分子レベルの定量による細菌性膣炎の診断および追跡調査の方法
本発明は、細菌性膣炎の存在に関して膣内細菌叢の状態を診断およびｉｎ ｖｉｔｒｏで追跡調査する方法、ならびに必要な場合には細菌性膣炎の治療的処置を追跡調査する方法に関する。該方法は、患者の膣分泌物のＤＮＡ抽出物における細菌アポトビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの単一コピーＤＮＡとして存在する特異配列の濃度が少なくとも下記の２つの条件ａ）およびｂ）すなわち：ａ）アポトビウム・バギナエ由来の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍｌ以上であること、およびｂ）ガードネレラ・バギナリス由来の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍｌ以上であること、を満たす場合に、細菌性膣炎の存在または現行の治療的処置の失敗が判定されるという特徴を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性膣炎（ＢＶ）の存在に関して、または適用可能な場合には、細菌性膣炎の治療管理を追跡するために細菌性膣炎の転帰に関して、膣内細菌叢の状態を診断および追跡調査するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠にとって非常に有害な一般的感染症であるＢＶを診断するための現在の技法は、信頼性の低い基準に基づいている。何種類かの細菌がこの疾患に関係していると言われてきたが、信頼できる分子レベルの定量および定性を活用してはいなかった。
【０００３】
長い間、ＢＶは、微生物学的見地から、ラクトバチルス属細菌が他の細菌、特にガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、モビルンカス属細菌（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｓｐｐ．）、および生殖器マイコプラズマに屈し、主としてラクトバチルスで構成される正常な膣内細菌叢がほとんど消失することをもって定義されてきた［非特許文献１および２］。ＢＶは多くの女性を診療室へと導き、特に、ＨＩＶのような性感染症への罹病性に関与し、また妊娠の場合には未熟児および低出産体重児に関与する。女性（妊婦を含む）におけるＢＶ有病率は、現行の調査法によれば８〜２３％である［非特許文献３］。
【０００４】
しかしながら、文献を再検討すると、この病的状態の治療管理への影響に関しては論争がある。ＢＶを治療した場合の早産のリスクの低下を示した初期の研究を確認することはできなかった［非特許文献４および５、非特許文献３、非特許文献６〜１０］。
【０００５】
本発明の当初の目的は、妊娠中のＢＶの影響、および妊娠中のＢＶの治療管理の有効性を評価することであった。しかしながら、そうするための客観的な診断ツールが利用可能ではなかった。文献の検討から、ＢＶの診断および追跡調査のための合理的ツールが存在しないことが主な原因で、この疾患の治療管理に関して大きな混乱があることが明らかである。
【０００６】
現在利用可能な２つの診断ツールはＮｕｇｅｎｔスコアおよびＡｍｓｅｌ基準である。実施が煩雑であるため臨床微生物学実験室において日常的には使用されないにもかかわらず、Ｎｕｇｅｎｔスコアは文献中で報告の最も多い方法であり、一部の人々にはゴールドスタンダードと考えられている［非特許文献１１〜１４］。Ｎｕｇｅｎｔスコアはグラム染色後に細菌を半定量的に形態分析することによってＢＶを同定する。従ってこれは主観的な技法であり、その再現性には疑問がもたれてきた［非特許文献１５および１６］。Ａｍｓｅｌの臨床基準（膣内ｐＨが４．５を上回る；灰色がかった均質で粘着性の帯下；１０％ＫＯＨ添加後の窒素臭；クルーセルの存在）は、第２の診断手法の代表である［非特許文献１７］。Ｎｕｇｅｎｔスコアと同様にこれも煩雑であり、日常的な臨床業務においては使用されていない。
【０００７】
これらの診断法の、最も弊害の大きい限界のうちの１つは、ＢＶに関与する特定の微生物を同定できないことである。一方では、マイコプラズマは壁を持たないのでグラム染色されず、Ｎｕｇｅｎｔ法によってスコア化することができない。他方では、分子生物学的知識によりＢＶに関与する可能性のある新しい細菌を同定することが可能となっているものの、該細菌を既存の２つの診断法により実証することは不可能である。アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）は、特徴解析が為された主な新しい細菌種である。該細菌の存在はいくつかの論文においてＢＶと関連付けられているが、他の微生物との相対的な位置付けに関する、信頼できる定量的な評価はなされていない［非特許文献１８〜２２］。
【０００８】
ブラッドショーらによって最近発表された論文［非特許文献１８］には、細菌Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスの検出とＢＶとの間の関連が記載されているが、これらの結果は、ＢＶの診断および／またはＢＶの転帰の信頼性の高い追跡調査を行うには不十分である。この論文で示されたデータは上記細菌のスクリーニングを可能にしているが、実際に定量化はされていない。さらに、このスクリーニングは、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスがＢＶ患者のそれぞれ９６％および９９％において検出されたので、良好な感度を示した。しかしながら、正常細菌叢を有する患者の１２％においてＡ．バギナエが、６０％においてＧ．バギナリスが検出されたので、特異性は不十分である。
【０００９】
そこで著者らは、分析標本における微生物検出の平均ＣＴ（サイクル閾値）との比較により細菌負荷を低いか高いか分類することによる「半定量的」手法を試みた。こうして著者らは、Ｇ．バギナリスについて４×１０５コピー（２１サイクルに相当する平均）およびＡ．バギナエについて４×１０６コピー（１８サイクルに相当する平均）の平均負荷を概算した。高負荷のＧ．バギナリス（＞４×１０５）およびＡ．バギナエ（＞４×１０６）は、ＢＶ患者において正常細菌叢を有する患者よりも顕著にみられた。しかしながら、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスがＢＶ患者の４９％および７１％にしか検出されなかったように（表１）、これらの値の感度は不十分である。さらに、治療後にＢＶを再発した１６人の患者（２８％）は、所定の閾値より低いＧ．バギナリス濃度を有していた（表３）。ＢＶを再発した４０人の患者（７０％）も、閾値より低いＡ．バギナエ濃度を有していた。
【００１０】
従って、著者らの「半定量的」手法は、患者の診断および当座の追跡調査のツールとしてのみ適用可能である。これらの結果を得るために使用した技法は、いくつかの点で不適当であった。第１に、分子標的によって増幅されるフラグメントが長すぎたので（１６ＳリボソームＲＮＡの４３０塩基対（Ａ．バギナエ）および２９１塩基対（Ｇ．バギナリス））、該ＰＣＲ法は十分な感度ではなかった。そのような長いＰＣＲ反応において標的とされた配列を用いると感度が低いことがここで確証された。さらに、リアルタイムＰＣＲ技法は検出および定量に増幅産物のＳｙｂｒＧｒｅｅｎ標識を使用し、それは３重の特異性（大きさが１２０塩基対を超えないフラグメントを増幅するための２つのプライマーおよびプローブ）を必要とする標識加水分解プローブを使用する方法よりも、特異性の低い方法である。定量は通常、長期間にわたって比較できる安定で再現性の良いプラスミド範囲の関数としてではなく、可変的な標準を用いて行われる。最後に、標本の品質評価を可能にする定量用の対照ツールを活用していない：試料中のヒトβ‐グロビンを定量することなく存在のみを調べている。従って、細菌量の変動が、採取された膣分泌物における質的かつ量的変動に関連しているかもしれないので、試料を相互に定量的に比較することは非常に困難であった。
【００１１】
従って、ＢＶの治療管理を評価するためには、ＢＶの診断および膣内細菌叢の定性的かつ定量的なモニタリングのための信頼性の高いツールの開発が不可欠である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】シュピーゲル ＣＡ（Ｓｐｉｅｇｅｌ ＣＡ）、ＣＭＲ １９９１
【非特許文献２】トーセン Ｐ（Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｐ）、ＡＪＧＯ １９９８
【非特許文献３】ギーズ ＪＭ（Ｇｕｉｓｅ ＪＭ）、ＡＪＰＭ ２００１
【非特許文献４】モラレス ＨＪ（Ｍｏｒａｌｅｓ ＨＪ）、ＡＪＯＧ １９９４
【非特許文献５】ホース ＪＣ（Ｈａｕｔｈ ＪＣ）、ＮＥＪＭ １９９５
【非特許文献６】マクドナルド Ｈ（ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｈ）、ＣＤＳＲ ２００５
【非特許文献７】バルマー Ｒ（Ｖａｒｍａ Ｒ）、ＥＪＯＧＲＢ ２００６
【非特許文献８】オークン Ｎ（Ｏｋｕｎ Ｎ）、ＯＧ、２００５
【非特許文献９】ライティヒ Ｈ（Ｌｅｉｔｉｃｈ Ｈ）、ＡＪＯＧ ２００３
【非特許文献１０】グェルラ Ｂ（Ｇｕｅｒｒａ Ｂ）、ＥＪＯＧＲＢ ２００６
【非特許文献１１】フレドリクス ＤＮ（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓ ＤＮ）、ＮＥＪＭ ２００５
【非特許文献１２】トマソン ＪＬ（Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＪＬ）、ＡＪＯＧ １９９２
【非特許文献１３】イーソン ＣＡ（Ｉｓｏｎ ＣＡ）、ＳＴＤ ２００２
【非特許文献１４】ニュージェント ＲＰ（Ｎｕｇｅｎｔ ＲＰ）、ＪＣＭ １９９１
【非特許文献１５】シャー ＢＥ（Ｓｈａ ＢＥ）、ＪＣＭ ２００５
【非特許文献１６】シュウェブキー ＪＲ（Ｓｃｈｗｅｂｋｅ ＪＲ）、ＯＧ １９９６
【非特許文献１７】アムセル Ｒ（Ａｍｓｅｌ Ｒ）、ＡＪＭ １９８３
【非特許文献１８】ブラッドショー ＣＳ（Ｂｒａｄｓｈａｗ ＣＳ）、ＪＩＤ ２００６
【非特許文献１９】ロドリゲス ＪＭ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＭ）、ＩＪＳＢ １９９９
【非特許文献２０】フェリス ＭＪ（Ｆｅｒｒｉｓ ＭＪ）、ＢＭＣＩＤ ２００４
【非特許文献２１】フェリス ＭＪ（Ｆｅｒｒｉｓ ＭＪ）、ＪＣＭ ２００４
【非特許文献２２】フェルヘルスト Ｒ（Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ）、ＢＭＣＭ ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、より信頼性が高く、より正確で、かつ臨床の微生物分析実験室において日常的に使用することが容易な、ＢＶの診断およびモニタリングのための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的のために、本発明者らは、２０４人の妊婦からの膣標本について検討し、かつＢＶに関与する各微生物について調べて、特定の細菌のＤＮＡの検出を可能にし、かつ参照用プラスミドの構築により確立されたプラスミド範囲によって細菌負荷の測定を可能にするリアルタイムＰＣＲ法を開発した。上記プラスミドは、増幅および定量すべき前記細菌の特異的ＤＮＡフラグメント、ならびに生体標本の豊富度だけでなくＤＮＡ標本および分子増幅の品質をも制御するために使用されるヒトアルブミン遺伝子の特異的ＤＮＡフラグメントを有している。調べた標的微生物（ラクトバチルス属細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、Ｇ．バギナリス、モビルンカス・クルティシイ（Ｍｏｂｉｌｉｎｃｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｉｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ウレアプラスマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ａ．バギナエ、およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））は、ＢＶまたは早産のうち少なくともいずれか一方に関与している可能性があると報告されたものとした。分子生物学によって得られた様々な微生物の定量結果を、Ｎｕｇｅｎｔスコアによる分類と比較した。
【００１５】
本発明によれば、ある閾値濃度を起点とするＡ．バギナエの存在が、非常に特異的かつ顕著にＢＶに関連している可能性があること、およびこの分子レベルの検出により診断が簡単かつ信頼性の高いものとなることが実証された。
【００１６】
細菌Ｇ．バギナリスについての特異的ＢＶ閾値濃度の存在も、本発明によって実証された。
さらに、ある濃度の上記２種類の細菌の組み合わせによって、９５％を越える陽性予測率、およびとりわけ９９％を越える陰性予測率をもってＢＶを診断することができることも実証された。
【００１７】
さらに、ＢＶの際には、膣内に通常存在するラクトバチルス属細菌の濃度が減少し、また本発明によって、ある閾値濃度を過ぎるとこれらのラクトバチルス属細菌の定量により信頼性をもってＢＶを診断することが可能となることが実証された。最終的に、Ｇ．バギナリス＋Ａ．バギナエの濃度に対するラクトバチルス属細菌濃度の比の変化により、信頼性をもってＢＶの経過を評価できることが実証された。
【００１８】
より具体的には、本発明は、細菌性膣炎の存在に関して膣内細菌叢の状態をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断および追跡調査するための、ならびに適用可能な場合には細菌性膣炎の治療をモニタリングするための方法を提供し、該方法は：
【００１９】
１）細菌アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）およびガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の濃度を；
・患者由来の膣帯下標本から抽出されたＤＮＡ中の、前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスのＤＮＡ中に単一コピーとして存在する前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの特異配列の濃度と、ヒト細胞を含むすべての生体標本中に存在するヒト遺伝子の特異配列の濃度とを測定することと、前記特異配列は大きさが１５０ヌクレオチド未満であることと；
【００２０】
・一方では標本から抽出された前記ＤＮＡ中に含まれる前記特異配列、他方では前記細菌の各々の前記特異配列およびすべてのヒト細胞生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列を含む合成ＤＮＡフラグメントの試料中に含まれる前記特異配列を、ＰＣＲにより酵素的に同時増幅することと、前記試料はＤＮＡを定量するための検量標準品としての役割を果たすことと；
【００２１】
・前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの前記特異配列ならびにすべてのヒト細胞生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列各々のための増幅プライマーの配列とは異なる配列を備えた標識プローブを助力として、前記増幅フラグメントの検出および定量を実行することと；
【００２２】
によって定量するステップ、ならびに
２）ヒト細胞を少なくとも１０４個／ｍＬ含んでいる患者の膣帯下標本中の細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの２つの前記特異配列のＤＮＡフラグメントの濃度が、次の２つの状態ａ）およびｂ）すなわち：
【００２３】
ａ）アトポビウム・バギナエの前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍＬ以上であること；および
ｂ）ガードネレラ・バギナリスの前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍＬ以上であること；
【００２４】
のうち少なくとも一方に合致する場合は、細菌性膣炎の存在、または進行中の治療の失敗を判定するステップ；
を特徴とする。
細菌アトポビウム・バギナエの濃度が閾値１０８以上であると、膣炎の約９０％を検出することが可能となる。細菌１０９個／ｍＬ以上のＧ．バギナリスの検出閾値は単独では膣炎症例のおよそ半分しか検出することができないと思われるので、アトポビウム・バギナエの濃度が細菌１０８個／ｍＬの閾値未満である場合に、膣炎を検出するために、細菌ガードネレラ・バギナリスの定量を追加として使用することが可能である。このため、本発明によれば、両方の細菌についてのＤＮＡ濃度の定量が必要である。
【００２５】
さらに、患者の膣帯下標本から抽出されたＤＮＡ中の、細菌Ａ．バギナエ（Ｃａ）、Ｇ．バギナリス（Ｃｇ）およびラクトバチルス属細菌（Ｃｌ）のＤＮＡ中に単一コピーとして存在する特異配列の少なくとも３つのフラグメントの濃度Ｃａ、ＣｇおよびＣｌについて、濃度比Ｃｌ／（Ｃａ＋Ｃｇ）が、十分な時間間隔で、好ましくは少なくとも１か月間隔で順次採取された２つの標本間で低下する場合、細菌性膣炎の発症が確認されるということに留意すべきである。
【００２６】
「膣炎の発症」とは、本明細書では、既に検出済みの膣炎の悪化、または、ある場合には、膣炎が出現するリスク、すなわち病的状態に至ることもあり得る膣内細菌叢の平衡失調もしくは異常であると理解される。
【００２７】
同様に、濃度比Ｃｌ／（Ｃａ＋Ｃｇ）が、十分な時間間隔で、好ましくは少なくとも１か月間隔で順次採取された２つの標本間で低下するかまたは増大しない場合は、細菌のＤＮＡ中に単一コピーとして存在する特異配列の濃度の関数として、進行中の治療の失敗が確認される。
【００２８】
より具体的には；
ａ）ステップ１）においてさらに、少なくともラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｅｉｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）およびラクトバチルス・イネルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ）を含むラクトバチルス属細菌を；
【００２９】
・前記ラクトバチルス属細菌の特異配列の濃度をさらに測定することと、前記ラクトバチルス属細菌の特異配列は前記ラクトバチルス属細菌のＤＮＡ中に単一コピーとして存在し、大きさは１５０ヌクレオチド未満であることと；
【００３０】
・一方では標本から抽出された前記ＤＮＡ中に含まれるラクトバチルス属細菌の特異配列、他方では前記ラクトバチルス属細菌の前記特異配列を追加として含む合成ＤＮＡフラグメントの試料中に含まれるラクトバチルス属細菌の特異配列を、ＰＣＲにより酵素的にさらに同時増幅することと、前記ラクトバチルス属細菌の前記特異配列を含む前記合成ＤＮＡフラグメントは定量用標準品としての役割を果たすことと；
【００３１】
・前記アトポビウム・バギナエ、ガードネレラ・バギナリスおよびラクトバチルス属細菌の前記特異配列、ならびにヒト細胞を含むすべての生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列各々のための増幅プライマーの配列とは異なる配列を備えた標識プローブを助力として、前記増幅フラグメントの検出および定量を実行することと；
【００３２】
によって定量すること、ならびに
ｂ）ステップ２）において、前記ラクトバチルス属細菌の特異的ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｌがさらに１０８コピー／ｍＬ以下、好ましくは１０７コピー／ｍＬ以下である場合に、細菌性膣炎が判定されること；
【００３３】
を特徴とする方法が創出される。
本発明によれば、ラクトバチルス属細菌の濃度は細菌性膣炎の存在を結論付けるには不十分であるが、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスの濃度を組み合わせた場合には補完または確証となる。
【００３４】
好ましくは、前記濃度が次の３つの条件：
ａ− アトポビウム・バギナエの特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍＬ以上であること；
【００３５】
ｂ− ガードネレラ・バギナリスの特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍＬ以上であること、および
ｃ− ラクトバチルス属細菌の特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｌが１０７コピー／ｍＬ以下であること；
【００３６】
を満たす場合に細菌性膣炎と判定される。
好都合には、細菌アトポビウム・バギナエ、ガードネレラ・バギナリス、および適用可能であればラクトバチルス属細菌の特異配列の前記ＤＮＡフラグメントと、同様に好ましくは細胞を含むあらゆるヒト生体標本中に存在するヒトＤＮＡフラグメントのＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより酵素的に増幅および定量することにより、前記濃度Ｃａ、ＣｇまたはＣｌを測定する。
【００３７】
好ましくは、前記細菌アトポビウム・バギナエ、ガードネレラ・バギナリス、および適用可能であればラクトバチルス属細菌の、前記特異配列は、大きさが７０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは９０〜１２０ヌクレオチドである。
【００３８】
さらに好ましくは、リアルタイムＰＣＲによる増幅反応および定量化反応は、被験標本中の、前記細菌の前記特異配列およびヒト細胞を含むあらゆる生体標本中に存在するヒト遺伝子の特異配列の各々に特異的な加水分解プローブを使用して実施される。
【００３９】
リアルタイムＰＣＲ技法は、順方向配列および逆方向配列のプライマーを用いる古典的ＰＣＲで構成され、いわゆる「加水分解」プローブを用いた、増幅遺伝子の量に比例する蛍光発光の計測に基づいた増幅産物の検出を含んでいる。この目的のために、前記プローブを、５’は蛍光発光体またはフルオロフォアで、３’は蛍光発光を妨害する物質で標識する。この妨害物質は、フルオロフォアと妨害物質とが互いに接近している時は放射された蛍光を吸収する。フルオロフォアと妨害物質とが離れると、蛍光発光は妨害物質に吸収されなくなる。Ｔａｑポリメラーゼは通過する際にプローブの加水分解を引き起こし、その結果溶液中にヌクレオチドおよびフルオロフォアの放出を引き起こす。このように蛍光発光は増幅数に比例することになる。リアルタイムＰＣＲの原理は、伸長ステップの際に複製されるＤＮＡ上にハイブリダイズしたプローブを加水分解するＴａｑポリメラーゼの能力に基づき、この加水分解により蛍光発光が可能となり、蛍光発光により定量が可能となる。第１の標的に対する２つのプライマーおよび１つのプローブ、ならびに他の標的に対する別の２つのプライマーおよびプローブを反応混合物中に導入することにより、同一の反応の間に２つの異なる標的を定量することもできる。前記２つのプローブは異なるフルオロフォアで標識する。
【００４０】
さらに好ましくは、ＤＮＡ定量の参照標準品としての役割を果たす大きな合成ＤＮＡフラグメントを使用し、前記大きな合成ＤＮＡフラグメントは、濃度定量の対象である前記細菌各々の前記特異配列と、ヒト細胞の前記ヒトＤＮＡ特異配列とを寄せ集めたものである。所定の核酸フラグメント上にいくつかの分子標的が存在することにより、所定の標本中の異なる標的を定量することが可能となり、かつ均一に同時定量することが可能となる；数種類の分子について同じ参照範囲を使用する定量により、様々なＰＣＲ反応の有効性を相互に比較し、経時的に相互に識別して、陽性対照に関連するバイアスを回避することができる。
【００４１】
「前記細菌の特異配列」とは、前記細菌のゲノムの配列であって他の生物のゲノム中には見られない配列とする。
「ＤＮＡフラグメント」とは、その配列を５’→３’方向で以下に記載するＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドであるものとする。
【００４２】
より具体的には、前記細菌の前記特異配列としては：
− アトポビウム・バギナエ細菌については：１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＹ７３８６５８．１）の２４８〜３３４位のフラグメント；
【００４３】
− ガードネレラ・バギナリス細菌については、シャペロンタンパク質６０ｋＤａのＣｐｎ６０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＦ２４０５７９．３）の９８１〜１０７２位のフラグメント、ならびに
【００４４】
− ラクトバチルス属細菌については、伸長因子をコードするｔｕｆ遺伝子中の、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・イネルス、およびラクトバチルス・アシドフィルスに共通の配列であってＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＹ５６２１９１．１の遺伝子の２５３〜３４３位の配列
【００４５】
が挙げられる。
さらに具体的には、前記細菌の前記特異配列は、プローブ配列（下線）とその前後のプライマー配列（太字）を含む以下の配列：
【００４６】
− アトポビウム・バギナエについては：
【００４７】
【化１】
− ガードネレラ・バギナリスについては：
【００４８】
【化２】
− ラクトバチルス属細菌については
【００４９】
【化３】
または該配列のアンチセンスプライマー用の逆方向かつ相補的な配列である。
好都合には、前記標本中、特に被験膣標本から得られたＤＮＡ中に存在するヒト細胞が、サンプリングの豊富度、ＤＮＡ抽出の質、およびＰＣＲ反応阻害剤が存在する可能性に関する対照として定量される。この目的のために、細胞を含むあらゆるヒト生体標本中に存在するヒト遺伝子のコピー数、具体的にはヒトアルブミン遺伝子のコピー数を定量する。このようにヒトアルブミン遺伝子の定量は、標本の品質および豊富度を証明するための内部対照としての役割を果たす。さらに、患者の追跡調査の際には、この定量は異なる時期に得られた２つの標本の間の正規化の手段である。その理由は、ヒト細胞１００万個あたりの微生物の数を計算することにより正確な標本間の比較を行うことができるからである。アルブミン遺伝子はヒト細胞中に２コピーだけ存在し、この配列のシグナルを計測することにより標本中の当初のヒト細胞数が定量される。試料５μｌ当たりの細胞数が５０個（細胞１０４個／ｍＬ）以下、またはアルブミンＤＮＡの量が１０２／５μＬ以下の場合は、その標本は量的に不十分であるため却下する。
【００５０】
標本の品質、輸送および保存状態が様々であるため、このように本発明には、信頼性の高い定量を伴って診断を体系化することを可能にする分子レベルの品質管理が含まれる。
細胞の定量はさらに、検出すべきＰＣＲ反応制限因子を無くすことを可能にする：標本を様々な希釈率でＰＣＲにより試験する時、検出されるアルブミンの量は、制限因子の存在下で希釈率を上げると増大するが、ＰＣＲ反応の制限因子の不存下で希釈率を上げると減少する。
【００５１】
より具体的には、前記試料中に含まれるヒトＤＮＡの定量が実施され、かつ前記大きなＤＮＡフラグメントは特異的アルブミン配列のような被験標本中のヒトＤＮＡ特異配列をさらに含む。
【００５２】
さらに具体的には、試験標本中の前記ヒトＤＮＡ特異配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ１２５２３．１のヒトアルブミン遺伝子のエキソン１２の１６２８３‐１６４２３位のフラグメントであって、次の配列または相補配列：
【００５３】
【化４】
好ましくは、配列番号１７のような、プライマーに対応する配列（太字の配列）およびプローブ配列（下線を付した配列）以外の場所に切断部位、特にＸｈｏＩ部位（削除された括弧内の配列）を挿入することによって修飾された配列番号１のフラグメントを含む。
【００５４】
ここでも好都合には、増幅反応および定量反応は、前記被験細菌、および適用可能な場合には特異的ヒトアルブミン配列のような試験標本中のヒトＤＮＡの特異配列、のそれぞれに特異的な加水分解プライマーおよびプローブのセットを使用することにより行われ、前記特異配列は、ＰＣＲによる前記特異配列の増幅反応におけるプライマーとしての役割を果たすことができる配列に囲まれたプローブ配列を含む。
【００５５】
「プローブ」とは、本明細書において、オリゴヌクレオチドであって、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長であり、前記特異配列と特異的にハイブリダイズし、従ってＰＣＲ反応に関連した蛍光の増大を計測することにより特異的に検出および定量することが可能なものであると解される。
【００５６】
該プローブによって、シグナル強度を定量標準品のシグナル強度と比較することにより、増幅された特異的ＤＮＡを検出および定量することができる。
「プライマー」とは、本明細書において、好ましくは１５〜２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってＤＮＡポリメラーゼがＰＣＲ反応において増幅する配列の両端のうちの一方と特異的にハイブリダイズするものであると解される。
【００５７】
より具体的には、プライマーとプローブとのセットは、適用可能な場合には本願に添付された配列表の以下の配列すなわち：
− アトポビウム・バギナエ用として：
プライマー５’：配列番号５＝５’‐ＣＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＣＣＴＧＡＴＡＣＣ‐３’
【００５８】
プライマー３’：配列番号６＝５’‐ＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＣＡＴＴＴＣＡ‐３’
プローブ：配列番号７＝５’‐ＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＡ‐３’
【００５９】
− ガードネレラ・バギナリス用として：
プライマー５’：配列番号８＝５’‐ＣＧＣＡＴＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＧ‐３’
【００６０】
プライマー３’：配列番号９＝５’‐ＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＣＴ‐３’
プローブ：配列番号１０＝５’‐ＴＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣ‐３’
【００６１】
− ラクトバチルス属細菌用として：
プライマー５’：配列番号１１＝５’‐ＴＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＧ‐３’
【００６２】
プライマー３’：配列番号１２＝５’‐ＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡ‐３’
プローブ：配列番号１３＝５’‐ＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＣＡ‐３’
【００６３】
− ヒトアルブミン用として：
プライマー５’：配列番号１４＝５’‐ＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧＣＴＧＴ‐３’
【００６４】
プライマー３’：配列番号１５＝３’‐ＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣ‐３’
プローブ：配列番号１６＝５’‐ＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＣＣ‐３’
【００６５】
またはこれらの相補配列から選択されて使用される。
好ましくは、定量化のための参照標準試料のＤＮＡを構成する前記大きな合成ＤＮＡフラグメントはプラスミドに挿入される。
【００６６】
これらのＤＮＡ定量法において、陽性反応が、定量用標準品または陽性対照として使用される組換えプラスミドの混入によるものかどうかを知ることは重要である。この問題を解決するために、該合成分子標的のうち少なくとも１つに制限酵素切断部位を導入すると好都合である。この部位は天然の配列には存在しない。従って、増幅されたフラグメントを酵素的に切断してアガロースゲルで分析することによって、または制限酵素切断部位を特異的に認識するリアルタイムＰＣＲプローブを使用することによって、任意の混入プラスミドの存在を検出することができる。
【００６７】
したがって、より具体的には、下記ステップを実行することが可能であり、該ステップは：
１）前記試験標本から抽出されたＤＮＡ中および標準参照試料のＤＮＡ中の、少なくとも１つの前記物質の少なくとも１つの前記特異配列のＤＮＡの、ＰＣＲによる酵素的増幅反応を行うステップであって、少なくとも前記本来の特異配列および前記修飾特異配列の両方を増幅することができる少なくとも１セットのプライマーを助力とするステップ；
【００６８】
２）前記試験標本から抽出されたＤＮＡ増幅物が前記特異配列を含むかどうかを検証するステップ、ならびに
３）標準参照試料由来のＤＮＡによる前記試験標本への混入から生じるあらゆる偽陽性を、下記ステップのうち少なくとも１つによって検出するステップである：
【００６９】
３ａ）得られたＰＣＲ産物を切断部位に対応する酵素で酵素消化し、該消化産物をアガロースゲル上で制限酵素によって消化されていないＰＣＲ産物と比較することにより分析するステップ。
【００７０】
消化されるフラグメントが対照プラスミドに挿入された分子標的の増幅に由来する場合は、該フラグメントは制限酵素切断部位を含み、未消化のフラグメントより小さくなる。
３ｂ）分子標的のうちの１つについての順方向および逆方向プライマーと、制限酵素切断部位を含む前記外因性の配列の特異的プローブとを用いてリアルタイムＰＣＲによる反応を実施するステップ。
【００７１】
対照プラスミドに由来し、かつ外因性の配列を含む１種類のフラグメントのみを増幅することができる。
より具体的には、試験標本中の前記ヒトＤＮＡ特異配列を使用し、該特異配列は、ヒトアルブミン遺伝子ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ１２５２３．１のエキソン１２の１６２８３‐１６４２３位のフラグメントを、プライマー（太字の配列）およびプローブ配列（下線を付した配列）に対応する配列以外の場所に切断部位（特にＸｈｏＩ部位）を挿入することによって修飾した、以下の配列：
【００７２】
【化５】
（プライマー（太字の配列）およびプローブ配列（下線を付した配列）に対応する配列以外の場所にＸｈｏＩ部位（括弧内）を含んでいる）を含む。
より好都合には、ＰＣＲによる複数の酵素的増幅反応を、前記細菌の前記特異配列それぞれを同一の大きな標準合成ＤＮＡフラグメントとともに用いて同時にまたは別々に、前記細菌各々の様々な前記特異配列各々の特異的プライマーの複数の異なるセットを助力として実施することによって、様々なプライマーの配列が前記様々な細菌の間で互いに交わることはなく、また同じプロトコール（特に同じハイブリダイゼーション温度）で行なわれる酵素的増幅反応において前記プライマーを使用することができる。
【００７３】
いくつかのフラグメント、特に異なる起源のフラグメントを組み合わせた大きなキメラＤＮＡフラグメントを構築するための様々な方法が知られており、特に仏国特許出願第２８８２０６３号明細書に記載されている方法では、第１の大きな二本鎖構造の合成ＤＮＡフラグメントが、耐熱ポリメラーゼ酵素を使用した酵素的増幅による複数のｎ個のオリゴヌクレオチドの二量体化で本質的に構成される、複数のｎ個の小さな連続的な第２の合成ＤＮＡフラグメントが特定の順序をなした鎖を含んでなる所定の配列として調製され、前記酵素的増幅は：
【００７４】
− 外生のプライマーを用いない、所定の配列を備えた一連のｎ個のオリゴヌクレオチドの前記ポリメラーゼ酵素存在下でのＰＣＲによる核酸増幅反応で構成される第１ステップであって、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションとその後の得られた複合体の伸長を可能にする温度条件下の一連のサイクルを含み、前記複合体は前記オリゴヌクレオチドの末端と末端とが所与の順序に配置されるように設計され、前記オリゴヌクレオチドの配列は、様々な前記第２の合成フラグメントの配列のセンス配列およびアンチセンス配列に連続的または交互に対応しており、前記オリゴヌクレオチドはそれぞれ、適用可能な場合には該オリゴヌクレオチドの５’領域および３’領域に、後続および先行するオリゴヌクレオチドの５’領域および３’領域と相補的な配列を含むことを特徴とするステップと；
【００７５】
− 調製すべき第１の大きな合成フラグメントの前記順方向の鎖の５’末端および３’末端に特異的なプライマーの助力を用いる第２の増幅ステップであって、前記第１の大きなフラグメントの同一コピーの生産を可能にするステップと
【００７６】
を含む。
従って、この技法は、プライマーの相互ハイブリダイゼーション（プライマーの二量体化）で構成されるＰＣＲアーチファクトを利用しかつ使いこなすことに基づく。この現象は、ＰＣＲ条件（特に温度）が不適当で、プライマーが部分的に相補的な配列を含む場合に観察される。
【００７７】
このように該構築技法は、標的配列から、順方向のオリゴヌクレオチド配列（「センス」）と逆方向（または「アンチセンス」）のオリゴヌクレオチド配列とが交互になっているオリゴヌクレオチド配列を選択することから成る。これらのオリゴヌクレオチドの末端と末端との配置を可能にするために、あるオリゴヌクレオチド配列の３’に、次のオリゴヌクレオチドの最初のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を導入するように注意する。これらのオリゴヌクレオチドはその相補的な部分によってハイブリダイズすることになり、例えばＴａｑポリメラーゼのポリメラーゼ活性により５’から３’への合成が行われて二本鎖のフラグメントが得られる。最終的な（組み立てられた）フラグメントは、所望の第１の大きな合成二本鎖ＤＮＡフラグメントの末端の配列に対応する順方向プライマーおよび逆方向プライマーの対を使用して、ＰＣＲによって合成される。
【００７８】
上述のように、前記大きな合成ＤＮＡフラグメントをプラスミドに好都合なように挿入すると好都合である。
この一般的な合成ヌクレオチドフラグメント構築技法により、対象とするいくつかの分子標的を連続的に配置することが可能となる。これは簡単、迅速、かつ信頼できる方法であり、煩雑かつ高価な設備を必要としない。
【００７９】
本発明はさらに、本発明に従って膣炎の診断方法および追跡調査方法を実行するために使用される診断キットに関し、該キットは：
− 既知濃度の標準参照ＤＮＡ試料であって、上記に定義された前記細菌それぞれの前記特異配列を、好ましくは１つの上記に定義された前記ヒトＤＮＡ特異配列を、より好ましくは上記に定義された前記細菌それぞれの前記特異配列と好ましくは１つの上記に定義されたヒトＤＮＡ特異配列とを含む１つの前記大きな合成ＤＮＡフラグメントを、含む試料、同様に
【００８０】
− 前記細菌に特異的な前記修飾合成ＤＮＡフラグメントに特異的なプライマーのセット、およびより好ましくは上記に定義されるようなプローブ、ならびに
− ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を実行するための試薬
を含むことを特徴とする。
本発明のその他の特徴は、配列表および図１〜４を引用した以下の様々な実施形態の詳細な説明から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義され、本発明のリアルタイムＰＣＲによって定量された、２０例の細菌性膣炎の微生物負荷の分析を示す図。
【図１Ｂ】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義され、本発明のリアルタイムＰＣＲによって定量された、１６７例の正常細菌叢の微生物負荷の分析を示す図。
【図２】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義され、本発明のリアルタイムＰＣＲによって定量された、４４例の中間的細菌叢の微生物負荷の分析を示す図。
【図３】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義された４４例の中間的細菌叢の群から、本発明に従って分子レベルの基準により同定され、定量がなされた２５例の細菌性膣炎について示す図。
【図４】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって同定された４４例の中間的細菌叢の群に細菌性膣炎の分子レベルの基準が適用された後で、本発明に従って分子レベルの基準により同定され、定量がなされた１９例の正常細菌叢について示す図。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
Ｉ．患者、材料および方法
Ｉ．１ 膣標本の入手および輸送
妊娠が判明した妊婦をマルセイユのラ・コンセプション（Ｌａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ）病院で募集した。インフォームド・コンセントを参加の前提条件とした。標本を、消毒薬を用いずに無潤滑の滅菌膣鏡を用いて後膣円蓋から採取した。各々の女性から４つの試料を採取した：乾燥したチューブ内に入った綿棒（イタリア国ブレーシア所在のコパン・イノベーション（Ｃｏｐａｎ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）（登録商標））による２つの試料、および細胞採取用ブラシ（Ｓｃｒｉｎｅｔ（登録商標）５．５ｍｍ、フランス国パリ所在のシーシーディーインターナショナル（Ｃ．Ｃ．Ｄ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））による２つの試料である。一般的な綿棒のうち一方はすぐに細菌の培養に使用した。他方の綿棒は、生殖器マイコプラズマ（Ｍ．ホミニス（Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓ）およびＭ．ウレアリチカム（Ｍ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ））について調べるために、特別な輸送培地（Ｒ１尿素‐アルギニンＬＹＯ２、フランス国マーシーレトワール所在のビオメリュー社（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ））の中に入れた。細胞採取用ブラシのうち一方はスライド上に塗抹してグラム染色するために使用した。分子増幅による定量用のＤＮＡを抽出するための他方の細胞採取用ブラシは、５００μＬのＭＥＭ輸送培地（最少必須培地、米国カリフォルニア州カールスバード所在のインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に入れて運んだ。これは実験室に到着した時から使用時まで−８０℃で冷凍した。
【００８３】
Ｉ．２ 細菌学的分析
Ｉ．２．１ 採取直後の状態
光学顕微鏡下（１０×対物レンズ）にてスライドとカバーグラスとの間で採取後すぐに検査することにより、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）について調べた。
【００８４】
Ｉ．２ Ｎｕｇｅｎｔスコア：
Ｉ．２．２．１ グラム染色：
スライドグラスに標本を塗抹して乾燥させた後、グラム染色は：シュウ酸クリスタルバイオレットで染色（１分）、ルゴール液で染色（１分）、アルコール／アセトンを用いた脱色およびサフラニン溶液（ビオメリュー）を用いた呈色、という構成とした。各ステップの後で、水中ですすぎを行った。グラム染色により、３種の細菌形態型の半定量的評価からＮｕｇｅｎｔスコアを定めることが可能となる（表１）。このスコアに従って、３種類の膣内細菌叢、すなわち：スコアが０〜３の正常細菌叢（ＮＦ）、スコアが４〜６の中間的細菌叢（ＩＦ）、およびスコアが７以上のＢＶ、が同定される。
【００８５】
Ｉ．２．２．２ 培養
膣標本を、３種類の培地、すなわち：コロンビアＡＮＣ寒天＋５％ヒツジ血液（ビオメリュー）、チョコレートポリバイテックス（Ｃｈｏｃｏｌａｔｅ Ｐｏｌｙ Ｖｉｔｅｘ）ＰＶＸ寒天（ビオメリュー）、ＣＨＯＣ ＶＣＡＴ寒天（ビオメリュー）に播種して３７℃で４８時間インキュベートした。マイコプラズマを検出するために、標本を特異的キット（尿素‐アルギニンＬＹＯ２、ビオメリュー）に播種して３７℃でインキュベートし、嫌気培養培地（ビオメリュー）に接種して４８時間培養した。
【００８６】
Ｉ．３． リアルタイムＰＣＲによる検出および定量
Ｉ．３．１ ＤＮＡの抽出
ＤＮＡの抽出は、ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（フランス国クルタブフ所在のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（登録商標））を用いて実施した。プロトコールは以下のように変更した。すなわち：２００μＬの溶解バッファーおよび２０μＬのプロテイナーゼＫあたり２００μＬの試料を５６℃で１２時間インキュベートした。溶解物を製造業者の推奨に従って処理した。ＤＮＡを１００μＬの溶出バッファー中に溶出させた後、−２０℃で保存した。
【００８７】
Ｉ．３．２ リアルタイムＰＣＲの開発
Ｉ．３．２．１ 分子標的の選択
ＧｅｎＢａｎｋのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＧｅｎＢａｎｋＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）に供託された文献および配列データの分析から、標的微生物それぞれについて利用可能な配列に関する情報が得られた。選択された微生物それぞれの標的配列のプローブおよびフラグメントの特異性を、ＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で特異性に関してテストした。
【００８８】
本発明者らは、その役割が不確かな病原体を含むすべての潜在的な膣炎病原体から標的を選択した。驚くべきことに、最も重要な標的のアトポビウム・バギナエは決定的な病原体であるとは考えられていなかった。
【００８９】
選択された標的は、Ｇ．バギナリスおよびＭ．クルティシイについては６０ＫＤａシャペロンタンパク質（Ｃｐｎ６０）をコードする遺伝子配列上に、Ｍ．ムリエリスおよびＡ．バギナエについては１６Ｓ ＲＮＡ、Ｍ．ホミニスについてはｆｔｓ Ｙ配列、Ｕ．ウレアリチクムについてはウレアーゼ配列、ならびにＣ．アルビカンスについてはトポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子の遺伝子配列上に位置づけられた。ラクトバチルス属細菌の標的については、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・イネルス、およびラクトバチルス・アシドフィルスに共通の配列が選択され；該配列は伸長因子ｔｕ（ｔｕｆ）をコードする遺伝子上に位置している。試験標本中のＤＮＡの存在および量を証明するために、ヒトアルブミン遺伝子のエキソン１２の中の配列を選択した。
【００９０】
Ｉ．３．２．２ プローブおよびプライマーの選択
調べた微生物（ラクトバチルス属細菌、Ｇ．バギナリス、Ｍ．クルティシイ、Ｍ．ムリエリス、Ｕ．ウレアリチクム、Ｍ．ホミニス、Ａ．バギナエ、Ｃ．アルビカンス）およびヒトアルブミンそれぞれについて、Ｐｒｉｍｅｒ３（登録商標）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｃｏｄｅ．ｈｔｍｌ）を使用して上記に定義した標的配列からプローブおよびセンス＋アンチセンスプライマー対を選択した。プライマーおよびプローブは、以下の付録１に記載されている。プライマーおよびプローブそれぞれについて、特異性を保証するためにＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで分析した（付録１）。
【００９１】
リアルタイムの二重認識ＰＣＲ（二重ＰＣＲ）を実施するために、認識する微生物の対を適宜選択した：プローブのうち一方をＦＡＭで、他方をＶＩＣで標識した。こうして４つのＰＣＲ対を規定した。
【００９２】
― ラクトバチルス属細菌（ＦＡＭ）およびＧ．バギナリス（ＶＩＣ）
― Ｍ．クルティシイ（ＦＡＭ）およびＭ．ムリエリス（ＶＩＣ）
― Ｕ．ウレアリチクム（ＶＩＣ）およびヒトアルブミン（ＦＡＭ）
― Ａ．バギナエ（ＶＩＣ）およびＣ．アルビカンス（ＦＡＭ）
― マイコプラズマ・ホミニス（ＦＡＭ）は単独で定量することとした。
プライマーはユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）（登録商標）（ベルギー国スラン所在）、およびプローブはアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（英国チェシア州ウォリントン所在）によって合成された。
【００９３】
Ｉ．３．２．３ 様々な被験菌株についての特異性試験
プライマーおよびプローブの特異性を試験するために、参照用細菌株（Ｌ．アシドフィルス ＣＩＰ１０４４６４、Ａ．バギナエ ＣＩＰ１０６４３１、Ｇ．バギナリス ＣＩＰ１０３６６０、Ｍ．クルティシイ亜種ホルメシイ ＡＴＣＣ３５２４２、Ｍ．ムリエリス ＡＴＣＣ３５２３９、Ｃ．アルビカンス ＵＭＩＰ１１８０．７９、Ｕ．ウレアリチクム ＣＩＰ１０３７５５およびＭ．ホミニス ＣＩＰ１０３７１５）から抽出したＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲの開発（プライマーおよびプローブの相対量、特異性、交差反応の測定）のために３種の希釈率（１：１０、１：１００および１：１０００）で使用した。それぞれの菌株を、プライマーおよび特異的プローブを用いて試験したが、他の７種の微生物のプローブおよびプライマー、ならびにヒトアルブミンのプローブおよびプライマーも用いて試験した。
【００９４】
Ｉ．３．２．４ 二重ＰＣＲの開発
ＣＴ値（サイクル閾値）を計測した。ＣＴは、反応のベースラインと、増幅を表わす対数曲線とが交差する点である。このＣＴ値は増幅が始まるのに必要な増幅サイクルの数に相当する。ＣＴ値は定量すべき核産物の濃度と関係し：濃度が高いほど、ＣＴは低い。
【００９５】
単一および二重の蛍光を用いて最適な増幅を得るために必要なプライマーおよびプローブの量を、等モル条件下の８つの参照用菌株由来の細菌ＤＮＡ混合物について、また純粋な菌株を用いて、いずれの場合においても終濃度１：１０について増幅反応を試験することにより規定する。使用する実験条件は、ＣＴ値が単一の蛍光を用いて得られるＣＴ値と同一である条件とした。
【００９６】
Ｉ．３．２．５ 未試験の４０株に対する特異性試験：
８つの参照用菌株以外の４０種の異なる細菌株（付録）に由来するゲノムＤＮＡ試料を１：１０希釈で試験した。これらすべての試験について、各増幅反応とともに、ＤＮＡを含まない陰性対照または陽性対照（８つの参照用菌株由来のＤＮＡの混合）を注意深く導入した。特異性を、４つのリアルタイムＰＣＲ対ならびにマイコプラズマ・ホミニスを用いて試験した。
【００９７】
Ｉ．４． プラスミドの構築
仏国特許出願第２ ８８２ ０６３号明細書に記載の方法を使用した。
Ｉ．４．１ 定量用ハイブリッド・フラグメント配列：
定量用ハイブリッド・フラグメントのヌクレオチド配列を、８種の微生物およびヒトアルブミンのリアルタイムＰＣＲの標的配列を並べることにより得た。本発明者らは、以下の付録２に記載の、９３１塩基対のハイブリッド・フラグメントを得た。
【００９８】
Ｉ．４．２ 定量用ハイブリッド・フラグメントの構築におけるオリゴヌクレオチド配列
上記ハイブリッド・ヌクレオチドフラグメントの配列を、付録３に記載の６つの連続するオリゴヌクレオチドフラグメントに分割した。隣接するオリゴヌクレオチドの連続性を保証するために、上流のオリゴヌクレオチドの３’末端の追加の１０ヌクレオチドを、下流のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加した。６つのオリゴヌクレオチド配列の長さは１５５〜１７２ヌクレオチドの範囲であった。これらの連続するオリゴヌクレオチドは、順方向および逆方向が交互になっている配列とした。したがって、オリゴヌクレオチド１、３および５は順方向配列の形で使用し、オリゴヌクレオチド２、４および６は逆方向配列の形で使用した。配列が定量用ハイブリッド・フラグメントの５’および３’の２０ヌクレオチドの配列に相当するいわゆる「構築用」プライマー（センスおよびアンチセンス）を合成することとした。オリゴヌクレオチドおよびプライマーはユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）（登録商標）により合成された。
【００９９】
Ｉ．４．３ ハイブリッド・フラグメントの構築：
２つの隣接したオリゴヌクレオチドの末端が相補的であるため、増幅反応によって二本鎖ヌクレオチドフラグメントが構築された。段階的な２回のＰＣＲが必要であった。
【０１００】
Ｉ．４．３．１ １回目のＰＣＲ：
ここでは、オリゴヌクレオチドの末端のハイブリダイゼーションと、Ｔａｑポリメラーゼの活性に適合しうる場合には部分的な伸長とが可能であった。６種のオリゴヌクレオチドを等モル条件（０．２ｍＭｏｌ）で、１×ポリメラーゼバッファーＭｇＣｌ２（１．５ｍＭｏｌ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭｏｌ）、０．２μＬのＲｏｃｈｅ Ｔａｑ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）（登録商標））（５ＩＵ／μＬ）とともに、５０μＬの反応体積中に導入した。増幅プログラムは：９５℃で２分と、続いて９４℃で３０秒（変性）、３７℃で１分（ハイブリダイゼーション）、７２℃で１分３０秒（伸長）のサイクルを４０サイクルとした。
【０１０１】
Ｉ．４．３．２ ２回目のＰＣＲ：
ここでは、期待される末端間が結合したオリゴヌクレオチド群を含むＰＣＲフラグメントが得られる（付録４）。１回目のＰＣＲから得られた増幅産物１μＬを、次の反応混合物すなわち：１×Ｈｏｔｓｔａｒポリメラーゼバッファー（キアゲン（登録商標））ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭｏｌ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭｏｌ）、５ＩＵ／μＬのＨｏｔｓｔａｒ（キアゲン（登録商標））を０．２μＬ、および０．２ｍＭｏｌの構築用のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー：に添加した。ＰＣＲプログラムは：９５℃で１５分と、続いて９５℃で３０秒、５８℃で４５秒、７２℃で２分のサイクルを４０サイクルと、７２℃で５分とした。得られたＰＣＲフラグメントを、０．５×ＴＢＥバッファー中の１．５％ＴＢＥアガロースゲルで分析した。フラグメントの長さが期待の長さである場合に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット２５０ＰＣＲ Ｑｉａｋｉｔ（キアゲン（登録商標））を使用して該フラグメントを精製した。
【０１０２】
Ｉ．４．３．３ 挿入物のクローニング
先述のようにして得られたフラグメント２μＬを、５μＬのリガーゼバッファー、１μＬのリガーゼ、および１μＬの直線化した脱リン酸化プラスミドＰＧＥＭ（ｐＧＥＭ（登録商標）‐Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ２キット、米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（登録商標））を含むライゲーション反応混合物に導入した。最終体積は１０μＬであった。ライゲーション反応産物を１５℃で一晩インキュベートした。７μＬのライゲーション反応産物を、２０分間氷中に置いたコンピテントセル（大腸菌ＪＭ１０９）５０μＬと混合し、４２℃で１分間インキュベートした。９５０μＬのＬＢブロス（ＵＳＢ（登録商標）、米国オハイオ州クリーヴランド所在）を添加し、３７℃で１時間３０分インキュベートした後、この培地５００μＬおよび２５０μＬを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天（ＵＳＢ（登録商標））の入った２つのペトリディッシュに塗抹した。ディッシュを３７℃で一晩インキュベートした。組換え型のコロニーを、５０μＬの滅菌蒸留水中と、ＬＢ寒天アンピシリンのペトリディッシュ上との両方に播種した。
【０１０３】
この組換え大腸菌コロニーをＰＣＲ分析のためにサンプリングした：蒸留水中の細菌懸濁液５μｌ、Ｍ１３プライマー対（１０ｐｍ／μＬ）、および先述のＰＣＲ反応媒体。ＰＣＲプログラムは２回目の構築ステップに使用したプログラムと同一とした。得られたＰＣＲ産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中の１．５％アガロースゲルで分析した。期待される大きさのフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット２５０Ｑｉａｋｉｔ（キアゲン（登録商標））を使用して精製した。その後、Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ１．１サイクルシーケンシングキット（アプライド・バイオシステムズ（登録商標）、英国ウォリントン所在）、クロマトグラフィで分離されたセンスおよびアンチセンスプライマー３．２ｐｍｏｌ／μＬを使用して、ＡＢＩ ＰＲＩＭ ３１００シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ（登録商標））で配列決定した。得られた配列を、自動アセンブラプログラムおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（アプライド・バイオシステムズ（登録商標））プログラムを使用して、期待されるフラグメント配列と比較した。組換え体クローンのうち、期待の配列に一致する１クローンを、１００ｍＬのＬＢブロス・アンピシリン中で大量に生産し、Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉキット（キアゲン（登録商標））のプロトコールに従って精製することとした。その後、精製プラスミドを−２０℃で保存した。選択された組換え菌株は−８０℃で冷凍した。
【０１０４】
Ｉ．４．３．４ プラスミド範囲の取得
２６０ｎｍで光学密度を計測することにより濃度を測定した。例えば、初期溶液が０．３８であるとする。１ユニットのＯＤは５０μＬ／ｍＬに相当する：初期溶液中のプラスミドは０．３８×５０＝１９μｇ／ｍＬ＝１９×１０−６ｇ／ｍＬである。プラスミドの大きさ＝ｐＧＥＭ（登録商標）‐Ｔ Ｅａｓｙの大きさ＋フラグメントの大きさ＝３０１５＋９３１＝４３３４ｂｐ、すなわち塩基数８６６８。１つのヌクレオチドのモル質量は３３０Ｄａ（ｇ／ｍｏｌ）である。プラスミドのモル質量は８６６８×３３０＝２．８６０×１０６ｇ／ｍｏｌとなる。プラスミドの濃度は、ｍｏｌ／ｍＬでは、１９×１０−６／２．８６０×１０６＝６．６４×１０−１２ｍｏｌ／ｍＬとなる。アボガドロ数を掛けて、溶液１ｍＬあたりのプラスミドコピー数、すなわち：６．６４×１０−１２×６．０２３×１０２３＝４０×１０１１コピー／ｍＬすなわち２×１０１０コピー／５μＬを得た。初期プラスミド溶液の最初の希釈を１：２５００とすることにより、濃度をプラスミド範囲の第１段階、すなわち１０７コピー／５μＬのプラスミド溶液に調節することができた。１０段階の系列希釈により、連続的な段階の範囲を作成することができた（溶液５μＬ当たり１０７コピー〜１コピー）。
【０１０５】
Ｉ．５． 標本の分析
Ｉ．５．１ 定量的リアルタイムＰＣＲ
定量化反応は、膣標本由来ＤＮＡ抽出物についてのリアルタイムＰＣＲによって行った。各反応プレートに下記すなわち：４つの陰性対照（ＮＴＣ）、較正用プラスミド範囲（１ウェルあたり１０７〜１コピー）、ならびに２４例の試験標本を、未希釈で、および阻害剤について調べるために１：１０と１：１００とに希釈して、投入した。陰性対照およびプラスミド範囲のポイントは２連として試験した。８種の微生物およびヒトアルブミンの増幅および定量について、４枚のＰＣＲプレートは二重の蛍光を用いて、１枚は単一の蛍光を用いて実施した。反応混合物の調製については、ＴａｑポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼバッファー（Ｈｏｔｓｔａｒ）を組み合わせる２×反応混合物、ｄＮＴＰ、ならびにｄＵＴＰを含むキットＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲキット（キアゲン（登録商標））を使用した。この反応混合物に、付録６に記載の実験条件による単一蛍光または二重蛍光ＰＣＲに必要なセンスおよびアンチセンスプローブを、希釈した試験標本または未希釈の試験標本と共に添加した：プラスミド範囲のポイントには５μＬおよび０．２５μＬのＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、１００ユニット、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、フランス国リヨン所在）を添加して、最終反応体積を２５μＬとした。ＰＣＲ反応はストラタジーン（登録商標）のＭＸ ３０００Ｐ（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在）で実施した。増幅プログラムは下記すなわち：５０℃で２分、９５℃で１５分、続いて９５℃で３０秒間の変性とその後の６０℃で１分間のハイブリダイゼーションおよび伸長の相とから成るＰＣＲサイクルを４５サイクルとした。
【０１０６】
Ｉ．５．２ 細菌負荷の算出
個々の膣標本および各微生物について、標本を確実に比較できるように、細菌負荷を以下のように定義した。ＤＮＡ抽出物５μＬあたりの各微生物由来のＤＮＡコピー数の定量については、初期標本１ｍＬあたりの細菌数として報告した。ＤＮＡ溶出体積（１００μＬ）、初期標本あたりの輸送培地の体積（２００μＬ）、および定量される遺伝子が単一遺伝子であるという事実、を考慮に入れなければならない。各微生物についてＤＮＡ抽出物５μＬあたりのコピー数として得られた値に１０２を掛けて標本１ｍｌ当たりの細菌数としての濃度を得て、次に、試料２００μＬから抽出されたＤＮＡの溶出体積１００μＬを引き出した。
【０１０７】
Ｉ．５．３ 統計解析
リアルタイムＰＣＲによる細菌定量データの統計解析には、有意水準ｐ＜０．０５のウィルコクソン検定およびマン・ホイットニーの検定を用いた。統計解析については、正の閾値より下のものを含むすべての定量値を考慮に入れた。ゼロに匹敵する定量値については、分析した全標本の最低濃度をその値と考えた。ウィルコクソンの統計的検定は、各細菌叢群内での各微生物の分布について述べるために適用した。マン・ホイットニーの検定は、ＢＶ群およびＮＦ群における８つの微生物それぞれの定量値を比較するために適用した。ＢＶの分子レベルの基準について調べるために、各々の細菌定量の閾値（１０３／ｍＬ〜１０９／ｍＬ）を、先にＮｕｇｅｎｔスコアで定義されたＮＦおよびＢＶの閾値による同定に従って計算された感度、特異性、ならびに陽性的中率および陰性的中率について検討した。単独でも組み合わせにおいても、最良の感度および特異性を有する定量閾値を、分子レベルの基準としてＢＶの同定に使用した。
【０１０８】
ＩＩ．結果
ＩＩ．１．集団についての説明
２００５年６月から２００６年４月までに、１８〜４９歳（平均年齢２８．９±６．２）の２０４名の妊婦が参加した。種族的出身は、北アフリカ（４３％）、ヨーロッパ（４２％）、南アフリカ（１４％）およびその他（１％）であった。各女性から１つの膣標本を採取した。標本の７２パーセントは第３妊娠三半期、２０％は第２妊娠三半期、および８％は第１妊娠三半期に採取されたものであった。２１名の女性が細菌学的追跡調査を受け、２〜４例の標本が採取された。従って、合計２３１例の標本を分析した。
【０１０９】
ＩＩ．２．細菌学上の結果
ＩＩ．２．１ グラム染色およびＮｕｇｅｎｔスコアの決定
２０４名の女性に由来する２３１件の膣標本から、Ｎｕｇｅｎｔスコアにより、１６７例のＮＦ、４４例のＩＦ、および２０例のＢＶが同定された。２０４名の女性それぞれの最初の膣標本における膣内細菌叢の異常の頻度は、ＮＦが７１％（１４５例）、ＩＦが１９％（３９例）、ＢＶが１０％（２０例）であった。ＢＶの女性の半分が症候性であった。最も頻繁に観察された症状は大量の膣帯下であった。
【０１１０】
ＩＩ．２．２ 培養および採取直後の状態
培養により、Ｇ．バギナリス、Ｃ．アルビカンス、Ｍ．ホミニス、Ｕ．ウレアリチクムおよびストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｔｉａｅ）を分離することができた（表１）。調べたいずれの膣標本も直接的な検査では膣トリコモナス（Ｔ． ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を示さなかった。
【０１１１】
ＩＩ．３．分子生物学上の結果
ＩＩ．３．１ リアルタイムＰＣＲの展開
単一蛍光および二重蛍光のＰＣＲを進行させると、交差反応はなく、競合は伴わなかった。純粋な細菌株およびプラスミド範囲を使用する単一蛍光および二重蛍光で、同様のＣＴ値の結果が得られた。
【０１１２】
最適の増幅を得るために必要なプライマーおよびプローブの最適量を、付録５に示す。
ＩＩ．３．２ 分子生物学による定量技法の評価
各標本の細菌の定量について、プラスミドの希釈範囲を設けた。各増幅反応について、プラスミド範囲にある８ポイント（５μＬ当たり１０７コピー〜１コピー）を試験した。該範囲の１０７コピーのポイントが、始めにＣＴ値約１７と同定された。該範囲の１コピーのポイントについては、後にＣＴ値３７で検出された。範囲内のすべてのポイントについて、増幅反応は直線的であった。グラフで表すと傾きが−３．２〜−３．５の直線である。この直線性は、１：１０、１：１００および１：１０００に希釈した純粋な菌株の試験により確認された。検討した微生物の種類が何であれ、正の閾値は１０コピー（または細菌１０３個／ｍＬ）以上と定義された（表２）。統計的には、「１コピー」のポイントの増幅は７５％で生じるのに対し、「１０コピー」のポイントについての増幅は１００％である。それぞれの増幅用プレート内では、各標本を、未希釈の溶液、ならびに１０分の１希釈および１００分の１希釈として試験した。再現性よく、１０分の１希釈が３ＣＴの増大に相当するので、増幅産物の検出は希釈段階に従っていた。細菌負荷の算出には純粋な溶液だけを考慮した。各標本について、リアルタイムＰＣＲでヒトアルブミンを試験した。得られた結果は、２３１例の試料のセットについて均質であった。ＣＴ値は１９〜２２（すなわち抽出されたＤＮＡ５μＬあたり１０５〜１０６コピーのアルブミンＤＮＡ）に分布した。いずれの標本も分析から除外されなかった。
【０１１３】
ＩＩ．３．３ データ分析
ＩＩ．３．３．１ 細菌性膣炎の分子レベルでの説明
Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスの平均濃度はそれぞれ１．１×１０９／ｍＬおよび１．２×１０９／ｍＬであり、ウィルコクソン検定では統計的有意差はなかった（ｐ＝０．３７５５）。これらの２種の細菌は、他の微生物の平均濃度が統計的に低かった（ｐ＝０．０００１）のに比べて高濃度であった（図１Ａおよび３）。
【０１１４】
ＩＩ．３．３．２ 細菌性膣炎および正常細菌叢の分子レベルの比較
ラクトバチルス属細菌の平均濃度は、細菌性膣炎（平均濃度３×１０３／ｍＬ）においてＮＦ（平均濃度５．７×１０７／ｍＬ）より有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。他方、Ａ．バギナエ、Ｇ．バギナリス、Ｍ．クルティシイおよびＭ．ホミニスの平均濃度は、細菌性膣炎（平均濃度はそれぞれ１×１０９／ｍＬ；１．２×１０９／ｍＬ；５×１０３／ｍＬおよび５．５×１０２／ｍＬ）においてＮＦより有意に高かった（ｐ≦０．００３７）。Ｕ．ウレアリチクムおよびＣ．アルビカンスの平均濃度については、ＢＶとＮＦとの間に統計的有意差はなかった。最後に、Ｍ．ムリエリスはＢＶのいずれにおいても、またはＮＦのいずれにおいても同定されなかった（正の閾値≧１０３／ｍＬ）。
【０１１５】
ＩＩ．３．３．３ 細菌性膣炎の分子レベルの基準の決定
分離されたＡ．バギナエおよびＧ．バギナリスの定量閾値による分析は、Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義されるＢＶおよびＮＦを分子レベルで同定するための感度、特異性、ならびに陽性的中率および陰性的中率の最良の基準を有する（表４）。Ａ．バギナエの定量値≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリスの定量値≧１０９／ｍＬの組み合わせは、９５％の感受性、９９％の特異性、９５％の陽性的中率（ＰＰＶ）、および９９％の陰性的中率（ＮＰＶ）を有する。
【０１１６】
ＩＩ．３．３．４ 中間的細菌叢の分子レベルの特徴解析
Ａ．バギナエの定量値≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリスの定量値≧１０９／ｍＬにより既に定義されたＢＶの同定のための分子レベルの基準をＮｕｇｅｎｔスコアのＩＦ（図２）に適用すると、２５例の細菌叢（５７％）がＢＶのプロファイル（図３）を有し、１９例の細菌叢（４３％）がＮＦのプロファイル（図４）を有するものと特徴付けることができた。
【０１１７】
ＩＩ．３．３．５ 細菌学的な追跡調査
ＮｕｇｅｎｔスコアでＢＶまたはＩＦである８名の女性を追跡調査した（表７）。分子レベルの定量により、被験者１についてＮｕｇｅｎｔスコアでは同定されないＢＶの再発が示された。被験者７および８についてはＢＶの消失が確認された。被験者２および５については１か月以上後も持続しているＮｕｇｅｎｔスコアのＩＦがＢＶであると特徴付けられた。最後に、被験者３では正常な性質の膣内細菌叢の維持が確認された。
【０１１８】
ＩＩＩ 論考
Ｎｕｇｅｎｔスコアによる膣内細菌叢のＮＦ（７１％）、ＢＶ（１０％）およびＩＦ（１９％）への分類は、フランス国［Ｇｏｆｆｉｎｅｔ Ｆ，ＥＪＯＧＲ ２００３］、ヨーロッパ［Ｇｕｉｓｅ ＪＭ，ＡＭＪＰＭ ２００１］、および米国［Ｄｅｌａｎｅｙ ＭＬ，ＯＧ ２００１］で文献に報告された分類と一致する。本発明の独自の特徴は、特異的なリアルタイムＰＣＲ検出技法と較正プラスミドによる相対的定量とを組み合わせることにより、膣内細菌叢を同定するための合理的なツールを確立していることである。
【０１１９】
最も驚くべき結果はＡ．バギナエに関するものであった。この細菌は、健康な被験者由来の膣標本からの１６Ｓ ＲＮＡの増幅および配列決定によって１９９９年に初めて同定された［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＭ，ＩＪＳＢ １９９９］。２００３年に、Ａ．バギナエは卵管卵巣膿瘍由来の標本を培養することにより分離され、この細菌が病原性の役割を果たすことが示唆された［Ｇｅｉｓｓｄｏｒｆｅｒ Ｗ，ＪＣＭ ２００３］。２００４年に、１６Ｓ ｒＲＮＡをクローニング技法と組み合わせる手法により、卵管炎の患者から手術時に得られた標本中に該細菌の存在が示された［Ｈｅｂｂ ＪＫ，ＪＩＤ ２００４］。本発明によれば、この細菌は、２０例のＢＶのうち１９例（９５％）、および１６７例のＮＦのうち１１５例（６９％）において高頻度で同定される。ＢＶおよびＮＦを診断するための最も識別力の高い基準はＡ．バギナエ濃度≧１０８／ｍＬであり、感度は９０％（２０例のＢＶのうち１８例）、特異性は９９％（１６７例のＮＦのうち１例）である。
【０１２０】
２００４年以来、様々な分子レベルの技法に基づいた４つの研究から、Ａ．バギナエとＢＶとの間の関連の可能性が示されてきたが、いずれの研究も正確な定量値基準を用いたものではなかった。第一に、１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とするＰＣＲ法とその後のゲル泳動から、わずかに２０例中１２例のＢＶ（６０％）、および２４例中２例のＮＦ（８．３％）にＡ．バギナエが示された［Ｆｅｒｒｉｓ ＭＪ，ＢＭＣＩＤ ２００４］。Ａ．バギナエの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異標的とするＰＣＲによって、該細菌のＤＮＡが、９例のＢＶのうち７例（７７．８％）、および１１２例のＮＦのうち２２例（１９．６％）に見出された［Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ，ＢＭＣＭ ２００４］。同じ技法を適用して、Ａ．バギナエのＤＮＡが、２２例のＢＶのうち１９例（８６．４％）、および４０３例のＮＦのうち５９例（１４．７％）において示された［Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ，ＢＭＣＭ ２００５］。最後に、増幅、クローニングおよび配列決定の技法によって、Ａ．バギナエのＤＮＡが、２７例中２６例のＢＶ（９６％）および４６例中９例のＮＦ（１９．５％）において観察された［Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓ ＤＮ，ＮＥＪＭ ２００５］。これらの研究のいずれもＡ．バギナエのＤＮＡを定量していないが、Ａ．バギナエのＤＮＡは該細菌の濃度が診断の重要な要素である細菌性膣炎において不可欠である。
【０１２１】
Ａ．バギナエは、膣内細菌叢の異常において主導的役割を果たすにもかかわらずＮｕｇｅｎｔスコアには欠けている。形態学的基準によるＡ．バギナエの同定は不適当である。小さなグラム陽性球杆菌（０．６〜０．９μｍ）の形であるＡ．バギナエの可変的な形態は、他の細菌と接触したときに集合して対や短連鎖を形成した状態で検出不能となることがある［Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ，ＢＭＣＭ ２００４］。従ってラクトバチルス属細菌および連鎖球菌との類似が同定誤差の原因である［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＭ，ＩＪＳＢ １９９９］。
【０１２２】
ＢＶにおけるＡ．バギナエとＧ．バギナリスとの関連についての記載は、最近少数の報告文書があるが、定量を伴わない限定的な診断範囲のものである。この関連は、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする特異的ＰＣＲによる、８７．８％（９例のＢＶのうち８例）［Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ，ＢＭＣＭ ２００４］および９０％（２２例のＢＶのうち２０例）［Ｚａｒｉｆｆａｒｄ ＭＲ，ＦＥＭＳ ２００２］である。最近の発表は、半定量的な方法により、細菌性膣炎におけるＡ．バギナエの存在を示している［Ｂｒａｄｓｈａｗ ＣＳ，ＪＩＤ ２００６］。
【０１２３】
本発明によれば、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスのこの組み合わせは９０％（２０例のＢＶのうち１８例）であるが、９５％（２０例のＢＶのうち１９例）の感度を有するＡ．バギナエ≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリス≧１０９／ｍＬの定量値を考慮すると、特異性（９９％）、ＰＰＶ（９５％）およびＮＰＶ（９９％）について、これまでにＢＶの同定用に達成された最良の基準が提示される。従って、Ａ．バギナエ濃度≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリス濃度≧１０９／ｍＬをＢＶの分子レベルの診断に使用する。
【０１２４】
本発明による結果から、Ｇ．バギナリスの定量はＡ．バギナエの定量より判別力が低いことが示唆される。ラクトバチルス属細菌については、Ｎｕｇｅｎｔスコアによって客観的に示されたＢＶにおける同細菌の減少が、これらの結果によって確認されている：１０７／ｍＬ以下のラクトバチルス属細菌の濃度を考慮すれば、ＢＶを診断するための感度は１００％、特異性は４４％である。さらに、１０８／ｍＬ以上のラクトバチルス属細菌の濃度を考慮すれば、正常な膣内細菌叢の実証において１００％の特異性が観察される。
【０１２５】
モビルンカス属細菌については、Ｎｕｇｅｎｔスコアによって該細菌に与えられた地位にもかかわらず、ＰＣＲではＭ．ムリエリスは陽性ではない。Ｍ．クルティシイだけがＢＶと関連付けられている。しかしながら、考えられる分子レベル診断の基準としての該細菌の有用性は小さいままである。
【０１２６】
生殖器マイコプラズマはＮｕｇｅｎｔスコアでは考慮されていない。しかしながら、生殖器マイコプラズマは培養または分子生物学により同定可能である。４４５例のＢＶおよび２７２９例のＮＦを培養する研究から、Ｍ．ホミニスは感染率２９％（１２９例のＢＶ）で有意に関連するものと特定され、Ｕ．ウレアリチクムは感染率５６％（２５３例のＢＶ）にもかかわらずＢＶとの関連はないとして特定された［Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｐ，ＡＪＯＧ １９９８］。リアルタイムＰＣＲによるＭ．ホミニスを標的とした２０３例のＢＶおよび２０３例のＮＦに関する研究から、ＢＶへのＭ．ホミニスの関与が示唆された［Ｚａｒｉｆｆａｒｄ ＭＲ，ＦＥＭＳ ２００２］。しかしながら、より小さな集団（５例のＢＶと１６例のＮＦ）に関する同じ研究では、この関連は実証されなかった［Ｓｈａ ＢＥ，ＪＣＭ ２００５］。本発明によれば、Ｍ．ホミニスだけがＢＶと関連するが、この相関関係はＢＶの診断基準としてこの微生物を提案するには不十分である。
【０１２７】
本発明による結果は、文献［Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｐ，ＡＪＯＧ １９９８］にデータで示されるようなＢＶとＣ．アルビカンスとの関連を示さない。このことは、生殖器にカンジダ・アルビカンスを有していても早産のリスクは増加しない［Ｃｏｔｃｈ ＭＦ，ＡＪＯＧ １９９８］一方で、最近の研究［Ｋｉｓｓ Ｈ，ＢＭＪ ２００４］から生殖器のＣ．アルビカンスの治療による早産の低減が示されたため、興味深い。
【０１２８】
本発明の独創性は、本発明が初めてＡ．バギナエおよびＧ．バギナリスの定量に基づいたＢＶの診断ツールを提供することである。現時点での使用時の基準は、Ａ．バギナエの濃度≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリスの濃度≧１０９／ｍＬを組み合わせる。この診断テストは、９５％の感度、９９％の特異性、９５％のＰＰＶおよび９９％のＮＰＶを有する。ＰＣＲの結果を読み取るいくつかの方法、特に細菌濃度の比および積が計算される方法について、最も適切な方法を特定できるように試験してきた。
【０１２９】
本発明による分子生物学的ツールの最も厄介な適用のうちの１つは、ＮｕｇｅｎｔスコアのＩＦについて行なわれたものである。本発明者らは、Ｎｕｇｅｎｔスコアによってのみ同定されるＩＦが、Ｎｕｇｅｎｔスコアで同定されるすべての細菌叢のうちの無視できない割合（８％〜２２％）を占めること［Ｇｕｅｒｒａ Ｂ、ＥＪＯＧＲＢ ２００６；Ｇｏｆｆｉｎｅｔ Ｆ，ＥＪＯＧＲＢ ２００３；Ｄｅｌａｎｅｙ ＭＬ，ＯＧ ２００１；Ｌｉｂｍａｎ ＭＤ，ＤＭＩＤ ２００６；Ｌａｒｓｓｏｎ ＰＧ，ＳＴＩ ２００４］、および多くの不確実性を伴うことを認識している。実際、本発明者らはこの中間的細菌叢が対応する微生物学的実体を知らないので、ＩＦの解釈には注意が必要である。一部の研究者は、ＩＦはＮＦとＢＶとの間の過渡期の細菌叢であると考えている［Ｉｓｏｎ ＣＡ，ＳＴＩ ２００２；Ｇｕｅｒｒａ Ｂ，ＥＪＯＧＲＢ ２００６；Ｇｏｆｆｉｎｅｔ Ｆ，ＥＪＯＧＲＢ ２００３；Ｕｇｗｕｍａｄｕ Ａ，Ｌａｎｃｅｔ ２００３；Ｃａｒｅｙ ＪＣ，ＮＥＪＭ ２０００］。他の人々は、ＩＦはＮＦとＢＶとを含む不均質な集合と考えている［Ｉｓｏｎ ＣＡ，ＳＴＩ ２００２；Ｌｉｂｍａｎ ＭＤ，ＤＭＩＤ ２００６；Ｌａｒｓｓｏｎ ＰＧ，ＳＴＩ ２００４］。ＩＦをＮＦまたはＢＶとして特徴付ける試みが文献に報告されている。１３例のＩＦにＡｍｓｅｌの基準を適用することによって、１２例のＩＦがＮＦとして、１例はＢＶとして再分類された［Ｉｓｏｎ ＣＡ，ＳＴＩ ２００２］。Ｎｕｇｅｎｔスコアを確立するためにコペロフ（Ｋｏｐｅｌｏｆｆ）の染色を使用して、２３２例のＩＦのうち６９例（３０％）がＮＦまたはＢＶとして再分類された［Ｌｉｂｍａｎ ＭＤ，ＤＭＩＤ ２００６］。この染色では、グラム陰性細菌をより良好に同定するためにグラム染色においてサフラニンをフクシンに替えている。最後に、使用した顕微鏡の光学視野の表面の関数としてＮｕｇｅｎｔスコアの基準を標準化することによって、１１７６例のＩＦのうち４５８例（３９％）をＮＦまたはＢＶとして再分類することができた［Ｌａｒｓｓｏｎ ＰＧ，ＳＴＩ ２００４］。
【０１３０】
Ａ．バギナエ濃度≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリス濃度≧１０９／ｍＬをＢＶと関連付ける本発明の分子レベルの基準をＩＦに適用することにより、このＩＦを合理的に特徴づけることができる。このように、２４例のＩＦ（５７％）はＮＦに類似のプロファイルを有している。よってこれらの結果は、ＩＦの性質が不均質であること、およびＮｕｇｅｎｔスコアは感度が低すぎてＢＶ症例の半分以上を診断することができないことを示唆している。したがって、これらのデータはＮｕｇｅｎｔスコアの限界を確認するものである。
【０１３１】
ＢＶの病因論は依然として全く不可解であるが、本発明者らは初めて、ＢＶの診断への合理的な手法を提供する客観的な定量ツールを有している。本発明の特有な性質は、ＢＶにおけるＡ．バギナエの重大な役割、およびＢＶの主要な診断基準として定量することによるＡ．バギナエの利用の両方を示していることである。このことは、Ａ．バギナエがメトロニダゾールに対し比較的抵抗性であること（治療後の頻繁な再発の原因の一部であるかもしれない）によって提起される治療上の問題についてよりよい理解を提示している［ＡＮＡＥＳ ２００１；Ｆｅｒｒｉｓ ＭＪ，ＢＭＣ ＩＤ ２００４；Ｓｅｃｏｒ ＡＭ，ＣＮＰ １９９７；Ｇｅｉｓｓｄｏｒｆｅｒ Ｗ，ＪＣＭ ２００３；Ｄｅ Ｂａｃｋｅｒ Ｅ，ＢＭＣ ＩＤ ２００６］。ＢＶを診断するために使用される分子レベルの基準は、Ａ．バギナエ濃度≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリス濃度≧１０９／ｍＬを組み合わせる。この分子ツールによって、ＢＶを診断すること、および一部のＩＦをＢＶとして特徴づけることが可能となる。本発明者らはさらに本分子ツールを、ＢＶの診断ツールとして、および妊娠中のＢＶの治療管理を評価する追跡調査方法として構想することができる。
【０１３２】
付録１． 検討した各微生物についての分子標的ならびにプライマー対およびプローブのヌクレオチド配列。
以下の表において、「センスプライマー」および「プローブ」の配列は５’→３’方向に記載され、「アンチセンスプライマー」配列は相補的な逆方向の５’→３’で記載されている。
【０１３３】
【表１】
付録２． ９３９塩基対の挿入物全体の理論上の配列。
太字の配列＝センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの配列
下線を付した配列＝特異的プローブ配列
黒色の配列＝挿入配列
括弧内の配列＝Ｘｈｏ１制限酵素切断部位の配列
【０１３４】
【化６】
付録３． ６つのオリゴヌクレオチドおよび挿入物構築用プライマーの配列。
− センスオリゴヌクレオチド１、１７８ヌクレオチド：Ｍ．クルティシイおよびＭ．ムリエリスの配列
【０１３５】
配列番号１９＝５’ＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＴＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＡＴＧＣＧＴＴＴＣＡＴＴＡＴＧＧＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＡＴＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣ３’
【０１３６】
− アンチセンスオリゴヌクレオチド２、１８３ヌクレオチド：Ｇ．バギナリスおよびラクトバチルス属細菌
配列番号２０＝５’ＣＧＡＣＣＡＧＴＧＡＴＡＧＴＡＡＡＴＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＣＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＡＴＧＴＡＴＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴＧＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＴ３’
【０１３７】
− センスオリゴヌクレオチド３、１４５ヌクレオチド：Ｕ．ウレアリチクム
配列番号２１＝５’ＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＡＧＴＧＣＡＴＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＧＴＡＡＡＧＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＡ３’
【０１３８】
− アンチセンスオリゴヌクレオチド４、１８８ヌクレオチド：Ｍ．ホミニス
配列番号２２＝５’ＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＴＡＴＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＴＡＴＣＧＡＡＡＣＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＡＧＣＡ３’
【０１３９】
− センスオリゴヌクレオチド５、１５２ヌクレオチド：Ａ．バギナエおよびＣ．アルビカンス
配列番号２３＝５’ＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＧＡＡＡＡＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴ３’
【０１４０】
− アンチセンスオリゴヌクレオチド６、１４７ヌクレオチド：ヒトアルブミン
配列番号２４＝５’ＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡ３’
【０１４１】
− ９３９塩基対のフラグメントを備えた組換えプラスミドの構築用プライマー
− センス 配列番号２５＝５’ＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＧＴＣ３’
アンチセンス 配列番号２８＝５’ＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴ３’
【０１４２】
付録４． 二重ＰＣＲによる挿入物構築の理論を示す図
６つのオリゴヌクレオチドを用いて挿入物を構築する原理。
プラスミド構築の図解
【０１４３】
【化７】
付録５． 各微生物およびヒトアルブミンについてのＤＮＡ抽出物５μＬの増幅反応に必要なプローブならびにセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの量
【０１４４】
【表２】
参考文献
【０１４５】
【表３】
【０１４６】
【表４】
【０１４７】
【表５】
【０１４８】
【表６】
【０１４９】
【表７】
【０１５０】
【表８】
【０１５１】
【表９】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性膣炎（ＢＶ）の存在に関して、または適用可能な場合には、細菌性膣炎の治療管理を追跡するために細菌性膣炎の転帰に関して、膣内細菌叢の状態を診断および追跡調査するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
妊娠にとって非常に有害な一般的感染症であるＢＶを診断するための現在の技法は、信頼性の低い基準に基づいている。何種類かの細菌がこの疾患に関係していると言われてきたが、信頼できる分子レベルの定量および定性を活用してはいなかった。
【０００３】
長い間、ＢＶは、微生物学的見地から、ラクトバチルス属細菌が他の細菌、特にガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、モビルンカス属細菌（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｓｐｐ．）、および生殖器マイコプラズマに屈し、主としてラクトバチルスで構成される正常な膣内細菌叢がほとんど消失することをもって定義されてきた［非特許文献１および２］。ＢＶは多くの女性を診療室へと導き、特に、ＨＩＶのような性感染症への罹病性に関与し、また妊娠の場合には未熟児および低出産体重児に関与する。女性（妊婦を含む）におけるＢＶ有病率は、現行の調査法によれば８〜２３％である［非特許文献３］。
【０００４】
しかしながら、文献を再検討すると、この病的状態の治療管理への影響に関しては論争がある。ＢＶを治療した場合の早産のリスクの低下を示した初期の研究を確認することはできなかった［非特許文献４および５、非特許文献３、非特許文献６〜１０］。
【０００５】
本発明の当初の目的は、妊娠中のＢＶの影響、および妊娠中のＢＶの治療管理の有効性を評価することであった。しかしながら、そうするための客観的な診断ツールが利用可能ではなかった。文献の検討から、ＢＶの診断および追跡調査のための合理的ツールが存在しないことが主な原因で、この疾患の治療管理に関して大きな混乱があることが明らかである。
【０００６】
現在利用可能な２つの診断ツールはＮｕｇｅｎｔスコアおよびＡｍｓｅｌ基準である。実施が煩雑であるため臨床微生物学実験室において日常的には使用されないにもかかわらず、Ｎｕｇｅｎｔスコアは文献中で報告の最も多い方法であり、一部の人々にはゴールドスタンダードと考えられている［非特許文献１１〜１４］。Ｎｕｇｅｎｔスコアはグラム染色後に細菌を半定量的に形態分析することによってＢＶを同定する。従ってこれは主観的な技法であり、その再現性には疑問がもたれてきた［非特許文献１５および１６］。Ａｍｓｅｌの臨床基準（膣内ｐＨが４．５を上回る；灰色がかった均質で粘着性の帯下；１０％ＫＯＨ添加後の窒素臭；クルーセルの存在）は、第２の診断手法の代表である［非特許文献１７］。Ｎｕｇｅｎｔスコアと同様にこれも煩雑であり、日常的な臨床業務においては使用されていない。
【０００７】
これらの診断法の、最も弊害の大きい限界のうちの１つは、ＢＶに関与する特定の微生物を同定できないことである。一方では、マイコプラズマは壁を持たないのでグラム染色されず、Ｎｕｇｅｎｔ法によってスコア化することができない。他方では、分子生物学的知識によりＢＶに関与する可能性のある新しい細菌を同定することが可能となっているものの、該細菌を既存の２つの診断法により実証することは不可能である。アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）は、特徴解析が為された主な新しい細菌種である。該細菌の存在はいくつかの論文においてＢＶと関連付けられているが、他の微生物との相対的な位置付けに関する、信頼できる定量的な評価はなされていない［非特許文献１８〜２２］。
【０００８】
ブラッドショーらによって最近発表された論文［非特許文献１８］には、細菌Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスの検出とＢＶとの間の関連が記載されているが、これらの結果は、ＢＶの診断および／またはＢＶの転帰の信頼性の高い追跡調査を行うには不十分である。この論文で示されたデータは上記細菌のスクリーニングを可能にしているが、実際に定量化はされていない。さらに、このスクリーニングは、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスがＢＶ患者のそれぞれ９６％および９９％において検出されたので、良好な感度を示した。しかしながら、正常細菌叢を有する患者の１２％においてＡ．バギナエが、６０％においてＧ．バギナリスが検出されたので、特異性は不十分である。
【０００９】
そこで著者らは、分析標本における微生物検出の平均ＣＴ（サイクル閾値）との比較により細菌負荷を低いか高いか分類することによる「半定量的」手法を試みた。こうして著者らは、Ｇ．バギナリスについて４×１０５コピー（２１サイクルに相当する平均）およびＡ．バギナエについて４×１０６コピー（１８サイクルに相当する平均）の平均負荷を概算した。高負荷のＧ．バギナリス（＞４×１０５）およびＡ．バギナエ（＞４×１０６）は、ＢＶ患者において正常細菌叢を有する患者よりも顕著にみられた。しかしながら、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスがＢＶ患者の４９％および７１％にしか検出されなかったように（表１）、これらの値の感度は不十分である。さらに、治療後にＢＶを再発した１６人の患者（２８％）は、所定の閾値より低いＧ．バギナリス濃度を有していた（表３）。ＢＶを再発した４０人の患者（７０％）も、閾値より低いＡ．バギナエ濃度を有していた。
【００１０】
従って、著者らの「半定量的」手法は、患者の診断および当座の追跡調査のツールとしてのみ適用可能である。これらの結果を得るために使用した技法は、いくつかの点で不適当であった。第１に、分子標的によって増幅されるフラグメントが長すぎたので（１６ＳリボソームＲＮＡの４３０塩基対（Ａ．バギナエ）および２９１塩基対（Ｇ．バギナリス））、該ＰＣＲ法は十分な感度ではなかった。そのような長いＰＣＲ反応において標的とされた配列を用いると感度が低いことがここで確証された。さらに、リアルタイムＰＣＲ技法は検出および定量に増幅産物のＳｙｂｒＧｒｅｅｎ標識を使用し、それは３重の特異性（大きさが１２０塩基対を超えないフラグメントを増幅するための２つのプライマーおよびプローブ）を必要とする標識加水分解プローブを使用する方法よりも、特異性の低い方法である。定量は通常、長期間にわたって比較できる安定で再現性の良いプラスミド範囲の関数としてではなく、可変的な標準を用いて行われる。最後に、標本の品質評価を可能にする定量用の対照ツールを活用していない：試料中のヒトβ‐グロビンを定量することなく存在のみを調べている。従って、細菌量の変動が、採取された膣分泌物における質的かつ量的変動に関連しているかもしれないので、試料を相互に定量的に比較することは非常に困難であった。
【００１１】
従って、ＢＶの治療管理を評価するためには、ＢＶの診断および膣内細菌叢の定性的かつ定量的なモニタリングのための信頼性の高いツールの開発が不可欠である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】シュピーゲル ＣＡ（Ｓｐｉｅｇｅｌ ＣＡ）、ＣＭＲ １９９１
【非特許文献２】トーセン Ｐ（Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｐ）、ＡＪＧＯ １９９８
【非特許文献３】ギーズ ＪＭ（Ｇｕｉｓｅ ＪＭ）、ＡＪＰＭ ２００１
【非特許文献４】モラレス ＨＪ（Ｍｏｒａｌｅｓ ＨＪ）、ＡＪＯＧ １９９４
【非特許文献５】ホース ＪＣ（Ｈａｕｔｈ ＪＣ）、ＮＥＪＭ １９９５
【非特許文献６】マクドナルド Ｈ（ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｈ）、ＣＤＳＲ ２００５
【非特許文献７】バルマー Ｒ（Ｖａｒｍａ Ｒ）、ＥＪＯＧＲＢ ２００６
【非特許文献８】オークン Ｎ（Ｏｋｕｎ Ｎ）、ＯＧ、２００５
【非特許文献９】ライティヒ Ｈ（Ｌｅｉｔｉｃｈ Ｈ）、ＡＪＯＧ ２００３
【非特許文献１０】グェルラ Ｂ（Ｇｕｅｒｒａ Ｂ）、ＥＪＯＧＲＢ ２００６
【非特許文献１１】フレドリクス ＤＮ（Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓ ＤＮ）、ＮＥＪＭ ２００５
【非特許文献１２】トマソン ＪＬ（Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＪＬ）、ＡＪＯＧ １９９２
【非特許文献１３】イーソン ＣＡ（Ｉｓｏｎ ＣＡ）、ＳＴＤ ２００２
【非特許文献１４】ニュージェント ＲＰ（Ｎｕｇｅｎｔ ＲＰ）、ＪＣＭ １９９１
【非特許文献１５】シャー ＢＥ（Ｓｈａ ＢＥ）、ＪＣＭ ２００５
【非特許文献１６】シュウェブキー ＪＲ（Ｓｃｈｗｅｂｋｅ ＪＲ）、ＯＧ １９９６
【非特許文献１７】アムセル Ｒ（Ａｍｓｅｌ Ｒ）、ＡＪＭ １９８３
【非特許文献１８】ブラッドショー ＣＳ（Ｂｒａｄｓｈａｗ ＣＳ）、ＪＩＤ ２００６
【非特許文献１９】ロドリゲス ＪＭ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＭ）、ＩＪＳＢ １９９９
【非特許文献２０】フェリス ＭＪ（Ｆｅｒｒｉｓ ＭＪ）、ＢＭＣＩＤ ２００４
【非特許文献２１】フェリス ＭＪ（Ｆｅｒｒｉｓ ＭＪ）、ＪＣＭ ２００４
【非特許文献２２】フェルヘルスト Ｒ（Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ）、ＢＭＣＭ ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、より信頼性が高く、より正確で、かつ臨床の微生物分析実験室において日常的に使用することが容易な、ＢＶの診断およびモニタリングのための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的のために、本発明者らは、２０４人の妊婦からの膣標本について検討し、かつＢＶに関与する各微生物について調べて、特定の細菌のＤＮＡの検出を可能にし、かつ参照用プラスミドの構築により確立されたプラスミド範囲によって細菌負荷の測定を可能にするリアルタイムＰＣＲ法を開発した。上記プラスミドは、増幅および定量すべき前記細菌の特異的ＤＮＡフラグメント、ならびに生体標本の豊富度だけでなくＤＮＡ標本および分子増幅の品質をも制御するために使用されるヒトアルブミン遺伝子の特異的ＤＮＡフラグメントを有している。調べた標的微生物（ラクトバチルス属細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、Ｇ．バギナリス、モビルンカス・クルティシイ（Ｍｏｂｉｌｉｎｃｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｉｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ウレアプラスマ・ウレアリチクム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ａ．バギナエ、およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））は、ＢＶまたは早産のうち少なくともいずれか一方に関与している可能性があると報告されたものとした。分子生物学によって得られた様々な微生物の定量結果を、Ｎｕｇｅｎｔスコアによる分類と比較した。
【００１５】
本発明によれば、ある閾値濃度を起点とするＡ．バギナエの存在が、非常に特異的かつ顕著にＢＶに関連している可能性があること、およびこの分子レベルの検出により診断が簡単かつ信頼性の高いものとなることが実証された。
【００１６】
細菌Ｇ．バギナリスについての特異的ＢＶ閾値濃度の存在も、本発明によって実証された。
さらに、ある濃度の上記２種類の細菌の組み合わせによって、９５％を越える陽性予測率、およびとりわけ９９％を越える陰性予測率をもってＢＶを診断することができることも実証された。
【００１７】
さらに、ＢＶの際には、膣内に通常存在するラクトバチルス属細菌の濃度が減少し、また本発明によって、ある閾値濃度を過ぎるとこれらのラクトバチルス属細菌の定量により信頼性をもってＢＶを診断することが可能となることが実証された。最終的に、Ｇ．バギナリス＋Ａ．バギナエの濃度に対するラクトバチルス属細菌濃度の比の変化により、信頼性をもってＢＶの経過を評価できることが実証された。
【００１８】
より具体的には、本発明は、細菌性膣炎の存在に関して膣内細菌叢の状態をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断および追跡調査するための、ならびに適用可能な場合には細菌性膣炎の治療をモニタリングするための方法を提供し、該方法は：
【００１９】
１）細菌アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）およびガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の濃度を；
・患者由来の膣帯下標本から抽出されたＤＮＡ中の、前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスのＤＮＡ中に単一コピーとして存在する前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの特異配列の濃度と、ヒト細胞を含むすべての生体標本中に存在するヒト遺伝子の特異配列の濃度とを測定することと、前記特異配列は大きさが１５０ヌクレオチド未満であることと；
【００２０】
・一方では標本から抽出された前記ＤＮＡ中に含まれる前記特異配列、他方では前記細菌の各々の前記特異配列およびすべてのヒト細胞生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列を含む合成ＤＮＡフラグメントの試料中に含まれる前記特異配列を、ＰＣＲにより酵素的に同時増幅することと、前記試料はＤＮＡを定量するための検量標準品としての役割を果たすことと；
【００２１】
・前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの前記特異配列ならびにすべてのヒト細胞生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列各々のための増幅プライマーの配列とは異なる配列を備えた標識プローブを助力として、前記増幅フラグメントの検出および定量を実行することと；
【００２２】
によって定量するステップ、ならびに
２）ヒト細胞を少なくとも１０４個／ｍＬ含んでいる患者の膣帯下標本中の細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの２つの前記特異配列のＤＮＡフラグメントの濃度が、次の２つの状態ａ）およびｂ）すなわち：
【００２３】
ａ）アトポビウム・バギナエの前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍＬ以上であること；および
ｂ）ガードネレラ・バギナリスの前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍＬ以上であること；
【００２４】
のうち少なくとも一方に合致する場合は、細菌性膣炎の存在、または進行中の治療の失敗を判定するステップ；
を特徴とする。
細菌アトポビウム・バギナエの濃度が閾値１０８以上であると、膣炎の約９０％を検出することが可能となる。細菌１０９個／ｍＬ以上のＧ．バギナリスの検出閾値は単独では膣炎症例のおよそ半分しか検出することができないと思われるので、アトポビウム・バギナエの濃度が細菌１０８個／ｍＬの閾値未満である場合に、膣炎を検出するために、細菌ガードネレラ・バギナリスの定量を追加として使用することが可能である。このため、本発明によれば、両方の細菌についてのＤＮＡ濃度の定量が必要である。
【００２５】
さらに、患者の膣帯下標本から抽出されたＤＮＡ中の、細菌Ａ．バギナエ（Ｃａ）、Ｇ．バギナリス（Ｃｇ）およびラクトバチルス属細菌（Ｃｌ）のＤＮＡ中に単一コピーとして存在する特異配列の少なくとも３つのフラグメントの濃度Ｃａ、ＣｇおよびＣｌについて、濃度比Ｃｌ／（Ｃａ＋Ｃｇ）が、十分な時間間隔で、好ましくは少なくとも１か月間隔で順次採取された２つの標本間で低下する場合、細菌性膣炎の発症が確認されるということに留意すべきである。
【００２６】
「膣炎の発症」とは、本明細書では、既に検出済みの膣炎の悪化、または、ある場合には、膣炎が出現するリスク、すなわち病的状態に至ることもあり得る膣内細菌叢の平衡失調もしくは異常であると理解される。
【００２７】
同様に、濃度比Ｃｌ／（Ｃａ＋Ｃｇ）が、十分な時間間隔で、好ましくは少なくとも１か月間隔で順次採取された２つの標本間で低下するかまたは増大しない場合は、細菌のＤＮＡ中に単一コピーとして存在する特異配列の濃度の関数として、進行中の治療の失敗が確認される。
【００２８】
より具体的には；
ａ）ステップ１）においてさらに、少なくともラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｅｉｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）およびラクトバチルス・イネルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ）を含むラクトバチルス属細菌を；
【００２９】
・前記ラクトバチルス属細菌の特異配列の濃度をさらに測定することと、前記ラクトバチルス属細菌の特異配列は前記ラクトバチルス属細菌のＤＮＡ中に単一コピーとして存在し、大きさは１５０ヌクレオチド未満であることと；
【００３０】
・一方では標本から抽出された前記ＤＮＡ中に含まれるラクトバチルス属細菌の特異配列、他方では前記ラクトバチルス属細菌の前記特異配列を追加として含む合成ＤＮＡフラグメントの試料中に含まれるラクトバチルス属細菌の特異配列を、ＰＣＲにより酵素的にさらに同時増幅することと、前記ラクトバチルス属細菌の前記特異配列を含む前記合成ＤＮＡフラグメントは定量用標準品としての役割を果たすことと；
【００３１】
・前記アトポビウム・バギナエ、ガードネレラ・バギナリスおよびラクトバチルス属細菌の前記特異配列、ならびにヒト細胞を含むすべての生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列各々のための増幅プライマーの配列とは異なる配列を備えた標識プローブを助力として、前記増幅フラグメントの検出および定量を実行することと；
【００３２】
によって定量すること、ならびに
ｂ）ステップ２）において、前記ラクトバチルス属細菌の特異的ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｌがさらに１０８コピー／ｍＬ以下、好ましくは１０７コピー／ｍＬ以下である場合に、細菌性膣炎が判定されること；
【００３３】
を特徴とする方法が創出される。
本発明によれば、ラクトバチルス属細菌の濃度は細菌性膣炎の存在を結論付けるには不十分であるが、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスの濃度を組み合わせた場合には補完または確証となる。
【００３４】
好ましくは、前記濃度が次の３つの条件：
ａ− アトポビウム・バギナエの特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍＬ以上であること；
【００３５】
ｂ− ガードネレラ・バギナリスの特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍＬ以上であること、および
ｃ− ラクトバチルス属細菌の特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｌが１０７コピー／ｍＬ以下であること；
【００３６】
を満たす場合に細菌性膣炎と判定される。
好都合には、細菌アトポビウム・バギナエ、ガードネレラ・バギナリス、および適用可能であればラクトバチルス属細菌の特異配列の前記ＤＮＡフラグメントと、同様に好ましくは細胞を含むあらゆるヒト生体標本中に存在するヒトＤＮＡフラグメントのＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより酵素的に増幅および定量することにより、前記濃度Ｃａ、ＣｇまたはＣｌを測定する。
【００３７】
好ましくは、前記細菌アトポビウム・バギナエ、ガードネレラ・バギナリス、および適用可能であればラクトバチルス属細菌の、前記特異配列は、大きさが７０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは９０〜１２０ヌクレオチドである。
【００３８】
さらに好ましくは、リアルタイムＰＣＲによる増幅反応および定量化反応は、被験標本中の、前記細菌の前記特異配列およびヒト細胞を含むあらゆる生体標本中に存在するヒト遺伝子の特異配列の各々に特異的な加水分解プローブを使用して実施される。
【００３９】
リアルタイムＰＣＲ技法は、順方向配列および逆方向配列のプライマーを用いる古典的ＰＣＲで構成され、いわゆる「加水分解」プローブを用いた、増幅遺伝子の量に比例する蛍光発光の計測に基づいた増幅産物の検出を含んでいる。この目的のために、前記プローブを、５’は蛍光発光体またはフルオロフォアで、３’は蛍光発光を妨害する物質で標識する。この妨害物質は、フルオロフォアと妨害物質とが互いに接近している時は放射された蛍光を吸収する。フルオロフォアと妨害物質とが離れると、蛍光発光は妨害物質に吸収されなくなる。Ｔａｑポリメラーゼは通過する際にプローブの加水分解を引き起こし、その結果溶液中にヌクレオチドおよびフルオロフォアの放出を引き起こす。このように蛍光発光は増幅数に比例することになる。リアルタイムＰＣＲの原理は、伸長ステップの際に複製されるＤＮＡ上にハイブリダイズしたプローブを加水分解するＴａｑポリメラーゼの能力に基づき、この加水分解により蛍光発光が可能となり、蛍光発光により定量が可能となる。第１の標的に対する２つのプライマーおよび１つのプローブ、ならびに他の標的に対する別の２つのプライマーおよびプローブを反応混合物中に導入することにより、同一の反応の間に２つの異なる標的を定量することもできる。前記２つのプローブは異なるフルオロフォアで標識する。
【００４０】
さらに好ましくは、ＤＮＡ定量の参照標準品としての役割を果たす大きな合成ＤＮＡフラグメントを使用し、前記大きな合成ＤＮＡフラグメントは、濃度定量の対象である前記細菌各々の前記特異配列と、ヒト細胞の前記ヒトＤＮＡ特異配列とを寄せ集めたものである。所定の核酸フラグメント上にいくつかの分子標的が存在することにより、所定の標本中の異なる標的を定量することが可能となり、かつ均一に同時定量することが可能となる；数種類の分子について同じ参照範囲を使用する定量により、様々なＰＣＲ反応の有効性を相互に比較し、経時的に相互に識別して、陽性対照に関連するバイアスを回避することができる。
【００４１】
「前記細菌の特異配列」とは、前記細菌のゲノムの配列であって他の生物のゲノム中には見られない配列とする。
「ＤＮＡフラグメント」とは、その配列を５’→３’方向で以下に記載するＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドであるものとする。
【００４２】
より具体的には、前記細菌の前記特異配列としては：
− アトポビウム・バギナエ細菌については：１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＹ７３８６５８．１）の２４８〜３３４位のフラグメント；
【００４３】
− ガードネレラ・バギナリス細菌については、シャペロンタンパク質６０ｋＤａのＣｐｎ６０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＦ２４０５７９．３）の９８１〜１０７２位のフラグメント、ならびに
【００４４】
− ラクトバチルス属細菌については、伸長因子をコードするｔｕｆ遺伝子中の、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・イネルス、およびラクトバチルス・アシドフィルスに共通の配列であってＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＹ５６２１９１．１の遺伝子の２５３〜３４３位の配列
【００４５】
が挙げられる。
さらに具体的には、前記細菌の前記特異配列は、プローブ配列（下線）とその前後のプライマー配列（太字）を含む以下の配列：
【００４６】
− アトポビウム・バギナエについては：
【００４７】
【化１】
− ガードネレラ・バギナリスについては：
【００４８】
【化２】
− ラクトバチルス属細菌については
【００４９】
【化３】
または該配列のアンチセンスプライマー用の逆方向かつ相補的な配列である。
好都合には、前記標本中、特に被験膣標本から得られたＤＮＡ中に存在するヒト細胞が、サンプリングの豊富度、ＤＮＡ抽出の質、およびＰＣＲ反応阻害剤が存在する可能性に関する対照として定量される。この目的のために、細胞を含むあらゆるヒト生体標本中に存在するヒト遺伝子のコピー数、具体的にはヒトアルブミン遺伝子のコピー数を定量する。このようにヒトアルブミン遺伝子の定量は、標本の品質および豊富度を証明するための内部対照としての役割を果たす。さらに、患者の追跡調査の際には、この定量は異なる時期に得られた２つの標本の間の正規化の手段である。その理由は、ヒト細胞１００万個あたりの微生物の数を計算することにより正確な標本間の比較を行うことができるからである。アルブミン遺伝子はヒト細胞中に２コピーだけ存在し、この配列のシグナルを計測することにより標本中の当初のヒト細胞数が定量される。試料５μｌ当たりの細胞数が５０個（細胞１０４個／ｍＬ）以下、またはアルブミンＤＮＡの量が１０２／５μＬ以下の場合は、その標本は量的に不十分であるため却下する。
【００５０】
標本の品質、輸送および保存状態が様々であるため、このように本発明には、信頼性の高い定量を伴って診断を体系化することを可能にする分子レベルの品質管理が含まれる。
細胞の定量はさらに、検出すべきＰＣＲ反応制限因子を無くすことを可能にする：標本を様々な希釈率でＰＣＲにより試験する時、検出されるアルブミンの量は、制限因子の存在下で希釈率を上げると増大するが、ＰＣＲ反応の制限因子の不存下で希釈率を上げると減少する。
【００５１】
より具体的には、前記試料中に含まれるヒトＤＮＡの定量が実施され、かつ前記大きなＤＮＡフラグメントは特異的アルブミン配列のような被験標本中のヒトＤＮＡ特異配列をさらに含む。
【００５２】
さらに具体的には、試験標本中の前記ヒトＤＮＡ特異配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ１２５２３．１のヒトアルブミン遺伝子のエキソン１２の１６２８３‐１６４２３位のフラグメントであって、次の配列または相補配列：
【００５３】
【化４】
好ましくは、配列番号１７のような、プライマーに対応する配列（太字の配列）およびプローブ配列（下線を付した配列）以外の場所に切断部位、特にＸｈｏＩ部位（削除された括弧内の配列）を挿入することによって修飾された配列番号１のフラグメントを含む。
【００５４】
ここでも好都合には、増幅反応および定量反応は、前記被験細菌、および適用可能な場合には特異的ヒトアルブミン配列のような試験標本中のヒトＤＮＡの特異配列、のそれぞれに特異的な加水分解プライマーおよびプローブのセットを使用することにより行われ、前記特異配列は、ＰＣＲによる前記特異配列の増幅反応におけるプライマーとしての役割を果たすことができる配列に囲まれたプローブ配列を含む。
【００５５】
「プローブ」とは、本明細書において、オリゴヌクレオチドであって、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長であり、前記特異配列と特異的にハイブリダイズし、従ってＰＣＲ反応に関連した蛍光の増大を計測することにより特異的に検出および定量することが可能なものであると解される。
【００５６】
該プローブによって、シグナル強度を定量標準品のシグナル強度と比較することにより、増幅された特異的ＤＮＡを検出および定量することができる。
「プライマー」とは、本明細書において、好ましくは１５〜２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってＤＮＡポリメラーゼがＰＣＲ反応において増幅する配列の両端のうちの一方と特異的にハイブリダイズするものであると解される。
【００５７】
より具体的には、プライマーとプローブとのセットは、適用可能な場合には本願に添付された配列表の以下の配列すなわち：
− アトポビウム・バギナエ用として：
プライマー５’：配列番号５＝５’‐ＣＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＣＣＴＧＡＴＡＣＣ‐３’
【００５８】
プライマー３’：配列番号６＝５’‐ＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＣＡＴＴＴＣＡ‐３’
プローブ：配列番号７＝５’‐ＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＡ‐３’
【００５９】
− ガードネレラ・バギナリス用として：
プライマー５’：配列番号８＝５’‐ＣＧＣＡＴＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＧ‐３’
【００６０】
プライマー３’：配列番号９＝５’‐ＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＣＴ‐３’
プローブ：配列番号１０＝５’‐ＴＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣ‐３’
【００６１】
− ラクトバチルス属細菌用として：
プライマー５’：配列番号１１＝５’‐ＴＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＧ‐３’
【００６２】
プライマー３’：配列番号１２＝５’‐ＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡ‐３’
プローブ：配列番号１３＝５’‐ＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＣＡ‐３’
【００６３】
− ヒトアルブミン用として：
プライマー５’：配列番号１４＝５’‐ＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧＣＴＧＴ‐３’
【００６４】
プライマー３’：配列番号１５＝３’‐ＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣ‐３’
プローブ：配列番号１６＝５’‐ＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＣＣ‐３’
【００６５】
またはこれらの相補配列から選択されて使用される。
好ましくは、定量化のための参照標準試料のＤＮＡを構成する前記大きな合成ＤＮＡフラグメントはプラスミドに挿入される。
【００６６】
これらのＤＮＡ定量法において、陽性反応が、定量用標準品または陽性対照として使用される組換えプラスミドの混入によるものかどうかを知ることは重要である。この問題を解決するために、該合成分子標的のうち少なくとも１つに制限酵素切断部位を導入すると好都合である。この部位は天然の配列には存在しない。従って、増幅されたフラグメントを酵素的に切断してアガロースゲルで分析することによって、または制限酵素切断部位を特異的に認識するリアルタイムＰＣＲプローブを使用することによって、任意の混入プラスミドの存在を検出することができる。
【００６７】
したがって、より具体的には、下記ステップを実行することが可能であり、該ステップは：
１）前記試験標本から抽出されたＤＮＡ中および標準参照試料のＤＮＡ中の、少なくとも１つの前記物質の少なくとも１つの前記特異配列のＤＮＡの、ＰＣＲによる酵素的増幅反応を行うステップであって、少なくとも前記本来の特異配列および前記修飾特異配列の両方を増幅することができる少なくとも１セットのプライマーを助力とするステップ；
【００６８】
２）前記試験標本から抽出されたＤＮＡ増幅物が前記特異配列を含むかどうかを検証するステップ、ならびに
３）標準参照試料由来のＤＮＡによる前記試験標本への混入から生じるあらゆる偽陽性を、下記ステップのうち少なくとも１つによって検出するステップである：
【００６９】
３ａ）得られたＰＣＲ産物を切断部位に対応する酵素で酵素消化し、該消化産物をアガロースゲル上で制限酵素によって消化されていないＰＣＲ産物と比較することにより分析するステップ。
【００７０】
消化されるフラグメントが対照プラスミドに挿入された分子標的の増幅に由来する場合は、該フラグメントは制限酵素切断部位を含み、未消化のフラグメントより小さくなる。
３ｂ）分子標的のうちの１つについての順方向および逆方向プライマーと、制限酵素切断部位を含む前記外因性の配列の特異的プローブとを用いてリアルタイムＰＣＲによる反応を実施するステップ。
【００７１】
対照プラスミドに由来し、かつ外因性の配列を含む１種類のフラグメントのみを増幅することができる。
より具体的には、試験標本中の前記ヒトＤＮＡ特異配列を使用し、該特異配列は、ヒトアルブミン遺伝子ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ１２５２３．１のエキソン１２の１６２８３‐１６４２３位のフラグメントを、プライマー（太字の配列）およびプローブ配列（下線を付した配列）に対応する配列以外の場所に切断部位（特にＸｈｏＩ部位）を挿入することによって修飾した、以下の配列：
【００７２】
【化５】
（プライマー（太字の配列）およびプローブ配列（下線を付した配列）に対応する配列以外の場所にＸｈｏＩ部位（括弧内）を含んでいる）を含む。
より好都合には、ＰＣＲによる複数の酵素的増幅反応を、前記細菌の前記特異配列それぞれを同一の大きな標準合成ＤＮＡフラグメントとともに用いて同時にまたは別々に、前記細菌各々の様々な前記特異配列各々の特異的プライマーの複数の異なるセットを助力として実施することによって、様々なプライマーの配列が前記様々な細菌の間で互いに交わることはなく、また同じプロトコール（特に同じハイブリダイゼーション温度）で行なわれる酵素的増幅反応において前記プライマーを使用することができる。
【００７３】
いくつかのフラグメント、特に異なる起源のフラグメントを組み合わせた大きなキメラＤＮＡフラグメントを構築するための様々な方法が知られており、特に仏国特許出願第２８８２０６３号明細書に記載されている方法では、第１の大きな二本鎖構造の合成ＤＮＡフラグメントが、耐熱ポリメラーゼ酵素を使用した酵素的増幅による複数のｎ個のオリゴヌクレオチドの二量体化で本質的に構成される、複数のｎ個の小さな連続的な第２の合成ＤＮＡフラグメントが特定の順序をなした鎖を含んでなる所定の配列として調製され、前記酵素的増幅は：
【００７４】
− 外生のプライマーを用いない、所定の配列を備えた一連のｎ個のオリゴヌクレオチドの前記ポリメラーゼ酵素存在下でのＰＣＲによる核酸増幅反応で構成される第１ステップであって、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションとその後の得られた複合体の伸長を可能にする温度条件下の一連のサイクルを含み、前記複合体は前記オリゴヌクレオチドの末端と末端とが所与の順序に配置されるように設計され、前記オリゴヌクレオチドの配列は、様々な前記第２の合成フラグメントの配列のセンス配列およびアンチセンス配列に連続的または交互に対応しており、前記オリゴヌクレオチドはそれぞれ、適用可能な場合には該オリゴヌクレオチドの５’領域および３’領域に、後続および先行するオリゴヌクレオチドの５’領域および３’領域と相補的な配列を含むことを特徴とするステップと；
【００７５】
− 調製すべき第１の大きな合成フラグメントの前記順方向の鎖の５’末端および３’末端に特異的なプライマーの助力を用いる第２の増幅ステップであって、前記第１の大きなフラグメントの同一コピーの生産を可能にするステップと
【００７６】
を含む。
従って、この技法は、プライマーの相互ハイブリダイゼーション（プライマーの二量体化）で構成されるＰＣＲアーチファクトを利用しかつ使いこなすことに基づく。この現象は、ＰＣＲ条件（特に温度）が不適当で、プライマーが部分的に相補的な配列を含む場合に観察される。
【００７７】
このように該構築技法は、標的配列から、順方向のオリゴヌクレオチド配列（「センス」）と逆方向（または「アンチセンス」）のオリゴヌクレオチド配列とが交互になっているオリゴヌクレオチド配列を選択することから成る。これらのオリゴヌクレオチドの末端と末端との配置を可能にするために、あるオリゴヌクレオチド配列の３’に、次のオリゴヌクレオチドの最初のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を導入するように注意する。これらのオリゴヌクレオチドはその相補的な部分によってハイブリダイズすることになり、例えばＴａｑポリメラーゼのポリメラーゼ活性により５’から３’への合成が行われて二本鎖のフラグメントが得られる。最終的な（組み立てられた）フラグメントは、所望の第１の大きな合成二本鎖ＤＮＡフラグメントの末端の配列に対応する順方向プライマーおよび逆方向プライマーの対を使用して、ＰＣＲによって合成される。
【００７８】
上述のように、前記大きな合成ＤＮＡフラグメントをプラスミドに好都合なように挿入すると好都合である。
この一般的な合成ヌクレオチドフラグメント構築技法により、対象とするいくつかの分子標的を連続的に配置することが可能となる。これは簡単、迅速、かつ信頼できる方法であり、煩雑かつ高価な設備を必要としない。
【００７９】
本発明はさらに、本発明に従って膣炎の診断方法および追跡調査方法を実行するために使用される診断キットに関し、該キットは：
− 既知濃度の標準参照ＤＮＡ試料であって、上記に定義された前記細菌それぞれの前記特異配列を、好ましくは１つの上記に定義された前記ヒトＤＮＡ特異配列を、より好ましくは上記に定義された前記細菌それぞれの前記特異配列と好ましくは１つの上記に定義されたヒトＤＮＡ特異配列とを含む１つの前記大きな合成ＤＮＡフラグメントを、含む試料、同様に
【００８０】
− 前記細菌に特異的な前記修飾合成ＤＮＡフラグメントに特異的なプライマーのセット、およびより好ましくは上記に定義されるようなプローブ、ならびに
− ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を実行するための試薬
を含むことを特徴とする。
本発明のその他の特徴は、配列表および図１〜４を引用した以下の様々な実施形態の詳細な説明から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義され、本発明のリアルタイムＰＣＲによって定量された、２０例の細菌性膣炎の微生物負荷の分析を示す図。
【図１Ｂ】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義され、本発明のリアルタイムＰＣＲによって定量された、１６７例の正常細菌叢の微生物負荷の分析を示す図。
【図２】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義され、本発明のリアルタイムＰＣＲによって定量された、４４例の中間的細菌叢の微生物負荷の分析を示す図。
【図３】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義された４４例の中間的細菌叢の群から、本発明に従って分子レベルの基準により同定され、定量がなされた２５例の細菌性膣炎について示す図。
【図４】Ｎｕｇｅｎｔスコアによって同定された４４例の中間的細菌叢の群に細菌性膣炎の分子レベルの基準が適用された後で、本発明に従って分子レベルの基準により同定され、定量がなされた１９例の正常細菌叢について示す図。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
Ｉ．患者、材料および方法
Ｉ．１ 膣標本の入手および輸送
妊娠が判明した妊婦をマルセイユのラ・コンセプション（Ｌａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ）病院で募集した。インフォームド・コンセントを参加の前提条件とした。標本を、消毒薬を用いずに無潤滑の滅菌膣鏡を用いて後膣円蓋から採取した。各々の女性から４つの試料を採取した：乾燥したチューブ内に入った綿棒（イタリア国ブレーシア所在のコパン・イノベーション（Ｃｏｐａｎ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）（登録商標））による２つの試料、および細胞採取用ブラシ（Ｓｃｒｉｎｅｔ（登録商標）５．５ｍｍ、フランス国パリ所在のシーシーディーインターナショナル（Ｃ．Ｃ．Ｄ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））による２つの試料である。一般的な綿棒のうち一方はすぐに細菌の培養に使用した。他方の綿棒は、生殖器マイコプラズマ（Ｍ．ホミニス（Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓ）およびＭ．ウレアリチカム（Ｍ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ））について調べるために、特別な輸送培地（Ｒ１尿素‐アルギニンＬＹＯ２、フランス国マーシーレトワール所在のビオメリュー社（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ ＳＡ））の中に入れた。細胞採取用ブラシのうち一方はスライド上に塗抹してグラム染色するために使用した。分子増幅による定量用のＤＮＡを抽出するための他方の細胞採取用ブラシは、５００μＬのＭＥＭ輸送培地（最少必須培地、米国カリフォルニア州カールスバード所在のインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に入れて運んだ。これは実験室に到着した時から使用時まで−８０℃で冷凍した。
【００８３】
Ｉ．２ 細菌学的分析
Ｉ．２．１ 採取直後の状態
光学顕微鏡下（１０×対物レンズ）にてスライドとカバーグラスとの間で採取後すぐに検査することにより、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）について調べた。
【００８４】
Ｉ．２ Ｎｕｇｅｎｔスコア：
Ｉ．２．２．１ グラム染色：
スライドグラスに標本を塗抹して乾燥させた後、グラム染色は：シュウ酸クリスタルバイオレットで染色（１分）、ルゴール液で染色（１分）、アルコール／アセトンを用いた脱色およびサフラニン溶液（ビオメリュー）を用いた呈色、という構成とした。各ステップの後で、水中ですすぎを行った。グラム染色により、３種の細菌形態型の半定量的評価からＮｕｇｅｎｔスコアを定めることが可能となる（表１）。このスコアに従って、３種類の膣内細菌叢、すなわち：スコアが０〜３の正常細菌叢（ＮＦ）、スコアが４〜６の中間的細菌叢（ＩＦ）、およびスコアが７以上のＢＶ、が同定される。
【００８５】
Ｉ．２．２．２ 培養
膣標本を、３種類の培地、すなわち：コロンビアＡＮＣ寒天＋５％ヒツジ血液（ビオメリュー）、チョコレートポリバイテックス（Ｃｈｏｃｏｌａｔｅ Ｐｏｌｙ Ｖｉｔｅｘ）ＰＶＸ寒天（ビオメリュー）、ＣＨＯＣ ＶＣＡＴ寒天（ビオメリュー）に播種して３７℃で４８時間インキュベートした。マイコプラズマを検出するために、標本を特異的キット（尿素‐アルギニンＬＹＯ２、ビオメリュー）に播種して３７℃でインキュベートし、嫌気培養培地（ビオメリュー）に接種して４８時間培養した。
【００８６】
Ｉ．３． リアルタイムＰＣＲによる検出および定量
Ｉ．３．１ ＤＮＡの抽出
ＤＮＡの抽出は、ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキット（フランス国クルタブフ所在のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（登録商標））を用いて実施した。プロトコールは以下のように変更した。すなわち：２００μＬの溶解バッファーおよび２０μＬのプロテイナーゼＫあたり２００μＬの試料を５６℃で１２時間インキュベートした。溶解物を製造業者の推奨に従って処理した。ＤＮＡを１００μＬの溶出バッファー中に溶出させた後、−２０℃で保存した。
【００８７】
Ｉ．３．２ リアルタイムＰＣＲの開発
Ｉ．３．２．１ 分子標的の選択
ＧｅｎＢａｎｋのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＧｅｎＢａｎｋＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）に供託された文献および配列データの分析から、標的微生物それぞれについて利用可能な配列に関する情報が得られた。選択された微生物それぞれの標的配列のプローブおよびフラグメントの特異性を、ＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で特異性に関してテストした。
【００８８】
本発明者らは、その役割が不確かな病原体を含むすべての潜在的な膣炎病原体から標的を選択した。驚くべきことに、最も重要な標的のアトポビウム・バギナエは決定的な病原体であるとは考えられていなかった。
【００８９】
選択された標的は、Ｇ．バギナリスおよびＭ．クルティシイについては６０ＫＤａシャペロンタンパク質（Ｃｐｎ６０）をコードする遺伝子配列上に、Ｍ．ムリエリスおよびＡ．バギナエについては１６Ｓ ＲＮＡ、Ｍ．ホミニスについてはｆｔｓ Ｙ配列、Ｕ．ウレアリチクムについてはウレアーゼ配列、ならびにＣ．アルビカンスについてはトポイソメラーゼＩＩＩ遺伝子の遺伝子配列上に位置づけられた。ラクトバチルス属細菌の標的については、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・イネルス、およびラクトバチルス・アシドフィルスに共通の配列が選択され；該配列は伸長因子ｔｕ（ｔｕｆ）をコードする遺伝子上に位置している。試験標本中のＤＮＡの存在および量を証明するために、ヒトアルブミン遺伝子のエキソン１２の中の配列を選択した。
【００９０】
Ｉ．３．２．２ プローブおよびプライマーの選択
調べた微生物（ラクトバチルス属細菌、Ｇ．バギナリス、Ｍ．クルティシイ、Ｍ．ムリエリス、Ｕ．ウレアリチクム、Ｍ．ホミニス、Ａ．バギナエ、Ｃ．アルビカンス）およびヒトアルブミンそれぞれについて、Ｐｒｉｍｅｒ３（登録商標）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｃｏｄｅ．ｈｔｍｌ）を使用して上記に定義した標的配列からプローブおよびセンス＋アンチセンスプライマー対を選択した。プライマーおよびプローブは、以下の付録１に記載されている。プライマーおよびプローブそれぞれについて、特異性を保証するためにＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで分析した（付録１）。
【００９１】
リアルタイムの二重認識ＰＣＲ（二重ＰＣＲ）を実施するために、認識する微生物の対を適宜選択した：プローブのうち一方をＦＡＭで、他方をＶＩＣで標識した。こうして４つのＰＣＲ対を規定した。
【００９２】
― ラクトバチルス属細菌（ＦＡＭ）およびＧ．バギナリス（ＶＩＣ）
― Ｍ．クルティシイ（ＦＡＭ）およびＭ．ムリエリス（ＶＩＣ）
― Ｕ．ウレアリチクム（ＶＩＣ）およびヒトアルブミン（ＦＡＭ）
― Ａ．バギナエ（ＶＩＣ）およびＣ．アルビカンス（ＦＡＭ）
― マイコプラズマ・ホミニス（ＦＡＭ）は単独で定量することとした。
プライマーはユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）（登録商標）（ベルギー国スラン所在）、およびプローブはアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（英国チェシア州ウォリントン所在）によって合成された。
【００９３】
Ｉ．３．２．３ 様々な被験菌株についての特異性試験
プライマーおよびプローブの特異性を試験するために、参照用細菌株（Ｌ．アシドフィルス ＣＩＰ１０４４６４、Ａ．バギナエ ＣＩＰ１０６４３１、Ｇ．バギナリス ＣＩＰ１０３６６０、Ｍ．クルティシイ亜種ホルメシイ ＡＴＣＣ３５２４２、Ｍ．ムリエリス ＡＴＣＣ３５２３９、Ｃ．アルビカンス ＵＭＩＰ１１８０．７９、Ｕ．ウレアリチクム ＣＩＰ１０３７５５およびＭ．ホミニス ＣＩＰ１０３７１５）から抽出したＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲの開発（プライマーおよびプローブの相対量、特異性、交差反応の測定）のために３種の希釈率（１：１０、１：１００および１：１０００）で使用した。それぞれの菌株を、プライマーおよび特異的プローブを用いて試験したが、他の７種の微生物のプローブおよびプライマー、ならびにヒトアルブミンのプローブおよびプライマーも用いて試験した。
【００９４】
Ｉ．３．２．４ 二重ＰＣＲの開発
ＣＴ値（サイクル閾値）を計測した。ＣＴは、反応のベースラインと、増幅を表わす対数曲線とが交差する点である。このＣＴ値は増幅が始まるのに必要な増幅サイクルの数に相当する。ＣＴ値は定量すべき核産物の濃度と関係し：濃度が高いほど、ＣＴは低い。
【００９５】
単一および二重の蛍光を用いて最適な増幅を得るために必要なプライマーおよびプローブの量を、等モル条件下の８つの参照用菌株由来の細菌ＤＮＡ混合物について、また純粋な菌株を用いて、いずれの場合においても終濃度１：１０について増幅反応を試験することにより規定する。使用する実験条件は、ＣＴ値が単一の蛍光を用いて得られるＣＴ値と同一である条件とした。
【００９６】
Ｉ．３．２．５ 未試験の４０株に対する特異性試験：
８つの参照用菌株以外の４０種の異なる細菌株（付録）に由来するゲノムＤＮＡ試料を１：１０希釈で試験した。これらすべての試験について、各増幅反応とともに、ＤＮＡを含まない陰性対照または陽性対照（８つの参照用菌株由来のＤＮＡの混合）を注意深く導入した。特異性を、４つのリアルタイムＰＣＲ対ならびにマイコプラズマ・ホミニスを用いて試験した。
【００９７】
Ｉ．４． プラスミドの構築
仏国特許出願第２ ８８２ ０６３号明細書に記載の方法を使用した。
Ｉ．４．１ 定量用ハイブリッド・フラグメント配列：
定量用ハイブリッド・フラグメントのヌクレオチド配列を、８種の微生物およびヒトアルブミンのリアルタイムＰＣＲの標的配列を並べることにより得た。本発明者らは、以下の付録２に記載の、９３１塩基対のハイブリッド・フラグメントを得た。
【００９８】
Ｉ．４．２ 定量用ハイブリッド・フラグメントの構築におけるオリゴヌクレオチド配列
上記ハイブリッド・ヌクレオチドフラグメントの配列を、付録３に記載の６つの連続するオリゴヌクレオチドフラグメントに分割した。隣接するオリゴヌクレオチドの連続性を保証するために、上流のオリゴヌクレオチドの３’末端の追加の１０ヌクレオチドを、下流のオリゴヌクレオチドの５’末端に付加した。６つのオリゴヌクレオチド配列の長さは１５５〜１７２ヌクレオチドの範囲であった。これらの連続するオリゴヌクレオチドは、順方向および逆方向が交互になっている配列とした。したがって、オリゴヌクレオチド１、３および５は順方向配列の形で使用し、オリゴヌクレオチド２、４および６は逆方向配列の形で使用した。配列が定量用ハイブリッド・フラグメントの５’および３’の２０ヌクレオチドの配列に相当するいわゆる「構築用」プライマー（センスおよびアンチセンス）を合成することとした。オリゴヌクレオチドおよびプライマーはユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）（登録商標）により合成された。
【００９９】
Ｉ．４．３ ハイブリッド・フラグメントの構築：
２つの隣接したオリゴヌクレオチドの末端が相補的であるため、増幅反応によって二本鎖ヌクレオチドフラグメントが構築された。段階的な２回のＰＣＲが必要であった。
【０１００】
Ｉ．４．３．１ １回目のＰＣＲ：
ここでは、オリゴヌクレオチドの末端のハイブリダイゼーションと、Ｔａｑポリメラーゼの活性に適合しうる場合には部分的な伸長とが可能であった。６種のオリゴヌクレオチドを等モル条件（０．２ｍＭｏｌ）で、１×ポリメラーゼバッファーＭｇＣｌ２（１．５ｍＭｏｌ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭｏｌ）、０．２μＬのＲｏｃｈｅ Ｔａｑ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）（登録商標））（５ＩＵ／μＬ）とともに、５０μＬの反応体積中に導入した。増幅プログラムは：９５℃で２分と、続いて９４℃で３０秒（変性）、３７℃で１分（ハイブリダイゼーション）、７２℃で１分３０秒（伸長）のサイクルを４０サイクルとした。
【０１０１】
Ｉ．４．３．２ ２回目のＰＣＲ：
ここでは、期待される末端間が結合したオリゴヌクレオチド群を含むＰＣＲフラグメントが得られる（付録４）。１回目のＰＣＲから得られた増幅産物１μＬを、次の反応混合物すなわち：１×Ｈｏｔｓｔａｒポリメラーゼバッファー（キアゲン（登録商標））ＭｇＣｌ２（１．５ｍＭｏｌ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭｏｌ）、５ＩＵ／μＬのＨｏｔｓｔａｒ（キアゲン（登録商標））を０．２μＬ、および０．２ｍＭｏｌの構築用のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー：に添加した。ＰＣＲプログラムは：９５℃で１５分と、続いて９５℃で３０秒、５８℃で４５秒、７２℃で２分のサイクルを４０サイクルと、７２℃で５分とした。得られたＰＣＲフラグメントを、０．５×ＴＢＥバッファー中の１．５％ＴＢＥアガロースゲルで分析した。フラグメントの長さが期待の長さである場合に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット２５０ＰＣＲ Ｑｉａｋｉｔ（キアゲン（登録商標））を使用して該フラグメントを精製した。
【０１０２】
Ｉ．４．３．３ 挿入物のクローニング
先述のようにして得られたフラグメント２μＬを、５μＬのリガーゼバッファー、１μＬのリガーゼ、および１μＬの直線化した脱リン酸化プラスミドＰＧＥＭ（ｐＧＥＭ（登録商標）‐Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ２キット、米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（登録商標））を含むライゲーション反応混合物に導入した。最終体積は１０μＬであった。ライゲーション反応産物を１５℃で一晩インキュベートした。７μＬのライゲーション反応産物を、２０分間氷中に置いたコンピテントセル（大腸菌ＪＭ１０９）５０μＬと混合し、４２℃で１分間インキュベートした。９５０μＬのＬＢブロス（ＵＳＢ（登録商標）、米国オハイオ州クリーヴランド所在）を添加し、３７℃で１時間３０分インキュベートした後、この培地５００μＬおよび２５０μＬを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天（ＵＳＢ（登録商標））の入った２つのペトリディッシュに塗抹した。ディッシュを３７℃で一晩インキュベートした。組換え型のコロニーを、５０μＬの滅菌蒸留水中と、ＬＢ寒天アンピシリンのペトリディッシュ上との両方に播種した。
【０１０３】
この組換え大腸菌コロニーをＰＣＲ分析のためにサンプリングした：蒸留水中の細菌懸濁液５μｌ、Ｍ１３プライマー対（１０ｐｍ／μＬ）、および先述のＰＣＲ反応媒体。ＰＣＲプログラムは２回目の構築ステップに使用したプログラムと同一とした。得られたＰＣＲ産物を、０．５×ＴＢＥバッファー中の１．５％アガロースゲルで分析した。期待される大きさのフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット２５０Ｑｉａｋｉｔ（キアゲン（登録商標））を使用して精製した。その後、Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ１．１サイクルシーケンシングキット（アプライド・バイオシステムズ（登録商標）、英国ウォリントン所在）、クロマトグラフィで分離されたセンスおよびアンチセンスプライマー３．２ｐｍｏｌ／μＬを使用して、ＡＢＩ ＰＲＩＭ ３１００シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ（登録商標））で配列決定した。得られた配列を、自動アセンブラプログラムおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（アプライド・バイオシステムズ（登録商標））プログラムを使用して、期待されるフラグメント配列と比較した。組換え体クローンのうち、期待の配列に一致する１クローンを、１００ｍＬのＬＢブロス・アンピシリン中で大量に生産し、Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉキット（キアゲン（登録商標））のプロトコールに従って精製することとした。その後、精製プラスミドを−２０℃で保存した。選択された組換え菌株は−８０℃で冷凍した。
【０１０４】
Ｉ．４．３．４ プラスミド範囲の取得
２６０ｎｍで光学密度を計測することにより濃度を測定した。例えば、初期溶液が０．３８であるとする。１ユニットのＯＤは５０μＬ／ｍＬに相当する：初期溶液中のプラスミドは０．３８×５０＝１９μｇ／ｍＬ＝１９×１０−６ｇ／ｍＬである。プラスミドの大きさ＝ｐＧＥＭ（登録商標）‐Ｔ Ｅａｓｙの大きさ＋フラグメントの大きさ＝３０１５＋９３１＝４３３４ｂｐ、すなわち塩基数８６６８。１つのヌクレオチドのモル質量は３３０Ｄａ（ｇ／ｍｏｌ）である。プラスミドのモル質量は８６６８×３３０＝２．８６０×１０６ｇ／ｍｏｌとなる。プラスミドの濃度は、ｍｏｌ／ｍＬでは、１９×１０−６／２．８６０×１０６＝６．６４×１０−１２ｍｏｌ／ｍＬとなる。アボガドロ数を掛けて、溶液１ｍＬあたりのプラスミドコピー数、すなわち：６．６４×１０−１２×６．０２３×１０２３＝４０×１０１１コピー／ｍＬすなわち２×１０１０コピー／５μＬを得た。初期プラスミド溶液の最初の希釈を１：２５００とすることにより、濃度をプラスミド範囲の第１段階、すなわち１０７コピー／５μＬのプラスミド溶液に調節することができた。１０段階の系列希釈により、連続的な段階の範囲を作成することができた（溶液５μＬ当たり１０７コピー〜１コピー）。
【０１０５】
Ｉ．５． 標本の分析
Ｉ．５．１ 定量的リアルタイムＰＣＲ
定量化反応は、膣標本由来ＤＮＡ抽出物についてのリアルタイムＰＣＲによって行った。各反応プレートに下記すなわち：４つの陰性対照（ＮＴＣ）、較正用プラスミド範囲（１ウェルあたり１０７〜１コピー）、ならびに２４例の試験標本を、未希釈で、および阻害剤について調べるために１：１０と１：１００とに希釈して、投入した。陰性対照およびプラスミド範囲のポイントは２連として試験した。８種の微生物およびヒトアルブミンの増幅および定量について、４枚のＰＣＲプレートは二重の蛍光を用いて、１枚は単一の蛍光を用いて実施した。反応混合物の調製については、ＴａｑポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼバッファー（Ｈｏｔｓｔａｒ）を組み合わせる２×反応混合物、ｄＮＴＰ、ならびにｄＵＴＰを含むキットＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲキット（キアゲン（登録商標））を使用した。この反応混合物に、付録６に記載の実験条件による単一蛍光または二重蛍光ＰＣＲに必要なセンスおよびアンチセンスプローブを、希釈した試験標本または未希釈の試験標本と共に添加した：プラスミド範囲のポイントには５μＬおよび０．２５μＬのＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、１００ユニット、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、フランス国リヨン所在）を添加して、最終反応体積を２５μＬとした。ＰＣＲ反応はストラタジーン（登録商標）のＭＸ ３０００Ｐ（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在）で実施した。増幅プログラムは下記すなわち：５０℃で２分、９５℃で１５分、続いて９５℃で３０秒間の変性とその後の６０℃で１分間のハイブリダイゼーションおよび伸長の相とから成るＰＣＲサイクルを４５サイクルとした。
【０１０６】
Ｉ．５．２ 細菌負荷の算出
個々の膣標本および各微生物について、標本を確実に比較できるように、細菌負荷を以下のように定義した。ＤＮＡ抽出物５μＬあたりの各微生物由来のＤＮＡコピー数の定量については、初期標本１ｍＬあたりの細菌数として報告した。ＤＮＡ溶出体積（１００μＬ）、初期標本あたりの輸送培地の体積（２００μＬ）、および定量される遺伝子が単一遺伝子であるという事実、を考慮に入れなければならない。各微生物についてＤＮＡ抽出物５μＬあたりのコピー数として得られた値に１０２を掛けて標本１ｍｌ当たりの細菌数としての濃度を得て、次に、試料２００μＬから抽出されたＤＮＡの溶出体積１００μＬを引き出した。
【０１０７】
Ｉ．５．３ 統計解析
リアルタイムＰＣＲによる細菌定量データの統計解析には、有意水準ｐ＜０．０５のウィルコクソン検定およびマン・ホイットニーの検定を用いた。統計解析については、正の閾値より下のものを含むすべての定量値を考慮に入れた。ゼロに匹敵する定量値については、分析した全標本の最低濃度をその値と考えた。ウィルコクソンの統計的検定は、各細菌叢群内での各微生物の分布について述べるために適用した。マン・ホイットニーの検定は、ＢＶ群およびＮＦ群における８つの微生物それぞれの定量値を比較するために適用した。ＢＶの分子レベルの基準について調べるために、各々の細菌定量の閾値（１０３／ｍＬ〜１０９／ｍＬ）を、先にＮｕｇｅｎｔスコアで定義されたＮＦおよびＢＶの閾値による同定に従って計算された感度、特異性、ならびに陽性的中率および陰性的中率について検討した。単独でも組み合わせにおいても、最良の感度および特異性を有する定量閾値を、分子レベルの基準としてＢＶの同定に使用した。
【０１０８】
ＩＩ．結果
ＩＩ．１．集団についての説明
２００５年６月から２００６年４月までに、１８〜４９歳（平均年齢２８．９±６．２）の２０４名の妊婦が参加した。種族的出身は、北アフリカ（４３％）、ヨーロッパ（４２％）、南アフリカ（１４％）およびその他（１％）であった。各女性から１つの膣標本を採取した。標本の７２パーセントは第３妊娠三半期、２０％は第２妊娠三半期、および８％は第１妊娠三半期に採取されたものであった。２１名の女性が細菌学的追跡調査を受け、２〜４例の標本が採取された。従って、合計２３１例の標本を分析した。
【０１０９】
ＩＩ．２．細菌学上の結果
ＩＩ．２．１ グラム染色およびＮｕｇｅｎｔスコアの決定
２０４名の女性に由来する２３１件の膣標本から、Ｎｕｇｅｎｔスコアにより、１６７例のＮＦ、４４例のＩＦ、および２０例のＢＶが同定された。２０４名の女性それぞれの最初の膣標本における膣内細菌叢の異常の頻度は、ＮＦが７１％（１４５例）、ＩＦが１９％（３９例）、ＢＶが１０％（２０例）であった。ＢＶの女性の半分が症候性であった。最も頻繁に観察された症状は大量の膣帯下であった。
【０１１０】
ＩＩ．２．２ 培養および採取直後の状態
培養により、Ｇ．バギナリス、Ｃ．アルビカンス、Ｍ．ホミニス、Ｕ．ウレアリチクムおよびストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｔｉａｅ）を分離することができた（表１）。調べたいずれの膣標本も直接的な検査では膣トリコモナス（Ｔ． ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を示さなかった。
【０１１１】
ＩＩ．３．分子生物学上の結果
ＩＩ．３．１ リアルタイムＰＣＲの展開
単一蛍光および二重蛍光のＰＣＲを進行させると、交差反応はなく、競合は伴わなかった。純粋な細菌株およびプラスミド範囲を使用する単一蛍光および二重蛍光で、同様のＣＴ値の結果が得られた。
【０１１２】
最適の増幅を得るために必要なプライマーおよびプローブの最適量を、付録５に示す。
ＩＩ．３．２ 分子生物学による定量技法の評価
各標本の細菌の定量について、プラスミドの希釈範囲を設けた。各増幅反応について、プラスミド範囲にある８ポイント（５μＬ当たり１０７コピー〜１コピー）を試験した。該範囲の１０７コピーのポイントが、始めにＣＴ値約１７と同定された。該範囲の１コピーのポイントについては、後にＣＴ値３７で検出された。範囲内のすべてのポイントについて、増幅反応は直線的であった。グラフで表すと傾きが−３．２〜−３．５の直線である。この直線性は、１：１０、１：１００および１：１０００に希釈した純粋な菌株の試験により確認された。検討した微生物の種類が何であれ、正の閾値は１０コピー（または細菌１０３個／ｍＬ）以上と定義された（表２）。統計的には、「１コピー」のポイントの増幅は７５％で生じるのに対し、「１０コピー」のポイントについての増幅は１００％である。それぞれの増幅用プレート内では、各標本を、未希釈の溶液、ならびに１０分の１希釈および１００分の１希釈として試験した。再現性よく、１０分の１希釈が３ＣＴの増大に相当するので、増幅産物の検出は希釈段階に従っていた。細菌負荷の算出には純粋な溶液だけを考慮した。各標本について、リアルタイムＰＣＲでヒトアルブミンを試験した。得られた結果は、２３１例の試料のセットについて均質であった。ＣＴ値は１９〜２２（すなわち抽出されたＤＮＡ５μＬあたり１０５〜１０６コピーのアルブミンＤＮＡ）に分布した。いずれの標本も分析から除外されなかった。
【０１１３】
ＩＩ．３．３ データ分析
ＩＩ．３．３．１ 細菌性膣炎の分子レベルでの説明
Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスの平均濃度はそれぞれ１．１×１０９／ｍＬおよび１．２×１０９／ｍＬであり、ウィルコクソン検定では統計的有意差はなかった（ｐ＝０．３７５５）。これらの２種の細菌は、他の微生物の平均濃度が統計的に低かった（ｐ＝０．０００１）のに比べて高濃度であった（図１Ａおよび３）。
【０１１４】
ＩＩ．３．３．２ 細菌性膣炎および正常細菌叢の分子レベルの比較
ラクトバチルス属細菌の平均濃度は、細菌性膣炎（平均濃度３×１０３／ｍＬ）においてＮＦ（平均濃度５．７×１０７／ｍＬ）より有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。他方、Ａ．バギナエ、Ｇ．バギナリス、Ｍ．クルティシイおよびＭ．ホミニスの平均濃度は、細菌性膣炎（平均濃度はそれぞれ１×１０９／ｍＬ；１．２×１０９／ｍＬ；５×１０３／ｍＬおよび５．５×１０２／ｍＬ）においてＮＦより有意に高かった（ｐ≦０．００３７）。Ｕ．ウレアリチクムおよびＣ．アルビカンスの平均濃度については、ＢＶとＮＦとの間に統計的有意差はなかった。最後に、Ｍ．ムリエリスはＢＶのいずれにおいても、またはＮＦのいずれにおいても同定されなかった（正の閾値≧１０３／ｍＬ）。
【０１１５】
ＩＩ．３．３．３ 細菌性膣炎の分子レベルの基準の決定
分離されたＡ．バギナエおよびＧ．バギナリスの定量閾値による分析は、Ｎｕｇｅｎｔスコアによって定義されるＢＶおよびＮＦを分子レベルで同定するための感度、特異性、ならびに陽性的中率および陰性的中率の最良の基準を有する（表４）。Ａ．バギナエの定量値≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリスの定量値≧１０９／ｍＬの組み合わせは、９５％の感受性、９９％の特異性、９５％の陽性的中率（ＰＰＶ）、および９９％の陰性的中率（ＮＰＶ）を有する。
【０１１６】
ＩＩ．３．３．４ 中間的細菌叢の分子レベルの特徴解析
Ａ．バギナエの定量値≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリスの定量値≧１０９／ｍＬにより既に定義されたＢＶの同定のための分子レベルの基準をＮｕｇｅｎｔスコアのＩＦ（図２）に適用すると、２５例の細菌叢（５７％）がＢＶのプロファイル（図３）を有し、１９例の細菌叢（４３％）がＮＦのプロファイル（図４）を有するものと特徴付けることができた。
【０１１７】
ＩＩ．３．３．５ 細菌学的な追跡調査
ＮｕｇｅｎｔスコアでＢＶまたはＩＦである８名の女性を追跡調査した（表７）。分子レベルの定量により、被験者１についてＮｕｇｅｎｔスコアでは同定されないＢＶの再発が示された。被験者７および８についてはＢＶの消失が確認された。被験者２および５については１か月以上後も持続しているＮｕｇｅｎｔスコアのＩＦがＢＶであると特徴付けられた。最後に、被験者３では正常な性質の膣内細菌叢の維持が確認された。
【０１１８】
ＩＩＩ 論考
Ｎｕｇｅｎｔスコアによる膣内細菌叢のＮＦ（７１％）、ＢＶ（１０％）およびＩＦ（１９％）への分類は、フランス国［Ｇｏｆｆｉｎｅｔ Ｆ，ＥＪＯＧＲ ２００３］、ヨーロッパ［Ｇｕｉｓｅ ＪＭ，ＡＭＪＰＭ ２００１］、および米国［Ｄｅｌａｎｅｙ ＭＬ，ＯＧ ２００１］で文献に報告された分類と一致する。本発明の独自の特徴は、特異的なリアルタイムＰＣＲ検出技法と較正プラスミドによる相対的定量とを組み合わせることにより、膣内細菌叢を同定するための合理的なツールを確立していることである。
【０１１９】
最も驚くべき結果はＡ．バギナエに関するものであった。この細菌は、健康な被験者由来の膣標本からの１６Ｓ ＲＮＡの増幅および配列決定によって１９９９年に初めて同定された［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＭ，ＩＪＳＢ １９９９］。２００３年に、Ａ．バギナエは卵管卵巣膿瘍由来の標本を培養することにより分離され、この細菌が病原性の役割を果たすことが示唆された［Ｇｅｉｓｓｄｏｒｆｅｒ Ｗ，ＪＣＭ ２００３］。２００４年に、１６Ｓ ｒＲＮＡをクローニング技法と組み合わせる手法により、卵管炎の患者から手術時に得られた標本中に該細菌の存在が示された［Ｈｅｂｂ ＪＫ，ＪＩＤ ２００４］。本発明によれば、この細菌は、２０例のＢＶのうち１９例（９５％）、および１６７例のＮＦのうち１１５例（６９％）において高頻度で同定される。ＢＶおよびＮＦを診断するための最も識別力の高い基準はＡ．バギナエ濃度≧１０８／ｍＬであり、感度は９０％（２０例のＢＶのうち１８例）、特異性は９９％（１６７例のＮＦのうち１例）である。
【０１２０】
２００４年以来、様々な分子レベルの技法に基づいた４つの研究から、Ａ．バギナエとＢＶとの間の関連の可能性が示されてきたが、いずれの研究も正確な定量値基準を用いたものではなかった。第一に、１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とするＰＣＲ法とその後のゲル泳動から、わずかに２０例中１２例のＢＶ（６０％）、および２４例中２例のＮＦ（８．３％）にＡ．バギナエが示された［Ｆｅｒｒｉｓ ＭＪ，ＢＭＣＩＤ ２００４］。Ａ．バギナエの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異標的とするＰＣＲによって、該細菌のＤＮＡが、９例のＢＶのうち７例（７７．８％）、および１１２例のＮＦのうち２２例（１９．６％）に見出された［Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ，ＢＭＣＭ ２００４］。同じ技法を適用して、Ａ．バギナエのＤＮＡが、２２例のＢＶのうち１９例（８６．４％）、および４０３例のＮＦのうち５９例（１４．７％）において示された［Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ，ＢＭＣＭ ２００５］。最後に、増幅、クローニングおよび配列決定の技法によって、Ａ．バギナエのＤＮＡが、２７例中２６例のＢＶ（９６％）および４６例中９例のＮＦ（１９．５％）において観察された［Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓ ＤＮ，ＮＥＪＭ ２００５］。これらの研究のいずれもＡ．バギナエのＤＮＡを定量していないが、Ａ．バギナエのＤＮＡは該細菌の濃度が診断の重要な要素である細菌性膣炎において不可欠である。
【０１２１】
Ａ．バギナエは、膣内細菌叢の異常において主導的役割を果たすにもかかわらずＮｕｇｅｎｔスコアには欠けている。形態学的基準によるＡ．バギナエの同定は不適当である。小さなグラム陽性球杆菌（０．６〜０．９μｍ）の形であるＡ．バギナエの可変的な形態は、他の細菌と接触したときに集合して対や短連鎖を形成した状態で検出不能となることがある［Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ，ＢＭＣＭ ２００４］。従ってラクトバチルス属細菌および連鎖球菌との類似が同定誤差の原因である［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＪＭ，ＩＪＳＢ １９９９］。
【０１２２】
ＢＶにおけるＡ．バギナエとＧ．バギナリスとの関連についての記載は、最近少数の報告文書があるが、定量を伴わない限定的な診断範囲のものである。この関連は、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする特異的ＰＣＲによる、８７．８％（９例のＢＶのうち８例）［Ｖｅｒｈｅｌｓｔ Ｒ，ＢＭＣＭ ２００４］および９０％（２２例のＢＶのうち２０例）［Ｚａｒｉｆｆａｒｄ ＭＲ，ＦＥＭＳ ２００２］である。最近の発表は、半定量的な方法により、細菌性膣炎におけるＡ．バギナエの存在を示している［Ｂｒａｄｓｈａｗ ＣＳ，ＪＩＤ ２００６］。
【０１２３】
本発明によれば、Ａ．バギナエおよびＧ．バギナリスのこの組み合わせは９０％（２０例のＢＶのうち１８例）であるが、９５％（２０例のＢＶのうち１９例）の感度を有するＡ．バギナエ≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリス≧１０９／ｍＬの定量値を考慮すると、特異性（９９％）、ＰＰＶ（９５％）およびＮＰＶ（９９％）について、これまでにＢＶの同定用に達成された最良の基準が提示される。従って、Ａ．バギナエ濃度≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリス濃度≧１０９／ｍＬをＢＶの分子レベルの診断に使用する。
【０１２４】
本発明による結果から、Ｇ．バギナリスの定量はＡ．バギナエの定量より判別力が低いことが示唆される。ラクトバチルス属細菌については、Ｎｕｇｅｎｔスコアによって客観的に示されたＢＶにおける同細菌の減少が、これらの結果によって確認されている：１０７／ｍＬ以下のラクトバチルス属細菌の濃度を考慮すれば、ＢＶを診断するための感度は１００％、特異性は４４％である。さらに、１０８／ｍＬ以上のラクトバチルス属細菌の濃度を考慮すれば、正常な膣内細菌叢の実証において１００％の特異性が観察される。
【０１２５】
モビルンカス属細菌については、Ｎｕｇｅｎｔスコアによって該細菌に与えられた地位にもかかわらず、ＰＣＲではＭ．ムリエリスは陽性ではない。Ｍ．クルティシイだけがＢＶと関連付けられている。しかしながら、考えられる分子レベル診断の基準としての該細菌の有用性は小さいままである。
【０１２６】
生殖器マイコプラズマはＮｕｇｅｎｔスコアでは考慮されていない。しかしながら、生殖器マイコプラズマは培養または分子生物学により同定可能である。４４５例のＢＶおよび２７２９例のＮＦを培養する研究から、Ｍ．ホミニスは感染率２９％（１２９例のＢＶ）で有意に関連するものと特定され、Ｕ．ウレアリチクムは感染率５６％（２５３例のＢＶ）にもかかわらずＢＶとの関連はないとして特定された［Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｐ，ＡＪＯＧ １９９８］。リアルタイムＰＣＲによるＭ．ホミニスを標的とした２０３例のＢＶおよび２０３例のＮＦに関する研究から、ＢＶへのＭ．ホミニスの関与が示唆された［Ｚａｒｉｆｆａｒｄ ＭＲ，ＦＥＭＳ ２００２］。しかしながら、より小さな集団（５例のＢＶと１６例のＮＦ）に関する同じ研究では、この関連は実証されなかった［Ｓｈａ ＢＥ，ＪＣＭ ２００５］。本発明によれば、Ｍ．ホミニスだけがＢＶと関連するが、この相関関係はＢＶの診断基準としてこの微生物を提案するには不十分である。
【０１２７】
本発明による結果は、文献［Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｐ，ＡＪＯＧ １９９８］にデータで示されるようなＢＶとＣ．アルビカンスとの関連を示さない。このことは、生殖器にカンジダ・アルビカンスを有していても早産のリスクは増加しない［Ｃｏｔｃｈ ＭＦ，ＡＪＯＧ １９９８］一方で、最近の研究［Ｋｉｓｓ Ｈ，ＢＭＪ ２００４］から生殖器のＣ．アルビカンスの治療による早産の低減が示されたため、興味深い。
【０１２８】
本発明の独創性は、本発明が初めてＡ．バギナエおよびＧ．バギナリスの定量に基づいたＢＶの診断ツールを提供することである。現時点での使用時の基準は、Ａ．バギナエの濃度≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリスの濃度≧１０９／ｍＬを組み合わせる。この診断テストは、９５％の感度、９９％の特異性、９５％のＰＰＶおよび９９％のＮＰＶを有する。ＰＣＲの結果を読み取るいくつかの方法、特に細菌濃度の比および積が計算される方法について、最も適切な方法を特定できるように試験してきた。
【０１２９】
本発明による分子生物学的ツールの最も厄介な適用のうちの１つは、ＮｕｇｅｎｔスコアのＩＦについて行なわれたものである。本発明者らは、Ｎｕｇｅｎｔスコアによってのみ同定されるＩＦが、Ｎｕｇｅｎｔスコアで同定されるすべての細菌叢のうちの無視できない割合（８％〜２２％）を占めること［Ｇｕｅｒｒａ Ｂ、ＥＪＯＧＲＢ ２００６；Ｇｏｆｆｉｎｅｔ Ｆ，ＥＪＯＧＲＢ ２００３；Ｄｅｌａｎｅｙ ＭＬ，ＯＧ ２００１；Ｌｉｂｍａｎ ＭＤ，ＤＭＩＤ ２００６；Ｌａｒｓｓｏｎ ＰＧ，ＳＴＩ ２００４］、および多くの不確実性を伴うことを認識している。実際、本発明者らはこの中間的細菌叢が対応する微生物学的実体を知らないので、ＩＦの解釈には注意が必要である。一部の研究者は、ＩＦはＮＦとＢＶとの間の過渡期の細菌叢であると考えている［Ｉｓｏｎ ＣＡ，ＳＴＩ ２００２；Ｇｕｅｒｒａ Ｂ，ＥＪＯＧＲＢ ２００６；Ｇｏｆｆｉｎｅｔ Ｆ，ＥＪＯＧＲＢ ２００３；Ｕｇｗｕｍａｄｕ Ａ，Ｌａｎｃｅｔ ２００３；Ｃａｒｅｙ ＪＣ，ＮＥＪＭ ２０００］。他の人々は、ＩＦはＮＦとＢＶとを含む不均質な集合と考えている［Ｉｓｏｎ ＣＡ，ＳＴＩ ２００２；Ｌｉｂｍａｎ ＭＤ，ＤＭＩＤ ２００６；Ｌａｒｓｓｏｎ ＰＧ，ＳＴＩ ２００４］。ＩＦをＮＦまたはＢＶとして特徴付ける試みが文献に報告されている。１３例のＩＦにＡｍｓｅｌの基準を適用することによって、１２例のＩＦがＮＦとして、１例はＢＶとして再分類された［Ｉｓｏｎ ＣＡ，ＳＴＩ ２００２］。Ｎｕｇｅｎｔスコアを確立するためにコペロフ（Ｋｏｐｅｌｏｆｆ）の染色を使用して、２３２例のＩＦのうち６９例（３０％）がＮＦまたはＢＶとして再分類された［Ｌｉｂｍａｎ ＭＤ，ＤＭＩＤ ２００６］。この染色では、グラム陰性細菌をより良好に同定するためにグラム染色においてサフラニンをフクシンに替えている。最後に、使用した顕微鏡の光学視野の表面の関数としてＮｕｇｅｎｔスコアの基準を標準化することによって、１１７６例のＩＦのうち４５８例（３９％）をＮＦまたはＢＶとして再分類することができた［Ｌａｒｓｓｏｎ ＰＧ，ＳＴＩ ２００４］。
【０１３０】
Ａ．バギナエ濃度≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリス濃度≧１０９／ｍＬをＢＶと関連付ける本発明の分子レベルの基準をＩＦに適用することにより、このＩＦを合理的に特徴づけることができる。このように、２４例のＩＦ（５７％）はＮＦに類似のプロファイルを有している。よってこれらの結果は、ＩＦの性質が不均質であること、およびＮｕｇｅｎｔスコアは感度が低すぎてＢＶ症例の半分以上を診断することができないことを示唆している。したがって、これらのデータはＮｕｇｅｎｔスコアの限界を確認するものである。
【０１３１】
ＢＶの病因論は依然として全く不可解であるが、本発明者らは初めて、ＢＶの診断への合理的な手法を提供する客観的な定量ツールを有している。本発明の特有な性質は、ＢＶにおけるＡ．バギナエの重大な役割、およびＢＶの主要な診断基準として定量することによるＡ．バギナエの利用の両方を示していることである。このことは、Ａ．バギナエがメトロニダゾールに対し比較的抵抗性であること（治療後の頻繁な再発の原因の一部であるかもしれない）によって提起される治療上の問題についてよりよい理解を提示している［ＡＮＡＥＳ ２００１；Ｆｅｒｒｉｓ ＭＪ，ＢＭＣ ＩＤ ２００４；Ｓｅｃｏｒ ＡＭ，ＣＮＰ １９９７；Ｇｅｉｓｓｄｏｒｆｅｒ Ｗ，ＪＣＭ ２００３；Ｄｅ Ｂａｃｋｅｒ Ｅ，ＢＭＣ ＩＤ ２００６］。ＢＶを診断するために使用される分子レベルの基準は、Ａ．バギナエ濃度≧１０８／ｍＬおよび／またはＧ．バギナリス濃度≧１０９／ｍＬを組み合わせる。この分子ツールによって、ＢＶを診断すること、および一部のＩＦをＢＶとして特徴づけることが可能となる。本発明者らはさらに本分子ツールを、ＢＶの診断ツールとして、および妊娠中のＢＶの治療管理を評価する追跡調査方法として構想することができる。
【０１３２】
付録１． 検討した各微生物についての分子標的ならびにプライマー対およびプローブのヌクレオチド配列。
以下の表において、「センスプライマー」および「プローブ」の配列は５’→３’方向に記載され、「アンチセンスプライマー」配列は相補的な逆方向の５’→３’で記載されている。
【０１３３】
【表１】
付録２． ９３９塩基対の挿入物全体の理論上の配列。
太字の配列＝センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの配列
下線を付した配列＝特異的プローブ配列
黒色の配列＝挿入配列
括弧内の配列＝Ｘｈｏ１制限酵素切断部位の配列
【０１３４】
【化６】
付録３． ６つのオリゴヌクレオチドおよび挿入物構築用プライマーの配列。
− センスオリゴヌクレオチド１、１７８ヌクレオチド：Ｍ．クルティシイおよびＭ．ムリエリスの配列
【０１３５】
配列番号１９＝５’ＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＴＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＡＴＧＣＧＴＴＴＣＡＴＴＡＴＧＧＡＴＡＴＧＣＧＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＣＴＡＴＣＧＧＧＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣ３’
【０１３６】
− アンチセンスオリゴヌクレオチド２、１８３ヌクレオチド：Ｇ．バギナリスおよびラクトバチルス属細菌
配列番号２０＝５’ＣＧＡＣＣＡＧＴＧＡＴＡＧＴＡＡＡＴＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＣＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＡＴＧＴＡＴＴＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴＧＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＴ３’
【０１３７】
− センスオリゴヌクレオチド３、１４５ヌクレオチド：Ｕ．ウレアリチクム
配列番号２１＝５’ＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＴＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＡＡＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＡＧＴＧＣＡＴＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＧＴＡＡＡＧＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＡ３’
【０１３８】
− アンチセンスオリゴヌクレオチド４、１８８ヌクレオチド：Ｍ．ホミニス
配列番号２２＝５’ＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＴＡＴＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＴＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＴＡＴＣＧＡＡＡＣＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＡＧＣＡ３’
【０１３９】
− センスオリゴヌクレオチド５、１５２ヌクレオチド：Ａ．バギナエおよびＣ．アルビカンス
配列番号２３＝５’ＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＧＡＡＡＡＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＧＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴ３’
【０１４０】
− アンチセンスオリゴヌクレオチド６、１４７ヌクレオチド：ヒトアルブミン
配列番号２４＝５’ＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡ３’
【０１４１】
− ９３９塩基対のフラグメントを備えた組換えプラスミドの構築用プライマー
− センス 配列番号２５＝５’ＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＧＴＣ３’
アンチセンス 配列番号２８＝５’ＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴ３’
【０１４２】
付録４． 二重ＰＣＲによる挿入物構築の理論を示す図
６つのオリゴヌクレオチドを用いて挿入物を構築する原理。
プラスミド構築の図解
【０１４３】
【化７】
付録５． 各微生物およびヒトアルブミンについてのＤＮＡ抽出物５μＬの増幅反応に必要なプローブならびにセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの量
【０１４４】
【表２】
参考文献
【０１４５】
【表３】
【０１４６】
【表４】
【０１４７】
【表５】
【０１４８】
【表６】
【０１４９】
【表７】
【０１５０】
【表８】
【０１５１】
【表９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌性膣炎の存在に関して膣内細菌叢の状態をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断および追跡調査するための、ならびに適用可能な場合には細菌性膣炎の治療をモニタリングするための方法であって：
１）細菌アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）およびガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の濃度を、
・患者由来の膣帯下標本から抽出されたＤＮＡ中の、前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスのＤＮＡ中に単一コピーとして存在する前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの特異配列の濃度と、ヒト細胞を含むすべての生体標本中に存在するヒト遺伝子の特異配列の濃度とを測定することと、前記特異配列は大きさが１５０ヌクレオチド未満であることと、
・一方では標本から抽出された前記ＤＮＡ中に含まれる前記特異配列、他方では前記細菌各々の前記特異配列およびすべてのヒト細胞生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列を含む合成ＤＮＡフラグメントの試料中に含まれる前記特異配列を、ＰＣＲにより酵素的に同時増幅することと、前記試料はＤＮＡを定量するための検量標準品としての役割を果たすことと、
・前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの前記特異配列ならびにすべてのヒト細胞生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列各々のための増幅プライマーの配列とは異なる配列を備えた標識プローブを助力として、前記増幅フラグメントの検出および定量を実行することと、
によって定量するステップ、ならびに
２）ヒト細胞を少なくとも１０４個／ｍＬ含んでいる患者の膣帯下標本中の、細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの２つの前記特異配列のＤＮＡフラグメントの濃度が、次の２つの状態ａ）およびｂ）、すなわち：
ａ）アトポビウム・バギナエの前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍＬ以上であること、および
ｂ）ガードネレラ・バギナリスの前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍＬ以上であること
のうち少なくとも一方に合致する場合は、細菌性膣炎の存在、または進行中の治療の失敗を判定するステップ
を特徴とする方法。
【請求項２】
ａ）ステップ１）においてさらに、少なくともラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｅｉｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）およびラクトバチルス・イネルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ）を含むラクトバチルス属細菌を、
・前記ラクトバチルス属細菌の特異配列の濃度をさらに測定することと、ラクトバチルス属細菌の前記特異配列は前記ラクトバチルス属細菌のＤＮＡ中に単一コピーとして存在し、大きさは１５０ヌクレオチド未満であることと、
・一方では標本から抽出された前記ＤＮＡ中に含まれるラクトバチルス属細菌の前記特異配列、他方では前記ラクトバチルス属細菌の前記特異配列を追加として含む合成ＤＮＡフラグメントの試料中に含まれるラクトバチルス属細菌の前記特異配列を、ＰＣＲにより酵素的にさらに同時増幅することと、前記ラクトバチルス属細菌の前記特異配列を含む前記合成ＤＮＡフラグメントは定量用参照標準品としての役割を果たすことと、
・前記アトポビウム・バギナエ、ガードネレラ・バギナリスおよびラクトバチルス属細菌の前記特異配列、ならびにヒト細胞を含むすべての生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列各々のための増幅プライマーの配列とは異なる配列を備えた標識プローブを助力として、前記増幅フラグメントの検出および定量を実行することと、
によって定量すること、ならびに
ｂ）ステップ２）において、前記ラクトバチルス属細菌の特異的ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｌがさらに１０８コピー／ｍＬ以下、好ましくは１０７コピー／ｍＬ以下である場合に、細菌性膣炎と判定されること
を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記濃度が次の３つの条件：
ａ‐ アトポビウム・バギナエの特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍＬ以上であること、
ｂ‐ ガードネレラ・バギナリスの特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍＬ以上であること、および
ｃ‐ ラクトバチルス属細菌の特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｌが１０７コピー／ｍＬ以下であること
を満たす場合に細菌性膣炎と判定されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲによる増幅反応および定量化反応は、被験標本中の、前記細菌の前記特異配列およびヒト細胞を含むあらゆる生体標本中に存在するヒト遺伝子の特異配列の各々に特異的な加水分解プローブを使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記特異配列は、大きさが７０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは９０〜１２０ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ定量の参照標準品としての役割を果たす大きな合成ＤＮＡフラグメントを使用し、前記大きな合成ＤＮＡフラグメントは、濃度定量の対象である前記細菌各々の前記特異配列と、ヒト細胞の前記ヒトＤＮＡ特異配列とを寄せ集めたものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌の前記特異配列は：
− アトポビウム・バギナエ細菌については：１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＹ７３８６５８．１）の２４８〜３３４位のフラグメント、
− ガードネレラ・バギナリス細菌については、シャペロンタンパク質６０ｋＤａのＣｐｎ６０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＦ２４０５７９．３）の９８１〜１０７２位のフラグメント、ならびに
− ラクトバチルス属細菌については、伸長因子をコードするｔｕｆ遺伝子中の、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・イネルス、およびラクトバチルス・アシドフィルスに共通の配列であってＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＹ５６２１９１．１の遺伝子の２５３〜３４３位の配列
を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌の前記特異配列は、プローブ配列（下線）とその前後のプライマー配列（太字）を含む以下の配列：
− アトポビウム・バギナエについては：
【化１】
− ガードネレラ・バギナリスについては：
【化２】
− ラクトバチルス属細菌については
【化３】
または該配列の相補配列であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記大きなＤＮＡフラグメントは、試験標本中のヒトＤＮＡ特異配列として、特異的アルブミン配列を含むことを特徴とする、請求項６および８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試験標本中の前記ヒトＤＮＡ特異配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ１２５２３．１のヒトアルブミン遺伝子のエキソン１２の１６２８３‐１６４２３位のフラグメントであって、次の配列または相補配列：
【化４】
を有することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ１２５２３．１のヒトアルブミン遺伝子のエキソン１２の１６２８３‐１６４２３位のフラグメントを含む、試験標本中の前記ヒトＤＮＡ特異配列は、プライマー（太字の配列）およびプローブ配列（下線を付した配列）に対応する配列以外の場所に切断部位、特にＸｈｏＩ部位を挿入することによって修飾される、以下の配列：
【化５】
であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
適用可能な場合には配列表の以下の配列すなわち：
− アトポビウム・バギナエ用として：
プライマー５’：配列番号５＝５’‐ＣＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＣＣＴＧＡＴＡＣＣ‐３’
プライマー３’：配列番号６＝５’‐ＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＣＡＴＴＴＣＡ‐３’
プローブ ：配列番号７＝５’‐ＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＡ‐３’
− ガードネレラ・バギナリス用として：
プライマー５’：配列番号８＝５’‐ＣＧＣＡＴＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＧ‐３’
プライマー３’：配列番号９＝５’‐ＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＣＴ‐３’
プローブ ：配列番号１０＝５’‐ＴＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣ‐３’
− ラクトバチルス属細菌用として：
プライマー５’：配列番号１１＝５’‐ＴＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＧ‐３’
プライマー３’：配列番号１２＝５’‐ＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡ‐３’
プローブ ：配列番号１３＝５’‐ＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＣＡ‐３’
− ヒトアルブミン用として：
プライマー５’：配列番号１４＝５’‐ＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧＣＴＧＴ‐３’
プライマー３’：配列番号１５＝３’‐ＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣ‐３’
プローブ ：配列番号１６＝５’‐ＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＣＣ‐３’
またはこれらの相補配列から選択された、プライマーとプローブとのセットを使用することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
定量化のための参照標準試料のＤＮＡを構成する前記大きな合成ＤＮＡフラグメントはプラスミドに挿入されることを特徴とする、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行するために使用される診断キットであって：
− 参照標準ＤＮＡ試料であって、請求項１、５、７、および８のいずれか１項に定義された前記細菌各々の前記特異配列を、好ましくは請求項１、９、１０、および１１のいずれか１項に定義された１つの前記ヒトＤＮＡ特異配列を、より好ましくは請求項６および１３に定義された１つの前記大きな合成ＤＮＡフラグメントを、含む試料、同様に、
− 前記細菌に特異的な前記修飾合成ＤＮＡフラグメントに特異的なプライマーのセット、およびより好ましくは請求項１、４、８、および１２のいずれか１項に定義されるプローブ、ならびに
− ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を実行するための試薬
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１】
細菌性膣炎の存在に関して膣内細菌叢の状態をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断および追跡調査するための、ならびに適用可能な場合には細菌性膣炎の治療をモニタリングするための方法であって：
１）細菌アトポビウム・バギナエ（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ ｖａｇｉｎａｅ）およびガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）の濃度を、
・患者由来の膣帯下標本から抽出されたＤＮＡ中の、前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスのＤＮＡ中に単一コピーとして存在する前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの特異配列の濃度と、ヒト細胞を含むすべての生体標本中に存在するヒト遺伝子の特異配列の濃度とを測定することと、前記特異配列は大きさが１５０ヌクレオチド未満であることと、
・一方では標本から抽出された前記ＤＮＡ中に含まれる前記特異配列、他方では前記細菌各々の前記特異配列およびすべてのヒト細胞生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列を含む合成ＤＮＡフラグメントの試料中に含まれる前記特異配列を、ＰＣＲにより酵素的に同時増幅することと、前記試料はＤＮＡを定量するための検量標準品としての役割を果たすことと、
・前記細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの前記特異配列ならびにすべてのヒト細胞生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列各々のための増幅プライマーの配列とは異なる配列を備えた標識プローブを助力として、前記増幅フラグメントの検出および定量を実行することと、
によって定量するステップ、ならびに
２）ヒト細胞を少なくとも１０４個／ｍＬ含んでいる患者の膣帯下標本中の、細菌アトポビウム・バギナエおよびガードネレラ・バギナリスの２つの前記特異配列のＤＮＡフラグメントの濃度が、次の２つの状態ａ）およびｂ）、すなわち：
ａ）アトポビウム・バギナエの前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍＬ以上であること、および
ｂ）ガードネレラ・バギナリスの前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍＬ以上であること
のうち少なくとも一方に合致する場合は、細菌性膣炎の存在、または進行中の治療の失敗を判定するステップ
を特徴とする方法。
【請求項２】
ａ）ステップ１）においてさらに、少なくともラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｅｉｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）およびラクトバチルス・イネルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ）を含むラクトバチルス属細菌を、
・前記ラクトバチルス属細菌の特異配列の濃度をさらに測定することと、ラクトバチルス属細菌の前記特異配列は前記ラクトバチルス属細菌のＤＮＡ中に単一コピーとして存在し、大きさは１５０ヌクレオチド未満であることと、
・一方では標本から抽出された前記ＤＮＡ中に含まれるラクトバチルス属細菌の前記特異配列、他方では前記ラクトバチルス属細菌の前記特異配列を追加として含む合成ＤＮＡフラグメントの試料中に含まれるラクトバチルス属細菌の前記特異配列を、ＰＣＲにより酵素的にさらに同時増幅することと、前記ラクトバチルス属細菌の前記特異配列を含む前記合成ＤＮＡフラグメントは定量用参照標準品としての役割を果たすことと、
・前記アトポビウム・バギナエ、ガードネレラ・バギナリスおよびラクトバチルス属細菌の前記特異配列、ならびにヒト細胞を含むすべての生体標本に存在するヒト遺伝子の前記特異配列各々のための増幅プライマーの配列とは異なる配列を備えた標識プローブを助力として、前記増幅フラグメントの検出および定量を実行することと、
によって定量すること、ならびに
ｂ）ステップ２）において、前記ラクトバチルス属細菌の特異的ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｌがさらに１０８コピー／ｍＬ以下、好ましくは１０７コピー／ｍＬ以下である場合に、細菌性膣炎と判定されること
を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記濃度が次の３つの条件：
ａ‐ アトポビウム・バギナエの特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃａが１０８コピー／ｍＬ以上であること、
ｂ‐ ガードネレラ・バギナリスの特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｇが１０９コピー／ｍＬ以上であること、および
ｃ‐ ラクトバチルス属細菌の特異配列の前記ＤＮＡフラグメントの濃度Ｃｌが１０７コピー／ｍＬ以下であること
を満たす場合に細菌性膣炎と判定されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リアルタイムＰＣＲによる増幅反応および定量化反応は、被験標本中の、前記細菌の前記特異配列およびヒト細胞を含むあらゆる生体標本中に存在するヒト遺伝子の特異配列の各々に特異的な加水分解プローブを使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記特異配列は、大きさが７０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは９０〜１２０ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ定量の参照標準品としての役割を果たす大きな合成ＤＮＡフラグメントを使用し、前記大きな合成ＤＮＡフラグメントは、濃度定量の対象である前記細菌各々の前記特異配列と、ヒト細胞の前記ヒトＤＮＡ特異配列とを寄せ集めたものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌の前記特異配列は：
− アトポビウム・バギナエ細菌については：１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＹ７３８６５８．１）の２４８〜３３４位のフラグメント、
− ガードネレラ・バギナリス細菌については、シャペロンタンパク質６０ｋＤａのＣｐｎ６０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＦ２４０５７９．３）の９８１〜１０７２位のフラグメント、ならびに
− ラクトバチルス属細菌については、伸長因子をコードするｔｕｆ遺伝子中の、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ジェンセニイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・イネルス、およびラクトバチルス・アシドフィルスに共通の配列であってＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＹ５６２１９１．１の遺伝子の２５３〜３４３位の配列
を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌の前記特異配列は、プローブ配列（下線）とその前後のプライマー配列（太字）を含む以下の配列：
− アトポビウム・バギナエについては：
【化１】
− ガードネレラ・バギナリスについては：
【化２】
− ラクトバチルス属細菌については
【化３】
または該配列の相補配列であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記大きなＤＮＡフラグメントは、試験標本中のヒトＤＮＡ特異配列として、特異的アルブミン配列を含むことを特徴とする、請求項６および８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試験標本中の前記ヒトＤＮＡ特異配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ１２５２３．１のヒトアルブミン遺伝子のエキソン１２の１６２８３‐１６４２３位のフラグメントであって、次の配列または相補配列：
【化４】
を有することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧｅｎＢａｎｋ参照番号Ｍ１２５２３．１のヒトアルブミン遺伝子のエキソン１２の１６２８３‐１６４２３位のフラグメントを含む、試験標本中の前記ヒトＤＮＡ特異配列は、プライマー（太字の配列）およびプローブ配列（下線を付した配列）に対応する配列以外の場所に切断部位、特にＸｈｏＩ部位を挿入することによって修飾される、以下の配列：
【化５】
であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
適用可能な場合には配列表の以下の配列すなわち：
− アトポビウム・バギナエ用として：
プライマー５’：配列番号５＝５’‐ＣＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＣＣＴＧＡＴＡＣＣ‐３’
プライマー３’：配列番号６＝５’‐ＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＣＡＴＴＴＣＡ‐３’
プローブ ：配列番号７＝５’‐ＧＣＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＡ‐３’
− ガードネレラ・バギナリス用として：
プライマー５’：配列番号８＝５’‐ＣＧＣＡＴＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＧ‐３’
プライマー３’：配列番号９＝５’‐ＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＣＴ‐３’
プローブ ：配列番号１０＝５’‐ＴＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣ‐３’
− ラクトバチルス属細菌用として：
プライマー５’：配列番号１１＝５’‐ＴＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＧ‐３’
プライマー３’：配列番号１２＝５’‐ＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＣＡＣＧＡＣＣＡ‐３’
プローブ ：配列番号１３＝５’‐ＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＣＡ‐３’
− ヒトアルブミン用として：
プライマー５’：配列番号１４＝５’‐ＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＧＧＧＣＴＧＴ‐３’
プライマー３’：配列番号１５＝３’‐ＡＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣ‐３’
プローブ ：配列番号１６＝５’‐ＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＣＣ‐３’
またはこれらの相補配列から選択された、プライマーとプローブとのセットを使用することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
定量化のための参照標準試料のＤＮＡを構成する前記大きな合成ＤＮＡフラグメントはプラスミドに挿入されることを特徴とする、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行するために使用される診断キットであって：
− 参照標準ＤＮＡ試料であって、請求項１、５、７、および８のいずれか１項に定義された前記細菌各々の前記特異配列を、好ましくは請求項１、９、１０、および１１のいずれか１項に定義された１つの前記ヒトＤＮＡ特異配列を、より好ましくは請求項６および１３に定義された１つの前記大きな合成ＤＮＡフラグメントを、含む試料、同様に、
− 前記細菌に特異的な前記修飾合成ＤＮＡフラグメントに特異的なプライマーのセット、およびより好ましくは請求項１、４、８、および１２のいずれか１項に定義されるプローブ、ならびに
− ＰＣＲによるＤＮＡ増幅反応を実行するための試薬
を含むことを特徴とするキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５０９９３２（Ｐ２０１０−５０９９３２Ａ）
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３７６８４（Ｐ２００９−５３７６８４）
【出願日】平成１９年１１月２０日（２００７．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０５２３６８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６２１３６
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５０１３７４１４９）ユニヴェルシテ ドゥ ラ メディテラネ（エックス−マルセイユ ドゥー） (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＡ ＭＥＤＩＴＥＲＲＡＮＥＥ（ＡＩＸ−ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ ＩＩ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２０日（２００７．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０５２３６８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６２１３６
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５０１３７４１４９）ユニヴェルシテ ドゥ ラ メディテラネ（エックス−マルセイユ ドゥー） (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＡ ＭＥＤＩＴＥＲＲＡＮＥＥ（ＡＩＸ−ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ ＩＩ）
【Ｆターム（参考）】
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