本発明は、医学および診断分野におけるマイクロRNA-199b-5pの使用に関する。特に、本発明は、抗癌治療における、また病理組織学的および転移マーカーとしてのmiR199b-5pの使用に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学および診断分野におけるマイクロRNA-199b-5pの使用に関する。特に、本発明は、抗癌治療における、ならびに病理組織学的マーカーおよび転移マーカーとしての、miR199b-5pの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロRNA(miRNA)は、約22ヌクレオチド長の一本鎖RNAであり、遺伝子調節因子の新規クラスを構成する[1]。動物では、miRNAは、そのmRNA標的の3’-非翻訳領域(3’UTR)内の不完全相補部位とのその結合を介して調節作用を有する。多数のmiRNAの発現の変化が、いくつかの腫瘍種:例えば、B-細胞リンパ腫(クラスター化miR-17)[2、3]、悪性リンパ腫(miR-15a、miR-16-1;BCL2を標的とする)[4]、神経膠芽腫腫瘍(miR-21アップレギュレーション)[5]、結腸直腸新生物(miR-143、miR-145ダウンレギュレートされる)[6]、肺癌(miR-29)[7]および乳癌(miR-10b)[8]において観察されており、いくつかのさらなる腫瘍種が分析下にある。
【０００３】
髄芽腫(MB)は、最もよくある悪性脳腫瘍である。幹細胞および小脳の外顆粒層中の顆粒ニューロン前駆体が起源であると思われ[9]、あるいは、小脳の脳室帯中の多能性前駆体が起源であると思われる[10〜12]。臨床的観点から、現在の集学的治療は、根治的外科的切除と、それに続く放射線療法および化学療法を含む。これらの治療は、生存率を改善し得るが、MBはこれらの患者の約3分の1において不治のままである。死亡の主な原因は、腫瘍播種を伴う再発であり、その時点で、現在の治療の選択肢はほとんど有効性がない[13]。これらの治療はまた、毒性であり、長期の能力障害につながり得る[14〜16]。結果として、髄芽細胞腫を有する小児のための、新規の有効な、低毒性の治療が実質的に必要である。
【０００４】
MB細胞はまた、独特に腫瘍成長を増殖させることができる幹様特性を有する、機能的に重要な細胞のサブセットを含有し得る[17、18]。最近の研究は、前駆細胞および幹細胞の両方が、ソニック-ヘッジホッグ(Shh)経路に応答し得、MBの起源の細胞として働き得ることを示した[19]。
【０００５】
ノッチ活性は、MBが生じる顆粒細胞前駆細胞を調節することがわかっており、MBの15%においてノッチ2遺伝子コピー数が増大している[12、20]。主なノッチ応答性遺伝子、bHLH HES1の持続性発現は、脳室帯からの神経前駆体細胞の移動および神経細胞マーカーの発現の両方を防ぐ[21]。Hes1を欠くマウスは、神経bHLH転写因子のアップレギュレーションとして見られる未熟な神経発生を示し、これは、主な神経管欠損をもたらし[22];これらのマウスに由来する前駆体細胞は、自己再生能が損なわれており、神経細胞系への関わり合いを有する[23]。
【０００６】
重要なことに、MBにおけるHES1の発現は、悪い臨床成績と関連している[24]。注目すべきことに、その他の経路、例えば、ポリコーム群遺伝子BMI-1とのクロストークも有するような[26]、顆粒細胞前駆体発達におけるソニック-ヘッジホッグ(Shh)との相互作用が仮定されている[25]。
【０００７】
髄芽細胞腫の治癒にとって、また病理組織学的マーカーおよび転移の検出による初期診断にとって、新規医学的介入の必要性は明らかである。本発明者らは、転移患者では、miRNA 199b-5pの発現が失われることを示し、発癌の際に起こるメチル化プロセスによるエピジェネティックサイレンシング後の調節の機序を推定し、MBを有する患者における危険性の高いクラスの新規分子マーカーを同定している。MiR-199b-5p過剰発現は、いくつかの癌幹細胞遺伝子の発現を阻止し、胸腺欠損/ヌードマウスの小脳におけるMB細胞の生着能力を損ない、特に注目されることに、細胞のMB腫瘍幹細胞様(CD133+)サブポピュレーション集団を低減する。このため、miR-199b-5pは、抗癌治療として、ならびに腫瘍の病理組織学的状態を調べるための、および転移の有無の知見のためのマーカーとして使用できる。本発明の発明者らは、転移患者ではmiR-199-5pの発現が失われることを同定し、この喪失は、発癌の際のサイレンシングの機序によると推定した。本発明者らは、再発の危険性が低いおよび侵攻性疾患の特定のクラスの髄芽細胞腫患者の新規分子マーカーを同定した。実際、miR-199-5pは、CD133+癌幹細胞に負に影響を及ぼし、異種移植片同所性小脳癌動物モデルにおいて、in vivoで、小脳への増殖および腫瘍形成の障害を示す。これらの上記の理由のために、miR-199b-5pを、抗癌治療において、ならびに腫瘍の病理組織学的状態のマーカーとして診断目的のために、また予測マーカーとして転移の有無との相関のために使用できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、MB細胞株のスクリーニングにおいて、転写因子HES1のターゲッティングによってノッチシグナル伝達経路の調節因子としてmiR-199b-5pを見い出した。miR-199b-5pのHES1発現のダウンレギュレーションは、MB細胞の増殖速度および足場非依存性増殖を負に調節する。MiR-199b-5p過剰発現は、いくつかの癌幹細胞遺伝子の発現を阻止し、胸腺欠損/ヌードマウスの小脳におけるMB細胞の生着能力を損ない、特に注目されることに、細胞のMB幹細胞様(CD133+)亜集団を低減する。MBを有する61人の患者の分析では、miR 199b-5pの発現は、非転移症例では、転移症例においてよりも大幅に高かった(P=0.001)。miR-199b-5pの高い発現レベルを有する患者の生存データに従う統計的相関分析は、miR-199b-5p低発現miR-199b-5p患者のものよりも全生存を規定するオーダーを高める正の傾向を示す。転移性MB患者におけるmiR-199b-5pのダウンレギュレーションを示すこれらのデータは、遺伝子修飾またはエピジェネティック修飾によるサイレンシング機序の可能性を示唆する。脱メチル化剤(例えば、5-アザ-デオキシシチジン)の誘導時に、MB細胞株のパネルにおいてmiR-199b-5p発現の増強が観察され、このことは、miR-199b-5pの調節のエピジェネティック機序を支持する。さらに、2種の髄芽細胞腫細胞株(Med8およびUV238)は、5-アザ-デオキシシチジン処理の際にmiR-199b-5pの有意なアップレギュレーション現象を示す。本発明者らは、マウス小脳小脳に、MB細胞に対するmiR-199b-5pを保持するアデノウイルス(Daoy 細胞株)の以前の感染および胸腺欠損(atimic)/ヌードマウスの小脳へのその注入が、腫瘍増殖および特に、MB癌幹細胞のサブセットに対するmiR199b-5pの負の影響によって臨床上の利益を示す、誘導された異種移植片同所性モデルを作製し、さらなる概念実証を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明の特定の目的は、髄芽細胞腫、リンパ腫、神経膠芽腫(glyoblastoma)、結腸癌腫および乳癌からなる群において選択される、遺伝子CD133の発現を特徴とする腫瘍の治療および/または予防において使用するための、以下の配列:
CCAGAGGACACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTATCTGTT CAGGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGC TGGGTTAGACCCTCGG (配列番号1)
を含む、もしくはからなる、
または対応するリボヌクレオチド配列:
CCAGAGGACACCUCCACUCCGUCUACCCAGUGUUUAGACUAUCUG UUCAGGACUCCCAAAUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGCU GGGCUGGGUUAGACCCUCGG (配列番号10)
を含む、もしくはからなるか、
または配列番号10の一部:
CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC(配列番号11)
を含む、もしくはからなるオリゴヌクレオチド配列である。
【００１１】
特に、太字の配列は、成熟miR-199b-5p配列に対応する。
【００１２】
上記の配列は、ウイルスベクター(デオキシ-リボヌクレオチド配列について)、例えば、アデノウイルスベクター、SNALP技術(リボヌクレオチド配列について)、LNA技術によって、または、コレステロールの結合分子の結合による、もしくはリンカーC_1〜7を使用するO-2-メチル基の修飾によってヒトに保持され得る。特に、アデノウイルスベクターは、配列番号1の配列を含むかまたはからなる、クローニングされた、CMVプロモーター、Xhol/Hindlll制限部位を有する6217bpの、図15および16に示されるマップを有するAdV5ベクターであり得る。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、CD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される癌幹細胞において発現される1つまたは複数の遺伝子とともに、配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の生体サンプルにおける調査による、腫瘍の病理組織学的状態(ステージ)の評価または転移の有無の定義のためのin vitroでの診断方法である。
【００１４】
特に、腫瘍は、結腸癌腫、髄芽細胞腫、神経膠芽腫、乳癌、リンパ腫および肺癌腫;好ましくは、結腸癌腫、髄芽細胞腫、神経膠芽腫(glyoblastoma)、乳癌およびリンパ腫;最も好ましくは、結腸癌腫、髄芽細胞腫、神経膠芽腫、リンパ腫からなる群内で選択され得る。
【００１５】
本発明の一実施形態によれば、本発明の診断方法は、結腸癌腫、髄芽細胞腫および神経膠芽腫に適用されるmiR199b-5pおよびCD133の発現分析を含む。第2の実施形態によれば、診断方法は、結腸癌腫、乳癌およびリンパ腫に適用されるmiR199b-5pおよびHMGA1の発現分析を含む。
【００１６】
配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の検出は、増幅のために以下のプライマー:
プライマーフォワード:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(配列番号3)
プライマーリバース:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(配列番号4)
および配列の発現値を正規化するための対照プライマーの対、例えば、以下のプリマー:
プライマーフォワード:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(配列番号5)
プライマーリバース:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T (配列番号6)。
を用いるリアルタイムPCRによって評価できることが好ましい。
【００１７】
代替様式におけるように、配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の検出は、以下のステップ:
a)RNAのレトロ転写;およびb)以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(配列番号7)
プライマーリバース:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(配列番号8)
プローブ:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(配列番号9)
を使用するTaqManアッセイによる前記配列の発現を含むかまたはからなる。
【００１８】
本発明の特定の実施形態によれば、前記1つまたは複数の遺伝子は、以下の対の増幅プライマー:
CD133:
プライマーフォワード:CTATGTGGTACAGCCGCGTG (配列番号22)
プライマーリバース:TAATCAATTTTGGATTCATATGCCTTC (配列番号23)
c-myc
プライマーフォワード:ATGAGGAGACACCGCCCAC (配列番号24)
プライマーリバース:AACATCGATTTCTTCCTCATCTTCTT (配列番号25)
Nanog:
プライマーフォワード:GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGC (配列番号26)
プライマーリバース:GCTGTCCTGAATAAGCAGATCCAT (配列番号27)
Oct4:
プライマーフォワード:ACTGCAGCAGATCAGCCACA (配列番号28)
プライマーリバース:TGGCGCCGGTTACAGAAC (配列番号29)
TCFL1:
プライマーフォワード:CCGCGGGACTATTTCGC (配列番号30)
プライマーリバース:AAAGAACGCGCTGTCCTGAG (配列番号31)
ZIC1:
プライマーフォワード:CAGTTCGCTGCGCAAACA (配列番号32)
プライマーリバース:GAGCCCTGCGAGGAGGAT (配列番号33)
KLF5:
プライマーフォワード:GCATCCACTACTGCGATTACCC (配列番号34)
プライマーリバース:TGAGAAGACTTGGTATAAACTTTTGTGC (配列番号35)
HMGA1:
プライマーフォワード:AAAAACAAGGGTGCTGCCAA (配列番号36)
プライマーリバース:CCTTCCTGGAGTTGTGGTGGT (配列番号37)
HMGB3:
プライマーフォワード:TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGG (配列番号38)
プライマーリバース:TTTCTCTTTCCCGGACATCG (配列番号39)
を使用する以下の配列:
CD133:
CTATGTGGTACAGCCGCGTGATTTCCCAGAAGATACTTTGAGAAAATT CTTACAGAAGGCATATGAATCCAA AATTGATTA (配列番号13)
c-myc:
AGGAGGAACAAGAAGATGAGGAAGAAATCGATGTT (配列番号14)
Nanog:
GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGCCTCACACGGAGACTGTCTCTCCTC TTCCTTCCTCCATGGATCTGCTTATTCAGGACAGC (配列番号15)
Oct4:
ACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAG G
ATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCA (配列番号16)
TCFL1:
CCGCGGGACTATTTCGCCGAAGTGAGAAGGCCTCAGGACAGCGCG TTCTTT (配列番号17)
ZIC1:
CAGTTCGCTGCGCAAACACATGAAGGTCCACGAATCCTCCTCGCAGG GCTC (配列番号18)
KLF5:
GCATCCACTACTGCGATTACCCTGGTTGCACAAAAGTTTATACCAAGT CTTCTCA (配列番号19)
HMGA1:
AAAAACAAGGGTGCTGCCAAGACCCGGAAAACCACCACAACTCCAG GAAGG (配列番号20)
HMGB3:
TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGGTGGAAGACGATGTCCGGGAAAGA GAAA (配列番号21);
のうち少なくとも1つを増幅によって、および
以下の遺伝子配列の発現を正規化するために以下の対のプライマー:
プライマーフォワード:CGT GCT GCT GAC CGA GG(配列番号79)
プライマーリバース:GAA GGT CTC AAA CAT GAT CTG GGT(配列番号80)
を使用して、リアルタイムPCRによって検出される。
【００１９】
あるいは、前記1つまたは複数の遺伝子は、増幅のために以下のプライマーおよびプローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
を使用して、以下の配列:
cd 133
TCCACAGAAATTTACCTACATT
GGAAGAGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGCCTGGTCATCTGCT CTCTGCTGACCC (配列番号40)
c myc
GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCT
CCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAACTA (配列番号41)
nanog:
CCGAAGAATAGCAATGGTGTGACGCAG
AAGGCCTCAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTACTCTTCCTACCACCA GGGATG (配列番号42)
oct 4:
AACCCGGAGGAGGTAGTCCTTTGTTACATGCATGAGTCAGTGAACAG GGAATGGGTGAATGACATTTGTGGGTAGGTTATT (配列番号43)
tcfl1:
CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAGAAGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGT CTTTTGTCCTCAGACTTGATCCTGCTCCCTCGG (配列番号44)
zic 1:
CGCGCTCCGAGAATTTAAAGATCCACAAAAGGACGCACACAGGGAGA AGCCCTTCAAGTGCGAGTTTGAGGGCTGTGACC (配列番号45)
KLF5:
TTTAACCCCACCTCCATCCTATGCTGCTACAATTGCTTCTAAACTGGC AATTCACAATCCAAATTTACCCACCACCCTGCC (配列番号46)
HMGA1:
CCCCAGGCAGACCTTATATGAGACATGGGAGTCCCACCGTATTGTCC AGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAAGCA (配列番号47)
HMGB3:
CGCTATGATCGGGAAATGAAGGATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAA GAAGAAGAAGGATCCTAATGCTCCCAAAAGGCCA (配列番号48);
のうち少なくとも1つの増幅のためのリアルタイムTaqManによって、
遺伝子配列の発現を正規化するために以下の対のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG (配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA (配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC (配列番号83)
を使用して、検出され得る。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、リアルタイムPCRによる、生体サンプルにおける、配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の検出、およびリアルタイムTaqManによる、CD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される、癌幹細胞において発現される1つまたは複数の(one o more)遺伝子の検出によって、腫瘍の病理組織学的ステージおよび転移の存在を評価するためのin vitroでの診断キットであり、前記キットは、
a)配列番号1を含むかまたはからなる前記配列の増幅の以下のプライマー:
プライマーフォワード:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(配列番号3)
プライマーリバース:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(配列番号4)
b)前記配列の発現値を正規化するための1対の対照プライマー;
c)前記1つまたは複数の遺伝子の配列を示すための以下の1または複数の対のプライマーおよび対応するプローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ:CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
d)前記遺伝子の配列の発現を正規化するための以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG(配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(配列番号83)
を含むかまたはからなる。
【００２１】
特に、配列の発現を正規化するためのb)において提示される対照プライマーは、以下:
プライマーフォワード:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(配列番号5)
プライマーリバース:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(配列番号6)
であり得る。
【００２２】
さらに、本発明は、TaqManアッセイによって、生体サンプルにおける、配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現、およびCD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される、癌幹細胞において発現される1つまたは複数の遺伝子の発現を検出することによって腫瘍の病理組織学的ステージおよび転移の存在を評価するためのin vitroでの診断キットに関し、前記診断キットは、
a1)配列番号1を含むかまたはからなる前記配列の発現を検出するための以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(配列番号7)
プライマーリバース:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(配列番号8)
プローブ:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(配列番号9);
b1)前記1つまたは複数の遺伝子の発現の検出のための、1または複数の対の以下のプライマーおよび対応するプローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
c1)上記の報告された遺伝子の配列の発現の正規化のための、以下の対のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG(配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(配列番号83)
を含む、およびからなる。
【００２３】
本発明は、例示によってであるが、制限的な方法ではなく、添付の図面と関連して、好ましい形態の理解によって記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Daoy MB細胞の増殖および分化に対するmiR199b-5bのin-vitro機能を示す図である。 A)安定な199bSC1クローンのS相の細胞のパーセンテージの低下およびGO〜G1の増大を示す、ヨウ化プロピジウムを用いる代表的なFACS分析。199bSC1および199bMC1クローンにおけるG0〜G1の赤色ピークを有するショルダーシグナルがないことが、アポトーシス過程を排除する。B)空のベクター単独を有する安定なクローン(青色の菱形)と比較した、安定な199bSC1クローン(赤色の三角形)および199bMC1クローン(緑色の×印)の増殖速度の低下を示す、3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-5-3-カルボキシメトキシフェニル-2-4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウム塩(MTS)による増殖アッセイ。miR-199b-5p過剰発現のこの効果は、2-OMトランスフェクション(桃色の四角)によって低減された。示されるデータは、各々3連で実施された2回の独立した実験から得た平均±SDである。C)安定な199bSC1および199bMC1クローンを野生型細胞と比較する、リアルタイムPCRによって示されるような、miR-199b-5p過剰発現の際の、分化(例えば、MASH1、MATH3およびNEUROGENIN2)および増殖(例えば、c-MYC、サイクリンD1)マーカーの代表的な(Rapresentative)mRNA発現。D)miR-199b-5pの安定な199bSC1クローンは、軟寒天アッセイにおけるコロニー形成の低下を示す。プロットは、各々、3連で実施された3回の独立実験から平均±SDとして計数されたコロニーを示す。E)抗c-Mycおよび抗サイクリンD1抗体を使用する代表的なウエスタンブロットは、安定な199bSC1クローンにおいてこれら2種のタンパク質がダウンレギュレートされることを示す;右パネルにおける濃度測定分析も参照。F)Eについては、miR-199b発現後にアップレギュレートされるGABRA6およびMATH3タンパク質を示し、分化の誘導を示唆する。抗ラミニン-β抗体を使用して、核c-MycおよびサイクリンD1タンパク質発現を正規化した。抗β-アクチン抗体を使用して、細胞質GABRA6およびMATH3タンパク質発現を正規化した。
【図２】miR-199b-5pの過剰発現が、Daoy細胞のCD133+コンパートメントを低減することを示す図である。 A〜F)安定な199bSC1(D)および199bMC1(F)クローンの代表的なFACS分析は、幹細胞マーカーCD133について陽性である細胞(B)のパーセンテージの低下を示し;A、CおよびEは、陰性対照である(抗体なし)。
【図３】miR-199b-5p過剰発現の効果が、HES1トランスフェクションによって逆転されることを示す図である。 A)安定な199bSC1クローンにおけるHES1 cDNAの過剰発現によるHES1発現のレスキューが、サイクリンD1発現を回復させることを示す、代表的なウエスタンブロットおよび濃度測定分析。B)安定な199bSC1クローン単独(淡青の菱形)と比較した、HES1発現を有する安定な199bSC1クローン(暗青色の四角)の増殖速度の増大を示す、3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-5-3-カルボキシメトキシフェニル-2-4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウム塩(MTS)による増殖アッセイ。示されるデータは、各々、3連で実施された2回の独立実験から得た平均±SDである。C)リアルタイムPCRによって示されるような、野生型細胞と比較する、安定な199bSC1クローンにおけるHES1を用いる細胞レスキューの際の、分化(例えば、MASH1、MATH3およびNEUROGENIN 2)および増殖(例えば、c-MYC、サイクリンD1)マーカーの代表的な(Rapresentative)mRNA発現。GABRA6およびMAP2の発現は、レスキュー実験においてダウンレギュレートされる。D)HES1を発現する安定な199bSC1クローンの代表的なFACS分析は、安定な199bSC1クローン単独に対して、S相の細胞の画分の増大およびG1の減少を示す。E〜H)Daoy細胞のSPに対するmiR-199b-5p発現の効果は、HES1再発現によって逆転される。199bSC1安定クローンを、HES1 cDNAおよびGFPをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、次いで、ヘキストおよびベラパミル(E〜F)またはヘキスト単独(G〜H)を用いて48時間後に処理し、FACSによって分析した。GFP陽性細胞(P5ゲート)、パネルEおよびGを、色素排除細胞の存在について分析した(F〜H、P6ゲート)。トランスフェクトされていないGFP陰性細胞(P3ゲート)は分析しなかった。
【図４】miR-199b-5pを過剰発現するDaoy細胞の腫瘍形成能の低下を示す図である。 A)対照Daoy細胞(CTRサイド)およびmiR-199b-5pを過剰発現するDaoy細胞(199bサイド)を用いる、5匹のマウスのs.c.注射後の9週間にわたる異種移植片実験。腫瘍は、CTR細胞を用いると、5/5マウスにおいて、過剰発現細胞を用いると、3/5マウスにおいて巨視的に検出可能であった。9週間の増殖後のCTRおよび199bを注射されたサイド間の総腫瘍体積差は、示されるように(平均±SD)統計的に有意であった。B)9週間の腫瘍増殖後のマウス番号4の光子放出。199bサイド(199bLuc-1)は、一貫して、対照サイド(Ctl-Luc-4)よりも低い光子放出を有していた。腫瘍の寸法の比較も示されている。C)光子放出(Bを参照のこと)が細胞数に変換されると、5匹のマウスのうち1匹が、有意な相違を示さなかった(平均±SD)(両側の対応のないt検定)。D)それぞれ、199bLuc-1、mockAdV5に感染したCtl-Luc-4およびmiR-199b-5p AdV5に感染したCtl-Luc-4を用いて第4脳室に注射された3匹のマウスの光子放出。E)動物の脳全体および注射部位(白色矢印)。小脳のヘマトキシリン/エオシン染色;黒色矢印、腫瘍形成の開始部位。F)1カ月の腫瘍増殖後のDについての注射されたマウスのBLI。群間の差異は、統計的に有意である。G)Ctl-luc4-AdV5-Mock番号7を用いた全身腫瘍量の発生を示す2匹の選択されたマウスのBLIおよびCtl-luc4-AdV5-199b番号3を用いた経時的な低減(0〜8週)。H)外顆粒層の周囲およびIV心室内の腫瘍細胞(白色の星)を示す、同所性注射の10週後に、AdV5-Mock番号2およびAdV5- 199b番号3動物から得た小脳のヘマトキシリン-エオシン染色。青色で、GFP検出と一緒の、DAPY染色。示される倍率。
【図５】小脳に注射された異種移植されたMB細胞の高解像度分子イメージングを示す図である。 手術および注射から12週間の、AdV5-Mock番号7(A)およびAdV5-199b番号5(B)マウスのPET-CT融合画像および3D体積レンダリングおよびFLT取り込みの領域の同時表示(青色-緑色、白色矢印)。AdV5-Mock番号7マウスでは、頭蓋の後頭-頭頂部分におけるより広い骨の欠損が明らかである。下部:PET-CT獲得(補足材料に記載される)を用いて行われた、腫瘍量の測定値(cm3)の表。
【図６】ヒト小脳における、および腫瘍におけるmiR199bの発現レベルおよび予後との相関を示す図である。 A)示される2つの年齢範囲における健常なヒト小脳におけるmiR-199b-5pの発現レベルのボックスプロット。MiR-199b-5pは、より若い対照から得た外殖片において高い発現を示した(マン-ホイットニー検定、P=0.006)。B)MiR-199b-5pを高度に発現する症例は、大部分はMOであるP=0.001(ピアソンカイ二乗検定)。C)低対高(中央値に対して)レベルのmiR-199b-5p発現を有する患者を比較するカプラン-マイヤー生存推定値(利用可能なフォローアップデータを有する45人の患者)。D)5-Aza-Cで処理されていない、または処理された(DAC-/+)5種のMB細胞株のパネルにおけるリアルタイムPCRによるMiR-199b-5p発現;2種の細胞株:med8aおよびuw228における脱メチル化誘導されたmiR-199b-5p転写。 E)miR-199b-5pおよびノッチ経路間の相互作用。 MOおよびM+患者は、エピジェネティック機序によって駆動され得る、miR-199b-5pの異なる発現レベルを示す。左側:誘導されたmiR-199b-5p発現の条件下(1)、神経性bHLHに対する阻害を軽減するHES1低下のレベル(2)。これは、次いで、神経性プログラムおよび増殖、SPおよびCD133+細胞の低減を促進する(3)。右側:低miR-199b-5p発現の条件下、HES1のレベルが高く(1)、前神経bHLH遺伝子を抑制し、その結果、増殖、SPが増大し、CD133+コンパートメントが拡大する(4)。
【図７】miR199b-5p発現のMB患者の生存との関連を示す図である:カプラン-マイヤー分析は、高レベルのMir-199b-5pを有する患者に対する低レベルのmiR199b-5pを有する患者を示す(33°および66°パーセンタイル) (90/108人の患者のフォローアップデータが利用可能である)。
【図８】miR199b-5p発現のMB患者の生存との関連を示す図である:カプラン-マイヤー分析は、高レベルのMir-199b-5pを有する患者に対する低レベルのmiR199b-5pを有する患者を示す(33°および66°パーセンタイル)(90/108人の患者のフォローアップデータが利用可能である)。
【図９】A)miR-199b-5pおよびmiR-199aのための発現構築物を用いるHEK293細胞の一時的トランスフェクションから得た代表的なウエスタンブロット。MiR-199b-5p過剰発現は、内因性HES1タンパク質のレベルを低下させ;対照的に、miR-199aは、トランスフェクションの48時間後にHES1レベルの増大を誘導した。右:濃度測定分析による定量化。B)miR-199b-5pのための発現構築物を用い、空のベクターを使用するD283細胞の一時的トランスフェクションから得た代表的なウエスタンブロット。やはり、miR-199b-5p過剰発現は、内因性HES1タンパク質のレベルを低下させた。下部、濃度測定分析による定量化。C)D283およびSH-SY5Y細胞は、同様のレベルのmiR-199b-5pおよびmiR-124aを発現し、後者は、中枢神経系において選択的に発現されることが知られている。対照的に、D283Med細胞は、一貫して低いレベルのmiR-199b-5pを示した。示されるデータは、それぞれ、3連で実施した、2回の独立した実験から得た平均±SDである。D)ヒト組織のパネル(Ambion)にわたる代表的なMiR-199b-5p発現プロフィール;miR-199b-5pは、種々の程度に発現され、十二指腸、リンパ節、肺、骨格筋、右心室(最高)、腎臓、心臓全体および甲状腺において比較的高い発現を有していた。 その推定標的遺伝子、HES1の3’UTRに対するMiR-199b-5pの影響。 E〜F)miR-199b-5pの発現ベクターと同時トランスフェクトされた、またはされていない、野生型HES1 3’UTRおよびmiR-199b結合部位において突然変異したHES1 3’UTRを含有するリポーターベクターからのルシフェラーゼ活性。野生型3’UTR活性からのルシフェラーゼは、miR-199b-5p発現で50%低減され、一方で、2’-O-メチル-オリゴリボヌクレオチド(2-OM;400nM)は、この効果を阻止する。結合部位において突然変異されたHES1 3’UTRと一緒にmiR-199b-5pを用いると効果がない。代表的な実験は示されており、これでは、データは、各々、HEK293およびDaoy細胞株における3回の反復から得た平均±SDである。G〜I)Pre-miR-199をクローニングし、Daoy細胞にトランスフェクトし、qRT PCRおよびウエスタンブロッティングによってHES1発現について3種の安定なクローンを評価した。抗HES1ポリクローナル抗体を使用して示されるように、HES1タンパク質レベルの有意な低下があり;低下はまた、濃度測定分析によって示された(G;右パネル) H)miR-199b-5pに対して向けられた2’-O-メチル-オリゴリボヌクレオチド(2-OM)を、安定な199bSC1クローンにトランスフェクトし、代表的なウエスタンブロットおよび濃度測定分析による定量化は、回復されたHES1発現を示す。示される定量化データは、各々3連で実施した、2回の独立した実験から得た平均±SDである。
【図１０】マウス胎生期小脳におけるMmu-miR-199b発現およびヒトmiR-199b-5pによるその他の可能性ある標的の調節。 A) Mmu-miR-199b in situ mRNA発現は、E14.5で、および新生仔マウス(p0)小脳において検出可能である。染色は散在性であり、小脳のすべての領域においてであり;発現は、E14.5からp0へ低下した。Mmu-miR-124a(脳特異的miRNA)を対照として使用した。左:倍率、50X;右:倍率、200X。B)マウス発達および小脳の分化の間のmmu-miR-199b発現の低下の定量化。成熟miR-199b-5pの発現レベルが、let-7Aに対して示されており、データは、各々、3連で実施した2回の独立した実験から得た平均±SDとして示されている。C)高度に発現するmiR-199b-5p安定クローンにおける、標的であると予測されるGSK3-βのタンパク質レベルを示す代表的なウエスタンブロット。右のパネルに示される濃度測定分析による定量化から明らかであるように、GSK3-βレベルは、ダウンレギュレートされず、代わりに、わずかに増大し、これでは、データは、各々、3連で実施した2回の独立した実験から得た平均±SDとして示されている。D)MiR-199b-5pは、その他のUTRと結合すると予測される(補足表S1参照のこと)。Daoy細胞におけるmiR-199b-5p過剰発現が、示される全長3’UTRを保持するリポーター遺伝子からの増殖性翻訳のダウンレギュレーションについて調べられると、それらのうち影響を受けているとわかったものはなかった。示されるデータは、各々、3連で実施した2回の独立した実験から得た平均±SDである。E)ボイデンチャンバーシステム(化学誘引物質として0.5% FBS)を使用する、199bSC1細胞株を、Daoy空ベクターCTR(対照)株と比較する細胞運動性アッセイ。高運動性細胞を固定し、ヘマトキシリン染色し、顕微鏡下でカウントした。示されるデータは、各々、3連で実施した2回の独立した実験から得た平均±SDであり、それらは、対照(CTR)および199bSC1細胞株間の相違を示さない。F)示されるように、一時的トランスフェクション後にmiR-199b-5pを過剰発現する、D283MEDおよびONS76細胞の増殖アッセイ(MTS)。199b-5pを用いてトランスフェクトされたD283MED細胞(青色の菱型)は、対照、空のベクター、トランスフェクション(緑色の三角)と比較して、細胞増殖の相当な低減を示す。それにもかかわらず199b-5p形質転換体によって影響を受けるONS76細胞は、高い増殖率を示す(空のベクタートランスフェクションの橙色の十字を、紫色の四角と比較する)。示されるデータは、各々、3連で実施した2回の独立した実験から得た平均±SDである。G)2-O-メチルオリゴリボヌクレオチドアンチセンス(2-OM-a)のトランスフェクションによるmiR-199b-5pの内因性発現のサイレンシングは、Daoy細胞増殖の増大につながり、おそらくは、HES1 3’UTR上の内因性miR-199b-5pの制御を軽減する。示されるデータは、各々、3連で実施した2回の独立した実験から得た平均±SDである。
【図１１】Daoy細胞サイドポピュレーションに対するmiR-199b-5pの役割のFACS分析。 A、C、E)Hoechst33342染色によって決定される、Daoy199bSC1安定クローンのSP細胞の低減。B、D、F)SP細胞への色素組み込みも強制するベラパミルの添加。Daoy細胞は、5.2%の割合のSP細胞を示したのに対し、miR-199b-5pを過剰発現する安定な199bSC1および199bMC1クローンは、有意なレベルのSP細胞を示さない(それぞれ、0.2%、0.4%)。
【図１２】in-vivo研究のための、miR-199b-5pを過剰発現する生物発光Daoy細胞の作製。 空のベクターを有するDaoy安定クローン(Ctl)およびmiR-199b-5pを過剰発現するDaoy安定クローン(199b)を、ルシフェラーゼ発現ベクター(Luc)とともにトランスフェクトし、それぞれ、Ctl-Luc番号4クローンおよび199bLuc-1および199b-Luc-3クローンを作製した。これらを、すべて、酵素基質、ルシフェリンとともにインキュベートされた場合のその生物発光の発現について評価した。A)マイクロプレート中の示された細胞の段階希釈の光発光。生物発光シグナルは、IVIS200 Imaging System(Xenogen Corp. Alameda, CA)によって得た。B)細胞数と光子放出間の相関。in-vivo研究に使用された199b-Luc1およびCtl-Luc番号4クローン、データは2回の独立した実験から得た平均±SDとして示された。C)空のベクターを保持するルシフェラーゼクローンに対する、ルシフェラーゼクローン中のmiR-199b-5pの発現の代表的なデータ。D)空のベクタークローンと比較した、199b-LucクローンにおけるHES1の発現の低下を示す代表的なイムノブロット分析。E、F)マウス番号4に由来する異種移植片のヘマトキシリンおよびエオシン染色:対照を注射されたサイドは、異種移植片浸潤性筋肉組織を示すのに対し、199bを注射されたサイドは示さない。G、H)ネスチンは、神経芽細胞のマーカーであり、その発現は、より少なく分化した状態と相関する:マウス番号4 199b-を注射したサイドから得た異種移植片は、ネスチン陽性の低下を示す。ネスチン染色を、ポリクローナル抗体(Abeam)を用いる免疫組織化学によって実施した。倍率、100X。I)マウス番号5に由来する腫瘍外殖片中の導入遺伝子miR-199b-5pの代表的な遺伝子発現レベル。miR-199b-5pの過剰発現は失われた。L、M、N)AdV5-MockおよびAdV5-199bマウスの小脳から得た異種移植片の抗HES1、抗KI67、抗Gabraθ、抗ネスチン、抗Math3抗体およびヘマトキシリン染色を用いた免疫組織化学。AdV5-Mock小脳腫瘍組織において、Hes1、Ki67、ネスチンおよびMath3タンパク質の有意な発現が見られるが、小脳中のAdV5-199b腫瘍細胞では、極めて低いHes1、Ki67ネスチンおよびMath3発現が見られる。Gabra6の発現の相違は、AdV5-Mock小脳腫瘍組織およびAdV5-199bマウス間でほとんど観察されない。左:倍率、25X;右:倍率、100X。
【図１３】DAPT処理の際の内因性miR199bの過剰発現は、Daoy細胞株中の胚幹細胞および癌幹細胞に関与する遺伝子のダウンレギュレーションを誘導する。 A)補給した培地を用い、4時間毎に置換した、Daoy細胞株のDAPT処理の経時的推移実験の代表的なデータ(6時間、12時間、24時間)、時間0に対するmiR199bの発現の倍数を、定量的リアルタイム検出を使用して求めた。B)Daoy細胞株におけるDAPTの誘導の12時間後のHES1ダウンレギュレーションを示す代表的なウエスタンブロット。C)12時間のDAPTを用いる処理を施さない、および施したDaoy細胞株におけるCD133、c-Myc Oct4、KFL5、Nanog、TCF7L1、HMGA1、HMGB3、ZIC1、MYBL2、TEAD4、ILF3の相対的遺伝子発現レベル。D)12時間のDAPTを用いる処理を施さない、および施したDaoy細胞株におけるPDGFR-A、PDGFR-BおよびSPARCの相対的遺伝子発現。リアルタイムcDNA定量的検出を使用する相対的発現の、使用したプライマーおよびそのDDct値が補足表S3に列挙されている。
【図１４】Mir-199-b-5pは、マウス小脳へ注入されたDaoy細胞の生着能力を干渉する。 A)安定なクローン分析によってmiR-199bを過剰発現するDaoy Luc1細胞株を用いて異種移植された199b-Luc1マウスのIVIS 3Dを使用するIn-vivo生物発光分析(マウス番号3参照のこと;図4F、本文中のさらなるデータを参照のこと)。マウスを、週に1回、合計8週間スキャンした。B)ADV5-199bに感染した細胞を保持するマウスから得たBLI測定値(光子/sec/cm-2)は、8週に向かって低下を示す。C)被験体の局所分布を作製するために560nmおよび660nmでIVIS Spectrumによってとられた画像。3D軸(x、y、z)で示されるClt-Luc-4 AdV5-Mock異種移植マウス、Living Imagesソフトウェアを使用して、腫瘍量の拡張が、3D再構成での3D骨格および臓器のディスプレイを可能にするデジタルマウスアトラスと比較して示される。D)上記のように、分析は、Ctl-luc AdV5 199b異種移植マウスで行われている。3D画像のビデオは、別個のファイルとして添付されている。
【図１５】配列番号1を有する、アデノウイルスベクターAdV5-CMV-Kpnl-NotlpA 6217bpのマップ。
【図１６】ベクターAdV5-CMV-Kpnl-NotlpA 6217bp(配列番号2)の配列。
【図１７】A)対照SNALP(Daoy SNALP CTR)を用いる、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(Daoy SNALP 199b)処理後0、24、48および72時間でのヒトMB細胞株Daoyの増殖アッセイ(MTS);B)対照SNALPを用いる(Daoy SNALP CTR)、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(Daoy SNALP 199b)処理後72時間でのヒトMB細胞株DaoyにおけるリアルタイムPCRによるmiR 199b-5pの発現;C)対照SNALPを用いる(Daoy SNALP CTR)、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(Daoy SNALP 199b)処理後72時間でのヒトMB細胞株DaoyにおけるアネキシンVを用いるアポトーシスアッセイ;D)対照SNALPを用いる(Daoy SNALP CTR)、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(Daoy SNALP 199b)処理後72時間でのヒトMB細胞株DaoyにおけるウエスタンブロッティングによるHes1の発現。
【図１８】A)対照SNALPを用いる(HT29 SNALP CTR)、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(HT29 SNALP 199b)処理後0、24、48および72時間でのヒト結腸癌腫細胞株における増殖アッセイ(MTS);サイドに、対照SNALPを用いる(HT29 SNALP CTR)、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(HT29 SNALP 199b)処理後のHes1のウエスタンブロッティング分析。;B)対照SNALPを用いる(MDA-231T SNALP CTR)、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(MDA-231T SNALP 199b)処理後0、24、48および72時間でのヒト乳癌MDA-231Tにおける増殖アッセイ(MTS)。サイドに、対照SNALPを用いる、およびSNALP miR 199b-5pを用いる処理後のHes1のウエスタンブロッティング分析。
【図１９】A)対照SNALPを用いる(4T1 SNALP CTR)、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(4T1 SNALP 199b)処理後0、24、48および72時間でのヒト結腸癌腫細胞株における増殖アッセイ(MTS);B)対照SNALP(4T1 SNALP CTR)を用いる、およびSNALP miR 199b-5p(4T1 SNALP 199b)を用いる処理後のマウス乳癌細胞株4T1におけるリアルタイムPCRによるmiR 199b-5pの発現;C)対照SNALP(4T1 SNALP CTR)を用いる、およびSNALP miR 199b-5pを用いる(4T1 SNALP 199b)処理後72時間でのマウス乳癌細胞株4T1におけるアネキシンVを用いるアポトーシスアッセイ;D)対照SNALPを用いる、およびSNALP miR 199b-5pを用いる処理後のHes1のウエスタンブロッティング分析。
【図２０】A)ピアソン検定による、28種の乳癌組織におけるリアルタイムPCRによるmiR 199b-5p発現と遺伝子HMGA1の逆相関(p=0.046)。B)リアルタイムPCRによる28種の乳癌組織におけるmiR 199b-5pおよび遺伝子c-mycおよびCD133の発現。
【図２１】A)ピアソン検定による、15種の結腸癌腫におけるリアルタイムPCRによるmiR 199b-5p発現および遺伝子HMGA1の逆相関(p=0.08)。B)リアルタイムPCRによる15種の結腸癌腫組織におけるmiR 199b-5pおよび遺伝子c-mycおよびCD133の発現。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２５】
癌におけるmiRNA 199b-5p機能の研究
材料および方法
倫理的公開
すべての動物は、国内および国際的指針に従って処理した。倫理的承認は、「Istituzioni per Ia Cura degli Animali e comitato etico CEINGE」-Universita degli Studi di Napoli Federico II、プロトコール番号13-2007年8月1日から、およびすべての実験が法律(low)に従っていることを裏付けるMinistero della Salute Italiano, Dipartimento Sanita Pubblica Veterinaria DL 116/92によって得た。
【００２６】
フローサイトメトリー分析。
S相画分および細胞周期速度論のフローサイトメトリー分析を、CELL Questバージョン3.3ソフトウェアを使用するFACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施した。CD133研究は、Miltenyi Biotec(Auburn, CA)から得た抗体を用い、同一機器を使用して、製造業者の使用説明書に従って実施した。手短には、Fc受容体をブロックする試薬中で細胞をブロックし、抗CD133/1(AC133)-フィコエリトリン抗体(Miltenyi Biotec)とともに、4℃、暗所で10分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、PBSに再懸濁した。免疫グロブリンG(IgG)対照よりも高いレベルのCD133を発現する細胞を陽性と考えた。サイドポピュレーションの分析のために、細胞(106/mL)を、2% FBSを含有するEMEM中、37℃で90分間、Hoechst33342(5μmol/L;Sigma)とともにインキュベートした。サイドポピュレーション細胞の正しい同定を確実にするために、細胞を上記のように、50μMベラパミル(Sigma)を添加してインキュベートした。
【００２７】
安定なDaoyルシフェラーゼクローンによるin-vivoイメージング
安定な199bSC1クローンに、または対照の空のベクタークローンに、ルシフェラーゼを発現するベクター(plentiV5ベクターにクローニングされたホタルルシフェラーゼ遺伝子;Invitrogen)をトランスフェクトすることによって、安定なDaoy細胞クローンを作製した。次いで、100,000個の生存199b-Luc1およびCtl-Luc-4細胞を、1:1 PBS:マトリゲル溶液(BD Biosciences, San Jose, CA)と混合した。6週齢の雌の胸腺欠損マウスに、アベルチン(Sigma)をt-アミルアルコール(Fisher)中の3%溶液として体重10gあたり3mgの用量で使用して麻酔した。マウスに総容量0.1mLのマトリゲルPBS細胞懸濁液を用いて各側腹部にs.c.注射した。細胞を移植した後、マウスを撮像し、毎週のIVIS 3D Illumina Imaging System(Xenogen Corp. Alameda, CA)を使用する生物発光獲得(BLI)によって腫瘍増殖をモニタリングした。獲得のために、マウスをイソフルラン(isofluorane)i.p.麻酔し、体重10gあたり100μLのD-ルシフェリン(15mg/ストック1mL)を注射し、ルシフェリン注射の10分後30秒間撮像し;マウスあたり4回の獲得を行った(腹部、背部および各側腹部)。生物発光を定量化するために、Living Imagesソフトウェアパッケージ3.0(Xenogen-Caliper)を使用して注目する各領域内の光子の積分流量（毎秒あたりの光子数）を求めた。腫瘍増殖の開始からの放出データを、少なくとも6週間集め、次いで、注射日の生物発光に対して正規化した。腫瘍の大きさのカリパス測定を、長軸および短軸に沿って毎週行い、式:幅2×長さ×0.52を使用してその容積の推定を行った。
【００２８】
動物の準備およびPET/CTイメージング
イメージング研究に先立って、マウスを換気したケージ中(26℃)に1時間維持した。ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の混合物(注射容量、100μl/10g)の腹膜内投与を用いて麻酔を実施した。外側尾静脈中に3’-デオキシ-3’-[18F]フルオロチミジン([18F]FLT)、腫瘍増殖のマーカー(50μL;7.4MBq;スキャン時間、18分)を投与した1時間後に、動物PETスキャナー(GE Healthcare eXplore Vista, FWHM 1.6mm)を使用してPETを実施した。高分解能CT研究(GE Healtcare eXplore Locus;空間分解能、45μm)を、PETから24時間以内に実施した。
【００２９】
データ分析
PET研究から、最大(SUVmax)および平均(SUVmean)標準化取り込み値(SUV)を算出した(SUV=組織活性(MBq/cc)/[注射された用量(MBq)/体重(g)])。PET/CT画像を後処理し、Osirix 3.3(MAC OS 10.5 operating system)を使用して多断面再構成(MPR)、最大値投影法(MIP)、3D体積レンダリングおよび融合画像を得た。MicroView(GE eXplore Locus)を使用してさらなる3D再構成を得た。
【００３０】
SUV>50% SUVmaxであるすべての空間的に接続されたボクセルをまとめることによって、社内で開発されたソフトウェア(IDL、ITT Vis Incをベースとして)を使用してPETデータから病変容積を算出した。これらの手順を用いて規定された病変プロフィールを、AdV5-MockおよびAdV5-199b間のROIベースの比較に使用した。
【００３１】
図5(本文)に示された結果は、おそらくは、PETでの対応するFLT取り込みを伴う、頭蓋内で起こっている高レベルの腫瘍形成および高レベルの軟骨-骨変性による移植部位での広い頭蓋欠損のレベルで腫瘍量を示した。このPET-CT分析において、本発明者らは、過剰発現する細胞miR-199b-5p(AdV5-199p番号5)を用いて異種移植されたマウスと比較して、対照マウス(AdV5-Mock番号7)の小脳における拡大した腫瘍の発達の存在を確認した。
【００３２】
標準細胞培養。
ヒトDaoyおよびD283-MED MB細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)から入手し、10%ウシ胎児血清(FBS)、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio Pero, Milan, Italy)を補給したイーグル最小必須培地(EMEM;Sigma)で維持した。HEK-293およびSH-5YSY細胞は、10% FBS、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシンを補給した「ダルベッコ改変イーグル培地」(DMEM;Sigma)で維持した。
【００３３】
Daoy細胞のトランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼ-3’UTRが融合している構築物の抑制に対するmiR-199b-5pの活性を調べるために、2-OM(400nM)の不在下または存在下で、pGL3基本ベクターと一緒にPolyfect試薬(Qiagen)を使用して、pREYZO-miR-199b-5p構築物およびpRL-CMV-3’UTR標的構築物を10:1の比で、HEK293細胞に同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を二重ルシフェラーゼリポーターアッセイシステム(Promega, Madison, Wl)を使用して分析した。
【００３４】
AZA処理
5種のMB細胞株(d283、Daoy、med8a、ons76、uw228)を10% FBSおよび抗生物質を補給したDMEMで増殖させた。85%コンフルエンスに達すると、培地に5-アザ-デオキシシチジン(AZA)(Sigma)を5μMの最終濃度に添加した。72時間にわたって、培地を新鮮AZA増強培地で毎日置換した。RNAを標準フェノール(TRIzol)-クロロホルムプロトコールを使用して抽出した。
【００３５】
ベクタークローニング
Pre-miR-199bを、EcoRI-XhoI制限部位を使用してpcDNA3改変ベクター(pREYZO)(D’angeloら、2004年)にクローニングした。HES1およびGSK-3β標的結合部位(3’UTR)を、XbaI部位で、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ(RL)のコーディング領域の下流のpRL-サイトメガロウイルス(CMV)ベクター(Promega, Madison, Wl)の3’UTRにタンデムにクローニングした。HES1 3’UTR(199b結合部位を含む)を、以下のプライマー:AAAATCTAGACAGTTCGAAGACATAAAAGCCとしてHES1_3’UTRおよびAAAATCTAGAAACGCAGTGTCACCTTCCとしてHES1_3’UTRを用いてゲノムDNAから増幅し、Xbal部位で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流のTKベクター(Promega, Madison, Wl)にクローニングした。HES1全長cDNAを、Daoy cDNAから標準RT-PCRアプローチを用いて得た。
【００３６】
位置指定突然変異誘発
HES1 3’UTR中のmiR-199b-5p結合部位の位置指定突然変異誘発を、QuikChange位置指定突然変異誘発キット(Stratagene, La JoIIa, CA)の製造業者のプロトコールに従って作製した。突然変異誘発に以下のプライマーを使用した(センス配列のみが示されており、コンセンサス配列内の突然変異したヌクレオチドに下線が引かれている):HES1 3’UTRセンスAACAGGAACTTGAATATTTGTAGAGAAGAGGACTTT
【００３７】
TaqMan miRNAアッセイ
リバーストランスクリプターゼ反応
リバーストランスクリプターゼ(RT)反応には、40ng RNAサンプル、50nMステム-ループRTプライマー、1×RTバッファー(P/N:4319981 , Applied Biosystems)、0.25mM 各dNTP、3.33U/ml MultiScribe RT(P/N: 4319983, Applied Biosystems)および0.25U/ml RNアーゼ阻害剤(P/N: N8080119; Applied Biosystems)を含めた。15μlの反応物を、Applied Biosystems 9700 Thermocycler中、16℃で30分間、42℃で30分間、85℃で5分間インキュベートし、次いで、4℃で維持した。
【００３８】
リアルタイムPCR
リアルタイムPCRは、Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection Systemで標準TaqMan PCRキットプロトコールを使用して実施した。20μlのPCRミックスは、2μlのRT生成物、10μl TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)、0.2mM TaqManプローブを含んでいた。反応物を、96ウェルプレート中、95℃で10分間、続いて、95℃で15秒間および60℃で1分間の60サイクルでインキュベートした。
【００３９】
RNA単離、cDNA調製およびリアルタイム定量的PCR
全RNAを、Trizol試薬(Invitrogen)を使用して細胞株から抽出した。全RNA(4μg)からのcDNAの合成をSuper Script Il First Strandキット(Invitrogen)を使用して実施した。リアルタイム定量的PCRを、Applied Biosystems ABI PRISM 7900HT Seuence Detection systemを用い、標準プロトコールを使用して実施した。miR-199b-5p前駆体の相対的遺伝子発現を算出するために、各pre-miRNAの相対量を、U6 miRNAに対して正規化し;その他の遺伝子はβ-アクチン遺伝子を使用して正規化した。各遺伝子のリアルタイムPCRプライマーは、Primer Expressソフトウェアバージョン2.0(Applied Biosystems)を使用して設計した。プライマー配列は、要求に応じて入手可能である。
【００４０】
2^-DCt値を有する癌幹細胞生物学に関与する遺伝子の分析のための、Unigene IDおよびプライマーの配列(sequenze)が、table 1(表1)に示されている。
【００４１】
【表１】

【００４２】
ウエスタンブロッティング
30μgの細胞質または核溶解物を12%ポリアクリルアミドゲルにロードし、ポリビニリデンジフルオリドメンブラン(PVDF; BioRad, Milan, Italy)にブロットした。次いで、メンブランを抗HES1(Dr.Tetsuo Sudo TORAY Industries, Tebiro Kamakura, Japanの親切な贈り物)、ポリクローナルウサギ抗体(1:500)、抗GSK3-β(B&D Bioscience)モノクローナル抗体(1:2500)、抗c-Mycポリクローナルウサギ抗体(1:200)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)、抗GABRA6抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)(1:200)、抗MATH3抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)(1:200)および抗サイクリンD1(1:200)ポリクローナルウサギ抗体(細胞シグナル伝達)とともにインキュベートした。抗β-アクチン抗体(1:1.000)(Sigma)を細胞質溶解物の同等のローディングのための対照として、核溶解物の同等のローディングのためにポリクローナル抗β-ラミニン抗体(1:50)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)を使用した。
【００４３】
軟寒天アッセイ
Daoy細胞および安定な199bクローンを、2% FBSを補給し、0.3%アガロースを含有する1ml EMEMに播種した。培養物を2週間維持し、2% FBSを補給したEMEMを用いて週に2回再び注いだ。Leica(Nussloch, Germany)DC500化合物顕微鏡下で、直径が100μmを超えるコロニーをカウントした
【００４４】
増殖アッセイMTS
細胞増殖をCellTiter96 AQueous非放射性細胞増殖アッセイキット(Promega Madison, Wl)を使用して調べた。細胞を、FBSを含むか含まないEMEM中、1×10³個細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。0、24、48および72時間後、各ウェルにMTS([3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム])およびPMS(フェナジンメトスルファート)を加え、4時間後に各ウェルの吸光度をMultilabel counter Victor³(Perkin Elmer)を使用して490nm(OD₄₉₀)で測定した。各条件は5ウェルを用いて実施し、各実験は2回反復した。
【００４５】
免疫組織化学
脱マスキングを、10mMクエン酸バッファー、pH6中、97℃で45分間実施した。ブロッキングを、Backgroud Reducing Components(Dako Cytomation)とともに抗体希釈液を用いて、室温で30分間実施し;ポリクローナル抗HES1(1:1000)、抗ネスチン(1:1000)、抗GABRA6(1:100)、抗MATH3(1:100)抗体を4℃で一晩使用した。室温で、キットLSAB DAKOを15分間使用して(ビオチン)、およびキットLSAB DAKOを15分間使用して(ストレプトアビジン(Streptavidina)シグナルが示された。
【００４６】
DABは、DakoCytomation製であり、スライドをマウントし、Leica(Nussloch, Germany)DC500化合物顕微鏡下で調べた。
【００４７】
ロックド核酸in-situハイブリダイゼーション
マウス胎生期脳またはヒト多組織アレイから得た乾燥したスライドを、4%パラホルムアルデヒド中、室温で10分間固定し、1×PBS中、室温で3分間、2回洗浄した。洗浄ステップの際に、0.01%トリエタノールアミンおよびジエチレンピロカルボナート(DEPC)水中0.0025mM無水酢酸を含有するアセチル化溶液を新しく調製した。次いで、スライドをアセチル化溶液のビーカー中に入れ、穏やかに10分間撹拌した。次いで、スライドを、DEPC処理水中5μg/m1のプロテイナーゼK処理に付し、続いて、1×PBS中、室温で3分間、3回洗浄し、ハイブリダイゼーション溶液を用いて室温で6時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、150μlの変性(denaturizing)ハイブリダイゼーションを含み、1pMのロックド核酸DIG標識プローブ(Exiqon, miRCURY)を含んでいた。ハイブリダイゼーションを、60℃で一晩実施した。スライドを、予温した60℃の5×SSC中に浸漬し、カバースリップを注意深く除去し;次いで、スライドを0.2×SSC中、60℃で1時間インキュベートし、次いで、0.1M Tris、pH7.5、0.15M NaCl中、室温で10分間インキュベートした。過剰な溶液を除去し、スライドを加湿チャンバーに入れ;室温で1時間のインキュベーションの間、500μlのブロッキング溶液(0.1M Tris、pH7.5、0.15M NaCl中、1% FCS)をスライド上に置いた。抗DIG-アルカリホスファターゼ抗体を、ブロッキング溶液で1:2,000希釈し、4℃で一晩インキュベートした。スライドを、0.1M Tris、pH7.5、0.15M NaClで3回洗浄し、次いで、0.1M Tris、pH9.5、0.1M NaCl、50mM MgCl中で平衡化した。スライドをBCIP/NTB(Sigma)を用いて染色し、脱水し、マウントし、Leica(Nussloch, Germany)DC500化合物顕微鏡下で画像を獲得した。
【００４８】
Daoy細胞株のDAPT処理
ヒトDaoy細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)から入手し、10%ウシ胎児血清(FBS)(Celbio Pero, Milan, Italy)、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio Pero, Milan, Italy)を補給したEMEM(Sigma Aldrich, Milan, Italy)で維持した。HEK-293およびSH-5YSY細胞は、10% FBS(Celbio)、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio)を補給したDMEM(Sigma)で維持した。
【００４９】
Daoy細胞のN-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-l-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル(DAPT(Sigma-Aldrich)処理を、以下のように実施した:細胞をプレーティングし、10% FBSを含有する培地で一晩増殖させた。翌朝、培地を10μM DAPTを含有する培地と交換し、この培地を用いて4時間毎に交換した。miR199bの処理の0、6、12、24時間後に、対応する容量のDMSOをビヒクルとして含む対照実験を使用して発現アッセイを実施した。
【００５０】
In-vitro細胞運動性アッセイ
対照DAOY細胞株および安定なDAOY-199bSC1クローンを、「細胞運動性」アッセイに使用した。細胞遊走アッセイは、8μmのポアサイズのTranswells(Costar)を用いて実施した。細胞をトリプシン処理によって懸濁し、洗浄し、0.1% BSA(5×10⁴個細胞)を含有する100μlの血清を含まないDMEMに再懸濁し、Transwellsの上側のチャンバー中に入れた。下側チャンバーは、600μlの、化学誘引物質(chemo-attractor)として0.5% FBSを補給した血清を含まないDMEMで満たした。細胞を37℃で1時間遊走させた。ポリカーボネートメンブレンの下側に遊走した細胞を、2.5%グルタルアルデヒドを用いて固定し、ヘマトキシリン溶液(Sigma)を用いて染色した。細胞をカウントし、分析は各条件に対して3個のTranswellsで実施し、各実験は2回反復した。
【００５１】
患者サンプル
3つの異なるセンターから、合計61のMBの症例を集めた:12の外科MB標本はDepartment of Neurosurgery, Santobono Hospital, Naples, Italyから得;18は、Institute Curie, Paris, Franceから得;31は、Hospital for Sick Children, Toronto, Canadaから得た。患者の特徴はTable 2(表2)に示されている。インフォームドコンセントは、腫瘍サンプルの分析の前に得た。試料のすべては、放射線療法または化学療法の前の診断の時点で得、29は、WHO判定基準[14]に従って病理組織学的再調査に付し、すべての患者についてM状態の情報が入手可能であった。対照ヒト組織は、University of Maryland, Baltimore, MarylandのNICHD Brain and Tissue Bank for Developmental Disordersから入手した。全RNAは、細胞株について上記で記載されたようにTrizol試薬(Invitrogen)を使用して抽出し、TaqManマイクロRNAアッセイによってmiR-199b-5p発現レベルについて分析した。miR-199b-5p発現レベルは、中央値に従って2群(低および高)に分け、ピアソンカイ二乗検定を使用して転移性および非転移性群間を比較した。生存分析をログランク検定を使用してSPSSソフトウェアによって得、有意性を確認した。統計的有意性は、0.05のP値で確立された。
【００５２】
【表２Ａ】

【表２Ｂ】

【表２Ｃ】

【表２Ｄ】

【００５３】
アデノウイルス構築物
miR199b配列を、5’-Xhol、3’-Hindl IIIに向けて、その組換えおよび199bアデノウイルス構築物を提供した、ViraQuest Inc.Innovative Adenovirus Technologies and Reagentから供給されたVQ Ad5CMV K-NpAシャトルベクターにクローニングした(ベクター配列配列番号2を示した図16および配列番号1の配列を含むベクターを示した図15参照のこと)。それらはまた、VQ Ad5CMVeGFPプラスミドから作製された対照骨格E3ルシフェラーゼウイルスを提供した。
【００５４】
アデノウイルス感染
組換えウイルスでの感染は、500μlの完全細胞培養培地中で、1時間、細胞をアデノウイルスに曝露することと、それに続いて、その他の培地を添加することによって達成した。本発明者らは、トランスフェクション効率を決定する場合に対照としてアデノウイルス(AdV MOCKおよびAdV 199b)によるGFP発現を使用した。
【００５５】
SCIDマウスの小脳の右側脳室への異種移植(Heterotransplantion)
小脳内異種移植モデルを確立するために、6〜8週齢SCIDマウスに、トリブロムエタノール(アベルチン(登録商標))(50mg/kg)を用いて麻酔し;この後、小さい皮膚切開(1mm)を行い、顕微手術用ドリル(Fine Science Tools, Foster City, CA)を用いて頭蓋穿孔(直径0.7mm)を作製した。アデノウイルスmock、アデノウイル199bが感染したDaoy Luc細胞および199b LUC1安定クローン(10⁵)を5μlのPBSに懸濁し、頭蓋表面に対して垂直に挿入された10-AL、26ゲージHamilton Gastight1701シリンジニードルを使用して、頭蓋穿孔を通って右側小脳半球中にゆっくりと注入した(ブレグマ前後5.5mmからの定位座標;右外側2.1mm;背腹側5.0mm)。動物を、生物発光によって毎週モニタリングし、腫瘍増殖を8週間評価した。
【００５６】
3D獲得
IVISスペクトル:このシステムは、写真の画像および構築された光画像ならびに異なる波長(560〜660nm)での2種以上の生物発光画像を獲得し、被験体の表面トポグラフィー(メッシュ)を作製する。本発明者らは、特定のユーザーが変更可能なDLITアルゴリズムパラメータ(例えば、分析波長、供給源スペクトルおよび組織特性)を改変することによって、被験体中の発光供給源の位置、幾何学および強度を再構成できる。Living Image(登録商標)ソフトウェアは、3D再構築での3D骨格および臓器のディスプレイを可能にするデジタルマウスアトラスを提供する。
【００５７】
動物PETおよびSPECT-CT
次いで、マウスに2.5%のイソフルランを用いて麻酔し、イメージング手順のすべてを通じて1%イソフルラン麻酔下で維持した。[¹⁸F]FDGおよび[¹⁸F]フッ化物PETイメージングを使用して、腫瘍細胞誘導性代謝および骨格変化をそれぞれ調べた。画像は、Explorer-Vista小動物PET-CTシステム(GE Healthcare)を使用して3ベッドポジション(ベッドポジションあたり10分、合計30分間)および1.2mmの距離分解能で獲得した。
【００５８】
結果
Hsa-miR-199b-5pは、3’UTR結合によってHES1発現を発現停止させる。
本発明者らのmirBase標的データベースのコンピュータによる解析は[27]、HES1、MB細胞増殖の調節における基本的な機序であるノッチ経路のエフェクターをターゲッティングする可能性のあるmiRNAの同定に向けられた。miR-199b-5pおよびmiR-199a-5pは、良好なスコアのmiRNAであり、ヒトbHLH HES1の3’UTRと結合すると予測された。本発明者らは、miR-199a-5pと比較した、一時的な過剰発現下でHES1発現を低下させるその能力のためにmiR-199b-5pに焦点を合わせた(図9A、B)。MiR-199b-5pは、肺腫瘍では失われており[28]、膀胱癌において欠失されるゲノム領域にマッピングされている[29]。MiR-199a^*(miR-199a-5pとしても知られ、miR-199b-5pと同一配列を有する)もまた、肝細胞癌において低減する[30〜32]。2種のMB細胞株、ヒト成人組織およびマウス小脳におけるmiR-199b-5p発現の分析が、図9C、Dおよび10A、Bに示されている。
【００５９】
HES1がmiR-199b-5pの標的であるかどうかを調べるために、HES1 3’UTRをルシフェラーゼリポーター遺伝子ベクターの下流にクローニングし;pre-miR-199b-5pもまた、哺乳類発現ベクターにクローニングした。次いで、HEK-293細胞をトランスフェクトし、相対ルシフェラーゼ活性が、miR-199b-5p同時トランスフェクションがリポーター遺伝子活性を低下させたことを示し、ひいては、3’UTRとの結合およびルシフェラーゼmRNAの増殖性翻訳の不安定化を示す(図9、9E)。対照として、miR-199b-5p結合部位中で突然変異されたHES1 3’UTRは、miR-199b-5pによって影響を受けず(図9、9E)、成熟miR-199b-5pに対して相補的である2-O’-メチルオリゴリボヌクレオチド(2-OM)を同時トランスフェクトした場合には、miR-199b-5pトランスフェクションの効果を相殺し、リポーター活性を回復させた(図9、9E)。Daoy MB細胞において同様の結果が得られた(図9図9F)。
【００６０】
MB細胞生物学におけるmiR-199b-5pの役割を調べるために、miR-199b-5p発現構築物をDaoy細胞にトランスフェクトし、miR-199b-5pを過剰発現するいくつかの安定なクローンを選択した。過剰発現は、リアルタイムPCRによって確認した(図9、9G)。3種のクローンが、HES1タンパク質レベルの低下を示し、そのうち1種(199bSC1)は、検出可能なHES1を全く示さなかった。199bSC1および199bMC1クローンを、さらなる研究のために選択した(図9、9H)。HES1タンパク質発現に対するmiR-199b-5pのこれらの効果は、miR-199b-5pの発現構築物を用いて一時的にトランスフェクトされたD283MED細胞が、HES1レベルの低下を示したので(図9、9B)、安定なクローンまたはDaoy細胞に限定されなかった。
【００６１】
これらの知見を強化するために199bSC1クローンをmiR-199b-5pに対する2-OMアンチセンスとともにトランスフェクトし、陰性対照として使用した(図9、9I)。これでは、HES1レベルは回復し、このことは、miR-199b-5pによるHES1抑制の2-OM阻止を示唆し、miR-199b-5pがHES1を直接的に標的とするというさらなる確認を提供する。miR-199b-5pのその他の可能性ある標的も、この方法で調べた(図9、図1OC、D)。
【００６２】
miR-199b-5pの過剰発現は、細胞増殖を低減し、MB細胞株のクローン形成能を損なう。
199bSC1および199bMC1クローンは、対照クローンと比較した場合に標準培養条件下で増殖速度を低減させた。したがって、本発明者らは、これらのクローンにおける細胞周期変化の可能性を期待した。199bSC1クローンでのFACS分析は、空のベクタークローンと比較して、S相画分の31%減少およびG0〜G1の細胞の15%の増大を示した(図1A)。これは、細胞周期からの脱出が、Daoy細胞199bSC1クローンの増殖速度の低下において役割を有することを示唆した。対照的に、199bMC1クローンは、その細胞周期において有意な変化を示さなかった。本発明者らは、これらの知見は、HES1タンパク質レベルを低下させる199bMC1の全体的な低い効率によると考えている。199bSC1および199bMC1クローンを、空のベクタークローンおよびmiR-199b-5pに対して設計された2-OMの一時的な形質転換体と比較するin-vitro増殖アッセイによって評価されるように、これらの細胞周期表現型は、in vitroで増殖速度の低下に変換した(図1B)。199bMC1および1999SC1両クローンは、著しく低下した増殖速度を示した。このアンチセンス2-OMのトランスフェクションは、HES1の発現レベルの回復と一致して、安定な199bSC1クローンの著しい増大を誘発した。Daoy細胞増殖に関するこれらの結果はまた、D283およびONS76細胞を用いても確認された(図10F)。miR-199b特異的2-OMの効果はまた、野生型Daoy細胞において確認され、これでは、それは、内因性miR-199bに対して作用する可能性がある(図10G)。
【００６３】
miR-199b-5pの誘導の効果は、リアルタイムアプローチによって増殖および分化の分子マーカーで評価した。図1Cに示されるように、成熟ニューロンにおいてほとんど発現されるMAP2[33]が、安定な199bSC1および199bMC1クローンにおいてアップレギュレートされた。同様に、Daoy細胞は、フェニルブチレートを用いる分化後にGFAPを発現すると報告されており[34]、安定な199bSC1クローンでは、GFAPレベルは増大した。全体的に、miR-199b-5pを過剰発現する本発明者らの安定な細胞株では、遺伝子発現の像は、Hes1-/-マウスの脳において見られた表現型と一致する[23]。その他の遺伝子の中でも、GABRA6、小脳顆粒細胞分化のマーカーもまた、安定なクローンにおいて有意に過剰発現された(図1C)。
【００６４】
正および負のbHLH転写因子の微調整されたカスケードは、神経発生の中核をなし、MASH1、MATH3およびNGN2などの遺伝子は、神経発生を誘導し、HES1変異体マウスは、これらのアクチベーター型bHLHのアップレギュレーションを示す[35]。両miR-199b-5p安定クローンは、前神経bHLHの発現の増大を示した。その増殖速度の低下と一致して、増殖マーカーc-MycおよびサイクリンD1は低減した。分析された2種のクローンのうち、199bSCは、より一致した表現型を示し;本発明者らは、これらの結果を、このクローンにおける、より効率的なHES1サイレンシングによって説明する。
【００６５】
miR-199b-5p安定199bSC1クローンは、より強い、より一致した表現型を示したので、本発明者らは、次いで、標準クローン形成アッセイにおいてそれを調べ、足場非依存性増殖がmiR-199b-5pによって影響を受けるかどうかを調べた。これでは、空のベクタークローンと比較してコロニー形成能の80%低下があった(図1D)。増殖速度のこの低下と一致して、増殖マーカーc-MycおよびサイクリンD1は低減した(図1E)。本発明者らは、GABRA6およびMATH3が、199bSC1クローンにおいてアップレギュレートされることをタンパク質レベルでも確認した(図1F);後者は、HES1によって直接抑制されるとわかっている[35]。
【００６６】
MiR-199b-5pは、Daoy細胞株においてサイドポピュレーションコンパートメントを枯渇させ、MB腫瘍幹細胞ポピュレーションを負に調節する。
ノッチ経路は、前駆体幹細胞マーカーを有するMB腫瘍細胞の画分と関連しており[36]、HES1は、多能性前駆体細胞の自己再生において役割を有する[23]。腫瘍細胞のこのサイドポピュレーション(SP)は、動物モデルにおける腫瘍の生着において役割を有する[37]。したがって、本発明者らは、Hoechst 33342色素を排除する腫瘍細胞のポピュレーションに対するmiR-199b-5pの影響を調べた、これらのSP細胞を同定するための戦略。これは、Daoy細胞株におけるフローサイトメトリーによって決定され、ベラパミル処理された細胞(陰性対照)と比較されるように、これらのうちSPは、細胞の最大4.9%を占める(図11A、B)。このベラパミル処理は、Hoechst 33342色素排除を担うイオンポンプのベラパミル阻害に基づいおり、したがって、SP細胞を見られようにする[38]。199bSC1および199bMC1細胞の染色は、Hoechst処理サンプルとHoechstおよびベラパミルサンプル間で相違がないに近かったのでSPが除去されたことを示した(図11C〜F)。
【００６７】
中枢神経系腫瘍幹細胞はCD133抗原を発現することおよびこれらの細胞が、NOD-SCIDマウスにおいて独特に腫瘍形成できることもわかっている[18、39]。さらに、ノッチ経路は、自己再生プロセスにおいて中心的な役割を有し、その阻害は、前駆体様細胞のアポトーシスの誘導によってCD133陽性(CD133+)Daoy細胞の枯渇につながる[36]。最近、CD133+Daoy細胞は、ヌードマウスの側腹部において腫瘍増殖を促進するのに対し、CD133-細胞はそうしないことが示された[40]。これらの理由のために、本発明者らは、Daoy細胞のCD133陽性を、安定な199bSC1および199bMC1クローンと比較して評価した(図2)。これでは、野生型細胞は、14.8% CD133+であったのに対し、安定な199bSC1および199bMC1クローンでは、これは、2.4%および6.5%CD133+にそれぞれ低下した(図2C〜F)。したがって、これは腫瘍開始細胞のこの画分の負の調節におけるmiR-199b-5pの役割を示した。
【００６８】
HES1過剰発現は、miR-199b-5pクローン表現型をレスキューする。
本発明者らは、細胞表現型が、HES1のダウンレギュレーションと直接的に相関していることを確認するために、in-vitro細胞レスキュー実験を実施した。本発明者らは、安定な199bSC1クローンによって示される、より一致した表現型をレスキューするよう選択した。全長HES1 cDNAが、安定なDaoy細胞199bSC1クローンにクローニングされ、トランスフェクトされると、イムノブロット法によって評価されるように(図3A)HES1発現を回復させた。本発明者らはまた、安定な199bSC1クローンにおいてダウンレギュレートされたサイクリンD1の再発現に留意した。回復されたHES1発現はまた、細胞増殖に対するmiR-199b-5pの効果を逆転させた(図3B)。同時に、199bSC1クローンへのHES1 cDNAのトランスフェクションは、前神経bHLHおよび分化マーカーの誘導を低減させ、増殖遺伝子のレベルを増大した(図3C)。さらに、安定な199bSC1クローンへのHES1 cDNAの一時的トランスフェクションは、S相の細胞のパーセンテージの増大およびG0〜G1相に対する遮断の除去につながった(図3D)。これは、miR-199b-5pを過剰発現する安定な199bSC1クローンにおいて見られる効果と反対であった(図1Cおよび図3C参照のこと)。安定な199bSC1クローンのSPに対するHES1の発現の回復の効果も評価した。HES1をトランスフェクトされた細胞(GFP陽性)が、Hoechst色素を排除するその能力について評価された場合には、それらは、SPにおいて、最大1.3%の最小の増大しか示さなかった。安定な199bクローンについて測定されたものよりも高かったが(図3E〜H)、これは依然として、野生型細胞のSP細胞のレベルを下回る(図11)。これはおそらくは、一時的トランスフェクション後のHES1の再発現の短い時間のためであり、これは、完全な表現型レスキューを可能にするのに十分ではない可能性がある。次いで、本発明者らは、CD133コンパートメントに対する効果をレスキューしようとしたが、199bSC1クローンにおけるHES1の一時的トランスフェクションは、CD133+細胞の有意な増大はもたらさなかった。本発明者らは、これは、Daoy細胞階層の再組織化を可能にしない短い一時的トランスフェクション時間によると考えている。
【００６９】
腫瘍増殖は、安定な199SC1クローンに由来する異種移植片において低減される。
ここで、この知見は、miR-199b-5pが腫瘍形成の可能性ある阻害剤であることを示した。したがって、本発明者らは、in-vivo腫瘍モデルにおけるmiR-199b-5pの役割を調べるために、ルシフェラーゼcDNAを保持する発現ベクターを用いて199bSC1および対照Daoyクローンを安定化した。得られたクローンを、ルシフェラーゼ発現レベルについて試験し、またHES1およびmiR-199b-5p発現の両方の点で親の表現型の維持について確認した(図12A〜D参照のこと)。次いで、これらの安定な199b-Luc1およびCtl-Luc-4 Daoyクローンをそれぞれ、5匹の胸腺欠損ヌード/ヌードマウスの左および右側腹部に注射した。腫瘍増殖を毎週の注射されたマウスのin-vivo生物発光イメージング(BLI)によって評価した。8週間で、すべてのマウスが各対照側腹部において可視量を示したのに対し、199b-Luc1を用いて注射された3匹の側腹部しか、腫瘍生着を示さなかった。全体として、対照側腹部とmiR-199b-5p側腹部間の腫瘍体積において有意差が見られた(図4A)。生物発光測定は、対照サイド(例えば、マウス番号4、図4B)と比較して、腫瘍増殖の間のmiR-199b-5pサイドの発光において有意な低減を示した。9週間後、5匹のマウスのうち4匹が、対照サイドとmiR-199b-5p対サイド間でこれらの生物発光シグナルにおいて統計的に有意な相違を示した(図4C)。統合すると、これらのデータは、miR-199b-5pは、胸腺欠損ヌード/ヌードマウスにおいてin vivoで腫瘍形成を損なうことができることを示す。マウス番号5およびマウス番号4に由来する異種移植片腫瘍を外殖し、miR-199b-5pおよびHES1発現について分析し、病理組織学的に評価した(図12E〜H)。
【００７０】
本発明者らは、miR-199b-5pの、MB増殖を調節する能力をさらに調べるために、5週齢のヌードマウスの第4脳質に注射した(図4D、E)。生物発光イメージング(BLI)によって腫瘍増殖をin vivo非侵襲性モニタリングを4週間した後、199bSC1クローンを用いて注射されたマウスでは、腫瘍増殖は、対照(CTL)細胞を注射されたサイドにおいて観察されたものよりも一貫して低かった。本発明者らはまた、これらの効果のさらなる確認のために、miR-199bをコードするアデノウイルスに感染したCTL細胞を注射した:先の知見と一致して、これらのマウスも4週間後にBLIの低減を示した(図4F)。図4Gでは、細胞の移植から8週間後のさらなるBLI獲得が示されている。この時点で、2匹のマウスを屠殺し、組織病理学についてさらに分析した。凍結組織のヘマトキシリン-エオシン染色は、AdV5-Mock番号2およびAdV5-199b番号3を注射された動物の小脳における腫瘍量を示した。連続平行凍結組織学的切片を、アデノウイルス感染細胞によって発現された内因性緑色蛍光タンパク質(GFP)について蛍光顕微鏡によって調べた。次いで、本発明者らは、抗HES1抗体を使用する、その他のパラフィン包埋された組織の免疫組織化学染色によってHES1タンパク質発現を評価した。全体として、本発明者らは、アデノウイルス発現を保持するmiR199bによるHES1発現のダウンレギュレーションとして、感染細胞におけるアデノウイルス発現の残留性のレベルを評価し、BLI(図4G〜H参照)および抗体染色(Hes1、Ki67、Gabra6、ネスチン、Math-3)(補足図12L〜M)によって腫瘍増殖を経時的に追跡した。次いで、2匹のさらなるヌードマウス(AdV5-Mock番号7;AdV5-199b番号5)が、腫瘍増殖活性を評価するために注射後12週でPET-CT研究を受けた(図5A、B)。2本のビデオを用いる生物発光の補足獲得データは、それぞれ、AdV5-MockおよびAdV5-199bを用いて注射された2匹のマウスの3D再構成を示した(図14)。これらの分析は、AdV5-Mock番号7対照マウスと比較して、AdV5-199b番号5動物において腫瘍量の有意な低減を示し、PET-CT分析もまた腫瘍体積を提供した(それぞれ、0.024cm³対0.044cm³)。全体として、これらのデータは、この同所性異種移植片ヌードマウスモデルにおけるMB細胞の腫瘍増殖に対する負の影響としての、miR199b-5pの過剰発現の有益な効果を示す。
【００７１】
ヒト髄芽細胞腫腫瘍におけるmiR-199b-5pの発現
本発明者らは、健常なヒト小児小脳において、miR-199b-5pが効率的に発現されるかどうかを調べるために、Developmental Disorders, at the University of Maryland, USAのNICHD Brain and Tissue Bankから入手した13の対照サンプルを使用した。本発明者らは、miR-199b-5p発現を測定し、0〜1歳の小児から得た5種の小脳サンプルを、13〜16歳の小児から得た6種と比較した(図6A)。MiR-199b-5pは、より若い健常な対照から得た外殖片において、より多い発現を示した(マン-ホイットニー検定、P=0.006)。
【００７２】
miR-199b-5p発現が、ヒトMBにおいて役割を有するかどうかを調べるために、61人のMB患者のコホートから得たサンプルを分析した(試験手順参照のこと)。実際、HES1タンパク質レベルは、MB患者における負の結果と相関することがすでに示されている[24]。次いで、全患者集団(n=61)を、全中央値に対する低対高miR-199b-5p発現として2群に分割した。非転移性(MO)および転移性(M1、M2およびM3)症例間のmiR-199b-5p発現の分布は、非転移性症例におけるmiR-199b-5p発現が、転移性の症例においてよりも有意に高いことを示した(P=0.001、ピアソンカイ二乗検定;図6B)。
【００７３】
フォローアップ情報が入手可能であった患者のサブセットでは(n=45)、miR-199bを高レベルで発現した患者の生存曲線は、正の傾向を示し、低く発現する患者よりも良好な全生存を有していた。しかし、カプラン-マイヤー曲線のログランク検定は、おそらくは、長期のフォローアップを有する患者の限定された数のために有意差を示さなかった(P=0.182;図6C)。
【００７４】
転移性MBにおけるmiR-199b-5pのダウンレギュレーションを示すこれらのデータは、エピジェネティックな変化または遺伝子変化によるサイレンシングの機序を示す。したがって、本発明者らは、5-アザ-デオキシシチジンを用いる脱メチル化の誘導後に、MB細胞株のパネルにおいてリアルタイムPCRによってmiR-199b-5pの発現を試験した(図6D)。実際、2種の細胞株(Med8およびUV238)は、miR-199b-5pの有意なアップレギュレーションを示し、したがって、miR-199b-5p発現のエピジェネティック制御という仮説を支持する。腫瘍発達の際のmiR199b-5p発現のエピジェネティック不活性化による作用の、この調整された調節機序を同定するために、さらなる研究が実施される必要がある。
【００７５】
支持情報
標的予測分析によって、miR-199a-5pおよびmiR-199b-5pは、高スコア値を有するHES1をターゲッティングする可能性があるとわかった。この可能性ある結合が、生存細胞において効率的なHES1調節に変換するかどうかを調べるために、本発明者らは、両miRNAをHEK-293細胞株にトランスフェクトした(図9A、B)。本発明者らは、pre-miRNAを、発現がCMVプロモーターによって駆動される2種の構築物にクローニングした。一時的トランスフェクションの48時間後、miR-199b-5pは、実際、HES1発現をダウンレギュレートしなかった。本発明者らは、この段階で、種々の細胞種におけるHES1 3’UTRに対するmiR-199a-5pの効果も排除できた。
【００７６】
次いで、本発明者らは、リアルタイムアプローチを使用して、DaoyおよびD283MED細胞において成熟miR-199b-5pの発現レベルを評価した(試験手順参照のこと)(図9C)。MiR-199b-5pは、SH-SY5Y細胞、神経芽腫細胞株において低い発現レベルを示したが、Daoy細胞は、より多いmiR-199b-5pを発現した。同様に、Daoy細胞株とは異なり、転移性MB患者の腹水に由来するD283MED MB細胞株において2種のmiRNAの発現レベルに相違がある[1]。ここで、miR-199b-5pの発現は、Daoy細胞と比較して、10⁴倍低く、異なる腫瘍細胞種起源を反映している可能性がある[2]。miR-199a-3pとしても知られており、最近MET癌原遺伝子と関連付けられた[3]miR-199a^*の発現も評価した(示されていないデータ)。本発明者らは、pre-miR-199aの過剰発現後、Daoy細胞においてmiR-199a^*の過剰発現を見なかった。これは、おそらくは、miR-199aの生成に向かうpre-miR-199b-5pの特定のプロセシングによる(示されていないデータ)。正常ヒト組織において、MiR-199b-5p発現もまた評価し(図9D):その発現は、十二指腸およびリンパ節において高く、低い発現は、成体(全)脳および皮質において見られた。
【００７７】
種々のMB細胞株に対するmiR-199b-5pの効果を確認するために、本発明者らは、D283MED細胞を一時的にトランスフェクトし、ウエスタンブロッティングによるHES1のダウンレギュレーションを評価した。図9Gに示されるように、miR-199b-5pの過剰発現は、HES1タンパク質レベルの低下につながった。HES1タンパク質に対するこの効果は、MTSアッセイによって評価されるような細胞増殖の低減に変換する(図10F)。この場合には、本発明者らは、miR-199b-5pを用いて一時的にトランスフェクトされたD283MEDおよびONS76細胞株を比較した;両場合において、本発明者らは、モック(mock)でトランスフェクトされた細胞と比較して、増殖の低減を見た。
【００７８】
そのため、本発明者らは、miR-199b-5pが、内因性レベルで細胞増殖の制御に関与しているかどうかを問うた。これに答えるために、本発明者らは、成熟miR-199b-5p配列に対して向けられた2-O-メチル-オリゴリボヌクレオチド(199b-OM)を使用して、その内因性レベルを低下させた。Daoy細胞は、試験されたMB細胞株の中でも最高量のmiR-199b-5pを示したので、それらを199b-OMを用いてトランスフェクトした(図10G)。細胞は、対照OM(混ぜられた2-O-メチルオリゴリボヌクレオチド)を用いてトランスフェクトされたDaoy細胞の増殖速度と比較して、in vitroでより高い増殖速度を示した。
【００７９】
発達中の小脳におけるMmu-miR-199b-5p発現
本発明者らは、小脳発達の際にmir199がどのように発現されるかについての疑問に対応するために、mmu-miR-199b-5pマウス同族体を使用し、発達中のマウス小脳におけるその発現についてアッセイした。本発明者らは、ジゴキシゲニン(digoxygenin)(DIG)で標識されたロックド核酸プローブの使用のために開発された方法論を適用した。図10Aに示されるように、E14.5の胚およびPOの新生仔マウス脳を、in-situハイブリダイゼーション実験において使用した。mmu-miR-199b-5pの発現を、中枢神経系における大量のmiRNAであるとわかっている対照としてのmiR-124aのものと比較した。mmu-miR-199b-5pの発現は、miR-124aと比較して、より散在性であった。また、mmu-miR-199b-5p発現は、小脳の発達とともに低下し、miR-124aは、内顆粒細胞層(IGL)において、およびプルキンエニューロンにおいてその発現を保有した。次いで、mmu-miR-199b-5pの発現を、成熟miRNAのレベルを測定することによって、また、リアルタイムPCRを使用するその発現分析によって、マウス小脳において、種々の発達段階で評価した。データは、mmu-miR-199b-5pは、miR-124aと比較して低レベルで発現されても、mmu-miR-199b-5p発現は発達において調節され、胎生期16.5から成体に発達したマウス小脳へと低減するということを示した(図10B)。
【００８０】
その他の可能性ある標的のMiR-199b-5p調節。
miR-199b-5pの予測される標的の中には、キナーゼGSK3-β、ShhおよびWnt経路からのシグナル変換に関与するタンパク質、したがって、小脳の細胞ホメオスタシスを調節する経路における重大なキナーゼがある。この理由のために、本発明者らは、すでに得られた安定な199bSC1クローンを使用して、miR-199b-5pの、GSK3-βをダウンレギュレートする能力を評価した。このクローンは、GSK3-βタンパク質のレベルの任意の有意な低減を示さなかった(図10C)。この効果は、実際に、ピタアルゴリズムによって評価される高いΔΔGによって示唆されるように、miR-199b-5pとの結合に利用できないGSK3-βの3’UTRに従って説明できる(表3;[4]参照のこと)。本発明者らはまた、miR-199b-5pによるその可能性ある調節について試験される3種のその他の遺伝子を選択した:Nanog、NHLH2およびサイクリンL1。これらの遺伝子は、ダウンレギュレートされると、安定なmiR-199b-5pクローンにおいて見られるものと同様の表現型につながり得る。本発明者らは、これらの選択された遺伝子3’UTRに対するmiR-199b-5pのダウンレギュレート性の効果は全く検出しなかった(図10D)。より最近、miR-199a*は、MET癌原遺伝子を調節することが示された[3]。miR-199b-5pと同一の配列を共有するので、本発明者らの分析において、この癌原遺伝子のレベルを調べることは注目されるものとなり、これが将来の研究の論点となる。
【００８１】
【表３】

【００８２】
in-vivo研究のためのmiR-199b-5pを過剰発現する生物発光Daoy細胞の作製
ルシフェラーゼに基づく、in-vivoイメージングが、同所性動物モデルにおいて腫瘍細胞の生着の可能性を調べるための強力なツールとして最近現れた[5]。in-vivo腫瘍モデルにおけるmiR-199b-5pの役割を調べるために、本発明者らは、ルシフェラーゼcDNAを保持する発現ベクターを用いて199bSC1および対照Daoyクローンを安定化した。クローンをそのルシフェラーゼ発現レベルを評価するために試験した(図12A、B):これらのin-vitro実験は、細胞数と生物発光測定値の間に高い相関を示した。したがって、このルシフェラーゼ発現によって、腫瘍関連生物発光の非侵襲性イメージングおよび腫瘍増殖の定量化が可能となった。補足図12C、Dに示されるように、得られた安定なクローンを、miR-199b-5pおよびHES1発現の両方の点で、その親の表現型の維持について確認した。マウス番号4に由来する異種移植片を外殖し、処理し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用してその形態学を調べた。対照サイドで形成された腫瘍は、miR-199b-5pを注射されたサイドで形成されたものよりも、筋肉組織への前者の浸潤によって見ることができるように、より浸潤性であり、侵襲性である(図12E;黒色矢印)。ネスチンに対する抗体を用いる染色は、miR-199b-5pサイドに形成された腫瘍は、ノッチ経路ダウンレギュレーションと一致して、神経前駆細胞の特徴を有する細胞をあまり示さないことを示した(図12G、H)[6]。199b-および対照を注射されたサイドの両方で腫瘍を形成したマウス番号5に由来する外殖片は、導入遺伝子(miR-199b-5p)の発現の喪失を示し、これは、腫瘍能の回復の一因であり得る(図12I)。
【００８３】
In vivo腫瘍増殖を相殺するmiR-199b-5pの能力をさらに特性決定するために、本発明者らは、Ctl-Luc1および199b-Luc4細胞の同所性移植片を確立した。さらに、本発明者らはまた、miR-199b- 5pを発現する先に組換えアデノウイルスを感染させた野生型Daoy細胞(AdV5-199b)を注射し、in-vivoイメージング生物発光(BLI technologies)を続けた。本発明者らは、199b-Luc4-およびAdV-199b-感染細胞の両方を対照として使用し、次いで、Ctl-Luc1クローンをAdV5-mockウイルスを用いて感染させた。注射から4週間の結果が図5に示されており、4および8週間で、より多くのマウスのBLI分析が示されている(図4Gおよび14)。
【００８４】
DAPTで処理したDaoy細胞株は、miR-199bの内因性発現および胚性幹細胞様遺伝子発現サインの増大を示す。
本発明者らが、miR-199b-5pの内因性レベルを増大できるかどうかを調べるために、本発明者らは、Daoy細胞株を、プレセニリン-セクレターゼ複合体を効率的に遮断し、結果として、ノッチ反応の活性化を効率的に阻止する[7,8]N-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-l-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル(DAPT、Sigma-Aldrich)を用いて処理した。図13Aに示されるように、本発明者らは、DAPTを用いる処理の際に、12時間でmiR-199b-5pのレベルが9倍に増大することを見い出した。次いで、この活性化は、処理の24時間以内の、その発現の迅速な阻害に続いた。その後、これらのデータは、ウエスタンブロット分析を使用してHES1のレベルを確認することによって支持され(図13B)、ひいては、miR-199b-5p過剰発現に続いて、HES1タンパク質レベルの阻害が見られることを示す。これらのデータから、本発明者らがDAPT処理の際に、HES1喪失およびmiR199過剰発現が、どの程度、胚性幹(ES)および癌幹細胞に関与する遺伝子の遺伝子発現のサインに影響を及ぼし得るかを調べるよう促された。
【００８５】
1つの細菌の研究[9]に示された結果に従って、本発明者らは、豊富であり、胚性幹(ES)細胞同定、ならびに乳房、膀胱および神経膠腫を含めたいくつかの固形腫瘍の「幹細胞性」特性と関連している遺伝子の発現プロフィール(上位8種のリスト)にリアルタイム定量的検出を適用した。ここで、本発明者らは、CD133およびc-Mycなどの、幹細胞遺伝子(MBおよび神経膠芽腫)のマーカーを選択し、次いで、ES細胞同定の重要な制御因子である遺伝子:Oct4、KFL5およびNanogを選択した。本発明者らはまた、成体幹細胞/前駆体機能、ESおよび腫瘍細胞増殖および/または癌の進行と関連している遺伝子を調べた。これらの判定基準に従って、遺伝子リストにCD133、c-Myc、Oct4、KFL5、Nanog、TCF7L1、HMGA1、HMGB3、ZIC1、MYBL2、TEAD4およびILF3を含めた。補足図S5Cに示されるように、CD133およびc-Myc遺伝子の発現は、DAPTを用いて誘導されたDaoy細胞株においてダウンレギュレートされた。次いで、Daoyでは、Oct4、Nanog、KFL5、TCF7L1、HMGA1、HMGB3、ZIC1、MYBL2およびTEAD4遺伝子の発現レベルもダウンレギュレートされるとわかった。Tab S3には、miR-199b-5pのDAPT誘導性過剰発現、プライマーおよび生の2^DCt値が列挙されている。したがって、これによって、miR-199b-5pアップレギュレーションが、この現象に「直接的に」または「間接的に」関与しているとすでにわかっている選択されたマーカーによって示されるように、幹細胞ポピュレーションを調節するノッチ経路の阻害と同時であることが確認された。現時点では、miR-199b-5pの過剰発現が、ノッチ経路の阻害によってどの程度調節され得るかは決定されるべきであるままである。これらの問題は、さらなる研究の論点となる。
【００８６】
さらなる研究によって、転移性MB患者における、およびMB細胞株におけるPDGFR-A、PDGFR-BおよびSPARC遺伝子の過剰発現が示された[10,11]。本発明者らはまた、上記で示される、DAPTを用いる処理の際に内因性miR199bがアップレギュレーションされたDaoy細胞株モデルにおいてPDGFR-A、PDGFR-BおよびSPARC遺伝子の発現を分析した。図13Dに示されるように、PDGFR-BおよびSPARCの発現は、ビヒクルのみの処理と比較して、DAPTを用いて処理されたDaoy細胞株においてダウンレギュレートされ、PDGFR-Aの低いアップレギュレーションも見られた。この時点で、RAS/MAPK経路によるPDGFR-Aの発現におけるこの低い増大が、miR-199b-5pを過剰発現するMB細胞の転移性能力を駆動するのに十分であるかどうかは決定されるべきであるままであり;これは、本発明者らが腫瘍においてmiR199b-5pの発現を確認することによって得たものとは反対の効果である。これらの結果はまた、どういうわけか、誤字の枠組みにおいてであるが、文献におけるデータと矛盾しており[11]、MB転移性腫瘍において見られたPDGFR-Aの過剰発現は、GenBankおよびAffymetrixによる不正確な配列およびプローブ注釈のために誤って判断された:GenBank配列J03278は、PDGFR-Bの完全コーディング領域を含むが、遺伝子座は「PDGFRA」として示され、Affymetrixプローブ1771は「J03278 HUMPDGFRAヒト血小板由来増殖因子(PDGF)受容体mRNA」として注釈がつけられた。これらの新しく報告されたデータ¹⁰内で、PDGFR-Bは、転移性MB腫瘍においてアップレギュレートされるとわかった。これらの最新の結果は、DAPT処理の際のmiR-199b-5pの過剰発現が、PDGFR-BおよびSPARCの発現のダウンレギュレーションを誘導した、本発明者らが本発明者らのDaoy細胞株において見たものと一致している。これは、次に、転移患者におけるmiR199b-5pの発現の喪失と相関し、その転移性能力を損なう、miR-199b-5p発現の重要性およびMB癌発達におけるその関与を決定的に強化する。最後に、その主な機能を、これらの作用機序にすでに関与している遺伝子によって動かされるESおよび癌幹細胞維持を阻害することと関連付けることによって、miR-199b-5p過剰発現の役割を確認するデータが示されている。
【００８７】
極めて最近、小児MB患者から得た特異的発現パターンが、miR-199b-5pを含み、ErbB2-および/またはc-Myc-過剰発現腫瘍を用いてクラスター化した9種のmiRNAを示した[12]。特に、それらはmiR-135aおよびb、miR-10b、miR-125bおよびmiR-153の高い発現を示し、miR-199bは、これらのErB2陽性患者において低い発現を示した。注目すべきGilbertsonら[13]は、ErbB2-HER4陽性腫瘍は、小児MBにおいて独立した予後マーカーとして挙動し、特に、Erb-2は、MBにおける負の生存効果を考えると最も悪い予後マーカーであることを示した。全体として、文献から得たそれらの結果は、その発現が、MB腫瘍においてダウンレギュレートされ、これらのErb-2陽性コホートの侵襲性と関連しているmir199b-5pの重要性をさらに強化した。
【００８８】
小動物PETおよびSPECT-CT分析による高解像度分子イメージング。
動物の準備およびPET/CTイメージング
イメージング研究に先立って、マウスを換気したケージ中(26℃)に1時間維持した。ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の混合物(注射容量、100μl/10g)の腹膜内投与を用いて麻酔を実施した。外側尾静脈中に3^’-デオキシ-3’-[¹⁸F]フルオロチミジン([¹⁸F]FLT)、腫瘍増殖のマーカー(50μL;7.4MBq;スキャン時間、18分)を投与した1時間後に、動物PETスキャナー(GE Healthcare eXplore Vista, FWHM 1.6mm)を使用してPETを実施した。高分解能CT研究(GE Healtcare eXplore Locus;空間分解能、45μm)を、PETから24時間以内に実施した。
【００８９】
データ分析
PET研究から、最大(SUVmax)および平均(SUVmean)標準化取り込み値(SUV)を算出した(SUV=組織活性(MBq/cc)/[注射された用量(MBq)/体重(g)])。PET/CTイメージを後処理し、Osirix 3.3(MAC OS 10.5 operating system)を使用して多断面再構成(MPR)、最大値投影法(MIP)、3D体積レンダリングおよび融合画像を得た。MicroView(GE eXplore Locus)を使用してさらなる3D再構成を得た。
【００９０】
SUV>50% SUVmaxであるすべての空間的に接続されたボクセルをまとめることによって、社内で開発されたソフトウェア(IDL、ITT Vis Incをベースとして)を使用してPETデータから病変容積を算出した。これらの手順を用いて規定された病変プロフィールを、AdV5-MockおよびAdV5-199b間のROIベースの比較に使用した。
【００９１】
考察
MBにおいて変化しているシグナル伝達経路間の相互接続は、大部分はわかっておらず、治療に関係している死亡率および罹病率を低下させる、リスククラスに従って特定の患者の層別化を規定することは依然として困難である。本発明者らは、本研究において、miRNA miR-199b-5pによるHES1遺伝子調節の機序を同定した。HES1は、小脳顆粒細胞の、Shhを用いる処理がHES1のレベルを増大するという最近の知見によって示されるように[20]、小脳発達の重要な調節因子である。これは、HES1が、Shhおよびノッチ2シグナル伝達カスケード両方の転写標的であるということを示唆する。
【００９２】
本発明者らは、ここで、HES1 3’UTRと結合し、非増殖性翻訳につながるmiR-199b-5pによって駆動されるHES1発現の新規レベルの調節を報告する。注目すべきことに、本発明者らはまた、NHLH2、サイクリンL1およびNanogの3’UTRと融合したリポーター構築物に対するmiR-199b-5pの作用を調べた(図10D)。2つの異なるアルゴリズムを使用して得た(表3)、miR-199b-5pの予測された標的の中でも、これらの遺伝子は、miR-199b過剰発現後に得られた表現型と関連している可能性ある候補であった。それにもかかわらず、本発明者らは、HES1 3’UTRに対する効果を得た同一条件下で試験した場合にリポーター活性のダウンレギュレーションを得なかった。さらに、安定な199bSC1クローンは、対照に匹敵するGSK3-βタンパク質レベルを有する。注目すべきことに、ピタアルゴリズムに従って分析すると、GSK3-βの3’UTRとのmiR-199b-5pの結合のΔΔGの値は極めて高く、これは、3’UTRへの接近可能性に乏しいことを示す[41](表3)。最近、Met癌原遺伝子ダウンレギュレーションを介して作用することによる可能性がある、miR-199b-5pと同一配列を有するmiR-199a*が、カスパーゼ活性化に関与していることも示された[42]。miR-199bによるこの標的のダウンレギュレーションを調べることは、たとえ、それが本発明者らの細胞系においてはmiR-199b過剰発現後のアポトーシスの誘導の欠如のためであるとは考えにくくても、将来の研究のために注目されるであろう。
【００９３】
過剰発現するmiR-199b-5pクローンの分析は、miR-199b-5pは、MB細胞の増殖および生着能力を損ない得るということを示唆した。実際、過剰発現miR-199b-5pクローンにおけるサイクリンD1の喪失は、正常な小脳機能の獲得の遅延の結果として初期GNP増殖および初期運動失調を低減し、ひいては、前腫瘍性病変からMBへの進行に影響を及ぼすCcndi-/-マウスにおいて見られる同様の効果を思い出させるものである[43]。
【００９４】
本発明者らのデータはまた、Hes1について遺伝的にノックダウンされたマウス細胞から報告されたin-vivoデータと一致する。miR-199b-5pの効果は、アポトーシスの誘発によって説明され得るが、本発明者らの細胞蛍光測定法(cytofluorimetric)アッセイは、MB細胞増殖の障害は、miR-199b-5pを過剰発現する細胞の大規模なアポトーシスと関連しないことを示唆した(図1Aの細胞周期アッセイ参照のこと)。これは、アポトーシスの徴候が制限された細胞種においてしか見られなかったHes1-/-マウスから得られた神経前駆細胞について報告されたデータと一致する[22]。
【００９５】
本発明者らがmiR-199b-5pおよび腫瘍Mステージ間に示す相関は、腫瘍摘出と同時にmiR-199b-5p発現レベルを調べることができるということを示す。これは、侵襲性腫瘍を発達させ、将来の転移形成を有するはずである患者のサブセットの同定を可能にし、これは、播種性疾患が、低い生存率と関連している最も強力な独立因子であることを意味する。M状態との相関にもかかわらず、miR-199b-5pの過剰発現は、Daoy細胞の細胞運動の低減につながらなかった(図10E)。これは、Daoy細胞の極度に高い運動性によるであろうが、これは、この表現型に打ち勝つには、ノッチ経路の調節を越えるさらなるステップが行われる必要があることを示す。しかし、注目すべきことに、PDGFR-BおよびSPARCの発現(両遺伝子は、最近、転移性MBと相互に関連があった[44,45])は、本発明者らが図13Dに示し、補足材料において記載するように、miR-199b-5pの過剰発現の存在下で低減する。
【００９６】
miR-199b-5p調整を介したノッチ経路の調節に関する本発明者らのデータを踏まえると、将来の研究を、転移性MB患者におけるノッチによって調節される遺伝子の役割に絞ることが注目されるであろう。したがって、ヒト疾患を良好に再現するマウスモデルを開発することが重要な課題である。このシナリオ内で、ホモ接合Smo/Smoマウスモデルは、軟髄膜伝播を有するという知見から、MB増殖の調節におけるノッチ経路の関与が確認される[25、46]。図6およびTable 2(表2)に示されるように、本発明者らは、miR-199b-5p発現レベルにおいて大きな可変性を示し、これは、悪い結果を有する患者のサブセットにおける遺伝的染色体変化またはエピジェネティックサイレンシングによる可能性がある。MB細胞株のパネルでの本発明者らのデータ(図6D参照のこと)は、この最新の仮説を支持する。MB細胞株の一部が、漸増するmiR-199bを用いる処理に反応しない理由は、遺伝子自体の遺伝的喪失による、またはmiR-199b発現の、厳密な、細胞株の種々の起源を反映する細胞種調節による可能性がある。
【００９７】
現時点で、「癌幹細胞」に独特の特性を付与する機序の解明に関心が高まっている[47]。最近、神経膠芽腫CD133+細胞は、イオン化放射線後に、損傷を受けたDNAの修復の誘導によって良好な生存の機会を有するということが示された[48]。実際、CD133抗原を発現するDaoy細胞は、放射線耐性であり、したがって、Daoy細胞は腫瘍幹細胞コンパートメントの研究のためのモデルに相当するという仮説を支持する[49]。ここで、miR-199b-5pは、Daoy細胞、すなわち、癌幹細胞の、このサイドポピュレーションおよびCD133+ポピュレーションに影響を及ぼし得る。
【００９８】
本発明者らはまた、CD133と一緒に、最近、固形腫瘍の侵襲性と相関しているとわかったいくつかの癌幹細胞遺伝子の発現レベルを評価した;補足図S5Bにで示されるように、これらの遺伝子の発現は、N[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-l-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル(DAPT)を用いて処理されたDaoy細胞の「幹細胞性」表現型の全体的な低減と一致する。これは、ノッチ反応の活性化を阻止し(補足材料を参照のこと)、ひいては、プレセニリン-セクレターゼ複合体を遮断し、miR199b-5p発現を増強する[50、51]。今日まで、これは、miRNAの発現が、この腫瘍細胞コンパートメントを枯渇し得、脳腫瘍におけるこれらの細胞のターゲッティングのための興味深い治療アプローチを示す最初の報告である。
【００９９】
3歳を超えて提示する髄芽細胞腫を有する小児は、放射線療法から大きく恩恵を受けるが、より若い小児の治療は依然として課題であるという、公開された一連のものからの強い徴候が見られる。MBの全切除または亜全摘を行った患者間に生存率において有意差がないことは、神経障害の可能性のリスクが高い場合には、MBの全切除は避けられ得るという見解を支持する。最近の試みによって、化学療法の有益な効果が実証されたが、これは普遍的に見られてはいない[52、53]。ここで、本発明者らは、腫瘍形成性CD133+癌細胞の維持をこのように損なうための、3歳未満(およびHES1に対して陽性)のMBに冒された小児の小脳への、生体内原位置でのmiR199b-5pの使用および送達を構想する。化学療法と組み合わせて、放射線療法を廃止し、全腫瘍切除による脳損傷を避ける可能性を有し、これは、MBの現在の治療における全体的な改善を提供する。したがって、本発明者らは、カプセル化された安定な核酸脂質粒子(SNALP)の使用によってMBを治療する可能性を予見する。これらは、全身送達にとって非ヒト霊長類において有効であることおよびアゴミア(agomir) 199b-5p分子を含有するカプセル化されたナノ粒子を使用することによって血液脳関門を擦り抜けるであろうと実証されている[54]。これらの遺伝子療法アプローチがどのようにさらに進歩するかが、前臨床動物研究の将来の課題となろう。
【０１００】
本発明者らのモデルに示されるように(図6E)、本発明者らは、発癌の際のエピジェネティック調節によるであろう、MOおよびM+患者におけるmiR-199b-5pの2つの異なる発現レベルを描いている。本発明者らの「中程度に高い」モデルでは、miR-199b-5p発現の増大がHES1を抑制し、これが、次いで、前神経bHLH遺伝子発現の増大につながり、細胞を分化プロセスに向ける。「中程度に低い」モデルでは、miR-199b-5p発現は、エピジェネティック制御機序によって低下され、次いで、HES1が過剰発現され、細胞増殖およびSPの誘導、ゆえに、CD133+細胞の増大につながる。多数のその他の転写因子に関しては、HES1は、種々のシグナル変換経路間およびその間の統合点であり、その発現のバランスが、分化プログラムを開始するか否かなどの基本的な細胞決定を左右する。このシナリオで、miR-199b-5pは、HES1 bHLH転写因子の発現レベルの微調整物質として複雑なノッチシグナル形質導入経路の一部として見ることができる。これらの現象は、活性化されたノッチ経路が関与しているさまざまな組織および癌において起こると考えることができる。
【実施例２】
【０１０１】
SNALP miR199b-5pを用いる、MB、結腸癌腫および乳癌細胞株の処理の効果の評価。
材料および方法:
SNALP形成
その他の研究(71〜73)において使用されるSNALP(安定な核酸脂質粒子)技術を、mir 199b-5pおよびLipoid GMBH(Cam, Switzerland)によって提供される種々の脂質によるその関連対照スクランブル(図ではCTRと名づけられている)のためにに考案した。Carlo Erba Reagenti製の分析等級溶媒を使用した。押し出し工程では、Nucleopore Track Membrane 25mmポリカーボネートフィルターは、Whatman(Brentford,UK)製であった。透析のためのメンブラン、塩およびすべてのその他の化学物質は、Sigma-Aldrich (Milan, Italy)から購入した。
【０１０２】
SNALPは、その他の中性脂質、すなわち、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、卵ホスファチジルコリン(EPC)およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-ポリエチレングリコール2000(DSPE₂₀₀₀)と会合させた、イオン化できるアミノ脂質ジオレオイルジメチルアンモニウムプロパン(DODAP)からなる脂質ミックスによって調製した。SNALPへのmiRNAのカプセル化は、miRNAの水溶液を用いる脂質層の水和によって達成した(chieved)。得られた懸濁液をThermobarrel Extruder Systems(Northern Lipids Inc., Vancouver, BC, Canada)を使用することによって、3枚重ねた100nmポリカーボネートフィルターを10回通過させた。調製物を300mMのクエン酸バッファー、pH4.0に対して約1時間透析して、過剰のエタノールを除去し;次いで、HBS(20mM HEPES、145mM NaCl、pH7.6)に対して12〜18時間さらに透析して、クエン酸バッファーを除去し、DODAPを中和し、小泡の表面と会合している任意のmiRNAを放出した。カプセル化されていないODNを、DEAE-セファロースCL-6Bカラムクロマトグラフィーによって除去した。多量のmiRNAを小泡にカプセル化するために、実験条件、すなわち、水溶液中のmiRNAに対する濃度および種々の脂質間の割合を最適化した。調製後、SNALPを有機溶媒に可溶化し、水溶液中にmiRNAを抽出し、UV分光光度法によって定量化する。種々のSNALP製剤の粒子平均直径およびサイズ分布を、光子相関分光法(N5 Beckmann Coulter, Miami)によって調べる。SNALPゼータ電位をMS-PALS技術(Zetasizer Nano, Malvern, Worcestershire, UK)を使用することによって決定した。(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)プロピル]-N,N,Nトリメチルアンモニウムメチルスルファート(DOTAP)/コレステロールまたはDOTAP/コレステロール/DSPE-PEG₂₀₀₀に基づいたカチオン性リポソームの懸濁液を、プロタミンを含有する水溶液およびウシ胸腺DNAおよびmiRNAまたはmiRNAのみの水溶液と混合し、続いて、室温で10〜15分間インキュベートすることによってmiRNA/脂質ステルスナノ複合体を調製した。DOTAP/コレステロールに基づいたリポソームの場合には、次いで、得られた粒子をDSPE-PEGのミセル分散物とともに、50℃で10〜15分間インキュベートした。NPを室温で10分間静置させた。複合体の超遠心分離法および上清のUV分析によって、錯体形成されたmiRNAのパーセンテージを求めた。より高い錯体形成効率を得るために、製剤条件、すなわち、最初の水溶液中のmiRNAの濃度、プロタミンの存在、使用されるカチオン性脂質の量を最適化した。ナノ複合体の粒子平均直径およびサイズ分布を、光子相関分光法によって調べ、M3-PALS技術によってゼータ電位を決定した。
【０１０３】
SNALPオリゴヌクレオチドmiR 199b-5pの配列:CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC(配列番号11)およびその関連配列スクランブルCTR:gguuguaugcauucccuaucuac(配列番号12)。
【０１０４】
増殖アッセイMTS
増殖アッセイ(MTS)を、キットCellTiter96 AQueous非放射性細胞増殖アッセイ(Promega)によって72時間行った。対照SNALPを用いて、およびmiR 199b-5pを用いて処理された細胞株daoy、MDA-231Tおよび4t1を、100μlの完全培地中1000および3000個細胞の濃度(それぞれ、daoy、MDA-231Tおよび4t1)で96マルチウェルに移した。各実験点について、5回の反復を行った。24、48および72時間後、各ウェルに、20μlの5×溶液を加えた。4時間後、Multilabel counter Victor3(Perkin Elmer)によって490nmでホルマザンの吸光度を読み取った。
【０１０５】
アポトーシス(Apoptosy)アッセイ
ソフトウェアCELL Questバージョン3.3を用いて、FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)によって、対照SNALPおよびmiR 199b-5p SNALPを用いて処理したdaoy、MDA-231Tおよび4t1においてアポトーシスアッセイを行った。アネキシンV分析を、抗体Miltenyi Biotec(Auburn, CA)によって行った。細胞をヨウ化プロピジウム(Propidium iodure)を用いて染色し、次いで、抗アネキシンV anticorpo FITC(Miltenyi Biotec)とともに、4℃、暗所で10分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSを用いて洗浄した。
【０１０６】
ウエスタンブロッティングHes1:以下参照
RT syber green 199bおよびCD133:以下参照
細胞培養
マウス乳癌細胞株4T1は、American Type Culture Collection(参照74、ATCC, Manassas, VA)によって得、10% FBS、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio Pero, Milan, Italy)を補給した「ダルベッコ改変イーグル培地」(DMEM;Sigma)で継代した。細胞株HT29(ヒト結腸癌腫)およびMDA-231T(ヒト乳癌)は、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)によって得、10% FBS、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio Pero, Milan, Italy)を含む「ダルベッコ改変イーグル培地」(DMEM; Sigma)で継代した。
【０１０７】
結果
髄芽細胞腫、乳癌および結腸癌腫細胞株においてSNALPによって保持されるMiR 199b-5pならびに毒性の評価および標的Hes1阻害の評価。
成熟型のmiR 199b-5p(リボヌクレオチド配列)を、関連対照を用いて材料および方法に記載されるとおりSNALPによって製剤した。Daoy、MDA231T、HT29および4T1細胞株を1μgのオリゴヌクレオチドを用いて処理し、増殖アッセイMTSによって生命力を評価した(図17Aおよび18A)。図17A、18A、20A〜Bに示されるように、株は、miR 199b-5p SNALPを用いる処理後24、48および72時間で、対照に対して増殖速度の低下を示した。処理の72時間後、miR 199b-5pの発現は、両細胞株において増大した(図17Bおよび18B)。処理の72時間後、アネキシンV分析によって処理の毒性を評価した(図17Cおよび18C)。図17Cおよび18Cに示されるように、両細胞株は、対照およびmiR 199b-5p間でアポトーシスレベルにおいて相違を示さなかった。さらに、図17Dおよび18Dに示されるように、処理の72時間後、ウエスタンブロッティングによってHes1発現を評価した。SNALPによるmiR 199b-5pの過剰発現は、Hes1の低減を示し、処理の有効性を示した。
【０１０８】
乳房および結腸癌腫組織におけるmiR 199b-5pの発現
miR 199b-5pの発現を、乳房(29組織)および結腸癌腫(13組織)において評価した。図19において示されるように、miR 199b-5pの発現レベルは、健常な対照に癌腫組織において低く、これはまた、これらの腫瘍において、腫瘍進行の際にmiR 199b-5pが発現停止されることを示す。遺伝子Cd133の発現レベルはまた、癌幹細胞マーカーであるので、癌腫組織に対して健常な対照において低い。
【０１０９】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄芽細胞腫、リンパ腫、神経膠芽腫、結腸癌腫および乳癌からなる群において選択される、遺伝子CD133の発現を特徴とする腫瘍の治療および/または予防において使用するための、以下の配列:
CAGAGGACACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTATCTGTTCA GGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTG GGTTAGACCCTCGG (配列番号1)
を含む、もしくはからなる、
または対応するリボヌクレオチド配列:
CCAGAGGACACCUCCACUCCGUCUACCCAGUGUUUAGACUAUCUG UUCAGGACUCCCAAAUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGCU GGGCUGGGUUAGACCCUCGG (配列番号10)
を含む、もしくはからなる、
または配列番号10の一部:
CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC(配列番号11)
を含む、もしくはからなるオリゴヌクレオチド配列。
【請求項２】
ウイルスベクターによって、またはSNALP技術、LNA技術によって保持される、またはC_1〜7リンカーを介して連結されるコレステロール分子の結合によって修飾されるO-2-メチル基を有する、請求項1に記載の配列。
【請求項３】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項2に記載の配列。
【請求項４】
アデノウイルスベクターが、図16に示されるゲノムマップ配列を有するAdV5ベクターであり、前記ベクターが、CMVプロモーターを含む6217bpからなり、ベクター中、XhoI/HindIII制限部位に配列番号1からなるかまたは含む配列がクローニングされている、請求項3に記載の配列。
【請求項５】
生体サンプルにおける、配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現およびCD133、c-myc、nanog、oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される、癌幹細胞において発現される1つまたは複数の遺伝子の発現の検出によって、腫瘍の病理組織学的ステージおよび転移の存在を評価するためのin vitro診断方法。
【請求項６】
配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の検出が、以下の増幅プライマー:
プライマーフォワード:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(配列番号3)
プライマーリバース:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(配列番号4)
および配列の発現値を正規化するために使用される1対の対照プライマーを使用するリアルタイムPCRによって行われる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
配列の発現値を正規化するために使用される対照プライマーが、以下:
プライマーフォワード:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(配列番号5)
プライマーリバース:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(配列番号6)
である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の検出が、以下のステップ:
a)RNAのレトロ転写;およびb)以下のプライマーおよびプローブ配列:
プライマーフォワード:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(配列番号7)
プライマーリバース:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(配列番号8)
プローブ:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(配列番号9)
を使用するTaqManアッセイによる前記配列の発現
を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
前記1つまたは複数の遺伝子が、以下の対の増幅プライマー:
CD133:
プライマーフォワード:CTATGTGGTACAGCCGCGTG (配列番号22)
プライマーリバース:TAATCAATTTTGGATTCATATGCCTTC (配列番号23)
c-myc
プライマーフォワード:ATGAGGAGACACCGCCCAC (配列番号24)
プライマーリバース:AACATCGATTTCTTCCTCATCTTCTT (配列番号25)
Nanog:
プライマーフォワード:GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGC (配列番号26)
プライマーリバース:GCTGTCCTGAATAAGCAGATCCAT (配列番号27)
Oct4:
プライマーフォワード:ACTGCAGCAGATCAGCCACA (配列番号28)
プライマーリバース:TGGCGCCGGTTACAGAAC (配列番号29)
TCFL1:
プライマーフォワード:CCGCGGGACTATTTCGC (配列番号30)
プライマーリバース:AAAGAACGCGCTGTCCTGAG (配列番号31)
ZIC1:
プライマーフォワード:CAGTTCGCTGCGCAAACA (配列番号32)
プライマーリバース:GAGCCCTGCGAGGAGGAT (配列番号33)
KLF5:
プライマーフォワード:GCATCCACTACTGCGATTACCC (配列番号34)
プライマーリバース:TGAGAAGACTTGGTATAAACTTTTGTGC (配列番号35)
HMGA1:
プライマーフォワード:AAAAACAAGGGTGCTGCCAA (配列番号36)
プライマーリバース:CCTTCCTGGAGTTGTGGTGGT (配列番号37)
HMGB3:
プライマーフォワード:TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGG (配列番号38)
プライマーリバース:TTTCTCTTTCCCGGACATCG (配列番号39)
を使用する、以下の配列:
CD133:
CTATGTGGTACAGCCGCGTGATTTCCCAGAAGATACTTTGAGAAAATT CTTACAGAAGGCATATGAATCCAA AATTGATTA (配列番号13)
c-myc:
AGGAGGAACAAGAAGATGAGGAAGAAATCGATGTT (配列番号14)
Nanog:
GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGCCTCACACGGAGACTGTCTCTCCTC TTCCTTCCTCCATGGATCTGCTTATTCAGGACAGC (配列番号15)
Oct4:
ACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAG G
ATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCA (配列番号16)
TCFL1:
CCGCGGGACTATTTCGCCGAAGTGAGAAGGCCTCAGGACAGCGCGT TCTTT (配列番号17)
ZIC1:
CAGTTCGCTGCGCAAACACATGAAGGTCCACGAATCCTCCTCGCAGG GCTC (配列番号18)
KLF5:
GCATCCACTACTGCGATTACCCTGGTTGCACAAAAGTTTATACCAAGT CTTCTCA (配列番号19)
HMGA1:
AAAAACAAGGGTGCTGCCAAGACCCGGAAAACCACCACAACTCCAG GAAGG (配列番号20)
HMGB3:
TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGGTGGAAGACGATGTCCGGGAAAGA GAAA (配列番号21);
のうち少なくとも1つの増幅によって、および
遺伝子配列の発現を正規化するために使用される以下の対のプライマー:
プライマーフォワード:CGT GCT GCT GAC CGA GG(配列番号79)
プライマーリバース:GAA GGT CTC AAA CAT GAT CTG GGT(配列番号80)
を使用することによって、リアルタイムPCRによって検出される、請求項5から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記1つまたは複数の遺伝子が、増幅のための以下のプライマーおよびプローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
を使用する、以下の配列:
cd133
TCCACAGAAATTTACCTACATT
GGAAGAGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGCCTGGTCATCTGCT CTCTGCTGACCC (配列番号40)
c myc
GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCT
CCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAACTA (配列番号41)
nanog:
CCGAAGAATAGCAATGGTGTGACGCAG
AAGGCCTCAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTACTCTTCCTACCACCA GGGATG (配列番号42)
oct 4:
AACCCGGAGGAGGTAGTCCTTTGTTACATGCATGAGTCAGTGAACAG GGAATGGGTGAATGACATTTGTGGGTAGGTTATT (配列番号43)
tcfl1:
CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAGAAGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGT CTTTTGTCCTCAGACTTGATCCTGCTCCCTCGG (配列番号44)
zic 1:
CGCGCTCCGAGAATTTAAAGATCCACAAAAGGACGCACACAGGGAGA AGCCCTTCAAGTGCGAGTTTGAGGGCTGTGACC (配列番号45)
KLF5:
TTTAACCCCACCTCCATCCTATGCTGCTACAATTGCTTCTAAACTGGC AATTCACAATCCAAATTTACCCACCACCCTGCC (配列番号46)
HMGA1:
CCCCAGGCAGACCTTATATGAGACATGGGAGTCCCACCGTATTGTCC AGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAAGCA (配列番号47)
HMGB3:
CGCTATGATCGGGAAATGAAGGATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAA GAAGAAGAAGGATCCTAATGCTCCCAAAAGGCCA (配列番号48);
のうち少なくとも1つの増幅によって、および
遺伝子配列の発現を正規化するための以下の対のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG(配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(配列番号83)
を使用することによって、リアルタイムTaqManアッセイによって検出される、請求項5から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
リアルタイムPCRによる、生体サンプルにおける、配列番号1の配列を含むかまたはからなる配列の発現の検出およびCD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される、癌幹細胞において発現される1つまたは複数の遺伝子の検出によって、腫瘍の病理組織学的ステージおよび転移の存在を評価するためのin vitro診断キットであって、
a)配列番号1を含むかまたはからなる前記配列の以下の増幅プライマー:
プライマーフォワード:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(配列番号3)
プライマーリバース:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(配列番号4)
b)前記配列の発現値を正規化するための1対の対照プライマー;
c)前記1つまたは複数の遺伝子の配列を検出するための以下の1または複数の対のプライマーおよびプローブ:
cd133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
e)前記遺伝子配列の発現を正規化するための以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG(配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(配列番号83)
を含むかまたはからなるキット。
【請求項１２】
配列の発現を正規化するためのb)中の前記対照プライマーが、以下:
プライマーフォワード:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(配列番号5)
プライマーリバース:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(配列番号6)
である、請求項11に記載のキット。
【請求項１３】
配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の、TaqmanリアルタイムPCRを使用する、生体サンプルにおける検出およびCD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される、癌幹細胞において発現される1つまたは複数の遺伝子の検出によって、腫瘍の病理組織学的ステージおよび転移の存在を評価するためのin vitro診断キットであって、
a1)配列番号1を含むかまたはからなる前記配列の発現を検出するための以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(配列番号7)
プライマーリバース:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(配列番号8)
プローブ:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(配列番号9)
b1)前記1つまたは複数の遺伝子配列の発現の検出のための、以下の1または複数の対のプライマーおよび関連プローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
c1)前記遺伝子配列の発現を正規化するための、以下の対のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG (配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA (配列番号81)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC (配列番号83)
を含むかまたはからなるキット。

【図１５】

【図１６ａ】

【図１６ｂ】

【図１６ｃ】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【公表番号】特表２０１２−５２１２１３（Ｐ２０１２−５２１２１３Ａ）
【公表日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０１５１３（Ｐ２０１２−５０１５１３）
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＴ２０１０／０００１２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０９５１１
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３２１１２）
【Ｆターム（参考）】