共重合体および共重合体の製造方法
【課題】ペプチドや酵素の修飾率の低下や活性点を封鎖することなく、高純度な修飾物が得られる、医薬品原料として可能な共重合体を提供。
【解決手段】 式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体であって、この共重合体中に含まれる重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下であり、共重合体の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である。Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・・・（１）
【解決手段】 式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体であって、この共重合体中に含まれる重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下であり、共重合体の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である。Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・・・（１）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位と不飽和カルボン酸に基づく構成単位からなる共重合体、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体が開発され、それを単量体とする重合体や、他の単量体との共重合体が開発されている（特許文献１、２参照）。
例えば、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体と不飽和カルボン酸からなる共重合体は、分散剤、増粘剤、混和剤、コーティング剤、凝集剤、多価金属イオン捕捉剤、接着剤、化粧品基材等の多くの用途に用いられている。
【特許文献１】特開昭６４−１０９
【特許文献２】特開２００３−１０５００３
【０００３】
一方、特許文献３にあるようにこれらの共重合体はペプチドや酵素の修飾にも有用であることが知られている。
【特許文献３】特開平５−３３６９６６
【０００４】
こうしたポリエチレングリコール誘導体を用いて、化学修飾したペプチドは体内でのペプチドの抗原性を低下させる等の利点があり、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）用基剤として期待されるものである。
【０００５】
しかしながら、特許文献１−３で使用されている、従来の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体と無水マレイン酸の共重合体中には、重合に関与しなかった未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体が含まれており（特許文献２では重合率約７７，８２％の記載あり）、医薬品として使用するには共重合体の純度において十分満足のいくものではなかった。
【０００６】
そして、従来の方法にて製造された共重合体は、重合に関与しなかった未反応の構成単位（ア）のピークが大きい上に、共重合体のピークの多分散度が広かった。
すなわち、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体は不純物として残存していることはもちろん、共重合体のメインピークよりも高分子量不純物や低分子量不純物が多いことを意味し、生体関連物質と結合させる際、副反応物が多くなり、純度不十分となる恐れがあり、かつ、薬剤の均一性や修飾物の効果・効能の点から、好ましくない。
【０００７】
特に、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の分子量が大きい共重合体は重合転化率が低いため、従来の製造方法では共重合体中に未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体がさらに多く残存するばかりか、共重合体の分子量分布が不均一で多分散度が大きく、薬剤の修飾に使用する場合には、不適であった。
【０００８】
このため、これまで次のようなポリマーから不純物を除去する精製方法が研究されている。
重、縮合反応が完全に行われないときには単量体が残存していることがある。一般に共存する低分子化合物を除去するのは高圧の真空で−高分子化合物が崩壊しない程度に−加熱するとか、適当な大きさの固体試料を高分子化合物を溶解しない溶媒で洗うとかの方法を用いる。また、一般的に最もよく用いられる方法は溶液としたのち、貧溶媒を加えて沈殿させる方法がある。しかしながら、これらの方法では、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の除去は困難であった。
【非特許文献１】社団法人日本化学会編,「実験化学講座８ 高分子化学（上）」,丸善,昭和３１年,Ｐ４−５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、例えばペプチドや酵素の修飾に使用した場合、ペプチドや酵素の修飾率の低下や活性点を封鎖することがなく、均一性のある高純度な修飾物を得ることが可能な、医薬品原料として使用可能な共重合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る共重合体は、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体であって、この共重合体中に含まれる重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下であり、共重合体の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【００１１】
好ましくは、不飽和カルボン酸が、無水マレイン酸およびマレイン酸誘導体からなる群より選ばれた一種以上の化合物である。
【００１２】
また、本発明は、生体関連物質分子、およびこの分子に結合された少なくとも１個の前記共重合体を有する、修飾された生体関連物質に係るものである。
【００１３】
また、本発明に係る共重合体の製造方法は、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体の重量に対して０．１重量倍〜１００重量倍のｔ−ブチル メチル エーテルを添加し、攪拌、分層後、ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去することにより、前記共重合体中に存在する前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去する。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【００１４】
本発明の方法において好ましくは、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）とを重合させる時に使用する溶媒が、式（２）からなるポリオキシアルキレンジアルキルエーテル誘導体である。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
Ｒ３Ｏ（ＡＯ）ｍＲ４ ・・・・・（２）
（但し、式中、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ炭素数１〜５の飽和炭化水素基であり、炭化水素基は直鎖状、分岐状、環状であってもよい。Ｒ３とＲ４は同一であってもよく、異なっていても良い。ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１〜１０である。）
【００１５】
また、本発明の方法において好ましくは、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、メチル基およびエチル基から選択される基であり、ｍは１〜４である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の共重合体は、共重合体中に含まれる前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下であり、共重合体の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である。そのため、本発明の共重合体を薬剤の修飾用途、例えばペプチドや酵素の修飾に使用した場合、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体と反応してペプチドや酵素の修飾率の低下や活性点を封鎖することがなく、しかも、多分散度が小さいことから、修飾率が高く、安定で、均一性の高い、薬剤用途に適した修飾物を得ることができる。
共重合体中に含まれる前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量は、特に好ましくは、ＴＬＣ上でヨウ素蒸気による発色の検出限界未満であり、即ち０．１重量％未満である。
【００１７】
また、本発明の方法によれば、精製溶媒として特定の有機溶媒、即ち、ｔ−ブチル メチル エーテルを使用することにより、共重合体中から未反応のモノマーを効率良く除去出来ることを見出し、本発明に至った。
更に、重合時に、前記式（２）のような特定の反応溶媒を使用することにより、得られる共重合体の多分散度が小さくなることを見いだした。
【００１８】
本発明に基づく、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体が少なく、多分散度の小さい共重合体は、このような新たな製法によって提供可能となったものであり、医薬用途への使用に適している。これによって本発明の共重合体が有する前記の顕著な作用効果が確認されるに至ったのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の共重合体は、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体中に含まれる未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である共重合体である。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2・・・（１）
（ただし、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【００２０】
式（１）において、Ｒ1で示される炭素数１〜２４の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert―ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基などを挙げることができる。これらの中で、炭素数１〜４の炭化水素基がより好ましい。
【００２１】
式（１）において、Ｒ２で示される炭素数３〜５の不飽和炭化水素基としてはビニル基、アリル基、メタリル基、３−メチル−３−ブテニル基などがあり、好ましくはアリル基、メタリル基である。
【００２２】
式（１）において、ＡＯで示される炭素数２〜４のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、２，３−オキシブチレン基およびオキシテトラメチレン基などを挙げることができる。好ましくは、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基である。
【００２３】
式（１）において、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のオキシアルキレン基であるとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよい。
【００２４】
また、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００であり、より好ましくは５〜１００である。ｎが５未満であると、該ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテルを出発原料として得られる共重合体が、十分な親水性基を有しておらず、分散剤やタンパク修飾などに使用する共重合体としての性能を発現しないおそれがある。ｎが５００を超えると、粘度が高くなって取り扱いが困難となるおそれがある。
【００２５】
本発明の共重合体を構成する不飽和カルボン酸としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸などの不飽和モノカルボン酸及びそれらの塩、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、イタコン酸などの不飽和ジカルボン酸及びそれらの塩、アクリルアミド類、無水マレイン酸、マレイン酸エステル類及びこれらの塩などを挙げることができる。
【００２６】
これらの不飽和カルボン酸は、１種を単独で用いることができ、あるいは２種以上を組み合わせて用いることもできる。これらの中で、不飽和モノカルボン酸、不飽和ジカルボン酸及びこれらの塩を好適に使用することができ、好ましくはマレイン酸およびその誘導体からなる群より選ばれた一種または二種以上の化合物である。この化合物は、マレイン酸の他、マレイン酸誘導体、例えば無水マレイン酸、マレイン酸エステル、マレイン酸塩を例示でき、特に好ましくは無水マレイン酸を好適に使用することができる。
また、本発明の共重合体の製造方法では、本発明の効果に影響を与えない程度で、必要に応じて他の共重合可能な単量体を用いることができる。
【００２７】
また、本発明で得られた共重合体を構成する不飽和カルボン酸部は公知の方法によってさらに変性したものを使用しても良い。
【００２８】
上記構成単位（ア）及び（イ）の組成比は限定されない。構成単位（ア）と構成単位（イ）との組成比率（構成単位（ア）／構成単位（イ））は（５モル％〜９５モル％）／（９５モル％〜５モル％であることが好ましく、（３０モル％〜７０モル％）／（７０モル％〜３０モル％）であることがさらに好ましい。
【００２９】
本発明で得られる共重合体は重合開始剤の種類あるいは重合条件等を変化させることにより、種々の重合度の共重合体を得ることができ、その重合平均分子量は通常３,０００〜３００，０００であり、好ましくは３,０００〜１００,０００であり、より好ましくは３，０００〜３０，０００である。
【００３０】
式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）を得るには、合成方法に特に制限はなく、例えば、ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテルに水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物を加え、塩化アリル、臭化アリル、よう化アリル、塩化メタリル、臭化メタリルなどのモノハロゲン化不飽和炭化水素とのエーテル化反応により得ることができる。
【００３１】
本発明の共重合体の製造方法に特に制限はなく、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、これと不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）を、有機溶剤中又は水系溶剤中で溶液重合することができる。好ましい重合方法は、有機溶剤中での重合である。
【００３２】
本発明の共重合体中の不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）が無水マレイン酸等のように反応性基である場合には、水や、メタノールやエタノール等の水酸基を有するアルコール類の溶剤や、アミノ基やチオール基等を有する溶媒は、無水マレイン酸と反応するため好ましくなく、反応性基と反応しない溶剤を使用することが望ましい。
【００３３】
有機溶剤系で用いる有機溶剤は、トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒、モノグライム、ジグライム、トリグライム、テトラグライム等のエーテル系溶媒、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等の脂環式系溶媒であり、好ましくは、式（２）で示される溶媒であり、より好ましくはモノグライム、ジグライム、トリグライムである。
有機溶剤は１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００３４】
前記式（２）において、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ炭素数１〜５の飽和炭化水素基であり、炭化水素基は直鎖状、分岐状、環状であってもよい。Ｒ３とＲ４は同一であってもよく、異なっていても良い。Ｒ３、Ｒ４は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert―ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基を挙げることができる。これらの中で、炭素数１〜４の炭化水素基がより好ましく、メチル基、エチル基が特に好ましい。
【００３５】
式（２）において、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよい。ＡＯで示される炭素数２〜４のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、２，３−オキシブチレン基およびオキシテトラメチレン基などを挙げることができる。好ましくは、オキシエチレン基である。
【００３６】
式（２）において、ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１〜１０である。ｍは好ましくは１〜４である。ｍが１０を超えると、操作上、取り扱いにくくなるため、好ましくない。
【００３７】
本発明の共重合体を得る際に使用する溶媒量は、溶媒の種類によって異なるが、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）の合計重量に対して、０．１〜２００重量倍である。
例えば、トルエンやキシレンを使用する場合は、上記構成単位（ア）および（イ）の合計重量の０．１〜２００重量倍であり、好ましくは５〜１００重量倍である。
モノグライム、ジグライム、トリグライムを使用する場合は、上記構成単位（ア）および（イ）の合計重量の０．１〜１００重量倍であり、好ましくは０．２〜５０重量倍である。
【００３８】
また、重合反応に用いる重合開始剤としては、水系溶剤の場合には、例えば、tert―ブチルヒドロペルオキシドなどのヒドロペルオキシドや、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩などの水溶性の重合開始剤を挙げることができる。有機溶剤系又は無溶剤系で重合を行う場合には、例えば、ベンゾイルペルオキシド、ジ−tert−ブチルペルオキシド、tert−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエートなどの過酸化物や、２,２'−アゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ系開始剤などを挙げることができる。
これらの重合開始剤は、１種を単独で用いることができ、あるいは２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００３９】
重合開始剤量は特に制限はないが、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と不飽和カルボン酸の構成単位に基づく（イ）の合計重量に対して、通常０．００１〜０．１モル％、好ましくは０．００５〜０．１モル％である。また、必要に応じて連鎖移動剤を併用して重合を行うこともできる。
但し、本発明の不飽和カルボン酸の構成単位（イ）が無水マレイン酸等のように反応性基である場合には、チオール基等を有する連鎖移動剤は、無水マレイン酸と反応するため好ましくない。
【００４０】
反応条件は特に制限はないが、通常、反応温度は０〜１４０℃、好ましくは反応温度２０〜１２０℃であり、反応時間は１〜１００時間、好ましくは反応時間２〜５０時間である。
【００４１】
式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体から、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去するためには、ｔ−ブチル メチル エーテルの使用量を、共重合体の重量に対して、０．１重量倍〜１００重量倍使用する。好ましくは、０．５〜５０重量倍であり、より好ましくは、１〜２０重量倍である。
【００４２】
例えばトルエンなどの減圧下での留去が可能な溶媒で重合した際、共重合体中から未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去する場合には、濃縮等の方法により溶媒を一部または完全に留去した後、ｔ−ブチル メチル エーテルで精製すると良い。
重合溶媒を除去しない場合、または一部だけ除去する場合、残存した重合溶液にｔ−ブチル メチル エーテルを入れても良いし、またはｔ−ブチル メチル エーテルに重合溶液を入れても良い。但し、完全に溶媒を除去した場合と比較して、使用するｔ−ブチル メチル エーテル量が多くなる。
また、重合溶媒に対するｔ−ブチル メチル エーテル量が少ないと歩留まりが悪くなる可能性がある。
【００４３】
重合溶液中にｔ−ブチル メチル エーテルを入れる場合、使用するｔ−ブチル メチル エーテル量は、重合溶媒の重量に対して、０．１重量倍〜１００重量倍使用すると良い。好ましくは、０．１〜１０重量倍であり、より好ましくは、０．１〜５重量倍である。０．１重量倍以下の場合、沈殿しない可能性があるため、好ましくない。
ｔ−ブチル メチル エーテル中に重合溶液を入れる場合、ｔ−ブチル メチル エーテルは、重合溶媒の重量に対して、０．１重量倍〜１００重量倍使用する。好ましくは、１〜５０重量倍であり、より好ましくは、２〜３０重量倍である。０．１重量倍以下の場合、沈殿しない可能性があるため、好ましくない。
【００４４】
一方、例えばジグライムなどのように、比較的沸点の高い溶媒、すなわち、減圧下で除去が困難な溶媒で重合した場合は、例えばヘキサンなどの貧溶媒を加えるか、貧溶媒中に重合溶液を入れることにより共重合体を沈殿させた後、デカンテーションまたは濾過により溶液を除去した後、ｔ−ブチル メチル エーテルにて処理すると良い。
沈殿を得る方法としては、重合溶液中に貧溶媒を入れても良いし、貧溶媒中に重合溶液を入れても良い。また、重合溶媒に対する貧溶媒量が少ないと歩留まりが悪くなる可能性がある。
【００４５】
重合溶液中に貧溶媒を入れる場合、使用する貧溶媒量は、重合溶媒の重量に対して、０．５重量倍〜５０重量倍使用する。好ましくは、０．５〜１０重量倍であり、より好ましくは、０．５〜５重量倍である。０．５重量倍以下の場合、沈殿しない可能性があるため、好ましくない。
貧溶媒中に重合溶液を入れる場合、使用する貧溶媒量は、重合溶媒の重量に対して、０．５重量倍〜１００重量倍使用する。好ましくは、１〜５０重量倍であり、より好ましくは、２〜３０重量倍である。０．５重量倍以下の場合、沈殿しない可能性があるため、好ましくない。
【００４６】
共重合体にｔ−ブチル メチル エーテルを添加した後の攪拌については、十分に攪拌する方が共重合体から未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去しやすい。十分な攪拌を得るためには、スリーワンモーターや高トルクの攪拌機を使用することが好ましい。少量の場合にはマグネティックスターラーでも良い。いずれの方法も、十分に攪拌が行われないと、共重合体から未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を十分に除去できない場合がある。
【００４７】
ｔ−ブチル メチル エーテルを添加した後は、界面が分かるまで十分静置することが好ましい。静置時間は、１分〜７２時間であり、好ましくは５分〜４８時間である。
静置が不十分な場合には、ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去する際に、浮遊している共重合体を同時に除去してしまい、歩留まりが悪くなる場合がある。
【００４８】
ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去する際は、濾過やデカンテーションにより除去しても良く、分液漏斗などにより下層の共重合体を抜き取り後、上層の溶液を除去しても良い。
【００４９】
共重合体中の未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量にも依存するが、攪拌、静置、除去する工程は少なくとも１回行うのが良い。
【００５０】
ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去後は、該共重合体中に残存するｔ−ブチル メチル エーテルを除去するために、減圧下で脱溶剤を行うことが望ましい。
【００５１】
本発明の共重合体にて修飾された生体関連物質は、少なくとも１個の共重合体で生体関連物質分子を結合させたものである。
【００５２】
生体関連物質分子の修飾に使用する本発明の共重合体は、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体中に含まれる未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である共重合体である
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2・・・（１）
［式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である］
【００５３】
式（１）において、Ｒ1で示される炭素数１〜２４の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert―ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基などを挙げることができる。これらの中で、炭素数１〜４の炭化水素基がより好ましい。
【００５４】
式（１）において、Ｒ２で示される炭素数３〜５の不飽和炭化水素基としてはビニル基、アリル基、メタリル基、３−メチル−３−ブテニル基などがあり、好ましくはアリル基、メタリル基である。
【００５５】
式（１）において、ＡＯで示される炭素数２〜４のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、２，３−オキシブチレン基およびオキシテトラメチレン基などを挙げることができる。好ましくは、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基である。
式（１）において、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のオキシアルキレン基であるとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよい。
また、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００であり、より好ましくは５〜１００である。
【００５６】
共重合体を構成する不飽和カルボン酸としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸などの不飽和モノカルボン酸及びそれらの塩、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、イタコン酸などの不飽和ジカルボン酸及びそれらの塩、アクリルアミド類、無水マレイン酸、マレイン酸エステル類及びこれらの塩などを挙げることができる。これらの不飽和カルボン酸は、１種を単独で用いることができ、あるいは２種以上を組み合わせて用いることもできる。これらの中で、不飽和モノカルボン酸、不飽和ジカルボン酸及びこれらの塩を好適に使用することができ、好ましくは無水マレイン酸、マレイン酸エステル、さらに好ましくはマレイン酸を好適に使用することができる。
また、本発明で得られた共重合体を構成する不飽和カルボン酸部は公知の方法によってさらに変性したものを使用しても良い。
【００５７】
また、本発明の共重合体の製造方法では、本発明の効果に影響を与えない程度で、必要に応じて他の共重合可能な単量体を用いることができる。
上記構成単位（ア）及び（イ）の組成比は限定されない。構成単位（ア）と（イ）との組成比率（構成単位（ア）／構成単位（イ））は（５モル％〜９５モル％）／（９５モル％〜５モル％）であることが好ましく、（３０モル％〜７０モル％）／（７０モル％〜３０モル％）であることがさらに好ましい。
本発明で得られる共重合体は重合開始剤の種類あるいは重合条件等を変化させることにより、種々の重合度の共重合体を得ることができ、その重合平均分子量は通常３,０００〜３００，０００であり、好ましくは３,０００〜１００,０００であり、より好ましくは３，０００〜３０，０００である。
【００５８】
本発明の共重合体での生体関連物質分子への修飾数は特に限定されないが、１〜１００箇所が好ましく、更に好ましくは１〜２０箇所である。
【００５９】
本発明で言う「生体関連物質」とは、生体に関連する物質を意味する。生体に関連する物質とは、以下を含むものである。
【００６０】
（１） リン脂質、糖脂質、糖タンパク等の動物細胞構成材料
動物細胞構成材料とは、細胞膜等を構成する成分であり、特にその種類を限定されるものではないが、例えばリン脂質、糖脂質、糖タンパク質等が挙げられる。より具体的なリン脂質としては、例えばファスファチジジン酸、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、カルジオリピン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトールが挙げられる。また、これらのリゾ体も含まれる。これらリン脂質は卵黄あるいは大豆等の天然物由来のものでも良いし、合成物でも良い。脂肪酸組成としては、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１２〜２２の脂肪酸が挙げられる。これらの脂肪酸は飽和脂肪酸でも良いし、不飽和結合を含んだものでも良い。より具体的な糖脂質としては、例えばセラミド、セレブロシド、スフィンゴシン、ガングリオシド、グリセロ糖脂質等が挙げられる。また、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、コレステロール、胆汁酸もこれに含まれる。
【００６１】
（２） 血液、リンパ液、骨髄液等の体液構成物質
体液構成物質とは、細胞内外に存在する液体成分であり、特にその種類を限定されるものではないが、血液、リンパ液、骨髄液が挙げられる。これら体液のより具体的な構成成分としては、例えばヘモグロビン、アルブミン、血液凝固因子等が挙げられる。
【００６２】
（３）ビタミン、神経伝達物質、タンパク質、ポリペプチド、薬剤等の生理活性物質
生理活性物質とは、体の働きを調節する成分であり、特にその種類を限定されるものではないが、ビタミン、神経伝達物質、タンパク質、ポリペプチド、薬剤が挙げられる。
より具体的なビタミンとしては、例えばビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK等が挙げられる。
【００６３】
より具体的な神経伝達物質としては、例えばアドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン、アセチルコリン、GABA、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられる。
より具体的なタンパク質、ポリペプチドとしては、例えば以下に挙げられるものがある。脳下垂体ホルモン、甲状腺ホルモン、男性ホルモン、女性ホルモン、副腎皮質ホルモン等のホルモン。ヘモグロビン、血液因子等の血清タンパク質。IgG、IgE、IgM、IgA、IgD等の免疫グロブリン。インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１およびＩＬ１２サブタイプ）、インターフェロン（―α、−β、−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（αおよびβ型）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質、インシュリン、グルカゴン、レクチン、リシン、腫瘍壊死因子、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（―α、−β）、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、骨増殖因子、インスリン様増殖因子、ヘパリン結合増殖因子、腫瘍増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、マクロファージ分化因子、分化誘導因子、白血病阻害因子、アンフィレグリン、ソマトメジン、エリスロポエチン、ヘモポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン等のサイトカインおよびそのフラグメント。タンパク質分解酵素、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、エラスターゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼ等の酵素。モノクロナール及びポリクロナール抗体およびそれらのフラグメント。ポリーL−リジン、ポリーD−リジン等のポリアミノ酸。Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチン、メラノーマワクチン、ＨＩＶ−１ワクチン等のワクチンおよび抗原。また、糖タンパクも含まれる。また、これらの生理活性物質と同様の生理活性を有する類似構造物質もこれに含まれる。
【００６４】
また、これらのタンパク質、ポリペプチドは、それらの天然源または遺伝子工学的処理を受けた細胞から単離されるか、あるいは種々の合成法を経て作り出されたものでも良い。
【００６５】
薬剤としては、特に限定されるものではないが、より好ましくは抗癌剤と抗真菌剤が挙げられる。
より具体的な抗癌剤としては、特に限定されるものではないが、例えばパクリタキセル、アドリアマイシン、ドキソルビシン、シスプラチン、ダウノマイシン、マイトマイシン、ビンクリスチン、エピルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アクラシノマイシン、イダマイシン、ブレオマイシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、パンコマイシン、カンプトテシン等が挙げられる。
具体的な抗真菌剤としては、特に限定されるものではないが、例えばアムホテリシンB、ナイスタチン、フルシトシン、ミコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾールおよびペプチド性抗真菌剤が挙げられる。
また、これら生理活性物質には、例えば抗酸化作用、PAF阻害作用、抗炎症作用、抗菌作用等を有する、フラボノイド、テルペノイド、カルテノイド、サポニン、ステロイド、キノン、アントラキノン、キサントン、クマリン、アルカロイド、ポルフィリン、ポリフェノール等も含まれる。
【００６６】
例えば、本発明の修飾された生体関連物質は、以下のようにして製造することができるが、この方法に限定されるものではない。
生体関連物質分子の官能基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基等と本発明の共重合体を反応させる場合の比率は、生体関連物質分子中の官能基の個数、あるいは共重合体中の構成単位（イ）の含有量により異なるため、一概に特定することはできないが、生体関連物質分子の官能基の数と比較して共重合体の量が少ないと修飾率が低下し、生体関連物質分子の官能基の数と比較して共重合体の量が多いと修飾率が高くなる。修飾率は、修飾された生体関連物質の効果・効能に影響を与えることがあるので、それらの効果・効能に合わせて、適宜選択すると良い。
【００６７】
反応溶媒としては、反応に関与しない溶媒であれば特に限定されないが、タンパク質、ポリペプチドを反応させる場合は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液などの緩衝液が好ましい溶媒として挙げられる。更には、タンパク質、ポリペプチドの活性を失うことなく、反応に関与しないアセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の有機溶媒を添加しても良い。
抗癌剤、抗真菌剤、リン脂質を反応させる場合は、前述の緩衝液のほかにもトルエン、ベンゼン、キシレン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルーメチルエーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、水、メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール、２-プロパノール、ｎ−ブタノール等が好ましい溶媒として挙げられる。また、溶媒を用いなくとも良い。共重合体中の構成単位（イ）が無水マレイン酸などの場合、メタノール、エタノールなどのアルコール溶媒下では、反応する可能性があるので好ましくない。本発明の共重合体と生体関連物質を反応溶媒に加える順番はどちらが先でも良い。反応温度は、生体関連物質の活性が失われない温度であれば特に限定されないが、タンパク質、ポリペプチドを反応させる場合は、好ましくは０〜４０℃であり、抗癌剤、抗真菌剤、リン脂質を反応させる場合は、好ましくは−２０〜１５０℃である。反応時間は０．５〜７２時間が好ましく、更に好ましくは、１〜２４時間である。反応に際しては、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等の縮合剤を用いても良い。
反応後は、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等の精製手段にて精製してもよい。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６９】
（実施例１）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（５０ｇ）、無水マレイン酸(９．５ｇ)、トルエン（３５０ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。ｔ−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（１．０ｇ）を入れ、加温し、７５℃〜９５℃にて４時間、重合反応をおこなった。減圧下でトルエンおよび無水マレイン酸を留去し、粘性液体を得た。
【００７０】
次に、粘性液体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（３００ｇ）を入れ、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（２５．２ｇ）を得た。
【００７１】
（実施例２）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（５０ｇ）、無水マレイン酸(９．５ｇ)、トルエン（３５０ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。
Ｎ，Ｎ−アゾイソブチロニトリル（０．３９ｇ）を入れ、加温し、６３℃〜８０℃にて４時間、重合反応をおこなった。減圧下でトルエンおよび無水マレイン酸を留去し、粘性液体を得た。
次に、粘性液体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（９００ｇ）を入れ、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（９．６ｇ）を得た。
【００７２】
（実施例３）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量１５００）（５０．４ｇ）、無水マレイン酸(３．４１ｇ)、トルエン（１５０ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。
ｔ−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（０．３４ｇ）を入れ、加温し、７５℃〜９５℃にて５時間、重合反応をおこなった。減圧下でトルエンおよび無水マレイン酸を留去し、黄白色固体を得た。次に、黄白色固体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（３００ｇ）を入れ、５０℃に加温し、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１５．０ｇ）を得た。
【００７３】
（実施例４）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（３０ｇ）、無水マレイン酸(５．７ｇ)、エチレングリコールジメチルエーテル（モノグライム）（４８０ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。ｔ−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（０．６２ｇ）を入れ、加温し、８０℃にて４時間、重合反応をおこなった。次に、室温に冷却後、ヘキサン（７３０ｇ）を入れ、１５分攪拌した。攪拌を止め、静置し、上澄み溶液を除去し、粘性液体を得た。次に、粘性液体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（１６０ｇ）を入れ、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（３．３ｇ）を得た。
【００７４】
（実施例５）
２Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（５０ｇ）、無水マレイン酸(９．５ｇ)、ジエチレングリコールジメチルエーテル（ジグライム）（８００ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。ｔ−ヘキシルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（１．１９ｇ）を入れ、加温し、７５℃〜９５℃にて４時間、重合反応をおこなった。次に、室温に冷却後、ヘキサン（９８９ｇ）中に重合溶液を入れ、１５分攪拌した。攪拌を止め、静置し、上澄み溶液を除去し、粘性液体を得た。次に、粘性液体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（３００ｇ）を入れ、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１５．１ｇ）を得た。
【００７５】
（実施例６）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（１５０ｇ）、無水マレイン酸(２８．５ｇ)、トルエン（９０００ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。
ｔ−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（３．１ｇ）を入れ、加温し、７５℃〜９５℃にて５時間、重合反応をおこなった。減圧下でトルエンおよび無水マレイン酸を留去し、黄白色固体を得た。次に、黄白色固体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（９００ｇ）を入れ、５０℃に加温し、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（３１．１ｇ）を得た。
【００７６】
特開昭６４−１０９の製造例１に示されている方法に準じて、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルを合成した（製造例１）。
【００７７】
（製造例１：ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルの合成）
加圧反応器にメタノール（３２ｇ）、触媒としてナトリウムメチラート（１．１ｇ）を入れ、系内の空気を窒素ガスで置換した後、１４０℃にてエチレンオキシド（４１０ｇ）を徐々に圧入し、付加反応を行った。
反応終了後、室温に冷却し、水酸化ナトリウム（７５ｇ）を加え、１１０℃に加熱し、窒素ガス雰囲気下、約２０ｍｍＨｇの減圧下で脱水を行った。
次に、窒素ガスを加え、１ｋｇｆ／ｃｍ２に加圧した後、攪拌しながらアリルクロリド（９８ｇ）を徐々に加えた。反応開始４時間後に反応を止め、塩酸で中和し、副生した塩を濾別して、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルを得た。
【００７８】
次に、製造例１で得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルを、特開昭６４−１０９の実施例１に従い、共重合反応を行った（比較例１）。
【００７９】
（比較例１）
冷却管、窒素ガス吹き込み管、温度計および攪拌器を備えた３００ｍＬフラスコに、上記の製造例１にて得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（５０ｇ）、無水マレイン酸(１０．５ｇ)、トルエン（６０．５ｇ）を入れた。ベンゾイルペルオキシド（０．６４ｇ）を入れ、８０℃に昇温し、４時間、重合反応をおこなった。
反応終了後、１０ｍｍＨｇの減圧下に１１０℃でトルエンを留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（５４．１ｇ）を得た。
【００８０】
ＧＰＣシステムとしては、ＳＨＯＤＥＸ ＧＰＣ ＳＹＳＴＥＭ−１１、示差屈折率計としてＳＨＯＤＥＸ
ＲＩ−７１を用い、カラムとしてＳＨＯＤＥＸ ＫＦ−８０１、ＫＦ−８０３及びＫＦ−８０４を３本連続装着した。
カラム温度を４０℃とし、展開溶剤として０.０５モル／リットル硝酸ナトリウム水溶液を用い、１ｍＬ／分の流速で流し、サンプル濃度０.１重量％のサンプル溶液０.１ｍＬを注入した。
分子量は、ＢＯＲＷＩＮ ＧＰＣ計算プログラムを用いて得られたクロマトグラムをもとに求めた、ポリエチレングリコール標準体換算の重量平均分子量である。以下の実施例及び比較例においても、同様の条件で測定を行った。
【００８１】
共重合体のピークの分子量（Ｍｎ）と多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）の結果を以下の表１に示す。
多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、共重合体のピークの溶出開始点からそのピークの溶出終了点までの値を示す。また、これはメインピークについてのみの値であり、チャートに現れるピーク全体についての値ではない。
【００８２】
本発明の共重合体中に含まれる未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により測定した値である。
展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５（体積比）の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。
この方法により、共重合体中に含まれる、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の量を定量することが出来る。
これらの方法により純度を求めた結果を表１に示す。「％」は重量％を示す。
なお、ヨウ素蒸気による発色の検出限界は０．１％であるため、０．１％未満の場合は＜０．１とした。
【００８３】
次に、実施例１〜６および比較例１のサンプルについて、７０℃にて１ヶ月の保存安定性試験を行った。結果を表１に示す。
【００８４】
【表１】
【００８５】
表１の結果から、本実施例１〜６において製造した共重合体中に含まれる未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析において、＜０．１％であり、比較例１と比較して、極めて少なかった。また、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）も、１．３以下であった。
【００８６】
一方、比較例１で得られた共重合体は、多分散度は極めて広く、未反応のポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルも多く残存していた。さらに、７０℃、１ヶ月後の安定性試験ではゲル化していたが、実施例１〜６はゲル化が見られず保存安定性は良好であった。
【００８７】
次に、比較例１で得られた共重合体を、非特許文献１記載の方法（比較例２、比較例３）および本発明の方法（実施例７）により、精製を試みた。
比較例２、比較例３、および実施例７の、ＴＬＣ分析結果および、保存安定性の結果を表２に示す。
【００８８】
（比較例２）
比較例１で得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体のうち、１５ｇをフラスコに入れ、酢酸エチル（３０ｇ）に溶解した。酢酸エチル溶液に、ヘキサン（９０ｇ）を入れ沈殿させた。攪拌し、静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存する溶剤を減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１４．６ｇ）を得た。
【００８９】
（比較例３）
比較例１で得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（５４．１ｇ）のうち、１５ｇをフラスコに入れ、酢酸エチル（３０ｇ）に溶解した。酢酸エチル溶液をヘキサン（９０ｇ）中に滴下し、沈殿させた。攪拌し、静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存する溶剤を減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１４．８ｇ）を得た。
【００９０】
（実施例７）
実施例１で得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体のうち、１５ｇをフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（９０ｇ）を入れ、５０℃に加温し、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１２．２ｇ）を得た。
【００９１】
【表２】
【００９２】
表２の結果から、比較例２および比較例３の方法では共重合体中から未反応のポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルをほとんど除去出来なかったのに対して、実施例７では＜０．１％まで除去することが出来た。
【００９３】
次に得られた共重合体の効果を見るために、実施例４、比較例１について、特開平０５−３３６９６６の方法に従い、大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼを用いて、表１の共重合体による修飾およびその評価を行った。
【００９４】
（実施例８）
Ｌ−アスパラギナーゼ４．０ｍｇを０．５Ｍ硼酸緩衝液（ｐH８．５）１ｍｌに溶解し、系の温度を３℃に保持した。これに実施例４の共重合体
２００ｍｇを系に加えて３±１℃で１時間攪拌した。ついで ５０ｍＭ硼酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌを加えて反応を停止させた。ついで反応液を限外濾過により３回処理して未反応の共重合体を除去し、修飾アスパラギナーゼ１３ｍｇを得た。
【００９５】
（比較例４）
実施例８と同様に、比較例の共重合体についても行い、修飾アスパラギナーゼ１８ｍｇを得た。
【００９６】
実施例８、比較例４で得られた修飾アスパラギナーゼの修飾率と残存活性の結果を表３に示す。
【００９７】
【表３】
【００９８】
表３より、本発明の共重合体によるＬ−アスパラギナーゼの修飾は、これまでの共重合体による修飾と比較すると、高い残存活性を有していることがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位と不飽和カルボン酸に基づく構成単位からなる共重合体、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体が開発され、それを単量体とする重合体や、他の単量体との共重合体が開発されている（特許文献１、２参照）。
例えば、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体と不飽和カルボン酸からなる共重合体は、分散剤、増粘剤、混和剤、コーティング剤、凝集剤、多価金属イオン捕捉剤、接着剤、化粧品基材等の多くの用途に用いられている。
【特許文献１】特開昭６４−１０９
【特許文献２】特開２００３−１０５００３
【０００３】
一方、特許文献３にあるようにこれらの共重合体はペプチドや酵素の修飾にも有用であることが知られている。
【特許文献３】特開平５−３３６９６６
【０００４】
こうしたポリエチレングリコール誘導体を用いて、化学修飾したペプチドは体内でのペプチドの抗原性を低下させる等の利点があり、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）用基剤として期待されるものである。
【０００５】
しかしながら、特許文献１−３で使用されている、従来の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体と無水マレイン酸の共重合体中には、重合に関与しなかった未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体が含まれており（特許文献２では重合率約７７，８２％の記載あり）、医薬品として使用するには共重合体の純度において十分満足のいくものではなかった。
【０００６】
そして、従来の方法にて製造された共重合体は、重合に関与しなかった未反応の構成単位（ア）のピークが大きい上に、共重合体のピークの多分散度が広かった。
すなわち、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体は不純物として残存していることはもちろん、共重合体のメインピークよりも高分子量不純物や低分子量不純物が多いことを意味し、生体関連物質と結合させる際、副反応物が多くなり、純度不十分となる恐れがあり、かつ、薬剤の均一性や修飾物の効果・効能の点から、好ましくない。
【０００７】
特に、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の分子量が大きい共重合体は重合転化率が低いため、従来の製造方法では共重合体中に未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体がさらに多く残存するばかりか、共重合体の分子量分布が不均一で多分散度が大きく、薬剤の修飾に使用する場合には、不適であった。
【０００８】
このため、これまで次のようなポリマーから不純物を除去する精製方法が研究されている。
重、縮合反応が完全に行われないときには単量体が残存していることがある。一般に共存する低分子化合物を除去するのは高圧の真空で−高分子化合物が崩壊しない程度に−加熱するとか、適当な大きさの固体試料を高分子化合物を溶解しない溶媒で洗うとかの方法を用いる。また、一般的に最もよく用いられる方法は溶液としたのち、貧溶媒を加えて沈殿させる方法がある。しかしながら、これらの方法では、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の除去は困難であった。
【非特許文献１】社団法人日本化学会編,「実験化学講座８ 高分子化学（上）」,丸善,昭和３１年,Ｐ４−５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、例えばペプチドや酵素の修飾に使用した場合、ペプチドや酵素の修飾率の低下や活性点を封鎖することがなく、均一性のある高純度な修飾物を得ることが可能な、医薬品原料として使用可能な共重合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る共重合体は、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体であって、この共重合体中に含まれる重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下であり、共重合体の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【００１１】
好ましくは、不飽和カルボン酸が、無水マレイン酸およびマレイン酸誘導体からなる群より選ばれた一種以上の化合物である。
【００１２】
また、本発明は、生体関連物質分子、およびこの分子に結合された少なくとも１個の前記共重合体を有する、修飾された生体関連物質に係るものである。
【００１３】
また、本発明に係る共重合体の製造方法は、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体の重量に対して０．１重量倍〜１００重量倍のｔ−ブチル メチル エーテルを添加し、攪拌、分層後、ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去することにより、前記共重合体中に存在する前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去する。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【００１４】
本発明の方法において好ましくは、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）とを重合させる時に使用する溶媒が、式（２）からなるポリオキシアルキレンジアルキルエーテル誘導体である。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
Ｒ３Ｏ（ＡＯ）ｍＲ４ ・・・・・（２）
（但し、式中、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ炭素数１〜５の飽和炭化水素基であり、炭化水素基は直鎖状、分岐状、環状であってもよい。Ｒ３とＲ４は同一であってもよく、異なっていても良い。ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１〜１０である。）
【００１５】
また、本発明の方法において好ましくは、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、メチル基およびエチル基から選択される基であり、ｍは１〜４である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の共重合体は、共重合体中に含まれる前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下であり、共重合体の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である。そのため、本発明の共重合体を薬剤の修飾用途、例えばペプチドや酵素の修飾に使用した場合、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体と反応してペプチドや酵素の修飾率の低下や活性点を封鎖することがなく、しかも、多分散度が小さいことから、修飾率が高く、安定で、均一性の高い、薬剤用途に適した修飾物を得ることができる。
共重合体中に含まれる前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量は、特に好ましくは、ＴＬＣ上でヨウ素蒸気による発色の検出限界未満であり、即ち０．１重量％未満である。
【００１７】
また、本発明の方法によれば、精製溶媒として特定の有機溶媒、即ち、ｔ−ブチル メチル エーテルを使用することにより、共重合体中から未反応のモノマーを効率良く除去出来ることを見出し、本発明に至った。
更に、重合時に、前記式（２）のような特定の反応溶媒を使用することにより、得られる共重合体の多分散度が小さくなることを見いだした。
【００１８】
本発明に基づく、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体が少なく、多分散度の小さい共重合体は、このような新たな製法によって提供可能となったものであり、医薬用途への使用に適している。これによって本発明の共重合体が有する前記の顕著な作用効果が確認されるに至ったのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の共重合体は、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体中に含まれる未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である共重合体である。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2・・・（１）
（ただし、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【００２０】
式（１）において、Ｒ1で示される炭素数１〜２４の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert―ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基などを挙げることができる。これらの中で、炭素数１〜４の炭化水素基がより好ましい。
【００２１】
式（１）において、Ｒ２で示される炭素数３〜５の不飽和炭化水素基としてはビニル基、アリル基、メタリル基、３−メチル−３−ブテニル基などがあり、好ましくはアリル基、メタリル基である。
【００２２】
式（１）において、ＡＯで示される炭素数２〜４のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、２，３−オキシブチレン基およびオキシテトラメチレン基などを挙げることができる。好ましくは、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基である。
【００２３】
式（１）において、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のオキシアルキレン基であるとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよい。
【００２４】
また、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００であり、より好ましくは５〜１００である。ｎが５未満であると、該ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテルを出発原料として得られる共重合体が、十分な親水性基を有しておらず、分散剤やタンパク修飾などに使用する共重合体としての性能を発現しないおそれがある。ｎが５００を超えると、粘度が高くなって取り扱いが困難となるおそれがある。
【００２５】
本発明の共重合体を構成する不飽和カルボン酸としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸などの不飽和モノカルボン酸及びそれらの塩、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、イタコン酸などの不飽和ジカルボン酸及びそれらの塩、アクリルアミド類、無水マレイン酸、マレイン酸エステル類及びこれらの塩などを挙げることができる。
【００２６】
これらの不飽和カルボン酸は、１種を単独で用いることができ、あるいは２種以上を組み合わせて用いることもできる。これらの中で、不飽和モノカルボン酸、不飽和ジカルボン酸及びこれらの塩を好適に使用することができ、好ましくはマレイン酸およびその誘導体からなる群より選ばれた一種または二種以上の化合物である。この化合物は、マレイン酸の他、マレイン酸誘導体、例えば無水マレイン酸、マレイン酸エステル、マレイン酸塩を例示でき、特に好ましくは無水マレイン酸を好適に使用することができる。
また、本発明の共重合体の製造方法では、本発明の効果に影響を与えない程度で、必要に応じて他の共重合可能な単量体を用いることができる。
【００２７】
また、本発明で得られた共重合体を構成する不飽和カルボン酸部は公知の方法によってさらに変性したものを使用しても良い。
【００２８】
上記構成単位（ア）及び（イ）の組成比は限定されない。構成単位（ア）と構成単位（イ）との組成比率（構成単位（ア）／構成単位（イ））は（５モル％〜９５モル％）／（９５モル％〜５モル％であることが好ましく、（３０モル％〜７０モル％）／（７０モル％〜３０モル％）であることがさらに好ましい。
【００２９】
本発明で得られる共重合体は重合開始剤の種類あるいは重合条件等を変化させることにより、種々の重合度の共重合体を得ることができ、その重合平均分子量は通常３,０００〜３００，０００であり、好ましくは３,０００〜１００,０００であり、より好ましくは３，０００〜３０，０００である。
【００３０】
式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）を得るには、合成方法に特に制限はなく、例えば、ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテルに水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物を加え、塩化アリル、臭化アリル、よう化アリル、塩化メタリル、臭化メタリルなどのモノハロゲン化不飽和炭化水素とのエーテル化反応により得ることができる。
【００３１】
本発明の共重合体の製造方法に特に制限はなく、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、これと不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）を、有機溶剤中又は水系溶剤中で溶液重合することができる。好ましい重合方法は、有機溶剤中での重合である。
【００３２】
本発明の共重合体中の不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）が無水マレイン酸等のように反応性基である場合には、水や、メタノールやエタノール等の水酸基を有するアルコール類の溶剤や、アミノ基やチオール基等を有する溶媒は、無水マレイン酸と反応するため好ましくなく、反応性基と反応しない溶剤を使用することが望ましい。
【００３３】
有機溶剤系で用いる有機溶剤は、トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒、モノグライム、ジグライム、トリグライム、テトラグライム等のエーテル系溶媒、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等の脂環式系溶媒であり、好ましくは、式（２）で示される溶媒であり、より好ましくはモノグライム、ジグライム、トリグライムである。
有機溶剤は１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００３４】
前記式（２）において、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ炭素数１〜５の飽和炭化水素基であり、炭化水素基は直鎖状、分岐状、環状であってもよい。Ｒ３とＲ４は同一であってもよく、異なっていても良い。Ｒ３、Ｒ４は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert―ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基を挙げることができる。これらの中で、炭素数１〜４の炭化水素基がより好ましく、メチル基、エチル基が特に好ましい。
【００３５】
式（２）において、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよい。ＡＯで示される炭素数２〜４のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、２，３−オキシブチレン基およびオキシテトラメチレン基などを挙げることができる。好ましくは、オキシエチレン基である。
【００３６】
式（２）において、ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１〜１０である。ｍは好ましくは１〜４である。ｍが１０を超えると、操作上、取り扱いにくくなるため、好ましくない。
【００３７】
本発明の共重合体を得る際に使用する溶媒量は、溶媒の種類によって異なるが、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）の合計重量に対して、０．１〜２００重量倍である。
例えば、トルエンやキシレンを使用する場合は、上記構成単位（ア）および（イ）の合計重量の０．１〜２００重量倍であり、好ましくは５〜１００重量倍である。
モノグライム、ジグライム、トリグライムを使用する場合は、上記構成単位（ア）および（イ）の合計重量の０．１〜１００重量倍であり、好ましくは０．２〜５０重量倍である。
【００３８】
また、重合反応に用いる重合開始剤としては、水系溶剤の場合には、例えば、tert―ブチルヒドロペルオキシドなどのヒドロペルオキシドや、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩などの水溶性の重合開始剤を挙げることができる。有機溶剤系又は無溶剤系で重合を行う場合には、例えば、ベンゾイルペルオキシド、ジ−tert−ブチルペルオキシド、tert−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエートなどの過酸化物や、２,２'−アゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ系開始剤などを挙げることができる。
これらの重合開始剤は、１種を単独で用いることができ、あるいは２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００３９】
重合開始剤量は特に制限はないが、重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と不飽和カルボン酸の構成単位に基づく（イ）の合計重量に対して、通常０．００１〜０．１モル％、好ましくは０．００５〜０．１モル％である。また、必要に応じて連鎖移動剤を併用して重合を行うこともできる。
但し、本発明の不飽和カルボン酸の構成単位（イ）が無水マレイン酸等のように反応性基である場合には、チオール基等を有する連鎖移動剤は、無水マレイン酸と反応するため好ましくない。
【００４０】
反応条件は特に制限はないが、通常、反応温度は０〜１４０℃、好ましくは反応温度２０〜１２０℃であり、反応時間は１〜１００時間、好ましくは反応時間２〜５０時間である。
【００４１】
式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体から、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去するためには、ｔ−ブチル メチル エーテルの使用量を、共重合体の重量に対して、０．１重量倍〜１００重量倍使用する。好ましくは、０．５〜５０重量倍であり、より好ましくは、１〜２０重量倍である。
【００４２】
例えばトルエンなどの減圧下での留去が可能な溶媒で重合した際、共重合体中から未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去する場合には、濃縮等の方法により溶媒を一部または完全に留去した後、ｔ−ブチル メチル エーテルで精製すると良い。
重合溶媒を除去しない場合、または一部だけ除去する場合、残存した重合溶液にｔ−ブチル メチル エーテルを入れても良いし、またはｔ−ブチル メチル エーテルに重合溶液を入れても良い。但し、完全に溶媒を除去した場合と比較して、使用するｔ−ブチル メチル エーテル量が多くなる。
また、重合溶媒に対するｔ−ブチル メチル エーテル量が少ないと歩留まりが悪くなる可能性がある。
【００４３】
重合溶液中にｔ−ブチル メチル エーテルを入れる場合、使用するｔ−ブチル メチル エーテル量は、重合溶媒の重量に対して、０．１重量倍〜１００重量倍使用すると良い。好ましくは、０．１〜１０重量倍であり、より好ましくは、０．１〜５重量倍である。０．１重量倍以下の場合、沈殿しない可能性があるため、好ましくない。
ｔ−ブチル メチル エーテル中に重合溶液を入れる場合、ｔ−ブチル メチル エーテルは、重合溶媒の重量に対して、０．１重量倍〜１００重量倍使用する。好ましくは、１〜５０重量倍であり、より好ましくは、２〜３０重量倍である。０．１重量倍以下の場合、沈殿しない可能性があるため、好ましくない。
【００４４】
一方、例えばジグライムなどのように、比較的沸点の高い溶媒、すなわち、減圧下で除去が困難な溶媒で重合した場合は、例えばヘキサンなどの貧溶媒を加えるか、貧溶媒中に重合溶液を入れることにより共重合体を沈殿させた後、デカンテーションまたは濾過により溶液を除去した後、ｔ−ブチル メチル エーテルにて処理すると良い。
沈殿を得る方法としては、重合溶液中に貧溶媒を入れても良いし、貧溶媒中に重合溶液を入れても良い。また、重合溶媒に対する貧溶媒量が少ないと歩留まりが悪くなる可能性がある。
【００４５】
重合溶液中に貧溶媒を入れる場合、使用する貧溶媒量は、重合溶媒の重量に対して、０．５重量倍〜５０重量倍使用する。好ましくは、０．５〜１０重量倍であり、より好ましくは、０．５〜５重量倍である。０．５重量倍以下の場合、沈殿しない可能性があるため、好ましくない。
貧溶媒中に重合溶液を入れる場合、使用する貧溶媒量は、重合溶媒の重量に対して、０．５重量倍〜１００重量倍使用する。好ましくは、１〜５０重量倍であり、より好ましくは、２〜３０重量倍である。０．５重量倍以下の場合、沈殿しない可能性があるため、好ましくない。
【００４６】
共重合体にｔ−ブチル メチル エーテルを添加した後の攪拌については、十分に攪拌する方が共重合体から未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去しやすい。十分な攪拌を得るためには、スリーワンモーターや高トルクの攪拌機を使用することが好ましい。少量の場合にはマグネティックスターラーでも良い。いずれの方法も、十分に攪拌が行われないと、共重合体から未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を十分に除去できない場合がある。
【００４７】
ｔ−ブチル メチル エーテルを添加した後は、界面が分かるまで十分静置することが好ましい。静置時間は、１分〜７２時間であり、好ましくは５分〜４８時間である。
静置が不十分な場合には、ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去する際に、浮遊している共重合体を同時に除去してしまい、歩留まりが悪くなる場合がある。
【００４８】
ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去する際は、濾過やデカンテーションにより除去しても良く、分液漏斗などにより下層の共重合体を抜き取り後、上層の溶液を除去しても良い。
【００４９】
共重合体中の未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量にも依存するが、攪拌、静置、除去する工程は少なくとも１回行うのが良い。
【００５０】
ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去後は、該共重合体中に残存するｔ−ブチル メチル エーテルを除去するために、減圧下で脱溶剤を行うことが望ましい。
【００５１】
本発明の共重合体にて修飾された生体関連物質は、少なくとも１個の共重合体で生体関連物質分子を結合させたものである。
【００５２】
生体関連物質分子の修飾に使用する本発明の共重合体は、式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体中に含まれる未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である共重合体である
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2・・・（１）
［式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である］
【００５３】
式（１）において、Ｒ1で示される炭素数１〜２４の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert―ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ベンジル基などを挙げることができる。これらの中で、炭素数１〜４の炭化水素基がより好ましい。
【００５４】
式（１）において、Ｒ２で示される炭素数３〜５の不飽和炭化水素基としてはビニル基、アリル基、メタリル基、３−メチル−３−ブテニル基などがあり、好ましくはアリル基、メタリル基である。
【００５５】
式（１）において、ＡＯで示される炭素数２〜４のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、２，３−オキシブチレン基およびオキシテトラメチレン基などを挙げることができる。好ましくは、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、１，２−オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基である。
式（１）において、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のオキシアルキレン基であるとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよい。
また、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００であり、より好ましくは５〜１００である。
【００５６】
共重合体を構成する不飽和カルボン酸としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸などの不飽和モノカルボン酸及びそれらの塩、マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、イタコン酸などの不飽和ジカルボン酸及びそれらの塩、アクリルアミド類、無水マレイン酸、マレイン酸エステル類及びこれらの塩などを挙げることができる。これらの不飽和カルボン酸は、１種を単独で用いることができ、あるいは２種以上を組み合わせて用いることもできる。これらの中で、不飽和モノカルボン酸、不飽和ジカルボン酸及びこれらの塩を好適に使用することができ、好ましくは無水マレイン酸、マレイン酸エステル、さらに好ましくはマレイン酸を好適に使用することができる。
また、本発明で得られた共重合体を構成する不飽和カルボン酸部は公知の方法によってさらに変性したものを使用しても良い。
【００５７】
また、本発明の共重合体の製造方法では、本発明の効果に影響を与えない程度で、必要に応じて他の共重合可能な単量体を用いることができる。
上記構成単位（ア）及び（イ）の組成比は限定されない。構成単位（ア）と（イ）との組成比率（構成単位（ア）／構成単位（イ））は（５モル％〜９５モル％）／（９５モル％〜５モル％）であることが好ましく、（３０モル％〜７０モル％）／（７０モル％〜３０モル％）であることがさらに好ましい。
本発明で得られる共重合体は重合開始剤の種類あるいは重合条件等を変化させることにより、種々の重合度の共重合体を得ることができ、その重合平均分子量は通常３,０００〜３００，０００であり、好ましくは３,０００〜１００,０００であり、より好ましくは３，０００〜３０，０００である。
【００５８】
本発明の共重合体での生体関連物質分子への修飾数は特に限定されないが、１〜１００箇所が好ましく、更に好ましくは１〜２０箇所である。
【００５９】
本発明で言う「生体関連物質」とは、生体に関連する物質を意味する。生体に関連する物質とは、以下を含むものである。
【００６０】
（１） リン脂質、糖脂質、糖タンパク等の動物細胞構成材料
動物細胞構成材料とは、細胞膜等を構成する成分であり、特にその種類を限定されるものではないが、例えばリン脂質、糖脂質、糖タンパク質等が挙げられる。より具体的なリン脂質としては、例えばファスファチジジン酸、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、カルジオリピン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトールが挙げられる。また、これらのリゾ体も含まれる。これらリン脂質は卵黄あるいは大豆等の天然物由来のものでも良いし、合成物でも良い。脂肪酸組成としては、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１２〜２２の脂肪酸が挙げられる。これらの脂肪酸は飽和脂肪酸でも良いし、不飽和結合を含んだものでも良い。より具体的な糖脂質としては、例えばセラミド、セレブロシド、スフィンゴシン、ガングリオシド、グリセロ糖脂質等が挙げられる。また、脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセライド、コレステロール、胆汁酸もこれに含まれる。
【００６１】
（２） 血液、リンパ液、骨髄液等の体液構成物質
体液構成物質とは、細胞内外に存在する液体成分であり、特にその種類を限定されるものではないが、血液、リンパ液、骨髄液が挙げられる。これら体液のより具体的な構成成分としては、例えばヘモグロビン、アルブミン、血液凝固因子等が挙げられる。
【００６２】
（３）ビタミン、神経伝達物質、タンパク質、ポリペプチド、薬剤等の生理活性物質
生理活性物質とは、体の働きを調節する成分であり、特にその種類を限定されるものではないが、ビタミン、神経伝達物質、タンパク質、ポリペプチド、薬剤が挙げられる。
より具体的なビタミンとしては、例えばビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK等が挙げられる。
【００６３】
より具体的な神経伝達物質としては、例えばアドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン、アセチルコリン、GABA、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられる。
より具体的なタンパク質、ポリペプチドとしては、例えば以下に挙げられるものがある。脳下垂体ホルモン、甲状腺ホルモン、男性ホルモン、女性ホルモン、副腎皮質ホルモン等のホルモン。ヘモグロビン、血液因子等の血清タンパク質。IgG、IgE、IgM、IgA、IgD等の免疫グロブリン。インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１およびＩＬ１２サブタイプ）、インターフェロン（―α、−β、−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（αおよびβ型）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質、インシュリン、グルカゴン、レクチン、リシン、腫瘍壊死因子、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（―α、−β）、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、骨増殖因子、インスリン様増殖因子、ヘパリン結合増殖因子、腫瘍増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、マクロファージ分化因子、分化誘導因子、白血病阻害因子、アンフィレグリン、ソマトメジン、エリスロポエチン、ヘモポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン等のサイトカインおよびそのフラグメント。タンパク質分解酵素、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、エラスターゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼ等の酵素。モノクロナール及びポリクロナール抗体およびそれらのフラグメント。ポリーL−リジン、ポリーD−リジン等のポリアミノ酸。Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチン、メラノーマワクチン、ＨＩＶ−１ワクチン等のワクチンおよび抗原。また、糖タンパクも含まれる。また、これらの生理活性物質と同様の生理活性を有する類似構造物質もこれに含まれる。
【００６４】
また、これらのタンパク質、ポリペプチドは、それらの天然源または遺伝子工学的処理を受けた細胞から単離されるか、あるいは種々の合成法を経て作り出されたものでも良い。
【００６５】
薬剤としては、特に限定されるものではないが、より好ましくは抗癌剤と抗真菌剤が挙げられる。
より具体的な抗癌剤としては、特に限定されるものではないが、例えばパクリタキセル、アドリアマイシン、ドキソルビシン、シスプラチン、ダウノマイシン、マイトマイシン、ビンクリスチン、エピルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アクラシノマイシン、イダマイシン、ブレオマイシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、パンコマイシン、カンプトテシン等が挙げられる。
具体的な抗真菌剤としては、特に限定されるものではないが、例えばアムホテリシンB、ナイスタチン、フルシトシン、ミコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾールおよびペプチド性抗真菌剤が挙げられる。
また、これら生理活性物質には、例えば抗酸化作用、PAF阻害作用、抗炎症作用、抗菌作用等を有する、フラボノイド、テルペノイド、カルテノイド、サポニン、ステロイド、キノン、アントラキノン、キサントン、クマリン、アルカロイド、ポルフィリン、ポリフェノール等も含まれる。
【００６６】
例えば、本発明の修飾された生体関連物質は、以下のようにして製造することができるが、この方法に限定されるものではない。
生体関連物質分子の官能基、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基等と本発明の共重合体を反応させる場合の比率は、生体関連物質分子中の官能基の個数、あるいは共重合体中の構成単位（イ）の含有量により異なるため、一概に特定することはできないが、生体関連物質分子の官能基の数と比較して共重合体の量が少ないと修飾率が低下し、生体関連物質分子の官能基の数と比較して共重合体の量が多いと修飾率が高くなる。修飾率は、修飾された生体関連物質の効果・効能に影響を与えることがあるので、それらの効果・効能に合わせて、適宜選択すると良い。
【００６７】
反応溶媒としては、反応に関与しない溶媒であれば特に限定されないが、タンパク質、ポリペプチドを反応させる場合は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液などの緩衝液が好ましい溶媒として挙げられる。更には、タンパク質、ポリペプチドの活性を失うことなく、反応に関与しないアセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の有機溶媒を添加しても良い。
抗癌剤、抗真菌剤、リン脂質を反応させる場合は、前述の緩衝液のほかにもトルエン、ベンゼン、キシレン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルーメチルエーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、塩化メチレン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、水、メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール、２-プロパノール、ｎ−ブタノール等が好ましい溶媒として挙げられる。また、溶媒を用いなくとも良い。共重合体中の構成単位（イ）が無水マレイン酸などの場合、メタノール、エタノールなどのアルコール溶媒下では、反応する可能性があるので好ましくない。本発明の共重合体と生体関連物質を反応溶媒に加える順番はどちらが先でも良い。反応温度は、生体関連物質の活性が失われない温度であれば特に限定されないが、タンパク質、ポリペプチドを反応させる場合は、好ましくは０〜４０℃であり、抗癌剤、抗真菌剤、リン脂質を反応させる場合は、好ましくは−２０〜１５０℃である。反応時間は０．５〜７２時間が好ましく、更に好ましくは、１〜２４時間である。反応に際しては、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等の縮合剤を用いても良い。
反応後は、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出等の精製手段にて精製してもよい。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６９】
（実施例１）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（５０ｇ）、無水マレイン酸(９．５ｇ)、トルエン（３５０ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。ｔ−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（１．０ｇ）を入れ、加温し、７５℃〜９５℃にて４時間、重合反応をおこなった。減圧下でトルエンおよび無水マレイン酸を留去し、粘性液体を得た。
【００７０】
次に、粘性液体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（３００ｇ）を入れ、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（２５．２ｇ）を得た。
【００７１】
（実施例２）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（５０ｇ）、無水マレイン酸(９．５ｇ)、トルエン（３５０ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。
Ｎ，Ｎ−アゾイソブチロニトリル（０．３９ｇ）を入れ、加温し、６３℃〜８０℃にて４時間、重合反応をおこなった。減圧下でトルエンおよび無水マレイン酸を留去し、粘性液体を得た。
次に、粘性液体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（９００ｇ）を入れ、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（９．６ｇ）を得た。
【００７２】
（実施例３）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量１５００）（５０．４ｇ）、無水マレイン酸(３．４１ｇ)、トルエン（１５０ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。
ｔ−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（０．３４ｇ）を入れ、加温し、７５℃〜９５℃にて５時間、重合反応をおこなった。減圧下でトルエンおよび無水マレイン酸を留去し、黄白色固体を得た。次に、黄白色固体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（３００ｇ）を入れ、５０℃に加温し、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１５．０ｇ）を得た。
【００７３】
（実施例４）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（３０ｇ）、無水マレイン酸(５．７ｇ)、エチレングリコールジメチルエーテル（モノグライム）（４８０ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。ｔ−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（０．６２ｇ）を入れ、加温し、８０℃にて４時間、重合反応をおこなった。次に、室温に冷却後、ヘキサン（７３０ｇ）を入れ、１５分攪拌した。攪拌を止め、静置し、上澄み溶液を除去し、粘性液体を得た。次に、粘性液体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（１６０ｇ）を入れ、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（３．３ｇ）を得た。
【００７４】
（実施例５）
２Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（５０ｇ）、無水マレイン酸(９．５ｇ)、ジエチレングリコールジメチルエーテル（ジグライム）（８００ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。ｔ−ヘキシルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（１．１９ｇ）を入れ、加温し、７５℃〜９５℃にて４時間、重合反応をおこなった。次に、室温に冷却後、ヘキサン（９８９ｇ）中に重合溶液を入れ、１５分攪拌した。攪拌を止め、静置し、上澄み溶液を除去し、粘性液体を得た。次に、粘性液体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（３００ｇ）を入れ、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１５．１ｇ）を得た。
【００７５】
（実施例６）
１Ｌフラスコに、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（１５０ｇ）、無水マレイン酸(２８．５ｇ)、トルエン（９０００ｇ）を入れ、５０℃にて溶解した。
ｔ−ブチルペルオキシ ２−エチルヘキサノエート（３．１ｇ）を入れ、加温し、７５℃〜９５℃にて５時間、重合反応をおこなった。減圧下でトルエンおよび無水マレイン酸を留去し、黄白色固体を得た。次に、黄白色固体をフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（９００ｇ）を入れ、５０℃に加温し、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（３１．１ｇ）を得た。
【００７６】
特開昭６４−１０９の製造例１に示されている方法に準じて、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルを合成した（製造例１）。
【００７７】
（製造例１：ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルの合成）
加圧反応器にメタノール（３２ｇ）、触媒としてナトリウムメチラート（１．１ｇ）を入れ、系内の空気を窒素ガスで置換した後、１４０℃にてエチレンオキシド（４１０ｇ）を徐々に圧入し、付加反応を行った。
反応終了後、室温に冷却し、水酸化ナトリウム（７５ｇ）を加え、１１０℃に加熱し、窒素ガス雰囲気下、約２０ｍｍＨｇの減圧下で脱水を行った。
次に、窒素ガスを加え、１ｋｇｆ／ｃｍ２に加圧した後、攪拌しながらアリルクロリド（９８ｇ）を徐々に加えた。反応開始４時間後に反応を止め、塩酸で中和し、副生した塩を濾別して、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルを得た。
【００７８】
次に、製造例１で得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルを、特開昭６４−１０９の実施例１に従い、共重合反応を行った（比較例１）。
【００７９】
（比較例１）
冷却管、窒素ガス吹き込み管、温度計および攪拌器を備えた３００ｍＬフラスコに、上記の製造例１にて得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル（分子量５００）（５０ｇ）、無水マレイン酸(１０．５ｇ)、トルエン（６０．５ｇ）を入れた。ベンゾイルペルオキシド（０．６４ｇ）を入れ、８０℃に昇温し、４時間、重合反応をおこなった。
反応終了後、１０ｍｍＨｇの減圧下に１１０℃でトルエンを留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（５４．１ｇ）を得た。
【００８０】
ＧＰＣシステムとしては、ＳＨＯＤＥＸ ＧＰＣ ＳＹＳＴＥＭ−１１、示差屈折率計としてＳＨＯＤＥＸ
ＲＩ−７１を用い、カラムとしてＳＨＯＤＥＸ ＫＦ−８０１、ＫＦ−８０３及びＫＦ−８０４を３本連続装着した。
カラム温度を４０℃とし、展開溶剤として０.０５モル／リットル硝酸ナトリウム水溶液を用い、１ｍＬ／分の流速で流し、サンプル濃度０.１重量％のサンプル溶液０.１ｍＬを注入した。
分子量は、ＢＯＲＷＩＮ ＧＰＣ計算プログラムを用いて得られたクロマトグラムをもとに求めた、ポリエチレングリコール標準体換算の重量平均分子量である。以下の実施例及び比較例においても、同様の条件で測定を行った。
【００８１】
共重合体のピークの分子量（Ｍｎ）と多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）の結果を以下の表１に示す。
多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、共重合体のピークの溶出開始点からそのピークの溶出終了点までの値を示す。また、これはメインピークについてのみの値であり、チャートに現れるピーク全体についての値ではない。
【００８２】
本発明の共重合体中に含まれる未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により測定した値である。
展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５（体積比）の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。
この方法により、共重合体中に含まれる、未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の量を定量することが出来る。
これらの方法により純度を求めた結果を表１に示す。「％」は重量％を示す。
なお、ヨウ素蒸気による発色の検出限界は０．１％であるため、０．１％未満の場合は＜０．１とした。
【００８３】
次に、実施例１〜６および比較例１のサンプルについて、７０℃にて１ヶ月の保存安定性試験を行った。結果を表１に示す。
【００８４】
【表１】
【００８５】
表１の結果から、本実施例１〜６において製造した共重合体中に含まれる未反応の重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析において、＜０．１％であり、比較例１と比較して、極めて少なかった。また、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）も、１．３以下であった。
【００８６】
一方、比較例１で得られた共重合体は、多分散度は極めて広く、未反応のポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルも多く残存していた。さらに、７０℃、１ヶ月後の安定性試験ではゲル化していたが、実施例１〜６はゲル化が見られず保存安定性は良好であった。
【００８７】
次に、比較例１で得られた共重合体を、非特許文献１記載の方法（比較例２、比較例３）および本発明の方法（実施例７）により、精製を試みた。
比較例２、比較例３、および実施例７の、ＴＬＣ分析結果および、保存安定性の結果を表２に示す。
【００８８】
（比較例２）
比較例１で得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体のうち、１５ｇをフラスコに入れ、酢酸エチル（３０ｇ）に溶解した。酢酸エチル溶液に、ヘキサン（９０ｇ）を入れ沈殿させた。攪拌し、静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存する溶剤を減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１４．６ｇ）を得た。
【００８９】
（比較例３）
比較例１で得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（５４．１ｇ）のうち、１５ｇをフラスコに入れ、酢酸エチル（３０ｇ）に溶解した。酢酸エチル溶液をヘキサン（９０ｇ）中に滴下し、沈殿させた。攪拌し、静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存する溶剤を減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１４．８ｇ）を得た。
【００９０】
（実施例７）
実施例１で得られたポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体のうち、１５ｇをフラスコに入れ、ｔ−ブチルメチルエーテル（９０ｇ）を入れ、５０℃に加温し、攪拌した。静置後、上澄み溶液を除去した。同様の操作を２回繰り返した後、残存するｔ−ブチルメチルエーテルを減圧下で留去し、ポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテル−無水マレイン酸共重合体（１２．２ｇ）を得た。
【００９１】
【表２】
【００９２】
表２の結果から、比較例２および比較例３の方法では共重合体中から未反応のポリオキシエチレンモノメチルモノアリルエーテルをほとんど除去出来なかったのに対して、実施例７では＜０．１％まで除去することが出来た。
【００９３】
次に得られた共重合体の効果を見るために、実施例４、比較例１について、特開平０５−３３６９６６の方法に従い、大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼを用いて、表１の共重合体による修飾およびその評価を行った。
【００９４】
（実施例８）
Ｌ−アスパラギナーゼ４．０ｍｇを０．５Ｍ硼酸緩衝液（ｐH８．５）１ｍｌに溶解し、系の温度を３℃に保持した。これに実施例４の共重合体
２００ｍｇを系に加えて３±１℃で１時間攪拌した。ついで ５０ｍＭ硼酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌを加えて反応を停止させた。ついで反応液を限外濾過により３回処理して未反応の共重合体を除去し、修飾アスパラギナーゼ１３ｍｇを得た。
【００９５】
（比較例４）
実施例８と同様に、比較例の共重合体についても行い、修飾アスパラギナーゼ１８ｍｇを得た。
【００９６】
実施例８、比較例４で得られた修飾アスパラギナーゼの修飾率と残存活性の結果を表３に示す。
【００９７】
【表３】
【００９８】
表３より、本発明の共重合体によるＬ−アスパラギナーゼの修飾は、これまでの共重合体による修飾と比較すると、高い残存活性を有していることがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体であって、この共重合体中に含まれる前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下であり、前記共重合体の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である、共重合体。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【請求項２】
前記不飽和カルボン酸が、無水マレイン酸およびマレイン酸誘導体からなる群より選ばれた一種以上の化合物である、請求項１記載の共重合体。
【請求項３】
生体関連物質分子、およびこの分子に結合された少なくとも１個の請求項１または２記載の共重合体を有する、修飾された生体関連物質。
【請求項４】
式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体の重量に対して０．１重量倍〜１００重量倍のｔ−ブチル メチル エーテルを添加し、攪拌、分層後、ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去することにより、前記共重合体中に存在する前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去する、共重合体の製造方法。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【請求項５】
式（１）で示される前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、前記不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）とを重合させる時に使用する溶媒が、式（２）からなるポリオキシアルキレンジアルキルエーテル誘導体であることを特徴とする、請求項４記載の共重合体の製造方法。
Ｒ３Ｏ（ＡＯ）ｍＲ４ ・・・・・（２）
（但し、式中、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ炭素数１〜５の飽和炭化水素基であり、炭化水素基は直鎖状、分岐状、環状であってもよい。Ｒ３とＲ４は同一であってもよく、異なっていても良い。ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１〜１０である。）
【請求項６】
Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、メチル基およびエチル基から選択される基であり、ｍは１〜４である、請求項５記載の共重合体の製造方法。
【請求項１】
式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体であって、この共重合体中に含まれる前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体の含有量が０．１重量％以下であり、前記共重合体の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以下である、共重合体。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【請求項２】
前記不飽和カルボン酸が、無水マレイン酸およびマレイン酸誘導体からなる群より選ばれた一種以上の化合物である、請求項１記載の共重合体。
【請求項３】
生体関連物質分子、およびこの分子に結合された少なくとも１個の請求項１または２記載の共重合体を有する、修飾された生体関連物質。
【請求項４】
式（１）で示される重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）からなる共重合体の重量に対して０．１重量倍〜１００重量倍のｔ−ブチル メチル エーテルを添加し、攪拌、分層後、ｔ−ブチル メチル エーテル溶液を除去することにより、前記共重合体中に存在する前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体を除去する、共重合体の製造方法。
Ｒ1Ｏ（ＡＯ）ｎＲ2 ・・・・・・（１）
（但し、式中、Ｒ１は炭素数１〜２４の炭化水素基であり、Ｒ２は炭素数３〜５の不飽和炭化水素基であり、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で５〜５００である。）
【請求項５】
式（１）で示される前記重合性ポリオキシアルキレンモノアルキルエーテル誘導体に基づく構成単位（ア）と、前記不飽和カルボン酸に基づく構成単位（イ）とを重合させる時に使用する溶媒が、式（２）からなるポリオキシアルキレンジアルキルエーテル誘導体であることを特徴とする、請求項４記載の共重合体の製造方法。
Ｒ３Ｏ（ＡＯ）ｍＲ４ ・・・・・（２）
（但し、式中、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ炭素数１〜５の飽和炭化水素基であり、炭化水素基は直鎖状、分岐状、環状であってもよい。Ｒ３とＲ４は同一であってもよく、異なっていても良い。ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、ＡＯは１種であっても、２種以上であってもよく、ＡＯが２種以上のとき、その付加形式はランダム状であっても、ブロック状であってもよく、ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１〜１０である。）
【請求項６】
Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、メチル基およびエチル基から選択される基であり、ｍは１〜４である、請求項５記載の共重合体の製造方法。
【公開番号】特開２００７−９１８８３（Ｐ２００７−９１８８３Ａ）
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８３３３８（Ｐ２００５−２８３３３８）
【出願日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（０００００４３４１）日本油脂株式会社 (896)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（０００００４３４１）日本油脂株式会社 (896)
【Ｆターム（参考）】
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