動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング方法及び動脈硬化症の予防・治療剤
【課題】歯周病菌に起因する動脈硬化症を改善する有効成分を、簡便かつ高精度にスクリーニングする方法、歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供する。
【解決手段】歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング法であって、マクロファージに歯周病菌の内毒素及び被験物質を接触させ、このマクロファージの下記（Ａ）ＬＤＬ受容体、（Ｂ）ＮＯ合成阻害因子、（Ｃ）ＭＭＰ、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素からなる群から選ばれる蛋白質の遺伝子発現量を測定し、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを比較し、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する遺伝子の発現量を増加させる物質を選択するスクリーニング方法。
【解決手段】歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング法であって、マクロファージに歯周病菌の内毒素及び被験物質を接触させ、このマクロファージの下記（Ａ）ＬＤＬ受容体、（Ｂ）ＮＯ合成阻害因子、（Ｃ）ＭＭＰ、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素からなる群から選ばれる蛋白質の遺伝子発現量を測定し、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを比較し、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する遺伝子の発現量を増加させる物質を選択するスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病菌に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング方法、及び動脈硬化症の予防・治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、疫学的な研究結果から、歯周病の罹患率と心臓血管系疾患、糖尿病、肥満、早産、呼吸器疾患等の間で相関関係があることが明らかになり、歯周病が全身健康にも大きな影響を及ぼしうることが指摘されている。
【０００３】
歯周病の患者では、歯周病原因菌やその内毒素（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：以下、ＬＰＳと略す場合がある。）は容易に歯肉を通過し、血中へと入り込み、血流に乗って全身に広がるといわれている。さらに血中に入った歯周病原因菌やその内毒素は、マクロファージ、血管内皮細胞、肥満細胞等を刺激し、炎症性サイトカイン等の炎症性メディエーター産生を促進する。その結果、前述の疾患の原因となることが推察される。
【０００４】
また、歯周病患者では、血液中のコレステロール、中性脂肪等の値が高いことが知られている。血液中のコレステロール、特に低密度リポプロテイン（ＬＤＬ：Ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の増加は、動脈硬化等の原因となることが知られている（非特許文献１，２、特許文献１参照）。
【０００５】
一方、歯周病を治療することにより前述の全身疾患も改善できることが近年示されている。例えば、歯周病患者である妊婦にスケーリング及びルートプレーニングを処置することにより、早産を予防することができるという報告がある（非特許文献３参照）。また、安全かつ有効な量の抗菌剤を口腔に局所適用することにより、身体の健康を増進する方法が提案されている（特許文献１参照）。
【０００６】
しかしながら、スケーリングやルートプレーニングは、歯科医でなければ処置できず、通常の生活の中で実施するのは極めて困難であり簡便な方法ではない。また、抗菌剤による処置により、歯周病菌は駆除されても、歯周病菌が産生したＬＰＳは残存することから、効果的な予防方法とは言い難い。
【０００７】
一方、一般的に動脈硬化症に対して直接有効な薬剤はなく、血清コレステロール低下剤（脂質低下剤）あるいは血小板凝集抑制剤（抗血栓剤）を投与して、間接的に動脈硬化の危険因子を取り除く療法のみであった。しかしながら、歯周病に伴って生じる動脈硬化症の原因は未解明な部分が多い。従って、上述したような脂質低下剤や抗血栓剤によって、歯周病に伴って生じる動脈硬化症を改善できるか否かは不明である。
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５１７０３８号公報
【非特許文献１】「Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．」、２００２年５月、７３（５）、ｐ４９４−５００
【非特許文献２】「Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．」、２００３年７月、７４（７）、ｐ１００７−１６
【非特許文献３】「Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．」、２００３年８月、７４（８）、ｐ１２１４−１２１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、歯周病に起因する動脈硬化症の詳細なメカニズムは不明であり、歯周病に起因する動脈硬化症の改善に有効な成分を特定することが困難であった。本発明は上記事情に鑑みなされたもので、歯周病に起因する動脈硬化症の詳細なメカニズムを明らかにし、歯周病菌に起因する動脈硬化症を改善する有効成分を、簡便かつ高精度にスクリーニングする方法、歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記目的を達成するため、歯周病に起因する動脈硬化症のメカニズムの解明の研究を進めてきた。その結果、マクロファージを歯周病原因菌の内毒素（ＬＰＳ）で刺激すると、ＬＰＳ無刺激の単球性白血病細胞株と比較して、遺伝子発現が増加あるいは減少する因子群が存在することを知見し、歯周病に起因する動脈硬化症のメカニズムの一つが、これらの遺伝子発現が増加又は減少するによるものであることを知見した。これを利用して歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分を、簡便かつ高精度にスクリーニングでき、このスクリーニング方法を用いて、歯周病に起因する動脈硬化症を予防・改善する有効成分が得られることを知見し、本発明をなすに至ったものである。
【００１１】
従って、本発明は下記スクリーニング方法及び歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供する。
［１］．歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング法であって、マクロファージに歯周病菌の内毒素及び被験物質を接触させ、このマクロファージの下記（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素からなる群から選ばれる蛋白質の遺伝子発現量を測定し、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを比較し、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量を増加させる物質を、動脈硬化症を改善する有効成分として選択するスクリーニング方法。
（Ａ）オキシダイズド ロー デンシティ リポプロテイン（レクチン−ライク）レセプター１（ＯＬＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：４９７３）
（Ｂ）プロテイン アルギニン メチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１、ＧｅｎｅＩＤ：３２７６）
（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ１（インタースティシャル コラゲナーゼ）（ＭＭＰ１、ＧｅｎｅＩＤ：４３１２）、マトリックスメタロプロテアーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ）（ＭＭＰ３、ＧｅｎｅＩＤ：４３１４）、マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２）（ＭＭＰ１０、ＧｅｎｅＩＤ：４３１９）、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（コラゲナーゼ３）（ＭＭＰ１３、ＧｅｎｅＩＤ：４３２２）
（Ｄ）インターセルラー アドヒージョン モレキュール１（ＣＤ５４）、ヒューマン ライノウイルス レセプター（ＩＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：３３８３）、インターセルラー アドヒージョン モレキュール５、テレンセファリン（ＩＣＡＭ５、ＧｅｎｅＩＤ：７０８７）、バスキュラー セル アドヒージョン モレキュール１（ＶＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）
（Ｅ）コアギュレーション ファクターＩＩＩ（トロンボプラスチン、ティシュー ファクター）（Ｆ３、ＧｅｎｅＩＤ：２１５２）、セルピン ペプチダーゼ インヒビター、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー２（ＳＥＲＰＩＮＥＢ２、ＧｅｎｅＩＤ：５０５５）
（Ｆ）ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ グロース スティミュレーティング アクティビティ、アルファ）（ＣＸＣＬ１、ＧｅｎｅＩＤ：２９１９）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２、ＧｅｎｅＩＤ：２９２０）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３（ＣＸＣＬ３、ＧｅｎｅＩＤ：２９２１）、チューマー ネクローシス ファクター（ＴＮＦ スーパーファミリー、メンバー２）（ＴＮＦ、ＧｅｎｅＩＤ：７１２４）、インターロイキン１、ベータ（ＩＬ１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３５５３）、インターロイキン８（ＩＬ８、ＧｅｎｅＩＤ：３５７６）、コロニー スティミュレーティング ファクター３（グラニュロサイト）（ＣＳＦ３、ＧｅｎｅＩＤ：１４４０）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＣＬ４、ＧｅｎｅＩＤ：６３５１）
（Ｇ）プロスタグランジン−エンドパーオキシド シンターゼ２（プロスタグランジン Ｇ／Ｈ シンターゼ アンド シクロオキシゲナーゼ）（ＰＴＧＳ２、ＧｅｎｅＩＤ：５７４３）
（Ｈ）ジメチルアルギニン ジメチルアミノハイドロラーゼ２（ＤＤＡＨ２、ＧｅｎｅＩＤ：２３５６４）
（Ｉ）パラオキソナーゼ（ＰＯＮ２、ＧｅｎｅＩＤ：５４４５）
［２］．マクロファージが、単球性白血病細胞株にホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）を接触させたものである［１］記載のスクリーニング方法。
［３］．［１］又は［２］記載のスクリーニング方法により得られる、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する上記（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量を増加させる物質を、有効成分として含有する歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分を、簡便かつ正確にスクリーニングでき、歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
まず、歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング方法について説明する。このスクリーニング方法には、歯周病に起因する動脈硬化症のメカニズム解明が必須である。まず、ＬＰＳが動脈硬化症の原因の一つであることを確認した（試験例１参照）。さらに、歯周病に起因する動脈硬化症の原因を追究した。すなわち、歯周病原因菌の内毒素（ＬＰＳ）によるマクロファージへの影響をＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ解析により探索した。
【００１４】
具体的には、マクロファージと歯周病菌の内毒素とを接触させる、つまりマクロファージを歯周病菌の内毒素で刺激すると、酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、細胞接着分子、血液凝固因子、炎症性サイトカイン、生理活性物質の遺伝子発現量の増加が認められ、一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子の遺伝子発現量の減少が認められた（試験例２参照）。なお、ＧｅｎｅＩＤは「ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」での遺伝子ＩＤを表す。
【００１５】
下記、（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体の遺伝子発現量の増加が認められた。
オキシダイズド ロー デンシティ リポプロテイン（レクチン−ライク）レセプター１（ＯＬＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：４９７３）
【００１６】
下記、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子の遺伝子発現量の増加が認められた。
プロテイン アルギニン メチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１、ＧｅｎｅＩＤ：３２７６）
【００１７】
下記、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の遺伝子発現量の増加が認められた。
マトリックスメタロプロテアーゼ１（インタースティシャル コラゲナーゼ）（ＭＭＰ１、ＧｅｎｅＩＤ：４３１２）
マトリックスメタロプロテアーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ）（ＭＭＰ３、ＧｅｎｅＩＤ：４３１４）
マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２）（ＭＭＰ１０、ＧｅｎｅＩＤ：４３１９）
マトリックスメタロプロテアーゼ１３（コラゲナーゼ３）（ＭＭＰ１３、ＧｅｎｅＩＤ：４３２２）
【００１８】
下記、（Ｄ）細胞接着分子の遺伝子発現量の増加が認められた。
インターセルラー アドヒージョン モレキュール１（ＣＤ５４）、ヒューマン ライノウイルス レセプター（ＩＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：３３８３）
インターセルラー アドヒージョン モレキュール５、テレンセファリン（ＩＣＡＭ５、ＧｅｎｅＩＤ：７０８７）
バスキュラー セル アドヒージョン モレキュール１（ＶＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）
【００１９】
下記、（Ｅ）血液凝固因子の遺伝子発現量の増加が認められた。
コアギュレーション ファクターＩＩＩ（トロンボプラスチン、ティシュー ファクター）（Ｆ３、ＧｅｎｅＩＤ：２１５２）、セルピン ペプチダーゼ インヒビター、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー２（ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＧｅｎｅＩＤ：５０５５）
【００２０】
下記、（Ｆ）炎症性サイトカインの遺伝子発現量の増加が認められた。
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ グロース スティミュレーティング アクティビティ、アルファ）（ＣＸＣＬ１、ＧｅｎｅＩＤ：２９１９）
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２、ＧｅｎｅＩＤ：２９２０）
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３（ＣＸＣＬ３、ＧｅｎｅＩＤ：２９２１）
チューマー ネクローシス ファクター（ＴＮＦ スーパーファミリー、メンバー２）（ＴＮＦ、ＧｅｎｅＩＤ：７１２４）
インターロイキン１、ベータ（ＩＬ１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３５５３）
インターロイキン８（ＩＬ８、ＧｅｎｅＩＤ：３５７６）
コロニー スティミュレーティング ファクター３（グラニュロサイト）（ＣＳＦ３、ＧｅｎｅＩＤ：１４４０）
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＣＬ４、ＧｅｎｅＩＤ：６３５１）
【００２１】
下記、（Ｇ）生理活性物質の遺伝子発現量の増加が認められた。
プロスタグランジン−エンドパーオキシド シンターゼ２（プロスタグランジン Ｇ／Ｈ シンターゼ アンド シクロオキシゲナーゼ）（ＰＴＧＳ２、ＧｅｎｅＩＤ：５７４３）
【００２２】
下記、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子の遺伝子発現量の低下が認められた。
ジメチルアルギニン ジメチルアミノハイドロラーゼ２（ＤＤＡＨ２、ＧｅｎｅＩＤ：２３５６４）
【００２３】
下記、（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素の遺伝子発現量の低下が認められた。
パラオキソナーゼ（ＰＯＮ２、ＧｅｎｅＩＤ：５４４５）
【００２４】
したがって、歯周病に起因する動脈硬化症の原因が下記であることを知見した。内毒素によってマクロファージにおける（１）（Ｆ），（Ｇ）炎症性メディエーターである炎症性サイトカインやＰＴＧＳ２が増加することにより、マクロファージの分化前の状態である単球及びマクロファージを血管に集積しやすくなった。（２）（Ｄ）接着分子の発現が亢進し、集積したマクロファージがより血管に接着しやすくなった。（３）（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解作用が低下して酸化ＬＤＬが増加した。（４）さらには、（Ａ）酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みが促進することで、動脈硬化の初期病変である細胞の泡沫化が進展した。（５）（Ｃ）泡沫化した細胞の破壊（プラーク破綻）を起こすＭＭＰの産生が亢進し、血栓生成のリスクが上昇した。（６）（Ｅ）血液凝固系が促進し、プラーク破綻時の血栓生成のリスクが上昇した。（７）（Ｂ）（Ｈ）複合的に抗動脈硬化作用を示すＮＯの合成が阻害され、一方で分解が促進することにより、ＮＯ産生が低下した。
【００２５】
以上の検討結果から、ＬＰＳの不活化剤、又はＬＰＳにより変動したマクロファージの遺伝子発現量を、正常なレベルに戻す物質を用いることにより、歯周病に起因する動脈硬化症を改善することができる。
【００２６】
本発明の歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング方法は、歯周病菌の内毒素の接触により変動する上記（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素の遺伝子発現量を正常なレベルに戻すことを選択基準とし、これらの遺伝子の発現量から歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分をスクリーニングするものである。具体的には、歯周病菌の内毒素及び被験物質で刺激したマクロファージの（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素からなる群から選ばれる蛋白質の遺伝子発現量を測定し、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを測定するものである。より具体的には、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを比較し、歯周病菌の内毒素の刺激によって増加する（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量が減少する物質、又は内毒素の接触により減少する（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量が増加する物質を、前記動脈硬化症を改善する有効成分として選択するスクリーニング方法である。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法にはマクロファージを使用する。動脈硬化症の初期であるプラーク形成にはマクロファージが関与しており、マクロファージが血管内皮細胞に接着し、ＬＤＬを細胞内に取り込んで大きくなり（泡沫化）、プラークを形成する。使用するマクロファージの種類は特に限定されないが、哺乳動物由来の単球性白血病細胞株、哺乳動物由来の末梢血由来単球マクロファージ、哺乳動物由来の腹腔マクロファージ、哺乳動物由来の肺胞マクロファージ、哺乳動物由来の大動脈マクロファージ等が挙げられる（ＴＨＰ−１（ヒト）、Ｕ９３７（ヒト）、Ｊ７７４Ａ．１（マウス）、ＲＡＷ２６４．７（マウス）、ＷＥＨＩ（マウス）、Ｐ３８８Ｄ１（マウス））。この中でも、単球性白血病細胞株、ヒト単球性白血病細胞株（ＴＨＰ−１及びＵ９３７）が好ましい。マクロファージはそのまま用いてもよいが、例えば、単球性白血病細胞株にホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）等を接触させ、分化誘導してもよい。
【００２８】
歯周病菌としては、歯周病原因菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ：以下Ｐ．ｇ．菌と略す場合がある。）、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ：以下Ａ．ａ．菌と略す場合がある。）等が挙げられ、これらから抽出した内毒素（ＬＰＳ）を使用する。
【００２９】
具体的には、マクロファージを培養したものを用いるか、あるいは単球性白血病細胞株を培養し、単球性白血病細胞株とホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）等とを接触させたものを用いる。ＰＭＡの培養液に対する添加濃度は、２０〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、添加後２４〜１２０時間刺激する。その後、培地を交換し、歯周病菌のＬＰＳ及び被験物質を添加し、１〜１０％ＣＯ2、好ましくは５％ＣＯ2、２５〜４０℃、好ましくは３７℃の条件下で０．１〜７２時間、好ましくは０．５〜２４時間培養する。培養液に対する歯周病菌の内毒素（ＬＰＳ）の添加濃度は、０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜１０５μｇ／ｍＬがより好ましい。培地等は、マクロファージに通常用いるものを使用する。被験物質の添加時期は特に限定されず、歯周病菌の内毒素の添加前、添加と同時、添加後のいずれでもよいが、添加と同時が好ましく、被験物質と内毒素を予め３０分程度混合した後に培地に添加する方法がより好ましい。上記試験の他に、対照として、別途被験物質を接触させない（添加しない）以外は同様の条件で培養を行う。
【００３０】
遺伝子発現量の測定には、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた遺伝子発現量の定量法、抗体アレイ、ウエスタンブロッティング等を用いた蛋白質発現量の定量法等を用いることができる。本発明においては、培養後の細胞からＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡから、（Ａ）〜（Ｉ）から選ばれる遺伝子の発現量をＤＮＡマイクロアレイで測定することが好ましい。
【００３１】
この発現量と被験物質を接触させない（添加しない）場合の発現量を比較する。具体的には、マクロファージと歯周病菌の内毒素とを接触させる、つまり歯周病菌の内毒素の刺激により増加する（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、又は（Ｇ）遺伝子の発現量が減少する結果が得られる物質、又は歯周病菌の内毒素の接触（添加）により減少する（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量が増加する結果が得られる物質を、前記動脈硬化症を改善する有効成分として選択する。
【００３２】
この方法により、歯周病に起因する動脈硬化症改善剤を、簡便に高精度でスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法でスクリーニングされる物質は、特に限定されず、例えば、植物抽出物や海藻抽出物、菌由来物質等の天然物、化学合成化合物、遺伝子組み換え産物等が挙げられ、このスクリーニングにより得られた歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供することができる。
【００３３】
また、上記スクリーニング法のためのキットであって、上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）又は（Ｉ）遺伝子を有する、歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング用キットを提供することができる。スクリーニング用キットとしては、遺伝子発現の変化を該遺伝子のｍＲＮＡの発現量で測定するものであって、発現量を測定する遺伝子に対応する核酸又はその断片が支持体のそれぞれ定められた領域に固定化されたＤＮＡアレイ、蛋白発現の変化を該遺伝子から翻訳されたタンパク質の発現量で測定するプロテインアレイ等が挙げられる。
【実施例】
【００３４】
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に制限されるものではない。
【００３５】
［試験例１］
（１）供試動物：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オス、日本エスエルシー、５週齢、体重１８〜２０ｇ）各群、ｎ＝１０で実施した。
投与ＬＰＳ種：主要な歯周病原因菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ：Ｐ．ｇ．菌）から抽出したＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を内毒素として使用した。ＬＰＳの代わりに生理食塩水を投与したものを比較対照とした。ＬＰＳ投与量：血清総コレステロール濃度を測定する際には、ＬＰＳ投与量は３、１０μｇ／匹とした。
【００３６】
動脈硬化指数の算出：ＬＰＳ投与１６時間後に、血液をサンプリングし、血清中のコレステロール濃度及びＨＤＬコレステロール濃度を、コレステロール：Ｅ−テストワコー、ＨＤＬ−コレステロール：Ｅ−テストワコー（いずれも和光純薬工業（株）製）にて測定した。得られた結果から、下記式に基づいて動脈硬化指数を算出した。この動脈硬化指数が高いほど、動脈硬化の危険率が高い。結果を表１に示す。
動脈硬化指数＝（総コレステロール−ＨＤＬコレステロール）／ＨＤＬコレステロール
【００３７】
【表１】
【００３８】
歯周病原因菌のＬＰＳ投与により、生理食塩水投与群と比較して動脈硬化指数が１．７〜２．１倍増加し、ＬＰＳが動脈硬化症の原因の一つであることが分かった。
【００３９】
［試験例２］
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）由来内毒素（ＬＰＳ）のヒト単球性白血病細胞株（ＴＨＰ−１）への影響
（１）方法
２５ｃｍ2の組織培養用フラスコに、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁したヒト単球性白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーターで培養した。細胞がコンフルエントになったところで、３０ｎｇ／ｍＬのホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）で３１時間刺激し、マクロファージへの分化を誘導した。ＰＭＡ処理後、新鮮培地に交換し、１９時間培養後、５％ＦＢＳ及び１μｇ／ｍＬのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ ３３２７７）由来ＬＰＳを含むＲＰＭＩ１６４０に移行し、２，６時間培養した。培養後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にてＲＮＡを抽出し、逆転写酵素にてｃＤＮＡを合成した後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｆｏｃｕｓ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、あるいは定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて遺伝子発現量の解析を行なった。結果を、ＬＰＳ刺激直前（０時間）の細胞を対照とし、ＬＰＳ刺激直前に対する相対値で示す。
（２）結果
ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析結果の中から、動脈硬化に関与する遺伝子のデータを抽出してまとめた。その結果、ＬＰＳで刺激したＴＨＰ−１において、ＬＰＳ無刺激のＴＨＰ−１と比較して遺伝子発現が増加あるいは減少する因子群が存在していた。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
＊ 遺伝子名称の日本語表記は段落［００１１］の記載である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病菌に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング方法、及び動脈硬化症の予防・治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、疫学的な研究結果から、歯周病の罹患率と心臓血管系疾患、糖尿病、肥満、早産、呼吸器疾患等の間で相関関係があることが明らかになり、歯周病が全身健康にも大きな影響を及ぼしうることが指摘されている。
【０００３】
歯周病の患者では、歯周病原因菌やその内毒素（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：以下、ＬＰＳと略す場合がある。）は容易に歯肉を通過し、血中へと入り込み、血流に乗って全身に広がるといわれている。さらに血中に入った歯周病原因菌やその内毒素は、マクロファージ、血管内皮細胞、肥満細胞等を刺激し、炎症性サイトカイン等の炎症性メディエーター産生を促進する。その結果、前述の疾患の原因となることが推察される。
【０００４】
また、歯周病患者では、血液中のコレステロール、中性脂肪等の値が高いことが知られている。血液中のコレステロール、特に低密度リポプロテイン（ＬＤＬ：Ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の増加は、動脈硬化等の原因となることが知られている（非特許文献１，２、特許文献１参照）。
【０００５】
一方、歯周病を治療することにより前述の全身疾患も改善できることが近年示されている。例えば、歯周病患者である妊婦にスケーリング及びルートプレーニングを処置することにより、早産を予防することができるという報告がある（非特許文献３参照）。また、安全かつ有効な量の抗菌剤を口腔に局所適用することにより、身体の健康を増進する方法が提案されている（特許文献１参照）。
【０００６】
しかしながら、スケーリングやルートプレーニングは、歯科医でなければ処置できず、通常の生活の中で実施するのは極めて困難であり簡便な方法ではない。また、抗菌剤による処置により、歯周病菌は駆除されても、歯周病菌が産生したＬＰＳは残存することから、効果的な予防方法とは言い難い。
【０００７】
一方、一般的に動脈硬化症に対して直接有効な薬剤はなく、血清コレステロール低下剤（脂質低下剤）あるいは血小板凝集抑制剤（抗血栓剤）を投与して、間接的に動脈硬化の危険因子を取り除く療法のみであった。しかしながら、歯周病に伴って生じる動脈硬化症の原因は未解明な部分が多い。従って、上述したような脂質低下剤や抗血栓剤によって、歯周病に伴って生じる動脈硬化症を改善できるか否かは不明である。
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５１７０３８号公報
【非特許文献１】「Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．」、２００２年５月、７３（５）、ｐ４９４−５００
【非特許文献２】「Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．」、２００３年７月、７４（７）、ｐ１００７−１６
【非特許文献３】「Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．」、２００３年８月、７４（８）、ｐ１２１４−１２１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、歯周病に起因する動脈硬化症の詳細なメカニズムは不明であり、歯周病に起因する動脈硬化症の改善に有効な成分を特定することが困難であった。本発明は上記事情に鑑みなされたもので、歯周病に起因する動脈硬化症の詳細なメカニズムを明らかにし、歯周病菌に起因する動脈硬化症を改善する有効成分を、簡便かつ高精度にスクリーニングする方法、歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記目的を達成するため、歯周病に起因する動脈硬化症のメカニズムの解明の研究を進めてきた。その結果、マクロファージを歯周病原因菌の内毒素（ＬＰＳ）で刺激すると、ＬＰＳ無刺激の単球性白血病細胞株と比較して、遺伝子発現が増加あるいは減少する因子群が存在することを知見し、歯周病に起因する動脈硬化症のメカニズムの一つが、これらの遺伝子発現が増加又は減少するによるものであることを知見した。これを利用して歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分を、簡便かつ高精度にスクリーニングでき、このスクリーニング方法を用いて、歯周病に起因する動脈硬化症を予防・改善する有効成分が得られることを知見し、本発明をなすに至ったものである。
【００１１】
従って、本発明は下記スクリーニング方法及び歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供する。
［１］．歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング法であって、マクロファージに歯周病菌の内毒素及び被験物質を接触させ、このマクロファージの下記（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素からなる群から選ばれる蛋白質の遺伝子発現量を測定し、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを比較し、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量を増加させる物質を、動脈硬化症を改善する有効成分として選択するスクリーニング方法。
（Ａ）オキシダイズド ロー デンシティ リポプロテイン（レクチン−ライク）レセプター１（ＯＬＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：４９７３）
（Ｂ）プロテイン アルギニン メチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１、ＧｅｎｅＩＤ：３２７６）
（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ１（インタースティシャル コラゲナーゼ）（ＭＭＰ１、ＧｅｎｅＩＤ：４３１２）、マトリックスメタロプロテアーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ）（ＭＭＰ３、ＧｅｎｅＩＤ：４３１４）、マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２）（ＭＭＰ１０、ＧｅｎｅＩＤ：４３１９）、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（コラゲナーゼ３）（ＭＭＰ１３、ＧｅｎｅＩＤ：４３２２）
（Ｄ）インターセルラー アドヒージョン モレキュール１（ＣＤ５４）、ヒューマン ライノウイルス レセプター（ＩＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：３３８３）、インターセルラー アドヒージョン モレキュール５、テレンセファリン（ＩＣＡＭ５、ＧｅｎｅＩＤ：７０８７）、バスキュラー セル アドヒージョン モレキュール１（ＶＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）
（Ｅ）コアギュレーション ファクターＩＩＩ（トロンボプラスチン、ティシュー ファクター）（Ｆ３、ＧｅｎｅＩＤ：２１５２）、セルピン ペプチダーゼ インヒビター、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー２（ＳＥＲＰＩＮＥＢ２、ＧｅｎｅＩＤ：５０５５）
（Ｆ）ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ グロース スティミュレーティング アクティビティ、アルファ）（ＣＸＣＬ１、ＧｅｎｅＩＤ：２９１９）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２、ＧｅｎｅＩＤ：２９２０）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３（ＣＸＣＬ３、ＧｅｎｅＩＤ：２９２１）、チューマー ネクローシス ファクター（ＴＮＦ スーパーファミリー、メンバー２）（ＴＮＦ、ＧｅｎｅＩＤ：７１２４）、インターロイキン１、ベータ（ＩＬ１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３５５３）、インターロイキン８（ＩＬ８、ＧｅｎｅＩＤ：３５７６）、コロニー スティミュレーティング ファクター３（グラニュロサイト）（ＣＳＦ３、ＧｅｎｅＩＤ：１４４０）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＣＬ４、ＧｅｎｅＩＤ：６３５１）
（Ｇ）プロスタグランジン−エンドパーオキシド シンターゼ２（プロスタグランジン Ｇ／Ｈ シンターゼ アンド シクロオキシゲナーゼ）（ＰＴＧＳ２、ＧｅｎｅＩＤ：５７４３）
（Ｈ）ジメチルアルギニン ジメチルアミノハイドロラーゼ２（ＤＤＡＨ２、ＧｅｎｅＩＤ：２３５６４）
（Ｉ）パラオキソナーゼ（ＰＯＮ２、ＧｅｎｅＩＤ：５４４５）
［２］．マクロファージが、単球性白血病細胞株にホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）を接触させたものである［１］記載のスクリーニング方法。
［３］．［１］又は［２］記載のスクリーニング方法により得られる、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する上記（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量を増加させる物質を、有効成分として含有する歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分を、簡便かつ正確にスクリーニングでき、歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
まず、歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング方法について説明する。このスクリーニング方法には、歯周病に起因する動脈硬化症のメカニズム解明が必須である。まず、ＬＰＳが動脈硬化症の原因の一つであることを確認した（試験例１参照）。さらに、歯周病に起因する動脈硬化症の原因を追究した。すなわち、歯周病原因菌の内毒素（ＬＰＳ）によるマクロファージへの影響をＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ解析により探索した。
【００１４】
具体的には、マクロファージと歯周病菌の内毒素とを接触させる、つまりマクロファージを歯周病菌の内毒素で刺激すると、酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、細胞接着分子、血液凝固因子、炎症性サイトカイン、生理活性物質の遺伝子発現量の増加が認められ、一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子の遺伝子発現量の減少が認められた（試験例２参照）。なお、ＧｅｎｅＩＤは「ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ」での遺伝子ＩＤを表す。
【００１５】
下記、（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体の遺伝子発現量の増加が認められた。
オキシダイズド ロー デンシティ リポプロテイン（レクチン−ライク）レセプター１（ＯＬＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：４９７３）
【００１６】
下記、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子の遺伝子発現量の増加が認められた。
プロテイン アルギニン メチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１、ＧｅｎｅＩＤ：３２７６）
【００１７】
下記、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の遺伝子発現量の増加が認められた。
マトリックスメタロプロテアーゼ１（インタースティシャル コラゲナーゼ）（ＭＭＰ１、ＧｅｎｅＩＤ：４３１２）
マトリックスメタロプロテアーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ）（ＭＭＰ３、ＧｅｎｅＩＤ：４３１４）
マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２）（ＭＭＰ１０、ＧｅｎｅＩＤ：４３１９）
マトリックスメタロプロテアーゼ１３（コラゲナーゼ３）（ＭＭＰ１３、ＧｅｎｅＩＤ：４３２２）
【００１８】
下記、（Ｄ）細胞接着分子の遺伝子発現量の増加が認められた。
インターセルラー アドヒージョン モレキュール１（ＣＤ５４）、ヒューマン ライノウイルス レセプター（ＩＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：３３８３）
インターセルラー アドヒージョン モレキュール５、テレンセファリン（ＩＣＡＭ５、ＧｅｎｅＩＤ：７０８７）
バスキュラー セル アドヒージョン モレキュール１（ＶＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）
【００１９】
下記、（Ｅ）血液凝固因子の遺伝子発現量の増加が認められた。
コアギュレーション ファクターＩＩＩ（トロンボプラスチン、ティシュー ファクター）（Ｆ３、ＧｅｎｅＩＤ：２１５２）、セルピン ペプチダーゼ インヒビター、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー２（ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＧｅｎｅＩＤ：５０５５）
【００２０】
下記、（Ｆ）炎症性サイトカインの遺伝子発現量の増加が認められた。
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ グロース スティミュレーティング アクティビティ、アルファ）（ＣＸＣＬ１、ＧｅｎｅＩＤ：２９１９）
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２、ＧｅｎｅＩＤ：２９２０）
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３（ＣＸＣＬ３、ＧｅｎｅＩＤ：２９２１）
チューマー ネクローシス ファクター（ＴＮＦ スーパーファミリー、メンバー２）（ＴＮＦ、ＧｅｎｅＩＤ：７１２４）
インターロイキン１、ベータ（ＩＬ１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３５５３）
インターロイキン８（ＩＬ８、ＧｅｎｅＩＤ：３５７６）
コロニー スティミュレーティング ファクター３（グラニュロサイト）（ＣＳＦ３、ＧｅｎｅＩＤ：１４４０）
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＣＬ４、ＧｅｎｅＩＤ：６３５１）
【００２１】
下記、（Ｇ）生理活性物質の遺伝子発現量の増加が認められた。
プロスタグランジン−エンドパーオキシド シンターゼ２（プロスタグランジン Ｇ／Ｈ シンターゼ アンド シクロオキシゲナーゼ）（ＰＴＧＳ２、ＧｅｎｅＩＤ：５７４３）
【００２２】
下記、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子の遺伝子発現量の低下が認められた。
ジメチルアルギニン ジメチルアミノハイドロラーゼ２（ＤＤＡＨ２、ＧｅｎｅＩＤ：２３５６４）
【００２３】
下記、（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素の遺伝子発現量の低下が認められた。
パラオキソナーゼ（ＰＯＮ２、ＧｅｎｅＩＤ：５４４５）
【００２４】
したがって、歯周病に起因する動脈硬化症の原因が下記であることを知見した。内毒素によってマクロファージにおける（１）（Ｆ），（Ｇ）炎症性メディエーターである炎症性サイトカインやＰＴＧＳ２が増加することにより、マクロファージの分化前の状態である単球及びマクロファージを血管に集積しやすくなった。（２）（Ｄ）接着分子の発現が亢進し、集積したマクロファージがより血管に接着しやすくなった。（３）（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解作用が低下して酸化ＬＤＬが増加した。（４）さらには、（Ａ）酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みが促進することで、動脈硬化の初期病変である細胞の泡沫化が進展した。（５）（Ｃ）泡沫化した細胞の破壊（プラーク破綻）を起こすＭＭＰの産生が亢進し、血栓生成のリスクが上昇した。（６）（Ｅ）血液凝固系が促進し、プラーク破綻時の血栓生成のリスクが上昇した。（７）（Ｂ）（Ｈ）複合的に抗動脈硬化作用を示すＮＯの合成が阻害され、一方で分解が促進することにより、ＮＯ産生が低下した。
【００２５】
以上の検討結果から、ＬＰＳの不活化剤、又はＬＰＳにより変動したマクロファージの遺伝子発現量を、正常なレベルに戻す物質を用いることにより、歯周病に起因する動脈硬化症を改善することができる。
【００２６】
本発明の歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング方法は、歯周病菌の内毒素の接触により変動する上記（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素の遺伝子発現量を正常なレベルに戻すことを選択基準とし、これらの遺伝子の発現量から歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分をスクリーニングするものである。具体的には、歯周病菌の内毒素及び被験物質で刺激したマクロファージの（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素からなる群から選ばれる蛋白質の遺伝子発現量を測定し、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを測定するものである。より具体的には、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを比較し、歯周病菌の内毒素の刺激によって増加する（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量が減少する物質、又は内毒素の接触により減少する（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量が増加する物質を、前記動脈硬化症を改善する有効成分として選択するスクリーニング方法である。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法にはマクロファージを使用する。動脈硬化症の初期であるプラーク形成にはマクロファージが関与しており、マクロファージが血管内皮細胞に接着し、ＬＤＬを細胞内に取り込んで大きくなり（泡沫化）、プラークを形成する。使用するマクロファージの種類は特に限定されないが、哺乳動物由来の単球性白血病細胞株、哺乳動物由来の末梢血由来単球マクロファージ、哺乳動物由来の腹腔マクロファージ、哺乳動物由来の肺胞マクロファージ、哺乳動物由来の大動脈マクロファージ等が挙げられる（ＴＨＰ−１（ヒト）、Ｕ９３７（ヒト）、Ｊ７７４Ａ．１（マウス）、ＲＡＷ２６４．７（マウス）、ＷＥＨＩ（マウス）、Ｐ３８８Ｄ１（マウス））。この中でも、単球性白血病細胞株、ヒト単球性白血病細胞株（ＴＨＰ−１及びＵ９３７）が好ましい。マクロファージはそのまま用いてもよいが、例えば、単球性白血病細胞株にホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）等を接触させ、分化誘導してもよい。
【００２８】
歯周病菌としては、歯周病原因菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ：以下Ｐ．ｇ．菌と略す場合がある。）、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ：以下Ａ．ａ．菌と略す場合がある。）等が挙げられ、これらから抽出した内毒素（ＬＰＳ）を使用する。
【００２９】
具体的には、マクロファージを培養したものを用いるか、あるいは単球性白血病細胞株を培養し、単球性白血病細胞株とホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）等とを接触させたものを用いる。ＰＭＡの培養液に対する添加濃度は、２０〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、添加後２４〜１２０時間刺激する。その後、培地を交換し、歯周病菌のＬＰＳ及び被験物質を添加し、１〜１０％ＣＯ2、好ましくは５％ＣＯ2、２５〜４０℃、好ましくは３７℃の条件下で０．１〜７２時間、好ましくは０．５〜２４時間培養する。培養液に対する歯周病菌の内毒素（ＬＰＳ）の添加濃度は、０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜１０５μｇ／ｍＬがより好ましい。培地等は、マクロファージに通常用いるものを使用する。被験物質の添加時期は特に限定されず、歯周病菌の内毒素の添加前、添加と同時、添加後のいずれでもよいが、添加と同時が好ましく、被験物質と内毒素を予め３０分程度混合した後に培地に添加する方法がより好ましい。上記試験の他に、対照として、別途被験物質を接触させない（添加しない）以外は同様の条件で培養を行う。
【００３０】
遺伝子発現量の測定には、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた遺伝子発現量の定量法、抗体アレイ、ウエスタンブロッティング等を用いた蛋白質発現量の定量法等を用いることができる。本発明においては、培養後の細胞からＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡから、（Ａ）〜（Ｉ）から選ばれる遺伝子の発現量をＤＮＡマイクロアレイで測定することが好ましい。
【００３１】
この発現量と被験物質を接触させない（添加しない）場合の発現量を比較する。具体的には、マクロファージと歯周病菌の内毒素とを接触させる、つまり歯周病菌の内毒素の刺激により増加する（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、又は（Ｇ）遺伝子の発現量が減少する結果が得られる物質、又は歯周病菌の内毒素の接触（添加）により減少する（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量が増加する結果が得られる物質を、前記動脈硬化症を改善する有効成分として選択する。
【００３２】
この方法により、歯周病に起因する動脈硬化症改善剤を、簡便に高精度でスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法でスクリーニングされる物質は、特に限定されず、例えば、植物抽出物や海藻抽出物、菌由来物質等の天然物、化学合成化合物、遺伝子組み換え産物等が挙げられ、このスクリーニングにより得られた歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤を提供することができる。
【００３３】
また、上記スクリーニング法のためのキットであって、上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）又は（Ｉ）遺伝子を有する、歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング用キットを提供することができる。スクリーニング用キットとしては、遺伝子発現の変化を該遺伝子のｍＲＮＡの発現量で測定するものであって、発現量を測定する遺伝子に対応する核酸又はその断片が支持体のそれぞれ定められた領域に固定化されたＤＮＡアレイ、蛋白発現の変化を該遺伝子から翻訳されたタンパク質の発現量で測定するプロテインアレイ等が挙げられる。
【実施例】
【００３４】
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に制限されるものではない。
【００３５】
［試験例１］
（１）供試動物：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オス、日本エスエルシー、５週齢、体重１８〜２０ｇ）各群、ｎ＝１０で実施した。
投与ＬＰＳ種：主要な歯周病原因菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ：Ｐ．ｇ．菌）から抽出したＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を内毒素として使用した。ＬＰＳの代わりに生理食塩水を投与したものを比較対照とした。ＬＰＳ投与量：血清総コレステロール濃度を測定する際には、ＬＰＳ投与量は３、１０μｇ／匹とした。
【００３６】
動脈硬化指数の算出：ＬＰＳ投与１６時間後に、血液をサンプリングし、血清中のコレステロール濃度及びＨＤＬコレステロール濃度を、コレステロール：Ｅ−テストワコー、ＨＤＬ−コレステロール：Ｅ−テストワコー（いずれも和光純薬工業（株）製）にて測定した。得られた結果から、下記式に基づいて動脈硬化指数を算出した。この動脈硬化指数が高いほど、動脈硬化の危険率が高い。結果を表１に示す。
動脈硬化指数＝（総コレステロール−ＨＤＬコレステロール）／ＨＤＬコレステロール
【００３７】
【表１】
【００３８】
歯周病原因菌のＬＰＳ投与により、生理食塩水投与群と比較して動脈硬化指数が１．７〜２．１倍増加し、ＬＰＳが動脈硬化症の原因の一つであることが分かった。
【００３９】
［試験例２］
ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）由来内毒素（ＬＰＳ）のヒト単球性白血病細胞株（ＴＨＰ−１）への影響
（１）方法
２５ｃｍ2の組織培養用フラスコに、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁したヒト単球性白血病細胞株（ＴＨＰ−１）を播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーターで培養した。細胞がコンフルエントになったところで、３０ｎｇ／ｍＬのホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）で３１時間刺激し、マクロファージへの分化を誘導した。ＰＭＡ処理後、新鮮培地に交換し、１９時間培養後、５％ＦＢＳ及び１μｇ／ｍＬのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＡＴＣＣ ３３２７７）由来ＬＰＳを含むＲＰＭＩ１６４０に移行し、２，６時間培養した。培養後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にてＲＮＡを抽出し、逆転写酵素にてｃＤＮＡを合成した後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｆｏｃｕｓ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、あるいは定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて遺伝子発現量の解析を行なった。結果を、ＬＰＳ刺激直前（０時間）の細胞を対照とし、ＬＰＳ刺激直前に対する相対値で示す。
（２）結果
ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析結果の中から、動脈硬化に関与する遺伝子のデータを抽出してまとめた。その結果、ＬＰＳで刺激したＴＨＰ−１において、ＬＰＳ無刺激のＴＨＰ−１と比較して遺伝子発現が増加あるいは減少する因子群が存在していた。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
＊ 遺伝子名称の日本語表記は段落［００１１］の記載である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング法であって、マクロファージに歯周病菌の内毒素及び被験物質を接触させ、このマクロファージの下記（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素からなる群から選ばれる蛋白質の遺伝子発現量を測定し、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを比較し、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量を増加させる物質を、動脈硬化症を改善する有効成分として選択するスクリーニング方法。
（Ａ）オキシダイズド ロー デンシティ リポプロテイン（レクチン−ライク）レセプター１（ＯＬＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：４９７３）
（Ｂ）プロテイン アルギニン メチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１、ＧｅｎｅＩＤ：３２７６）
（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ１（インタースティシャル コラゲナーゼ）（ＭＭＰ１、ＧｅｎｅＩＤ：４３１２）、マトリックスメタロプロテアーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ）（ＭＭＰ３、ＧｅｎｅＩＤ：４３１４）、マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２）（ＭＭＰ１０、ＧｅｎｅＩＤ：４３１９）、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（コラゲナーゼ３）（ＭＭＰ１３、ＧｅｎｅＩＤ：４３２２）
（Ｄ）インターセルラー アドヒージョン モレキュール１（ＣＤ５４）、ヒューマン ライノウイルス レセプター（ＩＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：３３８３）、インターセルラー アドヒージョン モレキュール５、テレンセファリン（ＩＣＡＭ５、ＧｅｎｅＩＤ：７０８７）、バスキュラー セル アドヒージョン モレキュール１（ＶＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）
（Ｅ）コアギュレーション ファクターＩＩＩ（トロンボプラスチン、ティシュー ファクター）（Ｆ３、ＧｅｎｅＩＤ：２１５２）、セルピン ペプチダーゼ インヒビター、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー２（ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＧｅｎｅＩＤ：５０５５）
（Ｆ）ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ グロース スティミュレーティング アクティビティ、アルファ）（ＣＸＣＬ１、ＧｅｎｅＩＤ：２９１９）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２、ＧｅｎｅＩＤ：２９２０）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３（ＣＸＣＬ３、ＧｅｎｅＩＤ：２９２１）、チューマー ネクローシス ファクター（ＴＮＦ スーパーファミリー、メンバー２）（ＴＮＦ、ＧｅｎｅＩＤ：７１２４）、インターロイキン１、ベータ（ＩＬ１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３５５３）、インターロイキン８（ＩＬ８、ＧｅｎｅＩＤ：３５７６）、コロニー スティミュレーティング ファクター３（グラニュロサイト）（ＣＳＦ３、ＧｅｎｅＩＤ：１４４０）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＣＬ４、ＧｅｎｅＩＤ：６３５１）
（Ｇ）プロスタグランジン−エンドパーオキシド シンターゼ２（プロスタグランジン Ｇ／Ｈ シンターゼ アンド シクロオキシゲナーゼ）（ＰＴＧＳ２、ＧｅｎｅＩＤ：５７４３）
（Ｈ）ジメチルアルギニン ジメチルアミノハイドロラーゼ２（ＤＤＡＨ２、ＧｅｎｅＩＤ：２３５６４）
（Ｉ）パラオキソナーゼ（ＰＯＮ２、ＧｅｎｅＩＤ：５４４５）
【請求項２】
マクロファージが、単球性白血病細胞株にホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）を接触させたものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のスクリーニング方法により得られる、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する上記（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量を増加させる物質を、有効成分として含有する歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤。
【請求項１】
歯周病に起因する動脈硬化症を改善する有効成分のスクリーニング法であって、マクロファージに歯周病菌の内毒素及び被験物質を接触させ、このマクロファージの下記（Ａ）酸化低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、（Ｂ）一酸化窒素（ＮＯ）合成阻害因子、（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（Ｄ）細胞接着分子、（Ｅ）血液凝固因子、（Ｆ）炎症性サイトカイン、（Ｇ）生理活性物質、（Ｈ）一酸化窒素（ＮＯ）合成促進因子及び（Ｉ）酸化ＬＤＬ分解酵素からなる群から選ばれる蛋白質の遺伝子発現量を測定し、この発現量と被験物質を接触させない場合の発現量とを比較し、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量を増加させる物質を、動脈硬化症を改善する有効成分として選択するスクリーニング方法。
（Ａ）オキシダイズド ロー デンシティ リポプロテイン（レクチン−ライク）レセプター１（ＯＬＲ１、ＧｅｎｅＩＤ：４９７３）
（Ｂ）プロテイン アルギニン メチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１、ＧｅｎｅＩＤ：３２７６）
（Ｃ）マトリックスメタロプロテアーゼ１（インタースティシャル コラゲナーゼ）（ＭＭＰ１、ＧｅｎｅＩＤ：４３１２）、マトリックスメタロプロテアーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ）（ＭＭＰ３、ＧｅｎｅＩＤ：４３１４）、マトリックスメタロプロテアーゼ１０（ストロメライシン２）（ＭＭＰ１０、ＧｅｎｅＩＤ：４３１９）、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（コラゲナーゼ３）（ＭＭＰ１３、ＧｅｎｅＩＤ：４３２２）
（Ｄ）インターセルラー アドヒージョン モレキュール１（ＣＤ５４）、ヒューマン ライノウイルス レセプター（ＩＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：３３８３）、インターセルラー アドヒージョン モレキュール５、テレンセファリン（ＩＣＡＭ５、ＧｅｎｅＩＤ：７０８７）、バスキュラー セル アドヒージョン モレキュール１（ＶＣＡＭ１、ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）
（Ｅ）コアギュレーション ファクターＩＩＩ（トロンボプラスチン、ティシュー ファクター）（Ｆ３、ＧｅｎｅＩＤ：２１５２）、セルピン ペプチダーゼ インヒビター、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー２（ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＧｅｎｅＩＤ：５０５５）
（Ｆ）ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（メラノーマ グロース スティミュレーティング アクティビティ、アルファ）（ＣＸＣＬ１、ＧｅｎｅＩＤ：２９１９）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２、ＧｅｎｅＩＤ：２９２０）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３（ＣＸＣＬ３、ＧｅｎｅＩＤ：２９２１）、チューマー ネクローシス ファクター（ＴＮＦ スーパーファミリー、メンバー２）（ＴＮＦ、ＧｅｎｅＩＤ：７１２４）、インターロイキン１、ベータ（ＩＬ１Ｂ、ＧｅｎｅＩＤ：３５５３）、インターロイキン８（ＩＬ８、ＧｅｎｅＩＤ：３５７６）、コロニー スティミュレーティング ファクター３（グラニュロサイト）（ＣＳＦ３、ＧｅｎｅＩＤ：１４４０）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＣＬ４、ＧｅｎｅＩＤ：６３５１）
（Ｇ）プロスタグランジン−エンドパーオキシド シンターゼ２（プロスタグランジン Ｇ／Ｈ シンターゼ アンド シクロオキシゲナーゼ）（ＰＴＧＳ２、ＧｅｎｅＩＤ：５７４３）
（Ｈ）ジメチルアルギニン ジメチルアミノハイドロラーゼ２（ＤＤＡＨ２、ＧｅｎｅＩＤ：２３５６４）
（Ｉ）パラオキソナーゼ（ＰＯＮ２、ＧｅｎｅＩＤ：５４４５）
【請求項２】
マクロファージが、単球性白血病細胞株にホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）を接触させたものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のスクリーニング方法により得られる、歯周病菌の内毒素の接触によって増加する上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、もしくは（Ｇ）遺伝子の発現量を減少させる物質、又は内毒素の接触により減少する上記（Ｈ）もしくは（Ｉ）遺伝子の発現量を増加させる物質を、有効成分として含有する歯周病に起因する動脈硬化症の予防・治療剤。
【公開番号】特開２００９−２８６７３６（Ｐ２００９−２８６７３６Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４１７９３（Ｐ２００８−１４１７９３）
【出願日】平成２０年５月３０日（２００８．５．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年５月（５月１６日以降） ｈｔｔｐ：／／ｉａｄｒ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ｉａｄｒ／２００８Ｔｏｒｏｎｔｏ／ｔｅｃｈｐｒｏｇｒａｍ／ａｂｓｔｒａｃｔ＿１０７３０６．ｈｔｍを通じて発表
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月３０日（２００８．５．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年５月（５月１６日以降） ｈｔｔｐ：／／ｉａｄｒ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ｉａｄｒ／２００８Ｔｏｒｏｎｔｏ／ｔｅｃｈｐｒｏｇｒａｍ／ａｂｓｔｒａｃｔ＿１０７３０６．ｈｔｍを通じて発表
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
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