全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療するためのヒト化抗ＩＬ−１０抗体
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、（ｉ）ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、ＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができず、且つ（ｉｉ）両方のモノマーの残基を含む不連続なエピトープに結合することによりホモダイマー型のＩＬ−１０に結合するヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。更に、前記抗体又はその断片を使用することを含む製品及び方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）及びＩＬ−１０に特異的な剤に関する。特に、本発明は、ヒト化ＩＬ−１０抗体及びその使用に関する。更に、本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己免疫疾患であると考えられており、この疾患においては、Ｂリンパ球の異常な高活性及び免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）自己抗体の異常な大量産生が重要な役割を果たしている。この病理過程では、Ｉｇでコーティングされた細胞が隔離及び破壊され、補体タンパク質が定着及び分割され、且つケモタキシン、血管作動性ペプチド、及び破壊酵素が組織に放出される（非特許文献１）。
【０００３】
ＳＬＥは、多様な徴候を特徴とする。この疾患の過程においては、合計９５％の患者が筋骨格系疾患を訴え、８０％が皮膚病変、８５％が血液疾患、６０％が神経障害、６０％が心肺疾患、３０％〜５０％が腎臓疾患、４０％が胃腸疾患、１５％が血栓症、及び１５％が眼疾患を示す。また、患者の大部分（９５％）が、疲労、倦怠感、発熱、食欲不振、及び体重減少等の全身性症状に苦しみ、これら症状は、殆ど常に発現している。大部分の患者では、寛解と突然再発する疾患期間とが交互に生じる。永続的に寛解する（治療をしなくても症状が出ない）ことは非常に稀である。５０年以上前、ＳＬＥと診断された患者の大部分は、５年間未満しか生存できなかった。現在は、１０年生存率が９０％を超えており、これは、早期診断、対症療法的な抗炎症及び免疫抑制治療によるものである。最も一般的な死因は、免疫抑制の結果としての感染症である（非特許文献１）。
【０００４】
ＳＬＥの治療には、通常、抗マラリア薬、抗炎症薬、及び免疫抑制薬が用いられている。症状の制御が困難になった場合には、非ステロイド性抗炎症薬にコルチコステロイドを加える。更に、多くの臓器に関連する活動性ＳＬＥは、シクロホスファミドを用いる積極的治療を必要とする。
【０００５】
現在まで、ＳＬＥを治癒させる及び／又は長期間に亘って患者の生活の質を向上させるために利用可能な原因療法は存在していない。しかし、近年、抗体技術が進歩し、また、この自己免疫疾患の原因である因子が更に同定されたことにより、治療の選択肢としてモノクローナル抗体を使用する可能性が開かれつつある。特に、ＳＬＥを治療するための好ましいアプローチは、ポリクローナル自己抗体を大量に過剰産生させる病的免疫反応と相互作用するか又は補正する特異的な治療である。ＳＬＥの病因は、主にＢ細胞の調節不全に関連しているので、Ｂ細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体が特に注目されている。非特許文献２に記載の通り、潜在的なＢ細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、及びＣＤ２２を標的とする。更に、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２（非特許文献３）及びＩＬ−６（非特許文献４）は、免疫反応の調節において重要なサイトカインであり、特に、ＳＬＥ患者における突然の再発中に上昇する。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する自己抗体及びＩＬ−１０の血漿レベルは、ＳＬＥ患者における疾患の活動性を反映していることが多い。ＩＬ−１０レベルの上昇は、ＳＬＥ患者における疾患の活動性と相関している（非特許文献５）。しかし、ＩＬ−１０は、免疫系に対して多面的な作用を有するサイトカインであり、また、炎症促進反応の低減に関与していることが知られている。
【０００６】
モノクローナル抗体を用いた臨床試験がＳＬＥ患者で実施されている。具体的には、幾つかの臨床試験では、非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられるキメラマウス抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である抗体リタキシマブが用いられた。非特許文献２に記載の通り、これら臨床試験の結果は、ＳＬＥ患者においてこの抗体が高い活性を有していることを示したので、オファツムマブ、ＩＭＭＵ−１０６、及びＧＡ−１０１等のＣＤ２０を標的とする幾つかの新規抗体が開発された。ＳＬＥにおけるモノクローナル抗体の活性を報告している更なる臨床試験では、抗ＣＤ２２抗体であるエプラツズマブ、抗ＴＮＦα抗体であるインフリキシマブ、抗ＩＬ−１０抗体であるＢ−Ｎ１０（非特許文献６）、抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ１３１及びＢＧ９５８８、ＢＬＹＳ阻害剤であるベリムマブ、抗ＩＬ−６受容体抗体であるトクリムマブ、並びに抗Ｃ５抗体であるエクリズマブが用いられた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｈｎ ＢＨ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｎ：Ｋａｓｐｅｒ ＤＬ，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ Ｅ，Ｆａｕｃｉ ＡＳ，Ｈａｕｓｅｒ ＳＬ，Ｌｏｎｇｏ ＤＬ，Ｊａｍｅｓｏｎ，ＪＬ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ＵＳ）：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ；２００５．ｐｐ．１９６０−１９６７
【非特許文献２】Ｒｏｂａｋ ａｎｄ Ｒｏｂａｋ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２００９，Ｎｏ．１０，ｐａｇｅｓ２６−３７）
【非特許文献３】Ｃａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４ Ｎｏｖ；１３８（２）：３４８−５６
【非特許文献４】Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｓｅｐ；２７（５）：４６１−６
【非特許文献５】Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９８ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１６（３）：２８３−８
【非特許文献６】Ｌｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０００ Ａｕｇ；４３（８）：１７９０−８００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、更なる剤、特に、この領域において有用性を有する抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、第１の態様では、本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、（ｉ）ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、且つＩＬ−１０がＩＬ−１０の受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合できず；（ｉｉ）両方のモノマーの残基を含む不連続なエピトープに結合することによりホモダイマー型のＩＬ−１０に結合する抗体又はその断片を提供する。
【００１０】
本発明者らは、本発明の抗体が、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状、特に、自己免疫疾患を治療するのに好適であるように、特に有利な結合様式を有することを見出した。具体的には、本発明の抗体及びその断片は、一旦ＩＬ−１０Ｒαに結合したＩＬ−１０には結合することができないので、ＡＤＣＣ反応又はＣＤＣ反応をトリガーすることができない。結果として、本発明の抗体は、ＩＬ−１０が受容体に結合している細胞には結合することができないので、ＡＤＣＣ反応又はＣＤＣ反応を誘導することができない。したがって、これは、特に有利な結合様式である。この方法では、免疫系の他の部分に対する抗体の影響が制御される。更に、本発明の抗体及びその断片は、ＩＬ−１０モノマーよりも遥かに高い親和性でＩＬ−１０ホモダイマーに結合可能である。したがって、前記抗体は、モノマー又は分解産物ではなく機能的に活性のある形態のＩＬ−１０に優先的に結合する。これは、中和効果を生じさせるのに必要なＩＬ−１０抗体の量を減少させ、且つ非活性分子に対する非特異的な結合に起因する副作用のリスクを低減するので、特に有利である。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、且つＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができない抗体又はその断片を提供する。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、ホモダイマー型のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、両方のモノマーの残基を含む不連続なエピトープに結合する抗体又はその断片を提供する。
【００１３】
第４の態様では、本発明は、請求項１に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、及び／又はマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
【００１４】
第５の態様では、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用及び／又は補体依存性細胞傷害作用を誘導しない抗体又はその断片を提供する。
【００１５】
第６の態様では、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＩＬ−１０α受容体を介するＩＬ−１０シグナル伝達を妨げることができる抗体又はその断片を提供する。
【００１６】
第７の態様では、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＩＬ−１０Ｒ発現細胞には結合することができない抗体又はその断片を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
単なる一例として、以下の図面を参照して本発明を例証する。
【図１Ａ】図１Ａは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く（ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり；ＬＣＤＲ３は、配列番号６である）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く（ＨＣＤＲ１は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号８であり；ＨＣＤＲ３は、配列番号９である）。
【図２Ａ】図２Ａは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、マウスＢ−Ｎ１０の軽鎖可変領域（配列番号１２）、Ａ１７（配列番号１４）、ＪＫ１（配列番号１５）、及びマウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域ｈＶＬ１〜ｈＶＬ１２（配列番号１８〜２９）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０の重鎖可変領域（配列番号１３）、３−６６＋０４（配列番号１６）、ＪＨ４（配列番号１７）、及びマウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域可変領域ｈＶＨ１〜ｈＶＨ１２（配列番号３０〜４１）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、マウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域ｈＶＨ１３〜ｈＶＨ２９（配列番号４２〜５８）のアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ｈＩＬ−１０抗原ＥＬＩＳＡを用いてキメラｃＢ−Ｎ１０抗体と比較した、ヒト化抗体変異体の抗原結合性を提供する。
【図５】図５は、精製抗体製剤を用いてキメラＢ−Ｎ１０抗体と比較した、３つのヒト化変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８、及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７の結合性の測定結果を提供する。
【図６】図６は、標識されているＢＴ０６１及びＢＴ−０６３によるリンパ球の染色を示す。
【図７】図７は、ＢＴ−０６３ Ｆａｂ（上段）、ＩＬ−１０モノマー及びダイマー（中段）、及びＩＬ−１０ダイマーとＢＴ−０６３ Ｆａｂとの複合体（下段）のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図８】図８は、ＩＬ−１０に結合しているＢＴ−０６３のＦａｂ断片の全体構造を示す。ＩＬ−１０及びＦａｂ断片をリボン図で示す。
【図９】図９は、ＩＬ−１０受容体が結合する部位と同じＩＬ−１０の部位に結合するＢＴ−０６３のＦａｂ断片を示す。ＩＬ−１０、ＩＬ−１０Ｒ１、及びＦａｂ断片をリボン図で示す。
【図１０】図１０は、健常ボランティアに静脈内注射した後に漸増合計用量のＢＴ−０６３と結合しているＩＬ−１０の理論的に計算された用量依存性を示す。
【図１１】図１１は、図１０に示す用量応答曲線に対する様々なＩＬ−１０濃度の理論的影響を示す。正常であると推定される濃度（１５ｐｇ／ｍＬ）の１，０００倍高い及び低い濃度についての曲線を示す。曲線間では僅かな差しかみられなかった。
【図１２】図１２は、図１０に示す用量応答曲線に対する、ＢＴ−０６３のＩＬ−１０に対する様々な親和性の理論的影響を示す。ＢＴ−０６３により決定された親和性（３ｎＭ）よりも１０倍高い及び低い親和性についての曲線を示す。用量応答曲線は、ＢＴ−０６３のＩＬ−１０に対する親和性に大きく依存する。
【図１３】図１３は、健常ボランティアにＢＴ−０６３をインビボ投与した後の、投薬量に対するサイトカインの血漿濃度の平均ｃｍａｘのグラフを示す。
【図１４】図１４は、健常ボランティアにＢＴ−０６３をインビボ投与した後の、経時的なＩＬ−１０平均血漿濃度のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
上記の通り、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片、及び高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状の治療におけるこの抗体又はその断片の使用に関する。
【００１９】
ヒトＩＬ−１０は、分子量３７ｋＤａのホモダイマーである。各モノマーは、１６０アミノ酸からなり、分子量は１８．５ｋＤａである。ＩＬ−１０のダイマーは、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−Ｒα又はＩＬ−１０Ｒ１）と相互作用し、次いで、ＩＬ−１０受容体β（ＩＬ−１０Ｒβ又はＩＬ−１０Ｒ２）を複合体に動員する。これら受容体は、様々な細胞、特に、単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球等の大部分の造血細胞を含む免疫細胞（Ａｓａｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２００３ Ｊｕｎ；５５（２）：２４１−６９）で発現するが、表皮細胞又はケラチン産生細胞等の非造血細胞でも発現する。ＩＬ−１０受容体αとＩＬ−１０との結合及びＩＬ−１０受容体βの動員により、Ｊａｋ１及びＴｙｋ２チロシンキナーゼを介するシグナル伝達が導かれ、次いで、ＳＴＡＴファミリーの転写因子が活性化される。ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、好酸球、マスト細胞、ケラチン産生細胞、樹状細胞、更には癌細胞等、様々なＩＬ−１０の細胞源が公知である。Ｂ細胞におけるＩＬ−１０の機能は、アポトーシスの防止、増殖の強化、クラススイッチ事象、及びプラズマ細胞への分化（Ａｓａｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２００３ Ｊｕｎ；５５（２）：２４１−６９）から炎症の阻害まで多岐に亘る。
【００２０】
本発明の第１及び第２の態様、並びに本発明の好ましい実施形態及び他の態様では、抗体又はその断片は、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、且つＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができない、即ち、ＩＬ−１０が前記抗体又はその断片に結合しているとき、ＩＬ−１０はＩＬ−１０Ｒαに結合することができない。
【００２１】
上記の通り、機能的に活性のあるＩＬ−１０ダイマーは、ＩＬ−１０Ｒαと相互作用し、次いで、ＩＬ−１０Ｒβを複合体に動員して、シグナル伝達を生じさせる。しかし、幾つかの準最適なシグナル伝達事象は、最初にＩＬ−１０がＩＬ−１０Ｒαに結合している間に生じると予測されている。
【００２２】
ＩＬ−１０の作用を中和可能な抗体は、多数の機序を介して機能することができる。前記抗体は、ＩＬ−１０に結合し、立体障害によりＩＬ−１０Ｒαに対するＩＬ−１０の結合を妨げることができる。具体的には、機能的に活性のあるＩＬ−１０はホモダイマーであるので、２つの抗体分子が同じＩＬ−１０ダイマーに結合可能である。或いは、ＩＬ−１０Ｒαの結合部位とは重複しないＩＬ−１０の領域に中和抗体を結合させて、ＩＬ−１０の立体構造の変化を誘導することによりＩＬ−１０Ｒαの結合と拮抗させることも可能である（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００２）１０；９８１−９８７）。
【００２３】
或いは、前記抗体は、ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒβとの間の相互作用を防ぐＩＬ−１０の領域に結合可能である。更に、高親和性受容体鎖にサイトカインが結合した後も露出しているＩＬ−１０の部位に抗体を結合させて、立体構造の変化を誘導し、シグナル伝達に必要な第２の受容体鎖の動員を妨げることも可能である。
【００２４】
対照的に、本発明の抗体又はその断片は、ＩＬ−１０Ｒαが結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合することにより、ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒαとの相互作用を阻害する。したがって、本発明の抗体は、ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒαとの間の任意の結合を防ぐ。したがって、上記準最適なシグナル伝達事象でさえも避けることができる。したがって、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＩＬ−１０α受容体を介するＩＬ−１０のシグナル伝達を防ぐことができる抗体又はその断片を提供する。
【００２５】
本明細書で使用される語句「同じ領域に結合する」とは、ＩＬ−１０の結合についてＩＬ−１０Ｒαと競合する抗体又はその断片の能力を指す。実際、本発明の抗体又はその断片は、競合的阻害剤として作用する。ＩＬ−１０Ｒαは、ＩＬ−１０ダイマーにおける１９〜４２及び１３８〜１５８の残基に結合することが知られている。したがって、本発明の抗体又はその断片は、ＩＬ−１０Ｒαの結合を有効にブロックするために、これら両方の領域のうちの少なくとも１残基に結合することもできる。
【００２６】
更に、語句「ＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているとき」とは、ＩＬ−１０が、両側で、即ち両方のモノマーを介してＩＬ−１０受容体に結合している状況を指す。
【００２７】
好ましい実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＩＬ−１０受容体β（ＩＬ−１０Ｒβ）が結合する領域と同じ領域には結合しない。
【００２８】
或いは、本発明のこの態様及び実施形態は、ＩＬ−１０αを介したＩＬ−１０のシグナル伝達を防ぐことができるか、又はＩＬ−１０Ｒ発現細胞に（即ち、結合しているＩＬ−１０を介して）結合することができないと定義することができる。
【００２９】
本発明の第１及び第３の態様、並びに本発明の他の態様の好ましい実施形態では、抗体又はその断片は、ＩＬ−１０ホモダイマーのモノマーのうちの一方の残基と、ＩＬ−１０ホモダイマーの第２のモノマーの残基とを含む不連続なエピトープに結合する、即ち、前記抗体又はその断片は、ホモダイマーを形成している第１のモノマーの残基と第２のモノマーの残基とを含む不連続なエピトープに結合する。
【００３０】
用語「ホモダイマー型」とは、互いに９０°で配向されている２つのαヘリカルドメイン（ドメインＡ及びドメインＢ）からなる対称的ホモダイマーによって表される機能的に活性のあるＩＬ−１０を指す。各ドメインの構造的一体性は、一方の鎖の最初の４つのへリックスが他方の鎖の最後２つのへリックスと会合するような、各ペプチド鎖のαへリックスの絡み合いに依存する。界面を構築するためには両方の鎖の部分が必要であるので、単一のＩＬ−１０モノマーは、ＩＬ−１０受容体に結合することはできない。
【００３１】
本発明の抗体又はその断片は、野生型ＩＬ−１０ダイマーの両方のモノマーと同時に相互作用する。したがって、本発明の抗体又はその断片は、「不連続なエピトープ」、即ち、折り畳まれているタンパク質ではアミノ酸が極近接しているが、折り畳まれていないときは離れているエピトープに結合する。具体的には、エピトープは、ＩＬ−１０ダイマーの両方の鎖に存在するアミノ酸によって表される。
【００３２】
この結合様式の結果として、前記抗体又はその断片は、不連続なエピトープの一部のみが存在するＩＬ−１０モノマーに対する親和性よりも遥かに高い親和性で機能的に活性のあるＩＬ−１０に結合する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、抗体又はその断片は、一方のＩＬ−１０モノマー（即ち、第１のモノマー）のへリックスＡの残基と、他方のＩＬ−１０モノマー（即ち、第２のモノマー）のへリックスＦ’の残基とを含む不連続なエピトープに結合する。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態では、ヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片は、一方のＩＬ−１０モノマーの最初の５５アミノ酸、より好ましくはアミノ酸２０〜５５と、第２のモノマーの最後の２０アミノ酸とにより提供される不連続なエピトープに結合し、逆もまた同様である。
【００３５】
一方のモノマーのへリックスＡ〜ＤとへリックスＥ〜Ｆとを組み合わせた、ＩＬ−１０Ｒ１又はＢＴ−０６３により認識される形態の人工突然変異型ＩＬ−１０が、文献から公知である。
【００３６】
本明細書で言及されるＩＬ−１０は、ヒトＩＬ−１０であり、そのアミノ酸配列は、以下の通り表すことができる：
ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮ ＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰ ＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦ
ＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫ ＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥ ＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬ
ＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱ ＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡ ＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨ
ＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴ ＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲ ＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡ
ＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫ ＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭ ＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩ
ＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ （配列番号１）
【００３７】
抗ＩＬ−１０抗体が望ましい活性を有しているかどうかは、公知のペプチドスキャニング技術により、又はサイズ排除クロマトグラフィーにより決定することができる。
【００３８】
ペプチドスキャニング技術は、ＩＬ−１０結合剤候補をスクリーニングすることからなり得、前記結合剤の全て又は断片を膜又は適切な表面に固定化することができる。具体的には、ＩＬ−１０又はＩＬ−１０断片は、合成してもよく、ＩＬ−１０又はＩＬ−１０断片をコードしているヌクレオチド配列を例えば大腸菌又は昆虫細胞等の適切なホストで高発現させてもよい。具体的には、本発明の抗体についてのエピトープを形成すると本明細書で同定されたＩＬ−１０の領域を用いることができる。
【００３９】
抗ＩＬ−１０抗体は、例えば、ファージ又はリボソーマルディスプレイ（又はｍＲＮＡディスプレイ、ポリソーマルディスプレイ、酵母ディスプレイ）技術を用いて同定することができる。これら技術を用いて、不連続なエピトープを認識する結合剤を同定することもできる。タンパク質又はリガンド（即ち、選択される抗体）のいずれかを固定化し、結合パートナー候補と共にインキュベートしてもよい。結合していないタンパク質を除去し、結合しているリガンドを溶出する。数ラウンドの選択を実施して、高親和性結合剤を同定する。
【００４０】
本願において、用語「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、或いは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の配列と同一であるが、一方、抗体の残りの部分は、異なる種、抗体クラス、又は抗体サブクラスに由来する抗体の配列と同一である抗体を指す。キメラ抗体のＣＤＲはある起源に由来するが、抗体の残りの部分は異なる起源に由来することが特に好ましい。具体的には、本発明において、キメラ抗体は、非ヒト抗体の抗原結合配列／可変ドメインがヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされているヒト化抗体であってよい。
【００４１】
本願において、用語「断片」は、望ましい生物活性を保持している抗体の断片又は誘導体を指す。断片は、一般的に、抗体の抗原結合領域、具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに多価抗体誘導体、具体的には、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）又はタンデム二重特異性抗体を含む。断片は、少なくとも２５アミノ酸が好ましく、５０アミノ酸がより好ましく、２００アミノ酸〜５００アミノ酸が更により好ましい。或いは、断片は、３０ＫＤａ〜１５０ｋＤａのサイズを有する断片として定義することもできる。更に、抗体断片は、２以上のペプチド／ポリペプチド鎖を含んでいてもよい。例えば、各長さが２００アミノ酸〜３００アミノ酸である２本の鎖を含むＦａｂ断片、又は各長さが４００アミノ酸〜５００アミノ酸である２本の鎖を含むＴａｎｄＡｂｓ（登録商標）（四価二重特異的抗体フォーマット）である。
【００４２】
本発明の第４の態様、並びに本発明の他の態様の好ましい実施形態では、抗体又はその断片は、マウスＢ−Ｎ１０抗体又はＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）に由来する。具体的には、かかる抗体又はその断片は、Ｂ−Ｎ１０若しくはＢＴ−０６３可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、及び／又はＢ−Ｎ１０若しくはＢＴ−０６３可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。マウスＣＤＲのアミノ酸配列を図１に示す。ＢＴ−０６３変異体の可変配列を実施例６に示す。前記配列は、Ｂ−Ｎ１０又はＢＴ−０６３抗体のＣＤＲの配列と少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であることがより好ましい。
【００４３】
或いは、Ｂ−Ｎ１０又はＢＴ−０６３抗体に由来する抗体又は断片は、抗体又はその断片の親和性及び／又は特異性を実質的に変化させることのない変異を配列中に任意で含む、Ｂ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、及び／又はＢ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含んでいてもよい。具体的には、マウスＢ−Ｎ１０抗体又はＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）抗体のＣＤＲを含む抗体又は断片と比べて、前記配列中の変異は、ＩＬ−１０に対する抗体又は断片の親和性又は特異性を低下させない。
【００４４】
特定の実施形態では、ヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片は、マウスＢ−Ｎ１０の可変軽鎖及び／又は重鎖、或いはＢＴ−０６３変異体の軽鎖及び／又は重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明は、図１に示すマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変ドメイン、又は実施例６に示すＢＴ−０６３抗体の可変ドメインと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。
【００４５】
更に、本発明者らが実施したＸ線結晶構造解析の結果、本発明の抗体又は断片は、ＩＬ−１０に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＢＴ−０６３軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む可変領域及び／又はＢＴ−０６３重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域を含み、前記ＣＤＲが、配列中に以下のアミノ酸置換を任意で含むＣＤＲである抗体又はその断片として定義することができる：
（ｉ）Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｙｓ５５を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６を含む重鎖ＣＤＲ２、
（ｖ）Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３を含む重鎖ＣＤＲ３。
【００４６】
より好ましくは、重鎖可変領域は、Ａｓｎ７３及びＳｅｒ７４を更に含む。ＣＤＲ内の置換について、前記ＣＤＲの配列は、ＢＴ−０６３におけるＣＤＲの配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であることが特に好ましい。
【００４７】
残基の種類及び番号は、言及されるＢＴ−０６３のＣＤＲのアミノ酸残基を明確に同定する目的のために使用した。しかし、残基の番号は、この方法でスクリーニングされる候補抗体又は断片の位置に関して残基を限定することを意図するものではないと理解されたい。例えば、この実施形態の抗体では、Ｓｅｒ３２は、軽鎖のセクション１〜３０から１つの非必須アミノ酸残基が欠失している場合、軽鎖ＣＤＲ１内の３１位に存在してもよい。
【００４８】
ＢＴ−０６３重鎖及び軽鎖の配列、並びにＣＤＲの位置を、以下の実施例６に示す。
【００４９】
本発明の第５の態様及び本発明の残りの態様の好ましい実施形態では、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘導しない。
【００５０】
上記の通り、前記抗体又は断片は、ＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体αに結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができない。したがって、前記抗体又はその断片は、可溶性ＩＬ−１０にのみ結合することができ、（ＩＬ−１０を介して）ＩＬ−１０Ｒ発現細胞に結合することはできない。結果として、本発明の抗体又は断片は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを誘導することはできず、これは、可溶性ＩＬ−１０にしか結合せず、細胞に結合しているＩＬ−１０には結合しないという性質に少なくとも部分的に起因している。
【００５１】
抗体がＣＤＣを誘導するかどうかを試験するために、対象抗原を有する細胞を、補体（又はＣ１ｑ等の活性補体を含有する血清）の存在下で漸増用量の抗体と共にインキュベートしてもよい。細胞の殺傷の程度は、誘導されるＣＤＣの量を表すパラメータとして測定することができる。
【００５２】
抗体がＡＤＣＣを誘導するかどうかを試験するために、対象抗原を有する細胞（標的細胞）を、ＡＤＣＣを誘導する細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、エフェクター細胞）の存在下で漸増用量の抗体と共にインキュベートしてもよい。標的細胞における細胞の殺傷の程度は、誘導されるＡＤＣＣの量を表すパラメータとして測定することができる。
【００５３】
更に、本発明の更なる態様及び本発明の残りの態様の好ましい実施形態では、ヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片は、患者に投与したとき、患者の血漿中のＩＬ−１０のうちの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％が前記抗体又はその断片と複合体化するようにインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）と結合可能である。この状況では、用語「抗体又はその断片と複合体化する」とは、患者に投与した後、前記抗体又はその断片がＩＬ−１０を占有することを指す。前記抗体又はその断片のＩＬ−１０占有能は、抗体又はその断片とＩＬ−１０との間の解離定数を知った上で、更に、以下の実施例８に提供する仮説及び方法を用いて、３．５Ｌの血液体積に基づいてインビトロで評価することができる。
【００５４】
一般的に、本発明の抗体は、ヒト定常領域（Ｆｃ）を更に含む。これは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプに由来する定常ドメインの中から選択することができる。好ましい定常領域は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１の定常ドメインの中から選択される。
【００５５】
他の生成物
本発明は、更に、上記抗体又は抗体断片をコードする核酸配列を提供する。前記核酸配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡが好ましい。前記配列は、発現カセット又はベクター内で用いることができ、本明細書に開示される抗体及びその断片の産生において特に用いられる。
【００５６】
本発明は、更に、これらポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターで形質転換されたホスト細胞を提供する。好適なホスト細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００５７】
或いは、ホスト細胞は、本発明の抗体を産生する細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマであってもよい。
【００５８】
上記ホスト細胞は、抗体又はその断片を産生するための方法で利用することができる。具体的には、かかる方法は、抗体又はその断片を発現させる条件下で好適な培養培地中にてホスト細胞を培養する工程と、培養培地から前記抗体又はその断片を分離する工程とを含んでいてもよい。この種の方法は、当技術分野において公知であり、報告されている。
【００５９】
また、本発明は、ヒトＩＬ−１０のアミノ酸２７〜５３及びアミノ酸１４２〜１５５のうちの一方又は両方を含む５０未満のアミノ酸を含む単離ペプチドを提供する。かかるペプチドは、下記スクリーニング方法で特に用いられる。
【００６０】
医療的用途
本明細書に記載される抗体又はその断片は、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される疾患又は病状の治療において有用性を有する。結果として、被験体における病状を治療又は予防するための方法であって、前記病状が高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介され、治療上有効な量の本明細書に記載される抗体又はその断片を投与することを含む方法を提供する。
【００６１】
具体的には、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状は、ＳＬＥである。したがって、また、本発明は、医療において、具体的にはＳＬＥの治療において使用するための本明細書に記載される抗体又はその断片を提供する。
【００６２】
更なる例は、血小板減少性紫斑病、ループス腎炎、ＨＩＶ、ｈＣＭＶ、及びＣ型肝炎である。別の例は、免疫反応の増殖又は抑制を直接支持することによりＩＬ−１０に依存している腫瘍細胞を治療することである。
【００６３】
本発明の更なる実施形態は、薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と共に、上記抗体又はその断片を含む医薬組成物である。１つの実施形態では、前記組成物は、抗体又はその断片がカップリングしているリポソームを含む。
【００６４】
かかる組成物は、患者に対して、非経口的に、静脈内に、又は皮下に投与することができる。ＳＬＥの治療において、前記抗体又はその断片は、静脈内又は皮下に投与されることが好ましい。
【００６５】
更に、本明細書に記載される抗体及びその断片は、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状の診断において有用である。具体的には、抗体及びその断片は、個体から採取されたサンプル中の異常なレベルのＩＬ−１０の存在を判定するためのインビトロアッセイで利用することができる。かかる診断方法は、（ａ）個体から採取したサンプルを得る又は提供する工程と；（ｂ）本明細書に記載される抗ＩＬ−１０抗体又はその断片と前記サンプルとを接触させる工程と；（ｃ）（例えば、前記抗体又はその断片の存在を検出することにより）ＩＬ−１０の存在を検出する工程とを含んでいてもよい。具体的には、工程（ｃ）は、サンプル中に存在するＩＬ−１０の量を決定することを含んでいてもよい。更に、前記方法は、患者及び病状に関連する評価を行うために、１以上の所定の値と存在するＩＬ−１０の量とを比較する工程（ｄ）を更に含んでいてもよい。前記所定の値は、健常個体から採取された等価なサンプル中に存在するＩＬ−１０の量の標準的な値を表していてもよい。
【００６６】
サンプルは、個体から血液を採取することにより得られる血漿サンプルであることが好ましい。具体的には、前記病状がＳＬＥである診断方法を用いることができる。
【００６７】
非医療的用途
更に、本明細書に記載される抗体又はその断片と標識とを含む、標識されているヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。前記標識は、サンプル中の抗体の存在を検出するために当技術分野において公知である任意の好適な種類であってよい。具体的には、前記標識は、蛍光標識であってよい。
【００６８】
本発明の抗体又はその断片、具体的には、前記標識されている抗体は、サンプル中に存在するＩＬ−１０の存在を検出するためのインビトロ方法において特定の有用性を有する。前記方法は、標識されていない抗体若しくは標識されている抗体又はこれらの断片とサンプルとを接触させる工程と、前記サンプルを洗浄して、前記サンプルに結合していない抗体又は抗体断片（非結合抗体又は抗体断片）を除去する工程と、例えば標識を介して、前記サンプル中の前記抗体の存在を検出する工程とを含む。
【００６９】
或いは、サンプル中のＩＬ−１０を中和するためのインビトロ方法に、標識されていない抗体又は断片を使用してもよい。かかる方法は、抗体又はその断片をＩＬ−１０に結合させるために、前記抗体又は断片とサンプルとを接触させる工程を含む。
【００７０】
更に、また、本発明は、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合可能である１以上の分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）以下のヒトＩＬ１０の領域：アミノ酸２７〜５３及びアミノ酸１４２〜１５５のうちの１以上を含むペプチドと前記１以上の分子とを接触させる工程と；
（ｂ）前記１以上の分子が前記ペプチドの１以上の領域に結合するかどうかを検出する工程と
を含む方法を提供する。
【００７１】
具体的には、前記１以上の分子は、好ましくはペプチド、最も好ましくは抗体又は抗体断片である。スクリーニングは、ファージディスプレイライブラリの作製及びスクリーニングを用いる等、当技術分野において公知の方法により行うことができる。
【００７２】
更に、本発明は、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合可能である抗体又は抗体断片をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１以上の抗体又は抗体断片とＩＬ−１０とを接触させる工程と；
（ｂ）ＩＬ−１０とＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）との相互作用を阻害する前記抗体又は抗体断片の能力を評価する工程と；
（ｃ）ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合可能である抗体又は抗体断片を同定する工程と
を含み、
前記抗体又は抗体断片が、ＢＴ−０６３軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む可変領域及び／又はＢＴ−０６３重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域を含み、
前記ＣＤＲが、配列中に以下のアミノ酸置換を任意で含むＣＤＲである方法を提供する：
（ｉ）Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｙｓ５５を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６を含む重鎖ＣＤＲ２、
（ｖ）Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３を含む重鎖ＣＤＲ３。
【００７３】
この態様では、分子がＩＬ−１０に結合する能力を有している可能性があり、したがって、特定の候補分子を用いてスクリーニングする方法が可能であるという本発明者らによる研究についてより詳細に説明した。前記候補分子は、ＢＴ−０６３抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列の標的突然変異誘発により作製することができる。
【実施例】
【００７４】
次に、以下の特定の実施形態に関連して本発明を更に説明する。
【００７５】
実施例１−マウス抗ＩＬ１０抗体Ｂ−Ｎ１０の特性評価
１．１ Ｂ−Ｎ１０抗体の可変ドメインをコードするＤＮＡの単離
マウスＢＮ−１０の可変配列を同定するために、細胞ペレットを用いた。−８０℃で保存しておいたサンプル（３×Ｂ−Ｎ１０、３代継代、１×１０７細胞）の細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した後、Ｂ−Ｎ１０の可変配列をＰＣＲにより増幅させ、次いで、クローニングした。
【００７６】
合計１４クローンの配列を決定し（ＳＥＱ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、可変軽鎖及び可変重鎖について分析した。Ｂ−Ｎ１０の可変配列を明確に決定した。Ｎ−末端のプライマー領域でのみ差が生じた（表１を参照されたい）。可変重鎖については、プライマー領域における配列変異ＱＶＱＬＫＱ（配列番号５９）が９クローンで生じていたが、他の変異は１クローン又は２クローンでしか生じていなかった。サブクローニングするためにこの変異体を選択した。可変軽鎖については、２つの変異体が同比率で存在していた。マウス生殖細胞系配列と比較したところ、３つの突然変異しか有しないｃｒ１配列が、同定されたＶＬ配列と高い相同性を示した。これは、ＤＶＬＭＴＱ（配列番号６０）配列が正確な配列である可能性が非常に高いことを意味する。配列ＤＩＶＭＴＱ（配列番号６１）は、典型的な別のクラスの生殖細胞系配列であるので、除外した。
【表１】
【００７７】
可変軽鎖ＶＬ及び可変重鎖ＶＨのタンパク質配列を、それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。対応するＤＮＡ配列を、それぞれ図２Ａ及び２Ｂに示す。
【００７８】
実施例２−キメラＢ−Ｎ１０抗体の作製
組換え抗体を発現させるために、実施例１で同定された抗体の重鎖及び軽鎖の可変配列をベクター系にクローニングした。第１の工程として、前記配列をＢＳリーダーにクローニングし、Ｎ末端に分泌シグナルを付加し、Ｃ末端にスプライスドナー配列を付加した。第２の工程として、それぞれ定常ヒトカッパ鎖及び定常ヒトガンマ−１鎖を含有する発現ベクターにこれら配列をクローニングした。軽鎖用ベクター及び重鎖用ベクターを調製し、次いで、リン酸カルシウム沈殿又はリポフェクションによってＣＯＳ−７細胞に一過的にコトランスフェクトした。２日間後、細胞培養上清を回収した。ＣＯＳ−７細胞中でキメラＢ−Ｎ１０を発現させ、上清中の抗体の力価を検出した（サンドイッチＥＬＩＳＡ）後、ヒトインターロイキン−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１７−ＩＬ／ＣＦ、ロット番号ＥＴ１１４０２１、−２０℃で保存）に対する結合能をＥＬＩＳＡで試験した。
【００７９】
サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、マウス抗ヒトカッパ鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をキャッチャー抗体としてプレート表面に結合させ、次いで、細胞培養上清と共にインキュベートし、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いてキメラ抗体の存在を検出した。規定の濃度（０．１２５μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬ）のキメラ対照抗体をポジティブコントロールとして用いた。
【００８０】
抗原ＥＬＩＳＡの場合、０．５μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの濃度でプレート表面にヒトＩＬ−１０を結合させた。細胞培養上清（未希釈及び１：５希釈）と共にインキュベートした後、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いてキメラＢ−Ｎ１０の結合を検出した。マウスＢ−Ｎ１０をポジティブコントロールとして用いた。０．５μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの濃度の抗体を用い、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（Ｄａｋｏ）で結合を検出した。
【００８１】
ＥＬＩＳＡの結果については、実施例３で論じる。
【００８２】
実施例３−抗ＩＬ−１０抗体のヒト化
げっ歯類抗体のヒトにおける免疫原性を低下させようとする最初の試みは、げっ歯類抗体の定常ドメインをヒト抗体の定常ドメインに置き換えることによりキメラ抗体を作製することであった。依然として可変ドメイン内のげっ歯類のフレームワーク領域が免疫反応を誘導する場合があったので、より進歩したＣＤＲのグラフト方法、即ち、抗原結合配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）を完全にヒト抗体フレームワークに転移させる（ヒト化）方法が開発された。通常、マウスドナー抗体に最も類似するヒトアクセプターフレームワークを選択して、ヒト化プロセス中にオリジナル抗原の特異性及び親和性が回復される可能性を高める。ヒト抗体生殖細胞系配列、発現抗体のコンセンサス配列、ＣＤＲループ構造の分析、及び抗体／抗原複合体のＸ線構造を用いる異なるアプローチを用いてもよく、これらと組み合わせて前記プロセスを改善してもよい。通常、幾つかのヒト化抗体変異体は、この方法で作製され、後に、互いに異なる及びオリジナル抗体と異なる可能性のある生物学的作用に関して分析される。最後に、抗体の望ましい機能に従って、好適なヒト定常領域を選択することができる。
【００８３】
３．１ Ｂ−Ｎ１０のマウス可変配列とヒト配列との配列比較、並びにヒト化ＶＬ（ｈＶＬ）及びＶＨ（ｈＶＨ）の配列のセットの設計
マウス抗ＩＬ−１０抗体であるＢ−Ｎ１０を選択した（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９３ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；４（６）：４２１−７；及びＬｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０００ Ａｕｇ；４３（８）：１７９０−８０）。ヒト化抗体を得るための方法は、相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトアクセプター領域に融合させるＣＤＲグラフト手順に基づく。
【００８４】
以下の３つのデータセットの複合分析に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークを選択した：
１． 体細胞突然変異のリスクを最小化するための、マウス配列とヒト生殖細胞系配列との相同性、
２． 異常なアミノ酸残基を同定するための、マウス配列とヒトコンセンサス配列との比較、及び
３． 重要な構造フレームワークアミノ酸残基についての情報を得るための、ＣＤＲ配列の基準となる構造クラスの同定。
【００８５】
Ｂ−Ｎ１０のマウス可変軽鎖は、ヒト生殖細胞系可変セグメント２−３０＊０１（Ａ１７（配列番号１４））及び接合セグメントＪＫ１（配列番号１５）に対して最も高い相同性を示す。Ｂ−Ｎ１０に対して最も高い相同性を有するヒトコンセンサス配列は、ＨｕＫＩＩである。可変軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｌ１の場合クラス４に、Ｌ２及びＬ３の場合クラス１に分類することができた。重要なアミノ酸残基を同定した。
【００８６】
クラス４−１−１の基準構造を有するマウスＣＤＲとヒト生殖細胞系ＶＬ遺伝子との配列比較により、２−３０＊０１と最も高い相同性を有する（一致しないアミノ酸数が最も少ない）ことが明らかになった。
【００８７】
Ｂ−Ｎ１０のマウス可変重鎖は、ヒト生殖細胞系可変セグメントＶＨ３−３３及び接合セグメントＪＨ４（配列番号１７）に対して最も高い相同性を示す。Ｂ−Ｎ１０に対して最も高い相同性を有するヒトコンセンサス配列は、ＨｕＨＩＩＩである。可変重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｈ１及びＨ２の場合クラス１に分類することができた。重要なアミノ酸残基を同定した。クラス１−１の基準構造を有するマウスＣＤＲとヒト生殖細胞系ＶＨ遺伝子との配列比較により、３−６６＊０４（配列番号１６）と最も高い相同性を有する（一致しないアミノ酸数が最も少ない）ことが明らかになった。したがって、生殖細胞系配列ＶＨ３−６６を考慮した。
【００８８】
ヒト化可変軽鎖（１２変異体）と可変重鎖（２９変異体）との様々な可変配列のセットを設計するために、得られた全てのデータを検討した。
【００８９】
３．２ ヒト化ｈＩＬ−１０結合抗体断片の小さなライブラリの構築及び選択
ｈＩＬ−１０に結合する可能性のある抗体断片のライブラリを作製して最適なヒトＩＬ−１０結合抗体を得るために、真核細胞のコドン使用頻度を考慮した上で、図３に示す１２個のｈＶＬ断片及び２９個のｈＶＨ断片をコードするｃＤＮＡ配列を作製した。
【００９０】
次いで、得られたｃＤＮＡをクローニングベクターにクローニングし、ＳＥＱ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において配列を決定した。ｈＶＬ断片をコードする１２個の各ｃＤＮＡとｈＶＨ断片をコードする２９個のｃＤＮＡとを組み合わせて、発現する可能性のある３４８個の抗体断片を得るという方法でライブラリを構築した。
【００９１】
細菌で発現させ、ヒトＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１７−ＩＬ／ＣＦ）に対して２ラウンドの選択を行った後、ｈＩＬ−１０（同様に選択した）に対する結合についてＥＬＩＳＡにより前記抗体断片を分析した。簡潔に述べると、４℃で一晩、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０でＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をコーティングした。前記プレートをブロッキング及び洗浄した後、抗体断片を産生する細菌の上清を添加した。結合しているヒト化抗体断片を検出するために、ＰＯＤと複合体化している二次抗体を用いた。
【００９２】
優れた結合剤のコード配列を分析し、同定されたｈＶＬ断片及びｈＶＨ断片の発生について列記した（表２）。
【表２】
【００９３】
太字にした配列は、抗体全体について結合特性を分析するために、適切な真核発現ベクターにサブクローニングするために選択した配列である。括弧内に示す配列は、発現ベクターにサブクローニングするために選択したが、欠陥コンストラクトしか得られなかった配列である。
【００９４】
３．３ 選択したＢＴ−０６３のヒト化軽鎖及び重鎖の変異体用の発現ベクターの作製
スクリーニングアプローチにより求められた統計値に基づいて、ベクター系にクローニングするためのＢＴ−０６３のヒト化ＶＬ及びヒト化ＶＨの変異体のセットを選択した。第１の工程では、分泌シグナル５’及びスプライスドナー配列３’をコードしている配列とクローニングしたｃＤＮＡとを融合させるために、ヒト化ＶＬ及びＶＨの変異体をコードするｃＤＮＡを適切なベクターに転移させた。第２の及び最後のサブクローニング工程で、それぞれ、ヒト定常カッパ鎖及びヒト定常ガンマ−１鎖をコードする発現ベクターにこれらｃＤＮＡコンストラクトを転移させた。内毒素を含まないＱｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、独立に得られたｈＶＬ及びｈＶＨを含有する発現ベクターのプラスミドを調製した。
【００９５】
３．４ ＣＯＳ−７細胞における選択されたヒト化ＢＴ−０６３変異体の一過的発現及びｈＩＬ−１０に対する抗体結合の比較
ＣＯＳ−７細胞におけるヒト化抗体変異体を一過的に発現させるために、選択した各ヒト化ＶＬ変異体（ｈＶＬ７及びｈＶＬ８）と、選択した各ヒト化ＶＨ変異体（ｈＶＨ１、ｈＶＨ９、ｈＶＨ１３、ｈＶＨ１８、ｈＶＨ２０、ｈＶＨ２６、ｈＶＨ２８）とを組み合わせて、１４個の異なるヒト化抗体を得た。
【００９６】
簡潔に述べると、２４ウェルフォーマットにおいて１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で、リン酸カルシウム沈殿により、軽鎖及び重鎖をコードする発現ベクターをＣＯＳ−７細胞に一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に置換し、トランスフェクションの２日間後〜３日間後にＣＯＳ−７細胞の上清を回収した。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の上清に分泌されたヒト化抗体の抗体力価をサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。求められた抗体濃度に基づいて、全てのサンプルの上清を同じ抗体濃度に調整した。ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０でコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる抗原ＥＬＩＳＡにより、全てのサンプルを用いてヒトＩＬ−１０に対する結合を分析した。
【００９７】
図４に示す通り、分析した変異体は全てｈＩＬ−１０に結合するが、結合性は異なっている。有意に、抗原ＥＬＩＳＡにおいて最も高いシグナルは、キメラＢ−Ｎ１０抗体で得られた強度に匹敵するシグナル強度を示すＢＴ−０６３変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７、及びｈＶＨ２０／ｈＶＬ８で得られた。これら３つの抗体内のシグナル強度の差（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８のシグナルがより強く、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７のシグナルがより弱い）は、定量サンドイッチＥＬＩＳＡ（上記を参照されたい）の結果、抗体濃度の差に起因していた可能性がある。調べた他の全ての変異体からは、キメラＢ−Ｎ１０抗体と比べてかなり弱いシグナルが得られた。
【００９８】
３．５ キメラ及びヒト化抗体の変異体の産生及びアフィニティー精製
選択されたヒト化ＢＴ−０６３変異体（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８、ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）及びキメラｃＢ−Ｎ１０（実施例２で論じた）をＣＯＳ−７細胞で産生させた。
【００９９】
１０ｃｍの組織プレートを用いて、セクション３．４に記載の通り一過的に発現させた。トランスフェクションの５日間後、各変異体から約０．５Ｌの無血清上清を回収した。
【０１００】
前記無血清上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。２ＭのＮａＣｌの存在下で上清をロードした。０．１Ｍのクエン酸バッファ（ｐＨ４．０）により抗体を溶出し、２Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．２）を含有するチューブに分画した。ＰＢＳでバッファ交換し、３０ｋＤａでカットオフする膜を用いて遠心分離することにより個々の抗体のプローブを濃縮した。抗原ＥＬＩＳＡ、非還元条件及び還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びに２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるＵＶ測定により、精製された物質の品質をチェックした。
【０１０１】
精製したキメラＢ−Ｎ１０及びヒト化変異体のｈＩＬ−１０に対する結合を、実施例２に記載した方法に従ってＥＬＩＳＡにより試験した。ｈＩＬ１０をコーティングし、変異体ｃＢ−Ｎ１０、ＢＴ−０６３−１（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７）、ＢＴ−０６３−２（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８）、及びＢＴ−０６３−３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）について抗体の結合を測定した。結果を図５に示す。
【０１０２】
キメラＢ−Ｎ１０及びｈＶＨ２０／ｈＶＬ７変異体のシグナル強度は同程度であったが、変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７のシグナル強度は僅かに低かった。
【０１０３】
３．６ ＢｉａｃｏｒｅヒトＩＬ−１０による親和性の測定
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ｈＩＬ−１０に対する様々な抗体（マウス、キメラ、３つのヒト化変異体）の結合についての会合速度定数及び解離速度定数を測定するために表面プラズモン共鳴分析を用いた。製造業者の条件に従って、ｈＩＬ−１０をＣＭ−５センサチップに固定化した。５μＬ／分の流速で２０μｇ／ｍＬのアリコート５０μＬを添加することによりｈＩＬ−１０を固定化して、固定化密度３２０ＲＵにした。５０μＬ／分の流速で０．１Ｍの炭酸バッファ（ｐＨ９．２）及び０．０１ＭのＨＣＬ／１ＭのＮａＣｌを各１分間用いることにより２段階サイクルで、固定化ｈＩＬ−１０表面を再生した。２０μｇ／ｍＬ〜０．１５μｇ／ｍＬの抗体濃度範囲で少なくとも４回各抗体サンプルを分析した。ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３（１９９９）ソフトウェアを用いることにより、センサグラムからの計算を実施した。
【０１０４】
表３に、全てのＢｉａｃｏｒｅ測定の結果を要約する。全ての変異体が同程度ｈＩＬ−１０に結合する。しかし、僅かな差が検出可能である。結果として、マウスモノクローナル抗体Ｂ−Ｎ１０、キメラｃＢ−Ｎ１０、及びヒト化変異体ＢＴ−０６３−１（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７）は、同程度の親和性で結合するが、２つの他のヒト化変異体ＢＴ−０６３−２（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８）及びＢＴ−０６３−３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）は、（マウスＢ−Ｎ１０に比べて約３倍）低い親和性を示す。会合速度及び解離速度の僅かな差も検出可能である。
【表３】
【０１０５】
カニクイザルのＩＬ−１０
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた更なる表面プラズモン共鳴実験により、ＢＴ−６３変異体３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）のカニクイザルＩＬ−１０に対する親和性を分析した。
【０１０６】
ＢＴ−０６３を１０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．５）で５μｇ／ｍＬに希釈し、アミンカップリング手順を用いて固定化して、最終レベルを約１，０００ＲＵにした。１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．８）を３０秒間注入して、センサチップ表面を再生した。フローセル及びレファレンスセルに異なる濃度のサンプルを注入した。検出器フローセルから得られたシグナルからレファレンスセルから得られたシグナルを減じ、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、得られた結合プロファイルを評価した。濃度依存性の結合プロファイルが得られ、カニクイザルのＩＬ−１０についての平均ＫＤは１９４ｐＭであると計算された。ポジティブコントロールとして、ｒｈＩＬ−１０を分析したところ、ＫＤは４．６ｎＭであった。結果を表４に要約する。
【表４】
【０１０７】
実施例４−インビトロにおける抗ＩＬ−１０抗体の活性
ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の能力を確認するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−６放出の遮断について調べた。ＰＢＭＣは、リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激されるとインターロイキン−６（ＩＬ−６）を放出する。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の生理学的活性は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−６の分泌阻害である。したがって、ＬＰＳで刺激された細胞にＩＬ−１０を添加すると、ＩＬ−６の分泌が阻害され、細胞培養培地中に存在するＩＬ−６が著しく低下する。しかし、細胞培養物にＢＴ−０６３を添加するとＩＬ−１０と結合するので、ＩＬ−１０が細胞表面上の受容体に結合することができなくなる。ＩＬ−１０の阻害作用は補償され、ＩＬ−６分泌は回復し、培地中にＩＬ−６が放出される。
【０１０８】
Ｆｉｃｏｌｌ勾配によりヒト血液からＰＢＭＣを単離した。単離した細胞を１×１０６細胞／ｍＬで播種し、ＩＬ−６を分泌させるためにＬＰＳで刺激したが、ＩＬ−１０の添加により阻害された。ＢＴ−０６３の添加によりＩＬ−１０の阻害作用が中和されたので、ＩＬ−６分泌が回復した。添加したＢＴ−０６３の目的（レファレンス、又は低品質若しくは高品質の対照サンプル）によって、異なる力価濃度のＢＴ−０６３を用い、濃度依依存的にＩＬ−６を分泌させた。このＩＬ−６の分布は、細胞培養の上清において検出した。
【表５】
【０１０９】
表５に示す通り、分泌されたＩＬ−６の量は、ＢＴ−０６３の濃度と直接相関している。ＢＴ−０６３の濃度が高くなるほど、より多くの量のＩＬ−６がＰＢＭＣから分泌され、上清中に存在する。ポジティブコントロール（ＩＬ−１０を含まない、刺激されたＰＢＭＣをインキュベートしたもの）と比べて、４０μｇ／ｍＬのＢＴ−０６３と共に細胞をインキュベートした場合はＩＬ−６分泌が約７３％回復するが、一方、０．９８８μｇ／ｍＬのＢＴ−０６３と共にインキュベートしても（用量設定の下限）、培地中で検出可能であったＩＬ−６レベルは僅か１７．５％であった。
【０１１０】
実施例５−ヒトＰＢＭＣに対する抗体の結合
勾配遠心分離を用いて様々な健常ボランティアから新たにヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。この目的のために、Ｈａｎｋｓ緩衝溶液で血液サンプルを１：１に希釈し、５０ｍＬの滅菌チューブ内のこの溶液２０ｍＬ上にＦｉｃｏｌｌ２０ｍＬをゆっくり重ねた。制動することなしに室温で２５分間１，２００×ｇにてこのチューブを遠心分離した。遠心分離後、曇った界面、即ちバッフィコートを５０ｍＬのチューブに移し、ＰＢＳで洗浄し、１０分間２６０ｇで再度遠心分離した。製造業者のプロトコールに従って、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（登録商標）を用いて残留赤血球を溶解させた。単離したＰＢＭＣをＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）に再懸濁させた。
【０１１１】
ヒトＰＢＭＣに対するＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の結合を、Ｚｅｎｏｎ標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＦＡＣＳ分析により決定した。製造業者の説明書に従って抗ヒトＩｇＧ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−Ｚｅｎｏｎキットを用いて抗体を標識した。キット中の試薬は、蛍光標識されているＦａｂ断片の結合を介して、その抗原認識性に影響を及ぼすことなしにＢＴ−０６３を標識する。Ｚｅｎｏｎキットを用いて同時に標識したヒトＩｇＧ１抗ＣＤ４抗体（ＢＴ０６１、Ｂｉｏｔｅｓｔ）をポジティブコントロールとして用いた。
【０１１２】
蛍光Ｆａｂ断片を過剰の抗体と共にインキュベートし、ｍＡｂのＦｃ部分に結合させる。無関係なＩｇＧとの第２の反応により残りの遊離Ｆａｂ断片をブロッキングして、誤陽性結合を阻害する。次いで、蛍光標識されているＢＴ−０６３又はＢＴ０６１を含む混合物を染色実験のために用いた。ネガティブコントロールとして、抗体無しで反応を実施した。
【０１１３】
１μｇの一次抗体（ＢＴ−０６３、α−ＣＤ４、又はネガティブコントロールとしてのＰＢＳ）を、５分間、総体積６μＬで、５μＬのＺｅｎｏｎ−ＡＦ４８８試薬（ＡＦ−４８８標識抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ断片）で標識した。次いで、５μＬのブロッキング試薬（無関係なヒトＩｇＧ）と共に２０分間インキュベートした。混合物全体をＰＢＳで希釈して適切な抗体濃度にした後、直ちに細胞の染色を実施した。
【０１１４】
実施例の結果を図６に示す。ヒトＰＢＭＣに対する結合を示さない２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、及び０．０２５μｇ／ｍＬの濃度の、標識ＢＴ−０６３を用いた。抗ＣＤ４抗体を用いた場合、ヒトＰＢＭＣに対する予測結合が検出されたが、ＢＴ−０６３は、２５μｇ／ｍＬの濃度以下ではリンパ球又は単球に対して全く結合を示さなかった。したがって、ＢＴ−０６３は、ヒト起源の末梢血単核細胞に対して検出可能な交差反応性を示さないと結論付けることができる。
【０１１５】
結果は、ＢＴ−０６３抗体は、ＰＢＭＣに結合しないので、ＢＴ−０６３は、可溶性ＩＬ−１０にのみ結合することを示す。
【０１１６】
実施例６−Ｘ線結晶構造解析
６．１ ヒトＩＬ−１０との複合体におけるＢＴ−０６３ Ｆａｂの結晶化
公開されている構造データに従って幾つかのＩＬ−１０コンストラクトを設計し（Ｚｄａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３，１９９５，ｐｐ．５９１）、標準的な手順により大腸菌で異種発現させるためのベクターにクローニングした。クローニングしたコンストラクトを標準的なプロトコールに従って試験的に発現させたところ、約１８ｋＤａの予測範囲でバンドが増加したことにより示される通り、ＩＬ−１０の高発現を示した。
【０１１７】
後でタンパク質を精製するために、最適な条件下で発現したＩＬ−１０タンパク質を様々な量得た。再折り畳みの後、固定化アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製して、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定したところ９５％を超える均質性を有するタンパク質が得られた。精製タンパク質の収量は、発現培養物１リットル当たり約０．３ｍｇであり、これは結晶化試験に十分であった。
【０１１８】
ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）のＦａｂ断片を、プロテアーゼパパインを用いてインタクトな抗体から切断し、プロテインＡにより精製した。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーによりＦａｂ断片を更に精製した。
【０１１９】
精製タンパク質をモル過剰のＩＬ−１０と混合することによりＩＬ−１０：ＢＴ−０６３ Ｆａｂ複合体を形成し、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。保持体積は、複合体のサイズと一致していた。次いで、結晶化に好適な濃度にタンパク質を濃縮した。
【０１２０】
ＩＬ−１０：ＢＴ−０６３ Ｆａｂ複合体の結晶を共結晶化法により調製した。
【０１２１】
６．２ データ収集及び処理
結晶を急速冷凍させ、１００Ｋの温度で測定した。低温条件を用いてＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ（ＳＬＳ，Ｖｉｌｌｉｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でＢＴ−０６３のＦａｂ断片と共にＩＬ−１０の共結晶からＸ線回折データを収集した。
【０１２２】
結晶は、非対称単位における２つの複合体と共に空間群Ｐ６に属する。プログラムＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥを用いてデータを処理した。データ収集統計値を表６に要約する。
【表６】
【０１２３】
６．３ 構造のモデリング及び構造の精密化
分子置換により、構造を決定及び分析するのに必要な位相情報を得た。ＩＬ−１０及びＦａｂ断片の公開モデルをサーチモデルとして用いた。次いで、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４及びＣＯＯＴを用いて標準的なプロトコールに従って、モデルの構築及び構造の精密化を実施した。最終モデルの正確さを交差検定するための尺度であるフリーＲ因子を計算するために、構造の精密化手順から測定された反射の４．２％を除外した（表７を参照されたい）。
【０１２４】
プログラムＣＨＥＭＳＫＥＴＣＨを用いてナノボディのパラメータ化を実施した。対応するライブラリファイルを作製するためにＬＩＢＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４）を用いた。
【０１２５】
３．０σで一致するＦｏ−Ｆｃマップのピークに水分子を置くことによりＣＯＯＴの「Ｆｉｎｄ ｗａｔｅｒｓ…」アルゴリズムを用いて水モデルを構築し、次いで、ＲＥＦＭＡＣ５で構造を精密化し、ＣＯＯＴの検証ツールを用いて全ての水をチェックした。疑わしい水のリストの基準は、以下の通りであった：Ｂ因子：８０超、２Ｆｏ−Ｆｃマップ：１．２σ未満、最も近接する接触までの距離：２．３Å未満又は３．５Å超。疑わしい水分子及び活性部位（阻害剤までの距離が１０Å未満）におけるものを用手的にチェックした。Ｆｏ−Ｆｃマップ（−３．０σに一致）におけるネガティブピークに存在していた側鎖の占有率をゼロに設定し、次いで、次の精密化サイクル後にポジティブピークが生じた場合、０．５に設定した。
【０１２６】
最終モデルのラマチャンドランプロットは、全ての残基の８０．８％が最も好ましい領域に、１７．９％が更に許容される領域に、残基の０．７％が寛容に許容される領域にあることを示す。残基Ｖａｌ８６（Ａ）、Ｈｉｓ１４（Ｂ）、Ａｓｐ８６（Ｂ）、Ｓｅｒ１３１（Ｃ）、Ｖａｌ５６（Ｄ）、及びＶａｌ５６（Ｆ）は、ラマチャンドランプロットの許容されない領域にみられる（表７）。これらは、電子密度マップにより確認される、即ち別の知覚可能な立体構造ではモデル化することができなかった。最終構造及び精密化プロセスの統計値を表７に示す。
【表７】
【０１２７】
６．４ Ｘ線構造解析
ＢＴ−０６３ Ｆａｂ抗体断片が結合するヒトＩＬ−１０の複合体構造を３．４８Åの解像度で分析し、Ｆａｂ抗体断片の詳細な結合様式を明らかにする。
【０１２８】
得られた電子密度は、Ｆａｂ断片の配向及び立体構造を含むＦａｂ断片の明確な結合様式を示す。空間群Ｐ６の結晶は、非対称単位における２つの複合体を含有する。
【０１２９】
Ｆａｂとの複合体におけるＩＬ−１０の構造を図７に示す。２つのＦａｂ断片は、ＣＤＲループでＩＬ−１０の各ホモダイマーに結合する。
【０１３０】
以下のＩＬ−１０の残基（分子Ａ及びＢ）は、３．９Åの最大距離内でＣＤＲループの近傍に見出すことができる：Ａｒｇ２７、Ｌｙｓ３４、Ｇｌｎ３８、Ｍｅｔ３９、Ａｓｐ４１、Ｇｌｎ４２、Ａｓｐ４４、Ｌｅｕ４６、Ｇｌｕ５０、Ｌｅｕ５３、Ｇｌｕ１４２、Ａｓｐ１４４、Ｉｌｅ１４５、Ａｓｎ１４８、Ｔｙｒ１４９、Ｇｌｕ１５１、及びＴｈｒ１５５。
【０１３１】
ＣＤＲループの以下の残基は、３．９Åの最大距離内でＩＬ−１０の近傍に見出すことができる：Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｓｎ７３、Ｓｅｒ７４、Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３（分子Ｃ及びＥ）、Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７、Ｌｙｓ５５（分子Ｄ及びＦ）。
【０１３２】
ＩＬ−１０：ＩＬ−１０Ｒ１受容体複合体の公開されている構造にＩＬ−１０：ＢＴ−０６３の複合体構造を重ねることにより示される通り、ＢＴ−０６３の結合部位は、ＩＬ−１０の表面上のＩＬ−１０受容体の結合部位と一致する（図８）。
【０１３３】
Ｘ線解析によって同定されたヒトＩＬ−１０と接触しているＢＴ−０６３のアミノ酸残基を、以下に示すＢＴ−０６３抗体可変ドメインの直鎖アミノ酸配列において強調する。
【表８】
ＣＤＲ領域（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９，６５７−６７０）に下線を引く（軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７１、７２、及び７３であり；重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７４、７５、及び７６である）。ＩＬ−１０と接触する残基を太字で示す。
【０１３４】
軽鎖内において、接触残基は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２にはみられるが、ＣＤＲ３にはみられない。３つ全てのＣＤＲの重鎖残基は抗原結合に関与していると考えられる。ＦＲ３の２つの残基（Ａｓｎ７３及びＳｅｒ７４）も抗原結合に寄与している。
【０１３５】
ＣＤＲ１の最初のＳｅｒ２８及びＡｌａ３０は、マウスＶＨの元になった配列（ＢＮ−１０）の一部であり、選択されるヒトフレームワーク（３−６６＊０４）中には存在しない。両方の位置は、それほど高い頻度で抗原結合に関与しておらず、ヒト化プロセス中に代替アミノ酸として導入された。
【０１３６】
残基Ａｓｎ７３及びＳｅｒ７４は、マウスにみられ、ヒト抗体フレームワーク配列でも頻繁にみられるが、通常、抗原結合には関与していない（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，２００１）。抗原結合に対するこれらの寄与は、予測されていない。
【０１３７】
ＢＴ−０６３結合に関与するＩＬ−１０アミノ酸残基を以下に示す。また、高親和性ＩＬ−１０受容体鎖（ＩＬ−１０Ｒ１）及び低親和性受容体鎖（ＩＬ−１０Ｒ２）に対する結合に関与しているＩＬ−１０の残基も示す。両方の受容体鎖が、ＩＬ−１０ホモダイマーの結合に関与しており、シグナル伝達に必要である。配列Ａでは、ＢＴ−０６３に接触する残基を太字で示し、下線を引く。配列Ｂでは、ＩＬ−１０Ｒ１に対する接触残基を太字で示し、下線を引き、ＩＬ−１Ｒ２に対する接触残基をイタリック体で示し、下線を引き、ＩＬ−１０Ｒ１とＩＬ−１０Ｒ２により共有されている接触残基を太字、イタリック体、及び下線で示す（Ｐｌｅｔｎｅｖ ｅｔ ａｌ ２００５）。
【表９】
【０１３８】
ＢＴ−０６３は、第１のＩＬ−１０モノマーのへリックスＡの連結ループ配列（Ｇｌｕ４２、Ａｓｐ４４、Ｌｅｕ４６）を含む残基（Ａｒｇ２７、Ｌｙｓ３４、Ｇｌｎ３８、Ｍｅｔ３９、Ａｓｐ４１）、及びへリックスＢ（Ｇｌｕ５０及びＬｅｕ５３）のＮ−末端部分と、第２のＩＬ−１０モノマーのへリックスＦ’の残基（Ｇｌｕ１４２、Ａｓｐ１４４、Ｉｌｅ１４５、Ａｓｎ１４８、Ｔｙｒ１４９、Ｇｌｕ１５１、Ｔｈｒ１５５）とを含むＩＬ−１０の不連続なエピトープに結合することが分かる。
【０１３９】
したがって、ＢＴ−０６３は、高親和性受容体鎖ＩＬ−１０Ｒ１の結合部位をブロックすることが分かる。
【０１４０】
実施例７−カニクイザルにおけるインビボ単回用量毒性試験
カニクイザルで、ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の単回静脈内注射後、安全性薬理学的パラメータを含む単回用量毒性試験を実施した。４匹／性別／群になるように動物を４群に分けた（プラセボ、１ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、及び５０ｍｇ／ｋｇ）。１日目にＢＴ−０６３を静脈内注射した。５日間後に動物の半数を剖検し、残りの動物は２８日目に屠殺した。
【０１４１】
この実験における低用量レベルである１ｍｇ／ｋｇは、ヒトにおける約３００μｇ／ｋｇの用量と等しく、合計ヒト（体重６０ｋｇ）用量は１８ｍｇになる。少数の研究者で開始した実験では、ＢＴ−０６３の元になった抗体Ｂ−Ｎ１００を同用量２１日間毎日投与した（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ，２０００）。この量の抗体は、薬理学的効果及び臨床的有効性を示した。したがって、この結果を踏まえて低用量レベルを選択した。高用量は、出発用量の倍数（５０）として選択した。中間用量は、低用量と高用量との幾何平均である。
【０１４２】
試験中、生理学的パラメータ又は組織病理学的パラメータにおいて毒物学的に有意又は明らかな変化はみられなかった。更に、臨床化学パラメータの変化は、毒物学的有意性が僅かである又は存在しないとみなされた。
【０１４３】
実施例８−静脈内投与後のＩＬ−１０特異的ＢＴ−０６３抗体による推定標的占有率
ｍＡｂ ＢＴ−０６３の単回静脈内注射後のヒト健常ボランティアにおけるＩＬ−１０の中和を推定するために、ＢＴ−０６３−ＩＬ−１０複合体の解離定数、ヒト血液体積の標準的なパラメータ、及び血流内にはＢＴ−０６３のみが分布しているという仮説に基づいて、健常ボランティアにおいて、ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）によるＩＬ−１０の標的占有率を推定した。
【０１４４】
８．１ 方法
検証されていないＭｉｃｒｏｓｏｆｔ−Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて、ＢＴ−０６３によるＩＬ−１０の標的占有率を計算し、用量依存性を示した。
計算のための仮説：
− 血液体積（血清）：３．５Ｌ
− 健常ボランティアの血清におけるＩＬ−１０の平均濃度：１５ｐｇ／ｍＬ
− ｋＤ（解離定数、ＢＴ−０６３⇔ＩＬ−１０）：３ｎＭ（Ｂｉａｃｏｒｅ実験から得た）
− ＩＬ−１０ダイマーの分子量：３７，０００ｇ／ｍｏｌ
− ＢＴ−０６３の分子量：１５０，０００ｇ／ｍｏｌ
【０１４５】
質量作用の法則を用いて、様々な用量のＢＴ−０６３抗体におけるＩＬ−１０の標的占有率を計算した。遊離ＩＬ−１０及び複合体ＩＬ−１０を理論的に計算するにあたって、１分子の抗ＩＬ−１０抗体が１つのＩＬ−１０ダイマーに結合すると仮定した。以下の平衡方程式を適用した：
質量作用の法則：ＢＴ０６３＋ＩＬ１０⇔ＢＴ０６３／ＩＬ−１０複合体
得られた解離定数は、ＢＴ０６３の定常状態濃度（［ＢＴ０６３］）、ＩＬ−１０の定常状態濃度（［ＩＬ−１０］）、及びＢＴ０６３−ＩＬ−１０複合体の定常状態濃度（［複合体］）により求められる：
ｋＤ＝［ＢＴ０６３］＊［ＩＬ−１０］／［複合体］
【０１４６】
定常状態濃度を直接得ることはできないが、出発濃度［ＢＴ０６３０］及び［ＩＬ−１００］、並びに複合体の定常状態濃度（［複合体］）から計算することができる：
［ＢＴ０６３］＝［ＢＴ０６３０］−［複合体］
［ＩＬ−１０］＝［ＩＬ−１００］−［複合体］
【０１４７】
ｍＡｂを静脈内注射した後のＢＴ０６３によるＩＬ−１０占有率を計算するために、以下の仮説を立てた：
− ＢＴ０６３は、注射直後、血液中に等しく且つ排他的に分布する
− ＢＴ０６３分子は、血液体積中に留まる
− ＩＬ−１０は、血液中に排他的に分布し、ＩＬ−１０の他の起源は存在しない
− ＩＬ−１０分子又はＢＴ０６３−ＩＬ−１０複合体は、血流中に留まり、Ｆｃ受容体の媒介する機序又は他の機序により循環から外れることもない
− 速やかに平衡に達する。
【０１４８】
これら仮説は、人工的に選択されたものであり、恐らくインビボにおける生物学的に関連する状況を表すものではない。ＢＴ０６３の分布体積は推定よりも大きいと仮定することができるが、その理由は、循環中のｍＡｂ濃度が速やかに低下するので、ＢＴ０６３は、略間違いなく体の脈管外区画にも分布すると考えられるためである。更に、脈管外にもＩＬ−１０の起源が存在し、体内に存在するＩＬ−１０の量も本明細書で推定した量よりも多いと予測することができる。
【０１４９】
結論として、本明細書で行った計算は、インビボにおける複合体化ＩＬ−１０の割合を過大評価している。したがって、インビボでは推定されるほどのＩＬ−１０の複合体化は生じず、計算値の安全域が存在する。
【０１５０】
計算基準として、以下の定数を用いた：
◆分子量（ＢＴ０６３）：１５，０００ｇ／ｍｏｌ
◆分子量（ＩＬ−１０ダイマー）：３７，０００ｇ／ｍｏｌ
◆健常ボランティアの血清におけるＩＬ−１０の平均濃度：１５ｐｇ／ｍＬ
◆血清体積：３．５Ｌ
【０１５１】
この基準に基づいて、平衡濃度下でＢＴ０６３と複合体化されるＩＬ−１０の用量依存的割合をコンピュータで計算することができる。表８及び図１０は、ｍＡｂの静脈内注射後の、ＢＴ０６３によるＩＬ−１０のブロックの用量依存性を示す。
【表１０】
【０１５２】
ＩＬ−１０濃度の差又はＢＴ０６３のＩＬ−１０に対する親和性の差（解離定数）の影響を理論的に推定するために、対応する曲線を図１０に示すオリジナルの用量応答依存性と比較した。
【０１５３】
図１１は、単に、複合体化ＩＬ−１０の割合がＩＬ−１０の血中濃度には依存していないことを示す。ＩＬ−１０濃度が１，０００倍変化した場合でさえも、用量応答曲線に対する影響は僅かなものでしかない。したがって、ＩＬ−１０濃度の変動は、百分率に基づくＢＴ−０６３によるＩＬ−１０の占有率を変化させるものではない。
【０１５４】
ＢＴ−０６３のヒトＩＬ−１０に対する親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ実験から求められるが、他の方法では、複合体の解離定数が僅かに異なる場合がある（Ｗａｉｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８ Ｎｏｖ；１２２（５）：８９０−２，Ｅｐｕｂ ２００８，Ｓｅｐ ２０）。したがって、親和性の差がＩＬ−１０占有率の用量応答性をどの程度変化させるかについて分析した。
【０１５５】
ＩＬ−１０濃度の変化とは対照的に、ＢＴ−０６３のＩＬ−１０に対する親和性が異なると、親和性がより高い（１０倍高い）場合はＢＴ−０６３の占有率が高くなる方向に曲線がシフトし、親和性がより低い場合も同様である（図１２）。
【０１５６】
データから、１７５μｇのＢＴ−０６３（最初の健常ボランティアヒト臨床試験の意図する出発用量）は、健常ボランティアの血中に存在する全てのＩＬ−１０のうちの約１０％を中和することができると結論付けることができる。ＢＴ−０６３の用量１０ｍｇまでは、ＢＴ−０６３の用量と複合体化しているＩＬ−１０の割合との間に対数線形関係が存在する。１０ｍｇのＢＴ−０６３では、全てのＩＬ−１０のうちの約８５％が中和される。
【０１５７】
計算された曲線の軌跡は、血中のＩＬ−１０濃度にそれ程依存せず、これは、（百分率に基づく）ＢＴ−０６３の中和能が、ＩＬ−１０濃度の差によって僅かな程度しか影響を受けないことを意味する。
【０１５８】
したがって、健常ボランティアについて表される曲線は、血中のＩＬ−１０濃度が高い全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者にも当てはまると推測することができる。これらデータから、健常ボランティアにおけるＢＴ−０６３の合計用量が１７５μｇを超える場合、サイトカインのうちの１０％超が中和されると結論付けることができる。この用量から合計用量１０ｍｇまでは、ｍＡｂによるＩＬ−１０の複合体化と８５％まで対数線形関係にある。ＢＴ−０６３が１０ｍｇを超えると、曲線は、飽和レベルに達する。合計用量１００ｍｇで中和が略１００％に達する。
【０１５９】
実施例８−健常ボランティアにおけるインビボ単回用量毒性試験
健常ボランティアにおいて漸増用量の抗体を用いて、ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の安全性及び忍容性、並びにＢＴ−０６３の投与の効果をモニターするために実験を行った。２３人のボランティアを８用量群に分け、ＢＴ−０６３を単回静脈内投与した。用量群は、以下の通りであった：０．１７５ｍｇ、０．７５ｍｇ、３．５ｍｇ、７ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び１００ｍｇ。１００ｍｇ用量群のボランティアが２人であったことを除いて、１群当たりのボランティアは３人であった。
【０１６０】
各用量を０．９％塩化ナトリウム注射液で合計体積２０ｍＬに希釈した。注入ポンプを用いて２時間に亘って用量を単回連続静脈内注射した。注入後８５日間に亘ってボランティアを評価し、この期間中の複数の時点で血液を採取した。
【０１６１】
採取した血液から、サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、及びＴＮＦαの濃度を評価した。
【０１６２】
結果
注入後２４時間以内では、ＩＬ−６及びＩＬ−８が非用量依存的に一過的に増加したが、３日間後には投与前のレベルに戻った。この作用は、抗体ではなく注入事象に関連すると考えられる。その理由は、用量との相関がなく、また最低用量でさえも前記事象が生じたためである。
【０１６３】
驚くべきことに、ＩＬ−１０が重要な調節性サイトカインであるにも関わらず、図１３に示される通り、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＴＮＦαの濃度増加は検出されなかった。また、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の濃度が増加しないことにより、ＢＴ−０６３の投与がヘルパーＴ細胞を活性化させないことが確認される。更に、体温も炎症促進性サイトカインの大量放出の指標であるので、処理されたボランティアにおいてこのパラメータも測定した。しかし、投与後、体温の上昇は検出されなかった。
【０１６４】
図１４に示す通り、ＩＬ−１０の血漿濃度は、ＢＴ−０６３の投与により影響を受け、ＢＴ−０６３の用量が増加するにつれて検出される血漿ＩＬ−１０も増加する。用いたアッセイは、遊離ＩＬ−１０及びＢＴ−０６３に結合しているＩＬ−１０の両方を検出することに留意すべきである。増加の理由としては、以下の２つの可能性がある：（１）ＩＬ−１０の半減期の延長、ＩＬ−１０のＢＴ−０６３への結合がＩＬ−１０の内部移行を妨げ、同時に、血液からＩＬ−１０を排出させなくする（通常、ＩＬ−１０は速やかにターンオーバーし、分泌されたＩＬ−１０の半減期は約２．３時間〜３．５時間である（Ｈｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９６）Ｊａｎ １５：８７（２）：６９９−７０５）；及び／又は（２）ネガティブフィードバックループの誘導−ＢＴ−０６３は、ＩＬ−１０のその受容体への結合をブロックするので、ＩＬ−１０が細胞に取り込まれることができなくなり、したがって、Ｂ細胞がより多くのＩＬ−１０を産生するようになる。ＢＴ−０６３及びマウスＩＬ−１０Ｒノックアウト細胞を用いた全血培養実験から得られたインビトロにおけるデータにより確認されているので（Ｍａｈｎｋｅ ｅｔ ａｌ．、未公開データ）、仮説（２）の可能性の方が高いと考えられる。
【０１６５】
薬物動態
薬物動態データは、ＢＴ−０６３のＣｍａｘ、ＡＵＣ、及び半減期が、予測される理論値の範囲内であることを示した。ＢＴ−０６３の終末半減期は、１５日間〜３０日間である。３０ｍｇ以上の用量を投与した後、８５日間後も依然としてＢＴ−０６３を血漿中で検出することが可能である。
【０１６６】
他のサイトカイン中和抗体（例えば、アダリムマブ、ヒト化抗ＴＮＦ−α）ではヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）応答がみられるという事実にも関わらず、処理したボランティアにおいてはＨＡＨＡがみられなかった。
【０１６７】
ＢＴ−０６３投与後、ＩＬ−１０の検出量は増加したが、この実験が、更に多い用量のＢＴ−０６３の安全性及び許容性を示したことに留意すべきであり、したがって、過剰のＩＬ−１０の効果を相殺するために十分な用量のＢＴ−０６３をＳＬＥ患者に安全に投与できると結論付けることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）及びＩＬ−１０に特異的な剤に関する。特に、本発明は、ヒト化ＩＬ−１０抗体及びその使用に関する。更に、本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己免疫疾患であると考えられており、この疾患においては、Ｂリンパ球の異常な高活性及び免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）自己抗体の異常な大量産生が重要な役割を果たしている。この病理過程では、Ｉｇでコーティングされた細胞が隔離及び破壊され、補体タンパク質が定着及び分割され、且つケモタキシン、血管作動性ペプチド、及び破壊酵素が組織に放出される（非特許文献１）。
【０００３】
ＳＬＥは、多様な徴候を特徴とする。この疾患の過程においては、合計９５％の患者が筋骨格系疾患を訴え、８０％が皮膚病変、８５％が血液疾患、６０％が神経障害、６０％が心肺疾患、３０％〜５０％が腎臓疾患、４０％が胃腸疾患、１５％が血栓症、及び１５％が眼疾患を示す。また、患者の大部分（９５％）が、疲労、倦怠感、発熱、食欲不振、及び体重減少等の全身性症状に苦しみ、これら症状は、殆ど常に発現している。大部分の患者では、寛解と突然再発する疾患期間とが交互に生じる。永続的に寛解する（治療をしなくても症状が出ない）ことは非常に稀である。５０年以上前、ＳＬＥと診断された患者の大部分は、５年間未満しか生存できなかった。現在は、１０年生存率が９０％を超えており、これは、早期診断、対症療法的な抗炎症及び免疫抑制治療によるものである。最も一般的な死因は、免疫抑制の結果としての感染症である（非特許文献１）。
【０００４】
ＳＬＥの治療には、通常、抗マラリア薬、抗炎症薬、及び免疫抑制薬が用いられている。症状の制御が困難になった場合には、非ステロイド性抗炎症薬にコルチコステロイドを加える。更に、多くの臓器に関連する活動性ＳＬＥは、シクロホスファミドを用いる積極的治療を必要とする。
【０００５】
現在まで、ＳＬＥを治癒させる及び／又は長期間に亘って患者の生活の質を向上させるために利用可能な原因療法は存在していない。しかし、近年、抗体技術が進歩し、また、この自己免疫疾患の原因である因子が更に同定されたことにより、治療の選択肢としてモノクローナル抗体を使用する可能性が開かれつつある。特に、ＳＬＥを治療するための好ましいアプローチは、ポリクローナル自己抗体を大量に過剰産生させる病的免疫反応と相互作用するか又は補正する特異的な治療である。ＳＬＥの病因は、主にＢ細胞の調節不全に関連しているので、Ｂ細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体が特に注目されている。非特許文献２に記載の通り、潜在的なＢ細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、及びＣＤ２２を標的とする。更に、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２（非特許文献３）及びＩＬ−６（非特許文献４）は、免疫反応の調節において重要なサイトカインであり、特に、ＳＬＥ患者における突然の再発中に上昇する。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する自己抗体及びＩＬ−１０の血漿レベルは、ＳＬＥ患者における疾患の活動性を反映していることが多い。ＩＬ−１０レベルの上昇は、ＳＬＥ患者における疾患の活動性と相関している（非特許文献５）。しかし、ＩＬ−１０は、免疫系に対して多面的な作用を有するサイトカインであり、また、炎症促進反応の低減に関与していることが知られている。
【０００６】
モノクローナル抗体を用いた臨床試験がＳＬＥ患者で実施されている。具体的には、幾つかの臨床試験では、非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられるキメラマウス抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である抗体リタキシマブが用いられた。非特許文献２に記載の通り、これら臨床試験の結果は、ＳＬＥ患者においてこの抗体が高い活性を有していることを示したので、オファツムマブ、ＩＭＭＵ−１０６、及びＧＡ−１０１等のＣＤ２０を標的とする幾つかの新規抗体が開発された。ＳＬＥにおけるモノクローナル抗体の活性を報告している更なる臨床試験では、抗ＣＤ２２抗体であるエプラツズマブ、抗ＴＮＦα抗体であるインフリキシマブ、抗ＩＬ−１０抗体であるＢ−Ｎ１０（非特許文献６）、抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ１３１及びＢＧ９５８８、ＢＬＹＳ阻害剤であるベリムマブ、抗ＩＬ−６受容体抗体であるトクリムマブ、並びに抗Ｃ５抗体であるエクリズマブが用いられた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｈｎ ＢＨ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｎ：Ｋａｓｐｅｒ ＤＬ，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ Ｅ，Ｆａｕｃｉ ＡＳ，Ｈａｕｓｅｒ ＳＬ，Ｌｏｎｇｏ ＤＬ，Ｊａｍｅｓｏｎ，ＪＬ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ＵＳ）：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ；２００５．ｐｐ．１９６０−１９６７
【非特許文献２】Ｒｏｂａｋ ａｎｄ Ｒｏｂａｋ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２００９，Ｎｏ．１０，ｐａｇｅｓ２６−３７）
【非特許文献３】Ｃａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４ Ｎｏｖ；１３８（２）：３４８−５６
【非特許文献４】Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｓｅｐ；２７（５）：４６１−６
【非特許文献５】Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９８ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１６（３）：２８３−８
【非特許文献６】Ｌｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０００ Ａｕｇ；４３（８）：１７９０−８００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、更なる剤、特に、この領域において有用性を有する抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、第１の態様では、本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、（ｉ）ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、且つＩＬ−１０がＩＬ−１０の受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合できず；（ｉｉ）両方のモノマーの残基を含む不連続なエピトープに結合することによりホモダイマー型のＩＬ−１０に結合する抗体又はその断片を提供する。
【００１０】
本発明者らは、本発明の抗体が、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状、特に、自己免疫疾患を治療するのに好適であるように、特に有利な結合様式を有することを見出した。具体的には、本発明の抗体及びその断片は、一旦ＩＬ−１０Ｒαに結合したＩＬ−１０には結合することができないので、ＡＤＣＣ反応又はＣＤＣ反応をトリガーすることができない。結果として、本発明の抗体は、ＩＬ−１０が受容体に結合している細胞には結合することができないので、ＡＤＣＣ反応又はＣＤＣ反応を誘導することができない。したがって、これは、特に有利な結合様式である。この方法では、免疫系の他の部分に対する抗体の影響が制御される。更に、本発明の抗体及びその断片は、ＩＬ−１０モノマーよりも遥かに高い親和性でＩＬ−１０ホモダイマーに結合可能である。したがって、前記抗体は、モノマー又は分解産物ではなく機能的に活性のある形態のＩＬ−１０に優先的に結合する。これは、中和効果を生じさせるのに必要なＩＬ−１０抗体の量を減少させ、且つ非活性分子に対する非特異的な結合に起因する副作用のリスクを低減するので、特に有利である。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、且つＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができない抗体又はその断片を提供する。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、ホモダイマー型のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、両方のモノマーの残基を含む不連続なエピトープに結合する抗体又はその断片を提供する。
【００１３】
第４の態様では、本発明は、請求項１に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、及び／又はマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を提供する。
【００１４】
第５の態様では、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用及び／又は補体依存性細胞傷害作用を誘導しない抗体又はその断片を提供する。
【００１５】
第６の態様では、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＩＬ−１０α受容体を介するＩＬ−１０シグナル伝達を妨げることができる抗体又はその断片を提供する。
【００１６】
第７の態様では、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＩＬ−１０Ｒ発現細胞には結合することができない抗体又はその断片を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
単なる一例として、以下の図面を参照して本発明を例証する。
【図１Ａ】図１Ａは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く（ＬＣＤＲ１は、配列番号４であり、ＬＣＤＲ２は、配列番号５であり；ＬＣＤＲ３は、配列番号６である）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く（ＨＣＤＲ１は、配列番号７であり、ＨＣＤＲ２は、配列番号８であり；ＨＣＤＲ３は、配列番号９である）。
【図２Ａ】図２Ａは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、マウスＢ−Ｎ１０の軽鎖可変領域（配列番号１２）、Ａ１７（配列番号１４）、ＪＫ１（配列番号１５）、及びマウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域ｈＶＬ１〜ｈＶＬ１２（配列番号１８〜２９）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、マウスＢ−Ｎ１０の重鎖可変領域（配列番号１３）、３−６６＋０４（配列番号１６）、ＪＨ４（配列番号１７）、及びマウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域可変領域ｈＶＨ１〜ｈＶＨ１２（配列番号３０〜４１）のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、マウスＢ−Ｎ１０抗体のヒト化中に生じた可変領域ｈＶＨ１３〜ｈＶＨ２９（配列番号４２〜５８）のアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ｈＩＬ−１０抗原ＥＬＩＳＡを用いてキメラｃＢ−Ｎ１０抗体と比較した、ヒト化抗体変異体の抗原結合性を提供する。
【図５】図５は、精製抗体製剤を用いてキメラＢ−Ｎ１０抗体と比較した、３つのヒト化変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８、及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７の結合性の測定結果を提供する。
【図６】図６は、標識されているＢＴ０６１及びＢＴ−０６３によるリンパ球の染色を示す。
【図７】図７は、ＢＴ−０６３ Ｆａｂ（上段）、ＩＬ−１０モノマー及びダイマー（中段）、及びＩＬ−１０ダイマーとＢＴ−０６３ Ｆａｂとの複合体（下段）のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図８】図８は、ＩＬ−１０に結合しているＢＴ−０６３のＦａｂ断片の全体構造を示す。ＩＬ−１０及びＦａｂ断片をリボン図で示す。
【図９】図９は、ＩＬ−１０受容体が結合する部位と同じＩＬ−１０の部位に結合するＢＴ−０６３のＦａｂ断片を示す。ＩＬ−１０、ＩＬ−１０Ｒ１、及びＦａｂ断片をリボン図で示す。
【図１０】図１０は、健常ボランティアに静脈内注射した後に漸増合計用量のＢＴ−０６３と結合しているＩＬ−１０の理論的に計算された用量依存性を示す。
【図１１】図１１は、図１０に示す用量応答曲線に対する様々なＩＬ−１０濃度の理論的影響を示す。正常であると推定される濃度（１５ｐｇ／ｍＬ）の１，０００倍高い及び低い濃度についての曲線を示す。曲線間では僅かな差しかみられなかった。
【図１２】図１２は、図１０に示す用量応答曲線に対する、ＢＴ−０６３のＩＬ−１０に対する様々な親和性の理論的影響を示す。ＢＴ−０６３により決定された親和性（３ｎＭ）よりも１０倍高い及び低い親和性についての曲線を示す。用量応答曲線は、ＢＴ−０６３のＩＬ−１０に対する親和性に大きく依存する。
【図１３】図１３は、健常ボランティアにＢＴ−０６３をインビボ投与した後の、投薬量に対するサイトカインの血漿濃度の平均ｃｍａｘのグラフを示す。
【図１４】図１４は、健常ボランティアにＢＴ−０６３をインビボ投与した後の、経時的なＩＬ−１０平均血漿濃度のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
上記の通り、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片、及び高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状の治療におけるこの抗体又はその断片の使用に関する。
【００１９】
ヒトＩＬ−１０は、分子量３７ｋＤａのホモダイマーである。各モノマーは、１６０アミノ酸からなり、分子量は１８．５ｋＤａである。ＩＬ−１０のダイマーは、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−Ｒα又はＩＬ−１０Ｒ１）と相互作用し、次いで、ＩＬ−１０受容体β（ＩＬ−１０Ｒβ又はＩＬ−１０Ｒ２）を複合体に動員する。これら受容体は、様々な細胞、特に、単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、及びＢリンパ球等の大部分の造血細胞を含む免疫細胞（Ａｓａｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２００３ Ｊｕｎ；５５（２）：２４１−６９）で発現するが、表皮細胞又はケラチン産生細胞等の非造血細胞でも発現する。ＩＬ−１０受容体αとＩＬ−１０との結合及びＩＬ−１０受容体βの動員により、Ｊａｋ１及びＴｙｋ２チロシンキナーゼを介するシグナル伝達が導かれ、次いで、ＳＴＡＴファミリーの転写因子が活性化される。ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、好酸球、マスト細胞、ケラチン産生細胞、樹状細胞、更には癌細胞等、様々なＩＬ−１０の細胞源が公知である。Ｂ細胞におけるＩＬ−１０の機能は、アポトーシスの防止、増殖の強化、クラススイッチ事象、及びプラズマ細胞への分化（Ａｓａｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．２００３ Ｊｕｎ；５５（２）：２４１−６９）から炎症の阻害まで多岐に亘る。
【００２０】
本発明の第１及び第２の態様、並びに本発明の好ましい実施形態及び他の態様では、抗体又はその断片は、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、且つＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができない、即ち、ＩＬ−１０が前記抗体又はその断片に結合しているとき、ＩＬ−１０はＩＬ−１０Ｒαに結合することができない。
【００２１】
上記の通り、機能的に活性のあるＩＬ−１０ダイマーは、ＩＬ−１０Ｒαと相互作用し、次いで、ＩＬ−１０Ｒβを複合体に動員して、シグナル伝達を生じさせる。しかし、幾つかの準最適なシグナル伝達事象は、最初にＩＬ−１０がＩＬ−１０Ｒαに結合している間に生じると予測されている。
【００２２】
ＩＬ−１０の作用を中和可能な抗体は、多数の機序を介して機能することができる。前記抗体は、ＩＬ−１０に結合し、立体障害によりＩＬ−１０Ｒαに対するＩＬ−１０の結合を妨げることができる。具体的には、機能的に活性のあるＩＬ−１０はホモダイマーであるので、２つの抗体分子が同じＩＬ−１０ダイマーに結合可能である。或いは、ＩＬ−１０Ｒαの結合部位とは重複しないＩＬ−１０の領域に中和抗体を結合させて、ＩＬ−１０の立体構造の変化を誘導することによりＩＬ−１０Ｒαの結合と拮抗させることも可能である（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００２）１０；９８１−９８７）。
【００２３】
或いは、前記抗体は、ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒβとの間の相互作用を防ぐＩＬ−１０の領域に結合可能である。更に、高親和性受容体鎖にサイトカインが結合した後も露出しているＩＬ−１０の部位に抗体を結合させて、立体構造の変化を誘導し、シグナル伝達に必要な第２の受容体鎖の動員を妨げることも可能である。
【００２４】
対照的に、本発明の抗体又はその断片は、ＩＬ−１０Ｒαが結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合することにより、ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒαとの相互作用を阻害する。したがって、本発明の抗体は、ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒαとの間の任意の結合を防ぐ。したがって、上記準最適なシグナル伝達事象でさえも避けることができる。したがって、本発明は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＩＬ−１０α受容体を介するＩＬ−１０のシグナル伝達を防ぐことができる抗体又はその断片を提供する。
【００２５】
本明細書で使用される語句「同じ領域に結合する」とは、ＩＬ−１０の結合についてＩＬ−１０Ｒαと競合する抗体又はその断片の能力を指す。実際、本発明の抗体又はその断片は、競合的阻害剤として作用する。ＩＬ−１０Ｒαは、ＩＬ−１０ダイマーにおける１９〜４２及び１３８〜１５８の残基に結合することが知られている。したがって、本発明の抗体又はその断片は、ＩＬ−１０Ｒαの結合を有効にブロックするために、これら両方の領域のうちの少なくとも１残基に結合することもできる。
【００２６】
更に、語句「ＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているとき」とは、ＩＬ−１０が、両側で、即ち両方のモノマーを介してＩＬ−１０受容体に結合している状況を指す。
【００２７】
好ましい実施形態では、前記抗体又はその断片は、ＩＬ−１０受容体β（ＩＬ−１０Ｒβ）が結合する領域と同じ領域には結合しない。
【００２８】
或いは、本発明のこの態様及び実施形態は、ＩＬ−１０αを介したＩＬ−１０のシグナル伝達を防ぐことができるか、又はＩＬ−１０Ｒ発現細胞に（即ち、結合しているＩＬ−１０を介して）結合することができないと定義することができる。
【００２９】
本発明の第１及び第３の態様、並びに本発明の他の態様の好ましい実施形態では、抗体又はその断片は、ＩＬ−１０ホモダイマーのモノマーのうちの一方の残基と、ＩＬ−１０ホモダイマーの第２のモノマーの残基とを含む不連続なエピトープに結合する、即ち、前記抗体又はその断片は、ホモダイマーを形成している第１のモノマーの残基と第２のモノマーの残基とを含む不連続なエピトープに結合する。
【００３０】
用語「ホモダイマー型」とは、互いに９０°で配向されている２つのαヘリカルドメイン（ドメインＡ及びドメインＢ）からなる対称的ホモダイマーによって表される機能的に活性のあるＩＬ−１０を指す。各ドメインの構造的一体性は、一方の鎖の最初の４つのへリックスが他方の鎖の最後２つのへリックスと会合するような、各ペプチド鎖のαへリックスの絡み合いに依存する。界面を構築するためには両方の鎖の部分が必要であるので、単一のＩＬ−１０モノマーは、ＩＬ−１０受容体に結合することはできない。
【００３１】
本発明の抗体又はその断片は、野生型ＩＬ−１０ダイマーの両方のモノマーと同時に相互作用する。したがって、本発明の抗体又はその断片は、「不連続なエピトープ」、即ち、折り畳まれているタンパク質ではアミノ酸が極近接しているが、折り畳まれていないときは離れているエピトープに結合する。具体的には、エピトープは、ＩＬ−１０ダイマーの両方の鎖に存在するアミノ酸によって表される。
【００３２】
この結合様式の結果として、前記抗体又はその断片は、不連続なエピトープの一部のみが存在するＩＬ−１０モノマーに対する親和性よりも遥かに高い親和性で機能的に活性のあるＩＬ−１０に結合する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、抗体又はその断片は、一方のＩＬ−１０モノマー（即ち、第１のモノマー）のへリックスＡの残基と、他方のＩＬ−１０モノマー（即ち、第２のモノマー）のへリックスＦ’の残基とを含む不連続なエピトープに結合する。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態では、ヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片は、一方のＩＬ−１０モノマーの最初の５５アミノ酸、より好ましくはアミノ酸２０〜５５と、第２のモノマーの最後の２０アミノ酸とにより提供される不連続なエピトープに結合し、逆もまた同様である。
【００３５】
一方のモノマーのへリックスＡ〜ＤとへリックスＥ〜Ｆとを組み合わせた、ＩＬ−１０Ｒ１又はＢＴ−０６３により認識される形態の人工突然変異型ＩＬ−１０が、文献から公知である。
【００３６】
本明細書で言及されるＩＬ−１０は、ヒトＩＬ−１０であり、そのアミノ酸配列は、以下の通り表すことができる：
ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮ ＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰ ＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦ
ＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫ ＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥ ＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬ
ＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱ ＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡ ＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨ
ＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴ ＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲ ＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡ
ＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫ ＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭ ＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩ
ＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ （配列番号１）
【００３７】
抗ＩＬ−１０抗体が望ましい活性を有しているかどうかは、公知のペプチドスキャニング技術により、又はサイズ排除クロマトグラフィーにより決定することができる。
【００３８】
ペプチドスキャニング技術は、ＩＬ−１０結合剤候補をスクリーニングすることからなり得、前記結合剤の全て又は断片を膜又は適切な表面に固定化することができる。具体的には、ＩＬ−１０又はＩＬ−１０断片は、合成してもよく、ＩＬ−１０又はＩＬ−１０断片をコードしているヌクレオチド配列を例えば大腸菌又は昆虫細胞等の適切なホストで高発現させてもよい。具体的には、本発明の抗体についてのエピトープを形成すると本明細書で同定されたＩＬ−１０の領域を用いることができる。
【００３９】
抗ＩＬ−１０抗体は、例えば、ファージ又はリボソーマルディスプレイ（又はｍＲＮＡディスプレイ、ポリソーマルディスプレイ、酵母ディスプレイ）技術を用いて同定することができる。これら技術を用いて、不連続なエピトープを認識する結合剤を同定することもできる。タンパク質又はリガンド（即ち、選択される抗体）のいずれかを固定化し、結合パートナー候補と共にインキュベートしてもよい。結合していないタンパク質を除去し、結合しているリガンドを溶出する。数ラウンドの選択を実施して、高親和性結合剤を同定する。
【００４０】
本願において、用語「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、或いは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の配列と同一であるが、一方、抗体の残りの部分は、異なる種、抗体クラス、又は抗体サブクラスに由来する抗体の配列と同一である抗体を指す。キメラ抗体のＣＤＲはある起源に由来するが、抗体の残りの部分は異なる起源に由来することが特に好ましい。具体的には、本発明において、キメラ抗体は、非ヒト抗体の抗原結合配列／可変ドメインがヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされているヒト化抗体であってよい。
【００４１】
本願において、用語「断片」は、望ましい生物活性を保持している抗体の断片又は誘導体を指す。断片は、一般的に、抗体の抗原結合領域、具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに多価抗体誘導体、具体的には、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）又はタンデム二重特異性抗体を含む。断片は、少なくとも２５アミノ酸が好ましく、５０アミノ酸がより好ましく、２００アミノ酸〜５００アミノ酸が更により好ましい。或いは、断片は、３０ＫＤａ〜１５０ｋＤａのサイズを有する断片として定義することもできる。更に、抗体断片は、２以上のペプチド／ポリペプチド鎖を含んでいてもよい。例えば、各長さが２００アミノ酸〜３００アミノ酸である２本の鎖を含むＦａｂ断片、又は各長さが４００アミノ酸〜５００アミノ酸である２本の鎖を含むＴａｎｄＡｂｓ（登録商標）（四価二重特異的抗体フォーマット）である。
【００４２】
本発明の第４の態様、並びに本発明の他の態様の好ましい実施形態では、抗体又はその断片は、マウスＢ−Ｎ１０抗体又はＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）に由来する。具体的には、かかる抗体又はその断片は、Ｂ−Ｎ１０若しくはＢＴ−０６３可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、及び／又はＢ−Ｎ１０若しくはＢＴ−０６３可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。マウスＣＤＲのアミノ酸配列を図１に示す。ＢＴ−０６３変異体の可変配列を実施例６に示す。前記配列は、Ｂ−Ｎ１０又はＢＴ−０６３抗体のＣＤＲの配列と少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であることがより好ましい。
【００４３】
或いは、Ｂ−Ｎ１０又はＢＴ−０６３抗体に由来する抗体又は断片は、抗体又はその断片の親和性及び／又は特異性を実質的に変化させることのない変異を配列中に任意で含む、Ｂ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、及び／又はＢ−Ｎ１０／ＢＴ−０６３可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含んでいてもよい。具体的には、マウスＢ−Ｎ１０抗体又はＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）抗体のＣＤＲを含む抗体又は断片と比べて、前記配列中の変異は、ＩＬ−１０に対する抗体又は断片の親和性又は特異性を低下させない。
【００４４】
特定の実施形態では、ヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片は、マウスＢ−Ｎ１０の可変軽鎖及び／又は重鎖、或いはＢＴ−０６３変異体の軽鎖及び／又は重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明は、図１に示すマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変ドメイン、又は実施例６に示すＢＴ−０６３抗体の可変ドメインと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。
【００４５】
更に、本発明者らが実施したＸ線結晶構造解析の結果、本発明の抗体又は断片は、ＩＬ−１０に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、ＢＴ−０６３軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む可変領域及び／又はＢＴ−０６３重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域を含み、前記ＣＤＲが、配列中に以下のアミノ酸置換を任意で含むＣＤＲである抗体又はその断片として定義することができる：
（ｉ）Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｙｓ５５を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６を含む重鎖ＣＤＲ２、
（ｖ）Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３を含む重鎖ＣＤＲ３。
【００４６】
より好ましくは、重鎖可変領域は、Ａｓｎ７３及びＳｅｒ７４を更に含む。ＣＤＲ内の置換について、前記ＣＤＲの配列は、ＢＴ−０６３におけるＣＤＲの配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であることが特に好ましい。
【００４７】
残基の種類及び番号は、言及されるＢＴ−０６３のＣＤＲのアミノ酸残基を明確に同定する目的のために使用した。しかし、残基の番号は、この方法でスクリーニングされる候補抗体又は断片の位置に関して残基を限定することを意図するものではないと理解されたい。例えば、この実施形態の抗体では、Ｓｅｒ３２は、軽鎖のセクション１〜３０から１つの非必須アミノ酸残基が欠失している場合、軽鎖ＣＤＲ１内の３１位に存在してもよい。
【００４８】
ＢＴ−０６３重鎖及び軽鎖の配列、並びにＣＤＲの位置を、以下の実施例６に示す。
【００４９】
本発明の第５の態様及び本発明の残りの態様の好ましい実施形態では、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能であるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘導しない。
【００５０】
上記の通り、前記抗体又は断片は、ＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体αに結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができない。したがって、前記抗体又はその断片は、可溶性ＩＬ−１０にのみ結合することができ、（ＩＬ−１０を介して）ＩＬ−１０Ｒ発現細胞に結合することはできない。結果として、本発明の抗体又は断片は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを誘導することはできず、これは、可溶性ＩＬ−１０にしか結合せず、細胞に結合しているＩＬ−１０には結合しないという性質に少なくとも部分的に起因している。
【００５１】
抗体がＣＤＣを誘導するかどうかを試験するために、対象抗原を有する細胞を、補体（又はＣ１ｑ等の活性補体を含有する血清）の存在下で漸増用量の抗体と共にインキュベートしてもよい。細胞の殺傷の程度は、誘導されるＣＤＣの量を表すパラメータとして測定することができる。
【００５２】
抗体がＡＤＣＣを誘導するかどうかを試験するために、対象抗原を有する細胞（標的細胞）を、ＡＤＣＣを誘導する細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、エフェクター細胞）の存在下で漸増用量の抗体と共にインキュベートしてもよい。標的細胞における細胞の殺傷の程度は、誘導されるＡＤＣＣの量を表すパラメータとして測定することができる。
【００５３】
更に、本発明の更なる態様及び本発明の残りの態様の好ましい実施形態では、ヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片は、患者に投与したとき、患者の血漿中のＩＬ−１０のうちの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％が前記抗体又はその断片と複合体化するようにインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）と結合可能である。この状況では、用語「抗体又はその断片と複合体化する」とは、患者に投与した後、前記抗体又はその断片がＩＬ−１０を占有することを指す。前記抗体又はその断片のＩＬ−１０占有能は、抗体又はその断片とＩＬ−１０との間の解離定数を知った上で、更に、以下の実施例８に提供する仮説及び方法を用いて、３．５Ｌの血液体積に基づいてインビトロで評価することができる。
【００５４】
一般的に、本発明の抗体は、ヒト定常領域（Ｆｃ）を更に含む。これは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプに由来する定常ドメインの中から選択することができる。好ましい定常領域は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１の定常ドメインの中から選択される。
【００５５】
他の生成物
本発明は、更に、上記抗体又は抗体断片をコードする核酸配列を提供する。前記核酸配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡが好ましい。前記配列は、発現カセット又はベクター内で用いることができ、本明細書に開示される抗体及びその断片の産生において特に用いられる。
【００５６】
本発明は、更に、これらポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターで形質転換されたホスト細胞を提供する。好適なホスト細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００５７】
或いは、ホスト細胞は、本発明の抗体を産生する細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマであってもよい。
【００５８】
上記ホスト細胞は、抗体又はその断片を産生するための方法で利用することができる。具体的には、かかる方法は、抗体又はその断片を発現させる条件下で好適な培養培地中にてホスト細胞を培養する工程と、培養培地から前記抗体又はその断片を分離する工程とを含んでいてもよい。この種の方法は、当技術分野において公知であり、報告されている。
【００５９】
また、本発明は、ヒトＩＬ−１０のアミノ酸２７〜５３及びアミノ酸１４２〜１５５のうちの一方又は両方を含む５０未満のアミノ酸を含む単離ペプチドを提供する。かかるペプチドは、下記スクリーニング方法で特に用いられる。
【００６０】
医療的用途
本明細書に記載される抗体又はその断片は、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される疾患又は病状の治療において有用性を有する。結果として、被験体における病状を治療又は予防するための方法であって、前記病状が高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介され、治療上有効な量の本明細書に記載される抗体又はその断片を投与することを含む方法を提供する。
【００６１】
具体的には、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状は、ＳＬＥである。したがって、また、本発明は、医療において、具体的にはＳＬＥの治療において使用するための本明細書に記載される抗体又はその断片を提供する。
【００６２】
更なる例は、血小板減少性紫斑病、ループス腎炎、ＨＩＶ、ｈＣＭＶ、及びＣ型肝炎である。別の例は、免疫反応の増殖又は抑制を直接支持することによりＩＬ−１０に依存している腫瘍細胞を治療することである。
【００６３】
本発明の更なる実施形態は、薬学的に許容し得る担体又は希釈剤と共に、上記抗体又はその断片を含む医薬組成物である。１つの実施形態では、前記組成物は、抗体又はその断片がカップリングしているリポソームを含む。
【００６４】
かかる組成物は、患者に対して、非経口的に、静脈内に、又は皮下に投与することができる。ＳＬＥの治療において、前記抗体又はその断片は、静脈内又は皮下に投与されることが好ましい。
【００６５】
更に、本明細書に記載される抗体及びその断片は、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状の診断において有用である。具体的には、抗体及びその断片は、個体から採取されたサンプル中の異常なレベルのＩＬ−１０の存在を判定するためのインビトロアッセイで利用することができる。かかる診断方法は、（ａ）個体から採取したサンプルを得る又は提供する工程と；（ｂ）本明細書に記載される抗ＩＬ−１０抗体又はその断片と前記サンプルとを接触させる工程と；（ｃ）（例えば、前記抗体又はその断片の存在を検出することにより）ＩＬ−１０の存在を検出する工程とを含んでいてもよい。具体的には、工程（ｃ）は、サンプル中に存在するＩＬ−１０の量を決定することを含んでいてもよい。更に、前記方法は、患者及び病状に関連する評価を行うために、１以上の所定の値と存在するＩＬ−１０の量とを比較する工程（ｄ）を更に含んでいてもよい。前記所定の値は、健常個体から採取された等価なサンプル中に存在するＩＬ−１０の量の標準的な値を表していてもよい。
【００６６】
サンプルは、個体から血液を採取することにより得られる血漿サンプルであることが好ましい。具体的には、前記病状がＳＬＥである診断方法を用いることができる。
【００６７】
非医療的用途
更に、本明細書に記載される抗体又はその断片と標識とを含む、標識されているヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片を提供する。前記標識は、サンプル中の抗体の存在を検出するために当技術分野において公知である任意の好適な種類であってよい。具体的には、前記標識は、蛍光標識であってよい。
【００６８】
本発明の抗体又はその断片、具体的には、前記標識されている抗体は、サンプル中に存在するＩＬ−１０の存在を検出するためのインビトロ方法において特定の有用性を有する。前記方法は、標識されていない抗体若しくは標識されている抗体又はこれらの断片とサンプルとを接触させる工程と、前記サンプルを洗浄して、前記サンプルに結合していない抗体又は抗体断片（非結合抗体又は抗体断片）を除去する工程と、例えば標識を介して、前記サンプル中の前記抗体の存在を検出する工程とを含む。
【００６９】
或いは、サンプル中のＩＬ−１０を中和するためのインビトロ方法に、標識されていない抗体又は断片を使用してもよい。かかる方法は、抗体又はその断片をＩＬ−１０に結合させるために、前記抗体又は断片とサンプルとを接触させる工程を含む。
【００７０】
更に、また、本発明は、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合可能である１以上の分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）以下のヒトＩＬ１０の領域：アミノ酸２７〜５３及びアミノ酸１４２〜１５５のうちの１以上を含むペプチドと前記１以上の分子とを接触させる工程と；
（ｂ）前記１以上の分子が前記ペプチドの１以上の領域に結合するかどうかを検出する工程と
を含む方法を提供する。
【００７１】
具体的には、前記１以上の分子は、好ましくはペプチド、最も好ましくは抗体又は抗体断片である。スクリーニングは、ファージディスプレイライブラリの作製及びスクリーニングを用いる等、当技術分野において公知の方法により行うことができる。
【００７２】
更に、本発明は、ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合可能である抗体又は抗体断片をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１以上の抗体又は抗体断片とＩＬ−１０とを接触させる工程と；
（ｂ）ＩＬ−１０とＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）との相互作用を阻害する前記抗体又は抗体断片の能力を評価する工程と；
（ｃ）ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合可能である抗体又は抗体断片を同定する工程と
を含み、
前記抗体又は抗体断片が、ＢＴ−０６３軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む可変領域及び／又はＢＴ−０６３重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域を含み、
前記ＣＤＲが、配列中に以下のアミノ酸置換を任意で含むＣＤＲである方法を提供する：
（ｉ）Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｙｓ５５を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６を含む重鎖ＣＤＲ２、
（ｖ）Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３を含む重鎖ＣＤＲ３。
【００７３】
この態様では、分子がＩＬ−１０に結合する能力を有している可能性があり、したがって、特定の候補分子を用いてスクリーニングする方法が可能であるという本発明者らによる研究についてより詳細に説明した。前記候補分子は、ＢＴ−０６３抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列の標的突然変異誘発により作製することができる。
【実施例】
【００７４】
次に、以下の特定の実施形態に関連して本発明を更に説明する。
【００７５】
実施例１−マウス抗ＩＬ１０抗体Ｂ−Ｎ１０の特性評価
１．１ Ｂ−Ｎ１０抗体の可変ドメインをコードするＤＮＡの単離
マウスＢＮ−１０の可変配列を同定するために、細胞ペレットを用いた。−８０℃で保存しておいたサンプル（３×Ｂ−Ｎ１０、３代継代、１×１０７細胞）の細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した後、Ｂ−Ｎ１０の可変配列をＰＣＲにより増幅させ、次いで、クローニングした。
【００７６】
合計１４クローンの配列を決定し（ＳＥＱ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、可変軽鎖及び可変重鎖について分析した。Ｂ−Ｎ１０の可変配列を明確に決定した。Ｎ−末端のプライマー領域でのみ差が生じた（表１を参照されたい）。可変重鎖については、プライマー領域における配列変異ＱＶＱＬＫＱ（配列番号５９）が９クローンで生じていたが、他の変異は１クローン又は２クローンでしか生じていなかった。サブクローニングするためにこの変異体を選択した。可変軽鎖については、２つの変異体が同比率で存在していた。マウス生殖細胞系配列と比較したところ、３つの突然変異しか有しないｃｒ１配列が、同定されたＶＬ配列と高い相同性を示した。これは、ＤＶＬＭＴＱ（配列番号６０）配列が正確な配列である可能性が非常に高いことを意味する。配列ＤＩＶＭＴＱ（配列番号６１）は、典型的な別のクラスの生殖細胞系配列であるので、除外した。
【表１】
【００７７】
可変軽鎖ＶＬ及び可変重鎖ＶＨのタンパク質配列を、それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示す。超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。対応するＤＮＡ配列を、それぞれ図２Ａ及び２Ｂに示す。
【００７８】
実施例２−キメラＢ−Ｎ１０抗体の作製
組換え抗体を発現させるために、実施例１で同定された抗体の重鎖及び軽鎖の可変配列をベクター系にクローニングした。第１の工程として、前記配列をＢＳリーダーにクローニングし、Ｎ末端に分泌シグナルを付加し、Ｃ末端にスプライスドナー配列を付加した。第２の工程として、それぞれ定常ヒトカッパ鎖及び定常ヒトガンマ−１鎖を含有する発現ベクターにこれら配列をクローニングした。軽鎖用ベクター及び重鎖用ベクターを調製し、次いで、リン酸カルシウム沈殿又はリポフェクションによってＣＯＳ−７細胞に一過的にコトランスフェクトした。２日間後、細胞培養上清を回収した。ＣＯＳ−７細胞中でキメラＢ−Ｎ１０を発現させ、上清中の抗体の力価を検出した（サンドイッチＥＬＩＳＡ）後、ヒトインターロイキン−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１７−ＩＬ／ＣＦ、ロット番号ＥＴ１１４０２１、−２０℃で保存）に対する結合能をＥＬＩＳＡで試験した。
【００７９】
サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、マウス抗ヒトカッパ鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をキャッチャー抗体としてプレート表面に結合させ、次いで、細胞培養上清と共にインキュベートし、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いてキメラ抗体の存在を検出した。規定の濃度（０．１２５μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬ）のキメラ対照抗体をポジティブコントロールとして用いた。
【００８０】
抗原ＥＬＩＳＡの場合、０．５μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの濃度でプレート表面にヒトＩＬ−１０を結合させた。細胞培養上清（未希釈及び１：５希釈）と共にインキュベートした後、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いてキメラＢ−Ｎ１０の結合を検出した。マウスＢ−Ｎ１０をポジティブコントロールとして用いた。０．５μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの濃度の抗体を用い、ＰＯＤと複合体化しているウサギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（Ｄａｋｏ）で結合を検出した。
【００８１】
ＥＬＩＳＡの結果については、実施例３で論じる。
【００８２】
実施例３−抗ＩＬ−１０抗体のヒト化
げっ歯類抗体のヒトにおける免疫原性を低下させようとする最初の試みは、げっ歯類抗体の定常ドメインをヒト抗体の定常ドメインに置き換えることによりキメラ抗体を作製することであった。依然として可変ドメイン内のげっ歯類のフレームワーク領域が免疫反応を誘導する場合があったので、より進歩したＣＤＲのグラフト方法、即ち、抗原結合配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）を完全にヒト抗体フレームワークに転移させる（ヒト化）方法が開発された。通常、マウスドナー抗体に最も類似するヒトアクセプターフレームワークを選択して、ヒト化プロセス中にオリジナル抗原の特異性及び親和性が回復される可能性を高める。ヒト抗体生殖細胞系配列、発現抗体のコンセンサス配列、ＣＤＲループ構造の分析、及び抗体／抗原複合体のＸ線構造を用いる異なるアプローチを用いてもよく、これらと組み合わせて前記プロセスを改善してもよい。通常、幾つかのヒト化抗体変異体は、この方法で作製され、後に、互いに異なる及びオリジナル抗体と異なる可能性のある生物学的作用に関して分析される。最後に、抗体の望ましい機能に従って、好適なヒト定常領域を選択することができる。
【００８３】
３．１ Ｂ−Ｎ１０のマウス可変配列とヒト配列との配列比較、並びにヒト化ＶＬ（ｈＶＬ）及びＶＨ（ｈＶＨ）の配列のセットの設計
マウス抗ＩＬ−１０抗体であるＢ−Ｎ１０を選択した（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．１９９３ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；４（６）：４２１−７；及びＬｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０００ Ａｕｇ；４３（８）：１７９０−８０）。ヒト化抗体を得るための方法は、相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトアクセプター領域に融合させるＣＤＲグラフト手順に基づく。
【００８４】
以下の３つのデータセットの複合分析に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークを選択した：
１． 体細胞突然変異のリスクを最小化するための、マウス配列とヒト生殖細胞系配列との相同性、
２． 異常なアミノ酸残基を同定するための、マウス配列とヒトコンセンサス配列との比較、及び
３． 重要な構造フレームワークアミノ酸残基についての情報を得るための、ＣＤＲ配列の基準となる構造クラスの同定。
【００８５】
Ｂ−Ｎ１０のマウス可変軽鎖は、ヒト生殖細胞系可変セグメント２−３０＊０１（Ａ１７（配列番号１４））及び接合セグメントＪＫ１（配列番号１５）に対して最も高い相同性を示す。Ｂ−Ｎ１０に対して最も高い相同性を有するヒトコンセンサス配列は、ＨｕＫＩＩである。可変軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｌ１の場合クラス４に、Ｌ２及びＬ３の場合クラス１に分類することができた。重要なアミノ酸残基を同定した。
【００８６】
クラス４−１−１の基準構造を有するマウスＣＤＲとヒト生殖細胞系ＶＬ遺伝子との配列比較により、２−３０＊０１と最も高い相同性を有する（一致しないアミノ酸数が最も少ない）ことが明らかになった。
【００８７】
Ｂ−Ｎ１０のマウス可変重鎖は、ヒト生殖細胞系可変セグメントＶＨ３−３３及び接合セグメントＪＨ４（配列番号１７）に対して最も高い相同性を示す。Ｂ−Ｎ１０に対して最も高い相同性を有するヒトコンセンサス配列は、ＨｕＨＩＩＩである。可変重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｈ１及びＨ２の場合クラス１に分類することができた。重要なアミノ酸残基を同定した。クラス１−１の基準構造を有するマウスＣＤＲとヒト生殖細胞系ＶＨ遺伝子との配列比較により、３−６６＊０４（配列番号１６）と最も高い相同性を有する（一致しないアミノ酸数が最も少ない）ことが明らかになった。したがって、生殖細胞系配列ＶＨ３−６６を考慮した。
【００８８】
ヒト化可変軽鎖（１２変異体）と可変重鎖（２９変異体）との様々な可変配列のセットを設計するために、得られた全てのデータを検討した。
【００８９】
３．２ ヒト化ｈＩＬ−１０結合抗体断片の小さなライブラリの構築及び選択
ｈＩＬ−１０に結合する可能性のある抗体断片のライブラリを作製して最適なヒトＩＬ−１０結合抗体を得るために、真核細胞のコドン使用頻度を考慮した上で、図３に示す１２個のｈＶＬ断片及び２９個のｈＶＨ断片をコードするｃＤＮＡ配列を作製した。
【００９０】
次いで、得られたｃＤＮＡをクローニングベクターにクローニングし、ＳＥＱ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において配列を決定した。ｈＶＬ断片をコードする１２個の各ｃＤＮＡとｈＶＨ断片をコードする２９個のｃＤＮＡとを組み合わせて、発現する可能性のある３４８個の抗体断片を得るという方法でライブラリを構築した。
【００９１】
細菌で発現させ、ヒトＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１７−ＩＬ／ＣＦ）に対して２ラウンドの選択を行った後、ｈＩＬ−１０（同様に選択した）に対する結合についてＥＬＩＳＡにより前記抗体断片を分析した。簡潔に述べると、４℃で一晩、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０でＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をコーティングした。前記プレートをブロッキング及び洗浄した後、抗体断片を産生する細菌の上清を添加した。結合しているヒト化抗体断片を検出するために、ＰＯＤと複合体化している二次抗体を用いた。
【００９２】
優れた結合剤のコード配列を分析し、同定されたｈＶＬ断片及びｈＶＨ断片の発生について列記した（表２）。
【表２】
【００９３】
太字にした配列は、抗体全体について結合特性を分析するために、適切な真核発現ベクターにサブクローニングするために選択した配列である。括弧内に示す配列は、発現ベクターにサブクローニングするために選択したが、欠陥コンストラクトしか得られなかった配列である。
【００９４】
３．３ 選択したＢＴ−０６３のヒト化軽鎖及び重鎖の変異体用の発現ベクターの作製
スクリーニングアプローチにより求められた統計値に基づいて、ベクター系にクローニングするためのＢＴ−０６３のヒト化ＶＬ及びヒト化ＶＨの変異体のセットを選択した。第１の工程では、分泌シグナル５’及びスプライスドナー配列３’をコードしている配列とクローニングしたｃＤＮＡとを融合させるために、ヒト化ＶＬ及びＶＨの変異体をコードするｃＤＮＡを適切なベクターに転移させた。第２の及び最後のサブクローニング工程で、それぞれ、ヒト定常カッパ鎖及びヒト定常ガンマ−１鎖をコードする発現ベクターにこれらｃＤＮＡコンストラクトを転移させた。内毒素を含まないＱｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、独立に得られたｈＶＬ及びｈＶＨを含有する発現ベクターのプラスミドを調製した。
【００９５】
３．４ ＣＯＳ−７細胞における選択されたヒト化ＢＴ−０６３変異体の一過的発現及びｈＩＬ−１０に対する抗体結合の比較
ＣＯＳ−７細胞におけるヒト化抗体変異体を一過的に発現させるために、選択した各ヒト化ＶＬ変異体（ｈＶＬ７及びｈＶＬ８）と、選択した各ヒト化ＶＨ変異体（ｈＶＨ１、ｈＶＨ９、ｈＶＨ１３、ｈＶＨ１８、ｈＶＨ２０、ｈＶＨ２６、ｈＶＨ２８）とを組み合わせて、１４個の異なるヒト化抗体を得た。
【００９６】
簡潔に述べると、２４ウェルフォーマットにおいて１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で、リン酸カルシウム沈殿により、軽鎖及び重鎖をコードする発現ベクターをＣＯＳ−７細胞に一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクション後、培地を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に置換し、トランスフェクションの２日間後〜３日間後にＣＯＳ−７細胞の上清を回収した。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の上清に分泌されたヒト化抗体の抗体力価をサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。求められた抗体濃度に基づいて、全てのサンプルの上清を同じ抗体濃度に調整した。ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０でコーティングされたＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる抗原ＥＬＩＳＡにより、全てのサンプルを用いてヒトＩＬ−１０に対する結合を分析した。
【００９７】
図４に示す通り、分析した変異体は全てｈＩＬ−１０に結合するが、結合性は異なっている。有意に、抗原ＥＬＩＳＡにおいて最も高いシグナルは、キメラＢ−Ｎ１０抗体で得られた強度に匹敵するシグナル強度を示すＢＴ−０６３変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７、及びｈＶＨ２０／ｈＶＬ８で得られた。これら３つの抗体内のシグナル強度の差（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８のシグナルがより強く、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７のシグナルがより弱い）は、定量サンドイッチＥＬＩＳＡ（上記を参照されたい）の結果、抗体濃度の差に起因していた可能性がある。調べた他の全ての変異体からは、キメラＢ−Ｎ１０抗体と比べてかなり弱いシグナルが得られた。
【００９８】
３．５ キメラ及びヒト化抗体の変異体の産生及びアフィニティー精製
選択されたヒト化ＢＴ−０６３変異体（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７、ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８、ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）及びキメラｃＢ−Ｎ１０（実施例２で論じた）をＣＯＳ−７細胞で産生させた。
【００９９】
１０ｃｍの組織プレートを用いて、セクション３．４に記載の通り一過的に発現させた。トランスフェクションの５日間後、各変異体から約０．５Ｌの無血清上清を回収した。
【０１００】
前記無血清上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。２ＭのＮａＣｌの存在下で上清をロードした。０．１Ｍのクエン酸バッファ（ｐＨ４．０）により抗体を溶出し、２Ｍのリン酸バッファ（ｐＨ７．２）を含有するチューブに分画した。ＰＢＳでバッファ交換し、３０ｋＤａでカットオフする膜を用いて遠心分離することにより個々の抗体のプローブを濃縮した。抗原ＥＬＩＳＡ、非還元条件及び還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びに２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおけるＵＶ測定により、精製された物質の品質をチェックした。
【０１０１】
精製したキメラＢ−Ｎ１０及びヒト化変異体のｈＩＬ−１０に対する結合を、実施例２に記載した方法に従ってＥＬＩＳＡにより試験した。ｈＩＬ１０をコーティングし、変異体ｃＢ−Ｎ１０、ＢＴ−０６３−１（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７）、ＢＴ−０６３−２（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８）、及びＢＴ−０６３−３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）について抗体の結合を測定した。結果を図５に示す。
【０１０２】
キメラＢ−Ｎ１０及びｈＶＨ２０／ｈＶＬ７変異体のシグナル強度は同程度であったが、変異体ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８及びｈＶＨ２６／ｈＶＬ７のシグナル強度は僅かに低かった。
【０１０３】
３．６ ＢｉａｃｏｒｅヒトＩＬ−１０による親和性の測定
ＢＩＡＣＯＲＥ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ｈＩＬ−１０に対する様々な抗体（マウス、キメラ、３つのヒト化変異体）の結合についての会合速度定数及び解離速度定数を測定するために表面プラズモン共鳴分析を用いた。製造業者の条件に従って、ｈＩＬ−１０をＣＭ−５センサチップに固定化した。５μＬ／分の流速で２０μｇ／ｍＬのアリコート５０μＬを添加することによりｈＩＬ−１０を固定化して、固定化密度３２０ＲＵにした。５０μＬ／分の流速で０．１Ｍの炭酸バッファ（ｐＨ９．２）及び０．０１ＭのＨＣＬ／１ＭのＮａＣｌを各１分間用いることにより２段階サイクルで、固定化ｈＩＬ−１０表面を再生した。２０μｇ／ｍＬ〜０．１５μｇ／ｍＬの抗体濃度範囲で少なくとも４回各抗体サンプルを分析した。ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３（１９９９）ソフトウェアを用いることにより、センサグラムからの計算を実施した。
【０１０４】
表３に、全てのＢｉａｃｏｒｅ測定の結果を要約する。全ての変異体が同程度ｈＩＬ−１０に結合する。しかし、僅かな差が検出可能である。結果として、マウスモノクローナル抗体Ｂ−Ｎ１０、キメラｃＢ−Ｎ１０、及びヒト化変異体ＢＴ−０６３−１（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ７）は、同程度の親和性で結合するが、２つの他のヒト化変異体ＢＴ−０６３−２（ｈＶＨ２０／ｈＶＬ８）及びＢＴ−０６３−３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）は、（マウスＢ−Ｎ１０に比べて約３倍）低い親和性を示す。会合速度及び解離速度の僅かな差も検出可能である。
【表３】
【０１０５】
カニクイザルのＩＬ−１０
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた更なる表面プラズモン共鳴実験により、ＢＴ−６３変異体３（ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）のカニクイザルＩＬ−１０に対する親和性を分析した。
【０１０６】
ＢＴ−０６３を１０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．５）で５μｇ／ｍＬに希釈し、アミンカップリング手順を用いて固定化して、最終レベルを約１，０００ＲＵにした。１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．８）を３０秒間注入して、センサチップ表面を再生した。フローセル及びレファレンスセルに異なる濃度のサンプルを注入した。検出器フローセルから得られたシグナルからレファレンスセルから得られたシグナルを減じ、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、得られた結合プロファイルを評価した。濃度依存性の結合プロファイルが得られ、カニクイザルのＩＬ−１０についての平均ＫＤは１９４ｐＭであると計算された。ポジティブコントロールとして、ｒｈＩＬ−１０を分析したところ、ＫＤは４．６ｎＭであった。結果を表４に要約する。
【表４】
【０１０７】
実施例４−インビトロにおける抗ＩＬ−１０抗体の活性
ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の能力を確認するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＬ−６放出の遮断について調べた。ＰＢＭＣは、リポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激されるとインターロイキン−６（ＩＬ−６）を放出する。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の生理学的活性は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−６の分泌阻害である。したがって、ＬＰＳで刺激された細胞にＩＬ−１０を添加すると、ＩＬ−６の分泌が阻害され、細胞培養培地中に存在するＩＬ−６が著しく低下する。しかし、細胞培養物にＢＴ−０６３を添加するとＩＬ−１０と結合するので、ＩＬ−１０が細胞表面上の受容体に結合することができなくなる。ＩＬ−１０の阻害作用は補償され、ＩＬ−６分泌は回復し、培地中にＩＬ−６が放出される。
【０１０８】
Ｆｉｃｏｌｌ勾配によりヒト血液からＰＢＭＣを単離した。単離した細胞を１×１０６細胞／ｍＬで播種し、ＩＬ−６を分泌させるためにＬＰＳで刺激したが、ＩＬ−１０の添加により阻害された。ＢＴ−０６３の添加によりＩＬ−１０の阻害作用が中和されたので、ＩＬ−６分泌が回復した。添加したＢＴ−０６３の目的（レファレンス、又は低品質若しくは高品質の対照サンプル）によって、異なる力価濃度のＢＴ−０６３を用い、濃度依依存的にＩＬ−６を分泌させた。このＩＬ−６の分布は、細胞培養の上清において検出した。
【表５】
【０１０９】
表５に示す通り、分泌されたＩＬ−６の量は、ＢＴ−０６３の濃度と直接相関している。ＢＴ−０６３の濃度が高くなるほど、より多くの量のＩＬ−６がＰＢＭＣから分泌され、上清中に存在する。ポジティブコントロール（ＩＬ−１０を含まない、刺激されたＰＢＭＣをインキュベートしたもの）と比べて、４０μｇ／ｍＬのＢＴ−０６３と共に細胞をインキュベートした場合はＩＬ−６分泌が約７３％回復するが、一方、０．９８８μｇ／ｍＬのＢＴ−０６３と共にインキュベートしても（用量設定の下限）、培地中で検出可能であったＩＬ−６レベルは僅か１７．５％であった。
【０１１０】
実施例５−ヒトＰＢＭＣに対する抗体の結合
勾配遠心分離を用いて様々な健常ボランティアから新たにヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。この目的のために、Ｈａｎｋｓ緩衝溶液で血液サンプルを１：１に希釈し、５０ｍＬの滅菌チューブ内のこの溶液２０ｍＬ上にＦｉｃｏｌｌ２０ｍＬをゆっくり重ねた。制動することなしに室温で２５分間１，２００×ｇにてこのチューブを遠心分離した。遠心分離後、曇った界面、即ちバッフィコートを５０ｍＬのチューブに移し、ＰＢＳで洗浄し、１０分間２６０ｇで再度遠心分離した。製造業者のプロトコールに従って、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（登録商標）を用いて残留赤血球を溶解させた。単離したＰＢＭＣをＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）に再懸濁させた。
【０１１１】
ヒトＰＢＭＣに対するＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の結合を、Ｚｅｎｏｎ標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＦＡＣＳ分析により決定した。製造業者の説明書に従って抗ヒトＩｇＧ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−Ｚｅｎｏｎキットを用いて抗体を標識した。キット中の試薬は、蛍光標識されているＦａｂ断片の結合を介して、その抗原認識性に影響を及ぼすことなしにＢＴ−０６３を標識する。Ｚｅｎｏｎキットを用いて同時に標識したヒトＩｇＧ１抗ＣＤ４抗体（ＢＴ０６１、Ｂｉｏｔｅｓｔ）をポジティブコントロールとして用いた。
【０１１２】
蛍光Ｆａｂ断片を過剰の抗体と共にインキュベートし、ｍＡｂのＦｃ部分に結合させる。無関係なＩｇＧとの第２の反応により残りの遊離Ｆａｂ断片をブロッキングして、誤陽性結合を阻害する。次いで、蛍光標識されているＢＴ−０６３又はＢＴ０６１を含む混合物を染色実験のために用いた。ネガティブコントロールとして、抗体無しで反応を実施した。
【０１１３】
１μｇの一次抗体（ＢＴ−０６３、α−ＣＤ４、又はネガティブコントロールとしてのＰＢＳ）を、５分間、総体積６μＬで、５μＬのＺｅｎｏｎ−ＡＦ４８８試薬（ＡＦ−４８８標識抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ断片）で標識した。次いで、５μＬのブロッキング試薬（無関係なヒトＩｇＧ）と共に２０分間インキュベートした。混合物全体をＰＢＳで希釈して適切な抗体濃度にした後、直ちに細胞の染色を実施した。
【０１１４】
実施例の結果を図６に示す。ヒトＰＢＭＣに対する結合を示さない２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、及び０．０２５μｇ／ｍＬの濃度の、標識ＢＴ−０６３を用いた。抗ＣＤ４抗体を用いた場合、ヒトＰＢＭＣに対する予測結合が検出されたが、ＢＴ−０６３は、２５μｇ／ｍＬの濃度以下ではリンパ球又は単球に対して全く結合を示さなかった。したがって、ＢＴ−０６３は、ヒト起源の末梢血単核細胞に対して検出可能な交差反応性を示さないと結論付けることができる。
【０１１５】
結果は、ＢＴ−０６３抗体は、ＰＢＭＣに結合しないので、ＢＴ−０６３は、可溶性ＩＬ−１０にのみ結合することを示す。
【０１１６】
実施例６−Ｘ線結晶構造解析
６．１ ヒトＩＬ−１０との複合体におけるＢＴ−０６３ Ｆａｂの結晶化
公開されている構造データに従って幾つかのＩＬ−１０コンストラクトを設計し（Ｚｄａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３，１９９５，ｐｐ．５９１）、標準的な手順により大腸菌で異種発現させるためのベクターにクローニングした。クローニングしたコンストラクトを標準的なプロトコールに従って試験的に発現させたところ、約１８ｋＤａの予測範囲でバンドが増加したことにより示される通り、ＩＬ−１０の高発現を示した。
【０１１７】
後でタンパク質を精製するために、最適な条件下で発現したＩＬ−１０タンパク質を様々な量得た。再折り畳みの後、固定化アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を精製して、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定したところ９５％を超える均質性を有するタンパク質が得られた。精製タンパク質の収量は、発現培養物１リットル当たり約０．３ｍｇであり、これは結晶化試験に十分であった。
【０１１８】
ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）のＦａｂ断片を、プロテアーゼパパインを用いてインタクトな抗体から切断し、プロテインＡにより精製した。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーによりＦａｂ断片を更に精製した。
【０１１９】
精製タンパク質をモル過剰のＩＬ−１０と混合することによりＩＬ−１０：ＢＴ−０６３ Ｆａｂ複合体を形成し、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。保持体積は、複合体のサイズと一致していた。次いで、結晶化に好適な濃度にタンパク質を濃縮した。
【０１２０】
ＩＬ−１０：ＢＴ−０６３ Ｆａｂ複合体の結晶を共結晶化法により調製した。
【０１２１】
６．２ データ収集及び処理
結晶を急速冷凍させ、１００Ｋの温度で測定した。低温条件を用いてＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ（ＳＬＳ，Ｖｉｌｌｉｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でＢＴ−０６３のＦａｂ断片と共にＩＬ−１０の共結晶からＸ線回折データを収集した。
【０１２２】
結晶は、非対称単位における２つの複合体と共に空間群Ｐ６に属する。プログラムＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥを用いてデータを処理した。データ収集統計値を表６に要約する。
【表６】
【０１２３】
６．３ 構造のモデリング及び構造の精密化
分子置換により、構造を決定及び分析するのに必要な位相情報を得た。ＩＬ−１０及びＦａｂ断片の公開モデルをサーチモデルとして用いた。次いで、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４及びＣＯＯＴを用いて標準的なプロトコールに従って、モデルの構築及び構造の精密化を実施した。最終モデルの正確さを交差検定するための尺度であるフリーＲ因子を計算するために、構造の精密化手順から測定された反射の４．２％を除外した（表７を参照されたい）。
【０１２４】
プログラムＣＨＥＭＳＫＥＴＣＨを用いてナノボディのパラメータ化を実施した。対応するライブラリファイルを作製するためにＬＩＢＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４）を用いた。
【０１２５】
３．０σで一致するＦｏ−Ｆｃマップのピークに水分子を置くことによりＣＯＯＴの「Ｆｉｎｄ ｗａｔｅｒｓ…」アルゴリズムを用いて水モデルを構築し、次いで、ＲＥＦＭＡＣ５で構造を精密化し、ＣＯＯＴの検証ツールを用いて全ての水をチェックした。疑わしい水のリストの基準は、以下の通りであった：Ｂ因子：８０超、２Ｆｏ−Ｆｃマップ：１．２σ未満、最も近接する接触までの距離：２．３Å未満又は３．５Å超。疑わしい水分子及び活性部位（阻害剤までの距離が１０Å未満）におけるものを用手的にチェックした。Ｆｏ−Ｆｃマップ（−３．０σに一致）におけるネガティブピークに存在していた側鎖の占有率をゼロに設定し、次いで、次の精密化サイクル後にポジティブピークが生じた場合、０．５に設定した。
【０１２６】
最終モデルのラマチャンドランプロットは、全ての残基の８０．８％が最も好ましい領域に、１７．９％が更に許容される領域に、残基の０．７％が寛容に許容される領域にあることを示す。残基Ｖａｌ８６（Ａ）、Ｈｉｓ１４（Ｂ）、Ａｓｐ８６（Ｂ）、Ｓｅｒ１３１（Ｃ）、Ｖａｌ５６（Ｄ）、及びＶａｌ５６（Ｆ）は、ラマチャンドランプロットの許容されない領域にみられる（表７）。これらは、電子密度マップにより確認される、即ち別の知覚可能な立体構造ではモデル化することができなかった。最終構造及び精密化プロセスの統計値を表７に示す。
【表７】
【０１２７】
６．４ Ｘ線構造解析
ＢＴ−０６３ Ｆａｂ抗体断片が結合するヒトＩＬ−１０の複合体構造を３．４８Åの解像度で分析し、Ｆａｂ抗体断片の詳細な結合様式を明らかにする。
【０１２８】
得られた電子密度は、Ｆａｂ断片の配向及び立体構造を含むＦａｂ断片の明確な結合様式を示す。空間群Ｐ６の結晶は、非対称単位における２つの複合体を含有する。
【０１２９】
Ｆａｂとの複合体におけるＩＬ−１０の構造を図７に示す。２つのＦａｂ断片は、ＣＤＲループでＩＬ−１０の各ホモダイマーに結合する。
【０１３０】
以下のＩＬ−１０の残基（分子Ａ及びＢ）は、３．９Åの最大距離内でＣＤＲループの近傍に見出すことができる：Ａｒｇ２７、Ｌｙｓ３４、Ｇｌｎ３８、Ｍｅｔ３９、Ａｓｐ４１、Ｇｌｎ４２、Ａｓｐ４４、Ｌｅｕ４６、Ｇｌｕ５０、Ｌｅｕ５３、Ｇｌｕ１４２、Ａｓｐ１４４、Ｉｌｅ１４５、Ａｓｎ１４８、Ｔｙｒ１４９、Ｇｌｕ１５１、及びＴｈｒ１５５。
【０１３１】
ＣＤＲループの以下の残基は、３．９Åの最大距離内でＩＬ−１０の近傍に見出すことができる：Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｓｎ７３、Ｓｅｒ７４、Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３（分子Ｃ及びＥ）、Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７、Ｌｙｓ５５（分子Ｄ及びＦ）。
【０１３２】
ＩＬ−１０：ＩＬ−１０Ｒ１受容体複合体の公開されている構造にＩＬ−１０：ＢＴ−０６３の複合体構造を重ねることにより示される通り、ＢＴ−０６３の結合部位は、ＩＬ−１０の表面上のＩＬ−１０受容体の結合部位と一致する（図８）。
【０１３３】
Ｘ線解析によって同定されたヒトＩＬ−１０と接触しているＢＴ−０６３のアミノ酸残基を、以下に示すＢＴ−０６３抗体可変ドメインの直鎖アミノ酸配列において強調する。
【表８】
ＣＤＲ領域（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９，６５７−６７０）に下線を引く（軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７１、７２、及び７３であり；重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７４、７５、及び７６である）。ＩＬ−１０と接触する残基を太字で示す。
【０１３４】
軽鎖内において、接触残基は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２にはみられるが、ＣＤＲ３にはみられない。３つ全てのＣＤＲの重鎖残基は抗原結合に関与していると考えられる。ＦＲ３の２つの残基（Ａｓｎ７３及びＳｅｒ７４）も抗原結合に寄与している。
【０１３５】
ＣＤＲ１の最初のＳｅｒ２８及びＡｌａ３０は、マウスＶＨの元になった配列（ＢＮ−１０）の一部であり、選択されるヒトフレームワーク（３−６６＊０４）中には存在しない。両方の位置は、それほど高い頻度で抗原結合に関与しておらず、ヒト化プロセス中に代替アミノ酸として導入された。
【０１３６】
残基Ａｓｎ７３及びＳｅｒ７４は、マウスにみられ、ヒト抗体フレームワーク配列でも頻繁にみられるが、通常、抗原結合には関与していない（ｗｗｗ．ｂｉｏｃ．ｕｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，２００１）。抗原結合に対するこれらの寄与は、予測されていない。
【０１３７】
ＢＴ−０６３結合に関与するＩＬ−１０アミノ酸残基を以下に示す。また、高親和性ＩＬ−１０受容体鎖（ＩＬ−１０Ｒ１）及び低親和性受容体鎖（ＩＬ−１０Ｒ２）に対する結合に関与しているＩＬ−１０の残基も示す。両方の受容体鎖が、ＩＬ−１０ホモダイマーの結合に関与しており、シグナル伝達に必要である。配列Ａでは、ＢＴ−０６３に接触する残基を太字で示し、下線を引く。配列Ｂでは、ＩＬ−１０Ｒ１に対する接触残基を太字で示し、下線を引き、ＩＬ−１Ｒ２に対する接触残基をイタリック体で示し、下線を引き、ＩＬ−１０Ｒ１とＩＬ−１０Ｒ２により共有されている接触残基を太字、イタリック体、及び下線で示す（Ｐｌｅｔｎｅｖ ｅｔ ａｌ ２００５）。
【表９】
【０１３８】
ＢＴ−０６３は、第１のＩＬ−１０モノマーのへリックスＡの連結ループ配列（Ｇｌｕ４２、Ａｓｐ４４、Ｌｅｕ４６）を含む残基（Ａｒｇ２７、Ｌｙｓ３４、Ｇｌｎ３８、Ｍｅｔ３９、Ａｓｐ４１）、及びへリックスＢ（Ｇｌｕ５０及びＬｅｕ５３）のＮ−末端部分と、第２のＩＬ−１０モノマーのへリックスＦ’の残基（Ｇｌｕ１４２、Ａｓｐ１４４、Ｉｌｅ１４５、Ａｓｎ１４８、Ｔｙｒ１４９、Ｇｌｕ１５１、Ｔｈｒ１５５）とを含むＩＬ−１０の不連続なエピトープに結合することが分かる。
【０１３９】
したがって、ＢＴ−０６３は、高親和性受容体鎖ＩＬ−１０Ｒ１の結合部位をブロックすることが分かる。
【０１４０】
実施例７−カニクイザルにおけるインビボ単回用量毒性試験
カニクイザルで、ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の単回静脈内注射後、安全性薬理学的パラメータを含む単回用量毒性試験を実施した。４匹／性別／群になるように動物を４群に分けた（プラセボ、１ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、及び５０ｍｇ／ｋｇ）。１日目にＢＴ−０６３を静脈内注射した。５日間後に動物の半数を剖検し、残りの動物は２８日目に屠殺した。
【０１４１】
この実験における低用量レベルである１ｍｇ／ｋｇは、ヒトにおける約３００μｇ／ｋｇの用量と等しく、合計ヒト（体重６０ｋｇ）用量は１８ｍｇになる。少数の研究者で開始した実験では、ＢＴ−０６３の元になった抗体Ｂ−Ｎ１００を同用量２１日間毎日投与した（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ，２０００）。この量の抗体は、薬理学的効果及び臨床的有効性を示した。したがって、この結果を踏まえて低用量レベルを選択した。高用量は、出発用量の倍数（５０）として選択した。中間用量は、低用量と高用量との幾何平均である。
【０１４２】
試験中、生理学的パラメータ又は組織病理学的パラメータにおいて毒物学的に有意又は明らかな変化はみられなかった。更に、臨床化学パラメータの変化は、毒物学的有意性が僅かである又は存在しないとみなされた。
【０１４３】
実施例８−静脈内投与後のＩＬ−１０特異的ＢＴ−０６３抗体による推定標的占有率
ｍＡｂ ＢＴ−０６３の単回静脈内注射後のヒト健常ボランティアにおけるＩＬ−１０の中和を推定するために、ＢＴ−０６３−ＩＬ−１０複合体の解離定数、ヒト血液体積の標準的なパラメータ、及び血流内にはＢＴ−０６３のみが分布しているという仮説に基づいて、健常ボランティアにおいて、ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）によるＩＬ−１０の標的占有率を推定した。
【０１４４】
８．１ 方法
検証されていないＭｉｃｒｏｓｏｆｔ−Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて、ＢＴ−０６３によるＩＬ−１０の標的占有率を計算し、用量依存性を示した。
計算のための仮説：
− 血液体積（血清）：３．５Ｌ
− 健常ボランティアの血清におけるＩＬ−１０の平均濃度：１５ｐｇ／ｍＬ
− ｋＤ（解離定数、ＢＴ−０６３⇔ＩＬ−１０）：３ｎＭ（Ｂｉａｃｏｒｅ実験から得た）
− ＩＬ−１０ダイマーの分子量：３７，０００ｇ／ｍｏｌ
− ＢＴ−０６３の分子量：１５０，０００ｇ／ｍｏｌ
【０１４５】
質量作用の法則を用いて、様々な用量のＢＴ−０６３抗体におけるＩＬ−１０の標的占有率を計算した。遊離ＩＬ−１０及び複合体ＩＬ−１０を理論的に計算するにあたって、１分子の抗ＩＬ−１０抗体が１つのＩＬ−１０ダイマーに結合すると仮定した。以下の平衡方程式を適用した：
質量作用の法則：ＢＴ０６３＋ＩＬ１０⇔ＢＴ０６３／ＩＬ−１０複合体
得られた解離定数は、ＢＴ０６３の定常状態濃度（［ＢＴ０６３］）、ＩＬ−１０の定常状態濃度（［ＩＬ−１０］）、及びＢＴ０６３−ＩＬ−１０複合体の定常状態濃度（［複合体］）により求められる：
ｋＤ＝［ＢＴ０６３］＊［ＩＬ−１０］／［複合体］
【０１４６】
定常状態濃度を直接得ることはできないが、出発濃度［ＢＴ０６３０］及び［ＩＬ−１００］、並びに複合体の定常状態濃度（［複合体］）から計算することができる：
［ＢＴ０６３］＝［ＢＴ０６３０］−［複合体］
［ＩＬ−１０］＝［ＩＬ−１００］−［複合体］
【０１４７】
ｍＡｂを静脈内注射した後のＢＴ０６３によるＩＬ−１０占有率を計算するために、以下の仮説を立てた：
− ＢＴ０６３は、注射直後、血液中に等しく且つ排他的に分布する
− ＢＴ０６３分子は、血液体積中に留まる
− ＩＬ−１０は、血液中に排他的に分布し、ＩＬ−１０の他の起源は存在しない
− ＩＬ−１０分子又はＢＴ０６３−ＩＬ−１０複合体は、血流中に留まり、Ｆｃ受容体の媒介する機序又は他の機序により循環から外れることもない
− 速やかに平衡に達する。
【０１４８】
これら仮説は、人工的に選択されたものであり、恐らくインビボにおける生物学的に関連する状況を表すものではない。ＢＴ０６３の分布体積は推定よりも大きいと仮定することができるが、その理由は、循環中のｍＡｂ濃度が速やかに低下するので、ＢＴ０６３は、略間違いなく体の脈管外区画にも分布すると考えられるためである。更に、脈管外にもＩＬ−１０の起源が存在し、体内に存在するＩＬ−１０の量も本明細書で推定した量よりも多いと予測することができる。
【０１４９】
結論として、本明細書で行った計算は、インビボにおける複合体化ＩＬ−１０の割合を過大評価している。したがって、インビボでは推定されるほどのＩＬ−１０の複合体化は生じず、計算値の安全域が存在する。
【０１５０】
計算基準として、以下の定数を用いた：
◆分子量（ＢＴ０６３）：１５，０００ｇ／ｍｏｌ
◆分子量（ＩＬ−１０ダイマー）：３７，０００ｇ／ｍｏｌ
◆健常ボランティアの血清におけるＩＬ−１０の平均濃度：１５ｐｇ／ｍＬ
◆血清体積：３．５Ｌ
【０１５１】
この基準に基づいて、平衡濃度下でＢＴ０６３と複合体化されるＩＬ−１０の用量依存的割合をコンピュータで計算することができる。表８及び図１０は、ｍＡｂの静脈内注射後の、ＢＴ０６３によるＩＬ−１０のブロックの用量依存性を示す。
【表１０】
【０１５２】
ＩＬ−１０濃度の差又はＢＴ０６３のＩＬ−１０に対する親和性の差（解離定数）の影響を理論的に推定するために、対応する曲線を図１０に示すオリジナルの用量応答依存性と比較した。
【０１５３】
図１１は、単に、複合体化ＩＬ−１０の割合がＩＬ−１０の血中濃度には依存していないことを示す。ＩＬ−１０濃度が１，０００倍変化した場合でさえも、用量応答曲線に対する影響は僅かなものでしかない。したがって、ＩＬ−１０濃度の変動は、百分率に基づくＢＴ−０６３によるＩＬ−１０の占有率を変化させるものではない。
【０１５４】
ＢＴ−０６３のヒトＩＬ−１０に対する親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ実験から求められるが、他の方法では、複合体の解離定数が僅かに異なる場合がある（Ｗａｉｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８ Ｎｏｖ；１２２（５）：８９０−２，Ｅｐｕｂ ２００８，Ｓｅｐ ２０）。したがって、親和性の差がＩＬ−１０占有率の用量応答性をどの程度変化させるかについて分析した。
【０１５５】
ＩＬ−１０濃度の変化とは対照的に、ＢＴ−０６３のＩＬ−１０に対する親和性が異なると、親和性がより高い（１０倍高い）場合はＢＴ−０６３の占有率が高くなる方向に曲線がシフトし、親和性がより低い場合も同様である（図１２）。
【０１５６】
データから、１７５μｇのＢＴ−０６３（最初の健常ボランティアヒト臨床試験の意図する出発用量）は、健常ボランティアの血中に存在する全てのＩＬ−１０のうちの約１０％を中和することができると結論付けることができる。ＢＴ−０６３の用量１０ｍｇまでは、ＢＴ−０６３の用量と複合体化しているＩＬ−１０の割合との間に対数線形関係が存在する。１０ｍｇのＢＴ−０６３では、全てのＩＬ−１０のうちの約８５％が中和される。
【０１５７】
計算された曲線の軌跡は、血中のＩＬ−１０濃度にそれ程依存せず、これは、（百分率に基づく）ＢＴ−０６３の中和能が、ＩＬ−１０濃度の差によって僅かな程度しか影響を受けないことを意味する。
【０１５８】
したがって、健常ボランティアについて表される曲線は、血中のＩＬ−１０濃度が高い全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者にも当てはまると推測することができる。これらデータから、健常ボランティアにおけるＢＴ−０６３の合計用量が１７５μｇを超える場合、サイトカインのうちの１０％超が中和されると結論付けることができる。この用量から合計用量１０ｍｇまでは、ｍＡｂによるＩＬ−１０の複合体化と８５％まで対数線形関係にある。ＢＴ−０６３が１０ｍｇを超えると、曲線は、飽和レベルに達する。合計用量１００ｍｇで中和が略１００％に達する。
【０１５９】
実施例８−健常ボランティアにおけるインビボ単回用量毒性試験
健常ボランティアにおいて漸増用量の抗体を用いて、ＢＴ−０６３（変異体ｈＶＨ２６／ｈＶＬ７）の安全性及び忍容性、並びにＢＴ−０６３の投与の効果をモニターするために実験を行った。２３人のボランティアを８用量群に分け、ＢＴ−０６３を単回静脈内投与した。用量群は、以下の通りであった：０．１７５ｍｇ、０．７５ｍｇ、３．５ｍｇ、７ｍｇ、１５ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、及び１００ｍｇ。１００ｍｇ用量群のボランティアが２人であったことを除いて、１群当たりのボランティアは３人であった。
【０１６０】
各用量を０．９％塩化ナトリウム注射液で合計体積２０ｍＬに希釈した。注入ポンプを用いて２時間に亘って用量を単回連続静脈内注射した。注入後８５日間に亘ってボランティアを評価し、この期間中の複数の時点で血液を採取した。
【０１６１】
採取した血液から、サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、及びＴＮＦαの濃度を評価した。
【０１６２】
結果
注入後２４時間以内では、ＩＬ−６及びＩＬ−８が非用量依存的に一過的に増加したが、３日間後には投与前のレベルに戻った。この作用は、抗体ではなく注入事象に関連すると考えられる。その理由は、用量との相関がなく、また最低用量でさえも前記事象が生じたためである。
【０１６３】
驚くべきことに、ＩＬ−１０が重要な調節性サイトカインであるにも関わらず、図１３に示される通り、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＴＮＦαの濃度増加は検出されなかった。また、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の濃度が増加しないことにより、ＢＴ−０６３の投与がヘルパーＴ細胞を活性化させないことが確認される。更に、体温も炎症促進性サイトカインの大量放出の指標であるので、処理されたボランティアにおいてこのパラメータも測定した。しかし、投与後、体温の上昇は検出されなかった。
【０１６４】
図１４に示す通り、ＩＬ−１０の血漿濃度は、ＢＴ−０６３の投与により影響を受け、ＢＴ−０６３の用量が増加するにつれて検出される血漿ＩＬ−１０も増加する。用いたアッセイは、遊離ＩＬ−１０及びＢＴ−０６３に結合しているＩＬ−１０の両方を検出することに留意すべきである。増加の理由としては、以下の２つの可能性がある：（１）ＩＬ−１０の半減期の延長、ＩＬ−１０のＢＴ−０６３への結合がＩＬ−１０の内部移行を妨げ、同時に、血液からＩＬ−１０を排出させなくする（通常、ＩＬ−１０は速やかにターンオーバーし、分泌されたＩＬ−１０の半減期は約２．３時間〜３．５時間である（Ｈｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９６）Ｊａｎ １５：８７（２）：６９９−７０５）；及び／又は（２）ネガティブフィードバックループの誘導−ＢＴ−０６３は、ＩＬ−１０のその受容体への結合をブロックするので、ＩＬ−１０が細胞に取り込まれることができなくなり、したがって、Ｂ細胞がより多くのＩＬ−１０を産生するようになる。ＢＴ−０６３及びマウスＩＬ−１０Ｒノックアウト細胞を用いた全血培養実験から得られたインビトロにおけるデータにより確認されているので（Ｍａｈｎｋｅ ｅｔ ａｌ．、未公開データ）、仮説（２）の可能性の方が高いと考えられる。
【０１６５】
薬物動態
薬物動態データは、ＢＴ−０６３のＣｍａｘ、ＡＵＣ、及び半減期が、予測される理論値の範囲内であることを示した。ＢＴ−０６３の終末半減期は、１５日間〜３０日間である。３０ｍｇ以上の用量を投与した後、８５日間後も依然としてＢＴ−０６３を血漿中で検出することが可能である。
【０１６６】
他のサイトカイン中和抗体（例えば、アダリムマブ、ヒト化抗ＴＮＦ−α）ではヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）応答がみられるという事実にも関わらず、処理したボランティアにおいてはＨＡＨＡがみられなかった。
【０１６７】
ＢＴ−０６３投与後、ＩＬ−１０の検出量は増加したが、この実験が、更に多い用量のＢＴ−０６３の安全性及び許容性を示したことに留意すべきであり、したがって、過剰のＩＬ−１０の効果を相殺するために十分な用量のＢＴ−０６３をＳＬＥ患者に安全に投与できると結論付けることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、
（ｉ）ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、ＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができず、且つ
（ｉｉ）ホモダイマー型のＩＬ−１０に、両方のモノマーの残基を含む不連続なエピトープに結合することにより結合する
ことを特徴とするヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項２】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、又は
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項３】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖及び可変重鎖の少なくともいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む請求項２に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項４】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、又は
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとを含み、
これら配列中に、親和性及び特異性の少なくともいずれかを実質的に変化させることのない変異が任意で存在する請求項１に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項５】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のアミノ酸配列、及びマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のアミノ酸配列の少なくともいずれかを含む請求項１から４のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項６】
抗体ＢＴ−０６３の可変重鎖配列（配列番号７０）及びＢＴ−０６３の可変軽鎖配列（配列番号６９）を含む請求項１から４のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項７】
ＩＬ−１０受容体β（ＩＬ−１０Ｒβ）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域には結合しない請求項１から６のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項８】
一方のＩＬ−１０モノマーのへリックスＡの残基と、他方のＩＬ−１０モノマーのへリックスＦ’の残基とを含む不連続なエピトープに結合する請求項１から７のいずれかに記載のヒト化抗体又はキメラ抗体。
【請求項９】
不連続なエピトープの残基が、一方のモノマーの最初の５５アミノ酸及び他方のモノマーの最後の２０アミノ酸中に存在する請求項１から８のいずれかに記載のヒト化抗体又はキメラ抗体。
【請求項１０】
不連続なエピトープが、一方のモノマーのアミノ酸２０〜５５及び他方のモノマーの最後の２０アミノ酸中に存在する請求項９に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１１】
抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用及び補体依存性細胞傷害作用の少なくともいずれかを誘導しない請求項１から１０のいずれかに記載のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１２】
ＩＬ−１０α受容体を介するＩＬ−１０シグナル伝達を妨げることができる請求項１から１１のいずれかに記載のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１３】
ＩＬ−１０Ｒ発現細胞に結合することができないことを特徴とするインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸又は請求項１５に記載のベクターを含むことを特徴とするホスト細胞。
【請求項１７】
請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片を産生する方法であって、前記抗体又はその断片を発現させる条件下で培養培地中にて請求項１６に記載のホスト細胞を培養し、前記培養培地から前記抗体又はその断片を分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片を含み、且つ薬学的に許容し得る担体又は希釈剤を更に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
被験体における、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状を治療又は予防する方法であって、治療上有効な量の請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片を前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
病状が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である請求項１９に記載の被験体における病状を治療又は予防する方法。
【請求項２１】
医療において使用するための請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【請求項２２】
ＳＬＥの治療において使用するための請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【請求項２３】
ＳＬＥを治療する医薬の製造における請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片の使用。
【請求項２４】
標識と請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片とを含むことを特徴とする標識されているヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項２５】
サンプル中のＩＬ−１０を中和するためのインビトロにおける方法であって、前記サンプルと請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片とを接触させて、前記抗体又はその断片をＩＬ−１０に結合させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
サンプル中のＩＬ−１０の存在を検出するためのインビトロにおける方法であって、前記サンプルと、請求項１から１３のいずれかに記載の標識されていない抗体若しくはその断片又は請求項２４に記載の標識されている抗体若しくはその断片とを接触させる工程と、前記サンプルに結合していない抗体又は抗体断片を除去するために洗浄する工程と、前記サンプル中の前記抗体若しくはその断片又は前記標識の存在を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
個体においてＳＬＥを診断する方法であって、（ａ）前記個体から採取した血漿サンプルを提供する工程と、（ｂ）前記サンプルと請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片とを接触させる工程と、（ｃ）ＩＬ−１０の存在を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
工程（ｃ）が、サンプル中に存在するＩＬ−１０の量を測定することを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から５のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、
ＢＴ−０６３の軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む可変領域、
ＢＴ−０６３の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域、又は
ＢＴ−０６３の軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む可変領域とＢＴ−０６３の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域とを含み、
前記ＣＤＲが、配列中に以下のアミノ酸置換を任意で含むＣＤＲであるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片：
（ｉ）Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｙｓ５５を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６を含む重鎖ＣＤＲ２、
（ｖ）Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３を含む重鎖ＣＤＲ３。
【請求項３０】
重鎖可変領域がＡｓｎ７３及びＳｅｒ７４を更に含む請求項２９に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、
（ｉ）ＩＬ−１０受容体α（ＩＬ−１０Ｒα）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域に結合し、ＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に結合しているときにはＩＬ−１０に結合することができず、且つ
（ｉｉ）ホモダイマー型のＩＬ−１０に、両方のモノマーの残基を含む不連続なエピトープに結合することにより結合する
ことを特徴とするヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項２】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、又は
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項３】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖及び可変重鎖の少なくともいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む請求項２に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項４】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、又は
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つとを含み、
これら配列中に、親和性及び特異性の少なくともいずれかを実質的に変化させることのない変異が任意で存在する請求項１に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項５】
マウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変軽鎖のアミノ酸配列、及びマウス抗体Ｂ−Ｎ１０の可変重鎖のアミノ酸配列の少なくともいずれかを含む請求項１から４のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項６】
抗体ＢＴ−０６３の可変重鎖配列（配列番号７０）及びＢＴ−０６３の可変軽鎖配列（配列番号６９）を含む請求項１から４のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項７】
ＩＬ−１０受容体β（ＩＬ−１０Ｒβ）が結合する領域と同じＩＬ−１０の領域には結合しない請求項１から６のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項８】
一方のＩＬ−１０モノマーのへリックスＡの残基と、他方のＩＬ−１０モノマーのへリックスＦ’の残基とを含む不連続なエピトープに結合する請求項１から７のいずれかに記載のヒト化抗体又はキメラ抗体。
【請求項９】
不連続なエピトープの残基が、一方のモノマーの最初の５５アミノ酸及び他方のモノマーの最後の２０アミノ酸中に存在する請求項１から８のいずれかに記載のヒト化抗体又はキメラ抗体。
【請求項１０】
不連続なエピトープが、一方のモノマーのアミノ酸２０〜５５及び他方のモノマーの最後の２０アミノ酸中に存在する請求項９に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１１】
抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用及び補体依存性細胞傷害作用の少なくともいずれかを誘導しない請求項１から１０のいずれかに記載のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１２】
ＩＬ−１０α受容体を介するＩＬ−１０シグナル伝達を妨げることができる請求項１から１１のいずれかに記載のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１３】
ＩＬ−１０Ｒ発現細胞に結合することができないことを特徴とするインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に結合可能なヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸又は請求項１５に記載のベクターを含むことを特徴とするホスト細胞。
【請求項１７】
請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片を産生する方法であって、前記抗体又はその断片を発現させる条件下で培養培地中にて請求項１６に記載のホスト細胞を培養し、前記培養培地から前記抗体又はその断片を分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片を含み、且つ薬学的に許容し得る担体又は希釈剤を更に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
被験体における、高レベル又は高活性のＩＬ−１０により媒介される病状を治療又は予防する方法であって、治療上有効な量の請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片を前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
病状が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である請求項１９に記載の被験体における病状を治療又は予防する方法。
【請求項２１】
医療において使用するための請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【請求項２２】
ＳＬＥの治療において使用するための請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【請求項２３】
ＳＬＥを治療する医薬の製造における請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片の使用。
【請求項２４】
標識と請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片とを含むことを特徴とする標識されているヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【請求項２５】
サンプル中のＩＬ−１０を中和するためのインビトロにおける方法であって、前記サンプルと請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片とを接触させて、前記抗体又はその断片をＩＬ−１０に結合させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
サンプル中のＩＬ−１０の存在を検出するためのインビトロにおける方法であって、前記サンプルと、請求項１から１３のいずれかに記載の標識されていない抗体若しくはその断片又は請求項２４に記載の標識されている抗体若しくはその断片とを接触させる工程と、前記サンプルに結合していない抗体又は抗体断片を除去するために洗浄する工程と、前記サンプル中の前記抗体若しくはその断片又は前記標識の存在を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
個体においてＳＬＥを診断する方法であって、（ａ）前記個体から採取した血漿サンプルを提供する工程と、（ｂ）前記サンプルと請求項１から１３のいずれかに記載の抗体又はその断片とを接触させる工程と、（ｃ）ＩＬ−１０の存在を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
工程（ｃ）が、サンプル中に存在するＩＬ−１０の量を測定することを含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から５のいずれかに記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片であって、
ＢＴ−０６３の軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む可変領域、
ＢＴ−０６３の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域、又は
ＢＴ−０６３の軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む可変領域とＢＴ−０６３の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域とを含み、
前記ＣＤＲが、配列中に以下のアミノ酸置換を任意で含むＣＤＲであるヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片：
（ｉ）Ｓｅｒ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ３７を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｙｓ５５を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ｐｈｅ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｌａ３０、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｇｌｙ５４、Ｓｅｒ５６を含む重鎖ＣＤＲ２、
（ｖ）Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｙｒ１０３を含む重鎖ＣＤＲ３。
【請求項３０】
重鎖可変領域がＡｓｎ７３及びＳｅｒ７４を更に含む請求項２９に記載のヒト化抗体、キメラ抗体又はこれらの断片。
【図３Ｂ】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１３−５１１９９５（Ｐ２０１３−５１１９９５Ａ）
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４１４６９（Ｐ２０１２−５４１４６９）
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６４３９９
【国際公開日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（３９００３５３７８）バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６４３９９
【国際公開日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（３９００３５３７８）バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト (13)
【Ｆターム（参考）】
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