医薬組成物、医薬組成物を含む基質、および医薬組成物の使用
本発明は、感染部位での組織感染症の局所治療または防止のための医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が、Ａ群の少なくとも２つの異なる抗生物質もしくは薬学上許容されるその誘導体、またはＡ群の抗生物質およびＢ群の少なくとも１つの抗生物質もしくは薬学上許容されるその誘導体を含む使用に関する。Ａ群は、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として、ギラーゼの阻害薬として、または細菌のタンパク質合成の阻害薬として働く細胞内活性型の抗生物質を主に含む。Ｂ群は、細菌の細胞壁合成の阻害薬もしくは細菌のタンパク質合成の阻害薬として、または、細菌の細胞壁の直接の不安定化もしくは破壊により働く細胞外活性型の抗生物質を主に含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、請求項１のプリアンブル（ｐｒｅａｍｂｌｅ）による医薬組成物、請求項１１のプリアンブルによる医薬組成物、請求項１６による微生物に細胞外および／または細胞内感染した細胞の治療用の医薬組成物、ならびに請求項２２のプリアンブルによる医薬組成物を含む基質の使用に関する。本発明はさらに、請求項２７による表面上の微生物に対する抗付着薬（ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｖｅ）としての抗生物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨および組織の感染症は、整形外科および外科の最も深刻な問題であり、手術の頻度の増加が原因である場合はとりわけ深刻である。骨感染症全体の３０％は、治療しても慢性となる。さらに、以前の治療が成功したと思われた後に感染症が再発する多くの症例が知られている。全症例の３％においては、残る選択肢は切断術のみである。抗生物質を用いた全身治療は難しいが、それは、抗生物質は一般に非常にわずかしか骨を透過しないため、感染症を排除するための十分に高い濃度を達成することはほとんど不可能だからである。
【０００３】
骨および他の組織の感染症の療法については、抗生物質の全身療法より抗生物質の局所施用の方が適しているが、それは、局所施用では、全身施用の場合より高い濃度の抗生物質が治療部位で達成できるからである。抗生物質による局所療法が成功するための必要条件は、すべての骨または組織の壊死部の病巣清掃術およびすべての異物の除去など、前もって行われる外科的な根治療法である。従来技術から知られる局所用の抗生物質担体は、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）で作製された骨セメント、ＰＭＭＡで作製されたビーズ、コラーゲンフリースおよび骨置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）である。このような担体は市販されているが、それらに施用されている抗生物質の数は以下のとおり限られている：ゲンタマイシン、トブラマイシン、クリンダマイシン、バンコマイシンおよびテイコプラニン。
【０００４】
前述の抗生物質を用いる抗生物質による局所療法には、骨および関節の感染症についての改善された治療法がすでにあるものの、そのような療法は、相当な数の症例（１６％に及ぶ）において失敗している。しかし、療法が失敗すると、最終的には切断術が必要になることが多い。
【０００５】
療法の失敗の主な理由は、ａ）特定の抗生物質に対する耐性、ｂ）固着性の細菌に対する抗生物質の無効性、ｃ）細胞内に局在する細菌およびｄ）小型コロニー変種の誘発である。ここで言う、項目ｂ）による無効性は、バイオフィルムが形成されて排除すべき細菌の増殖が休止することが原因である。さらに、ここで言う細胞内の、とは、宿主の、すなわち治療すべき対象の細胞のことと理解されたい。したがって、細菌が宿主の細胞内部に存在すれば、細胞の内側にあるものに浸透できない抗生物質は、排除すべき細菌に対して作用できない。
【０００６】
以前から、ブドウ球菌は白血球内部で生存できることが知られていた。さらに、いわゆる小型コロニー変種表現型を示す黄色ブドウ球菌株は、ケラチン生成細胞および内皮細胞により取り込まれることができ、細胞内に存続できることが知られている。こうした菌株は、細胞内にリソソーム内部でとどまることが実証された。さらに、普通の表現型の黄色ブドウ球菌も、内皮細胞、線維芽細胞およびケラチン生成細胞によって取り込まれることができ、細胞内にリソソーム内部でとどまることができる。
【０００７】
黄色ブドウ球菌の単離株は、対立する２つの性質を示すことが実証された。すなわち、細胞毒性株がケラチン生成細胞および線維芽細胞中で生存し、細胞内で分裂することによりその宿主細胞に対し顕著な細胞毒性を引き起こすのに対し、非細胞毒性株はケラチン生成細胞および線維芽細胞の内部で殺されることから、黄色ブドウ球菌の取込みは細胞自律的な宿主防御の重要な機序を表すことが示唆される（Krut, O.ら、Infection and Immunity、2003、71、2716〜2723）。
【０００８】
黄色ブドウ球菌は、骨芽細胞によっても取り込まれることがあるが、骨芽細胞は、取り込んだ非細胞毒性のブドウ球菌を殺すことができず、代わりにこうした菌は、数日、数週間にわたり骨芽細胞内部で増殖せずに存続できる。骨芽細胞の溶解後、ブドウ球菌は再度増殖できる。骨芽細胞において、ブドウ球菌および場合によっては他の細菌が細胞内で存続すること、ならびに、細胞内にリソソーム内部で存続するその潜在能力は、骨感染症に注目した場合、格別な役割を果たすと考えられる。これが骨感染症の慢性進行の原因ではないかと考えられる。
【０００９】
シュードモナス菌、レンサ球菌および腸球菌が骨芽細胞中で存続できるかどうか依然として正確には知られていないが、これらの細菌が細胞内で存続することは普通に見ることができた。こうした細胞内での存続は、今までは、おそらく他の疾患の慢性進行と関連があると考えられていたにすぎなかったが、シュードモナス菌、レンサ球菌および腸球菌は骨感染症に関する病原である場合が多いことから、それらが細胞内で存続することが、骨感染症の慢性進行の原因である可能性がある。
【００１０】
首尾よく治療されたと思われた骨感染症が数年後であっても再発することがある理由は、この仮定に基づいて説明できる。宿主細胞内部では、細菌は、細胞膜を透過できない多数の抗生物質（例えばペニシリン、糖ペプチド）に対して保護される。プランクトン性（ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ）（浮遊性）の細菌により誘発されている急性感染症は、このような抗生物質で治療できる可能性があるものの、細菌は、細胞内にとどまり、宿主細胞からの放出後に再感染を引き起こすことがある。
【００１１】
従来技術では、骨および軟部組織の感染症は、主にアミノグリコシド（ゲンタマイシン、トブラマイシン）で局所治療されるが、このような薬物は宿主細胞の細胞膜を通常は透過できない。一方、アミノグリコシドは線維芽細胞のリソソーム中で蓄積できるが、リソソームが低ｐＨであることから不活性であることが報告された。
【００１２】
したがって、骨および他の組織の感染症の局所療法のために従来技術で使用される抗生物質は、このようなすべての感染症を首尾よく治療するには適さない。とりわけ、ゲンタマイシンのみを含有する局所用の抗生物質担体は、小型コロニー変種表現型を示す細菌の感染症に対しては効果がなく、小型コロニー変種表現型の形成を誘発する恐れすらある。感染症の局所療法のために現時点で使用される抗生物質のいずれも、細胞内に局在する細菌を排除できない。
【００１３】
ＷＯ２００６／０６４５１７（特許文献１）では、細菌のタンパク質合成を阻害する第１の抗生物質と、細菌のタンパク質合成を阻害しない第２の抗生物質と、を含む抗生物質組成物が開示されている。
【００１４】
ＵＳ５，２１７，４９３（特許文献２）では、バイオフィルムの定着を防ぐために、リファンピンおよびノボビオシンで、またはリファンピンおよびミノサイクリンでコーティングした埋込み可能な医療器具が開示されている。
【００１５】
一実施形態を考慮すれば、細胞（特に組織細胞）の細胞外および細胞内感染症を治療および防止するための医薬組成物、そのような組成物を担持する基質、ならびにそのような組成物および基質を施用する方法を提供することが可能である。
【００１６】
異なる基質表面上での微生物の付着率を低下させることがさらに可能である。
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【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００６／０６４５１７号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５２１７４９３号明細書
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清中の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８ＰのＣＦＵを示すグラフである。
【図２】ＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清中の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図３ａ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清にリファンピンを加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図３ｂ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清にホスホマイシンを加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図３ｃ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清にホスホマイシン、リファンピンおよびその組合せを加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図３ｄ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清に１０μｇ／ｍｌのホスホマイシンと０．００６〜０．００７５μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図３ｅ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清にモキシフロキサシンを加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。 組織感染症の局所治療および防止のための医薬または医療器具を製造するための医薬組成物が、請求項１の主題である。
【図４ａ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清にホスホマイシンを加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｂ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清にリファンピンを加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｃ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、５０μｇ／ｍｌのホスホマイシンと２．５〜４０μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｄ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、２５〜４００μｇ／ｍｌのホスホマイシンと２．５μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｅ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、ホスホマイシン、リファンピン、および、５０μｇ／ｍｌのホスホマイシンと１０μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｆ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、ホスホマイシン、リファンピン、および、２５μｇ／ｍｌのホスホマイシンと２．５μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｇ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、ホスホマイシン、リファンピン、および、５０μｇ／ｍｌのホスホマイシンと２０μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図５ａ】バンコマイシンまたはリファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスク（ディスクは、インキュベーション前に１回または３回のいずれかの回数、洗浄した）上で黄色ブドウ球菌を１．５時間インキュベーションした後の、チタンディスク１枚当たりの黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８ＰのＣＦＵを示すグラフである。
【図５ｂ】リファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスク（ディスクは、インキュベーション前に２回洗浄した）上でＳ．エピデルミス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）と共に２時間インキュベーションした後の、チタンディスク１枚当たりの表皮ブドウ球菌ＡＴＴＣ３５９８４のＣＦＵを示すグラフである。
【図５ｃ】バンコマイシンまたはリファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスク（ディスクは、インキュベーション前に１回または２回のいずれかの回数、洗浄した）上で黄色ブドウ球菌を１．５時間インキュベーションした後の、チタンディスク１枚当たりの黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図５ｄ】最少培地中に入れた、バンコマイシンまたはリファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスクと共に黄色ブドウ球菌を一晩インキュベーションした後の、チタンディスク上または上清中の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図６】最少培地中に入れた、バンコマイシンまたはリファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスクと共に黄色ブドウ球菌を一晩インキュベーションした後の、チタンディスク上または上清中の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一実施形態では、局所治療および防止は感染部位で行われる。治療対象となる組織は、例えば軟部組織および／または骨組織（一般に「骨」と表されるものを含む）であってもよい。請求項１の特徴によれば、この医薬組成物は、Ａ群の少なくとも２つの異なる抗生物質もしくは薬学上許容されるその誘導体、またはＡ群の１つの抗生物質およびＢ群の少なくとも１つの抗生物質もしくは薬学上許容されるそのそれぞれの誘導体を含む。Ａ群は、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として、ギラーゼの阻害薬として、または細菌のタンパク質合成の阻害薬として働く細胞内活性型の抗生物質を主に含む。Ｂ群は、細菌の細胞壁合成の阻害薬として、もしくは細菌のタンパク質合成の阻害薬として働くか、または細菌の細胞壁を直接不安定化もしくは破壊する、細胞外活性型の抗生物質を主に含む。
【００２０】
本説明に関する場合、組織感染症は、微生物が原因で生じる組織細胞の細胞外および細胞内の感染症として理解される。
【００２１】
使用される抗生物質に対する耐性をとりわけ長期治療において回避するために、少なくとも２つの抗生物質の組合せを選択できる。そのような組合せは、結果としてより高い有効性ももたらす。細胞内活性型の抗生物質のみを使用することが一般に考慮できるが、細胞内活性型の抗生物質（Ａ群）と細胞外活性型の抗生物質（Ｂ群）との組合せを選択してもよい。Ｂ群の抗生物質は、細胞内で活性をもたなくても耐性の形成を阻害できるが、その理由は、Ｂ群の抗生物質は細胞外の細菌に対して殺菌の形で作用し、耐性は、細菌のうちプランクトン性の増殖性の個体群において形成されるだけだからである。Ｂ群の細胞外活性型の抗生物質はＡ群の抗生物質とは異なる作用機序を示すため、似たような耐性が生じる可能性はほとんどない。
【００２２】
使用対象となる医薬組成物は、それ自体が公知の添加物、分散剤、溶媒または担体物質などをさらに含んでもよい。
【００２３】
骨および他の組織の感染症を治療する上で良好な結果に到達するために、一実施形態では、選択される抗生物質の少なくとも１つは以下の基準の少なくとも１つを満たすべきである：
ａ）宿主細胞（すなわち、排除すべき細菌が内部に位置する、治療すべき対象の細胞）の細胞膜を透過すべきである
ｂ）宿主細胞のリソソーム内部に到達可能であるべきである
ｃ）低ｐＨで（とりわけ、リソソーム中の実際の低ｐＨ、すなわちおよそｐＨ４からｐＨ５で）活性をもつべきである
ｄ）殺菌活性をもつべきである
ｅ）非増殖性の細菌に対してもその殺菌活性を示すべきである。
【００２４】
一実施形態では、選択される抗生物質の少なくとも１つは前述の複数の基準を満たす。別の実施形態では、これらの基準のすべての実現が達成される。さらに別の実施形態では、選択されるすべての抗生物質がすべての基準の実現を達成する。
【００２５】
一実施形態では、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として働くＡ群の前記抗生物質は、アンサマイシン、とりわけリファマイシンを含む。とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシン（ｒｉｆａｍｉｘｉｎ）を選択してもよい。リファンピンを含有する医薬組成物は、細胞内のブドウ球菌を排除する上でとりわけ適しており、この菌は当該医薬組成物の局所投与後３日以内に排除されることが示された。
【００２６】
さらなる一実施形態では、ギラーゼの阻害薬として働くＡ群の前記抗生物質は、フルオロキノロンを含む。フルオロキノロンであるモキシフロキサシンがとりわけ選択される。
【００２７】
一実施形態では、細菌のタンパク質合成の阻害薬として働くＡ群の前記抗生物質は、例えばキヌプリスチンまたはダルフォプリスチンのようなストレプトグラミンを含む。一実施形態では、キヌプリスチンとダルフォプリスチンとの組合せが使用される。使用対象となる医薬組成物は、各群の１つを超える抗生物質（およびＢ群の抗生物質が使用されない場合はＡ群の２つを超える抗生物質）を、したがって合計で２つを超える抗生物質を含有してもよいことに注目されたい。
【００２８】
一実施形態では、細菌の細胞壁合成の阻害薬として働くか、またはその細胞壁を直接不安定化および破壊するＢ群の前記抗生物質は、糖ペプチド、ホスホマイシンおよびポリペプチドを含む。一実施形態では、選択される糖ペプチドは、バンコマイシンおよびテイコプラニンである。同じまたは別の実施形態では、選択されるポリペプチドは、バシトラシン、ポリミキシンＢ、ならびに他のポリミキシンおよびダプトマイシンである。
【００２９】
一実施形態では、細菌のタンパク質合成の阻害薬として働くＢ群の前記抗生物質はアミノグリコシドを含む。この場合は、とりわけアルベカシンを選択してもよい。
【００３０】
使用対象となる例示的な医薬組成物は、リファマイシンおよびアミノグリコシドを含む。別の例示的な医薬組成物は、リファンピンおよびアルベカシンを含み、そのような組成物は、排除すべき病原菌の全範囲を本質的にカバーし、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはメチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ＭＲＳＥ）のような問題のある細菌に対して有効である。いずれの抗生物質も、非増殖性（静止している）細菌に対しても有効であり、温度に耐性がある（熱安定性である）ことから、このような抗生物質は、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）製の骨セメントに、ＰＭＭＡビーズチェーンに、および修正（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）手術用のスペーサーに加えることができる。
【００３１】
使用対象となる別の医薬組成物はリファマイシンおよびホスホマイシンを含む。さらに別の医薬組成物は、リファンピンおよびホスホマイシンを含み、そのような組成物も排除すべき病原菌の全範囲を本質的にカバーし、ＭＲＳＡおよびＭＲＳＥのような問題のある細菌に対しても有効である。ホスホマイシンは、ヒドロキシルアパタイトに可逆的に結合することにより、担体から放出された後でも他の抗生物質より長く骨中にとどまるというさらなる特性を有する。さらに、ホスホマイシンは、公知のものとしては最小の抗生物質であり、骨組織を通ってまたは骨組織中へ非常によく拡散または透過する。
【００３２】
使用対象となるさらなる医薬組成物は、リファマイシンおよびフルオロキノロンを含む。別の医薬組成物はリファンピンおよびモキシフロキサシンを含む。
【００３３】
１つの目的は、請求項１１による医薬組成物を提供することによっても取り組まれる。そのような医薬組成物は、感染部位での組織感染症の局所治療および防止のために使用できることにより、そのような使用のさらなる実施形態は、上で説明したものに、および本明細書により全体が参照されるものと同様である。
【００３４】
そのような医薬組成物は、Ａ’群の少なくとも２つの異なる抗生物質もしくは薬学上許容されるその誘導体、またはＡ’群の１つの抗生物質およびＢ’群の抗生物質もしくは薬学上許容されるその誘導体を含む。この場合、Ａ’群は、主に細胞内活性型の抗生物質であるアンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシン；フルオロキノロン、とりわけモキシフロキサシン；ストレプトグラミン、とりわけキヌプリスチンおよび／またはダルフォプリスチンを含む。Ｂ’群は、主に細胞外活性型の抗生物質である糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン；ホスホマイシン；ポリペプチド、とりわけバシトラシン、ダプトマイシンまたはポリミキシンＢ；およびアミノグリコシド、とりわけアルベカシンを含む。糖ペプチドは、２つのみの抗生物質を含み第１の抗生物質としてアンサマイシンを含む医薬組成物の第２の抗生物質であることはできないことに留意されたい。
【００３５】
一実施形態では、この医薬組成物は、可能性のあるＢ’群の抗生物質として糖ペプチド、ポリペプチドまたはホスホマイシンのみを含むが、Ｂ’群の抗生物質としてアミノグリコシドは使用されない。別の実施形態では、Ａ’群の抗生物質としてストレプトグラミンは使用されない。
【００３６】
一実施形態では、抗生物質は、この医薬組成物中の抗生物質が、タンパク質合成の阻害薬としてはそのすべてが働かないか、またはそのすべてが働くかいずれかである。すなわち、ａ）異なるストレプトグラミンのみ、もしくはストレプトグラミンおよびアミノグリコシドを使用してもよいか、またはｂ）ストレプトグラミンおよびアミノグリコシドは一切使用できないかのいずれかであるような方式で選択される。
【００３７】
代替的な一実施形態では、この医薬組成物は、リファマイシンおよびアミノグリコシド、とりわけリファンピンおよびアルベカシンを含む。
【００３８】
別の実施形態では、この医薬組成物は、リファマイシンおよびホスホマイシン、とりわけリファンピンおよびホスホマイシンを含む。
【００３９】
そのような組成物は、リファマイシンおよびホスマイシン（ｆｏｓｍｙｃｉｎ）を、リファマイシンが治療対象部位で０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から２０μｇ／ｍｌの濃度に達するような濃度で含む。ホスホマイシンは、治療対象部位で１から１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から８００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０から２００μｇ／ｍｌの濃度に達する。
【００４０】
さらに別の実施形態では、この医薬組成物は、リファマイシンおよびポリペプチド、とりわけリファンピンおよびダプトマイシンを含む。
【００４１】
そのような組成物は、リファマイシンおよびダプトマイシンを、リファマイシンが治療対象部位で０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から２０μｇ／ｍｌの濃度に達するような濃度で含む。ダプトマイシンは、治療対象部位で０．１から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から２０μｇ／ｍｌの濃度に達する。
【００４２】
さらに別の実施形態では、この医薬組成物は、リファマイシンおよびフルオロキノロン、とりわけリファンピンおよびモキシフロキサシンを含む。
【００４３】
１つの目的は、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質、細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質、および／またはギラーゼ阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質を含む、微生物に細胞外および／または細胞内感染した細胞の治療のための、および／または細胞の微生物感染症防止のための請求項１５による医薬組成物によっても達成される。
【００４４】
この治療は、局所的または全身に好ましくは行われる。
【００４５】
有利には、アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシンは、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として使用される。細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす抗生物質としては、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、およびポリペプチド、とりわけバシトラシンおよびダプトマイシンが選択される。ギラーゼ阻害薬としては、フルオロキノロン、とりわけモキシフロキサシンが施用される。
【００４６】
リファマイシンは、０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から２０μｇ／ｍｌの間の濃度で使用される。ホスホマイシンは、１から１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から８００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０から２００μｇ／ｍｌの濃度で使用される。モキシフロキサシンは、０．１から５００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から２００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から１００μｇ／ｍｌの間の濃度で施用される。ダプトマイシンは、０．１から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から２０μｇ／ｍｌの濃度で使用される。リファマイシン、ホスホマイシン、ダプトマイシンおよび／またはモキシフロキサシンの組合せにおいては、同じ濃度が好ましくは用いられる。
【００４７】
この医薬組成物は、骨芽細胞、白血球、赤血球、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、筋細胞および／または内皮細胞などの感染細胞の場合に特に有効である。
【００４８】
さらに、この医薬組成物は、グラム陰性菌および／またはグラム陽性菌、好ましくはスタフィロッコシ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｉ）型、最も好ましくは黄色ブドウ球菌が原因で生じる微生物感染症に対して有効である。
【００４９】
一実施形態では、使用対象となる医薬組成物はバイオフィルム形成阻害薬をさらに含む。病原菌（特に表面上の細菌）の付着、または病原菌が表面上に蓄積して当該表面上にバイオフィルムを形成する能力を少なくとも部分的に低下させるかまたは阻害する物質はすべて、バイオフィルム形成阻害薬とみなされる。
【００５０】
一実施形態では、バイオフィルム形成阻害薬として、サリチル酸または薬学的活性をもつその誘導体または塩が使用される。とりわけサリチル酸とアミノグリコシドとの組合せを使用してもよい。サリチル酸は、細菌に対する、特に大腸菌および肺炎桿菌に対するアミノグリコシドの微生物活性を高める。すなわち、サリチル酸はプロトン化された形態で細胞に入り込むことにより細胞の膜電位を高める。これにより今度は細胞の内部中へのアミノグリコシドの取込みが容易になる。
【００５１】
さらにはサリチル酸自体も細菌に対する効果を示す。サリチル酸の存在下で被包性の肺炎桿菌を成長させると、結果として莢膜多糖類の合成が減少する。莢膜の材料が失われることにより肺炎桿菌の細胞表面が宿主の防御機序にさらされることで、感染排除に必要な時間が短縮される。サリチル酸は細菌が表面上に付着してバイオフィルムを形成する能力を低下させる。サリチル酸は、バイオフィルム形成に対して１００％の防御は提供しないものの抗生物質の効果を支持する。
【００５２】
アセチルサリチル酸および／またはその主な代謝産物であるサリチル酸は、微生物の病原性表現型に対しｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において限定的な影響を呈する。細菌の病原性因子は宿主生物において細菌による感染の媒介を助長する。以下の効果が認められている：関連のバイオマトリックスへの付着の減少、莢膜産生の減少、バイオフィルム形成の低減、および疣（ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ）の成長、疣内の細菌増殖の減退、および実験的な感染性心内膜炎における血行性播種。また、サリチル酸は、複数の抗生物質に耐性を有する遺伝子座など特定の遺伝子座の翻訳を正に調節する。さらに、サリチル酸は細胞質のタンパク質を誘導し、キノロン耐性を高める。
【００５３】
サリチル酸の存在下で成長させた後では、大腸菌におけるいくつかの型の線毛（例えば、定着因子抗原、Ｐ線毛および１型線毛）の合成が減少する。線毛は、大腸菌が上皮の表面に付着する上で決定的に重要な役割を果たすので、サリチル酸による治療は、線毛を有する（ｆｉｍｂｒｉａｔｅｄ）大腸菌の何らかの菌株が原因で生じる感染症を防止する可能性がある。サリチル酸はシラスティックカテーテルへの大腸菌の付着も制限する。
【００５４】
細菌における走化性は鞭毛の旋回の規則により調節される。この旋回が反時計回りのときは直線軌道に沿って泳ぐことになり、時計回りのときは回転することになる。サリチル酸は大腸菌ｔｓｒ遺伝子産物によりケモリペラント（ｃｈｅｍｏｒｅｐｅｌｌａｎｔ）として認識される。この認識により、運動性大腸菌は持続的に回転することとなり、その結果最終的に細胞はサリチル酸から遊走して逃れる。大腸菌が群れる行動も濃度に依存する形でサリチル酸により阻害される。大腸菌における鞭毛自体の産生は、サリチル酸の存在下での成長により阻害される。これには、鞭毛を構成するタンパク質モノマーであるフラゲリンの産生の阻害が介在する。サリチル酸による大腸菌における鞭毛合成および運動性の阻害は、鞭毛の構築に必要と考えられるＯｍｐＦ合成における合成が減少することによるものであるとも推測されている。
【００５５】
バイオフィルムは、微生物由来の多糖マトリックス中に封じ込められた微生物および他の物質からなる。サリチル酸の存在下で緑膿菌および表皮ブドウ球菌を成長させると、バイオフィルム形成に必要な細胞外多糖の産生が減少する。バイオフィルム形成が減少すると、これらの生物がコンタクトレンズおよび医療用ポリマーに付着する能力が低下する。表皮ブドウ球菌におけるバイオフィルム産物の成分は、多糖類、タイコ酸およびタンパク質の複合混合物で構成される細胞外粘液である。粘液に関連するタンパク質およびタイコ酸の産生は、表皮ブドウ球菌の場合はサリチル酸により阻害される。
【００５６】
黄色ブドウ球菌の場合は、サリチル酸は、マトリックス結合（すなわちフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンへの）およびαヘモリシン活性にとって重大な関連のある２つの異なる病原性表現型を軽減する。こうした効果は、それぞれの構造遺伝子、すなわちｆｎｂＡ、ｆｎｂＢおよびｈｌａの発現がサリチル酸の媒介により減少することと特異的に関連する。マトリックスタンパク質結合および細胞溶解のプロファイルの抑制に加え、サリチル酸の存在下では細胞外酵素およびプロテインＡの産生強化が生じる。これらの知見から、サリチル酸は、全体的な遺伝子転写の抑制ではなく、１つまたは複数のグローバル制御網（ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋ）によりその抗微生物効果を果たしたという可能性が高まる。グローバルレギュロン（ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌｏｎ）ｓａｒＡおよびグローバルレギュロンａｇｒは、サリチル酸により軽減され、このことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈｌａおよびｆｎｂＡ遺伝子の発現低下と合致する。黄色ブドウ球菌の病原性パラメーターは、サリチル酸により完全に抑制されたわけではないが、薬物濃度に依存する形で最大およそ５０％低下したことには注目すべきである。
【００５７】
一実施形態では、治療対象となる感染組織は急性的または慢性的に感染したものである。急性感染症と慢性感染症との組合せ（すなわち急性感染症が起きてから慢性感染症になる）も治療できると考えられる。
【００５８】
今回の目的は、請求項２１による医療目的用の基質を提供することによっても達成される。この基質は、組織感染症を局所治療および防止する場合に医薬組成物の担体として好ましくは使用される。さらなる実施形態では、この基質は、外科的な病巣清掃術における補助剤として感染組織の除去後に局所的にも使用される。
【００５９】
一実施形態では、この基質は使用対象となる医薬組成物と共に浸漬できる。別の実施形態では、医薬組成物は基質の基材中で分散させることができる。さらに別の実施形態では、医薬組成物を基材と共に重合させることができる。したがって、基質を医薬組成物でコーティングしおよび／または医薬組成物を基質中に組み込むことが可能である。
【００６０】
好ましい一実施形態では、この基質には医薬組成物を施用する前に特別な処理（例えばサンドブラスト加工またはヒドロキシルアパタイトコーティング）を施した。
【００６１】
本説明の範囲内では、コーティングも医薬組成物がその中に存在する（例えば分散形態で）支持材料で作製される。そのような支持材料としてはポリラクチドを挙げることができる。次に、分散された医薬組成物が含まれている支持材料を、基質上に（後者の表面上に直接、またはその表面上にすでに存在している層もしくは別の層の上、そのいずれかに）コーティングとして施用する。
【００６２】
一実施形態では、この基質は、フリース、織物、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチルとアクリル酸メチルとのコポリマー、再吸収可能なポリマー、ポリエチレン、金属または金属合金（例えば、Ｔｉ６ＡＩ４Ｖ合金または別のチタン合金）、セラミック、骨セメント、とりわけポリマー材料またはリン酸カルシウムで作製されているもの、および／または代用骨を含む。したがって、メタクリル酸メチルとアクリル酸メチルとのコポリマーおよびグリシンから主になるＰＭＭＡビーズチェーン、ならびに局所用の抗生物質担体として投与される特定の医薬組成物は、可能性のある基質である。さらに、骨セメントはスペーサー用および修正手術用に使用することを意図してもよい。
【００６３】
ＰＭＭＡビーズチェーンの場合は以下の使用様式が可能である：まず、ＰＭＭＡ基材内に医薬組成物を分散させる。この粉末を１８０℃に加熱してから、射出成型により型の中に充填する。医薬組成物は、基材全体にわたって分布しており、ＰＭＭＡビーズの内側部分から表面に向かって拡散でき、そこでＰＭＭＡビーズチェーンの周囲に存在している細菌と相互作用できる。ＰＭＭＡビーズチェーンは、０．１〜１０質量％、好ましくは０．５〜８質量％、最も好ましくは１〜５質量％の（１つまたは複数の）抗生物質を含んでもよい。
【００６４】
別の実施形態では、とりわけ修正手術の場合、基質は埋込み可能な人工器官であり、この場合、人工関節、および、とりわけ膝、股関節、肩、肘用の人工器官、ならびに椎骨インプラントはそれぞれの例である。さらに、スクリュー、プレートなどのような外傷の外科手術用のインプラントはすべて基質として使用してもよい。基質のコーティングは、基質の表面積１ｃｍ2当たり、１０〜１０００μｇ／ｃｍ2、好ましくは２０〜５００μｇ／ｃｍ2、最も好ましくは５０〜３００μｇ／ｃｍ2の（１つまたは複数の）抗生物質を含んでもよい。
【００６５】
一実施形態では，フリースまたは織物は天然または合成の繊維（生分解性のものであってもよい）を含み、この場合ポリラクチド（ポリ乳酸）が例示的な材料である。別の実施形態では、フリースまたは織物はコラーゲンを含み、この場合、フリースはコラーゲンから本質的になるものであってもよい。後者の場合、コラーゲンフリースもまた、完全に生分解性である。フリースは、フリース１ｃｍ2当たり０．０１〜１０ｍｇ／ｃｍ2、好ましくは０．１〜８ｍｇ／ｃｍ2、最も好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｃｍ2の（１つまたは複数の）抗生物質を含んでもよい。
【００６６】
さらに、医薬組成物で対象を局所治療する方法であって、該医薬組成物が、
− Ａ群の少なくとも２つの異なる抗生物質または薬学上許容されるその誘導体、または
− Ａ群の１つの抗生物質およびＢ群の少なくとも１つの抗生物質または薬学上許容されるその誘導体を含み、
Ａ群が
− 細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬、
− ギラーゼの阻害薬、または
− 細菌のタンパク質合成の阻害薬
として働く細胞内活性型の抗生物質を含み、
Ｂ群が
− 細菌の細胞壁合成の阻害薬として、
− 細菌のタンパク質合成の阻害薬として、または
− 細菌の細胞壁の直接的な不安定化または破壊により
働く細胞外活性型の抗生物質を含む方法を記載する。
【００６７】
この方法は、とりわけ、前記対象の組織感染症を治療するために使用でき、この場合の組織とは、例えば軟部組織および／または骨組織および／または骨であってもよい。これらの感染症は、外科手術が原因で、とりわけヒトまたはヒト以外の体内へのインプラントの埋込みに関する手術が原因で生じることがあると考えられる。したがって、この治療はヒトまたはヒト以外の体に施してもよいと考えられる。
【００６８】
本態様のさらなる実施形態に関しては、前記方法（とりわけ使用対象となる基質および選択対象となる抗生物質に関する）に同様に適用可能である前述の説明が参照によりなされる。
【００６９】
第２の目的は、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として作用する少なくとも抗生物質と、表面上の微生物に対する抗付着薬として細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質との組合せを使用することにより達成される。
【００７０】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬は、アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシンを含む群から好ましくは選択される。
【００７１】
細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす抗生物質は、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、およびポリペプチド、とりわけバシトラシンまたはダプトマイシンを含む群から好ましくは選択される。好ましい組合せは、リファマイシンおよびホスホマイシンを含む。
【００７２】
さらなる実施形態では、微生物は、グラム陰性菌および／またはグラム陽性菌、好ましくはスタフィロッコシ型のもの、最も好ましくは黄色ブドウ球菌である。
【００７３】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つの阻害薬と細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質との組合せは、金属、好ましくはチタン、鋼または金属合金、セラミックス、および骨セメントまたはヒドロキシルアパタイトで作製された表面上に、好ましくは付加またはコーティングされる。
【００７４】
基質上にコーティングする場合、この組合せは、リファマイシンおよびホスホマイシンを、それぞれ１０から１０００μｇ／ｃｍ2、好ましくは２０から５００μｇ／ｃｍ2、最も好ましくは５０〜２００μｇ／ｃｍ2の間の濃度で含んでもよい。
【００７５】
有利には、抗付着効果は、コーティングされた表面を取り囲む組織に対する殺菌効果を伴う。
【００７６】
実施形態の例を、以下の図および例によりさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００７７】
１．細胞外感染症の治療のためのリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
１．１．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス・ローゼンバッハ（Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ）（ＡＴＴＣ６５３８Ｐ）に感染したＭＧ６３骨芽細胞の細胞外感染症の治療のためのリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
細胞剥離用媒体のＡｃｃｕｔａｓｅを用いて、感染の２４時間前にＭＧ６３骨芽細胞を剥離した。Ｎｅｕｂａｕｅｒ計数盤を用いて細胞数を定量した。コーティングされていない２４ウェルのプレート上に、１．５×１０4細胞／ｃｍ2の細胞密度で、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉおよび１％Ｎａｔｒｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔを添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｅｄｉｕｍ）１ｍｌ中に細胞を播種し、３７℃および５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。
【００７８】
Ｃａｓｏ−Ｂｏｕｉｌｌｏｎ培地５ｍｌを黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させることにより、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの一晩培養物を調製した。この培養物を、３７℃で一晩、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。感染に先立ち、一晩培養物１００μｌをＣａｓｏ Ｂｏｕｌｉｌｌｏｎ培地５ｍｌ中に移し、３７℃で２時間、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。
【００７９】
ＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清を、ピペットを用いてウェルから除去した。１×１０6の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐ細胞を含有する１ｍｌを各ウェルに加えた。２４ウェルのプレートを２つ、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐと共にインキュベートした。骨芽細胞と細菌とを合わせたものを、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて１．５時間インキュベートした。顕微鏡を用いて細菌の存在を定量した。
【００８０】
１．５時間後、上清を除去し、添加物の入っていない３７℃の温ＤＭＥＭで、ウェルを慎重に２回洗浄した。洗浄手順中に細胞が多く剥離されすぎなかったかどうか、顕微鏡でチェックした。洗浄中にはプランクトン性の細胞のみが除去されており、細胞および細胞培養プラスチックに付着した細菌が多数目視できた。その後、細胞培養完全培地１ｍｌを、以下の抗生物質を含有する各ウェルに加えた：
− １００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
− １μｇ／ｍｌのリファンピン
− １００μｇ／ｍｌのホスホマイシン二ナトリウム
− １μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのホスホマイシン二ナトリウム
− １μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン。
【００８１】
抗生物質の入っていない陰性対照は使用しなかったが、これは抗生物質の不在下での細菌の急激な成長は骨芽細胞に損傷を与えると考えられたためである。
【００８２】
２４時間のインキュベーション後、細胞培養物の上清１００μｌをＣａｓｏ寒天プレート（カゼインペプトン・大豆かすペプトンのブロス）上に直接（例えば、リファンピン、ホスホマイシン、リファンピン／ホスホマイシン、およびリフムピシン（ｒｉｆｍｐｉｃｉｎ）／ゲンタマイシンの場合）、または適切な希釈（例えば、ゲンタマイシンの場合は１：１００）の後で、筋状に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。１群当たり２つのウェルの上清を筋状に播種した。
【００８３】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【００８４】
上清のＣＦＵ（コロニー形成単位）を測定し、結果を図１に示す。
【００８５】
図１は、ＭＧ６３骨芽細胞培養物の上清中に位置する黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐのゲンタマイシンを除く異なる抗生物質に対する感受性を明確に示す。用いた濃度は、この黄色ブドウ球菌株について定量されたＭＩＣ値（最小発育阻止濃度）と比較して高かったが、この抗生物質治療では細菌を完全には除去できなかった。このことは、細菌が細胞または細胞培養プラスチックの表面上に定着し、その結果抗生物質に対する感受性が低下した事実によるものである。これにより、ブドウ球菌が細胞外マトリックスおよび異物に容易に結合するｉｎ ｖｉｖｏでの状況が模擬的に再現される。リファンピン、ホスホマイシン、およびリファンピン／ゲンタマイシンの組合せの効果は中程度であるが、リファンピン／ホスホマイシンの組合せは強力で相乗的な効果を示す。
【００８６】
１．２．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（ＢＡＡ４４）に感染したＭＧ６３骨芽細胞の細胞外感染症の治療のためのリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４、複数の抗生物質に対する追加的な耐性を有するＭＲＳＡ株に感染したＭＧ６３骨芽細胞の感染についての実験手順は、前述のものと基本的に同じであった。
【００８７】
以下の抗生物質を使用した：
− １００μｇ／ｍｌのバンコマイシン
− １０μｇ／ｍｌのリファンピン
− １００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− １０μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− １０μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのバンコマイシン。
【００８８】
２４時間のインキュベーション後、細胞培養物１００μｌをＣａｓｏ寒天プレート（カゼインペプトン・大豆かすペプトンのブロス）上に、直接（例えば、バンコマイシン、リファンピン／ホスホマイシン、およびリファンピン／バンコマイシンの場合）、または適切な希釈（例えば、リファンピンおよびホスホマイシンの場合は１：１００）の後で、筋状に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。１群当たり２つのウェルの上清を筋状に播種した。
【００８９】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【００９０】
上清のＣＦＵ（コロニー形成単位）を測定し、結果を図２に示す。
【００９１】
図２は、ＭＧ６３骨芽細胞培養物の上清中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の、異なる抗生物質に対する感受性を明確に示す。ＣＦＵ値を対数値に変える必要があったことが注目される。
【００９２】
用いた濃度でのリファンピンは、予想どおりほとんど有効性を示さないが、これは黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４がリファンピン耐性株であるためである。ホスホマイシンの抗生物質効果も比較的小さい。しかし、リファンピン／ホスホマイシンの組合せは、細胞外の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に対する強力で相乗的な効果を示し、このことは単一の化合物の効果が弱いことから、驚きであり、予想外であった。
【００９３】
リファンピン／ホスホマイシンの組合せの効果は、ＭＲＳＡ感染症の治療にとって最も重要な抗生物質の１つであるバンコマイシンの効果よりわずかに良好ですらある。バンコマイシンとリファンピンとの組合せもわずかな相乗効果を示す。この実験において用いたバンコマイシンの濃度は非常に高かったため、そうしなければ弱いバンコマイシンの殺菌効果が高まったことに留意すべきである。１００μｇ／ｍｌというバンコマイシンの濃度は、静脈内施用では達成できない。
【００９４】
２．細胞内感染症の治療のための、異なる抗生物質、すなわちリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
２．１．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス・ローゼンバッハ（ＡＴＴＣ６５３８Ｐ）に感染した骨芽細胞ＭＧ６３の細胞内感染症の治療のための、異なる抗生物質、すなわちリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染したＭＧ６３骨芽細胞の細胞内感染の定量についての実験手順は、前述のものと本質的に同じであった。
【００９５】
ただし、細胞外の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐを排除するために、感染後、抗生物質を加える前に、各細胞培養物をリゾスタフィンで処理した。
【００９６】
この目的のため、各ウェルから細菌懸濁液を除去し、１０％ＦＣＳを含有する温ＤＭＥＭで細胞を１回洗浄した。２５μｇ／ｍｌのリゾスタフィン溶液２５０μｌを各ウェルに加えた。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、細胞外の細菌は顕微鏡で一切観察できなかった。リゾスタフィン溶液を完全に除去してから、細胞を温ＤＭＥＭ１ｍｌで１回洗浄した。その後、以下の組成を有する抗生物質溶液を加えた：
− １００μｇ／ｍｌのバンコマイシン
− １００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
− ０．０１〜１００μｇ／ｍｌのリファンピン
− １０〜１０００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− １μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− １μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
− １〜１００μｇ／ｍｌのモキシフロキサシン。
【００９７】
感染細胞を、ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて２４時間インキュベートした。
【００９８】
感染後のＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を定量するために、細胞の上清を除去してから、細胞培養用の新鮮な温培地１ｍｌを各ウェルに加えた。その後、２００μｌのＭＴＴ溶液（３［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェナル（ｄｉｐｈｅｎａｌ）テトラゾリウムブロミド）を各ウェルに加えた。この培養物を５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて２時間インキュベートした。細胞培養物の上清を除去してから、ホルマザン（代謝活性により形成された）をイソプロパノール１ｍｌで可溶化した。各懸濁液２００μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移して、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて５４０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００９９】
５４０ｎｍでの吸光度はＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性の指標である。ＭＧ６３骨芽細胞中の細胞毒性黄色ブドウ球菌株ＡＴＴＣ６５３８Ｐが細胞内で繁殖すると、結果として感染細胞は死ぬ。吸光度が低いほど細胞の代謝活性が低く、したがって細胞の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐへの感染が強い。
【０１００】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１０１】
図３ａ〜ｄは、異なる抗生物質がＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性に及ぼす影響を示すものである。
【０１０２】
バンコマイシンは、細胞中に透過できないため、骨芽細胞内部の黄色ブドウ球菌の細胞内繁殖に影響を及ぼさない。したがって、骨芽細胞の代謝活性は黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染することにより強力に低下する（図３ａ〜ｄ）。同じことがゲンタマイシンにも当てはまる。それにもかかわらず、ゲンタマイシンとリファンピンとの組合せにおいては、代謝活性はリファンピン単独の場合より高かった（データは示していない）。
【０１０３】
これに対し、リファンピンは黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐが原因で生じる細胞死を大幅に減らすことができる（図３ａ）。低濃度（０．００６μｇ／ｍｌ）でもすでに代謝活性を高める上で十分である。
【０１０４】
ホスホマイシンも、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの細胞内繁殖、ひいては感染した骨芽細胞の代謝活性に影響を及ぼす（図３ｂ）。１０μｇ／ｍｌのホスホマイシンは代謝活性をわずかに高めるのみであり、それにより１００μｇ／ｍｌは最大限の効果を有し、代謝活性はほぼ２倍となった。この結果は驚くべきものであるが、それはホスホマイシンが細胞中に透過できることはこれまで知られていなかったからである。ホスホマイシンは好中球中に透過できることが知られているにすぎない。
【０１０５】
リファンピンとホスホマイシンとの組合せも代謝活性の向上をもたらし（図３ｄ）、相乗効果すら示す（図３ｃ）。
【０１０６】
１から１００μｇ／ｍｌのモキシフロキサシンの施用も、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの細胞内成長を阻害し、それにより代謝活性を２倍を超えるまで高めることができる（図３ｅ）。
【０１０７】
２．２．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（ＢＡＡ４４）に感染した骨芽細胞ＭＧ６３の細胞内感染症の治療のための、リファンピン、ホスホマイシンまたはその組合せの使用
黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に感染したＭＧ６３骨芽細胞の細胞内感染の定量についての実験手順は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐについて前述したものと本質的に同じであった。
【０１０８】
非細胞毒性黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４は骨芽細胞中で存続し、細胞毒性株の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐとは異なり細胞内で分裂しないので、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４が細胞内に局在しても骨芽細胞の細胞死を招く結果にならない。したがって、ＭＧ６３骨芽細胞の、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への細胞内感染を細胞の代謝活性に基づいて定量することはできず、代わりに細胞溶解および細胞内ＣＦＵの計数により定量した。
【０１０９】
以下の組成を有する抗生物質溶液を加えた：
− １００μｇ／ｍｌのバンコマイシン
− ２．５〜４０μｇ／ｍｌのリファンピン
− ２５〜４００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− および、追って記載の異なる比率でのその混合物。
【０１１０】
感染細胞を、抗生物質（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃｓ）と共に５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて２４時間インキュベートした。
【０１１１】
その後、この細胞をｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝液）で１回洗浄してから、リンゲル液中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ １ｍｌで溶解させる。この溶菌液を５分間超音波処理した。溶菌液はピペットを用いて徹底的に再懸濁させる。２４ウェルのプレート１つのみを扱い、他のプレートは溶菌液中での細菌の成長を最小限にするために４℃で保管した。溶菌液１００μｌを希釈せずにＣａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種し、３７℃で一晩インキュベートしてからコロニーを計数した。
【０１１２】
図４ａ〜４ｇは、ＭＧ６３骨芽細胞の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への細胞内感染の程度についての指標としての、１ウェル当たりのＣＦＵ値を示すものである。ＣＦＵ値が低いほど、骨芽細胞の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への感染率が低い。このことは、添加した抗生物質の有効性と相関する。黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の細胞内成長力が弱いため、抗生物質の殺菌（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｉａｌ）効果によりＣＦＵは減少する。
【０１１３】
５０〜４００μｇ／ｍｌの間の濃度のホスホマイシンは、細胞内に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への感染率に対する良好な有効性を示す（図４ａ）。驚くべきことに、ホスホマイシンの効果は静脈内施用が可能な濃度（血清中で１００〜４００μｇ／ｍｌ、好ましくは１３２〜２９７μｇ／ｍｌ）で達成できる。そのすぐれた組織浸透性から、高いホスホマイシン濃度は骨中でも達成される。したがって、ホスホマイシンは骨髄炎の治療において首尾よく施用される。
【０１１４】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１１５】
黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４はリファンピン耐性株であるが（Ａｔｈｏｕｇｈ）、リファンピンは良好な細胞内効力を示す（図４ｂ）。
【０１１６】
リファンピンおよびホスホマイシンは、さまざまな濃度比率において相乗効果を明確に示す（図４ｃ〜ｇ）。
【０１１７】
リファンピン耐性黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の場合においてさえ、施用された濃度は骨感染症の全身治療を可能にするために十分満足なものであった。したがって、リファマイシンとホスホマイシンとの組合せは、骨髄炎の治療に適しており、全身施用することもできる。
【０１１８】
３．医療用基質の表面上での抗付着薬としての、リファンピンとホスホマイシンとの組合せの使用
３．１．リファンピンおよびホスホマイシンでコーティングしたチタン基質上での黄色ブドウ球菌亜種アウレウス・ローゼンバッハ（ＡＴＴＣ６５３８Ｐ）の付着
Ｃａｓｏ−Ｂｏｕｉｌｌｏｎ培地５ｍｌを黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させることにより、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの一晩培養物を調製した。この培養物を、３７℃で一晩、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。一晩培養物１００μｌをＣａｓｏ Ｂｏｕｌｉｌｌｏｎ培地５ｍｌ中に移し、３７℃で２時間、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。細菌密度を測光法で定量した。測定に先立ち、細菌懸濁液をＣａｓｏ Ｂｏｕｉｌｌｏｎ中で１：２で希釈した。付着実験用に、１０％ＦＣＳを添加したＣａｓｏ Ｂｏｕｌｌｉｏｎ中の１×１０5ＣＦＵ／ｍｌの密度の細菌懸濁液を使用した。
【０１１９】
異なる方式でコーティングした２ｃｍのチタンディスクを試料として使用した：
− 陰性対照として、サンドブラスト加工したチタンディスク、
− サンドブラスト加工の上２００μｇ／ｃｍ2のバンコマイシンでコーティングしたチタンディスク、
− ５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンおよび２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムで同時にコーティングしたチタンディスク、
− 第１のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンで、第２のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムでコーティングしたチタンディスク、および
− 第１のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムで、第２のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンでコーティングしたチタンディスク。
【０１２０】
コーティング後、チタンディスクをＰＢＳで１回または３回洗浄した。コーティングした、およびコーティングしていないチタンディスクを、ＰＢＳ５ｍｌと共に室温で５分間インキュベートした。これをさらに２回繰り返した。３回目のサークルではチタンディスクを室温で１時間インキュベートした。抗生物質の剥離量を増やすため、ＰＢＳ溶液を除去する前にチタンディスクを裏返すかまたは回転させた。その後、滅菌済みの１２ウェルのプレート中にチタンディスクを移した。
【０１２１】
異なるチタン試料を、細菌懸濁液２ｍｌと共に３７℃で１．５時間、振盪せずにインキュベートした。
【０１２２】
その後、細菌懸濁液を除去し、ＰＢＳ２．５ｍｌでディスクを３回洗浄した。最後の洗浄サイクルの後、滅菌済みのリンゲル液１０ｍｌ中に各ディスクを入れた。各群の１枚のみのディスクを同時に試験し、他のディスクは４℃で保管した。付着した細菌を剥離するためにリンゲル液中のチタンディスクに超音波を１０分間あてた。剥離された細菌を含む懸濁液を希釈し（１：１０、１：１００）、Ｃａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種した。寒天プレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日コロニーを計数した。
【０１２３】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１２４】
図５ａは、細菌と共に１．５時間インキュベーションした後のチタンディスク１枚当たりの黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８ＰのＣＦＵを示すものである。バンコマイシンは、１回の洗浄ステップ後には抗付着効果のみを有したが、３回の洗浄ステップ後には抗付着効果は一切明らかにならなかった。事実、バンコマイシンでコーティングしたディスクに付着した黄色ブドウ球菌細胞の数は、コーティングされていないディスクと同等であった。しかしながら、リファンピンとホスホマイシンとの組合せは、強力な抗付着効果を示した。この効果は洗浄ステップの数にほんのわずか依存した。リファンピン／ホスホマイシンでのコーティングは、バンコマイシンと比較した場合、数回の洗浄ステップによりチタン表面から完全には除去されにくいことが明らかであった。
【０１２５】
リファンピンおよびホスホマイシンでディスクをコーティングする順序（一緒に、最初にリファンピン、次にホスホマイシン；最初にホスホマイシン、次にリファンピン）は、この効果に影響しないようである（図５ａ）。
【０１２６】
３．２．リファンピンとホスホマイシンとの組合せでコーティングしたチタン基質上でのスタフィロコックス・エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＡＴＴＣ３５９８４の付着
実験手順は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐについて前述したものと本質的に同じであった。
【０１２７】
異なる方式でコーティングした２ｃｍのチタンディスクを試料として使用した：
− 陰性対照としてのチタンディスク（サンドブラスト加工してある）、
− 第１のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンで、第２のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムでコーティングしたチタンディスク、および
− 第１のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムで、第２のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンでコーティングしたチタンディスク。
【０１２８】
コーティングしたチタンディスクを、Ｓ．エピデルミスと共にインキュベーションする前にＰＢＳ５ｍｌで３回洗浄した。
【０１２９】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１３０】
Ｓ．エピデルミスについての実験結果（図５ｂ）は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの場合において見出された結果を支持する。コーティングされていないチタン上へのＳ．エピデルミスＡＴＴＣ３５９８４の付着量は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの付着量より少なかった。このことは、Ｓ．エピデルミスは、プラスチックまたはヒドロキシアパタイトに好んで付着するが、チタンへの付着量はそれより少ないという事実に関連する可能性がある。チタンディスクは細菌と共にインキュベーションする前に３回洗浄したが、リファンピンとホスホマイシンとの組合せは強力な抗付着効果を示す。
【０１３１】
３．３．リファンピンとホスホマイシンとの組合せでコーティングしたチタン基質上での黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の付着
実験手順は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐについて前述したものと本質的に同じであった。
【０１３２】
以下のコーティングした２ｃｍのチタンディスクを、試料として使用した：
− 陰性対照としてのサンドブラスト加工したチタンディスク、
− ２００μｇ／ｃｍ2のバンコマイシンでコーティングしたチタンディスク、
− サンドブラスト加工の上、第１のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンで、第２のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムでコーティングしたチタンディスク。
【０１３３】
コーティングしたチタンディスクを、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４と共に１．５時間インキュベーションする前に、ＰＢＳ５ｍｌで１回または２回洗浄した。
【０１３４】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１３５】
図５ｃは、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４と共にインキュベーションした後のディスク上のＣＦＵを示すものである。バンコマイシンは、ディスクを１回洗浄した場合にのみ黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の付着を減少させた。すなわち、２回の洗浄ステップ後はすべてのバンコマイシンが除去されたようであり、細菌の付着の減少は観察できなかった。黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のリファンピン耐性にもかかわらず、リファンピン／ホスホマイシンの組合せは強力な抗付着薬効果を有したが、この効果は細菌と共にインキュベーションする前にディスクを１回ではなく２回洗浄した場合にはほんのわずか低下した。
【０１３６】
３．４．リファンピンおよびホスホマイシンでコーティングしたチタン基質の、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に対する殺菌活性
Ｃａｓｏ―Ｂｏｕｉｌｌｏｎ培地５ｍｌを黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に感染させることにより、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の一晩培養物を調製した。この培養物を、３７℃で一晩、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。チタンディスクと共にインキュベーションする前に、一晩培養物１００μｌをＣａｓｏ Ｂｏｕｌｉｌｌｏｎ培地５ｍｌ中に移し、３７℃で２時間、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。細菌密度を測光法で定量した。
【０１３７】
付着アッセイでは、最少培地（ＰＢＳ、０．２％塩化アンモニウム、０．２％硫酸ナトリウム、０．２５％グルコース、１％Ｃａｓｏ Ｂｏｕｉｌｌｏｎ、５０μｇ／ｍｌのグルコース−６−ホスホネート）中の密度が１×１０4ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液を使用した。最少培地は、細菌の成長を最小限にするため、Ｃａｓｏ Ｂｏｕｉｌｌｏｎの代わりに使用した。
【０１３８】
異なる方式でコーティングした２ｃｍのチタンディスクを試料として使用した：
− 陰性対照としてのチタンディスク（サンドブラスト加工してある）、
− ２００μｇ／ｃｍ2のバンコマイシンでコーティングしたチタンディスク（サンドブラスト加工してある）、
− 第１のステップでは３００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムで、第２のステップでは７０μｇ／ｃｍ2のリファンピンでコーティングしたチタンディスク。
【０１３９】
コーティング後、室温のＰＢＳ２．５ｍｌでチタンディスクを３回洗浄した。
【０１４０】
異なるチタン試料を、細菌懸濁液２ｍｌと共に３７℃で１５．５時間、振盪せずにインキュベートした。
【０１４１】
その後、上清中のＣＦＵ、ならびにチタンディスク上の付着細菌を分析した。上清はＰＢＳ中で１：１０で希釈し、この希釈液１００μｌをＣａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種した。ディスクをＰＢＳ２．５ｍｌで４回洗浄して、付着していない（ｎｏｔ ａｄｈｅｒｅｎｔ）細菌を除去した。最後の洗浄サイクルの後、滅菌済みのリンゲル液１０ｍｌ中に各ディスクを入れた。各群の１枚のみのディスクを同時に試験し、他のディスクは４℃で保管した。付着細菌を剥離するために、リンゲル液中のチタンディスクに１０分間超音波をあてた。剥離した細菌を含む懸濁液を希釈し（１：１０、１：１００、１：１０００）、Ｃａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種した。寒天プレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日コロニーを計数した。
【０１４２】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１４３】
結果を図５ｄに示す。陰性対照中での細菌の成長は、最少培地を使用することにより減ったが、それにもかかわらず、上清中の細菌のＣＦＵはインキュベーション期間中に１０倍増加した。驚くべきことに、コーティングされていないディスクに付着した分のＣＦＵは上清中より高いことを見出すことができた。
【０１４４】
バンコマイシンは、コーティングされていない対照と比較して、細胞培養物の上清中での細菌の成長をわずかに低下させたが、細菌の付着はそれよりさらに大きく減少した。しかしながら、バンコマイシンは、殺菌効果を一切呈することができず、バンコマイシンでコーティングしたチタン試料上では５０，０００を超えるＣＦＵを見出すことができた。
【０１４５】
チタンディスクは付着アッセイ前に３回洗浄したが、ホスホマイシン／リファンピンの組合せは、リファンピン耐性株ＢＡＡ４４に対し明らかな殺菌活性を示した。上清中ではＣＦＵは検出できず、チタン表面に付着したのは１００ＣＦＵ未満であった。これは、コーティングされていないチタンと比較した場合の細菌の付着量では８６，０００倍の減少、およびバンコマイシンでのコーティングと比較した場合の４７０倍の減少に相当する。
【０１４６】
担体マトリックス（例えばポリマーマトリックス）を有さない可溶性の抗生物質コーティングは、埋込み後に組織液中に溶解させることによりその有効性が発揮されるようになることが期待された。溶解した抗生物質の有効性により定着して細菌の繁殖が減る前にプランクトン性の細菌を殺すことにより、この場合は、インプラントまたは人工器官への定着が妨げられる。数回の洗浄ステップ後にディスク上に残った、したがって上清中で入手できるリファンピンおよびホスホマイシンの量は、上清中で抗細菌の有効性を示すには依然として十分多かった。したがって、リファンピン／ホスホマイシンでのコーティングは十分安定であるため、埋込み中に組織液および血液と接触させることができ、インプラント表面および周囲組織への細菌の付着を防止する上で依然として有効である。この特性は、ブドウ球菌感染症にとって特に重要であるが、その理由は、ブドウ球菌はインプラントに専ら付着するのではなく、組織の細胞外マトリックスにも付着するからである。
【０１４７】
４．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（ＢＡＡ４４）への骨芽細胞ＭＧ６３細胞の急性感染症の治療のためのリファンピンおよびダプトマイシンまたはその組合せの使用
感染の２４時間前に、細胞剥離用媒体のＡｃｃｕｔａｓｅを用いてＭＧ６３骨芽細胞を剥離した。Ｎｅｕｂａｕｅｒ計算盤を用いて細胞数を定量した。コーティングされていない２４ウェルのプレート上に、１．５×１０4細胞／ｃｍ2の細胞密度で、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉおよび１％Ｎａｔｒｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔを添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）１ｍｌ中に細胞を播種し、３７℃および５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。
【０１４８】
Ｃａｓｏ−Ｂｏｕｉｌｌｏｎ培地５ｍｌを黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に感染させることにより、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の一晩培養物を調製した。この培養物を、３７℃で一晩、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。感染に先立ち、一晩培養物１００μｌをＣａｓｏ Ｂｏｕｌｉｌｌｏｎ培地５ｍｌ中に移し、３７℃で２時間、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。
【０１４９】
ＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清を、ピペットを用いてウェルから除去した。１×１０6の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４ＣＦＵを含有する１ｍｌを、以下の組成を有する抗生物質も含有する各ウェルに加えた。
【０１５０】
− ５０μｇ／ｍｌのバンコマイシン
− ２．５μｇ／ｍｌのリファンピン
− １．２５〜１０μｇ／ｍｌのダプトマイシン
− および、追って記載の異なる比率でのその混合物。
【０１５１】
骨芽細胞、細菌および抗生物質組成物を合わせたものを、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて１８時間インキュベートした。
【０１５２】
その後、この細胞をｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝液）で１回洗浄してから、リンゲル液中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ １ｍｌで溶解させる。この溶菌液を、ピペットを用いて徹底的に再懸濁させた。２４ウェルのプレート１つのみを扱い、他のプレートは溶菌液中での細菌の成長を最小限にするために４℃で保管した。溶菌液をＰＢＳ中で１：１０で希釈し、希釈した溶菌液１００μｌをＣａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種し、３７℃で一晩インキュベートしてから、コロニーを計数した。
【０１５３】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１５４】
細胞は感染後にリゾスタフィンで処理しなかったので、１ウェル当たりのＣＦＵ値（図６）は、ＭＧ６３骨芽細胞の、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への細胞内感染の程度についての、ならびにＭＧ６３骨芽細胞に細胞外付着した黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４についての指標である。ＣＦＵ値が低いほど、骨芽細胞の、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への感染率が低い。このことは添加した抗生物質の有効性と相関する。
【０１５５】
菌株はリファンピン耐性であるため、リファンピン２．５μｇの効果はバンコマイシンおよびダプトマイシンの場合より低かったが、プランクトン性の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に感染したＭＧ６３細胞の過成長は有効に防止された（データには示していない）。
【０１５６】
ダプトマイシン単独は、１．２５μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌの濃度ですでに良好な有効性を示したが、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌでは感染症を完全に根絶できた。
【０１５７】
リファンピン単独の無効性にもかかわらず、２．５μｇ／ｍｌのリファンピンと１．２５μｇ／ｍｌまたは２．５μｇ／ｍｌのダプトマイシンとの組合せは、細胞内および細胞外に付着したすべての細菌の排除においてそれぞれ相乗的であった。
【０１５８】
バンコマイシンは弱い殺菌性しかもたないことから、その有効性を高めるためにこの実験では非常に高濃度のバンコマイシンを使用した。この濃度は、バンコマイシンの静脈内施用によっては絶対に達成できない。ところが、数百の黄色ブドウ球菌が、骨芽細胞に侵入することによりバンコイミシン（ｖａｎｃｏｙｍｉｃｉｎ）を逃れることができたが、これは、ｉｎ ｖｉｖｏでの（特に骨感染症の治療において）関連性を有する現象である。
【０１５９】
ダプトマイシンは、バンコマイシンのような糖ペプチドとは対照的に殺菌速度が速く、この殺菌活性は濃度依存性である。したがって、より高い５および１０μｇ／ｍｌの濃度は、細菌が骨芽細胞に侵入できる前にすべての細菌を排除できた。
【０１６０】
リファンピンおよびダプトマイシンの局所施用は、急性の骨感染症にとっての効率的な治療である可能性があると考えられる。ダプトマイシンは、高濃度で非常に効率的にすべての細胞外の細菌を排除することにより新しい骨芽細胞の感染を防止するが、リファンピンは、細胞内感染した骨芽細胞を根絶することが可能である。
【０１６１】
５．医療目的用の、コーティングまたは浸透加工を施した基質
３０〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度のメタノール中でリファンピンを希釈した。１００〜１４０μｇ／ｍｌの濃度の超純水中でホスホマイシンカルシウムを懸濁させた。さらなる添加物は用いなかった。異なる表面改変（サンドブラスト加工した、多孔質でコーティングが施された、またはヒドロキシアパタイトでコーティングした）が施されたチタン製の内部人工器官を、インクジェット式またはスプレー式のコーティング過程を用いて、抗生物質溶液で直接コーティングした。表面を最初にリファンピンで、次いでホスホマイシンカルシウムで、その逆で、または両方の抗生物質を同時に、コーティングしてもよい。その結果得られる被覆密度は、リファンピンが５０〜７０μｇ／ｃｍ2、ホスホマイシンが３００〜３５０μｇ／ｃｍ2であった。
【０１６２】
リファンピン、ホスホマイシン二ナトリウムおよびホスホマイシンカルシウムを、コラーゲンフリース中にフリースの作製過程の間に組み込んだ。リファンピンおよびホスホマイシン二ナトリウムは、酸性化した緩衝液中に加えて溶解させ、ホスホマイシンカルシウムは薄い懸濁液中に加えた。最終濃度は、コラーゲンフリース１ｃｍ2当たりリファンピンが０．１〜０．２ｍｇ、コラーゲンフリース１ｃｍ2当たりホスホマイシンが０．５ｍｇ〜２ｍｇであり、これに対しホスホマイシン二ナトリウムおよびホスホマイシンカルシウムは、さまざまな比率で、ホスホマイシンの最終濃度に寄与できた。
【０１６３】
リファンピンおよびホスホマイシン二ナトリウムを、ＰＭＭＡベースの２つの異なるポリマー、ジルコニウムジオキシド（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ ｄｉｏｘｉｄ）およびグリシンと混合した。リファンピンは総重量の０．５〜１．５％の量で加え、ホスホマイシン二ナトリウムは総重量の２．５〜７．５％の量で加えた。このポリマー／抗生物質混合物を１６０〜１８０℃に加熱し、射出成型により、金属ワイヤー上で直接ＰＭＭＡビーズを製造した。
【０１６４】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１６５】
本発明の実践の多数の改変および変形は、前述の教示に照らせば可能であることから、以下の特許請求の範囲に記載の範囲内に属すると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、請求項１のプリアンブル（ｐｒｅａｍｂｌｅ）による医薬組成物、請求項１１のプリアンブルによる医薬組成物、請求項１６による微生物に細胞外および／または細胞内感染した細胞の治療用の医薬組成物、ならびに請求項２２のプリアンブルによる医薬組成物を含む基質の使用に関する。本発明はさらに、請求項２７による表面上の微生物に対する抗付着薬（ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｖｅ）としての抗生物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨および組織の感染症は、整形外科および外科の最も深刻な問題であり、手術の頻度の増加が原因である場合はとりわけ深刻である。骨感染症全体の３０％は、治療しても慢性となる。さらに、以前の治療が成功したと思われた後に感染症が再発する多くの症例が知られている。全症例の３％においては、残る選択肢は切断術のみである。抗生物質を用いた全身治療は難しいが、それは、抗生物質は一般に非常にわずかしか骨を透過しないため、感染症を排除するための十分に高い濃度を達成することはほとんど不可能だからである。
【０００３】
骨および他の組織の感染症の療法については、抗生物質の全身療法より抗生物質の局所施用の方が適しているが、それは、局所施用では、全身施用の場合より高い濃度の抗生物質が治療部位で達成できるからである。抗生物質による局所療法が成功するための必要条件は、すべての骨または組織の壊死部の病巣清掃術およびすべての異物の除去など、前もって行われる外科的な根治療法である。従来技術から知られる局所用の抗生物質担体は、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）で作製された骨セメント、ＰＭＭＡで作製されたビーズ、コラーゲンフリースおよび骨置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）である。このような担体は市販されているが、それらに施用されている抗生物質の数は以下のとおり限られている：ゲンタマイシン、トブラマイシン、クリンダマイシン、バンコマイシンおよびテイコプラニン。
【０００４】
前述の抗生物質を用いる抗生物質による局所療法には、骨および関節の感染症についての改善された治療法がすでにあるものの、そのような療法は、相当な数の症例（１６％に及ぶ）において失敗している。しかし、療法が失敗すると、最終的には切断術が必要になることが多い。
【０００５】
療法の失敗の主な理由は、ａ）特定の抗生物質に対する耐性、ｂ）固着性の細菌に対する抗生物質の無効性、ｃ）細胞内に局在する細菌およびｄ）小型コロニー変種の誘発である。ここで言う、項目ｂ）による無効性は、バイオフィルムが形成されて排除すべき細菌の増殖が休止することが原因である。さらに、ここで言う細胞内の、とは、宿主の、すなわち治療すべき対象の細胞のことと理解されたい。したがって、細菌が宿主の細胞内部に存在すれば、細胞の内側にあるものに浸透できない抗生物質は、排除すべき細菌に対して作用できない。
【０００６】
以前から、ブドウ球菌は白血球内部で生存できることが知られていた。さらに、いわゆる小型コロニー変種表現型を示す黄色ブドウ球菌株は、ケラチン生成細胞および内皮細胞により取り込まれることができ、細胞内に存続できることが知られている。こうした菌株は、細胞内にリソソーム内部でとどまることが実証された。さらに、普通の表現型の黄色ブドウ球菌も、内皮細胞、線維芽細胞およびケラチン生成細胞によって取り込まれることができ、細胞内にリソソーム内部でとどまることができる。
【０００７】
黄色ブドウ球菌の単離株は、対立する２つの性質を示すことが実証された。すなわち、細胞毒性株がケラチン生成細胞および線維芽細胞中で生存し、細胞内で分裂することによりその宿主細胞に対し顕著な細胞毒性を引き起こすのに対し、非細胞毒性株はケラチン生成細胞および線維芽細胞の内部で殺されることから、黄色ブドウ球菌の取込みは細胞自律的な宿主防御の重要な機序を表すことが示唆される（Krut, O.ら、Infection and Immunity、2003、71、2716〜2723）。
【０００８】
黄色ブドウ球菌は、骨芽細胞によっても取り込まれることがあるが、骨芽細胞は、取り込んだ非細胞毒性のブドウ球菌を殺すことができず、代わりにこうした菌は、数日、数週間にわたり骨芽細胞内部で増殖せずに存続できる。骨芽細胞の溶解後、ブドウ球菌は再度増殖できる。骨芽細胞において、ブドウ球菌および場合によっては他の細菌が細胞内で存続すること、ならびに、細胞内にリソソーム内部で存続するその潜在能力は、骨感染症に注目した場合、格別な役割を果たすと考えられる。これが骨感染症の慢性進行の原因ではないかと考えられる。
【０００９】
シュードモナス菌、レンサ球菌および腸球菌が骨芽細胞中で存続できるかどうか依然として正確には知られていないが、これらの細菌が細胞内で存続することは普通に見ることができた。こうした細胞内での存続は、今までは、おそらく他の疾患の慢性進行と関連があると考えられていたにすぎなかったが、シュードモナス菌、レンサ球菌および腸球菌は骨感染症に関する病原である場合が多いことから、それらが細胞内で存続することが、骨感染症の慢性進行の原因である可能性がある。
【００１０】
首尾よく治療されたと思われた骨感染症が数年後であっても再発することがある理由は、この仮定に基づいて説明できる。宿主細胞内部では、細菌は、細胞膜を透過できない多数の抗生物質（例えばペニシリン、糖ペプチド）に対して保護される。プランクトン性（ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ）（浮遊性）の細菌により誘発されている急性感染症は、このような抗生物質で治療できる可能性があるものの、細菌は、細胞内にとどまり、宿主細胞からの放出後に再感染を引き起こすことがある。
【００１１】
従来技術では、骨および軟部組織の感染症は、主にアミノグリコシド（ゲンタマイシン、トブラマイシン）で局所治療されるが、このような薬物は宿主細胞の細胞膜を通常は透過できない。一方、アミノグリコシドは線維芽細胞のリソソーム中で蓄積できるが、リソソームが低ｐＨであることから不活性であることが報告された。
【００１２】
したがって、骨および他の組織の感染症の局所療法のために従来技術で使用される抗生物質は、このようなすべての感染症を首尾よく治療するには適さない。とりわけ、ゲンタマイシンのみを含有する局所用の抗生物質担体は、小型コロニー変種表現型を示す細菌の感染症に対しては効果がなく、小型コロニー変種表現型の形成を誘発する恐れすらある。感染症の局所療法のために現時点で使用される抗生物質のいずれも、細胞内に局在する細菌を排除できない。
【００１３】
ＷＯ２００６／０６４５１７（特許文献１）では、細菌のタンパク質合成を阻害する第１の抗生物質と、細菌のタンパク質合成を阻害しない第２の抗生物質と、を含む抗生物質組成物が開示されている。
【００１４】
ＵＳ５，２１７，４９３（特許文献２）では、バイオフィルムの定着を防ぐために、リファンピンおよびノボビオシンで、またはリファンピンおよびミノサイクリンでコーティングした埋込み可能な医療器具が開示されている。
【００１５】
一実施形態を考慮すれば、細胞（特に組織細胞）の細胞外および細胞内感染症を治療および防止するための医薬組成物、そのような組成物を担持する基質、ならびにそのような組成物および基質を施用する方法を提供することが可能である。
【００１６】
異なる基質表面上での微生物の付着率を低下させることがさらに可能である。
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【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００６／０６４５１７号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５２１７４９３号明細書
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清中の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８ＰのＣＦＵを示すグラフである。
【図２】ＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清中の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図３ａ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清にリファンピンを加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図３ｂ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清にホスホマイシンを加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図３ｃ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清にホスホマイシン、リファンピンおよびその組合せを加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図３ｄ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清に１０μｇ／ｍｌのホスホマイシンと０．００６〜０．００７５μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図３ｅ】黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させ、次いで、細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置してから細胞培養物の上清にモキシフロキサシンを加えた後の、ＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を示すグラフである。 組織感染症の局所治療および防止のための医薬または医療器具を製造するための医薬組成物が、請求項１の主題である。
【図４ａ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清にホスホマイシンを加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｂ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清にリファンピンを加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｃ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、５０μｇ／ｍｌのホスホマイシンと２．５〜４０μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｄ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、２５〜４００μｇ／ｍｌのホスホマイシンと２．５μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｅ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、ホスホマイシン、リファンピン、および、５０μｇ／ｍｌのホスホマイシンと１０μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｆ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、ホスホマイシン、リファンピン、および、２５μｇ／ｍｌのホスホマイシンと２．５μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図４ｇ】細胞外の細菌を除去するためにリゾスタフィンで処置した後のＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清に、ホスホマイシン、リファンピン、および、５０μｇ／ｍｌのホスホマイシンと２０μｇ／ｍｌのリファンピンとを含有する混合物を加えた後に、ＭＧ６３骨芽細胞中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図５ａ】バンコマイシンまたはリファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスク（ディスクは、インキュベーション前に１回または３回のいずれかの回数、洗浄した）上で黄色ブドウ球菌を１．５時間インキュベーションした後の、チタンディスク１枚当たりの黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８ＰのＣＦＵを示すグラフである。
【図５ｂ】リファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスク（ディスクは、インキュベーション前に２回洗浄した）上でＳ．エピデルミス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）と共に２時間インキュベーションした後の、チタンディスク１枚当たりの表皮ブドウ球菌ＡＴＴＣ３５９８４のＣＦＵを示すグラフである。
【図５ｃ】バンコマイシンまたはリファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスク（ディスクは、インキュベーション前に１回または２回のいずれかの回数、洗浄した）上で黄色ブドウ球菌を１．５時間インキュベーションした後の、チタンディスク１枚当たりの黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図５ｄ】最少培地中に入れた、バンコマイシンまたはリファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスクと共に黄色ブドウ球菌を一晩インキュベーションした後の、チタンディスク上または上清中の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【図６】最少培地中に入れた、バンコマイシンまたはリファンピン／ホスホマイシンでコーティングしたチタンディスクと共に黄色ブドウ球菌を一晩インキュベーションした後の、チタンディスク上または上清中の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のＣＦＵを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一実施形態では、局所治療および防止は感染部位で行われる。治療対象となる組織は、例えば軟部組織および／または骨組織（一般に「骨」と表されるものを含む）であってもよい。請求項１の特徴によれば、この医薬組成物は、Ａ群の少なくとも２つの異なる抗生物質もしくは薬学上許容されるその誘導体、またはＡ群の１つの抗生物質およびＢ群の少なくとも１つの抗生物質もしくは薬学上許容されるそのそれぞれの誘導体を含む。Ａ群は、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として、ギラーゼの阻害薬として、または細菌のタンパク質合成の阻害薬として働く細胞内活性型の抗生物質を主に含む。Ｂ群は、細菌の細胞壁合成の阻害薬として、もしくは細菌のタンパク質合成の阻害薬として働くか、または細菌の細胞壁を直接不安定化もしくは破壊する、細胞外活性型の抗生物質を主に含む。
【００２０】
本説明に関する場合、組織感染症は、微生物が原因で生じる組織細胞の細胞外および細胞内の感染症として理解される。
【００２１】
使用される抗生物質に対する耐性をとりわけ長期治療において回避するために、少なくとも２つの抗生物質の組合せを選択できる。そのような組合せは、結果としてより高い有効性ももたらす。細胞内活性型の抗生物質のみを使用することが一般に考慮できるが、細胞内活性型の抗生物質（Ａ群）と細胞外活性型の抗生物質（Ｂ群）との組合せを選択してもよい。Ｂ群の抗生物質は、細胞内で活性をもたなくても耐性の形成を阻害できるが、その理由は、Ｂ群の抗生物質は細胞外の細菌に対して殺菌の形で作用し、耐性は、細菌のうちプランクトン性の増殖性の個体群において形成されるだけだからである。Ｂ群の細胞外活性型の抗生物質はＡ群の抗生物質とは異なる作用機序を示すため、似たような耐性が生じる可能性はほとんどない。
【００２２】
使用対象となる医薬組成物は、それ自体が公知の添加物、分散剤、溶媒または担体物質などをさらに含んでもよい。
【００２３】
骨および他の組織の感染症を治療する上で良好な結果に到達するために、一実施形態では、選択される抗生物質の少なくとも１つは以下の基準の少なくとも１つを満たすべきである：
ａ）宿主細胞（すなわち、排除すべき細菌が内部に位置する、治療すべき対象の細胞）の細胞膜を透過すべきである
ｂ）宿主細胞のリソソーム内部に到達可能であるべきである
ｃ）低ｐＨで（とりわけ、リソソーム中の実際の低ｐＨ、すなわちおよそｐＨ４からｐＨ５で）活性をもつべきである
ｄ）殺菌活性をもつべきである
ｅ）非増殖性の細菌に対してもその殺菌活性を示すべきである。
【００２４】
一実施形態では、選択される抗生物質の少なくとも１つは前述の複数の基準を満たす。別の実施形態では、これらの基準のすべての実現が達成される。さらに別の実施形態では、選択されるすべての抗生物質がすべての基準の実現を達成する。
【００２５】
一実施形態では、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として働くＡ群の前記抗生物質は、アンサマイシン、とりわけリファマイシンを含む。とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシン（ｒｉｆａｍｉｘｉｎ）を選択してもよい。リファンピンを含有する医薬組成物は、細胞内のブドウ球菌を排除する上でとりわけ適しており、この菌は当該医薬組成物の局所投与後３日以内に排除されることが示された。
【００２６】
さらなる一実施形態では、ギラーゼの阻害薬として働くＡ群の前記抗生物質は、フルオロキノロンを含む。フルオロキノロンであるモキシフロキサシンがとりわけ選択される。
【００２７】
一実施形態では、細菌のタンパク質合成の阻害薬として働くＡ群の前記抗生物質は、例えばキヌプリスチンまたはダルフォプリスチンのようなストレプトグラミンを含む。一実施形態では、キヌプリスチンとダルフォプリスチンとの組合せが使用される。使用対象となる医薬組成物は、各群の１つを超える抗生物質（およびＢ群の抗生物質が使用されない場合はＡ群の２つを超える抗生物質）を、したがって合計で２つを超える抗生物質を含有してもよいことに注目されたい。
【００２８】
一実施形態では、細菌の細胞壁合成の阻害薬として働くか、またはその細胞壁を直接不安定化および破壊するＢ群の前記抗生物質は、糖ペプチド、ホスホマイシンおよびポリペプチドを含む。一実施形態では、選択される糖ペプチドは、バンコマイシンおよびテイコプラニンである。同じまたは別の実施形態では、選択されるポリペプチドは、バシトラシン、ポリミキシンＢ、ならびに他のポリミキシンおよびダプトマイシンである。
【００２９】
一実施形態では、細菌のタンパク質合成の阻害薬として働くＢ群の前記抗生物質はアミノグリコシドを含む。この場合は、とりわけアルベカシンを選択してもよい。
【００３０】
使用対象となる例示的な医薬組成物は、リファマイシンおよびアミノグリコシドを含む。別の例示的な医薬組成物は、リファンピンおよびアルベカシンを含み、そのような組成物は、排除すべき病原菌の全範囲を本質的にカバーし、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはメチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ＭＲＳＥ）のような問題のある細菌に対して有効である。いずれの抗生物質も、非増殖性（静止している）細菌に対しても有効であり、温度に耐性がある（熱安定性である）ことから、このような抗生物質は、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）製の骨セメントに、ＰＭＭＡビーズチェーンに、および修正（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）手術用のスペーサーに加えることができる。
【００３１】
使用対象となる別の医薬組成物はリファマイシンおよびホスホマイシンを含む。さらに別の医薬組成物は、リファンピンおよびホスホマイシンを含み、そのような組成物も排除すべき病原菌の全範囲を本質的にカバーし、ＭＲＳＡおよびＭＲＳＥのような問題のある細菌に対しても有効である。ホスホマイシンは、ヒドロキシルアパタイトに可逆的に結合することにより、担体から放出された後でも他の抗生物質より長く骨中にとどまるというさらなる特性を有する。さらに、ホスホマイシンは、公知のものとしては最小の抗生物質であり、骨組織を通ってまたは骨組織中へ非常によく拡散または透過する。
【００３２】
使用対象となるさらなる医薬組成物は、リファマイシンおよびフルオロキノロンを含む。別の医薬組成物はリファンピンおよびモキシフロキサシンを含む。
【００３３】
１つの目的は、請求項１１による医薬組成物を提供することによっても取り組まれる。そのような医薬組成物は、感染部位での組織感染症の局所治療および防止のために使用できることにより、そのような使用のさらなる実施形態は、上で説明したものに、および本明細書により全体が参照されるものと同様である。
【００３４】
そのような医薬組成物は、Ａ’群の少なくとも２つの異なる抗生物質もしくは薬学上許容されるその誘導体、またはＡ’群の１つの抗生物質およびＢ’群の抗生物質もしくは薬学上許容されるその誘導体を含む。この場合、Ａ’群は、主に細胞内活性型の抗生物質であるアンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシン；フルオロキノロン、とりわけモキシフロキサシン；ストレプトグラミン、とりわけキヌプリスチンおよび／またはダルフォプリスチンを含む。Ｂ’群は、主に細胞外活性型の抗生物質である糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン；ホスホマイシン；ポリペプチド、とりわけバシトラシン、ダプトマイシンまたはポリミキシンＢ；およびアミノグリコシド、とりわけアルベカシンを含む。糖ペプチドは、２つのみの抗生物質を含み第１の抗生物質としてアンサマイシンを含む医薬組成物の第２の抗生物質であることはできないことに留意されたい。
【００３５】
一実施形態では、この医薬組成物は、可能性のあるＢ’群の抗生物質として糖ペプチド、ポリペプチドまたはホスホマイシンのみを含むが、Ｂ’群の抗生物質としてアミノグリコシドは使用されない。別の実施形態では、Ａ’群の抗生物質としてストレプトグラミンは使用されない。
【００３６】
一実施形態では、抗生物質は、この医薬組成物中の抗生物質が、タンパク質合成の阻害薬としてはそのすべてが働かないか、またはそのすべてが働くかいずれかである。すなわち、ａ）異なるストレプトグラミンのみ、もしくはストレプトグラミンおよびアミノグリコシドを使用してもよいか、またはｂ）ストレプトグラミンおよびアミノグリコシドは一切使用できないかのいずれかであるような方式で選択される。
【００３７】
代替的な一実施形態では、この医薬組成物は、リファマイシンおよびアミノグリコシド、とりわけリファンピンおよびアルベカシンを含む。
【００３８】
別の実施形態では、この医薬組成物は、リファマイシンおよびホスホマイシン、とりわけリファンピンおよびホスホマイシンを含む。
【００３９】
そのような組成物は、リファマイシンおよびホスマイシン（ｆｏｓｍｙｃｉｎ）を、リファマイシンが治療対象部位で０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から２０μｇ／ｍｌの濃度に達するような濃度で含む。ホスホマイシンは、治療対象部位で１から１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から８００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０から２００μｇ／ｍｌの濃度に達する。
【００４０】
さらに別の実施形態では、この医薬組成物は、リファマイシンおよびポリペプチド、とりわけリファンピンおよびダプトマイシンを含む。
【００４１】
そのような組成物は、リファマイシンおよびダプトマイシンを、リファマイシンが治療対象部位で０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から２０μｇ／ｍｌの濃度に達するような濃度で含む。ダプトマイシンは、治療対象部位で０．１から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から２０μｇ／ｍｌの濃度に達する。
【００４２】
さらに別の実施形態では、この医薬組成物は、リファマイシンおよびフルオロキノロン、とりわけリファンピンおよびモキシフロキサシンを含む。
【００４３】
１つの目的は、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質、細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質、および／またはギラーゼ阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質を含む、微生物に細胞外および／または細胞内感染した細胞の治療のための、および／または細胞の微生物感染症防止のための請求項１５による医薬組成物によっても達成される。
【００４４】
この治療は、局所的または全身に好ましくは行われる。
【００４５】
有利には、アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシンは、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として使用される。細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす抗生物質としては、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、およびポリペプチド、とりわけバシトラシンおよびダプトマイシンが選択される。ギラーゼ阻害薬としては、フルオロキノロン、とりわけモキシフロキサシンが施用される。
【００４６】
リファマイシンは、０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から２０μｇ／ｍｌの間の濃度で使用される。ホスホマイシンは、１から１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から８００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０から２００μｇ／ｍｌの濃度で使用される。モキシフロキサシンは、０．１から５００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から２００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から１００μｇ／ｍｌの間の濃度で施用される。ダプトマイシンは、０．１から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から２０μｇ／ｍｌの濃度で使用される。リファマイシン、ホスホマイシン、ダプトマイシンおよび／またはモキシフロキサシンの組合せにおいては、同じ濃度が好ましくは用いられる。
【００４７】
この医薬組成物は、骨芽細胞、白血球、赤血球、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、筋細胞および／または内皮細胞などの感染細胞の場合に特に有効である。
【００４８】
さらに、この医薬組成物は、グラム陰性菌および／またはグラム陽性菌、好ましくはスタフィロッコシ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｉ）型、最も好ましくは黄色ブドウ球菌が原因で生じる微生物感染症に対して有効である。
【００４９】
一実施形態では、使用対象となる医薬組成物はバイオフィルム形成阻害薬をさらに含む。病原菌（特に表面上の細菌）の付着、または病原菌が表面上に蓄積して当該表面上にバイオフィルムを形成する能力を少なくとも部分的に低下させるかまたは阻害する物質はすべて、バイオフィルム形成阻害薬とみなされる。
【００５０】
一実施形態では、バイオフィルム形成阻害薬として、サリチル酸または薬学的活性をもつその誘導体または塩が使用される。とりわけサリチル酸とアミノグリコシドとの組合せを使用してもよい。サリチル酸は、細菌に対する、特に大腸菌および肺炎桿菌に対するアミノグリコシドの微生物活性を高める。すなわち、サリチル酸はプロトン化された形態で細胞に入り込むことにより細胞の膜電位を高める。これにより今度は細胞の内部中へのアミノグリコシドの取込みが容易になる。
【００５１】
さらにはサリチル酸自体も細菌に対する効果を示す。サリチル酸の存在下で被包性の肺炎桿菌を成長させると、結果として莢膜多糖類の合成が減少する。莢膜の材料が失われることにより肺炎桿菌の細胞表面が宿主の防御機序にさらされることで、感染排除に必要な時間が短縮される。サリチル酸は細菌が表面上に付着してバイオフィルムを形成する能力を低下させる。サリチル酸は、バイオフィルム形成に対して１００％の防御は提供しないものの抗生物質の効果を支持する。
【００５２】
アセチルサリチル酸および／またはその主な代謝産物であるサリチル酸は、微生物の病原性表現型に対しｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において限定的な影響を呈する。細菌の病原性因子は宿主生物において細菌による感染の媒介を助長する。以下の効果が認められている：関連のバイオマトリックスへの付着の減少、莢膜産生の減少、バイオフィルム形成の低減、および疣（ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ）の成長、疣内の細菌増殖の減退、および実験的な感染性心内膜炎における血行性播種。また、サリチル酸は、複数の抗生物質に耐性を有する遺伝子座など特定の遺伝子座の翻訳を正に調節する。さらに、サリチル酸は細胞質のタンパク質を誘導し、キノロン耐性を高める。
【００５３】
サリチル酸の存在下で成長させた後では、大腸菌におけるいくつかの型の線毛（例えば、定着因子抗原、Ｐ線毛および１型線毛）の合成が減少する。線毛は、大腸菌が上皮の表面に付着する上で決定的に重要な役割を果たすので、サリチル酸による治療は、線毛を有する（ｆｉｍｂｒｉａｔｅｄ）大腸菌の何らかの菌株が原因で生じる感染症を防止する可能性がある。サリチル酸はシラスティックカテーテルへの大腸菌の付着も制限する。
【００５４】
細菌における走化性は鞭毛の旋回の規則により調節される。この旋回が反時計回りのときは直線軌道に沿って泳ぐことになり、時計回りのときは回転することになる。サリチル酸は大腸菌ｔｓｒ遺伝子産物によりケモリペラント（ｃｈｅｍｏｒｅｐｅｌｌａｎｔ）として認識される。この認識により、運動性大腸菌は持続的に回転することとなり、その結果最終的に細胞はサリチル酸から遊走して逃れる。大腸菌が群れる行動も濃度に依存する形でサリチル酸により阻害される。大腸菌における鞭毛自体の産生は、サリチル酸の存在下での成長により阻害される。これには、鞭毛を構成するタンパク質モノマーであるフラゲリンの産生の阻害が介在する。サリチル酸による大腸菌における鞭毛合成および運動性の阻害は、鞭毛の構築に必要と考えられるＯｍｐＦ合成における合成が減少することによるものであるとも推測されている。
【００５５】
バイオフィルムは、微生物由来の多糖マトリックス中に封じ込められた微生物および他の物質からなる。サリチル酸の存在下で緑膿菌および表皮ブドウ球菌を成長させると、バイオフィルム形成に必要な細胞外多糖の産生が減少する。バイオフィルム形成が減少すると、これらの生物がコンタクトレンズおよび医療用ポリマーに付着する能力が低下する。表皮ブドウ球菌におけるバイオフィルム産物の成分は、多糖類、タイコ酸およびタンパク質の複合混合物で構成される細胞外粘液である。粘液に関連するタンパク質およびタイコ酸の産生は、表皮ブドウ球菌の場合はサリチル酸により阻害される。
【００５６】
黄色ブドウ球菌の場合は、サリチル酸は、マトリックス結合（すなわちフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンへの）およびαヘモリシン活性にとって重大な関連のある２つの異なる病原性表現型を軽減する。こうした効果は、それぞれの構造遺伝子、すなわちｆｎｂＡ、ｆｎｂＢおよびｈｌａの発現がサリチル酸の媒介により減少することと特異的に関連する。マトリックスタンパク質結合および細胞溶解のプロファイルの抑制に加え、サリチル酸の存在下では細胞外酵素およびプロテインＡの産生強化が生じる。これらの知見から、サリチル酸は、全体的な遺伝子転写の抑制ではなく、１つまたは複数のグローバル制御網（ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋ）によりその抗微生物効果を果たしたという可能性が高まる。グローバルレギュロン（ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌｏｎ）ｓａｒＡおよびグローバルレギュロンａｇｒは、サリチル酸により軽減され、このことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈｌａおよびｆｎｂＡ遺伝子の発現低下と合致する。黄色ブドウ球菌の病原性パラメーターは、サリチル酸により完全に抑制されたわけではないが、薬物濃度に依存する形で最大およそ５０％低下したことには注目すべきである。
【００５７】
一実施形態では、治療対象となる感染組織は急性的または慢性的に感染したものである。急性感染症と慢性感染症との組合せ（すなわち急性感染症が起きてから慢性感染症になる）も治療できると考えられる。
【００５８】
今回の目的は、請求項２１による医療目的用の基質を提供することによっても達成される。この基質は、組織感染症を局所治療および防止する場合に医薬組成物の担体として好ましくは使用される。さらなる実施形態では、この基質は、外科的な病巣清掃術における補助剤として感染組織の除去後に局所的にも使用される。
【００５９】
一実施形態では、この基質は使用対象となる医薬組成物と共に浸漬できる。別の実施形態では、医薬組成物は基質の基材中で分散させることができる。さらに別の実施形態では、医薬組成物を基材と共に重合させることができる。したがって、基質を医薬組成物でコーティングしおよび／または医薬組成物を基質中に組み込むことが可能である。
【００６０】
好ましい一実施形態では、この基質には医薬組成物を施用する前に特別な処理（例えばサンドブラスト加工またはヒドロキシルアパタイトコーティング）を施した。
【００６１】
本説明の範囲内では、コーティングも医薬組成物がその中に存在する（例えば分散形態で）支持材料で作製される。そのような支持材料としてはポリラクチドを挙げることができる。次に、分散された医薬組成物が含まれている支持材料を、基質上に（後者の表面上に直接、またはその表面上にすでに存在している層もしくは別の層の上、そのいずれかに）コーティングとして施用する。
【００６２】
一実施形態では、この基質は、フリース、織物、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチルとアクリル酸メチルとのコポリマー、再吸収可能なポリマー、ポリエチレン、金属または金属合金（例えば、Ｔｉ６ＡＩ４Ｖ合金または別のチタン合金）、セラミック、骨セメント、とりわけポリマー材料またはリン酸カルシウムで作製されているもの、および／または代用骨を含む。したがって、メタクリル酸メチルとアクリル酸メチルとのコポリマーおよびグリシンから主になるＰＭＭＡビーズチェーン、ならびに局所用の抗生物質担体として投与される特定の医薬組成物は、可能性のある基質である。さらに、骨セメントはスペーサー用および修正手術用に使用することを意図してもよい。
【００６３】
ＰＭＭＡビーズチェーンの場合は以下の使用様式が可能である：まず、ＰＭＭＡ基材内に医薬組成物を分散させる。この粉末を１８０℃に加熱してから、射出成型により型の中に充填する。医薬組成物は、基材全体にわたって分布しており、ＰＭＭＡビーズの内側部分から表面に向かって拡散でき、そこでＰＭＭＡビーズチェーンの周囲に存在している細菌と相互作用できる。ＰＭＭＡビーズチェーンは、０．１〜１０質量％、好ましくは０．５〜８質量％、最も好ましくは１〜５質量％の（１つまたは複数の）抗生物質を含んでもよい。
【００６４】
別の実施形態では、とりわけ修正手術の場合、基質は埋込み可能な人工器官であり、この場合、人工関節、および、とりわけ膝、股関節、肩、肘用の人工器官、ならびに椎骨インプラントはそれぞれの例である。さらに、スクリュー、プレートなどのような外傷の外科手術用のインプラントはすべて基質として使用してもよい。基質のコーティングは、基質の表面積１ｃｍ2当たり、１０〜１０００μｇ／ｃｍ2、好ましくは２０〜５００μｇ／ｃｍ2、最も好ましくは５０〜３００μｇ／ｃｍ2の（１つまたは複数の）抗生物質を含んでもよい。
【００６５】
一実施形態では，フリースまたは織物は天然または合成の繊維（生分解性のものであってもよい）を含み、この場合ポリラクチド（ポリ乳酸）が例示的な材料である。別の実施形態では、フリースまたは織物はコラーゲンを含み、この場合、フリースはコラーゲンから本質的になるものであってもよい。後者の場合、コラーゲンフリースもまた、完全に生分解性である。フリースは、フリース１ｃｍ2当たり０．０１〜１０ｍｇ／ｃｍ2、好ましくは０．１〜８ｍｇ／ｃｍ2、最も好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｃｍ2の（１つまたは複数の）抗生物質を含んでもよい。
【００６６】
さらに、医薬組成物で対象を局所治療する方法であって、該医薬組成物が、
− Ａ群の少なくとも２つの異なる抗生物質または薬学上許容されるその誘導体、または
− Ａ群の１つの抗生物質およびＢ群の少なくとも１つの抗生物質または薬学上許容されるその誘導体を含み、
Ａ群が
− 細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬、
− ギラーゼの阻害薬、または
− 細菌のタンパク質合成の阻害薬
として働く細胞内活性型の抗生物質を含み、
Ｂ群が
− 細菌の細胞壁合成の阻害薬として、
− 細菌のタンパク質合成の阻害薬として、または
− 細菌の細胞壁の直接的な不安定化または破壊により
働く細胞外活性型の抗生物質を含む方法を記載する。
【００６７】
この方法は、とりわけ、前記対象の組織感染症を治療するために使用でき、この場合の組織とは、例えば軟部組織および／または骨組織および／または骨であってもよい。これらの感染症は、外科手術が原因で、とりわけヒトまたはヒト以外の体内へのインプラントの埋込みに関する手術が原因で生じることがあると考えられる。したがって、この治療はヒトまたはヒト以外の体に施してもよいと考えられる。
【００６８】
本態様のさらなる実施形態に関しては、前記方法（とりわけ使用対象となる基質および選択対象となる抗生物質に関する）に同様に適用可能である前述の説明が参照によりなされる。
【００６９】
第２の目的は、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として作用する少なくとも抗生物質と、表面上の微生物に対する抗付着薬として細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質との組合せを使用することにより達成される。
【００７０】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬は、アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシンを含む群から好ましくは選択される。
【００７１】
細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす抗生物質は、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、およびポリペプチド、とりわけバシトラシンまたはダプトマイシンを含む群から好ましくは選択される。好ましい組合せは、リファマイシンおよびホスホマイシンを含む。
【００７２】
さらなる実施形態では、微生物は、グラム陰性菌および／またはグラム陽性菌、好ましくはスタフィロッコシ型のもの、最も好ましくは黄色ブドウ球菌である。
【００７３】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つの阻害薬と細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質との組合せは、金属、好ましくはチタン、鋼または金属合金、セラミックス、および骨セメントまたはヒドロキシルアパタイトで作製された表面上に、好ましくは付加またはコーティングされる。
【００７４】
基質上にコーティングする場合、この組合せは、リファマイシンおよびホスホマイシンを、それぞれ１０から１０００μｇ／ｃｍ2、好ましくは２０から５００μｇ／ｃｍ2、最も好ましくは５０〜２００μｇ／ｃｍ2の間の濃度で含んでもよい。
【００７５】
有利には、抗付着効果は、コーティングされた表面を取り囲む組織に対する殺菌効果を伴う。
【００７６】
実施形態の例を、以下の図および例によりさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００７７】
１．細胞外感染症の治療のためのリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
１．１．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス・ローゼンバッハ（Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ）（ＡＴＴＣ６５３８Ｐ）に感染したＭＧ６３骨芽細胞の細胞外感染症の治療のためのリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
細胞剥離用媒体のＡｃｃｕｔａｓｅを用いて、感染の２４時間前にＭＧ６３骨芽細胞を剥離した。Ｎｅｕｂａｕｅｒ計数盤を用いて細胞数を定量した。コーティングされていない２４ウェルのプレート上に、１．５×１０4細胞／ｃｍ2の細胞密度で、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉおよび１％Ｎａｔｒｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔを添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｅｄｉｕｍ）１ｍｌ中に細胞を播種し、３７℃および５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。
【００７８】
Ｃａｓｏ−Ｂｏｕｉｌｌｏｎ培地５ｍｌを黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させることにより、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの一晩培養物を調製した。この培養物を、３７℃で一晩、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。感染に先立ち、一晩培養物１００μｌをＣａｓｏ Ｂｏｕｌｉｌｌｏｎ培地５ｍｌ中に移し、３７℃で２時間、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。
【００７９】
ＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清を、ピペットを用いてウェルから除去した。１×１０6の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐ細胞を含有する１ｍｌを各ウェルに加えた。２４ウェルのプレートを２つ、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐと共にインキュベートした。骨芽細胞と細菌とを合わせたものを、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて１．５時間インキュベートした。顕微鏡を用いて細菌の存在を定量した。
【００８０】
１．５時間後、上清を除去し、添加物の入っていない３７℃の温ＤＭＥＭで、ウェルを慎重に２回洗浄した。洗浄手順中に細胞が多く剥離されすぎなかったかどうか、顕微鏡でチェックした。洗浄中にはプランクトン性の細胞のみが除去されており、細胞および細胞培養プラスチックに付着した細菌が多数目視できた。その後、細胞培養完全培地１ｍｌを、以下の抗生物質を含有する各ウェルに加えた：
− １００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
− １μｇ／ｍｌのリファンピン
− １００μｇ／ｍｌのホスホマイシン二ナトリウム
− １μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのホスホマイシン二ナトリウム
− １μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン。
【００８１】
抗生物質の入っていない陰性対照は使用しなかったが、これは抗生物質の不在下での細菌の急激な成長は骨芽細胞に損傷を与えると考えられたためである。
【００８２】
２４時間のインキュベーション後、細胞培養物の上清１００μｌをＣａｓｏ寒天プレート（カゼインペプトン・大豆かすペプトンのブロス）上に直接（例えば、リファンピン、ホスホマイシン、リファンピン／ホスホマイシン、およびリフムピシン（ｒｉｆｍｐｉｃｉｎ）／ゲンタマイシンの場合）、または適切な希釈（例えば、ゲンタマイシンの場合は１：１００）の後で、筋状に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。１群当たり２つのウェルの上清を筋状に播種した。
【００８３】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【００８４】
上清のＣＦＵ（コロニー形成単位）を測定し、結果を図１に示す。
【００８５】
図１は、ＭＧ６３骨芽細胞培養物の上清中に位置する黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐのゲンタマイシンを除く異なる抗生物質に対する感受性を明確に示す。用いた濃度は、この黄色ブドウ球菌株について定量されたＭＩＣ値（最小発育阻止濃度）と比較して高かったが、この抗生物質治療では細菌を完全には除去できなかった。このことは、細菌が細胞または細胞培養プラスチックの表面上に定着し、その結果抗生物質に対する感受性が低下した事実によるものである。これにより、ブドウ球菌が細胞外マトリックスおよび異物に容易に結合するｉｎ ｖｉｖｏでの状況が模擬的に再現される。リファンピン、ホスホマイシン、およびリファンピン／ゲンタマイシンの組合せの効果は中程度であるが、リファンピン／ホスホマイシンの組合せは強力で相乗的な効果を示す。
【００８６】
１．２．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（ＢＡＡ４４）に感染したＭＧ６３骨芽細胞の細胞外感染症の治療のためのリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４、複数の抗生物質に対する追加的な耐性を有するＭＲＳＡ株に感染したＭＧ６３骨芽細胞の感染についての実験手順は、前述のものと基本的に同じであった。
【００８７】
以下の抗生物質を使用した：
− １００μｇ／ｍｌのバンコマイシン
− １０μｇ／ｍｌのリファンピン
− １００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− １０μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− １０μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのバンコマイシン。
【００８８】
２４時間のインキュベーション後、細胞培養物１００μｌをＣａｓｏ寒天プレート（カゼインペプトン・大豆かすペプトンのブロス）上に、直接（例えば、バンコマイシン、リファンピン／ホスホマイシン、およびリファンピン／バンコマイシンの場合）、または適切な希釈（例えば、リファンピンおよびホスホマイシンの場合は１：１００）の後で、筋状に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。１群当たり２つのウェルの上清を筋状に播種した。
【００８９】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【００９０】
上清のＣＦＵ（コロニー形成単位）を測定し、結果を図２に示す。
【００９１】
図２は、ＭＧ６３骨芽細胞培養物の上清中に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の、異なる抗生物質に対する感受性を明確に示す。ＣＦＵ値を対数値に変える必要があったことが注目される。
【００９２】
用いた濃度でのリファンピンは、予想どおりほとんど有効性を示さないが、これは黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４がリファンピン耐性株であるためである。ホスホマイシンの抗生物質効果も比較的小さい。しかし、リファンピン／ホスホマイシンの組合せは、細胞外の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に対する強力で相乗的な効果を示し、このことは単一の化合物の効果が弱いことから、驚きであり、予想外であった。
【００９３】
リファンピン／ホスホマイシンの組合せの効果は、ＭＲＳＡ感染症の治療にとって最も重要な抗生物質の１つであるバンコマイシンの効果よりわずかに良好ですらある。バンコマイシンとリファンピンとの組合せもわずかな相乗効果を示す。この実験において用いたバンコマイシンの濃度は非常に高かったため、そうしなければ弱いバンコマイシンの殺菌効果が高まったことに留意すべきである。１００μｇ／ｍｌというバンコマイシンの濃度は、静脈内施用では達成できない。
【００９４】
２．細胞内感染症の治療のための、異なる抗生物質、すなわちリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
２．１．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス・ローゼンバッハ（ＡＴＴＣ６５３８Ｐ）に感染した骨芽細胞ＭＧ６３の細胞内感染症の治療のための、異なる抗生物質、すなわちリファンピンおよびホスホマイシンまたはその組合せの使用
黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染したＭＧ６３骨芽細胞の細胞内感染の定量についての実験手順は、前述のものと本質的に同じであった。
【００９５】
ただし、細胞外の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐを排除するために、感染後、抗生物質を加える前に、各細胞培養物をリゾスタフィンで処理した。
【００９６】
この目的のため、各ウェルから細菌懸濁液を除去し、１０％ＦＣＳを含有する温ＤＭＥＭで細胞を１回洗浄した。２５μｇ／ｍｌのリゾスタフィン溶液２５０μｌを各ウェルに加えた。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、細胞外の細菌は顕微鏡で一切観察できなかった。リゾスタフィン溶液を完全に除去してから、細胞を温ＤＭＥＭ１ｍｌで１回洗浄した。その後、以下の組成を有する抗生物質溶液を加えた：
− １００μｇ／ｍｌのバンコマイシン
− １００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
− ０．０１〜１００μｇ／ｍｌのリファンピン
− １０〜１０００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− １μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− １μｇ／ｍｌのリファンピン＋１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン
− １〜１００μｇ／ｍｌのモキシフロキサシン。
【００９７】
感染細胞を、ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて２４時間インキュベートした。
【００９８】
感染後のＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性を定量するために、細胞の上清を除去してから、細胞培養用の新鮮な温培地１ｍｌを各ウェルに加えた。その後、２００μｌのＭＴＴ溶液（３［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェナル（ｄｉｐｈｅｎａｌ）テトラゾリウムブロミド）を各ウェルに加えた。この培養物を５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて２時間インキュベートした。細胞培養物の上清を除去してから、ホルマザン（代謝活性により形成された）をイソプロパノール１ｍｌで可溶化した。各懸濁液２００μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移して、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて５４０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００９９】
５４０ｎｍでの吸光度はＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性の指標である。ＭＧ６３骨芽細胞中の細胞毒性黄色ブドウ球菌株ＡＴＴＣ６５３８Ｐが細胞内で繁殖すると、結果として感染細胞は死ぬ。吸光度が低いほど細胞の代謝活性が低く、したがって細胞の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐへの感染が強い。
【０１００】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１０１】
図３ａ〜ｄは、異なる抗生物質がＭＧ６３骨芽細胞の代謝活性に及ぼす影響を示すものである。
【０１０２】
バンコマイシンは、細胞中に透過できないため、骨芽細胞内部の黄色ブドウ球菌の細胞内繁殖に影響を及ぼさない。したがって、骨芽細胞の代謝活性は黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染することにより強力に低下する（図３ａ〜ｄ）。同じことがゲンタマイシンにも当てはまる。それにもかかわらず、ゲンタマイシンとリファンピンとの組合せにおいては、代謝活性はリファンピン単独の場合より高かった（データは示していない）。
【０１０３】
これに対し、リファンピンは黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐが原因で生じる細胞死を大幅に減らすことができる（図３ａ）。低濃度（０．００６μｇ／ｍｌ）でもすでに代謝活性を高める上で十分である。
【０１０４】
ホスホマイシンも、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの細胞内繁殖、ひいては感染した骨芽細胞の代謝活性に影響を及ぼす（図３ｂ）。１０μｇ／ｍｌのホスホマイシンは代謝活性をわずかに高めるのみであり、それにより１００μｇ／ｍｌは最大限の効果を有し、代謝活性はほぼ２倍となった。この結果は驚くべきものであるが、それはホスホマイシンが細胞中に透過できることはこれまで知られていなかったからである。ホスホマイシンは好中球中に透過できることが知られているにすぎない。
【０１０５】
リファンピンとホスホマイシンとの組合せも代謝活性の向上をもたらし（図３ｄ）、相乗効果すら示す（図３ｃ）。
【０１０６】
１から１００μｇ／ｍｌのモキシフロキサシンの施用も、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの細胞内成長を阻害し、それにより代謝活性を２倍を超えるまで高めることができる（図３ｅ）。
【０１０７】
２．２．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（ＢＡＡ４４）に感染した骨芽細胞ＭＧ６３の細胞内感染症の治療のための、リファンピン、ホスホマイシンまたはその組合せの使用
黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に感染したＭＧ６３骨芽細胞の細胞内感染の定量についての実験手順は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐについて前述したものと本質的に同じであった。
【０１０８】
非細胞毒性黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４は骨芽細胞中で存続し、細胞毒性株の黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐとは異なり細胞内で分裂しないので、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４が細胞内に局在しても骨芽細胞の細胞死を招く結果にならない。したがって、ＭＧ６３骨芽細胞の、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への細胞内感染を細胞の代謝活性に基づいて定量することはできず、代わりに細胞溶解および細胞内ＣＦＵの計数により定量した。
【０１０９】
以下の組成を有する抗生物質溶液を加えた：
− １００μｇ／ｍｌのバンコマイシン
− ２．５〜４０μｇ／ｍｌのリファンピン
− ２５〜４００μｇ／ｍｌのホスホマイシン
− および、追って記載の異なる比率でのその混合物。
【０１１０】
感染細胞を、抗生物質（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃｓ）と共に５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて２４時間インキュベートした。
【０１１１】
その後、この細胞をｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝液）で１回洗浄してから、リンゲル液中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ １ｍｌで溶解させる。この溶菌液を５分間超音波処理した。溶菌液はピペットを用いて徹底的に再懸濁させる。２４ウェルのプレート１つのみを扱い、他のプレートは溶菌液中での細菌の成長を最小限にするために４℃で保管した。溶菌液１００μｌを希釈せずにＣａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種し、３７℃で一晩インキュベートしてからコロニーを計数した。
【０１１２】
図４ａ〜４ｇは、ＭＧ６３骨芽細胞の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への細胞内感染の程度についての指標としての、１ウェル当たりのＣＦＵ値を示すものである。ＣＦＵ値が低いほど、骨芽細胞の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への感染率が低い。このことは、添加した抗生物質の有効性と相関する。黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の細胞内成長力が弱いため、抗生物質の殺菌（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｉａｌ）効果によりＣＦＵは減少する。
【０１１３】
５０〜４００μｇ／ｍｌの間の濃度のホスホマイシンは、細胞内に位置する黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への感染率に対する良好な有効性を示す（図４ａ）。驚くべきことに、ホスホマイシンの効果は静脈内施用が可能な濃度（血清中で１００〜４００μｇ／ｍｌ、好ましくは１３２〜２９７μｇ／ｍｌ）で達成できる。そのすぐれた組織浸透性から、高いホスホマイシン濃度は骨中でも達成される。したがって、ホスホマイシンは骨髄炎の治療において首尾よく施用される。
【０１１４】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１１５】
黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４はリファンピン耐性株であるが（Ａｔｈｏｕｇｈ）、リファンピンは良好な細胞内効力を示す（図４ｂ）。
【０１１６】
リファンピンおよびホスホマイシンは、さまざまな濃度比率において相乗効果を明確に示す（図４ｃ〜ｇ）。
【０１１７】
リファンピン耐性黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の場合においてさえ、施用された濃度は骨感染症の全身治療を可能にするために十分満足なものであった。したがって、リファマイシンとホスホマイシンとの組合せは、骨髄炎の治療に適しており、全身施用することもできる。
【０１１８】
３．医療用基質の表面上での抗付着薬としての、リファンピンとホスホマイシンとの組合せの使用
３．１．リファンピンおよびホスホマイシンでコーティングしたチタン基質上での黄色ブドウ球菌亜種アウレウス・ローゼンバッハ（ＡＴＴＣ６５３８Ｐ）の付着
Ｃａｓｏ−Ｂｏｕｉｌｌｏｎ培地５ｍｌを黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐに感染させることにより、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの一晩培養物を調製した。この培養物を、３７℃で一晩、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。一晩培養物１００μｌをＣａｓｏ Ｂｏｕｌｉｌｌｏｎ培地５ｍｌ中に移し、３７℃で２時間、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。細菌密度を測光法で定量した。測定に先立ち、細菌懸濁液をＣａｓｏ Ｂｏｕｉｌｌｏｎ中で１：２で希釈した。付着実験用に、１０％ＦＣＳを添加したＣａｓｏ Ｂｏｕｌｌｉｏｎ中の１×１０5ＣＦＵ／ｍｌの密度の細菌懸濁液を使用した。
【０１１９】
異なる方式でコーティングした２ｃｍのチタンディスクを試料として使用した：
− 陰性対照として、サンドブラスト加工したチタンディスク、
− サンドブラスト加工の上２００μｇ／ｃｍ2のバンコマイシンでコーティングしたチタンディスク、
− ５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンおよび２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムで同時にコーティングしたチタンディスク、
− 第１のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンで、第２のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムでコーティングしたチタンディスク、および
− 第１のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムで、第２のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンでコーティングしたチタンディスク。
【０１２０】
コーティング後、チタンディスクをＰＢＳで１回または３回洗浄した。コーティングした、およびコーティングしていないチタンディスクを、ＰＢＳ５ｍｌと共に室温で５分間インキュベートした。これをさらに２回繰り返した。３回目のサークルではチタンディスクを室温で１時間インキュベートした。抗生物質の剥離量を増やすため、ＰＢＳ溶液を除去する前にチタンディスクを裏返すかまたは回転させた。その後、滅菌済みの１２ウェルのプレート中にチタンディスクを移した。
【０１２１】
異なるチタン試料を、細菌懸濁液２ｍｌと共に３７℃で１．５時間、振盪せずにインキュベートした。
【０１２２】
その後、細菌懸濁液を除去し、ＰＢＳ２．５ｍｌでディスクを３回洗浄した。最後の洗浄サイクルの後、滅菌済みのリンゲル液１０ｍｌ中に各ディスクを入れた。各群の１枚のみのディスクを同時に試験し、他のディスクは４℃で保管した。付着した細菌を剥離するためにリンゲル液中のチタンディスクに超音波を１０分間あてた。剥離された細菌を含む懸濁液を希釈し（１：１０、１：１００）、Ｃａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種した。寒天プレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日コロニーを計数した。
【０１２３】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１２４】
図５ａは、細菌と共に１．５時間インキュベーションした後のチタンディスク１枚当たりの黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８ＰのＣＦＵを示すものである。バンコマイシンは、１回の洗浄ステップ後には抗付着効果のみを有したが、３回の洗浄ステップ後には抗付着効果は一切明らかにならなかった。事実、バンコマイシンでコーティングしたディスクに付着した黄色ブドウ球菌細胞の数は、コーティングされていないディスクと同等であった。しかしながら、リファンピンとホスホマイシンとの組合せは、強力な抗付着効果を示した。この効果は洗浄ステップの数にほんのわずか依存した。リファンピン／ホスホマイシンでのコーティングは、バンコマイシンと比較した場合、数回の洗浄ステップによりチタン表面から完全には除去されにくいことが明らかであった。
【０１２５】
リファンピンおよびホスホマイシンでディスクをコーティングする順序（一緒に、最初にリファンピン、次にホスホマイシン；最初にホスホマイシン、次にリファンピン）は、この効果に影響しないようである（図５ａ）。
【０１２６】
３．２．リファンピンとホスホマイシンとの組合せでコーティングしたチタン基質上でのスタフィロコックス・エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＡＴＴＣ３５９８４の付着
実験手順は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐについて前述したものと本質的に同じであった。
【０１２７】
異なる方式でコーティングした２ｃｍのチタンディスクを試料として使用した：
− 陰性対照としてのチタンディスク（サンドブラスト加工してある）、
− 第１のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンで、第２のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムでコーティングしたチタンディスク、および
− 第１のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムで、第２のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンでコーティングしたチタンディスク。
【０１２８】
コーティングしたチタンディスクを、Ｓ．エピデルミスと共にインキュベーションする前にＰＢＳ５ｍｌで３回洗浄した。
【０１２９】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１３０】
Ｓ．エピデルミスについての実験結果（図５ｂ）は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの場合において見出された結果を支持する。コーティングされていないチタン上へのＳ．エピデルミスＡＴＴＣ３５９８４の付着量は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐの付着量より少なかった。このことは、Ｓ．エピデルミスは、プラスチックまたはヒドロキシアパタイトに好んで付着するが、チタンへの付着量はそれより少ないという事実に関連する可能性がある。チタンディスクは細菌と共にインキュベーションする前に３回洗浄したが、リファンピンとホスホマイシンとの組合せは強力な抗付着効果を示す。
【０１３１】
３．３．リファンピンとホスホマイシンとの組合せでコーティングしたチタン基質上での黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の付着
実験手順は、黄色ブドウ球菌ＡＴＴＣ６５３８Ｐについて前述したものと本質的に同じであった。
【０１３２】
以下のコーティングした２ｃｍのチタンディスクを、試料として使用した：
− 陰性対照としてのサンドブラスト加工したチタンディスク、
− ２００μｇ／ｃｍ2のバンコマイシンでコーティングしたチタンディスク、
− サンドブラスト加工の上、第１のステップでは５０μｇ／ｃｍ2のリファンピンで、第２のステップでは２００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムでコーティングしたチタンディスク。
【０１３３】
コーティングしたチタンディスクを、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４と共に１．５時間インキュベーションする前に、ＰＢＳ５ｍｌで１回または２回洗浄した。
【０１３４】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１３５】
図５ｃは、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４と共にインキュベーションした後のディスク上のＣＦＵを示すものである。バンコマイシンは、ディスクを１回洗浄した場合にのみ黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の付着を減少させた。すなわち、２回の洗浄ステップ後はすべてのバンコマイシンが除去されたようであり、細菌の付着の減少は観察できなかった。黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４のリファンピン耐性にもかかわらず、リファンピン／ホスホマイシンの組合せは強力な抗付着薬効果を有したが、この効果は細菌と共にインキュベーションする前にディスクを１回ではなく２回洗浄した場合にはほんのわずか低下した。
【０１３６】
３．４．リファンピンおよびホスホマイシンでコーティングしたチタン基質の、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に対する殺菌活性
Ｃａｓｏ―Ｂｏｕｉｌｌｏｎ培地５ｍｌを黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に感染させることにより、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の一晩培養物を調製した。この培養物を、３７℃で一晩、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。チタンディスクと共にインキュベーションする前に、一晩培養物１００μｌをＣａｓｏ Ｂｏｕｌｉｌｌｏｎ培地５ｍｌ中に移し、３７℃で２時間、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。細菌密度を測光法で定量した。
【０１３７】
付着アッセイでは、最少培地（ＰＢＳ、０．２％塩化アンモニウム、０．２％硫酸ナトリウム、０．２５％グルコース、１％Ｃａｓｏ Ｂｏｕｉｌｌｏｎ、５０μｇ／ｍｌのグルコース−６−ホスホネート）中の密度が１×１０4ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液を使用した。最少培地は、細菌の成長を最小限にするため、Ｃａｓｏ Ｂｏｕｉｌｌｏｎの代わりに使用した。
【０１３８】
異なる方式でコーティングした２ｃｍのチタンディスクを試料として使用した：
− 陰性対照としてのチタンディスク（サンドブラスト加工してある）、
− ２００μｇ／ｃｍ2のバンコマイシンでコーティングしたチタンディスク（サンドブラスト加工してある）、
− 第１のステップでは３００μｇ／ｃｍ2のホスホマイシンカルシウムで、第２のステップでは７０μｇ／ｃｍ2のリファンピンでコーティングしたチタンディスク。
【０１３９】
コーティング後、室温のＰＢＳ２．５ｍｌでチタンディスクを３回洗浄した。
【０１４０】
異なるチタン試料を、細菌懸濁液２ｍｌと共に３７℃で１５．５時間、振盪せずにインキュベートした。
【０１４１】
その後、上清中のＣＦＵ、ならびにチタンディスク上の付着細菌を分析した。上清はＰＢＳ中で１：１０で希釈し、この希釈液１００μｌをＣａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種した。ディスクをＰＢＳ２．５ｍｌで４回洗浄して、付着していない（ｎｏｔ ａｄｈｅｒｅｎｔ）細菌を除去した。最後の洗浄サイクルの後、滅菌済みのリンゲル液１０ｍｌ中に各ディスクを入れた。各群の１枚のみのディスクを同時に試験し、他のディスクは４℃で保管した。付着細菌を剥離するために、リンゲル液中のチタンディスクに１０分間超音波をあてた。剥離した細菌を含む懸濁液を希釈し（１：１０、１：１００、１：１０００）、Ｃａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種した。寒天プレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日コロニーを計数した。
【０１４２】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１４３】
結果を図５ｄに示す。陰性対照中での細菌の成長は、最少培地を使用することにより減ったが、それにもかかわらず、上清中の細菌のＣＦＵはインキュベーション期間中に１０倍増加した。驚くべきことに、コーティングされていないディスクに付着した分のＣＦＵは上清中より高いことを見出すことができた。
【０１４４】
バンコマイシンは、コーティングされていない対照と比較して、細胞培養物の上清中での細菌の成長をわずかに低下させたが、細菌の付着はそれよりさらに大きく減少した。しかしながら、バンコマイシンは、殺菌効果を一切呈することができず、バンコマイシンでコーティングしたチタン試料上では５０，０００を超えるＣＦＵを見出すことができた。
【０１４５】
チタンディスクは付着アッセイ前に３回洗浄したが、ホスホマイシン／リファンピンの組合せは、リファンピン耐性株ＢＡＡ４４に対し明らかな殺菌活性を示した。上清中ではＣＦＵは検出できず、チタン表面に付着したのは１００ＣＦＵ未満であった。これは、コーティングされていないチタンと比較した場合の細菌の付着量では８６，０００倍の減少、およびバンコマイシンでのコーティングと比較した場合の４７０倍の減少に相当する。
【０１４６】
担体マトリックス（例えばポリマーマトリックス）を有さない可溶性の抗生物質コーティングは、埋込み後に組織液中に溶解させることによりその有効性が発揮されるようになることが期待された。溶解した抗生物質の有効性により定着して細菌の繁殖が減る前にプランクトン性の細菌を殺すことにより、この場合は、インプラントまたは人工器官への定着が妨げられる。数回の洗浄ステップ後にディスク上に残った、したがって上清中で入手できるリファンピンおよびホスホマイシンの量は、上清中で抗細菌の有効性を示すには依然として十分多かった。したがって、リファンピン／ホスホマイシンでのコーティングは十分安定であるため、埋込み中に組織液および血液と接触させることができ、インプラント表面および周囲組織への細菌の付着を防止する上で依然として有効である。この特性は、ブドウ球菌感染症にとって特に重要であるが、その理由は、ブドウ球菌はインプラントに専ら付着するのではなく、組織の細胞外マトリックスにも付着するからである。
【０１４７】
４．黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（ＢＡＡ４４）への骨芽細胞ＭＧ６３細胞の急性感染症の治療のためのリファンピンおよびダプトマイシンまたはその組合せの使用
感染の２４時間前に、細胞剥離用媒体のＡｃｃｕｔａｓｅを用いてＭＧ６３骨芽細胞を剥離した。Ｎｅｕｂａｕｅｒ計算盤を用いて細胞数を定量した。コーティングされていない２４ウェルのプレート上に、１．５×１０4細胞／ｃｍ2の細胞密度で、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉおよび１％Ｎａｔｒｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔを添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）１ｍｌ中に細胞を播種し、３７℃および５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。
【０１４８】
Ｃａｓｏ−Ｂｏｕｉｌｌｏｎ培地５ｍｌを黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に感染させることにより、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４の一晩培養物を調製した。この培養物を、３７℃で一晩、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。感染に先立ち、一晩培養物１００μｌをＣａｓｏ Ｂｏｕｌｉｌｌｏｎ培地５ｍｌ中に移し、３７℃で２時間、振盪（４５０Ｕ／分）しながらインキュベートした。
【０１４９】
ＭＧ６３骨芽細胞の細胞培養物の上清を、ピペットを用いてウェルから除去した。１×１０6の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４ＣＦＵを含有する１ｍｌを、以下の組成を有する抗生物質も含有する各ウェルに加えた。
【０１５０】
− ５０μｇ／ｍｌのバンコマイシン
− ２．５μｇ／ｍｌのリファンピン
− １．２５〜１０μｇ／ｍｌのダプトマイシン
− および、追って記載の異なる比率でのその混合物。
【０１５１】
骨芽細胞、細菌および抗生物質組成物を合わせたものを、５％ＣＯ2雰囲気下で３７℃にて１８時間インキュベートした。
【０１５２】
その後、この細胞をｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝液）で１回洗浄してから、リンゲル液中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ １ｍｌで溶解させる。この溶菌液を、ピペットを用いて徹底的に再懸濁させた。２４ウェルのプレート１つのみを扱い、他のプレートは溶菌液中での細菌の成長を最小限にするために４℃で保管した。溶菌液をＰＢＳ中で１：１０で希釈し、希釈した溶菌液１００μｌをＣａｓｏ寒天プレート上に筋状に播種し、３７℃で一晩インキュベートしてから、コロニーを計数した。
【０１５３】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１５４】
細胞は感染後にリゾスタフィンで処理しなかったので、１ウェル当たりのＣＦＵ値（図６）は、ＭＧ６３骨芽細胞の、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への細胞内感染の程度についての、ならびにＭＧ６３骨芽細胞に細胞外付着した黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４についての指標である。ＣＦＵ値が低いほど、骨芽細胞の、黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４への感染率が低い。このことは添加した抗生物質の有効性と相関する。
【０１５５】
菌株はリファンピン耐性であるため、リファンピン２．５μｇの効果はバンコマイシンおよびダプトマイシンの場合より低かったが、プランクトン性の黄色ブドウ球菌ＢＡＡ４４に感染したＭＧ６３細胞の過成長は有効に防止された（データには示していない）。
【０１５６】
ダプトマイシン単独は、１．２５μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌの濃度ですでに良好な有効性を示したが、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌでは感染症を完全に根絶できた。
【０１５７】
リファンピン単独の無効性にもかかわらず、２．５μｇ／ｍｌのリファンピンと１．２５μｇ／ｍｌまたは２．５μｇ／ｍｌのダプトマイシンとの組合せは、細胞内および細胞外に付着したすべての細菌の排除においてそれぞれ相乗的であった。
【０１５８】
バンコマイシンは弱い殺菌性しかもたないことから、その有効性を高めるためにこの実験では非常に高濃度のバンコマイシンを使用した。この濃度は、バンコマイシンの静脈内施用によっては絶対に達成できない。ところが、数百の黄色ブドウ球菌が、骨芽細胞に侵入することによりバンコイミシン（ｖａｎｃｏｙｍｉｃｉｎ）を逃れることができたが、これは、ｉｎ ｖｉｖｏでの（特に骨感染症の治療において）関連性を有する現象である。
【０１５９】
ダプトマイシンは、バンコマイシンのような糖ペプチドとは対照的に殺菌速度が速く、この殺菌活性は濃度依存性である。したがって、より高い５および１０μｇ／ｍｌの濃度は、細菌が骨芽細胞に侵入できる前にすべての細菌を排除できた。
【０１６０】
リファンピンおよびダプトマイシンの局所施用は、急性の骨感染症にとっての効率的な治療である可能性があると考えられる。ダプトマイシンは、高濃度で非常に効率的にすべての細胞外の細菌を排除することにより新しい骨芽細胞の感染を防止するが、リファンピンは、細胞内感染した骨芽細胞を根絶することが可能である。
【０１６１】
５．医療目的用の、コーティングまたは浸透加工を施した基質
３０〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度のメタノール中でリファンピンを希釈した。１００〜１４０μｇ／ｍｌの濃度の超純水中でホスホマイシンカルシウムを懸濁させた。さらなる添加物は用いなかった。異なる表面改変（サンドブラスト加工した、多孔質でコーティングが施された、またはヒドロキシアパタイトでコーティングした）が施されたチタン製の内部人工器官を、インクジェット式またはスプレー式のコーティング過程を用いて、抗生物質溶液で直接コーティングした。表面を最初にリファンピンで、次いでホスホマイシンカルシウムで、その逆で、または両方の抗生物質を同時に、コーティングしてもよい。その結果得られる被覆密度は、リファンピンが５０〜７０μｇ／ｃｍ2、ホスホマイシンが３００〜３５０μｇ／ｃｍ2であった。
【０１６２】
リファンピン、ホスホマイシン二ナトリウムおよびホスホマイシンカルシウムを、コラーゲンフリース中にフリースの作製過程の間に組み込んだ。リファンピンおよびホスホマイシン二ナトリウムは、酸性化した緩衝液中に加えて溶解させ、ホスホマイシンカルシウムは薄い懸濁液中に加えた。最終濃度は、コラーゲンフリース１ｃｍ2当たりリファンピンが０．１〜０．２ｍｇ、コラーゲンフリース１ｃｍ2当たりホスホマイシンが０．５ｍｇ〜２ｍｇであり、これに対しホスホマイシン二ナトリウムおよびホスホマイシンカルシウムは、さまざまな比率で、ホスホマイシンの最終濃度に寄与できた。
【０１６３】
リファンピンおよびホスホマイシン二ナトリウムを、ＰＭＭＡベースの２つの異なるポリマー、ジルコニウムジオキシド（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ ｄｉｏｘｉｄ）およびグリシンと混合した。リファンピンは総重量の０．５〜１．５％の量で加え、ホスホマイシン二ナトリウムは総重量の２．５〜７．５％の量で加えた。このポリマー／抗生物質混合物を１６０〜１８０℃に加熱し、射出成型により、金属ワイヤー上で直接ＰＭＭＡビーズを製造した。
【０１６４】
当業者であれば前述の説明は多くの選択肢のうちの１つの可能な形にすぎないことがわかるであろう。
【０１６５】
本発明の実践の多数の改変および変形は、前述の教示に照らせば可能であることから、以下の特許請求の範囲に記載の範囲内に属すると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織感染症の局所治療および防止のための医薬品または医療器具を製造するための医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が、
Ａ群の少なくとも２つの異なる抗生物質または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩、あるいは
Ａ群の１つの抗生物質およびＢ群の少なくとも１つの抗生物質または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩を含み、
Ａ群が、
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬、
ギラーゼの阻害薬、または
細菌のタンパク質合成の阻害薬
として働く細胞内活性型の抗生物質を主に含み、
Ｂ群が、
細菌の細胞壁合成の阻害薬として、
細菌のタンパク質合成の阻害薬として、または
細菌の細胞壁の直接の不安定化もしくは破壊により
働く細胞外活性型の抗生物質を主に含む使用。
【請求項２】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬としてのＡ群の前記抗生物質が、アンサマイシン、とりわけ、リファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシン（ｒｉｆａｍｉｘｉｎ）などのリファマイシンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼすＢ群の前記抗生物質が、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、ならびに、ポリペプチド、とりわけバシトラシンおよびダプトマイシンを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
リファマイシンおよびホスホマイシン、とりわけリファンピンおよびホスホマイシンを含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記医薬組成物が、バイオフィルム形成阻害薬、とりわけサリチル酸または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩をさらに含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
治療対象となる感染組織が、急性的または慢性的に感染したものであることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記医薬組成物の担体として基質が使用されることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記基質が、フリース、織物、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチルとアクリル酸メチルとのコポリマー、生分解性ポリマー、ポリエチレン、金属、セラミック、骨セメントおよび／または代用骨を含むことを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記フリースまたは前記織物が、天然または合成の繊維、とりわけポリラクチドおよび／またはコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記基質が、埋込み可能な人工器官、とりわけ人工股関節、人工肩関節、人工肘関節、人工膝関節もしくは椎骨インプラント、または外傷の外科手術用インプラントを含むことを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
Ａ’群の少なくとも２つの異なる抗生物質または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩、あるいは
Ａ’群の１つの抗生物質およびＢ’群の少なくとも１つの抗生物質または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩を含み、
Ａ’群が、
アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシン、
フルオロキノロン、とりわけモキシフロキサシン、
ストレプトグラミン、とりわけキヌプリスチンおよび／またはダルフォプリスチンを含み、
Ｂ’群が、
糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、
ホスホマイシン、
ポリペプチド、とりわけバシトラシン、ポリミキシンＢ、他のポリミキシンおよびダプトマイシン、
アミノグリコシド、とりわけアルベカシン
を含み、
糖ペプチドが、２つのみの抗生物質を含み第１の抗生物質としてアンサマイシンを含む組成物の第２の抗生物質であることはできない医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つのリファマイシンおよびホスホマイシンを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
リファマイシンが治療対象部位で０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から１０μｇ／ｍｌの濃度に達し、ホスホマイシンが治療対象部位で１から１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から８００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０から２００μｇ／ｍｌのホスホマイシンの濃度に達するような濃度でリファマイシンおよびホスホマイシンを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つのリファマイシンおよびダプトマイシンを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
リファマイシンが治療対象部位で０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から２０μｇ／ｍｌの濃度に達し、ダプトマイシンが治療対象部位で０．１から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から２０μｇ／ｍｌの濃度に達するような濃度でリファマイシンおよびダプトマイシンを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質、細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質および／またはギラーゼ阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質を含む、微生物に細胞外および／または細胞内感染した細胞の治療のための、および／または細胞の微生物感染症防止のための医薬組成物。
【請求項１７】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として、アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシンを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす抗生物質として、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、ならびに、ポリペプチド、とりわけバシトラシンおよびダプトマイシンを含む、請求項１６および１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ギラーゼ阻害薬として、フルオロキノロン、とりわけモキシフロキサシンを含む、請求項１６から１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記感染した細胞が、骨芽細胞、白血球、赤血球、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、筋細胞および／または内皮細胞であることを特徴とする、請求項１６から１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記微生物感染症が、グラム陰性菌および／またはグラム陽性菌、好ましくはスタフィロッコシ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｉ）型、最も好ましくは黄色ブドウ球菌が原因で生じることを特徴とする、請求項１６から２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１１から２１のいずれか一項（ａｎｙｏｎｅ）に記載の医薬組成物を含む、医療目的のための基質。
【請求項２３】
対象の組織の急性または慢性の感染症の、抗生物質による局所療法のための医薬組成物用担体として使用されるように計画および供給されることを特徴とする、請求項２２に記載の基質。
【請求項２４】
フリース、織物、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチルとアクリル酸メチルとのコポリマー、生分解性ポリマー、ポリエチレン、金属、セラミック、骨セメントおよび／または代用骨を含むことを特徴とする、請求項２２または２３に記載の基質。
【請求項２５】
前記フリースまたは前記織物が、天然または合成の繊維、とりわけポリラクチドおよび／またはコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項２４に記載の基質。
【請求項２６】
埋込み可能な人工器官、とりわけ人工股関節、人工肩関節、人工肘関節、人工膝関節もしくは椎骨インプラント、または外傷の外科手術用インプラントを含むことを特徴とする、請求項２２から２５のいずれかに記載の基質。
【請求項２７】
請求項１１から２１のいずれかに記載の医薬組成物でコーティングされたインプラント。
【請求項２８】
表面上の微生物に対する抗付着薬としての、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質と、細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質との組合せの使用。
【請求項２９】
前記細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬が、アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす抗生物質が、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、ならびに、ポリペプチド、とりわけバシトラシンおよびダプトマイシンを含有する群から選択されることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記微生物が、グラム陰性菌および／またはグラム陽性菌、好ましくはスタフィロッコシ型のもの、最も好ましくは黄色ブドウ球菌またはスタフィロコックス・エピデルミスであることを特徴とする、請求項２８から３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記表面が、金属、好ましくはチタン、鋼または金属合金、セラミックス、骨セメントまたはヒドロキシルアパタイトで作製されることを特徴とする、請求項２８から３１のいずれかに記載の使用。
【請求項１】
組織感染症の局所治療および防止のための医薬品または医療器具を製造するための医薬組成物の使用であって、該医薬組成物が、
Ａ群の少なくとも２つの異なる抗生物質または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩、あるいは
Ａ群の１つの抗生物質およびＢ群の少なくとも１つの抗生物質または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩を含み、
Ａ群が、
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬、
ギラーゼの阻害薬、または
細菌のタンパク質合成の阻害薬
として働く細胞内活性型の抗生物質を主に含み、
Ｂ群が、
細菌の細胞壁合成の阻害薬として、
細菌のタンパク質合成の阻害薬として、または
細菌の細胞壁の直接の不安定化もしくは破壊により
働く細胞外活性型の抗生物質を主に含む使用。
【請求項２】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬としてのＡ群の前記抗生物質が、アンサマイシン、とりわけ、リファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシン（ｒｉｆａｍｉｘｉｎ）などのリファマイシンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼすＢ群の前記抗生物質が、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、ならびに、ポリペプチド、とりわけバシトラシンおよびダプトマイシンを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
リファマイシンおよびホスホマイシン、とりわけリファンピンおよびホスホマイシンを含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記医薬組成物が、バイオフィルム形成阻害薬、とりわけサリチル酸または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩をさらに含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
治療対象となる感染組織が、急性的または慢性的に感染したものであることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記医薬組成物の担体として基質が使用されることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記基質が、フリース、織物、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチルとアクリル酸メチルとのコポリマー、生分解性ポリマー、ポリエチレン、金属、セラミック、骨セメントおよび／または代用骨を含むことを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記フリースまたは前記織物が、天然または合成の繊維、とりわけポリラクチドおよび／またはコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記基質が、埋込み可能な人工器官、とりわけ人工股関節、人工肩関節、人工肘関節、人工膝関節もしくは椎骨インプラント、または外傷の外科手術用インプラントを含むことを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
Ａ’群の少なくとも２つの異なる抗生物質または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩、あるいは
Ａ’群の１つの抗生物質およびＢ’群の少なくとも１つの抗生物質または薬学上許容されるその誘導体もしくは塩を含み、
Ａ’群が、
アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシン、
フルオロキノロン、とりわけモキシフロキサシン、
ストレプトグラミン、とりわけキヌプリスチンおよび／またはダルフォプリスチンを含み、
Ｂ’群が、
糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、
ホスホマイシン、
ポリペプチド、とりわけバシトラシン、ポリミキシンＢ、他のポリミキシンおよびダプトマイシン、
アミノグリコシド、とりわけアルベカシン
を含み、
糖ペプチドが、２つのみの抗生物質を含み第１の抗生物質としてアンサマイシンを含む組成物の第２の抗生物質であることはできない医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つのリファマイシンおよびホスホマイシンを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
リファマイシンが治療対象部位で０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から１０μｇ／ｍｌの濃度に達し、ホスホマイシンが治療対象部位で１から１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５から８００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０から２００μｇ／ｍｌのホスホマイシンの濃度に達するような濃度でリファマイシンおよびホスホマイシンを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つのリファマイシンおよびダプトマイシンを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
リファマイシンが治療対象部位で０．００５から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００６から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．００７５から２０μｇ／ｍｌの濃度に達し、ダプトマイシンが治療対象部位で０．１から１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５から８０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１から２０μｇ／ｍｌの濃度に達するような濃度でリファマイシンおよびダプトマイシンを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質、細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質および／またはギラーゼ阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質を含む、微生物に細胞外および／または細胞内感染した細胞の治療のための、および／または細胞の微生物感染症防止のための医薬組成物。
【請求項１７】
細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として、アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシンを含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす抗生物質として、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、ならびに、ポリペプチド、とりわけバシトラシンおよびダプトマイシンを含む、請求項１６および１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ギラーゼ阻害薬として、フルオロキノロン、とりわけモキシフロキサシンを含む、請求項１６から１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記感染した細胞が、骨芽細胞、白血球、赤血球、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、筋細胞および／または内皮細胞であることを特徴とする、請求項１６から１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記微生物感染症が、グラム陰性菌および／またはグラム陽性菌、好ましくはスタフィロッコシ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｉ）型、最も好ましくは黄色ブドウ球菌が原因で生じることを特徴とする、請求項１６から２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１１から２１のいずれか一項（ａｎｙｏｎｅ）に記載の医薬組成物を含む、医療目的のための基質。
【請求項２３】
対象の組織の急性または慢性の感染症の、抗生物質による局所療法のための医薬組成物用担体として使用されるように計画および供給されることを特徴とする、請求項２２に記載の基質。
【請求項２４】
フリース、織物、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチルとアクリル酸メチルとのコポリマー、生分解性ポリマー、ポリエチレン、金属、セラミック、骨セメントおよび／または代用骨を含むことを特徴とする、請求項２２または２３に記載の基質。
【請求項２５】
前記フリースまたは前記織物が、天然または合成の繊維、とりわけポリラクチドおよび／またはコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項２４に記載の基質。
【請求項２６】
埋込み可能な人工器官、とりわけ人工股関節、人工肩関節、人工肘関節、人工膝関節もしくは椎骨インプラント、または外傷の外科手術用インプラントを含むことを特徴とする、請求項２２から２５のいずれかに記載の基質。
【請求項２７】
請求項１１から２１のいずれかに記載の医薬組成物でコーティングされたインプラント。
【請求項２８】
表面上の微生物に対する抗付着薬としての、細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬として作用する少なくとも１つの抗生物質と、細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす少なくとも１つの抗生物質との組合せの使用。
【請求項２９】
前記細菌のＲＮＡポリメラーゼの阻害薬が、アンサマイシン、とりわけリファンピン、リファブチン、リファペンチンまたはリファミキシンなどのリファマイシンを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記細菌の細胞壁またはその合成に影響を及ぼす抗生物質が、糖ペプチド、とりわけバンコマイシンまたはテイコプラニン、ホスホマイシン、ならびに、ポリペプチド、とりわけバシトラシンおよびダプトマイシンを含有する群から選択されることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記微生物が、グラム陰性菌および／またはグラム陽性菌、好ましくはスタフィロッコシ型のもの、最も好ましくは黄色ブドウ球菌またはスタフィロコックス・エピデルミスであることを特徴とする、請求項２８から３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記表面が、金属、好ましくはチタン、鋼または金属合金、セラミックス、骨セメントまたはヒドロキシルアパタイトで作製されることを特徴とする、請求項２８から３１のいずれかに記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図４ｇ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図６】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図４ｇ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図５ｄ】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５３４２１３（Ｐ２０１０−５３４２１３Ａ）
【公表日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１７３１５（Ｐ２０１０−５１７３１５）
【出願日】平成２０年７月２３日（２００８．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００６０４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１２９８６
【国際公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【出願人】（５０４３６７８１８）バイオメット ドイチュラント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (2)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＴ ＤＥＵＴＳＣＨＬＡＮＤ ＧＭＢＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２３日（２００８．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００６０４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１２９８６
【国際公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【出願人】（５０４３６７８１８）バイオメット ドイチュラント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (2)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＴ ＤＥＵＴＳＣＨＬＡＮＤ ＧＭＢＨ
【Ｆターム（参考）】
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