切断反応を用いて核酸を検出するための組成物および方法
本発明は、プライマー-プローブ二重鎖を利用して、試料中の標的核酸の存在を示すシグナルを生成するための組成物および方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
第一のオリゴヌクレオチドの3'領域が第二のオリゴヌクレオチドに対して非相補的であり、かつ標的の第一鎖に対して相補的である、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項３】
第二のオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項４】
第二のオリゴヌクレオチドが相互作用シグナル生成部分の対を含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項５】
相互作用シグナル生成部分の対が消光部分と蛍光部分とを含む、請求項4記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項６】
相互作用シグナル生成部分の対が、非オーバーラップ切断構造の切断時に分離するように有効に配置される、請求項4記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項７】
相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの5'フラップに機能的に結合し、かつ相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの+1位に機能的に結合する、請求項6記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項８】
相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域に機能的に結合し、かつ相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが第二のオリゴヌクレオチドの3'領域に機能的に結合する、請求項6記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項９】
第二のオリゴヌクレオチドが、第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的であるヌクレオチドの3'テールをさらに含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１０】
3'テールが、標的核酸の第二鎖における第二のオリゴヌクレオチドに対して相補的な領域より下流の、標的核酸の第二鎖における領域に対して相補的である、請求項9記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１１】
第二のオリゴヌクレオチドが切断抵抗性プローブである、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１２】
切断抵抗性プローブが、+1位より下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項11記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１３】
切断抵抗性プローブが、+2位より下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項11記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１４】
以下を含む、組成物：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、かつ第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドプライマーが、標的核酸の第二鎖にアニールする場合に第二のオリゴヌクレオチドより上流にある、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
切断オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項14記載の組成物。
【請求項１７】
切断オリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖にアニールする場合に第二のオリゴヌクレオチドより上流にある、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
切断オリゴヌクレオチドが3'ブロックを有する、請求項16記載の組成物。
【請求項１９】
3'ブロックが、標的核酸に対して非相補的である一つまたは複数のヌクレオチドを含む、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび切断オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項14記載の組成物。
【請求項２１】
5'ヌクレアーゼをさらに含む、請求項14記載の組成物。
【請求項２２】
5'ヌクレアーゼがFENである、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
5'ヌクレアーゼが5'→3'合成活性を実質的に欠損している、請求項21記載の組成物。
【請求項２４】
5'ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項21記載の組成物。
【請求項２５】
5'ヌクレアーゼがFEN-1である、請求項21記載の組成物。
【請求項２６】
5'ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項21記載の組成物。
【請求項２７】
核酸ポリメラーゼをさらに含む、請求項21記載の組成物。
【請求項２８】
核酸ポリメラーゼが5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠損している、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
核酸ポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項27記載の組成物。
【請求項３０】
核酸ポリメラーゼがPfu DNAポリメラーゼである、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対と、その包装材料とを含むキット。
【請求項３２】
ヌクレアーゼをさらに含む、請求項31記載のキット。
【請求項３３】
核酸ポリメラーゼをさらに含む、請求項31記載のキット。
【請求項３４】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a．第一のオリゴヌクレオチドと、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチドと、
標的核酸と、
核酸ポリメラーゼと、
5'ヌクレアーゼと
を含む反応混合物を、核酸の重合化および切断構造の切断を可能にする条件に供する段階；
b．第一のオリゴヌクレオチドの伸長産物との二重鎖の状態にある第二のオリゴヌクレオチドを含む切断構造を形成する段階であって、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が伸長産物に対して非相補的であり、かつ5'ヌクレアーゼによって切断される、段階；ならびに
c．切断構造の切断を検出する段階。
【請求項３５】
第一のオリゴヌクレオチドが5'領域および3'領域を含み、第一のオリゴヌクレオチドの3'領域が第二のオリゴヌクレオチドに対して非相補的であり、かつ標的の第一鎖に対して相補的である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
第二のオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
第二のオリゴヌクレオチドが相互作用シグナル生成部分の対を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域に機能的に結合し、かつ相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域に機能的に結合する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
相互作用シグナル生成部分の対が、消光部分および蛍光部分を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
相互作用シグナル生成部分の対が、非オーバーラップ切断構造の切断時に分離するように有効に配置される、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの5'フラップに機能的に結合し、かつ相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが第二のオリゴヌクレオチドの+1位に機能的に結合する、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
第二のオリゴヌクレオチドが、第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的であるヌクレオチドの3'テールをさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項４４】
3'テールが、標的核酸の第二鎖における第二のオリゴヌクレオチドに対して相補的な領域より下流の、標的核酸の第二鎖における領域に対して相補的である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
第二のオリゴヌクレオチドが切断抵抗性プローブである、請求項34記載の方法。
【請求項４６】
切断抵抗性プローブが、+1位より下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
切断抵抗性プローブが、+2位より下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
5'ヌクレアーゼがFENである、請求項34記載の方法。
【請求項４９】
5'ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項34記載の方法。
【請求項５０】
5'ヌクレアーゼがFEN-1である、請求項34記載の方法。
【請求項５１】
5'ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項34記載の方法。
【請求項５２】
5'ヌクレアーゼが5'→3'合成活性を実質的に欠損している、請求項34記載の方法。
【請求項５３】
核酸ポリメラーゼが5'→3'ヌクレアーゼ活性を実質的に欠損している、請求項34記載の方法。
【請求項５４】
核酸ポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項34記載の方法。
【請求項５５】
切断抵抗性プローブが5'領域および3'領域を含み、3'領域が標的核酸の第二鎖に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ5'領域が標的核酸の第二鎖に対して相補的ではない、請求項45記載の方法。
【請求項５６】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a．第一のオリゴヌクレオチドと、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチドと、
切断オリゴヌクレオチドと、
標的核酸と、
核酸ポリメラーゼと、
5'ヌクレアーゼと
を含む反応混合物を、核酸の重合化および切断構造の切断を可能にする条件に供する段階；
b．いずれも第一のオリゴヌクレオチドの伸長産物との二重鎖の状態にある第二のオリゴヌクレオチドおよび切断オリゴヌクレオチドを含む切断構造を形成する段階であって、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が伸長産物に対して非相補的であり、かつ5'ヌクレアーゼによって切断される、段階；ならびに
c．切断構造の切断を検出する段階。
【請求項５７】
切断オリゴヌクレオチドが、標的核酸に対して非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a．第一のオリゴヌクレオチドと、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチドと、
リバースオリゴヌクレオチドプライマーと、
標的核酸と、
核酸ポリメラーゼと、
5'ヌクレアーゼと
を含む反応混合物を、核酸の重合化および切断構造の切断を可能にする条件に供する段階；
b．いずれも第一のオリゴヌクレオチドの伸長産物との二重鎖の状態にある、第二のオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物とを含む切断構造を形成する段階であって、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が伸長産物に対して非相補的であり、かつ5'ヌクレアーゼによって切断される、段階；ならびに
c．切断構造の切断を検出する段階。
【請求項５９】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a．第一のオリゴヌクレオチドと、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチドと、
切断オリゴヌクレオチドと、
リバースプライマーと、
標的核酸と、
核酸ポリメラーゼと、
5'ヌクレアーゼと
を含む反応混合物を、核酸の重合化および切断構造の切断を可能にする条件に供する段階；
b．いずれも第一のオリゴヌクレオチドの伸長産物との二重鎖の状態にある、第二のオリゴヌクレオチドと切断オリゴヌクレオチドとを含む切断構造を形成する段階であって、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が伸長産物に対して非相補的であり、かつ5'ヌクレアーゼによって切断される、段階；ならびに
c．切断構造の切断を検出する段階。
【請求項６０】
第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における切断オリゴヌクレオチドに対して相補的な領域に近接する、標的核酸の第二鎖における領域に対して相補的である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
第二のオリゴヌクレオチドおよび切断オリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖にハイブリダイズする場合にギャップによって分離されている、請求項59記載の方法。
【請求項６２】
第二のオリゴヌクレオチドおよび切断オリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖にハイブリダイズする場合にニックによって分離されている、請求項59記載の方法。
【請求項６３】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６６】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６７】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、かつ第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６８】
以下を含む組成物：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、かつ第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６９】
以下を含む反応混合物を、核酸の重合化を可能にする条件に供する段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
第一のオリゴヌクレオチド、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド、
核酸ポリメラーゼ、
5'ヌクレアーゼ、
第一鎖および第二鎖を含み、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域に対する相補性および第一のオリゴヌクレオチドに対する相補性を有することが予想される標的核酸、
ここで、標的核酸の第一鎖と第一のオリゴヌクレオチドとの間、および、標的核酸の第二鎖と第二のオリゴヌクレオチドの3'領域との間に相補性が存在する場合に、第一のオリゴヌクレオチドの伸長によって伸長産物が形成され、第二のオリゴヌクレオチドおよび伸長産物を含む切断構造が形成され、該条件が、形成された切断構造の切断および切断構造の切断の検出を可能にする。
【請求項１】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
第一のオリゴヌクレオチドの3'領域が第二のオリゴヌクレオチドに対して非相補的であり、かつ標的の第一鎖に対して相補的である、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項３】
第二のオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項４】
第二のオリゴヌクレオチドが相互作用シグナル生成部分の対を含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項５】
相互作用シグナル生成部分の対が消光部分と蛍光部分とを含む、請求項4記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項６】
相互作用シグナル生成部分の対が、非オーバーラップ切断構造の切断時に分離するように有効に配置される、請求項4記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項７】
相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの5'フラップに機能的に結合し、かつ相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの+1位に機能的に結合する、請求項6記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項８】
相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域に機能的に結合し、かつ相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが第二のオリゴヌクレオチドの3'領域に機能的に結合する、請求項6記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項９】
第二のオリゴヌクレオチドが、第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的であるヌクレオチドの3'テールをさらに含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１０】
3'テールが、標的核酸の第二鎖における第二のオリゴヌクレオチドに対して相補的な領域より下流の、標的核酸の第二鎖における領域に対して相補的である、請求項9記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１１】
第二のオリゴヌクレオチドが切断抵抗性プローブである、請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１２】
切断抵抗性プローブが、+1位より下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項11記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１３】
切断抵抗性プローブが、+2位より下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項11記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対。
【請求項１４】
以下を含む、組成物：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、かつ第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドプライマーが、標的核酸の第二鎖にアニールする場合に第二のオリゴヌクレオチドより上流にある、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
切断オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項14記載の組成物。
【請求項１７】
切断オリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖にアニールする場合に第二のオリゴヌクレオチドより上流にある、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
切断オリゴヌクレオチドが3'ブロックを有する、請求項16記載の組成物。
【請求項１９】
3'ブロックが、標的核酸に対して非相補的である一つまたは複数のヌクレオチドを含む、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび切断オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項14記載の組成物。
【請求項２１】
5'ヌクレアーゼをさらに含む、請求項14記載の組成物。
【請求項２２】
5'ヌクレアーゼがFENである、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
5'ヌクレアーゼが5'→3'合成活性を実質的に欠損している、請求項21記載の組成物。
【請求項２４】
5'ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項21記載の組成物。
【請求項２５】
5'ヌクレアーゼがFEN-1である、請求項21記載の組成物。
【請求項２６】
5'ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項21記載の組成物。
【請求項２７】
核酸ポリメラーゼをさらに含む、請求項21記載の組成物。
【請求項２８】
核酸ポリメラーゼが5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠損している、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
核酸ポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項27記載の組成物。
【請求項３０】
核酸ポリメラーゼがPfu DNAポリメラーゼである、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対と、その包装材料とを含むキット。
【請求項３２】
ヌクレアーゼをさらに含む、請求項31記載のキット。
【請求項３３】
核酸ポリメラーゼをさらに含む、請求項31記載のキット。
【請求項３４】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a．第一のオリゴヌクレオチドと、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチドと、
標的核酸と、
核酸ポリメラーゼと、
5'ヌクレアーゼと
を含む反応混合物を、核酸の重合化および切断構造の切断を可能にする条件に供する段階；
b．第一のオリゴヌクレオチドの伸長産物との二重鎖の状態にある第二のオリゴヌクレオチドを含む切断構造を形成する段階であって、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が伸長産物に対して非相補的であり、かつ5'ヌクレアーゼによって切断される、段階；ならびに
c．切断構造の切断を検出する段階。
【請求項３５】
第一のオリゴヌクレオチドが5'領域および3'領域を含み、第一のオリゴヌクレオチドの3'領域が第二のオリゴヌクレオチドに対して非相補的であり、かつ標的の第一鎖に対して相補的である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
第二のオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
第二のオリゴヌクレオチドが相互作用シグナル生成部分の対を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域に機能的に結合し、かつ相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域に機能的に結合する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
相互作用シグナル生成部分の対が、消光部分および蛍光部分を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
相互作用シグナル生成部分の対が、非オーバーラップ切断構造の切断時に分離するように有効に配置される、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
相互作用シグナル生成部分の対の第一のメンバーが、第二のオリゴヌクレオチドの5'フラップに機能的に結合し、かつ相互作用シグナル生成部分の対の第二のメンバーが第二のオリゴヌクレオチドの+1位に機能的に結合する、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
第二のオリゴヌクレオチドが、第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的であるヌクレオチドの3'テールをさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項４４】
3'テールが、標的核酸の第二鎖における第二のオリゴヌクレオチドに対して相補的な領域より下流の、標的核酸の第二鎖における領域に対して相補的である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
第二のオリゴヌクレオチドが切断抵抗性プローブである、請求項34記載の方法。
【請求項４６】
切断抵抗性プローブが、+1位より下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
切断抵抗性プローブが、+2位より下流の部分を切断に対して非感受性にする一つまたは複数の改変を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
5'ヌクレアーゼがFENである、請求項34記載の方法。
【請求項４９】
5'ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項34記載の方法。
【請求項５０】
5'ヌクレアーゼがFEN-1である、請求項34記載の方法。
【請求項５１】
5'ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項34記載の方法。
【請求項５２】
5'ヌクレアーゼが5'→3'合成活性を実質的に欠損している、請求項34記載の方法。
【請求項５３】
核酸ポリメラーゼが5'→3'ヌクレアーゼ活性を実質的に欠損している、請求項34記載の方法。
【請求項５４】
核酸ポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項34記載の方法。
【請求項５５】
切断抵抗性プローブが5'領域および3'領域を含み、3'領域が標的核酸の第二鎖に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ5'領域が標的核酸の第二鎖に対して相補的ではない、請求項45記載の方法。
【請求項５６】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a．第一のオリゴヌクレオチドと、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチドと、
切断オリゴヌクレオチドと、
標的核酸と、
核酸ポリメラーゼと、
5'ヌクレアーゼと
を含む反応混合物を、核酸の重合化および切断構造の切断を可能にする条件に供する段階；
b．いずれも第一のオリゴヌクレオチドの伸長産物との二重鎖の状態にある第二のオリゴヌクレオチドおよび切断オリゴヌクレオチドを含む切断構造を形成する段階であって、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が伸長産物に対して非相補的であり、かつ5'ヌクレアーゼによって切断される、段階；ならびに
c．切断構造の切断を検出する段階。
【請求項５７】
切断オリゴヌクレオチドが、標的核酸に対して非相補的である少なくとも一つの3'末端ヌクレオチドを含む、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a．第一のオリゴヌクレオチドと、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチドと、
リバースオリゴヌクレオチドプライマーと、
標的核酸と、
核酸ポリメラーゼと、
5'ヌクレアーゼと
を含む反応混合物を、核酸の重合化および切断構造の切断を可能にする条件に供する段階；
b．いずれも第一のオリゴヌクレオチドの伸長産物との二重鎖の状態にある、第二のオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物とを含む切断構造を形成する段階であって、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が伸長産物に対して非相補的であり、かつ5'ヌクレアーゼによって切断される、段階；ならびに
c．切断構造の切断を検出する段階。
【請求項５９】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a．第一のオリゴヌクレオチドと、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチドと、
切断オリゴヌクレオチドと、
リバースプライマーと、
標的核酸と、
核酸ポリメラーゼと、
5'ヌクレアーゼと
を含む反応混合物を、核酸の重合化および切断構造の切断を可能にする条件に供する段階；
b．いずれも第一のオリゴヌクレオチドの伸長産物との二重鎖の状態にある、第二のオリゴヌクレオチドと切断オリゴヌクレオチドとを含む切断構造を形成する段階であって、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が伸長産物に対して非相補的であり、かつ5'ヌクレアーゼによって切断される、段階；ならびに
c．切断構造の切断を検出する段階。
【請求項６０】
第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における切断オリゴヌクレオチドに対して相補的な領域に近接する、標的核酸の第二鎖における領域に対して相補的である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
第二のオリゴヌクレオチドおよび切断オリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖にハイブリダイズする場合にギャップによって分離されている、請求項59記載の方法。
【請求項６２】
第二のオリゴヌクレオチドおよび切断オリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖にハイブリダイズする場合にニックによって分離されている、請求項59記載の方法。
【請求項６３】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６６】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６７】
以下を含む、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの対：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、かつ第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６８】
以下を含む組成物：
第一のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第一鎖における領域にアニールすることによって伸長反応の合成をプライミングし、かつ第二のオリゴヌクレオチドが、標的核酸の第二鎖における領域にアニールして切断構造を形成し、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、かつ第二のオリゴヌクレオチドの5'領域が第一のオリゴヌクレオチドに対して非相補的である、5'領域および3'領域を含む第一のオリゴヌクレオチドならびに5'領域および3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド。
【請求項６９】
以下を含む反応混合物を、核酸の重合化を可能にする条件に供する段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
第一のオリゴヌクレオチド、
5'領域、および第一のオリゴヌクレオチドに対して相補的である3'領域を含む第二のオリゴヌクレオチド、
核酸ポリメラーゼ、
5'ヌクレアーゼ、
第一鎖および第二鎖を含み、第二のオリゴヌクレオチドの3'領域に対する相補性および第一のオリゴヌクレオチドに対する相補性を有することが予想される標的核酸、
ここで、標的核酸の第一鎖と第一のオリゴヌクレオチドとの間、および、標的核酸の第二鎖と第二のオリゴヌクレオチドの3'領域との間に相補性が存在する場合に、第一のオリゴヌクレオチドの伸長によって伸長産物が形成され、第二のオリゴヌクレオチドおよび伸長産物を含む切断構造が形成され、該条件が、形成された切断構造の切断および切断構造の切断の検出を可能にする。
【公表番号】特表２０１０−５２５７９２（Ｐ２０１０−５２５７９２Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４７４６５（Ｐ２００９−５４７４６５）
【出願日】平成２０年１月２９日（２００８．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２３０４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９４９０２
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０９２９１３１２）ホロジック インコーポレイティッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２９日（２００８．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２３０４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９４９０２
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０９２９１３１２）ホロジック インコーポレイティッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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