前立腺癌腫の検出のためのモノクローナル抗アネキシンＡ３抗体
本発明は、アネキシンＡ３、特に細胞外アネキシンＡ３を、高度に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体を用いて決定することを含む、前立腺癌腫の診断のための方法に関する。この方法は、更に、このような抗体を含有する試験剤にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、アネキシンＡ３、特に細胞外アネキシンＡ３を、高度に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体を用いて決定することを含む、前立腺癌腫の診断のための方法に関する。この方法は、更に、このような抗体を含有する試験剤にも関する。
【０００２】
男性では、前立腺癌腫は、悪性の出現率のうちでも第１位にランクされ、かつ、他の腫瘍の存在と比較して適度な生物学的な攻撃性にもかかわらず、癌誘発死のうち第２位にランクされる（Greenlee et al., 2000）。局部に限定された段階のためには優れた治療のための選択肢、即ち、外科手術（Huland, 2001a）及び／又は放射線治療（Wiegel, 1998）が存在するが、それにもかかわらず、進行した段階の場合には、ホルモン切除の一時的にのみ有効な方法が使用されることができる。ホルモン切除療法の間、通常は２〜３年間後、初期の疾病のこの新規に生じる進行は、ホルモン不応状態と呼ばれる。現在では、ホルモン不応前立腺癌腫のためには対症療法の選択肢のみが存在する（Knox & Moore, 2001）。
【０００３】
従って、早期の段階で、前立腺癌を診断することが決定的に重要である。 ＰＳＡ、前立腺特異的抗原を用いて、高度に感受性のある血清腫瘍マーカーが、前立腺癌腫の初期の診断（Stamey et al., 1987）のために、そして予後の作用（Haese et al., 1999）のために使用できる。
【０００４】
ＰＳＡは、かなり臓器特異的であり、腫瘍特異的でないので、良性の前立腺疾病は、４ｎｇ／ｍｌを上限として考慮した範囲を超えるＰＳＡの増加と関連していることもできる。現在の前立腺パンチバイオプシーにより少なくとも１０つの経直腸的に得られるその後の侵入性の製造は、この状況にある前立腺癌腫の完成した診断においてゴールドスタンダードを提示する（Miller & Weissbach, 1999a,b）。
【０００５】
患者の２５％までが、関連する込み入った事情に苦しむが、これは、更なる相談（患者の１３％）及び入院（罹患した患者の約６％）を必要にする（Lujan et al., 2001 ; Djavan et al., 2001）。尿路の感染の危険又は前立腺炎の危険とは別に、この操作の出血及び痛みが、更に不所望な症状として支配的であり、これは、いくつかの研究機関においては、局所的な麻酔剤処置によってのみ対応される（Irani et al., 1997; lssa et al., 2000; Alavi et al., 2001）。４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＰＳＡ値を有する患者の約７５％の場合に実施されるパンチバイオプシーは、陰性の、つまり良性の診断結果を示すものである（Huland, 2001b）。前立腺パンチバイオプシーを実施するための徴候が、幾人かの著者により現在示唆されているとおり（Djavan et al., 1999; Okihara et al., 2001）、２．５ｎｇ／ｍｌから始まるＰＳＡから既に得られる場合には、この物理学的な検査の侵入性の方法は、５０〜７５歳の男性の４人に１人に予期されなくてはならないことになる（Huland, 2001b）。
【０００６】
ＰＳＡに対する促進した特異性を有する新規のマーカー（この亜種形態も含む（Jung et al., 2001 ; Makinen et al., 2001））は、従って、前立腺癌腫の診断のために大きな興味をもたれていて、というのは、これらは、侵入性のパンチバイオプシーを実施するための徴候をより良好に定義し、かつ従って、この検査を受ける必要のある患者の数を減らす可能性があるからである。傑出した特異性を有する、非侵入性に得られるプローブ材料、例えば血漿又は圧出液、尿のためにも適する腫瘍マーカーは、従って、アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）マーカー（Wozny et al., 2006）として新規に特性決定されることができた。
【０００７】
ＡＮＸＡ３は、アネキシンのファミリー、Ｃａ2+エフェクタータンパク質のクラスのむしろまれな代表例であり、このタンパク質は、特定のリン脂質に結合することにより、その可変性の作用を実施する。これらは、膜表面上にネットワークを形成することができ、かつ、従って、膜ミクロドメインを組織化し、かつ、タンパク質の相互作用のための焦点を動員する（Gerke et al., 2005）。
【０００８】
アネキシンはこれにより、細胞分化、細胞移動、そしてまた免疫調節において重要な役割を果たす。膜構造及び膜輸送とは別に、アネキシンの膜及びリン脂質独立性のタンパク質−タンパク質相互作用も存在する（Rescher & Gerke 2004; Gerke & Moss, 2002）。アネキシンは、軟骨形成及び骨の無機化においてマトリックス小胞の主たる成分として参加する（Wang et al., 2003）。ＡＮＸＡ３の差次的発現（differential expression）は、前立腺癌腫の場合に、特に、骨芽細胞性転移の発生の通常でない頻度に関して興味がもたれるものである（Keller et al., 2001）。
【０００９】
ＡＮＸＡ３は、細胞内でも細胞外でも生じ（Carlson et al., 2004）、例えば尿中のエキソソームで生じる（Pisitkun et al., 2004）。エキソソームは、いわゆる「多小胞体」の誘導体であり、かつ、選択的な、しかしながら決定的な役割を、免疫細胞の抗原提示において果たす可能性がある（Schartz et al., 2002）。尿中で検出されるエキソソームは、早期のデータで既に説明された、いわゆるプロスタソーム（prostasome）に同一である可能性があり（Arienti et al., 2004; Utleg et al., 2003）、いずれの場合においても、両者共にＡＮＸＡ３を含有する。
【００１０】
前立腺癌及び尿路の他の上皮癌の治療又は診断のためのタンパク質バイオマーカーは、US 2005 130 876, WO 03 086 461 , WO 2005 078 124, EP 05 011 042.8 及び EP 05 026 092.6中に説明されている。
【００１１】
しかしながら、ＡＮＸＡ３を決定するための前の方法は、使用可能な抗体の低い特異性に苦しみ、これは、他のアネキシンに対してかなりの交差反応性を示す。従って、本発明の課題は、前立腺癌腫の早期の段階において、高い特異的な診断を可能にする前立腺癌腫の決定のための方法を提供することであった。
【００１２】
第１の観点において、本発明は、アネキシンA３（ＡＮＸ Ａ３）の存在及び／又は量について、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンA３に特異的な抗体を用いて、試料を分析する、癌の診断のための方法に関する。
【００１３】
本発明の更なる観点は、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有する、アネキシンＡ３に対して特異的な少なくとも１つの抗体を含有する、癌の診断のための試験剤である。
【００１４】
また、本発明の更なる観点は、癌の治療のための医薬品の製造のための、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３に対して特異的な抗体を活性剤として含有する医薬組成物である。
【００１５】
また、本発明の更なる観点は、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３にとって特異的な抗体である。
【００１６】
また、本発明の更なる観点は、上述した抗体を産生する細胞、特にハイブリドーマ細胞である。
【００１７】
本出願において使用される場合に「抗体」との用語は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する抗体断片をも包含し、これは例えばＦａｂ断片又はＦ（ａｂ′）2断片、又は組み換え抗体、例えば、この単鎖抗体又はこの断片、例えばＦｖ断片である。
【００１８】
有利には、この抗体は、銀染色後のウェスタンブロットの濃度測定的な分析により決定して、他のアネキシン、例えばアネキシン５、アネキシン６及び／又はアネキシン８に対して検出可能な交差反応性を有しない。有利には、この抗体は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の混合物である。モノクローナル抗体はまた、キメラのモノクローナル抗体又はヒト化したモノクローナル抗体であってよく、これはヒトでない定常の、及び、場合により可変の、フレームワーク領域のヒト化により得られる。幾つかの高度に特異的なポリクローナル抗血清はしかしながら、本発明の方法において適してもいる。
【００１９】
有利なモノクローナル抗体は、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギその他を、精製したＡＮＸＡ３又はその断片、特にこのＮ−末端断片を用いて免疫化し、そして、標準的な方法に応じて所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得ることにより得られて良い。より有利には、抗体は、ヒトアネキシンＡ３（アネキシンＩＩＩ、リポコルチンＩＩＩ、胎盤抗凝血タンパク質ＩＩＩ（ＰＡＰ−ＩＩＩ）、３５アルファカルシメジン、又はイノシトール−１，２−環式ホスファート−２−ホスホヒドロラーゼとしても示される）のＮ末端領域中の、特に、ヒトアネキシンＡ３（GenBank Accession No. P12429）のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している。有利には、抗体は、癌細胞の表面に結合する。
【００２０】
有利なモノクローナル抗体は、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギその他を、精製したＡＮＸＡ３又はその断片、特に１６個のＮ末端アミノ酸を含む断片、例えば、断片、例えば、ＡＮＸ Ａ３（ＡＡ１〜３２４）、ＡＮＸ Ａ３（ＡＡ１〜１５９）又はＡＮＸ Ａ３（ＡＡ１〜１０６）で免疫化し、そして、標準的な方法により、所望されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得ることにより得られてよい。上で説明したとおり、所望の特異性を有するモノクローナル抗体は、上述の又は類似の断片を、エピトープマッピング及びＡＮＸＡ３のＮ末端部分に特異的に結合するモノクローナル抗体の相応する選択のために利用するスクリーニング手法により得られて良い。特に有利であるのは、天然のヒトＡＮＸＡ３の使用でもあり、例えばこれは、モノクローナル抗体の産生のための免疫原としてヒトの好中球から単離される。
【００２１】
更に、ＡＮＸＡ３に対して指向した有利なモノクローナルヒト抗体は、個々のヒト、例えば、ヒトのガン患者又は他の個人から得られて良い。抗体産生Ｂ細胞は、標準的な方法により個人から単離されてよい。
【００２２】
特別な一実施態様において、抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1 G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7であり、又は、抗体は、又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する。同じエピトープに結合する抗体は、標準的なプロトコルにより競合的な実験により決定されてよい。上述のハイブリドーマ細胞系列は、２００６年５月５日に（DSM ACC2778, DSM ACC2779, DSM ACC2780及びDSM ACC2781）、かつ、２００７年６月５日に（tgc 13 Prol/5G9, tgc 12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7）ＤＭＳＺに（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig）、ブタペスト条約により寄託されている。
【００２３】
更なる有利な一実施態様において、抗体は、
（ｉ） VRDYPDFSPSVD（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されているモノクローナル抗体である。
【００２４】
配列番号１の特に有利な部分配列は、DYPDFSPSVである。配列番号２の特に有利な部分配列は、LISILTERSである。配列番号３の特に有利な部分配列は、ＦＲＫＡＬＬ又はＳＬＫＶＤＥＨＬＡである。配列番号４の特に有利な部分配列は、TFDEYRNISである。配列番号５の特に有利な部分配列は、SRSEIDLLDである。配列番号６の特に有利な部分配列は、AIKSDTSGDEYEIである。配列番号１中のエピトープに対して指向された抗体の例は、tgct ProVII 5C5（DSM ACC2780）である。配列番号２中のエピトープに対して指向された抗体の例は、tgc5 Proll 6G7 (DSM ACC2778)及びtgc6 Prolll 1611 (DSM ACC2779)である。人のＡＮＸＡ３のＣ末端領域中のエピトープに対して指向した抗体の例は、tgc 13 Prol/5G9, tgc 12 Prolll/4B11及びtgc 14 ProVIII/3D7である。特に、有利な抗体は、配列番号５及び／又は配列番号６中のエピトープに対して指向されている。
【００２５】
更に、配列番号１〜６中のエピトープに対して指向された抗体は、エピトープ配列を含むポリペプチド又はペプチド、例えば組み換えヒトＡＮＸＡ３、他の種からのホモログペプチド又はこの断片で実験動物を免疫化することにより得られて良い。
【００２６】
本発明により診断されてよい癌は、有利には、尿生殖及び／又は消化管路の癌であってよく、例えば前立腺、膀胱、腎臓、尿道、卵巣、子宮又は大腸の癌である。特に、癌は上皮癌である。特定の有利な実施態様において、癌は、前立腺癌である。
【００２７】
本発明の方法は、免疫学的決定に適した任意の試験形式において実施されてよい。いくつかの試験形式においては、ラベリング基、例えば視覚的マーカー、例えばラテックス又は金のビーズ、蛍光マーカー基、酵素マーカー基その他を有する抗体を使用することが有利であってよい。抗体及びラベリング基のコンジュゲートは、標準的な方法により産生されてよく、例えば、抗体の反応性アミノ酸側基、例えばカルボキシ、アミノ及び／又はチオール基に対する、ラベリング基を用いた、例えば二官能性スペーサー分子を介した共有結合により産生されてよい。
【００２８】
この試料は有利には、ヒトの被験体から得られる。特定の有利な実施態様において、本発明の方法は、非侵入性の診断手法であり、その際試料は、例えば尿の試料、特に、圧出物である尿試料又は糞試料であってよい。所望される場合には、試料は、前処理手順、例えばゲル濾過にかけられてよい。
【００２９】
この試料は、細胞外の及び細胞内のＡＮＸＡ３の別個の決定を可能にする分画化手順にかけられてよい。例えば、試料は、細胞ペレット及び上清を得るために遠心分離され、これにより細胞内アネキシンＡ３は、細胞ペレット中で決定され、細胞外アネキシンＡ３は、上清中で決定される。特別に有利な一実施態様において、この方法は、細胞外ＡＮＸＡ３の選択的な決定を含む。
【００３０】
更なる実施態様において、本発明の方法は、組織化学的な手法であってよく、その際この試料は、組織試料、特にバイオプシー、例えばパンチバイオプシーであってよい。組織化学的な手法において、細胞外ＡＮＸＡ３の選択的な決定は、試料内でのＡＮＸＡ３の局所化の決定により実施されてよい。
【００３１】
本発明の方法において、細胞外ＡＮＸＡ３の余剰量が、試料、例えば圧出物である尿の低速遠心分離後の上清中で又は相応するペレット中で、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、線維症、慢性前立腺炎、様々な段階の前立腺上皮新形成（ＰＩＮ１〜３）にわたる種々の状態を有する癌でない患者と比較して減少する場合に、試料は、癌、例えば前立腺癌のための徴候として分類される。完全に健康な患者と比較して、ＡＮＸＡ３の余剰分は、ペレット及び上清の両者中で増加しているように見える。これらを一緒に考えると、圧出物である尿の上清及び／又はペレット中のＡＮＸＡ３の全量の又は濃度の、割合又は組み合わせの任意の種類（これは、上述した様々な症状の診断による区別化のために使用される）が、本発明により包含される。
【００３２】
本発明は、様々な細胞な及び細胞外試料画分（例えば圧出物である尿）中のＡＮＸＡ３の余剰量に関する、実質的に任意のセットのカットオフ（cut-offs）をカバーし、これは、任意の種類の差分遠心分離及び診断目的のための関連する比により達成可能である。
【００３３】
本発明の方法は、更なる癌マーカー、例えば癌マーカーの決定を更に含んでよい。更なるマーカーの決定は、同じ試料中で実施されてよく、その際、ＡＮＸＡ３は、異なる試料、例えば血液、血清及び／又は血漿試料中で決定される。特に有利には、血液、血清又は血漿マーカー、特にカリクレインプロテアーゼファミリーの少なくとも１つのメンバー、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及び／又は少なくとも１つの上皮細胞マーカー、特に前立腺特異的な膜抗原（ＰＳＭＡ）の決定である。
【００３４】
本発明の診断方法は、疾病段階の決定を含んでよく、その際、前癌段階、例えばＰＩＮ及び癌疾病段階との間での区別化が実施される。疾病段階の決定は、臨床的な病理学者による組織学的分類に基づき、前立腺癌の標準的な分類化は、Gleasonスコアによるが、増加する重症度の３つの群に癌をグループ分けする他の段階付け方法も存在する。現在のところ、この段階分け方法は、形態学的な尺度に主に頼っていて、かつ、経験のある熟練者を必要とする。癌でない場合のためには、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、線維症、慢性前立腺炎、様々な段階（ＰＩＮ１〜３）の前立腺上皮新形成にわたる種々の状態が説明されている。本発明は、圧出物である尿（exprimate urine）又は他の任意の試料の任意の種類の画分からの適したセットのカットオフを用いた、ＡＮＸＡ３に関連した読み出し（read-out）による前立腺癌又は前立腺に関連した癌でない状態の、任意の種類の層化に関する。
【００３５】
本発明はまた、医薬適用における、例えば癌、特に上で説明した尿生殖及び／又は消化管路の癌、特に前立腺癌の治療のための医薬品の製造のための上述の抗体の使用にも関する。本発明のこの実施態様において、抗体は有利には、ヒトの定常領域、例えばヒトの定常ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４領域及び場合によりヒト化したフレームワーク領域を有する、キメラの又はヒト化したモノクローナル抗体である。又は、抗体は、個々のヒトの血清から得られてよい、ヒトの抗体であってよい。治療的な抗体は有利には、癌細胞、例えば前立腺癌の細胞の表面に結合する。
【００３６】
この治療的な抗体は、エフェクター分子、例えば放射性及び／又は細胞毒性残基に対してコンジュゲートしてよい。治療適用のためには、抗体は、治療的に有効な量、例えば１日につき１０〜５０００μｇ、１日につき４０００〜１０００μｇで、疾病の種類及び重症度に応じて、有利には輸液により投与されてよい。公知の方法により投与されてよい抗体は、公知の方法により、例えば、腸管外により、他の抗体、例えばトラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブその他の投与のために公知である標準的な方法により、投与されてよい。この抗体の投与は、他の治療的な選択肢、例えば、他の抗腫瘍抗体の投与、細胞毒性剤の投与、手術及び／又は放射線療法と組み合わせてよい。
【００３７】
更に、本発明は、以下の図及び実施例により、より詳細に説明されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】モノクローナル抗体のエピトープマッピングのために使用されるアネキシンA３（A）及びアネキシンA３の組み換え断片の構造の概要；本出願の主題であるモノクローナル抗体のエピトープマッピングによるスクリーニングのこのタイプに応じて、選択されている。
【図２】ヒトのアネキシンＡ３断片ｖＡＮＡ−５（アミノ酸１０７−２４３）の精製；ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィにより精製したｖＡＮＡ−５。
【図３】ヒトのアネキシンＡ３断片ｖＡＮＡ−７（アミノ酸１−１０６）の精製；ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィにより精製したｖＡＮＡ−７。
【図４】アネキシンＡ３断片ｖＡＮＡ−１（アミノ酸1−３２４）の精製；クロマトグラフィにより精製したｖＡＮＡ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図５】ｖＡＮＡ−１ＥＬＩＳＡプレートの試験：紫：アネキシンＡ３特異的抗血清；青：ゼロ血清（null serum）；ウサギからの高価値（premiumu）の血清。
【図６】抗ＡＮＸＡ３抗体の特異性；レーン１〜９及び２Ｄウェスタンブロットを、Wozny et al., 2006から取り出す；レーン１０−１９は、この文章中で説明されるとおりの様々なモノクローナル抗ＡＮＸＡ３抗体を示す。これらは、他のアネキシンの任意の他のタンパク質に対して交差反応性を実質的に示さない。
【図７】ＰＣ３細胞からの全体的な細胞溶解物のウェスタンブロットのＥＣＬ展開後の抗ＡＮＸＡ３染色の濃度測定による定量化は、モノクローナル抗体tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)の高い特異性を示す。
【図８】抗ＡＮＸＡ３ベースの、抗原としてｖＡＮＡ−１を用いたＥＬＩＳＡの校正、この色反応を、１５分（Ａ）、３０分（Ｂ）及び４５分（Ｃ）後に停止した。
【図９】標準的な低速遠心分離後の圧出物尿上清中のＡＮＸＡ３の検出；Ａ、Ｄ：１５分；Ｂ、Ｅ：３０分及びＣ、Ｆ：４５分の展開：ピンクのカーブを、尿を除去するためのゲル濾過（ＧＦ）後に得た。
【図１０】抗ＡＮＸＡ３ベースの診断検査のためのＲＯＣ曲線、図６中のＥＬＩＳＡを利用し、かつ、４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＰＳＡ値を有する２００名の患者を基礎とする：ＡＵＲＯＣは、０．８２３であり、ＰＳＡ「グレーゾーン」中の重要な集合のための、７０％の感受性での９０％の特異性を示す。
【図１１】Wozny et al., 2006中で使用されるポリクローナル血清（図１参照）は、ＰＣ−３細胞の表面に取るに足らない程度でのみ結合する。
【図１２】ＰＣ−３細胞上の表面ＡＮＸＡ３の、tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)による検出；この抗体は、グラフ中で示される濃度で使用した。二次抗体として、１：５０の希釈にある抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣを使用し、この出発容積は、抗体希釈の１００μｌであった。この結果は、この前立腺癌細胞系列中でのＡＮＸＡ３の表面局在化を示し、これは、治療的に利用されることができる可能性がある。
【図１３】ＡＮＸＡ３の抗原性領域をカバーするオーバーラップ配列を用いて、６個のエピトープが見出され、かつ、ポリクローナル抗血清の高度に特異的な結合に寄与すると特性決定された。Ｎ末端領域中の２つのエピトープ（これは、tgc5 Pro II6G7= DSM ACC2778; tgc6 Prolll1G11 = DSM ACC2779; tgc7 ProVII5C5 = DSM ACC2780により認識される）の隣には、図１４中でより詳細に示される更に４つのエピトープが存在する。
【図１４】ヒトのＡＮＸＡ３及びこの抗原性領域の配列に関する概要（濃い紫、最も下の線）；ポリクローナルＡＢ１は、高度に特異的なポリクローナル抗血清であり、ＡＮＸＡ３にのみ結合し、その他のアネキシン又は他の任意の抗原に対して交差反応性を有しない（２Ｄウェスタンブロット及び質量分析により示されるとおり、図１）。ポリクローナルＡＢ２は、エピトープ３及び４に対して指向されている；ＭＡＢ１は、tgc7 ProVII5C5 = DSM ACC2780であり、ＭＡＢ２は、tgc5 Pro II6G7= DSM ACC2778及びtgc6 Prolll1G11 = DSM ACC2779の両者を指す；この組み換えＡＮＸＡ３断片１−８は、それぞれの免疫化のために使用した。
【図１５】ヒトのＡＮＸＡ３の結晶構造の図式。
【００３９】
実施例
実施例１
ＡＮＸＡ ３に対して指向した特異的モノクローナル抗体の産生
ヒトのアネキシンＡ３、ｖＡＮＡ−５（AA 107〜243）、ｖＡＮＡ−７（ＡＡ1〜106）、ｖＡＮＡ−１（ＡＡ1〜324）、ｖＡＮＡ−２（ＡＡ1〜159）、ｖＡＮＡ−３（ＡＡ35〜159）、ｖＡＮＡ−４（ＡＡ191〜324）及びｖＡＮＡ−６（ＡＡ107〜190）の組み換え溶解性断片をクローニングし、かつ、大腸菌中で発現させ、引き続き、クロマトグラフィにより精製した。アネキシンＡ３及びこの組み換え断片の構造の概要は、図１中に示されている。
【００４０】
図２、３及び４は、標準的なクロマトグラフィ手法により精製された、組み換え溶解性ＡＮＸＡ３断片ｖＡＮＡ−５、ｖＡＮＡ−７及びｖＡＮＡ−１のクーマシー染色１Ｄゲルを示す。
【００４１】
抗体産生細胞の融合後及びクローニングの間の陽性のハイブリドーマ細胞のためのスクリーニング、断片ｖＡＮＡ−１を基礎とする抗アネキシンＡ３ ＥＬＩＳＡを展開した（図５）。ＡＮＸＡ３の天然のエピトープに結合する抗体の包括的な認識を達成するために、組み替えのｖＡＮＡ−１を、ＥＬＩＳＡプレートへのカップリング前に変性した。組み換えｖＡＮＡ−１を、ＥＬＩＳＡプレートに、１μｇ／ウェルの濃度で被覆した。ＥＬＩＳＡプレートの官能性を、ポリクローナル抗ＡＮＸＡ３血清を用いて確認した。
【００４２】
図６は、前立腺組織の良性の及び癌性の試料に対するポリクローナル血清の反応性の、擬似スペクトル色描写（false spectral colour depiction）を示す。この癌性の試料は、２Ｄ−ＰＡＧＥによりブロッティングして示されている。大半のシグナルが、４つのスポットの鎖から得られ、これは、ＡＮＸＡ３として質量分析により同定されている。これらの擬似スペクトルカラー画像は、単一のカラーグレースケールにより許容されるよりもはるかにより深いダイナミックレンジを反映する。非ＡＮＸＡ ３シグナルの強度は、常にバックグラウンドに近く、これは、青（バックグランドに近い）ピクセルにより示されている。特異的シグナルと非特異的シグナルの間のこのコントラストの程度は、図６中のレーン８及び９中に示され、これは、単一のカラーグレースケールにおける結果を示す。
【００４３】
この状況は、モノクローナル抗体tgc5 Pro II6G7= DSM ACC2778 (レーン１０及び１１); tgc6 Prolll1G11 (DSM ACC2779) (レーン１５及び１６); tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780) (レーン１２〜１４); tgc8 Prolll1 E1 (DSM ACC2781 ) (レーン１７〜１９)の様々な希釈のレーン１０〜１９のシグナルプロフィールにより更に強調される；これは、一層より低い交差反応性を示す。
【００４４】
図６中に示されるとおり、本発明の主題であるモノクローナル抗体は、他のアネキシンとの交差反応性を実質的に有しない。その一方で、Wozny et al. 2006からのポリクローナル血清はANXA６とのいくらかの残存交差反応性を有し、モノクローナル抗体（前立腺癌の患者からのバイオプシーの、及び、前立腺癌細胞系列、PC３の）を用いた染色は、図６の右側に示され、ANXA３に対して３３ｋＤａの他の位置での１％よりも少ないバックグラウンド染色を産生する。
【００４５】
図７は、電気化学発光（ＥＣＬ）展開後の抗ＡＮＸＡ３染色の濃度的な定量化を示す。ＰＣ３細胞からの全細胞溶解物のウェスタンブロットを、抗体tgc7 ProVII5C5 (DSM 2780)を用いて分析した。ＡＮＸＡ３に相応する単一バンドのみが見出された。実質的に交差反応性は存在しない。
【００４６】
実施例２
圧出物尿試料及び組織区画における抗体特異性の決定
実施例１のモノクローナル抗体を、上述したＥＬＩＳＡフォーマットにおいて使用し、癌患者からの圧出物尿からの上清中のＡＮＸＡ３を検出した。
【００４７】
図８中に示されるとおり、校正のために、ＥＬＩＳＡプレートを、tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)で被覆し、かつ、ｖＡＮＡ−１（２０〜０．３ｎｇ／ウェル）の希釈系列を、ビオチン化したtgc5 Pro II6G7 (DSM ACC2778)及びアビジンＨＲＰを基質としてのＴＭＢと共に使用して検出した。この酵素による色反応を、示したとおりに、１５、３０及び４５分後に停止した。
【００４８】
図９中に、患者から採取した圧出物尿の上清中のＡＮＸＡ３の検出を示した。この試料を、標準的な臨床的な手法に応じて、低速遠心分離でもって遠心分離した。このシグナルを、事前のゲル濾過（ＧＦ）により改善し、これは実質的に尿を除去し、尿は、１Ｄ ＰＡＧＥからのウェスタンブロットに干渉する可能性がある。
【００４９】
この抗体を、組織区画の免疫組織化学的染色手法においても試験した。ＡＮＸＡ３の高い細胞内濃度が、通常の前立腺上皮において見出された。ＰＩＮから癌腫への疾病進行の間に、細胞外に局在するＡＮＸＡ３の顕著な局所的な増加が見出された。この染色された領域のバイオプシーは、しかしながら、圧出物尿の上清とペレットとの間で、診断性のＡＮＸＡ３分布の、定量的な関連の一般的な評価を示すことも、可能にすることもない。これは単に、バイオプシーが、むしろ定量的であり、しかしながら、良性の質の癌性の前立腺領域を、理解可能に示すことができないからである。
【００５０】
実施例３
圧出物尿試料中のＡＮＸＡ３の決定のための臨床試験
多施設盲検臨床試験を、体液、特に圧出物尿中のＡＮＸＡ３の非侵入的な検出を基礎とする前立腺癌診断の感受性及び特異性を決定するために実施した。
【００５１】
３．１ 患者及び対照
Ａ：組織学的に確認された前立腺癌腫を有する患者（ＰＣＡ群）：ｎ＝約２００名
Ｂ：組織学的試験により決定して、前立腺癌腫を有しない患者（対照群）：ｎ＝約３００名
【００５２】
３．２ 試料の採取及び処理
３．２．１ 血清／血漿
血清ＰＳＡ値の日常的な決定のための血清管を、静脈的に採取した。更に、１〜２ｍｌの血清を、付加的に提供（asserve）し、深冷凍結して貯蔵した。この血液試料を更に、ＰＳＡについて分析した。血液試料の採取を、パンチバイオプシー又は直腸触診の実施前に実施した。
【００５３】
３．２．２ 圧出物尿沈殿
２０秒間の触診及び前立腺のマッサージ後に、患者に膀胱を空にするように要求した。この得られる圧出物尿を、刊行された手法（I. Rehman, A. R. Azzouzi, J. W. F. Catto, S. Allen, S. S. Cross, K. Feeley, M. Meuth, & F. C. Hamdy, Proteomic analysis of voided urine after prostatic massage from patients with prostate cancer: A pilot study, Urology 64 (6), 2004, 1238-1243; C. Goessl, M. Mueller, R. Heicappell, H. Krause, B. Straub, M. Schrader & K. Miller, DNA-based detection of prostate cancer in urine after prostatic massage. Urology 58 (3), 2001 , 335-338）に応じて処理し、この生成物を−８０℃で貯蔵した。
【００５４】
血清と同様に、圧出物尿を採取しなくてはならず、可能であれば、パンチバイオプシーが実施される前である。
【００５５】
３．３ 結果
約２００名のＰＳＡ陽性患者において、圧出物尿の試料中の沈殿及び上清中のＡＮＸＡ３の決定では、約９０％の感受性を、そして、約８０％の特異性を示した。
【００５６】
図１０中で示されるとおり、ＰＳＡを有する患者中の上清（u.anx.tot）中のＡＮＸＡ３を基礎とする読み取りのためのＲＯＣ値は、２〜６ｎｇ／ｍｌの範囲内で、０．８であり、ＰＳＡ値４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内ではＲＯＣ値は０．８５であり、かつ、全患者及び全てのＰＳＡ値の全範囲の全体的な集団においては、ＡＮＸＡ３のためのＲＯＣ値は０．７４であった。
【００５７】
図１０中の代表的なＲＯＣ曲線は、４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＰＳＡ値を有する患者について；診断的な関連性を、特に、ＰＳＡのこの重要なグレーゾーンにおいて示し（ここで、ＰＳＡの特異性は極めて低いRoddam AW, Duffy MJ, Hamdy FC, Ward AM, Patnick J, Price CP Rimmer J, Sturgeon C, White P, Allen NE; On behalf of the NHS Prostate Cancer Risk Management Programme. Use of prostate-specific antigen (PSA) isoforms for the detection of prostate cancer in men with a PSA level of 2-10 ng/ml: systematic review and meta-analysis. Eur Urol. 2005 Sep; 48 (3):386-99; discussion 398-9. Review. PMID: 15982797; Stamey TA, Caldwell M, McNeal JE, Nolley R, Hemenez M, Downs J. The prostate specific antigen era in the United States is over for prostate cancer: what happened in the last 20 years? J Urol. 2004 Oct; 172(4 Pt 1 ): 1297-301. PMID: 15371827)）、ＲＯＣ曲線は、臨床的な統計学の標準的な道具であり、例えばhttp://www.anaesthetist.com/mnm/stats/roc/に詳細に説明されている。
【００５８】
実施例４
癌細胞に対するモノクローナル抗体の結合
このモノクローナル抗ＡＮＸＡ３抗体は、診断（病理学的組織学）及び治療的適用において表面マーカーとして適している。
【００５９】
以下においてフローサイトメトリーにより示されるとおり、特に、Ｎ末端のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)は、前立腺癌細胞系列の細胞外結合部位（ＰＣ３細胞、ATCC, DCV-1017,２００４年８月）に、カルシウム依存性の様式で結合する。
【００６０】
非特異的な結合を、二次抗体単独を用いたインキュベーションによって、そして、非特異的及び未処理の対照抗体（モノクローナル及びポリクローナル）の使用により、各実験の間に評価した。
【００６１】
図１１は、Wozny et al., 2006中で使用されるポリクローナル血清（図6参照）が、ＰＣ−３細胞の表面に取るに足らない程度でのみ結合することを示す。
【００６２】
細胞を、適した緩衝液で洗浄し、かつ、氷上で３０分間、図１１に示される希釈で、インキュベーションした。引き続き、全ての試料を、ＦＩＴＣに結合した抗ウサギ二次抗体の１００μｌの１：５０希釈を用いてインキュベーションした。
【００６３】
洗浄工程後に、各試料の１２０００個の細胞を、示されるとおり、フローサイトメトリーにより分析した。
【００６４】
本質的には、ポリクローナル血清は、様々な希釈で、そして、対照血清に比較して、蛍光強度の著しい増加を示さなかった。ＰＣ−３細胞上のＡＮＸＡ３の表面発現は従って、この段階では示されることができず、ことによるとこれは、ポリクローナル血清中での特異的な抗体の濃度が低すぎるためである。
【００６５】
しかしながら、図１２中に示されるとおり、モノクローナル抗体tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)は、濃度依存性の及びカルシウム依存性の様式で確かに、ＰＣ−３細胞の表面エピトープに結合する。
【００６６】
実施例５
エピトープマッピング
アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）の全体的の抗原性領域をカバーする、重複するペプチド配列の使用後に、我々は、６個のみのエピトープが、高い特異性結合を担うことを結論づけ、これは図１３及び１４中に、高度に特異的なポリクローナル抗体の結合を分析することにより示されるとおりである（図１参照）。
【００６７】
ポリクローナル抗血清の特異性を、ウェスタンブロット及び質量分析に由来する２Ｄ−ＰＡＧＥにより制御した。同じことは、モノクローナル抗体tgc5 Pro II6G7= DSM ACC2778; tgc6 Prolll1G11 =DSM ACC2779; tgc7 ProVII5C5 = DSM ACC2780; tgc 13 Prol/5G9; tgc 12 Prolll/4B11 ; tgc 14 ProVIII/3D7に当てはまる。
【００６８】
このエピトープマッピングは、Ｎ末端領域中の２つのエピトープの隣に、中央の領域中の２つのエピトープからの、そして、ＡＮＸＡ３のＣ末端領域中の２つのエピトープ寄与が存在することを示す（図１３）。
【００６９】
ヒトのＡＮＸＡ３上のこれらのエピトープの局在化（エピトープ１〜６として示される）は、図１４中に示される。
【００７０】
概要として図１４中に示したヒトのＡＮＸＡ３の結晶構造（http://www.pdb.org/pdb/files/1axn.pdb 及びhttp://www.pdb.org/pdb/explore.do?structureld=1AXN）は、エピトープ１、２、５及び６が、一緒になって、ＡＮＸＡ３の天然の折りたたみにおけるドメインを形成することを示唆する。従って、我々は、相応する抗体を得るべくこの材料を用いて、ヒトＡＮＸＡ３を好中球及び免疫化したウサギから単離すべく、処理した。これらの抗体は、天然のＡＮＸＡ３に対して指向していて、我々は再度、最も高い特異性について、スクリーニングしかつ選択し、かつ、相応するエピトープ１、２、５及び６を含有するこれらのドメインに対する結合は、診断及び治療的目的に特に適している。
【００７１】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、アネキシンＡ３、特に細胞外アネキシンＡ３を、高度に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体を用いて決定することを含む、前立腺癌腫の診断のための方法に関する。この方法は、更に、このような抗体を含有する試験剤にも関する。
【０００２】
男性では、前立腺癌腫は、悪性の出現率のうちでも第１位にランクされ、かつ、他の腫瘍の存在と比較して適度な生物学的な攻撃性にもかかわらず、癌誘発死のうち第２位にランクされる（Greenlee et al., 2000）。局部に限定された段階のためには優れた治療のための選択肢、即ち、外科手術（Huland, 2001a）及び／又は放射線治療（Wiegel, 1998）が存在するが、それにもかかわらず、進行した段階の場合には、ホルモン切除の一時的にのみ有効な方法が使用されることができる。ホルモン切除療法の間、通常は２〜３年間後、初期の疾病のこの新規に生じる進行は、ホルモン不応状態と呼ばれる。現在では、ホルモン不応前立腺癌腫のためには対症療法の選択肢のみが存在する（Knox & Moore, 2001）。
【０００３】
従って、早期の段階で、前立腺癌を診断することが決定的に重要である。 ＰＳＡ、前立腺特異的抗原を用いて、高度に感受性のある血清腫瘍マーカーが、前立腺癌腫の初期の診断（Stamey et al., 1987）のために、そして予後の作用（Haese et al., 1999）のために使用できる。
【０００４】
ＰＳＡは、かなり臓器特異的であり、腫瘍特異的でないので、良性の前立腺疾病は、４ｎｇ／ｍｌを上限として考慮した範囲を超えるＰＳＡの増加と関連していることもできる。現在の前立腺パンチバイオプシーにより少なくとも１０つの経直腸的に得られるその後の侵入性の製造は、この状況にある前立腺癌腫の完成した診断においてゴールドスタンダードを提示する（Miller & Weissbach, 1999a,b）。
【０００５】
患者の２５％までが、関連する込み入った事情に苦しむが、これは、更なる相談（患者の１３％）及び入院（罹患した患者の約６％）を必要にする（Lujan et al., 2001 ; Djavan et al., 2001）。尿路の感染の危険又は前立腺炎の危険とは別に、この操作の出血及び痛みが、更に不所望な症状として支配的であり、これは、いくつかの研究機関においては、局所的な麻酔剤処置によってのみ対応される（Irani et al., 1997; lssa et al., 2000; Alavi et al., 2001）。４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＰＳＡ値を有する患者の約７５％の場合に実施されるパンチバイオプシーは、陰性の、つまり良性の診断結果を示すものである（Huland, 2001b）。前立腺パンチバイオプシーを実施するための徴候が、幾人かの著者により現在示唆されているとおり（Djavan et al., 1999; Okihara et al., 2001）、２．５ｎｇ／ｍｌから始まるＰＳＡから既に得られる場合には、この物理学的な検査の侵入性の方法は、５０〜７５歳の男性の４人に１人に予期されなくてはならないことになる（Huland, 2001b）。
【０００６】
ＰＳＡに対する促進した特異性を有する新規のマーカー（この亜種形態も含む（Jung et al., 2001 ; Makinen et al., 2001））は、従って、前立腺癌腫の診断のために大きな興味をもたれていて、というのは、これらは、侵入性のパンチバイオプシーを実施するための徴候をより良好に定義し、かつ従って、この検査を受ける必要のある患者の数を減らす可能性があるからである。傑出した特異性を有する、非侵入性に得られるプローブ材料、例えば血漿又は圧出液、尿のためにも適する腫瘍マーカーは、従って、アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）マーカー（Wozny et al., 2006）として新規に特性決定されることができた。
【０００７】
ＡＮＸＡ３は、アネキシンのファミリー、Ｃａ2+エフェクタータンパク質のクラスのむしろまれな代表例であり、このタンパク質は、特定のリン脂質に結合することにより、その可変性の作用を実施する。これらは、膜表面上にネットワークを形成することができ、かつ、従って、膜ミクロドメインを組織化し、かつ、タンパク質の相互作用のための焦点を動員する（Gerke et al., 2005）。
【０００８】
アネキシンはこれにより、細胞分化、細胞移動、そしてまた免疫調節において重要な役割を果たす。膜構造及び膜輸送とは別に、アネキシンの膜及びリン脂質独立性のタンパク質−タンパク質相互作用も存在する（Rescher & Gerke 2004; Gerke & Moss, 2002）。アネキシンは、軟骨形成及び骨の無機化においてマトリックス小胞の主たる成分として参加する（Wang et al., 2003）。ＡＮＸＡ３の差次的発現（differential expression）は、前立腺癌腫の場合に、特に、骨芽細胞性転移の発生の通常でない頻度に関して興味がもたれるものである（Keller et al., 2001）。
【０００９】
ＡＮＸＡ３は、細胞内でも細胞外でも生じ（Carlson et al., 2004）、例えば尿中のエキソソームで生じる（Pisitkun et al., 2004）。エキソソームは、いわゆる「多小胞体」の誘導体であり、かつ、選択的な、しかしながら決定的な役割を、免疫細胞の抗原提示において果たす可能性がある（Schartz et al., 2002）。尿中で検出されるエキソソームは、早期のデータで既に説明された、いわゆるプロスタソーム（prostasome）に同一である可能性があり（Arienti et al., 2004; Utleg et al., 2003）、いずれの場合においても、両者共にＡＮＸＡ３を含有する。
【００１０】
前立腺癌及び尿路の他の上皮癌の治療又は診断のためのタンパク質バイオマーカーは、US 2005 130 876, WO 03 086 461 , WO 2005 078 124, EP 05 011 042.8 及び EP 05 026 092.6中に説明されている。
【００１１】
しかしながら、ＡＮＸＡ３を決定するための前の方法は、使用可能な抗体の低い特異性に苦しみ、これは、他のアネキシンに対してかなりの交差反応性を示す。従って、本発明の課題は、前立腺癌腫の早期の段階において、高い特異的な診断を可能にする前立腺癌腫の決定のための方法を提供することであった。
【００１２】
第１の観点において、本発明は、アネキシンA３（ＡＮＸ Ａ３）の存在及び／又は量について、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンA３に特異的な抗体を用いて、試料を分析する、癌の診断のための方法に関する。
【００１３】
本発明の更なる観点は、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有する、アネキシンＡ３に対して特異的な少なくとも１つの抗体を含有する、癌の診断のための試験剤である。
【００１４】
また、本発明の更なる観点は、癌の治療のための医薬品の製造のための、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３に対して特異的な抗体を活性剤として含有する医薬組成物である。
【００１５】
また、本発明の更なる観点は、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３にとって特異的な抗体である。
【００１６】
また、本発明の更なる観点は、上述した抗体を産生する細胞、特にハイブリドーマ細胞である。
【００１７】
本出願において使用される場合に「抗体」との用語は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する抗体断片をも包含し、これは例えばＦａｂ断片又はＦ（ａｂ′）2断片、又は組み換え抗体、例えば、この単鎖抗体又はこの断片、例えばＦｖ断片である。
【００１８】
有利には、この抗体は、銀染色後のウェスタンブロットの濃度測定的な分析により決定して、他のアネキシン、例えばアネキシン５、アネキシン６及び／又はアネキシン８に対して検出可能な交差反応性を有しない。有利には、この抗体は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の混合物である。モノクローナル抗体はまた、キメラのモノクローナル抗体又はヒト化したモノクローナル抗体であってよく、これはヒトでない定常の、及び、場合により可変の、フレームワーク領域のヒト化により得られる。幾つかの高度に特異的なポリクローナル抗血清はしかしながら、本発明の方法において適してもいる。
【００１９】
有利なモノクローナル抗体は、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギその他を、精製したＡＮＸＡ３又はその断片、特にこのＮ−末端断片を用いて免疫化し、そして、標準的な方法に応じて所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得ることにより得られて良い。より有利には、抗体は、ヒトアネキシンＡ３（アネキシンＩＩＩ、リポコルチンＩＩＩ、胎盤抗凝血タンパク質ＩＩＩ（ＰＡＰ−ＩＩＩ）、３５アルファカルシメジン、又はイノシトール−１，２−環式ホスファート−２−ホスホヒドロラーゼとしても示される）のＮ末端領域中の、特に、ヒトアネキシンＡ３（GenBank Accession No. P12429）のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している。有利には、抗体は、癌細胞の表面に結合する。
【００２０】
有利なモノクローナル抗体は、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギその他を、精製したＡＮＸＡ３又はその断片、特に１６個のＮ末端アミノ酸を含む断片、例えば、断片、例えば、ＡＮＸ Ａ３（ＡＡ１〜３２４）、ＡＮＸ Ａ３（ＡＡ１〜１５９）又はＡＮＸ Ａ３（ＡＡ１〜１０６）で免疫化し、そして、標準的な方法により、所望されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得ることにより得られてよい。上で説明したとおり、所望の特異性を有するモノクローナル抗体は、上述の又は類似の断片を、エピトープマッピング及びＡＮＸＡ３のＮ末端部分に特異的に結合するモノクローナル抗体の相応する選択のために利用するスクリーニング手法により得られて良い。特に有利であるのは、天然のヒトＡＮＸＡ３の使用でもあり、例えばこれは、モノクローナル抗体の産生のための免疫原としてヒトの好中球から単離される。
【００２１】
更に、ＡＮＸＡ３に対して指向した有利なモノクローナルヒト抗体は、個々のヒト、例えば、ヒトのガン患者又は他の個人から得られて良い。抗体産生Ｂ細胞は、標準的な方法により個人から単離されてよい。
【００２２】
特別な一実施態様において、抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1 G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7であり、又は、抗体は、又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する。同じエピトープに結合する抗体は、標準的なプロトコルにより競合的な実験により決定されてよい。上述のハイブリドーマ細胞系列は、２００６年５月５日に（DSM ACC2778, DSM ACC2779, DSM ACC2780及びDSM ACC2781）、かつ、２００７年６月５日に（tgc 13 Prol/5G9, tgc 12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7）ＤＭＳＺに（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig）、ブタペスト条約により寄託されている。
【００２３】
更なる有利な一実施態様において、抗体は、
（ｉ） VRDYPDFSPSVD（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されているモノクローナル抗体である。
【００２４】
配列番号１の特に有利な部分配列は、DYPDFSPSVである。配列番号２の特に有利な部分配列は、LISILTERSである。配列番号３の特に有利な部分配列は、ＦＲＫＡＬＬ又はＳＬＫＶＤＥＨＬＡである。配列番号４の特に有利な部分配列は、TFDEYRNISである。配列番号５の特に有利な部分配列は、SRSEIDLLDである。配列番号６の特に有利な部分配列は、AIKSDTSGDEYEIである。配列番号１中のエピトープに対して指向された抗体の例は、tgct ProVII 5C5（DSM ACC2780）である。配列番号２中のエピトープに対して指向された抗体の例は、tgc5 Proll 6G7 (DSM ACC2778)及びtgc6 Prolll 1611 (DSM ACC2779)である。人のＡＮＸＡ３のＣ末端領域中のエピトープに対して指向した抗体の例は、tgc 13 Prol/5G9, tgc 12 Prolll/4B11及びtgc 14 ProVIII/3D7である。特に、有利な抗体は、配列番号５及び／又は配列番号６中のエピトープに対して指向されている。
【００２５】
更に、配列番号１〜６中のエピトープに対して指向された抗体は、エピトープ配列を含むポリペプチド又はペプチド、例えば組み換えヒトＡＮＸＡ３、他の種からのホモログペプチド又はこの断片で実験動物を免疫化することにより得られて良い。
【００２６】
本発明により診断されてよい癌は、有利には、尿生殖及び／又は消化管路の癌であってよく、例えば前立腺、膀胱、腎臓、尿道、卵巣、子宮又は大腸の癌である。特に、癌は上皮癌である。特定の有利な実施態様において、癌は、前立腺癌である。
【００２７】
本発明の方法は、免疫学的決定に適した任意の試験形式において実施されてよい。いくつかの試験形式においては、ラベリング基、例えば視覚的マーカー、例えばラテックス又は金のビーズ、蛍光マーカー基、酵素マーカー基その他を有する抗体を使用することが有利であってよい。抗体及びラベリング基のコンジュゲートは、標準的な方法により産生されてよく、例えば、抗体の反応性アミノ酸側基、例えばカルボキシ、アミノ及び／又はチオール基に対する、ラベリング基を用いた、例えば二官能性スペーサー分子を介した共有結合により産生されてよい。
【００２８】
この試料は有利には、ヒトの被験体から得られる。特定の有利な実施態様において、本発明の方法は、非侵入性の診断手法であり、その際試料は、例えば尿の試料、特に、圧出物である尿試料又は糞試料であってよい。所望される場合には、試料は、前処理手順、例えばゲル濾過にかけられてよい。
【００２９】
この試料は、細胞外の及び細胞内のＡＮＸＡ３の別個の決定を可能にする分画化手順にかけられてよい。例えば、試料は、細胞ペレット及び上清を得るために遠心分離され、これにより細胞内アネキシンＡ３は、細胞ペレット中で決定され、細胞外アネキシンＡ３は、上清中で決定される。特別に有利な一実施態様において、この方法は、細胞外ＡＮＸＡ３の選択的な決定を含む。
【００３０】
更なる実施態様において、本発明の方法は、組織化学的な手法であってよく、その際この試料は、組織試料、特にバイオプシー、例えばパンチバイオプシーであってよい。組織化学的な手法において、細胞外ＡＮＸＡ３の選択的な決定は、試料内でのＡＮＸＡ３の局所化の決定により実施されてよい。
【００３１】
本発明の方法において、細胞外ＡＮＸＡ３の余剰量が、試料、例えば圧出物である尿の低速遠心分離後の上清中で又は相応するペレット中で、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、線維症、慢性前立腺炎、様々な段階の前立腺上皮新形成（ＰＩＮ１〜３）にわたる種々の状態を有する癌でない患者と比較して減少する場合に、試料は、癌、例えば前立腺癌のための徴候として分類される。完全に健康な患者と比較して、ＡＮＸＡ３の余剰分は、ペレット及び上清の両者中で増加しているように見える。これらを一緒に考えると、圧出物である尿の上清及び／又はペレット中のＡＮＸＡ３の全量の又は濃度の、割合又は組み合わせの任意の種類（これは、上述した様々な症状の診断による区別化のために使用される）が、本発明により包含される。
【００３２】
本発明は、様々な細胞な及び細胞外試料画分（例えば圧出物である尿）中のＡＮＸＡ３の余剰量に関する、実質的に任意のセットのカットオフ（cut-offs）をカバーし、これは、任意の種類の差分遠心分離及び診断目的のための関連する比により達成可能である。
【００３３】
本発明の方法は、更なる癌マーカー、例えば癌マーカーの決定を更に含んでよい。更なるマーカーの決定は、同じ試料中で実施されてよく、その際、ＡＮＸＡ３は、異なる試料、例えば血液、血清及び／又は血漿試料中で決定される。特に有利には、血液、血清又は血漿マーカー、特にカリクレインプロテアーゼファミリーの少なくとも１つのメンバー、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及び／又は少なくとも１つの上皮細胞マーカー、特に前立腺特異的な膜抗原（ＰＳＭＡ）の決定である。
【００３４】
本発明の診断方法は、疾病段階の決定を含んでよく、その際、前癌段階、例えばＰＩＮ及び癌疾病段階との間での区別化が実施される。疾病段階の決定は、臨床的な病理学者による組織学的分類に基づき、前立腺癌の標準的な分類化は、Gleasonスコアによるが、増加する重症度の３つの群に癌をグループ分けする他の段階付け方法も存在する。現在のところ、この段階分け方法は、形態学的な尺度に主に頼っていて、かつ、経験のある熟練者を必要とする。癌でない場合のためには、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、線維症、慢性前立腺炎、様々な段階（ＰＩＮ１〜３）の前立腺上皮新形成にわたる種々の状態が説明されている。本発明は、圧出物である尿（exprimate urine）又は他の任意の試料の任意の種類の画分からの適したセットのカットオフを用いた、ＡＮＸＡ３に関連した読み出し（read-out）による前立腺癌又は前立腺に関連した癌でない状態の、任意の種類の層化に関する。
【００３５】
本発明はまた、医薬適用における、例えば癌、特に上で説明した尿生殖及び／又は消化管路の癌、特に前立腺癌の治療のための医薬品の製造のための上述の抗体の使用にも関する。本発明のこの実施態様において、抗体は有利には、ヒトの定常領域、例えばヒトの定常ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４領域及び場合によりヒト化したフレームワーク領域を有する、キメラの又はヒト化したモノクローナル抗体である。又は、抗体は、個々のヒトの血清から得られてよい、ヒトの抗体であってよい。治療的な抗体は有利には、癌細胞、例えば前立腺癌の細胞の表面に結合する。
【００３６】
この治療的な抗体は、エフェクター分子、例えば放射性及び／又は細胞毒性残基に対してコンジュゲートしてよい。治療適用のためには、抗体は、治療的に有効な量、例えば１日につき１０〜５０００μｇ、１日につき４０００〜１０００μｇで、疾病の種類及び重症度に応じて、有利には輸液により投与されてよい。公知の方法により投与されてよい抗体は、公知の方法により、例えば、腸管外により、他の抗体、例えばトラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブその他の投与のために公知である標準的な方法により、投与されてよい。この抗体の投与は、他の治療的な選択肢、例えば、他の抗腫瘍抗体の投与、細胞毒性剤の投与、手術及び／又は放射線療法と組み合わせてよい。
【００３７】
更に、本発明は、以下の図及び実施例により、より詳細に説明されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】モノクローナル抗体のエピトープマッピングのために使用されるアネキシンA３（A）及びアネキシンA３の組み換え断片の構造の概要；本出願の主題であるモノクローナル抗体のエピトープマッピングによるスクリーニングのこのタイプに応じて、選択されている。
【図２】ヒトのアネキシンＡ３断片ｖＡＮＡ−５（アミノ酸１０７−２４３）の精製；ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィにより精製したｖＡＮＡ−５。
【図３】ヒトのアネキシンＡ３断片ｖＡＮＡ−７（アミノ酸１−１０６）の精製；ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィにより精製したｖＡＮＡ−７。
【図４】アネキシンＡ３断片ｖＡＮＡ−１（アミノ酸1−３２４）の精製；クロマトグラフィにより精製したｖＡＮＡ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図５】ｖＡＮＡ−１ＥＬＩＳＡプレートの試験：紫：アネキシンＡ３特異的抗血清；青：ゼロ血清（null serum）；ウサギからの高価値（premiumu）の血清。
【図６】抗ＡＮＸＡ３抗体の特異性；レーン１〜９及び２Ｄウェスタンブロットを、Wozny et al., 2006から取り出す；レーン１０−１９は、この文章中で説明されるとおりの様々なモノクローナル抗ＡＮＸＡ３抗体を示す。これらは、他のアネキシンの任意の他のタンパク質に対して交差反応性を実質的に示さない。
【図７】ＰＣ３細胞からの全体的な細胞溶解物のウェスタンブロットのＥＣＬ展開後の抗ＡＮＸＡ３染色の濃度測定による定量化は、モノクローナル抗体tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)の高い特異性を示す。
【図８】抗ＡＮＸＡ３ベースの、抗原としてｖＡＮＡ−１を用いたＥＬＩＳＡの校正、この色反応を、１５分（Ａ）、３０分（Ｂ）及び４５分（Ｃ）後に停止した。
【図９】標準的な低速遠心分離後の圧出物尿上清中のＡＮＸＡ３の検出；Ａ、Ｄ：１５分；Ｂ、Ｅ：３０分及びＣ、Ｆ：４５分の展開：ピンクのカーブを、尿を除去するためのゲル濾過（ＧＦ）後に得た。
【図１０】抗ＡＮＸＡ３ベースの診断検査のためのＲＯＣ曲線、図６中のＥＬＩＳＡを利用し、かつ、４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＰＳＡ値を有する２００名の患者を基礎とする：ＡＵＲＯＣは、０．８２３であり、ＰＳＡ「グレーゾーン」中の重要な集合のための、７０％の感受性での９０％の特異性を示す。
【図１１】Wozny et al., 2006中で使用されるポリクローナル血清（図１参照）は、ＰＣ−３細胞の表面に取るに足らない程度でのみ結合する。
【図１２】ＰＣ−３細胞上の表面ＡＮＸＡ３の、tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)による検出；この抗体は、グラフ中で示される濃度で使用した。二次抗体として、１：５０の希釈にある抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣを使用し、この出発容積は、抗体希釈の１００μｌであった。この結果は、この前立腺癌細胞系列中でのＡＮＸＡ３の表面局在化を示し、これは、治療的に利用されることができる可能性がある。
【図１３】ＡＮＸＡ３の抗原性領域をカバーするオーバーラップ配列を用いて、６個のエピトープが見出され、かつ、ポリクローナル抗血清の高度に特異的な結合に寄与すると特性決定された。Ｎ末端領域中の２つのエピトープ（これは、tgc5 Pro II6G7= DSM ACC2778; tgc6 Prolll1G11 = DSM ACC2779; tgc7 ProVII5C5 = DSM ACC2780により認識される）の隣には、図１４中でより詳細に示される更に４つのエピトープが存在する。
【図１４】ヒトのＡＮＸＡ３及びこの抗原性領域の配列に関する概要（濃い紫、最も下の線）；ポリクローナルＡＢ１は、高度に特異的なポリクローナル抗血清であり、ＡＮＸＡ３にのみ結合し、その他のアネキシン又は他の任意の抗原に対して交差反応性を有しない（２Ｄウェスタンブロット及び質量分析により示されるとおり、図１）。ポリクローナルＡＢ２は、エピトープ３及び４に対して指向されている；ＭＡＢ１は、tgc7 ProVII5C5 = DSM ACC2780であり、ＭＡＢ２は、tgc5 Pro II6G7= DSM ACC2778及びtgc6 Prolll1G11 = DSM ACC2779の両者を指す；この組み換えＡＮＸＡ３断片１−８は、それぞれの免疫化のために使用した。
【図１５】ヒトのＡＮＸＡ３の結晶構造の図式。
【００３９】
実施例
実施例１
ＡＮＸＡ ３に対して指向した特異的モノクローナル抗体の産生
ヒトのアネキシンＡ３、ｖＡＮＡ−５（AA 107〜243）、ｖＡＮＡ−７（ＡＡ1〜106）、ｖＡＮＡ−１（ＡＡ1〜324）、ｖＡＮＡ−２（ＡＡ1〜159）、ｖＡＮＡ−３（ＡＡ35〜159）、ｖＡＮＡ−４（ＡＡ191〜324）及びｖＡＮＡ−６（ＡＡ107〜190）の組み換え溶解性断片をクローニングし、かつ、大腸菌中で発現させ、引き続き、クロマトグラフィにより精製した。アネキシンＡ３及びこの組み換え断片の構造の概要は、図１中に示されている。
【００４０】
図２、３及び４は、標準的なクロマトグラフィ手法により精製された、組み換え溶解性ＡＮＸＡ３断片ｖＡＮＡ−５、ｖＡＮＡ−７及びｖＡＮＡ−１のクーマシー染色１Ｄゲルを示す。
【００４１】
抗体産生細胞の融合後及びクローニングの間の陽性のハイブリドーマ細胞のためのスクリーニング、断片ｖＡＮＡ−１を基礎とする抗アネキシンＡ３ ＥＬＩＳＡを展開した（図５）。ＡＮＸＡ３の天然のエピトープに結合する抗体の包括的な認識を達成するために、組み替えのｖＡＮＡ−１を、ＥＬＩＳＡプレートへのカップリング前に変性した。組み換えｖＡＮＡ−１を、ＥＬＩＳＡプレートに、１μｇ／ウェルの濃度で被覆した。ＥＬＩＳＡプレートの官能性を、ポリクローナル抗ＡＮＸＡ３血清を用いて確認した。
【００４２】
図６は、前立腺組織の良性の及び癌性の試料に対するポリクローナル血清の反応性の、擬似スペクトル色描写（false spectral colour depiction）を示す。この癌性の試料は、２Ｄ−ＰＡＧＥによりブロッティングして示されている。大半のシグナルが、４つのスポットの鎖から得られ、これは、ＡＮＸＡ３として質量分析により同定されている。これらの擬似スペクトルカラー画像は、単一のカラーグレースケールにより許容されるよりもはるかにより深いダイナミックレンジを反映する。非ＡＮＸＡ ３シグナルの強度は、常にバックグラウンドに近く、これは、青（バックグランドに近い）ピクセルにより示されている。特異的シグナルと非特異的シグナルの間のこのコントラストの程度は、図６中のレーン８及び９中に示され、これは、単一のカラーグレースケールにおける結果を示す。
【００４３】
この状況は、モノクローナル抗体tgc5 Pro II6G7= DSM ACC2778 (レーン１０及び１１); tgc6 Prolll1G11 (DSM ACC2779) (レーン１５及び１６); tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780) (レーン１２〜１４); tgc8 Prolll1 E1 (DSM ACC2781 ) (レーン１７〜１９)の様々な希釈のレーン１０〜１９のシグナルプロフィールにより更に強調される；これは、一層より低い交差反応性を示す。
【００４４】
図６中に示されるとおり、本発明の主題であるモノクローナル抗体は、他のアネキシンとの交差反応性を実質的に有しない。その一方で、Wozny et al. 2006からのポリクローナル血清はANXA６とのいくらかの残存交差反応性を有し、モノクローナル抗体（前立腺癌の患者からのバイオプシーの、及び、前立腺癌細胞系列、PC３の）を用いた染色は、図６の右側に示され、ANXA３に対して３３ｋＤａの他の位置での１％よりも少ないバックグラウンド染色を産生する。
【００４５】
図７は、電気化学発光（ＥＣＬ）展開後の抗ＡＮＸＡ３染色の濃度的な定量化を示す。ＰＣ３細胞からの全細胞溶解物のウェスタンブロットを、抗体tgc7 ProVII5C5 (DSM 2780)を用いて分析した。ＡＮＸＡ３に相応する単一バンドのみが見出された。実質的に交差反応性は存在しない。
【００４６】
実施例２
圧出物尿試料及び組織区画における抗体特異性の決定
実施例１のモノクローナル抗体を、上述したＥＬＩＳＡフォーマットにおいて使用し、癌患者からの圧出物尿からの上清中のＡＮＸＡ３を検出した。
【００４７】
図８中に示されるとおり、校正のために、ＥＬＩＳＡプレートを、tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)で被覆し、かつ、ｖＡＮＡ−１（２０〜０．３ｎｇ／ウェル）の希釈系列を、ビオチン化したtgc5 Pro II6G7 (DSM ACC2778)及びアビジンＨＲＰを基質としてのＴＭＢと共に使用して検出した。この酵素による色反応を、示したとおりに、１５、３０及び４５分後に停止した。
【００４８】
図９中に、患者から採取した圧出物尿の上清中のＡＮＸＡ３の検出を示した。この試料を、標準的な臨床的な手法に応じて、低速遠心分離でもって遠心分離した。このシグナルを、事前のゲル濾過（ＧＦ）により改善し、これは実質的に尿を除去し、尿は、１Ｄ ＰＡＧＥからのウェスタンブロットに干渉する可能性がある。
【００４９】
この抗体を、組織区画の免疫組織化学的染色手法においても試験した。ＡＮＸＡ３の高い細胞内濃度が、通常の前立腺上皮において見出された。ＰＩＮから癌腫への疾病進行の間に、細胞外に局在するＡＮＸＡ３の顕著な局所的な増加が見出された。この染色された領域のバイオプシーは、しかしながら、圧出物尿の上清とペレットとの間で、診断性のＡＮＸＡ３分布の、定量的な関連の一般的な評価を示すことも、可能にすることもない。これは単に、バイオプシーが、むしろ定量的であり、しかしながら、良性の質の癌性の前立腺領域を、理解可能に示すことができないからである。
【００５０】
実施例３
圧出物尿試料中のＡＮＸＡ３の決定のための臨床試験
多施設盲検臨床試験を、体液、特に圧出物尿中のＡＮＸＡ３の非侵入的な検出を基礎とする前立腺癌診断の感受性及び特異性を決定するために実施した。
【００５１】
３．１ 患者及び対照
Ａ：組織学的に確認された前立腺癌腫を有する患者（ＰＣＡ群）：ｎ＝約２００名
Ｂ：組織学的試験により決定して、前立腺癌腫を有しない患者（対照群）：ｎ＝約３００名
【００５２】
３．２ 試料の採取及び処理
３．２．１ 血清／血漿
血清ＰＳＡ値の日常的な決定のための血清管を、静脈的に採取した。更に、１〜２ｍｌの血清を、付加的に提供（asserve）し、深冷凍結して貯蔵した。この血液試料を更に、ＰＳＡについて分析した。血液試料の採取を、パンチバイオプシー又は直腸触診の実施前に実施した。
【００５３】
３．２．２ 圧出物尿沈殿
２０秒間の触診及び前立腺のマッサージ後に、患者に膀胱を空にするように要求した。この得られる圧出物尿を、刊行された手法（I. Rehman, A. R. Azzouzi, J. W. F. Catto, S. Allen, S. S. Cross, K. Feeley, M. Meuth, & F. C. Hamdy, Proteomic analysis of voided urine after prostatic massage from patients with prostate cancer: A pilot study, Urology 64 (6), 2004, 1238-1243; C. Goessl, M. Mueller, R. Heicappell, H. Krause, B. Straub, M. Schrader & K. Miller, DNA-based detection of prostate cancer in urine after prostatic massage. Urology 58 (3), 2001 , 335-338）に応じて処理し、この生成物を−８０℃で貯蔵した。
【００５４】
血清と同様に、圧出物尿を採取しなくてはならず、可能であれば、パンチバイオプシーが実施される前である。
【００５５】
３．３ 結果
約２００名のＰＳＡ陽性患者において、圧出物尿の試料中の沈殿及び上清中のＡＮＸＡ３の決定では、約９０％の感受性を、そして、約８０％の特異性を示した。
【００５６】
図１０中で示されるとおり、ＰＳＡを有する患者中の上清（u.anx.tot）中のＡＮＸＡ３を基礎とする読み取りのためのＲＯＣ値は、２〜６ｎｇ／ｍｌの範囲内で、０．８であり、ＰＳＡ値４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内ではＲＯＣ値は０．８５であり、かつ、全患者及び全てのＰＳＡ値の全範囲の全体的な集団においては、ＡＮＸＡ３のためのＲＯＣ値は０．７４であった。
【００５７】
図１０中の代表的なＲＯＣ曲線は、４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内のＰＳＡ値を有する患者について；診断的な関連性を、特に、ＰＳＡのこの重要なグレーゾーンにおいて示し（ここで、ＰＳＡの特異性は極めて低いRoddam AW, Duffy MJ, Hamdy FC, Ward AM, Patnick J, Price CP Rimmer J, Sturgeon C, White P, Allen NE; On behalf of the NHS Prostate Cancer Risk Management Programme. Use of prostate-specific antigen (PSA) isoforms for the detection of prostate cancer in men with a PSA level of 2-10 ng/ml: systematic review and meta-analysis. Eur Urol. 2005 Sep; 48 (3):386-99; discussion 398-9. Review. PMID: 15982797; Stamey TA, Caldwell M, McNeal JE, Nolley R, Hemenez M, Downs J. The prostate specific antigen era in the United States is over for prostate cancer: what happened in the last 20 years? J Urol. 2004 Oct; 172(4 Pt 1 ): 1297-301. PMID: 15371827)）、ＲＯＣ曲線は、臨床的な統計学の標準的な道具であり、例えばhttp://www.anaesthetist.com/mnm/stats/roc/に詳細に説明されている。
【００５８】
実施例４
癌細胞に対するモノクローナル抗体の結合
このモノクローナル抗ＡＮＸＡ３抗体は、診断（病理学的組織学）及び治療的適用において表面マーカーとして適している。
【００５９】
以下においてフローサイトメトリーにより示されるとおり、特に、Ｎ末端のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)は、前立腺癌細胞系列の細胞外結合部位（ＰＣ３細胞、ATCC, DCV-1017,２００４年８月）に、カルシウム依存性の様式で結合する。
【００６０】
非特異的な結合を、二次抗体単独を用いたインキュベーションによって、そして、非特異的及び未処理の対照抗体（モノクローナル及びポリクローナル）の使用により、各実験の間に評価した。
【００６１】
図１１は、Wozny et al., 2006中で使用されるポリクローナル血清（図6参照）が、ＰＣ−３細胞の表面に取るに足らない程度でのみ結合することを示す。
【００６２】
細胞を、適した緩衝液で洗浄し、かつ、氷上で３０分間、図１１に示される希釈で、インキュベーションした。引き続き、全ての試料を、ＦＩＴＣに結合した抗ウサギ二次抗体の１００μｌの１：５０希釈を用いてインキュベーションした。
【００６３】
洗浄工程後に、各試料の１２０００個の細胞を、示されるとおり、フローサイトメトリーにより分析した。
【００６４】
本質的には、ポリクローナル血清は、様々な希釈で、そして、対照血清に比較して、蛍光強度の著しい増加を示さなかった。ＰＣ−３細胞上のＡＮＸＡ３の表面発現は従って、この段階では示されることができず、ことによるとこれは、ポリクローナル血清中での特異的な抗体の濃度が低すぎるためである。
【００６５】
しかしながら、図１２中に示されるとおり、モノクローナル抗体tgc7 ProVII5C5 (DSM ACC2780)は、濃度依存性の及びカルシウム依存性の様式で確かに、ＰＣ−３細胞の表面エピトープに結合する。
【００６６】
実施例５
エピトープマッピング
アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）の全体的の抗原性領域をカバーする、重複するペプチド配列の使用後に、我々は、６個のみのエピトープが、高い特異性結合を担うことを結論づけ、これは図１３及び１４中に、高度に特異的なポリクローナル抗体の結合を分析することにより示されるとおりである（図１参照）。
【００６７】
ポリクローナル抗血清の特異性を、ウェスタンブロット及び質量分析に由来する２Ｄ−ＰＡＧＥにより制御した。同じことは、モノクローナル抗体tgc5 Pro II6G7= DSM ACC2778; tgc6 Prolll1G11 =DSM ACC2779; tgc7 ProVII5C5 = DSM ACC2780; tgc 13 Prol/5G9; tgc 12 Prolll/4B11 ; tgc 14 ProVIII/3D7に当てはまる。
【００６８】
このエピトープマッピングは、Ｎ末端領域中の２つのエピトープの隣に、中央の領域中の２つのエピトープからの、そして、ＡＮＸＡ３のＣ末端領域中の２つのエピトープ寄与が存在することを示す（図１３）。
【００６９】
ヒトのＡＮＸＡ３上のこれらのエピトープの局在化（エピトープ１〜６として示される）は、図１４中に示される。
【００７０】
概要として図１４中に示したヒトのＡＮＸＡ３の結晶構造（http://www.pdb.org/pdb/files/1axn.pdb 及びhttp://www.pdb.org/pdb/explore.do?structureld=1AXN）は、エピトープ１、２、５及び６が、一緒になって、ＡＮＸＡ３の天然の折りたたみにおけるドメインを形成することを示唆する。従って、我々は、相応する抗体を得るべくこの材料を用いて、ヒトＡＮＸＡ３を好中球及び免疫化したウサギから単離すべく、処理した。これらの抗体は、天然のＡＮＸＡ３に対して指向していて、我々は再度、最も高い特異性について、スクリーニングしかつ選択し、かつ、相応するエピトープ１、２、５及び６を含有するこれらのドメインに対する結合は、診断及び治療的目的に特に適している。
【００７１】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシンＡ３の存在及び／又は量について、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３に特異的な抗体を用いて試料を分析する、癌の診断方法。
【請求項２】
癌が、尿生殖器及び／又は消化管路の癌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌が、上皮癌である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
癌が、前立腺癌である、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
抗体が、アネキシンＡ３のＮ末端に、特に、ヒトのアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する抗体から選択されている、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
抗体が、
（ｉ） ＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤ（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されている、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
抗体が、ラベリング基を有する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
非侵入性の手法である、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
試料が、尿の試料、特に圧出物尿試料である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
試料が、糞試料である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
組織化学的手法である、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
試料が、組織試料、特にバイオプシーである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞外アネキシンＡ３の存在及び／又は量及び／又は細胞内アネキシンＡ３の存在及び／又は量を決定する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの更なるマーカーを決定する、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
更なるマーカーが、前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）及び／又は前立腺特異的な膜抗原（ＰＳＭＡ）である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
診断が、この疾病段階の決定を含む、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前癌段階及び癌段階の間の少なくとも１つの区別化を実施する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
他のアネキシンに対して低い交差反応性を有する、アネキシンＡ３に対して特異的な少なくとも１つの抗体を含有する、前立腺癌の診断のための試験剤。
【請求項２１】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２０記載の剤。
【請求項２２】
抗体が、アネキシンＡ３のＮ末端に、特に、ヒトのアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している、請求項２０又は２１記載の剤。
【請求項２３】
抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1 G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する抗体から選択されている、請求項２０から２２までのいずれか１項記載の剤。
【請求項２４】
抗体が、
（ｉ） ＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤ（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されている、請求項２０から２３までのいずれか１項記載の剤。
【請求項２５】
抗体が、ラベリング基を有する、請求項２０から２４までのいずれか１項記載の剤。
【請求項２６】
癌の治療のための医薬品の製造のための、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３に対して特異的な抗体の使用。
【請求項２７】
癌が、尿生殖器及び／又は消化管路の癌である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
抗体が、キメラの又はヒト化した又はヒトのモノクローナル抗体である、請求項２６又は２７記載の使用。
【請求項２９】
抗体が、アネキシンＡ３のＮ末端に、特に、ヒトのアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している、請求項２６から２８までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３０】
抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1 G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する抗体から選択されている、請求項２６から２９までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３１】
抗体が、
（ｉ） ＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤ（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されている、請求項２６から３０までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３２】
抗体が、エフェクター分子にコンジュゲートしている、請求項２６から３１までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３３】
癌の治療のための医薬品の製造のための、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３に対して特異的な抗体を活性剤として含有する医薬組成物。
【請求項３４】
他のアネキシンに対して低い交差反応性を有する、アネキシンＡ３に対して特異的な抗体。
【請求項３５】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項３４記載の抗体。
【請求項３６】
抗体が、アネキシンＡ３のＮ末端に、特に、ヒトのアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している、請求項３４又は３５記載の抗体。
【請求項３７】
抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1 G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する抗体から選択されている、請求項３４から３６までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項３８】
抗体が、
（ｉ） ＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤ（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されている、請求項３４から３７までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項３９】
ラベリング基又はエフェクター基を有する、請求項３４から３８までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項４０】
請求項３４から３９までのいずれか１項記載の抗体を産生する細胞。
【請求項４１】
免疫化剤の製造のための、天然のヒトのアネキシンＡ３の使用。
【請求項４２】
天然のヒトのアネキシンＡ３が、好中球から単離されている、請求項４１記載の使用。
【請求項４３】
ヒトのアネキシンＡ３に対して指向したヒトの抗体を産生するための方法において、この抗体をヒトの試料から産生することができるＢ細胞を単離し、この抗体をこのＢ細胞又は細胞、例えばこの細胞に由来するハイブリドーマ細胞から獲得することを含む、ヒトのアネキシンＡ３に対して指向したヒトの抗体を産生するための方法。
【請求項１】
アネキシンＡ３の存在及び／又は量について、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３に特異的な抗体を用いて試料を分析する、癌の診断方法。
【請求項２】
癌が、尿生殖器及び／又は消化管路の癌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌が、上皮癌である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
癌が、前立腺癌である、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
抗体が、アネキシンＡ３のＮ末端に、特に、ヒトのアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する抗体から選択されている、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
抗体が、
（ｉ） ＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤ（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されている、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
抗体が、ラベリング基を有する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
非侵入性の手法である、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
試料が、尿の試料、特に圧出物尿試料である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
試料が、糞試料である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
組織化学的手法である、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
試料が、組織試料、特にバイオプシーである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞外アネキシンＡ３の存在及び／又は量及び／又は細胞内アネキシンＡ３の存在及び／又は量を決定する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの更なるマーカーを決定する、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
更なるマーカーが、前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）及び／又は前立腺特異的な膜抗原（ＰＳＭＡ）である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
診断が、この疾病段階の決定を含む、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前癌段階及び癌段階の間の少なくとも１つの区別化を実施する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
他のアネキシンに対して低い交差反応性を有する、アネキシンＡ３に対して特異的な少なくとも１つの抗体を含有する、前立腺癌の診断のための試験剤。
【請求項２１】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２０記載の剤。
【請求項２２】
抗体が、アネキシンＡ３のＮ末端に、特に、ヒトのアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している、請求項２０又は２１記載の剤。
【請求項２３】
抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1 G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する抗体から選択されている、請求項２０から２２までのいずれか１項記載の剤。
【請求項２４】
抗体が、
（ｉ） ＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤ（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されている、請求項２０から２３までのいずれか１項記載の剤。
【請求項２５】
抗体が、ラベリング基を有する、請求項２０から２４までのいずれか１項記載の剤。
【請求項２６】
癌の治療のための医薬品の製造のための、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３に対して特異的な抗体の使用。
【請求項２７】
癌が、尿生殖器及び／又は消化管路の癌である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
抗体が、キメラの又はヒト化した又はヒトのモノクローナル抗体である、請求項２６又は２７記載の使用。
【請求項２９】
抗体が、アネキシンＡ３のＮ末端に、特に、ヒトのアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している、請求項２６から２８までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３０】
抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1 G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する抗体から選択されている、請求項２６から２９までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３１】
抗体が、
（ｉ） ＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤ（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されている、請求項２６から３０までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３２】
抗体が、エフェクター分子にコンジュゲートしている、請求項２６から３１までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３３】
癌の治療のための医薬品の製造のための、他のアネキシンに対して低い交差反応性を有するアネキシンＡ３に対して特異的な抗体を活性剤として含有する医薬組成物。
【請求項３４】
他のアネキシンに対して低い交差反応性を有する、アネキシンＡ３に対して特異的な抗体。
【請求項３５】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項３４記載の抗体。
【請求項３６】
抗体が、アネキシンＡ３のＮ末端に、特に、ヒトのアネキシンＡ３のアミノ酸１〜１６の領域内のエピトープに対して指向している、請求項３４又は３５記載の抗体。
【請求項３７】
抗体が、ハイブリドーマ細胞系列により産生された抗体tgc 5 Proll6G7 (DSM ACC2788), tgc 6 Prolll1 G11(DSM ACC2779), tgc 7 ProVII5C5 (DSM ACC2780), tgc 8 Prolll1E1(DSM ACC2781), tgc 13 Prol/5G9, tgc12 Prolll/4B11 , tgc 14 ProVIII/3D7又はアネキシンＡ３上の同じエピトープに結合する抗体から選択されている、請求項３４から３６までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項３８】
抗体が、
（ｉ） ＶＲＤＹＰＤＦＳＰＳＶＤ（配列番号１）、
（ｉｉ） ＭＬＩＳＩＬＴＥＲＳＮＡ（配列番号２）、
（ｉｉｉ） ＧＤＦＲＫＡＬＬＴＬＡＤＧＲＲＤＥＳＬＫＶＤＥＨＬＡＫＱ（配列番号３）、
（ｉｖ） ＫＬＴＦＤＥＹＲＮＩＳＱＫＤＩＶＤＳＩＫＧＥＬＳＧ（配列番号４）、
（ｖ） ＩＭＶＳＲＳＥＩＤＬＬＤＩＲＴＥＦ（配列番号５）、
（ｖｉ） ＹＳＡＩＫＳＤＴＳＧＤＹＥＩＴＬＬ（配列番号６）
又は、少なくとも６アミノ酸の長さを有するこの部分的な連続配列
から選択される配列を含む、アネキシンＡ３上のエピトープに対して指向されている、請求項３４から３７までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項３９】
ラベリング基又はエフェクター基を有する、請求項３４から３８までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項４０】
請求項３４から３９までのいずれか１項記載の抗体を産生する細胞。
【請求項４１】
免疫化剤の製造のための、天然のヒトのアネキシンＡ３の使用。
【請求項４２】
天然のヒトのアネキシンＡ３が、好中球から単離されている、請求項４１記載の使用。
【請求項４３】
ヒトのアネキシンＡ３に対して指向したヒトの抗体を産生するための方法において、この抗体をヒトの試料から産生することができるＢ細胞を単離し、この抗体をこのＢ細胞又は細胞、例えばこの細胞に由来するハイブリドーマ細胞から獲得することを含む、ヒトのアネキシンＡ３に対して指向したヒトの抗体を産生するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５４０２７８（Ｐ２００９−５４０２７８Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３６０８（Ｐ２００９−５１３６０８）
【出願日】平成１９年６月１１日（２００７．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００５１３４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４１０４３
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０８３６２６０８）プロテオシス アクチエンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＰｒｏｔｅｏＳｙｓ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ−Ｓｔｒａｓｓｅ ５１， Ｄ−５５１２９ Ｍａｉｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１１日（２００７．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００５１３４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４１０４３
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０８３６２６０８）プロテオシス アクチエンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＰｒｏｔｅｏＳｙｓ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ−Ｓｔｒａｓｓｅ ５１， Ｄ−５５１２９ Ｍａｉｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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