分析方法
酵素的又は化学的切断により１つ又は複数の被分析タンパク質から生成された、１つ以上のペプチドの質量分析を用いた定量測定方法であって、１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体から１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成するために、分析されるべきサンプルと１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体とを、酵素的又は化学的切断に一緒に暴露する工程を含み、ここで、前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿、組織、及び細胞培養物などの複合ポリペプチド混合物から、タンパク質及びペプチドを定量化するための方法及び試薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
血漿及び組織などの内因性サンプルにおける、タンパク質及びペプチドの濃度レベルは、通常、酵素免疫吸着測定法（ELISA）又は放射免疫測定法（RIA）などの免疫化学的手法により測定される。これらの方法は、十分に確立されており、高感度であって、通常は非常に信頼できるが、特異抗体へのアクセスを必要とし、交差反応性、低再現性、及びエピトープの変性に関連する問題点に悩まされ得る。さらに、ELISA及びRIAアッセイは、通例、１つのアッセイにつき１種の被分析物を分析するために開発されており、複合分析にはあまり適していない。
【０００３】
質量分析（MS）は、血漿などの複合サンプルにおける、低分子量化合物の定量化のための確立された方法であって、しばしば、高速液体クロマトグラフィーと組み合わされる。質量分析による検出の主な利点には、高分解能及び高感度が含まれ、これにより、複合サンプルにおける、低レベルの被分析物の絶対的定量が可能となる。
【０００４】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI）及びエレクトロスプレーなどの「ソフトイオン化」技術の開発により、質量分析を用いた、ペプチド及びタンパク質などの大きな生体分子の分析が可能となっている。MSは、主に、配列分析、タンパク質の同定、及び翻訳後修飾の分析などの定性分析のために用いられている。
【０００５】
定量化手段として、MSは、低分子量化合物についてとほぼ同様の方法で、すなわち、高速液体クロマトグラフィー又はイムノアフィニティークロマトグラフィーと組み合わされ、内部の質量シフト標準ペプチド（internal, mass-shifted standard peptide）を用いた検出方法として、より小さなペプチドを定量化するために用いられている（参考文献１〜６）。タンパク質の定量化は容易でなく、その理由の一つは、未処理タンパク質（intact proteins）の分解能（resolution）が、複合サンプル中の異なるタンパク質種を分離（resolve）するのに、又は被分析物のシグナルと内部標準のシグナルとを区別するのに、通常は不十分だからである。
【０００６】
半定量化アプリケーションには、表面増強レーザー脱離／イオン化法（SELDI）（参考文献７）が含まれ、これは、タンパク質のサブフラクションを、親和性表面により複合サンプルから抽出し、線形MALDI−TOF質量分析により分析するものである。異なるサンプル（例えば、健康／病気の患者由来の血漿）から生じたスペクトルを比較することによって、時折、個別のタンパク質の相対存在量の変化を検出できる場合がある。
【０００７】
タンパク質濃度を測定するための別のアプローチは、酵素的又は化学的手段により、タンパク質をより短いペプチドへと断片化することである。未処理タンパク質よりもむしろペプチドを分析することの利点は、ペプチドは、より均質な生理化学的特性を示し、リフレクトロンMALDI−TOF MS又はエレクトロスプレーMSなどの高分解能質量分析技術による分析が可能な分子量範囲に該当する傾向にあることである。他方、単一のタンパク質が多くの異なるペプチドを生じさせることから、サンプルの複雑性は増加する。従って、断片化による、複合サンプル中のタンパク質分析は、通常、質量分析計へと導入される被分析物の数を減少させるために、MS分析の前に高分解能分離工程を必要とする。断片化サンプルのこのような前分画は、多次元液体クロマトグラフィー、及び／又はアフィニティータグによるペプチドサブグループの抽出を含み得る。
【０００８】
特定のタンパク質からもたらされた所定のペプチドを定量化する方法の一つは、同一のアミノ酸配列ではあるが、化学修飾により又は安定な同位体の導入により得られた質量シフトを有する内部標準を添加することである。一例として、Barrらは、トリプシン断片化及び同位体標識内部標準ペプチドの添加による、アポリポタンパク質A−1の測定方法を実証した（参考文献８）。最近になって、同一のアプローチが、Gerberらによって記載されているが（参考文献９）、この研究においては、MS／MSが定量化のために用いられていた。Gerberらのこの研究はまた、国際公開第０３／０１６８６１号の主題でもある。Gerberらは、「不揃い末端（ragged ends）」及び反応性アミノ酸は、可能な場合には、プロテアーゼ及びペプチドの選択により避けられるべきであるが、２つの隣接するエンドプロテアーゼ切断部位（不揃い末端）を有するペプチドを分析しなければならない場合には、いずれの切断部位が優位であるかを説明できるようにN末端伸長を追加することができる、と教示している。
【０００９】
別の変法は、例えば、システイン特異的化学修飾を用いることによって、ペプチドの亜集団に、ビオチンなどのアフィニティーラベルを加えることである。異なる質量を有するアフィニティータグを導入することにより、２種類の異なるサンプル間における、タンパク質含量の相対的差異を測定することが可能となる。この方法は、同位体コード・アフィニティータグ（ICAT）（参考文献１０）法と称されており、アフィニティータグを加えるのと同一の工程において、被分析物に質量シフトを導入するという利点を有する。しかし、この方法は、関心のあるタンパク質又はペプチドの絶対的定量化をもたらさないだろう。
【００１０】
好ましくは、内部標準は、全てのサンプル操作工程が、内部標準及び被分析物に等しく影響を与えるように、分析プロセスの間の出来るだけ早期に、分析されるべきサンプルに添加されるべきである。サンプル調製前の、タンパク質混合物への合成小ペプチドの添加は、いくつかの問題点をもたらし得る：i）サンプル調製後の内部標準の収量が、断片化工程の効率を反映しないだろう；ii）小さく、おそらく疎水性であるペプチドは、サンプル調製の間、他のタンパク質又はプラスチック製サンプル容器への吸着に起因して、部分的又は完全に失われ得る；及びiii）小ペプチドは、沈殿、限外ろ過、及びクロマトグラフィーなどのある種のサンプル調製工程の間に、分析されるべきタンパク質と必ずしも共精製されなくてよい。
【特許文献１】国際公開第０３／０１６８６１号パンフレット
【非特許文献１】Barr JR, et al., "Isotope dilution-mass spectrometric quantification of specific proteins : model application with apolipoprotein A−I." Clin Chem. 1996 Oct ; 42(10) : 1676−82
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、上述の欠点を有さない、タンパク質及びペプチドの定量化方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[本発明の要旨]
本発明は、質量ラベルペプチド内部標準前駆体を用いた、酵素的又は化学的切断により未処理タンパク質から生成されたペプチドの定量測定方法を提供する。質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質断片と同一又はほぼ同一（例えば、１つのアミノ酸が異なる）のアミノ酸配列を含むが、C末端及びN末端の両方において、１つ以上のアミノ酸で伸長されている。
【００１３】
本発明はまた、サンプル中のタンパク質及びペプチドを定量化するために用いられてよい、キットも提供する。
【００１４】
本発明はまた、サンプル中の１つ以上のペプチド又はタンパク質を定量化するための診断方法も提供する。
【００１５】
[本発明の詳細な説明]
「質量ラベルペプチド内部標準前駆体」という用語には、１つ又はいくつか（several）の既知又は予測されるタンパク質の配列に対応する、１つ又はいくつかのアミノ酸配列を含む、合成ペプチド又は組み換えタンパク質が含まれ、これは、プロテアーゼ又は化学物質による断片化時に、内部標準前駆体が、わずかに異なる分子量を除いて、分析されるべき１つ以上のタンパク質からもたらされる断片と同一又はほぼ同一の断片を生じるような方法で標識化されている。質量ラベルペプチド内部標準前駆体の化学修飾は、好ましくは、安定な同位体の組み込みである。この場合、内部標準前駆体由来の断片と被分析タンパク質由来の断片とは、わずかに異なる分子量を除いて、同一であるだろう。
【００１６】
「ポリペプチド」という用語には、ペプチド結合により結合されている２つ以上のアミノ酸を含む化合物が含まれる。
【００１７】
「タンパク質」とは、限定することなく、いずれのタンパク質をも意味し、好ましくは、少なくとも５０個を超えるアミノ酸からなるものが含まれる。
【００１８】
「ペプチド」とは、より短いポリペプチドを意味し、好ましくは、５０個以下のアミノ酸、例えば、４〜５０個のアミノ酸、又は１０〜２４個のアミノ酸などを含むものが含まれる。
【００１９】
「被分析タンパク質」及び「被分析ペプチド」とは、定量化されるべき特定のタンパク質又はペプチドを意味する。
【００２０】
本発明の第一の側面は、酵素的又は化学的切断により１つ又は複数（multiple）の被分析タンパク質から生成された、１つ以上のペプチドの質量分析を用いた定量測定方法であって、１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体から１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成させるために、分析されるべきサンプルと１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体とを、酵素的又は化学的切断に一緒に暴露する工程を含む方法を提供し、ここで、前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む。
【００２１】
本発明のこの側面の実施態様では、前記N末端伸長部は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側に対応する被分析タンパク質の配列において、被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのN末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列を、前記伸長部のC末端終端部に含む。
【００２２】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、前記C末端伸長部は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側に対応する被分析タンパク質の配列において、被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのC末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列を、前記伸長部のN末端終端部に含む。
【００２３】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準のN末端に隣接する、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列は、質量ラベルペプチド内部標準の配列に対応する被分析タンパク質の配列において、被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのN末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一である。
【００２４】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準のC末端に隣接する、少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列は、質量ラベルペプチド内部標準の配列に対応する被分析タンパク質の配列において、被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのC末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一である。
【００２５】
本発明は、質量ラベルペプチド内部標準前駆体を用いた、酵素的又は化学的切断により未処理タンパク質から生成されたペプチドの定量測定方法を提供する。質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質断片と同一又はほぼ同一のアミノ酸配列を含むが、C末端及びN末端の両方において、１つ以上のアミノ酸で伸長されている。この伸長は、断片化前に、生じた断片に隣接する、被分析タンパク質のアミノ酸の伸長と同一であっても、又は同一でなくてもよい。被分析タンパク質及び質量ラベルペプチド内部標準前駆体の切断により、タンパク質からは分析可能なペプチドが、内部標準前駆体からは内部標準ペプチドがもたらされ、分析的観点から、この２つの唯一の差は、典型的には２〜１０ダルトンの質量シフトだけである（図１）。
【００２６】
質量シフトペプチド内部標準前駆体を用いることにより、いくつかの利点が得られる：i）１つ以上のタンパク質の断片化後のペプチド収量の変動は、内部標準前駆体が、被分析タンパク質又は被分析ペプチドのものと同様の収量で断片化されることから、補正される；ii）内部標準前駆体は、タンパク質断片化前に行われる各種のサンプル調製工程の間に、被分析タンパク質又は被分析ペプチドとともに共精製されるように設計され得る；及びiii）単一の内部標準前駆体は、いくつかの異なる被分析タンパク質又は被分析ペプチド由来のペプチド断片を分析するために、複数の内部標準ペプチドを生成するように設計され得る。
【００２７】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、ペプチド合成により作製することができ、その間に、１つ以上の質量ラベルアミノ酸が組み込まれる。好ましくは、質量ラベルアミノ酸には、限定はしないが、１３C、１５N、１８O、２H、及び３４Sを含む、１つ以上の安定な同位体が含まれる。
【００２８】
参照として本明細書に援用される、Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433に開示されているとおりの、固相ペプチド合成のFmoc−ポリアミド法により、ペプチドを合成してよい。一時的なN−アミノ基の保護が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基により提供される。この高い塩基−不安定性（base−labile）保護基の反復切断は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを用いて行われる。側鎖官能基は、そのブチルエーテル（セリン、スレオニン及びチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸及びアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リシン及びヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、及び４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として、保護されてよい。グルタミン又はアスパラギンがC末端残基である場合には、側鎖アミド官能基の保護のために、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基を用いる。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（骨格モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、及びアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化剤[functionalizing agent]）の３種のモノマーからなる、ポリジメチルアクリルアミドポリマーに基づく。ペプチドと樹脂との、開裂可能な連結剤には、酸−不安定性の４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体が用いられる。すべてのアミノ酸誘導体は、アスパラギンとグルタミンを除いて、それらの前もって形成された対称な無水物誘導体として添加され、これは、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いたカップリングと逆の手順を用いて添加される。全てのカップリング及び脱保護反応を、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸、又はイソチン試験方法を用いてモニタリングする。合成完了時に、５０％のスカベンジャーミックスを含む９５％トリフルオロ酢酸での処理により側鎖保護基を除去するとともに、ペプチドを樹脂担体から切断する。一般的に用いられるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソール、及び水であり、合成されるペプチドの構成アミノ酸に応じて的確に選択される。トリフルオロ酢酸は、真空蒸発により除去され、それに続いて、これをジエチルエーテルですりつぶすことにより、粗ペプチドを得る。存在するスカベンジャーはいずれも、水相の凍結乾燥によりスカベンジャーを含まない粗ペプチドを得るという、単純な抽出方法によって除去される。ペプチド合成試薬は、通常、Calbiochem−Novabiochem（UK）Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UKから入手可能である。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び（主として）逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術のいずれか１つ、又はその組み合わせにより行われてよい。ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析、及び高速原子衝撃（FAB）質量分析を用いて実施されてよい。
【００２９】
質量ラベルはまた、これに限定されないが、アセチル化、メチル化、脱アミド化、及びカルボキシメチル化を含む、アミノ酸の他の化学修飾からなってもよい。質量ラベル修飾が、安定な同位体の組み込み以外である場合には、サンプル調製、分離、及びイオン化の間に内部標準ペプチド挙動を変更するおそれのある修飾を避けることが重要である。
【００３０】
さらに、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質又はペプチドに関連して、１つ以上の置換アミノ酸残基を有するように合成されてよい：例えば、グリシンのアラニンへの置換。このような状況下、被分析タンパク質又はペプチド、及び質量ラベルペプチド内部標準前駆体の切断により、タンパク質からは分析可能なペプチドが、内部標準前駆体からは内部標準ペプチドが生じ、分析的観点から、それらの間の唯一の差は、被分析タンパク質又はペプチド中のグリシンの存在に対する、ペプチド内部標準中のアラニンの存在に起因する、質量シフトである。本発明のこのような実施態様の利点は、質量ラベルペプチド内部標準前駆体の合成の間に、アラニンを、同位体標識アラニンにするよりもむしろ、グリシンに置換するほうがより容易であり得ることである。当業者ならば、さらなる適したアミノ酸置換を容易に理解でき、例えば、バリンとイソロイシンを交換してもよい。
【００３１】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質又はペプチドに関連して、０個、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換アミノ酸残基を有してよく、又は被分析タンパク質又はペプチドに関連して、アミノ酸残基の総数の、最大で５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％が異なっていてもよい。好ましくは、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質又はペプチドに関連して、置換アミノ酸残基を全く有さないか、又は１つしか置換アミノ酸残基を有さない。
【００３２】
被分析タンパク質断片が、リン酸化などの転写後修飾のいずれかを含む場合には、質量ラベルペプチド内部標準は、同一の修飾がなされるように合成されてよい。
【００３３】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体はまた、ハイブリッドタンパク質の一部としての質量ラベルアミノ酸の存在下、組み換えタンパク質発現により産生されてもよく、この場合、このようなハイブリッドタンパク質は、内部標準前駆体を構成できるか、又はハイブリッドタンパク質は、１つ以上のペプチド内部標準前駆体を産生するように処理されてよい。
【００３４】
組み換えタンパク質発現を用いて質量ラベルペプチド内部標準前駆体を準備する場合には、当業者に周知な方法であって、Sambrook et al (2001) 「Molecular Cloning, a Laboratory Manual」、第３版、Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAにより例証されている方法を用いて、所望のペプチドをコードするDNA分子を準備する。
【００３５】
ついで、質量ラベルペプチド内部標準前駆体を産生するために、適した宿主でDNAを発現させる。従って、発現ベクターを構築し、ついで、これを用いて、前記ペプチドを発現及び産生するのに適した宿主細胞をトランスフォームするという、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された公知技術に従って、前記ペプチドをコードするDNAを用いてよい。このような技術には、以下に開示されるものが含まれる：Rutterらにより１９８４年４月３日に取得された米国特許第４４４０８５９号；Weissmanにより１９８５年７月２３日に取得された同第４５３０９０１号；Crowlにより１９８６年４月１５日に取得された同第４５８２８００号；Markらにより１９８７年６月３０日に取得された同第４６７７０６３号；Goeddelにより１９８７年７月７日に取得された同第４６７８７５１号；Itakuraらにより１９８７年１１月３日に取得された同第４７０４３６２号；Murrayにより１９８７年１２月１日に取得された同第４７１０４６３号；Toole, Jr.らにより１９８８年７月１２日に取得された同第４７５７００６号；Goeddelらにより１９８８年８月２３日に取得された同第４７６６０７５号；及びStalkerにより１９８９年３月７日に取得された同第４８１０６４８号であって、この全ては、参照として本明細書に援用される。
【００３６】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体をコードするDNAは、適切な宿主への導入のために、非常に様々な他のDNA配列と結合されていてもよい。付随するDNAは、宿主の特性、宿主へのDNAの導入方法、及びエピソーム保持又は組み込みを所望するかどうかによって決まるだろう。
【００３７】
通常、DNAは、発現のための適切な配置及び正確なリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要な場合には、DNAを、所望の宿主により認識される、適切な転写及び翻訳制御コントロールヌクレオチド配列と結合させてよいが、とはいえ、このようなコントロールは、通常、発現ベクターで利用できる。従って、DNA挿入物は、適切なプロモーターに操作可能に連結されてよい。細菌プロモーターには、E.coli lacI及びlacZプロモーター、T3及びT7プロモーター、gptプロモーター、ファージλPR及びPLプロモーター、phoAプロモーター、並びにtrpプロモーターが含まれる。真核プロモーターには、CMV最初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、並びにレトロウイルスLTRのプロモーターが含まれる。他の適したプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物はまた、望ましくは、転写開始及び終了部位、並びに転写領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位も含む（Hastingsらによる、１９９８年４月２３日に公開された国際公開第９８／１６６４３号）。
【００３８】
ついで、標準的な技術を通じて、ベクターを宿主に導入する。通常、宿主の全てが、ベクターによりトランスフォームされるわけではなく、従って、トランスフォームされた宿主細胞を選択する必要があるだろう。選択技術の一つでは、任意の必要な制御要素とともに、トランスフォームされた細胞で選択可能な形質をコードするDNA配列マーカーを発現ベクターに組み込むことを伴う。これらのマーカーには、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素、G418耐性、又はネオマイシン耐性が含まれ、E.coli及び他の細菌における培養については、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、又はアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。別法として、このような選択可能な形質に対する遺伝子を別のべクターに入れることもでき、これを用いて、所望の宿主細胞を共トランスフォームする。
【００３９】
ついで、質量ラベルペプチド内部標準前駆体をコードする組み換えDNAによりトランスフォームされている宿主細胞を、ポリペプチドの発現を可能にする当業者に公知の適切な条件下、十分な時間培養し、ついで回収できる。
【００４０】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体を、以下の方法を含む周知方法により、組み換え細胞培養物から回収及び精製できる：硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィー。最も好ましくは、精製のために、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）を用いる。
【００４１】
以下を用いる系を含む、多くの発現系が公知である：例えば、組み換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドDNA発現ベクターなどでトランスフォームされた細菌（例えば、E.coli及びBacillus subtilisなど）；例えば、酵母発現ベクターなどでトランスフォームされた酵母（例えば、Saccaromyces cerevisiaeなど）；例えば、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルスなど）などでトランスフォームされた昆虫細胞系；例えば、ウイルス又は細菌発現ベクターなどでトランスフェクトされた植物細胞系；例えば、アデノウイルス発現ベクターなどでトランスフェクトされた動物細胞系。
【００４２】
質量ラベルペプチド内部標準としての使用に適したアミノ酸配列は、当業者に周知のin silico方法を用いて、タンパク質、及び被分析タンパク質のアミノ酸配列の特異性に基づき、タンパク質の断片化産物を予測することにより決定されてよい。ペプチド内部標準前駆体としての使用に適した１つ以上のアミノ酸配列はまた、被分析タンパク質の断片化及び質量分析により決定されてもよく、生じるペプチド断片の実際の一次構造を決定する。別の側面において、例えば、健康な患者及び病気の患者などに由来する断片化タンパク質の差を分析することにより発見された未知のペプチドを、同定し、配列決定し、その情報を、質量ラベルペプチド内部標準前駆体を設計するために用いてよい。この場合（例として）、伸長配列は、被分析タンパク質のフランキング配列と適合しなくてよいが、但し、未知のペプチドがそれに由来するポリペプチドを同定することが可能であって（配列決定後）、それにより、被分析タンパク質のフランキングアミノ酸を同定することが可能である場合は除かれる。
【００４３】
被分析タンパク質は、任意の既知のタンパク質、又は核酸配列の分析により予測される仮想タンパク質であることができる。被分析タンパク質はまた、以前には知られておらず、その存在が、以下の方法：二次元電気泳動、液体クロマトグラフィー、質量分析、若しくは他の分析方法、又はこれらの組み合わせ方法、を用いた未処理タンパク質又は断片化タンパク質のタンパク質発現分析により示唆されたものであることもできる。このような方法は、当業者に周知である。
【００４４】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、修飾タンパク質及びペプチドを検出及び測定するために設計されてよく、ここで、修飾には、これに限定されないが、リン酸化、グリコシル化、酸化、ファルネシル化、アセチル化、ユビキチン化、脂質化、プレニル化、及びスルホン化が含まれる。これらはまた、mRNAの別のスプライシングにより、in vivoにおけるタンパク質の特異的又は非特異的分解により、又は単一のヌクレオチドの多型に起因する変異により産生される、既知又は予測されるタンパク質及びペプチド種を検出及び測定するために設計されてもよい。
【００４５】
単一の内部標準前駆体を、切断時に、１つ、２つ、又はそれ以上の内部標準ペプチドを生じるように、設計し合成してよい。従って、本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、２つ以上の質量ラベルペプチド内部標準を含む。本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、複数の被分析タンパク質に由来するペプチド断片を分析するために、複数の質量ラベルペプチド内部標準を含む。
【００４６】
ペプチド又はタンパク質の不均一サンプルは、細胞又は組織サンプルから抽出されてよく、又は典型的には（必ずしもそうであることが必要ではないが）ヒト由来の細胞若しくは組織サンプルから抽出された、ペプチド及びタンパク質の不均一サンプルの断片化に由来してもよい。細胞又は組織サンプルは、正常又は病変組織に由来してよい。細胞又は組織サンプルは、様々な分化又は活性状態にある組織に由来してよい。タンパク質及びペプチドのさらなる適切な供給源には、原核生物、真核細胞系、ノックアウトマウス及び他の動物モデル由来の組織物質、並びにトランスジェニック植物及び植物物質が含まれる。このような組織サンプルからタンパク質を抽出する方法は、当業者に周知である。
【００４７】
本発明のこの側面において用いられる質量ラベルペプチド内部標準は、本発明の方法に適した任意の長さであることができ、典型的には４〜５０アミノ酸長、好ましくは１０〜４０アミノ酸長である。質量ラベルペプチド内部標準のサイズは、標準ペプチドが、被分析タンパク質又はペプチドに関連できるような最小サイズ、及び従来の質量分析法を用いて標準ペプチドを分離できるような最大サイズを有するための要件により決定づけられる。
【００４８】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、６〜２００アミノ酸長を有する。上述のとおり、前駆体は、１つ又はいくつかの既知又は予測タンパク質の配列に対応する、１つ又はいくつかのアミノ酸配列を含んでよい。質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、C末端及びN末端の両方において、１つ以上のアミノ酸で伸長されるので、質量ラベルペプチド内部標準前駆体の最小サイズは、６個のアミノ酸である。
【００４９】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、酵素的又は化学的切断への暴露前に実施されるサンプル調製工程の間に、測定されるべき１つ以上の被分析タンパク質とともに共精製される。
【００５０】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、サンプル回収後ではあるが、任意のサンプル調製又は断片化工程の前に、分析されるべきサンプルと組み合わされる。
【００５１】
図２及び図３に関して、質量シフトペプチド内部標準前駆体は、好ましくはサンプル回収後すぐに、好ましくは任意のサンプル調製又は断片化工程前に、分析されるべきサンプルに添加される。従って、質量シフトペプチド内部標準前駆体、及び被分析タンパク質又はペプチドは、同一のサンプル調製又は断片化工程を受ける。いくつかの異なる内部標準前駆体を、複数の異なるタンパク質及びペプチドの定量化を同時に可能にするために添加してよく、いくつかの内部標準前駆体を、重複（redundant）情報を得るために、同一タンパク質由来の異なる断片に対して添加できる。別法として、２つ以上の内部標準を生じる単一の内部標準前駆体を用いてもよい。
【００５２】
ついで、必要に応じて、分析に干渉し得る物質を除去することにより、かつ１つ以上の被分析物を濃縮（enrich）にするために、分析用サンプルを調製できる。用いられてよい方法には、当業者に理解されるとおりの、アフィニティー系技術を用いた、固相抽出、液体クロマトグラフィー、沈殿、限外ろ過、及び精製が含まれる。
【００５３】
サンプル中のタンパク質はまた、例えば、ジスルフィド結合を切断し、ペプチドダイマーの形成を回避するためのシステインの還元及びカルボキシメチル化などにより、化学修飾されてよい。
【００５４】
本発明の方法には、ペプチド断片の不均一サンプルを作製するための、タンパク質又はペプチドの不均一サンプルの断片化工程が含まれる。
【００５５】
タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの不均一サンプルを断片化する工程は、当分野で公知の任意の方法により達成されてよい。例えば、化学的又は酵素的切断を用いてよい。化学的又は酵素的（すなわち、プロテアーゼ指向性）切断の多数の方法が、当分野で公知である。例えば、プロテアーゼには、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、トロンビン、パパイン、ブロメライン、サーモリシン、サブチリシン（subsilisin）、Xa因子、Staphylococcus aureusプロテアーゼ、及びカルボキシペプチダーゼAが含まれる。好ましい実施態様では、断片化方法は、規定の位置で、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを切断する。酵素的切断は、典型的には、以下の表１に示すとおり、配列指向性（sequence−directed）である。従って、本発明のこの側面のさらなる実施態様では、酵素的又は化学的切断は、配列指向性である。
【００５６】
化学的切断方法もまた配列指向性であってよく、例えば、メチオニンのC末端側でタンパク質又はペプチドを切断する臭化シアン断片化などであってよい。
【００５７】
【表１】
【００５８】
表中、R１及びR２は、下記式：
Ｎ末端 ＮＨ−ＣＨＲ１−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨＲ２−ＣＯ C末端
により定義される。
【００５９】
従って、例えば、トリプシン切断は、その切断が、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド中のアルギニン又はリシン残基の存在によって導かれ、その結果、そのC末端残基として、アルギニン又はリシンのいずれかを有する切断断片をもたらすので、配列指向性の断片化手段である。
【００６０】
上述のとおり、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む。このような伸長に適したアミノ酸残基には、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、及びスレオニンなどの、親水性又は中性アミノ酸が含まれる。
【００６１】
あまり適していないアミノ酸残基には、システイン（ジスルフィド結合形成を誘導し得る）、プロリン（これは、得られたペプチドに柔軟性をあまり与えず、エピトープの構造に影響を及ぼし、トリプシン切断に感受性の低いペプチドを生じさせ得る）、及び疎水性又は芳香残基（これらは、ペプチドの溶解性を低減し得る）が含まれる。さらに、トリプシンが、配列指向性の断片化方法の手段（上述のとおり）として用いられる場合には、トリプシンは、疎水性アミノ酸残基のC末端において、より小さな範囲に切断し得る。
【００６２】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体及び１つ又は複数の被分析タンパク質を含むサンプルは、酵素的又は化学的切断後に分離される。
【００６３】
不均一タンパク質集団のペプチドへの断片化は、ペプチドのより高い複合混合物を通常もたらし、複雑性を低減させるために質量分析前に分離を必要とする。ペプチド分離のために用いられてよい方法には、当業者に理解されるとおりの、液体クロマトグラフィー（一次元以上の分離次元において）、固相抽出、及びアフィニティーキャプチャーが含まれる。
【００６４】
分離は、オンラインで（液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレー質量分析）、又は分画とそれに続く、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（MALDI）法などによる、個別の断片の分析によるいずれかで、質量分析と組み合わされることができる。被分析ペプチドと質量ラベル内部標準ペプチドとの存在量（abundance）の差を、シングルステージの質量分析（MS）又はマルチステージのMS（MS／MS又はMSn）のいずれかにより測定できる。二段階質量分析においては、第一の質量分離を用いて、分析されるべきペプチドを選択し、ついで、選択したペプチドを断片化し、第二段階の質量分離において、その断片を分析する。
【００６５】
MS／MSは、同一の分子量（molecular mass）を有するが、異なるアミノ酸組成を有するペプチドを分離する可能性を有しているので、複合ペプチド混合物を分析するための非常に強力なアプローチである。
【００６６】
質量分析により特定のペプチドから得られるシグナル強度は、ペプチドの濃度、分子量（molecular weight）、及びイオン化特性、並びにサンプル中の他の構成成分の抑制（クエンチング）効果によって決まる。例えば、同位体組成を除いては同一である２つのペプチドについて、その相対シグナル強度は、他の全ての因子が、それらに等しく影響を及ぼすべきであるので、濃度によってのみ決まるだろう（図２）。
【００６７】
ペプチドを分離するための好ましい方法は、参照として本明細書に援用されるＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２５６６に記載のとおりの、「シグネチャーペプチドキャプチャー（Signature Peptide Capture）」（SPC）である。
【００６８】
SPCは、ペプチド若しくはタンパク質、又はそれらの断片の不均一サンプルを分析するための方法であって、以下の工程：
（a）アレイ上の、間隔をあけて規定された位置に、各クラスの不均一ペプチド又はタンパク質メンバーを結合することによる、ペプチド若しくはタンパク質、又はそれらの断片の不均一サンプルを、不均一クラスに分離する工程であって、ここで、各クラスにおけるペプチド又はタンパク質は、そのクラスに共通するモチーフを有する、工程；及び
（b）各クラスにおけるペプチド又はタンパク質を特性決定する工程、
を含む。
【００６９】
ペプチド又はタンパク質の各不均一クラスは、アレイ上に存在する特異的結合分子と結合する、不均一サンプル中の全てのペプチド又はタンパク質からなる。結合分子は、特定のタンパク質又はペプチドよりもむしろモチーフとの結合能力について選択されるので、結合分子は、同一モチーフを含む、異なるタイプのタンパク質及びペプチドと結合できる。好ましくは、各結合分子は、所定のモチーフに特異的である。従って、SPCにおいて、所定の結合分子により結合された、不均一クラスのタンパク質及びペプチドは、典型的には、平均して、少なくとも２種、より典型的には２種を超える、例えば、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００種以上の異なるタイプのタンパク質又はペプチドを含む。
【００７０】
従って、タンパク質及びペプチドは、特異的結合分子により捕捉され保持される、それらの能力に基づいて、SPCにより分類される。不均一クラスのペプチド又はタンパク質は、特定のクラスの全てのメンバーに共通するモチーフの存在に起因して、特異的結合分子と結合するだろう。従って、各クラスのペプチドにおいて、結合されるモチーフの同一性は、そのクラスを規定する、結合分子の結合特異性の結果である。
【００７１】
本発明の方法は、SPCが、タンパク質又はペプチドの不均一サンプルについての分析を提供するだけでなく、その不均一サンプルの１つ以上の構成成分を定量化することも可能にする。
【００７２】
本発明のさらなる側面は、患者が、１つ以上のポリペプチドレベルの増加又は減少により特徴付けられる疾患を有しているかどうか、又は前記疾患に罹りやすい恐れがあるかどうかの診断を補助する方法であって、前記患者から試験サンプルを得る工程、及び本発明の第一の側面の方法を用いて、前記１つ以上のポリペプチドレベルを定量化する工程を含む方法である。
【００７３】
本発明の方法は、患者が疾患を有しているかどうか、又は疾患に罹りやすい恐れがあるかどうかを決定するために、他の診断方法と併用して用いることができる。これは、本発明の方法を用いて、試験サンプル中のタンパク質又はペプチドレベルを定量化できるからである。従って、本発明の方法を用いることにより、１つ以上のポリペプチドレベルの増加又は減少を結果としてもたらす疾患の診断を助けることができる。
【００７４】
「試験サンプル」には、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、胸膜液、及び精液などの体液のサンプルが含まれる。
【００７５】
１つ以上のポリペプチドレベルの増加又は減少を結果としてもたらし得る疾患の例には、癌、発作（stroke）、代謝性疾患、炎症、心筋梗塞、又はアテローム性動脈硬化が含まれる。
【００７６】
本発明のさらなる側面は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む、質量ラベルペプチド内部標準前駆体であって、ここで、前記前駆体は、酵素的又は化学的切断への暴露時に、１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成する。
【００７７】
「質量ラベルペプチド内部標準前駆体」という用語には、本発明の第一の側面に関連して定義された、それらのペプチド又はタンパク質が含まれる。従って、内部標準前駆体は、プロテアーゼ又は化学物質による断片化時に、わずかに異なる分子量を除いて、分析されるべき１つ以上のタンパク質からもたらされる断片と同一又はほぼ同一の断片を生じるだろう。
【００７８】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体の酵素的又は化学的切断方法は、本発明の第一の側面に関連して上述している。
【００７９】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体のアミノ酸配列は、当業者に理解されるとおり、標的となる被分析タンパク質又はペプチドに応じて、必然的に変化するだろう。
【００８０】
本発明のさらなる側面では、先に定義したとおりの、又は本発明の第一の側面に関連して定義したとおりの質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、ペプチドを断片化するための作用物質とを含む部品のキットを提供する。
【００８１】
本発明のさらなる側面では、先に定義したとおりの、又は本発明の第一の側面に関連して定義したとおりの質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、被分析タンパク質又はペプチドを含む試験サンプル、又は被分析タンパク質若しくはペプチドについて試験されるべき（例えば、含むと考える）試験サンプルとを含む部品のキットを提供する。このキットには、ペプチドを断片化するための作用物質をさらに含めてもよい。
【００８２】
上述のとおり、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む。
【００８３】
ペプチドを断片化するのに適した作用物質は、本発明の第一の側面に関連して上述している。キットの一部として供給されるべき作用物質は、質量ラベルペプチド内部標準前駆体の断片化特性に応じて必然的に変わり、例えば、前記前駆体が、トリプリンでの消化後に正しい質量ラベルペプチド内部標準を生じるならば、キットにはトリプシンが含まれるだろう。
【００８４】
キットにはまた、本発明の方法で使用するためのさらなる試薬を含めてもよく、例えば、当業者に理解されるとおりの、チップフォーマットでのアフィニティーアレイ、抗体、又はアフィニティーカラムなどである。
【００８５】
好ましくは、キットにはまた、本発明の第一の側面に関連して上述したとおりの、断片化ペプチドのSPCを介した分離を実施するのに必要とされる全ての構成要素を含めてもよい。
【００８６】
従って、キットにはまた、固相担体（典型的にはガラス又はポリマー）上の別個の領域でそれぞれ固定されている、多数の異なるタイプの結合分子を有するアレイを含めてもよい。それぞれの結合分子は、本発明の第一の側面に関連して上述したとおり、特定のタンパク質又はペプチドよりもむしろモチーフに特異的に結合する能力を有する。
【００８７】
本明細書で言及した全ての文献は、誤解を避けるために、参照として本明細書に援用される。
【００８８】
以下の非限定的な図面及び実施例を参照することにより、本発明を説明する。
【００８９】
[実施例]
（実施例１：ヒト血清におけるトランフェリンの定量化）
トランスフェリンは、鉄結合輸送タンパク質であって、吸着及びヘム分解部位から、貯蔵及び利用部位への鉄の輸送に関与する。血清トランスフェリンはまた、細胞増殖を刺激するのに、さらなる役割を有し得る。トランスフェリンの血漿レベルは、妊娠及び鉄欠乏の間に増加し、炎症、腫瘍、ネフローゼ、及びヘモクロマトーシスにより増加し得る。正常な血漿レベルは、２〜４ｍｇ／ｍＬである。
【００９０】
「EPNNK EGYYGYTGAFR*CLVE」のアミノ酸配列を有する内部ペプチド標準前駆体を合成し、ここで、アルギニンは、６個の１３C原子を組み込むことにより同位体標識されている。このペプチドを、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解する。
【００９１】
（サンプル調製）
分析されるべき０．１ｍＬの血清サンプルを、０．９ｍＬの内部ペプチド標準前駆体溶液と混合する。PBS中７５ｍＭのジチオスレイトール２２０μＬを添加することにより、このサンプルを還元し、５０℃で８０分間インキュベートする。PBS中１Ｍのヨード酢酸６０μＬを添加し、このサンプルを、暗所で、３７℃で３０分間インキュベートする。残存ヨード酢酸を、PBS中７５ｍＭのジチオスレイトール２２０μＬを添加することにより還元する。還元され、アルキル化されたタンパク質を、製造業者により提供されるプロトコルに従って、PD−10カラム（Amersham Biotech）でのゲル濾過により、過剰試薬から分離する。タンパク質画分を、およそ２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、３ｍＬのPBSで溶出する。１５０μＬのトリプリシン溶液（PBS中１ｍｇ／ｍＬのトリプシン）を添加し、このサンプルを３７℃で２時間インキュベートする。すぐに分析しない場合には、消化されたサンプルを−８０℃で凍結する。
【００９２】
（ペプチドの分離）
ペプチドを、２μＬ／分の流速で、C18固定相を用いたキャピラリーカラム（１００μｍ×１０ｃｍ）での逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離する。１０μＬのサンプルを負荷し、５〜６０％の相Bの移動相グラジエントにより、４５分間、ペプチドを溶出する（溶離液A：２％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、溶離液B：９５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）。溶出されたペプチドを、MALDI−TOF金属ターゲット上に直接、２μＬ画分で回収し、乾燥させる。
【００９３】
関連するペプチドを含む画分を同定するために、０．９ｍＬの内部ペプチド標準前駆体溶液を、上述のとおりではあるが、血清サンプルを０．１ｍＬのPBSに置き換えて調製する。上述のとおり、ペプチドを分離し、別のMALDIターゲットに回収する。MALDIターゲットプレートを、以下（bellow）のとおり、スキャンして、プレート上にペプチドを局在化させる。
【００９４】
（質量分析）
１μＬのα−シアノ−シナピン酸溶液（１％のトリフルオロ酢酸中５ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれの画分に添加する。リフレクターを備えたMALDI−TOF質量分析計を用いて、画分を分析する。
【００９５】
「EGYYGYTGAFR」配列を有する、トランスフェリン由来の被分析ペプチドは、１２８４．５７ダルトン（１２８３．５７プラス１プロトン）の質量に相当するシグナルを生じたが、他方、内部ペプチド標準は、１２８０．５７ダルトンの質量を有するものとして検出される。シグナルの相対強度は、被分析ペプチド及び参照ペプチドの相対量を反映するだろう。
[参考文献]
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１には、タンパク質からは分析可能なペプチドを、内部標準前駆体からは内部標準ペプチドを生じる、被分析タンパク質及び質量ラベルペプチド内部標準前駆体の切断を示す。
【図２】図２には、生物学的サンプル及び質量シフトペプチド内部標準前駆体の分析方法を示す。
【図３】図３には、被分析物及び内部標準ペプチドの質量分析結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿、組織、及び細胞培養物などの複合ポリペプチド混合物から、タンパク質及びペプチドを定量化するための方法及び試薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
血漿及び組織などの内因性サンプルにおける、タンパク質及びペプチドの濃度レベルは、通常、酵素免疫吸着測定法（ELISA）又は放射免疫測定法（RIA）などの免疫化学的手法により測定される。これらの方法は、十分に確立されており、高感度であって、通常は非常に信頼できるが、特異抗体へのアクセスを必要とし、交差反応性、低再現性、及びエピトープの変性に関連する問題点に悩まされ得る。さらに、ELISA及びRIAアッセイは、通例、１つのアッセイにつき１種の被分析物を分析するために開発されており、複合分析にはあまり適していない。
【０００３】
質量分析（MS）は、血漿などの複合サンプルにおける、低分子量化合物の定量化のための確立された方法であって、しばしば、高速液体クロマトグラフィーと組み合わされる。質量分析による検出の主な利点には、高分解能及び高感度が含まれ、これにより、複合サンプルにおける、低レベルの被分析物の絶対的定量が可能となる。
【０００４】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI）及びエレクトロスプレーなどの「ソフトイオン化」技術の開発により、質量分析を用いた、ペプチド及びタンパク質などの大きな生体分子の分析が可能となっている。MSは、主に、配列分析、タンパク質の同定、及び翻訳後修飾の分析などの定性分析のために用いられている。
【０００５】
定量化手段として、MSは、低分子量化合物についてとほぼ同様の方法で、すなわち、高速液体クロマトグラフィー又はイムノアフィニティークロマトグラフィーと組み合わされ、内部の質量シフト標準ペプチド（internal, mass-shifted standard peptide）を用いた検出方法として、より小さなペプチドを定量化するために用いられている（参考文献１〜６）。タンパク質の定量化は容易でなく、その理由の一つは、未処理タンパク質（intact proteins）の分解能（resolution）が、複合サンプル中の異なるタンパク質種を分離（resolve）するのに、又は被分析物のシグナルと内部標準のシグナルとを区別するのに、通常は不十分だからである。
【０００６】
半定量化アプリケーションには、表面増強レーザー脱離／イオン化法（SELDI）（参考文献７）が含まれ、これは、タンパク質のサブフラクションを、親和性表面により複合サンプルから抽出し、線形MALDI−TOF質量分析により分析するものである。異なるサンプル（例えば、健康／病気の患者由来の血漿）から生じたスペクトルを比較することによって、時折、個別のタンパク質の相対存在量の変化を検出できる場合がある。
【０００７】
タンパク質濃度を測定するための別のアプローチは、酵素的又は化学的手段により、タンパク質をより短いペプチドへと断片化することである。未処理タンパク質よりもむしろペプチドを分析することの利点は、ペプチドは、より均質な生理化学的特性を示し、リフレクトロンMALDI−TOF MS又はエレクトロスプレーMSなどの高分解能質量分析技術による分析が可能な分子量範囲に該当する傾向にあることである。他方、単一のタンパク質が多くの異なるペプチドを生じさせることから、サンプルの複雑性は増加する。従って、断片化による、複合サンプル中のタンパク質分析は、通常、質量分析計へと導入される被分析物の数を減少させるために、MS分析の前に高分解能分離工程を必要とする。断片化サンプルのこのような前分画は、多次元液体クロマトグラフィー、及び／又はアフィニティータグによるペプチドサブグループの抽出を含み得る。
【０００８】
特定のタンパク質からもたらされた所定のペプチドを定量化する方法の一つは、同一のアミノ酸配列ではあるが、化学修飾により又は安定な同位体の導入により得られた質量シフトを有する内部標準を添加することである。一例として、Barrらは、トリプシン断片化及び同位体標識内部標準ペプチドの添加による、アポリポタンパク質A−1の測定方法を実証した（参考文献８）。最近になって、同一のアプローチが、Gerberらによって記載されているが（参考文献９）、この研究においては、MS／MSが定量化のために用いられていた。Gerberらのこの研究はまた、国際公開第０３／０１６８６１号の主題でもある。Gerberらは、「不揃い末端（ragged ends）」及び反応性アミノ酸は、可能な場合には、プロテアーゼ及びペプチドの選択により避けられるべきであるが、２つの隣接するエンドプロテアーゼ切断部位（不揃い末端）を有するペプチドを分析しなければならない場合には、いずれの切断部位が優位であるかを説明できるようにN末端伸長を追加することができる、と教示している。
【０００９】
別の変法は、例えば、システイン特異的化学修飾を用いることによって、ペプチドの亜集団に、ビオチンなどのアフィニティーラベルを加えることである。異なる質量を有するアフィニティータグを導入することにより、２種類の異なるサンプル間における、タンパク質含量の相対的差異を測定することが可能となる。この方法は、同位体コード・アフィニティータグ（ICAT）（参考文献１０）法と称されており、アフィニティータグを加えるのと同一の工程において、被分析物に質量シフトを導入するという利点を有する。しかし、この方法は、関心のあるタンパク質又はペプチドの絶対的定量化をもたらさないだろう。
【００１０】
好ましくは、内部標準は、全てのサンプル操作工程が、内部標準及び被分析物に等しく影響を与えるように、分析プロセスの間の出来るだけ早期に、分析されるべきサンプルに添加されるべきである。サンプル調製前の、タンパク質混合物への合成小ペプチドの添加は、いくつかの問題点をもたらし得る：i）サンプル調製後の内部標準の収量が、断片化工程の効率を反映しないだろう；ii）小さく、おそらく疎水性であるペプチドは、サンプル調製の間、他のタンパク質又はプラスチック製サンプル容器への吸着に起因して、部分的又は完全に失われ得る；及びiii）小ペプチドは、沈殿、限外ろ過、及びクロマトグラフィーなどのある種のサンプル調製工程の間に、分析されるべきタンパク質と必ずしも共精製されなくてよい。
【特許文献１】国際公開第０３／０１６８６１号パンフレット
【非特許文献１】Barr JR, et al., "Isotope dilution-mass spectrometric quantification of specific proteins : model application with apolipoprotein A−I." Clin Chem. 1996 Oct ; 42(10) : 1676−82
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、上述の欠点を有さない、タンパク質及びペプチドの定量化方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[本発明の要旨]
本発明は、質量ラベルペプチド内部標準前駆体を用いた、酵素的又は化学的切断により未処理タンパク質から生成されたペプチドの定量測定方法を提供する。質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質断片と同一又はほぼ同一（例えば、１つのアミノ酸が異なる）のアミノ酸配列を含むが、C末端及びN末端の両方において、１つ以上のアミノ酸で伸長されている。
【００１３】
本発明はまた、サンプル中のタンパク質及びペプチドを定量化するために用いられてよい、キットも提供する。
【００１４】
本発明はまた、サンプル中の１つ以上のペプチド又はタンパク質を定量化するための診断方法も提供する。
【００１５】
[本発明の詳細な説明]
「質量ラベルペプチド内部標準前駆体」という用語には、１つ又はいくつか（several）の既知又は予測されるタンパク質の配列に対応する、１つ又はいくつかのアミノ酸配列を含む、合成ペプチド又は組み換えタンパク質が含まれ、これは、プロテアーゼ又は化学物質による断片化時に、内部標準前駆体が、わずかに異なる分子量を除いて、分析されるべき１つ以上のタンパク質からもたらされる断片と同一又はほぼ同一の断片を生じるような方法で標識化されている。質量ラベルペプチド内部標準前駆体の化学修飾は、好ましくは、安定な同位体の組み込みである。この場合、内部標準前駆体由来の断片と被分析タンパク質由来の断片とは、わずかに異なる分子量を除いて、同一であるだろう。
【００１６】
「ポリペプチド」という用語には、ペプチド結合により結合されている２つ以上のアミノ酸を含む化合物が含まれる。
【００１７】
「タンパク質」とは、限定することなく、いずれのタンパク質をも意味し、好ましくは、少なくとも５０個を超えるアミノ酸からなるものが含まれる。
【００１８】
「ペプチド」とは、より短いポリペプチドを意味し、好ましくは、５０個以下のアミノ酸、例えば、４〜５０個のアミノ酸、又は１０〜２４個のアミノ酸などを含むものが含まれる。
【００１９】
「被分析タンパク質」及び「被分析ペプチド」とは、定量化されるべき特定のタンパク質又はペプチドを意味する。
【００２０】
本発明の第一の側面は、酵素的又は化学的切断により１つ又は複数（multiple）の被分析タンパク質から生成された、１つ以上のペプチドの質量分析を用いた定量測定方法であって、１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体から１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成させるために、分析されるべきサンプルと１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体とを、酵素的又は化学的切断に一緒に暴露する工程を含む方法を提供し、ここで、前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む。
【００２１】
本発明のこの側面の実施態様では、前記N末端伸長部は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側に対応する被分析タンパク質の配列において、被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのN末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列を、前記伸長部のC末端終端部に含む。
【００２２】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、前記C末端伸長部は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側に対応する被分析タンパク質の配列において、被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのC末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列を、前記伸長部のN末端終端部に含む。
【００２３】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準のN末端に隣接する、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列は、質量ラベルペプチド内部標準の配列に対応する被分析タンパク質の配列において、被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのN末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一である。
【００２４】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準のC末端に隣接する、少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列は、質量ラベルペプチド内部標準の配列に対応する被分析タンパク質の配列において、被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのC末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一である。
【００２５】
本発明は、質量ラベルペプチド内部標準前駆体を用いた、酵素的又は化学的切断により未処理タンパク質から生成されたペプチドの定量測定方法を提供する。質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質断片と同一又はほぼ同一のアミノ酸配列を含むが、C末端及びN末端の両方において、１つ以上のアミノ酸で伸長されている。この伸長は、断片化前に、生じた断片に隣接する、被分析タンパク質のアミノ酸の伸長と同一であっても、又は同一でなくてもよい。被分析タンパク質及び質量ラベルペプチド内部標準前駆体の切断により、タンパク質からは分析可能なペプチドが、内部標準前駆体からは内部標準ペプチドがもたらされ、分析的観点から、この２つの唯一の差は、典型的には２〜１０ダルトンの質量シフトだけである（図１）。
【００２６】
質量シフトペプチド内部標準前駆体を用いることにより、いくつかの利点が得られる：i）１つ以上のタンパク質の断片化後のペプチド収量の変動は、内部標準前駆体が、被分析タンパク質又は被分析ペプチドのものと同様の収量で断片化されることから、補正される；ii）内部標準前駆体は、タンパク質断片化前に行われる各種のサンプル調製工程の間に、被分析タンパク質又は被分析ペプチドとともに共精製されるように設計され得る；及びiii）単一の内部標準前駆体は、いくつかの異なる被分析タンパク質又は被分析ペプチド由来のペプチド断片を分析するために、複数の内部標準ペプチドを生成するように設計され得る。
【００２７】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、ペプチド合成により作製することができ、その間に、１つ以上の質量ラベルアミノ酸が組み込まれる。好ましくは、質量ラベルアミノ酸には、限定はしないが、１３C、１５N、１８O、２H、及び３４Sを含む、１つ以上の安定な同位体が含まれる。
【００２８】
参照として本明細書に援用される、Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433に開示されているとおりの、固相ペプチド合成のFmoc−ポリアミド法により、ペプチドを合成してよい。一時的なN−アミノ基の保護が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基により提供される。この高い塩基−不安定性（base−labile）保護基の反復切断は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを用いて行われる。側鎖官能基は、そのブチルエーテル（セリン、スレオニン及びチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸及びアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リシン及びヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、及び４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として、保護されてよい。グルタミン又はアスパラギンがC末端残基である場合には、側鎖アミド官能基の保護のために、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基を用いる。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（骨格モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、及びアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化剤[functionalizing agent]）の３種のモノマーからなる、ポリジメチルアクリルアミドポリマーに基づく。ペプチドと樹脂との、開裂可能な連結剤には、酸−不安定性の４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体が用いられる。すべてのアミノ酸誘導体は、アスパラギンとグルタミンを除いて、それらの前もって形成された対称な無水物誘導体として添加され、これは、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いたカップリングと逆の手順を用いて添加される。全てのカップリング及び脱保護反応を、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸、又はイソチン試験方法を用いてモニタリングする。合成完了時に、５０％のスカベンジャーミックスを含む９５％トリフルオロ酢酸での処理により側鎖保護基を除去するとともに、ペプチドを樹脂担体から切断する。一般的に用いられるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソール、及び水であり、合成されるペプチドの構成アミノ酸に応じて的確に選択される。トリフルオロ酢酸は、真空蒸発により除去され、それに続いて、これをジエチルエーテルですりつぶすことにより、粗ペプチドを得る。存在するスカベンジャーはいずれも、水相の凍結乾燥によりスカベンジャーを含まない粗ペプチドを得るという、単純な抽出方法によって除去される。ペプチド合成試薬は、通常、Calbiochem−Novabiochem（UK）Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UKから入手可能である。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び（主として）逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術のいずれか１つ、又はその組み合わせにより行われてよい。ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析、及び高速原子衝撃（FAB）質量分析を用いて実施されてよい。
【００２９】
質量ラベルはまた、これに限定されないが、アセチル化、メチル化、脱アミド化、及びカルボキシメチル化を含む、アミノ酸の他の化学修飾からなってもよい。質量ラベル修飾が、安定な同位体の組み込み以外である場合には、サンプル調製、分離、及びイオン化の間に内部標準ペプチド挙動を変更するおそれのある修飾を避けることが重要である。
【００３０】
さらに、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質又はペプチドに関連して、１つ以上の置換アミノ酸残基を有するように合成されてよい：例えば、グリシンのアラニンへの置換。このような状況下、被分析タンパク質又はペプチド、及び質量ラベルペプチド内部標準前駆体の切断により、タンパク質からは分析可能なペプチドが、内部標準前駆体からは内部標準ペプチドが生じ、分析的観点から、それらの間の唯一の差は、被分析タンパク質又はペプチド中のグリシンの存在に対する、ペプチド内部標準中のアラニンの存在に起因する、質量シフトである。本発明のこのような実施態様の利点は、質量ラベルペプチド内部標準前駆体の合成の間に、アラニンを、同位体標識アラニンにするよりもむしろ、グリシンに置換するほうがより容易であり得ることである。当業者ならば、さらなる適したアミノ酸置換を容易に理解でき、例えば、バリンとイソロイシンを交換してもよい。
【００３１】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質又はペプチドに関連して、０個、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの置換アミノ酸残基を有してよく、又は被分析タンパク質又はペプチドに関連して、アミノ酸残基の総数の、最大で５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％が異なっていてもよい。好ましくは、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、被分析タンパク質又はペプチドに関連して、置換アミノ酸残基を全く有さないか、又は１つしか置換アミノ酸残基を有さない。
【００３２】
被分析タンパク質断片が、リン酸化などの転写後修飾のいずれかを含む場合には、質量ラベルペプチド内部標準は、同一の修飾がなされるように合成されてよい。
【００３３】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体はまた、ハイブリッドタンパク質の一部としての質量ラベルアミノ酸の存在下、組み換えタンパク質発現により産生されてもよく、この場合、このようなハイブリッドタンパク質は、内部標準前駆体を構成できるか、又はハイブリッドタンパク質は、１つ以上のペプチド内部標準前駆体を産生するように処理されてよい。
【００３４】
組み換えタンパク質発現を用いて質量ラベルペプチド内部標準前駆体を準備する場合には、当業者に周知な方法であって、Sambrook et al (2001) 「Molecular Cloning, a Laboratory Manual」、第３版、Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAにより例証されている方法を用いて、所望のペプチドをコードするDNA分子を準備する。
【００３５】
ついで、質量ラベルペプチド内部標準前駆体を産生するために、適した宿主でDNAを発現させる。従って、発現ベクターを構築し、ついで、これを用いて、前記ペプチドを発現及び産生するのに適した宿主細胞をトランスフォームするという、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された公知技術に従って、前記ペプチドをコードするDNAを用いてよい。このような技術には、以下に開示されるものが含まれる：Rutterらにより１９８４年４月３日に取得された米国特許第４４４０８５９号；Weissmanにより１９８５年７月２３日に取得された同第４５３０９０１号；Crowlにより１９８６年４月１５日に取得された同第４５８２８００号；Markらにより１９８７年６月３０日に取得された同第４６７７０６３号；Goeddelにより１９８７年７月７日に取得された同第４６７８７５１号；Itakuraらにより１９８７年１１月３日に取得された同第４７０４３６２号；Murrayにより１９８７年１２月１日に取得された同第４７１０４６３号；Toole, Jr.らにより１９８８年７月１２日に取得された同第４７５７００６号；Goeddelらにより１９８８年８月２３日に取得された同第４７６６０７５号；及びStalkerにより１９８９年３月７日に取得された同第４８１０６４８号であって、この全ては、参照として本明細書に援用される。
【００３６】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体をコードするDNAは、適切な宿主への導入のために、非常に様々な他のDNA配列と結合されていてもよい。付随するDNAは、宿主の特性、宿主へのDNAの導入方法、及びエピソーム保持又は組み込みを所望するかどうかによって決まるだろう。
【００３７】
通常、DNAは、発現のための適切な配置及び正確なリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要な場合には、DNAを、所望の宿主により認識される、適切な転写及び翻訳制御コントロールヌクレオチド配列と結合させてよいが、とはいえ、このようなコントロールは、通常、発現ベクターで利用できる。従って、DNA挿入物は、適切なプロモーターに操作可能に連結されてよい。細菌プロモーターには、E.coli lacI及びlacZプロモーター、T3及びT7プロモーター、gptプロモーター、ファージλPR及びPLプロモーター、phoAプロモーター、並びにtrpプロモーターが含まれる。真核プロモーターには、CMV最初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期SV40プロモーター、並びにレトロウイルスLTRのプロモーターが含まれる。他の適したプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物はまた、望ましくは、転写開始及び終了部位、並びに転写領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位も含む（Hastingsらによる、１９９８年４月２３日に公開された国際公開第９８／１６６４３号）。
【００３８】
ついで、標準的な技術を通じて、ベクターを宿主に導入する。通常、宿主の全てが、ベクターによりトランスフォームされるわけではなく、従って、トランスフォームされた宿主細胞を選択する必要があるだろう。選択技術の一つでは、任意の必要な制御要素とともに、トランスフォームされた細胞で選択可能な形質をコードするDNA配列マーカーを発現ベクターに組み込むことを伴う。これらのマーカーには、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素、G418耐性、又はネオマイシン耐性が含まれ、E.coli及び他の細菌における培養については、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、又はアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。別法として、このような選択可能な形質に対する遺伝子を別のべクターに入れることもでき、これを用いて、所望の宿主細胞を共トランスフォームする。
【００３９】
ついで、質量ラベルペプチド内部標準前駆体をコードする組み換えDNAによりトランスフォームされている宿主細胞を、ポリペプチドの発現を可能にする当業者に公知の適切な条件下、十分な時間培養し、ついで回収できる。
【００４０】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体を、以下の方法を含む周知方法により、組み換え細胞培養物から回収及び精製できる：硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィー。最も好ましくは、精製のために、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）を用いる。
【００４１】
以下を用いる系を含む、多くの発現系が公知である：例えば、組み換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドDNA発現ベクターなどでトランスフォームされた細菌（例えば、E.coli及びBacillus subtilisなど）；例えば、酵母発現ベクターなどでトランスフォームされた酵母（例えば、Saccaromyces cerevisiaeなど）；例えば、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルスなど）などでトランスフォームされた昆虫細胞系；例えば、ウイルス又は細菌発現ベクターなどでトランスフェクトされた植物細胞系；例えば、アデノウイルス発現ベクターなどでトランスフェクトされた動物細胞系。
【００４２】
質量ラベルペプチド内部標準としての使用に適したアミノ酸配列は、当業者に周知のin silico方法を用いて、タンパク質、及び被分析タンパク質のアミノ酸配列の特異性に基づき、タンパク質の断片化産物を予測することにより決定されてよい。ペプチド内部標準前駆体としての使用に適した１つ以上のアミノ酸配列はまた、被分析タンパク質の断片化及び質量分析により決定されてもよく、生じるペプチド断片の実際の一次構造を決定する。別の側面において、例えば、健康な患者及び病気の患者などに由来する断片化タンパク質の差を分析することにより発見された未知のペプチドを、同定し、配列決定し、その情報を、質量ラベルペプチド内部標準前駆体を設計するために用いてよい。この場合（例として）、伸長配列は、被分析タンパク質のフランキング配列と適合しなくてよいが、但し、未知のペプチドがそれに由来するポリペプチドを同定することが可能であって（配列決定後）、それにより、被分析タンパク質のフランキングアミノ酸を同定することが可能である場合は除かれる。
【００４３】
被分析タンパク質は、任意の既知のタンパク質、又は核酸配列の分析により予測される仮想タンパク質であることができる。被分析タンパク質はまた、以前には知られておらず、その存在が、以下の方法：二次元電気泳動、液体クロマトグラフィー、質量分析、若しくは他の分析方法、又はこれらの組み合わせ方法、を用いた未処理タンパク質又は断片化タンパク質のタンパク質発現分析により示唆されたものであることもできる。このような方法は、当業者に周知である。
【００４４】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、修飾タンパク質及びペプチドを検出及び測定するために設計されてよく、ここで、修飾には、これに限定されないが、リン酸化、グリコシル化、酸化、ファルネシル化、アセチル化、ユビキチン化、脂質化、プレニル化、及びスルホン化が含まれる。これらはまた、mRNAの別のスプライシングにより、in vivoにおけるタンパク質の特異的又は非特異的分解により、又は単一のヌクレオチドの多型に起因する変異により産生される、既知又は予測されるタンパク質及びペプチド種を検出及び測定するために設計されてもよい。
【００４５】
単一の内部標準前駆体を、切断時に、１つ、２つ、又はそれ以上の内部標準ペプチドを生じるように、設計し合成してよい。従って、本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、２つ以上の質量ラベルペプチド内部標準を含む。本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、複数の被分析タンパク質に由来するペプチド断片を分析するために、複数の質量ラベルペプチド内部標準を含む。
【００４６】
ペプチド又はタンパク質の不均一サンプルは、細胞又は組織サンプルから抽出されてよく、又は典型的には（必ずしもそうであることが必要ではないが）ヒト由来の細胞若しくは組織サンプルから抽出された、ペプチド及びタンパク質の不均一サンプルの断片化に由来してもよい。細胞又は組織サンプルは、正常又は病変組織に由来してよい。細胞又は組織サンプルは、様々な分化又は活性状態にある組織に由来してよい。タンパク質及びペプチドのさらなる適切な供給源には、原核生物、真核細胞系、ノックアウトマウス及び他の動物モデル由来の組織物質、並びにトランスジェニック植物及び植物物質が含まれる。このような組織サンプルからタンパク質を抽出する方法は、当業者に周知である。
【００４７】
本発明のこの側面において用いられる質量ラベルペプチド内部標準は、本発明の方法に適した任意の長さであることができ、典型的には４〜５０アミノ酸長、好ましくは１０〜４０アミノ酸長である。質量ラベルペプチド内部標準のサイズは、標準ペプチドが、被分析タンパク質又はペプチドに関連できるような最小サイズ、及び従来の質量分析法を用いて標準ペプチドを分離できるような最大サイズを有するための要件により決定づけられる。
【００４８】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、６〜２００アミノ酸長を有する。上述のとおり、前駆体は、１つ又はいくつかの既知又は予測タンパク質の配列に対応する、１つ又はいくつかのアミノ酸配列を含んでよい。質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、C末端及びN末端の両方において、１つ以上のアミノ酸で伸長されるので、質量ラベルペプチド内部標準前駆体の最小サイズは、６個のアミノ酸である。
【００４９】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、酵素的又は化学的切断への暴露前に実施されるサンプル調製工程の間に、測定されるべき１つ以上の被分析タンパク質とともに共精製される。
【００５０】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、サンプル回収後ではあるが、任意のサンプル調製又は断片化工程の前に、分析されるべきサンプルと組み合わされる。
【００５１】
図２及び図３に関して、質量シフトペプチド内部標準前駆体は、好ましくはサンプル回収後すぐに、好ましくは任意のサンプル調製又は断片化工程前に、分析されるべきサンプルに添加される。従って、質量シフトペプチド内部標準前駆体、及び被分析タンパク質又はペプチドは、同一のサンプル調製又は断片化工程を受ける。いくつかの異なる内部標準前駆体を、複数の異なるタンパク質及びペプチドの定量化を同時に可能にするために添加してよく、いくつかの内部標準前駆体を、重複（redundant）情報を得るために、同一タンパク質由来の異なる断片に対して添加できる。別法として、２つ以上の内部標準を生じる単一の内部標準前駆体を用いてもよい。
【００５２】
ついで、必要に応じて、分析に干渉し得る物質を除去することにより、かつ１つ以上の被分析物を濃縮（enrich）にするために、分析用サンプルを調製できる。用いられてよい方法には、当業者に理解されるとおりの、アフィニティー系技術を用いた、固相抽出、液体クロマトグラフィー、沈殿、限外ろ過、及び精製が含まれる。
【００５３】
サンプル中のタンパク質はまた、例えば、ジスルフィド結合を切断し、ペプチドダイマーの形成を回避するためのシステインの還元及びカルボキシメチル化などにより、化学修飾されてよい。
【００５４】
本発明の方法には、ペプチド断片の不均一サンプルを作製するための、タンパク質又はペプチドの不均一サンプルの断片化工程が含まれる。
【００５５】
タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの不均一サンプルを断片化する工程は、当分野で公知の任意の方法により達成されてよい。例えば、化学的又は酵素的切断を用いてよい。化学的又は酵素的（すなわち、プロテアーゼ指向性）切断の多数の方法が、当分野で公知である。例えば、プロテアーゼには、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、トロンビン、パパイン、ブロメライン、サーモリシン、サブチリシン（subsilisin）、Xa因子、Staphylococcus aureusプロテアーゼ、及びカルボキシペプチダーゼAが含まれる。好ましい実施態様では、断片化方法は、規定の位置で、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを切断する。酵素的切断は、典型的には、以下の表１に示すとおり、配列指向性（sequence−directed）である。従って、本発明のこの側面のさらなる実施態様では、酵素的又は化学的切断は、配列指向性である。
【００５６】
化学的切断方法もまた配列指向性であってよく、例えば、メチオニンのC末端側でタンパク質又はペプチドを切断する臭化シアン断片化などであってよい。
【００５７】
【表１】
【００５８】
表中、R１及びR２は、下記式：
Ｎ末端 ＮＨ−ＣＨＲ１−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨＲ２−ＣＯ C末端
により定義される。
【００５９】
従って、例えば、トリプシン切断は、その切断が、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド中のアルギニン又はリシン残基の存在によって導かれ、その結果、そのC末端残基として、アルギニン又はリシンのいずれかを有する切断断片をもたらすので、配列指向性の断片化手段である。
【００６０】
上述のとおり、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む。このような伸長に適したアミノ酸残基には、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、及びスレオニンなどの、親水性又は中性アミノ酸が含まれる。
【００６１】
あまり適していないアミノ酸残基には、システイン（ジスルフィド結合形成を誘導し得る）、プロリン（これは、得られたペプチドに柔軟性をあまり与えず、エピトープの構造に影響を及ぼし、トリプシン切断に感受性の低いペプチドを生じさせ得る）、及び疎水性又は芳香残基（これらは、ペプチドの溶解性を低減し得る）が含まれる。さらに、トリプシンが、配列指向性の断片化方法の手段（上述のとおり）として用いられる場合には、トリプシンは、疎水性アミノ酸残基のC末端において、より小さな範囲に切断し得る。
【００６２】
本発明のこの側面のさらなる実施態様では、質量ラベルペプチド内部標準前駆体及び１つ又は複数の被分析タンパク質を含むサンプルは、酵素的又は化学的切断後に分離される。
【００６３】
不均一タンパク質集団のペプチドへの断片化は、ペプチドのより高い複合混合物を通常もたらし、複雑性を低減させるために質量分析前に分離を必要とする。ペプチド分離のために用いられてよい方法には、当業者に理解されるとおりの、液体クロマトグラフィー（一次元以上の分離次元において）、固相抽出、及びアフィニティーキャプチャーが含まれる。
【００６４】
分離は、オンラインで（液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレー質量分析）、又は分画とそれに続く、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（MALDI）法などによる、個別の断片の分析によるいずれかで、質量分析と組み合わされることができる。被分析ペプチドと質量ラベル内部標準ペプチドとの存在量（abundance）の差を、シングルステージの質量分析（MS）又はマルチステージのMS（MS／MS又はMSn）のいずれかにより測定できる。二段階質量分析においては、第一の質量分離を用いて、分析されるべきペプチドを選択し、ついで、選択したペプチドを断片化し、第二段階の質量分離において、その断片を分析する。
【００６５】
MS／MSは、同一の分子量（molecular mass）を有するが、異なるアミノ酸組成を有するペプチドを分離する可能性を有しているので、複合ペプチド混合物を分析するための非常に強力なアプローチである。
【００６６】
質量分析により特定のペプチドから得られるシグナル強度は、ペプチドの濃度、分子量（molecular weight）、及びイオン化特性、並びにサンプル中の他の構成成分の抑制（クエンチング）効果によって決まる。例えば、同位体組成を除いては同一である２つのペプチドについて、その相対シグナル強度は、他の全ての因子が、それらに等しく影響を及ぼすべきであるので、濃度によってのみ決まるだろう（図２）。
【００６７】
ペプチドを分離するための好ましい方法は、参照として本明細書に援用されるＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２５６６に記載のとおりの、「シグネチャーペプチドキャプチャー（Signature Peptide Capture）」（SPC）である。
【００６８】
SPCは、ペプチド若しくはタンパク質、又はそれらの断片の不均一サンプルを分析するための方法であって、以下の工程：
（a）アレイ上の、間隔をあけて規定された位置に、各クラスの不均一ペプチド又はタンパク質メンバーを結合することによる、ペプチド若しくはタンパク質、又はそれらの断片の不均一サンプルを、不均一クラスに分離する工程であって、ここで、各クラスにおけるペプチド又はタンパク質は、そのクラスに共通するモチーフを有する、工程；及び
（b）各クラスにおけるペプチド又はタンパク質を特性決定する工程、
を含む。
【００６９】
ペプチド又はタンパク質の各不均一クラスは、アレイ上に存在する特異的結合分子と結合する、不均一サンプル中の全てのペプチド又はタンパク質からなる。結合分子は、特定のタンパク質又はペプチドよりもむしろモチーフとの結合能力について選択されるので、結合分子は、同一モチーフを含む、異なるタイプのタンパク質及びペプチドと結合できる。好ましくは、各結合分子は、所定のモチーフに特異的である。従って、SPCにおいて、所定の結合分子により結合された、不均一クラスのタンパク質及びペプチドは、典型的には、平均して、少なくとも２種、より典型的には２種を超える、例えば、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００種以上の異なるタイプのタンパク質又はペプチドを含む。
【００７０】
従って、タンパク質及びペプチドは、特異的結合分子により捕捉され保持される、それらの能力に基づいて、SPCにより分類される。不均一クラスのペプチド又はタンパク質は、特定のクラスの全てのメンバーに共通するモチーフの存在に起因して、特異的結合分子と結合するだろう。従って、各クラスのペプチドにおいて、結合されるモチーフの同一性は、そのクラスを規定する、結合分子の結合特異性の結果である。
【００７１】
本発明の方法は、SPCが、タンパク質又はペプチドの不均一サンプルについての分析を提供するだけでなく、その不均一サンプルの１つ以上の構成成分を定量化することも可能にする。
【００７２】
本発明のさらなる側面は、患者が、１つ以上のポリペプチドレベルの増加又は減少により特徴付けられる疾患を有しているかどうか、又は前記疾患に罹りやすい恐れがあるかどうかの診断を補助する方法であって、前記患者から試験サンプルを得る工程、及び本発明の第一の側面の方法を用いて、前記１つ以上のポリペプチドレベルを定量化する工程を含む方法である。
【００７３】
本発明の方法は、患者が疾患を有しているかどうか、又は疾患に罹りやすい恐れがあるかどうかを決定するために、他の診断方法と併用して用いることができる。これは、本発明の方法を用いて、試験サンプル中のタンパク質又はペプチドレベルを定量化できるからである。従って、本発明の方法を用いることにより、１つ以上のポリペプチドレベルの増加又は減少を結果としてもたらす疾患の診断を助けることができる。
【００７４】
「試験サンプル」には、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、胸膜液、及び精液などの体液のサンプルが含まれる。
【００７５】
１つ以上のポリペプチドレベルの増加又は減少を結果としてもたらし得る疾患の例には、癌、発作（stroke）、代謝性疾患、炎症、心筋梗塞、又はアテローム性動脈硬化が含まれる。
【００７６】
本発明のさらなる側面は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む、質量ラベルペプチド内部標準前駆体であって、ここで、前記前駆体は、酵素的又は化学的切断への暴露時に、１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成する。
【００７７】
「質量ラベルペプチド内部標準前駆体」という用語には、本発明の第一の側面に関連して定義された、それらのペプチド又はタンパク質が含まれる。従って、内部標準前駆体は、プロテアーゼ又は化学物質による断片化時に、わずかに異なる分子量を除いて、分析されるべき１つ以上のタンパク質からもたらされる断片と同一又はほぼ同一の断片を生じるだろう。
【００７８】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体の酵素的又は化学的切断方法は、本発明の第一の側面に関連して上述している。
【００７９】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体のアミノ酸配列は、当業者に理解されるとおり、標的となる被分析タンパク質又はペプチドに応じて、必然的に変化するだろう。
【００８０】
本発明のさらなる側面では、先に定義したとおりの、又は本発明の第一の側面に関連して定義したとおりの質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、ペプチドを断片化するための作用物質とを含む部品のキットを提供する。
【００８１】
本発明のさらなる側面では、先に定義したとおりの、又は本発明の第一の側面に関連して定義したとおりの質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、被分析タンパク質又はペプチドを含む試験サンプル、又は被分析タンパク質若しくはペプチドについて試験されるべき（例えば、含むと考える）試験サンプルとを含む部品のキットを提供する。このキットには、ペプチドを断片化するための作用物質をさらに含めてもよい。
【００８２】
上述のとおり、質量ラベルペプチド内部標準前駆体は、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む。
【００８３】
ペプチドを断片化するのに適した作用物質は、本発明の第一の側面に関連して上述している。キットの一部として供給されるべき作用物質は、質量ラベルペプチド内部標準前駆体の断片化特性に応じて必然的に変わり、例えば、前記前駆体が、トリプリンでの消化後に正しい質量ラベルペプチド内部標準を生じるならば、キットにはトリプシンが含まれるだろう。
【００８４】
キットにはまた、本発明の方法で使用するためのさらなる試薬を含めてもよく、例えば、当業者に理解されるとおりの、チップフォーマットでのアフィニティーアレイ、抗体、又はアフィニティーカラムなどである。
【００８５】
好ましくは、キットにはまた、本発明の第一の側面に関連して上述したとおりの、断片化ペプチドのSPCを介した分離を実施するのに必要とされる全ての構成要素を含めてもよい。
【００８６】
従って、キットにはまた、固相担体（典型的にはガラス又はポリマー）上の別個の領域でそれぞれ固定されている、多数の異なるタイプの結合分子を有するアレイを含めてもよい。それぞれの結合分子は、本発明の第一の側面に関連して上述したとおり、特定のタンパク質又はペプチドよりもむしろモチーフに特異的に結合する能力を有する。
【００８７】
本明細書で言及した全ての文献は、誤解を避けるために、参照として本明細書に援用される。
【００８８】
以下の非限定的な図面及び実施例を参照することにより、本発明を説明する。
【００８９】
[実施例]
（実施例１：ヒト血清におけるトランフェリンの定量化）
トランスフェリンは、鉄結合輸送タンパク質であって、吸着及びヘム分解部位から、貯蔵及び利用部位への鉄の輸送に関与する。血清トランスフェリンはまた、細胞増殖を刺激するのに、さらなる役割を有し得る。トランスフェリンの血漿レベルは、妊娠及び鉄欠乏の間に増加し、炎症、腫瘍、ネフローゼ、及びヘモクロマトーシスにより増加し得る。正常な血漿レベルは、２〜４ｍｇ／ｍＬである。
【００９０】
「EPNNK EGYYGYTGAFR*CLVE」のアミノ酸配列を有する内部ペプチド標準前駆体を合成し、ここで、アルギニンは、６個の１３C原子を組み込むことにより同位体標識されている。このペプチドを、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解する。
【００９１】
（サンプル調製）
分析されるべき０．１ｍＬの血清サンプルを、０．９ｍＬの内部ペプチド標準前駆体溶液と混合する。PBS中７５ｍＭのジチオスレイトール２２０μＬを添加することにより、このサンプルを還元し、５０℃で８０分間インキュベートする。PBS中１Ｍのヨード酢酸６０μＬを添加し、このサンプルを、暗所で、３７℃で３０分間インキュベートする。残存ヨード酢酸を、PBS中７５ｍＭのジチオスレイトール２２０μＬを添加することにより還元する。還元され、アルキル化されたタンパク質を、製造業者により提供されるプロトコルに従って、PD−10カラム（Amersham Biotech）でのゲル濾過により、過剰試薬から分離する。タンパク質画分を、およそ２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、３ｍＬのPBSで溶出する。１５０μＬのトリプリシン溶液（PBS中１ｍｇ／ｍＬのトリプシン）を添加し、このサンプルを３７℃で２時間インキュベートする。すぐに分析しない場合には、消化されたサンプルを−８０℃で凍結する。
【００９２】
（ペプチドの分離）
ペプチドを、２μＬ／分の流速で、C18固定相を用いたキャピラリーカラム（１００μｍ×１０ｃｍ）での逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離する。１０μＬのサンプルを負荷し、５〜６０％の相Bの移動相グラジエントにより、４５分間、ペプチドを溶出する（溶離液A：２％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸、溶離液B：９５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）。溶出されたペプチドを、MALDI−TOF金属ターゲット上に直接、２μＬ画分で回収し、乾燥させる。
【００９３】
関連するペプチドを含む画分を同定するために、０．９ｍＬの内部ペプチド標準前駆体溶液を、上述のとおりではあるが、血清サンプルを０．１ｍＬのPBSに置き換えて調製する。上述のとおり、ペプチドを分離し、別のMALDIターゲットに回収する。MALDIターゲットプレートを、以下（bellow）のとおり、スキャンして、プレート上にペプチドを局在化させる。
【００９４】
（質量分析）
１μＬのα−シアノ−シナピン酸溶液（１％のトリフルオロ酢酸中５ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれの画分に添加する。リフレクターを備えたMALDI−TOF質量分析計を用いて、画分を分析する。
【００９５】
「EGYYGYTGAFR」配列を有する、トランスフェリン由来の被分析ペプチドは、１２８４．５７ダルトン（１２８３．５７プラス１プロトン）の質量に相当するシグナルを生じたが、他方、内部ペプチド標準は、１２８０．５７ダルトンの質量を有するものとして検出される。シグナルの相対強度は、被分析ペプチド及び参照ペプチドの相対量を反映するだろう。
[参考文献]
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１には、タンパク質からは分析可能なペプチドを、内部標準前駆体からは内部標準ペプチドを生じる、被分析タンパク質及び質量ラベルペプチド内部標準前駆体の切断を示す。
【図２】図２には、生物学的サンプル及び質量シフトペプチド内部標準前駆体の分析方法を示す。
【図３】図３には、被分析物及び内部標準ペプチドの質量分析結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体から１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成させるために、分析されるべきサンプルと１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体とを、酵素的又は化学的切断に一緒に暴露する工程を含み、
ここで前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む、
酵素的又は化学的切断により１つ又は複数の被分析タンパク質から生成された１つ以上のペプチドの質量分析を用いた、定量測定方法。
【請求項２】
前記N末端伸長部が、前記前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側に対応する被分析タンパク質の配列において、前記被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのN末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列を、前記伸長部のC末端終端部に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記C末端伸長部が、前記前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側に対応する被分析タンパク質の配列において、前記被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのC末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列を、前記伸長部のN末端終端部に含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準のN末端に隣接する、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列が、前記質量ラベルペプチド内部標準の配列に対応する被分析タンパク質の配列において、前記被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのN末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一である、請求項１乃至３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準のC末端に隣接する、少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列が、前記質量ラベルペプチド内部標準の配列に対応する被分析タンパク質の配列において、前記被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのC末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一である、請求項１乃至４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
それぞれの質量ラベルペプチド内部標準が、４〜５０アミノ酸長を有する、請求項１乃至５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
それぞれの質量ラベルペプチド内部標準が、１０〜４０アミノ酸長を有する、請求項１乃至５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、６〜２００アミノ酸長を有する、請求項１乃至７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、２つ以上の質量ラベルペプチド内部標準を含む、請求項１乃至８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、複数の被分析タンパク質に由来するペプチド断片を分析するために、複数の質量ラベルペプチド内部標準を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、酵素的又は化学的切断への暴露前に実施されるサンプル調製の間に、測定されるべき１つ以上の被分析タンパク質とともに共精製される、請求項１乃至１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、サンプル収集後ではあるが、任意のサンプル調製又は断片化工程の前に、分析されるべきサンプルと組み合わされる、請求項１乃至１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素的又は化学的切断が、配列指向性である、請求項１乃至１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、１つ又は複数の被分析タンパク質を含むサンプルとが、酵素的又は化学的切断後に分離される、請求項１乃至１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記分離が、シグネチャーペプチドキャプチャーを用いて行われる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
患者が、１つ以上のポリペプチドレベルの増加又は減少により特徴付けられる疾患を有しているかどうか、又は前記疾患に罹りやすい恐れがあるかどうかの診断を補助する方法であって、前記患者から試験サンプルを得る工程、及び請求項１乃至１５のいずれか一項に規定される方法を用いて、前記１つ以上のポリペプチドレベルを定量化する工程を含む、方法。
【請求項１７】
そこから生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する、少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部、及びそこから生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する、少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部を含み、酵素的又は化学的切断への暴露時に、１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成する、質量ラベルペプチド内部標準前駆体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の、又は請求項１乃至１６のいずれか一項で規定されるとおりの、質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、ペプチドを断片化するための作用物質とを含む部品のキット。
【請求項１９】
請求項１７に記載の、又は請求項１乃至１６のいずれか一項で規定されるとおりの、質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、被分析タンパク質又はペプチドを含む試験サンプル、又は被分析タンパク質若しくはペプチドについて試験されるべき試験サンプルとを含む部品のキット。
【請求項１】
１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体から１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成させるために、分析されるべきサンプルと１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準前駆体とを、酵素的又は化学的切断に一緒に暴露する工程を含み、
ここで前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部と、前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部とを含む、
酵素的又は化学的切断により１つ又は複数の被分析タンパク質から生成された１つ以上のペプチドの質量分析を用いた、定量測定方法。
【請求項２】
前記N末端伸長部が、前記前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側に対応する被分析タンパク質の配列において、前記被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのN末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列を、前記伸長部のC末端終端部に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記C末端伸長部が、前記前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側に対応する被分析タンパク質の配列において、前記被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのC末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列を、前記伸長部のN末端終端部に含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準のN末端に隣接する、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列が、前記質量ラベルペプチド内部標準の配列に対応する被分析タンパク質の配列において、前記被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのN末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一である、請求項１乃至３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記前駆体から生じる質量ラベルペプチド内部標準のC末端に隣接する、少なくとも２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸のアミノ酸配列が、前記質量ラベルペプチド内部標準の配列に対応する被分析タンパク質の配列において、前記被分析タンパク質に（切断前に）存在する、そのC末端配列に隣接するアミノ酸配列と同一である、請求項１乃至４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
それぞれの質量ラベルペプチド内部標準が、４〜５０アミノ酸長を有する、請求項１乃至５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
それぞれの質量ラベルペプチド内部標準が、１０〜４０アミノ酸長を有する、請求項１乃至５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、６〜２００アミノ酸長を有する、請求項１乃至７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、２つ以上の質量ラベルペプチド内部標準を含む、請求項１乃至８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、複数の被分析タンパク質に由来するペプチド断片を分析するために、複数の質量ラベルペプチド内部標準を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、酵素的又は化学的切断への暴露前に実施されるサンプル調製の間に、測定されるべき１つ以上の被分析タンパク質とともに共精製される、請求項１乃至１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体が、サンプル収集後ではあるが、任意のサンプル調製又は断片化工程の前に、分析されるべきサンプルと組み合わされる、請求項１乃至１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素的又は化学的切断が、配列指向性である、請求項１乃至１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、１つ又は複数の被分析タンパク質を含むサンプルとが、酵素的又は化学的切断後に分離される、請求項１乃至１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記分離が、シグネチャーペプチドキャプチャーを用いて行われる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
患者が、１つ以上のポリペプチドレベルの増加又は減少により特徴付けられる疾患を有しているかどうか、又は前記疾患に罹りやすい恐れがあるかどうかの診断を補助する方法であって、前記患者から試験サンプルを得る工程、及び請求項１乃至１５のいずれか一項に規定される方法を用いて、前記１つ以上のポリペプチドレベルを定量化する工程を含む、方法。
【請求項１７】
そこから生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もN末端側のN末端に対する、少なくとも１つのアミノ酸のN末端伸長部、及びそこから生じる質量ラベルペプチド内部標準の最もC末端側のC末端に対する、少なくとも１つのアミノ酸のC末端伸長部を含み、酵素的又は化学的切断への暴露時に、１つ又は複数の質量ラベルペプチド内部標準を生成する、質量ラベルペプチド内部標準前駆体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の、又は請求項１乃至１６のいずれか一項で規定されるとおりの、質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、ペプチドを断片化するための作用物質とを含む部品のキット。
【請求項１９】
請求項１７に記載の、又は請求項１乃至１６のいずれか一項で規定されるとおりの、質量ラベルペプチド内部標準前駆体と、被分析タンパク質又はペプチドを含む試験サンプル、又は被分析タンパク質若しくはペプチドについて試験されるべき試験サンプルとを含む部品のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５０３７３８（Ｐ２００８−５０３７３８Ａ）
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１７２１３（Ｐ２００７−５１７２１３）
【出願日】平成１７年６月２２日（２００５．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００６８６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２８４１
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０６２０９７４３）バイオインヴェント インターナショナル アーベー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２２日（２００５．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００６８６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２８４１
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０６２０９７４３）バイオインヴェント インターナショナル アーベー (9)
【Ｆターム（参考）】
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