動物の健康を向上するためにバチルス・ズブチリス株を使用する方法
本発明は、動物の健康を向上させるための方法であって、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体を含む組成物を該動物に投与することを含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）により、２００８年９月１７日出願の米国特許仮出願第６１／１９２，４３６号の優先権を主張するものである。前記の出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0002] 本発明は、プロバイオティクス、および動物の健康または動物の全身的な身体状態を向上させるその能力の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003] バチルス属は、多数の内生胞子形成細菌を含み、中でも、農業および動物の栄養の分野において種々の用途がある。数種のバチルス株は、抗生物質に代わるものとして、動物用飼料中のプロバイオティクスとしての用途で現在流通している。こうしたプロバイオティクスは、胃腸の細菌叢を調節することによる動物の成長および飼料効率の改善を含め、動物の健康を向上させる。ヒトが消費するための動物製品中の残留抗生物質、および抗生物質への耐性の出現に対する懸念から、そのようなプロバイオティクスの使用は増加している。近年、プロバイオティクスとして使用するための胞子形成細菌をスクリーニングするための研究が行われている。多様な市販製品にはバチルス・ズブチリス株、バチルス・リケニフォルミス株およびバチルス・コアギュランス株が含有されているが、すべてのバチルス株が有効な飼料添加物であるわけではないことが、そうしたスクリーニングにより明らかになっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004] 本発明は、動物に投与されると当該動物の健康を向上させるバチルス・ズブチリス株を提供する。具体的には、本発明は、昆虫以外およびヒト以外の動物の健康を向上させ、または、当該動物の全身的な身体状態を改善するための方法であって、飼料または飲料水（経口強制栄養によらず）の中に（ｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、（ｉｉ）（ｉ）の変異体、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の無細胞調製物、または（ｉ）もしくは（ｉｉ）の代謝産物を含む組成物を当該動物に与えることによる方法に関する。一実施形態では、本発明の組成物は、バチルス・ズブチリス７１３またはその変異体、および細菌により産生される代謝産物を含む。別の実施形態では、この組成物は、主に胞子フォームのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を含む。
【０００５】
[0005] 本発明のいくつかの実施形態では、この組成物は、動物の生涯にわたり、または動物の生涯の特定の段階もしくは部分の間、複数日にわたり飼料に入れて動物に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、この組成物は、家畜の幼動物用飼料のみに加えて、または仕上げ飼料のみに加えて投与される。
【０００６】
[0006] 本発明の方法は、動物の体重増加を向上させ、飼料利用効率を高め、罹病率を低下させ、耐病性を高め、生存率を高め、動物の免疫応答を高め、および健康な腸内微生物叢を維持するために使用できる。一実施形態では、本発明の方法は、治療目的での１クールの抗生物質の投与後、腸内微生物叢の健康なバランスの回復を補助するために使用される。
【０００７】
[0007] 一実施形態では、本発明の組成物は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体を含み、飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０３ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０４ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０５ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０６ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０７ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０８ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０９ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０１０ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０１１ＣＦＵの比率で動物に投与される。
【０００８】
[0008] 別の実施形態では、本発明の組成物は、動物の腸内の病原性細菌の増殖を低下させるのに有効な量で動物に投与または給餌される。そのような病原性細菌としては、クロストリジウム、リステリア、サルモネラ、カンピロバクター、大腸菌およびビブリオが挙げられる。関連して、本発明の方法は、動物の糞便中の病原性細菌排出物の量を減少させるために使用できる。本発明の方法は、乳酸菌など、動物の腸内の有益細菌の増殖を維持または増加させるためにも使用できる。病原性細菌を減少させ、および／または有益細菌を増加もしくは維持することにより、本発明の組成物は、健康な腸内微生物叢全体を維持することが可能である。
【０００９】
[0009] 本発明の方法は、ヒト以外および昆虫以外のすべての動物に使用できる。本発明の方法が有効と考えられる動物としては、鳥類、ブタ、反芻動物、ペットおよび外来種動物、動物園の動物、水生動物、中でもウマが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、動物は、ブロイラーおよび卵用ニワトリなど、消費用または食物生産動物として飼育される家畜である。
【００１０】
[0010] 本発明は、動物の健康を向上させまたは動物の身体状態を改善するように構成される組成物も提供する。したがって、本発明の組成物は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体、その無細胞調製物またはその代謝産物、およびこれらの組成物を飼料添加物または飲料水用添加物として動物に与えるのに適したものとする担体を含むことができる。あるいは、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体、その無細胞調製物またはその代謝産物は、飼料タンパク質および／または飼料炭水化物などの動物用飼料原料と共に調合してもよい。そのような組合せは、標準的なペレット化工程により押し出されるペレットのフォームであってもよい。
【００１１】
[0011] 本発明の組成物は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体、ＱＳＴ７１３の無細胞調製物またはその変異体、ならびにＱＳＴ７１３の代謝産物およびその変異体と、他のプロバイオティクスおよび／またはプレバイオティクスとの組合せも含む。
【００１２】
[0012] 本発明は、ペレット化工程に先立ち、動物に与えると動物の健康を向上させるのに有効な量で、炭水化物およびタンパク質などの標準的な飼料成分にバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３胞子を加えることを含む、直接投与型微生物を含有する動物用飼料を調製する方法も包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[0013]クロストリジウムの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図２】[0014]クロストリジウムの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理した無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図３】[0015]リステリアの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図４】[0016]リステリアの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理した無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図５】[0017]サルモネラの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図６】[0018]サルモネラの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理した無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図７】[0019]病原菌に対するＱＳＴ７１３の有効性を試験するためにバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３（縦）およびクロストリジウム・ペルフリンゲンスの多様な単離物（横）を交叉画線した寒天プレートを示す写真である。
【図８】[0020]病原菌に対するＱＳＴ７１３の有効性を試験するためにバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３（縦）およびカンピロバクター・ジェジュニの多様な単離物（横）を交叉画線した寒天プレートを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[0021] 本明細書におけるすべての刊行物、特許および特許出願（一切の図面および補遺を含む）は、各個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれると具体的かつ個々に示された場合と同程度に、参照により組み込まれる。
【００１５】
[0022] 以下の説明には、本発明の理解に有用と考えられる情報が含まれる。本明細書に記載の情報の任意のものが本出願で特許請求される発明の先行技術もしくは関連するものであることも、具体的もしくは間接的に参照される任意の刊行物が先行技術であることも認めるものではない。
【００１６】
[0023] 本発明は、バチルス・ズブチリス株ＱＳＴ７１３および／または、プロバイオティクスとして動物の健康を向上させるのに有効なその代謝産物の新規の使用に関する。プロバイオティクスは、有害細菌（クロストリジウムおよびカンピロバクターなど）の減少および有益細菌（ラクトバチルス属種およびビフィズス属菌など）の増加を含め、健康な腸内微生物叢を維持するために動物の健康用途において使用される。プロバイオティクスは病原性細菌と有益細菌との間の健康なバランスを維持するために好適であるが、その理由は、プロバイオティクスは、抗生物質とは異なり、細菌を無差別に破壊もしなければ、病原性細菌の抗生物質耐性株となることもないからである。プロバイオティクスが健康な腸内微生物叢を維持すると考えられる多くの機序がある：病原性細菌の競合排除、抗微生物物質の産生による病原性細菌の減少、有益な腸内微生物叢の増殖および生存率の向上、ならびに動物の全身性免疫応答の刺激。
【００１７】
[0024] 本発明は、（ｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、（ｉｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の無細胞調製物、または（ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の代謝産物を含む組成物を動物に投与することにより、動物の健康を向上させる方法を包含する。
【００１８】
[0025] バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、その変異体、その上澄みおよびそのリポペプチド代謝産物、ならびに、植物の病原性細菌および昆虫を制御するためのその使用方法は、米国特許第６，０６０，０５１号、同第６，１０３，２２８号、同第６，２９１，４２６号、同第６，４１７，１６３号および同第６，６３８，９１０号に完全に記載されている。これらの特許においては、この株はＡＱ７１３と呼ばれている。バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、１９９７年５月７日、「特許手続きのための微生物の寄託の国際認識に関するブダペスト条約」の条項の下、受入番号Ｂ２１６６１でＮＲＲＬと共に寄託されている。本明細書においてＱＳＴ７１３と言う場合はすべて、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を指す。
【００１９】
[0026] バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３株は、驚くべきことに、この株を動物の健康の向上に好適なものとすることが見出されている一定の特性を有する。ＱＳＴ７１３の胞子は、低ｐＨで生存可能であり、ＱＳＴ７１３の細胞は４．５程度の低ｐＨで増殖する（促進的な栄養条件が前提）。加えて、それぞれ追って実施例８および４に記載のように、ＱＳＴ７１３は、高い塩条件下で少なくとも１０日間増殖可能であり、動物用飼料のペレット化に必要な高温を生き抜くことができる。ＱＳＴ７１３は、さらに、実施例２に示すように、凝集または大量に増殖し、それにより病原性細菌を駆逐および減少させる能力も有する。何らかの特定の理論により限定されることを望むものではないが、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、抗菌性の代謝産物を産生し、病原菌より多い栄養分および結合空間を使用することにより病原菌と競合し、それにより、腸内の病原性細菌の有効な定着を防止することなどの多面的な作用様式により、動物の健康を向上させると考えられる。
【００２０】
[0027] 本発明の一態様では、動物に投与される組成物は、ＱＳＴ７１３の同定特性をすべて有するバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体を含む。そのような変異体は、ＱＳＴ７１３とのＤＮＡ配列同一性が、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であってもよい。いくつかの実施形態では、変異体は、自然発生的な変異体である。自然発生的な変異体という用語は、変異原を意図的に使用しなくてもＱＳＴ７１３から生じる変異体を指す。そのような自然発生的な変異体は、親が感受性を有する一定の抗生物質の存在下でバチルス・ズブチリス株を増殖させること、および生物活性の改善、またはこの出願においては、追って記載の動物の健康の兆候のうち１つまたは複数を向上させる能力の改善について任意の耐性変異体を試験することなど古典的な方法により得てもよい。自然発生的な変異体を同定する他の方法は、当業者には公知であろう。
【００２１】
[0028] 本出願においてバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体と言う場合はすべて、自然から単離され、ヒトにより、例えば、実験室内または工業条件下で増殖させられる、細菌を指す。
【００２２】
[0029] バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３細胞は、胞子（休眠状態である）として、栄養細胞（増殖中である）として、移行状態の細胞（増殖期から胞子形成期に移行中である）として、またはこうした種類の細胞のすべての組合せとして、本発明の組成物中に存在してもよい。いくつかの実施形態では、この組成物は主に胞子を含む。
【００２３】
[0030] ＱＳＴ７１３の代謝産物またはその変異体としては、イツリン、スルファクチン、プリパスタチンおよびアグラスタチンなどのリポペプチド、ならびに、抗菌性を有する他の化合物が挙げられる。ＱＳＴ７１３のリポペプチド代謝産物は、米国特許第６，２９１，４２６号および同第６，６３８，９１０号に詳細に記載されている。
【００２４】
[0031] 本発明の組成物は、米国特許第６，０６０，０５１号に記載の培地および他の方法を使用することによるなど当技術分野で周知の方法に従い、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体を培養することにより入手できる。従来の大規模な微生物培養法としては、液内発酵、固体発酵または液体表面培養が挙げられる。発酵の終わりに向かって栄養分は枯渇するので、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３細胞は増殖期から胞子形成期へ移行を開始することから、発酵の最終生成物は大部分、胞子、代謝産物および残留発酵培地である。胞子形成は、このバチルス・ズブチリスの自然なライフサイクルの一部であり、通常は、栄養制限に応答して細胞により開始される。発酵は、高濃度のバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３のコロニー形成単位を入手し胞子形成を促進するように構成される。発酵の結果生じる培養培地中の細菌細胞、胞子および代謝産物は、直接使用するか、または遠心分離、接線流濾過、深層濾過および蒸発など従来の工業的方法により濃縮してもよい。いくつかの実施形態では、例えば透析濾過法により、濃縮した発酵ブロスを洗浄して、残留している発酵ブロスおよび代謝産物を除去する。
【００２５】
[0032] 発酵ブロスまたはブロス濃縮物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、トレー乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥または蒸発など従来の乾燥の工程または方法を用いて、担体を加え、または加えずに乾燥させることができる。その結果生じる乾燥製品は、製粉または顆粒化によるなどさらに加工して、特定の粒子サイズまたは物理的な型を達成してもよい。追って記載の担体を、乾燥後に加えてもよい。
【００２６】
[0033] ＱＳＴ７１３の発酵ブロスの無細胞調製物は、抽出、遠心分離および／または発酵ブロスの濾過など、当技術分野で公知の任意の手段により入手できる。当業者には、いわゆる無細胞調製物は、細胞を欠いていてはいけないのではなく、細胞を除去するために用いられる手法（例えば遠心分離の速度）により、ほぼ無細胞または本質的に無細胞であることは理解されよう。その結果得られる無細胞調製物は、乾燥させ、および／または動物へのその投与に役立つ成分と共に調合してもよい。発酵ブロスについて前記の濃縮法および乾燥法は、無細胞調製物にも適用可能である。
【００２７】
[0034] ＱＳＴ７１３の代謝産物は、米国特許第６，０６０，０５１号に記載の方法により得ることができる。用語「代謝産物」は、本明細書中で使用する場合、半純粋および純粋もしくは本質的に純粋な代謝産物、またはバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３から分離されていない代謝産物を指すことがある。ＱＳＴ７１３のリポペプチドおよび他の殺菌性の代謝産物は、６００キロダルトン〜１００ダルトンの間である。したがって、いくつかの実施形態では、無細胞調製物をＱＳＴ７１３の発酵ブロスの遠心分離により作製した後、代謝産物を分子量カットオフに基づき異なる画分（分子量６００ｋＤａ未満、５００ｋＤａ未満、４００ｋＤａ未満など）にグループ分けするサイズ排除濾過により精製してもよい。発酵ブロスの調合について前述した濃縮法および乾燥法は、代謝産物にも適用可能である。
【００２８】
[0035] 本発明の組成物は、担体を含んでいてもよく、これは、細胞、無細胞調製物または代謝産物を含む組成物に加えて、回復、効率もしくは物性を改善し、および／または包装および投与に役立つ不活性な調合原料である。そのような担体は、個々に、または組み合わせて加えてもよい。いくつかの実施形態では、担体は、固化防止剤、酸化防止剤、増量剤および／または保護剤である。有用な担体の例としては、以下が挙げられる：多糖類（デンプン、マルトデキストリン、メチルセルロース、乳清タンパク質などのタンパク質、ペプチド、ゴム）、糖（乳糖、トレハロース、ショ糖）、脂質（レシチン、植物油、鉱油）、塩（塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム）、およびシリケート（クレイ、非晶質シリカ、ヒュームド／沈降シリカ、シリケート塩）。動物用飼料添加物に適した担体は、毎年刊行されているＡｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ，Ｉｎｃ．’ｓ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎに記載されている。例えば、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ、Ｓｈａｒｏｎ Ｋｒｅｂｓ編、２００６年版、ＩＳＢＮ １−８７８３４１−１８−９を参照のこと。いくつかの実施形態では、担体は、発酵ブロスの濃縮後、ならびに乾燥の間および／または後に加える。
【００２９】
[0036] 組成物が飼料添加物として調合される実施形態では、（ｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３もしくはその変異体、（ｉｉ）ＱＳＴ７１３の無細胞調製物もしくはその変異体、（ｉｉｉ）ＱＳＴ７１３の代謝産物もしくはその変異体または（ｉｖ）調合された組成物中の細胞および代謝産物の組合せの重量ベース濃度（ｗ／ｗ）は、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％であってもよい。いくつかの実施形態では、例えば、濃縮調合ブロスが、洗浄され加熱を伴わずに乾燥されている（凍結乾燥によるなど）場合、最終組成物中のバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体の濃度は、約９０％〜約１００％であってもよい。
【００３０】
[0037] 本発明の組成物は、昆虫以外およびヒト以外の動物に投与／給餌して、動物の健康またはそのような動物の一般的な身体状態全体を改善するようにしてもよい。この組成物は、治療的および非治療的用途両方のために投与できる。有効量の組成物は、動物の健康を、この組成物を投与されていないが、それ以外は本発明の組成物を受けている動物が摂取しているものと同じ食餌（飼料および他の化合物を含め）を投与されている動物と比較して向上させるのに有効な量である。健康の向上の兆候には、以下のうち１つまたは複数が含まれる：体重増加の向上（動物の特定部分の重量の増加または体重全体の増加が含まれていてもよい）、腸内微生物叢の維持；飼料利用効率の向上、死亡リスクの低下、耐病性の向上、罹病率の低下、免疫応答の向上、下痢発生の減少、生産性の向上および／または病原菌排出の減少。したがって、前述の内容に従って、本出願の実施形態は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３由来の無細胞調製物もしくはその変異体、またはＱＳＴ７１３の代謝産物もしくはその変異体を含む組成物を動物に投与／給餌することによる、動物の体重の増加、腸内微生物叢の維持または飼料利用効率の向上などの非治療的方法を対象としている。
【００３１】
[0038] 本発明の組成物が家畜に投与／給餌されるいくつかの実施形態では、この組成物は、家畜の成長成績を改善するために投与される。本明細書中で使用する場合、成長成績の改善は、本発明の組成物を投与されていない動物と比較した場合の、成長（体重もしくは体長）および／または飼料利用効率の向上、および／または死亡率の低下／生存率の向上を指す。本発明の一態様では、約１％〜約２０％の間、または約１％〜約１５％の間、または約１％〜約９％の間の体重増加が達成される。本発明の方法は、さらに、動物の飼料利用効率を、本発明の組成物を投与されていない動物と比較して増加させることもできる。飼料効率は、典型的には、体重増加に対する飼料消費の比率である飼料転換率を用いて評価される。この比率の低下が、飼料効率の向上に関連する。飼料効率は、約１％〜１５％の間、約２％〜約１０％の間、および約３％〜約８％の間で改善できる。本発明の方法は、さらに、死亡率を低下させることもできる。約１％〜約２０％の間、または約２％〜１７％の間、または約４％〜約１３％の間、または約５％〜約１０％の間の生存率改善が達成されることもある。成長の増加、飼料効率の改善および死亡率の低下は、動物畜産分野において公知の平均値と個々に比較して、または典型的には、一緒におよび／または類似条件下で飼育されており、そのうち数匹は本発明の組成物を摂取していないほぼ同年齢の家畜群の成長成績データの平均値と比較することにより、個別に定量してもよい。
【００３２】
[0039] 腸内微生物叢の維持は、本発明の方法が適用されていない動物と比較して、公衆衛生上懸念される有害な病因性微生物を（その殺菌または増殖阻害により）減少させ、および／または、ラクトバチルスおよびビフィズス菌などの有益細菌を増加させることを意味する。何らかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、有益細菌の増加は、そのような細菌の増殖を刺激すること、または単純に、病原性細菌を選択的に減少させることにより、増殖し腸壁に結合するためのより多くの空間を有益細菌に与えることにより引き起こされることができると考えられる。本発明の方法により減少させることができる有害な病因性細菌としては、以下が挙げられる：クロストリジウム属種（ペルフリンゲンスおよびディフィシルなど）、リステリア属種（モンサイトゲネス（moncytogenes）、ゼーリゲリおよびウェルシメリなど）、サルモネラ属種（エンテリカ、アリゾネ、ティフィリウム、エンテリティディスおよびボングロリ（bonglori）など）、大腸菌、エンテロコッカス属種（フェカリスおよびフェシウムなど）、カンピロバクター、アエロモナス属種、黄色ブドウ球菌およびビブリオ属種。いくつかの実施形態では、有害な病因性微生物は、約０．５ログ、約１ログ、約２ログ、約３ログ、約４ログまたは約５ログ減少することがある。
【００３３】
[0040] 前述の病原性細菌は、動物において多様な疾患を引き起こす。例えば、家禽においては、クロストリジウム・ペルフリンゲンスで汚染された飼料は、ニワトリにおける壊死性腸炎（または腸管壁内の壊死性病変）の激増に関係していた。興味深いことに、この細菌はニワトリの腸管内で通常見られるが、この細菌は、レベルの増加がこの疾患に関連しているとはいえ、壊死性腸炎を常に引き起こすわけではない。プロバイオティクスの使用によるこの病原菌の減少の結果、下記の実施例に示すように、健康が向上し体重が増加する。したがって、腸内での増殖能力を減少させることによりこれらの細菌を制御すると、そのような細菌により引き起こされる疾患の発生率が低下する。下記の表１には、多様な微生物と、こうした微生物が関連している疾患または状態が示してある。
【００３４】
【表１】
【００３５】
[0041] 健康な腸内微生物叢の維持、および、とりわけ前記の有害細菌のうち１つまたは複数の減少は、さらに、動物の糞便を介した病原菌排出の減少ももたらす。病原菌の量は、動物の糞便中の病原菌排出物の分析または試験中の動物の屠殺およびそうした動物の腸内の（有益および病原性）細菌集団の分析など、当業者に公知のいくつかの方法により定量できる。
【００３６】
[0042] 本発明の方法は、病原性細菌の増殖の阻害および／または有益細菌の増殖の増加または維持により、治療量の抗生物質の投与後の正常な腸内バランスを回復するためにも使用できる。用語「治療量」は、動物の疾患状態を改善または反転させるのに十分な量を指す。
【００３７】
[0043] 本発明の方法により得られる生産性の増加は、以下のいずれかを指す：より多くもしくはより高品質の卵、乳もしくは肉の生産、または離乳する仔の生産増加。
【００３８】
[0044] 本発明の方法は、脊椎動物（哺乳動物および水生動物など）および甲殻類（エビなど）を含めた任意の動物に適用できるが、昆虫およびヒトを除く。本発明の組成物で治療できる哺乳動物としては、以下が挙げられる：家畜；ウマ（競走馬を含む）など、スポーツ、娯楽または作業に使用される動物；イヌ、ネコ、鳥および外来種を含めた、飼い馴らされた家庭用ペット；ならびに動物園の動物。家畜は、消費用に、または食物生産動物として飼育される動物を指す。一実施形態では、この方法は、家禽および猟鳥などの単胃動物に適用される。家禽としては、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、ならびにダチョウおよびエミューなどの走鳥類を挙げることができる。猟鳥としては、ウズラ、チャッカー（chukkar）、キジ、ライチョウ、コーニッシュヘンおよびヤマウズラを挙げることができる。ニワトリは、肉用ニワトリを指し、屠殺用に飼育されているニワトリ（ブロイラーとも呼ばれる）、ならびにヒトの摂取用の卵を生産するために使用される卵用ニワトリを包含する。別の実施形態では、この方法は、ブタなどの哺乳動物に適用してもよい。また別の実施形態では、この方法は、ウシ、ヤギおよびヒツジなどの複胃動物（本明細書においては反芻動物とも呼ぶ）に適用してもよい。一実施形態では、本発明の組成物は、健康を向上させ、とりわけこうした動物における下痢の発生率を低下させるために複胃未発達動物に与えてもよい。複胃未発達動物は、出生時から生後約１２週の年齢の範囲の反芻動物（仔ウシなど）である。本発明の組成物は、代用乳と共に複胃未発達動物に投与してもよい。代用乳は、複胃未発達動物の授乳期中に初乳の代わりにすることを意図した調合飼料を指す。
【００３９】
[0045] 一態様では、本発明の組成物は、給餌に先立ち対象動物の飼料または飲料水に加えられる飼料添加物である。そのような場合、この組成物は、前述のように、炭酸カルシウムまたは乳清タンパク質などの担体と共に調合してもよい。本発明の一態様では、そのような担体は疎水性である。
【００４０】
[0046] 別の態様では、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、その変異体、ＱＳＴ７１３の無細胞調製物およびその変異体、ならびにＱＳＴ７１３の代謝産物およびその変異体を含む組成物は、動物の成長を促進および維持するために必要な動物用飼料原料と組み合わせて調合できる。そのような動物用飼料原料としては、以下のうち１つまたは複数を挙げることができる：タンパク質、炭水化物、脂肪、ビタミン、ミネラル、抗コクシジウム剤、酸ベース製品、および／または抗生物質などの医薬。いくつかの実施形態では、前述のものなどの担体も存在すると考えられる。成長を促進および維持するために必要なタンパク質および炭水化物は、細菌の発酵工程から残存する可能性のある一切の残存性のタンパク質および／または炭水化物と区別するために、飼料タンパク質および飼料炭水化物と呼ぶものとする。
【００４１】
[0047] 別の態様では、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、その変異体、ＱＳＴ７１３の無細胞調製物およびその変異体、ならびにＱＳＴ７１３の代謝産物およびその変異体を含む本発明の組成物は、動物の健康を向上させまたは動物の全身的な身体状態を改善するために動物に与えられる他のプロバイオティクス（バチルスの他の種および株など）をさらに包含してもよい。例示的な株としては、以下が挙げられる：ＫｅｍｉｎからＣＬＯＳＴＡＴ（登録商標）の商品名で販売されているバチルス・ズブチリスＰＢ６（米国特許第７，２４７，２９９号に記載され、ATCC受入番号ＰＴＡ−６７３７として寄託されているもの）、または、カルピスからＣＡＬＳＰＯＲＩＮ（登録商標）として販売されているバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（米国特許第４，９１９，９３６号に記載され、日本の工業技術院発酵研究所、産業技術総合研究所と共にＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６として寄託されているもの）、またはＣｈｒ．ＨａｎｓｅｎからＢＩＯＰＬＵＳ２Ｂ（登録商標）の商品名で販売されている、バチルス・リケニフォルミスとバチルス・ズブチリス胞子との混合物、バチルス・コアギュランス（米国特許第６，８４９，２５６号に記載の当該株を含む）、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンツス、バチルス・プミルス、バチルス・ラテロスポラスおよびバチルス・アレヴィ。バチルス以外の他のプロバイオティクス（サッカロミセス・セレヴィシエなど）も、本発明の組成物中で使用できる。そのような他のプロバイオティクスが本発明の組成物の一部として調合されない場合、プロバイオティクスは、本発明の組成物と共に（同時または異なる時点のいずれでもよい）投与してもよい。
【００４２】
[0048] 別の態様では、本発明の組成物は、以下を包含し、またはこれらと共に投与してもよい（同時または異なる時点のいずれでもよい）：アミラーゼ、グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびペクチナーゼなど、飼料の消化を助ける酵素；抗体、サイトカイン、噴霧乾燥血漿などの免疫調節物質；インターロイキン、インターフェロン；および／または、フルクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イヌリン、オリゴフルクトース強化イヌリン、タガトースおよびポリデキストロースなどのオリゴ糖。
【００４３】
[0049] この組成物がＱＳＴ７１３またはその変異体を含む実施形態では、細菌は、飼料または飲料水に加えて、動物の健康を向上させるのに有効な量で動物に与えるべきである。一実施形態では、細菌は、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０４ＣＦＵ〜飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０１０の包含率で加えることができる。別の実施形態では、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０５ＣＦＵ〜飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０９を投与すべきである。また別の実施形態では、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０５ＣＦＵ〜飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０９を投与すべきである。また別の実施形態では、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０６ＣＦＵ〜飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０８を投与すべきである。いくつかの実施形態では、包含率は、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０３ＣＦＵ、または、飼料１グラムもしくは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０４ＣＦＵもしくは約１×１０５ＣＦＵもしくは約１×１０６ＣＦＵもしくは約１×１０７ＣＦＵもしくは約１×１０８ＣＦＵもしくは約１×１０９ＣＦＵもしくは約１×１０１０ＣＦＵもしくは約１×１０１１ＣＦＵである。ＱＳＴ７１３またはその変異体を含有する組成物が飼料添加物として供給される実施形態では、そのような組成物は、動物用飼料または飲料水に加えられる際、前記の範囲に希釈可能なＣＦＵ数を有するべきである。
【００４４】
[0050] バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体、その無細胞調製物またはその代謝産物を含む組成物は、前述の方法において使用される組成物が動物用飼料ペレットの一部を形成するように、ペレット化工程に先立ち動物用飼料に加えることができる。この態様においては、細菌細胞が組成物中で使用される場合、こうした細胞は、典型的には、ペレット化工程に先立ち動物用飼料の他の成分に胞子フォームで加えられる。乾燥または半含水飼料の押出し加工など、当業者に公知の標準的なペレット化工程を用いてもよい。いくつかの実施形態では、ペレット化工程には、少なくとも約６５℃の温度が含まれる。中でも、ペレット化温度は、約６５℃〜約１２０℃の間である。さらに中でも、ペレット化温度は、約８０℃〜約１００℃の間である。また中でも、ペレット化温度は、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃または約１００℃である。
【００４５】
[0051] 本発明の組成物は、薬学上許容される担体と組み合わせて医薬品として経口投与することもできる。多様な動物にとっての最適な投与レベルは、中でも、この組成物が（ｉ）腸内の病原性細菌を多様な用量で阻害もしくは減少させ、（ｉｉ）有益細菌のレベルを増加もしくは維持し、および／または（ｉｉ）動物の健康を多様な用量で向上させる能力を評価することにより、当業者が容易に決定できる。
【００４６】
[0052] サケ、マス、エビおよび観賞魚などの水生動物の場合、一実施形態では、本発明の組成物は、魚用飼育水（魚用飼料ではなく、または魚用飼料に加えて）に、魚の健康を向上させるのに有効な量で加えてもよい。そのような有効量は、飼育水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１０４〜約１０１０ＣＦＵの間、または別の実施形態では、飼育水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１０５〜約１０９ＣＦＵの間、またはまた別の実施形態では、飼育水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１０６〜約１０８ＣＦＵの間であってもよい。
【００４７】
[0053] 以下の実施例は、本発明の純粋な例証かつ非限定的な目的で記載するものである。
実施例
【実施例１】
【００４８】
[0054] 動物の病原菌に対するＱＳＴ７１３無細胞調製物の有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒおよび最低阻害濃度（ＭＩＣ）法を用いて、クロストリジウム（クロストリジウム・ペルフリンゲンスＡＴＣＣ１３１２４、およびクロストリジウム・ペルフリンゲンスの２つの環境単離物）、リステリア（リステリア・モンサイトゲネスＡＴＣＣ１９１１６および１９１１１、リステリア・ゼーリゲリＡＴＣＣ３５９６８およびリステリア・ウェルシメリＡＴＣＣ３５８９７）、サルモネラ（サルモネラ・エンテリカＡＴＣＣ１０３９８、サルモネラ・アリゾネＡＴＣＣ１３３１４およびサルモネラ・ボンゴリＡＴＣＣ４３９７５）および大腸菌に対する抗微生物活性について、ＱＳＴ７１３の無細胞調製物を試験した。
【００４９】
[0055] 標的病原菌が増殖した培地に対応する培地中でＱＳＴ７１３を増殖させ、下記の表１に示すように、１５分間、３０００ｒｐｍ、２３℃で培養物を遠心分離し、０．４５μｍのＮａｌｇｅｎｅフィルターユニットによりこれを濾過することにより、無細胞調製物を調製した。熱安定性について試験するため、Ｋｉｒｂｙ−ＢａｕｅｒおよびＭＩＣ試験のそれぞれに先立ち、無細胞調製物の一部を１時間かけて５０℃に加熱した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
[0056] Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ実験において、２ｍｍの滅菌済濾紙のディスクを、ＱＳＴ７１３の上澄みに浸漬させ、滅菌済条件下で風乾した。次に、このディスクを標的病原菌の菌叢上に置き、一晩インキュベートし、阻害域を測定した。クロストリジウムおよびリステリアの標的について阻害域を観察した。
【００５２】
[0057] ＭＩＣ法において、ミクロ滴定プレートのウェルに、それぞれの標的病原菌７５ｕｌを播種し、１×１０５に希釈した。前記の無細胞調製物を、各ウェルに最終希釈率１：２、１：１０および１：５０で加えた。プレートを３７℃、ＯＤ６００で一晩インキュベートし、Ｗａｌｌａｃｈマイクロ滴定読取器で読み取った。無細胞調製物（熱処理したものと非熱処理のものとの両方）は、クロストリジウムおよびリステリアの標的に対して顕著に効果的であり、サルモネラおよび大腸菌の増殖を阻害したが、Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒプレート上のこれらの最後の２つの病原菌については、阻害域が観察されなかった。クロストリジウム、リステリアおよびサルモネラのデータを図１〜６に示す。
【実施例２】
【００５３】
[0058] 多様な細菌に対するＱＳＴ７１３の有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の粉末調合物を、以下の細菌の多様な環境単離物に対する有効性について試験した：クロストリジウム・ペルフリンゲンス、大腸菌、サモネラ（Samonella）・エンテリティディス、カンピロバクター・ジェジュニおよびリステリア・モノサイトゲネス。「発明を実施するための形態」において前述したように、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を発酵させ、発酵ブロスを濃縮し乾燥させることにより、この粉末調合物を調製した。この調合物は、１４．６％の濃縮乾燥ブロスおよび８５．４％の不活性調合物（前述の候補から選択）を有し、１グラム当たりバチルス・ズブチリス最低およそ７．３×１０９ＣＦＵ、および１グラム当たりバチルス・ズブチリス最高およそ１×１０１０ＣＦＵを含有していた。この調合物を、本明細書においては組成物１と呼ぶものとする。溶液が１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリスおよそ１×１０９ＣＦＵを含有するように、調合粉末０．２グラムを滅菌済蒸留水１．８ｍｌに加えることにより、組成物１のストック溶液を調製した。５％ヒツジ血液を加えたトリプチカーゼ大豆寒天に試験生物を画線し、寒天プレートを二分する単一の線の中で単一の寒天プレートそれぞれに最大４つの生物を画線した。この生物を一晩乾燥させた。次に、播種したプレートに、前述の調合済ＱＳＴ７１３の懸濁液を画線し、これを試験生物に垂直に塗布した。クロストリジウム・ペルフリンゲンスおよびカンピロバクター・ジェジュニの単離物をＣａｍｐｙガス雰囲気（１０％ＣＯ２、５％Ｏ２、８％Ｎ２）中で４１±２℃にて一晩インキュベートした。他の単離物（これらは好気性である）を３６±２で一晩、Ｃａｍｐｙガスの不在下でインキュベートした。ＱＳＴ７１３は、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、サルモネラ・エンテリティディス、カンピロバクター・ジェジュニおよびリステリア・モノサイトゲネスの単離物のいくつかを阻害したが、大腸菌は阻害しなかった。加えて、いくつかのケースでは、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、病原性細菌の攻撃的な競合的過剰増殖を示した。結果を下記の表にまとめる。表において報告した阻害域を、バチルス増殖体の端から試験生物の増殖体の開始部分までを測定した。加えて、クロストリジウム・ペルフリンゲンスおよびカンピロバクター・ジェジュニのプレートの写真を、図７および８にそれぞれ示す。
【００５４】
【表３】
【実施例３】
【００５５】
[0059] ブロイラーにおけるＱＳＴ７１３のｉｎ ｖｉｖｏ試験
組成物１をブロイラー鶏の幼動物用および仕上げ用飼料に加え、体重増加および飼料効率を観察した。２５２羽のＪｕｍｂｏ Ｃｏｒｎｉｓｈ Ｃｒｏｓｓブロイラーの雛をランダムに４群に分け、下記に列挙する食餌の１つを与えた。
・基礎食のみ：対照
・基礎食＋０．０５％ＣＡＬＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（０．５ｇ／ｋｇ、１０６ＣＦＵ／ｇ）（追って記載の表ではＣＳと表記）
・基礎食＋０．０５％組成物１（０．５ｇ／ｋｇ、１０６ＣＦＵ／ｇ）（追って記載の表では組成物１−１０６と表記）
・基礎食＋０．０００５％組成物１（０．５ｍｇ／ｋｇ、１０３ＣＦＵ／ｇ）（追って記載の表では組成物１−１０３と表記）
以下の幼動物用飼料から成る基礎食を１〜２２日目の間、以下の仕上げ飼料を２２〜４２日目の間。
【００５６】
【表４】
【００５７】
[0060] 下記の表５の結果から、組成物１は、１０６ＣＦＵ／ｇレベルで鳥の体重増加を改善したことが示される。飼料効率は２１〜４２日目の期間にわたり、また成長期間全体（１〜４２日目）にわたり、改善した。下記のチャートにおいては、ＡＤＧは１日の体重増加平均を指し、ＡＤＦＩは１日の飼料摂取量平均を指す。
【００５８】
【表５】
【実施例４】
【００５９】
[0061] 飼料のペレット化工程におけるＱＳＴ７１３の安定性
動物用飼料のペレット化工程中のバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の安定性を定量するため、組成物１を含有する動物用飼料ペレットを調製し、多様な温度で試料を試験した。対照飼料は、表６に示す原料を含有し、実験用飼料には８％組成物１を添加した。
【００６０】
【表６】
【００６１】
[0062] 原料をＦｏｂｅｒｇミキサー中で周囲温度にて混合してから多様な標的温度に加熱し、これらの温度でこの混合物を約３０秒間維持してから、５／３２”×１ １／４”のペレット用金型を通して約２０００ポンド／時間でペレット化した。ミキサー全体の異なる１０箇所から１０試料を採取した。標的温度の６５℃、７５℃、８０℃および８５℃で、同じ７５０ポンドのバッチ内でペレット試料を採取した。
【００６２】
[0063] ミキサーの試料を希釈し、５分間置いて完全にぬらした。ＱＳＴ７１３細胞を回復させるため、ペレット試料を３０分間リン酸緩衝液に浸した。希釈試料を平板培養し、コロニー形成単位を定量した。コロニー形成単位は、下記の表７に示すように、ミキサーからペレット化段階に向けわずかに減少した。
【００６３】
【表７】
【実施例５】
【００６４】
[0064] ブタにおけるＱＳＴ７１３のｉｎ ｖｉｖｏ試験
飼料ペレットフォームでのＱＳＴ７１３を用いた試行を、養豚場における７５０匹のブタを用いて実行した。標準的な工程により、ペレット化に先立ち組成物１を飼料に加えた。標準的なペレット化工程の前後のＱＳＴ７１３のＣＦＵの試験は、前述の実施例４において得られた結果と一致し、ＱＳＴ７１３のＣＦＵは、ペレット化後、劇的に減少しないことが示された。
【００６５】
[0065] ブタ１匹当たりのおよその開始時体重は１０ポンドであり、ブタが成長する目標はおよそ４０ポンドであった。一切の抗生物質またはバチルスが含まれない標準的な食餌から成る対照処置食がおよそ２５０匹のブタに与えられた。別の２５０匹のブタは、標準的な食餌に加え、飼料１ｇ当たり１×１０６ＣＦＵのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を摂取した。３番目の群の２５０匹のブタには、飼料１グラム当たり１×１０７ＣＦＵのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３が与えられた。３番目の群において処分されたブタの数は、対照群と比較して顕著に減少した。処分の実行には、不健康またはサイズが不十分なブタには、治療的製品が与えられるようには給餌しないことまたは安楽死させることが含まれる。
【実施例６】
【００６６】
[0066] 家禽におけるＱＳＴ７１３のｉｎ ｖｉｖｏ試験
飼料添加物として組成物１を用いた試行を、敷料床鶏舎１つ当たり５０羽のブロイラー鶏、１処置当たり鶏舎６つを用いて実施した。家禽用の標準的な飼料（他のプロバイオティクスまたは抗生物質を含有しない）に、飼料１トン当たり組成物１が９１グラム（およそ６．６４×１０１１ＣＦＵ／トン）の比率で組成物１を加えた。対照群の１つおよび組成物１を添加した飼料を投与された鳥の群に、試験の１９日目、２０日目および２１日目にクロストリジウム・ペルフリンゲンスを接種した。試験期間を通して体重を記録し、これを下記の表８に示す。飼料効率を定量し、下記の表９に飼料転換率として報告した。飼料転換率は、死亡し取り除かれた鳥の体重で調節した。試験の２２日目、各鶏舎から５羽の鳥を選別し、屠殺し、計量し、壊死性腸炎（ＮＥ）病変の存在程度について調べた。ＮＥの評価付けは、０〜３の評価尺度（０は正常、３は最も重症）に基づくものであった。表８および９においては、異なる上付き文字を有するカラム内の平均値には有意差がある（Ｐ＜．０５）。ＳＥＭは、ＬＳＭＥＡＮＳの標準誤差である。
【００６７】
【表８】
【００６８】
【表９】
【実施例７】
【００６９】
[0067] 多様な試験についての組成物２の使用
バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の第２の調合物を用いて、成長成績の改善を試験するために試行を実施する。この粉末調合物は、この組成物が、細胞（主に胞子および数種の栄養細胞）から本質的に構成されるように、発酵させ、発酵ブロスを濃縮し、これを乾燥させ透析濾過工程により洗浄して、残存する発酵培地および代謝産物を除去することにより調製される（すべて前述のとおり）。この組成物は、１４．６％の濃縮乾燥洗浄した培養物および８５．４％の不活性調合物（「発明を実施するための形態」において前述した候補から選択）および１グラム当たり約１．０×１０１０ＣＦＵのバチルス・ズブチリスを含有し、本明細書においてはこれを組成物２と呼ぶものとする。実施例３〜６に記載の試行における組成物１を組成物２に置き換え、結果は、組成物１で達成されたものと同じであることが期待される。
【実施例８】
【００７０】
[0068] 海水中でのＱＳＴ７１３胞子の生存率
組成物１を試験して、海水およびＮａＣｌ中での生存率を定量した。人工的な海水を、１０ｐｐｔ、３０ｐｐｔ、５０ｐｐｔの３種類の濃度で、１つの濃度当たり２５ｍｌの試験管４本調製した。３種類の濃度のＮａＣｌ（１％、３％および５％）を加えて、栄養ブロスを、１つの濃度当たり２５ｍｌの試験管４本調製した。播種に先立ちオートクレーブすることにより、海水および栄養ブロスを両方とも滅菌した。組成物１の懸濁液０．５ｇをＤＩ水１０ｍｌに溶解することにより作製した。この懸濁液のアリコット（０．５ｍｌ）を、３種類の濃度の海水およびブロスのそれぞれの中に播種した。試験管には１０７ｃｆｕ／ｍｌ超（ｃｆｕ＝コロニー形成単位）が入っていると推定された。１％栄養ブロスおよび１％ＮａＣｌの希釈ボトルを調製し（１ボトル当たり９９ｍｌ）、オートクレーブすることにより滅菌した。製造者の使用説明書により栄養寒天を調製した；プレート計数試験用に１５×１００ｍｍのプレート（１試験当たり１つのプレートプラス播種していない対照）を調製した。
【００７１】
[0069] ２８℃、震盪インキュベーター中で、１２５ｒｐｍを用いて１４日間、試験管をインキュベートした。継代培養用の試料を０日目、２日目、１０日目に採取した。０日目にすべての試験管を試験し、２日目および１０日目には、最高濃度の海水およびＮａＣｌの２つのみを試験した。プレート計数は、０日目に元の試験管１０μl（＝１０−２希釈まで）、２日目および１０日目には１％栄養ブロス／１％ＮａＣｌ中で調製された１０−２および１０−４の希釈物１００μｌを平板培養することにより得た。こうして得られた数は、実際には１０−３および１０−５レベルであった。プレートを２８℃でインキュベートした。コロニーを２４時間および４８時間時点で観察した。
【００７２】
[0070] Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ２０Ｄ＋装置、キュベットとしての１２×７５のフラクションコレクター用ポリスチレン試験管、および各試料の吸光度を測定することによる６６０波長を用いて、濁度測定値を得た。試験試料は、各試験管からの１：１０希釈物を調製することにより０日目に作製した（１％生理食塩水４．５ｍｌ中０．５ｍｌ、２日目および１０日目には１０−２および１０−４希釈物の２４時間継代培養物５ｍｌを試験することにより）。加えて、濁度測定値は、２日目の希釈物の８日目のインキュベーション時に得た。
【００７３】
[0071] プレート培養物および濁度測定値の両方から、胞子は存続しており、少なくとも１０日間は数がほとんどまたは全く減少しなかったことが示された。
【００７４】
[0072] 培養プレートを２４時間および４８時間時点で読み取った。２４時間時点では、１０−３プレートは細菌が増殖してすべてコンフルエントな状態であった。１０−５プレートの方が少なかったが、それでも１プレート当たり約１０００コロニーを有した。４８時間までには、すべてのプレートは非常にコンフルエントな増殖、したがって、元の試験管中では１ｍｌ当たり１０８ｃｆｕ超を有した。この数は、０日目、２日目および１０日目時点で維持された。さまざまな範囲の濃度の海水またはＮａＣｌで増殖させた培養物においては、差は観察されなかった。組成物１の培養物は、試験したすべての範囲において良好に増殖した。播種していない海水またはＮａＣｌ添加栄養ブロス中では、どの時点でも増殖しなかった。
【００７５】
[0073] 濁度試験（吸光度測定値）でも同様の結果が得られたが、読取りはより困難であった。元の試験管は直接読み取ることができず、その理由は、そうした試験管は、特に最高濃度の海水で濁りすぎていたからである。１：１０希釈物を使用して、０日目の測定値を得た。２日目および１０日目の測定値は、培養プレートを播種するために用いた希釈物上のもので、希釈ボトルから得ることができた。２日目および１０日目の推定数は１ｍｌ当たり１０８を超えたことから、生理食塩水の濃度による増殖への悪影響は、あったとしてもごくわずかであった。
【００７６】
[0074] 組成物１を、３種類の濃度の人工海水（１０ｐｐｔ、３０ｐｐｔおよび５０ｐｐｔ）、ならびに、栄養ブロス中の３種類の濃度のＮａＣｌ（１％、３％および５％）における存続について試験した。プロバイオティクスは、すべての濃度において増殖し、少なくとも１０日間は、１ｍｌ当たり１０８を超える多数で生存可能であった。海水中またはブロス中の塩の濃度は、胞子が発芽および増殖する能力に影響しなかった。
【実施例９】
【００７７】
[0075] マスにおけるＱＳＴ７１３のｉｎ ｖｉｖｏ試験
約１４グラムのニジマスを、それぞれ魚２０尾ずつの２群に分ける。対照群には標準的な魚用飼料を与え、処置群には、魚用飼料と、飼料１グラム当たり１×１０６ＣＦＵのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を投与する。処置群は、対照群と比較して体重の増加を示すことが期待される。
【実施例１０】
【００７８】
[0076] エビにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験
ペナエダエ（Ｐｅｎａｅｄａｅ）科およびテナガエビ科のエビおよび中エビの公知の病原菌に対するＱＳＴ７１３の阻害作用を定量するために、養殖エビから単離される３つの病原性細菌：腸炎ビブリオ菌、Ｖ．アルギノリティカスおよびＶ．ブルニイフィカス、ならびにエビ由来の病原性真菌フザリウム・ソラニに対して組成物１および２を試験する。調合粉末０．２グラムを滅菌済蒸留水１．８ｍｌに加えることにより、各溶液が、１ｍｌ当たり約１×１０９ＣＦＵのバチルス・ズブチリスを含有するように、組成物１および組成物２のストック溶液を調製する。
【００７９】
[0077] サブローデキストロース寒天上で増殖させたフザリウム・ソラニの５日培養物に由来する分生胞子（condiospores）を、滅菌済２％ＮａＣｌ中に収集する。ビブリオは３７℃のＬｕｒｉａブロス培地上で増殖させる。海洋細菌の亜系は、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天またはマリンブロス２２１６の培地上で３０℃にて濃縮してから、１〜３％ＮａＣｌを添加したトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）中で３０℃にて培養する。腸炎ビブリオ株は、チオ硫酸塩・クエン酸塩・胆汁塩寒天上で４２℃にて選択的に増殖させてから、３％ＮａＣｌを添加したＴＳＢ上で３０℃にて培養する。
【００８０】
[0078] 試験生物、ビブリオおよびフザリウムを、それぞれ、寒天プレートを二分する単一の線の中で、単一の支持寒天プレートに画線する。この生物を一晩乾燥させる。次に、播種されたプレート２セットに、前述の組成物１の懸濁液または組成物２の懸濁液のいずれかを画線し、これを試験生物に垂直に塗布する。画線プレートを３６℃±２で一晩インキュベートする。ＱＳＴ７１３は、病原性のビブリオおよびフザリウムの単離物のいくつかを阻害すると期待される。加えて、いくつかのケースでは、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、病原性細菌の攻撃的な競合的過剰増殖を示すことが期待される。
【００８１】
[0079] 別に定義しない限り、本明細書におけるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実行または試験においては、本明細書に記載のものと同様または等価の任意の方法および材料を使用できるが、本明細書には好ましい方法および材料を記載してある。引用するすべての刊行物、特許および特許公報は、あらゆる目的について参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８２】
[0080] 本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日に先立ち、それらを開示するためにのみ記載するものである。本明細書に記載の一切は、先行発明があるという理由で本発明がそうした刊行物より以前のものであるとの権利を与えられていないと認めるものと解釈されるべきではない。
【００８３】
[0081] 本発明をその具体的な実施形態と関連づけて説明してきたが、さらなる改変形が可能であること、ならびに本出願は、一般には、本発明の原理に従う本発明の一切の変形、使用または適応を網羅することを意図しており、これには、本発明が関係する当技術分野内の公知のまたは慣例的な実行の範囲内で生じるような、また本明細書で前述した本質的なフィーチャに適用できるような、また添付の特許請求の範囲内で後に続くような、本開示からの逸脱が含まれることは理解されよう。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）により、２００８年９月１７日出願の米国特許仮出願第６１／１９２，４３６号の優先権を主張するものである。前記の出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[0002] 本発明は、プロバイオティクス、および動物の健康または動物の全身的な身体状態を向上させるその能力の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003] バチルス属は、多数の内生胞子形成細菌を含み、中でも、農業および動物の栄養の分野において種々の用途がある。数種のバチルス株は、抗生物質に代わるものとして、動物用飼料中のプロバイオティクスとしての用途で現在流通している。こうしたプロバイオティクスは、胃腸の細菌叢を調節することによる動物の成長および飼料効率の改善を含め、動物の健康を向上させる。ヒトが消費するための動物製品中の残留抗生物質、および抗生物質への耐性の出現に対する懸念から、そのようなプロバイオティクスの使用は増加している。近年、プロバイオティクスとして使用するための胞子形成細菌をスクリーニングするための研究が行われている。多様な市販製品にはバチルス・ズブチリス株、バチルス・リケニフォルミス株およびバチルス・コアギュランス株が含有されているが、すべてのバチルス株が有効な飼料添加物であるわけではないことが、そうしたスクリーニングにより明らかになっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004] 本発明は、動物に投与されると当該動物の健康を向上させるバチルス・ズブチリス株を提供する。具体的には、本発明は、昆虫以外およびヒト以外の動物の健康を向上させ、または、当該動物の全身的な身体状態を改善するための方法であって、飼料または飲料水（経口強制栄養によらず）の中に（ｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、（ｉｉ）（ｉ）の変異体、（ｉ）もしくは（ｉｉ）の無細胞調製物、または（ｉ）もしくは（ｉｉ）の代謝産物を含む組成物を当該動物に与えることによる方法に関する。一実施形態では、本発明の組成物は、バチルス・ズブチリス７１３またはその変異体、および細菌により産生される代謝産物を含む。別の実施形態では、この組成物は、主に胞子フォームのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を含む。
【０００５】
[0005] 本発明のいくつかの実施形態では、この組成物は、動物の生涯にわたり、または動物の生涯の特定の段階もしくは部分の間、複数日にわたり飼料に入れて動物に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、この組成物は、家畜の幼動物用飼料のみに加えて、または仕上げ飼料のみに加えて投与される。
【０００６】
[0006] 本発明の方法は、動物の体重増加を向上させ、飼料利用効率を高め、罹病率を低下させ、耐病性を高め、生存率を高め、動物の免疫応答を高め、および健康な腸内微生物叢を維持するために使用できる。一実施形態では、本発明の方法は、治療目的での１クールの抗生物質の投与後、腸内微生物叢の健康なバランスの回復を補助するために使用される。
【０００７】
[0007] 一実施形態では、本発明の組成物は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体を含み、飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０３ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０４ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０５ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０６ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０７ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０８ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０９ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０１０ＣＦＵ、または飼料１ｇもしくは飲料水１ｍｌ当たり約１×１０１１ＣＦＵの比率で動物に投与される。
【０００８】
[0008] 別の実施形態では、本発明の組成物は、動物の腸内の病原性細菌の増殖を低下させるのに有効な量で動物に投与または給餌される。そのような病原性細菌としては、クロストリジウム、リステリア、サルモネラ、カンピロバクター、大腸菌およびビブリオが挙げられる。関連して、本発明の方法は、動物の糞便中の病原性細菌排出物の量を減少させるために使用できる。本発明の方法は、乳酸菌など、動物の腸内の有益細菌の増殖を維持または増加させるためにも使用できる。病原性細菌を減少させ、および／または有益細菌を増加もしくは維持することにより、本発明の組成物は、健康な腸内微生物叢全体を維持することが可能である。
【０００９】
[0009] 本発明の方法は、ヒト以外および昆虫以外のすべての動物に使用できる。本発明の方法が有効と考えられる動物としては、鳥類、ブタ、反芻動物、ペットおよび外来種動物、動物園の動物、水生動物、中でもウマが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、動物は、ブロイラーおよび卵用ニワトリなど、消費用または食物生産動物として飼育される家畜である。
【００１０】
[0010] 本発明は、動物の健康を向上させまたは動物の身体状態を改善するように構成される組成物も提供する。したがって、本発明の組成物は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体、その無細胞調製物またはその代謝産物、およびこれらの組成物を飼料添加物または飲料水用添加物として動物に与えるのに適したものとする担体を含むことができる。あるいは、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体、その無細胞調製物またはその代謝産物は、飼料タンパク質および／または飼料炭水化物などの動物用飼料原料と共に調合してもよい。そのような組合せは、標準的なペレット化工程により押し出されるペレットのフォームであってもよい。
【００１１】
[0011] 本発明の組成物は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体、ＱＳＴ７１３の無細胞調製物またはその変異体、ならびにＱＳＴ７１３の代謝産物およびその変異体と、他のプロバイオティクスおよび／またはプレバイオティクスとの組合せも含む。
【００１２】
[0012] 本発明は、ペレット化工程に先立ち、動物に与えると動物の健康を向上させるのに有効な量で、炭水化物およびタンパク質などの標準的な飼料成分にバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３胞子を加えることを含む、直接投与型微生物を含有する動物用飼料を調製する方法も包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[0013]クロストリジウムの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図２】[0014]クロストリジウムの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理した無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図３】[0015]リステリアの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図４】[0016]リステリアの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理した無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図５】[0017]サルモネラの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図６】[0018]サルモネラの多様な単離物に対する有効性についてのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の熱処理した無細胞調製物の試験結果を示すグラフである。
【図７】[0019]病原菌に対するＱＳＴ７１３の有効性を試験するためにバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３（縦）およびクロストリジウム・ペルフリンゲンスの多様な単離物（横）を交叉画線した寒天プレートを示す写真である。
【図８】[0020]病原菌に対するＱＳＴ７１３の有効性を試験するためにバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３（縦）およびカンピロバクター・ジェジュニの多様な単離物（横）を交叉画線した寒天プレートを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[0021] 本明細書におけるすべての刊行物、特許および特許出願（一切の図面および補遺を含む）は、各個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれると具体的かつ個々に示された場合と同程度に、参照により組み込まれる。
【００１５】
[0022] 以下の説明には、本発明の理解に有用と考えられる情報が含まれる。本明細書に記載の情報の任意のものが本出願で特許請求される発明の先行技術もしくは関連するものであることも、具体的もしくは間接的に参照される任意の刊行物が先行技術であることも認めるものではない。
【００１６】
[0023] 本発明は、バチルス・ズブチリス株ＱＳＴ７１３および／または、プロバイオティクスとして動物の健康を向上させるのに有効なその代謝産物の新規の使用に関する。プロバイオティクスは、有害細菌（クロストリジウムおよびカンピロバクターなど）の減少および有益細菌（ラクトバチルス属種およびビフィズス属菌など）の増加を含め、健康な腸内微生物叢を維持するために動物の健康用途において使用される。プロバイオティクスは病原性細菌と有益細菌との間の健康なバランスを維持するために好適であるが、その理由は、プロバイオティクスは、抗生物質とは異なり、細菌を無差別に破壊もしなければ、病原性細菌の抗生物質耐性株となることもないからである。プロバイオティクスが健康な腸内微生物叢を維持すると考えられる多くの機序がある：病原性細菌の競合排除、抗微生物物質の産生による病原性細菌の減少、有益な腸内微生物叢の増殖および生存率の向上、ならびに動物の全身性免疫応答の刺激。
【００１７】
[0024] 本発明は、（ｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、（ｉｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の無細胞調製物、または（ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の代謝産物を含む組成物を動物に投与することにより、動物の健康を向上させる方法を包含する。
【００１８】
[0025] バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、その変異体、その上澄みおよびそのリポペプチド代謝産物、ならびに、植物の病原性細菌および昆虫を制御するためのその使用方法は、米国特許第６，０６０，０５１号、同第６，１０３，２２８号、同第６，２９１，４２６号、同第６，４１７，１６３号および同第６，６３８，９１０号に完全に記載されている。これらの特許においては、この株はＡＱ７１３と呼ばれている。バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、１９９７年５月７日、「特許手続きのための微生物の寄託の国際認識に関するブダペスト条約」の条項の下、受入番号Ｂ２１６６１でＮＲＲＬと共に寄託されている。本明細書においてＱＳＴ７１３と言う場合はすべて、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を指す。
【００１９】
[0026] バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３株は、驚くべきことに、この株を動物の健康の向上に好適なものとすることが見出されている一定の特性を有する。ＱＳＴ７１３の胞子は、低ｐＨで生存可能であり、ＱＳＴ７１３の細胞は４．５程度の低ｐＨで増殖する（促進的な栄養条件が前提）。加えて、それぞれ追って実施例８および４に記載のように、ＱＳＴ７１３は、高い塩条件下で少なくとも１０日間増殖可能であり、動物用飼料のペレット化に必要な高温を生き抜くことができる。ＱＳＴ７１３は、さらに、実施例２に示すように、凝集または大量に増殖し、それにより病原性細菌を駆逐および減少させる能力も有する。何らかの特定の理論により限定されることを望むものではないが、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、抗菌性の代謝産物を産生し、病原菌より多い栄養分および結合空間を使用することにより病原菌と競合し、それにより、腸内の病原性細菌の有効な定着を防止することなどの多面的な作用様式により、動物の健康を向上させると考えられる。
【００２０】
[0027] 本発明の一態様では、動物に投与される組成物は、ＱＳＴ７１３の同定特性をすべて有するバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体を含む。そのような変異体は、ＱＳＴ７１３とのＤＮＡ配列同一性が、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であってもよい。いくつかの実施形態では、変異体は、自然発生的な変異体である。自然発生的な変異体という用語は、変異原を意図的に使用しなくてもＱＳＴ７１３から生じる変異体を指す。そのような自然発生的な変異体は、親が感受性を有する一定の抗生物質の存在下でバチルス・ズブチリス株を増殖させること、および生物活性の改善、またはこの出願においては、追って記載の動物の健康の兆候のうち１つまたは複数を向上させる能力の改善について任意の耐性変異体を試験することなど古典的な方法により得てもよい。自然発生的な変異体を同定する他の方法は、当業者には公知であろう。
【００２１】
[0028] 本出願においてバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体と言う場合はすべて、自然から単離され、ヒトにより、例えば、実験室内または工業条件下で増殖させられる、細菌を指す。
【００２２】
[0029] バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３細胞は、胞子（休眠状態である）として、栄養細胞（増殖中である）として、移行状態の細胞（増殖期から胞子形成期に移行中である）として、またはこうした種類の細胞のすべての組合せとして、本発明の組成物中に存在してもよい。いくつかの実施形態では、この組成物は主に胞子を含む。
【００２３】
[0030] ＱＳＴ７１３の代謝産物またはその変異体としては、イツリン、スルファクチン、プリパスタチンおよびアグラスタチンなどのリポペプチド、ならびに、抗菌性を有する他の化合物が挙げられる。ＱＳＴ７１３のリポペプチド代謝産物は、米国特許第６，２９１，４２６号および同第６，６３８，９１０号に詳細に記載されている。
【００２４】
[0031] 本発明の組成物は、米国特許第６，０６０，０５１号に記載の培地および他の方法を使用することによるなど当技術分野で周知の方法に従い、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体を培養することにより入手できる。従来の大規模な微生物培養法としては、液内発酵、固体発酵または液体表面培養が挙げられる。発酵の終わりに向かって栄養分は枯渇するので、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３細胞は増殖期から胞子形成期へ移行を開始することから、発酵の最終生成物は大部分、胞子、代謝産物および残留発酵培地である。胞子形成は、このバチルス・ズブチリスの自然なライフサイクルの一部であり、通常は、栄養制限に応答して細胞により開始される。発酵は、高濃度のバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３のコロニー形成単位を入手し胞子形成を促進するように構成される。発酵の結果生じる培養培地中の細菌細胞、胞子および代謝産物は、直接使用するか、または遠心分離、接線流濾過、深層濾過および蒸発など従来の工業的方法により濃縮してもよい。いくつかの実施形態では、例えば透析濾過法により、濃縮した発酵ブロスを洗浄して、残留している発酵ブロスおよび代謝産物を除去する。
【００２５】
[0032] 発酵ブロスまたはブロス濃縮物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、トレー乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥または蒸発など従来の乾燥の工程または方法を用いて、担体を加え、または加えずに乾燥させることができる。その結果生じる乾燥製品は、製粉または顆粒化によるなどさらに加工して、特定の粒子サイズまたは物理的な型を達成してもよい。追って記載の担体を、乾燥後に加えてもよい。
【００２６】
[0033] ＱＳＴ７１３の発酵ブロスの無細胞調製物は、抽出、遠心分離および／または発酵ブロスの濾過など、当技術分野で公知の任意の手段により入手できる。当業者には、いわゆる無細胞調製物は、細胞を欠いていてはいけないのではなく、細胞を除去するために用いられる手法（例えば遠心分離の速度）により、ほぼ無細胞または本質的に無細胞であることは理解されよう。その結果得られる無細胞調製物は、乾燥させ、および／または動物へのその投与に役立つ成分と共に調合してもよい。発酵ブロスについて前記の濃縮法および乾燥法は、無細胞調製物にも適用可能である。
【００２７】
[0034] ＱＳＴ７１３の代謝産物は、米国特許第６，０６０，０５１号に記載の方法により得ることができる。用語「代謝産物」は、本明細書中で使用する場合、半純粋および純粋もしくは本質的に純粋な代謝産物、またはバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３から分離されていない代謝産物を指すことがある。ＱＳＴ７１３のリポペプチドおよび他の殺菌性の代謝産物は、６００キロダルトン〜１００ダルトンの間である。したがって、いくつかの実施形態では、無細胞調製物をＱＳＴ７１３の発酵ブロスの遠心分離により作製した後、代謝産物を分子量カットオフに基づき異なる画分（分子量６００ｋＤａ未満、５００ｋＤａ未満、４００ｋＤａ未満など）にグループ分けするサイズ排除濾過により精製してもよい。発酵ブロスの調合について前述した濃縮法および乾燥法は、代謝産物にも適用可能である。
【００２８】
[0035] 本発明の組成物は、担体を含んでいてもよく、これは、細胞、無細胞調製物または代謝産物を含む組成物に加えて、回復、効率もしくは物性を改善し、および／または包装および投与に役立つ不活性な調合原料である。そのような担体は、個々に、または組み合わせて加えてもよい。いくつかの実施形態では、担体は、固化防止剤、酸化防止剤、増量剤および／または保護剤である。有用な担体の例としては、以下が挙げられる：多糖類（デンプン、マルトデキストリン、メチルセルロース、乳清タンパク質などのタンパク質、ペプチド、ゴム）、糖（乳糖、トレハロース、ショ糖）、脂質（レシチン、植物油、鉱油）、塩（塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム）、およびシリケート（クレイ、非晶質シリカ、ヒュームド／沈降シリカ、シリケート塩）。動物用飼料添加物に適した担体は、毎年刊行されているＡｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ，Ｉｎｃ．’ｓ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎに記載されている。例えば、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ、Ｓｈａｒｏｎ Ｋｒｅｂｓ編、２００６年版、ＩＳＢＮ １−８７８３４１−１８−９を参照のこと。いくつかの実施形態では、担体は、発酵ブロスの濃縮後、ならびに乾燥の間および／または後に加える。
【００２９】
[0036] 組成物が飼料添加物として調合される実施形態では、（ｉ）バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３もしくはその変異体、（ｉｉ）ＱＳＴ７１３の無細胞調製物もしくはその変異体、（ｉｉｉ）ＱＳＴ７１３の代謝産物もしくはその変異体または（ｉｖ）調合された組成物中の細胞および代謝産物の組合せの重量ベース濃度（ｗ／ｗ）は、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％であってもよい。いくつかの実施形態では、例えば、濃縮調合ブロスが、洗浄され加熱を伴わずに乾燥されている（凍結乾燥によるなど）場合、最終組成物中のバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体の濃度は、約９０％〜約１００％であってもよい。
【００３０】
[0037] 本発明の組成物は、昆虫以外およびヒト以外の動物に投与／給餌して、動物の健康またはそのような動物の一般的な身体状態全体を改善するようにしてもよい。この組成物は、治療的および非治療的用途両方のために投与できる。有効量の組成物は、動物の健康を、この組成物を投与されていないが、それ以外は本発明の組成物を受けている動物が摂取しているものと同じ食餌（飼料および他の化合物を含め）を投与されている動物と比較して向上させるのに有効な量である。健康の向上の兆候には、以下のうち１つまたは複数が含まれる：体重増加の向上（動物の特定部分の重量の増加または体重全体の増加が含まれていてもよい）、腸内微生物叢の維持；飼料利用効率の向上、死亡リスクの低下、耐病性の向上、罹病率の低下、免疫応答の向上、下痢発生の減少、生産性の向上および／または病原菌排出の減少。したがって、前述の内容に従って、本出願の実施形態は、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３由来の無細胞調製物もしくはその変異体、またはＱＳＴ７１３の代謝産物もしくはその変異体を含む組成物を動物に投与／給餌することによる、動物の体重の増加、腸内微生物叢の維持または飼料利用効率の向上などの非治療的方法を対象としている。
【００３１】
[0038] 本発明の組成物が家畜に投与／給餌されるいくつかの実施形態では、この組成物は、家畜の成長成績を改善するために投与される。本明細書中で使用する場合、成長成績の改善は、本発明の組成物を投与されていない動物と比較した場合の、成長（体重もしくは体長）および／または飼料利用効率の向上、および／または死亡率の低下／生存率の向上を指す。本発明の一態様では、約１％〜約２０％の間、または約１％〜約１５％の間、または約１％〜約９％の間の体重増加が達成される。本発明の方法は、さらに、動物の飼料利用効率を、本発明の組成物を投与されていない動物と比較して増加させることもできる。飼料効率は、典型的には、体重増加に対する飼料消費の比率である飼料転換率を用いて評価される。この比率の低下が、飼料効率の向上に関連する。飼料効率は、約１％〜１５％の間、約２％〜約１０％の間、および約３％〜約８％の間で改善できる。本発明の方法は、さらに、死亡率を低下させることもできる。約１％〜約２０％の間、または約２％〜１７％の間、または約４％〜約１３％の間、または約５％〜約１０％の間の生存率改善が達成されることもある。成長の増加、飼料効率の改善および死亡率の低下は、動物畜産分野において公知の平均値と個々に比較して、または典型的には、一緒におよび／または類似条件下で飼育されており、そのうち数匹は本発明の組成物を摂取していないほぼ同年齢の家畜群の成長成績データの平均値と比較することにより、個別に定量してもよい。
【００３２】
[0039] 腸内微生物叢の維持は、本発明の方法が適用されていない動物と比較して、公衆衛生上懸念される有害な病因性微生物を（その殺菌または増殖阻害により）減少させ、および／または、ラクトバチルスおよびビフィズス菌などの有益細菌を増加させることを意味する。何らかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、有益細菌の増加は、そのような細菌の増殖を刺激すること、または単純に、病原性細菌を選択的に減少させることにより、増殖し腸壁に結合するためのより多くの空間を有益細菌に与えることにより引き起こされることができると考えられる。本発明の方法により減少させることができる有害な病因性細菌としては、以下が挙げられる：クロストリジウム属種（ペルフリンゲンスおよびディフィシルなど）、リステリア属種（モンサイトゲネス（moncytogenes）、ゼーリゲリおよびウェルシメリなど）、サルモネラ属種（エンテリカ、アリゾネ、ティフィリウム、エンテリティディスおよびボングロリ（bonglori）など）、大腸菌、エンテロコッカス属種（フェカリスおよびフェシウムなど）、カンピロバクター、アエロモナス属種、黄色ブドウ球菌およびビブリオ属種。いくつかの実施形態では、有害な病因性微生物は、約０．５ログ、約１ログ、約２ログ、約３ログ、約４ログまたは約５ログ減少することがある。
【００３３】
[0040] 前述の病原性細菌は、動物において多様な疾患を引き起こす。例えば、家禽においては、クロストリジウム・ペルフリンゲンスで汚染された飼料は、ニワトリにおける壊死性腸炎（または腸管壁内の壊死性病変）の激増に関係していた。興味深いことに、この細菌はニワトリの腸管内で通常見られるが、この細菌は、レベルの増加がこの疾患に関連しているとはいえ、壊死性腸炎を常に引き起こすわけではない。プロバイオティクスの使用によるこの病原菌の減少の結果、下記の実施例に示すように、健康が向上し体重が増加する。したがって、腸内での増殖能力を減少させることによりこれらの細菌を制御すると、そのような細菌により引き起こされる疾患の発生率が低下する。下記の表１には、多様な微生物と、こうした微生物が関連している疾患または状態が示してある。
【００３４】
【表１】
【００３５】
[0041] 健康な腸内微生物叢の維持、および、とりわけ前記の有害細菌のうち１つまたは複数の減少は、さらに、動物の糞便を介した病原菌排出の減少ももたらす。病原菌の量は、動物の糞便中の病原菌排出物の分析または試験中の動物の屠殺およびそうした動物の腸内の（有益および病原性）細菌集団の分析など、当業者に公知のいくつかの方法により定量できる。
【００３６】
[0042] 本発明の方法は、病原性細菌の増殖の阻害および／または有益細菌の増殖の増加または維持により、治療量の抗生物質の投与後の正常な腸内バランスを回復するためにも使用できる。用語「治療量」は、動物の疾患状態を改善または反転させるのに十分な量を指す。
【００３７】
[0043] 本発明の方法により得られる生産性の増加は、以下のいずれかを指す：より多くもしくはより高品質の卵、乳もしくは肉の生産、または離乳する仔の生産増加。
【００３８】
[0044] 本発明の方法は、脊椎動物（哺乳動物および水生動物など）および甲殻類（エビなど）を含めた任意の動物に適用できるが、昆虫およびヒトを除く。本発明の組成物で治療できる哺乳動物としては、以下が挙げられる：家畜；ウマ（競走馬を含む）など、スポーツ、娯楽または作業に使用される動物；イヌ、ネコ、鳥および外来種を含めた、飼い馴らされた家庭用ペット；ならびに動物園の動物。家畜は、消費用に、または食物生産動物として飼育される動物を指す。一実施形態では、この方法は、家禽および猟鳥などの単胃動物に適用される。家禽としては、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、ならびにダチョウおよびエミューなどの走鳥類を挙げることができる。猟鳥としては、ウズラ、チャッカー（chukkar）、キジ、ライチョウ、コーニッシュヘンおよびヤマウズラを挙げることができる。ニワトリは、肉用ニワトリを指し、屠殺用に飼育されているニワトリ（ブロイラーとも呼ばれる）、ならびにヒトの摂取用の卵を生産するために使用される卵用ニワトリを包含する。別の実施形態では、この方法は、ブタなどの哺乳動物に適用してもよい。また別の実施形態では、この方法は、ウシ、ヤギおよびヒツジなどの複胃動物（本明細書においては反芻動物とも呼ぶ）に適用してもよい。一実施形態では、本発明の組成物は、健康を向上させ、とりわけこうした動物における下痢の発生率を低下させるために複胃未発達動物に与えてもよい。複胃未発達動物は、出生時から生後約１２週の年齢の範囲の反芻動物（仔ウシなど）である。本発明の組成物は、代用乳と共に複胃未発達動物に投与してもよい。代用乳は、複胃未発達動物の授乳期中に初乳の代わりにすることを意図した調合飼料を指す。
【００３９】
[0045] 一態様では、本発明の組成物は、給餌に先立ち対象動物の飼料または飲料水に加えられる飼料添加物である。そのような場合、この組成物は、前述のように、炭酸カルシウムまたは乳清タンパク質などの担体と共に調合してもよい。本発明の一態様では、そのような担体は疎水性である。
【００４０】
[0046] 別の態様では、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、その変異体、ＱＳＴ７１３の無細胞調製物およびその変異体、ならびにＱＳＴ７１３の代謝産物およびその変異体を含む組成物は、動物の成長を促進および維持するために必要な動物用飼料原料と組み合わせて調合できる。そのような動物用飼料原料としては、以下のうち１つまたは複数を挙げることができる：タンパク質、炭水化物、脂肪、ビタミン、ミネラル、抗コクシジウム剤、酸ベース製品、および／または抗生物質などの医薬。いくつかの実施形態では、前述のものなどの担体も存在すると考えられる。成長を促進および維持するために必要なタンパク質および炭水化物は、細菌の発酵工程から残存する可能性のある一切の残存性のタンパク質および／または炭水化物と区別するために、飼料タンパク質および飼料炭水化物と呼ぶものとする。
【００４１】
[0047] 別の態様では、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３、その変異体、ＱＳＴ７１３の無細胞調製物およびその変異体、ならびにＱＳＴ７１３の代謝産物およびその変異体を含む本発明の組成物は、動物の健康を向上させまたは動物の全身的な身体状態を改善するために動物に与えられる他のプロバイオティクス（バチルスの他の種および株など）をさらに包含してもよい。例示的な株としては、以下が挙げられる：ＫｅｍｉｎからＣＬＯＳＴＡＴ（登録商標）の商品名で販売されているバチルス・ズブチリスＰＢ６（米国特許第７，２４７，２９９号に記載され、ATCC受入番号ＰＴＡ−６７３７として寄託されているもの）、または、カルピスからＣＡＬＳＰＯＲＩＮ（登録商標）として販売されているバチルス・ズブチリスＣ−３１０２（米国特許第４，９１９，９３６号に記載され、日本の工業技術院発酵研究所、産業技術総合研究所と共にＦＥＲＭ ＢＰ−１０９６として寄託されているもの）、またはＣｈｒ．ＨａｎｓｅｎからＢＩＯＰＬＵＳ２Ｂ（登録商標）の商品名で販売されている、バチルス・リケニフォルミスとバチルス・ズブチリス胞子との混合物、バチルス・コアギュランス（米国特許第６，８４９，２５６号に記載の当該株を含む）、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンツス、バチルス・プミルス、バチルス・ラテロスポラスおよびバチルス・アレヴィ。バチルス以外の他のプロバイオティクス（サッカロミセス・セレヴィシエなど）も、本発明の組成物中で使用できる。そのような他のプロバイオティクスが本発明の組成物の一部として調合されない場合、プロバイオティクスは、本発明の組成物と共に（同時または異なる時点のいずれでもよい）投与してもよい。
【００４２】
[0048] 別の態様では、本発明の組成物は、以下を包含し、またはこれらと共に投与してもよい（同時または異なる時点のいずれでもよい）：アミラーゼ、グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼおよびペクチナーゼなど、飼料の消化を助ける酵素；抗体、サイトカイン、噴霧乾燥血漿などの免疫調節物質；インターロイキン、インターフェロン；および／または、フルクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イヌリン、オリゴフルクトース強化イヌリン、タガトースおよびポリデキストロースなどのオリゴ糖。
【００４３】
[0049] この組成物がＱＳＴ７１３またはその変異体を含む実施形態では、細菌は、飼料または飲料水に加えて、動物の健康を向上させるのに有効な量で動物に与えるべきである。一実施形態では、細菌は、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０４ＣＦＵ〜飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０１０の包含率で加えることができる。別の実施形態では、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０５ＣＦＵ〜飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０９を投与すべきである。また別の実施形態では、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０５ＣＦＵ〜飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０９を投与すべきである。また別の実施形態では、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０６ＣＦＵ〜飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０８を投与すべきである。いくつかの実施形態では、包含率は、飼料１グラムまたは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０３ＣＦＵ、または、飼料１グラムもしくは飲料水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリス約１×１０４ＣＦＵもしくは約１×１０５ＣＦＵもしくは約１×１０６ＣＦＵもしくは約１×１０７ＣＦＵもしくは約１×１０８ＣＦＵもしくは約１×１０９ＣＦＵもしくは約１×１０１０ＣＦＵもしくは約１×１０１１ＣＦＵである。ＱＳＴ７１３またはその変異体を含有する組成物が飼料添加物として供給される実施形態では、そのような組成物は、動物用飼料または飲料水に加えられる際、前記の範囲に希釈可能なＣＦＵ数を有するべきである。
【００４４】
[0050] バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはその変異体、その無細胞調製物またはその代謝産物を含む組成物は、前述の方法において使用される組成物が動物用飼料ペレットの一部を形成するように、ペレット化工程に先立ち動物用飼料に加えることができる。この態様においては、細菌細胞が組成物中で使用される場合、こうした細胞は、典型的には、ペレット化工程に先立ち動物用飼料の他の成分に胞子フォームで加えられる。乾燥または半含水飼料の押出し加工など、当業者に公知の標準的なペレット化工程を用いてもよい。いくつかの実施形態では、ペレット化工程には、少なくとも約６５℃の温度が含まれる。中でも、ペレット化温度は、約６５℃〜約１２０℃の間である。さらに中でも、ペレット化温度は、約８０℃〜約１００℃の間である。また中でも、ペレット化温度は、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃または約１００℃である。
【００４５】
[0051] 本発明の組成物は、薬学上許容される担体と組み合わせて医薬品として経口投与することもできる。多様な動物にとっての最適な投与レベルは、中でも、この組成物が（ｉ）腸内の病原性細菌を多様な用量で阻害もしくは減少させ、（ｉｉ）有益細菌のレベルを増加もしくは維持し、および／または（ｉｉ）動物の健康を多様な用量で向上させる能力を評価することにより、当業者が容易に決定できる。
【００４６】
[0052] サケ、マス、エビおよび観賞魚などの水生動物の場合、一実施形態では、本発明の組成物は、魚用飼育水（魚用飼料ではなく、または魚用飼料に加えて）に、魚の健康を向上させるのに有効な量で加えてもよい。そのような有効量は、飼育水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１０４〜約１０１０ＣＦＵの間、または別の実施形態では、飼育水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１０５〜約１０９ＣＦＵの間、またはまた別の実施形態では、飼育水１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１０６〜約１０８ＣＦＵの間であってもよい。
【００４７】
[0053] 以下の実施例は、本発明の純粋な例証かつ非限定的な目的で記載するものである。
実施例
【実施例１】
【００４８】
[0054] 動物の病原菌に対するＱＳＴ７１３無細胞調製物の有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒおよび最低阻害濃度（ＭＩＣ）法を用いて、クロストリジウム（クロストリジウム・ペルフリンゲンスＡＴＣＣ１３１２４、およびクロストリジウム・ペルフリンゲンスの２つの環境単離物）、リステリア（リステリア・モンサイトゲネスＡＴＣＣ１９１１６および１９１１１、リステリア・ゼーリゲリＡＴＣＣ３５９６８およびリステリア・ウェルシメリＡＴＣＣ３５８９７）、サルモネラ（サルモネラ・エンテリカＡＴＣＣ１０３９８、サルモネラ・アリゾネＡＴＣＣ１３３１４およびサルモネラ・ボンゴリＡＴＣＣ４３９７５）および大腸菌に対する抗微生物活性について、ＱＳＴ７１３の無細胞調製物を試験した。
【００４９】
[0055] 標的病原菌が増殖した培地に対応する培地中でＱＳＴ７１３を増殖させ、下記の表１に示すように、１５分間、３０００ｒｐｍ、２３℃で培養物を遠心分離し、０．４５μｍのＮａｌｇｅｎｅフィルターユニットによりこれを濾過することにより、無細胞調製物を調製した。熱安定性について試験するため、Ｋｉｒｂｙ−ＢａｕｅｒおよびＭＩＣ試験のそれぞれに先立ち、無細胞調製物の一部を１時間かけて５０℃に加熱した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
[0056] Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒ実験において、２ｍｍの滅菌済濾紙のディスクを、ＱＳＴ７１３の上澄みに浸漬させ、滅菌済条件下で風乾した。次に、このディスクを標的病原菌の菌叢上に置き、一晩インキュベートし、阻害域を測定した。クロストリジウムおよびリステリアの標的について阻害域を観察した。
【００５２】
[0057] ＭＩＣ法において、ミクロ滴定プレートのウェルに、それぞれの標的病原菌７５ｕｌを播種し、１×１０５に希釈した。前記の無細胞調製物を、各ウェルに最終希釈率１：２、１：１０および１：５０で加えた。プレートを３７℃、ＯＤ６００で一晩インキュベートし、Ｗａｌｌａｃｈマイクロ滴定読取器で読み取った。無細胞調製物（熱処理したものと非熱処理のものとの両方）は、クロストリジウムおよびリステリアの標的に対して顕著に効果的であり、サルモネラおよび大腸菌の増殖を阻害したが、Ｋｉｒｂｙ−Ｂａｕｅｒプレート上のこれらの最後の２つの病原菌については、阻害域が観察されなかった。クロストリジウム、リステリアおよびサルモネラのデータを図１〜６に示す。
【実施例２】
【００５３】
[0058] 多様な細菌に対するＱＳＴ７１３の有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の粉末調合物を、以下の細菌の多様な環境単離物に対する有効性について試験した：クロストリジウム・ペルフリンゲンス、大腸菌、サモネラ（Samonella）・エンテリティディス、カンピロバクター・ジェジュニおよびリステリア・モノサイトゲネス。「発明を実施するための形態」において前述したように、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を発酵させ、発酵ブロスを濃縮し乾燥させることにより、この粉末調合物を調製した。この調合物は、１４．６％の濃縮乾燥ブロスおよび８５．４％の不活性調合物（前述の候補から選択）を有し、１グラム当たりバチルス・ズブチリス最低およそ７．３×１０９ＣＦＵ、および１グラム当たりバチルス・ズブチリス最高およそ１×１０１０ＣＦＵを含有していた。この調合物を、本明細書においては組成物１と呼ぶものとする。溶液が１ｍｌ当たりバチルス・ズブチリスおよそ１×１０９ＣＦＵを含有するように、調合粉末０．２グラムを滅菌済蒸留水１．８ｍｌに加えることにより、組成物１のストック溶液を調製した。５％ヒツジ血液を加えたトリプチカーゼ大豆寒天に試験生物を画線し、寒天プレートを二分する単一の線の中で単一の寒天プレートそれぞれに最大４つの生物を画線した。この生物を一晩乾燥させた。次に、播種したプレートに、前述の調合済ＱＳＴ７１３の懸濁液を画線し、これを試験生物に垂直に塗布した。クロストリジウム・ペルフリンゲンスおよびカンピロバクター・ジェジュニの単離物をＣａｍｐｙガス雰囲気（１０％ＣＯ２、５％Ｏ２、８％Ｎ２）中で４１±２℃にて一晩インキュベートした。他の単離物（これらは好気性である）を３６±２で一晩、Ｃａｍｐｙガスの不在下でインキュベートした。ＱＳＴ７１３は、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、サルモネラ・エンテリティディス、カンピロバクター・ジェジュニおよびリステリア・モノサイトゲネスの単離物のいくつかを阻害したが、大腸菌は阻害しなかった。加えて、いくつかのケースでは、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、病原性細菌の攻撃的な競合的過剰増殖を示した。結果を下記の表にまとめる。表において報告した阻害域を、バチルス増殖体の端から試験生物の増殖体の開始部分までを測定した。加えて、クロストリジウム・ペルフリンゲンスおよびカンピロバクター・ジェジュニのプレートの写真を、図７および８にそれぞれ示す。
【００５４】
【表３】
【実施例３】
【００５５】
[0059] ブロイラーにおけるＱＳＴ７１３のｉｎ ｖｉｖｏ試験
組成物１をブロイラー鶏の幼動物用および仕上げ用飼料に加え、体重増加および飼料効率を観察した。２５２羽のＪｕｍｂｏ Ｃｏｒｎｉｓｈ Ｃｒｏｓｓブロイラーの雛をランダムに４群に分け、下記に列挙する食餌の１つを与えた。
・基礎食のみ：対照
・基礎食＋０．０５％ＣＡＬＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（０．５ｇ／ｋｇ、１０６ＣＦＵ／ｇ）（追って記載の表ではＣＳと表記）
・基礎食＋０．０５％組成物１（０．５ｇ／ｋｇ、１０６ＣＦＵ／ｇ）（追って記載の表では組成物１−１０６と表記）
・基礎食＋０．０００５％組成物１（０．５ｍｇ／ｋｇ、１０３ＣＦＵ／ｇ）（追って記載の表では組成物１−１０３と表記）
以下の幼動物用飼料から成る基礎食を１〜２２日目の間、以下の仕上げ飼料を２２〜４２日目の間。
【００５６】
【表４】
【００５７】
[0060] 下記の表５の結果から、組成物１は、１０６ＣＦＵ／ｇレベルで鳥の体重増加を改善したことが示される。飼料効率は２１〜４２日目の期間にわたり、また成長期間全体（１〜４２日目）にわたり、改善した。下記のチャートにおいては、ＡＤＧは１日の体重増加平均を指し、ＡＤＦＩは１日の飼料摂取量平均を指す。
【００５８】
【表５】
【実施例４】
【００５９】
[0061] 飼料のペレット化工程におけるＱＳＴ７１３の安定性
動物用飼料のペレット化工程中のバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の安定性を定量するため、組成物１を含有する動物用飼料ペレットを調製し、多様な温度で試料を試験した。対照飼料は、表６に示す原料を含有し、実験用飼料には８％組成物１を添加した。
【００６０】
【表６】
【００６１】
[0062] 原料をＦｏｂｅｒｇミキサー中で周囲温度にて混合してから多様な標的温度に加熱し、これらの温度でこの混合物を約３０秒間維持してから、５／３２”×１ １／４”のペレット用金型を通して約２０００ポンド／時間でペレット化した。ミキサー全体の異なる１０箇所から１０試料を採取した。標的温度の６５℃、７５℃、８０℃および８５℃で、同じ７５０ポンドのバッチ内でペレット試料を採取した。
【００６２】
[0063] ミキサーの試料を希釈し、５分間置いて完全にぬらした。ＱＳＴ７１３細胞を回復させるため、ペレット試料を３０分間リン酸緩衝液に浸した。希釈試料を平板培養し、コロニー形成単位を定量した。コロニー形成単位は、下記の表７に示すように、ミキサーからペレット化段階に向けわずかに減少した。
【００６３】
【表７】
【実施例５】
【００６４】
[0064] ブタにおけるＱＳＴ７１３のｉｎ ｖｉｖｏ試験
飼料ペレットフォームでのＱＳＴ７１３を用いた試行を、養豚場における７５０匹のブタを用いて実行した。標準的な工程により、ペレット化に先立ち組成物１を飼料に加えた。標準的なペレット化工程の前後のＱＳＴ７１３のＣＦＵの試験は、前述の実施例４において得られた結果と一致し、ＱＳＴ７１３のＣＦＵは、ペレット化後、劇的に減少しないことが示された。
【００６５】
[0065] ブタ１匹当たりのおよその開始時体重は１０ポンドであり、ブタが成長する目標はおよそ４０ポンドであった。一切の抗生物質またはバチルスが含まれない標準的な食餌から成る対照処置食がおよそ２５０匹のブタに与えられた。別の２５０匹のブタは、標準的な食餌に加え、飼料１ｇ当たり１×１０６ＣＦＵのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を摂取した。３番目の群の２５０匹のブタには、飼料１グラム当たり１×１０７ＣＦＵのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３が与えられた。３番目の群において処分されたブタの数は、対照群と比較して顕著に減少した。処分の実行には、不健康またはサイズが不十分なブタには、治療的製品が与えられるようには給餌しないことまたは安楽死させることが含まれる。
【実施例６】
【００６６】
[0066] 家禽におけるＱＳＴ７１３のｉｎ ｖｉｖｏ試験
飼料添加物として組成物１を用いた試行を、敷料床鶏舎１つ当たり５０羽のブロイラー鶏、１処置当たり鶏舎６つを用いて実施した。家禽用の標準的な飼料（他のプロバイオティクスまたは抗生物質を含有しない）に、飼料１トン当たり組成物１が９１グラム（およそ６．６４×１０１１ＣＦＵ／トン）の比率で組成物１を加えた。対照群の１つおよび組成物１を添加した飼料を投与された鳥の群に、試験の１９日目、２０日目および２１日目にクロストリジウム・ペルフリンゲンスを接種した。試験期間を通して体重を記録し、これを下記の表８に示す。飼料効率を定量し、下記の表９に飼料転換率として報告した。飼料転換率は、死亡し取り除かれた鳥の体重で調節した。試験の２２日目、各鶏舎から５羽の鳥を選別し、屠殺し、計量し、壊死性腸炎（ＮＥ）病変の存在程度について調べた。ＮＥの評価付けは、０〜３の評価尺度（０は正常、３は最も重症）に基づくものであった。表８および９においては、異なる上付き文字を有するカラム内の平均値には有意差がある（Ｐ＜．０５）。ＳＥＭは、ＬＳＭＥＡＮＳの標準誤差である。
【００６７】
【表８】
【００６８】
【表９】
【実施例７】
【００６９】
[0067] 多様な試験についての組成物２の使用
バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の第２の調合物を用いて、成長成績の改善を試験するために試行を実施する。この粉末調合物は、この組成物が、細胞（主に胞子および数種の栄養細胞）から本質的に構成されるように、発酵させ、発酵ブロスを濃縮し、これを乾燥させ透析濾過工程により洗浄して、残存する発酵培地および代謝産物を除去することにより調製される（すべて前述のとおり）。この組成物は、１４．６％の濃縮乾燥洗浄した培養物および８５．４％の不活性調合物（「発明を実施するための形態」において前述した候補から選択）および１グラム当たり約１．０×１０１０ＣＦＵのバチルス・ズブチリスを含有し、本明細書においてはこれを組成物２と呼ぶものとする。実施例３〜６に記載の試行における組成物１を組成物２に置き換え、結果は、組成物１で達成されたものと同じであることが期待される。
【実施例８】
【００７０】
[0068] 海水中でのＱＳＴ７１３胞子の生存率
組成物１を試験して、海水およびＮａＣｌ中での生存率を定量した。人工的な海水を、１０ｐｐｔ、３０ｐｐｔ、５０ｐｐｔの３種類の濃度で、１つの濃度当たり２５ｍｌの試験管４本調製した。３種類の濃度のＮａＣｌ（１％、３％および５％）を加えて、栄養ブロスを、１つの濃度当たり２５ｍｌの試験管４本調製した。播種に先立ちオートクレーブすることにより、海水および栄養ブロスを両方とも滅菌した。組成物１の懸濁液０．５ｇをＤＩ水１０ｍｌに溶解することにより作製した。この懸濁液のアリコット（０．５ｍｌ）を、３種類の濃度の海水およびブロスのそれぞれの中に播種した。試験管には１０７ｃｆｕ／ｍｌ超（ｃｆｕ＝コロニー形成単位）が入っていると推定された。１％栄養ブロスおよび１％ＮａＣｌの希釈ボトルを調製し（１ボトル当たり９９ｍｌ）、オートクレーブすることにより滅菌した。製造者の使用説明書により栄養寒天を調製した；プレート計数試験用に１５×１００ｍｍのプレート（１試験当たり１つのプレートプラス播種していない対照）を調製した。
【００７１】
[0069] ２８℃、震盪インキュベーター中で、１２５ｒｐｍを用いて１４日間、試験管をインキュベートした。継代培養用の試料を０日目、２日目、１０日目に採取した。０日目にすべての試験管を試験し、２日目および１０日目には、最高濃度の海水およびＮａＣｌの２つのみを試験した。プレート計数は、０日目に元の試験管１０μl（＝１０−２希釈まで）、２日目および１０日目には１％栄養ブロス／１％ＮａＣｌ中で調製された１０−２および１０−４の希釈物１００μｌを平板培養することにより得た。こうして得られた数は、実際には１０−３および１０−５レベルであった。プレートを２８℃でインキュベートした。コロニーを２４時間および４８時間時点で観察した。
【００７２】
[0070] Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ２０Ｄ＋装置、キュベットとしての１２×７５のフラクションコレクター用ポリスチレン試験管、および各試料の吸光度を測定することによる６６０波長を用いて、濁度測定値を得た。試験試料は、各試験管からの１：１０希釈物を調製することにより０日目に作製した（１％生理食塩水４．５ｍｌ中０．５ｍｌ、２日目および１０日目には１０−２および１０−４希釈物の２４時間継代培養物５ｍｌを試験することにより）。加えて、濁度測定値は、２日目の希釈物の８日目のインキュベーション時に得た。
【００７３】
[0071] プレート培養物および濁度測定値の両方から、胞子は存続しており、少なくとも１０日間は数がほとんどまたは全く減少しなかったことが示された。
【００７４】
[0072] 培養プレートを２４時間および４８時間時点で読み取った。２４時間時点では、１０−３プレートは細菌が増殖してすべてコンフルエントな状態であった。１０−５プレートの方が少なかったが、それでも１プレート当たり約１０００コロニーを有した。４８時間までには、すべてのプレートは非常にコンフルエントな増殖、したがって、元の試験管中では１ｍｌ当たり１０８ｃｆｕ超を有した。この数は、０日目、２日目および１０日目時点で維持された。さまざまな範囲の濃度の海水またはＮａＣｌで増殖させた培養物においては、差は観察されなかった。組成物１の培養物は、試験したすべての範囲において良好に増殖した。播種していない海水またはＮａＣｌ添加栄養ブロス中では、どの時点でも増殖しなかった。
【００７５】
[0073] 濁度試験（吸光度測定値）でも同様の結果が得られたが、読取りはより困難であった。元の試験管は直接読み取ることができず、その理由は、そうした試験管は、特に最高濃度の海水で濁りすぎていたからである。１：１０希釈物を使用して、０日目の測定値を得た。２日目および１０日目の測定値は、培養プレートを播種するために用いた希釈物上のもので、希釈ボトルから得ることができた。２日目および１０日目の推定数は１ｍｌ当たり１０８を超えたことから、生理食塩水の濃度による増殖への悪影響は、あったとしてもごくわずかであった。
【００７６】
[0074] 組成物１を、３種類の濃度の人工海水（１０ｐｐｔ、３０ｐｐｔおよび５０ｐｐｔ）、ならびに、栄養ブロス中の３種類の濃度のＮａＣｌ（１％、３％および５％）における存続について試験した。プロバイオティクスは、すべての濃度において増殖し、少なくとも１０日間は、１ｍｌ当たり１０８を超える多数で生存可能であった。海水中またはブロス中の塩の濃度は、胞子が発芽および増殖する能力に影響しなかった。
【実施例９】
【００７７】
[0075] マスにおけるＱＳＴ７１３のｉｎ ｖｉｖｏ試験
約１４グラムのニジマスを、それぞれ魚２０尾ずつの２群に分ける。対照群には標準的な魚用飼料を与え、処置群には、魚用飼料と、飼料１グラム当たり１×１０６ＣＦＵのバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を投与する。処置群は、対照群と比較して体重の増加を示すことが期待される。
【実施例１０】
【００７８】
[0076] エビにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験
ペナエダエ（Ｐｅｎａｅｄａｅ）科およびテナガエビ科のエビおよび中エビの公知の病原菌に対するＱＳＴ７１３の阻害作用を定量するために、養殖エビから単離される３つの病原性細菌：腸炎ビブリオ菌、Ｖ．アルギノリティカスおよびＶ．ブルニイフィカス、ならびにエビ由来の病原性真菌フザリウム・ソラニに対して組成物１および２を試験する。調合粉末０．２グラムを滅菌済蒸留水１．８ｍｌに加えることにより、各溶液が、１ｍｌ当たり約１×１０９ＣＦＵのバチルス・ズブチリスを含有するように、組成物１および組成物２のストック溶液を調製する。
【００７９】
[0077] サブローデキストロース寒天上で増殖させたフザリウム・ソラニの５日培養物に由来する分生胞子（condiospores）を、滅菌済２％ＮａＣｌ中に収集する。ビブリオは３７℃のＬｕｒｉａブロス培地上で増殖させる。海洋細菌の亜系は、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天またはマリンブロス２２１６の培地上で３０℃にて濃縮してから、１〜３％ＮａＣｌを添加したトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）中で３０℃にて培養する。腸炎ビブリオ株は、チオ硫酸塩・クエン酸塩・胆汁塩寒天上で４２℃にて選択的に増殖させてから、３％ＮａＣｌを添加したＴＳＢ上で３０℃にて培養する。
【００８０】
[0078] 試験生物、ビブリオおよびフザリウムを、それぞれ、寒天プレートを二分する単一の線の中で、単一の支持寒天プレートに画線する。この生物を一晩乾燥させる。次に、播種されたプレート２セットに、前述の組成物１の懸濁液または組成物２の懸濁液のいずれかを画線し、これを試験生物に垂直に塗布する。画線プレートを３６℃±２で一晩インキュベートする。ＱＳＴ７１３は、病原性のビブリオおよびフザリウムの単離物のいくつかを阻害すると期待される。加えて、いくつかのケースでは、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３は、病原性細菌の攻撃的な競合的過剰増殖を示すことが期待される。
【００８１】
[0079] 別に定義しない限り、本明細書におけるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実行または試験においては、本明細書に記載のものと同様または等価の任意の方法および材料を使用できるが、本明細書には好ましい方法および材料を記載してある。引用するすべての刊行物、特許および特許公報は、あらゆる目的について参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８２】
[0080] 本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日に先立ち、それらを開示するためにのみ記載するものである。本明細書に記載の一切は、先行発明があるという理由で本発明がそうした刊行物より以前のものであるとの権利を与えられていないと認めるものと解釈されるべきではない。
【００８３】
[0081] 本発明をその具体的な実施形態と関連づけて説明してきたが、さらなる改変形が可能であること、ならびに本出願は、一般には、本発明の原理に従う本発明の一切の変形、使用または適応を網羅することを意図しており、これには、本発明が関係する当技術分野内の公知のまたは慣例的な実行の範囲内で生じるような、また本明細書で前述した本質的なフィーチャに適用できるような、また添付の特許請求の範囲内で後に続くような、本開示からの逸脱が含まれることは理解されよう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫以外およびヒト以外の動物の健康を向上させる方法であって、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体を含む組成物を、前記昆虫以外およびヒト以外の動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記組成物が、前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３により産生される代謝産物をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、成長成績を改善するのに有効な量で家畜に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記量が、前記昆虫以外およびヒト以外の動物の飼料利用効率を向上させるのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記量が、前記昆虫以外およびヒト以外の動物の生存率を向上させるのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記量が、前記昆虫以外およびヒト以外の動物の体重増加を向上させるのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、健康な腸内微生物叢を維持するのに有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、前記昆虫以外およびヒト以外の動物における病原性細菌の増殖を低下させるのに有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記病原性細菌が、クロストリジウム属種、カンピロバクター属種、リステリア属種および大腸菌から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記昆虫以外およびヒト以外の動物が家禽である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記家禽がブロイラー鶏である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記家禽が卵用ニワトリである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物がブタである、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物が反芻動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物が複胃未発達動物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が動物用飼料と共に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物用飼料原料が飼料タンパク質を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物用飼料原料が飼料炭水化物をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が飲料水をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、複胃未発達動物のための代用乳をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、前記動物用飼料１グラム当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１×１０３ＣＦＵから、前記動物用飼料１グラム当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１×１０１０ＣＦＵの比率で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
昆虫以外およびヒト以外の動物の身体状態を改善するための組成物であって、（ｉ）前記動物の成長を向上させるのに有効な量のバチルス・スブチルス（subtilus）ＱＳＴ７１３と（ｉｉ）少なくとも１つの動物用飼料原料とを含む組成物。
【請求項２５】
前記動物用飼料原料が、飼料炭水化物および飼料タンパク質を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の前記有効量が、動物用飼料１グラム当たり約１×１０３ＣＦＵから、動物用飼料１グラム当たり約１×１０１０ＣＦＵである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項１】
昆虫以外およびヒト以外の動物の健康を向上させる方法であって、バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３またはバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の変異体を含む組成物を、前記昆虫以外およびヒト以外の動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記組成物が、前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３により産生される代謝産物をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、成長成績を改善するのに有効な量で家畜に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記量が、前記昆虫以外およびヒト以外の動物の飼料利用効率を向上させるのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記量が、前記昆虫以外およびヒト以外の動物の生存率を向上させるのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記量が、前記昆虫以外およびヒト以外の動物の体重増加を向上させるのに有効である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、健康な腸内微生物叢を維持するのに有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、前記昆虫以外およびヒト以外の動物における病原性細菌の増殖を低下させるのに有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記病原性細菌が、クロストリジウム属種、カンピロバクター属種、リステリア属種および大腸菌から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記昆虫以外およびヒト以外の動物が家禽である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記家禽がブロイラー鶏である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記家禽が卵用ニワトリである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物がブタである、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物が反芻動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物が複胃未発達動物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が動物用飼料と共に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物用飼料原料が飼料タンパク質を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物用飼料原料が飼料炭水化物をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が飲料水をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、複胃未発達動物のための代用乳をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、前記動物用飼料１グラム当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１×１０３ＣＦＵから、前記動物用飼料１グラム当たりバチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３約１×１０１０ＣＦＵの比率で投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
昆虫以外およびヒト以外の動物の身体状態を改善するための組成物であって、（ｉ）前記動物の成長を向上させるのに有効な量のバチルス・スブチルス（subtilus）ＱＳＴ７１３と（ｉｉ）少なくとも１つの動物用飼料原料とを含む組成物。
【請求項２５】
前記動物用飼料原料が、飼料炭水化物および飼料タンパク質を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記バチルス・ズブチリスＱＳＴ７１３の前記有効量が、動物用飼料１グラム当たり約１×１０３ＣＦＵから、動物用飼料１グラム当たり約１×１０１０ＣＦＵである、請求項２４に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１２−５０２９２０（Ｐ２０１２−５０２９２０Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７０７３（Ｐ２０１１−５２７０７３）
【出願日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７３３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３７１４
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５００２８１００６）アグラクエスト インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５７３３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３７１４
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５００２８１００６）アグラクエスト インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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