共鳴非線形光信号を検出するための方法およびその方法を実装するための装置
【解決手段】本願発明は、界面を形成する共鳴媒質（６１）および非共鳴媒質を含むサンプル（８０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法および装置に関する。本装置は、第１の所定の角振動数ωｐにて励起するためのポンプビームと呼ばれる共鳴媒質の少なくとも１つの第１の励起光ビームの放射源（８０１）と、１以上の前記ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第１の光検出モジュール（８０３）と、１以上の前記入射励起ビームと実質的に同じ位置にて、前記反射された励起ビームが前記横断界面を妨害するように配置された１以上の前記励起ビームの反射手段（８１３）と、１以上の前記反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第２の光検出モジュール（８０６）と、共鳴媒質の振動共鳴もしくは電子共鳴の指標である検出信号の差の計算を含み、前記第１および第２の検出モジュールによって検出された光信号を処理するための処理モジュール（８３０）と、を含む。前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルに入射することにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との横断界面の所定位置にてサンプルを妨害する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、共鳴非線形光信号を検出するための方法およびその方法を実装するための装置に関する。本願発明は、特にＣＡＲＳ散乱信号の検出に適用できる。
【背景技術】
【０００２】
すべての化学結合は、それらに固有の振動数を有する。光と物質の相互作用を使用することによって、これらの分子振動に関する情報の取得を目指す方法は、振動感受性の光学技術と呼ばれる。これらの技術のうち最もよく知られているのは、赤外（ＩＲ）分光法である。赤外分光法は、サンプル中に存在する化学結合に特異的な吸収線を観察する。１９２８年に発見されたラマン散乱（この効果を発見した物理学者であるチャンドラシェーカル・ヴェンカタ・ラーマンの名前に由来する）は、使用される可視光線を、光線と相互作用する分子の振動スペクトルに接近させることを可能にする。ラマン散乱では、分子に入射する角振動数ωｐのポンプ波が、ストークス波と呼ばれる角振動数ωｓの波（図１（Ａ））および抗ストークス波と呼ばれる角振動数ωＡＳの波（図１（Ｂ））の中へと非弾性的に散乱される。生成された波とポンプ波との間の振動数の差は、ωｐ−ωｓ＝ωａｓ−ωｐ＝ΩＲとなるように（角振動数ΩＲの）分子ラマン遷移に依存する。この過程を光子的に見ると、ストークス波および抗ストークス波は、それぞれ基底振動準位および励起振動準位からの吸収に相当する。励起振動準位（Ｂ）から抗ストークス波を生成する過程は、ストークス波を生成する過程よりもずっと起こりにくい。ストークス波を生成する過程は、自発的ラマン分光法において実際に観察される唯一の過程である。ストークス波のスペクトル分布の詳細な研究によって、サンプル中に存在する化学結合の密度に関する情報が生み出される。この非弾性散乱の自発的過程は、蛍光発光に比べて非常に非効率である（１０−１６ｃｍ２／分子に達するフルオロフォア１光子の吸収断面積に対して、ラマン断面積は１０−３０ｃｍ２／分子のオーダーである）。
【０００３】
ＣＡＲＳ（コヒーレント抗ストークスラマン散乱）ラマン分光法は、４つの波を混合する過程であって、サンプル中に存在する振動性結合を検出することができる。この過程は、たとえばＲ．Ｗ．Ｂｏｙｄの非線形光学（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ボストン、１９９２年）に記載されている。本方法は、角振動数ωｐおよびωｓ（または振動数νｐおよびνｓ）の２つのレーザパルスを送出することを含む。この方法の角振動数差は、解析中の振動準位における角振動数Ωに等しい。ωｐ−ωｓ＝Ωというこの共鳴の形態において、角振動数Ωの振動準位は活性化された状態で存在しており、角振動数ωｐのビームを角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのビームへと非弾性的に散乱させることが可能であろう（図２（Ａ））。この新たな放射ωａｓが存在することは、サンプル中に角振動数Ωにて振動する結合が存在する痕跡（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）である。ＣＡＲＳの第１の実装は、スペクトル的にピコ秒という狭さの２つのパルスをサンプルに向けることを含む。これらのパルスの角振動数差によって、たった１つの特異的な振動性結合を検出することができるだけである。同定を最適にするためには、サンプル中に存在するすべての振動性結合がテストされる。これは「多重ＣＡＲＳ」（たとえばＭ．ＭｕｌｌｅｒおよびＪ．Ｓｃｈｉｎｓの「多重ＣＡＲＳ分光法を用いた脂質膜の熱力学的状態の画像化」（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ１０６巻、３７１５〜３７２３頁（２００２年）を参照）と呼ばれるモードの操作により行われる。ここではスペクトル的に狭いパルスωｐとスペクトル的に広いパルスωｓとがサンプルに向けられる（図２（Ｂ））。したがって、サンプル中に存在するすべての振動準位Ωｉを検出することができ、生じた信号ωａｓのスペクトルを得ることができる。技術的な観点から、狭スペクトルはたとえばピコ秒のレーザから生じ、広域スペクトルはたとえばフェムト秒のレーザ、または超連続体（ＳＣ）を生み出すフォトニック結晶ファイバーから生じる。
【０００４】
図３（Ａ）には、共鳴ＣＡＲＳ散乱の過程が説明されている。共鳴ＣＡＲＳ散乱は、特定される分子の痕跡に接近するために使用される。しかし、図３（Ｂ）に示された非共鳴ＣＡＲＳ寄与が存在する。非共鳴ＣＡＲＳ寄与はサンプルの電子的寄与から生じる。この非共鳴寄与は、様々な化学結合を含むサンプルに対してＣＡＲＳ分光法が実行される場合に重要となりうる。
【０００５】
Ｄ．Ｇａｃｈｅｔらによる「ノイズのないコヒーレント抗ストークスラマン分光法に対する焦点場（Ｆｏｃｕｓｅｄ ｆｉｅｌｄ）の対称性」（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ａ７７巻（２００８年））という論文には、原法が示されている。この方法は、非共鳴寄与を除去することを可能にする。図４〜６は本方法を説明する。本方法の特徴は、共鳴媒質（ｍｅｄｉｕｍ）（図４（Ａ）（Ｂ）の参照数字４１）と非共鳴媒質（図４（Ａ）（Ｂ）の参照数字４２）との間の横断界面４３に関して、物体とその鏡像との間の差動的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ＣＡＲＳ画像を生成することにある。三次非線形感受率は、共鳴媒質４１において共鳴項χ（３）１Ｒおよび非共鳴項χ（３）１ＮＲによって規定される。非共鳴媒質４２では、三次非線形感受率は非共鳴項χ（３）２ＮＲによって規定される。図４（Ａ）（Ｂ）は、共鳴媒質と非共鳴媒質との横断界面４３に位置する能動（ａｃｔｉｖｅ）ＣＡＲＳ体（ｖｏｌｕｍｅ）４５（それぞれ振動数ωｐとωｓのポンプビームとストークスビームの焦点）を示す。２つの状況が想定される。つまり、ポンプビームとストークスビームが非共鳴媒質側にて入射するケースαと、ポンプビームとストークスビームが共鳴媒質側にて入射するケースβである。この論文で実証されているのは、ケースαとケースβで得られたＣＡＲＳ信号間の差が共鳴媒質の共鳴寄与のみを含むということである。図５は、図４（Ａ）（Ｂ）に示すように横断界面に焦点が合わせられたポンプビームとストークスビームのベクトル特性を考慮に入れた数値計算の結果を示す。この解析の特徴は、問題α（Ｉα（Ｆｗｄ））およびβ（Ｉβ（Ｆｗｄ））にて放射されたＣＡＲＳ信号の差ΔＩＦｗｄを、標準化ラマン偏移ζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γ（式中、Γは研究された振動線の分光幅である）の関数として研究する点にある。差ΔＩＦｗｄはχ（３）１Ｒの虚数部に厳密に従うことが実証されている。χ（３）１Ｒは中央値１のラマンスペクトルであることが知られている。本方法の実験実装が図６（Ｂ）に示されている。実験結果が図６（Ａ）に示されている。図６（Ｂ）は、２つのスライドガラス６２，６３の間におけるＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）の層６１から構成されたサンプルを表す。ケースαは、ポンプビームとストークスビームとがガラス−ＤＭＦ界面（６２と６１の間の界面）に焦点を合わせられた場合に相当する。一方、ケースβは、励起ビームがＤＭＦ−ガラス界面（６１と６３の間の界面）で焦点を合わせられた場合に相当する。図６（Ａ）では、それぞれラマン偏移の関数として、曲線Ｃ１は（励起ビームが共鳴媒質中に焦点を合わせられた場合に）ＤＭＦ単独のＣＡＲ強度を示す。曲線Ｃ２は強度Ｉα（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｃ３は強度Ｉβ（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｃ４は差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ΔＩＦｗｄを示す。曲線Ｃ５はラマンスペクトルを示す。理論的に実証されるように、本方法は曲線Ｃ１で表されるＣＡＲＳ散乱信号のノイズとなる非共鳴成分を除去することを可能にするようである。
【０００６】
しかし、この方法には多くの欠点がある。特に、一方では共鳴／非共鳴界面に他方では非共鳴／共鳴界面に接近する必要があるために、使用が図６（Ｂ）またはこれとは逆のサンプルなどの対称なサンプルに限られる。これはこれらの特性をほとんど有さない生物学的サンプルの場合に制限となる。さらに、分光法への応用は可能となるものの、本方法は顕微鏡用途には制限がある。
【０００７】
本願発明は、従来技術で説明された横断界面検出の原理に基づいて、共鳴非線形光信号を検出するための新たな装置を提案する。しかし、本装置は、分光法用途および顕微鏡用途の両方に対して、共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を有するあらゆるサンプルに対して用いられてもよい。
【発明の概要】
【０００８】
第１の態様によると、本願発明は、界面を形成する共鳴媒質および非共鳴媒質を含むタイプのサンプル中に誘導された、共鳴非線形光信号を検出するための装置に関する。本装置は、所定タイプのサンプルの共鳴媒質を励起するための第１の所定の角振動数ωｐにおけるポンプビームと呼ばれる少なくとも１つの第１の励起光ビームの放射源と、前記入射ポンプビームとサンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質間の軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第１の光モジュールと、前記入射ポンプビームと実質的に同じ位置にて、前記反射ポンプビームが前記横断界面を妨害するように配置された前記ポンプビームの反射手段と、前記反射ポンプビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第２の光モジュールと、共鳴媒質の振動共鳴もしくは電子共鳴の指標である検出信号の差の計算を含む、前記第１および第２の検出モジュールによって検出された光信号処理モジュールと、を含む。
【０００９】
ある変形態様によると、放射源は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームの放射を可能とし、前記ポンプビームおよびストークスビームの相互作用から生じた非線形光信号は、角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、第１および第２の検出モジュールにより検出された信号の差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である。
【００１０】
別の変形態様によると、本願発明の装置は、入射励起ビームの焦点を共通の焦点体（ｆｏｃａｌ ｖｏｌｕｍｅ）中に合せることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の前記界面を妨害することを可能にするための焦点レンズと、入射ビームに焦点を合せる焦点レンズと同一のレンズであって、入射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるための集光レンズと、を含む。前記集光レンズは、反射励起ビームの焦点を合せるためのレンズを形成する。入射ビームの焦点を合わせるための焦点レンズは、反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるためのレンズを形成する。
【００１１】
別の変形態様によると、光検出モジュールのそれぞれは、画像記録装置を含み、非線形光信号は、光軸に対してそれぞれ対称な方向へと、光検出モジュールのそれぞれに集められることによって、各信号対（ｃｏｕｐｌｅ）に対して生じた差が検出される。
【００１２】
別の変形態様によると、励起ビームの角度スキャンを提供する装置によって、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の異なる位置にて、励起ビームがサンプルを妨害することを可能とする。
【００１３】
別の変形態様によると、放射源が少なくとも１つの可変波長励起ビームを放射することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることを可能にする。
【００１４】
第２の態様によると、本願発明は、サンプル中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法に関する。サンプルは、界面を形成する共鳴媒質と非共鳴媒質とを含む。本方法は、ポンプビームと呼ばれる共鳴媒質を励起させるための少なくとも１つの第１の光線を、第１の所定の角振動数ωｐにて放射するステップと、１つ以上の前記ビームとサンプルとの相互作用から生じた第１の非線形光信号を検出するステップと、１つ以上の前記励起ビームを反射することにより、反射した１つ以上の前記励起ビームが１つ以上の入射励起ビームと実質的に同じ位置にて前記横断界面を妨害するステップと、１つ以上の前記反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた第２の非線形光信号を検出するステップと、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である検出信号間の差を計算することを含む、検出された第１の光信号および第２の光信号を処理するステップと、を含む。前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルへ入射されることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の横断界面の所定位置にてサンプルを妨害する。
【００１５】
ある変形態様によると、本方法は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームを放射するステップを含む。前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号である。第１の検出信号と第２の検出信号との差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である。
【００１６】
別の変形態様によると、前記第１および第２の非線形光信号は、入射励起ビームの光軸に関して対称な方向にそれぞれ検出されることによって、各信号対に対して生じた差が検出される。
【００１７】
別の態様によると、１以上の励起ビームが、角度スキャンを受けることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の様々な位置にてサンプルを妨害する。
【００１８】
別の変形態様によると、少なくとも１つの励起ビームが可変の放射波長を有することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることが可能となる。
【００１９】
本願発明の他の利点および特徴は、以下の図を用いて説明された記載を読むことによって明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（説明済）図１（Ａ）と図１（Ｂ）は、ラマン散乱過程におけるストークス放射および抗ストークス放射の原理を示す。
【図２】（説明済）図２（Ａ）と図２（Ｂ）は、２つの異なるモードにおけるＣＡＲＳ放射の原理を示す。
【図３】（説明済）図３（Ａ）と図３（Ｂ）は、共鳴および非共鳴ＣＡＲＳ過程の図である。
【図４】（説明済）図４（Ａ）と図４（Ｂ）は、従来技術に従った方法を実装するためのケースαおよびβの図である。
【図５】（説明済）従来技術に従った方法によって得られた数値シミュレーションの結果である。
【図６】（説明済）図６（Ａ）と図６（Ｂ）は、従来技術に従った方法によって対称なサンプルを用いて得られた実験結果である。
【図７】図７（Ａ）と図７（Ｂ）は、本願発明に従った方法を実装するためのケースαおよびβの図である。
【図８】図８（Ａ）と図８（Ｂ）は、本願発明に従った方法を実装するための実験設定の例である。
【図９】図８（Ｂ）に示すタイプのサンプルを用いて得られた実験結果である。
【図１０】図１０（Ａ）〜図１０（Ｄ）は、本願発明に従った方法によって、屈折率ｎ＝１．３３の水溶液中に浸された直径３μｍのポリスチレンビーズを用いた数値シミュレーションによって得られた画像である。
【図１１】本願発明のある変形態様に従った方法を実装するための実験設定の例である。
【図１２】図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）は、図１１の例における方法を実装するためのケースαおよびケースβの図である。
【図１３】共鳴媒質と非共鳴媒質との間の軸方向界面において、ＣＡＲＳ散乱を実装するための幾何学的条件を示す略図である。
【図１４】図１４（Ａ）〜図１４（Ｅ）は、励起ビームの焦点の相対位置の関数として、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の軸方向界面とともにＣＡＲＳ散乱信号のずれを示す図である。
【図１５】図１５（Ａ）〜図１５（Ｃ）は、数値シミュレーションにより得られた曲線である。図１５（Ａ）は、パラメータζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γ（標準化ラマン偏移）の関数としてＣＡＲＳ散乱信号における偏移を説明する。図１５（Ｂ）は、パラメータζの関数として、空間（ｋｘ＞０）および空間（ｋｘ＜０）にてそれぞれ計算された光強度および光強度差を表す。図１５（Ｃ）は、軸方向界面に対する励起ビームの焦点のＸ座標上の位置の関数として、空間（ｋｘ＞０）および空間（ｋｘ＜０）にてそれぞれ計算された光強度および光強度差を表す。
【図１６】本願発明に従ったＣＡＲＳ検出を実装するための３つの可能なモダリティを説明する図である。
【００２１】
（詳細な説明）
図７（Ａ）および図７（Ｂ）は、２つの図を用いてＣＡＲＳ散乱のケースにおける本願発明に従った検出方法の原理を説明する。本方法によると、同一直線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）にある角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークビームが横断界面７０、つまり、入射ビームの軸（光軸）と垂直な平面に沿って非ゼロ成分を有する非共鳴媒質と共鳴媒質との間の界面を妨害する。一般に、これら２つのビームの焦点が合わせられる。７１は、横断界面７０を妨害する共通の焦点体を示す。本願発明によると、励起ビームが第１の方向に界面を横断し（ケースαと呼ぶ）、次に、同じ界面を実質的に同じ位置ではあるが反対方向に妨害するように、サンプルに向かって反射する（ケースβ）。図７に示す例では、励起ビームが最初に非共鳴媒質／共鳴媒質の方向（図７（Ａ）：ケースα）、次に共鳴媒質／非共鳴媒質の方向（図７（Ｂ）：ケースβ）へと界面を横切る。αおよびβの２つのケースでは、ＣＡＲＳ散乱信号強度Ｉα（Ｆｗｄ）およびＩβ（Ｆｗｄ）がそれぞれ測定され、これらの差ΔＩＦｗｄが計算される。校正後、信号が得られる。出願人が実証した信号は、共鳴媒質の三次非線形感受率の虚数部Ｉｍ［χ（３）１Ｒ］に比例する。本願発明によると、ケースαとβでサンプルを励起するためにポンプビームとストークスビームの単一パルスが使用される。これにより、図４〜６に示した従来技術の方法と比較して、ＳＮ比を増大させることが可能となる。
【００２２】
物体および光軸に垂直な平面に関するその物体の鏡像により生成されたＣＡＲＳ信号の差を用いるため、本願発明による方法を以下の説明ではＤｚ−ＣＡＲＳと呼ぶ（Ｄｚは、Ｚ軸の対称性における差動的な（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）画像化を意味する）。
【００２３】
図８（Ａ）は、本願発明による検出方法を実装するための例示的な装置を説明する。検出装置８００は通常、同一直線上にある角振動数ωｐの第１の励起ビーム（ポンプビーム）と角振動数ωｓの第２の励起ビーム（ストークスビーム）との放射を可能にするレーザシステム８０１を含む。２つの励起ビームは、矢印８０２によって表されている。装置８００はまた、反射シート８０４などの光学部材を含む。これにより、２つの励起ビームを本装置の第１の光検出モジュールへと向けることを可能にする。第１の光検出モジュールには、主方向Ｚに従って、一般に参照数字８０３が割り当てられる。
【００２４】
レーザシステム８０１は、たとえばいわゆる２色用途において、２つのスペクトル的に狭く調節可能なレーザ光源８０８を含む。レーザ光源８０８は、たとえば６９０〜１０００ｎｍの波長にて放射され、ポンプレーザ８０９によって送出されるチタン：サファイア型、または５３２ｎｍにて放射されるネオジム：ＹＶＯ４型である。調節可能なレーザは、たとえば通常３ピコ秒のオーダーのピコ秒のパルスを放射することにより、角振動数ωｐ（通常は波長７３０ｎｍ）のポンプ励起ビームおよび角振動数ωｓのストークス励起ビームを形成する。パルスピッカー（ｐｉｃｋｅｒ）８１０が使用されることにより、ピークパルス力を減らすことなく、ポンプ励起レーザおよびプローブ励起レーザのパルス反復振動数を減少させてもよい。調節可能なストークスビームまたはポンプビームを用いることにより、特に抗ストークス放射スペクトルを、共鳴媒質のラマンスペクトルを決定することを目的とした分光法における用途に対して、スキャンすることができる。たとえば光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）、光学的パラメトリック増幅器（ＯＰＡ）、ピコ秒ネオジム：ガラス発振器、イッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーなどの他の調整可能なレーザ光源が使用されてもよい。また光源は、観察されるラマン線の分光幅に応じて、ナノ秒またはフェムト秒のレーザ光源であってもよい。しかし、ナノ秒パルスはスペクトル的には非常に良いが、ピコ秒パルスよりも低い最大出力しか有さない。さらに、ナノ秒パルスに関連した熱的効果は、生物学的サンプルによりダメージを与えうる。未加工のフェムト秒パルスは一般に、スペクトルが広すぎる。凝縮相（固体または液体）では線幅が約１０〜２０ｃｍ−１である。これはピコ秒パルスの使用に対応する。
【００２５】
図８（Ａ）に示す例では、第１の光検出モジュール８０３は、図８（Ｂ）に示すサンプル８０５を解析するための共通の焦点体において、ポンプビームおよびストークスビームに焦点を合せるための焦点レンズ８０７を含む。焦点レンズの使用は、顕微鏡用途に特に好適である。しかし、特に薄いサンプルを研究する場合、ＣＡＲＳ信号の放射が焦点ビームを用いて機能するためには、焦点レンズは必須ではない。この例では、図６（Ｂ）に示す２つのスライドガラス６２，６３間のＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）の層６１の例のように、サンプルに焦点が合わせられる。第１の光検出モジュール８０３は同様に、放射された非線形光信号（この例ではＣＡＲＳ散乱信号）の集光を可能にする集光レンズ８１１、および検出器８１６を含む。検出器８１６は、たとえば集光レンズ８１８および残存励起ビームをカットするフィルタ８１２に続くアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、高速光ダイオード（ＰＩＮ）、または光電子増倍管（ＰＭＴ）型の点検出器である。
【００２６】
この例では、所定のサンプルに対するケースαからケースβへの移行は、鏡８１３によって図８（Ａ）に示すように、ポンプビームおよびストークスビームを戻すことにより行われる。鏡８１３の反射係数は、ポンプビームおよびストークスビームを反射して、励起ビームとサンプルとの相互作用から生じたＣＡＲＳ散乱信号を伝達できるように、一方では励起ビームの波長に他方ではＣＡＲＳ散乱信号の波長に好適である。この状況では、入射パルスの第１の経路中に、第１のＣＡＲＳ信号が発射され、検出器８１６によって集められる。つまり、これはケースαに関するため、集められた信号はＩα（Ｆｗｄ）である。ポンプパルスおよびストークスパルスが次に鏡によって反射されることにより、サンプルへと戻る。これは次に、図８（Ａ）で全体として参照数字８０６が割り当てられた第２の光検出モジュールにおいて、ケースβにあるとみなされる。第２の光検出モジュール８０６は、第１の光検出モジュールと共通してレンズ８１１およびレンズ８０７を含む。しかし、レンズ８１１は鏡８１３により戻される励起ビームに対する焦点レンズとして機能する。また、レンズ８０７は反射励起ビームとサンプル８０５との相互作用から生じた非線形光信号に対する集光レンズとして機能する。第２の光モジュール８０６は、検出器８１７をさらに含む。検出器８１７は、たとえば検出器８１６と同じタイプの点検出器であって、残存励起ビームをカットするための集光レンズ８１９およびフィルタ８２０に続く。次に、検出器８１７によってその後で収集された信号はＩβ（Ｆｗｄ）である。信号の差Ｉα（Ｆｗｄ）−Ｉβ（Ｆｗｄ）は、リアルタイムに操作される。出願人は、この差が共鳴媒質のラマンスペクトルに比例することを、図８（Ａ）で８３０と名付けられた処理装置を用いて示した。反射シート８０４は、２色性シートであることが有利である。これにより、レーザ光源８０１により放射された励起ビームをサンプル８０５に向かって反射させることが可能となる（ケースα）。一方、ケースβではＣＡＲＳ散乱信号が伝達される。焦点レンズ８０７および集光レンズ８１１は同一であることが有利である。これにより、ケースαおよびβにおいて対称な配置が可能となる。実際には、検出器８１６，８１７は測定に先立って校正される。たとえば、この校正は溶媒のみを含むサンプルに対して行われる。
【００２７】
図８（Ｂ）に見られるように、本願発明による装置は、同じポンプパルスおよびストロークパルスが、それぞれおケースαおよびβの場合に横断界面の同じ位置にてサンプルを妨害することを可能にする。本方法はしたがって、単に対称または可逆的なサンプルではなく、共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を呈する任意のタイプのサンプルに対して使用することができる。
【００２８】
ある例によると、装置８００はまた、サンプルのＸＹ平面中に励起ビームスキャン装置を含む（図示せず）。このスキャン装置は、サンプルを形成する共鳴媒質および非共鳴媒質の横断界面に対して励起ビームの焦点を調節するために、分光法用途において、つまり画像化用途においても有用であってもよい。このスキャン装置は、サンプルの置換を可能とする装置、または好ましくは励起ビームスキャン装置として機能してもよい。励起ビームを逆平行方向に反射できるように、球状励起ビーム−反射鏡８１３を使用できることが有利である。これにより、反射励起ビーム（ケースβ）が入射ビーム（ケースα）と同じ位置にてサンプルを妨害することができる。
【００２９】
図９は、図８（Ａ）の装置および図８（Ｂ）に示すタイプのサンプルを用いて得られた実験結果を示す。ここでは、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）の微細層が、（ここでは非共鳴媒質として機能する）２つのスライドガラス間で、共鳴媒質として機能する。ポンプビームの波長は７３０ｎｍである。ストークス励起ビームの波長は、約８１４ｎｍである。レンズ８０７，８１１の空気中の開口数は０．６である。図９では、それぞれラマン偏移の関数として、曲線Ｄ１はＤＭＦ中で測定されたＣＡＲＳ散乱信号を示す。曲線Ｄ２は、ケースα（図６（Ｂ））にて測定された強度Ｉα（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｄ３は、ケースβにて測定された強度Ｉβ（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｄ４は、差ΔＩＦｗｄを示す。曲線Ｄ５（点線）は、ラマンスペクトルを示す。曲線Ｄ６は、ガラス上で測定されたＣＡＲＳ散乱信号を示す。曲線Ｄ１は、共鳴媒質の非共鳴寄与による歪み効果を明確に示す。一方、差ΔＩＦｗｄはＤＭＦのラマンスペクトル（点線）上に正確に重畳されている。したがって、Ｄｚ−ＣＡＲＳが、共鳴媒質の非共鳴部分によるあらゆる歪みなく、共鳴媒質のラマンスペクトルを抽出する能力を有することが理解されるであろう。
【００３０】
この実験結果は、図６（Ａ）に示されるように、従来技術との比較によってはっきりと改善された正確性をもって、ノイズのない非共鳴ＣＡＲＳ分光法に対するＤｚ−ＣＡＲＳ法の関連性を実証する。さらに、本願発明による方法によって、作業中の界面における位置を完全に同定すること、およびケースαおよびβのように界面の同じ位置にて同一の励起パルスの焦点を合せること、特に顕微鏡に用いることが可能となる。
【００３１】
図１０（Ａ）〜（Ｄ）は、別のタイプのサンプルを用いて得られた数値シミュレーションを示す。この画像は、水性溶媒中にサンプルとして直径３μｍのビーズを用いることによって計算される（ポンプ波長：７３０ｎｍ、ストークス波長：８１４ｎｍ、水中における励起レンズの開口数：１．２、水中における集光レンズの開口数：１．２）。この画像は、各ケースでは励起ビームの入射方向を含む縦断面に対応するビーズのＺＸ平面にて計算される。図１０（Ａ）および（Ｂ）は、従来の検出におけるビーズの画像を表す。つまり、ケースαにおけるＣＡＲＳ散乱信号のみが示されている。共鳴しているときには（図１０（Ａ））、信号は共鳴していないとき（図１０（Ｂ））よりも強い。しかし、ビーズおよびその環境の非共鳴寄与のために、コントラスト差は弱い。図１０（Ｃ）および図１０（Ｄ）は、共鳴しているビーズと共鳴していないビーズの画像を示す。しかし、本願発明によるＤｚ−ＣＡＲＳ法を用いて、つまり図８（Ａ）に示すタイプの設定を用いてケースαおよびβにおいてＣＡＲＳ散乱信号を減算することによって、これらは計算されている。共鳴していないとき（図１０（Ｄ））、コントラストは０である。それは、非共鳴寄与のみを含む信号の差が相殺されるからである。一方、図１０（Ｃ）の共鳴しているときの計算では、横断界面におけるコントラストは最大である。これらの結果によって、顕微鏡の構成においてＤｚ−ＣＡＲＳの実現可能性が確立される。
【００３２】
図１１は、本願発明の変形態様に従った検出を実装するための例示的な実験設定を示す。この設定は、図８（Ａ）の設定と実質的に同一である。しかし、点検出器８１６，８１７が、たとえばＣＣＤ型またはＣＭＯＳ型のマトリックス検出器９０１，９０２に置き換えられている。この変形態様によると、検出されたレンズ開口数に含まれる波動ベクトルｋのすべての空間において、それぞれケースαおよびβに対して統合されたＣＡＲＳ散乱信号の差は、上述の通りもはや検出されない。代わりに、サンプルに入射する励起ビームの光軸に関して対称な方向におけるＣＡＲＳ散乱信号の差が測定される。信号は初めケースαにおいて、次にケースβにおいて検出される。
【００３３】
したがって、図１２（Ａ）に明らかなように、ケースαでは、主軸ｚに垂直なＸＹ投影面において座標（ｋｘ，ｋｙ）の波動ベクトルｋによって表される方向にＣＡＲＳ散乱信号が測定される。またケースβでは、ＸＹ投影面において座標（−ｋｘ，−ｋｙ）の波動ベクトルｋ″によって表される方向にＣＡＲＳ散乱信号が測定される。ここでは、上述のとおり、ケースαは入射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じたＣＡＲＳ散乱信号の生成に対応する。一方、ケースβは反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じたＣＡＲＳ散乱信号の生成に対応する。
【００３４】
サンプルの横断界面にて検出を可能とすることに加えて、本方法はサンプルの軸方向界面にて検出を可能とすること、つまり入射励起ビームの光軸に沿って非ゼロ成分を有することを、出願人は実際に理論的かつ実験的に示した。本出願では以下、本方法をＤ−ＣＡＲＳと呼ぶ。
【００３５】
Ｄ−ＣＡＲＳに関する理解を向上させるために、図１３〜１５では軸方向界面にて検出するためのＤｋ−ＣＡＲＳと呼ばれる以下のアプローチを示す（ＤｋはＫ−空間における差動的な画像化を意味する）。
【００３６】
図１３は、たとえば解析される媒質を含む媒質、つまり生物学的に興味のある媒質である共鳴媒質１３１、および通常は溶媒を含む媒質である非共鳴媒質１３２を含むサンプルを示す。三次非線形感受率は、共鳴媒質１３１では共鳴項χ（３）１Ｒおよび非共鳴項χ（３）１ＮＲによって定義される。非共鳴媒質１３２では、三次非線形感受率は非共鳴項χ（３）２ＮＲによって定義される。本願発明による方法のこの態様によると、同一直線上にある角振動数ωｐのポンプ励起ビームと角振動数ωｓのプローブ励起ビームは、焦点体１３５にてサンプルに入射し、サンプルの軸方向界面１３３を妨害する。本方法のこの態様によると、以下において詳細に説明するように、波動ベクトルｋの空間、つまりＣＡＲＳプロセスにより放射された信号の放射方向の空間における、界面の両側に対する非線型光ビームの光強度が解析される。この強度は、それぞれ界面の両側にて、ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）およびＩＦｗｄ（ベクトルｋ´）として図１３に示されている。「Ｆｗｄ」との省略形は、後ろ方向に散乱された「Ｅｐｉ」と呼ばれる信号の対語として、前方ＣＡＲＳ散乱信号を表す。
【００３７】
実際に、出願人は軸方向界面においてＣＡＲＳ過程によって放射された信号は共鳴によってずれるということを実験的および理論的に実証した。
【００３８】
図１４（Ａ）〜（Ｅ）は、ＣＡＲＳ散乱信号のずれを、界面に入射するポンプビームおよびストークスビームの相対位置の関数として、一連の略図によって示す。図１４（Ａ）〜（Ｅ）は、能動ＣＡＲＳ体１３５（ポンプビームおよびストークスビームの焦点）を示す。能動ＣＡＲＳ体１３５は、ＣＡＲＳ対象物１４０の中を通って移動される（各図は対象物中の能動体（ａｃｔｉｖｅ ｖｏｌｕｍｅ）の異なる位置に対応する）。ＣＡＲＳ対象物は、その対象物の周囲の媒質が共鳴していないと見なされる場合に、共鳴していると見なされる（以下の記載では、このＣＡＲＳ対象物を「溶媒」と呼ぶ）。ＣＡＲＳ対象物と溶媒との間の界面では、ＣＡＲＳ散乱信号はずれ（または偏向）の影響を受けるようである。出願人は、このずれは純粋にＣＡＲＳ対象物と溶媒との干渉過程から生じ、決して屈折の影響によるものではないことを実証している。２つの実例１（図１４（Ａ）および（Ｅ））では、溶媒中でＣＡＲＳ体に焦点が合わせられる。ＣＡＲＳ散乱信号は標準的な方向（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に平行である。矢印１４１により示される）に放射される。実例２（図１４（Ｂ））では、ＣＡＲＳ体はＣＡＲＳ対象物と溶媒との間の界面に焦点が合わせられる。次に、（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に対して）正の角度αにてＣＡＲＳ散乱信号が放射されることにより、波動ベクトルｋの空間において、（ｋｘ＞０）により規定される方向にビームをずれさせる。実例３（図１４（Ｃ））では、ＣＡＲＳ体がＣＡＲＳ対象物中の中心に置かれる。その結果ＣＡＲＳ信号は強くなり、標準的な方向（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に平行）に向けられる。次に以下の実例（図１４（Ｄ）の実例４および図１４（Ｅ）の実例１）において似た状況が見られる。しかし、実例４ではαが負で、（ｋｘ＜０）によって規定される方向へのずれに対応することに留意することは重要である。出願人は、標準化パラメータζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γ（式中、Γは実験された振動線の分光幅である）の関数としての角αの変化は、媒質１を記述するテンソルχ（３）１＝χ（３）１Ｒ＋χ（３）１ＮＲの位相に従うことを、理論的かつ実験的に実証している。出願人はまた、対称散乱方向にてＣＡＲＳ信号を解析することにより、ラマンスペクトルが決定可能であることを実証している。
【００３９】
図１５（Ａ）は、共鳴媒質１と非共鳴媒質２との間の軸方向界面（図１３）に焦点が合わせられたポンプビームおよびストークスビームのベクトル特性を考慮した厳密な数値計算の結果を示す。この解析の目的は、波動ベクトルｋの空間において、標準化ラマン偏移ζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γの関数として放射されたＣＡＲＳ散乱信号のずれを研究することにある。共鳴のない状態（ζ＝?１０）では、ビームが中心に向けられる。一方、共鳴のある状態（ζ＝０）では、角変位がはっきりと現れる。
【００４０】
図１５（Ｂ）および（Ｃ）は、数値シミュレーションを示す。ここではＣＡＲＳ散乱信号がそれぞれ半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）に統合される。次に、こうして統合された信号の差が決定される。図１５（Ｂ）は、ポンプビームおよびストークスビームが界面（ｘ＝０）に焦点を合わせられた場合の半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）に統合されたＣＡＲＳスペクトルを、これらの差ΔＩとともに示す。この差はＩｍ［χ（３）１Ｒ］によって与えられるラマンスペクトルに正確に従う。このことは非共鳴ノイズを有さないＣＡＲＳ分光法に対するＤｋ−ＣＡＲＳ法が適切であることを示す。したがって、たとえばストークスビームの振動数を変化させることによって、共鳴媒質のラマンスペクトルを決定することが可能である。図１５（Ｃ）は、界面に対してポンプビームおよびストークスビームの焦点の関数として半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）に積分されたＣＡＲＳ信号を示す。これらの差は、界面の近傍にて一意的にゼロではない。したがって、界面の近傍にて背景ノイズのない非共鳴ＣＡＲＳ画像を得ることができる。
【００４１】
したがって図１６（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｄｚ−ＣＡＲＳ法およびＤｋ−ＣＡＲＳ法を組み合わせたＤ−ＣＡＲＳ顕微鏡用の３つの可能な検出モダリティを示す。各検出モダリティに対して、数値シミュレーションは水性溶媒中で直径３μｍのビーズに対して得られた画像を示す（ポンプ波長：７３０ｎｍ、ストークス波長：８１４ｎｍ、励起レンズの水中の開口数：１．２、集光レンズの水中の開口数：１．２）。図１６（Ａ）は、Ｘ軸に垂直な界面およびＺ軸に垂直な界面における検出を可能にするＸＺ検出モダリティを示す。このために、ＣＡＲＳ信号を空間（ｋｘ＞０）（ケースα、図７（Ａ））および空間（ｋｘ＜０）（ケースβ、図７（Ｂ））にて積分することにより、それぞれケースαおよびβにおけるＣＡＲＳ散乱信号の差が計算される。これは励起ビームの方向の信号として選択された参照系である。したがって、たとえばポンプビームおよびストークスビームの焦点の相対位置を変えることにより、ビーズの赤道面において図１６（Ａ）の画像が得られる。図１６（Ｂ）は、Ｙ軸に垂直な界面およびＺ軸に垂直な界面における検出を可能にするＹＺ検出モダリティを示す。この例では、異なる位置に対して、空間（ｋｙ＞０）（ケースα、図７（Ａ））および空間（ｋｙ＜０）（ケースβ、図７（Ｂ））で積分された光強度差が計算される。図１６（Ｃ）は、検出モダリティＸＹＺを示す。この画像は、それぞれおケースαおよびβにおいて、２つの逆方向のベクトルｋ（ｋｘ，ｋｙ，ｋｚ）およびベクトルｋ″（−ｋｘ，−ｋｙ，ｋｚ）において測定された光強度差Ｉα（ｋｘ，ｋｙ）およびＩβ（−ｋｘ，−ｋｙ）において２×２の差をとることにより計算される。これらの方向は、角円錐（ａｎｇｕｌａｒ ｃｏｎｅ）に含まれる。角円錐の開口角は、ＣＡＲＳ散乱信号を集めるための開口数（たとえば水中では１．２である）によって規定される。また、波動ベクトルｋおよびｋ″の座標は、それぞれケースαおよびβに特異的な励起ビームを参照して表される。
【００４２】
図１１に示す例では、特に顕微鏡用途に対して、励起ビームを角度スキャンするための手段を提供することを可能とすることが有利であろう。図８（Ａ）に示す装置の例のように、励起ビーム８１３を反射するための球状鏡８１３を選択することが可能であろう。さらに、ケースαおよびβのそれぞれにおいてカメラに集中された励起ビームの入射方向を保つために、レンズ８１１，８０７の射出瞳（ｅｘｉｔ ｐｕｐｉｌｓ）においてそれぞれカメラ９０１，９０２を配置することが有利である。αおよびβの各ケースにおいて各スキャン角に対して励起ビームの方向を特定するために、溶液中におけるカメラの校正も可能である。励起ビームに対して、ＣＡＲＳ散乱信号のずれが測定される。
【００４３】
２つのスペクトル的に狭いレーザ光源を用いて、２色用途に関する図８（Ａ）および図１１の実装例によって、Ｄｚ−ＣＡＲＳまたはＤ−ＣＡＲＳの検出を説明してきた。多重用途（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）と呼ばれる用途では、たとえばフェムト秒パルスまたは光ファイバーもしくは他の分散性媒質により生成された超連続体によって生成されたストークスビームのスペクトル的に広い放射源が選択可能である。ポンプ信号は、スペクトル的に狭いままである。この用途では、たとえば２つのケースαおよびβにて検出された２つの信号が入力されるＣＣＤカメラを備えた２つのスリット分光計または単一の分光計を用いて、単一パルスにおけるラマンスペクトルを得ることが可能となるであろう。この用途では、各ケース（αまたはβ）においてスペクトルを得て、これらの差を生じさせることが問題である。
【００４４】
３色用途と呼ばれる用途では、関連する振動数ω１、ω２およびω３の３つの波長が使用されることにより、角振動数ω１−ω２＋ω３にてＣＡＲＳ信号が生成される。ケースαまたはβにおいて角振動数ω１−ω２＋ω３にて信号を検出してこれらの差を算出することにより、ＣＡＲＳ信号はノイズのない非共鳴な状態にされてもよい。
【００４５】
ＣＡＲＳ散乱の場合にて検出方法を説明してきたが、この検出方法は、分光法用途および顕微鏡用途の両方に対して、軸方向界面にて検出して共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を明らかにできることによって、他の非線形の２次または３次の処理にも同様に適用される。いずれの場合も、１つ以上の励起ビームの相互作用から生じた非線形光信号の解析が、共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を呈するサンプルを用いて行われる。この空間解析は、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を明らかにすること、または共鳴媒質のスペクトルを特徴づけることを可能にする。
【００４６】
ある例によると、第３の共鳴調波（ｈａｒｍｏｎｉｃ）を生成する処理は、角振動数ωｐの単一のポンプ励起ビームを用いて共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を含むサンプルを励起することによって、共鳴が電子共鳴である場合に使用されうる。たとえば、発振器型のチタン：サファイア、ネオジム：ガラス、またはイッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーのピコ秒またはフェムト秒レーザ光源である。
【００４７】
他の例によると、４波混合処理は、共鳴が電子共鳴である場合に、角振動数ωｐの単一のポンプ励起ビームを用いて、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を含むサンプルを励起することにより使用されうる。たとえば、発振器型のチタン：サファイア、ネオジム：ガラス、またはイッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーのピコ秒またはフェムト秒レーザ光源である。
【００４８】
上述の２つの例は、電子共鳴を取り扱っている。電子共鳴は、原子、分子、半導体の結晶などにおいて見られる。
【００４９】
別の態様によると、第２の共鳴調波は単一のポンプビームを用いて励起されうる。または、振動数の合計がポンプビームおよびプローブビームを用いて作られうる（二次の非線形効果）。
【００５０】
いくつかの詳細で例示的な態様を用いて本願発明を説明したが、本願発明による検出装置および方法は、当業者に明らかな異なる変形例、修正、および改良を含む。そのため、以下の特許請求の範囲に規定されるように、これらの異なる変形例、修正、および改良が本願発明の範囲に含まれることが理解されるであろう。
【図１Ａ−１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、共鳴非線形光信号を検出するための方法およびその方法を実装するための装置に関する。本願発明は、特にＣＡＲＳ散乱信号の検出に適用できる。
【背景技術】
【０００２】
すべての化学結合は、それらに固有の振動数を有する。光と物質の相互作用を使用することによって、これらの分子振動に関する情報の取得を目指す方法は、振動感受性の光学技術と呼ばれる。これらの技術のうち最もよく知られているのは、赤外（ＩＲ）分光法である。赤外分光法は、サンプル中に存在する化学結合に特異的な吸収線を観察する。１９２８年に発見されたラマン散乱（この効果を発見した物理学者であるチャンドラシェーカル・ヴェンカタ・ラーマンの名前に由来する）は、使用される可視光線を、光線と相互作用する分子の振動スペクトルに接近させることを可能にする。ラマン散乱では、分子に入射する角振動数ωｐのポンプ波が、ストークス波と呼ばれる角振動数ωｓの波（図１（Ａ））および抗ストークス波と呼ばれる角振動数ωＡＳの波（図１（Ｂ））の中へと非弾性的に散乱される。生成された波とポンプ波との間の振動数の差は、ωｐ−ωｓ＝ωａｓ−ωｐ＝ΩＲとなるように（角振動数ΩＲの）分子ラマン遷移に依存する。この過程を光子的に見ると、ストークス波および抗ストークス波は、それぞれ基底振動準位および励起振動準位からの吸収に相当する。励起振動準位（Ｂ）から抗ストークス波を生成する過程は、ストークス波を生成する過程よりもずっと起こりにくい。ストークス波を生成する過程は、自発的ラマン分光法において実際に観察される唯一の過程である。ストークス波のスペクトル分布の詳細な研究によって、サンプル中に存在する化学結合の密度に関する情報が生み出される。この非弾性散乱の自発的過程は、蛍光発光に比べて非常に非効率である（１０−１６ｃｍ２／分子に達するフルオロフォア１光子の吸収断面積に対して、ラマン断面積は１０−３０ｃｍ２／分子のオーダーである）。
【０００３】
ＣＡＲＳ（コヒーレント抗ストークスラマン散乱）ラマン分光法は、４つの波を混合する過程であって、サンプル中に存在する振動性結合を検出することができる。この過程は、たとえばＲ．Ｗ．Ｂｏｙｄの非線形光学（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ボストン、１９９２年）に記載されている。本方法は、角振動数ωｐおよびωｓ（または振動数νｐおよびνｓ）の２つのレーザパルスを送出することを含む。この方法の角振動数差は、解析中の振動準位における角振動数Ωに等しい。ωｐ−ωｓ＝Ωというこの共鳴の形態において、角振動数Ωの振動準位は活性化された状態で存在しており、角振動数ωｐのビームを角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのビームへと非弾性的に散乱させることが可能であろう（図２（Ａ））。この新たな放射ωａｓが存在することは、サンプル中に角振動数Ωにて振動する結合が存在する痕跡（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）である。ＣＡＲＳの第１の実装は、スペクトル的にピコ秒という狭さの２つのパルスをサンプルに向けることを含む。これらのパルスの角振動数差によって、たった１つの特異的な振動性結合を検出することができるだけである。同定を最適にするためには、サンプル中に存在するすべての振動性結合がテストされる。これは「多重ＣＡＲＳ」（たとえばＭ．ＭｕｌｌｅｒおよびＪ．Ｓｃｈｉｎｓの「多重ＣＡＲＳ分光法を用いた脂質膜の熱力学的状態の画像化」（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ１０６巻、３７１５〜３７２３頁（２００２年）を参照）と呼ばれるモードの操作により行われる。ここではスペクトル的に狭いパルスωｐとスペクトル的に広いパルスωｓとがサンプルに向けられる（図２（Ｂ））。したがって、サンプル中に存在するすべての振動準位Ωｉを検出することができ、生じた信号ωａｓのスペクトルを得ることができる。技術的な観点から、狭スペクトルはたとえばピコ秒のレーザから生じ、広域スペクトルはたとえばフェムト秒のレーザ、または超連続体（ＳＣ）を生み出すフォトニック結晶ファイバーから生じる。
【０００４】
図３（Ａ）には、共鳴ＣＡＲＳ散乱の過程が説明されている。共鳴ＣＡＲＳ散乱は、特定される分子の痕跡に接近するために使用される。しかし、図３（Ｂ）に示された非共鳴ＣＡＲＳ寄与が存在する。非共鳴ＣＡＲＳ寄与はサンプルの電子的寄与から生じる。この非共鳴寄与は、様々な化学結合を含むサンプルに対してＣＡＲＳ分光法が実行される場合に重要となりうる。
【０００５】
Ｄ．Ｇａｃｈｅｔらによる「ノイズのないコヒーレント抗ストークスラマン分光法に対する焦点場（Ｆｏｃｕｓｅｄ ｆｉｅｌｄ）の対称性」（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ａ７７巻（２００８年））という論文には、原法が示されている。この方法は、非共鳴寄与を除去することを可能にする。図４〜６は本方法を説明する。本方法の特徴は、共鳴媒質（ｍｅｄｉｕｍ）（図４（Ａ）（Ｂ）の参照数字４１）と非共鳴媒質（図４（Ａ）（Ｂ）の参照数字４２）との間の横断界面４３に関して、物体とその鏡像との間の差動的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ＣＡＲＳ画像を生成することにある。三次非線形感受率は、共鳴媒質４１において共鳴項χ（３）１Ｒおよび非共鳴項χ（３）１ＮＲによって規定される。非共鳴媒質４２では、三次非線形感受率は非共鳴項χ（３）２ＮＲによって規定される。図４（Ａ）（Ｂ）は、共鳴媒質と非共鳴媒質との横断界面４３に位置する能動（ａｃｔｉｖｅ）ＣＡＲＳ体（ｖｏｌｕｍｅ）４５（それぞれ振動数ωｐとωｓのポンプビームとストークスビームの焦点）を示す。２つの状況が想定される。つまり、ポンプビームとストークスビームが非共鳴媒質側にて入射するケースαと、ポンプビームとストークスビームが共鳴媒質側にて入射するケースβである。この論文で実証されているのは、ケースαとケースβで得られたＣＡＲＳ信号間の差が共鳴媒質の共鳴寄与のみを含むということである。図５は、図４（Ａ）（Ｂ）に示すように横断界面に焦点が合わせられたポンプビームとストークスビームのベクトル特性を考慮に入れた数値計算の結果を示す。この解析の特徴は、問題α（Ｉα（Ｆｗｄ））およびβ（Ｉβ（Ｆｗｄ））にて放射されたＣＡＲＳ信号の差ΔＩＦｗｄを、標準化ラマン偏移ζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γ（式中、Γは研究された振動線の分光幅である）の関数として研究する点にある。差ΔＩＦｗｄはχ（３）１Ｒの虚数部に厳密に従うことが実証されている。χ（３）１Ｒは中央値１のラマンスペクトルであることが知られている。本方法の実験実装が図６（Ｂ）に示されている。実験結果が図６（Ａ）に示されている。図６（Ｂ）は、２つのスライドガラス６２，６３の間におけるＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）の層６１から構成されたサンプルを表す。ケースαは、ポンプビームとストークスビームとがガラス−ＤＭＦ界面（６２と６１の間の界面）に焦点を合わせられた場合に相当する。一方、ケースβは、励起ビームがＤＭＦ−ガラス界面（６１と６３の間の界面）で焦点を合わせられた場合に相当する。図６（Ａ）では、それぞれラマン偏移の関数として、曲線Ｃ１は（励起ビームが共鳴媒質中に焦点を合わせられた場合に）ＤＭＦ単独のＣＡＲ強度を示す。曲線Ｃ２は強度Ｉα（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｃ３は強度Ｉβ（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｃ４は差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ΔＩＦｗｄを示す。曲線Ｃ５はラマンスペクトルを示す。理論的に実証されるように、本方法は曲線Ｃ１で表されるＣＡＲＳ散乱信号のノイズとなる非共鳴成分を除去することを可能にするようである。
【０００６】
しかし、この方法には多くの欠点がある。特に、一方では共鳴／非共鳴界面に他方では非共鳴／共鳴界面に接近する必要があるために、使用が図６（Ｂ）またはこれとは逆のサンプルなどの対称なサンプルに限られる。これはこれらの特性をほとんど有さない生物学的サンプルの場合に制限となる。さらに、分光法への応用は可能となるものの、本方法は顕微鏡用途には制限がある。
【０００７】
本願発明は、従来技術で説明された横断界面検出の原理に基づいて、共鳴非線形光信号を検出するための新たな装置を提案する。しかし、本装置は、分光法用途および顕微鏡用途の両方に対して、共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を有するあらゆるサンプルに対して用いられてもよい。
【発明の概要】
【０００８】
第１の態様によると、本願発明は、界面を形成する共鳴媒質および非共鳴媒質を含むタイプのサンプル中に誘導された、共鳴非線形光信号を検出するための装置に関する。本装置は、所定タイプのサンプルの共鳴媒質を励起するための第１の所定の角振動数ωｐにおけるポンプビームと呼ばれる少なくとも１つの第１の励起光ビームの放射源と、前記入射ポンプビームとサンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質間の軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第１の光モジュールと、前記入射ポンプビームと実質的に同じ位置にて、前記反射ポンプビームが前記横断界面を妨害するように配置された前記ポンプビームの反射手段と、前記反射ポンプビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第２の光モジュールと、共鳴媒質の振動共鳴もしくは電子共鳴の指標である検出信号の差の計算を含む、前記第１および第２の検出モジュールによって検出された光信号処理モジュールと、を含む。
【０００９】
ある変形態様によると、放射源は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームの放射を可能とし、前記ポンプビームおよびストークスビームの相互作用から生じた非線形光信号は、角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、第１および第２の検出モジュールにより検出された信号の差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である。
【００１０】
別の変形態様によると、本願発明の装置は、入射励起ビームの焦点を共通の焦点体（ｆｏｃａｌ ｖｏｌｕｍｅ）中に合せることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の前記界面を妨害することを可能にするための焦点レンズと、入射ビームに焦点を合せる焦点レンズと同一のレンズであって、入射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるための集光レンズと、を含む。前記集光レンズは、反射励起ビームの焦点を合せるためのレンズを形成する。入射ビームの焦点を合わせるための焦点レンズは、反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるためのレンズを形成する。
【００１１】
別の変形態様によると、光検出モジュールのそれぞれは、画像記録装置を含み、非線形光信号は、光軸に対してそれぞれ対称な方向へと、光検出モジュールのそれぞれに集められることによって、各信号対（ｃｏｕｐｌｅ）に対して生じた差が検出される。
【００１２】
別の変形態様によると、励起ビームの角度スキャンを提供する装置によって、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の異なる位置にて、励起ビームがサンプルを妨害することを可能とする。
【００１３】
別の変形態様によると、放射源が少なくとも１つの可変波長励起ビームを放射することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることを可能にする。
【００１４】
第２の態様によると、本願発明は、サンプル中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法に関する。サンプルは、界面を形成する共鳴媒質と非共鳴媒質とを含む。本方法は、ポンプビームと呼ばれる共鳴媒質を励起させるための少なくとも１つの第１の光線を、第１の所定の角振動数ωｐにて放射するステップと、１つ以上の前記ビームとサンプルとの相互作用から生じた第１の非線形光信号を検出するステップと、１つ以上の前記励起ビームを反射することにより、反射した１つ以上の前記励起ビームが１つ以上の入射励起ビームと実質的に同じ位置にて前記横断界面を妨害するステップと、１つ以上の前記反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた第２の非線形光信号を検出するステップと、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である検出信号間の差を計算することを含む、検出された第１の光信号および第２の光信号を処理するステップと、を含む。前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルへ入射されることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の横断界面の所定位置にてサンプルを妨害する。
【００１５】
ある変形態様によると、本方法は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームを放射するステップを含む。前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号である。第１の検出信号と第２の検出信号との差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である。
【００１６】
別の変形態様によると、前記第１および第２の非線形光信号は、入射励起ビームの光軸に関して対称な方向にそれぞれ検出されることによって、各信号対に対して生じた差が検出される。
【００１７】
別の態様によると、１以上の励起ビームが、角度スキャンを受けることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の様々な位置にてサンプルを妨害する。
【００１８】
別の変形態様によると、少なくとも１つの励起ビームが可変の放射波長を有することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることが可能となる。
【００１９】
本願発明の他の利点および特徴は、以下の図を用いて説明された記載を読むことによって明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（説明済）図１（Ａ）と図１（Ｂ）は、ラマン散乱過程におけるストークス放射および抗ストークス放射の原理を示す。
【図２】（説明済）図２（Ａ）と図２（Ｂ）は、２つの異なるモードにおけるＣＡＲＳ放射の原理を示す。
【図３】（説明済）図３（Ａ）と図３（Ｂ）は、共鳴および非共鳴ＣＡＲＳ過程の図である。
【図４】（説明済）図４（Ａ）と図４（Ｂ）は、従来技術に従った方法を実装するためのケースαおよびβの図である。
【図５】（説明済）従来技術に従った方法によって得られた数値シミュレーションの結果である。
【図６】（説明済）図６（Ａ）と図６（Ｂ）は、従来技術に従った方法によって対称なサンプルを用いて得られた実験結果である。
【図７】図７（Ａ）と図７（Ｂ）は、本願発明に従った方法を実装するためのケースαおよびβの図である。
【図８】図８（Ａ）と図８（Ｂ）は、本願発明に従った方法を実装するための実験設定の例である。
【図９】図８（Ｂ）に示すタイプのサンプルを用いて得られた実験結果である。
【図１０】図１０（Ａ）〜図１０（Ｄ）は、本願発明に従った方法によって、屈折率ｎ＝１．３３の水溶液中に浸された直径３μｍのポリスチレンビーズを用いた数値シミュレーションによって得られた画像である。
【図１１】本願発明のある変形態様に従った方法を実装するための実験設定の例である。
【図１２】図１２（Ａ）と図１２（Ｂ）は、図１１の例における方法を実装するためのケースαおよびケースβの図である。
【図１３】共鳴媒質と非共鳴媒質との間の軸方向界面において、ＣＡＲＳ散乱を実装するための幾何学的条件を示す略図である。
【図１４】図１４（Ａ）〜図１４（Ｅ）は、励起ビームの焦点の相対位置の関数として、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の軸方向界面とともにＣＡＲＳ散乱信号のずれを示す図である。
【図１５】図１５（Ａ）〜図１５（Ｃ）は、数値シミュレーションにより得られた曲線である。図１５（Ａ）は、パラメータζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γ（標準化ラマン偏移）の関数としてＣＡＲＳ散乱信号における偏移を説明する。図１５（Ｂ）は、パラメータζの関数として、空間（ｋｘ＞０）および空間（ｋｘ＜０）にてそれぞれ計算された光強度および光強度差を表す。図１５（Ｃ）は、軸方向界面に対する励起ビームの焦点のＸ座標上の位置の関数として、空間（ｋｘ＞０）および空間（ｋｘ＜０）にてそれぞれ計算された光強度および光強度差を表す。
【図１６】本願発明に従ったＣＡＲＳ検出を実装するための３つの可能なモダリティを説明する図である。
【００２１】
（詳細な説明）
図７（Ａ）および図７（Ｂ）は、２つの図を用いてＣＡＲＳ散乱のケースにおける本願発明に従った検出方法の原理を説明する。本方法によると、同一直線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）にある角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークビームが横断界面７０、つまり、入射ビームの軸（光軸）と垂直な平面に沿って非ゼロ成分を有する非共鳴媒質と共鳴媒質との間の界面を妨害する。一般に、これら２つのビームの焦点が合わせられる。７１は、横断界面７０を妨害する共通の焦点体を示す。本願発明によると、励起ビームが第１の方向に界面を横断し（ケースαと呼ぶ）、次に、同じ界面を実質的に同じ位置ではあるが反対方向に妨害するように、サンプルに向かって反射する（ケースβ）。図７に示す例では、励起ビームが最初に非共鳴媒質／共鳴媒質の方向（図７（Ａ）：ケースα）、次に共鳴媒質／非共鳴媒質の方向（図７（Ｂ）：ケースβ）へと界面を横切る。αおよびβの２つのケースでは、ＣＡＲＳ散乱信号強度Ｉα（Ｆｗｄ）およびＩβ（Ｆｗｄ）がそれぞれ測定され、これらの差ΔＩＦｗｄが計算される。校正後、信号が得られる。出願人が実証した信号は、共鳴媒質の三次非線形感受率の虚数部Ｉｍ［χ（３）１Ｒ］に比例する。本願発明によると、ケースαとβでサンプルを励起するためにポンプビームとストークスビームの単一パルスが使用される。これにより、図４〜６に示した従来技術の方法と比較して、ＳＮ比を増大させることが可能となる。
【００２２】
物体および光軸に垂直な平面に関するその物体の鏡像により生成されたＣＡＲＳ信号の差を用いるため、本願発明による方法を以下の説明ではＤｚ−ＣＡＲＳと呼ぶ（Ｄｚは、Ｚ軸の対称性における差動的な（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）画像化を意味する）。
【００２３】
図８（Ａ）は、本願発明による検出方法を実装するための例示的な装置を説明する。検出装置８００は通常、同一直線上にある角振動数ωｐの第１の励起ビーム（ポンプビーム）と角振動数ωｓの第２の励起ビーム（ストークスビーム）との放射を可能にするレーザシステム８０１を含む。２つの励起ビームは、矢印８０２によって表されている。装置８００はまた、反射シート８０４などの光学部材を含む。これにより、２つの励起ビームを本装置の第１の光検出モジュールへと向けることを可能にする。第１の光検出モジュールには、主方向Ｚに従って、一般に参照数字８０３が割り当てられる。
【００２４】
レーザシステム８０１は、たとえばいわゆる２色用途において、２つのスペクトル的に狭く調節可能なレーザ光源８０８を含む。レーザ光源８０８は、たとえば６９０〜１０００ｎｍの波長にて放射され、ポンプレーザ８０９によって送出されるチタン：サファイア型、または５３２ｎｍにて放射されるネオジム：ＹＶＯ４型である。調節可能なレーザは、たとえば通常３ピコ秒のオーダーのピコ秒のパルスを放射することにより、角振動数ωｐ（通常は波長７３０ｎｍ）のポンプ励起ビームおよび角振動数ωｓのストークス励起ビームを形成する。パルスピッカー（ｐｉｃｋｅｒ）８１０が使用されることにより、ピークパルス力を減らすことなく、ポンプ励起レーザおよびプローブ励起レーザのパルス反復振動数を減少させてもよい。調節可能なストークスビームまたはポンプビームを用いることにより、特に抗ストークス放射スペクトルを、共鳴媒質のラマンスペクトルを決定することを目的とした分光法における用途に対して、スキャンすることができる。たとえば光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）、光学的パラメトリック増幅器（ＯＰＡ）、ピコ秒ネオジム：ガラス発振器、イッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーなどの他の調整可能なレーザ光源が使用されてもよい。また光源は、観察されるラマン線の分光幅に応じて、ナノ秒またはフェムト秒のレーザ光源であってもよい。しかし、ナノ秒パルスはスペクトル的には非常に良いが、ピコ秒パルスよりも低い最大出力しか有さない。さらに、ナノ秒パルスに関連した熱的効果は、生物学的サンプルによりダメージを与えうる。未加工のフェムト秒パルスは一般に、スペクトルが広すぎる。凝縮相（固体または液体）では線幅が約１０〜２０ｃｍ−１である。これはピコ秒パルスの使用に対応する。
【００２５】
図８（Ａ）に示す例では、第１の光検出モジュール８０３は、図８（Ｂ）に示すサンプル８０５を解析するための共通の焦点体において、ポンプビームおよびストークスビームに焦点を合せるための焦点レンズ８０７を含む。焦点レンズの使用は、顕微鏡用途に特に好適である。しかし、特に薄いサンプルを研究する場合、ＣＡＲＳ信号の放射が焦点ビームを用いて機能するためには、焦点レンズは必須ではない。この例では、図６（Ｂ）に示す２つのスライドガラス６２，６３間のＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）の層６１の例のように、サンプルに焦点が合わせられる。第１の光検出モジュール８０３は同様に、放射された非線形光信号（この例ではＣＡＲＳ散乱信号）の集光を可能にする集光レンズ８１１、および検出器８１６を含む。検出器８１６は、たとえば集光レンズ８１８および残存励起ビームをカットするフィルタ８１２に続くアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、高速光ダイオード（ＰＩＮ）、または光電子増倍管（ＰＭＴ）型の点検出器である。
【００２６】
この例では、所定のサンプルに対するケースαからケースβへの移行は、鏡８１３によって図８（Ａ）に示すように、ポンプビームおよびストークスビームを戻すことにより行われる。鏡８１３の反射係数は、ポンプビームおよびストークスビームを反射して、励起ビームとサンプルとの相互作用から生じたＣＡＲＳ散乱信号を伝達できるように、一方では励起ビームの波長に他方ではＣＡＲＳ散乱信号の波長に好適である。この状況では、入射パルスの第１の経路中に、第１のＣＡＲＳ信号が発射され、検出器８１６によって集められる。つまり、これはケースαに関するため、集められた信号はＩα（Ｆｗｄ）である。ポンプパルスおよびストークスパルスが次に鏡によって反射されることにより、サンプルへと戻る。これは次に、図８（Ａ）で全体として参照数字８０６が割り当てられた第２の光検出モジュールにおいて、ケースβにあるとみなされる。第２の光検出モジュール８０６は、第１の光検出モジュールと共通してレンズ８１１およびレンズ８０７を含む。しかし、レンズ８１１は鏡８１３により戻される励起ビームに対する焦点レンズとして機能する。また、レンズ８０７は反射励起ビームとサンプル８０５との相互作用から生じた非線形光信号に対する集光レンズとして機能する。第２の光モジュール８０６は、検出器８１７をさらに含む。検出器８１７は、たとえば検出器８１６と同じタイプの点検出器であって、残存励起ビームをカットするための集光レンズ８１９およびフィルタ８２０に続く。次に、検出器８１７によってその後で収集された信号はＩβ（Ｆｗｄ）である。信号の差Ｉα（Ｆｗｄ）−Ｉβ（Ｆｗｄ）は、リアルタイムに操作される。出願人は、この差が共鳴媒質のラマンスペクトルに比例することを、図８（Ａ）で８３０と名付けられた処理装置を用いて示した。反射シート８０４は、２色性シートであることが有利である。これにより、レーザ光源８０１により放射された励起ビームをサンプル８０５に向かって反射させることが可能となる（ケースα）。一方、ケースβではＣＡＲＳ散乱信号が伝達される。焦点レンズ８０７および集光レンズ８１１は同一であることが有利である。これにより、ケースαおよびβにおいて対称な配置が可能となる。実際には、検出器８１６，８１７は測定に先立って校正される。たとえば、この校正は溶媒のみを含むサンプルに対して行われる。
【００２７】
図８（Ｂ）に見られるように、本願発明による装置は、同じポンプパルスおよびストロークパルスが、それぞれおケースαおよびβの場合に横断界面の同じ位置にてサンプルを妨害することを可能にする。本方法はしたがって、単に対称または可逆的なサンプルではなく、共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を呈する任意のタイプのサンプルに対して使用することができる。
【００２８】
ある例によると、装置８００はまた、サンプルのＸＹ平面中に励起ビームスキャン装置を含む（図示せず）。このスキャン装置は、サンプルを形成する共鳴媒質および非共鳴媒質の横断界面に対して励起ビームの焦点を調節するために、分光法用途において、つまり画像化用途においても有用であってもよい。このスキャン装置は、サンプルの置換を可能とする装置、または好ましくは励起ビームスキャン装置として機能してもよい。励起ビームを逆平行方向に反射できるように、球状励起ビーム−反射鏡８１３を使用できることが有利である。これにより、反射励起ビーム（ケースβ）が入射ビーム（ケースα）と同じ位置にてサンプルを妨害することができる。
【００２９】
図９は、図８（Ａ）の装置および図８（Ｂ）に示すタイプのサンプルを用いて得られた実験結果を示す。ここでは、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）の微細層が、（ここでは非共鳴媒質として機能する）２つのスライドガラス間で、共鳴媒質として機能する。ポンプビームの波長は７３０ｎｍである。ストークス励起ビームの波長は、約８１４ｎｍである。レンズ８０７，８１１の空気中の開口数は０．６である。図９では、それぞれラマン偏移の関数として、曲線Ｄ１はＤＭＦ中で測定されたＣＡＲＳ散乱信号を示す。曲線Ｄ２は、ケースα（図６（Ｂ））にて測定された強度Ｉα（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｄ３は、ケースβにて測定された強度Ｉβ（Ｆｗｄ）を示す。曲線Ｄ４は、差ΔＩＦｗｄを示す。曲線Ｄ５（点線）は、ラマンスペクトルを示す。曲線Ｄ６は、ガラス上で測定されたＣＡＲＳ散乱信号を示す。曲線Ｄ１は、共鳴媒質の非共鳴寄与による歪み効果を明確に示す。一方、差ΔＩＦｗｄはＤＭＦのラマンスペクトル（点線）上に正確に重畳されている。したがって、Ｄｚ−ＣＡＲＳが、共鳴媒質の非共鳴部分によるあらゆる歪みなく、共鳴媒質のラマンスペクトルを抽出する能力を有することが理解されるであろう。
【００３０】
この実験結果は、図６（Ａ）に示されるように、従来技術との比較によってはっきりと改善された正確性をもって、ノイズのない非共鳴ＣＡＲＳ分光法に対するＤｚ−ＣＡＲＳ法の関連性を実証する。さらに、本願発明による方法によって、作業中の界面における位置を完全に同定すること、およびケースαおよびβのように界面の同じ位置にて同一の励起パルスの焦点を合せること、特に顕微鏡に用いることが可能となる。
【００３１】
図１０（Ａ）〜（Ｄ）は、別のタイプのサンプルを用いて得られた数値シミュレーションを示す。この画像は、水性溶媒中にサンプルとして直径３μｍのビーズを用いることによって計算される（ポンプ波長：７３０ｎｍ、ストークス波長：８１４ｎｍ、水中における励起レンズの開口数：１．２、水中における集光レンズの開口数：１．２）。この画像は、各ケースでは励起ビームの入射方向を含む縦断面に対応するビーズのＺＸ平面にて計算される。図１０（Ａ）および（Ｂ）は、従来の検出におけるビーズの画像を表す。つまり、ケースαにおけるＣＡＲＳ散乱信号のみが示されている。共鳴しているときには（図１０（Ａ））、信号は共鳴していないとき（図１０（Ｂ））よりも強い。しかし、ビーズおよびその環境の非共鳴寄与のために、コントラスト差は弱い。図１０（Ｃ）および図１０（Ｄ）は、共鳴しているビーズと共鳴していないビーズの画像を示す。しかし、本願発明によるＤｚ−ＣＡＲＳ法を用いて、つまり図８（Ａ）に示すタイプの設定を用いてケースαおよびβにおいてＣＡＲＳ散乱信号を減算することによって、これらは計算されている。共鳴していないとき（図１０（Ｄ））、コントラストは０である。それは、非共鳴寄与のみを含む信号の差が相殺されるからである。一方、図１０（Ｃ）の共鳴しているときの計算では、横断界面におけるコントラストは最大である。これらの結果によって、顕微鏡の構成においてＤｚ−ＣＡＲＳの実現可能性が確立される。
【００３２】
図１１は、本願発明の変形態様に従った検出を実装するための例示的な実験設定を示す。この設定は、図８（Ａ）の設定と実質的に同一である。しかし、点検出器８１６，８１７が、たとえばＣＣＤ型またはＣＭＯＳ型のマトリックス検出器９０１，９０２に置き換えられている。この変形態様によると、検出されたレンズ開口数に含まれる波動ベクトルｋのすべての空間において、それぞれケースαおよびβに対して統合されたＣＡＲＳ散乱信号の差は、上述の通りもはや検出されない。代わりに、サンプルに入射する励起ビームの光軸に関して対称な方向におけるＣＡＲＳ散乱信号の差が測定される。信号は初めケースαにおいて、次にケースβにおいて検出される。
【００３３】
したがって、図１２（Ａ）に明らかなように、ケースαでは、主軸ｚに垂直なＸＹ投影面において座標（ｋｘ，ｋｙ）の波動ベクトルｋによって表される方向にＣＡＲＳ散乱信号が測定される。またケースβでは、ＸＹ投影面において座標（−ｋｘ，−ｋｙ）の波動ベクトルｋ″によって表される方向にＣＡＲＳ散乱信号が測定される。ここでは、上述のとおり、ケースαは入射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じたＣＡＲＳ散乱信号の生成に対応する。一方、ケースβは反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じたＣＡＲＳ散乱信号の生成に対応する。
【００３４】
サンプルの横断界面にて検出を可能とすることに加えて、本方法はサンプルの軸方向界面にて検出を可能とすること、つまり入射励起ビームの光軸に沿って非ゼロ成分を有することを、出願人は実際に理論的かつ実験的に示した。本出願では以下、本方法をＤ−ＣＡＲＳと呼ぶ。
【００３５】
Ｄ−ＣＡＲＳに関する理解を向上させるために、図１３〜１５では軸方向界面にて検出するためのＤｋ−ＣＡＲＳと呼ばれる以下のアプローチを示す（ＤｋはＫ−空間における差動的な画像化を意味する）。
【００３６】
図１３は、たとえば解析される媒質を含む媒質、つまり生物学的に興味のある媒質である共鳴媒質１３１、および通常は溶媒を含む媒質である非共鳴媒質１３２を含むサンプルを示す。三次非線形感受率は、共鳴媒質１３１では共鳴項χ（３）１Ｒおよび非共鳴項χ（３）１ＮＲによって定義される。非共鳴媒質１３２では、三次非線形感受率は非共鳴項χ（３）２ＮＲによって定義される。本願発明による方法のこの態様によると、同一直線上にある角振動数ωｐのポンプ励起ビームと角振動数ωｓのプローブ励起ビームは、焦点体１３５にてサンプルに入射し、サンプルの軸方向界面１３３を妨害する。本方法のこの態様によると、以下において詳細に説明するように、波動ベクトルｋの空間、つまりＣＡＲＳプロセスにより放射された信号の放射方向の空間における、界面の両側に対する非線型光ビームの光強度が解析される。この強度は、それぞれ界面の両側にて、ＩＦｗｄ（ベクトルｋ）およびＩＦｗｄ（ベクトルｋ´）として図１３に示されている。「Ｆｗｄ」との省略形は、後ろ方向に散乱された「Ｅｐｉ」と呼ばれる信号の対語として、前方ＣＡＲＳ散乱信号を表す。
【００３７】
実際に、出願人は軸方向界面においてＣＡＲＳ過程によって放射された信号は共鳴によってずれるということを実験的および理論的に実証した。
【００３８】
図１４（Ａ）〜（Ｅ）は、ＣＡＲＳ散乱信号のずれを、界面に入射するポンプビームおよびストークスビームの相対位置の関数として、一連の略図によって示す。図１４（Ａ）〜（Ｅ）は、能動ＣＡＲＳ体１３５（ポンプビームおよびストークスビームの焦点）を示す。能動ＣＡＲＳ体１３５は、ＣＡＲＳ対象物１４０の中を通って移動される（各図は対象物中の能動体（ａｃｔｉｖｅ ｖｏｌｕｍｅ）の異なる位置に対応する）。ＣＡＲＳ対象物は、その対象物の周囲の媒質が共鳴していないと見なされる場合に、共鳴していると見なされる（以下の記載では、このＣＡＲＳ対象物を「溶媒」と呼ぶ）。ＣＡＲＳ対象物と溶媒との間の界面では、ＣＡＲＳ散乱信号はずれ（または偏向）の影響を受けるようである。出願人は、このずれは純粋にＣＡＲＳ対象物と溶媒との干渉過程から生じ、決して屈折の影響によるものではないことを実証している。２つの実例１（図１４（Ａ）および（Ｅ））では、溶媒中でＣＡＲＳ体に焦点が合わせられる。ＣＡＲＳ散乱信号は標準的な方向（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に平行である。矢印１４１により示される）に放射される。実例２（図１４（Ｂ））では、ＣＡＲＳ体はＣＡＲＳ対象物と溶媒との間の界面に焦点が合わせられる。次に、（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に対して）正の角度αにてＣＡＲＳ散乱信号が放射されることにより、波動ベクトルｋの空間において、（ｋｘ＞０）により規定される方向にビームをずれさせる。実例３（図１４（Ｃ））では、ＣＡＲＳ体がＣＡＲＳ対象物中の中心に置かれる。その結果ＣＡＲＳ信号は強くなり、標準的な方向（ポンプビームおよびストークスビームの入射軸に平行）に向けられる。次に以下の実例（図１４（Ｄ）の実例４および図１４（Ｅ）の実例１）において似た状況が見られる。しかし、実例４ではαが負で、（ｋｘ＜０）によって規定される方向へのずれに対応することに留意することは重要である。出願人は、標準化パラメータζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γ（式中、Γは実験された振動線の分光幅である）の関数としての角αの変化は、媒質１を記述するテンソルχ（３）１＝χ（３）１Ｒ＋χ（３）１ＮＲの位相に従うことを、理論的かつ実験的に実証している。出願人はまた、対称散乱方向にてＣＡＲＳ信号を解析することにより、ラマンスペクトルが決定可能であることを実証している。
【００３９】
図１５（Ａ）は、共鳴媒質１と非共鳴媒質２との間の軸方向界面（図１３）に焦点が合わせられたポンプビームおよびストークスビームのベクトル特性を考慮した厳密な数値計算の結果を示す。この解析の目的は、波動ベクトルｋの空間において、標準化ラマン偏移ζ＝（ωｐ−ωｓ−ΩＲ）／Γの関数として放射されたＣＡＲＳ散乱信号のずれを研究することにある。共鳴のない状態（ζ＝?１０）では、ビームが中心に向けられる。一方、共鳴のある状態（ζ＝０）では、角変位がはっきりと現れる。
【００４０】
図１５（Ｂ）および（Ｃ）は、数値シミュレーションを示す。ここではＣＡＲＳ散乱信号がそれぞれ半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）に統合される。次に、こうして統合された信号の差が決定される。図１５（Ｂ）は、ポンプビームおよびストークスビームが界面（ｘ＝０）に焦点を合わせられた場合の半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）に統合されたＣＡＲＳスペクトルを、これらの差ΔＩとともに示す。この差はＩｍ［χ（３）１Ｒ］によって与えられるラマンスペクトルに正確に従う。このことは非共鳴ノイズを有さないＣＡＲＳ分光法に対するＤｋ−ＣＡＲＳ法が適切であることを示す。したがって、たとえばストークスビームの振動数を変化させることによって、共鳴媒質のラマンスペクトルを決定することが可能である。図１５（Ｃ）は、界面に対してポンプビームおよびストークスビームの焦点の関数として半空間（ｋｘ＞０）および半空間（ｋｘ＜０）に積分されたＣＡＲＳ信号を示す。これらの差は、界面の近傍にて一意的にゼロではない。したがって、界面の近傍にて背景ノイズのない非共鳴ＣＡＲＳ画像を得ることができる。
【００４１】
したがって図１６（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｄｚ−ＣＡＲＳ法およびＤｋ−ＣＡＲＳ法を組み合わせたＤ−ＣＡＲＳ顕微鏡用の３つの可能な検出モダリティを示す。各検出モダリティに対して、数値シミュレーションは水性溶媒中で直径３μｍのビーズに対して得られた画像を示す（ポンプ波長：７３０ｎｍ、ストークス波長：８１４ｎｍ、励起レンズの水中の開口数：１．２、集光レンズの水中の開口数：１．２）。図１６（Ａ）は、Ｘ軸に垂直な界面およびＺ軸に垂直な界面における検出を可能にするＸＺ検出モダリティを示す。このために、ＣＡＲＳ信号を空間（ｋｘ＞０）（ケースα、図７（Ａ））および空間（ｋｘ＜０）（ケースβ、図７（Ｂ））にて積分することにより、それぞれケースαおよびβにおけるＣＡＲＳ散乱信号の差が計算される。これは励起ビームの方向の信号として選択された参照系である。したがって、たとえばポンプビームおよびストークスビームの焦点の相対位置を変えることにより、ビーズの赤道面において図１６（Ａ）の画像が得られる。図１６（Ｂ）は、Ｙ軸に垂直な界面およびＺ軸に垂直な界面における検出を可能にするＹＺ検出モダリティを示す。この例では、異なる位置に対して、空間（ｋｙ＞０）（ケースα、図７（Ａ））および空間（ｋｙ＜０）（ケースβ、図７（Ｂ））で積分された光強度差が計算される。図１６（Ｃ）は、検出モダリティＸＹＺを示す。この画像は、それぞれおケースαおよびβにおいて、２つの逆方向のベクトルｋ（ｋｘ，ｋｙ，ｋｚ）およびベクトルｋ″（−ｋｘ，−ｋｙ，ｋｚ）において測定された光強度差Ｉα（ｋｘ，ｋｙ）およびＩβ（−ｋｘ，−ｋｙ）において２×２の差をとることにより計算される。これらの方向は、角円錐（ａｎｇｕｌａｒ ｃｏｎｅ）に含まれる。角円錐の開口角は、ＣＡＲＳ散乱信号を集めるための開口数（たとえば水中では１．２である）によって規定される。また、波動ベクトルｋおよびｋ″の座標は、それぞれケースαおよびβに特異的な励起ビームを参照して表される。
【００４２】
図１１に示す例では、特に顕微鏡用途に対して、励起ビームを角度スキャンするための手段を提供することを可能とすることが有利であろう。図８（Ａ）に示す装置の例のように、励起ビーム８１３を反射するための球状鏡８１３を選択することが可能であろう。さらに、ケースαおよびβのそれぞれにおいてカメラに集中された励起ビームの入射方向を保つために、レンズ８１１，８０７の射出瞳（ｅｘｉｔ ｐｕｐｉｌｓ）においてそれぞれカメラ９０１，９０２を配置することが有利である。αおよびβの各ケースにおいて各スキャン角に対して励起ビームの方向を特定するために、溶液中におけるカメラの校正も可能である。励起ビームに対して、ＣＡＲＳ散乱信号のずれが測定される。
【００４３】
２つのスペクトル的に狭いレーザ光源を用いて、２色用途に関する図８（Ａ）および図１１の実装例によって、Ｄｚ−ＣＡＲＳまたはＤ−ＣＡＲＳの検出を説明してきた。多重用途（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）と呼ばれる用途では、たとえばフェムト秒パルスまたは光ファイバーもしくは他の分散性媒質により生成された超連続体によって生成されたストークスビームのスペクトル的に広い放射源が選択可能である。ポンプ信号は、スペクトル的に狭いままである。この用途では、たとえば２つのケースαおよびβにて検出された２つの信号が入力されるＣＣＤカメラを備えた２つのスリット分光計または単一の分光計を用いて、単一パルスにおけるラマンスペクトルを得ることが可能となるであろう。この用途では、各ケース（αまたはβ）においてスペクトルを得て、これらの差を生じさせることが問題である。
【００４４】
３色用途と呼ばれる用途では、関連する振動数ω１、ω２およびω３の３つの波長が使用されることにより、角振動数ω１−ω２＋ω３にてＣＡＲＳ信号が生成される。ケースαまたはβにおいて角振動数ω１−ω２＋ω３にて信号を検出してこれらの差を算出することにより、ＣＡＲＳ信号はノイズのない非共鳴な状態にされてもよい。
【００４５】
ＣＡＲＳ散乱の場合にて検出方法を説明してきたが、この検出方法は、分光法用途および顕微鏡用途の両方に対して、軸方向界面にて検出して共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を明らかにできることによって、他の非線形の２次または３次の処理にも同様に適用される。いずれの場合も、１つ以上の励起ビームの相互作用から生じた非線形光信号の解析が、共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を呈するサンプルを用いて行われる。この空間解析は、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を明らかにすること、または共鳴媒質のスペクトルを特徴づけることを可能にする。
【００４６】
ある例によると、第３の共鳴調波（ｈａｒｍｏｎｉｃ）を生成する処理は、角振動数ωｐの単一のポンプ励起ビームを用いて共鳴媒質と非共鳴媒質との間に界面を含むサンプルを励起することによって、共鳴が電子共鳴である場合に使用されうる。たとえば、発振器型のチタン：サファイア、ネオジム：ガラス、またはイッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーのピコ秒またはフェムト秒レーザ光源である。
【００４７】
他の例によると、４波混合処理は、共鳴が電子共鳴である場合に、角振動数ωｐの単一のポンプ励起ビームを用いて、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面を含むサンプルを励起することにより使用されうる。たとえば、発振器型のチタン：サファイア、ネオジム：ガラス、またはイッテルビウムまたはエルビウム添加光ファイバーのピコ秒またはフェムト秒レーザ光源である。
【００４８】
上述の２つの例は、電子共鳴を取り扱っている。電子共鳴は、原子、分子、半導体の結晶などにおいて見られる。
【００４９】
別の態様によると、第２の共鳴調波は単一のポンプビームを用いて励起されうる。または、振動数の合計がポンプビームおよびプローブビームを用いて作られうる（二次の非線形効果）。
【００５０】
いくつかの詳細で例示的な態様を用いて本願発明を説明したが、本願発明による検出装置および方法は、当業者に明らかな異なる変形例、修正、および改良を含む。そのため、以下の特許請求の範囲に規定されるように、これらの異なる変形例、修正、および改良が本願発明の範囲に含まれることが理解されるであろう。
【図１Ａ−１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面を形成する共鳴媒質（６１）および非共鳴媒質（６２，６３）を含むタイプのサンプル（８０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための装置であって、
第１の所定の角振動数ωｐにて所定タイプのサンプルの共鳴媒質を励起するための、ポンプビームと呼ばれる少なくとも１つの第１の励起ビームの放射源（８０１）と、
前記入射ポンプビームとサンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質間の軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第１の光モジュール（８０３）と、
前記入射ポンプビームと実質的に同じ位置にて、前記反射ポンプビームが前記横断界面を妨害するように配置された前記ポンプビームの反射手段（８１３）と、
前記反射ポンプビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第２の光モジュール（８０６）と、
共鳴媒質の振動共鳴もしくは電子共鳴の指標である検出信号の差の計算を含み、前記第１および第２の検出モジュールによって検出された光信号を処理するための処理モジュール（８３０）と、を含む装置。
【請求項２】
放射源（８０１）は、第１の角振動数ωｐとは異なる少なくとも第２の角振動数ωｓにて、共鳴媒質を励起するための少なくとも第２の励起ビームの放射を可能とし、
励起ビームのすべては、同一線上にあって、共通の焦点体中の前記位置にて前記横断界面を妨害するように配置されており、
反射手段は、界面上の同じ位置にてすべての励起ビームを前記横断界面に反射するように配置され、
第１および第２の検出モジュールによって検出された信号の差は、第１および第２の振動数の振動数の線形結合に等しい角振動数における共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である請求項１に記載の装置。
【請求項３】
放射源（８０１）は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームの放射を可能とし、
前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は、角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、
第１および第２の検出モジュールにより検出された信号の差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である請求項２に記載の装置。
【請求項４】
反射手段は、１以上の励起ビームを反射でき、前記非線形光信号を伝達可能な反射鏡（８１３）により形成されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
反射鏡（８１３）が球状である請求項４に記載の装置。
【請求項６】
１以上の前記入射励起ビームの焦点を共通の焦点体（７１）中にて合せることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の前記界面を妨害することを可能にするための焦点レンズ（８０７）と、
入射ビームの焦点レンズと同一のレンズであって、入射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるための集光レンズと、をさらに含み、
前記集光レンズは、反射励起ビームの焦点を合せるための焦点レンズを形成し、
入射ビームの焦点を合せるための前記焦点レンズは、反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるための集光レンズを形成する請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
放射源（８０１）により放射された１以上の励起ビームをサンプルに向けることを可能とし、１以上の反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を通過させることを可能とする２色性ビームスプリッタ（８０４）をさらに含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
光検出モジュールのそれぞれは、画像記録装置を含み、
非線形光信号は、光軸に対してそれぞれ対称な方向にて光検出モジュールのそれぞれに集められ、検出された各信号対に対して生じた差がもたらされる請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
１以上の励起ビームの角度スキャンをもたらす装置をさらに含むことによって、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の異なる位置にて、１以上の励起ビームがサンプルを妨害することを可能とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
放射源が少なくとも１つの可変波長励起ビームを放射することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることを可能とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
サンプル（８０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法であって、
サンプル（８０５）は、界面を形成する共鳴媒質（６１）と非共鳴媒質（６２，６３）とを含み、
本方法は、
ポンプビームと呼ばれる共鳴媒質の少なくとも１つの第１の励起ビームを、第１の所定の角振動数ωｐにて放射するステップと、
１つ以上の前記ビームとサンプルとの相互作用から生じた第１の非線形光信号を検出するステップと、
１つ以上の前記励起ビームを反射することにより、反射した１つ以上の前記励起ビームが１つ以上の入射励起ビームと実質的に同じ位置にて前記横断界面を妨害するステップと、
１つ以上の前記反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた第２の非線形光信号を検出するステップと、
共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である検出信号間の差を計算することを含む、検出された第１の光信号および第２の光信号を処理するステップと、を含み、
前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルへ入射することによって、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の横断界面の所定位置にてサンプルを妨害する方法。
【請求項１２】
第１の角振動数ωｐとは異なる少なくとも第２の角振動数ωｓにて共鳴媒質の少なくとも１つの第２の励起ビームを放射するステップを含み、
第１の検出信号と第２の検出信号との差は、第１の振動数および第２の振動数の線形結合に等しい角振動数における共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標であって、
励起ビームはすべて同一線上にあって、共通の焦点体中の前記位置にて前記横断界面を妨害する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームを放射するステップを含み、
前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、
第１の検出信号と第２の検出信号との差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および第２の非線形光信号は、入射励起ビームの光軸に関して対称な方向にそれぞれ検出され、検出された各信号対に対して生じた差がもたらされる請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
１以上の励起ビームが、角度スキャンを受けることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の複数の位置にてサンプルを妨害する請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの励起ビームが可変の放射波長を有することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることが可能となる請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
界面を形成する共鳴媒質（６１）および非共鳴媒質（６２，６３）を含むタイプのサンプル（８０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための装置であって、
第１の所定の角振動数ωｐにて所定タイプのサンプルの共鳴媒質を励起するための、ポンプビームと呼ばれる少なくとも１つの第１の励起ビームの放射源（８０１）と、
前記入射ポンプビームとサンプルの共鳴媒質−非共鳴媒質間の軸方向界面との相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第１の光モジュール（８０３）と、
前記入射ポンプビームと実質的に同じ位置にて、前記反射ポンプビームが前記横断界面を妨害するように配置された前記ポンプビームの反射手段（８１３）と、
前記反射ポンプビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を検出するための第２の光モジュール（８０６）と、
共鳴媒質の振動共鳴もしくは電子共鳴の指標である検出信号の差の計算を含み、前記第１および第２の検出モジュールによって検出された光信号を処理するための処理モジュール（８３０）と、を含む装置。
【請求項２】
放射源（８０１）は、第１の角振動数ωｐとは異なる少なくとも第２の角振動数ωｓにて、共鳴媒質を励起するための少なくとも第２の励起ビームの放射を可能とし、
励起ビームのすべては、同一線上にあって、共通の焦点体中の前記位置にて前記横断界面を妨害するように配置されており、
反射手段は、界面上の同じ位置にてすべての励起ビームを前記横断界面に反射するように配置され、
第１および第２の検出モジュールによって検出された信号の差は、第１および第２の振動数の振動数の線形結合に等しい角振動数における共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である請求項１に記載の装置。
【請求項３】
放射源（８０１）は、角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームの放射を可能とし、
前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は、角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、
第１および第２の検出モジュールにより検出された信号の差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である請求項２に記載の装置。
【請求項４】
反射手段は、１以上の励起ビームを反射でき、前記非線形光信号を伝達可能な反射鏡（８１３）により形成されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
反射鏡（８１３）が球状である請求項４に記載の装置。
【請求項６】
１以上の前記入射励起ビームの焦点を共通の焦点体（７１）中にて合せることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の前記界面を妨害することを可能にするための焦点レンズ（８０７）と、
入射ビームの焦点レンズと同一のレンズであって、入射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるための集光レンズと、をさらに含み、
前記集光レンズは、反射励起ビームの焦点を合せるための焦点レンズを形成し、
入射ビームの焦点を合せるための前記焦点レンズは、反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形信号を集めるための集光レンズを形成する請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
放射源（８０１）により放射された１以上の励起ビームをサンプルに向けることを可能とし、１以上の反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた非線形光信号を通過させることを可能とする２色性ビームスプリッタ（８０４）をさらに含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
光検出モジュールのそれぞれは、画像記録装置を含み、
非線形光信号は、光軸に対してそれぞれ対称な方向にて光検出モジュールのそれぞれに集められ、検出された各信号対に対して生じた差がもたらされる請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
１以上の励起ビームの角度スキャンをもたらす装置をさらに含むことによって、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の異なる位置にて、１以上の励起ビームがサンプルを妨害することを可能とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
放射源が少なくとも１つの可変波長励起ビームを放射することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることを可能とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
サンプル（８０５）中に誘導された共鳴非線形光信号を検出するための方法であって、
サンプル（８０５）は、界面を形成する共鳴媒質（６１）と非共鳴媒質（６２，６３）とを含み、
本方法は、
ポンプビームと呼ばれる共鳴媒質の少なくとも１つの第１の励起ビームを、第１の所定の角振動数ωｐにて放射するステップと、
１つ以上の前記ビームとサンプルとの相互作用から生じた第１の非線形光信号を検出するステップと、
１つ以上の前記励起ビームを反射することにより、反射した１つ以上の前記励起ビームが１つ以上の入射励起ビームと実質的に同じ位置にて前記横断界面を妨害するステップと、
１つ以上の前記反射励起ビームとサンプルとの相互作用から生じた第２の非線形光信号を検出するステップと、
共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標である検出信号間の差を計算することを含む、検出された第１の光信号および第２の光信号を処理するステップと、を含み、
前記ポンプビームは、光軸に沿ってサンプルへ入射することによって、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の横断界面の所定位置にてサンプルを妨害する方法。
【請求項１２】
第１の角振動数ωｐとは異なる少なくとも第２の角振動数ωｓにて共鳴媒質の少なくとも１つの第２の励起ビームを放射するステップを含み、
第１の検出信号と第２の検出信号との差は、第１の振動数および第２の振動数の線形結合に等しい角振動数における共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴の指標であって、
励起ビームはすべて同一線上にあって、共通の焦点体中の前記位置にて前記横断界面を妨害する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
角振動数ωｐのポンプビームおよび角振動数ωｓのストークスビームを放射するステップを含み、
前記ポンプビームとストークスビームとの相互作用から生じた非線形光信号は角振動数ωａｓ＝２ωｐ−ωｓのＣＡＲＳ散乱信号と呼ばれる信号であって、
第１の検出信号と第２の検出信号との差は、共鳴媒質のラマン共鳴の指標である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および第２の非線形光信号は、入射励起ビームの光軸に関して対称な方向にそれぞれ検出され、検出された各信号対に対して生じた差がもたらされる請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
１以上の励起ビームが、角度スキャンを受けることにより、共鳴媒質と非共鳴媒質との間の界面の複数の位置にてサンプルを妨害する請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの励起ビームが可変の放射波長を有することにより、共鳴媒質の振動共鳴または電子共鳴のスペクトルを得ることが可能となる請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１０】
【図１４】
【図１６】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１０】
【図１４】
【図１６】
【公表番号】特表２０１３−５１７４９０（Ｐ２０１３−５１７４９０Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４９３３３（Ｐ２０１２−５４９３３３）
【出願日】平成２３年１月１８日（２０１１．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０６１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９１１８
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５１２１９０６０８）セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック−シーエヌアールエス (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１８日（２０１１．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０６１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９１１８
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５１２１９０６０８）セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック−シーエヌアールエス (2)
【Ｆターム（参考）】
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