化合物および病気に関連する遺伝子の特異的かつ同時阻害のための化合物の使用、および関連薬物
式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは、病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時にかつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；
ＣはトポイソメラーゼＩポイズンである］
の化合物の、遺伝子の発現によってもたらさせる病気の治療用の医薬品の調製のための使用であって、前記遺伝子は安定化されたトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂によって阻害される、使用である。
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは、病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時にかつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；
ＣはトポイソメラーゼＩポイズンである］
の化合物の、遺伝子の発現によってもたらさせる病気の治療用の医薬品の調製のための使用であって、前記遺伝子は安定化されたトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂によって阻害される、使用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生成物、それらの調製工程、それらの使用方法、およびいくつかの遺伝子に対する不可逆的病巣を誘導することによって病理学に関与するこれらの遺伝子の発現を同時に阻害することを可能とするそれを含む組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、選択された配列を選択的に標的化し、与えられた病理学につき関係のある幾つかの遺伝子によって共有された共通する配列を同時に阻害する方法および生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
三重ラセン形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、ある種の遺伝子の発現に特異的に干渉することを目的として、Ｍｕｓeｕｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄ’Ｈｉｓｔｏｉｒｅ Ｎａｔｕｒｅｌｌｅ ＵＳＭ ０５０３ Ｕｎｉｔ ＩＮＳＥＲＭ ＵＲ５６５、ＣＮＲＳ ＵＭＲ ５１５３の生物物理研究所で開発された。これらのＴＦＯは他の適用、例えば、プラスミドの精製または標的配列の化学的修飾で用いられてきた。１９９７年に、インビトロ研究は、カンプトテシンの誘導体、トポイソメラーゼＩ阻害剤または、より正確には、ポイズンの、三重ラセン形成性オリゴヌクレオチドへの化学的カップリングは、トポイソメラーゼＩによるＤＮＡの切断を、三重ラセンオリゴヌクレオチドによって標的化されたオリゴピリミジン−オリゴプリン配列に特異的に向けることを示した（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Sｏｃ．１１９（１９９７）ｐｐ６９３９−６９４０）。
【０００３】
本発明者らの刊行物、特に本発明者らの公表において既に記載されているように（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．１９９９，２０００，２００１ａ，ｂ，２００２）、特異的ＤＮＡリガンドにカップリングしたトポイソメラーゼＩ阻害剤は、ＤＮＡリガンドの結合部位に対して特異的となる。本発明との関係では、前記ＤＮＡリガンドに共有結合した生成物トポイソメラーゼＩポイズンは以後複合体ともいう。このアプローチは、その作用メカニズムが腫瘍状態に関与する単一遺伝子の選択的変調に基づく抗腫瘍剤の開発を可能とする（図１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
カンプトテシン（略してＣＰＴ）の２つの誘導体のようなある種のトポイソメラーゼＩ阻害剤が臨床的実践で用いられているが、恐らくは、その低い配列特異性に関係してかなりの毒性レベルを有する。
【０００５】
抗腫瘍薬物の選択性の問題もまた、抗生物質のような他のタイプの化学療法薬物に存在する。
【０００６】
薬物の標的化は現代の療法において一般的問題としてとらえることができ、それは、代謝異常および自己免疫疾患も含む。
【０００７】
今回、リンカーアームによって結合された、トポイソメラーゼＩポイズンおよびＤＮＡ配列−特異的リガンドを含む特異的複合体が、その発現が病気、特に腫瘍または感染症に関連する、注目すべき遺伝子に対して、トポイソメラーゼＩポイズンの作用を特異的に向けることができることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
先行技術で言及された問題および欠点は本発明によって解決され、本発明の主な主題は以下の通りである。
【０００９】
まず、本発明は、式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、Ａは病理学的に注目される遺伝子に共通した配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；ＣはトポイソメラーゼＩポイズンである］の化合物の、遺伝子の発現によってもたられる病気の治療の医薬品の調製のための使用であって、前記遺伝子が安定化されたトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂によって阻害される使用に関する。
【００１０】
本発明の開発においては、本発明者らは、本発明の特定の目的である式Ａ−Ｂ−Ｃの新しい化合物も見出した。
【００１１】
本発明は、前記化合物の調製工程、それらを含む組成物、新しい薬物の開発において、および薬理学的テストにおいて前記化合物を用いる方法にも関する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、特に腫瘍の発生および維持に関与する病理学的に注目されるタンパク質、またはウイルスおよび病原体タンパク質、または代謝異常または自己免疫タンパク質に関与するタンパク質につきコードするいくつかの標的遺伝子の発現を同時に阻害する方法であって、
（ｉ）少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤において前記複合体による前記遺伝子に特異的な部位に向けられる少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤の作用を、前記標的遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列−特異的リガンドに向け、
（ｉｉ）ゲノム中の前記遺伝子を前記複合体の前記リガンドによって認識し、前記リガンドの前記標的への結合を得、
（ｉｉｉ）トポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を誘導し、前記遺伝子の発現を阻害する；
工程を含む前記方法である。
【００１３】
本発明によると、この方法は特にインビトロおよびインビボで行うことができる。
【００１４】
前記構成を用いることによって、トポイソメラーゼＩ阻害剤（類）の効果をＤＮＡ−特異的部位に向け、トポイソメラーゼＩによるこれらの部位における破壊を選択的に誘導することが可能である。ＤＮＡ−特異的リガンドにカップリングした阻害剤（類）は、ＤＮＡリガンド固定部位に対してそれら自体が特異的となる。有利には、標的化されたＤＮＡ配列は、病理学の種類に依存して選択することができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態によると、前記遺伝子は、その発現が細胞の腫瘍状態の発生および維持を制御するものから選択される。特に好ましい実施形態において、遺伝子はＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＶＥＧＦ、ＢＣＬ２からなる群より選択される。
【００１６】
本発明のもう１つの好ましい実施形態によると、前記遺伝子は、感染性微生物またはウイルスの中から選択される。特に好ましい実施形態において、遺伝子はＨＩＶまたはＨＣＶウイルスからなる群より選択される病原体のものである。
【００１７】
本発明のなおさらに好ましい実施形態によると、前記遺伝子は代謝異常病に関与するものから選択される。
【００１８】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態によると、前記遺伝子は自己免疫疾患に関与するものから選択される。
【００１９】
本発明によると、トポイソメラーゼＩ阻害剤、またはより正確にはポイズンは、トポイソメラーゼＩの触媒作用によって媒介されるＤＮＡ／トポＩ開裂複合体を安定化する分子である。前記ポイズンは、有利には、インドロカルバゾールおよびその誘導体のような挿入剤、カンプトテシンおよびその誘導体のような非挿入剤、ベンズイミダゾールおよびその誘導体のような副溝リガンドからなる群より選択される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によると、前記ポイズンはカンプトテシン、より好ましくはカンプトテシン誘導体である。
【００２１】
好ましいカンプトテシン誘導体は式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1は−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）n−Ｒ4基であり、ｎは数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルまたはＣ2−Ｃ8アルケニル基、またはＣ3−Ｃ10シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、またはＣ6−Ｃ14アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、ケト、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖または分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、フェニルであり；あるいはＲ4は、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ6−Ｃ10）アリールまたは（Ｃ6−Ｃ10）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルであり；あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基、特に、−（ＣＨ2）m−ＮＲ12−（ＣＨ2）p−ＮＲ13−（ＣＨ2）q−ＮＨ2であり、ｍおよびｐは２〜６の整数であり、ｑは０〜６の整数であり、両端は含まれ、Ｒ12およびＲ13は直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル基、例えば、Ｎ−（４−アミノブチル）−２−アミノエチル、Ｎ−（３−アミノプロピル）−４−アミノブチル、Ｎ−［Ｎ−３−アミノプロピル）−Ｎ−（４−アミノブチル）］−３−アミノプロピルであり；あるいはＲ4はグリコシル残基、例えば、６−Ｄ−ガラクトシルまたは６−Ｄ−グルコシルであり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、Ｃ6−Ｃ14アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖または分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシである］の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩である。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物の好ましい例は、ｎが１であり、Ｒ4が２−アミノエチルまたは３−アミノプロピルであり、Ｒ2およびＲ3が水素である化合物である（これらの化合物は、各々、本明細書中ではＳＴ１５７８およびＳＴ２５４１ともいう）。
【００２３】
これらの化合物は、ＷＯ ００／５３６０７に十分に開示されており、技量のあるリーザーはそれを参照する。
【００２４】
もう１つの好ましいカンプトテシン誘導体は式（ＩＩ）：
［式中、Ａは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ3−Ｃ10シクロアルキル−Ｃ1−Ｃ8アルキルであり；ｎおよびｍが１に等しい場合、ＹはＮＲ12Ｒ13またはＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14で置換された飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルであり、同一または異なっていてもよいＲ12、Ｒ13およびＲ14は水素もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ4アルキルであり、あるいはＹはＢＣＯＯＸであり、Ｂはアミノ酸の残基であり、ＸはＨ、利用可能な位置でＣ1−Ｃ4アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキルから選択される少なくとも１つの基で置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ4アルキル、ベンジルまたはフェニルであり、あるいはもしｎおよびｍが共に０であるならば；Ｙは内部塩の形態、および医薬上許容される酸のアニオンとの塩の形態の双方である４−トリメチルアンモニウム−３−ヒドロキシブタノイルであり、あるいはＹは上記定義されたＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14であり；Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）p−Ｒ4基であり、ｐは数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルまたはＣ2−Ｃ8アルケニル基、またはＣ3−Ｃ10シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、またはＣ6−Ｃ14アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリール−アルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、ここで同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ6−Ｃ10）アリールまたは（Ｃ6−Ｃ10）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルであり；あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいはＲ4はグリコシル残基であり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、Ｃ6−Ｃ14アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシである］の化合物、Ｎ1−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩である。
【００２５】
式（ＩＩ）の化合物の好ましい例は、ｐが１であり、Ｒ4がｔｅｒｔ−ブチルである化合物であり、特に好ましい化合物はスクシニル−バリル−２０−Ｏ−（７−テルブトキシイミノメチルカンプトテシン）（ここではＳＴ２６７７という）である。
【００２６】
これらの化合物はＷＯ ０３／１０１９９６に十分に開示されており、技量のあるリーザーはそれを参照する。
【００２７】
もう１つの好ましいカンプトテシン誘導体は式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
［式中、Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）p−Ｒ4基であり、ｐは整数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルまたはＣ2−Ｃ8アルケニル基、またはＣ3−Ｃ10シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基、またはＣ6−Ｃ14アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリール−アルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ9アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、および−ＮＲ6Ｒ7からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ6−Ｃ10）アリールまたは（Ｃ6−Ｃ10）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ9アルキルであり；あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいはＲ4はグリコシル残基であり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、Ｃ6−Ｃ10アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシであり；ｎ＝１または２であり、Ｚは水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ4アルキルから選択される］の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、およびその医薬上許容される塩である。
【００２８】
これらの化合物はＷＯ ０３／１０１９９５に十分に開示されており、技量のあるリーザーはそれを参照する。
【００２９】
もう１つの好ましいカンプトテシンはＡｒｉｍｏｎｄｏ Ｐ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１４；４０３１−４０４０に開示されたもの、特に、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンである。さらにもう１つの好ましい化合物は１０−ヒドロキシカンプトテシンである。
【００３０】
前記リガンドはリボ核酸、デオキシリボ核酸、ＰＮＡ、ペプチド核酸、２’Ｏ−アルキルリボ核酸、オリゴホスホルアミデート、ＬＮＡ（リボース立体配座につきブロックされたＲＮＡ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ ２００３）は、それが三重ラセンを形成する場合はＴＦＯと呼ばれ、それが副溝に結合する場合はＭＧＢと呼ばれる）からなる群より選択される。後者はＮ−メチルピロール、Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−メチル−３−ヒドロキシピロールのポリアミド、ならびにβ−アラニンから選択される。
【００３１】
また、本発明の目的物は式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、Ａは病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；Ｃは前記式（Ｉ）〜（ＩＶ）のカンプトテシン誘導体である］の化合物である。
【００３２】
本発明の一般的な教示においては、前記した化合物のエレメントＡおよびＣはポイズン分子の異なる位置を通じてリンカーアームによって結合させることができ、但し、この位置はリガンドに結合すべき適当な官能基を有するものとする。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、カンプトテシン誘導体を用い、リガンドＡは好ましくは位置７、１０または２０においてカンプトテシン分子に結合することができる。
【００３４】
適当なリンカーアームは、１〜５０、好ましくは２０〜３０の長さの、ＮまたはＯを含む基において選択される炭素およびヘテロ原子の連続；およびホスホルアミドまたはアミド結合、またはチオエステルを与えるように反応することができる末端部位を含む。
【００３５】
そのようなリンカーアームの例は、ｎが１〜１２の整数である−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−のようなジアミノアルキル；ｎが２〜６の整数であって、ｍが２〜３である−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯ―、グリコール−（ＣＨ2）mＯ）n−である。
【００３６】
前記実施形態による複合体の例はＴＦＯ−Ｌ３−ＳＣＰＴ、および（３＋３）−ＣＰＴ、（４＋４）−ＣＰＴ、ＴＦＯ−１８−Ｌ６−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ−１８−Ｌ４−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ １６−Ｌ６−１０ＣＰＴ、およびＴＦＯ１６−Ｌ４−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ１６−Ｌ６−７ＣＰＴ、ＴＦＯ１８−Ｌ６−７ＣＰＴ、ＳＣＰＴ−Ｌｎ―ＴＦＯ、ＴＦＯ−Ｌ４−ｃＣＰＴ、ＴＦＯ−Ｌ６−ｃＣＰＴからなる群より選択され、ＴＦＯは三重ラセン形成性オリゴヌクレオチドであり、ＬはＣＨ2基の数であり、ＣＰＴはカンプトテシン誘導体である。（３＋３）および（４＋４）はヘアピンポリアミドである。
【００３７】
他の複合体はレベッカマイシン；特にポイズンとしてのレベッカマイシンのインドロカルバゾール誘導体を含む。
【００３８】
そのような複合体の例はＴＦＯ−Ｌn−ＲＢＣ（Ｌn＝−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ）n−、n＝２；３または６）である。
【００３９】
本発明のもう１つの実施形態によると、前記複合体は、前記したようなリガンド、前記トポイソメラーゼＩ阻害剤の誘導体よりなり、前記リンカーアームが阻害剤の置換基に組み入れられていることを特徴とする二元複合体である。前記置換基は、ホスフェートまたはホスホチオエート基と反応することができる末端部位を含む。そのような複合体の例はＴＦＯ−ＳＴ１５７８およびＴＦＯ−ＳＴ２５４１ならびに式（Ｉ）〜（ＩＶ）の関連化合物である。
【００４０】
複合体の第三の群は、それがリガンド、前記リンカーの一部の役割を果たす基によって置換された前記トポイソメラーゼＩポイズンの誘導体および、さらに、リンカーアームよりなることを特徴とする。その例はｎが２および６の間の整数であるＴＦＯ−（ＣＨ2）n―ｃＣＰＴ；ＴＦＯ−（ＣＨ2）3−ＳＣＰＴ、ＳＣＴ−ＴＦＯ、ＴＦＯ−ＳＴ２６７７である。
【００４１】
上述したように、本発明の複合体は、位置２および３０の間に多数のプリンを含有する前記標的遺伝子の各オリゴピリミジン・オリゴプリン配列の近傍にトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を起こす。ＤＮＡ／トポＩ開裂複合体の幾何学のため、切断部位は標的のオリゴピリミジン鎖上の三重鎖の３’側となるべきである。
【００４２】
この化学化合物は、トポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された前記開裂部位がリガンド結合部位の末端から１〜１０ヌクレオチドに位置することも特徴とする。
【００４３】
置換基の例はｎが２〜６の整数であるＨ2Ｎ（ＣＨ2）n−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−のような、所望により不飽和を持つジアミノアルキル、および式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物のＲ4基に認識可能な基を含む。他の置換基は−ＣＯ−ＮＨ−基−を含むジカルボン酸鎖を含む。
【００４４】
そのような基は、例えば、
［式中、ＲはＣ1−Ｃ4直鎖もしくは分岐鎖アルキルであり、ｎ’は１〜６の整数である］である。
【００４５】
本発明の複合体においては、阻害剤は例えばカンプトテシンであって、置換基はその位置２０を占める。
【００４６】
本発明のさらにもう１つの実施形態によると、複合体は、上記定義されたようなリンカーアームを介して阻害剤の置換基に連結されたリガンドを含む。
【００４７】
また、本発明は前記複合体の製法に関する。ホスホルアミド結合はＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．２０００に記載されているように４−ジメチルアミノピリジンの存在下でのトリフェニルホスフィンおよびジピリジルジスルフィドとの反応によって得られ；他方、アミド結合はこの方法によって、酸機能のカルボジイミド活性化によって、またはＨＡＴＵの使用に際しての修飾されたペプチド合成手法によってのいずれかによって形成される。
【００４８】
前記複合体は、有利には、細胞増殖抑制分子と比較して、新しいメカニズムを介して有効である。例によって示されたように、前記複合体は細胞に貫入し、その標的に結合する。
【００４９】
従って、本発明の新しいアプローチは、副作用を減少させつつ、最適な抗腫瘍効果を維持することを目的とする。
【００５０】
例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤の使用は、ほぼ１５％の場合において、今回よく特徴付けられた遺伝子の逆移動によって特徴付けられる二次白血病の出現と関連することが確立される。ある種の選択された遺伝子にこれらの阻害剤を向けることは、治療効果の良好な選択性を可能とすることによってその白血病形成力を低下させることができる。
【００５１】
また、本発明は、注目すべき遺伝子、またはいくつかの遺伝子の同時発現を特異的に阻害する方法における前記複合体の使用に関し、この遺伝子またはこれらの遺伝子は、例えば、１以上のウイルスまたは病原体タンパク質、または細胞の腫瘍状態の発生および維持に関与するタンパク質をコードする。
【００５２】
有利には、単一オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体は、現在の臨床で用いられる抗腫瘍薬物の組合せと類似の効果を有することができると判断されるであろう。複合体によって標的とされる部位の数は、単独で用いる場合のＣＰＴと比較してかなり低下する。
【００５３】
従って、本発明は、医薬的に不活性な溶剤と組み合わせた有効量の少なくとも１つの上記定義された複合体を含むことを特徴とする医薬組成物にも関する。
【００５４】
これらの組成物は、有利には、注射またはスプレーによるその投与を可能とする形態である。単位および日用量は病理学のタイプ、特に、治療すべき癌によって当業者によって測定されるであろう。この関連で、最先端技術水準で開示された複合体のいくつかはインビトロ、無細胞システムでおいてのみテストされた。本発明者らは、前記化合物を細胞に投与するのは不可能でないとしても非常に困難であることを見出した。従って、新しい化合物の態様および公知の化合物の使用の態様双方における本発明の化合物は、無細胞システムにてトランスフェクションベクターを共に投与されるべきである。トランスフェクションベクターの例はナノ粒子、リポソーム、カチオン性脂質、およびカチオン性ポリマーである。
【００５５】
全く驚くべきことには、Ｃが式（Ｉ）〜（ＩＶ）のカンプトテシン誘導体、特に、コードＳＴ１５７８およびＳＴ２６７７で確認されるカンプトテシン誘導体である化合物は、細胞に投与されるのにいずれのトランスセクションベクターも必要としない。というのは、それはエキソ・ビボで細胞膜を貫通するからである。従って、Ｃが式（Ｉ）〜（ＩＶ）のカンプトテシン誘導体、特に、コードＳＴ１５７８およびＳＴ２６７７で確認されるカンプトテシン誘導体である化合物Ａ−Ｂ−Ｃを含む組成物および薬物は、有利には、補充的トランスフェクションベクターを必要とせず、従って、その生物学的適用をより簡単なものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明の他の特徴および利点は、化学文献ならびに添付の図面を参照して、以下の実施例によって与えられる。
【００５７】
図１は、特異的部位におけるトポイソメラーゼＩによるＤＮＡの開裂／切断を標的化する原理を示すダイヤグラムである。
図２Ａは、公知の研究システム：標的オリゴプリン・オリゴピリミジン配列および対応する三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の配列を含む３２４−ｂｐ二重鎖を示す。
（例えば、５−メチル−デオキシシトシン（Ｍ）および５−プロピニル−デオキシウラシル（Ｐ）を用いることによって）三重ラセンを形成するオリゴヌクレオチド（ＴＦＯ１６、ＴＦＯ１８、ＴＦＯ２０、ＴＦＯ２３）を修飾して複合体の安定性を増加させた。ＴＦＯを２０Ｓ−１０−カルボキシカンプトテシン（１０ＣＰＴ）、２０Ｓ−７−アミノエチルカンプトテシン（７ＣＰＴ）、２０Ｓ−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン酢酸（ＳＣＰＴ）、２０Ｓ−７−アミノエチルイミノメチルカンプトテシン（ＳＴ１５７８）、２０Ｓ−７−アミノプロピルイミノメチルカンプトテシン（ＳＴ２５４１）に、およびスクシニル−バリル−２０−Ｏ−（７−テルブトキシイミノメチルカンプトテシン）（ＳＴ２６７７）にカップリングさせた。
（３＋３）および（４＋４）ヘアピンポリアミドタイプの２つの副溝リガンドを１０−カルボキシカンプトテシン（１０ＣＰＴ）にカップリングさせた。
ＴＦＯ１６の、および２つの副溝リガンドの結合部位は四角によって示す。オリゴヌクレオチドはオリゴプリン・オリゴピリミジン配列に結合し、ワトソンークリック塩基対のプリンとでＨｏｏｇｓｔｅｅｎ−タイプの水素結合を形成する。副溝リガンド（３＋３）および（４＋４）は結合し、副溝と相互作用する。複合体の化学式は図面の下方の部分で示され、リンカーアームはイタリック体で表す。オリゴヌクレオチドはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社（ベルギー国）から入手し、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １９（２０００）ｐｐ．１９４３−１９６５に記載された方法に従って、ＨＡＴＵの使用に基づく適合されたペプチド合成手法によって阻害剤とカップリングさせる。副溝リガンドはＡｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ． Ｅｄ．４０（２００１）ｐｐ．３０４５−３０４８に記載されたように合成した。
【００５８】
図２Ｂは、カンプトテシン誘導体ＳＴ１５７８、ＳＴ２５４１およびＳＴ２６７７、ならびに複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８、ＴＦＯ−ＳＴ２５４１，ＴＦＯ−Ｌ４−ＳＴ２６７７およびＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴの式を表す。
【００５９】
図３Ａは、トポイソメラーゼＩ開裂部位を表す。オリゴピリミジン鎖（ウェル１）上の位置３’における放射性標識３２４−ｂｐ二重鎖を、三種のカンプトテシン誘導体（ウェル２〜４、１０ＣＰＴ、７ＣＰＴ、ＳＣＰＴ）の、ＴＦＯ１６と複合体したこれらの三種の誘導体（ウェル５〜７、ＴＦＯ１６−Ｌ４−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ１６−Ｌ６−ＣＰＴ、ＴＦＯ１６−Ｌ３−ＳＣＰＴ）の存在下で、トポイソメラーゼＩと共にインキュベートした。開裂部位は文字によって示し、複合体の結合部位は図式によって示す。Ｌ３＝ジアミノプロピニル；Ｌ４＝ジアミノブチル、Ｌ６＝ジアミノベキシル；インキュベーションの後、ＳＤＳ／プロテナーゼでの処理によってタンパク質を消化し、開裂産物を変性ゲルで分析する。
【００６０】
図３Ｂは、本発明による他の複合体で得られた結果を表し、ＤＮＡは、単独、あるいは５μＭの１０ＣＰＴ、ＳＴ１５７８、ＳＴ２６７７またはＳＴ２５４１、または１μＭの非複合体ＴＦＯと共にトポイソメラーゼの存在下で対照として用いる。１μＭにおいては、全ての複合体は、オリゴヌクレオチドの結合部位の３’側のみにおいてヒトトポイソメラーゼによるＤＮＡの開裂を指令し、阻害剤は三重ラセンの形成による位置である（部位ｂ）。ｎＴＦＯは未修飾シチジンおよびチミジンを担う。
対照的に、阻害剤単独は数個の部位（部位ａ、ｂ、ｃおよびｄ）において開裂を刺激する。
複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８およびＴＦＯ−ＳＴ２５４１は複合体ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴよりも３倍効果的である。
複合体ＴＦＯ−Ｌ４−ＳＴ２６７７は複合体ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴに匹敵する。
また、もう１つの化学的に修飾されたＴＦＯ、すなわち、配列＋ＣＰ＋ＣＰ＋ＣＰ＋ＣＰ＋ＣＰ＋ＴＰ＋ＴＰ＋ＴＰ（ここで、ＣはＬＮＡシチジンを示し、＋Ｔ＝ＬＮＡチミジンである）を有するＬＮＡ（ロックされた核酸）についても結果を掲げる。
ＬＮＡを一工程合成にてＳＴ１５７８に結合させて、ＬＮＡ−ＳＴ１６７８複合体を得た。部位ｂにおける開裂を指令する効果を評価した。前記複合体はＴＴＦＯ−ＳＴ１５７８アナログよりも２倍効果は低かった。
ＤＮＡ／トポＩ開裂複合体の分子拘束は三元複合体の幾何学を支配し、結合した三重ラセン形成性オリゴヌクレオチドの存在下でＤＮＡ開裂を指令する。
【００６１】
図４は、これは好ましい部位であるか否かを問わず、標的のオリゴプリン鎖上の三重ラセンの５’側の開裂およびオリゴピリミジン鎖上の３’側の開裂を誘導することを示す。位置３’におけるオリゴヌクレオチド上の阻害剤の存在は、シグナルを増幅する効果を有する。
【００６２】
図５Ａは、実験構築を表す：用いたプラスミドは、ＳＶ４０プロモーターの制御下にあるＰｙｒａｌｉｓ ルシフェラーゼ遺伝子を含む、ｐＧＬ３プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の転写されたおよび非翻訳領域においてＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｃｏ Ｉ部位で５４−ｂｐ二重鎖をクローニングすることによって得られた。ＴＦＯ結合の配列、およびその近傍におけるカンプトテシンに感受性の部位を、Ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）の上流の転写体領域に置く。インビトロの実験で用いる無傷三重ラセン配列（Ｐｗｔ）；３部位で突然変異した三重ラセン配列（ｐＭＵＴ）；三重ラセン配列および３’側の、カンプトテシンによって刺激された公知の開裂部位（ｐＴＩＤ）、およびＴＦＯのいずれかのアンチセンス効果を回避するための対向鎖に挿入された無傷三重ラセン配列を含んだ５４−ｂｐのインサート。
【００６３】
図５Ｂは、標的二重鎖、ＴＦＯおよび対照オリゴヌクレオチド配列を与え：ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴを複合体および、対照としての、ホスフェート（化合物ＴＦＯＦ）によって、または１０ＣＰＴ、ＮＨ2−（ＣＨ2）4−ＮＨ2（化合物ＴＦＯ−ＮＨ２）のカップリングで用いるリンカーアームによって３’で保護されたオリゴヌクレオチドとして用いた。前記アームをジフェニル酢酸（化合物ＴＦＯ−ＮＰｈ２）に連結した。最後の対照として、同一の修正された塩基を含有するオリゴヌクレオチドを用いたが、異なる配列でもって、３’におけるホスフェート（１６ＨＩＶＵＰ）、１０ＣＰＴのいずれかに、リンカーアームＮＨ2−（ＣＨ2）6−ＮＨ2（化合物１６ＨＩＶ−ＣＰＴ）を介して連結した。次いで、複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８をＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴと比較した。
【００６４】
図６Ａは、最初に、これらの分子につき、ＨｅＬａ細胞におけるＰｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子の転写の阻害を説明する。ヒト接着ＨｅＬａ細胞を、３７℃および１０％ＣＯ2において、ＦＣＳ１０％を補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を、１２５μＬ／ウェルにて９６ウェルプレートに接種した（１１００００細胞／ｍＬ）。２４時間後、培地を、１１２．５μＬの新鮮な培地および１２．５μＬのトランスフェクション混合物と交換する。前記トランスフェクション混合物は、１μｇのｐＧＬ３Ｐｒまたは修飾されたもので；０．５μｇのｐＲＬ−ＴＫ、種々の濃度のオリゴヌクレオチドおよび３μＬのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ）を無血清倍地中に含有する。混合物は二連または三連で調製した。２４時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ発現を評価した。デュアル−ルシフェラーゼ（商標）レポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、同一細胞溶解物での双方のレポーター（ＰｙｒａｌｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ）の活性を測定し；９６−ウェルプレートの各ウェルを３０μＬの受動的溶解緩衝液中で溶解させ、１５μＬを自動装置（Ｖｉｃｔｏｒ／Ｗａｌｌａｃ）にて「Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（デュアル−ルシフェラーゼ（商標）レポーターアッセイシステム）」で分析した。双方の活性（ＰｙｒａｌｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ）の間の比率を用いて、効果の選択性を測定した。異なるオリゴヌクレオチドの存在下における双方の活性の間の比率の全ての値を、複合体（ＤＮＡ）の不存在下におけるプラスミドの発現に対して正規化した。対照オリゴヌクレオチドは、Ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの発現に対して効果を有さなかった。複合体ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴのみが、無傷三重ラセン配列（ｐＴＩＤおよびｐＷＴ）を含有する双方の標的に対して、０．５μＭにおいて約４０〜５０％からその発現を阻害する。
インサートを有さない市販のプラスミドｐＧＬ３Ｐｒについては、複合体は効果を有さず、突然変異した三重ラセン（ｐＭＵＴ）を有するものについては大いに低下する。
【００６５】
図６Ｂは、逆鎖でのプラスミド構築を用いる場合に得られた結果に関する。
図７Ａおよび７Ｂは、複合体の存在下における三重鎖の形成および強力な特異的破壊の存在（実施例Ａ）および、対照的に、三重ラセン部位での突然変異の場合における三重鎖の形成の、およびＤＮＡの特異的開裂の不存在（実施例Ｂ）および開裂部位ｂおよびｃにおける突然変異した二重鎖の場合における、三重鎖の形成、しかしながら、三重鎖部位の３’末端におけるトポＩ−媒介ＤＮＡ開裂部位の不存在（実施例Ｃ）を示す。
図８は、ＤＮＡ／トポ Ｉ／ＣＰＴ複合体の形成に伴う生物学的効果の相関結果を与え：細胞中の複合体の形成に続いて、イムノブロットを行った。
図９は、本発明の方法で有用なある種の複合体／複合体の（阻害剤単独と比較した開裂強度、および与えられた部位ａ、ｂ、ｃおよびｄの点における）有効性を示す。
【００６６】
ＤＮＡ配列を特異的に認識することができるオリゴヌクレオチドにトポイソメラーゼ阻害剤を複合体させることによって、選択された遺伝子に共通する標的配列での特異的三重ラセン複合体の形成のため、選択された遺伝子の群に対して阻害剤を標的化することが可能である。従って、これらの遺伝子についての不可逆的病巣を選択的に誘導し、その発現を阻害するのが可能となる。
【００６７】
これは、特に、トポイソメラーゼＩ阻害剤の、オリゴヌクレオチドのような配列−特異的ＤＮＡリガンド、または副溝リガンドのような非核酸リガンド（Ｎ−メチルピロールおよびイミダゾールよりなるポリアミド）、または亜鉛フィンガーペプチドとの共有結合カップリングを用い、本来公知の方法で達成することができる。
【００６８】
事実、そのようなリガンドは、各々、二重ラセンの主溝および副溝における結合によって、ある種のＤＮＡ配列を特異的に認識することができる。トポイソメラーゼＩ阻害剤のこれらのＤＮＡリガンドへの化学的カップリングは、阻害剤を、リガンドの結合部位の近傍に選択的に位置させ、従って、トポイソメラーゼＩによって誘導される破壊をこの部位に選択的に向ける。
【００６９】
本発明者らは、従って、細胞の腫瘍状態の増殖および維持へのその関与につき選択された遺伝子または遺伝子の群へトポイソメラーゼ阻害剤を標的化することに基づいて新しい概念を開発した。これらの遺伝子は、例えば、細胞周期および分裂、増殖を制御する遺伝子から、および抗アポトーシス遺伝子から選択される。また、ウイルス遺伝子はこの戦略で標的化することもできる。
【００７０】
選択されたオリゴヌクレオチドの長さに応じて、選択性を変調して、単一遺伝子のみにおいて狙うか、あるいは緩和して、次いで、遺伝子の群を阻害することができる。
【００７１】
抗腫瘍化学療法におけるこの革新的戦略は、数個の遺伝子／機能の同時阻害を明らかに治療的重要な他の病理学まで拡大することができる。
【００７２】
後に記載する薬理化学のアプローチの有用性は、本質的には、１つは標的のＤＮＡを認識し、他方はトポイソメラーゼを動員する２つのヘッドを有する複合体での新しい「双頭」方法論の定義にある。
【００７３】
これらの化合物の設計は、目的とする配列に適合させなければならず、かつ
上記した特徴を有さなければならない。
【００７４】
ファルマコゲニックアプローチは、癌性腫瘍の細胞増殖および維持に関与する、特異的遺伝子に向けられたトポイソメラーゼＩポイズンの標的化に基づいた新しい治療戦略の開発を含む。
【００７５】
前記アプローチは、特に、細胞増殖に関与する遺伝子に対するおよび／または抗アポトーシス遺伝子に対する安定した三重ラセンの形成、血管形成によって選択的に結合することができる修飾されたまたは未修飾のオリゴヌクレオチドへトポイソメラーゼＩ阻害剤を化学的にカップリングさせることよりなる（図２：オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体によるトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ配列の標的化）。
【００７６】
ＤＮＡリガンドアプローチは、いくつかの遺伝子の発現に対して同時に作用し、これらの遺伝子に共通する標的配列を選択する可能性を与える。
【００７７】
癌のような多重遺伝子病理学を効果的に処理するためには、事実、遺伝子ファミリー、より正確には、細胞の通常の増殖回路を改変する遺伝子の群を同時に制御することが必須である。
【００７８】
従って、かなり有利には、単一オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体は、臨床で現在用いられる抗腫瘍薬物の組合せに類似の効果を有し得る。
【００７９】
このアプローチは、ある種の副作用を低下させつつ、この最適な抗腫瘍効果を維持するのを可能とすることができる。例えば、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の使用は、症例のほぼ１５％において、今日よく特徴付けられている逆遺伝子トランスローケーションによって特徴付けられる二次性白血病の出現と関連するというのは確立された事実である。ある種の選択された遺伝子に対してこれらの阻害剤を向けることは、治療効果の良好な選択性を可能とすることによって、その白血病形成力を低下させることができる。
【００８０】
また、その特に必須の態様の１つにおいて、本発明は、トポイソメラーゼＩ阻害剤の作用をＤＮＡ−特異的部位に向けて、この部位において、トポイソメラーゼＩによる開裂を選択的に誘導するのを可能とする方法にも関する。
【００８１】
癌の発生および維持に関与する遺伝子の２つの群、（１）成長因子ＩＧＦ−１（インスリン−様−成長因子−１）がその受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する場合に確立されたもののような生存経路の遺伝子、および（２）ＩＡＰのようなアポトーシスを阻害する遺伝子、およびＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス遺伝子を考慮し、説明によって、以後純粋に、かつ非限定的にこの新しい概念を詳細に説明する。これらの遺伝子はある種の癌で過剰発現され、それをブロッキングすると抗腫瘍効果が得られる。
【００８２】
本発明者らは、三重ラセンを形成することができ、かつ標的化すべき注目すべき遺伝子の群に共通する配列につきサーチを行った。このサーチは、ＧＣＧソフトウェア Ｕｎｉｘ ｆｉｎｄｐａｔｔｅｒｎｓ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ，Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ）を用いて行った。
【００８３】
予備的サーチにおいて、本発明者らは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴ／ＰＢＫ遺伝子に共通する１２塩基対（ｂｐｓ）、およびｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ＸLおよびｓｕｒｖｉｖｉｎｅ抗アポトーシス遺伝子に共通する１０−ｂｐ配列を含むオリゴピリミジン配列を同定した。
【００８４】
さらに、図２に記載されたＴＦＯ配列は、表１に報告する遺伝子のリストに結合する。遊離ＣＰＴ誘導体はゲノム（および、従って、多くの部位）においてほとんど特異性なく開裂を誘導するのに対し、図２に示す塩基配列を持つＴＦＯ−ポイズン複合体はこれらの遺伝子および、とりわけ、特に、腫瘍の増殖および維持に関与するＩＧＦ１ＲおよびＶＥＧＦに対してのみ開裂を誘導する。サーチは、ＵＣＳＣにおいて公に入手可能なバイオインフォーマティクス源を用いて行った。
【００８５】
既に述べたように、副溝リガンド（Ｎ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールよりなるポリアミド）のような配列−特異的ＤＮＡの非核酸リガンドを用いて、与えられた部位に向けてのトポイソメラーゼ阻害剤の作用を指令することもできる。
【００８６】
これらの使用は、安定した三重ラセンの形成によって課されるオリゴピリミジン・オリゴプリン標的配列拘束を無くすることが可能なはずである。
【００８７】
カンプトテシンとカップリングした副溝リガンドでの結果を以下に示す。
【００８８】
標的遺伝子の群に共通する配列についてのこのサーチは、専ら、または主として選択された遺伝子の群の一部を形成するように選択された最適な標的配列を規定するのを可能とするはずである。
【００８９】
三重ラセンオリゴヌクレオチドの使用の場合には、複合体による開裂は、標的のオリゴピリミジン鎖上の三重鎖の３’側のトポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された開裂部位と共に、２〜１００、好ましくは１０〜３０の多数のプリンを含む各オリゴピリミジンオリゴプリン標的配列に向けられる。
【００９０】
さらに、阻害剤によって誘導され、かつ有利には三重ラセン末端およびリンカーアームから１〜１０ヌクレオチドに位置する開裂部位は、開裂部位、用いられる阻害剤、および阻害剤のオリゴヌクレオチドへの付着点に従って適合される。
【００９１】
オリゴヌクレオチド−トポイソメラーゼ阻害剤複合体に関しては、本発明者らは、カンプトテシン誘導体へのトポイソメラーゼ阻害剤のカップリングを行った。予備的試験では、本発明者らは、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるカンプトテシンおよびレベッカマイシン誘導体の、オリゴヌクレオチド１６ヌクレオチド長への共有結合カップリングが、インビトロにて、阻害剤が三重ラセンの形成によって位置する部位に対してトポイソメラーゼＩによって特異的に開裂を向けることを示した（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，２０００ａ）。
【００９２】
同一の工程を、同様にして、すなわち、共有結合様式にてＤＮＡ−特異的リガンドの末端に付着させることができるトポイソメラーゼポイズンである他のタイプの阻害剤で行うことができる。
【００９３】
リガンド部分および阻害剤部分を統合するリンカーアームの最適化は非常に重要であり、リガンド結合部位に関して用いられる阻害剤の切断部位の位置、および阻害剤のオリゴヌクレオチドへの付着点に従って適合させなければならない（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）。
【００９４】
オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体の合成の後であって、その細胞活性の評価の前に、ゲルシフト実験および熱解離実験によって、三重ラセンを形成するその能力を分析すべきである。例えば、図２に記載された組成のＴＦＯは結合し、インビトロにてトポＩ−媒介ＤＮＡ開裂を、同一標的配列を共有する、テストされた２つの遺伝子におけるリガンド認識部位に特異的に向ける。
【００９５】
選択された阻害剤の細胞活性
トポイソメラーゼＩ複合体のオリゴヌクレオチド−阻害剤の活性に関して、分子および細胞系は、ＩＧＦ−１およびその受容体に関連する遺伝子のカスケードに対する異なる複合体の効果を研究することを可能とする（Ｈａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。特に、開裂活性は、ゲノムＤＮＡの直接的分析、トランスクリプトーム（ＤＮＡチップおよびノーザンブロット）およびプロテオーム（二次元ゲルおよびウェスタンブロット）分析による作用特異性によって評価することができる。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒ遺伝子は膠芽細胞腫、肝細胞癌および前立腺の腫瘍の増殖に関与するので、アンチセンス構築体によるその阻害は動物に移植された腫瘍の増殖をブロックする（Ｌａｆａｒｇｅ−Ｆｒａｙｓｓｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。培養中の腫瘍細胞についてのテストは、最も効果的なオリゴヌクレオチド複合体を選択し、（例えば、ヌードマウスに注入された膠芽細胞腫、または同質遺伝子ラットにおける肝細胞癌を持つ）動物モデルを用いるのを可能とするであろう。
【００９６】
また、複合体の薬物動態学も標準的な手法で評価することができる。
【００９７】
最も効果的な複合体に関しては、癌性細胞の増殖を阻害するその能力は、部分的には、異なる腫瘍細胞系を用いることによって、従って、インビトロでのほとんどの細胞傷害性分子では、マウスに異種移植されたヒト腫瘍からの、インビボモデルに対して評価することができる。
【００９８】
本発明のある態様および目的の産業的適用の例
抗癌剤としてのトポイソメラーゼＩ阻害剤とカップリングさせたＤＮＡリガンドの評価
癌と同程度に重要な病理学における新しい治療経路が関連するので、経済的関心はかなりのものである。
【００９９】
従って、病理学における脱調節遺伝子の同定は新しい薬理遺伝学的製品の基礎を形成することができる。
【０１００】
薬理遺伝学的成功は、
副作用の減少および治療有効性の増加
医薬開発に関連するコストの減少
患者に適する非常に多数の治療的解決の開発
公の健康出費の大幅な減少
について重要な結果を有するであろうことは明白である。
【０１０１】
この経済的インパクトは、あいにくと低い個々の有効性のレベルを伴う多数の治療プロトコルの間に選択がある癌の分野において非常に実質的であろう。
【０１０２】
実施形態
略語：
ＣＰＴ＝カンプトテシン；Ｐ＝５−プロピニル−２’−デオキシウリジン；Ｍ＝５−メチル−２’−デオキシシチジン；Ｒ＝二重鎖のオリゴプリン鎖、Ｙ＝二重鎖のオリゴピリミジン鎖
＝ワトソン−クリック塩基対合
トポ＝トポイソメラーゼ
【０１０３】
材料および方法
阻害剤
全ての阻害剤はジメチルスルホキシドに溶解させ、次いで、水に希釈する。ジメチルスルホキシドの最終濃度は全てのテストにおいて決して０．３％（ｖ／ｖ）を超えない。阻害剤は図２において既に記載したようにＴＦＯの３’または５’末端に結合している。
【０１０４】
カンプトテシン誘導体はＡｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）およびＶｉｌｌｅｍｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）に記載された技術に従って合成される。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ断片
オリゴヌクレオチドはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃによって市販されており、「クイックスピン」カラムおよび微細なＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で精製される。濃度は、最も近いモデル（Ｃａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９７０）から計算された２６０ｎｍにおけるモル消光係数を用いて２５℃にて分光学的に測定される。
【０１０６】
ＣＴＰ複合体の合成
僅かに修飾したＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （２０００）に記載された技術に従い、および、アミド結合形成については、オリゴヌクレオチドに適合させたＨＡＴＵを用いるペプチド合成手法に従い、カンプトテシンＣＰＴの誘導体は異なるリンカーアームを介してオリゴヌクレオチドの３’または５’末端のリン酸に、または副溝リガンド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’｛１−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−［４−｛［１−メチル−４−［１−メチル−４［１−メチル−４−（４−アミノブチリル）アミノピロール−２−カルボニル］アミノピロール−２−カルボニル］アミノピロール−２−カルボニル］｝アミノブチリル］アミノピロール−２カルボニル］アミノピロール−２−カルボニル］アミノピロール−２−カルボニル｝プロピレンジアミン（３＋３）に複合体される。Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍ．，前記Ａｒｉｍｏｎｄｏ（２００２）に記載されているように、リンカーアームは、アミノ−末端の反応によって、Ｎ−メチルイミダゾール、ジピリジルジスルフィドおよびトリフェニルホスフィンでの処理によって活性化された３’または５’末端におけるリン酸化オリゴヌクレオチドに結合される。複合体はＵＶ分光測定および質量分光測定によって特徴付けられる。
【０１０７】
ＳＴ１５７８およびＳＴ２５４１におけるようにリンカーアームを用いない場合、ＣＰＴ誘導体上のアミノ基は、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．２０００に記載された技術に従ってオリゴヌクレオチドの末端リン酸に直接結合される。
【０１０８】
（ＤＮＡ）標的遺伝子の調製
ｐＢＳＫ（＋／−）プラスミドはＰｒｏｍｅｇａ（ＵＳＡ）によって市販されており、７７−ｂｐ標的二重鎖がＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間に挿入される。ＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩによるプラスミドの消化により、クレノウポリメラーゼ（Ｏｚｕｍｅ，ＧＢ）およびα［３２Ｐ］ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｓ．Ａ）によって、３’末端における標識に適した３２４−量体断片を生じる。この二重鎖ＤＮＡの単離、精製および標識のための技術の詳細は（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ２００２）に記載されている。２つの５９−ｂｐ二重鎖は、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｏｚｙｍｅ，ＧＢ）およびα［３２Ｐ］ｄｂＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｓ．Ａ）による鎖の標識、続いての、９０℃における５分間の非標識相補的鎖とのハイブリダイゼーション、および雰囲気温度までのゆっくりとした冷却によって得られる。放射性標識断片は、従前に記載されているようにゲルクロマトグラフィーによって精製される（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ２００２）。鎖の命名法は以下の通りである：Ｒはオリゴプリンを表し、Ｙはオリゴピリミジン鎖を表す。
【０１０９】
トポイソメラーゼ開裂テスト
記載した濃度にて（合計反応用量１０μＬ）、ＴＦＯまたはＭＧＢの存在下で、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ−７．５、６０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび３０μｇ／μＬのＢＳＡ中にて、放射性標識二重鎖（５０ｎＭ）を３０℃にて１時間インキュベートする。トポＩ ＤＮＡ開裂生成物を分析するために、１０単位の酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ）を加え、前述したように、リガンドおよび／または阻害剤と共にインキュベートし、続いて、３０℃にて２０分間インキュベーションする。トポＩ−ＤＮＡ複合体はＳＤＳ（最終濃度０．２５％）の添加によって解離させる。エタノール沈殿の後、全ての試料を６μｌのホルムアミドに再懸濁させ、９０℃まで４分間で加熱し、再度、氷上で４分間冷却し、その後、１×ＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５５ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に７．５ｍ尿素を含有する各々、長いおよび短い標的につき、８％および１０％変性ポリアクリルアミドゲル［１９／１アクリルアミド：ビスアクリルアミド］上に沈積させる。開裂強度を定量化するために、ゲルをＤｙｎａｍｉｃｓ ４４５ＳＩホスホルイメージャーでスキャンする。開裂速度を測定するために、合計沈積に対する標準化を行う。
【０１１０】
２０Ｓ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）酢酸（ＳＣＰＴ）、位置１０において前記酸に結合したＴＦＯ−ＳＣＰＴおよびＳＣＰＴ−ＴＦＯ複合体、ならびに例えばＴＦＯ−１０ＣＰＴ、およびＴＦＯ−７ＣＰＴ、（３＋３）−ＣＰＴおよび（４＋４）−ＣＰＴのような位置１０または位置７いずれかに付着した他の複合体の調製で用いられる新しいＣＰＴ誘導体の化学式は図２Ａに掲げる。リンカーアームの役割を果たす置換基を有するカンプトテシン誘導体ＳＴ１５７８およびＳＴ２６７７は図２Ｂに掲げる。
【０１１１】
本発明者らは、現在抗腫瘍剤として臨床試験を受けている分子と同様な３つのレベッカマイシン誘導体、およびＴＦＯ（三重ラセン形成性オリゴヌクレオチド）を持つ６つのカンプトテシン誘導体、および２つの副溝リガンド（ＭＣＢ、副溝バインダー）を持つ１０−カルボキシカンプトテシン誘導体を化学的にカップリングさせることによってアプローチを確認した（図２）。
【０１１２】
本発明者らは、阻害剤誘導体に存在しない場合、あるいは十分に長くない場合、阻害剤を適当なリンカーアームを介してオリゴヌクレオチドの１つの末端または副溝リガンドに共有結合させた。複合体はＵＶ分光測定および質量分光測定（Ｑ−ＳＴＡＲ Ｉ）によって特徴付けした。複合体の開裂特異性は、標準トポイソメラーゼＩ開裂テストによってインビトロにて測定した。開裂指標は、ＤＮＡリガンドとカップリングした阻害剤の存在下における開裂強度と、非結合阻害剤の存在下におけるそれとの間の関係として計算される。標的化の例を図３に示す。３つの非カップリングカンプトテシン誘導体（ウェル２、３、４）はいくつかの部位（部位ａ〜ｉ）における開裂を刺激する。誘導体が適当なアームを持つＴＦＯの３’末端に共有結合する場合、三重ラセンが形成され（ウェル５、６、７）、複合体は三重ラセン（部位「ｂ」）の３’側のみに開裂を誘導する。これは、複合体のオリゴヌクレオチド部分のその標的への結合による、三重ラセン部位の３’側に対する阻害剤の特異的位置決めによる。オリゴヌクレオチドの場合には負に荷電されたリガンドの存在は、三重ラセンの、またはこの部位からかなりの距離をもって位置した他の部位の５’側に位置する部位「ａ」の消失によって明らかに示されるように、複合体された阻害剤の他の部位への結合を妨げる。
【０１１３】
本発明者らは、異なる長さ（１６、１８、２０および２３ヌクレオチド）のＴＦＯ（図９参照）に対する、および異なるレベッカマイシンおよびカンプトテシン誘導体に対するＤＮＡリガンドの結合部位の近傍におけるトポイソメラーゼＩによるトポイソメラーゼ１媒介ＤＮＡ開裂のこの標的化を示した。同一のアプローチは、ＤＮＡの副溝に特異的に結合するＮ−メチルピロールヘアピンポリアミドのような他の配列−特異的ＤＮＡリガンドまで拡大された（図２：（３＋３）−ＣＰＴおよび（４＋４）−ＣＰＴ複合体）。また、本発明者らは、それをもう１つの標的：ＨＩＶ−１ウイルスのＰＰＴ（ポリプリントラクト）（５’ＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡ ３／ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＴ５’）まで、およびＩＧＦ−１のプロモーター１に存在する２２−量体配列（５’ ＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧ ３’／ＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣ ５’）まで拡大した。さらに、図２に記載されたＴＦＯはＩＧＦ１Ｒのイントロン２に結合することが示された（表１）。
【０１１４】
従って、前記アプローチは、特に、２つのクラスの配列−特異的ＤＮＡリガンド（ＴＦＯおよびＭＧＢ）で、異なるクラスのトポイソメラーゼＩ阻害剤で、および異なる標的で有効である。
【０１１５】
本発明の主題は、有利には、用いられるリガンドがオリゴヌクレオチドのような配列−特異的ＤＮＡリガンド、または副溝リガンドのような非核酸リガンド（Ｎ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールよりなるヘアピンポリアミド、特に、（３＋３）−ＣＰＴおよび（４＋４）−ＣＰＴ複合体）、または亜鉛フィンガーペプチドからなる群より選択される上記定義された方法でもある。
【０１１６】
また、本発明者らは、リガンドの結合部位においてかく刺激されたトポイソメラーゼＩ開裂有効性は、一方において、阻害剤およびリガンドの間のリンカーアームのサイズ、および他方において、阻害剤の固有の有効性に依存することも示した。さらに、本発明者らは、リガンドの結合による抗腫瘍剤のポジショニングは、標的化部位におけるこの分子の局所的濃度をインビトロで増加させる効果を有することを観察した；事実、複合体は１〜１０ｎＭの濃度においてトポイソメラーゼＩによる開裂を刺激する。さらに、ＤＮＡ／トポイソメラーゼ／阻害剤開裂複合体は、阻害剤がＴＦＯに複合体し、三重ラセンが形成された場合にかなり安定である。高濃度の塩（＞６００ｍＭ ＮａＣｌ）がそれを解離させるのに必要である。
【０１１７】
その配列がリガンド−阻害剤複合体のＤＮＡリガンドの結合によって認識される、これらの抗腫瘍剤の作用が前記部位に選択的に向けられるこのアプローチは、新しい抗腫瘍薬物の開発においてかなり新しいアプローチを可能とする。
【０１１８】
現在、三元トポイソメラーゼＩ／ＤＮＡ／阻害剤複合体の構造は完全にはまだ説明されていないのを考え、本発明者らは、三元ＤＮＡ／トポイソメラーゼ／阻害剤複合体の構造解析のために前記複合体を用いた。阻害剤のＴＦＯへの付着点を変化させると、三元複合体における阻害剤の向き、従って、前記酵素による開裂の有効性を修飾する（図４および９参照）。従って、本発明者らは、２つのカンプトテシン誘導体、１０−カルボキシカンプトテシンおよび７−アミノエチルカンプトテシンを異なる長さのＴＦＯに共有結合させた。三元複合体の近傍における位置および開裂強度の研究は、従って、三元複合体を記載する現在のモデルが適当ではなく、他の立体配座を考慮しなければならないことを示した。三元複合体の立体配座柔軟性のもう１つの表示は、開裂有効性が、１０−カルボキシカンプトテシンが主溝リガンド（ＴＦＯ）または副溝リガンド（ＭＧＢ）に連結されるかを問わず匹敵するという事実に由来する。
【０１１９】
予期せぬことに、三重ラセンそれ自体の存在は、単独で、トポＩ−媒介ＤＮＡ開裂のある種の標的化を誘導する。本発明者らは、複合体が以下に記載する特徴を有する場合に開裂が起こることを示した；
【０１２０】
また、本発明の主題は、まず、特に、腫瘍の発生および維持に関与するタンパク質をコードするいくつかの標的遺伝子の発現を同時に阻害する方法であって：
（ｉｖ）前記少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤を、前記標的遺伝子に共通する配列を同時かつ選択的に認識することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列−特異的リガンドに複合体させることによって、少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤の作用を前記遺伝子に特異的な部位に向けることと、
（ｖ）ゲノム中の前記遺伝子の前記複合体を前記リガンドによって認識し、前記標的への前記リガンドの結合を得ることと、
（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を誘導し、前記遺伝子の発現を阻害することと；
を含むことを特徴とする前記方法である。
【０１２１】
接合段階は、前記遺伝子およびトポイソメラーゼを含有する生物学的試料にてインビトロで、培養からの細胞にてエキソ・ビボで行われる。
【０１２２】
トポイソメラーゼ阻害剤の存在は、有利には、トポイソメラーゼＩによって媒介されるＤＮＡ開裂の標的化の効果を増幅する。三重鎖によって誘導されるこの開裂は正確な幾何学に依存し：オリゴヌクレオチドのその標的への結合は、標的のオリゴピリミジン鎖上の三重ラセンの３’側、および標的のオリゴプリン鎖上の５’側のみに対する開裂を刺激する（図４）。
【０１２３】
また、本発明は、少なくとも１つのリガンドの複合体、特に、標的のオリゴプリン鎖上の５’側、および標的遺伝子のオリゴピリミジン鎖上の３’側のトポイソメラーゼＩによる開裂を誘導するオリゴヌクレオチドで形成された三重ラセンの複合体（「ＴＦＯ」）に関する。
【０１２４】
さらに、本発明は、三重ラセンを形成し、位置３’において、三重ラセンの３’側の酵素の選択的かつ強力な開裂を刺激するトポイソメラーゼＩ阻害剤にカップリングしたピリミジンオリゴヌクレオチドに関する。
【０１２５】
三重鎖の３’側は、水素結合の形成によりＴＦＯによって認識されるオリゴプリン配列の３’側と定義される。開裂のこの向きは、開裂部位におけるＤＮＡへのトポイソメラーゼＩの結合が対称ではなく、前記酵素が開裂された鎖の３’リン酸とでホスホロチロシル結合を形成し、５’ＯＨ末端を脱離させるという事実にリンクされる。従って、三重ラセンは、酵素に対する立体的障害無くして、標的上の開裂部位の３’側に存在し得る。トポイソメラーゼＩの好ましい部位が三重ラセンの存在によって誘導されるのみならず、部位が三重ラセンの存在においてのみ検出できることが強調されなければならない。これは、三重鎖の存在にリンクされたＤＮＡの立体配座の局所的変化によるものと考えることができる。事実、開裂有効性は三重ラセンの５’側および３’側で同一ではなく、三重ラセンの２つの末端は等しくないことが知られていることに注意しなければならない。一方、酵素の進歩は、酵素を「休止させ」、それにこの近傍で開裂する時間を与える三重鎖構造による物理的ブロッキングによって停止される。２つの仮説は相互に排他的なものではない。
【０１２６】
本発明の主題は、
（ｖｉｉ）前記少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤を、前記標的遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列−特異的リガンドに複合体させることによって、少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤を前記遺伝子に特異的な部位に向けることと、
（ｖｉｉｉ）ゲノム中の前記遺伝子の前記複合体を前記リガンドによって認識し、前記リガンドの前記標的への結合を得ることと、
（ｉｘ）トポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を誘導し、前記遺伝子の発現を阻害することと；
を含む上記定義された方法でもある。
【０１２７】
本発明の方法の好ましい実施形態によると、標的化配列は、オリゴヌクレオチドの場合には、２〜１００、好ましくは２〜３０塩基対の多数のプリンを含む各オリゴピリミジン・オリゴプリン標的配列であるリガンドによって認識される部位を含む。なおより好ましくは、前記標的化配列は、より大きな有効性を得るためにその近傍にトポイソメラーゼ阻害剤の部位も含む。阻害剤によって誘導された開裂部位は、三重ラセンの末端から１〜１０ヌクレオチドに位置しなければならない。リンカーアームは、開裂部位、用いられる阻害剤、阻害剤のオリゴヌクレオチドへの結合点に従って適合させなければならない。
【０１２８】
次いで、本発明者らは、細胞における前記アプローチの有効性を初めて示した。
【０１２９】
インビトロ実験は、核バリアー、クロマチンの構造、および核中の複合体の特異性を考慮することができないので、本発明者らは、細胞系において複合体をテストした。前記複合体は細胞において特異的な効果を誘導し、これは、三重ラセンの形成、およびオリゴヌクレオチドにカップリングした阻害剤の存在に依存する。
【０１３０】
より正確には、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされたプラスミド発現ベクターを用い、ＴＦＯの結合配列、およびその近傍におけるカンプトテシンに対して感受性の部位のそれを、Ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）の上流の転写された領域に入れる。プラスミドは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｃｏ Ｉ部位の間のベクターｐＧＬ３プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）への、図５に記載された配列を含む５４塩基対を持つ断片のクローニングの後に得られた。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をトランスフェクション対照として用いる。
【０１３１】
ＨｅＬａヒト接着性細胞を、３７℃および１０％ＣＯ2にて、１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養する。細胞を、ウェル当たり１２５μＬにて、９６−ウェルプレートに接種（Ｍｌ当たり１１０，０００細胞）。２４時間後、細胞の培地を、１１２．５μＬの血清を含む新鮮な培地および１２．５μＬのトランスフェクション混合物によって置き換える。トランスフェクション混合物は無血清培地中に、１μｇのｐＷＴまたはｐＭＴＵＣまたはｐＭＵＴまたはｐＩＷＴ；０．５μｇのｐＲＬ−ＴＸ、変化させた濃度のオリゴヌクレオチド、および３μＬのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を含有する。混合物は二連または三連で調製する。２４時間後、細胞をルシフェラーゼ発現アッセイのために溶解する。
【０１３２】
「ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ」 （Ｐｒｏｍｅｇａ）を、同一細胞溶解物につき２つのレポーター（ＰｙｒａｌｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ）の活性の測定のために用いた：９６−ウェルプレートの各ウェルを３０μＬの「受動溶解緩衝液」に溶解させ、自動装置（Ｖｉｃｔｏｒ／Ｗａｌｌａｃ）を用いて、「ｄｕａｌ−Ｌｕｃｈｉｆｅｒａｓｅ（商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ」キットで１５μＬを分析した。
【０１３３】
２つの活性の比率（Ｐｙｒａｌｉｓ／Ｒｅｎｉｌｌａ）を用いて、効果の選択性を測定する。図６は、複合体の不存在下におけるプラスミドの発現と比較して標準化された、異なるオリゴヌクレオチドの存在下での２つの活性の間の比率を示す。３つのプラスミドｐＷＴ、ｐＭＴＵＣおよびｐＭＵＴは、オリゴヌクレオチド部分の長さ、アームの長さ、および結合したカンプトテシン誘導体が異なる４つの複合体として同様に表される。位置３’において（ＣＨ2）4−ＮＨ2（オリゴ−ＮＨ2）アームに結合したオリゴヌクレオチドＴＦＯ１６を対照として用いる。このオリゴヌクレオチドは非常に安定した三重ラセンを形成する。
【０１３４】
三重ラセンを形成する対照オリゴヌクレオチドオリゴ−ＮＨ2の１μＭにおける存在は、ほぼ３０％だけルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻害する。カンプトテシンへのカップリングは阻害効果を増加させる（複合体に従って４５％および６０％阻害の間）。阻害におけるこの増加は、インビトロで観察されたように、三重ラセンの形成によって位置されたカンプトテシンの存在下においてトポイソメラーゼによって誘導された三重ラセンの近傍におけるＤＮＡの開裂によって説明することができる。複合体はその有効性が異なり；１０−カルボキシカンプトテシンの誘導体ＴＦＯ１６、ＴＦＯ１６−Ｌ６−１０ＣＰＴおよびＴＦＯ１６−Ｌ４−１０ＣＰＴが最も効果的である（ほぼ６０％阻害）（図９参照）。結合アームの長さは阻害の有効性に大きく影響しない。インビトロ実験は、これらの複合体が、三重ラセンの３’末端から４ｂｐｓの部位「ｂ」において開裂を効果的に刺激することを示す（前記、図３参照）。インビトロにおいて同等に効果的であるが、１６−量体よりも特異性は低いＴＦＯ１８−Ｌ６−１０ＣＰＴ複合体は、ルシフェラーゼ遺伝子発現の４５％を阻害するに過ぎない。７−アミノエチルカンプトテシンを含むＴＦＯ１６−Ｌ６−７ＣＰＴ複合体は、対応するＴＦＯ１６−Ｌ６−１０ＣＰＴ複合体よりも効率は低く、ほぼ５０％阻害である。これは、阻害剤の開裂有効性についてのインビトロ結果と合致し：１０−カルボキシカンプトテシンは、７−アミノエチル−カンプトテシンよりも効果的にトポイソメラーゼ１によるＤＮＡの開裂を刺激する。観察された効果は、複合体のオリゴヌクレオチド部分による標的での三重ラセンの形成に確実によるものである。これは、２つの（ｐＭＴＵＣ）または３つの（ｐＭＵＴ）部位での三重ラセン配列における突然変異した標的での測定によって確認される。２つのプリン突然変異の存在は阻害の有効性を低下させ、三重ラセンは依然として形成されているが、事実上は少ない：オリゴ−ＮＨ2は３０％阻害〜ほぼ１５％通過し、ＴＦＯ１６−Ｌ６−１０ＣＰＴは６０％〜４５％複合体する。結合部位における３つのピリミジン突然変異の存在は阻害の全くの喪失を意味する。図７Ａおよび７Ｂ参照。
【０１３５】
合成されたＲＮＡ（ｐＩＷＴ）に対する複合体のアンチセンス効果を回避するために、逆鎖を持つプラスミド構築体を用いた。結果を図６Ｂに示す。対照はルシフェラーゼＰｙｒａｌｉｓの発現を阻害せず、複合体ＴＦＯ−Ｌ４−ＣＰＴは０．５μＭにおいてその発現を４０〜５０％阻害する。複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８は依然としてより効率的であり、０．５μＭにおいて５０〜６０％の阻害が測定される。前記複合体は、三重ラセン部位を有さないプラスミドｐＧＬ３Ｐｒ構築体に対して不活性であった。
【０１３６】
図８に対応する実験において、ＨｅＬａ核細胞（５００００００）を調製し、種々の濃度（図８では５μＭ）にて、遊離（ＣＰＴまたはＳＴ１５７８）、またはオリゴヌクレオチドにカップリングした（ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴまたはＴＦＯ−ＳＴ１５７８またはＬＮＡ−ＳＴ１５７８）トポイソメラーゼＩポイズンと共に、または対照オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ−ＮＨ２またはＴＦＯ−ＮＰｈ２）と共に３７℃にて３時間インキュベートした。サルコシルを添加した後、溶解物をＣｓＣｌの勾配にて１６時間超遠心した。１２の画分を回収し、ウェスタンスロットブロットによって分析して、トポイソメラーゼＩを含有する画分が示された（未処理対照（モック）ではＩ−４）。
【０１３７】
前記ＤＮＡを含有する画分は、２６０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって同定された（画分８〜１０）。トポイソメラーゼＩは、阻害剤（ＣＰＴまたはＳＴ１５７８）または複合体ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ−ＳＴ１５７８またはＬＮＡ−ＳＴ１５７８の存在下でＤＮＡを含有する画分のみで観察され、これはＤＮＡ／トポＩ開裂複合体の安定化を示唆する。対照ＴＦＯ（ＴＦＯ−ＮＨ２、ＴＦＯ−ＮＰｈ２）の使用に際して、トポイソメラーゼＩは、未処理細胞（モック）では最初の画分にのみ存在した。
【０１３８】
このアプローチでは、本発明者らは、複合体が、細胞システムで選択された部位にトポイソメラーゼによる特異的破壊を誘導することができることを示した。異なるトポイソメラーゼＩ阻害剤を用いることができ、阻害は阻害剤の固有の有効性に依存する。なぜなら、本発明者らは、６つのカンプトテシン誘導体およびインドロカルバゾール誘導体で観察したからである。
【０１３９】
阻害剤の効果を増加させるために、例えば、ＰＮＡ、ペプチド核酸、２’ＯＡＩｋｙｌリボ核酸、オリゴホスホルアミデート、ＬＮＡ（リボースの立体配座についてブロックされたＲＮＡ）のような化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【０１４０】
複合体は以下のものを目的とすることができる。
例えば、特定の（単一）遺伝子の発現に依存する病理学のためのヒトゲノムに、またはウイルスプロゲノム（例えば、ある種のウイルスＨＩＶおよびＨＳＶの発生を担う遺伝子）、または寄生虫のゲノムに存在する単一配列いずれか。次いで、複合体は遺伝子の選択的不活化を可能とする。
または病理の維持および発生に関与するいくつかの遺伝子に共通する標的配列（例えば、オンコジーン、成長因子、抗アポトーシス遺伝子、腫瘍細胞で観察される障害に参加する細胞周期および分裂を制御する遺伝子）。次いで、複合体は幾つかの遺伝子の同時制御を可能とする。
【０１４１】
事実、複合体のリガンド部分につき選択された結合部位の長さおよび配列によると、複合体の選択性は、単一遺伝子においてのみ目的とするために厳格であるか、あるいは遺伝子の群を標的とするために緩やかとすることができる。
【０１４２】
第一の場合において、統合されたウイルスのゲノムを標的化し、このゲノムにおいてのみ存在する配列に対して向けられた複合体によって特異的に開裂させることができる。本出願の範囲内では、本発明者らは、アプローチをＨＩＶ−ウイルスのＰＰＩを含むように拡大した。
【０１４３】
第二の場合において、ある種の腫瘍病理に関与するいくつかの遺伝子は、トポイソメラーゼＩによって特異的かつ同時に開裂させることができ、共通の標的配列を選択することができる。
【０１４４】
癌性特徴の獲得および維持に関連した遺伝子の同時阻害は、腫瘍細胞の悪性特性に対して特異的な必須の生化学的プロセスを標的化するのを可能とする。本発明者らは、成長シグナルの伝達、およびアポトーシスの阻害に関与する２つの群の遺伝子を選択した。最初の場合には、成長因子ＩＧＦ−１（インスリン−様成長因子−１）、その受容体ＩＧＦ−１Ｒ、および対応するシグナル化カスケードにおいて下流に位置する遺伝子を選択した。これらの遺伝子は細胞の生存経路を活性化し、膠芽細胞腫、肝細胞癌および前立腺腫瘍の増殖に関与する。アンチセンス構築体によるＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の阻害は、動物に移植された腫瘍の増幅をブロックする。第二の場合、目的は、癌性細胞にアポトーシスを誘導し、アポトーシス−抑制遺伝子（例えば、Ｃ−ＩＡＰ１／２、ＸＩＡＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎｅ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−Ｗ、ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１）に共通する配列を標的化することである。アポトーシスまたはプログラムされた細胞の死滅は、カスパーゼによって実行される細胞の制御された断片化である。前記プロセスは、アポトーシスを誘導するタンパク質とそれを阻害するタンパク質との間の平衡によって制御される。アポトーシス−阻害遺伝子は、細胞の寿命を延長することによって、細胞の悪性トランスフォーメーションに導く遺伝子事象の確立を増加させ；それらは、しばしば、癌細胞において過剰発現される。
【０１４５】
本発明者らは標的化することを望む遺伝子の群に共通する三重ラセンを形成することができる配列につきサーチするために、後者はＧＣＧ Ｕｎｉｘソフトウエアファインドパターンプログラム（Ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ、ＶｉｌｌｅｊｕｉｆによるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１）を用い、また、ＵＣＳＣヒトゲノムデータベースを用いた。
【０１４６】
ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴ／ＰＫＢ遺伝子に共通する１２塩基対（ｂｐｓ（ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧ）のオリゴピリミジン−オリゴプリン、および抗アポトーシスｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ＸＬおよびｓｕｒｖｉｖｉｎｅ遺伝子に共通する１０−ｂｐ配列（ＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧ）についての予備的サーチは、アプローチの可能性を示した。オリゴピリミジン・オリゴプリン配列の選択はアプローチを制限するものではない。というのは、これらの配列はヒトゲノムで過剰発現され、全遺伝子（調節領域、コーディングおよび非コーディング領域）は、三重ラセンを形成するオリゴヌクレオチドについての潜在的標的であるからである。さらに、図２に示されたオリゴヌクレオチドは、いくつかの遺伝子（表１）に存在する共通配列、例えば、癌性特性の獲得および維持に関与するＩＧＦ１ＲおよびＶＥＧＦを認識する。
【０１４７】
さらに、トポイソメラーゼ阻害剤は、通常は、開裂部位の周りのジヌクレオチドに制限されるある配列特異性を有することを忘れてはならない。事実、本発明者らは、複合体の三重ラセン部位への結合が強力な開裂を誘導するのに十分ではなく、三重ラセン部位の近傍における阻害剤に対して特異的な部位の存在は、トポイソメラーゼによる開裂の動員および誘導に対して大いに好ましいことが観察された。本発明者らは、これより、標的化配列は、好ましくは、オリゴヌクレオチドによって認識される部位のみならず、その近傍におけるトポイソメラーゼＩ阻害剤の部位を含み、従って、複合体の選択性を増大させると推定した。
【０１４８】
最後に、本発明者らは、オリゴヌクレオチドならびにＮ−メチルーピロールおよびＮ−メチルイミダゾールのポリアミドのようなＤＮＡリガンドに対するアプローチを確認したが、原理は、例えば、亜鉛フィンガーペプチドのような他のクラスのリガンドまで拡大することができる。
【０１４９】
本発明の主題は、
さらに、（特に、ＴＦＯ（三重ラセン形成性オリゴヌクレオチド）−トポイソメラーゼ阻害剤を含む）複合体による開裂が、より効果的には、標的のオリゴピリミジン鎖上の三重鎖の３’側のトポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された開裂部位と共に、２〜１００、好ましくは２〜３０の多数のプリンを含む前記オリゴピリミジン・オリゴプリン標的遺伝子の各配列に向けられることを特徴とする上記定義された方法、
さらに、トポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された前記切断部位が、三重ラセンの末端から１〜１０ヌクレオチドに位置することを特徴とする上記定義された方法、
さらに、前記標的遺伝子の配列が、病理学に関与する遺伝子上のヒトゲノムに存在する単一標的配列、またはウイルスまたは寄生性遺伝子のみに存在し、ヒトゲノムでは存在しない標的、または病理の維持または発生に関与する遺伝子の群に存在する配列いずれかであることを特徴とする上記定義された方法；
でもある。
【０１５０】
本発明者らは、さらに：
本発明による方法で有用な複合体は、細胞増殖、成長因子またはホルモン受容体シグナル伝達、および抗アポトーシス剤の群に作用することができる新しい効果的な抗腫瘍剤を構成するはずであり、
トポイソメラーゼＩ阻害剤にカップリングした前記副溝リガンドは、酵素による直接的開裂をリガンドの結合部位に選択的に向け、オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体と同一の適応を有する；
ことを提案しおよび／または示した。
【０１５１】
文献
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【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、特異的部位におけるトポイソメラーゼＩによるＤＮＡの開裂／切断を標的化する原理を示すダイヤグラムである。
【図２．Ａ】図２．Ａは、公知の研究システム：標的オリゴプリン・オリゴピリミジン配列および対応する三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の配列を含む３２４−ｂｐ二重鎖を示す説明図である。
【図２．Ｂ】図２．Ｂは、カンプトテシン誘導体ＳＴ１５７８、ＳＴ２５４１およびＳＴ２６７７、ならびに複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８、ＴＦＯ−ＳＴ２５４１，ＴＦＯ−Ｌ４−ＳＴ２６７７およびＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴの式を表す説明図である。
【図３．Ａ】図３．Ａは、トポイソメラーゼＩ開裂部位を表す説明図である。
【図３．Ｂ】図３．Ｂは、本発明による他の複合体で得られた結果を表す説明図である。
【図４】図４は、標的のオリゴプリン鎖上の三重ラセンの５’側の開裂およびオリゴピリミジン鎖上の３’側の開裂を誘導することを示す説明図である。
【図５．Ａ】図５．Ａは、実験構築を表す説明図である。
【図５．Ｂ】図５．Ｂは、標的二重鎖、ＴＦＯおよび対照オリゴヌクレオチド配列などを示す説明図である。
【図６．Ａ】図６．Ａは、ＨｅＬａ細胞におけるＰｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子の転写の阻害を説明する説明図である。
【図６．Ｂ】図６．Ｂは、逆鎖でのプラスミド構築を用いる場合に得られた結果に関する説明図である。
【図７．Ａ】図７．Ａは、複合体の存在下における三重鎖の形成および強力な特異的破壊の存在（実施例Ａ）および、対照的に、三重ラセン部位での突然変異の場合における三重鎖の形成の、およびＤＮＡの特異的開裂の不存在（実施例Ｂ）および開裂部位ｂおよびｃにおける突然変異した二重鎖の場合における、三重鎖の形成、三重鎖部位の３’末端におけるトポＩ−媒介ＤＮＡ開裂部位の不存在（実施例Ｃ）を示す説明図である。
【図７．Ｂ】図７．Ｂは、複合体の存在下における三重鎖の形成および強力な特異的破壊の存在（実施例Ａ）および、対照的に、三重ラセン部位での突然変異の場合における三重鎖の形成の、およびＤＮＡの特異的開裂の不存在（実施例Ｂ）および開裂部位ｂおよびｃにおける突然変異した二重鎖の場合における、三重鎖の形成、三重鎖部位の３’末端におけるトポＩ−媒介ＤＮＡ開裂部位の不存在（実施例Ｃ）を示す説明図である。
【図８．Ａ】図８．Ａは、ＤＮＡ／トポ Ｉ／ＣＰＴ複合体の形成に伴う生物学的効果の相関結果を示す説明図である。
【図８．Ｂ】図８．Ｂは、ＤＮＡ／トポ Ｉ／ＣＰＴ複合体の形成に伴う生物学的効果の相関結果を示す説明図である。
【図９】図９は、本発明の方法で有用なある種の複合体／複合体の（阻害剤単独と比較した開裂強度、および与えられた部位ａ、ｂ、ｃおよびｄの点における）有効性を示す説明図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生成物、それらの調製工程、それらの使用方法、およびいくつかの遺伝子に対する不可逆的病巣を誘導することによって病理学に関与するこれらの遺伝子の発現を同時に阻害することを可能とするそれを含む組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、選択された配列を選択的に標的化し、与えられた病理学につき関係のある幾つかの遺伝子によって共有された共通する配列を同時に阻害する方法および生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
三重ラセン形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、ある種の遺伝子の発現に特異的に干渉することを目的として、Ｍｕｓeｕｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄ’Ｈｉｓｔｏｉｒｅ Ｎａｔｕｒｅｌｌｅ ＵＳＭ ０５０３ Ｕｎｉｔ ＩＮＳＥＲＭ ＵＲ５６５、ＣＮＲＳ ＵＭＲ ５１５３の生物物理研究所で開発された。これらのＴＦＯは他の適用、例えば、プラスミドの精製または標的配列の化学的修飾で用いられてきた。１９９７年に、インビトロ研究は、カンプトテシンの誘導体、トポイソメラーゼＩ阻害剤または、より正確には、ポイズンの、三重ラセン形成性オリゴヌクレオチドへの化学的カップリングは、トポイソメラーゼＩによるＤＮＡの切断を、三重ラセンオリゴヌクレオチドによって標的化されたオリゴピリミジン−オリゴプリン配列に特異的に向けることを示した（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Sｏｃ．１１９（１９９７）ｐｐ６９３９−６９４０）。
【０００３】
本発明者らの刊行物、特に本発明者らの公表において既に記載されているように（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．１９９９，２０００，２００１ａ，ｂ，２００２）、特異的ＤＮＡリガンドにカップリングしたトポイソメラーゼＩ阻害剤は、ＤＮＡリガンドの結合部位に対して特異的となる。本発明との関係では、前記ＤＮＡリガンドに共有結合した生成物トポイソメラーゼＩポイズンは以後複合体ともいう。このアプローチは、その作用メカニズムが腫瘍状態に関与する単一遺伝子の選択的変調に基づく抗腫瘍剤の開発を可能とする（図１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
カンプトテシン（略してＣＰＴ）の２つの誘導体のようなある種のトポイソメラーゼＩ阻害剤が臨床的実践で用いられているが、恐らくは、その低い配列特異性に関係してかなりの毒性レベルを有する。
【０００５】
抗腫瘍薬物の選択性の問題もまた、抗生物質のような他のタイプの化学療法薬物に存在する。
【０００６】
薬物の標的化は現代の療法において一般的問題としてとらえることができ、それは、代謝異常および自己免疫疾患も含む。
【０００７】
今回、リンカーアームによって結合された、トポイソメラーゼＩポイズンおよびＤＮＡ配列−特異的リガンドを含む特異的複合体が、その発現が病気、特に腫瘍または感染症に関連する、注目すべき遺伝子に対して、トポイソメラーゼＩポイズンの作用を特異的に向けることができることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
先行技術で言及された問題および欠点は本発明によって解決され、本発明の主な主題は以下の通りである。
【０００９】
まず、本発明は、式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、Ａは病理学的に注目される遺伝子に共通した配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；ＣはトポイソメラーゼＩポイズンである］の化合物の、遺伝子の発現によってもたられる病気の治療の医薬品の調製のための使用であって、前記遺伝子が安定化されたトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂によって阻害される使用に関する。
【００１０】
本発明の開発においては、本発明者らは、本発明の特定の目的である式Ａ−Ｂ−Ｃの新しい化合物も見出した。
【００１１】
本発明は、前記化合物の調製工程、それらを含む組成物、新しい薬物の開発において、および薬理学的テストにおいて前記化合物を用いる方法にも関する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、特に腫瘍の発生および維持に関与する病理学的に注目されるタンパク質、またはウイルスおよび病原体タンパク質、または代謝異常または自己免疫タンパク質に関与するタンパク質につきコードするいくつかの標的遺伝子の発現を同時に阻害する方法であって、
（ｉ）少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤において前記複合体による前記遺伝子に特異的な部位に向けられる少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤の作用を、前記標的遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列−特異的リガンドに向け、
（ｉｉ）ゲノム中の前記遺伝子を前記複合体の前記リガンドによって認識し、前記リガンドの前記標的への結合を得、
（ｉｉｉ）トポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を誘導し、前記遺伝子の発現を阻害する；
工程を含む前記方法である。
【００１３】
本発明によると、この方法は特にインビトロおよびインビボで行うことができる。
【００１４】
前記構成を用いることによって、トポイソメラーゼＩ阻害剤（類）の効果をＤＮＡ−特異的部位に向け、トポイソメラーゼＩによるこれらの部位における破壊を選択的に誘導することが可能である。ＤＮＡ−特異的リガンドにカップリングした阻害剤（類）は、ＤＮＡリガンド固定部位に対してそれら自体が特異的となる。有利には、標的化されたＤＮＡ配列は、病理学の種類に依存して選択することができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態によると、前記遺伝子は、その発現が細胞の腫瘍状態の発生および維持を制御するものから選択される。特に好ましい実施形態において、遺伝子はＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＶＥＧＦ、ＢＣＬ２からなる群より選択される。
【００１６】
本発明のもう１つの好ましい実施形態によると、前記遺伝子は、感染性微生物またはウイルスの中から選択される。特に好ましい実施形態において、遺伝子はＨＩＶまたはＨＣＶウイルスからなる群より選択される病原体のものである。
【００１７】
本発明のなおさらに好ましい実施形態によると、前記遺伝子は代謝異常病に関与するものから選択される。
【００１８】
本発明のなおさらなる好ましい実施形態によると、前記遺伝子は自己免疫疾患に関与するものから選択される。
【００１９】
本発明によると、トポイソメラーゼＩ阻害剤、またはより正確にはポイズンは、トポイソメラーゼＩの触媒作用によって媒介されるＤＮＡ／トポＩ開裂複合体を安定化する分子である。前記ポイズンは、有利には、インドロカルバゾールおよびその誘導体のような挿入剤、カンプトテシンおよびその誘導体のような非挿入剤、ベンズイミダゾールおよびその誘導体のような副溝リガンドからなる群より選択される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によると、前記ポイズンはカンプトテシン、より好ましくはカンプトテシン誘導体である。
【００２１】
好ましいカンプトテシン誘導体は式（Ｉ）：
［式中、Ｒ1は−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）n−Ｒ4基であり、ｎは数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルまたはＣ2−Ｃ8アルケニル基、またはＣ3−Ｃ10シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、またはＣ6−Ｃ14アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、ケト、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖または分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、フェニルであり；あるいはＲ4は、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ6−Ｃ10）アリールまたは（Ｃ6−Ｃ10）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルであり；あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基、特に、−（ＣＨ2）m−ＮＲ12−（ＣＨ2）p−ＮＲ13−（ＣＨ2）q−ＮＨ2であり、ｍおよびｐは２〜６の整数であり、ｑは０〜６の整数であり、両端は含まれ、Ｒ12およびＲ13は直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル基、例えば、Ｎ−（４−アミノブチル）−２−アミノエチル、Ｎ−（３−アミノプロピル）−４−アミノブチル、Ｎ−［Ｎ−３−アミノプロピル）−Ｎ−（４−アミノブチル）］−３−アミノプロピルであり；あるいはＲ4はグリコシル残基、例えば、６−Ｄ−ガラクトシルまたは６−Ｄ−グルコシルであり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、Ｃ6−Ｃ14アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖または分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシである］の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩である。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物の好ましい例は、ｎが１であり、Ｒ4が２−アミノエチルまたは３−アミノプロピルであり、Ｒ2およびＲ3が水素である化合物である（これらの化合物は、各々、本明細書中ではＳＴ１５７８およびＳＴ２５４１ともいう）。
【００２３】
これらの化合物は、ＷＯ ００／５３６０７に十分に開示されており、技量のあるリーザーはそれを参照する。
【００２４】
もう１つの好ましいカンプトテシン誘導体は式（ＩＩ）：
［式中、Ａは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ3−Ｃ10シクロアルキル−Ｃ1−Ｃ8アルキルであり；ｎおよびｍが１に等しい場合、ＹはＮＲ12Ｒ13またはＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14で置換された飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルであり、同一または異なっていてもよいＲ12、Ｒ13およびＲ14は水素もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ4アルキルであり、あるいはＹはＢＣＯＯＸであり、Ｂはアミノ酸の残基であり、ＸはＨ、利用可能な位置でＣ1−Ｃ4アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキルから選択される少なくとも１つの基で置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ4アルキル、ベンジルまたはフェニルであり、あるいはもしｎおよびｍが共に０であるならば；Ｙは内部塩の形態、および医薬上許容される酸のアニオンとの塩の形態の双方である４−トリメチルアンモニウム−３−ヒドロキシブタノイルであり、あるいはＹは上記定義されたＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14であり；Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）p−Ｒ4基であり、ｐは数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルまたはＣ2−Ｃ8アルケニル基、またはＣ3−Ｃ10シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、またはＣ6−Ｃ14アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリール−アルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、ここで同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ6−Ｃ10）アリールまたは（Ｃ6−Ｃ10）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルであり；あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいはＲ4はグリコシル残基であり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、Ｃ6−Ｃ14アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシである］の化合物、Ｎ1−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩である。
【００２５】
式（ＩＩ）の化合物の好ましい例は、ｐが１であり、Ｒ4がｔｅｒｔ−ブチルである化合物であり、特に好ましい化合物はスクシニル−バリル−２０−Ｏ−（７−テルブトキシイミノメチルカンプトテシン）（ここではＳＴ２６７７という）である。
【００２６】
これらの化合物はＷＯ ０３／１０１９９６に十分に開示されており、技量のあるリーザーはそれを参照する。
【００２７】
もう１つの好ましいカンプトテシン誘導体は式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
［式中、Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）p−Ｒ4基であり、ｐは整数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキルまたはＣ2−Ｃ8アルケニル基、またはＣ3−Ｃ10シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ5）アルキル基、またはＣ6−Ｃ14アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリール−アルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ1−Ｃ9アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、および−ＮＲ6Ｒ7からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ6−Ｃ10）アリールまたは（Ｃ6−Ｃ10）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ9アルキルであり；あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいはＲ4はグリコシル残基であり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ2−Ｃ8アルケニル、Ｃ3−Ｃ10シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ3−Ｃ10）シクロアルキル−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、Ｃ6−Ｃ10アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ6−Ｃ14）アリール−（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ8アルコキシであり；ｎ＝１または２であり、Ｚは水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ1−Ｃ4アルキルから選択される］の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、およびその医薬上許容される塩である。
【００２８】
これらの化合物はＷＯ ０３／１０１９９５に十分に開示されており、技量のあるリーザーはそれを参照する。
【００２９】
もう１つの好ましいカンプトテシンはＡｒｉｍｏｎｄｏ Ｐ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１４；４０３１−４０４０に開示されたもの、特に、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンである。さらにもう１つの好ましい化合物は１０−ヒドロキシカンプトテシンである。
【００３０】
前記リガンドはリボ核酸、デオキシリボ核酸、ＰＮＡ、ペプチド核酸、２’Ｏ−アルキルリボ核酸、オリゴホスホルアミデート、ＬＮＡ（リボース立体配座につきブロックされたＲＮＡ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ ２００３）は、それが三重ラセンを形成する場合はＴＦＯと呼ばれ、それが副溝に結合する場合はＭＧＢと呼ばれる）からなる群より選択される。後者はＮ−メチルピロール、Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−メチル−３−ヒドロキシピロールのポリアミド、ならびにβ−アラニンから選択される。
【００３１】
また、本発明の目的物は式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、Ａは病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；Ｃは前記式（Ｉ）〜（ＩＶ）のカンプトテシン誘導体である］の化合物である。
【００３２】
本発明の一般的な教示においては、前記した化合物のエレメントＡおよびＣはポイズン分子の異なる位置を通じてリンカーアームによって結合させることができ、但し、この位置はリガンドに結合すべき適当な官能基を有するものとする。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、カンプトテシン誘導体を用い、リガンドＡは好ましくは位置７、１０または２０においてカンプトテシン分子に結合することができる。
【００３４】
適当なリンカーアームは、１〜５０、好ましくは２０〜３０の長さの、ＮまたはＯを含む基において選択される炭素およびヘテロ原子の連続；およびホスホルアミドまたはアミド結合、またはチオエステルを与えるように反応することができる末端部位を含む。
【００３５】
そのようなリンカーアームの例は、ｎが１〜１２の整数である−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＮＨ−のようなジアミノアルキル；ｎが２〜６の整数であって、ｍが２〜３である−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯ―、グリコール−（ＣＨ2）mＯ）n−である。
【００３６】
前記実施形態による複合体の例はＴＦＯ−Ｌ３−ＳＣＰＴ、および（３＋３）−ＣＰＴ、（４＋４）−ＣＰＴ、ＴＦＯ−１８−Ｌ６−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ−１８−Ｌ４−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ １６−Ｌ６−１０ＣＰＴ、およびＴＦＯ１６−Ｌ４−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ１６−Ｌ６−７ＣＰＴ、ＴＦＯ１８−Ｌ６−７ＣＰＴ、ＳＣＰＴ−Ｌｎ―ＴＦＯ、ＴＦＯ−Ｌ４−ｃＣＰＴ、ＴＦＯ−Ｌ６−ｃＣＰＴからなる群より選択され、ＴＦＯは三重ラセン形成性オリゴヌクレオチドであり、ＬはＣＨ2基の数であり、ＣＰＴはカンプトテシン誘導体である。（３＋３）および（４＋４）はヘアピンポリアミドである。
【００３７】
他の複合体はレベッカマイシン；特にポイズンとしてのレベッカマイシンのインドロカルバゾール誘導体を含む。
【００３８】
そのような複合体の例はＴＦＯ−Ｌn−ＲＢＣ（Ｌn＝−Ｏ（ＣＨ2）2Ｏ）n−、n＝２；３または６）である。
【００３９】
本発明のもう１つの実施形態によると、前記複合体は、前記したようなリガンド、前記トポイソメラーゼＩ阻害剤の誘導体よりなり、前記リンカーアームが阻害剤の置換基に組み入れられていることを特徴とする二元複合体である。前記置換基は、ホスフェートまたはホスホチオエート基と反応することができる末端部位を含む。そのような複合体の例はＴＦＯ−ＳＴ１５７８およびＴＦＯ−ＳＴ２５４１ならびに式（Ｉ）〜（ＩＶ）の関連化合物である。
【００４０】
複合体の第三の群は、それがリガンド、前記リンカーの一部の役割を果たす基によって置換された前記トポイソメラーゼＩポイズンの誘導体および、さらに、リンカーアームよりなることを特徴とする。その例はｎが２および６の間の整数であるＴＦＯ−（ＣＨ2）n―ｃＣＰＴ；ＴＦＯ−（ＣＨ2）3−ＳＣＰＴ、ＳＣＴ−ＴＦＯ、ＴＦＯ−ＳＴ２６７７である。
【００４１】
上述したように、本発明の複合体は、位置２および３０の間に多数のプリンを含有する前記標的遺伝子の各オリゴピリミジン・オリゴプリン配列の近傍にトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を起こす。ＤＮＡ／トポＩ開裂複合体の幾何学のため、切断部位は標的のオリゴピリミジン鎖上の三重鎖の３’側となるべきである。
【００４２】
この化学化合物は、トポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された前記開裂部位がリガンド結合部位の末端から１〜１０ヌクレオチドに位置することも特徴とする。
【００４３】
置換基の例はｎが２〜６の整数であるＨ2Ｎ（ＣＨ2）n−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−のような、所望により不飽和を持つジアミノアルキル、および式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物のＲ4基に認識可能な基を含む。他の置換基は−ＣＯ−ＮＨ−基−を含むジカルボン酸鎖を含む。
【００４４】
そのような基は、例えば、
［式中、ＲはＣ1−Ｃ4直鎖もしくは分岐鎖アルキルであり、ｎ’は１〜６の整数である］である。
【００４５】
本発明の複合体においては、阻害剤は例えばカンプトテシンであって、置換基はその位置２０を占める。
【００４６】
本発明のさらにもう１つの実施形態によると、複合体は、上記定義されたようなリンカーアームを介して阻害剤の置換基に連結されたリガンドを含む。
【００４７】
また、本発明は前記複合体の製法に関する。ホスホルアミド結合はＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．２０００に記載されているように４−ジメチルアミノピリジンの存在下でのトリフェニルホスフィンおよびジピリジルジスルフィドとの反応によって得られ；他方、アミド結合はこの方法によって、酸機能のカルボジイミド活性化によって、またはＨＡＴＵの使用に際しての修飾されたペプチド合成手法によってのいずれかによって形成される。
【００４８】
前記複合体は、有利には、細胞増殖抑制分子と比較して、新しいメカニズムを介して有効である。例によって示されたように、前記複合体は細胞に貫入し、その標的に結合する。
【００４９】
従って、本発明の新しいアプローチは、副作用を減少させつつ、最適な抗腫瘍効果を維持することを目的とする。
【００５０】
例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤の使用は、ほぼ１５％の場合において、今回よく特徴付けられた遺伝子の逆移動によって特徴付けられる二次白血病の出現と関連することが確立される。ある種の選択された遺伝子にこれらの阻害剤を向けることは、治療効果の良好な選択性を可能とすることによってその白血病形成力を低下させることができる。
【００５１】
また、本発明は、注目すべき遺伝子、またはいくつかの遺伝子の同時発現を特異的に阻害する方法における前記複合体の使用に関し、この遺伝子またはこれらの遺伝子は、例えば、１以上のウイルスまたは病原体タンパク質、または細胞の腫瘍状態の発生および維持に関与するタンパク質をコードする。
【００５２】
有利には、単一オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体は、現在の臨床で用いられる抗腫瘍薬物の組合せと類似の効果を有することができると判断されるであろう。複合体によって標的とされる部位の数は、単独で用いる場合のＣＰＴと比較してかなり低下する。
【００５３】
従って、本発明は、医薬的に不活性な溶剤と組み合わせた有効量の少なくとも１つの上記定義された複合体を含むことを特徴とする医薬組成物にも関する。
【００５４】
これらの組成物は、有利には、注射またはスプレーによるその投与を可能とする形態である。単位および日用量は病理学のタイプ、特に、治療すべき癌によって当業者によって測定されるであろう。この関連で、最先端技術水準で開示された複合体のいくつかはインビトロ、無細胞システムでおいてのみテストされた。本発明者らは、前記化合物を細胞に投与するのは不可能でないとしても非常に困難であることを見出した。従って、新しい化合物の態様および公知の化合物の使用の態様双方における本発明の化合物は、無細胞システムにてトランスフェクションベクターを共に投与されるべきである。トランスフェクションベクターの例はナノ粒子、リポソーム、カチオン性脂質、およびカチオン性ポリマーである。
【００５５】
全く驚くべきことには、Ｃが式（Ｉ）〜（ＩＶ）のカンプトテシン誘導体、特に、コードＳＴ１５７８およびＳＴ２６７７で確認されるカンプトテシン誘導体である化合物は、細胞に投与されるのにいずれのトランスセクションベクターも必要としない。というのは、それはエキソ・ビボで細胞膜を貫通するからである。従って、Ｃが式（Ｉ）〜（ＩＶ）のカンプトテシン誘導体、特に、コードＳＴ１５７８およびＳＴ２６７７で確認されるカンプトテシン誘導体である化合物Ａ−Ｂ−Ｃを含む組成物および薬物は、有利には、補充的トランスフェクションベクターを必要とせず、従って、その生物学的適用をより簡単なものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明の他の特徴および利点は、化学文献ならびに添付の図面を参照して、以下の実施例によって与えられる。
【００５７】
図１は、特異的部位におけるトポイソメラーゼＩによるＤＮＡの開裂／切断を標的化する原理を示すダイヤグラムである。
図２Ａは、公知の研究システム：標的オリゴプリン・オリゴピリミジン配列および対応する三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の配列を含む３２４−ｂｐ二重鎖を示す。
（例えば、５−メチル−デオキシシトシン（Ｍ）および５−プロピニル−デオキシウラシル（Ｐ）を用いることによって）三重ラセンを形成するオリゴヌクレオチド（ＴＦＯ１６、ＴＦＯ１８、ＴＦＯ２０、ＴＦＯ２３）を修飾して複合体の安定性を増加させた。ＴＦＯを２０Ｓ−１０−カルボキシカンプトテシン（１０ＣＰＴ）、２０Ｓ−７−アミノエチルカンプトテシン（７ＣＰＴ）、２０Ｓ−７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン酢酸（ＳＣＰＴ）、２０Ｓ−７−アミノエチルイミノメチルカンプトテシン（ＳＴ１５７８）、２０Ｓ−７−アミノプロピルイミノメチルカンプトテシン（ＳＴ２５４１）に、およびスクシニル−バリル−２０−Ｏ−（７−テルブトキシイミノメチルカンプトテシン）（ＳＴ２６７７）にカップリングさせた。
（３＋３）および（４＋４）ヘアピンポリアミドタイプの２つの副溝リガンドを１０−カルボキシカンプトテシン（１０ＣＰＴ）にカップリングさせた。
ＴＦＯ１６の、および２つの副溝リガンドの結合部位は四角によって示す。オリゴヌクレオチドはオリゴプリン・オリゴピリミジン配列に結合し、ワトソンークリック塩基対のプリンとでＨｏｏｇｓｔｅｅｎ−タイプの水素結合を形成する。副溝リガンド（３＋３）および（４＋４）は結合し、副溝と相互作用する。複合体の化学式は図面の下方の部分で示され、リンカーアームはイタリック体で表す。オリゴヌクレオチドはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社（ベルギー国）から入手し、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １９（２０００）ｐｐ．１９４３−１９６５に記載された方法に従って、ＨＡＴＵの使用に基づく適合されたペプチド合成手法によって阻害剤とカップリングさせる。副溝リガンドはＡｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ． Ｅｄ．４０（２００１）ｐｐ．３０４５−３０４８に記載されたように合成した。
【００５８】
図２Ｂは、カンプトテシン誘導体ＳＴ１５７８、ＳＴ２５４１およびＳＴ２６７７、ならびに複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８、ＴＦＯ−ＳＴ２５４１，ＴＦＯ−Ｌ４−ＳＴ２６７７およびＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴの式を表す。
【００５９】
図３Ａは、トポイソメラーゼＩ開裂部位を表す。オリゴピリミジン鎖（ウェル１）上の位置３’における放射性標識３２４−ｂｐ二重鎖を、三種のカンプトテシン誘導体（ウェル２〜４、１０ＣＰＴ、７ＣＰＴ、ＳＣＰＴ）の、ＴＦＯ１６と複合体したこれらの三種の誘導体（ウェル５〜７、ＴＦＯ１６−Ｌ４−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ１６−Ｌ６−ＣＰＴ、ＴＦＯ１６−Ｌ３−ＳＣＰＴ）の存在下で、トポイソメラーゼＩと共にインキュベートした。開裂部位は文字によって示し、複合体の結合部位は図式によって示す。Ｌ３＝ジアミノプロピニル；Ｌ４＝ジアミノブチル、Ｌ６＝ジアミノベキシル；インキュベーションの後、ＳＤＳ／プロテナーゼでの処理によってタンパク質を消化し、開裂産物を変性ゲルで分析する。
【００６０】
図３Ｂは、本発明による他の複合体で得られた結果を表し、ＤＮＡは、単独、あるいは５μＭの１０ＣＰＴ、ＳＴ１５７８、ＳＴ２６７７またはＳＴ２５４１、または１μＭの非複合体ＴＦＯと共にトポイソメラーゼの存在下で対照として用いる。１μＭにおいては、全ての複合体は、オリゴヌクレオチドの結合部位の３’側のみにおいてヒトトポイソメラーゼによるＤＮＡの開裂を指令し、阻害剤は三重ラセンの形成による位置である（部位ｂ）。ｎＴＦＯは未修飾シチジンおよびチミジンを担う。
対照的に、阻害剤単独は数個の部位（部位ａ、ｂ、ｃおよびｄ）において開裂を刺激する。
複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８およびＴＦＯ−ＳＴ２５４１は複合体ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴよりも３倍効果的である。
複合体ＴＦＯ−Ｌ４−ＳＴ２６７７は複合体ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴに匹敵する。
また、もう１つの化学的に修飾されたＴＦＯ、すなわち、配列＋ＣＰ＋ＣＰ＋ＣＰ＋ＣＰ＋ＣＰ＋ＴＰ＋ＴＰ＋ＴＰ（ここで、ＣはＬＮＡシチジンを示し、＋Ｔ＝ＬＮＡチミジンである）を有するＬＮＡ（ロックされた核酸）についても結果を掲げる。
ＬＮＡを一工程合成にてＳＴ１５７８に結合させて、ＬＮＡ−ＳＴ１６７８複合体を得た。部位ｂにおける開裂を指令する効果を評価した。前記複合体はＴＴＦＯ−ＳＴ１５７８アナログよりも２倍効果は低かった。
ＤＮＡ／トポＩ開裂複合体の分子拘束は三元複合体の幾何学を支配し、結合した三重ラセン形成性オリゴヌクレオチドの存在下でＤＮＡ開裂を指令する。
【００６１】
図４は、これは好ましい部位であるか否かを問わず、標的のオリゴプリン鎖上の三重ラセンの５’側の開裂およびオリゴピリミジン鎖上の３’側の開裂を誘導することを示す。位置３’におけるオリゴヌクレオチド上の阻害剤の存在は、シグナルを増幅する効果を有する。
【００６２】
図５Ａは、実験構築を表す：用いたプラスミドは、ＳＶ４０プロモーターの制御下にあるＰｙｒａｌｉｓ ルシフェラーゼ遺伝子を含む、ｐＧＬ３プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の転写されたおよび非翻訳領域においてＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｃｏ Ｉ部位で５４−ｂｐ二重鎖をクローニングすることによって得られた。ＴＦＯ結合の配列、およびその近傍におけるカンプトテシンに感受性の部位を、Ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）の上流の転写体領域に置く。インビトロの実験で用いる無傷三重ラセン配列（Ｐｗｔ）；３部位で突然変異した三重ラセン配列（ｐＭＵＴ）；三重ラセン配列および３’側の、カンプトテシンによって刺激された公知の開裂部位（ｐＴＩＤ）、およびＴＦＯのいずれかのアンチセンス効果を回避するための対向鎖に挿入された無傷三重ラセン配列を含んだ５４−ｂｐのインサート。
【００６３】
図５Ｂは、標的二重鎖、ＴＦＯおよび対照オリゴヌクレオチド配列を与え：ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴを複合体および、対照としての、ホスフェート（化合物ＴＦＯＦ）によって、または１０ＣＰＴ、ＮＨ2−（ＣＨ2）4−ＮＨ2（化合物ＴＦＯ−ＮＨ２）のカップリングで用いるリンカーアームによって３’で保護されたオリゴヌクレオチドとして用いた。前記アームをジフェニル酢酸（化合物ＴＦＯ−ＮＰｈ２）に連結した。最後の対照として、同一の修正された塩基を含有するオリゴヌクレオチドを用いたが、異なる配列でもって、３’におけるホスフェート（１６ＨＩＶＵＰ）、１０ＣＰＴのいずれかに、リンカーアームＮＨ2−（ＣＨ2）6−ＮＨ2（化合物１６ＨＩＶ−ＣＰＴ）を介して連結した。次いで、複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８をＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴと比較した。
【００６４】
図６Ａは、最初に、これらの分子につき、ＨｅＬａ細胞におけるＰｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子の転写の阻害を説明する。ヒト接着ＨｅＬａ細胞を、３７℃および１０％ＣＯ2において、ＦＣＳ１０％を補足したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を、１２５μＬ／ウェルにて９６ウェルプレートに接種した（１１００００細胞／ｍＬ）。２４時間後、培地を、１１２．５μＬの新鮮な培地および１２．５μＬのトランスフェクション混合物と交換する。前記トランスフェクション混合物は、１μｇのｐＧＬ３Ｐｒまたは修飾されたもので；０．５μｇのｐＲＬ−ＴＫ、種々の濃度のオリゴヌクレオチドおよび３μＬのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（ＱＩＡＧＥＮ）を無血清倍地中に含有する。混合物は二連または三連で調製した。２４時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ発現を評価した。デュアル−ルシフェラーゼ（商標）レポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、同一細胞溶解物での双方のレポーター（ＰｙｒａｌｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ）の活性を測定し；９６−ウェルプレートの各ウェルを３０μＬの受動的溶解緩衝液中で溶解させ、１５μＬを自動装置（Ｖｉｃｔｏｒ／Ｗａｌｌａｃ）にて「Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（デュアル−ルシフェラーゼ（商標）レポーターアッセイシステム）」で分析した。双方の活性（ＰｙｒａｌｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ）の間の比率を用いて、効果の選択性を測定した。異なるオリゴヌクレオチドの存在下における双方の活性の間の比率の全ての値を、複合体（ＤＮＡ）の不存在下におけるプラスミドの発現に対して正規化した。対照オリゴヌクレオチドは、Ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの発現に対して効果を有さなかった。複合体ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴのみが、無傷三重ラセン配列（ｐＴＩＤおよびｐＷＴ）を含有する双方の標的に対して、０．５μＭにおいて約４０〜５０％からその発現を阻害する。
インサートを有さない市販のプラスミドｐＧＬ３Ｐｒについては、複合体は効果を有さず、突然変異した三重ラセン（ｐＭＵＴ）を有するものについては大いに低下する。
【００６５】
図６Ｂは、逆鎖でのプラスミド構築を用いる場合に得られた結果に関する。
図７Ａおよび７Ｂは、複合体の存在下における三重鎖の形成および強力な特異的破壊の存在（実施例Ａ）および、対照的に、三重ラセン部位での突然変異の場合における三重鎖の形成の、およびＤＮＡの特異的開裂の不存在（実施例Ｂ）および開裂部位ｂおよびｃにおける突然変異した二重鎖の場合における、三重鎖の形成、しかしながら、三重鎖部位の３’末端におけるトポＩ−媒介ＤＮＡ開裂部位の不存在（実施例Ｃ）を示す。
図８は、ＤＮＡ／トポ Ｉ／ＣＰＴ複合体の形成に伴う生物学的効果の相関結果を与え：細胞中の複合体の形成に続いて、イムノブロットを行った。
図９は、本発明の方法で有用なある種の複合体／複合体の（阻害剤単独と比較した開裂強度、および与えられた部位ａ、ｂ、ｃおよびｄの点における）有効性を示す。
【００６６】
ＤＮＡ配列を特異的に認識することができるオリゴヌクレオチドにトポイソメラーゼ阻害剤を複合体させることによって、選択された遺伝子に共通する標的配列での特異的三重ラセン複合体の形成のため、選択された遺伝子の群に対して阻害剤を標的化することが可能である。従って、これらの遺伝子についての不可逆的病巣を選択的に誘導し、その発現を阻害するのが可能となる。
【００６７】
これは、特に、トポイソメラーゼＩ阻害剤の、オリゴヌクレオチドのような配列−特異的ＤＮＡリガンド、または副溝リガンドのような非核酸リガンド（Ｎ−メチルピロールおよびイミダゾールよりなるポリアミド）、または亜鉛フィンガーペプチドとの共有結合カップリングを用い、本来公知の方法で達成することができる。
【００６８】
事実、そのようなリガンドは、各々、二重ラセンの主溝および副溝における結合によって、ある種のＤＮＡ配列を特異的に認識することができる。トポイソメラーゼＩ阻害剤のこれらのＤＮＡリガンドへの化学的カップリングは、阻害剤を、リガンドの結合部位の近傍に選択的に位置させ、従って、トポイソメラーゼＩによって誘導される破壊をこの部位に選択的に向ける。
【００６９】
本発明者らは、従って、細胞の腫瘍状態の増殖および維持へのその関与につき選択された遺伝子または遺伝子の群へトポイソメラーゼ阻害剤を標的化することに基づいて新しい概念を開発した。これらの遺伝子は、例えば、細胞周期および分裂、増殖を制御する遺伝子から、および抗アポトーシス遺伝子から選択される。また、ウイルス遺伝子はこの戦略で標的化することもできる。
【００７０】
選択されたオリゴヌクレオチドの長さに応じて、選択性を変調して、単一遺伝子のみにおいて狙うか、あるいは緩和して、次いで、遺伝子の群を阻害することができる。
【００７１】
抗腫瘍化学療法におけるこの革新的戦略は、数個の遺伝子／機能の同時阻害を明らかに治療的重要な他の病理学まで拡大することができる。
【００７２】
後に記載する薬理化学のアプローチの有用性は、本質的には、１つは標的のＤＮＡを認識し、他方はトポイソメラーゼを動員する２つのヘッドを有する複合体での新しい「双頭」方法論の定義にある。
【００７３】
これらの化合物の設計は、目的とする配列に適合させなければならず、かつ
上記した特徴を有さなければならない。
【００７４】
ファルマコゲニックアプローチは、癌性腫瘍の細胞増殖および維持に関与する、特異的遺伝子に向けられたトポイソメラーゼＩポイズンの標的化に基づいた新しい治療戦略の開発を含む。
【００７５】
前記アプローチは、特に、細胞増殖に関与する遺伝子に対するおよび／または抗アポトーシス遺伝子に対する安定した三重ラセンの形成、血管形成によって選択的に結合することができる修飾されたまたは未修飾のオリゴヌクレオチドへトポイソメラーゼＩ阻害剤を化学的にカップリングさせることよりなる（図２：オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体によるトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ配列の標的化）。
【００７６】
ＤＮＡリガンドアプローチは、いくつかの遺伝子の発現に対して同時に作用し、これらの遺伝子に共通する標的配列を選択する可能性を与える。
【００７７】
癌のような多重遺伝子病理学を効果的に処理するためには、事実、遺伝子ファミリー、より正確には、細胞の通常の増殖回路を改変する遺伝子の群を同時に制御することが必須である。
【００７８】
従って、かなり有利には、単一オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体は、臨床で現在用いられる抗腫瘍薬物の組合せに類似の効果を有し得る。
【００７９】
このアプローチは、ある種の副作用を低下させつつ、この最適な抗腫瘍効果を維持するのを可能とすることができる。例えば、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の使用は、症例のほぼ１５％において、今日よく特徴付けられている逆遺伝子トランスローケーションによって特徴付けられる二次性白血病の出現と関連するというのは確立された事実である。ある種の選択された遺伝子に対してこれらの阻害剤を向けることは、治療効果の良好な選択性を可能とすることによって、その白血病形成力を低下させることができる。
【００８０】
また、その特に必須の態様の１つにおいて、本発明は、トポイソメラーゼＩ阻害剤の作用をＤＮＡ−特異的部位に向けて、この部位において、トポイソメラーゼＩによる開裂を選択的に誘導するのを可能とする方法にも関する。
【００８１】
癌の発生および維持に関与する遺伝子の２つの群、（１）成長因子ＩＧＦ−１（インスリン−様−成長因子−１）がその受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する場合に確立されたもののような生存経路の遺伝子、および（２）ＩＡＰのようなアポトーシスを阻害する遺伝子、およびＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス遺伝子を考慮し、説明によって、以後純粋に、かつ非限定的にこの新しい概念を詳細に説明する。これらの遺伝子はある種の癌で過剰発現され、それをブロッキングすると抗腫瘍効果が得られる。
【００８２】
本発明者らは、三重ラセンを形成することができ、かつ標的化すべき注目すべき遺伝子の群に共通する配列につきサーチを行った。このサーチは、ＧＣＧソフトウェア Ｕｎｉｘ ｆｉｎｄｐａｔｔｅｒｎｓ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ，Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ）を用いて行った。
【００８３】
予備的サーチにおいて、本発明者らは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴ／ＰＢＫ遺伝子に共通する１２塩基対（ｂｐｓ）、およびｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ＸLおよびｓｕｒｖｉｖｉｎｅ抗アポトーシス遺伝子に共通する１０−ｂｐ配列を含むオリゴピリミジン配列を同定した。
【００８４】
さらに、図２に記載されたＴＦＯ配列は、表１に報告する遺伝子のリストに結合する。遊離ＣＰＴ誘導体はゲノム（および、従って、多くの部位）においてほとんど特異性なく開裂を誘導するのに対し、図２に示す塩基配列を持つＴＦＯ−ポイズン複合体はこれらの遺伝子および、とりわけ、特に、腫瘍の増殖および維持に関与するＩＧＦ１ＲおよびＶＥＧＦに対してのみ開裂を誘導する。サーチは、ＵＣＳＣにおいて公に入手可能なバイオインフォーマティクス源を用いて行った。
【００８５】
既に述べたように、副溝リガンド（Ｎ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールよりなるポリアミド）のような配列−特異的ＤＮＡの非核酸リガンドを用いて、与えられた部位に向けてのトポイソメラーゼ阻害剤の作用を指令することもできる。
【００８６】
これらの使用は、安定した三重ラセンの形成によって課されるオリゴピリミジン・オリゴプリン標的配列拘束を無くすることが可能なはずである。
【００８７】
カンプトテシンとカップリングした副溝リガンドでの結果を以下に示す。
【００８８】
標的遺伝子の群に共通する配列についてのこのサーチは、専ら、または主として選択された遺伝子の群の一部を形成するように選択された最適な標的配列を規定するのを可能とするはずである。
【００８９】
三重ラセンオリゴヌクレオチドの使用の場合には、複合体による開裂は、標的のオリゴピリミジン鎖上の三重鎖の３’側のトポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された開裂部位と共に、２〜１００、好ましくは１０〜３０の多数のプリンを含む各オリゴピリミジンオリゴプリン標的配列に向けられる。
【００９０】
さらに、阻害剤によって誘導され、かつ有利には三重ラセン末端およびリンカーアームから１〜１０ヌクレオチドに位置する開裂部位は、開裂部位、用いられる阻害剤、および阻害剤のオリゴヌクレオチドへの付着点に従って適合される。
【００９１】
オリゴヌクレオチド−トポイソメラーゼ阻害剤複合体に関しては、本発明者らは、カンプトテシン誘導体へのトポイソメラーゼ阻害剤のカップリングを行った。予備的試験では、本発明者らは、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるカンプトテシンおよびレベッカマイシン誘導体の、オリゴヌクレオチド１６ヌクレオチド長への共有結合カップリングが、インビトロにて、阻害剤が三重ラセンの形成によって位置する部位に対してトポイソメラーゼＩによって特異的に開裂を向けることを示した（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，２０００ａ）。
【００９２】
同一の工程を、同様にして、すなわち、共有結合様式にてＤＮＡ−特異的リガンドの末端に付着させることができるトポイソメラーゼポイズンである他のタイプの阻害剤で行うことができる。
【００９３】
リガンド部分および阻害剤部分を統合するリンカーアームの最適化は非常に重要であり、リガンド結合部位に関して用いられる阻害剤の切断部位の位置、および阻害剤のオリゴヌクレオチドへの付着点に従って適合させなければならない（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）。
【００９４】
オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体の合成の後であって、その細胞活性の評価の前に、ゲルシフト実験および熱解離実験によって、三重ラセンを形成するその能力を分析すべきである。例えば、図２に記載された組成のＴＦＯは結合し、インビトロにてトポＩ−媒介ＤＮＡ開裂を、同一標的配列を共有する、テストされた２つの遺伝子におけるリガンド認識部位に特異的に向ける。
【００９５】
選択された阻害剤の細胞活性
トポイソメラーゼＩ複合体のオリゴヌクレオチド−阻害剤の活性に関して、分子および細胞系は、ＩＧＦ−１およびその受容体に関連する遺伝子のカスケードに対する異なる複合体の効果を研究することを可能とする（Ｈａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。特に、開裂活性は、ゲノムＤＮＡの直接的分析、トランスクリプトーム（ＤＮＡチップおよびノーザンブロット）およびプロテオーム（二次元ゲルおよびウェスタンブロット）分析による作用特異性によって評価することができる。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒ遺伝子は膠芽細胞腫、肝細胞癌および前立腺の腫瘍の増殖に関与するので、アンチセンス構築体によるその阻害は動物に移植された腫瘍の増殖をブロックする（Ｌａｆａｒｇｅ−Ｆｒａｙｓｓｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。培養中の腫瘍細胞についてのテストは、最も効果的なオリゴヌクレオチド複合体を選択し、（例えば、ヌードマウスに注入された膠芽細胞腫、または同質遺伝子ラットにおける肝細胞癌を持つ）動物モデルを用いるのを可能とするであろう。
【００９６】
また、複合体の薬物動態学も標準的な手法で評価することができる。
【００９７】
最も効果的な複合体に関しては、癌性細胞の増殖を阻害するその能力は、部分的には、異なる腫瘍細胞系を用いることによって、従って、インビトロでのほとんどの細胞傷害性分子では、マウスに異種移植されたヒト腫瘍からの、インビボモデルに対して評価することができる。
【００９８】
本発明のある態様および目的の産業的適用の例
抗癌剤としてのトポイソメラーゼＩ阻害剤とカップリングさせたＤＮＡリガンドの評価
癌と同程度に重要な病理学における新しい治療経路が関連するので、経済的関心はかなりのものである。
【００９９】
従って、病理学における脱調節遺伝子の同定は新しい薬理遺伝学的製品の基礎を形成することができる。
【０１００】
薬理遺伝学的成功は、
副作用の減少および治療有効性の増加
医薬開発に関連するコストの減少
患者に適する非常に多数の治療的解決の開発
公の健康出費の大幅な減少
について重要な結果を有するであろうことは明白である。
【０１０１】
この経済的インパクトは、あいにくと低い個々の有効性のレベルを伴う多数の治療プロトコルの間に選択がある癌の分野において非常に実質的であろう。
【０１０２】
実施形態
略語：
ＣＰＴ＝カンプトテシン；Ｐ＝５−プロピニル−２’−デオキシウリジン；Ｍ＝５−メチル−２’−デオキシシチジン；Ｒ＝二重鎖のオリゴプリン鎖、Ｙ＝二重鎖のオリゴピリミジン鎖
＝ワトソン−クリック塩基対合
トポ＝トポイソメラーゼ
【０１０３】
材料および方法
阻害剤
全ての阻害剤はジメチルスルホキシドに溶解させ、次いで、水に希釈する。ジメチルスルホキシドの最終濃度は全てのテストにおいて決して０．３％（ｖ／ｖ）を超えない。阻害剤は図２において既に記載したようにＴＦＯの３’または５’末端に結合している。
【０１０４】
カンプトテシン誘導体はＡｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）およびＶｉｌｌｅｍｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）に記載された技術に従って合成される。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ断片
オリゴヌクレオチドはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃによって市販されており、「クイックスピン」カラムおよび微細なＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で精製される。濃度は、最も近いモデル（Ｃａｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９７０）から計算された２６０ｎｍにおけるモル消光係数を用いて２５℃にて分光学的に測定される。
【０１０６】
ＣＴＰ複合体の合成
僅かに修飾したＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （２０００）に記載された技術に従い、および、アミド結合形成については、オリゴヌクレオチドに適合させたＨＡＴＵを用いるペプチド合成手法に従い、カンプトテシンＣＰＴの誘導体は異なるリンカーアームを介してオリゴヌクレオチドの３’または５’末端のリン酸に、または副溝リガンド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’｛１−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−［４−｛［１−メチル−４−［１−メチル−４［１−メチル−４−（４−アミノブチリル）アミノピロール−２−カルボニル］アミノピロール−２−カルボニル］アミノピロール−２−カルボニル］｝アミノブチリル］アミノピロール−２カルボニル］アミノピロール−２−カルボニル］アミノピロール−２−カルボニル｝プロピレンジアミン（３＋３）に複合体される。Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍ．，前記Ａｒｉｍｏｎｄｏ（２００２）に記載されているように、リンカーアームは、アミノ−末端の反応によって、Ｎ−メチルイミダゾール、ジピリジルジスルフィドおよびトリフェニルホスフィンでの処理によって活性化された３’または５’末端におけるリン酸化オリゴヌクレオチドに結合される。複合体はＵＶ分光測定および質量分光測定によって特徴付けられる。
【０１０７】
ＳＴ１５７８およびＳＴ２５４１におけるようにリンカーアームを用いない場合、ＣＰＴ誘導体上のアミノ基は、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．２０００に記載された技術に従ってオリゴヌクレオチドの末端リン酸に直接結合される。
【０１０８】
（ＤＮＡ）標的遺伝子の調製
ｐＢＳＫ（＋／−）プラスミドはＰｒｏｍｅｇａ（ＵＳＡ）によって市販されており、７７−ｂｐ標的二重鎖がＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間に挿入される。ＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩによるプラスミドの消化により、クレノウポリメラーゼ（Ｏｚｕｍｅ，ＧＢ）およびα［３２Ｐ］ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｓ．Ａ）によって、３’末端における標識に適した３２４−量体断片を生じる。この二重鎖ＤＮＡの単離、精製および標識のための技術の詳細は（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ２００２）に記載されている。２つの５９−ｂｐ二重鎖は、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｏｚｙｍｅ，ＧＢ）およびα［３２Ｐ］ｄｂＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．Ｓ．Ａ）による鎖の標識、続いての、９０℃における５分間の非標識相補的鎖とのハイブリダイゼーション、および雰囲気温度までのゆっくりとした冷却によって得られる。放射性標識断片は、従前に記載されているようにゲルクロマトグラフィーによって精製される（Ａｒｉｍｏｎｄｏ ２００２）。鎖の命名法は以下の通りである：Ｒはオリゴプリンを表し、Ｙはオリゴピリミジン鎖を表す。
【０１０９】
トポイソメラーゼ開裂テスト
記載した濃度にて（合計反応用量１０μＬ）、ＴＦＯまたはＭＧＢの存在下で、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ−７．５、６０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび３０μｇ／μＬのＢＳＡ中にて、放射性標識二重鎖（５０ｎＭ）を３０℃にて１時間インキュベートする。トポＩ ＤＮＡ開裂生成物を分析するために、１０単位の酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ）を加え、前述したように、リガンドおよび／または阻害剤と共にインキュベートし、続いて、３０℃にて２０分間インキュベーションする。トポＩ−ＤＮＡ複合体はＳＤＳ（最終濃度０．２５％）の添加によって解離させる。エタノール沈殿の後、全ての試料を６μｌのホルムアミドに再懸濁させ、９０℃まで４分間で加熱し、再度、氷上で４分間冷却し、その後、１×ＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５５ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に７．５ｍ尿素を含有する各々、長いおよび短い標的につき、８％および１０％変性ポリアクリルアミドゲル［１９／１アクリルアミド：ビスアクリルアミド］上に沈積させる。開裂強度を定量化するために、ゲルをＤｙｎａｍｉｃｓ ４４５ＳＩホスホルイメージャーでスキャンする。開裂速度を測定するために、合計沈積に対する標準化を行う。
【０１１０】
２０Ｓ−（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）酢酸（ＳＣＰＴ）、位置１０において前記酸に結合したＴＦＯ−ＳＣＰＴおよびＳＣＰＴ−ＴＦＯ複合体、ならびに例えばＴＦＯ−１０ＣＰＴ、およびＴＦＯ−７ＣＰＴ、（３＋３）−ＣＰＴおよび（４＋４）−ＣＰＴのような位置１０または位置７いずれかに付着した他の複合体の調製で用いられる新しいＣＰＴ誘導体の化学式は図２Ａに掲げる。リンカーアームの役割を果たす置換基を有するカンプトテシン誘導体ＳＴ１５７８およびＳＴ２６７７は図２Ｂに掲げる。
【０１１１】
本発明者らは、現在抗腫瘍剤として臨床試験を受けている分子と同様な３つのレベッカマイシン誘導体、およびＴＦＯ（三重ラセン形成性オリゴヌクレオチド）を持つ６つのカンプトテシン誘導体、および２つの副溝リガンド（ＭＣＢ、副溝バインダー）を持つ１０−カルボキシカンプトテシン誘導体を化学的にカップリングさせることによってアプローチを確認した（図２）。
【０１１２】
本発明者らは、阻害剤誘導体に存在しない場合、あるいは十分に長くない場合、阻害剤を適当なリンカーアームを介してオリゴヌクレオチドの１つの末端または副溝リガンドに共有結合させた。複合体はＵＶ分光測定および質量分光測定（Ｑ−ＳＴＡＲ Ｉ）によって特徴付けした。複合体の開裂特異性は、標準トポイソメラーゼＩ開裂テストによってインビトロにて測定した。開裂指標は、ＤＮＡリガンドとカップリングした阻害剤の存在下における開裂強度と、非結合阻害剤の存在下におけるそれとの間の関係として計算される。標的化の例を図３に示す。３つの非カップリングカンプトテシン誘導体（ウェル２、３、４）はいくつかの部位（部位ａ〜ｉ）における開裂を刺激する。誘導体が適当なアームを持つＴＦＯの３’末端に共有結合する場合、三重ラセンが形成され（ウェル５、６、７）、複合体は三重ラセン（部位「ｂ」）の３’側のみに開裂を誘導する。これは、複合体のオリゴヌクレオチド部分のその標的への結合による、三重ラセン部位の３’側に対する阻害剤の特異的位置決めによる。オリゴヌクレオチドの場合には負に荷電されたリガンドの存在は、三重ラセンの、またはこの部位からかなりの距離をもって位置した他の部位の５’側に位置する部位「ａ」の消失によって明らかに示されるように、複合体された阻害剤の他の部位への結合を妨げる。
【０１１３】
本発明者らは、異なる長さ（１６、１８、２０および２３ヌクレオチド）のＴＦＯ（図９参照）に対する、および異なるレベッカマイシンおよびカンプトテシン誘導体に対するＤＮＡリガンドの結合部位の近傍におけるトポイソメラーゼＩによるトポイソメラーゼ１媒介ＤＮＡ開裂のこの標的化を示した。同一のアプローチは、ＤＮＡの副溝に特異的に結合するＮ−メチルピロールヘアピンポリアミドのような他の配列−特異的ＤＮＡリガンドまで拡大された（図２：（３＋３）−ＣＰＴおよび（４＋４）−ＣＰＴ複合体）。また、本発明者らは、それをもう１つの標的：ＨＩＶ−１ウイルスのＰＰＴ（ポリプリントラクト）（５’ＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡ ３／ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＴ５’）まで、およびＩＧＦ−１のプロモーター１に存在する２２−量体配列（５’ ＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧ ３’／ＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣ ５’）まで拡大した。さらに、図２に記載されたＴＦＯはＩＧＦ１Ｒのイントロン２に結合することが示された（表１）。
【０１１４】
従って、前記アプローチは、特に、２つのクラスの配列−特異的ＤＮＡリガンド（ＴＦＯおよびＭＧＢ）で、異なるクラスのトポイソメラーゼＩ阻害剤で、および異なる標的で有効である。
【０１１５】
本発明の主題は、有利には、用いられるリガンドがオリゴヌクレオチドのような配列−特異的ＤＮＡリガンド、または副溝リガンドのような非核酸リガンド（Ｎ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールよりなるヘアピンポリアミド、特に、（３＋３）−ＣＰＴおよび（４＋４）−ＣＰＴ複合体）、または亜鉛フィンガーペプチドからなる群より選択される上記定義された方法でもある。
【０１１６】
また、本発明者らは、リガンドの結合部位においてかく刺激されたトポイソメラーゼＩ開裂有効性は、一方において、阻害剤およびリガンドの間のリンカーアームのサイズ、および他方において、阻害剤の固有の有効性に依存することも示した。さらに、本発明者らは、リガンドの結合による抗腫瘍剤のポジショニングは、標的化部位におけるこの分子の局所的濃度をインビトロで増加させる効果を有することを観察した；事実、複合体は１〜１０ｎＭの濃度においてトポイソメラーゼＩによる開裂を刺激する。さらに、ＤＮＡ／トポイソメラーゼ／阻害剤開裂複合体は、阻害剤がＴＦＯに複合体し、三重ラセンが形成された場合にかなり安定である。高濃度の塩（＞６００ｍＭ ＮａＣｌ）がそれを解離させるのに必要である。
【０１１７】
その配列がリガンド−阻害剤複合体のＤＮＡリガンドの結合によって認識される、これらの抗腫瘍剤の作用が前記部位に選択的に向けられるこのアプローチは、新しい抗腫瘍薬物の開発においてかなり新しいアプローチを可能とする。
【０１１８】
現在、三元トポイソメラーゼＩ／ＤＮＡ／阻害剤複合体の構造は完全にはまだ説明されていないのを考え、本発明者らは、三元ＤＮＡ／トポイソメラーゼ／阻害剤複合体の構造解析のために前記複合体を用いた。阻害剤のＴＦＯへの付着点を変化させると、三元複合体における阻害剤の向き、従って、前記酵素による開裂の有効性を修飾する（図４および９参照）。従って、本発明者らは、２つのカンプトテシン誘導体、１０−カルボキシカンプトテシンおよび７−アミノエチルカンプトテシンを異なる長さのＴＦＯに共有結合させた。三元複合体の近傍における位置および開裂強度の研究は、従って、三元複合体を記載する現在のモデルが適当ではなく、他の立体配座を考慮しなければならないことを示した。三元複合体の立体配座柔軟性のもう１つの表示は、開裂有効性が、１０−カルボキシカンプトテシンが主溝リガンド（ＴＦＯ）または副溝リガンド（ＭＧＢ）に連結されるかを問わず匹敵するという事実に由来する。
【０１１９】
予期せぬことに、三重ラセンそれ自体の存在は、単独で、トポＩ−媒介ＤＮＡ開裂のある種の標的化を誘導する。本発明者らは、複合体が以下に記載する特徴を有する場合に開裂が起こることを示した；
【０１２０】
また、本発明の主題は、まず、特に、腫瘍の発生および維持に関与するタンパク質をコードするいくつかの標的遺伝子の発現を同時に阻害する方法であって：
（ｉｖ）前記少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤を、前記標的遺伝子に共通する配列を同時かつ選択的に認識することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列−特異的リガンドに複合体させることによって、少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤の作用を前記遺伝子に特異的な部位に向けることと、
（ｖ）ゲノム中の前記遺伝子の前記複合体を前記リガンドによって認識し、前記標的への前記リガンドの結合を得ることと、
（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を誘導し、前記遺伝子の発現を阻害することと；
を含むことを特徴とする前記方法である。
【０１２１】
接合段階は、前記遺伝子およびトポイソメラーゼを含有する生物学的試料にてインビトロで、培養からの細胞にてエキソ・ビボで行われる。
【０１２２】
トポイソメラーゼ阻害剤の存在は、有利には、トポイソメラーゼＩによって媒介されるＤＮＡ開裂の標的化の効果を増幅する。三重鎖によって誘導されるこの開裂は正確な幾何学に依存し：オリゴヌクレオチドのその標的への結合は、標的のオリゴピリミジン鎖上の三重ラセンの３’側、および標的のオリゴプリン鎖上の５’側のみに対する開裂を刺激する（図４）。
【０１２３】
また、本発明は、少なくとも１つのリガンドの複合体、特に、標的のオリゴプリン鎖上の５’側、および標的遺伝子のオリゴピリミジン鎖上の３’側のトポイソメラーゼＩによる開裂を誘導するオリゴヌクレオチドで形成された三重ラセンの複合体（「ＴＦＯ」）に関する。
【０１２４】
さらに、本発明は、三重ラセンを形成し、位置３’において、三重ラセンの３’側の酵素の選択的かつ強力な開裂を刺激するトポイソメラーゼＩ阻害剤にカップリングしたピリミジンオリゴヌクレオチドに関する。
【０１２５】
三重鎖の３’側は、水素結合の形成によりＴＦＯによって認識されるオリゴプリン配列の３’側と定義される。開裂のこの向きは、開裂部位におけるＤＮＡへのトポイソメラーゼＩの結合が対称ではなく、前記酵素が開裂された鎖の３’リン酸とでホスホロチロシル結合を形成し、５’ＯＨ末端を脱離させるという事実にリンクされる。従って、三重ラセンは、酵素に対する立体的障害無くして、標的上の開裂部位の３’側に存在し得る。トポイソメラーゼＩの好ましい部位が三重ラセンの存在によって誘導されるのみならず、部位が三重ラセンの存在においてのみ検出できることが強調されなければならない。これは、三重鎖の存在にリンクされたＤＮＡの立体配座の局所的変化によるものと考えることができる。事実、開裂有効性は三重ラセンの５’側および３’側で同一ではなく、三重ラセンの２つの末端は等しくないことが知られていることに注意しなければならない。一方、酵素の進歩は、酵素を「休止させ」、それにこの近傍で開裂する時間を与える三重鎖構造による物理的ブロッキングによって停止される。２つの仮説は相互に排他的なものではない。
【０１２６】
本発明の主題は、
（ｖｉｉ）前記少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤を、前記標的遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列−特異的リガンドに複合体させることによって、少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤を前記遺伝子に特異的な部位に向けることと、
（ｖｉｉｉ）ゲノム中の前記遺伝子の前記複合体を前記リガンドによって認識し、前記リガンドの前記標的への結合を得ることと、
（ｉｘ）トポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を誘導し、前記遺伝子の発現を阻害することと；
を含む上記定義された方法でもある。
【０１２７】
本発明の方法の好ましい実施形態によると、標的化配列は、オリゴヌクレオチドの場合には、２〜１００、好ましくは２〜３０塩基対の多数のプリンを含む各オリゴピリミジン・オリゴプリン標的配列であるリガンドによって認識される部位を含む。なおより好ましくは、前記標的化配列は、より大きな有効性を得るためにその近傍にトポイソメラーゼ阻害剤の部位も含む。阻害剤によって誘導された開裂部位は、三重ラセンの末端から１〜１０ヌクレオチドに位置しなければならない。リンカーアームは、開裂部位、用いられる阻害剤、阻害剤のオリゴヌクレオチドへの結合点に従って適合させなければならない。
【０１２８】
次いで、本発明者らは、細胞における前記アプローチの有効性を初めて示した。
【０１２９】
インビトロ実験は、核バリアー、クロマチンの構造、および核中の複合体の特異性を考慮することができないので、本発明者らは、細胞系において複合体をテストした。前記複合体は細胞において特異的な効果を誘導し、これは、三重ラセンの形成、およびオリゴヌクレオチドにカップリングした阻害剤の存在に依存する。
【０１３０】
より正確には、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされたプラスミド発現ベクターを用い、ＴＦＯの結合配列、およびその近傍におけるカンプトテシンに対して感受性の部位のそれを、Ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）の上流の転写された領域に入れる。プラスミドは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｃｏ Ｉ部位の間のベクターｐＧＬ３プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）への、図５に記載された配列を含む５４塩基対を持つ断片のクローニングの後に得られた。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をトランスフェクション対照として用いる。
【０１３１】
ＨｅＬａヒト接着性細胞を、３７℃および１０％ＣＯ2にて、１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養する。細胞を、ウェル当たり１２５μＬにて、９６−ウェルプレートに接種（Ｍｌ当たり１１０，０００細胞）。２４時間後、細胞の培地を、１１２．５μＬの血清を含む新鮮な培地および１２．５μＬのトランスフェクション混合物によって置き換える。トランスフェクション混合物は無血清培地中に、１μｇのｐＷＴまたはｐＭＴＵＣまたはｐＭＵＴまたはｐＩＷＴ；０．５μｇのｐＲＬ−ＴＸ、変化させた濃度のオリゴヌクレオチド、および３μＬのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を含有する。混合物は二連または三連で調製する。２４時間後、細胞をルシフェラーゼ発現アッセイのために溶解する。
【０１３２】
「ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ」 （Ｐｒｏｍｅｇａ）を、同一細胞溶解物につき２つのレポーター（ＰｙｒａｌｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ）の活性の測定のために用いた：９６−ウェルプレートの各ウェルを３０μＬの「受動溶解緩衝液」に溶解させ、自動装置（Ｖｉｃｔｏｒ／Ｗａｌｌａｃ）を用いて、「ｄｕａｌ−Ｌｕｃｈｉｆｅｒａｓｅ（商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ」キットで１５μＬを分析した。
【０１３３】
２つの活性の比率（Ｐｙｒａｌｉｓ／Ｒｅｎｉｌｌａ）を用いて、効果の選択性を測定する。図６は、複合体の不存在下におけるプラスミドの発現と比較して標準化された、異なるオリゴヌクレオチドの存在下での２つの活性の間の比率を示す。３つのプラスミドｐＷＴ、ｐＭＴＵＣおよびｐＭＵＴは、オリゴヌクレオチド部分の長さ、アームの長さ、および結合したカンプトテシン誘導体が異なる４つの複合体として同様に表される。位置３’において（ＣＨ2）4−ＮＨ2（オリゴ−ＮＨ2）アームに結合したオリゴヌクレオチドＴＦＯ１６を対照として用いる。このオリゴヌクレオチドは非常に安定した三重ラセンを形成する。
【０１３４】
三重ラセンを形成する対照オリゴヌクレオチドオリゴ−ＮＨ2の１μＭにおける存在は、ほぼ３０％だけルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻害する。カンプトテシンへのカップリングは阻害効果を増加させる（複合体に従って４５％および６０％阻害の間）。阻害におけるこの増加は、インビトロで観察されたように、三重ラセンの形成によって位置されたカンプトテシンの存在下においてトポイソメラーゼによって誘導された三重ラセンの近傍におけるＤＮＡの開裂によって説明することができる。複合体はその有効性が異なり；１０−カルボキシカンプトテシンの誘導体ＴＦＯ１６、ＴＦＯ１６−Ｌ６−１０ＣＰＴおよびＴＦＯ１６−Ｌ４−１０ＣＰＴが最も効果的である（ほぼ６０％阻害）（図９参照）。結合アームの長さは阻害の有効性に大きく影響しない。インビトロ実験は、これらの複合体が、三重ラセンの３’末端から４ｂｐｓの部位「ｂ」において開裂を効果的に刺激することを示す（前記、図３参照）。インビトロにおいて同等に効果的であるが、１６−量体よりも特異性は低いＴＦＯ１８−Ｌ６−１０ＣＰＴ複合体は、ルシフェラーゼ遺伝子発現の４５％を阻害するに過ぎない。７−アミノエチルカンプトテシンを含むＴＦＯ１６−Ｌ６−７ＣＰＴ複合体は、対応するＴＦＯ１６−Ｌ６−１０ＣＰＴ複合体よりも効率は低く、ほぼ５０％阻害である。これは、阻害剤の開裂有効性についてのインビトロ結果と合致し：１０−カルボキシカンプトテシンは、７−アミノエチル−カンプトテシンよりも効果的にトポイソメラーゼ１によるＤＮＡの開裂を刺激する。観察された効果は、複合体のオリゴヌクレオチド部分による標的での三重ラセンの形成に確実によるものである。これは、２つの（ｐＭＴＵＣ）または３つの（ｐＭＵＴ）部位での三重ラセン配列における突然変異した標的での測定によって確認される。２つのプリン突然変異の存在は阻害の有効性を低下させ、三重ラセンは依然として形成されているが、事実上は少ない：オリゴ−ＮＨ2は３０％阻害〜ほぼ１５％通過し、ＴＦＯ１６−Ｌ６−１０ＣＰＴは６０％〜４５％複合体する。結合部位における３つのピリミジン突然変異の存在は阻害の全くの喪失を意味する。図７Ａおよび７Ｂ参照。
【０１３５】
合成されたＲＮＡ（ｐＩＷＴ）に対する複合体のアンチセンス効果を回避するために、逆鎖を持つプラスミド構築体を用いた。結果を図６Ｂに示す。対照はルシフェラーゼＰｙｒａｌｉｓの発現を阻害せず、複合体ＴＦＯ−Ｌ４−ＣＰＴは０．５μＭにおいてその発現を４０〜５０％阻害する。複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８は依然としてより効率的であり、０．５μＭにおいて５０〜６０％の阻害が測定される。前記複合体は、三重ラセン部位を有さないプラスミドｐＧＬ３Ｐｒ構築体に対して不活性であった。
【０１３６】
図８に対応する実験において、ＨｅＬａ核細胞（５００００００）を調製し、種々の濃度（図８では５μＭ）にて、遊離（ＣＰＴまたはＳＴ１５７８）、またはオリゴヌクレオチドにカップリングした（ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴまたはＴＦＯ−ＳＴ１５７８またはＬＮＡ−ＳＴ１５７８）トポイソメラーゼＩポイズンと共に、または対照オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ−ＮＨ２またはＴＦＯ−ＮＰｈ２）と共に３７℃にて３時間インキュベートした。サルコシルを添加した後、溶解物をＣｓＣｌの勾配にて１６時間超遠心した。１２の画分を回収し、ウェスタンスロットブロットによって分析して、トポイソメラーゼＩを含有する画分が示された（未処理対照（モック）ではＩ−４）。
【０１３７】
前記ＤＮＡを含有する画分は、２６０ｎｍにおいて吸光度を測定することによって同定された（画分８〜１０）。トポイソメラーゼＩは、阻害剤（ＣＰＴまたはＳＴ１５７８）または複合体ＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴ、ＴＦＯ−ＳＴ１５７８またはＬＮＡ−ＳＴ１５７８の存在下でＤＮＡを含有する画分のみで観察され、これはＤＮＡ／トポＩ開裂複合体の安定化を示唆する。対照ＴＦＯ（ＴＦＯ−ＮＨ２、ＴＦＯ−ＮＰｈ２）の使用に際して、トポイソメラーゼＩは、未処理細胞（モック）では最初の画分にのみ存在した。
【０１３８】
このアプローチでは、本発明者らは、複合体が、細胞システムで選択された部位にトポイソメラーゼによる特異的破壊を誘導することができることを示した。異なるトポイソメラーゼＩ阻害剤を用いることができ、阻害は阻害剤の固有の有効性に依存する。なぜなら、本発明者らは、６つのカンプトテシン誘導体およびインドロカルバゾール誘導体で観察したからである。
【０１３９】
阻害剤の効果を増加させるために、例えば、ＰＮＡ、ペプチド核酸、２’ＯＡＩｋｙｌリボ核酸、オリゴホスホルアミデート、ＬＮＡ（リボースの立体配座についてブロックされたＲＮＡ）のような化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【０１４０】
複合体は以下のものを目的とすることができる。
例えば、特定の（単一）遺伝子の発現に依存する病理学のためのヒトゲノムに、またはウイルスプロゲノム（例えば、ある種のウイルスＨＩＶおよびＨＳＶの発生を担う遺伝子）、または寄生虫のゲノムに存在する単一配列いずれか。次いで、複合体は遺伝子の選択的不活化を可能とする。
または病理の維持および発生に関与するいくつかの遺伝子に共通する標的配列（例えば、オンコジーン、成長因子、抗アポトーシス遺伝子、腫瘍細胞で観察される障害に参加する細胞周期および分裂を制御する遺伝子）。次いで、複合体は幾つかの遺伝子の同時制御を可能とする。
【０１４１】
事実、複合体のリガンド部分につき選択された結合部位の長さおよび配列によると、複合体の選択性は、単一遺伝子においてのみ目的とするために厳格であるか、あるいは遺伝子の群を標的とするために緩やかとすることができる。
【０１４２】
第一の場合において、統合されたウイルスのゲノムを標的化し、このゲノムにおいてのみ存在する配列に対して向けられた複合体によって特異的に開裂させることができる。本出願の範囲内では、本発明者らは、アプローチをＨＩＶ−ウイルスのＰＰＩを含むように拡大した。
【０１４３】
第二の場合において、ある種の腫瘍病理に関与するいくつかの遺伝子は、トポイソメラーゼＩによって特異的かつ同時に開裂させることができ、共通の標的配列を選択することができる。
【０１４４】
癌性特徴の獲得および維持に関連した遺伝子の同時阻害は、腫瘍細胞の悪性特性に対して特異的な必須の生化学的プロセスを標的化するのを可能とする。本発明者らは、成長シグナルの伝達、およびアポトーシスの阻害に関与する２つの群の遺伝子を選択した。最初の場合には、成長因子ＩＧＦ−１（インスリン−様成長因子−１）、その受容体ＩＧＦ−１Ｒ、および対応するシグナル化カスケードにおいて下流に位置する遺伝子を選択した。これらの遺伝子は細胞の生存経路を活性化し、膠芽細胞腫、肝細胞癌および前立腺腫瘍の増殖に関与する。アンチセンス構築体によるＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の阻害は、動物に移植された腫瘍の増幅をブロックする。第二の場合、目的は、癌性細胞にアポトーシスを誘導し、アポトーシス−抑制遺伝子（例えば、Ｃ−ＩＡＰ１／２、ＸＩＡＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎｅ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−Ｗ、ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１）に共通する配列を標的化することである。アポトーシスまたはプログラムされた細胞の死滅は、カスパーゼによって実行される細胞の制御された断片化である。前記プロセスは、アポトーシスを誘導するタンパク質とそれを阻害するタンパク質との間の平衡によって制御される。アポトーシス−阻害遺伝子は、細胞の寿命を延長することによって、細胞の悪性トランスフォーメーションに導く遺伝子事象の確立を増加させ；それらは、しばしば、癌細胞において過剰発現される。
【０１４５】
本発明者らは標的化することを望む遺伝子の群に共通する三重ラセンを形成することができる配列につきサーチするために、後者はＧＣＧ Ｕｎｉｘソフトウエアファインドパターンプログラム（Ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ、ＶｉｌｌｅｊｕｉｆによるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１）を用い、また、ＵＣＳＣヒトゲノムデータベースを用いた。
【０１４６】
ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１ＲおよびＡＫＴ／ＰＫＢ遺伝子に共通する１２塩基対（ｂｐｓ（ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧ）のオリゴピリミジン−オリゴプリン、および抗アポトーシスｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ＸＬおよびｓｕｒｖｉｖｉｎｅ遺伝子に共通する１０−ｂｐ配列（ＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧ）についての予備的サーチは、アプローチの可能性を示した。オリゴピリミジン・オリゴプリン配列の選択はアプローチを制限するものではない。というのは、これらの配列はヒトゲノムで過剰発現され、全遺伝子（調節領域、コーディングおよび非コーディング領域）は、三重ラセンを形成するオリゴヌクレオチドについての潜在的標的であるからである。さらに、図２に示されたオリゴヌクレオチドは、いくつかの遺伝子（表１）に存在する共通配列、例えば、癌性特性の獲得および維持に関与するＩＧＦ１ＲおよびＶＥＧＦを認識する。
【０１４７】
さらに、トポイソメラーゼ阻害剤は、通常は、開裂部位の周りのジヌクレオチドに制限されるある配列特異性を有することを忘れてはならない。事実、本発明者らは、複合体の三重ラセン部位への結合が強力な開裂を誘導するのに十分ではなく、三重ラセン部位の近傍における阻害剤に対して特異的な部位の存在は、トポイソメラーゼによる開裂の動員および誘導に対して大いに好ましいことが観察された。本発明者らは、これより、標的化配列は、好ましくは、オリゴヌクレオチドによって認識される部位のみならず、その近傍におけるトポイソメラーゼＩ阻害剤の部位を含み、従って、複合体の選択性を増大させると推定した。
【０１４８】
最後に、本発明者らは、オリゴヌクレオチドならびにＮ−メチルーピロールおよびＮ−メチルイミダゾールのポリアミドのようなＤＮＡリガンドに対するアプローチを確認したが、原理は、例えば、亜鉛フィンガーペプチドのような他のクラスのリガンドまで拡大することができる。
【０１４９】
本発明の主題は、
さらに、（特に、ＴＦＯ（三重ラセン形成性オリゴヌクレオチド）−トポイソメラーゼ阻害剤を含む）複合体による開裂が、より効果的には、標的のオリゴピリミジン鎖上の三重鎖の３’側のトポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された開裂部位と共に、２〜１００、好ましくは２〜３０の多数のプリンを含む前記オリゴピリミジン・オリゴプリン標的遺伝子の各配列に向けられることを特徴とする上記定義された方法、
さらに、トポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された前記切断部位が、三重ラセンの末端から１〜１０ヌクレオチドに位置することを特徴とする上記定義された方法、
さらに、前記標的遺伝子の配列が、病理学に関与する遺伝子上のヒトゲノムに存在する単一標的配列、またはウイルスまたは寄生性遺伝子のみに存在し、ヒトゲノムでは存在しない標的、または病理の維持または発生に関与する遺伝子の群に存在する配列いずれかであることを特徴とする上記定義された方法；
でもある。
【０１５０】
本発明者らは、さらに：
本発明による方法で有用な複合体は、細胞増殖、成長因子またはホルモン受容体シグナル伝達、および抗アポトーシス剤の群に作用することができる新しい効果的な抗腫瘍剤を構成するはずであり、
トポイソメラーゼＩ阻害剤にカップリングした前記副溝リガンドは、酵素による直接的開裂をリガンドの結合部位に選択的に向け、オリゴヌクレオチド−阻害剤複合体と同一の適応を有する；
ことを提案しおよび／または示した。
【０１５１】
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【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１は、特異的部位におけるトポイソメラーゼＩによるＤＮＡの開裂／切断を標的化する原理を示すダイヤグラムである。
【図２．Ａ】図２．Ａは、公知の研究システム：標的オリゴプリン・オリゴピリミジン配列および対応する三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の配列を含む３２４−ｂｐ二重鎖を示す説明図である。
【図２．Ｂ】図２．Ｂは、カンプトテシン誘導体ＳＴ１５７８、ＳＴ２５４１およびＳＴ２６７７、ならびに複合体ＴＦＯ−ＳＴ１５７８、ＴＦＯ−ＳＴ２５４１，ＴＦＯ−Ｌ４−ＳＴ２６７７およびＴＦＯ−Ｌ４−１０ＣＰＴの式を表す説明図である。
【図３．Ａ】図３．Ａは、トポイソメラーゼＩ開裂部位を表す説明図である。
【図３．Ｂ】図３．Ｂは、本発明による他の複合体で得られた結果を表す説明図である。
【図４】図４は、標的のオリゴプリン鎖上の三重ラセンの５’側の開裂およびオリゴピリミジン鎖上の３’側の開裂を誘導することを示す説明図である。
【図５．Ａ】図５．Ａは、実験構築を表す説明図である。
【図５．Ｂ】図５．Ｂは、標的二重鎖、ＴＦＯおよび対照オリゴヌクレオチド配列などを示す説明図である。
【図６．Ａ】図６．Ａは、ＨｅＬａ細胞におけるＰｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子の転写の阻害を説明する説明図である。
【図６．Ｂ】図６．Ｂは、逆鎖でのプラスミド構築を用いる場合に得られた結果に関する説明図である。
【図７．Ａ】図７．Ａは、複合体の存在下における三重鎖の形成および強力な特異的破壊の存在（実施例Ａ）および、対照的に、三重ラセン部位での突然変異の場合における三重鎖の形成の、およびＤＮＡの特異的開裂の不存在（実施例Ｂ）および開裂部位ｂおよびｃにおける突然変異した二重鎖の場合における、三重鎖の形成、三重鎖部位の３’末端におけるトポＩ−媒介ＤＮＡ開裂部位の不存在（実施例Ｃ）を示す説明図である。
【図７．Ｂ】図７．Ｂは、複合体の存在下における三重鎖の形成および強力な特異的破壊の存在（実施例Ａ）および、対照的に、三重ラセン部位での突然変異の場合における三重鎖の形成の、およびＤＮＡの特異的開裂の不存在（実施例Ｂ）および開裂部位ｂおよびｃにおける突然変異した二重鎖の場合における、三重鎖の形成、三重鎖部位の３’末端におけるトポＩ−媒介ＤＮＡ開裂部位の不存在（実施例Ｃ）を示す説明図である。
【図８．Ａ】図８．Ａは、ＤＮＡ／トポ Ｉ／ＣＰＴ複合体の形成に伴う生物学的効果の相関結果を示す説明図である。
【図８．Ｂ】図８．Ｂは、ＤＮＡ／トポ Ｉ／ＣＰＴ複合体の形成に伴う生物学的効果の相関結果を示す説明図である。
【図９】図９は、本発明の方法で有用なある種の複合体／複合体の（阻害剤単独と比較した開裂強度、および与えられた部位ａ、ｂ、ｃおよびｄの点における）有効性を示す説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは、病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時にかつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；
ＣはトポイソメラーゼＩポイズンである］
の化合物の、遺伝子の発現によってもたらさせる病気の治療用の医薬品の調製のための使用であって、前記遺伝子は安定化されたトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂によって阻害される、使用。
【請求項２】
前記遺伝子が、その発現が細胞の腫瘍状態の発生および維持を制御する遺伝子である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記遺伝子が、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＶＥＧＦ、ＢＣＬ２からなる群より選択される遺伝子である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記遺伝子が、感染性微生物またはウイルスの遺伝子である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記遺伝子が、ＨＩＶまたはＨＣＶウイルスのものである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記遺伝子が、代謝異常病に関与する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記遺伝子が自己免疫疾患に関与する、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記トポイソメラーゼＩポイズンがカンプトテシン、レベッカマイシン、副溝リガンドおよびベンズイミダゾールからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記トポイソメラーゼポイズンがカンプトテシンである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記カンプトテシンが７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンおよび１０−ヒドロキシカンプトテシンからなる群より選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記カンプトテシンが式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ1は−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｎ−Ｒ4基であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ２−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は所望により（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み：前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、ケト、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり：あるいはＲ1は−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、フェニルであり：あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり：あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり：あるいはＲ4はグリコシル残基であり：Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシである］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記カンプトテシンが式（ＩＩ）：
［式中、
Ａは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり：
ｎおよびｍが１に等しい場合：ＹはＮＲ12Ｒ13またはＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14で置換された飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり、同一または異なっていてもよいＲ12、Ｒ13およびＲ14は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキルであり、あるいはＹはＢＣＯＯＸであり、Ｂはアミノ酸の残基であり、ＸはＨ、利用可能な位置でＣ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、Ｃ−Ｃ４アルキルから選択される少なくとも１つの基で置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキル、ベンジルまたはフェニルであり、あるいは
もしｎおよびｍが共に０であれば：Ｙは内部塩の形態、および医薬上許容される酸のアニオンとの塩の形態の双方である４−トリメチルアンモニウム−３−ヒドロキシブタノイルであり、あるいはＹは上記定義されたＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14であり：
Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｐ−Ｒ4基であり、ｐは数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ１−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み：前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される1以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり：あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり：あるいはＲ4はポリアミノアルキル基であり：あるいはＲ4はグリコシル残基であり：Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシである］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマ−、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩である、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
前記カンプトテシンが式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
［式中、
Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｐ−Ｒ4基であり、ｐは整数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ２−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換された窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み：前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ９アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、および−ＮＲ6Ｒ7からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基またはその医薬上許容されるエステルの１つであり：あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ９アルキルであり：
あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり：あるいは
Ｒ4はグリコシル残基であり：
Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：
同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシであり：
ｎ＝１または２であり、
Ｚは水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルから選択される］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、およびその医薬上許容される塩である、請求項９に記載の使用。
【請求項１４】
前記カンプトテシンが７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンまたは１０−ヒドロキシカンプトテシンである、請求項９に記載の使用。
【請求項１５】
前記リガンドが三重ラセン形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＴＦＯがリボ核酸、デオキシリボ核酸、ＰＮＡ、ペプチド核酸、２´Ｏ−アルキルリボ核酸、オリゴホスホルアミデート、ＬＮＡからなる群より選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ配列−特異的リガンドが副溝バインダー（ＭＧＢ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＭＧＢがＮ−メチルピロール、Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−メチル−３−ヒドロキシピロールのポリアミド、ならびにβ−アラニンからなる群より選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記リンカーアームが、１〜５０、好ましくは２〜３０の、炭素原子、およびＮまたはＯからなる群より選択されるヘテロ原子の連続：およびホスホルアミドもしくはアミド結合、またはチオエステルを与えるように反応することができる末端部位によって形成される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記リンカーアームが、ジアミノアルキルおよびグリコールからなる群より選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記医薬品が、局所注射によって病気の部位に投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記病気が腫瘍または感染病である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬品が全身経路によって投与され、前記化合物がトランスフェクションベクターによって、または単独で運ばれる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記トランスフェクションベクターがナノ粒子、リポソーム、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーからなる群より選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記医薬が全身経路によって投与され、前記化合物Ｃが７−（２−アミノエトキシイミノメチル）カンプトテシンおよび７−（３−アミノプロポキシイミノメチル）カンプトテシンからなる群より選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは、病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり：
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており：
Ｃは式Ｉ：
（式中、
Ｒ1は−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｎ−Ｒ4基であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ２−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、ケト、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、フェニルであり；あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり：あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいはＲ4はグリコシル残基であり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシである）
のカンプトテシン誘導体である］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のシアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩。
【請求項２７】
Ｒ1が２−アミノエトキシイミノメチルおよび３−アミノプロポキシイミノメチルからなる群より選択され、Ｒ2およびＲ3が水素である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは病理学上重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ選択的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３´末端に結合しており；
Ｃは式（ＩＩ）：
（式中、
Ａは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
ｎおよびｍが１に等しい場合、ＹはＮＲ12Ｒ13またはＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14で置換された飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり、同一または異なっていてもよいＲ12、Ｒ13およびＲ14は水素、または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキルであり、あるいはＹはＢＣＯＯＸであり、Ｂはアミノ酸の残基であり、ＸはＨ、利用可能な位置がＣ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される少なくとも１つの基で置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキル、ベンジルまたはフェニルであり、あるいは
もしｎおよびｍが共に０であるならば；Ｙは内部塩の形態、および医薬上許容される酸のアニオンとの塩の形態の双方である４−トリメチルアンモニウム−３−ヒドロキシブタノイルであり、あるいはＹは上記定義されたＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14であり；
Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｐ−Ｒ４基であり、ｐは数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ１−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子、および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり；あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいはＲ4はグリコシル残基であり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシである）
のカンプトテシン誘導体である］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、およびその医薬上許容される塩。
【請求項２９】
式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；
Ｃは式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
（式中、
Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｐ−Ｒ4基であり、ｐは整数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、またはＣ２−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または、酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ９アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、および−ＮＲ6Ｒ7からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；あるいは
Ｒ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ９アルキルであり；あるいは
Ｒ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいは
Ｒ4はグリコシル残基であり；
Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシであり；
ｎ＝１または２であり；
Ｚは水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキルから選択される）
のカンプトテシン誘導体である］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩。
【請求項３０】
式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；
Ｃは７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンならびに１０−ヒドロキシカンプトテシン、スクシニル−バリル−２０−Ｏ−（７−テルブトキシイミノメチルカンプトテシン）（ＳＴ２６７７）、２０Ｓ−７−アミノエチルイミノメチルカンプトテシン（ＳＴ１５７８）、２０Ｓ−７−アミノプロピルイミノメチルカンプトテシン（ＳＴ２５４１）からなる群より選択される、カンプトテシン誘導体である］
の化合物。
【請求項３１】
少なくとも一種の医薬上許容される溶剤および／または賦形剤と混合した、請求項１に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項３２】
注射に適した請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
さらにトランスフェクションベクターを含む、請求項３１または３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記トランスフェクションベクターがナノ粒子、リポソーム、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーからなる群より選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
特に腫瘍の発生および維持に関与する病理学的に注目されるタンパク質、またはウイルスおよび病原体タンパク質、または代謝異常または自己免疫タンパク質に関与するタンパク質をコードする数個の標的遺伝子発現を同時に阻害するインビトロ方法であって、
（ｉ）少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤が、前記標的遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列−特異的リガンドに結合した前記複合体により、少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤の作用を、前記遺伝子に特異的な部位に向けることと、
（ｉｉ）前記複合体の前記リガンドによってゲノム中の前記遺伝子を認識し、前記リガンドの前記標的への結合を得ることと、
（ｉｉｉ）トポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を誘導し、前記遺伝子の発現を阻害すること；
を含む、方法。
【請求項３６】
前記標的遺伝子の配列がその近傍にトポイソメラーゼ阻害剤の部位を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤がインドロカルバゾールおよびその誘導体のような挿入剤、カンプトテシンおよびその誘導体のような非挿入剤、ベンズイミダゾールおよびその誘導体のような副溝リガンドからなる群より選択される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのリガンドがリボ核酸、デオキシリボ核酸、ＰＮＡ、ペプチド核酸、２’Ｏ−アルキルリボ核酸、オリゴホスホルアミデート、ＬＮＡからなる群より選択され、それが三重ラセンを形成する場合にはＴＦＯに、それが副溝に結合する場合にはＭＧＢに対応し、次いで、Ｎ−メチルピロール、Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−メチルー３−ヒドロキシピロールのポリアミド、ならびにβ−アラニンから選択される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
三重ラセン形成性オリゴヌクレオチドトポイソメラーゼ阻害剤を含む複合体による開裂が、標的のオリゴピリミジン鎖上の三重鎖の３’側のトポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された開裂部位を持つ２および１００の間、好ましくは１０〜３０の多数のプリンを含む前記標的遺伝子の各オリゴピリミジン・オリゴプリン配列に向けられる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
トポイソメラーゼ阻害剤によって誘導された前記開裂部位が、三重ラセンの末端から３〜８ヌクレオチドに位置する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的遺伝子の配列が、遺伝子、特に、アポトーシス成長および／または阻害シグナルの伝達に関与する遺伝子の群に存在する、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは、病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時にかつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；
ＣはトポイソメラーゼＩポイズンである］
の化合物の、遺伝子の発現によってもたらさせる病気の治療用の医薬品の調製のための使用であって、前記遺伝子は安定化されたトポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂によって阻害される、使用。
【請求項２】
前記遺伝子が、その発現が細胞の腫瘍状態の発生および維持を制御する遺伝子である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記遺伝子が、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＶＥＧＦ、ＢＣＬ２からなる群より選択される遺伝子である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記遺伝子が、感染性微生物またはウイルスの遺伝子である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記遺伝子が、ＨＩＶまたはＨＣＶウイルスのものである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記遺伝子が、代謝異常病に関与する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記遺伝子が自己免疫疾患に関与する、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記トポイソメラーゼＩポイズンがカンプトテシン、レベッカマイシン、副溝リガンドおよびベンズイミダゾールからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記トポイソメラーゼポイズンがカンプトテシンである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記カンプトテシンが７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンおよび１０−ヒドロキシカンプトテシンからなる群より選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記カンプトテシンが式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ1は−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｎ−Ｒ4基であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ２−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は所望により（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み：前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、ケト、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり：あるいはＲ1は−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、フェニルであり：あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり：あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり：あるいはＲ4はグリコシル残基であり：Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシである］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記カンプトテシンが式（ＩＩ）：
［式中、
Ａは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり：
ｎおよびｍが１に等しい場合：ＹはＮＲ12Ｒ13またはＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14で置換された飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり、同一または異なっていてもよいＲ12、Ｒ13およびＲ14は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキルであり、あるいはＹはＢＣＯＯＸであり、Ｂはアミノ酸の残基であり、ＸはＨ、利用可能な位置でＣ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、Ｃ−Ｃ４アルキルから選択される少なくとも１つの基で置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキル、ベンジルまたはフェニルであり、あるいは
もしｎおよびｍが共に０であれば：Ｙは内部塩の形態、および医薬上許容される酸のアニオンとの塩の形態の双方である４−トリメチルアンモニウム−３−ヒドロキシブタノイルであり、あるいはＹは上記定義されたＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14であり：
Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｐ−Ｒ4基であり、ｐは数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ１−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み：前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される1以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり：あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり：あるいはＲ4はポリアミノアルキル基であり：あるいはＲ4はグリコシル残基であり：Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシである］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマ−、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩である、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
前記カンプトテシンが式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
［式中、
Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｐ−Ｒ4基であり、ｐは整数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ２−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換された窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み：前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ９アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、および−ＮＲ6Ｒ7からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基またはその医薬上許容されるエステルの１つであり：あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ９アルキルであり：
あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり：あるいは
Ｒ4はグリコシル残基であり：
Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり：
同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシであり：
ｎ＝１または２であり、
Ｚは水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルから選択される］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、およびその医薬上許容される塩である、請求項９に記載の使用。
【請求項１４】
前記カンプトテシンが７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンまたは１０−ヒドロキシカンプトテシンである、請求項９に記載の使用。
【請求項１５】
前記リガンドが三重ラセン形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＴＦＯがリボ核酸、デオキシリボ核酸、ＰＮＡ、ペプチド核酸、２´Ｏ−アルキルリボ核酸、オリゴホスホルアミデート、ＬＮＡからなる群より選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ配列−特異的リガンドが副溝バインダー（ＭＧＢ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＭＧＢがＮ−メチルピロール、Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−メチル−３−ヒドロキシピロールのポリアミド、ならびにβ−アラニンからなる群より選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記リンカーアームが、１〜５０、好ましくは２〜３０の、炭素原子、およびＮまたはＯからなる群より選択されるヘテロ原子の連続：およびホスホルアミドもしくはアミド結合、またはチオエステルを与えるように反応することができる末端部位によって形成される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記リンカーアームが、ジアミノアルキルおよびグリコールからなる群より選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記医薬品が、局所注射によって病気の部位に投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記病気が腫瘍または感染病である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬品が全身経路によって投与され、前記化合物がトランスフェクションベクターによって、または単独で運ばれる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記トランスフェクションベクターがナノ粒子、リポソーム、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーからなる群より選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記医薬が全身経路によって投与され、前記化合物Ｃが７−（２−アミノエトキシイミノメチル）カンプトテシンおよび７−（３−アミノプロポキシイミノメチル）カンプトテシンからなる群より選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは、病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり：
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており：
Ｃは式Ｉ：
（式中、
Ｒ1は−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｎ−Ｒ4基であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ２−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、ケト、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、フェニルであり；あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり：あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいはＲ4はグリコシル残基であり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１０）アリール（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシである）
のカンプトテシン誘導体である］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のシアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩。
【請求項２７】
Ｒ1が２−アミノエトキシイミノメチルおよび３−アミノプロポキシイミノメチルからなる群より選択され、Ｒ2およびＲ3が水素である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
式Ｉ：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは病理学上重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ選択的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３´末端に結合しており；
Ｃは式（ＩＩ）：
（式中、
Ａは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ３−Ｃ１０シクロアルキル−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり；
ｎおよびｍが１に等しい場合、ＹはＮＲ12Ｒ13またはＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14で置換された飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり、同一または異なっていてもよいＲ12、Ｒ13およびＲ14は水素、または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキルであり、あるいはＹはＢＣＯＯＸであり、Ｂはアミノ酸の残基であり、ＸはＨ、利用可能な位置がＣ１−Ｃ４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、アミノ、Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される少なくとも１つの基で置換された直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキル、ベンジルまたはフェニルであり、あるいは
もしｎおよびｍが共に０であるならば；Ｙは内部塩の形態、および医薬上許容される酸のアニオンとの塩の形態の双方である４−トリメチルアンモニウム−３−ヒドロキシブタノイルであり、あるいはＹは上記定義されたＮ+Ｒ12Ｒ13Ｒ14であり；
Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｐ−Ｒ４基であり、ｐは数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ１−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または酸素の原子、および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ6Ｒ7から選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；あるいはＲ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されていてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキルであり；あるいはＲ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいはＲ4はグリコシル残基であり；Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシである）
のカンプトテシン誘導体である］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、およびその医薬上許容される塩。
【請求項２９】
式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；
Ｃは式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
（式中、
Ｒ1は水素または−Ｃ（Ｒ5）＝Ｎ−（Ｏ）ｐ−Ｒ4基であり、ｐは整数０または１であり、Ｒ4は水素または直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、またはＣ２−Ｃ８アルケニル基、またはＣ３−Ｃ１０シクロアルキル基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル基、またはＣ６−Ｃ１４アリール基、または直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基、または複素環基または直鎖もしくは分岐鎖のヘテロシクロ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基であり、前記複素環基は、所望により、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基で置換されていてもよい窒素の原子、および／または、酸素の原子および／または硫黄の原子から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み；前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、複素環またはヘテロシクロ−アルキル基は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ９アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、および−ＮＲ6Ｒ7からなる群より選択される１以上の基で置換されていてもよく、同一または異なっていてもよいＲ6およびＲ7は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、−ＣＯＯＨ基、またはその医薬上許容されるエステルの１つであり；あるいは−ＣＯＮＲ8Ｒ9基であり、同一または異なっていてもよいＲ8およびＲ9は水素、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；あるいは
Ｒ4は、所望により、ハロゲン、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシ、フェニル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ10Ｒ11から選択される１以上の基で置換されてもよい（Ｃ６−Ｃ１０）アロイルまたは（Ｃ６−Ｃ１０）アリールスルホニル残基であり、同一または異なっていてもよいＲ10およびＲ11は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ９アルキルであり；あるいは
Ｒ4はポリアミノアルキル残基であり；あるいは
Ｒ4はグリコシル残基であり；
Ｒ5は水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルキル、直鎖もしくは分岐鎖のＣ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ３−Ｃ１０）シクロアルキル−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、直鎖もしくは分岐鎖の（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
同一または異なっていてもよいＲ2およびＲ3は水素、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ８アルコキシであり；
ｎ＝１または２であり；
Ｚは水素、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１−Ｃ４アルキルから選択される）
のカンプトテシン誘導体である］
の化合物、Ｎ１−オキシド、ラセミ混合物、その個々のエナンチオマー、その個々のジアステレオマー、その混合物、および医薬上許容される塩。
【請求項３０】
式：
Ａ−Ｂ−Ｃ
［式中、
Ａは病理学的に重要な遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができるＤＮＡ配列−特異的リガンドであり；
Ｂはリンカーアームであり、前記リンカーアームはＡの３’末端に結合しており；
Ｃは７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンならびに１０−ヒドロキシカンプトテシン、スクシニル−バリル−２０−Ｏ−（７−テルブトキシイミノメチルカンプトテシン）（ＳＴ２６７７）、２０Ｓ−７−アミノエチルイミノメチルカンプトテシン（ＳＴ１５７８）、２０Ｓ−７−アミノプロピルイミノメチルカンプトテシン（ＳＴ２５４１）からなる群より選択される、カンプトテシン誘導体である］
の化合物。
【請求項３１】
少なくとも一種の医薬上許容される溶剤および／または賦形剤と混合した、請求項１に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項３２】
注射に適した請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
さらにトランスフェクションベクターを含む、請求項３１または３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記トランスフェクションベクターがナノ粒子、リポソーム、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーからなる群より選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
特に腫瘍の発生および維持に関与する病理学的に注目されるタンパク質、またはウイルスおよび病原体タンパク質、または代謝異常または自己免疫タンパク質に関与するタンパク質をコードする数個の標的遺伝子発現を同時に阻害するインビトロ方法であって、
（ｉ）少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤が、前記標的遺伝子に共通する配列を同時かつ特異的に認識することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列−特異的リガンドに結合した前記複合体により、少なくとも１つのトポイソメラーゼＩ阻害剤の作用を、前記遺伝子に特異的な部位に向けることと、
（ｉｉ）前記複合体の前記リガンドによってゲノム中の前記遺伝子を認識し、前記リガンドの前記標的への結合を得ることと、
（ｉｉｉ）トポイソメラーゼＩ−媒介ＤＮＡ開裂を誘導し、前記遺伝子の発現を阻害すること；
を含む、方法。
【請求項３６】
前記標的遺伝子の配列がその近傍にトポイソメラーゼ阻害剤の部位を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのトポイソメラーゼ阻害剤がインドロカルバゾールおよびその誘導体のような挿入剤、カンプトテシンおよびその誘導体のような非挿入剤、ベンズイミダゾールおよびその誘導体のような副溝リガンドからなる群より選択される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのリガンドがリボ核酸、デオキシリボ核酸、ＰＮＡ、ペプチド核酸、２’Ｏ−アルキルリボ核酸、オリゴホスホルアミデート、ＬＮＡからなる群より選択され、それが三重ラセンを形成する場合にはＴＦＯに、それが副溝に結合する場合にはＭＧＢに対応し、次いで、Ｎ−メチルピロール、Ｎ−メチルイミダゾールおよびＮ−メチルー３−ヒドロキシピロールのポリアミド、ならびにβ−アラニンから選択される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
三重ラセン形成性オリゴヌクレオチドトポイソメラーゼ阻害剤を含む複合体による開裂が、標的のオリゴピリミジン鎖上の三重鎖の３’側のトポイソメラーゼＩ阻害剤によって誘導された開裂部位を持つ２および１００の間、好ましくは１０〜３０の多数のプリンを含む前記標的遺伝子の各オリゴピリミジン・オリゴプリン配列に向けられる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
トポイソメラーゼ阻害剤によって誘導された前記開裂部位が、三重ラセンの末端から３〜８ヌクレオチドに位置する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的遺伝子の配列が、遺伝子、特に、アポトーシス成長および／または阻害シグナルの伝達に関与する遺伝子の群に存在する、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２．Ａ】
【図２．Ｂ】
【図３．Ａ】
【図３．Ｂ】
【図４】
【図５．Ａ】
【図５．Ｂ】
【図６．Ａ】
【図６．Ｂ】
【図７．Ａ】
【図７．Ｂ】
【図８．Ａ】
【図８．Ｂ】
【図９】
【図２．Ａ】
【図２．Ｂ】
【図３．Ａ】
【図３．Ｂ】
【図４】
【図５．Ａ】
【図５．Ｂ】
【図６．Ａ】
【図６．Ｂ】
【図７．Ａ】
【図７．Ｂ】
【図８．Ａ】
【図８．Ｂ】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５２３６４６（Ｐ２００６−５２３６４６Ａ）
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５１５４（Ｐ２００６−５０５１５４）
【出願日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４０２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３３６５
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０５３５３８０３）アンセルム（アンスティテュ ナシオナル デ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） (1)
【出願人】（５０２０７１２１８）サーントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シャーンティフィク（セーエンヌエールエス） (8)
【出願人】（５０５３５３７９９）ミュゼウム ナシオナル ディストワール ナチュレール (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４０２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３３６５
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５０５３５３８０３）アンセルム（アンスティテュ ナシオナル デ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） (1)
【出願人】（５０２０７１２１８）サーントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シャーンティフィク（セーエンヌエールエス） (8)
【出願人】（５０５３５３７９９）ミュゼウム ナシオナル ディストワール ナチュレール (1)
【Ｆターム（参考）】
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