凝固因子の吸入による血友病処置
凝固因子の吸入による、血友病処置。乾燥粉末の第ＩＸ因子が、４μｍ以下の質量中央空気力学直径までエアロゾル化され、このエアロゾルは、少なくとも９０％のモノマー含有量、少なくとも８０％の活性レベル、および１０％以下の水を有する。このエアロゾルは、肺内にゆっくりと深く吸入され、そして引き続いて、最大の呼気が行われる。１つの実施形態において、ＭＭＡＤは、２．８〜３．６μｍであり、ＦＰＦ％＜３．３μｍは、少なくとも６０％であり、モノマー含有量は、少なくとも９５％であり、そしてエアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性は、少なくとも９０％である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、凝固因子の吸入による、血友病の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
約４５０，０００人の患者が、世界中で、出血障害（「血友病」として公知）を患って生きている。血友病は、血液中の１つ以上の凝固因子の欠損によって引き起こされ、この凝固因子の欠如は、長期間の出血を引き起こす。小さい挫傷でさえも、内出血を引き起こし得る。いくつかの症例において、内出血は、明白な原因なしで開始し得、関節および組織に広がる。膨潤および強い疼痛が、通常生じ、そして血友病を患う人は、自分の一生にわたって悩まされる。３つの主要な型の血友病が存在し、それぞれが、凝固カスケードにおける異なるタンパク質の変異から生じる。
【０００３】
血友病Ａ（時々、古典的血友病と称される）は、最も通常の型の血友病であり、凝固因子欠損を患う患者の約８０％において起こる。これは、Ｘ染色体に担持されるＤＮＡ欠損によって引き起こされ、そして大ＶＩＩＩ因子の欠損を生じる。唯一の正常なＸ染色体は、十分なレベルの第ＶＩＩＩ因子を産生する必要がある。従って、ほとんど全ての罹患する患者は、男性である。ほとんどの場合において、この欠損遺伝子は、数世代にわたって継代されるが、症例の約２０％において、この欠損は、自発的な変異によって生じる。
【０００４】
血友病Ｂ（クリスマス病としてもまた公知）は、血友病の症例の１２％〜１５％を占め、そして第ＩＸ凝固因子の欠損によって引き起こされる。血友病Ａと同様に、血友病Ｂは、Ｘ染色体上の栄養欠損に関連し、そして通常、保有者の母親の男児に影響を与える。
【０００５】
第ＸＩ因子の欠損は、凝固因子欠損状態を有する患者のほんの２％〜５％を占める。この欠損は、第ＩＸ凝固因子の欠損によって引き起こされ、そして血友病ＡおよびＢとは異なり、Ｘ染色体以外の染色体上に遺伝され、そして男児と女児との両方に継代され得る。ヴォン・ヴィレブランド病は、なお別の形態の血友病であり、これは、男性および女性において予防される。失われる他の稀な因子（例えば、第Ｖ因子、第Ｘ因子、および第ＸＩＩＩ因子）もまた、存在する。
【０００６】
これらの血友病患者に対する現在の治療は、出血を防止するため、または血友病の事象に対する「オンデマンド」で、予防的に与えられる凝固因子の静脈内（ＩＶ）投与を包含する。処置は、診療所または家庭で施され得るが、種々のアクセスを達成することが不可能であることは、治療を、いずれの位置においても非常に困難にし得る。凝固因子の脈管外投与は、この困難を回避し得る。皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、および腹腔内（ＩＰ）の投与経路は、治療レベルを達成するが、針が依然として、代表的に、送達のために使用される（１）。
【０００７】
吸入治療は、治療レベルが気道から体循環に達し得る場合、凝固因子のための「無針」投与経路を提供する。呼吸系は、胃腸管におけるタンパク質分解に耐えられないタンパク質またはペプチドの全身送達のため、またはＩＶ経路、ＳＣ経路、ＩＭ経路もしくはＩＰ経路の代替としての、魅力的な経路である。血友病の処置のために、呼吸器官は、いくつかの利点を与える。第一に、吸入によって投与される凝固因子は、肺上皮と体循環との間の比較的短い距離を移行する必要があるのみである。第二に、より小さい気道および肺胞は、非常に透過性かつ吸収性の膜から構成される、大きい表面積を有する。第三に、肺胞は、巨大な脈管床を有し、この脈管床を通して、数リットルの血液が１分間あたりに流れる。第四に、肺は、比較的低い酵素活性を有し、そして気道粘膜および肺胞の薄い界面活性剤の水性層は、高濃度のプロテアーゼインヒビターを含む（２）。この環境は、タンパク質の分解を起こりにくくし、そして体循環への移行の間、Ｖ．ＩＸ、Ｆ．ＶＩＩＩおよびＦ．ＸＩのようなタンパク質に、分解からの少なくともいくらかの保護を与え得る（２、３）。
【０００８】
エアロゾルタンパク質の、呼吸器道内での堆積の部位を規定する最も重要なパラメータは、そのエアロゾルの粒子特徴である。エアロゾルの液滴の挙動は、その「質量中央空気力学直径」（ＭＭＡＤ）に依存し、この直径は、粒子のサイズ、形状、密度および電荷の関数である。気道内の空気の速度もまた、重要な特性である。
【０００９】
粒子のＭＭＡＤの厳密な制御が、呼吸気道の所望の領域内でのエアロゾルの堆積および保持の再現性を確実にする。肺全体にわたるよい分布は、１μｍと５μｍとの間の空気力学直径を有する粒子を必要とする。非常に小さい粒子（１μｍ未満）が、通常のむらのある呼吸の間に吸入される。３μｍの粒子は、肺胞領域を標的とし、そして６μｍより大きい粒子は、口腔咽頭部に堆積される。
【００１０】
ほとんどの疾患の最適な管理は、治療化合物の正確な投薬を必要とする。灰での薬物投与は、送達デバイスに対するストリンジェントな要求を負わせる；このことは、粉末または液滴の粒子サイズは、送達部位、および従って、肺からの薬物吸収の程度に大いに影響を与えるからである。
【００１１】
肺での薬物投与のために現在利用可能なデバイスは、主として、伝導性の気道（例えば、喘息において）における薬物の局所効果を達成するために、開発された。これらのデバイスとしては、ネブライザ、軽量要領吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）が挙げられる。
【００１２】
生物薬物的薬剤を投与するためのネブライザの使用は、多くの重要な制限を有する。このような薬物は、しばしば、水溶液中で非常に不安定であり、そして容易に加水分解される。さらに、噴霧のプロセスは、これらの化合物に高いせん断応力を付与し、これは、タンパク質の変性をもたらし得る。これは、特別な問題である。なぜなら、生じる液滴の９９％が、次の投薬の間に噴霧されるように、リザーバー内にリサイクルされるからである（６）。さらに、ネブライザによって生成される液滴は、不均一であり、このことは、下気道への乏しい薬物送達を生じる。タンパク質溶液をＭＤＩ中で噴霧するために使用される推進薬（クロロフルオロカーボン、および次第に増加しているものは、ヒドロフルオロアルカン）もまた、タンパク質の変性に寄与し得る。
【００１３】
ネブライザおよびＭＤＩに対する有望な代替物は、ＤＰＩであり、これは、乾燥形態でタンパク質を送達する。ＭＤＩと同様に、現在認可されているほとんどのＤＰＩは、喘息および慢性閉塞性肺疾患の管理のための、局所的に作用する薬物（例えば、喘息治療薬）の肺薬物投与のために製造される。
【００１４】
吸入の投薬経路による全身の治療におけるほとんどの努力は、糖尿病に向いてきた。最近まで、研究者らは、非侵襲性に送達されるインスリンが、現実的な臨床アプローチを得るためには低すぎるバイオアベイラビリティに関連すると考えていた。しかし、次第に増えている証拠は、吸入されるインスリンが効果的であり、十分に許容され、注射されるインスリンの非侵襲性の代替物であり、そしてインスリンの吸入治療が第３期の臨床治験であることを示唆する。
【００１５】
インスリンは、単一の遺伝子を起源とするαサブユニットおよびβサブユニットから作製される。その機能的組換え酵素は、約５．９〜６．９ＫＤであるが、生理学的条件下では、ネイティブのインスリンは、約３１．２〜３２．８ＫＤの六量体として存在することを示唆する証拠が存在する。従って、インスリンは、非常に小さいタンパク質であり、このことは、インスリンの、吸入送達における成功の原因であり得る。吸入治療によって送達されている、他の代謝性ホルモンもまた、小さい：カルシトニン（３５ＫＤ）、ＨＧＨ（２２ＫＤ）、ＴＳＨα（１３ＫＤ）、ＴＳＨβ（１５〜１６ＫＤ）、ＦＳＨ（３６ＫＤ）およびソマトスタチン（２ＫＤ）。ヘパリン（２０ＫＤ）もまた、抗凝固剤として、吸入送達によって試験されている。大きさに加えて、バイオアベイラビリティの程度もまた、肺における加水分解酵素に対する治療タンパク質の感受性に依存し得る。より大きいタンパク質の吸入療法に関しては、ほとんど努力がなされていない。これはおそらく、より大きいタンパク質を首尾よくエアロゾル化すること、送達すること、および吸収することの困難に起因する。
【００１６】
本発明者らが知る限り、凝固タンパク質の肺送達には、誰も成功していない。これはおそらく、これらの大きいサイズ、およびこれらの有名な溶液中での不安定性に起因する。グリコシル化第ＩＸ因子は、５５ＫＤであり、第ＶＩＩＩ因子は、２００ＫＤであり、そして第ＸＩ因子は、１４０〜１５０ＫＤである。従って、これらのタンパク質は、上で議論されたタンパク質よりかなり大きい。Ｇｕｐｔａ（２９）は、凝固因子の肺送達を試みたが、ヒト第ＩＸ因子は、噴霧の間に分解することが見出された。このことは、ネブライザによって付与されるせん断力、またはこのプロセスの間に生じる大きい空気−水界面に起因することが仮定された。
【００１７】
本明細書中に記載される研究より前には、第ＩＸ因子と同様に大きくかつ繊細なタンパク質を、誰も首尾よくエアロゾル化し、そして肺系に送達していない。さらに、現在まで、誰も、血友病を吸入療法によって首尾よく処置していない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、一般に、エアロゾル化された第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）を用いて、血友病を処置する方法に関する。この方法において、エアロゾル化されたＦ．ＩＸは、２μｍと４μｍとの間の質量中央空気力学直径（ＭＭＡＤ）を有し、少なくとも５０％の３．３μｍ未満の微細粒子割合百分率（ＦＰＦ％＜３．３μｍ）を有し、少なくとも９０％がモノマータンパク質であり、エアロゾル化後の活性／エアロゾル化前の活性が、少なくとも８０％であり；そして２０％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有する乾燥粉末である。このエアロゾルは、ゆっくりと最大に吸入されて、このＦ．ＩＸを、肺組織の深部に堆積させ、引き続いて、最大に呼気される。
【００１９】
吸入されたＦ．ＩＸは、吸入投与後に、いくらかの時間にわたって、肺内に封じ込められるようであるので、この方法はまた、血友病の出血の予防的処置のために、出血の事象の前にもまた適用可能である。従って、毎週または２週間後との、Ｆ．ＩＸの適用は、蓄積効果を生じ、十分なＦ．ＩＸが、投与の２〜４日後でさえも、出血を予防するために利用可能なままであることを可能にする。
【００２０】
好ましい実施形態において、ＭＭＡＤは、２〜５μｍ、２．８〜３．６μｍ、または３〜３．５μｍであり、ＰＰＰ％＜３．３μｍは、少なくとも６０％または６４％であり、そしてモノマー含有量は、少なくとも９５％または９７％である。エアロゾル化後の活性／エアロゾル化前の活性は、少なくとも８５％であり、好ましくは、９０％または９５％である。水含有量は、好ましくは、非常に低く、１０％または５％程度である。さらに好ましいのは、Ｆ．ＩＸが、アルコールなしでエアロゾル化される方法である。なぜなら、アルコールは、スプレー乾燥された粉末の長期間の貯蔵に対して、ネガティブに影響を与えるようであるからである。組換えＦ．ＩＸの使用もまた、好ましい。
【００２１】
好ましい実施形態は、表面活性なジペプチドまたはトリペプチドを、賦形剤として使用する。本発明において使用するための、ジロイシル含有トリペプチドは、式Ｘ−Ｙ−Ｚを有するトリペプチドであり、ここで、少なくともＸおよびＹ、またはＸおよびＺは、ロイシル残基である。特に好ましいものは、ジロイシンまたはトリロイシン／Ｆ．ＩＸの比が、約０．５〜１．５ｗ／ｗまたは４５／４０ｗ／ｗである、ジロイシン賦形剤またはトリロイシン賦形剤である。
【００２２】
エアロゾル化されたＦ．ＩＸの組成物、および微細な乾燥Ｆ．ＩＸを含有するブリスターパックもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００２３】
「ロイシン」とは、単一のアミノ酸として存在しようと、ペプチドのアミノ酸成分として存在しようと、アミノ酸のロイシン、およびロイシンの修飾形態（すなわち、ロイシンの１つ以上の原子が、別の原子または官能基で置換されているロイシン）をいい、このロイシンは、ラセミ混合物であっても、そのＤ体またはＬ体のいずれかであってもよい。この修飾形態において、修飾されたアミノ酸またはペプチドの分散増強効果は、未修飾物質の効果からさほど大きくは変わらない。
【００２４】
「ジペプチド」とは、２つのアミノ酸からなるペプチドをいう。「トリペプチド」とは、３つのアミノ酸からなるペプチドをいう。
【００２５】
「表面活性」材料とは、この材料が溶解した場合に、液体の表面張力を低下させる能力によって特徴付けられる、表面活性（例えば、表面張力によって測定される）を有する材料である。表面張力（これは、液相と別の相との間の界面に関連する）とは、表面分子が内向きの引力を示すために利用される、液体の特性である。
【００２６】
「乾燥粉末」とは、特定の処方に依存して、約２０％の水分、好ましくは、約１０％の水分、より好ましくは、約５〜６％未満の水分、そして最も好ましくは、約３未満％の水分を含有する、粉末組成物をいう。
【００２７】
「肺送達に適切な」乾燥粉末とは、（ｉ）吸入デバイスにおいて／吸入デバイスによって、容易に分散されること、および（ｉｉ）粒子の一部分が肺に達するように、被験体によって吸入されることが可能な、固体を含有する組成物をいう。このような粉末は、「呼吸可能」であるとみなされる。「エアロゾル化」粒子とは、気体ストリーム中に分散される場合に、この気体内に、粒子の少なくとも一部分が患者によって吸入されるために十分な量の時間にわたって分散され、その結果、これらの粒子の一部分が肺に達する、粒子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（発明の実施形態の説明）
本発明は、ヒト組換え第ＩＸ因子に関して例示される。しかし、本明細書中で得られる知識を用いて、より大きい凝固因子（例えば、Ｆ．ＶＩＩＩおよびＦ．ＩＸ）のエアロゾル課が、試みられる。これらの因子は、Ｆ．ＩＸよりかなり大きく、そして吸入療法によって投与することが、より困難であり得る。しかし、これらの短縮型機能的フラグメントを投与することが、可能であり得る。
【００２９】
本発明は、３．５μｍ未満のＭＭＡＤ、０．５０より大きいＦＰＦ、および９５％より大きいモノマー含有量を有する、乾燥されたエアロゾル化凝固因子粉末の吸入療法によって、血友病を処置する方法を提供する。このような粉末は、肺組織への局在を可能にし、血友病の処置のために理想的な活性凝固因子のゆっくりとした放出を生じる。
【実施例】
【００３０】
（実施例１：液体の第ＩＸ因子の気管内投与を介する血友病の処置）
概念の確認のために、本発明者らは、液体のヒト組換え第ＩＸ因子（ｒＦ．ＩＸ）を、血友病Ｂのイヌモデルにおいて、気管内で（ＩＴ）堆積させた。液体のＩＴ ｒＦ．ＩＸが、バイオアベイラビリティを示した場合、本発明者らは、さらに進み、同じモデル系において、このタンパク質のエアロゾル化された乾燥粉末形態を試験する。
【００３１】
血友病Ｂのイヌ：Ｃｈａｐｅｌ ＨｉｌｌのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ ＣａｒｏｌｉｎａのＦｒａｎｃｉｓ Ｏｗｅｎ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの閉じたコロニーからの血友病Ｂのイヌを、この研究において使用した。これらのイヌにおける原因となる分子欠損は、第ＩＸ因子分子の触媒ドメインにおけるミスセンス点変異（ヌクレオチド１４７７におけるＧからＡ）であり、循環Ｆ．ＩＸの完全な非存在を生じる（６）。血友病Ｂのイヌのこの株は、機能アッセイにおける検出可能なＦ．ＩＸ活性も、ＥＬＩＳＡまたは免疫ブロットによる抗原も、有さない（７、８）。全ての動物を、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ出版Ｎｏ．８５−２３）における標準に従って、処置した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、全ての実験を認可した。
【００３２】
ヒト組換え第ＩＸ因子（ｒＦ．ＩＸ）：ｒＦ．ＩＸは、以前に記載されたように（９〜１１）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ（現在、Ｗｙｅｔｈ）によって調製された。この調製物は、非常に濃厚であり、Ｆ．ＩＸ活性が、約１２，５００ＩＵ／ｍｌであり、そしてタンパク質濃度が、約３９ｍｇ／ｍｌであった。ｒＦ．ＩＸを、投与されるまで、そのビヒクル処方緩衝液中で貯蔵した（１２）。
【００３３】
インビボ実験：９匹の血友病Ｂのイヌを、３つの処置群のうちの１つに、無作為に割り当てた：２００ＩＵ／ｋｇ（ｎ＝３）もしくは１０００ＩＵ／ｋｇ（ｎ＝３）の気管内投与、または２００ＩＵ／ｋｇの静脈内注入（ｎ＝３）。ｒＦ．ＩＸの気管内用量を受けたイヌを、プロポフォルまたはメデトミジン塩酸塩で鎮静させ、そして手順の間、示される場合、イソフルオラン（ノーズコーンを介して２〜４％）での麻酔の外科手術面に維持した。気管内（ＩＴ）投与については、内視鏡を、左右の気管支に挿入した。７フレンチ（直径約２ｍｍ）の三重管腔肺動脈カテーテルを、内視鏡の案内の下で、適切な気管支に挿入した。用量（１ｍｌの体積）を、左右の気管支の間に等しく分配し、そしておよそ２分間にわたって注入した。ｒＦ．ＩＸの注入後、このカテーテルを、２ｍｌの０．９％生理食塩水でフラッシュした。比較実験において、静脈内（ＩＶ）用量を、ボーラスとして、２〜３分間にわたって、頭部の静脈に注入した。
【００３４】
サンプリングプロトコル：血液サンプルを、ｒＦ．ＩＸの投与の前後に、以下の時点で採取した：０分、５分、１５分、３０分、および１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、および７２時間。全血を、静脈穿刺によって引き抜き、そして４％クエン酸ナトリウム中に、全血８部に対して抗凝固剤１部の最終濃度で収集した。血漿を調製し、そして分析されるまで、−８０℃で凍結させた。抗Ｆ．ＩＸ抗体利器化に対する血清サンプルを、ｒＦ．ＩＸ投与の前、ならびに５日後、１０日後、１５日後、および２８日後に採取した。全血凝固時間を実施するための全血を、各群において選択されたイヌから、処置の２時間後に得た。完全な血液計数（ＣＢＣ）を、ｒＦ．ＩＸ予備処理を受けた、処理後４８〜７２時間のイヌに対して実施した。胸部Ｘ線写真を、ＩＴ群由来のイヌに対する同じ時点において得た。研究の終了時に、これらのイヌを、過剰用量のペントバルビタールによって殺し、そして剖検を実施した。
【００３５】
全血凝固時間（ＷＢＣＴ）：ＷＢＣＴを、以前に記載されたように実施した（７、１３〜１５）。ＷＢＣＴは、代表的に、Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌコロニー由来の未処理の血友病Ｂのイヌにおいて、５０分より大きい（１４、１５）。このコロニーにおける正常な健常なイヌにおけるＷＢＣＴについての参照範囲は、８〜１２分である。ＷＢＣＴを、ＩＴ群から選択された３匹のイヌにおける処置の２時間後に決定した。これは、２００ＩＵ／ｋｇ ＩＴを受けた１匹のイヌにおいて、２３．５分に短縮され、そして１０００ＩＵ／ｋｇ ＩＴを受けた、試験された２匹のイヌのうちの１匹において、２１．５分に短縮される。処置の２時間後にアッセイされる場合、ＩＶ群からのこれらの全てのイヌにおけるＷＢＣＴを、９．５分に補正した。
【００３６】
Ｆ．ＩＸ活性：Ｆ．ＩＸ凝固アッセイを、Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ １８０（ＭＤＡ−１８０、ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥＫＮＩＫＡＴＭ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）（４）での改変したＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｂｌａｓｓｔｉｎ Ｔｉｍｅ（ＡＰＴＴ）試験を使用して決定した。コントロール標準は、１ＩＵのｒＦ．ＩＸを含有する、１ｍｌのプールされたＦ．ＩＸ欠損イヌ血漿から調製された、希釈物からなった。
【００３７】
Ｆ．ＩＸ活性（図１）は、ｒＦ．ＩＸの注入前に、いずれのイヌにおいても検出されなかった。ＩＴ投与後、Ｆ．ＩＸ活性が、注入の１８時間目に検出され、そして７２時間目にも依然として測定可能であった。血漿レベルにおける小さい差が、２つのＩＴ用量の間で注目された。ｒＦ．ＩＸの静脈内投与は、以前の研究（４）において報告されたように、即時の二双性の応答を生じた。Ｆ．ＩＸ活性は、注入の５分後に、７２時間にわたって検出され、そして最大活性は、ＩＶ投与によって達成された。
【００３８】
Ｆ．ＩＸ抗原濃度：Ｆ．ＩＸ抗原濃度を、二重モノクローナル抗体サンドイッチ酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（１２）を使用して、決定した。この研究におけるＥＬＩＳＡの下限は、約３８ｎｇ／ｍｌであった。この限界未満の全ての値を、１ｎｇ／ｍｌ未満と仮定した。
【００３９】
Ｆ．ＩＸ抗原濃度（図２）は、３つ全ての群におけるＦ．ＩＸ活性についてみられたものと類似のパターンに従った。Ｆ．ＩＸ抗原は、ＩＶ群における第一の血液サンプル（５分）において検出されたが、両方のＩＴ群においては、８時間目まで検出されなかった。予測されたように、検出可能な最も高い抗原濃度は、ＩＶ群において見出された。
【００４０】
薬物動力学分析：薬物動力学分析を、ＩＶ群とＩＴ群との両方について、活性時間データに対して実施した。２区分モデル（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ，ＰＨＡＲＳＩＧＨＴ ＣＯＲＰ．ＴＭ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）は、ＩＶデータ（モデル８）を最もよく説明し、そして遅れ時間を用いる１区画モデルは、ＩＴデータ（モデル４）を最もよく説明した。数値の逆重畳分析もまた、吸収の速度および程度を理解するために、これらのデータに対して実施した（１６）。
【００４１】
２つのＩＴ群をＩＶ群と比較する表１は、最も高い平均最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）が、ＩＶ投与を用いて起こることを示した（１５７．３±２９．３ＩＵ／ｄｌ）。２０ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群におけるＣｍａｘについての平均値は、それぞれ、４．７±０．５ＩＵ／ｄｌおよび６．５±０．５ＩＵ／ｄｌであった。ＩＶ投与後の全曝露（曲線下面積；；ＡＵＣ０−∞）は、２７１６＋／−１６４ＩＵ／ｋＬ×時間であった。対照的に、ＩＴ投与後の全曝露は、２００ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群について、それぞれ３０６＋／−２０．８ＩＵ／ｄＬ×時間および６６６＋／−１２７ＩＵ／ｄＬ×時間であった。平均Ｔ１／２は、ＩＶ群、２００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群および１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群について、それぞれ２４．２±１０．７時間、３０．７±５．３時間、および４６．４±２９．２時間であった。
【００４２】
【表１】
半減期は、Ｆ．ＩＸ光源曲線（図２）よりも、Ｆ．ＩＸ活性曲線（図１）において、より長いようであることが、注目されるべきである。しかし、これらのサンプルは、同時に調製された。Ｆ．ＩＸ ＥＬＩＳＡは、３８ｎｇ／ｍｌの閾値感度を有すると決定された。活性アッセイは、このＥＬＩＳＡよりも感受性であるので、この活性アッセイは、Ｆ．ＩＸクリアランスのより正確な表現であるようである。最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ（時間））は、２つのＩＴ用量の間で類似であり、それぞれ、２１．１±３．４および３０．０±６．３であった。ＩＴ投与後のバイオアベイラビリティは、２００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群について１１．３％、そして１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群について４．９％であった。
【００４３】
２００ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとの両方のＩＴ用量群について経時的に吸収された累積量（図３に示される）は、２つの用量についての吸収速度が、類似ことを示す。なぜなら、これらの２つの曲線の傾斜が、類似であるからである。しかし、吸収された総量は、これらの２つの用量について異なった。２００ＩＵ／ｋｇのＩＴ用量について、吸収された総量は、約２１ＩＵ／ｋｇであり、そして１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群については、吸収された総量は、約３７ＩＵ／ｋｇであった。従って、これらの２つの用量群の間で、吸収された量の増加は、非比例的である。
【００４４】
この観察は、図４においてさらに注目され得る。逆重畳分析によって計算された、吸収された総量の百分率は、２００ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ用量群について、それぞれ約１．２％および約３．７％であった。これらのデータは、２００ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇの用量群について、それぞれ１１．３％および４．９％のＡＵＣ０−∞の比較によって計算された、これらの２つの群についてのバイオアベイラビリティ値と類似である。
【００４５】
抗ヒトＦ．ＩＸ抗体分析：処理されたイヌ由来のイヌ血清における抗ヒトＦ．ＩＸ抗体についての力価を、イヌ抗ヒトＦ．ＩＸ ＩｇＧ抗体に特異的なＥＬＩＳＡを使用して、決定した（１２）。所定のイヌについての抗体力価は、ネガティブコントロールと比較される場合に、光学密度（ＯＤ）シグナルの２倍の増加を生じる血漿サンプル希釈として、任意に規定する。このアッセイについての感度の閾値は、２０任意単位である。
【００４６】
血友病Ｂの成体イヌは、慣用的に、ヒトＦ．ＩＸに対する抗体を発生させる。抗ヒトＦ．ＩＸ抗体力価を、投与の１０日後までに、両方のＩＴ群由来の全てのイヌにおいて決定した（表２）。ＩＶ群由来の３匹のイヌのうちの２匹は、同じ時点で、検出可能な抗体力価を有した。抗ヒトＦ．ＩＸ抗体力価を、１５日目までに、これらのイヌのすべてにおいて低下し、これは、この研究の２８日目にわたって残存した。
【００４７】
【表２】
臨床プロフィールおよび免疫応答：濃縮されたｒＦ．ＩＸの気管内投与は、以前には試みられなかった。従って、これらのイヌを、任意の有害な応答について、臨床的にモニタリングした。咳は、２００ＩＵ／ｋｇ用量のＩＴのイヌにおいても、ｒＦ．ＩＸをＩＶで受けたイヌにおいても、注目されなかった。１０００ＩＵ／ｋｇ用量をＩＴで受けたイヌは、穏やかな、一時的な咳を、注入後約４５分〜１時間で有し、これは、１時間より長くは続かなかった。異常な肺音は、いずれの動物においても、聴診の際に注目されなかった。両方のＩＴ群のイヌからの、処置前および処置後の気管支のＸ線写真は、気道または肺の柔組織の外観において、いかなる変化も検出しなかった。処置の前および４８時間後もしくは７２時間後のＣＢＣは、３つ全ての処置軍において、顕著ではなかった。気道または肺の柔組織における大きい異常な知見は、処置の１ヵ月後に実施した剖検において、注目されなかった。
【００４８】
（実施例２：第ＩＸ因子のエアロゾル化）
液体のＲＦ．ＩＸの期間投与は、安全かつ効率的であることが示されたので、本発明者らは、次に、ＲＦ．ＩＸを得るゾル化することを試みた。組換えヒト第ＩＸ因子は、グリコシル化されなければ４７ｋＤであり、そしてグリコシル化されると５５ｋＤである、糖タンパク質である。現在の薬学的処方物は、凍結乾燥された粉末である。なぜなら、液体のＦ．ＩＸは、不安定である傾向があるからである。粉末処方物もなお、周囲のレベルの湿度に曝露される場合、酸化および分解を受けやすい。従って、本発明者らは、予測される不安定性を最小にする試みにおいて、乾燥粉末のエアロゾル化された粉末を使用することを選択する。
【００４９】
ｒＦ．ＩＸ粉末についての目標エアロゾル特性は、５０％より大きい初期放出用量（ＥＤ）値、３．５μｍ未満の平均中央空気力学的直径（ＭＭＡＤ）、および０．５０より大きい微細粒子割合（ＦＰＦ＜３．３μｍ）であった。化学的および物理的に安定な粉末を、最初のスプレー乾燥溶液特徴に対して５％未満の純度の損失を有し、形態学的に可視の変化がなく、目標範囲内のＥＤ、ＭＭＡＤおよびＦＰＦを有し、そしてブリスターパッケージ中で４週間、４０℃／０％相対湿度に曝露された後に、粒子サイズ分布に変化を有さないとして分類した。
【００５０】
処方物：研究１および研究２のためのｒＦ．ＩＸ溶液は、１０ｍＭヒスチジン、２６０ｍＭグリシン、１％スクロース、０．００５％ポリソルベート−８０（ｐＨ６．８）中での、それぞれ１２ｍｇ／ｍＬおよび２．２６ｍｇ／ｍＬの濃度で処方された、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製であった。溶液を、１．２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）と一緒に、ＡＭＩＣＯＮＴＭ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＴＭ）ユニットに通してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションのために使用した緩衝液の総体積は、もとの溶液体積の約４〜５倍であった。最後の一次ストック溶液の濃度は、ＵＶによって測定した場合、研究１については１２ｍｇ／ｍＬであり、そして研究２については１１．５ｍｇ／ｍＬであった。処方物を、表３に記載されるように、水中０．５％の全固形分を使用して、調製した。
【００５１】
【表３ａ】
＊１．１７グリコシル化／非グリコシル化ｒＦ．ＩＸ．の比として、グリコシル化ｒＦ．ＩＸ（ｇ−ｒＦ．ＩＸ）の重量から計算したｒＦ．ＩＸの重量
＊＊ニート：１０ｍＭ ヒスチジン／２６０ｍＭ グリシン／１％ スクロース／０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０
【００５２】
【表３ｂ】
ＫＲＵＳＳ Ｋ１２ ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ ＴＥＮＳＩＯＭＥＴＥＲＴＭを用いて周囲条件で表面張力測定を行った。水を参照として使用し、これを測定すると、７２．５ｍＮ／ｍであった。溶液を、粉体加工（ｐｏｗｄｅｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）する前に分析した。噴霧乾燥する直前に、その溶液のｐＨを、ＯＲＩＯＮＴＭ モデル７２０Ａ ｐＨメーターを使用して室温でチェックした。ｐＨ７．０および１０．０の標準物質で、２点補正を行った。結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
エアロゾル化。改良型サイクロン、アトマイザーノズルおよび粉体収集容器を備えるＢｕｃｈｉ １９０ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ（ＢＲＩＮＫＭＡＮＴＭ）で、上記の１１の処方物を噴霧乾燥した。そのＢｕｃｈｉ噴霧乾燥機のアトマイザーを、研究１については６０ｐｓｉ、および研究２については４０ｐｓｉに設定した圧縮乾燥空気で作動させた。そのＢｕｃｈｉへの液体流速は、両方の研究とも、５ｍＬ／分であった。出口温度を、研究１については７０℃に、および研究２については６０℃に設定した。そのＢｕｃｈｉを通る総空気流は、１７．８ｓｃｆｍであった。バッチサイズは、６７５〜１，３５０ｍｇであり、収率は、１１ロットについて、２０〜６７％であった。その使用した収集器は、硼珪酸ガラスから作製された１／２インチまたは１インチであった。
【００５４】
ブリスターパック。その粉体を、資格のある人員により手で全て充填した。その粉体を、相対湿度が５％未満のグローブボックスに移した。その使用されたブリスター形態は、Ｐ３．０５ ＰＶＣブリスターであった。その粉体７．５±０．１５ｍｇを、各ブリスターに充填し、ふた（ｌｉｄｓｔｏｃｋ）を上部に置き、そのブリスターパックを密封した。その密封温度は、１秒の滞留時間で１７１℃（±５℃）であった。次いで、そのブリスターパックをダイカットして、そのデバイスに適合させた。
【００５５】
安定性試験。エアロゾル試験、熱試験、物理的試験および化学的試験を、初期条件下で、ならびに制御温度および相対湿度で２〜３週間保存した後に行った。処方物粉体を、ＰＶＣブリスターパックに充填し、放出された用量（ｅｍｉｔｔｅｄ ｄｏｓｅ）、粒径分布および熱分析についてアッセイした。化学的特徴付けおよび走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）検査を、バルクエアロゾル薬物粉体について、初期条件下で行った。全ての粉体を、相対湿度が５％未満の、湿度制御されたグローブボックス中で扱った。
【００５６】
促進保存条件（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。研究１の処方物についてのバルクエアロゾル薬物粉体を乾燥させ、２〜８℃および４０℃（０％ ＲＨ）、ならびに２５℃（０．３３ＲＨおよび７５％ＲＨ）で保存した。研究２の処方物についてのバルクエアロゾル薬物粉体を、２種類の温度条件（２５℃および４０℃）および両方の温度条件につき２種類の相対湿度（０％および７５％）の条件で保存した。
【００５７】
バルクエアロゾル薬物粉体を、グローブボックス中で硼珪酸ガラスバイアル中に秤量した。０％ ＲＨ安定性サンプルについては、バイアルにキャップをし、乾燥剤を有するホイル上包装パウチに入れ、温度制御チャンバ中で保存する前に熱シールした。湿度制御安定性サンプルについては、バイアルを開いたままにし、適切な温度の湿度制御チャンバ中で保存した。サンプルを、２週間後または３週間後に、ＵＶ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＥＭで分析した。
【００５８】
エアロゾル試験。米国特許第６，２５７，２３３号に記載されるようなデバイスを使用して、全てのエアロゾル試験を行った。そのデバイスを、まず、ブリスターパックをデバイスに挿入し、デバイスハンドルを引っ張り、次いで、そのハンドルを押し下げてそのデバイスを加圧することでチャンバを圧縮することにより、準備される。そのデバイスを、ボタンを押して作動させ、そのブリスターパックを持ち上げ、そのパックを穿刺し、その粉体をデバイスのチャンバに分散させ、エアロゾルの雲（ｃｌｏｕｄ）を形成した。充填したブリスターパックの全てを、エアロゾル試験に使用するまで、乾燥ボックス中で保存した。
【００５９】
放出される用量。エアロゾルを、そのデバイスのチャンバのマウスピースの上のホルダに配置されたガラス繊維フィルタ上に収集した。放出された用量％（ＥＤ％）を測定するために、ブリスターパックを、そのデバイスを使用してエアロゾルとして分散させ、その粉体サンプルを、空気流速３０Ｌ／分で２．５秒間にわたり（自動タイマーにより制御した）チャンバからエアロゾルを引き出すことによって、予め秤量したガラス繊維フィルタ（ＧＥＬＭＡＮＴＭ，４７ｍｍ直径）上に収集した。このサンプリングパターンは、患者のゆっくりとした深呼吸を模倣する。ＥＤ％を、そのフィルタ上に収集された粉体の質量を、ブリスターパック中の粉体の質量で除算することにより計算した。報告される各結果は、１０回の測定値の平均および標準偏差であった（表５）。
【００６０】
粒径。８段階（９．０μｍ、５．８μｍ、４．７μｍ、３．３μｍ、２．１μｍ、１．１μｍ、０．７μｍ、および０．４μｍの孔サイズ）のカスケードインパクター（ＡＮＤＥＲＳＥＮ ＣＡＳＣＡＤＥ ＩＭＰＡＣＴＯＲＴＭ）を使用して、粒径分布を測定した。各測定値を、そのデバイス中に５ｍｇ充填重量の５つのブリスターパックを分散させることによって得た。２．５秒間にわたって（自動タイマーにより制御した）補正流速２８．５Ｌ／分で、そのインパクターを通して真空を引き出した（表５）。ＭＭＡＤは、カスケードインパクションにより決定されたエアロゾル化粉体の空力的粒径分布の中間点またはメジアンである。
【００６１】
ＦＰＦ％＜３３μｍもまた、カスケードインパクターを用いて得た。微細粒子画分％＜３．３μｍは、流速１立方フィート／分（ｃｆｍ）（２８．３Ｌ／分）のみで操作した場合、そのＡｎｄｅｒｓｅｎインパクターの段階３の下で総重量である。（その段階４、５、６、７および８からの合計質量）÷（全ての段階で回収された総質量）が、報告された値である。
【００６２】
【表５Ａ】
＊ＲＳＤ＝標準偏差／平均×１００
【００６３】
【表５Ｂ】
形態。走査型電子顕微鏡を利用して、噴霧乾燥した粉体に関する初期形態情報を得、安定後の形態における変化を評価した。全てのサンプルを、相対湿度が５％未満のグローブボックス中で調製した。サンプルを、アルミニウムのＳＥＭスタブ上の両側炭素テープに取り付けたシリコンウェハに置いた。次いで、その置かれた粉体を、７５ｍトルおよび３８ｍＡにて６０〜９０秒間、金：パラジウムを用いてＤｅｎｔｏｎスパッターコーティング機でスパッターコーティングした。このことにより、約１５０オングストロームのコーティング厚が生じる。Ｅｖｅｒｈａｒｔ−Ｔｈｏｒｎｌｅｙ検出器を用いて高真空モードにおいて作動させたＰｈｉｌｉｐｓ ＸＬ３０ ＥＳＥＭで画像を撮って、画像合成のための二次電子を捕捉した。加速電圧は、ＬａＢ６供給源を用いて３〜１０ｋＶであった。作業距離は、約５μｍである。
【００６４】
ロット４（エタノール中のニート処方物）以外の全ての粉体は、安定プロトコルに記載される温度およびＲＨ条件において２週間または３週間のいずれかで保存した後で、形態において評価できるほどの変化を何ら示さなかった。そのエタノール粉体は、７５％ ＲＨ、４０℃で形態変化を示した。加速保存条件下で、エタノール処方物は、初期と比較した場合、より多くのしわが寄り、いくらかの断片を含んでいた。
【００６５】
残留溶媒。噴霧乾燥後の粉体中の残留溶媒含有量を、ＴＡ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳＴＭ（Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）ＴＧＡを用いて、ＴＧＡにより決定した。約３ｍｇの粉体を、相対湿度が５％未満のグローブボックス中で密閉アルミニウムパンにパックした。分析前に、そのパンをピンで穿刺し、装置に装填した。使用した方法を、室温から１７５℃まで１０℃／分で実行した（表６）。
【００６６】
【表６】
タンパク質安定性。いくつかの技術を使用して、凝集および分解についてサンプルを分析した。可溶性の凝集物を、ＳＥ−ＨＰＬＣにより定量的に測定した。そのＨＰＬＣは、ＷＡＴＥＲＳＴＭシステム、Ａｌｌｉａｎｃｅモデル２６９０であった。このクロマトグラフィーシステムは、溶媒送達システム、発光ダイオードアレイ検出器、温度制御自動サンプラーおよびデータ管理システムを装備していた。移動相は、５０ｍＭ リン酸ナトリウムと１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０に調節）からなっており、１ｍＬ／分で定組成で（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）実施であった。カラムは、ＴＯＳＯＨＡＡＳＴＭ ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ、５μｍ孔サイズ、ガードカラム付き）であった。サンプルを、水で１ｍｇのｒＦ．ＩＸペプチド／ｍＬの濃度に再構成したかまたは希釈した。サンプルを、注入するまで５℃で保存した。クロマトグラムを抽出し、２１４ｎｍで処理した。噴霧乾燥前の、処方した溶液のモノマー含有量％を、その対応する再構成したエアロゾル薬物粉体と比較した。
【００６７】
ＵＶ分光光度分析を利用して、サンプルの混濁度（凝集／沈殿）を評価した。ＨＩＴＡＣＨＩＴＭ Ｕ−３０００（デュアルビーム分光光度計）で測定を行った。機器のパラメーターを、スキャン速度３００ｎｍ／分；１．０ｎｍスリット幅；およびスキャン範囲４００ｎｍ〜２００ｎｍに設定した。サンプルを、粒状物質について目視により検査した。不溶性凝集物を、ＬＴＶでその溶液の混濁度を測定することにより、定量的に決定した。散乱について補正するための線形回帰を、吸光度値３５０ｎｍ、３７５ｎｍおよび４００ｎｍから行った。光散乱について補正したλ最大での吸光度を、回帰直線についての式から外挿した。不溶性凝集物％は、以下の式１に示されるように、λ最大で補正していない吸光度で割った光散乱について補正した吸光度の％である：
不溶性凝集物％＝Ａｂｓλ最大（光散乱補正）／Ａｂｓλ最大（光散乱非補正）
５％の不溶性凝集物未満の値を、処方物安定の指標についての基準として設定した。サンプルを、水で０．１ｍｇのｒＦ．ＩＸペプチド／ｍＬの濃度に再構成したかまたは希釈した。
【００６８】
噴霧乾燥前（プレＳＤ）および噴霧乾燥後の全ての溶液サンプルは、粒状物質の目に見える兆候は何らなかったか、または５％未満の不溶性凝集物を有した。温度安定および湿度安定に配置した研究１および研究２における全てのサンプルは、粒状不溶性凝集物物質も検出可能な不溶性凝集物も目に見える徴候を何ら示さなかった。５％未満の不溶性凝集物を、全てのバッチについて式１を用いて計算した。従って、表７は、ＳＥ−ＨＰＬＣによってのみ収集されたデータである。
【００６９】
【表７】
可溶性凝集物および分解を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥみにんらすに定性的に測定した。ＮＯＶＥＸＴＭ成形済み４〜２０％ トリス−グリシンゲルを、ＮＯＶＥＸ ＸＣＥＬＬ ＩＩＴＭ電気泳動ミニセルで泳動させた。サンプルを、水で０．１ｍｇのｒＦ．ＩＸペプチド／ｍＬの濃度に再構成したかまたは希釈した。溶液を、還元条件下および非還元条件下で調製して、各レーンに１μｇのタンパク質の充填を送達した。還元サンプルは、２−メルカプトエタノールで処理された。ゲルを、ゲルの先頭が底部に達するまで（約１．５時間）１２５Ｖ、２５ｍＡ／ゲルで泳動させた。増大した感度についてＮＯＶＥＸ ＳＩＬＶＥＲ ＸＰＲＥＳＳＴＭ 染色キットを用いて、銀染色検出を使用した。２週間、２５℃および２週間、４０℃の安定時間点で研究１および研究２両方の代表的処方物からのサンプルを使用して、還元ゲルおよび非還元ゲルを調製した。これらのゲルを泳動させる目的は、レーンに５μｇのタンパク質を負荷して、１μｇのタンパク質負荷では見出されなかった任意の弱いバンドを検出することであった。
【００７０】
噴霧乾燥する前の処方溶液と再構成したエアロゾル薬物粉体間のゲルプロフィールに何ら変化はなかった（データは示さず）。ゲル上の全てのサンプルのモノマーバンドおよびｒＦ．ＩＸのコントロールは、報告されている値よりも高分子量で泳動し（約６５ｋＤａ）、広くかつ拡散しているようである。これは、タンパク質のグリコシル化およびｒＦ．ＩＸのゲルを介する移動をもたらすことに寄与する可能性が最も高い。モノマーバンドの他に、ｒＦ．ＩＸａおよびｃ末端ペプチドに寄与する他のバンドが存在した。しかし、噴霧乾燥薬物粉体と再構成したエアロゾル薬物粉体との間に何ら差異はなかった。
【００７１】
まとめ。第２のスクリーニング実験に関して低噴霧圧を選択した後、ｒＦ．ＩＸ粉体処方物のエアロゾル性能は、全ての評価で最良に機能するトリロイシン処方物で事業目的を満たした。その放出された用量は、５７％、６２％、７８％、８９％および５０％であり、エアロゾルＭＭＡＤ値は、３．４μｍ、４．２μｍ、２．８μｍ、２．９μｍおよび３．５μｍであり、ニートｒＦ．ＩＸ、５％ エタノール：クエン酸中ｒＦ．ＩＸ、６０％ ロイシン：クエン酸中ｒＦ．ＩＸ、４０％ トリロイシン：クエン酸中ｒＦ．ＩＸおよび３７℃まで加熱したニートｒＦ．ＩＸについては、それぞれ、４９％、３６％、６０％、５８％および４４％が３．３μｍ未満であった。
【００７２】
研究２において、エタノール処方物およびロイシン処方物は各々、モノマー含有量において３％ 低下を有し、はじめに、噴霧乾燥前溶液を、再構成したエアロゾル薬物粉体と比較した。噴霧乾燥前と比較して、はじめに研究２における他の処方物において何ら変化はなかった。２週間の安定研究に基づいて、湿度は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した場合、化学的安定性に関して最も大きな影響を有した。全てのバッチに関して、不溶性凝集物は、ＵＶでは観察されなかった。余分の可溶性凝集物バンドも分解バンドも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して観察されなかった。選択した処方物の凝固活性は、噴霧乾燥に起因して損なわれることはなかった。噴霧乾燥後の活性は、Ｆ．ＩＸアッセイによって測定される場合、噴霧乾燥前に平均８０〜９０％の活性であり、最良の処方物は、９５％以上で機能した。
【００７３】
エタノール（ロット４）噴霧乾燥粉体は、ＳＥＭにより観察した場合に、形態変化を示した唯一の処方物であった。４０℃／７５％ ＲＨでの２週間の安定において、そのエタノール処方物は、よりしわが寄り、断片になったフラグメントを含んでいた。同一の保存条件に曝した場合、他の粉体のいずれにおいても、有意な形態変化は示されなかった。このデータは、肺送達に適した乾燥Ｆ．ＩＸが、アルコールを用いて噴霧乾燥されるべきではないことを示唆する。
【００７４】
（実施例３：インビボでのバイオアベイラビリティー研究）
最初の２つの研究は、１）液体ｒＦ．ＩＸの有効レベルが気管内表面を介して全身に送達できること、および２）乾燥粉体ｒＦ．ＩＸを酵素活性および安定性を維持しながら首尾よくエアロゾル化できることを示した。次の実験は、インビボイヌモデルにおいて処方物６（トリロイシン賦形剤）を用いて、ｒＦ．ＩＸのバイオアベイラビリティーについて試験した。
【００７５】
この研究の目的は、ヒト第ＩＸ因子に対して以前から寛容であった血友病Ｂのイヌにおける経口投与後にヒト第ＩＸ因子の薬力学的パラメーターおよび薬理学的パラメーターを決定することであった。この研究からのデータを、静脈内注射によりヒト第ＩＸ因子を投与するその後の研究からのデータに対して比較する。測定したパラメーターは、以下を含んでいた：１）全血凝固時間（ＷＢＣＴ）、２）Ｆ．ＩＸ抗原（Ｆ．ＩＸ：Ａｇ）、３）活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、４）Ｆ．ＩＸ活性、５）ＥＬＩＳＡによるＦ．ＩＸ抗体、および６）Ｂｅｔｈｅｓｄａインヒビターアッセイ。
【００７６】
イヌ：Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌコロニー（実施例１を参照のこと）に由来する５匹の血友病イヌを、この研究において使用した。使用した５匹のイヌのうち、４匹は、ヒトＦ．ＩＸ寛容性血友病イヌであり、予防に関連した（月曜日および木曜日に８２ＩＵ／Ｋｇ ＳＣ）。２匹のイヌは、最後の投与（木曜日）を受けなかった。代わりに、１日目に吸入により投薬を受けた。１匹のイヌは、ｒＦ．ＩＸを受けなかった。
【００７７】
イヌモデルにおけるエアロゾル送達を評価するために、米国特許第６，２５７，２３３号に記載されるような改良型デバイスを使用した。簡潔には、レギュレーター、ＨＥＰＡフィルタおよび一連のバルブを通して、加圧空気（−５ｐｓｉ）により空気を供給した。パーソナルコンピューター（ＰＣ）は、そのシステムを通る空気の流れを調節した。空気を、改良されているデバイスに、イヌの肺に、カフを介して適所に保持したＥＴチューブを通して送達した。リリーフバルブは、送達される空気が多すぎないようにし、Ｕ字型マノメーターにより、送達空気の圧力を測定した。
【００７８】
コンピューターを使用して、加圧空気の既知容積（約８００ｍｌ）および流速を制御した。その加圧空気を使用して、エアロゾルを気管内チューブを通してイヌに送達した。このシステムにより生成した容積は、麻酔した１０ｋｇのイヌの肺機構に基づいた。麻酔したイヌの合計最大肺容積は、約１４００ｍｌであり、平均送達ボーラスは、８００ｍｌであった。
【００７９】
カテーテルを、以下の手順を使用して、研究の比にイヌに入れた。全身麻酔のために、その動物をチオペンタールＮａを使用して鎮静させた。動物を静置し、イソフルランを使用して麻酔を維持した（酸素を補給しながら２〜４％ 吸入）。動物を、心拍数、呼吸数、血圧、ならびに眼瞼反射、角膜反射および耐薬反射（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｒｅｆｌｅｘ）の持続または不在について評価した。局所麻酔および鎮静を要する手順のために、動物に、メジトミジン（Ｍｅｄｉｔｏｍｉｄｉｎｅ）、バリウム（Ｖａｌｉｕｍ）、酒石酸ブロルファノール（Ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ Ｔａｒｔｒａｔｅ）もしくはプロポフォル（Ｐｒｏｐｏｆｏｌ）または類似の麻酔薬／鎮静剤を与えた。
【００８０】
イヌを、２％ イソフルランおよび酸素を用いて１〜４分間過換気させた。このことにより、約３分間持続する無呼吸が生じる。無呼吸の間に、そのイヌを、エアロゾル装置に接続し、８００ｍｌのボーラスの空気をそのシステムを通して与えた。そのシステムのエアロゾル送達を、レーザー、インラインフィルタ、およびバルーンを用いて再度特徴付けして、イヌの肺を模倣した。エアロゾルボーラスの大部分は、約６００ｍｌで送達されたと結論づけられた。
【００８１】
比較のために、イヌに、匹敵する用量の組換えヒトＦ．ＩＸの静脈内注射を与え、同じサンプリングおよび分析プロトコルを用いた。このプロトコルは、吸入研究完了して少なくとも２８日後に開始した。これらのイヌは全て、過去において、それらの特徴付けの一部と類似のＩＶボーラスを有した。
【００８２】
【表８】
投薬量：組換えヒト第ＩＸ因子を、粉体重量で７．５ｍｇを含むブリスターパックとして供給した。そのうち３．９５ｍｇは、糖タンパク質であり、０．５５ｍｇは、クエン酸Ｎａであり、３．０ｍｇは、賦形剤（トリロイシン），ｐＨ６．４であった。各７．５ｍｇのブリスターは、約５ｍｇの粉体を送達する。その比活性は、約３００ユニット／ｍｇタンパク質である。１．０ｍｇの糖タンパク質あたり、８５．５％がタンパク質であり、残りは、糖部分である。
【００８３】
サンプル収集：血液を、以下に列挙する時点で頸動脈または橈側皮静脈から採取した。第ＩＸ因子抗原およびＡＰＴＴの血漿濃度を決定するために、血液サンプル（３．０ｍｌ）を、以下の時点で３．８％ クエン酸含有チューブに回収した：投与直前、投与後０．０８時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、２８時間、３２時間、４８時間、７２時間、および９６時間。さらなる血液サンプルを、抗ヒト第ＩＸ因子抗体の形成およびその濃度を決定するために、投与前、月曜日の皮下投与の直前、連続４週間にわたって１週間に１回、回収した。
【００８４】
その血漿を、４℃で１４分間４５００ｒｐｍで遠心分離することにより分離した。血清を、室温で１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離することにより分離した。その血漿を、１２×７５ｍｍポリプロピレンクライオバイアルに入れて少なくとも３つのアリコートに分けた。全ての血漿／血清含有チューブを、必要時まで約−８０℃で凍結した。
【００８５】
データ分析：第ＩＸ因子の血漿濃度の薬理学的分析を、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、最大血漿濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）、および見かけ上の半減期（ｔ１／２）のようなパラメーターを決定するために行った。分析を、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ ＰＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ ２．０ＴＭ（ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＣＯＮＳＵＬＴＩＮＧＴＭ，Ａｐｅｘ，ＮＣ）有効のコンピュータープログラムまたは等価物を使用して行った。さらに、ＡＰＴＴの血漿濃度および抗体濃度を、時間に対してプロットした。
【００８６】
Ｆ．ＩＸバイオアッセイ：第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）凝固活性を、イヌＦ．ＩＸ欠損基質血漿を用いて、改変１段階部分的トロンボプラスチン時間アッセイにより決定した。正常のヒト参照血漿は、５〜１０名の正常ヒトに由来するプールからなる。その試験サンプルを、数倍に希釈し、正常曲線の同じ希釈倍率に対して比較した。結果を正常の百分率として報告する。
【００８７】
ＡＰＴＴ：ＡＰＴＴを、大量のサンプルを迅速に処理する性能を有する、ＳＴ４ＴＭ凝固機器（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯＴＭ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）またはＭＵＬＴＩＰＬＥ ＤＩＳＣＲＥＴＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（ＭＤＡ）１８０ＴＭ（ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥＫＮＩＫＡＴＭ）で決定した。ＡＰＴＴがＳＴ４ＴＭ凝固器具またはＭＤＡ１８０ＴＭで決定されるか否かに拘わらず、コントロールおよび試薬は、同じ型である。ＡＰＴＴ試験については、混合物は、等量部の部分的トロンボプラスチン（ＡＵＴＯＭＡＴＥＤ ＡＰＴＴＴＭ，ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥＫＮＩＫＡＴＭ）、０．０２５Ｍ ＣａＣｌ２、およびクエン酸処理試験血漿からなった。
【００８８】
その結果を、図５に示す。ＡＰＴＴは、吸入投与して約１００時間後に、９０秒から７０〜７５秒に短縮した。このことは、低用量の予防応答に代表的である。
【００８９】
ＷＢＣＴ：ＷＢＣＴを、以前に記載されているように行った（７，１３−１５）。ＷＢＣＴは、代表的には、Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌコロニー由来の未処置血友病Ｂのイヌにおいて５０分より大きい（１４，１５）。そのこのコロニーにおける正常な健康なイヌのＷＢＣＴについての基準範囲は、８〜１２分である。その結果を図６に示す。ＷＢＣＴは、５０＋分から約１０分にまで減少した。
【００９０】
Ｂｅｔｈｅｓｄａインヒビターアッセイ：第ＩＸ因子についてのＢｅｔｈｅｓｄａインヒビターアッセイを行った。このアッセイは、元はＫａｓｐｅｒらによって報告された手順にＮｉｊｍｅｇａｎが改変を加えている（３４，３５）。簡潔には、正常コントロールの５０％の残留第ＩＸ因子活性を有する患者の血漿を、インヒビターの１ Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット（ＢＵ）／ｍＬと規定する。適切なスクリーニング希釈を行って、低力価（２ＢＵ）および高力価（＞５ＢＵ）両方のインヒビターを検出した。インヒビターは見出されなかった（データは示さず）。
【００９１】
第ＩＸ因子抗原：抗原濃度を、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによる二重モノクローナル抗体サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。
【００９２】
（実施例４：第ＶＩＩＩ因子）
第ＶＩＩＩ因子もまた、血友病Ａの処置において重要であり、第ＸＩ因子は、第ＸＩ因子欠損の処置のために重要である。実験を計画して、Ｆ．ＶＩＩＩもまた、上記の第ＩＸ因子と同様に、エアロゾル吸入治療によって送達されうることを確認した。ＦＶＩＩＩを、研究２と同じ処方物および方法を用いて、実施例２に記載されるようにエアロゾル化する。
【００９３】
本明細書に引用された全ての参考文献は、全ての目的で本明細書に明示的に参考として援用される。
【００９４】
【表９】
【００９５】
【表１０】
【００９６】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、静脈内または気管内で与えられるｒＦ．ＩＸの単回投与に続く、血友病ＢのイヌにおけるＦ．ＩＸの活性である。ＩＶで与えられたｒＦ．ＩＸ（２００ＩＵ／ｋｇ）は、Ｆ．ＩＸ活性において、即時の二双性の応答を生じた。ＩＴで与えられたｒＦ，ＩＸ（２００ＩＵ／ｋｇまたは１０００ＩＵ／ｋｇ）は、８時間目に開始する、発生が遅れた、検出可能なＦ．ＩＸ活性レベルを生じた。Ｆ．ＩＸ活性を、ＩＶ用量と両方のＩＴ用量とを用いて、少なくとも７２時間にわたって検出した。２００ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとでのＩＴ用量の投与は、２００ＩＵ／ｋｇのＩＶ用量を用いて達成されるより低い、かなりの治療レベルを達成した。各データ点は、ＩＶ群における１８時間の時点（これは、２匹のイヌからのデータを表す）を除いて、３匹のイヌから計算された平均±標準偏差を表す。
【図２】図２は、図１は、静脈内または気管内で与えられるｒＦ．ＩＸの単回投与に続く、血友病ＢのイヌにおけるＦ．ＩＸの活性である。Ｆ．ＩＸ抗原は、検出の持続時間がより短いようであることを除いて、図１に示される活性アッセイを本質的に反映する。この明らかなより短い持続時間は、おそらく、このアッセイの感度に起因する。
【図３】図３は、血友病Ｂイヌへの、２００ＩＵ／ｋｇまたは１０００ＩＵ／ｋｇの気管内投与とに吸収された、ｒＦ．ＩＸの累積総量である。２００ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとの両方でのＩＴ用量の群についての、経時的に吸収された累積量は、類似であるようである。吸収されるｒＦ．ＩＸの総量は、２００ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとの両方のＩＴ群について、それぞれおよそ２１ＩＵ／ｋｇおよび３７ＩＵ／ｋｇである。これらのデータは、２つの用量の群の間で吸収された量の、比例しない増加（図４を参照のこと）と一致する。
【図４】図４は、２００ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇを気管内で受けた、血友病Ｂのイヌに投与された総用量の百分率としての、吸収されたｒＦ．ＩＸの累積量である。逆重畳分析によって計算された、吸収された総量の百分率は、２００ＩＵ／ｋｇ用量の群と１０００ＩＵ／ｋｇ用量の群とについて、それぞれ、およそ１０．２％および３．７％であった。
【図５】図５は、ネイティブな血友病Ｂのイヌにおける、ｒＦ．ＩＸ吸入後のＡＰＴＴ短縮である。
【図６】図６は、ネイティブな血友病Ｂのイヌにおける、ｒＦ．ＩＸ吸入後のＷＢＣＴ短縮である。
【図７】図７は、吸入によってｒＲＦ．ＩＸ（５０ＩＵ／ｋｇ）を受けた、寛容化された血友病Ｂのイヌ（ｎ＝３）についての、平均で補正されたｒＦ．ＩＸ抗原濃度時間曲線である。
【図８】図８は、抗原アッセイによって決定される場合の、寛容化された血友病のイヌ（ｎ＝４）における、吸入後に吸収されたｒＦ．ＩＸの累積量である。イヌは、Ｃ２２（上の線４）、Ｃ２０（線３）、Ｃ２５（線２）、Ｃ２６）（下の線１）である。
【図９】記載なし。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、凝固因子の吸入による、血友病の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
約４５０，０００人の患者が、世界中で、出血障害（「血友病」として公知）を患って生きている。血友病は、血液中の１つ以上の凝固因子の欠損によって引き起こされ、この凝固因子の欠如は、長期間の出血を引き起こす。小さい挫傷でさえも、内出血を引き起こし得る。いくつかの症例において、内出血は、明白な原因なしで開始し得、関節および組織に広がる。膨潤および強い疼痛が、通常生じ、そして血友病を患う人は、自分の一生にわたって悩まされる。３つの主要な型の血友病が存在し、それぞれが、凝固カスケードにおける異なるタンパク質の変異から生じる。
【０００３】
血友病Ａ（時々、古典的血友病と称される）は、最も通常の型の血友病であり、凝固因子欠損を患う患者の約８０％において起こる。これは、Ｘ染色体に担持されるＤＮＡ欠損によって引き起こされ、そして大ＶＩＩＩ因子の欠損を生じる。唯一の正常なＸ染色体は、十分なレベルの第ＶＩＩＩ因子を産生する必要がある。従って、ほとんど全ての罹患する患者は、男性である。ほとんどの場合において、この欠損遺伝子は、数世代にわたって継代されるが、症例の約２０％において、この欠損は、自発的な変異によって生じる。
【０００４】
血友病Ｂ（クリスマス病としてもまた公知）は、血友病の症例の１２％〜１５％を占め、そして第ＩＸ凝固因子の欠損によって引き起こされる。血友病Ａと同様に、血友病Ｂは、Ｘ染色体上の栄養欠損に関連し、そして通常、保有者の母親の男児に影響を与える。
【０００５】
第ＸＩ因子の欠損は、凝固因子欠損状態を有する患者のほんの２％〜５％を占める。この欠損は、第ＩＸ凝固因子の欠損によって引き起こされ、そして血友病ＡおよびＢとは異なり、Ｘ染色体以外の染色体上に遺伝され、そして男児と女児との両方に継代され得る。ヴォン・ヴィレブランド病は、なお別の形態の血友病であり、これは、男性および女性において予防される。失われる他の稀な因子（例えば、第Ｖ因子、第Ｘ因子、および第ＸＩＩＩ因子）もまた、存在する。
【０００６】
これらの血友病患者に対する現在の治療は、出血を防止するため、または血友病の事象に対する「オンデマンド」で、予防的に与えられる凝固因子の静脈内（ＩＶ）投与を包含する。処置は、診療所または家庭で施され得るが、種々のアクセスを達成することが不可能であることは、治療を、いずれの位置においても非常に困難にし得る。凝固因子の脈管外投与は、この困難を回避し得る。皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、および腹腔内（ＩＰ）の投与経路は、治療レベルを達成するが、針が依然として、代表的に、送達のために使用される（１）。
【０００７】
吸入治療は、治療レベルが気道から体循環に達し得る場合、凝固因子のための「無針」投与経路を提供する。呼吸系は、胃腸管におけるタンパク質分解に耐えられないタンパク質またはペプチドの全身送達のため、またはＩＶ経路、ＳＣ経路、ＩＭ経路もしくはＩＰ経路の代替としての、魅力的な経路である。血友病の処置のために、呼吸器官は、いくつかの利点を与える。第一に、吸入によって投与される凝固因子は、肺上皮と体循環との間の比較的短い距離を移行する必要があるのみである。第二に、より小さい気道および肺胞は、非常に透過性かつ吸収性の膜から構成される、大きい表面積を有する。第三に、肺胞は、巨大な脈管床を有し、この脈管床を通して、数リットルの血液が１分間あたりに流れる。第四に、肺は、比較的低い酵素活性を有し、そして気道粘膜および肺胞の薄い界面活性剤の水性層は、高濃度のプロテアーゼインヒビターを含む（２）。この環境は、タンパク質の分解を起こりにくくし、そして体循環への移行の間、Ｖ．ＩＸ、Ｆ．ＶＩＩＩおよびＦ．ＸＩのようなタンパク質に、分解からの少なくともいくらかの保護を与え得る（２、３）。
【０００８】
エアロゾルタンパク質の、呼吸器道内での堆積の部位を規定する最も重要なパラメータは、そのエアロゾルの粒子特徴である。エアロゾルの液滴の挙動は、その「質量中央空気力学直径」（ＭＭＡＤ）に依存し、この直径は、粒子のサイズ、形状、密度および電荷の関数である。気道内の空気の速度もまた、重要な特性である。
【０００９】
粒子のＭＭＡＤの厳密な制御が、呼吸気道の所望の領域内でのエアロゾルの堆積および保持の再現性を確実にする。肺全体にわたるよい分布は、１μｍと５μｍとの間の空気力学直径を有する粒子を必要とする。非常に小さい粒子（１μｍ未満）が、通常のむらのある呼吸の間に吸入される。３μｍの粒子は、肺胞領域を標的とし、そして６μｍより大きい粒子は、口腔咽頭部に堆積される。
【００１０】
ほとんどの疾患の最適な管理は、治療化合物の正確な投薬を必要とする。灰での薬物投与は、送達デバイスに対するストリンジェントな要求を負わせる；このことは、粉末または液滴の粒子サイズは、送達部位、および従って、肺からの薬物吸収の程度に大いに影響を与えるからである。
【００１１】
肺での薬物投与のために現在利用可能なデバイスは、主として、伝導性の気道（例えば、喘息において）における薬物の局所効果を達成するために、開発された。これらのデバイスとしては、ネブライザ、軽量要領吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）が挙げられる。
【００１２】
生物薬物的薬剤を投与するためのネブライザの使用は、多くの重要な制限を有する。このような薬物は、しばしば、水溶液中で非常に不安定であり、そして容易に加水分解される。さらに、噴霧のプロセスは、これらの化合物に高いせん断応力を付与し、これは、タンパク質の変性をもたらし得る。これは、特別な問題である。なぜなら、生じる液滴の９９％が、次の投薬の間に噴霧されるように、リザーバー内にリサイクルされるからである（６）。さらに、ネブライザによって生成される液滴は、不均一であり、このことは、下気道への乏しい薬物送達を生じる。タンパク質溶液をＭＤＩ中で噴霧するために使用される推進薬（クロロフルオロカーボン、および次第に増加しているものは、ヒドロフルオロアルカン）もまた、タンパク質の変性に寄与し得る。
【００１３】
ネブライザおよびＭＤＩに対する有望な代替物は、ＤＰＩであり、これは、乾燥形態でタンパク質を送達する。ＭＤＩと同様に、現在認可されているほとんどのＤＰＩは、喘息および慢性閉塞性肺疾患の管理のための、局所的に作用する薬物（例えば、喘息治療薬）の肺薬物投与のために製造される。
【００１４】
吸入の投薬経路による全身の治療におけるほとんどの努力は、糖尿病に向いてきた。最近まで、研究者らは、非侵襲性に送達されるインスリンが、現実的な臨床アプローチを得るためには低すぎるバイオアベイラビリティに関連すると考えていた。しかし、次第に増えている証拠は、吸入されるインスリンが効果的であり、十分に許容され、注射されるインスリンの非侵襲性の代替物であり、そしてインスリンの吸入治療が第３期の臨床治験であることを示唆する。
【００１５】
インスリンは、単一の遺伝子を起源とするαサブユニットおよびβサブユニットから作製される。その機能的組換え酵素は、約５．９〜６．９ＫＤであるが、生理学的条件下では、ネイティブのインスリンは、約３１．２〜３２．８ＫＤの六量体として存在することを示唆する証拠が存在する。従って、インスリンは、非常に小さいタンパク質であり、このことは、インスリンの、吸入送達における成功の原因であり得る。吸入治療によって送達されている、他の代謝性ホルモンもまた、小さい：カルシトニン（３５ＫＤ）、ＨＧＨ（２２ＫＤ）、ＴＳＨα（１３ＫＤ）、ＴＳＨβ（１５〜１６ＫＤ）、ＦＳＨ（３６ＫＤ）およびソマトスタチン（２ＫＤ）。ヘパリン（２０ＫＤ）もまた、抗凝固剤として、吸入送達によって試験されている。大きさに加えて、バイオアベイラビリティの程度もまた、肺における加水分解酵素に対する治療タンパク質の感受性に依存し得る。より大きいタンパク質の吸入療法に関しては、ほとんど努力がなされていない。これはおそらく、より大きいタンパク質を首尾よくエアロゾル化すること、送達すること、および吸収することの困難に起因する。
【００１６】
本発明者らが知る限り、凝固タンパク質の肺送達には、誰も成功していない。これはおそらく、これらの大きいサイズ、およびこれらの有名な溶液中での不安定性に起因する。グリコシル化第ＩＸ因子は、５５ＫＤであり、第ＶＩＩＩ因子は、２００ＫＤであり、そして第ＸＩ因子は、１４０〜１５０ＫＤである。従って、これらのタンパク質は、上で議論されたタンパク質よりかなり大きい。Ｇｕｐｔａ（２９）は、凝固因子の肺送達を試みたが、ヒト第ＩＸ因子は、噴霧の間に分解することが見出された。このことは、ネブライザによって付与されるせん断力、またはこのプロセスの間に生じる大きい空気−水界面に起因することが仮定された。
【００１７】
本明細書中に記載される研究より前には、第ＩＸ因子と同様に大きくかつ繊細なタンパク質を、誰も首尾よくエアロゾル化し、そして肺系に送達していない。さらに、現在まで、誰も、血友病を吸入療法によって首尾よく処置していない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、一般に、エアロゾル化された第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）を用いて、血友病を処置する方法に関する。この方法において、エアロゾル化されたＦ．ＩＸは、２μｍと４μｍとの間の質量中央空気力学直径（ＭＭＡＤ）を有し、少なくとも５０％の３．３μｍ未満の微細粒子割合百分率（ＦＰＦ％＜３．３μｍ）を有し、少なくとも９０％がモノマータンパク質であり、エアロゾル化後の活性／エアロゾル化前の活性が、少なくとも８０％であり；そして２０％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有する乾燥粉末である。このエアロゾルは、ゆっくりと最大に吸入されて、このＦ．ＩＸを、肺組織の深部に堆積させ、引き続いて、最大に呼気される。
【００１９】
吸入されたＦ．ＩＸは、吸入投与後に、いくらかの時間にわたって、肺内に封じ込められるようであるので、この方法はまた、血友病の出血の予防的処置のために、出血の事象の前にもまた適用可能である。従って、毎週または２週間後との、Ｆ．ＩＸの適用は、蓄積効果を生じ、十分なＦ．ＩＸが、投与の２〜４日後でさえも、出血を予防するために利用可能なままであることを可能にする。
【００２０】
好ましい実施形態において、ＭＭＡＤは、２〜５μｍ、２．８〜３．６μｍ、または３〜３．５μｍであり、ＰＰＰ％＜３．３μｍは、少なくとも６０％または６４％であり、そしてモノマー含有量は、少なくとも９５％または９７％である。エアロゾル化後の活性／エアロゾル化前の活性は、少なくとも８５％であり、好ましくは、９０％または９５％である。水含有量は、好ましくは、非常に低く、１０％または５％程度である。さらに好ましいのは、Ｆ．ＩＸが、アルコールなしでエアロゾル化される方法である。なぜなら、アルコールは、スプレー乾燥された粉末の長期間の貯蔵に対して、ネガティブに影響を与えるようであるからである。組換えＦ．ＩＸの使用もまた、好ましい。
【００２１】
好ましい実施形態は、表面活性なジペプチドまたはトリペプチドを、賦形剤として使用する。本発明において使用するための、ジロイシル含有トリペプチドは、式Ｘ−Ｙ−Ｚを有するトリペプチドであり、ここで、少なくともＸおよびＹ、またはＸおよびＺは、ロイシル残基である。特に好ましいものは、ジロイシンまたはトリロイシン／Ｆ．ＩＸの比が、約０．５〜１．５ｗ／ｗまたは４５／４０ｗ／ｗである、ジロイシン賦形剤またはトリロイシン賦形剤である。
【００２２】
エアロゾル化されたＦ．ＩＸの組成物、および微細な乾燥Ｆ．ＩＸを含有するブリスターパックもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００２３】
「ロイシン」とは、単一のアミノ酸として存在しようと、ペプチドのアミノ酸成分として存在しようと、アミノ酸のロイシン、およびロイシンの修飾形態（すなわち、ロイシンの１つ以上の原子が、別の原子または官能基で置換されているロイシン）をいい、このロイシンは、ラセミ混合物であっても、そのＤ体またはＬ体のいずれかであってもよい。この修飾形態において、修飾されたアミノ酸またはペプチドの分散増強効果は、未修飾物質の効果からさほど大きくは変わらない。
【００２４】
「ジペプチド」とは、２つのアミノ酸からなるペプチドをいう。「トリペプチド」とは、３つのアミノ酸からなるペプチドをいう。
【００２５】
「表面活性」材料とは、この材料が溶解した場合に、液体の表面張力を低下させる能力によって特徴付けられる、表面活性（例えば、表面張力によって測定される）を有する材料である。表面張力（これは、液相と別の相との間の界面に関連する）とは、表面分子が内向きの引力を示すために利用される、液体の特性である。
【００２６】
「乾燥粉末」とは、特定の処方に依存して、約２０％の水分、好ましくは、約１０％の水分、より好ましくは、約５〜６％未満の水分、そして最も好ましくは、約３未満％の水分を含有する、粉末組成物をいう。
【００２７】
「肺送達に適切な」乾燥粉末とは、（ｉ）吸入デバイスにおいて／吸入デバイスによって、容易に分散されること、および（ｉｉ）粒子の一部分が肺に達するように、被験体によって吸入されることが可能な、固体を含有する組成物をいう。このような粉末は、「呼吸可能」であるとみなされる。「エアロゾル化」粒子とは、気体ストリーム中に分散される場合に、この気体内に、粒子の少なくとも一部分が患者によって吸入されるために十分な量の時間にわたって分散され、その結果、これらの粒子の一部分が肺に達する、粒子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（発明の実施形態の説明）
本発明は、ヒト組換え第ＩＸ因子に関して例示される。しかし、本明細書中で得られる知識を用いて、より大きい凝固因子（例えば、Ｆ．ＶＩＩＩおよびＦ．ＩＸ）のエアロゾル課が、試みられる。これらの因子は、Ｆ．ＩＸよりかなり大きく、そして吸入療法によって投与することが、より困難であり得る。しかし、これらの短縮型機能的フラグメントを投与することが、可能であり得る。
【００２９】
本発明は、３．５μｍ未満のＭＭＡＤ、０．５０より大きいＦＰＦ、および９５％より大きいモノマー含有量を有する、乾燥されたエアロゾル化凝固因子粉末の吸入療法によって、血友病を処置する方法を提供する。このような粉末は、肺組織への局在を可能にし、血友病の処置のために理想的な活性凝固因子のゆっくりとした放出を生じる。
【実施例】
【００３０】
（実施例１：液体の第ＩＸ因子の気管内投与を介する血友病の処置）
概念の確認のために、本発明者らは、液体のヒト組換え第ＩＸ因子（ｒＦ．ＩＸ）を、血友病Ｂのイヌモデルにおいて、気管内で（ＩＴ）堆積させた。液体のＩＴ ｒＦ．ＩＸが、バイオアベイラビリティを示した場合、本発明者らは、さらに進み、同じモデル系において、このタンパク質のエアロゾル化された乾燥粉末形態を試験する。
【００３１】
血友病Ｂのイヌ：Ｃｈａｐｅｌ ＨｉｌｌのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ ＣａｒｏｌｉｎａのＦｒａｎｃｉｓ Ｏｗｅｎ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの閉じたコロニーからの血友病Ｂのイヌを、この研究において使用した。これらのイヌにおける原因となる分子欠損は、第ＩＸ因子分子の触媒ドメインにおけるミスセンス点変異（ヌクレオチド１４７７におけるＧからＡ）であり、循環Ｆ．ＩＸの完全な非存在を生じる（６）。血友病Ｂのイヌのこの株は、機能アッセイにおける検出可能なＦ．ＩＸ活性も、ＥＬＩＳＡまたは免疫ブロットによる抗原も、有さない（７、８）。全ての動物を、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ出版Ｎｏ．８５−２３）における標準に従って、処置した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは、全ての実験を認可した。
【００３２】
ヒト組換え第ＩＸ因子（ｒＦ．ＩＸ）：ｒＦ．ＩＸは、以前に記載されたように（９〜１１）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ（現在、Ｗｙｅｔｈ）によって調製された。この調製物は、非常に濃厚であり、Ｆ．ＩＸ活性が、約１２，５００ＩＵ／ｍｌであり、そしてタンパク質濃度が、約３９ｍｇ／ｍｌであった。ｒＦ．ＩＸを、投与されるまで、そのビヒクル処方緩衝液中で貯蔵した（１２）。
【００３３】
インビボ実験：９匹の血友病Ｂのイヌを、３つの処置群のうちの１つに、無作為に割り当てた：２００ＩＵ／ｋｇ（ｎ＝３）もしくは１０００ＩＵ／ｋｇ（ｎ＝３）の気管内投与、または２００ＩＵ／ｋｇの静脈内注入（ｎ＝３）。ｒＦ．ＩＸの気管内用量を受けたイヌを、プロポフォルまたはメデトミジン塩酸塩で鎮静させ、そして手順の間、示される場合、イソフルオラン（ノーズコーンを介して２〜４％）での麻酔の外科手術面に維持した。気管内（ＩＴ）投与については、内視鏡を、左右の気管支に挿入した。７フレンチ（直径約２ｍｍ）の三重管腔肺動脈カテーテルを、内視鏡の案内の下で、適切な気管支に挿入した。用量（１ｍｌの体積）を、左右の気管支の間に等しく分配し、そしておよそ２分間にわたって注入した。ｒＦ．ＩＸの注入後、このカテーテルを、２ｍｌの０．９％生理食塩水でフラッシュした。比較実験において、静脈内（ＩＶ）用量を、ボーラスとして、２〜３分間にわたって、頭部の静脈に注入した。
【００３４】
サンプリングプロトコル：血液サンプルを、ｒＦ．ＩＸの投与の前後に、以下の時点で採取した：０分、５分、１５分、３０分、および１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、および７２時間。全血を、静脈穿刺によって引き抜き、そして４％クエン酸ナトリウム中に、全血８部に対して抗凝固剤１部の最終濃度で収集した。血漿を調製し、そして分析されるまで、−８０℃で凍結させた。抗Ｆ．ＩＸ抗体利器化に対する血清サンプルを、ｒＦ．ＩＸ投与の前、ならびに５日後、１０日後、１５日後、および２８日後に採取した。全血凝固時間を実施するための全血を、各群において選択されたイヌから、処置の２時間後に得た。完全な血液計数（ＣＢＣ）を、ｒＦ．ＩＸ予備処理を受けた、処理後４８〜７２時間のイヌに対して実施した。胸部Ｘ線写真を、ＩＴ群由来のイヌに対する同じ時点において得た。研究の終了時に、これらのイヌを、過剰用量のペントバルビタールによって殺し、そして剖検を実施した。
【００３５】
全血凝固時間（ＷＢＣＴ）：ＷＢＣＴを、以前に記載されたように実施した（７、１３〜１５）。ＷＢＣＴは、代表的に、Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌコロニー由来の未処理の血友病Ｂのイヌにおいて、５０分より大きい（１４、１５）。このコロニーにおける正常な健常なイヌにおけるＷＢＣＴについての参照範囲は、８〜１２分である。ＷＢＣＴを、ＩＴ群から選択された３匹のイヌにおける処置の２時間後に決定した。これは、２００ＩＵ／ｋｇ ＩＴを受けた１匹のイヌにおいて、２３．５分に短縮され、そして１０００ＩＵ／ｋｇ ＩＴを受けた、試験された２匹のイヌのうちの１匹において、２１．５分に短縮される。処置の２時間後にアッセイされる場合、ＩＶ群からのこれらの全てのイヌにおけるＷＢＣＴを、９．５分に補正した。
【００３６】
Ｆ．ＩＸ活性：Ｆ．ＩＸ凝固アッセイを、Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ １８０（ＭＤＡ−１８０、ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥＫＮＩＫＡＴＭ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）（４）での改変したＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｂｌａｓｓｔｉｎ Ｔｉｍｅ（ＡＰＴＴ）試験を使用して決定した。コントロール標準は、１ＩＵのｒＦ．ＩＸを含有する、１ｍｌのプールされたＦ．ＩＸ欠損イヌ血漿から調製された、希釈物からなった。
【００３７】
Ｆ．ＩＸ活性（図１）は、ｒＦ．ＩＸの注入前に、いずれのイヌにおいても検出されなかった。ＩＴ投与後、Ｆ．ＩＸ活性が、注入の１８時間目に検出され、そして７２時間目にも依然として測定可能であった。血漿レベルにおける小さい差が、２つのＩＴ用量の間で注目された。ｒＦ．ＩＸの静脈内投与は、以前の研究（４）において報告されたように、即時の二双性の応答を生じた。Ｆ．ＩＸ活性は、注入の５分後に、７２時間にわたって検出され、そして最大活性は、ＩＶ投与によって達成された。
【００３８】
Ｆ．ＩＸ抗原濃度：Ｆ．ＩＸ抗原濃度を、二重モノクローナル抗体サンドイッチ酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（１２）を使用して、決定した。この研究におけるＥＬＩＳＡの下限は、約３８ｎｇ／ｍｌであった。この限界未満の全ての値を、１ｎｇ／ｍｌ未満と仮定した。
【００３９】
Ｆ．ＩＸ抗原濃度（図２）は、３つ全ての群におけるＦ．ＩＸ活性についてみられたものと類似のパターンに従った。Ｆ．ＩＸ抗原は、ＩＶ群における第一の血液サンプル（５分）において検出されたが、両方のＩＴ群においては、８時間目まで検出されなかった。予測されたように、検出可能な最も高い抗原濃度は、ＩＶ群において見出された。
【００４０】
薬物動力学分析：薬物動力学分析を、ＩＶ群とＩＴ群との両方について、活性時間データに対して実施した。２区分モデル（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ，ＰＨＡＲＳＩＧＨＴ ＣＯＲＰ．ＴＭ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）は、ＩＶデータ（モデル８）を最もよく説明し、そして遅れ時間を用いる１区画モデルは、ＩＴデータ（モデル４）を最もよく説明した。数値の逆重畳分析もまた、吸収の速度および程度を理解するために、これらのデータに対して実施した（１６）。
【００４１】
２つのＩＴ群をＩＶ群と比較する表１は、最も高い平均最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）が、ＩＶ投与を用いて起こることを示した（１５７．３±２９．３ＩＵ／ｄｌ）。２０ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群におけるＣｍａｘについての平均値は、それぞれ、４．７±０．５ＩＵ／ｄｌおよび６．５±０．５ＩＵ／ｄｌであった。ＩＶ投与後の全曝露（曲線下面積；；ＡＵＣ０−∞）は、２７１６＋／−１６４ＩＵ／ｋＬ×時間であった。対照的に、ＩＴ投与後の全曝露は、２００ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群について、それぞれ３０６＋／−２０．８ＩＵ／ｄＬ×時間および６６６＋／−１２７ＩＵ／ｄＬ×時間であった。平均Ｔ１／２は、ＩＶ群、２００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群および１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群について、それぞれ２４．２±１０．７時間、３０．７±５．３時間、および４６．４±２９．２時間であった。
【００４２】
【表１】
半減期は、Ｆ．ＩＸ光源曲線（図２）よりも、Ｆ．ＩＸ活性曲線（図１）において、より長いようであることが、注目されるべきである。しかし、これらのサンプルは、同時に調製された。Ｆ．ＩＸ ＥＬＩＳＡは、３８ｎｇ／ｍｌの閾値感度を有すると決定された。活性アッセイは、このＥＬＩＳＡよりも感受性であるので、この活性アッセイは、Ｆ．ＩＸクリアランスのより正確な表現であるようである。最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ（時間））は、２つのＩＴ用量の間で類似であり、それぞれ、２１．１±３．４および３０．０±６．３であった。ＩＴ投与後のバイオアベイラビリティは、２００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群について１１．３％、そして１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群について４．９％であった。
【００４３】
２００ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとの両方のＩＴ用量群について経時的に吸収された累積量（図３に示される）は、２つの用量についての吸収速度が、類似ことを示す。なぜなら、これらの２つの曲線の傾斜が、類似であるからである。しかし、吸収された総量は、これらの２つの用量について異なった。２００ＩＵ／ｋｇのＩＴ用量について、吸収された総量は、約２１ＩＵ／ｋｇであり、そして１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ群については、吸収された総量は、約３７ＩＵ／ｋｇであった。従って、これらの２つの用量群の間で、吸収された量の増加は、非比例的である。
【００４４】
この観察は、図４においてさらに注目され得る。逆重畳分析によって計算された、吸収された総量の百分率は、２００ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇのＩＴ用量群について、それぞれ約１．２％および約３．７％であった。これらのデータは、２００ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇの用量群について、それぞれ１１．３％および４．９％のＡＵＣ０−∞の比較によって計算された、これらの２つの群についてのバイオアベイラビリティ値と類似である。
【００４５】
抗ヒトＦ．ＩＸ抗体分析：処理されたイヌ由来のイヌ血清における抗ヒトＦ．ＩＸ抗体についての力価を、イヌ抗ヒトＦ．ＩＸ ＩｇＧ抗体に特異的なＥＬＩＳＡを使用して、決定した（１２）。所定のイヌについての抗体力価は、ネガティブコントロールと比較される場合に、光学密度（ＯＤ）シグナルの２倍の増加を生じる血漿サンプル希釈として、任意に規定する。このアッセイについての感度の閾値は、２０任意単位である。
【００４６】
血友病Ｂの成体イヌは、慣用的に、ヒトＦ．ＩＸに対する抗体を発生させる。抗ヒトＦ．ＩＸ抗体力価を、投与の１０日後までに、両方のＩＴ群由来の全てのイヌにおいて決定した（表２）。ＩＶ群由来の３匹のイヌのうちの２匹は、同じ時点で、検出可能な抗体力価を有した。抗ヒトＦ．ＩＸ抗体力価を、１５日目までに、これらのイヌのすべてにおいて低下し、これは、この研究の２８日目にわたって残存した。
【００４７】
【表２】
臨床プロフィールおよび免疫応答：濃縮されたｒＦ．ＩＸの気管内投与は、以前には試みられなかった。従って、これらのイヌを、任意の有害な応答について、臨床的にモニタリングした。咳は、２００ＩＵ／ｋｇ用量のＩＴのイヌにおいても、ｒＦ．ＩＸをＩＶで受けたイヌにおいても、注目されなかった。１０００ＩＵ／ｋｇ用量をＩＴで受けたイヌは、穏やかな、一時的な咳を、注入後約４５分〜１時間で有し、これは、１時間より長くは続かなかった。異常な肺音は、いずれの動物においても、聴診の際に注目されなかった。両方のＩＴ群のイヌからの、処置前および処置後の気管支のＸ線写真は、気道または肺の柔組織の外観において、いかなる変化も検出しなかった。処置の前および４８時間後もしくは７２時間後のＣＢＣは、３つ全ての処置軍において、顕著ではなかった。気道または肺の柔組織における大きい異常な知見は、処置の１ヵ月後に実施した剖検において、注目されなかった。
【００４８】
（実施例２：第ＩＸ因子のエアロゾル化）
液体のＲＦ．ＩＸの期間投与は、安全かつ効率的であることが示されたので、本発明者らは、次に、ＲＦ．ＩＸを得るゾル化することを試みた。組換えヒト第ＩＸ因子は、グリコシル化されなければ４７ｋＤであり、そしてグリコシル化されると５５ｋＤである、糖タンパク質である。現在の薬学的処方物は、凍結乾燥された粉末である。なぜなら、液体のＦ．ＩＸは、不安定である傾向があるからである。粉末処方物もなお、周囲のレベルの湿度に曝露される場合、酸化および分解を受けやすい。従って、本発明者らは、予測される不安定性を最小にする試みにおいて、乾燥粉末のエアロゾル化された粉末を使用することを選択する。
【００４９】
ｒＦ．ＩＸ粉末についての目標エアロゾル特性は、５０％より大きい初期放出用量（ＥＤ）値、３．５μｍ未満の平均中央空気力学的直径（ＭＭＡＤ）、および０．５０より大きい微細粒子割合（ＦＰＦ＜３．３μｍ）であった。化学的および物理的に安定な粉末を、最初のスプレー乾燥溶液特徴に対して５％未満の純度の損失を有し、形態学的に可視の変化がなく、目標範囲内のＥＤ、ＭＭＡＤおよびＦＰＦを有し、そしてブリスターパッケージ中で４週間、４０℃／０％相対湿度に曝露された後に、粒子サイズ分布に変化を有さないとして分類した。
【００５０】
処方物：研究１および研究２のためのｒＦ．ＩＸ溶液は、１０ｍＭヒスチジン、２６０ｍＭグリシン、１％スクロース、０．００５％ポリソルベート−８０（ｐＨ６．８）中での、それぞれ１２ｍｇ／ｍＬおよび２．２６ｍｇ／ｍＬの濃度で処方された、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製であった。溶液を、１．２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）と一緒に、ＡＭＩＣＯＮＴＭ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＴＭ）ユニットに通してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションのために使用した緩衝液の総体積は、もとの溶液体積の約４〜５倍であった。最後の一次ストック溶液の濃度は、ＵＶによって測定した場合、研究１については１２ｍｇ／ｍＬであり、そして研究２については１１．５ｍｇ／ｍＬであった。処方物を、表３に記載されるように、水中０．５％の全固形分を使用して、調製した。
【００５１】
【表３ａ】
＊１．１７グリコシル化／非グリコシル化ｒＦ．ＩＸ．の比として、グリコシル化ｒＦ．ＩＸ（ｇ−ｒＦ．ＩＸ）の重量から計算したｒＦ．ＩＸの重量
＊＊ニート：１０ｍＭ ヒスチジン／２６０ｍＭ グリシン／１％ スクロース／０．００５％ Ｔｗｅｅｎ８０
【００５２】
【表３ｂ】
ＫＲＵＳＳ Ｋ１２ ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ ＴＥＮＳＩＯＭＥＴＥＲＴＭを用いて周囲条件で表面張力測定を行った。水を参照として使用し、これを測定すると、７２．５ｍＮ／ｍであった。溶液を、粉体加工（ｐｏｗｄｅｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）する前に分析した。噴霧乾燥する直前に、その溶液のｐＨを、ＯＲＩＯＮＴＭ モデル７２０Ａ ｐＨメーターを使用して室温でチェックした。ｐＨ７．０および１０．０の標準物質で、２点補正を行った。結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
エアロゾル化。改良型サイクロン、アトマイザーノズルおよび粉体収集容器を備えるＢｕｃｈｉ １９０ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ（ＢＲＩＮＫＭＡＮＴＭ）で、上記の１１の処方物を噴霧乾燥した。そのＢｕｃｈｉ噴霧乾燥機のアトマイザーを、研究１については６０ｐｓｉ、および研究２については４０ｐｓｉに設定した圧縮乾燥空気で作動させた。そのＢｕｃｈｉへの液体流速は、両方の研究とも、５ｍＬ／分であった。出口温度を、研究１については７０℃に、および研究２については６０℃に設定した。そのＢｕｃｈｉを通る総空気流は、１７．８ｓｃｆｍであった。バッチサイズは、６７５〜１，３５０ｍｇであり、収率は、１１ロットについて、２０〜６７％であった。その使用した収集器は、硼珪酸ガラスから作製された１／２インチまたは１インチであった。
【００５４】
ブリスターパック。その粉体を、資格のある人員により手で全て充填した。その粉体を、相対湿度が５％未満のグローブボックスに移した。その使用されたブリスター形態は、Ｐ３．０５ ＰＶＣブリスターであった。その粉体７．５±０．１５ｍｇを、各ブリスターに充填し、ふた（ｌｉｄｓｔｏｃｋ）を上部に置き、そのブリスターパックを密封した。その密封温度は、１秒の滞留時間で１７１℃（±５℃）であった。次いで、そのブリスターパックをダイカットして、そのデバイスに適合させた。
【００５５】
安定性試験。エアロゾル試験、熱試験、物理的試験および化学的試験を、初期条件下で、ならびに制御温度および相対湿度で２〜３週間保存した後に行った。処方物粉体を、ＰＶＣブリスターパックに充填し、放出された用量（ｅｍｉｔｔｅｄ ｄｏｓｅ）、粒径分布および熱分析についてアッセイした。化学的特徴付けおよび走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）検査を、バルクエアロゾル薬物粉体について、初期条件下で行った。全ての粉体を、相対湿度が５％未満の、湿度制御されたグローブボックス中で扱った。
【００５６】
促進保存条件（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）。研究１の処方物についてのバルクエアロゾル薬物粉体を乾燥させ、２〜８℃および４０℃（０％ ＲＨ）、ならびに２５℃（０．３３ＲＨおよび７５％ＲＨ）で保存した。研究２の処方物についてのバルクエアロゾル薬物粉体を、２種類の温度条件（２５℃および４０℃）および両方の温度条件につき２種類の相対湿度（０％および７５％）の条件で保存した。
【００５７】
バルクエアロゾル薬物粉体を、グローブボックス中で硼珪酸ガラスバイアル中に秤量した。０％ ＲＨ安定性サンプルについては、バイアルにキャップをし、乾燥剤を有するホイル上包装パウチに入れ、温度制御チャンバ中で保存する前に熱シールした。湿度制御安定性サンプルについては、バイアルを開いたままにし、適切な温度の湿度制御チャンバ中で保存した。サンプルを、２週間後または３週間後に、ＵＶ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＥＭで分析した。
【００５８】
エアロゾル試験。米国特許第６，２５７，２３３号に記載されるようなデバイスを使用して、全てのエアロゾル試験を行った。そのデバイスを、まず、ブリスターパックをデバイスに挿入し、デバイスハンドルを引っ張り、次いで、そのハンドルを押し下げてそのデバイスを加圧することでチャンバを圧縮することにより、準備される。そのデバイスを、ボタンを押して作動させ、そのブリスターパックを持ち上げ、そのパックを穿刺し、その粉体をデバイスのチャンバに分散させ、エアロゾルの雲（ｃｌｏｕｄ）を形成した。充填したブリスターパックの全てを、エアロゾル試験に使用するまで、乾燥ボックス中で保存した。
【００５９】
放出される用量。エアロゾルを、そのデバイスのチャンバのマウスピースの上のホルダに配置されたガラス繊維フィルタ上に収集した。放出された用量％（ＥＤ％）を測定するために、ブリスターパックを、そのデバイスを使用してエアロゾルとして分散させ、その粉体サンプルを、空気流速３０Ｌ／分で２．５秒間にわたり（自動タイマーにより制御した）チャンバからエアロゾルを引き出すことによって、予め秤量したガラス繊維フィルタ（ＧＥＬＭＡＮＴＭ，４７ｍｍ直径）上に収集した。このサンプリングパターンは、患者のゆっくりとした深呼吸を模倣する。ＥＤ％を、そのフィルタ上に収集された粉体の質量を、ブリスターパック中の粉体の質量で除算することにより計算した。報告される各結果は、１０回の測定値の平均および標準偏差であった（表５）。
【００６０】
粒径。８段階（９．０μｍ、５．８μｍ、４．７μｍ、３．３μｍ、２．１μｍ、１．１μｍ、０．７μｍ、および０．４μｍの孔サイズ）のカスケードインパクター（ＡＮＤＥＲＳＥＮ ＣＡＳＣＡＤＥ ＩＭＰＡＣＴＯＲＴＭ）を使用して、粒径分布を測定した。各測定値を、そのデバイス中に５ｍｇ充填重量の５つのブリスターパックを分散させることによって得た。２．５秒間にわたって（自動タイマーにより制御した）補正流速２８．５Ｌ／分で、そのインパクターを通して真空を引き出した（表５）。ＭＭＡＤは、カスケードインパクションにより決定されたエアロゾル化粉体の空力的粒径分布の中間点またはメジアンである。
【００６１】
ＦＰＦ％＜３３μｍもまた、カスケードインパクターを用いて得た。微細粒子画分％＜３．３μｍは、流速１立方フィート／分（ｃｆｍ）（２８．３Ｌ／分）のみで操作した場合、そのＡｎｄｅｒｓｅｎインパクターの段階３の下で総重量である。（その段階４、５、６、７および８からの合計質量）÷（全ての段階で回収された総質量）が、報告された値である。
【００６２】
【表５Ａ】
＊ＲＳＤ＝標準偏差／平均×１００
【００６３】
【表５Ｂ】
形態。走査型電子顕微鏡を利用して、噴霧乾燥した粉体に関する初期形態情報を得、安定後の形態における変化を評価した。全てのサンプルを、相対湿度が５％未満のグローブボックス中で調製した。サンプルを、アルミニウムのＳＥＭスタブ上の両側炭素テープに取り付けたシリコンウェハに置いた。次いで、その置かれた粉体を、７５ｍトルおよび３８ｍＡにて６０〜９０秒間、金：パラジウムを用いてＤｅｎｔｏｎスパッターコーティング機でスパッターコーティングした。このことにより、約１５０オングストロームのコーティング厚が生じる。Ｅｖｅｒｈａｒｔ−Ｔｈｏｒｎｌｅｙ検出器を用いて高真空モードにおいて作動させたＰｈｉｌｉｐｓ ＸＬ３０ ＥＳＥＭで画像を撮って、画像合成のための二次電子を捕捉した。加速電圧は、ＬａＢ６供給源を用いて３〜１０ｋＶであった。作業距離は、約５μｍである。
【００６４】
ロット４（エタノール中のニート処方物）以外の全ての粉体は、安定プロトコルに記載される温度およびＲＨ条件において２週間または３週間のいずれかで保存した後で、形態において評価できるほどの変化を何ら示さなかった。そのエタノール粉体は、７５％ ＲＨ、４０℃で形態変化を示した。加速保存条件下で、エタノール処方物は、初期と比較した場合、より多くのしわが寄り、いくらかの断片を含んでいた。
【００６５】
残留溶媒。噴霧乾燥後の粉体中の残留溶媒含有量を、ＴＡ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳＴＭ（Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）ＴＧＡを用いて、ＴＧＡにより決定した。約３ｍｇの粉体を、相対湿度が５％未満のグローブボックス中で密閉アルミニウムパンにパックした。分析前に、そのパンをピンで穿刺し、装置に装填した。使用した方法を、室温から１７５℃まで１０℃／分で実行した（表６）。
【００６６】
【表６】
タンパク質安定性。いくつかの技術を使用して、凝集および分解についてサンプルを分析した。可溶性の凝集物を、ＳＥ−ＨＰＬＣにより定量的に測定した。そのＨＰＬＣは、ＷＡＴＥＲＳＴＭシステム、Ａｌｌｉａｎｃｅモデル２６９０であった。このクロマトグラフィーシステムは、溶媒送達システム、発光ダイオードアレイ検出器、温度制御自動サンプラーおよびデータ管理システムを装備していた。移動相は、５０ｍＭ リン酸ナトリウムと１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０に調節）からなっており、１ｍＬ／分で定組成で（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）実施であった。カラムは、ＴＯＳＯＨＡＡＳＴＭ ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ、５μｍ孔サイズ、ガードカラム付き）であった。サンプルを、水で１ｍｇのｒＦ．ＩＸペプチド／ｍＬの濃度に再構成したかまたは希釈した。サンプルを、注入するまで５℃で保存した。クロマトグラムを抽出し、２１４ｎｍで処理した。噴霧乾燥前の、処方した溶液のモノマー含有量％を、その対応する再構成したエアロゾル薬物粉体と比較した。
【００６７】
ＵＶ分光光度分析を利用して、サンプルの混濁度（凝集／沈殿）を評価した。ＨＩＴＡＣＨＩＴＭ Ｕ−３０００（デュアルビーム分光光度計）で測定を行った。機器のパラメーターを、スキャン速度３００ｎｍ／分；１．０ｎｍスリット幅；およびスキャン範囲４００ｎｍ〜２００ｎｍに設定した。サンプルを、粒状物質について目視により検査した。不溶性凝集物を、ＬＴＶでその溶液の混濁度を測定することにより、定量的に決定した。散乱について補正するための線形回帰を、吸光度値３５０ｎｍ、３７５ｎｍおよび４００ｎｍから行った。光散乱について補正したλ最大での吸光度を、回帰直線についての式から外挿した。不溶性凝集物％は、以下の式１に示されるように、λ最大で補正していない吸光度で割った光散乱について補正した吸光度の％である：
不溶性凝集物％＝Ａｂｓλ最大（光散乱補正）／Ａｂｓλ最大（光散乱非補正）
５％の不溶性凝集物未満の値を、処方物安定の指標についての基準として設定した。サンプルを、水で０．１ｍｇのｒＦ．ＩＸペプチド／ｍＬの濃度に再構成したかまたは希釈した。
【００６８】
噴霧乾燥前（プレＳＤ）および噴霧乾燥後の全ての溶液サンプルは、粒状物質の目に見える兆候は何らなかったか、または５％未満の不溶性凝集物を有した。温度安定および湿度安定に配置した研究１および研究２における全てのサンプルは、粒状不溶性凝集物物質も検出可能な不溶性凝集物も目に見える徴候を何ら示さなかった。５％未満の不溶性凝集物を、全てのバッチについて式１を用いて計算した。従って、表７は、ＳＥ−ＨＰＬＣによってのみ収集されたデータである。
【００６９】
【表７】
可溶性凝集物および分解を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥみにんらすに定性的に測定した。ＮＯＶＥＸＴＭ成形済み４〜２０％ トリス−グリシンゲルを、ＮＯＶＥＸ ＸＣＥＬＬ ＩＩＴＭ電気泳動ミニセルで泳動させた。サンプルを、水で０．１ｍｇのｒＦ．ＩＸペプチド／ｍＬの濃度に再構成したかまたは希釈した。溶液を、還元条件下および非還元条件下で調製して、各レーンに１μｇのタンパク質の充填を送達した。還元サンプルは、２−メルカプトエタノールで処理された。ゲルを、ゲルの先頭が底部に達するまで（約１．５時間）１２５Ｖ、２５ｍＡ／ゲルで泳動させた。増大した感度についてＮＯＶＥＸ ＳＩＬＶＥＲ ＸＰＲＥＳＳＴＭ 染色キットを用いて、銀染色検出を使用した。２週間、２５℃および２週間、４０℃の安定時間点で研究１および研究２両方の代表的処方物からのサンプルを使用して、還元ゲルおよび非還元ゲルを調製した。これらのゲルを泳動させる目的は、レーンに５μｇのタンパク質を負荷して、１μｇのタンパク質負荷では見出されなかった任意の弱いバンドを検出することであった。
【００７０】
噴霧乾燥する前の処方溶液と再構成したエアロゾル薬物粉体間のゲルプロフィールに何ら変化はなかった（データは示さず）。ゲル上の全てのサンプルのモノマーバンドおよびｒＦ．ＩＸのコントロールは、報告されている値よりも高分子量で泳動し（約６５ｋＤａ）、広くかつ拡散しているようである。これは、タンパク質のグリコシル化およびｒＦ．ＩＸのゲルを介する移動をもたらすことに寄与する可能性が最も高い。モノマーバンドの他に、ｒＦ．ＩＸａおよびｃ末端ペプチドに寄与する他のバンドが存在した。しかし、噴霧乾燥薬物粉体と再構成したエアロゾル薬物粉体との間に何ら差異はなかった。
【００７１】
まとめ。第２のスクリーニング実験に関して低噴霧圧を選択した後、ｒＦ．ＩＸ粉体処方物のエアロゾル性能は、全ての評価で最良に機能するトリロイシン処方物で事業目的を満たした。その放出された用量は、５７％、６２％、７８％、８９％および５０％であり、エアロゾルＭＭＡＤ値は、３．４μｍ、４．２μｍ、２．８μｍ、２．９μｍおよび３．５μｍであり、ニートｒＦ．ＩＸ、５％ エタノール：クエン酸中ｒＦ．ＩＸ、６０％ ロイシン：クエン酸中ｒＦ．ＩＸ、４０％ トリロイシン：クエン酸中ｒＦ．ＩＸおよび３７℃まで加熱したニートｒＦ．ＩＸについては、それぞれ、４９％、３６％、６０％、５８％および４４％が３．３μｍ未満であった。
【００７２】
研究２において、エタノール処方物およびロイシン処方物は各々、モノマー含有量において３％ 低下を有し、はじめに、噴霧乾燥前溶液を、再構成したエアロゾル薬物粉体と比較した。噴霧乾燥前と比較して、はじめに研究２における他の処方物において何ら変化はなかった。２週間の安定研究に基づいて、湿度は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した場合、化学的安定性に関して最も大きな影響を有した。全てのバッチに関して、不溶性凝集物は、ＵＶでは観察されなかった。余分の可溶性凝集物バンドも分解バンドも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して観察されなかった。選択した処方物の凝固活性は、噴霧乾燥に起因して損なわれることはなかった。噴霧乾燥後の活性は、Ｆ．ＩＸアッセイによって測定される場合、噴霧乾燥前に平均８０〜９０％の活性であり、最良の処方物は、９５％以上で機能した。
【００７３】
エタノール（ロット４）噴霧乾燥粉体は、ＳＥＭにより観察した場合に、形態変化を示した唯一の処方物であった。４０℃／７５％ ＲＨでの２週間の安定において、そのエタノール処方物は、よりしわが寄り、断片になったフラグメントを含んでいた。同一の保存条件に曝した場合、他の粉体のいずれにおいても、有意な形態変化は示されなかった。このデータは、肺送達に適した乾燥Ｆ．ＩＸが、アルコールを用いて噴霧乾燥されるべきではないことを示唆する。
【００７４】
（実施例３：インビボでのバイオアベイラビリティー研究）
最初の２つの研究は、１）液体ｒＦ．ＩＸの有効レベルが気管内表面を介して全身に送達できること、および２）乾燥粉体ｒＦ．ＩＸを酵素活性および安定性を維持しながら首尾よくエアロゾル化できることを示した。次の実験は、インビボイヌモデルにおいて処方物６（トリロイシン賦形剤）を用いて、ｒＦ．ＩＸのバイオアベイラビリティーについて試験した。
【００７５】
この研究の目的は、ヒト第ＩＸ因子に対して以前から寛容であった血友病Ｂのイヌにおける経口投与後にヒト第ＩＸ因子の薬力学的パラメーターおよび薬理学的パラメーターを決定することであった。この研究からのデータを、静脈内注射によりヒト第ＩＸ因子を投与するその後の研究からのデータに対して比較する。測定したパラメーターは、以下を含んでいた：１）全血凝固時間（ＷＢＣＴ）、２）Ｆ．ＩＸ抗原（Ｆ．ＩＸ：Ａｇ）、３）活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、４）Ｆ．ＩＸ活性、５）ＥＬＩＳＡによるＦ．ＩＸ抗体、および６）Ｂｅｔｈｅｓｄａインヒビターアッセイ。
【００７６】
イヌ：Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌコロニー（実施例１を参照のこと）に由来する５匹の血友病イヌを、この研究において使用した。使用した５匹のイヌのうち、４匹は、ヒトＦ．ＩＸ寛容性血友病イヌであり、予防に関連した（月曜日および木曜日に８２ＩＵ／Ｋｇ ＳＣ）。２匹のイヌは、最後の投与（木曜日）を受けなかった。代わりに、１日目に吸入により投薬を受けた。１匹のイヌは、ｒＦ．ＩＸを受けなかった。
【００７７】
イヌモデルにおけるエアロゾル送達を評価するために、米国特許第６，２５７，２３３号に記載されるような改良型デバイスを使用した。簡潔には、レギュレーター、ＨＥＰＡフィルタおよび一連のバルブを通して、加圧空気（−５ｐｓｉ）により空気を供給した。パーソナルコンピューター（ＰＣ）は、そのシステムを通る空気の流れを調節した。空気を、改良されているデバイスに、イヌの肺に、カフを介して適所に保持したＥＴチューブを通して送達した。リリーフバルブは、送達される空気が多すぎないようにし、Ｕ字型マノメーターにより、送達空気の圧力を測定した。
【００７８】
コンピューターを使用して、加圧空気の既知容積（約８００ｍｌ）および流速を制御した。その加圧空気を使用して、エアロゾルを気管内チューブを通してイヌに送達した。このシステムにより生成した容積は、麻酔した１０ｋｇのイヌの肺機構に基づいた。麻酔したイヌの合計最大肺容積は、約１４００ｍｌであり、平均送達ボーラスは、８００ｍｌであった。
【００７９】
カテーテルを、以下の手順を使用して、研究の比にイヌに入れた。全身麻酔のために、その動物をチオペンタールＮａを使用して鎮静させた。動物を静置し、イソフルランを使用して麻酔を維持した（酸素を補給しながら２〜４％ 吸入）。動物を、心拍数、呼吸数、血圧、ならびに眼瞼反射、角膜反射および耐薬反射（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｒｅｆｌｅｘ）の持続または不在について評価した。局所麻酔および鎮静を要する手順のために、動物に、メジトミジン（Ｍｅｄｉｔｏｍｉｄｉｎｅ）、バリウム（Ｖａｌｉｕｍ）、酒石酸ブロルファノール（Ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ Ｔａｒｔｒａｔｅ）もしくはプロポフォル（Ｐｒｏｐｏｆｏｌ）または類似の麻酔薬／鎮静剤を与えた。
【００８０】
イヌを、２％ イソフルランおよび酸素を用いて１〜４分間過換気させた。このことにより、約３分間持続する無呼吸が生じる。無呼吸の間に、そのイヌを、エアロゾル装置に接続し、８００ｍｌのボーラスの空気をそのシステムを通して与えた。そのシステムのエアロゾル送達を、レーザー、インラインフィルタ、およびバルーンを用いて再度特徴付けして、イヌの肺を模倣した。エアロゾルボーラスの大部分は、約６００ｍｌで送達されたと結論づけられた。
【００８１】
比較のために、イヌに、匹敵する用量の組換えヒトＦ．ＩＸの静脈内注射を与え、同じサンプリングおよび分析プロトコルを用いた。このプロトコルは、吸入研究完了して少なくとも２８日後に開始した。これらのイヌは全て、過去において、それらの特徴付けの一部と類似のＩＶボーラスを有した。
【００８２】
【表８】
投薬量：組換えヒト第ＩＸ因子を、粉体重量で７．５ｍｇを含むブリスターパックとして供給した。そのうち３．９５ｍｇは、糖タンパク質であり、０．５５ｍｇは、クエン酸Ｎａであり、３．０ｍｇは、賦形剤（トリロイシン），ｐＨ６．４であった。各７．５ｍｇのブリスターは、約５ｍｇの粉体を送達する。その比活性は、約３００ユニット／ｍｇタンパク質である。１．０ｍｇの糖タンパク質あたり、８５．５％がタンパク質であり、残りは、糖部分である。
【００８３】
サンプル収集：血液を、以下に列挙する時点で頸動脈または橈側皮静脈から採取した。第ＩＸ因子抗原およびＡＰＴＴの血漿濃度を決定するために、血液サンプル（３．０ｍｌ）を、以下の時点で３．８％ クエン酸含有チューブに回収した：投与直前、投与後０．０８時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、２８時間、３２時間、４８時間、７２時間、および９６時間。さらなる血液サンプルを、抗ヒト第ＩＸ因子抗体の形成およびその濃度を決定するために、投与前、月曜日の皮下投与の直前、連続４週間にわたって１週間に１回、回収した。
【００８４】
その血漿を、４℃で１４分間４５００ｒｐｍで遠心分離することにより分離した。血清を、室温で１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離することにより分離した。その血漿を、１２×７５ｍｍポリプロピレンクライオバイアルに入れて少なくとも３つのアリコートに分けた。全ての血漿／血清含有チューブを、必要時まで約−８０℃で凍結した。
【００８５】
データ分析：第ＩＸ因子の血漿濃度の薬理学的分析を、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、最大血漿濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）、および見かけ上の半減期（ｔ１／２）のようなパラメーターを決定するために行った。分析を、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ ＰＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ ２．０ＴＭ（ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＣＯＮＳＵＬＴＩＮＧＴＭ，Ａｐｅｘ，ＮＣ）有効のコンピュータープログラムまたは等価物を使用して行った。さらに、ＡＰＴＴの血漿濃度および抗体濃度を、時間に対してプロットした。
【００８６】
Ｆ．ＩＸバイオアッセイ：第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）凝固活性を、イヌＦ．ＩＸ欠損基質血漿を用いて、改変１段階部分的トロンボプラスチン時間アッセイにより決定した。正常のヒト参照血漿は、５〜１０名の正常ヒトに由来するプールからなる。その試験サンプルを、数倍に希釈し、正常曲線の同じ希釈倍率に対して比較した。結果を正常の百分率として報告する。
【００８７】
ＡＰＴＴ：ＡＰＴＴを、大量のサンプルを迅速に処理する性能を有する、ＳＴ４ＴＭ凝固機器（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯＴＭ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）またはＭＵＬＴＩＰＬＥ ＤＩＳＣＲＥＴＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（ＭＤＡ）１８０ＴＭ（ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥＫＮＩＫＡＴＭ）で決定した。ＡＰＴＴがＳＴ４ＴＭ凝固器具またはＭＤＡ１８０ＴＭで決定されるか否かに拘わらず、コントロールおよび試薬は、同じ型である。ＡＰＴＴ試験については、混合物は、等量部の部分的トロンボプラスチン（ＡＵＴＯＭＡＴＥＤ ＡＰＴＴＴＭ，ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥＫＮＩＫＡＴＭ）、０．０２５Ｍ ＣａＣｌ２、およびクエン酸処理試験血漿からなった。
【００８８】
その結果を、図５に示す。ＡＰＴＴは、吸入投与して約１００時間後に、９０秒から７０〜７５秒に短縮した。このことは、低用量の予防応答に代表的である。
【００８９】
ＷＢＣＴ：ＷＢＣＴを、以前に記載されているように行った（７，１３−１５）。ＷＢＣＴは、代表的には、Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌコロニー由来の未処置血友病Ｂのイヌにおいて５０分より大きい（１４，１５）。そのこのコロニーにおける正常な健康なイヌのＷＢＣＴについての基準範囲は、８〜１２分である。その結果を図６に示す。ＷＢＣＴは、５０＋分から約１０分にまで減少した。
【００９０】
Ｂｅｔｈｅｓｄａインヒビターアッセイ：第ＩＸ因子についてのＢｅｔｈｅｓｄａインヒビターアッセイを行った。このアッセイは、元はＫａｓｐｅｒらによって報告された手順にＮｉｊｍｅｇａｎが改変を加えている（３４，３５）。簡潔には、正常コントロールの５０％の残留第ＩＸ因子活性を有する患者の血漿を、インヒビターの１ Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット（ＢＵ）／ｍＬと規定する。適切なスクリーニング希釈を行って、低力価（２ＢＵ）および高力価（＞５ＢＵ）両方のインヒビターを検出した。インヒビターは見出されなかった（データは示さず）。
【００９１】
第ＩＸ因子抗原：抗原濃度を、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによる二重モノクローナル抗体サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。
【００９２】
（実施例４：第ＶＩＩＩ因子）
第ＶＩＩＩ因子もまた、血友病Ａの処置において重要であり、第ＸＩ因子は、第ＸＩ因子欠損の処置のために重要である。実験を計画して、Ｆ．ＶＩＩＩもまた、上記の第ＩＸ因子と同様に、エアロゾル吸入治療によって送達されうることを確認した。ＦＶＩＩＩを、研究２と同じ処方物および方法を用いて、実施例２に記載されるようにエアロゾル化する。
【００９３】
本明細書に引用された全ての参考文献は、全ての目的で本明細書に明示的に参考として援用される。
【００９４】
【表９】
【００９５】
【表１０】
【００９６】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、静脈内または気管内で与えられるｒＦ．ＩＸの単回投与に続く、血友病ＢのイヌにおけるＦ．ＩＸの活性である。ＩＶで与えられたｒＦ．ＩＸ（２００ＩＵ／ｋｇ）は、Ｆ．ＩＸ活性において、即時の二双性の応答を生じた。ＩＴで与えられたｒＦ，ＩＸ（２００ＩＵ／ｋｇまたは１０００ＩＵ／ｋｇ）は、８時間目に開始する、発生が遅れた、検出可能なＦ．ＩＸ活性レベルを生じた。Ｆ．ＩＸ活性を、ＩＶ用量と両方のＩＴ用量とを用いて、少なくとも７２時間にわたって検出した。２００ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとでのＩＴ用量の投与は、２００ＩＵ／ｋｇのＩＶ用量を用いて達成されるより低い、かなりの治療レベルを達成した。各データ点は、ＩＶ群における１８時間の時点（これは、２匹のイヌからのデータを表す）を除いて、３匹のイヌから計算された平均±標準偏差を表す。
【図２】図２は、図１は、静脈内または気管内で与えられるｒＦ．ＩＸの単回投与に続く、血友病ＢのイヌにおけるＦ．ＩＸの活性である。Ｆ．ＩＸ抗原は、検出の持続時間がより短いようであることを除いて、図１に示される活性アッセイを本質的に反映する。この明らかなより短い持続時間は、おそらく、このアッセイの感度に起因する。
【図３】図３は、血友病Ｂイヌへの、２００ＩＵ／ｋｇまたは１０００ＩＵ／ｋｇの気管内投与とに吸収された、ｒＦ．ＩＸの累積総量である。２００ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとの両方でのＩＴ用量の群についての、経時的に吸収された累積量は、類似であるようである。吸収されるｒＦ．ＩＸの総量は、２００ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとの両方のＩＴ群について、それぞれおよそ２１ＩＵ／ｋｇおよび３７ＩＵ／ｋｇである。これらのデータは、２つの用量の群の間で吸収された量の、比例しない増加（図４を参照のこと）と一致する。
【図４】図４は、２００ＩＵ／ｋｇおよび１０００ＩＵ／ｋｇを気管内で受けた、血友病Ｂのイヌに投与された総用量の百分率としての、吸収されたｒＦ．ＩＸの累積量である。逆重畳分析によって計算された、吸収された総量の百分率は、２００ＩＵ／ｋｇ用量の群と１０００ＩＵ／ｋｇ用量の群とについて、それぞれ、およそ１０．２％および３．７％であった。
【図５】図５は、ネイティブな血友病Ｂのイヌにおける、ｒＦ．ＩＸ吸入後のＡＰＴＴ短縮である。
【図６】図６は、ネイティブな血友病Ｂのイヌにおける、ｒＦ．ＩＸ吸入後のＷＢＣＴ短縮である。
【図７】図７は、吸入によってｒＲＦ．ＩＸ（５０ＩＵ／ｋｇ）を受けた、寛容化された血友病Ｂのイヌ（ｎ＝３）についての、平均で補正されたｒＦ．ＩＸ抗原濃度時間曲線である。
【図８】図８は、抗原アッセイによって決定される場合の、寛容化された血友病のイヌ（ｎ＝４）における、吸入後に吸収されたｒＦ．ＩＸの累積量である。イヌは、Ｃ２２（上の線４）、Ｃ２０（線３）、Ｃ２５（線２）、Ｃ２６）（下の線１）である。
【図９】記載なし。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血友病を処置する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）をエアロゾル化する工程であって、該エアロゾル化されたＦ．ＩＸが：
ｉ）２μｍと４μｍとの間の質量中央空気力学直径（ＭＭＡＤ）を有し、少なくとも５０％の３．３μｍ未満の微細粒子割合百分率（ＦＰＦ％＜３．３μｍ）を有し、
ｉｉ）少なくとも９０％がモノマーであり、
ｉｉｉ）エアロゾル化後の活性／エアロゾル化前の活性が、少なくとも８０％であり；そして
ｉｖ）１０％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有する乾燥粉末である、工程；
ｂ）該エアロゾル化Ｆ．ＩＸを吸入して、該エアロゾル化Ｆ．ＩＸを肺内に堆積させる工程；
ｃ）引き続いて、呼気を行う工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＭＭＡＤが、２．８〜３．６μｍであり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６０％であり、前記モノマー含有量が、少なくとも９５％であり、そして前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＭＡＤが、約３〜３．５μｍであり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６４％であり、前記モノマー含有量が、少なくとも９７％であり、そして前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｆ．ＩＸが、アルコールなしでエアロゾル化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｆ．ＩＸが、組換え体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｆ．ＩＸが、トリロイシン賦形剤を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記トリロイシン／Ｆ．ＩＸの比が、０．５〜０．５ｗｔ／ｗｔである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血友病を処置する方法であって、該方法は、エアロゾル化された乾燥第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）の吸入を包含し、該エアロゾル化乾燥Ｆ．ＩＸは、以下：
ａ）表面活性ジペプチドもしくはトリペプチドを含有し、ｂ）２．８μｍと３．６μｍとの間のＭＭＡＤ、６０％より大きいＦＰＦ％＜３．３μｍ、ｄ）少なくとも９５％のモノマー含有量、ｅ）少なくとも８０％のエアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性、そしてｆ）１０％未満の水を有する、
方法。
【請求項９】
前記ＭＭＡＤが、約３〜３．５μｍであり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６４％であり、前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９５％であり、前記モノマー含有量が、少なくとも９７％であり、そして前記水含有量が、５％未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｆ．ＩＸが、アルコールを含有しない、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｆ．ＩＸが、組換え体である、請求子８に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｆ．ＩＸが、トリロイシン賦形剤を含有する、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記トリロイシン／Ｆ．ＩＸの比が、０．５〜１．５ｗｔ／ｗｔである、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
血友病の出血を、血友病の襲撃の前に予防する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）をエアロゾル化する工程であって、該エアロゾル化されたＦ．ＩＸが：
ｉ）２μｍと４μｍとの間の質量中央空気力学直径（ＭＭＡＤ）を有し、
ｉｉ）少なくとも５０％の３．３μｍ未満の微細粒子割合百分率（ＦＰＦ％＜３．３μｍ）を有し、
ｉｉｉ）少なくとも９０％がモノマーであり、
ｉｖ）エアロゾル化後の活性／エアロゾル化前の活性が、少なくとも８０％であり；そして
ｖ）１０％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有する乾燥粉末である、工程；
ｂ）該エアロゾル化Ｆ．ＩＸを、１週間当たり少なくとも１回吸入して、該エアロゾル化Ｆ．ＩＸを肺内に堆積させる工程；
ｃ）引き続いて、呼気を行う工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記吸入が、２週間ごとである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記吸入が、２〜３日ごとである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
エアロゾル化乾燥Ｆ．ＩＸ、および表面活性ジペプチド賦形剤またはトリペプチド賦形剤を含有するが、エタノールを有さない組成物であって、該エアロゾル化乾燥Ｆ．ＩＸは、エアロゾル化される場合に、２μｍと４μｍとの間のＭＭＡＤ、少なくとも５０％のＦＰＦ％＜３．３μｍ、少なくとも５０％の放出用量（ＥＤ）、少なくとも９５％のモノマー含有量、少なくとも８０％のエアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性、１０％未満の水を有する、組成物。
【請求項１８】
前記ＭＭＡＤが、２．８〜３．６μｍであり、前記ＥＤが、少なくとも６０％であり、前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９５％であり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６５％であり、そして５％未満が水である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＭＭＡＤが、３μｍと３．５μｍとの間であり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６４％であり、前記ＥＤが、少なくとも８０％であり、前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９５％であり、前記モノマー含有量が、少なくとも９７％であり、そして前記水含有量が、５％未満である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｆ．ＩＸ、および表面活性ジペプチド賦形剤またはトリペプチド賦形剤を含有するが、エタノールを有さないブリスターパックであって、該ブリスターパックは、防水性であり、そして少なくとも９０％がモノマーであり、そして１０％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有する、Ｆ．ＩＸ、ブリスターパック。
【請求項２１】
前記Ｆ．ＩＸが、少なくとも９５％がモノマーであり、そして５％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有し、そして前記賦形剤が、ジロイシルまたはトリロイシンである、請求項２０に記載のブリスターパック。
【請求項２２】
前記Ｆ．ＩＸが、少なくとも９７％がモノマーであり、そして５％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有し、そして前記賦形剤が、トリロイシンである、請求項２０に記載のブリスターパック。
【請求項２３】
前記Ｆ．ＩＸが、組換えＦ．ＩＸである、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のブリスターパック。
【請求項２４】
乾燥粉末状のＦ．ＩＸであって、生物学的に活性な組換え第ＩＸ因子、および表面活性ジペプチド賦形剤またはトリペプチド賦形剤を含有するが、エタノールを有さず、該組換え第ＩＸ因子は、少なくとも９０％がモノマーであり、そして１０％未満の水を有する、乾燥粉末状のＦ．ＩＸ。
【請求項２５】
前記賦形剤が、トリロイシンである、請求項２４に記載の乾燥粉末状のＦ．ＩＸ。
【請求項２６】
賦形剤に対するＦ．ＩＸの比が、０．２〜５．０／１である、請求項２５に記載の乾燥粉末状のＦ．ＩＸ。
【請求項２７】
乾燥した分散可能な粉末および固体内容物を含有する組成物であって、該固体内容物は、約５０ｗｔ％のグリコシル化Ｆ．ＩＸ、約４０ｗｔ％のトリロイシン、および約１０ｗｔ％の緩衝剤である、組成物。
【請求項２８】
乾燥した分散可能な粉末および固体内容物を含有する組成物であって、該固体内容物は、約４０〜６０ｗｔ％のグリコシル化Ｆ．ＩＸ、４０〜６０ｗｔ％のトリロイシン、および０〜１０ｗｔ％の緩衝剤である、組成物。
【請求項１】
血友病を処置する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）をエアロゾル化する工程であって、該エアロゾル化されたＦ．ＩＸが：
ｉ）２μｍと４μｍとの間の質量中央空気力学直径（ＭＭＡＤ）を有し、少なくとも５０％の３．３μｍ未満の微細粒子割合百分率（ＦＰＦ％＜３．３μｍ）を有し、
ｉｉ）少なくとも９０％がモノマーであり、
ｉｉｉ）エアロゾル化後の活性／エアロゾル化前の活性が、少なくとも８０％であり；そして
ｉｖ）１０％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有する乾燥粉末である、工程；
ｂ）該エアロゾル化Ｆ．ＩＸを吸入して、該エアロゾル化Ｆ．ＩＸを肺内に堆積させる工程；
ｃ）引き続いて、呼気を行う工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＭＭＡＤが、２．８〜３．６μｍであり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６０％であり、前記モノマー含有量が、少なくとも９５％であり、そして前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＭＡＤが、約３〜３．５μｍであり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６４％であり、前記モノマー含有量が、少なくとも９７％であり、そして前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｆ．ＩＸが、アルコールなしでエアロゾル化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｆ．ＩＸが、組換え体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｆ．ＩＸが、トリロイシン賦形剤を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記トリロイシン／Ｆ．ＩＸの比が、０．５〜０．５ｗｔ／ｗｔである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血友病を処置する方法であって、該方法は、エアロゾル化された乾燥第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）の吸入を包含し、該エアロゾル化乾燥Ｆ．ＩＸは、以下：
ａ）表面活性ジペプチドもしくはトリペプチドを含有し、ｂ）２．８μｍと３．６μｍとの間のＭＭＡＤ、６０％より大きいＦＰＦ％＜３．３μｍ、ｄ）少なくとも９５％のモノマー含有量、ｅ）少なくとも８０％のエアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性、そしてｆ）１０％未満の水を有する、
方法。
【請求項９】
前記ＭＭＡＤが、約３〜３．５μｍであり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６４％であり、前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９５％であり、前記モノマー含有量が、少なくとも９７％であり、そして前記水含有量が、５％未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｆ．ＩＸが、アルコールを含有しない、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｆ．ＩＸが、組換え体である、請求子８に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｆ．ＩＸが、トリロイシン賦形剤を含有する、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記トリロイシン／Ｆ．ＩＸの比が、０．５〜１．５ｗｔ／ｗｔである、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
血友病の出血を、血友病の襲撃の前に予防する方法であって、該方法は、以下：
ａ）第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）をエアロゾル化する工程であって、該エアロゾル化されたＦ．ＩＸが：
ｉ）２μｍと４μｍとの間の質量中央空気力学直径（ＭＭＡＤ）を有し、
ｉｉ）少なくとも５０％の３．３μｍ未満の微細粒子割合百分率（ＦＰＦ％＜３．３μｍ）を有し、
ｉｉｉ）少なくとも９０％がモノマーであり、
ｉｖ）エアロゾル化後の活性／エアロゾル化前の活性が、少なくとも８０％であり；そして
ｖ）１０％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有する乾燥粉末である、工程；
ｂ）該エアロゾル化Ｆ．ＩＸを、１週間当たり少なくとも１回吸入して、該エアロゾル化Ｆ．ＩＸを肺内に堆積させる工程；
ｃ）引き続いて、呼気を行う工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記吸入が、２週間ごとである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記吸入が、２〜３日ごとである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
エアロゾル化乾燥Ｆ．ＩＸ、および表面活性ジペプチド賦形剤またはトリペプチド賦形剤を含有するが、エタノールを有さない組成物であって、該エアロゾル化乾燥Ｆ．ＩＸは、エアロゾル化される場合に、２μｍと４μｍとの間のＭＭＡＤ、少なくとも５０％のＦＰＦ％＜３．３μｍ、少なくとも５０％の放出用量（ＥＤ）、少なくとも９５％のモノマー含有量、少なくとも８０％のエアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性、１０％未満の水を有する、組成物。
【請求項１８】
前記ＭＭＡＤが、２．８〜３．６μｍであり、前記ＥＤが、少なくとも６０％であり、前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９５％であり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６５％であり、そして５％未満が水である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＭＭＡＤが、３μｍと３．５μｍとの間であり、前記ＦＰＦ％＜３．３μｍが、少なくとも６４％であり、前記ＥＤが、少なくとも８０％であり、前記エアロゾル化後活性／エアロゾル化前活性が、少なくとも９５％であり、前記モノマー含有量が、少なくとも９７％であり、そして前記水含有量が、５％未満である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｆ．ＩＸ、および表面活性ジペプチド賦形剤またはトリペプチド賦形剤を含有するが、エタノールを有さないブリスターパックであって、該ブリスターパックは、防水性であり、そして少なくとも９０％がモノマーであり、そして１０％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有する、Ｆ．ＩＸ、ブリスターパック。
【請求項２１】
前記Ｆ．ＩＸが、少なくとも９５％がモノマーであり、そして５％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有し、そして前記賦形剤が、ジロイシルまたはトリロイシンである、請求項２０に記載のブリスターパック。
【請求項２２】
前記Ｆ．ＩＸが、少なくとも９７％がモノマーであり、そして５％（ｗｔ／ｗｔ）未満の水を有し、そして前記賦形剤が、トリロイシンである、請求項２０に記載のブリスターパック。
【請求項２３】
前記Ｆ．ＩＸが、組換えＦ．ＩＸである、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のブリスターパック。
【請求項２４】
乾燥粉末状のＦ．ＩＸであって、生物学的に活性な組換え第ＩＸ因子、および表面活性ジペプチド賦形剤またはトリペプチド賦形剤を含有するが、エタノールを有さず、該組換え第ＩＸ因子は、少なくとも９０％がモノマーであり、そして１０％未満の水を有する、乾燥粉末状のＦ．ＩＸ。
【請求項２５】
前記賦形剤が、トリロイシンである、請求項２４に記載の乾燥粉末状のＦ．ＩＸ。
【請求項２６】
賦形剤に対するＦ．ＩＸの比が、０．２〜５．０／１である、請求項２５に記載の乾燥粉末状のＦ．ＩＸ。
【請求項２７】
乾燥した分散可能な粉末および固体内容物を含有する組成物であって、該固体内容物は、約５０ｗｔ％のグリコシル化Ｆ．ＩＸ、約４０ｗｔ％のトリロイシン、および約１０ｗｔ％の緩衝剤である、組成物。
【請求項２８】
乾燥した分散可能な粉末および固体内容物を含有する組成物であって、該固体内容物は、約４０〜６０ｗｔ％のグリコシル化Ｆ．ＩＸ、４０〜６０ｗｔ％のトリロイシン、および０〜１０ｗｔ％の緩衝剤である、組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２４６０７（Ｐ２００７−５２４６０７Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９８１３（Ｐ２００６−５０９８１３）
【出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１４８７
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０４２９９７４８）
【出願人】（５００１３８０４３）ネクター セラピューティックス (32)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１４８７
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０４２９９７４８）
【出願人】（５００１３８０４３）ネクター セラピューティックス (32)
【Ｆターム（参考）】
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