
変異体６〜８、及び野生型２倍体株を使用して、スコーンを製造した。
薄力粉１００ｇに、４ｇの変異体６〜８、及び野生型２倍体株のいずれか、及びその他、ベーキングパウダー、砂糖、食塩、生クリーム、油脂、牛乳などを適宜加え、２４℃でミキシングし捏ね上げた後、３０℃、相対湿度７５％にて３０分ホイロ発酵を行い、２００℃にて焼成した。充分に発酵したトップの立ったスコーンが製造出来た。
変異体６〜８より得られたスコーンを食してみたところ、香り、味などの風味、及び食感においては、野生型２倍体株のスコーンと全く変わらないものであった。
【０１１０】
（実施例７：ドッグフードの製造）
変異体６〜８を使用して、ドッグフードを製造した。
イヌ用動物実験用飼料ＤＳ−Ａ（オリエンタル酵母工業（株）製）の仕込み原料に仕上がり固形物ペレット中の乾燥含量が３質量％になるように、変異体６〜８のいずれかを加え、攪拌、水を加え捏ね上げ、ペレット状に成型し、乾燥した。通常製品のＤＳ−Ａと同様に製造することが出来た。
【受託番号】
【０１１１】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１３
ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１４
ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５４
ＦＥＲＭ Ｐ−２１３５５
ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８
ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９
ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の酵母は、優れた免疫賦活能を有し、安全に摂取することができるので、免疫機能が低下した消費者の免疫機能の改善、並びに、癌、アレルギー症状、感染症などの疾患の予防及び治療に、好適に利用することができる。具体的には、前記酵母は、食品素材、飼料、餌料などへの使用や、パンやビールの発酵など、食品の製造に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、対糖収率が７５質量％以上であり、ゲノム数が２倍体以上であることを特徴とする酵母。
【請求項２】
酵母がウラシル非要求性である請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
免疫賦活能が、マクロファージ活性化能である請求項１から２のいずれかに記載の酵母。
【請求項４】
突然変異誘発法により免疫賦活能を獲得した請求項１から３のいずれかに記載の酵母。
【請求項５】
突然変異誘発法が、突然変異誘発剤、紫外線照射及び放射線照射のいずれかを利用する方法である請求項１から４のいずれかに記載の酵母。
【請求項６】
遺伝子組換えされていない請求項１から５のいずれかに記載の酵母。
【請求項７】
ゲノム数が２倍体以上である酵母の親株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１から６のいずれかに記載の酵母。
【請求項８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０のいずれかである請求項１から７のいずれかに記載の酵母。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の酵母を含有する食品又は飼料。
【請求項１】
細胞壁のマンナンが少なく、免疫賦活能を有し、浸透圧が３００ｍ ＯｓｍのＹＰＤ液体培地で増殖可能であり、対糖収率が７５質量％以上であり、ゲノム数が２倍体以上であることを特徴とする酵母。
【請求項２】
酵母がウラシル非要求性である請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
免疫賦活能が、マクロファージ活性化能である請求項１から２のいずれかに記載の酵母。
【請求項４】
突然変異誘発法により免疫賦活能を獲得した請求項１から３のいずれかに記載の酵母。
【請求項５】
突然変異誘発法が、突然変異誘発剤、紫外線照射及び放射線照射のいずれかを利用する方法である請求項１から４のいずれかに記載の酵母。
【請求項６】
遺伝子組換えされていない請求項１から５のいずれかに記載の酵母。
【請求項７】
ゲノム数が２倍体以上である酵母の親株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１から６のいずれかに記載の酵母。
【請求項８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７２９、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＥＲＭ Ｐ−２１７３０のいずれかである請求項１から７のいずれかに記載の酵母。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の酵母を含有する食品又は飼料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２８４０８５（Ｐ２０１０−２８４０８５Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３８６４２（Ｐ２００９−１３８６４２）
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【出願人】（５０４３４２３５４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月９日（２００９．６．９）
【出願人】（０００１０３８４０）オリエンタル酵母工業株式会社 (60)
【出願人】（５０４３４２３５４）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]