受容体ポリペプチドを有する植物細胞
異種(例えばヒト)受容体ポリペプチドまたはその断片を含む新規なトランスジェニック植物細胞を開示する。これらの植物細胞を使用して、受容体ポリペプチドまたはその断片と相互作用することのできる分子(すなわちリガンド)を同定することが可能である。これらの植物細胞を使用して、トランスジェニック植物細胞に内因性のリガンド、または植物細胞に添加される外因性リガンドを同定することができる。このような受容体ポリペプチドリガンドは新規医薬の同定に使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体ポリペプチドと相互作用可能な分子を同定するのに有用な方法および材料に関する。特に、本発明は核ホルモン受容体ポリペプチドと相互作用するリガンドを同定するためにトランスジェニック植物細胞を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歴史的には、植物は化学物質の豊富な供給源であり、これらの化学物質は効力のある薬であることが証明されている。その一例はワイルドメキシカンヤム芋という、ベラクルース(Veracruz)の山々に生育する食べられない「cabeza de negro」ヤム芋の根である。この植物は、コルチゾンまたは女性性ホルモンであるプロゲステロン(エストラジオールの前駆体)へと変換可能なステロイドを産生する。
【０００３】
多くの臨床上活性のある薬物は受容体ポリペプチドと相互作用するものであり、受容体のコグネイトシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。植物由来のこのような薬物の例を下記の表に示す。
【０００４】
【０００５】
受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を同定するアッセイが望ましい。例えば米国特許第5,665,543号を参照されたい。しかしながら、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する植物由来の化合物を同定するための現在のアッセイの多くは、多数の化合物をスクリーニングすることができない。さらに、ある受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして植物由来の化合物が同定されたとしても、そのような化合物の多くは、哺乳動物に投与したときに深刻な副作用を示すことがわかっている。受容体ポリペプチドのリガンドとなる新規な植物由来化合物を迅速に、そして効率的に同定するためのニーズが存在している。
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明は、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸で形質転換された植物細胞において受容体ポリペプチド(「受容体」)と相互作用可能なリガンドを同定するための方法およびトランスジェニック植物細胞に関する。かくして、本発明は、受容体に対するリガンドを同定する方法であって、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸を含んでなる複数の植物細胞を用意し、該受容体のシグナル伝達活性に応答するレポーターを用いて、１以上の候補リガンドが該受容体と相互作用するかを判別することを含んでなる前記方法に関する。植物細胞は、少なくとも１つの植物体の一部、例えば葉細胞または毛状体細胞であり得る。植物細胞は組織培養の細胞であり得る。植物細胞は、機械的ストレス、熱ストレス、または真菌ストレスにさらされたものであってもよい。
【０００７】
異種受容体は、リガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含み得る。異種受容体は、核ホルモン受容体ポリペプチドであり得る。核ホルモン受容体は、昆虫核ホルモン受容体または哺乳動物核ホルモン受容体であってよく、例えばAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRが挙げられる。複数の植物細胞はさらに、二量体化受容体ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。異種受容体はキメラ受容体、例えばリガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含むキメラ受容体であり得る。キメラ受容体のトランス活性化ドメインは、VP16トランス活性化ドメイン、またはトウモロコシ転写因子Ｃトランス活性化ドメインとすることができる。
【０００８】
キメラ受容体のDNA結合ドメインは、AR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXRまたはRXRのDNA結合ドメインであり得る。異種受容体はさらに、二量体化配列を含み得る。異種受容体はさらに、局在化シグナルを含み得る。局在化シグナルは、細胞質局在化シグナル、核局在化シグナル、ER局在化シグナル、ゴルジ装置局在化シグナル、または細胞膜局在化シグナルであり得る。
【０００９】
１以上の候補リガンドは、植物体の一部である植物細胞により合成され得る。候補リガンドは、前記複数の植物細胞により合成される内因性リガンドであってもよい。
【００１０】
レポーターは、分光測光的に測定可能な活性(例えば蛍光、または生物発光)を有するポリペプチドであり得る。レポーターポリペプチドはエピトープタグを含み得る。エピトープタグは、FLAG(登録商標)タグ、HAタグ、c-Mycエピトープ、AU1タグまたは6-HISタグとすることができる。レポーターポリペプチドは、GFP、GUS、YFP、RFP、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼであり得る。レポーターポリペプチドを前記複数の植物細胞中の組換え核酸にコードさせて、この組換え核酸の転写を該受容体のシグナル伝達活性により仲介させることが可能である。レポーターは、異種受容体ポリペプチド中に存在するDNA結合ドメインと相互作用可能な受容体応答エレメントに応答性であり得る。
【００１１】
異種受容体ポリペプチドをコードする核酸は、植物組織または器官（例えば葉、根、茎および種子）での優先的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結させることができる。いくつかの実施形態において、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸は、構成的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結され得る。
【００１２】
受容体ポリペプチドは、エピトープを含み得る。エピトープは、天然に存在するものであってもよく、またはFLAG(登録商標)もしくはHISタグなどの合成エピトープであってもよい。前記方法はさらに、質量分析を用いてリガンドを同定することを含み得る。
【００１３】
受容体ポリペプチドは、該受容体を膜（例えば、小胞体膜、ゴルジ膜、核膜、ペルオキシソーム膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、および原形質膜からなる群より選択される膜)へと標的化するシグナル配列を含み得る。
【００１４】
前記方法は、該受容体を発現する細胞を単離すること、または質量分析を用いてリガンドを同定することを含み得る。いくつかの実施形態において、前記方法は、レポーターを発現する細胞を単離すること、または質量分析を用いてリガンドを同定することを含む。
【００１５】
前記複数の植物細胞はさらに、ステロール生合成ポリペプチド、例えば、スクアレンシンターゼポリペプチド、ルペオールシンターゼポリペプチド、シクロアルテノールシンターゼポリペプチド、ステロールメチルオキシダーゼポリペプチド、ジテルペンシンターゼポリペプチド、セスキテルペンシンターゼポリペプチド、またはテルペノイドシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含み得る。前記複数の植物細胞はさらに、フラボノイド生合成ポリペプチド、例えば、カルコンイソメラーゼポリペプチド、カルコンレダクターゼポリペプチド、ジヒドロフラボノールレダクターゼポリペプチド、イソフラボンシンターゼポリペプチド、イソフラボンレダクターゼポリペプチド、またはフラボノイド3-ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸を含み得る。前記複数の植物細胞はさらに、フェノール系生合成ポリペプチド、テルペノイド生合成ポリペプチド、またはアルカロイド生合成ポリペプチドをコードする核酸を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明はまた、核ホルモン受容体リガンドをスクリーニングする方法に関する。この方法は、核ホルモン受容体ポリペプチドのコード配列、およびレポーターとして転写される配列を含む少なくとも１つの構築物を含有する１個以上の植物細胞を用意することを含む。核ホルモン受容体ポリペプチドは、リガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含み、ここでレポーターとして転写される配列は、DNA結合ドメインと相互作用可能な受容体応答エレメントに機能的に連結されており、ここでレポーターの活性は、該配列の受容体／リガンド結合依存性転写の際に検出可能である。候補リガンドを、構築物からの受容体ポリペプチドの転写および該受容体ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にする条件下で受容体ポリペプチドと接触させ、レポーターの活性が検出されるか否か測定する。植物細胞は、少なくとも１つの植物体の一部、例えば葉細胞または毛状体細胞であり得る。植物細胞は、組織培養の細胞、例えばカルス培養の細胞であり得る。植物細胞は、機械的ストレス、熱ストレス、または真菌ストレスにさらされたものであり得る。核ホルモン受容体は、哺乳動物核ホルモン受容体、例えばAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRであり得る。複数の植物細胞はさらに、二量体化受容体ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
【００１７】
核ホルモン受容体は、キメラ受容体であり得る。キメラ受容体のトランス活性化ドメインは、VP16トランス活性化ドメイン、またはトウモロコシ転写因子Ｃトランス活性化ドメインとすることができる。キメラ受容体のDNA結合ドメインは、AR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXRまたはRXRのDNA結合ドメインであってよい。核ホルモン受容体はさらに、二量体化配列を含み得る。核ホルモン受容体ポリペプチドのコード配列は、植物組織または器官（例えば葉、根、茎および種子）での優先的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結され得る。いくつかの実施形態において、核ホルモン受容体ポリペプチドのコード配列は、構成的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結され得る。
【００１８】
核ホルモン受容体はさらに、局在化シグナル、例えば、細胞質局在化シグナル、核局在化シグナル、ER局在化シグナル、ゴルジ装置局在化シグナル、または細胞膜局在化シグナルを含み得る。
【００１９】
１以上の候補リガンドは植物細胞に合成させることが可能であり、植物細胞は植物体の一部または全部であり得る。候補リガンドは、前記複数の植物細胞により合成される内因性リガンドであり得る。
【００２０】
前記転写される配列は、分光測光的に測定可能な活性（例えば蛍光、または生物発光)を有するポリペプチドをコードし得る。前記転写される配列はさらにエピトープタグをコードしてもよい。エピトープタグは、FLAG(登録商標)タグ、HAタグ、c-Mycエピトープ、AU1タグまたは6-HISタグであり得る。レポーターポリペプチドは、GFP、GUS、YFP、RFP、ルシフェラーゼまたはβガラクトシダーゼであり得る。
【００２１】
受容体ポリペプチドは、該受容体を膜、例えば、小胞体膜、ゴルジ膜、核膜、ペルオキシソーム膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、または原形質膜へと標的化するシグナル配列を含み得る。前記方法はさらに、該受容体を発現する細胞を単離することを含み得る。前記方法はさらに、質量分析を用いてリガンドを同定することを含み得る。
【００２２】
前記１個以上の植物細胞はさらに、ステロール生合成ポリペプチド、例えば、スクアレンシンターゼポリペプチド、ルペオールシンターゼポリペプチド、シクロアルテノールシンターゼポリペプチド、またはステロールメチルオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸を含み得る。前記１個以上の植物細胞はさらに、フラボノイド生合成ポリペプチド、例えば、カルコンイソメラーゼポリペプチド、カルコンレダクターゼポリペプチド、ジヒドロフラボノールレダクターゼポリペプチド、イソフラボンシンターゼポリペプチド、イソフラボンレダクターゼポリペプチド、またはフラボノイド3-ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸を含み得る。前記１個以上の植物細胞はさらに、フェノール系生合成ポリペプチド、テルペノイド生合成ポリペプチド、またはアルカロイド生合成ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
【００２３】
本発明はまた、核ホルモン受容体ポリペプチドに対して40％を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする第１組換え核酸(ここで該ポリペプチドは調節エレメントに機能的に連結されている)、および、レポーターコード配列に機能的に連結された核内受容体応答エレメントを含む第２組換え核酸を含有するトランスジェニック植物細胞に関する。核ホルモン受容体ポリペプチドは、AR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRであり得る。いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、一過性に形質転換された細胞である。
【００２４】
本発明の他の構成および効果は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。特に断らない限り、本明細書において用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般的に理解される意味を有する。本明細書に記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。不一致が生じた場合には、定義を含めて本明細書が優先する。開示される材料、方法および実施例は説明のみを目的としたものであり、限定を意図したものではない。当業者ならば、本発明を実施するために、本明細書に記載した方法および材料と類似または均等な方法および材料が使用可能であると理解するであろう。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、受容体ポリペプチドと相互作用する分子を同定するための方法および材料を提供する。一般に、このような分子はリガンドと呼ばれており、受容体のコグネイトシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる。提供する植物および技術は、トランスジェニック植物細胞に適用される多種多様の外因性候補リガンドをスクリーニングするために、また、トランスジェニック植物細胞の内因性リガンドを効率的に同定するために使用可能である。本方法によって同定されたリガンドは、受容体のコグネイトシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し、医薬として有用であり得る。
【００２６】
本発明に従った方法は、異種受容体をコードする核酸を含む植物細胞の、該受容体と相互作用する１以上の候補リガンドを同定するための使用に関するが、ここで、この系はまた、レポーターを利用し、該レポーターの活性が異種受容体のシグナル伝達活性のリガンドによるモジュレーションに応答性である。いくつかの実施形態において、候補リガンドは異種受容体を発現する植物細胞中に存在し、それゆえに、そのような植物細胞が受容体と相互作用するリガンドを保有するか否かを判別するための、簡便な自己内蔵型系を提供する。その後、従来の方法ではこれまで同定されていなかったリガンドを同定するために、受容体活性のモジュレーションを示す植物細胞中に存在する分子を特徴付けすることができる。
【００２７】
Ｉ．異種受容体
本明細書に記載する方法に使用するためのトランスジェニック植物および植物細胞は、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸を含有する。異種受容体ポリペプチドとは、本方法に使用される植物細胞の対応する非トランスジェニック植物中には存在しない受容体ポリペプチドのことである。異種受容体ポリペプチドは、天然に存在する受容体の全長コード配列によりコードされるポリペプチドであり得る。多くの異種受容体ポリペプチドが、本明細書に記載する方法での使用に適している。
【００２８】
特に興味がもたれるのは核ホルモン受容体、とりわけヒト核ホルモン受容体である。核ホルモン受容体は、ホルモンおよび栄養素として誘導される親油性リガンドに結合する、遺伝子制御性のDNA結合タンパク質の大きなファミリーである。核ホルモン受容体は、標的遺伝子の転写を活性化または抑制することのできるDNA結合タンパク質であることが久しく知られている。多くの核ホルモン受容体が同定されており、例えば、レチノイドＸ受容体、レチノイン酸受容体、プロゲステロン受容体、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、およびビタミンＤ受容体が挙げられる。核ホルモン受容体は、進化の過程で保存されてきたと考えられており、細胞の成長と増殖、発生、およびホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすと考えられている。核ホルモン受容体の変化は、多くの疾患に関係している。
【００２９】
特定の実施形態において、植物細胞中に存在する異種受容体ポリペプチドは、次のものであり得る：レチノイドＸ受容体(RXR)、肝細胞核因子４(HFN4)、精巣受容体、テールレス(tailless)遺伝子ホモログ(TLX)、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子(COUP-TF)、甲状腺ホルモン受容体(THR)、レチノイン酸受容体(RAR)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)、リバースErb(reverb)、RAR関連オーファン受容体(ROR)、ステロイド産生因子-１(SF-1)、肝臓受容体ホモログ-1(LRH-1)、肝臓Ｘ受容体(LXR)、ファルネソイドＸ受容体(FXR)、ビタミンＤ受容体(VDR)、エクジソン受容体(EcR)、プレグナンＸ受容体(PXR)、構成的アンドロスタン受容体(CAR)、ニューロン由来活性化受容体(NOR1)、核内受容体１(NURR1)、エストロゲン受容体(ER)、エストロゲン関連受容体(ERR)、グルココルチコイド受容体(GR)、アンドロゲン受容体(AR)、プロゲステロン受容体(PR)、またはミネラルコルチコイド受容体(MR)。
【００３０】
代表的な核ホルモン受容体は、PPAR受容体ポリペプチドである。PPAR受容体は、核ホルモン受容体のスーパーファミリーのメンバーであると考えられている。PPARは、リガンド結合時に活性化され、ヘテロ二量体の形態でのPPAR／リガンドの、応答配列(ペルオキシソーム増殖因子応答エレメント、PPRE)への結合は、PPREの下流に機能的に配置された配列の転写を活性化する。PPAR受容体ポリペプチドは、PPARα、PPARβ、およびPPARγと呼ばれる３種のサブタイプに分類され、cDNA配列が得られている。例えば米国特許公開第20020119499号を参照のこと。
【００３１】
別の代表的な核ホルモン受容体はERポリペプチドである。エストロゲン受容体は、エストロゲンなどのリガンドの結合により活性化される。ERホモ二量体／リガンド複合体の、cis-応答性エストロゲン受容体エレメント(ERE)への結合は、EREの3'側に機能的に配置された配列の転写を活性化する。ヒトでは２種のエストロゲン受容体、ERαおよびERβが知られている。この２種の受容体は共通の構造ドメインおよび機能ドメインを有している。すなわち、これらはエストロゲンに高い親和性で結合し、かつ類似の様式でエストロゲン応答エレメントに結合するが、組織分布、転写活性、およびノックアウトモデルにおける表現型に関しては異なる。
【００３２】
レチノイドＸ受容体(RXR)は、ホモ二量体としてリガンド依存的にRXR応答エレメントでDNAと結合し得る。このようなリガンドの１種は9-cisレチノイン酸である。RXRはまた、レチノイン酸受容体(RAR)、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、NGFI-Bおよび他の核内受容体と機能的なヘテロ二量体を形成することができる。マウスにおいては、レチノイドＸ受容体は、RXRα(RXRA)、RXRβ(RXRB)、およびRXRγ(RXRG)と命名された３種のサブタイプに分類されている。
【００３３】
肝細胞核因子４(HFN4)は、ホモ二量体としてリガンド依存的に２つのコアモチーフ5'-RG(G/T)TCAを含む応答エレメント、または１ヌクレオチドだけ離れている密接に関連した配列(直接反復配列、またはDR1エレメント)でDNAと結合することができる。
【００３４】
精巣受容体２(TR2)は、ホモ二量体としてリガンド依存的にDNAと結合することができる。TR2／リガンド複合体は、種々の間隔をおいた２つのAGGTCA半部位(half-site)直接反復配列を含む応答エレメントに結合する。このような複合体はまた、細胞性レチノール結合タンパク質IIプロモーター領域(CRBPIIp)、SV40＋55領域、およびレチノイン酸応答エレメントβ（RAREβ)などの応答エレメントに結合することもできる。
【００３５】
甲状腺ホルモン受容体ポリペプチド(THR)は、ホモ二量体として、およびヘテロ二量体として(例えばレチノイドＸ受容体と共に)、DNAに結合することができる。これらのポリペプチドはTHR応答エレメントに結合することができる。ステロイドホルモン受容体とは異なり、甲状腺ホルモン受容体はリガンドの不在下でDNAに結合することができ、この結合は転写の低減をもたらし得る。ホルモンが結合すると、該受容体はコンフォメーション変化を起こし、その結果転写に正の影響を及ぼす。ヒトにおいては、甲状腺ホルモン受容体は、THRα(THRA)およびTHRβ(THRB)と命名された２種のサブタイプに分類されている。
【００３６】
レチノイン酸受容体(RAR)ポリペプチドは、ホモ二量体としてリガンド依存的にRARエレメント(RARE)でDNAに結合することができる。このようなリガンドの１種はレチノイン酸である。いくつかのRARイソ型が哺乳動物で知られており、RARα、RARβ、およびRARγなどが挙げられる。
【００３７】
アンドロゲン受容体(AR)は、ホモ二量体としてリガンド依存的にアンドロゲン応答エレメント(ARE)でDNAに結合することができる。このようなリガンドの１種は、7α-メチル-17α-(2'-(E)-ヨードビニル)-19-ノルテストステロンである。
【００３８】
適当な異種受容体ポリペプチドは、種々の方法で同定することができる。既知の受容体に対する抗体を使用する共免疫沈降アッセイを用いて、候補ポリペプチドを同定することができる。候補ポリペプチドを同定する別の方法は、変異型受容体の機能的相補性によるものである。受容体の適当な候補はまた、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列アライメントを解析することにより同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに対してクエリーを実行することにより、異種受容体ポリペプチドのオーソログを同定し得る。配列解析は、既知の受容体のアミノ酸配列を用いた重複のないデータベースのBLASTまたはPSI-BLAST解析を含み得る。40％を超える配列同一性を示すデータベース中のタンパク質は、受容体としての適合性についてさらに評価すべき候補である。所望ならば、さらに評価する候補の数を絞り込むために、このような候補の手検査を行ってもよい。手検査は、受容体中に存在すると考えられるドメインをもつらしい候補を選択することにより行ってもよい。
【００３９】
ある対象核酸またはアミノ酸配列(例えばヒトERα受容体ポリペプチド)の、別の「標的」核酸またはアミノ酸配列に対する同一性パーセントは、次のように求めることができる。まず、標的核酸またはアミノ酸配列を、BLASTZ(BLASTNおよびBLASTPを内包する)のスタンド-アローンバージョン(例えばバージョン2.0.14)からのBLAST2 Sequences(Bl2seq)プログラムを用いて、対象核酸またはアミノ酸配列と比較しアライメントすることができる。BLASTZの独立型バージョンは、<www.fr.com/blast>またはwww.ncbi.nlm.nih.gov>から得ることができる。BLASTZ、特にBl2seqプログラムの使用方法を説明した説明書は、BLASTZに付随する'readme'ファイルに見出せる。これらのプログラムはまた、Karlinら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264; Karlinら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873;およびAltschulら, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389に詳述されている。
【００４０】
Bl2seqは、対象配列と標的配列との比較を、BLASTN(核酸配列を比較するために使用)またはBLASTP(アミノ酸配列を比較するために使用)アルゴリズムを用いて行う。典型的には、アミノ酸配列アライメントを行うときには、BLOSUM62スコアリングマトリクスのデフォルトパラメーターである、ギャップ存在コスト11および伸長コスト１、ワードサイズ３、期待値10、残基当たりのコスト１、およびラムダ比0.85を使用する。出力ファイルは、標的配列と対象配列間のアライメントされた相同性の領域を含む。一旦アライメントされたならば、任意のマッチする位置から開始して任意の他のマッチする位置で終了する対象配列からの配列とアライメントした、標的配列からの連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基(すなわちギャップを除外する)の数を数えることにより、長さを決定する。マッチする位置とは、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、標的配列および対象配列の両方に存在する位置である。構造的に保存されたドメイン(例えばαヘリックス、βシート、およびループ)間の配列アライメントを最大化するために、１個以上の残基のギャップを標的配列または対象配列に挿入することができる。
【００４１】
ある特定の長さにわたる同一性パーセントは、その特定の長さにわたってマッチする位置の数を数え、その数を長さで割り、得られた値に100を掛けることにより決定される。例えば、(i) 500アミノ酸の標的配列が対象アミノ酸配列と比較され、(ii) Bl2seqプログラムが、対象配列の領域とアライメントされた標的配列からの200アミノ酸（その200アミノ酸領域の最初と最後のアミノ酸がマッチである）を提示し、(iii) その200のアライメントされたアミノ酸にわたるマッチの数が180であるとすると、前記500アミノ酸標的配列は、200の長さを含み、その長さにわたる配列同一性が90％(すなわち、180÷200×100=90)となる。いくつかの実施形態において、適当な異種受容体ポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトERαポリペプチドのアミノ酸配列に対して40％を超える配列同一性(例えば＞80％、＞70％、＞60％、＞50％または＞40％)を示す。他の実施形態において、適当な異種受容体ポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトPPARαポリペプチドのアミノ酸配列に対して40％を超える配列同一性(例えば＞80％、＞70％、＞60％、＞50％または＞40％)を示す。他の特定の実施形態において、適当な異種受容体ポリペプチドのアミノ酸配列は、レチノイドＸ受容体(RXR)ポリペプチド、肝細胞核因子４(HFN4)ポリペプチド、精巣受容体ポリペプチド、テールレス遺伝子ホモログ(TLX)ポリペプチド、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子(COUP-TF)ポリペプチド、甲状腺ホルモン受容体-α(THRA)ポリペプチド、甲状腺ホルモン受容体-β(THRB)ポリペプチド、レチノイン酸受容体(RAR)ポリペプチド、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)ポリペプチド、リバースErb(reverb)ポリペプチド、RAR関連オーファン受容体(ROR)ポリペプチド、ステロイド産生因子-１(SF-1)ポリペプチド、肝臓受容体ホモログ-1(LRH-1)ポリペプチド、肝臓Ｘ受容体(LXR)ポリペプチド、ファルネソイドＸ受容体(FXR)ポリペプチド、ビタミンＤ受容体(VDR)ポリペプチド、エクジソン受容体(EcR)ポリペプチド、プレグナンＸ受容体(PXR)ポリペプチド、構成的アンドロスタン受容体(CAR)ポリペプ
チド、ニューロン由来活性化受容体(NOR1)ポリペプチド、核内受容体１(NURR1)ポリペプチド、エストロゲン受容体(ER)ポリペプチド、エストロゲン関連受容体(ERR)ポリペプチド、グルココルチコイド受容体(GR)ポリペプチド、アンドロゲン受容体(AR)ポリペプチド、プロゲステロン受容体(PR)ポリペプチド、またはミネラルコルチコイド受容体(MR)ポリペプチドのアミノ酸配列に対して40％を超える配列同一性(例えば＞80％、＞70％、＞60％、＞50％または＞40％)を示す。
【００４２】
対象配列とアライメントされる核酸またはアミノ酸標的配列は、多くの異なる長さ（各長さがそれ自体の同一性パーセントを有する）にしうることが理解されよう。同一性パーセント値は、最も近い小数点以下第１位に端数を切り捨てることができると留意されたい。例えば、78.11、78.12、78.13および78.14は78.1に切り下げ、一方78.15、78.16、78.17、78.18および78.19は78.2へと切り上げる。また、長さの値は必ず整数であることにも注意されたい。
【００４３】
鋳型（つまり対象）ポリペプチド中の保存領域を同定することは、野生型受容体の変異体の作製を促進し得る。保存領域は、鋳型ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の、反復配列の領域、何らかの二次構造(例えばヘリックスやβシート)を形成している領域、正もしくは負に荷電されたドメインを確立している領域、またはタンパク質モチーフもしくはドメインに相当する領域の位置を決定することにより同定することができる。例えば、http://www.sanger.ac.uk/Pfam/およびhttp://genome.wustl.edu/Pfam/で、種々のタンパク質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を掲載しているPfamウェブサイトを参照されたい。Pfamデータベースに収録されている情報の解説は、Sonnhammerら, 1998, Nucl. Acids Res. 26: 320-322；Sonnhammerら, 1997, Proteins 28:405-420；およびBatemanら, 1999, Nucl. Acids Res. 27:260-262に記載されている。Pfamデータベースからは、タンパク質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を鋳型ポリペプチド配列とアライメントさせて保存領域を判別することができる。
【００４４】
保存領域はまた、近縁種からの同一または関連ポリペプチドの配列をアライメントすることにより確認することができる。近縁種は好ましくは同じ科に由来するものである。いくつかの実施形態においては、２つの異なる種からの配列のアライメントで十分である。例えば、ヒトおよびチンパンジーからの配列を使用して、１以上の保存領域を同定することができる。
【００４５】
典型的には、保存領域を同定するためには、少なくとも約35％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが有用である。関連タンパク質の保存領域は時には少なくとも約40％のアミノ酸配列同一性を示す(例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％のアミノ酸配列同一性)。いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドと鋳型ポリペプチドの保存領域は、少なくとも92、94、96、98または99％のアミノ酸配列同一性を示す。アミノ酸配列同一性はアミノ酸配列またはヌクレオチド配列から推定することができる。
【００４６】
天然に存在する全長受容体の少なくとも１つのリガンド結合活性が保持されているという条件で、天然に存在する受容体の変異体、断片および融合体であるポリペプチドもまた対象とされる。典型的には、天然受容体の変異体、断片および融合体のリガンド結合活性は、野生型受容体のリガンド結合活性の少なくとも40％であり、より典型的には野生型受容体の活性の50〜80％、さらに典型的には70〜90％であり、さらに典型的には80％を超える。
【００４７】
異種受容体ポリペプチドは、天然の全長コード配列の保存的置換、挿入または欠失を有しうる。当業者であれば、コード配列中の単一アミノ酸または小割合のアミノ酸を変更、付加または欠失させる、ポリペプチドの個々の置換、欠失または付加は「保存的に改変された変異体」（この場合には、かかる改変により、あるアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換が生じる）をもたらすことが理解されよう。機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換の一覧表は、当技術分野でよく知られている。次の６グループはそれぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：
１) アラニン(Ａ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)；
２) アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；
３) アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)；
４) アルギニン(Ｒ)、リジン(Ｋ)；
５) イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチオニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；および
６) フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)。
【００４８】
いくつかの場合においては、適当な受容体を、相同受容体であるポリペプチドのコンセンサス機能ドメインおよび／または保存領域を基にして合成することができる。コンセンサスドメインおよび保存領域は、上述の相同ポリペプチド配列解析により同定し得る。このような合成ポリペプチドが異種受容体として使用するのに適しているかは、異種受容体ポリペプチドの機能的相補性により評価することができる。
【００４９】
あるいはまた、本発明の異種受容体は、天然に存在する受容体の断片であってもよい。通常、このような断片は、天然受容体のリガンド結合ドメインを含むものである。ドメインとは、ポリペプチド中の実質的に連続したアミノ酸のグループであって、タンパク質ファミリーおよび／またはタンパク質の一部を特徴づけるために用いることができる。このようなドメインは、保存された(１)一次配列、(２)二次構造、および／または(３)三次元コンフォメーションを含みうる「フィンガープリント」(fingerprint)または「シグネチャー」(signature)を有する。
【００５０】
一般にこれらのドメインは、特定のin vitroおよび／またはin vivo活性と関連づけられている。ドメインは、10アミノ酸〜100アミノ酸の長さ、例えば10〜50アミノ酸、または25〜100アミノ酸、または35〜65アミノ酸、または35〜55アミノ酸、または45〜60アミノ酸の長さを有しうる。典型的には、核ホルモン受容体ポリペプチドは、リガンド結合ドメイン、DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含んでなる。核ホルモン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列中のサブ領域は、Ｎ末端からＣ末端の順に、Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦと呼ぶことができる。
【００５１】
Ａ. リガンド結合ドメイン
大きなＣ末端リガンド結合ドメイン(LBD)は、典型的には、天然の核ホルモン受容体中に観察されるが、これらの受容体は一般的に、リガンド結合ドメイン中にやはり存在する受容体二量体化接触部位から離れて、３箇所の別個のクラスターとしてリガンド接触部位を有する。保存されたE1サブ領域、ならびにあまりよく保存されていないヘプタッド９(h9)領域および第２トランス活性化ドメイン(AF2)もまた、リガンド結合ドメイン内に存在する。
【００５２】
リガンド結合ドメインは一般的に、親油性の結合空隙の周辺に組織化されたいくつかの小さなβ鎖と11〜13のαヘリックスとのサンドイッチである三次構造を有する。表１に、天然に存在する受容体のリガンド結合ドメインの具体的なアミノ酸配列を示す。典型的には、リガンド結合ドメインは、E1サブ領域に、保存されたリジン、プロリン、フェニルアラニン、ロイシン、アスパラギン酸、およびグルタミン残基を有し得る(下記表１)。例えば、ERリガンド結合ドメイン中の保存アミノ酸は、残基362(リジン)、365(プロリン)、367(フェニルアラニン)、370、378、379(いずれもロイシン)、374(アスパラギン酸)、および375(グルタミン)である。典型的には本発明の異種受容体のリガンド結合ドメインは、天然に存在するヒト核ホルモン受容体ファミリーのメンバーに対する保存された一次、二次、および／または三次構造類似性を示す変異体、断片または融合体であり得る。in vitroまたはin vivoで、異種受容体のリガンド結合ドメインは、核ホルモン受容体の既知のリガンドに結合する能力を示す。典型的には、異種受容体ポリペプチドは少なくとも300nMの結合定数(Kd)、例えば少なくとも200nM、少なくとも100nM、少なくとも75nM、または少なくとも50nMのKdで、既知のリガンドに結合する能力を保持する。リガンド結合ドメインの例を以下の表１に示す。
【表１】
【００５３】
Ｂ. DNA結合ドメイン
異種受容体ポリペプチドは、DNA結合ドメインと呼ばれ、また「Ｃドメイン」としても知られているドメインを含み、このドメインはDNA上の認識部位に結合する。DNA結合ドメインは典型的には(Cys)４型のジンクフィンガーDNA結合モチーフを２つ含む。いくつかの実施形態において、例えば、甲状腺受容体ポリペプチドの場合において、可変性Ｃ末端伸長部(CTE)がジンクフィンガーモチーフに挟まれており、DNA結合に関与している。DNA結合ドメインの例を以下の表２に示す。
【表２】
【００５４】
異種受容体ポリペプチドのDNA結合ドメインは、リガンド依存的に、特定のcis-応答性ヌクレオチド配列(受容体応答エレメント)に結合する。典型的な結果として、受容体応答エレメントと関連しておりかつ該エレメントに機能的に連結された転写開始部位からの転写の活性化が起こる。よって、転写開始部位からの転写の活性化はリガンド依存的である。いくつかの実施形態において、DNA結合ドメインがそのコグネイト受容体応答エレメントに結合するのを促進するには、適当なシャペロニンまたは他の成分が必要である。
【００５５】
Ｃ. トランス活性化ドメイン
異種受容体ポリペプチドは典型的には、個別のDNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを有する。典型的には、Ａ／Ｂドメインとしても知られているトランス活性化ドメインは、細胞の転写・翻訳機構のタンパク質を転写開始部位と接触させて、転写を開始させることができる。異種受容体ポリペプチドのトランス活性化ドメインは、合成されたものであるか、またはリガンド結合ドメインとは異なる供給源に由来するものであり得る。適当なトランス活性化ドメインの例としては、ヘルペスウイルスVP16ポリペプチドおよびトウモロコシ転写因子Ｃポリペプチドのトランス活性化ドメインが挙げられる。
【００５６】
Ｄ. 二量体化配列
いくつかの実施形態において、異種受容体ポリペプチドは、二量体化配列を含んでなる。いくつかの場合に、リガンド／受容体複合体がその認識DNA部位に結合するためには二量体化が必要である。例えばPPARは、レチノイドＸ受容体(RXR)とヘテロ二量体を形成して、ヘテロ二量体の形態でPPREに結合することが知られている。また、他の核内受容体と同様に、PPARは、転写コアクチベーターの一群と相互作用して転写活性化作用を促進すると考えられている。
【００５７】
二量体化配列は、受容体ポリペプチドがホモまたはヘテロ二量体を生じるようにすることができる。受容体のアミノ酸配列中のいくつかのモチーフまたはドメインは、所定の核内受容体(例えばDNA結合(Ｃ)ドメインまたはリガンド結合(Ｅ)ドメイン)のヘテロ二量体化またはホモ二量体化に影響を与えることができる。ＤドメインのＮ末端部分(ヒンジ領域としても知られている)もまたヘテロ二量体化においてある役割を果たし得る。
【００５８】
このことから、いくつかの実施形態において、本明細書に記載する異種受容体はヘテロ二量体としてそのコグネイト応答エレメントに結合する。そのような実施形態においては、本方法に用いる植物細胞は、異種受容体ポリペプチドをコードする配列に加えて、二量体化パートナーとして、第２の受容体ポリペプチドを発現するコード配列を含有する。ヘテロ二量体として結合する核ホルモン受容体は、例えば、レチノイン酸受容体、甲状腺受容体、ビタミンＤ受容体、ファルネソイドＸ受容体、オキシステロール受容体、ペルオキシソーム増殖因子受容体またはエクジソン受容体であってもよく、その各々はレチノイドＸ受容体とのヘテロ二量体として結合する。このような受容体を用いる場合、本方法に使用する植物細胞は、異種受容体ポリペプチドをコードする配列に加えて、二量体化パートナーとして、レチノイドＸ受容体を発現するコード配列を含有する。他の代表的ヘテロ二量体としては、RXR/LXR、RXR/PXR、RXR/CAR、RXR/THR、RXR/THRα、RXR/THRβ、RXRα/THRβ、RXRα/THRα、RXRβ/THRα、RXRβ/THRβおよびUSP/EcR、RXRα/PPARγ、RXRα/PPARα、RXRα/RARα、RXRα/RARβが挙げられる。
【００５９】
Ｅ. 局在化シグナル
本発明に有用な異種受容体ポリペプチドはまた、局在化シグナル配列、例えば、細胞質局在化シグナル、核局在化シグナル、ER局在化シグナル、ゴルジ装置局在化シグナル、または細胞膜局在化シグナルを含み得る。異種受容体は、グルココルチコイド受容体およびミネラルコルチコイド受容体の場合と同様に、リガンドの不在下では細胞の細胞質に存在し、リガンドに結合すると核または他の細胞区画へと少なくとも一部が移動することが理解されている。細胞質局在化シグナルは、例えば細胞質／核局在の比を増加させることができる。
【００６０】
このような配列は、天然の核ホルモン受容体の内因性局在化シグナルまたは合成配列であり得る。細胞質局在化シグナルの一例は、異種受容体ポリペプチドを細胞の細胞質膜へと向かわせることのできるドメインである「膜固着ドメイン」である。適当な膜固着ドメインとしては、例えば、ミリストイル化(MYR)ドメイン、例えばSrcファミリーキナーゼ由来；プレクストリン相同(PH)ドメイン、例えばインスリン受容体基質、ホスホリパーゼＣ(PLC)、もしくはプロテインキナーゼＢ(PKB)由来；または、C2ドメイン、例えばプロテインキナーゼＣ(PKC)もしくはPI3キナーゼ由来；が挙げられる。
【００６１】
Ｆ. エピトープタグ
いくつかの実施形態において、異種受容体ポリペプチドはエピトープタグを有する。エピトープタグは、リガンドに結合した受容体ポリペプチドおよび／またはリガンドに結合していない受容体ポリペプチドを単離するための、あるいは、異種受容体ポリペプチドを発現している植物中の細胞を単離するための、都合の良い手段を提供し得る。当技術分野では種々のエピトープタグが公知であって、使用されているが、その例としてはFLAG(登録商標)タグであるDYKDDDDK(配列番号36)、HAタグであるYPYDVPDYA(配列番号37)、c-MycエピトープであるEQKLISEEDL(配列番号38)、AU1タグであるDTYRYI(配列番号39)、および6-HISタグであるHHHHHH(配列番号40)などが挙げられる。
【００６２】
Ｇ. キメラ受容体
他の実施形態において、異種受容体ポリペプチドはキメラポリペプチドである。例としては、ある受容体のリガンド結合ドメインと別の受容体のDNA結合ドメインの融合体が挙げられる。別の事例では、キメラ構築物は、全長受容体ポリペプチドの１以上のドメインと、受容体活性を示さないポリペプチド由来の１以上のドメインまたはモチーフを含有し、例えば核ホルモン受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインと、ウイルスの非ホルモン転写活性化ポリペプチドのDNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含有する。他の実施形態では、異種受容体ポリペプチドは、局在化シグナルまたはエピトープタグを有するキメラポリペプチドである。特定の場合においては、別の受容体の活性化ドメインをVP16活性化ドメインで置き換えて、例えばVP16THRβなどのキメラ受容体ポリペプチドを得ることもできる。
【００６３】
キメラ異種受容体ポリペプチドはまた、リガンドの同定に有用であり得る。キメラ異種受容体ポリペプチドは、２以上のポリペプチドセグメントを有し、各々のセグメントは上記のドメイン、タグ、配列またはシグナルを１以上有する。かくして、キメラポリペプチドは、核ホルモン受容体のリガンド結合活性を示す第１ポリペプチドセグメントと、DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインの活性を有する第２ポリペプチドセグメントとを含み得る。いくつかの実施形態において、第１ポリペプチドセグメントは、RXR、HFN4、精巣受容体、TLX、COUP-TF、THR、RAR、PPAR、reverb、ROR、SF-1、LRH-1、LXR、FXR、VDR、EcR、PXR、CAR、NOR1、NURR1、ER、ERR、GR、AR、PR、またはMRのリガンド結合ドメインに対して40％以上（例えば少なくとも40％、少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％)の配列同一性を示す。第１および第２ポリペプチドセグメントは、第２ポリペプチドセグメントの一端が、少なくとも１箇所の共有結合により第１ポリペプチドセグメントの一端に連結されるように配置される。
【００６４】
典型的には第１および第２ポリペプチドセグメントは、ペプチド結合により直接連結されている。このような実施形態においては、第１ポリペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸を、第２ポリペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸に連結させることができる。あるいは、第１ポリペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸を、第２ポリペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸に連結させてもよい。いくつかの実施形態において、第１および第２ポリペプチドセグメントは、第１および第２ポリペプチドの間に配置された１以上(例えば１〜50および10〜50)の介在アミノ酸によって間接的に連結され得る。このような実施形態においては、第１ポリペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸を介在アミノ酸に連結させ、第２ポリペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸を介在アミノ酸に連結させる。あるいはまた、第１ポリペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸を介在アミノ酸に連結させ、第２ポリペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸を介在アミノ酸に連結させてもよい。いくつかの実施形態において、介在アミノ酸には、少なくとも1個のアラニン残基および／または少なくとも１個のグリシン残基が含まれる。
【００６５】
いくつかの実施形態においては、追加のセグメントが存在し、例えば第３セグメントがエピトープタグもしくは局在化シグナルを有するか、または、第１セグメントがリガンド結合ドメインのみならずエピトープタグを有する。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体ポリペプチドは３つのセグメントを含み得る。例えば、キメラ受容体ポリペプチドは、リガンド結合ドメインを有する第１セグメント、DNA結合ドメインを有する第２セグメント、およびトランス活性化ドメインを有する第３セグメントを含み得る。さらなる実施形態において、キメラポリペプチドはさらに、二量体化配列を有する第４セグメントを含んでもよい。特定の実施形態においては、キメラポリペプチドはさらに、局在化シグナルを有するセグメントおよびエピトープタグを有するセグメントを含み得る。そのようなキメラ受容体中のセグメント同士は、上記のように連結されている。
【００６７】
Ｈ. 異種受容体構築物
トランスジェニック植物細胞は、コード配列およびそれに機能的に連結された１以上の調節配列を含む異種受容体構築物を含む。コード配列を発現させて、上述のドメインを含む異種受容体を産生させることができる。本明細書において用いる核酸とは、RNAまたはDNA（cDNA、合成DNAもしくはゲノムDNAを含む）をさす。核酸は一本鎖または二本鎖であり得るが、一本鎖の場合にはコード鎖または非コード鎖のいずれであってもよい。核酸に関連して本明細書で用いる「単離された」とは、(i) 本発明のポリペプチドの一部もしくは全部をコードする天然に存在する核酸であって、しかしゲノム中でポリペプチドをコードする核酸の片側もしくは両側に通常隣接している配列（すなわち、コード配列）を含まないもの；(ii) ベクターもしくは生物のゲノムDNAに組み込まれた核酸であって、結果的に得られる分子がどのような天然に存在するベクターもしくはゲノムDNAとも同一ではないもの；または(iii) cDNA、ゲノム核酸断片、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により生成された断片もしくは制限断片をさす。この定義から特別に除外されるのは、核酸分子の混合物中または細胞中に存在する核酸である。
【００６８】
適当な核酸の例としては、ヒト核ホルモン受容体ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。本明細書に開示する具体的なヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列を有する核酸であっても、なおも例示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうることが理解されよう。遺伝暗号の縮重は当技術分野でよく知られている。すなわち、多くのアミノ酸については、そのアミノ酸のコドンとしての機能を果たすヌクレオチドのトリプレットが２以上存在する。さらに、所望であれば、特定の生物種における最適な発現のために核酸コード配列中のコドンを選択しうることが知られている。
【００６９】
組換え核酸構築物は、本明細書に記載する他の配列に加え、クローニングベクター配列を含むことができる。適当なクローニングベクター配列は市販されており、当業者によって日常的に使用されている。本発明の核酸構築物はまた、他のポリペプチドをコードする配列を含有してもよい。そのようなポリペプチドは、例えば、宿主生物への核酸構築物の導入または維持を促進し得る。他のポリペプチドもまた、コードされている受容体ポリペプチドの発現、活性または生化学的もしくは生理学的作用に影響を及ぼし得る。あるいはまた、他のポリペプチドをコードする配列を別個の核酸構築物上に存在させてもよい。
【００７０】
異種受容体をコードする核酸は、例えばDNA合成またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得ることができる。PCRとは、標的核酸を増幅する手法または技術を言う。PCRを用いると、DNAのみならずRNAからの特定の配列（全ゲノムDNAもしくは全細胞RNAからの配列を含む）を増幅することができる。種々のPCR技法が、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach, C. & Dveksler, G.編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995などに記載されている。一般に、対象の領域またはそれを越えた領域の両端からの配列情報を用いて、増幅されるテンプレートの相対する鎖と配列が同一であるかまたは類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。テンプレート核酸に部位特異的ヌクレオチド配列改変を導入することができる種々のPCR戦略が利用可能である。
【００７１】
核酸の検出は、アガロースゲルの臭化エチジウム染色、サザンもしくはノーザンブロットハイブリダイゼーション、PCR、またはin situハイブリダイゼーションなどの手法により行うことができる。ハイブリダイゼーションは典型的にはサザンまたはノーザンブロット法を必要とする。プローブは、核酸またはその相補体に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるべきである。高度にストリンジェントな条件は、低いイオン強度の使用および高温での洗浄（例えば、65℃で0.015 M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム(0.1×SSC)、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)）を含みうる。さらに、ホルムアミドなどの変性剤を、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの過程で使用することができ、例えば、42℃で750 mM NaCl、75 mMクエン酸ナトリウムを含む、0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％ポリビニルピロリドン/pH 6.5の50 mM リン酸ナトリウムバッファーと共に50％ホルムアミドを使用する。
【００７２】
Ｉ. 調節エレメント
異種受容体のコード配列は、その受容体コード配列の転写および翻訳を促進する１以上の調節エレメントに機能的に連結される。典型的には、受容体コード配列は構成的に(例えばCaMV 35Sプロモーターによって)発現される。しかしながら、構成的な発現が、枯死や緩慢な成長などといった望ましくない生理学的または形態学的作用をもたらす場合には、発現を誘導性にしてもよい。
【００７３】
調節エレメントとしては、プロモーター配列、エンハンサー配列、インスレーターエレメント、応答エレメント、タンパク質認識部位、核酸配列の発現をモジュレートする誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、5'および3'UTR、転写開始部位、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、イントロンおよびアミノ酸コード配列中の特定の配列(分泌シグナルなど)、ならびにプロテアーゼ切断部位などが挙げられる。本明細書において用いる「機能的に連結された」とは、構築物中の調節エレメントが、ある核酸に対して、その核酸の転写および／または翻訳を可能にするかまたは促進するように位置づけられている、ことを意味する。追加するエレメントの選択は、いくつかの要因に依存するが、そうした要因としては、限定するものではないが、複製効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および細胞もしくは組織特異性が挙げられる。
【００７４】
一般的には、プロモーターは転写される配列の5'側に位置し、該配列の転写開始部位に近接している。プロモーターはコード配列の第１エキソンの上流にあり、かつ多重転写開始部位の最初の部位の上流にある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、コード配列の第１エキソンのATGから約3000ヌクレオチド上流に配置される。他の実施形態では、プロモーターは多重転写開始部位の最初の部位よりも約2000ヌクレオチド上流に配置される。本発明のプロモーターは少なくともコアプロモーターを含む。さらに、プロモーターはまた、上流エレメントなどの制御エレメントを少なくとも１つ含んでもよい。そのようなエレメントとして上流活性化領域(UAR)が挙げられ、場合によりポリヌクレオチドの転写に影響を及ぼす、合成上流エレメントのような、他のDNA配列が挙げられる。
【００７５】
5'非翻訳領域(UTR)は、転写されるものの翻訳はされず、転写産物の開始部位と翻訳開始コドンの間に介在し、+1ヌクレオチドを含む。翻訳終結コドンと転写産物の終端の間には3'UTRが配置され得る。UTRは、mRNAの安定性を高めるまたは翻訳を減衰させるなどといった特別の機能を有し得る。3'UTRの例としては、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列などが挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施形態においては、特定の細胞型、組織、または発達段階における転写を優先的に駆動する調節エレメントが使用される。例えば、栄養組織由来の細胞(例えば葉細胞または根細胞)における転写を駆動するプロモーターを使用することができる。細胞型特異的または組織特異的プロモーターは標的組織以外の組織中で機能的に連結された配列の発現を駆動することが、往々にして観察されている。従って、本明細書中で用いる細胞型特異的または組織特異的プロモーターは、標的組織で優先的に発現を駆動するものではあるが、さらに他の細胞型または組織でも若干の発現をもたらし得るものである。植物ゲノムDNA中の調節エレメントを同定して特徴づける方法は知られている。
【００７７】
II. レポーター構築物
本明細書に記載する方法に使用する植物細胞は、典型的にはレポーター構築物を含有する。レポーター構築物は、異種受容体／リガンド複合体が結合するためのcis-応答性受容体エレメント(受容体応答エレメント、RRE)、および該RREに機能的に連結された転写される配列を含む。候補リガンドと異種受容体ポリペプチドの相互作用は、RREに機能的に連結されたプロモーターからの転写の活性化と、転写される配列の発現をもたらす。転写される配列は、容易に検出できる性質を示すタンパク質のコード配列でありうる。あるいは、転写される配列はレポーター遺伝子を抑制するアンチセンス、RNAi、またはセンス抑制構築物であってもよい。従って、レポーター活性は、リガンドによる異種受容体のシグナル伝達活性のモジュレーションに応答する。特定のレポーターの安定性は、生物種間で、または同じ種の栽培品種間で様々であることが理解されよう。さらに、他の要因（例えば、形質転換条件、形質転換法など）もレポーターコード配列の安定性および発現レベルに影響を及ぼしうる。かくして、適当なレポーターコード配列は所定の使用のために選択することができる。
【００７８】
Ａ. 受容体応答エレメント(RRE)
cis-応答性受容体エレメントは、多くの核ホルモン受容体ポリペプチドについて知られており、典型的には該エレメントの半分としてのヘキサヌクレオチド配列を含む。半エレメントは、多くの場合ヘキサヌクレオチドAGGTCAのバリエーションであるが、いくつかの受容体ポリペプチド、例えばグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、プロゲステロン受容体およびアンドロゲン受容体などは、AGAACA半部位に結合する。cis-作動性受容体応答エレメントの代表的配列を以下の表３に示す。
【表３】
【００７９】
リガンドを伴った異種受容体ポリペプチドがヘテロ二量体としてそのコグネイト受容体応答エレメントに結合する場合、結合はいくつかのパターンのうちの１つとして起こりうる。いくつかの受容体はヘテロ二量体として、直接(縦列)反復半応答エレメントに結合する。縦列反復配列は典型的には約１〜５ヌクレオチドだけ離れている。あるいは、ヘテロ二量体としての結合は、１塩基対だけ離れた逆方向(パリンドローム)応答エレメントで起こる。RXR/RAR、RXR/VDR、RXR/LXR、RXR/PXR、RXR/CAR、PPAR/RXR、およびRXR/PPARヘテロ二量体は直接反復配列に結合するのに対して、RXR/THRおよびUSP/EcRは逆方向半反復配列に結合する。１つ以上のこのような反復配列は、受容体応答エレメントを構成する。典型的には、cis応答性受容体エレメントは１〜５個の反復配列を含むが、５個以上 (例えば、７、８、９、10、12、15、17、18、19または20) の反復配列を含んでもよい。
【００８０】
他の実施形態において、本明細書に記載する方法に用いる異種受容体は、ホモ二量体としてそのコグネイト応答エレメントに結合する。このような異種受容体は、例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲスチン、またはミネラルコルチコイド受容体であり得る。リガンドを伴った異種受容体ポリペプチドがホモ二量体として、そのコグネイト受容体応答エレメントに結合する場合、結合は、ホモ二量体として３塩基対だけ離れた逆方向反復配列で起こるか、ホモ二量体として１塩基対だけ離れた直接反復配列で起こるか、または単量体として単一の半部位(２ヌクレオチドの5'伸長を含みうる)で起こる。ホモ二量体の活性のためには、おそらく、ホモ二量体の両方の受容体がリガンドと結合するのに対して、ヘテロ二量体の活性のためには、一般に、3'半エレメント上に存在する一次受容体のリガンド結合で十分である。
【００８１】
Ｂ. 転写される配列
典型的には、転写される配列はレポーターポリペプチドのコード配列である。適当なレポーターポリペプチドはいくつか存在しており、そのコード配列を１以上の受容体応答エレメントに機能的に連結することができる。例えば、細胞において発現させた場合、適当な励起波長の光に曝露したときに蛍光を発するポリペプチドが適している。このようなポリペプチドとしては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)および黄色蛍光タンパク質(YFP)が挙げられる。このような蛍光タンパク質は、クラゲAequorea victoria由来の野生型GFP、または腔腸動物の他のメンバー由来のもの、例えばDiscosoma spp.由来の赤色蛍光タンパク質、ウミシイタケRenilla reniformis由来のGFP、Renilla muelleri由来のGFP、あるいは他の動物、菌類もしくは植物由来の蛍光タンパク質であってもよい。天然に存在するアミノ酸配列から改変されたポリペプチドもまた使用可能であり、例えば、GFPの青色蛍光変異体などの改変体、GFP蛍光のスペクトル特性を変更する改変体、または約30℃より高い温度で細胞内に発現させたときに増大した蛍光を示す改変体が使用可能である。例えば、WO 97/11094を参照されたい。GFP変異体の例はF64L-GFP、F64L-Y66H-GFP F64L-S65T-GFP、およびF64L-E222G-GFPである。いくつかの変異体は、InvitrogenまたはClontechから市販されている。GenBank登録番号U55762およびU55763も参照のこと。他の適当なレポーターポリペプチドとしては、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ(GUS)、ホタルルシフェラーゼ、ならびにエピトープタグ、膜局在化セグメントおよびレポーターセグメントを含んでなるキメラポリペプチドが挙げられる。例えば米国特許出願第10/046,660号を参照されたい。レポーターポリペプチドはまた、カルシウム流出をモジュレートするかまたは内因性受容体の発現を誘導するポリペプチドであり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、転写される配列は、キメラレポーターポリペプチドをコードする。例えば、キメラレポーターポリペプチドは、レポーターセグメントと、エピトープタグを有するセグメントを含み得る。当技術分野では種々のエピトープタグが公知で使用されており、例えば、FLAG(登録商標)タグ(DYKDDDDK；配列番号36)、HAタグ(YPYDVPDYA；配列番号37)、c-Mycエピトープ(EQKLISEEDL；配列番号38)、AU1タグ(DTYRYI；配列番号39)、および6-HISタグ(HHHHHH；配列番号40)などがある。特定の場合においては、エピトープタグを含むセグメントがレポーターセグメントのＮ末端に隣接して位置する。他の事例では、エピトープタグを含むセグメントはレポーターセグメントのＣ末端に隣接して位置する。例えば、キメラルシフェラーゼレポーターポリペプチドは、そのＮ末端にHAタグを有してもよく、キメラGFPレポーターポリペプチドは、そのＣ末端に6-HISタグを有してもよい。他の場合には、キメラポリペプチドはレポーターセグメントと２つの追加セグメントを含み、それぞれの追加セグメントがエピトープタグを含む。
【００８３】
III. トランスジェニック植物および植物細胞
本明細書に記載する方法に有用な植物および植物細胞は、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸、および、場合によりレポーターポリペプチドをコードする核酸を含有する。このような核酸は、別々の構築物として、または同一の構築物として植物細胞に導入することができる。一般に、核酸分子はプラスミドの形態である。植物の形質転換を成功させるための核酸分子の組成物および該核酸分子の構築方法は当業者に知られており、例えばプロモーター、ポリアデニル化配列、選択マーカー配列、エンハンサー、イントロンなどといった適当な核酸構成要素の使用が知られている。導入された核酸配列がゲノムに組み込まれている細胞のことを、安定に形質転換された細胞と呼ぶ。安定に形質転換された細胞は典型的には、細胞分裂が起こっても導入された核酸配列を保持している。導入された核酸配列がゲノムに組み込まれていない細胞は、一過性に形質転換された細胞と呼ばれる。一過性に形質転換された細胞は典型的には、細胞分裂が起こるたびに、導入された核酸配列の一部を失い、十分な回数の細胞分裂後には娘細胞から導入核酸を検出することができない。したがって、形質転換細胞は一過性におよび／または安定に形質転換されたものであり得る。一過性に形質転換されたおよび安定に形質転換されたトランスジェニック植物細胞は、どちらも本明細書に記載する方法に有用であり得る。
【００８４】
懸濁培養、または組織もしくは器官培養で生育するトランスジェニック植物細胞は、受容体ポリペプチドと相互作用するリガンドを同定するために使用することができる。本発明のために、固体および／または液体組織培養技術を使用することができる。固形の培地を使用する場合には、トランスジェニック植物細胞を培地上に直接播種してもよく、またはフィルター膜上に配置し、次いでその膜を培地と接触させるように配置してもよい。液体培地を使用する場合には、トランスジェニック植物細胞を、液体培地に接触する浮揚装置(例えば多孔質膜)上に配置しうる。固形培地は典型的には液体培地に寒天を加えることにより調製する。例えば、固形培地は、寒天および適当な濃度のオーキシン(例えば2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D))および適当な濃度のサイトカイニン(例えばカイネチン)を含有するムラシゲ・スクーグ(MS)培地であり得る。いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物細胞はプロトプラストである。
【００８５】
他の実施形態において、受容体ポリペプチドと相互作用するリガンドを同定するのに適当なトランスジェニック植物細胞は、植物体の一部または全部を構成する。トランスジェニック植物は、例えば、核酸を他の系統に導入するために、核酸を他の種に導入するために、または他の望ましい特性をさらに選択するために、本明細書に開示する方法で使用する前に、生育させることができる。あるいは、トランスジェニック植物は、そのような技術に適している種について栄養繁殖させてもよい。後代には、特定の植物または植物系統の子孫が含まれる。現存の植物の後代には、F1、F2、F3および後続世代の植物に形成された種子、またはBC1、BC2、BC3および後続世代の植物に形成された種子が含まれる。トランスジェニック植物により産生された種子を育てて、その後自家受粉(または異系交配および自家受粉)させることにより、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸についてホモ接合性の種子を得ることができる。
【００８６】
一過性に形質転換された植物細胞を使用する場合、形質転換後の適当な時期にレポーター活性についてのアッセイをおこなってもよい。アッセイを行うのに適当な時期は、典型的には形質転換後から約１〜21日、例えば約１〜14日、約１〜７日または約１〜３日である。一過性アッセイの使用は、異なる種における候補リガンドの迅速な解析のために、または、受容細胞中でそれまで確認されたことのない異種受容体の発現を確認するために、特に好都合である。いくつかの場合において、一過性アッセイを行うためには葉組織(例えばリーフディスク)が適当である。他の場合には、根、根毛、花粉または種子組織など他の植物組織が適している。
【００８７】
単子葉および双子葉植物に外因性核酸を導入する技術は当技術分野で知られており、限定するものではないが、アグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介形質転換、ウイルスベクター仲介形質転換、エレクトロポレーション、パーティクルガン形質転換などが挙げられる。例えば米国特許第5,538,880号、第5,204,253号、第6,329,571号および第6,013,863号を参照されたい。細胞または組織培養物を形質転換の受容組織として使用する場合は、所望により、当業者に知られた技術を用いて形質転換培養物から植物を再生することができる。
【００８８】
植物種の適当なグループには、ベニバナ、アルファルファ、ダイズ、セイヨウアブラナ(高エルカ酸品種およびキャノーラ)、ヒマワリなどの双子葉植物が含まれる。単子葉植物、例えば、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、イネ、キビ、アマランス、ソルガムなども適している。他の適当な種として挙げられるのは、ニチニチソウ（Catharanthus roseus）、ツルニチニチソウ（Vinca major）、ハナビシソウ（Eschscholtzia californica）、ポピー（Papaver spp.、例えばケシ(P. somniferum)）、カンレンボク（Camptotheca accuminata）、ラウォルフィア（Rauwolfia spp.）、ジギタリス（Digitalis spp.）、スペアミント（Mentha spicata）、ペニーロイヤルミント（M. pulegium）、ペパーミント（M. piperita）、タイム（Thymus vulgaris L.）、オレガノ（Origanum vulgare）、ローズマリー（Rosmarinus officinalis）、レモンバーム（Melissa officinalis）、ラベンダー（Lavandula augustifolia）、コモンセージ（Salvia officinalis）などである。野菜および根菜もまた適しており、例えばブロッコリー、エンドウマメ、スイートコーン、ポップコーン、トマト、豆類(インゲンマメ、ライマメ、乾燥シロインゲンマメ、グリーンビーンズを含む)などが挙げられる。果実作物もまた適しており、モモ、ナシ、リンゴ、サクランボ、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、プラム、マンゴーおよびヤシなどが挙げられる。したがって、本発明は広範な植物に対して使用でき、次の属からの種が含まれる；Arabidopsis、Agastache、Anacardium、Arachis、Asparagus、Atropa、Avena、Brassica、Citrus、Citrullus、Capsicum、Catharanthus、Carthamus、Cocos、Coffea、Cucumis、Cucurbita、Datura、Daucus、Elaeis、Echinacea、Eschscholtzia、Fragaria、Glycine、Gossypium、Helianthus、Heterocallis、Hordeum、Hyoscyamus、Hyssopus、Lactuca、Linum、Lolium、Lupinus、Lycopersicon、Malus、Manihot、Majorana、Medicago、Mentha、Nicotiana、Ocimum、Olea、Oenothera、Oryza、Panicum、Pannesetum、Papaver、Persea、Phaseolus、Pinus、Pistachia、Pisum、Plantago、Pyrus、Prunella、Prunus、Raphanus、Rheum、Ricinus、Salvia、Secale、Senecio、Sinapis、Solanum、Sorghum、Theobromus、Trifolium、Trigonella、Triticum、Vicia、Vinca、Vitex、Vitis、Vigna、Withania、およびZea。
【００８９】
Ａ． 異種シグナル伝達ポリペプチド
いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物はまた、異種受容体と相互作用して異種受容体のシグナル伝達活性を仲介することのできる異種シグナル伝達ポリペプチドを含むことができる。このようなポリペプチドとしては、転写コアクチベーターおよびシャペロニンが挙げられる。いくつかの実施形態において、異種シグナル伝達ポリペプチドは、非植物性シグナル伝達ポリペプチドと植物性シグナル伝達ポリペプチドのキメラである。
【００９０】
IV．候補リガンド／レポーター活性
Ａ． レポーター活性の検出
候補リガンドは、本明細書に記載するトランスジェニック植物細胞中でレポーター活性の増大が検出された場合に同定される。レポーター活性は、１以上のリガンドが受容体ポリペプチドに接触した後に測定される。リガンドと受容体ポリペプチドとの相互作用があるならば、受容体のシグナル伝達活性はモジュレートされ、結果的にレポーター活性が変化する。相互作用は典型的にはリガンドと受容体ポリペプチドの特異的結合によって生じる。典型的には、異種受容体ポリペプチド／リガンド複合体は、コグネイトRREに機能的に連結されたプロモーターからの転写の活性化と、その結果生じる転写産物によりコードされるレポーターポリペプチドの翻訳をもたらす。
【００９１】
レポーター活性の検出は、使用するレポーターによって変化する。例えば、レポーターとしてGFPを使用する場合は、当業者に知られた種々の装置を用いて発光を測定することができる。典型的にはこのような装置は、光源、発光団の発光を励起する光源からの光の波長を選択する手段、励起光を迅速に遮断するまたはシステムの他の部分に送るための機器、励起光を検体に伝達し、発生した蛍光を空間的に分離された様式で集光し、この蛍光発光から画像(または検出及び測定法に適した別の種類の強度マップ)を作成するための一連の光学素子、光強度を好ましくは画像の形で記録する検出器、ならびに記録された情報および／または画像を取得して記憶し、記録された画像から再分布の程度を計算するコンピューターまたは電子システムおよび関連ソフトウェアを含む。ある実施形態においては、レポーター活性を蛍光顕微鏡により検出する。別の実施形態では、レポーター活性をCCD（charged coupled device）カメラで検出する。装置一式のシステムは自動化されたものでもよい。あるいは、レポーター活性を定性的に、例えば顕微鏡下で蛍光強度を視覚的に観察することにより確認することもできる。いくつかの実施形態では、１以上の候補リガンドを受容体ポリペプチドと接触させた後のレポーター活性を、対照におけるレポーター活性(例えば、リガンドと受容体ポリペプチドの接触の不在下でのレポーター活性)と比較する。
【００９２】
候補リガンドは、異種受容体ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物細胞により合成される化合物であり得る。このようなリガンドは内因性リガンドとみなすことができる。候補リガンドは小有機化合物またはタンパク質もしくはペプチドなどの生体高分子であり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、内因性リガンドは、異種受容体を発現するのと同じ植物細胞によって合成される化合物である。他の実施形態では、内因性リガンドは、異種受容体を発現するトランスジェニック細胞以外の植物細胞によって合成される化合物である。例えば、内因性リガンドは植物の第１の組織、例えば根組織または葉組織で合成され、一方異種受容体は該植物の第２の組織、例えば分裂組織または花の組織で優先的に発現される。内因性リガンドは植物の第２の組織へ輸送され、第２の組織の細胞により取り込まれ、レポーター活性の増加をもたらし得る。別の例として、第１のトランスジェニック植物組織または器官培養物を、第２の植物組織または器官培養物の存在下で、支持細胞層として生育させることができる。第１の組織または器官培養物からの内因性リガンドは培地中に拡散し、第２の組織または器官培養物の細胞により取り込まれ、レポーター活性の増加をもたらし得る。第１の組織または器官は異種受容体を発現してもしなくてもよいことが理解されよう。レポーター活性が検出された植物細胞を、レポーター活性に起因するリガンドを特徴付けするために、分画に供することができる。あるいは、内因性リガンドを合成することが知られているかまたは推測される植物細胞を、レポーター活性に起因するリガンドを特徴付けするために分画に供してもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態では、植物細胞を、増加した量の内因性リガンドの合成を促進する環境条件に供する。植物または植物培養物もしくは細胞培養物を生育させる環境条件は、例えば対照の温度もしくは散水率と比較して、温度を上げたり、散水率を増加させたり、または散水率を減少させることにより、変更可能である。内因性リガンドの量または合成率を増加させるために変更することのできる他の環境条件としては、塩、ミネラル、ホルモン、窒素、炭素、浸透圧調節物質、または酵母エキス、サリチル酸、およびジャスモン酸メチルなどの既知の誘導因子の濃度が挙げられる。
【００９５】
他の実施形態においては、１以上の候補リガンドは抽出物中に存在する。適当な供給源としては、植物細胞型、組織または器官からの抽出物が挙げられる。このような抽出物は粗抽出物であってもよく、または部分的に精製もしくは徹底的に精製されたものであってもよい。このような抽出物は、水性抽出物または非水性抽出物であり得る。植物抽出物を調製するのに適した組織または器官としては、葉、根、茎、皮、花、種子、胚、内胚乳、子葉、毛状突起、分裂組織、胚発生培養物、器官形成培養物、または形成層細胞が挙げられる。このような抽出物を、異種受容体ポリペプチドを発現する植物細胞に接触させてもよい。
【００９６】
Ｂ． リガンド合成ポリペプチド
いくつかの実施形態において、候補リガンドは、増加した量の天然の内因性化合物の合成を仲介するか、または新規な内因性化合物の合成を仲介するポリペプチドをコードする組換え核酸構築物を含む植物細胞から得られる。このような化合物は、本明細書に記載するように、その活性についてスクリーニングすることのできる候補リガンドである。
【００９７】
例えば、ステロール生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にステロール量の増加および／または新規ステロールの合成がもたらされる。このような増加したステロールまたは新規ステロールは、ステロイド受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。ステロール生合成に関与するポリペプチドとしては、スクアレンシンターゼポリペプチド、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis)、トマト(tomato)およびアブラナ(Brassica)由来のSQS1およびSQS2遺伝子によりコードされるポリペプチドが挙げられる。ステロール量を増加させる、および／または新規ステロールを産生させるために適当な他のポリペプチドとしては、限定するものではないが、ルペオールシンターゼ遺伝子、シクロアルテノールシンターゼ遺伝子、ステロールメチルオキシダーゼ遺伝子、ならびに前記遺伝子およびステロール生合成経路に関与する遺伝子の発現を制御する調節因子遺伝子が挙げられる。
【００９８】
別の例として、フラボノイド生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にフラボノイド量の増加および／または新規フラボノイドの合成がもたらされる。このような増加したフラボノイドまたは新規フラボノイドは、フラボノイド受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。イソフラボンは潜在的な植物エストロゲンであり、エストロゲン受容体の可能性のあるリガンドである。フラボノイド生合成に関与するポリペプチドとしては、限定するものではないが、カルコンイソメラーゼ遺伝子、カルコンレダクターゼ遺伝子、ジヒドロフラボノールレダクターゼ遺伝子、イソフラボンシンターゼ遺伝子、イソフラボンレダクターゼ遺伝子、フラボノイド３-ヒドロキシラーゼ遺伝子、ならびに前記遺伝子およびフラボノイド生合成経路に関与する遺伝子の発現を制御する調節因子遺伝子が挙げられる。
【００９９】
いくつかの事例においては、フェノール類の生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にフェノール系化合物(例えばアントシアニン、クマリンおよびプソラレンを含む)の量の増加がもたらされる。このような遺伝子の過剰発現はまた新規フェノール類の合成をもたらし得る。このような増加したフェノール類または新規フェノール類は、フェノール系受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。
【０１００】
いくつかの場合において、テルペノイド生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にテルペノイド量の増加および／または新規テルペノイドの合成がもたらされる。このような増加したテルペノイドまたは新規テルペノイドは、テルペノイド受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態においては、アルカロイド生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にアルカロイド量の増加および／または新規アルカロイドの合成がもたらされる。このような増加したアルカロイドまたは新規アルカロイドは、アルカロイド受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。
【０１０２】
さらに他の場合においては、ポリチエニル、イソチオシアネート、グルコシノレート、シアン発生グリコシド、ポリアセチレン、脂質、セスキテルペノイド、またはクアシノイドの生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にこれらの化合物の量の増加および／または新規化合物の合成がもたらされる。
【０１０３】
このようなポリペプチドをコードする核酸は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、温度の上昇もしくは誘導物質の存在に応答して転写レベルの増加を付与するようなプロモーターなど）の制御下におくことができる。このような遺伝子を含む植物細胞は、異種受容体をコードする核酸を含む植物細胞と同一でも異なっていてもよい。
【０１０４】
Ｃ． 分画
レポーター活性が検出された植物細胞、または内因性リガンドを合成することが知られているかまたは推測される植物細胞は、レポーター活性に起因するリガンドを特徴付けするために分画に供することができる。一般的には、分画は、画分のin vivoレポーター活性、または画分のin vitroアッセイによって導かれる。いくつかの事例においては、１以上の候補リガンドを含有し、かつレポーター活性を示す細胞は、レポーター活性を示さない細胞から分離することができる。かかる分離により、リガンドを含有する細胞または細胞型が富化される。特定の細胞型または細胞層を分離するためのいくつかの方法が当業者に知られている。例えば、レポーター活性を示す細胞型を、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションを用いて切り出したり、またはレポーターもしくは受容体中のエピトープタグを利用するセルソーターを用いて回収したりすることができる。
【０１０５】
分画は当技術分野で知られた方法を用いて行うことができる。例えば、サンプルを100％MeOHで抽出して粗製の油を得、この油を慣用方法で複数の溶媒間に分配する。代替方法として、ヘキサンおよび塩化メチレン分画を、ゲルカラムで塩化メチレンおよび酢酸エチル／ヘキサン溶媒を用いて行ってもよい。
【０１０６】
候補リガンドを同定するためのin vitroアッセイは、対象の異種受容体の転写活性に基づくものであってもよい。他の実施形態では、in vitroアッセイは、ある画分中の化合物が対象の異種受容体と特異的に結合する能力を、例えば競合的均質生化学アッセイで、測定するアッセイに基づく。例えば、リガンドを含有すると推測される植物組織または器官を分画し、分画の流出液をリガンドに結合すると推測される所定量の受容体と接触させる。該受容体に結合する所定量の既知リガンドを、既知リガンドと受容体の複合体が混合物中で形成される条件下で加える。混合物中の結合していない既知リガンドの量を、例えば、既知リガンド上の蛍光標識または固有の蛍光を有する既知リガンドを用いることにより、検出する。
【０１０７】
他の実施形態においては、分画されたもしくはされていない植物組織もしくは器官を、候補リガンドを同定し特徴付けするために、質量分析に供する。例えばWO 02/37111を参照のこと。質量分析は、しばしば、レポーター活性に起因する特定のリガンドを特徴付けし同定するのに適している。いくつかの実施形態では、エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析を使用することができる。他の実施形態では、大気圧化学イオン化(APCI)質量分析が使用される。抽出物中の比較的高分子量の分子を同定したいのであれば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析法が有用であり得る。
【０１０８】
本明細書に記載する方法は、他のタイプのリガンド同定法と比較して、より迅速な候補リガンドの同定を促進することができる。本明細書に開示する方法は、リガンドを含有することが知られているかまたは推測される植物の広範なグループのスクリーニングを可能にし、また所望により、そのような植物中の特定の組織または器官に焦点を合わせたスクリーニングを可能にする。それにひきかえ、多くの公知の方法は、特定の組織または器官を用いて実施することが比較的困難であり、しかも本明細書に記載する新規方法で達成できる感度が得られない。
【０１０９】
核内受容体に対する新規リガンドは、例えば癌を治療もしくは検出するための医薬または診断薬として、使用することができる。乳癌細胞および前立腺癌細胞は、それぞれエストロゲン受容体およびテストステロン受容体を発現することが明らかにされている。そのような受容体に対する新規リガンドを放射性同位体とコンジュゲートさせて、乳癌細胞および前立腺癌細胞へと標的化された放射線治療を送達することができる。また、そのような受容体に対する新規リガンドを発蛍光団とコンジュゲートさせて、エストロゲン受容体およびテストステロン受容体の増加したレベルを検出することができるが、かかる受容体レベルの増加は患者における癌性の乳腺細胞または前立腺細胞の数の増加に関係している可能性がある。新規リガンドはまた、新規リガンドのアナログを合成するための基礎として使用可能である。このようなアナログは、新規なまたは改変された治療活性を有し得る。
【０１１０】
本発明を以下の実施例でさらに詳述するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１．VP16ER核酸構築物および形質転換
VP16-ヒトエストロゲン受容体α(ERα)キメラポリペプチドのコード配列がCaMV35Sプロモーターおよびノパリンシンターゼ(NOS)ターミネーターに機能的に連結されている受容体核酸構築物を作製した。VP16活性化ドメインがヒトERαポリペプチドの最初の90アミノ酸を置き換える。このキメラポリペプチドのコード配列を図１および配列番号１に示す。アミノ酸配列は配列番号２に示す。下線のあるヌクレオチドがVP16活性化ドメイン配列に対応し、下線のないヌクレオチドがヒトエストロゲン受容体配列に対応する。
【０１１２】
５コピーのヒトエストロゲン応答エレメントに機能的に連結されたキメラ緑色蛍光タンパク質のコード配列を含むレポーター核酸構築物を作製した。ERE-GFP構築物のヌクレオチド配列を図２および配列番号３に示す。５コピーのエストロゲン応答エレメントに下線を引いた。最小TATA配列を波線の下線で示す。大文字のヌクレオチドがキメラ緑色蛍光タンパク質(GFP)のコード配列であり、この配列は5'末端にキチナーゼシグナル配列を、そして3'末端にHDEL(配列番号48)シグナル配列を含む。アミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１１３】
VP16ERα構築物およびERE-GFP構築物をアグロバクテリウムバイナリーベクター内にクローニングし、Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81と命名されたベクターを作製した。このベクターは、合成ホスフィノトリシン(phosphinothricin)耐性遺伝子の発現を駆動する28716プロモーターと、それに続くオクトピンシンターゼ(OCS)ターミネーターを含んでなる。ホスフィノトリシン耐性遺伝子は、形質転換された植物細胞の選択を可能にする。このベクターはまた、アグロバクテリウム中での選択のためのスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む。対照のアグロバクテリウムバイナリーベクターもまた作製し、Bin4-EUTG-101と命名した。Bin4-EUTG-101はホスフィノトリシン耐性遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むものの、VP16ERα配列およびERE-GFP配列を欠く。Bin4-EUTG-101を有するトランスジェニック植物を対照として用いた。
【０１１４】
イネの形質転換は、米国特許第5,591,616号に記載の方法と同様に行った。形質転換体は、ホスフィノトリシン耐性遺伝子および選択物質としてのビアラホスを用いて選択した。シロイヌナズナ（Arabidopsis）の形質転換は、本質的にBechtoldら, C.R. Acad. Sci. Paris, 316:1194-1199 (1993)に記載された方法で行った。一次形質転換体により形成された種子をT1世代と言い、そのような種子から発芽した植物をT1植物と言う。
【０１１５】
実施例２．VP16ER構築物を含むトランスジェニックイネ
Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81ベクターを含むトランスジェニックイネのカルスを作製した。選択した約50個の系統を取得し、5mg/mlビアラホスを含有するN6培地上で27℃にて培養し、約２週間毎に新鮮な培地に移し換えた。形質転換から約45日後、６系統からのカルスを約５μMのエストラジオールまたは５μMの4-ヒドロキシタモキシフェンと共にインキュベートした。約40時間インキュベートした後、カルス細胞を解剖顕微鏡下で10×〜60×倍率で検査した。
【０１１６】
検査した６系統中の４系統である、系統１、２、５および６は、外因性化合物の存在下で中位から非常に明るい緑色蛍光を示したが、外因性化合物の不在下では全く蛍光を示さなかった。これらの実験の結果は、外因的に加えたエストラジオールまたは4-ヒドロキシタモキシフェンがこれら４つのトランスジェニック系統中に存在するGFPコード配列の転写を活性化できることを示す。
【０１１７】
検査した６つのイネカルス系統中の２系統は、外因性化合物の不在下でさえも弱いから中位の緑色蛍光を示し、外因性化合物の存在下では中位から明るい緑色蛍光を示した。この結果から、この２系統は、これらの培養条件下でBin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81中に存在するGFPコード配列の転写を活性化する内因性化合物を有することが示された。
【０１１８】
実施例３．VP16ER構築物を含むトランスジェニックシロイヌナズナ
Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81ベクターを含んでなるトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）植物を、実施例１に記載の通り作製した。３つの独立したT1植物からのそれぞれ約100個のトランスジェニックT2種子を、22℃で、MS寒天培地のみで、または約５μMのエストラジオールもしくは５μMの4-ヒドロキシタモキシフェンを含むMS寒天培地で発芽させた。PCR解析は、受容体構築物配列がヘテロ接合およびホモ接合状態で苗中に存在することを示した。苗を、発芽後５日目から開始して、解剖顕微鏡下で緑色蛍光について検査した。エストラジオールまたは4-ヒドロキシタモキシフェンの存在下で生育させた全てのT2苗は中位から強い緑色蛍光を示したのに対して、エストラジオールまたは4-ヒドロキシタモキシフェンの不在下で生育させたT2苗はいずれも緑色蛍光を示さなかった。
【０１１９】
イソフラボン抽出物を調製するために、乾燥ダイズ種子を液体窒素下に粉砕機で挽いた。約３gの挽いた種子を、メタノールにより室温で約10分間抽出した。その後メタノール抽出物を、室温で約10分間酢酸エチルと共にインキュベートした。酢酸エチル可溶性化合物を真空乾燥により濃縮した。乾燥させたペレットを200μlのDMSO中に再懸濁し、粗イソフラボン抽出物を４℃で保存した。この抽出物は調製から２日以内に使用した。
【０１２０】
上述の３つのT1植物からの約100個のT2種子を、22℃で、約100μlイソフラボン抽出物/350ml培地を含むMS寒天培地上で発芽させた。また、対照としてT2種子を、100μl DMSO/350ml培地を含むMS寒天培地上で発芽させた。苗の根を、発芽後５日目から開始して、解剖顕微鏡下で緑色蛍光について検査した。抽出物の存在下で生育させた全てのT2苗は中位から強い緑色蛍光を示した。抽出物の不在下で生育させたT2苗はいずれも緑色蛍光を示さなかった。Bin4-EUTG-101対照構築物を含むT2トランスジェニックシロイヌナズナ植物は、抽出物の存在下でも不在下でも緑色蛍光を示さなかった。これらの結果が示すのは、ダイズイソフラボン抽出物が、Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81トランスジェニック植物中に存在するGFPコード配列の転写を活性化する化合物を含有する、ということである。
【０１２１】
実施例４．VP16ER構築物を含有するトランスジェニックハナビシソウ
無菌的に発芽させたハナビシソウ（California poppy）苗からの根の外植片を、Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81ベクターを含有するアグロバクテリウムと共存培養した。２日後、処理した根外植片を液体組織培養培地で洗ってアグロバクテリウムを除去し、0.5mg/mlオーキシン、0.5mg/mlサイトカイニンおよび2.5mg/mlビアラホスを含有するカルス誘導培地(CIM)に移した。ビアラホスの存在下で生存していると見られた20を超えるカルスクラスター(推定上の形質転換体)を、CIMに移した後３日目から開始して、解剖顕微鏡下で10×〜60×倍率で検査した。検査したカルスクラスターのいくつかは、中位から強い緑色蛍光を示した。Bin4-EUTG-101対照構築物で形質転換された対照植物からの外植片はいずれも緑色蛍光を示さなかった。
【０１２２】
実施例５．VP16ER構築物を含有するトランスジェニックダイズ
無菌的に発芽させたダイズ苗からの子葉および根の外植片を、Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81ベクターを含有するアグロバクテリウムと共存培養した。２日後、処理した子葉および根の外植片を液体組織培養培地で洗ってアグロバクテリウムを除去し、0.5mg/mlオーキシン、0.5mg/mlサイトカイニンおよび2.5mg/mlビアラホスを含有するカルス誘導培地(CIM)に移した。ビアラホスの存在下で生存していると見られた20を超えるカルスクラスター(推定上の形質転換体)を、CIMに移した後３日目から開始して、解剖顕微鏡下で10×〜60×倍率で検査した。検査したカルスクラスターのいくつかは、中位から強い緑色蛍光を示した。Bin4-EUTG-101対照構築物で形質転換された対照植物からの外植片はいずれも緑色蛍光を示さなかった。
【０１２３】
実施例６．RXRα／VP16THRβ核酸構築物
RXRαおよびキメラVP16THRβを両方ともコードするT-DNAバイナリーベクターヘテロ二量体核内受容体構築物を、標準的な分子生物学的手法に沿って調製した。この構築物をBin4-35S::RXRa-35S::VP16THRb-3RXRE::Luc #12と命名した。この構築物は、RXRαコード配列に機能的に連結された35Sプロモーターを含んでいた。配列番号５および配列番号６を参照のこと。この構築物はまた、VP16THRβコード配列に機能的に連結された35Sプロモーターを含んでいた。配列番号７および配列番号８を参照のこと。キメラVP16THRβ受容体コード配列には、THRβコード配列に機能的に連結されたVP16活性化ドメインコード配列が含まれていた。それぞれの受容体コード配列は35Sプロモーターに機能的に連結されていた。また、このバイナリーベクターは、３つの反復配列を含むcis RXR応答エレメント(RXRE)(表３を参照のこと、ここでn=C)により駆動されるレポータールシフェラーゼ(Luc)コード配列を含有しており、これはRXRE::Lucと命名された。配列番号９および配列番号10を参照のこと。また、35Sにより駆動されるLucコード配列をコードする構築物を作製して陽性対照処理のために使用し、35Sにより駆動されるGFPコード配列をコードする構築物を作製して陰性対照処理のために使用した。
【０１２４】
実施例７．RXRα／VP16THRβ構築物を用いたタバコの一過性形質転換
植物組織を以下のように一過性に形質転換した。実施例６に記載のBin4-35S::RXRa-35S::VP16THRb-3RXRE::Luc #12構築物を含むアグロバクテリウム菌株のYEB培養物(4ml)を、28℃で振とうしながら一晩培養した。アグロバクテリウムを4000rpmで25分間遠心分離し、細菌ペレットを浸潤培地（MS溶液に0.25μg/ml NAAおよび0.1μg/ml BAPを加えたもの）に再懸濁した。アグロバクテリウムの最終0.05-OD希釈物を、同じ浸潤培地を用いて調製した。次に、タバコのリーフディスクをペーパーパンチャーで切り出し、直ちに浸潤培地に浸した。その後リーフディスクを希釈したアグロバクテリウム培地に約５分間浸し、次いでペーパータオル上でブロット乾燥させてから、浸潤培地にあらかじめ浸したペーパータオルを敷いたペトリ皿に移した。処理したリーフディスクを、27℃で16時間の光周期に維持した生育チャンバーの中で４日間インキュベートした。
【０１２５】
インキュベートした後、リーフディスクを外因性リガンドによる処理に供した。リガンドの適当なストックをDMSOに溶解させ、調製したばかりの新鮮な浸潤培地を用いて５μMの濃度へと希釈した。一過性に形質転換されたリーフディスクを次に、希釈リガンド溶液を含むペトリ皿に移した。その後ディスクをリガンド溶液で手短にすすぎ、希釈リガンド溶液にあらかじめ浸したペーパータオルを敷しいた新しいペトリ皿に移した。処理されたリーフディスクまたは対照リーフディスクのプレートをアルミホイルで包んで、27℃に設定した生育チャンバーの中で１〜２日間インキュベートした。インキュベートした後、リーフディスクを、硬化させた0.5％アガロースの薄層を重層したプレートに移した。次にリーフディスクに10μMルシフェリン(0.01％Triton X-100中)調製物を噴霧し、CCD撮像装置を用いて発光画像を撮った。これらの実験結果を表４にまとめた。
【表４】
【０１２６】
これらの実験結果からは、タバコではトリヨードチロニンのキメラVP16THRβ受容体への結合が起こること、また、キメラVP16THRβ受容体はRXRα受容体と機能的に会合してヘテロ二量体を形成し、このヘテロ二量体が次にRXR応答エレメントに機能的に連結されたレポーター遺伝子の転写を増加させること、が示される。
【０１２７】
実施例８．RXRα／VP16THRβヘテロ二量体構築物のin planta試験
実施例６に記載のBin4-35S::RXRa-35S::VP16THRb-3RXRE::Luc #12構築物を含むアグロバクテリウムを用いて次の植物を一過性に形質転換した：ベラドンナ（Atropa belladonna）、ジギタリス（Digitalis purpurea）、イネ（Oryza sativa (ジャポニカ)）、ヘラオオバコ（Plantago lanceolata）、サルビアコクシネア（Salvia coccinea (スペインサルビア、カタログ番号1835、レディーインレッド変種)）、サルビアコクシネア（Salvia coccinea (スペインサルビア、カタログ番号1831、チェリーブロッサム変種)）、およびウィタニアソムニフェラ（Withania somniferum）。種子はThompson & Morgan Seedsmen Inc. (Jackson, NJ)およびSand Mountain Herbs (Fyffe, AL)から購入した。一過的形質転換は実施例７に記載の方法と同様に行った。インキュベートした後、様々な種のリーフディスクをリガンドとしてのトリヨードチロニンによる処理に供したが、これも実施例７に記載のように行った。トリヨードチロニンとのインキュベーション後、リーフディスクを硬化させた0.5％アガロースの薄層を重層したプレートに移し、10μMルシフェリン(0.01％Triton X-100中)調製物を噴霧し、CCD撮像装置を用いて発光画像を撮った。これらの実験結果を表５にまとめた。
【表５】
【０１２８】
これらの実験結果からは、トリヨードチロニンが種々の植物種中のキメラVP16THRβ受容体に結合すること、また、キメラVP16THRβ受容体がRXRα受容体と機能的に会合してヘテロ二量体を形成し、このヘテロ二量体は次にRXR応答エレメントに機能的に連結されたレポーター遺伝子の転写を増加させること、が示される。ジギタリスでは、Lucレポーター活性が、トリヨードチロニンの存在下よりも不在下でより高レベルに検出された。これらの結果は、トリヨードチロニンがジギタリス中で発揮し得る負の効果によるものかもしれず、またはこの植物種におけるレポーター安定性の低下によるものかもしれない。トリヨードチロニンの不在下では、Sc1835はレポーター発現を示したのに対して、Sc1831は示さなかった。この違いは、一方の品種に存在し、もう一方には存在しない１以上の候補リガンドによるものかもしれない。このようなリガンドは、外因性リガンドの不在下でレポーター遺伝子転写を活性化し得る。
【０１２９】
実施例９．VP16ERホモ二量体構築物のin planta試験
キメラERホルモン受容体をコードするT-DNAバイナリーベクター核内受容体構築物を、標準的な分子生物学的手法により作製した。この構築物をBin4-35S::VP16ER-ERE::Luc #3と命名した。キメラVP16ER受容体コード配列は35Sプロモーターに機能的に連結させた。配列番号11および配列番号12を参照されたい。このバイナリーベクターはまた、５つの反復配列を含むcis ER応答エレメント(ERE)により駆動されるLucコード配列を含んでいた。表３（ここで、nnn=GGG）、ならびに配列番号13および配列番号14を参照のこと。
【０１３０】
Bin4-35S::VP16ER-ERE::Luc #3構築物を、本質的に上記のようないくつかの植物種へと一過性に形質転換した。種子は、Thompson & Morgan Seedsmen Inc. (Jackson, NJ)およびSand Mountain Herbs (Fyffe, AL)から購入した。
【０１３１】
対照リーフディスクは、浸潤培地中でのインキュベーションに供した。試験リーフディスクは、浸潤培地中でのインキュベーションに供した後、エストラジオールと共にインキュベートした。リーフディスクを次に、硬化させた0.5％アガロースの薄層を重層したプレートに移し、10μMルシフェリン(0.01％Triton X-100中)調製物を噴霧した。対照および試験リーフの両方の発光画像を、CCD撮像装置を用いて撮った。これらの実験結果を表６にまとめた。
【表６】
【０１３２】
これらの実験結果からは、チョウセンアサガオ（Datura sp.）、ハナビシソウ（Eschscholtzia californica）、マツヨイグサ（Oenothera odorata (Oo6739)）、マツヨイグサ（Oenothera odorata (Oo8881)）、およびダイオウ（Rheum palmatum）がエストロゲン核内受容体ポリペプチドに結合する候補リガンドを保有すること、が示唆される。これらの結果からは、そのようなリガンドが植物中での転写を活性化するように該ポリペプチドを誘導しうること、がさらに示唆される。
【０１３３】
実施例１０．AR核酸構築物
アンドロゲン受容体(AR)をコードするT-DNAバイナリーベクター核内受容体構築物であるBin4-Ins5ARE::Luc-35S::AR#2を、標準的な分子生物学的手法により作製した。受容体コード配列は、35Sプロモーターに機能的に連結させた(配列番号15および配列番号16)。このバイナリーベクターはまた、cis アンドロゲン受容体応答エレメント(ARE)により駆動されるレポータールシフェラーゼ(Luc)コード配列を含有した。配列番号17および配列番号18を参照のこと。AREは、インスレーター配列に機能的に連結された5’-AGAACACTGTGTACC-3’(配列番号19)の５つの反復配列を含んでいた。
【０１３４】
実施例１１．AR構築物を用いたタバコの一過性形質転換
植物組織を、実施例１０に記載のBin4-Ins5ARE::Luc-35S::AR#2構築物を含有するアグロバクテリウム菌株を用いて、本質的に実施例７に記載された方法で一過性に形質転換した。これらの実験結果を表７にまとめた。
【表７】
【０１３５】
これらの実験結果から、フルタミド、9-cisレチノイン酸、および13-cisレチノイン酸のAR受容体への結合がタバコ内で起こることが示される。
【０１３６】
実施例１２．AR構築物のin planta試験
実施例１０に記載のBin4-Ins5ARE::Luc-35S::AR#2構築物を含有するアグロバクテリウムを用いて、ベラドンナ（Atropa belladonna）、エキナセアプルプレア（Echinacea purpurea）、バジル（Ocimum basilicum）、マツヨイグサ（Oenothera odorata）、イネ（Oryza sativa）、およびヘラオオバコ（Plantago lanceolata）を一過性に形質転換した。一過性形質転換は実施例７に記載の方法と同様に行った。インキュベーション後、実施例７に記載のように、様々な種のリーフディスクを、リガンドとしてのフルタミドによる処理に供した。フルタミドとのインキュベーション後、リーフディスクを、硬化させた0.5％アガロースの薄層を重層したプレートに移し、10μMルシフェリン(0.01％Triton X-100中)調製物を噴霧し、CCD撮像装置を用いて発光画像を撮った。これらの実験結果を表８にまとめた。
【表８】
【０１３７】
これらの実験結果から、バジル（Ocimum basilicum）およびイネ（Oryza sativa）は、アンドロゲン核内受容体ポリペプチドに結合する候補リガンドを保有することが示唆される。これらの結果からはさらに、そのようなリガンドが植物中での転写を活性化するように該ポリペプチドを誘導しうることが示唆される。これらの結果はさらに、トランスジェニックヘラオオバコ（Plantago lanceolata）へのフルタミドの添加が、レポーター遺伝子転写を活性化したことを示唆している。
【０１３８】
実施例１３．エストロゲン受容体リガンド活性を有する内因性リガンドの同定
実施例４に記載のハナビシソウのカルス250mgを凍結乾燥させ、Dionex ASE(登録商標)200高速溶媒抽出機(Sunnyvale, CA)を用いてメタノールでの抽出に供した。粗抽出物を乾燥させ、純粋メタノールに再懸濁させた。再懸濁させた粗抽出物を、Dionex Summit(登録商標)HPLC装置を用いて、Alltima 150×10mm-5μm C18カラムにかけ、55分間で0.1％ギ酸中の20％から95％アセトニトリルの準分取HPLC勾配により、4.7ml／画分で分画した。溶出した画分を真空下で乾燥させ、画分あたり100μlのDMSOに再懸濁させた。どの画分がERリガンド活性を有するのかを確認するために、画分を用いて、HitHunterエストロゲンキット(Discoverx, Fremont, CA)および精製エストロゲン受容体タンパク質(Panvera/Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてin vitroアッセイを行った。各画分の２μlアリコートをアッセイに使用し、各アッセイを三回反復して行った。結果は、いくつかの画分がERリガンド活性を保有することを示した。
【０１３９】
活性画分中の化合物の正体を突き止めるために、上述のようにハナビシソウカルスの粗抽出物を調製してメタノール中に再懸濁させた。粗抽出物の液体クロマトグラフィー分画および質量分析(LC-MS)を、Waters Micromass(登録商標)ZQTM質量分析器(単一四重極、ベンチトップMS検出器; Milford, MA)を用いて行った。LC勾配は、上記の準分取HPLC分画に使用したのと同じ勾配であり、Alltima 150×4.6mm-5μm C18カラムを用いた。ピークのうちの３つはサンギナリン誘導体であると同定された。これらの結果から、核ホルモン受容体ポリペプチドを発現する植物細胞は候補リガンドのスクリーニングに使用することができ、また、そのような受容体に結合するリガンドを同定することができることが実証された。
【０１４０】
他の実施形態
以上の説明は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を説明するためのもので、限定するものではない。他の態様、効果および改変も特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】VP16ERαキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２】５コピーのヒトエストロゲン応答エレメントに機能的に連結された緑色蛍光タンパク質のコード配列を示す。下線（直線）を引いたヌクレオチドは、５コピーのエストロゲン応答エレメントを示す。下線（波線）を引いたヌクレオチドは、最小TATA配列を示す。緑色のフォントのヌクレオチドは、キメラ緑色蛍光タンパク質(GFP)のコード配列に対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体ポリペプチドと相互作用可能な分子を同定するのに有用な方法および材料に関する。特に、本発明は核ホルモン受容体ポリペプチドと相互作用するリガンドを同定するためにトランスジェニック植物細胞を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歴史的には、植物は化学物質の豊富な供給源であり、これらの化学物質は効力のある薬であることが証明されている。その一例はワイルドメキシカンヤム芋という、ベラクルース(Veracruz)の山々に生育する食べられない「cabeza de negro」ヤム芋の根である。この植物は、コルチゾンまたは女性性ホルモンであるプロゲステロン(エストラジオールの前駆体)へと変換可能なステロイドを産生する。
【０００３】
多くの臨床上活性のある薬物は受容体ポリペプチドと相互作用するものであり、受容体のコグネイトシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。植物由来のこのような薬物の例を下記の表に示す。
【０００４】
【０００５】
受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を同定するアッセイが望ましい。例えば米国特許第5,665,543号を参照されたい。しかしながら、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する植物由来の化合物を同定するための現在のアッセイの多くは、多数の化合物をスクリーニングすることができない。さらに、ある受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして植物由来の化合物が同定されたとしても、そのような化合物の多くは、哺乳動物に投与したときに深刻な副作用を示すことがわかっている。受容体ポリペプチドのリガンドとなる新規な植物由来化合物を迅速に、そして効率的に同定するためのニーズが存在している。
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明は、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸で形質転換された植物細胞において受容体ポリペプチド(「受容体」)と相互作用可能なリガンドを同定するための方法およびトランスジェニック植物細胞に関する。かくして、本発明は、受容体に対するリガンドを同定する方法であって、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸を含んでなる複数の植物細胞を用意し、該受容体のシグナル伝達活性に応答するレポーターを用いて、１以上の候補リガンドが該受容体と相互作用するかを判別することを含んでなる前記方法に関する。植物細胞は、少なくとも１つの植物体の一部、例えば葉細胞または毛状体細胞であり得る。植物細胞は組織培養の細胞であり得る。植物細胞は、機械的ストレス、熱ストレス、または真菌ストレスにさらされたものであってもよい。
【０００７】
異種受容体は、リガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含み得る。異種受容体は、核ホルモン受容体ポリペプチドであり得る。核ホルモン受容体は、昆虫核ホルモン受容体または哺乳動物核ホルモン受容体であってよく、例えばAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRが挙げられる。複数の植物細胞はさらに、二量体化受容体ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。異種受容体はキメラ受容体、例えばリガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含むキメラ受容体であり得る。キメラ受容体のトランス活性化ドメインは、VP16トランス活性化ドメイン、またはトウモロコシ転写因子Ｃトランス活性化ドメインとすることができる。
【０００８】
キメラ受容体のDNA結合ドメインは、AR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXRまたはRXRのDNA結合ドメインであり得る。異種受容体はさらに、二量体化配列を含み得る。異種受容体はさらに、局在化シグナルを含み得る。局在化シグナルは、細胞質局在化シグナル、核局在化シグナル、ER局在化シグナル、ゴルジ装置局在化シグナル、または細胞膜局在化シグナルであり得る。
【０００９】
１以上の候補リガンドは、植物体の一部である植物細胞により合成され得る。候補リガンドは、前記複数の植物細胞により合成される内因性リガンドであってもよい。
【００１０】
レポーターは、分光測光的に測定可能な活性(例えば蛍光、または生物発光)を有するポリペプチドであり得る。レポーターポリペプチドはエピトープタグを含み得る。エピトープタグは、FLAG(登録商標)タグ、HAタグ、c-Mycエピトープ、AU1タグまたは6-HISタグとすることができる。レポーターポリペプチドは、GFP、GUS、YFP、RFP、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼであり得る。レポーターポリペプチドを前記複数の植物細胞中の組換え核酸にコードさせて、この組換え核酸の転写を該受容体のシグナル伝達活性により仲介させることが可能である。レポーターは、異種受容体ポリペプチド中に存在するDNA結合ドメインと相互作用可能な受容体応答エレメントに応答性であり得る。
【００１１】
異種受容体ポリペプチドをコードする核酸は、植物組織または器官（例えば葉、根、茎および種子）での優先的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結させることができる。いくつかの実施形態において、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸は、構成的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結され得る。
【００１２】
受容体ポリペプチドは、エピトープを含み得る。エピトープは、天然に存在するものであってもよく、またはFLAG(登録商標)もしくはHISタグなどの合成エピトープであってもよい。前記方法はさらに、質量分析を用いてリガンドを同定することを含み得る。
【００１３】
受容体ポリペプチドは、該受容体を膜（例えば、小胞体膜、ゴルジ膜、核膜、ペルオキシソーム膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、および原形質膜からなる群より選択される膜)へと標的化するシグナル配列を含み得る。
【００１４】
前記方法は、該受容体を発現する細胞を単離すること、または質量分析を用いてリガンドを同定することを含み得る。いくつかの実施形態において、前記方法は、レポーターを発現する細胞を単離すること、または質量分析を用いてリガンドを同定することを含む。
【００１５】
前記複数の植物細胞はさらに、ステロール生合成ポリペプチド、例えば、スクアレンシンターゼポリペプチド、ルペオールシンターゼポリペプチド、シクロアルテノールシンターゼポリペプチド、ステロールメチルオキシダーゼポリペプチド、ジテルペンシンターゼポリペプチド、セスキテルペンシンターゼポリペプチド、またはテルペノイドシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含み得る。前記複数の植物細胞はさらに、フラボノイド生合成ポリペプチド、例えば、カルコンイソメラーゼポリペプチド、カルコンレダクターゼポリペプチド、ジヒドロフラボノールレダクターゼポリペプチド、イソフラボンシンターゼポリペプチド、イソフラボンレダクターゼポリペプチド、またはフラボノイド3-ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸を含み得る。前記複数の植物細胞はさらに、フェノール系生合成ポリペプチド、テルペノイド生合成ポリペプチド、またはアルカロイド生合成ポリペプチドをコードする核酸を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明はまた、核ホルモン受容体リガンドをスクリーニングする方法に関する。この方法は、核ホルモン受容体ポリペプチドのコード配列、およびレポーターとして転写される配列を含む少なくとも１つの構築物を含有する１個以上の植物細胞を用意することを含む。核ホルモン受容体ポリペプチドは、リガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含み、ここでレポーターとして転写される配列は、DNA結合ドメインと相互作用可能な受容体応答エレメントに機能的に連結されており、ここでレポーターの活性は、該配列の受容体／リガンド結合依存性転写の際に検出可能である。候補リガンドを、構築物からの受容体ポリペプチドの転写および該受容体ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にする条件下で受容体ポリペプチドと接触させ、レポーターの活性が検出されるか否か測定する。植物細胞は、少なくとも１つの植物体の一部、例えば葉細胞または毛状体細胞であり得る。植物細胞は、組織培養の細胞、例えばカルス培養の細胞であり得る。植物細胞は、機械的ストレス、熱ストレス、または真菌ストレスにさらされたものであり得る。核ホルモン受容体は、哺乳動物核ホルモン受容体、例えばAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRであり得る。複数の植物細胞はさらに、二量体化受容体ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
【００１７】
核ホルモン受容体は、キメラ受容体であり得る。キメラ受容体のトランス活性化ドメインは、VP16トランス活性化ドメイン、またはトウモロコシ転写因子Ｃトランス活性化ドメインとすることができる。キメラ受容体のDNA結合ドメインは、AR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXRまたはRXRのDNA結合ドメインであってよい。核ホルモン受容体はさらに、二量体化配列を含み得る。核ホルモン受容体ポリペプチドのコード配列は、植物組織または器官（例えば葉、根、茎および種子）での優先的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結され得る。いくつかの実施形態において、核ホルモン受容体ポリペプチドのコード配列は、構成的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結され得る。
【００１８】
核ホルモン受容体はさらに、局在化シグナル、例えば、細胞質局在化シグナル、核局在化シグナル、ER局在化シグナル、ゴルジ装置局在化シグナル、または細胞膜局在化シグナルを含み得る。
【００１９】
１以上の候補リガンドは植物細胞に合成させることが可能であり、植物細胞は植物体の一部または全部であり得る。候補リガンドは、前記複数の植物細胞により合成される内因性リガンドであり得る。
【００２０】
前記転写される配列は、分光測光的に測定可能な活性（例えば蛍光、または生物発光)を有するポリペプチドをコードし得る。前記転写される配列はさらにエピトープタグをコードしてもよい。エピトープタグは、FLAG(登録商標)タグ、HAタグ、c-Mycエピトープ、AU1タグまたは6-HISタグであり得る。レポーターポリペプチドは、GFP、GUS、YFP、RFP、ルシフェラーゼまたはβガラクトシダーゼであり得る。
【００２１】
受容体ポリペプチドは、該受容体を膜、例えば、小胞体膜、ゴルジ膜、核膜、ペルオキシソーム膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、または原形質膜へと標的化するシグナル配列を含み得る。前記方法はさらに、該受容体を発現する細胞を単離することを含み得る。前記方法はさらに、質量分析を用いてリガンドを同定することを含み得る。
【００２２】
前記１個以上の植物細胞はさらに、ステロール生合成ポリペプチド、例えば、スクアレンシンターゼポリペプチド、ルペオールシンターゼポリペプチド、シクロアルテノールシンターゼポリペプチド、またはステロールメチルオキシダーゼポリペプチドをコードする核酸を含み得る。前記１個以上の植物細胞はさらに、フラボノイド生合成ポリペプチド、例えば、カルコンイソメラーゼポリペプチド、カルコンレダクターゼポリペプチド、ジヒドロフラボノールレダクターゼポリペプチド、イソフラボンシンターゼポリペプチド、イソフラボンレダクターゼポリペプチド、またはフラボノイド3-ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸を含み得る。前記１個以上の植物細胞はさらに、フェノール系生合成ポリペプチド、テルペノイド生合成ポリペプチド、またはアルカロイド生合成ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
【００２３】
本発明はまた、核ホルモン受容体ポリペプチドに対して40％を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする第１組換え核酸(ここで該ポリペプチドは調節エレメントに機能的に連結されている)、および、レポーターコード配列に機能的に連結された核内受容体応答エレメントを含む第２組換え核酸を含有するトランスジェニック植物細胞に関する。核ホルモン受容体ポリペプチドは、AR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRであり得る。いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、一過性に形質転換された細胞である。
【００２４】
本発明の他の構成および効果は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。特に断らない限り、本明細書において用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般的に理解される意味を有する。本明細書に記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。不一致が生じた場合には、定義を含めて本明細書が優先する。開示される材料、方法および実施例は説明のみを目的としたものであり、限定を意図したものではない。当業者ならば、本発明を実施するために、本明細書に記載した方法および材料と類似または均等な方法および材料が使用可能であると理解するであろう。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、受容体ポリペプチドと相互作用する分子を同定するための方法および材料を提供する。一般に、このような分子はリガンドと呼ばれており、受容体のコグネイトシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる。提供する植物および技術は、トランスジェニック植物細胞に適用される多種多様の外因性候補リガンドをスクリーニングするために、また、トランスジェニック植物細胞の内因性リガンドを効率的に同定するために使用可能である。本方法によって同定されたリガンドは、受容体のコグネイトシグナル伝達分子のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し、医薬として有用であり得る。
【００２６】
本発明に従った方法は、異種受容体をコードする核酸を含む植物細胞の、該受容体と相互作用する１以上の候補リガンドを同定するための使用に関するが、ここで、この系はまた、レポーターを利用し、該レポーターの活性が異種受容体のシグナル伝達活性のリガンドによるモジュレーションに応答性である。いくつかの実施形態において、候補リガンドは異種受容体を発現する植物細胞中に存在し、それゆえに、そのような植物細胞が受容体と相互作用するリガンドを保有するか否かを判別するための、簡便な自己内蔵型系を提供する。その後、従来の方法ではこれまで同定されていなかったリガンドを同定するために、受容体活性のモジュレーションを示す植物細胞中に存在する分子を特徴付けすることができる。
【００２７】
Ｉ．異種受容体
本明細書に記載する方法に使用するためのトランスジェニック植物および植物細胞は、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸を含有する。異種受容体ポリペプチドとは、本方法に使用される植物細胞の対応する非トランスジェニック植物中には存在しない受容体ポリペプチドのことである。異種受容体ポリペプチドは、天然に存在する受容体の全長コード配列によりコードされるポリペプチドであり得る。多くの異種受容体ポリペプチドが、本明細書に記載する方法での使用に適している。
【００２８】
特に興味がもたれるのは核ホルモン受容体、とりわけヒト核ホルモン受容体である。核ホルモン受容体は、ホルモンおよび栄養素として誘導される親油性リガンドに結合する、遺伝子制御性のDNA結合タンパク質の大きなファミリーである。核ホルモン受容体は、標的遺伝子の転写を活性化または抑制することのできるDNA結合タンパク質であることが久しく知られている。多くの核ホルモン受容体が同定されており、例えば、レチノイドＸ受容体、レチノイン酸受容体、プロゲステロン受容体、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、およびビタミンＤ受容体が挙げられる。核ホルモン受容体は、進化の過程で保存されてきたと考えられており、細胞の成長と増殖、発生、およびホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすと考えられている。核ホルモン受容体の変化は、多くの疾患に関係している。
【００２９】
特定の実施形態において、植物細胞中に存在する異種受容体ポリペプチドは、次のものであり得る：レチノイドＸ受容体(RXR)、肝細胞核因子４(HFN4)、精巣受容体、テールレス(tailless)遺伝子ホモログ(TLX)、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター転写因子(COUP-TF)、甲状腺ホルモン受容体(THR)、レチノイン酸受容体(RAR)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)、リバースErb(reverb)、RAR関連オーファン受容体(ROR)、ステロイド産生因子-１(SF-1)、肝臓受容体ホモログ-1(LRH-1)、肝臓Ｘ受容体(LXR)、ファルネソイドＸ受容体(FXR)、ビタミンＤ受容体(VDR)、エクジソン受容体(EcR)、プレグナンＸ受容体(PXR)、構成的アンドロスタン受容体(CAR)、ニューロン由来活性化受容体(NOR1)、核内受容体１(NURR1)、エストロゲン受容体(ER)、エストロゲン関連受容体(ERR)、グルココルチコイド受容体(GR)、アンドロゲン受容体(AR)、プロゲステロン受容体(PR)、またはミネラルコルチコイド受容体(MR)。
【００３０】
代表的な核ホルモン受容体は、PPAR受容体ポリペプチドである。PPAR受容体は、核ホルモン受容体のスーパーファミリーのメンバーであると考えられている。PPARは、リガンド結合時に活性化され、ヘテロ二量体の形態でのPPAR／リガンドの、応答配列(ペルオキシソーム増殖因子応答エレメント、PPRE)への結合は、PPREの下流に機能的に配置された配列の転写を活性化する。PPAR受容体ポリペプチドは、PPARα、PPARβ、およびPPARγと呼ばれる３種のサブタイプに分類され、cDNA配列が得られている。例えば米国特許公開第20020119499号を参照のこと。
【００３１】
別の代表的な核ホルモン受容体はERポリペプチドである。エストロゲン受容体は、エストロゲンなどのリガンドの結合により活性化される。ERホモ二量体／リガンド複合体の、cis-応答性エストロゲン受容体エレメント(ERE)への結合は、EREの3'側に機能的に配置された配列の転写を活性化する。ヒトでは２種のエストロゲン受容体、ERαおよびERβが知られている。この２種の受容体は共通の構造ドメインおよび機能ドメインを有している。すなわち、これらはエストロゲンに高い親和性で結合し、かつ類似の様式でエストロゲン応答エレメントに結合するが、組織分布、転写活性、およびノックアウトモデルにおける表現型に関しては異なる。
【００３２】
レチノイドＸ受容体(RXR)は、ホモ二量体としてリガンド依存的にRXR応答エレメントでDNAと結合し得る。このようなリガンドの１種は9-cisレチノイン酸である。RXRはまた、レチノイン酸受容体(RAR)、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、NGFI-Bおよび他の核内受容体と機能的なヘテロ二量体を形成することができる。マウスにおいては、レチノイドＸ受容体は、RXRα(RXRA)、RXRβ(RXRB)、およびRXRγ(RXRG)と命名された３種のサブタイプに分類されている。
【００３３】
肝細胞核因子４(HFN4)は、ホモ二量体としてリガンド依存的に２つのコアモチーフ5'-RG(G/T)TCAを含む応答エレメント、または１ヌクレオチドだけ離れている密接に関連した配列(直接反復配列、またはDR1エレメント)でDNAと結合することができる。
【００３４】
精巣受容体２(TR2)は、ホモ二量体としてリガンド依存的にDNAと結合することができる。TR2／リガンド複合体は、種々の間隔をおいた２つのAGGTCA半部位(half-site)直接反復配列を含む応答エレメントに結合する。このような複合体はまた、細胞性レチノール結合タンパク質IIプロモーター領域(CRBPIIp)、SV40＋55領域、およびレチノイン酸応答エレメントβ（RAREβ)などの応答エレメントに結合することもできる。
【００３５】
甲状腺ホルモン受容体ポリペプチド(THR)は、ホモ二量体として、およびヘテロ二量体として(例えばレチノイドＸ受容体と共に)、DNAに結合することができる。これらのポリペプチドはTHR応答エレメントに結合することができる。ステロイドホルモン受容体とは異なり、甲状腺ホルモン受容体はリガンドの不在下でDNAに結合することができ、この結合は転写の低減をもたらし得る。ホルモンが結合すると、該受容体はコンフォメーション変化を起こし、その結果転写に正の影響を及ぼす。ヒトにおいては、甲状腺ホルモン受容体は、THRα(THRA)およびTHRβ(THRB)と命名された２種のサブタイプに分類されている。
【００３６】
レチノイン酸受容体(RAR)ポリペプチドは、ホモ二量体としてリガンド依存的にRARエレメント(RARE)でDNAに結合することができる。このようなリガンドの１種はレチノイン酸である。いくつかのRARイソ型が哺乳動物で知られており、RARα、RARβ、およびRARγなどが挙げられる。
【００３７】
アンドロゲン受容体(AR)は、ホモ二量体としてリガンド依存的にアンドロゲン応答エレメント(ARE)でDNAに結合することができる。このようなリガンドの１種は、7α-メチル-17α-(2'-(E)-ヨードビニル)-19-ノルテストステロンである。
【００３８】
適当な異種受容体ポリペプチドは、種々の方法で同定することができる。既知の受容体に対する抗体を使用する共免疫沈降アッセイを用いて、候補ポリペプチドを同定することができる。候補ポリペプチドを同定する別の方法は、変異型受容体の機能的相補性によるものである。受容体の適当な候補はまた、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列アライメントを解析することにより同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに対してクエリーを実行することにより、異種受容体ポリペプチドのオーソログを同定し得る。配列解析は、既知の受容体のアミノ酸配列を用いた重複のないデータベースのBLASTまたはPSI-BLAST解析を含み得る。40％を超える配列同一性を示すデータベース中のタンパク質は、受容体としての適合性についてさらに評価すべき候補である。所望ならば、さらに評価する候補の数を絞り込むために、このような候補の手検査を行ってもよい。手検査は、受容体中に存在すると考えられるドメインをもつらしい候補を選択することにより行ってもよい。
【００３９】
ある対象核酸またはアミノ酸配列(例えばヒトERα受容体ポリペプチド)の、別の「標的」核酸またはアミノ酸配列に対する同一性パーセントは、次のように求めることができる。まず、標的核酸またはアミノ酸配列を、BLASTZ(BLASTNおよびBLASTPを内包する)のスタンド-アローンバージョン(例えばバージョン2.0.14)からのBLAST2 Sequences(Bl2seq)プログラムを用いて、対象核酸またはアミノ酸配列と比較しアライメントすることができる。BLASTZの独立型バージョンは、<www.fr.com/blast>またはwww.ncbi.nlm.nih.gov>から得ることができる。BLASTZ、特にBl2seqプログラムの使用方法を説明した説明書は、BLASTZに付随する'readme'ファイルに見出せる。これらのプログラムはまた、Karlinら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264; Karlinら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873;およびAltschulら, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389に詳述されている。
【００４０】
Bl2seqは、対象配列と標的配列との比較を、BLASTN(核酸配列を比較するために使用)またはBLASTP(アミノ酸配列を比較するために使用)アルゴリズムを用いて行う。典型的には、アミノ酸配列アライメントを行うときには、BLOSUM62スコアリングマトリクスのデフォルトパラメーターである、ギャップ存在コスト11および伸長コスト１、ワードサイズ３、期待値10、残基当たりのコスト１、およびラムダ比0.85を使用する。出力ファイルは、標的配列と対象配列間のアライメントされた相同性の領域を含む。一旦アライメントされたならば、任意のマッチする位置から開始して任意の他のマッチする位置で終了する対象配列からの配列とアライメントした、標的配列からの連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基(すなわちギャップを除外する)の数を数えることにより、長さを決定する。マッチする位置とは、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、標的配列および対象配列の両方に存在する位置である。構造的に保存されたドメイン(例えばαヘリックス、βシート、およびループ)間の配列アライメントを最大化するために、１個以上の残基のギャップを標的配列または対象配列に挿入することができる。
【００４１】
ある特定の長さにわたる同一性パーセントは、その特定の長さにわたってマッチする位置の数を数え、その数を長さで割り、得られた値に100を掛けることにより決定される。例えば、(i) 500アミノ酸の標的配列が対象アミノ酸配列と比較され、(ii) Bl2seqプログラムが、対象配列の領域とアライメントされた標的配列からの200アミノ酸（その200アミノ酸領域の最初と最後のアミノ酸がマッチである）を提示し、(iii) その200のアライメントされたアミノ酸にわたるマッチの数が180であるとすると、前記500アミノ酸標的配列は、200の長さを含み、その長さにわたる配列同一性が90％(すなわち、180÷200×100=90)となる。いくつかの実施形態において、適当な異種受容体ポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトERαポリペプチドのアミノ酸配列に対して40％を超える配列同一性(例えば＞80％、＞70％、＞60％、＞50％または＞40％)を示す。他の実施形態において、適当な異種受容体ポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトPPARαポリペプチドのアミノ酸配列に対して40％を超える配列同一性(例えば＞80％、＞70％、＞60％、＞50％または＞40％)を示す。他の特定の実施形態において、適当な異種受容体ポリペプチドのアミノ酸配列は、レチノイドＸ受容体(RXR)ポリペプチド、肝細胞核因子４(HFN4)ポリペプチド、精巣受容体ポリペプチド、テールレス遺伝子ホモログ(TLX)ポリペプチド、ニワトリオブアルブミン上流プロモーター転写因子(COUP-TF)ポリペプチド、甲状腺ホルモン受容体-α(THRA)ポリペプチド、甲状腺ホルモン受容体-β(THRB)ポリペプチド、レチノイン酸受容体(RAR)ポリペプチド、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)ポリペプチド、リバースErb(reverb)ポリペプチド、RAR関連オーファン受容体(ROR)ポリペプチド、ステロイド産生因子-１(SF-1)ポリペプチド、肝臓受容体ホモログ-1(LRH-1)ポリペプチド、肝臓Ｘ受容体(LXR)ポリペプチド、ファルネソイドＸ受容体(FXR)ポリペプチド、ビタミンＤ受容体(VDR)ポリペプチド、エクジソン受容体(EcR)ポリペプチド、プレグナンＸ受容体(PXR)ポリペプチド、構成的アンドロスタン受容体(CAR)ポリペプ
チド、ニューロン由来活性化受容体(NOR1)ポリペプチド、核内受容体１(NURR1)ポリペプチド、エストロゲン受容体(ER)ポリペプチド、エストロゲン関連受容体(ERR)ポリペプチド、グルココルチコイド受容体(GR)ポリペプチド、アンドロゲン受容体(AR)ポリペプチド、プロゲステロン受容体(PR)ポリペプチド、またはミネラルコルチコイド受容体(MR)ポリペプチドのアミノ酸配列に対して40％を超える配列同一性(例えば＞80％、＞70％、＞60％、＞50％または＞40％)を示す。
【００４２】
対象配列とアライメントされる核酸またはアミノ酸標的配列は、多くの異なる長さ（各長さがそれ自体の同一性パーセントを有する）にしうることが理解されよう。同一性パーセント値は、最も近い小数点以下第１位に端数を切り捨てることができると留意されたい。例えば、78.11、78.12、78.13および78.14は78.1に切り下げ、一方78.15、78.16、78.17、78.18および78.19は78.2へと切り上げる。また、長さの値は必ず整数であることにも注意されたい。
【００４３】
鋳型（つまり対象）ポリペプチド中の保存領域を同定することは、野生型受容体の変異体の作製を促進し得る。保存領域は、鋳型ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の、反復配列の領域、何らかの二次構造(例えばヘリックスやβシート)を形成している領域、正もしくは負に荷電されたドメインを確立している領域、またはタンパク質モチーフもしくはドメインに相当する領域の位置を決定することにより同定することができる。例えば、http://www.sanger.ac.uk/Pfam/およびhttp://genome.wustl.edu/Pfam/で、種々のタンパク質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を掲載しているPfamウェブサイトを参照されたい。Pfamデータベースに収録されている情報の解説は、Sonnhammerら, 1998, Nucl. Acids Res. 26: 320-322；Sonnhammerら, 1997, Proteins 28:405-420；およびBatemanら, 1999, Nucl. Acids Res. 27:260-262に記載されている。Pfamデータベースからは、タンパク質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を鋳型ポリペプチド配列とアライメントさせて保存領域を判別することができる。
【００４４】
保存領域はまた、近縁種からの同一または関連ポリペプチドの配列をアライメントすることにより確認することができる。近縁種は好ましくは同じ科に由来するものである。いくつかの実施形態においては、２つの異なる種からの配列のアライメントで十分である。例えば、ヒトおよびチンパンジーからの配列を使用して、１以上の保存領域を同定することができる。
【００４５】
典型的には、保存領域を同定するためには、少なくとも約35％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが有用である。関連タンパク質の保存領域は時には少なくとも約40％のアミノ酸配列同一性を示す(例えば、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％のアミノ酸配列同一性)。いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドと鋳型ポリペプチドの保存領域は、少なくとも92、94、96、98または99％のアミノ酸配列同一性を示す。アミノ酸配列同一性はアミノ酸配列またはヌクレオチド配列から推定することができる。
【００４６】
天然に存在する全長受容体の少なくとも１つのリガンド結合活性が保持されているという条件で、天然に存在する受容体の変異体、断片および融合体であるポリペプチドもまた対象とされる。典型的には、天然受容体の変異体、断片および融合体のリガンド結合活性は、野生型受容体のリガンド結合活性の少なくとも40％であり、より典型的には野生型受容体の活性の50〜80％、さらに典型的には70〜90％であり、さらに典型的には80％を超える。
【００４７】
異種受容体ポリペプチドは、天然の全長コード配列の保存的置換、挿入または欠失を有しうる。当業者であれば、コード配列中の単一アミノ酸または小割合のアミノ酸を変更、付加または欠失させる、ポリペプチドの個々の置換、欠失または付加は「保存的に改変された変異体」（この場合には、かかる改変により、あるアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換が生じる）をもたらすことが理解されよう。機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換の一覧表は、当技術分野でよく知られている。次の６グループはそれぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：
１) アラニン(Ａ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)；
２) アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；
３) アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)；
４) アルギニン(Ｒ)、リジン(Ｋ)；
５) イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチオニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；および
６) フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)。
【００４８】
いくつかの場合においては、適当な受容体を、相同受容体であるポリペプチドのコンセンサス機能ドメインおよび／または保存領域を基にして合成することができる。コンセンサスドメインおよび保存領域は、上述の相同ポリペプチド配列解析により同定し得る。このような合成ポリペプチドが異種受容体として使用するのに適しているかは、異種受容体ポリペプチドの機能的相補性により評価することができる。
【００４９】
あるいはまた、本発明の異種受容体は、天然に存在する受容体の断片であってもよい。通常、このような断片は、天然受容体のリガンド結合ドメインを含むものである。ドメインとは、ポリペプチド中の実質的に連続したアミノ酸のグループであって、タンパク質ファミリーおよび／またはタンパク質の一部を特徴づけるために用いることができる。このようなドメインは、保存された(１)一次配列、(２)二次構造、および／または(３)三次元コンフォメーションを含みうる「フィンガープリント」(fingerprint)または「シグネチャー」(signature)を有する。
【００５０】
一般にこれらのドメインは、特定のin vitroおよび／またはin vivo活性と関連づけられている。ドメインは、10アミノ酸〜100アミノ酸の長さ、例えば10〜50アミノ酸、または25〜100アミノ酸、または35〜65アミノ酸、または35〜55アミノ酸、または45〜60アミノ酸の長さを有しうる。典型的には、核ホルモン受容体ポリペプチドは、リガンド結合ドメイン、DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含んでなる。核ホルモン受容体ポリペプチドのアミノ酸配列中のサブ領域は、Ｎ末端からＣ末端の順に、Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦと呼ぶことができる。
【００５１】
Ａ. リガンド結合ドメイン
大きなＣ末端リガンド結合ドメイン(LBD)は、典型的には、天然の核ホルモン受容体中に観察されるが、これらの受容体は一般的に、リガンド結合ドメイン中にやはり存在する受容体二量体化接触部位から離れて、３箇所の別個のクラスターとしてリガンド接触部位を有する。保存されたE1サブ領域、ならびにあまりよく保存されていないヘプタッド９(h9)領域および第２トランス活性化ドメイン(AF2)もまた、リガンド結合ドメイン内に存在する。
【００５２】
リガンド結合ドメインは一般的に、親油性の結合空隙の周辺に組織化されたいくつかの小さなβ鎖と11〜13のαヘリックスとのサンドイッチである三次構造を有する。表１に、天然に存在する受容体のリガンド結合ドメインの具体的なアミノ酸配列を示す。典型的には、リガンド結合ドメインは、E1サブ領域に、保存されたリジン、プロリン、フェニルアラニン、ロイシン、アスパラギン酸、およびグルタミン残基を有し得る(下記表１)。例えば、ERリガンド結合ドメイン中の保存アミノ酸は、残基362(リジン)、365(プロリン)、367(フェニルアラニン)、370、378、379(いずれもロイシン)、374(アスパラギン酸)、および375(グルタミン)である。典型的には本発明の異種受容体のリガンド結合ドメインは、天然に存在するヒト核ホルモン受容体ファミリーのメンバーに対する保存された一次、二次、および／または三次構造類似性を示す変異体、断片または融合体であり得る。in vitroまたはin vivoで、異種受容体のリガンド結合ドメインは、核ホルモン受容体の既知のリガンドに結合する能力を示す。典型的には、異種受容体ポリペプチドは少なくとも300nMの結合定数(Kd)、例えば少なくとも200nM、少なくとも100nM、少なくとも75nM、または少なくとも50nMのKdで、既知のリガンドに結合する能力を保持する。リガンド結合ドメインの例を以下の表１に示す。
【表１】
【００５３】
Ｂ. DNA結合ドメイン
異種受容体ポリペプチドは、DNA結合ドメインと呼ばれ、また「Ｃドメイン」としても知られているドメインを含み、このドメインはDNA上の認識部位に結合する。DNA結合ドメインは典型的には(Cys)４型のジンクフィンガーDNA結合モチーフを２つ含む。いくつかの実施形態において、例えば、甲状腺受容体ポリペプチドの場合において、可変性Ｃ末端伸長部(CTE)がジンクフィンガーモチーフに挟まれており、DNA結合に関与している。DNA結合ドメインの例を以下の表２に示す。
【表２】
【００５４】
異種受容体ポリペプチドのDNA結合ドメインは、リガンド依存的に、特定のcis-応答性ヌクレオチド配列(受容体応答エレメント)に結合する。典型的な結果として、受容体応答エレメントと関連しておりかつ該エレメントに機能的に連結された転写開始部位からの転写の活性化が起こる。よって、転写開始部位からの転写の活性化はリガンド依存的である。いくつかの実施形態において、DNA結合ドメインがそのコグネイト受容体応答エレメントに結合するのを促進するには、適当なシャペロニンまたは他の成分が必要である。
【００５５】
Ｃ. トランス活性化ドメイン
異種受容体ポリペプチドは典型的には、個別のDNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを有する。典型的には、Ａ／Ｂドメインとしても知られているトランス活性化ドメインは、細胞の転写・翻訳機構のタンパク質を転写開始部位と接触させて、転写を開始させることができる。異種受容体ポリペプチドのトランス活性化ドメインは、合成されたものであるか、またはリガンド結合ドメインとは異なる供給源に由来するものであり得る。適当なトランス活性化ドメインの例としては、ヘルペスウイルスVP16ポリペプチドおよびトウモロコシ転写因子Ｃポリペプチドのトランス活性化ドメインが挙げられる。
【００５６】
Ｄ. 二量体化配列
いくつかの実施形態において、異種受容体ポリペプチドは、二量体化配列を含んでなる。いくつかの場合に、リガンド／受容体複合体がその認識DNA部位に結合するためには二量体化が必要である。例えばPPARは、レチノイドＸ受容体(RXR)とヘテロ二量体を形成して、ヘテロ二量体の形態でPPREに結合することが知られている。また、他の核内受容体と同様に、PPARは、転写コアクチベーターの一群と相互作用して転写活性化作用を促進すると考えられている。
【００５７】
二量体化配列は、受容体ポリペプチドがホモまたはヘテロ二量体を生じるようにすることができる。受容体のアミノ酸配列中のいくつかのモチーフまたはドメインは、所定の核内受容体(例えばDNA結合(Ｃ)ドメインまたはリガンド結合(Ｅ)ドメイン)のヘテロ二量体化またはホモ二量体化に影響を与えることができる。ＤドメインのＮ末端部分(ヒンジ領域としても知られている)もまたヘテロ二量体化においてある役割を果たし得る。
【００５８】
このことから、いくつかの実施形態において、本明細書に記載する異種受容体はヘテロ二量体としてそのコグネイト応答エレメントに結合する。そのような実施形態においては、本方法に用いる植物細胞は、異種受容体ポリペプチドをコードする配列に加えて、二量体化パートナーとして、第２の受容体ポリペプチドを発現するコード配列を含有する。ヘテロ二量体として結合する核ホルモン受容体は、例えば、レチノイン酸受容体、甲状腺受容体、ビタミンＤ受容体、ファルネソイドＸ受容体、オキシステロール受容体、ペルオキシソーム増殖因子受容体またはエクジソン受容体であってもよく、その各々はレチノイドＸ受容体とのヘテロ二量体として結合する。このような受容体を用いる場合、本方法に使用する植物細胞は、異種受容体ポリペプチドをコードする配列に加えて、二量体化パートナーとして、レチノイドＸ受容体を発現するコード配列を含有する。他の代表的ヘテロ二量体としては、RXR/LXR、RXR/PXR、RXR/CAR、RXR/THR、RXR/THRα、RXR/THRβ、RXRα/THRβ、RXRα/THRα、RXRβ/THRα、RXRβ/THRβおよびUSP/EcR、RXRα/PPARγ、RXRα/PPARα、RXRα/RARα、RXRα/RARβが挙げられる。
【００５９】
Ｅ. 局在化シグナル
本発明に有用な異種受容体ポリペプチドはまた、局在化シグナル配列、例えば、細胞質局在化シグナル、核局在化シグナル、ER局在化シグナル、ゴルジ装置局在化シグナル、または細胞膜局在化シグナルを含み得る。異種受容体は、グルココルチコイド受容体およびミネラルコルチコイド受容体の場合と同様に、リガンドの不在下では細胞の細胞質に存在し、リガンドに結合すると核または他の細胞区画へと少なくとも一部が移動することが理解されている。細胞質局在化シグナルは、例えば細胞質／核局在の比を増加させることができる。
【００６０】
このような配列は、天然の核ホルモン受容体の内因性局在化シグナルまたは合成配列であり得る。細胞質局在化シグナルの一例は、異種受容体ポリペプチドを細胞の細胞質膜へと向かわせることのできるドメインである「膜固着ドメイン」である。適当な膜固着ドメインとしては、例えば、ミリストイル化(MYR)ドメイン、例えばSrcファミリーキナーゼ由来；プレクストリン相同(PH)ドメイン、例えばインスリン受容体基質、ホスホリパーゼＣ(PLC)、もしくはプロテインキナーゼＢ(PKB)由来；または、C2ドメイン、例えばプロテインキナーゼＣ(PKC)もしくはPI3キナーゼ由来；が挙げられる。
【００６１】
Ｆ. エピトープタグ
いくつかの実施形態において、異種受容体ポリペプチドはエピトープタグを有する。エピトープタグは、リガンドに結合した受容体ポリペプチドおよび／またはリガンドに結合していない受容体ポリペプチドを単離するための、あるいは、異種受容体ポリペプチドを発現している植物中の細胞を単離するための、都合の良い手段を提供し得る。当技術分野では種々のエピトープタグが公知であって、使用されているが、その例としてはFLAG(登録商標)タグであるDYKDDDDK(配列番号36)、HAタグであるYPYDVPDYA(配列番号37)、c-MycエピトープであるEQKLISEEDL(配列番号38)、AU1タグであるDTYRYI(配列番号39)、および6-HISタグであるHHHHHH(配列番号40)などが挙げられる。
【００６２】
Ｇ. キメラ受容体
他の実施形態において、異種受容体ポリペプチドはキメラポリペプチドである。例としては、ある受容体のリガンド結合ドメインと別の受容体のDNA結合ドメインの融合体が挙げられる。別の事例では、キメラ構築物は、全長受容体ポリペプチドの１以上のドメインと、受容体活性を示さないポリペプチド由来の１以上のドメインまたはモチーフを含有し、例えば核ホルモン受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインと、ウイルスの非ホルモン転写活性化ポリペプチドのDNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインを含有する。他の実施形態では、異種受容体ポリペプチドは、局在化シグナルまたはエピトープタグを有するキメラポリペプチドである。特定の場合においては、別の受容体の活性化ドメインをVP16活性化ドメインで置き換えて、例えばVP16THRβなどのキメラ受容体ポリペプチドを得ることもできる。
【００６３】
キメラ異種受容体ポリペプチドはまた、リガンドの同定に有用であり得る。キメラ異種受容体ポリペプチドは、２以上のポリペプチドセグメントを有し、各々のセグメントは上記のドメイン、タグ、配列またはシグナルを１以上有する。かくして、キメラポリペプチドは、核ホルモン受容体のリガンド結合活性を示す第１ポリペプチドセグメントと、DNA結合ドメインおよびトランス活性化ドメインの活性を有する第２ポリペプチドセグメントとを含み得る。いくつかの実施形態において、第１ポリペプチドセグメントは、RXR、HFN4、精巣受容体、TLX、COUP-TF、THR、RAR、PPAR、reverb、ROR、SF-1、LRH-1、LXR、FXR、VDR、EcR、PXR、CAR、NOR1、NURR1、ER、ERR、GR、AR、PR、またはMRのリガンド結合ドメインに対して40％以上（例えば少なくとも40％、少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％)の配列同一性を示す。第１および第２ポリペプチドセグメントは、第２ポリペプチドセグメントの一端が、少なくとも１箇所の共有結合により第１ポリペプチドセグメントの一端に連結されるように配置される。
【００６４】
典型的には第１および第２ポリペプチドセグメントは、ペプチド結合により直接連結されている。このような実施形態においては、第１ポリペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸を、第２ポリペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸に連結させることができる。あるいは、第１ポリペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸を、第２ポリペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸に連結させてもよい。いくつかの実施形態において、第１および第２ポリペプチドセグメントは、第１および第２ポリペプチドの間に配置された１以上(例えば１〜50および10〜50)の介在アミノ酸によって間接的に連結され得る。このような実施形態においては、第１ポリペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸を介在アミノ酸に連結させ、第２ポリペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸を介在アミノ酸に連結させる。あるいはまた、第１ポリペプチドセグメントのＮ末端アミノ酸を介在アミノ酸に連結させ、第２ポリペプチドセグメントのＣ末端アミノ酸を介在アミノ酸に連結させてもよい。いくつかの実施形態において、介在アミノ酸には、少なくとも1個のアラニン残基および／または少なくとも１個のグリシン残基が含まれる。
【００６５】
いくつかの実施形態においては、追加のセグメントが存在し、例えば第３セグメントがエピトープタグもしくは局在化シグナルを有するか、または、第１セグメントがリガンド結合ドメインのみならずエピトープタグを有する。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、キメラ受容体ポリペプチドは３つのセグメントを含み得る。例えば、キメラ受容体ポリペプチドは、リガンド結合ドメインを有する第１セグメント、DNA結合ドメインを有する第２セグメント、およびトランス活性化ドメインを有する第３セグメントを含み得る。さらなる実施形態において、キメラポリペプチドはさらに、二量体化配列を有する第４セグメントを含んでもよい。特定の実施形態においては、キメラポリペプチドはさらに、局在化シグナルを有するセグメントおよびエピトープタグを有するセグメントを含み得る。そのようなキメラ受容体中のセグメント同士は、上記のように連結されている。
【００６７】
Ｈ. 異種受容体構築物
トランスジェニック植物細胞は、コード配列およびそれに機能的に連結された１以上の調節配列を含む異種受容体構築物を含む。コード配列を発現させて、上述のドメインを含む異種受容体を産生させることができる。本明細書において用いる核酸とは、RNAまたはDNA（cDNA、合成DNAもしくはゲノムDNAを含む）をさす。核酸は一本鎖または二本鎖であり得るが、一本鎖の場合にはコード鎖または非コード鎖のいずれであってもよい。核酸に関連して本明細書で用いる「単離された」とは、(i) 本発明のポリペプチドの一部もしくは全部をコードする天然に存在する核酸であって、しかしゲノム中でポリペプチドをコードする核酸の片側もしくは両側に通常隣接している配列（すなわち、コード配列）を含まないもの；(ii) ベクターもしくは生物のゲノムDNAに組み込まれた核酸であって、結果的に得られる分子がどのような天然に存在するベクターもしくはゲノムDNAとも同一ではないもの；または(iii) cDNA、ゲノム核酸断片、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により生成された断片もしくは制限断片をさす。この定義から特別に除外されるのは、核酸分子の混合物中または細胞中に存在する核酸である。
【００６８】
適当な核酸の例としては、ヒト核ホルモン受容体ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。本明細書に開示する具体的なヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列を有する核酸であっても、なおも例示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうることが理解されよう。遺伝暗号の縮重は当技術分野でよく知られている。すなわち、多くのアミノ酸については、そのアミノ酸のコドンとしての機能を果たすヌクレオチドのトリプレットが２以上存在する。さらに、所望であれば、特定の生物種における最適な発現のために核酸コード配列中のコドンを選択しうることが知られている。
【００６９】
組換え核酸構築物は、本明細書に記載する他の配列に加え、クローニングベクター配列を含むことができる。適当なクローニングベクター配列は市販されており、当業者によって日常的に使用されている。本発明の核酸構築物はまた、他のポリペプチドをコードする配列を含有してもよい。そのようなポリペプチドは、例えば、宿主生物への核酸構築物の導入または維持を促進し得る。他のポリペプチドもまた、コードされている受容体ポリペプチドの発現、活性または生化学的もしくは生理学的作用に影響を及ぼし得る。あるいはまた、他のポリペプチドをコードする配列を別個の核酸構築物上に存在させてもよい。
【００７０】
異種受容体をコードする核酸は、例えばDNA合成またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得ることができる。PCRとは、標的核酸を増幅する手法または技術を言う。PCRを用いると、DNAのみならずRNAからの特定の配列（全ゲノムDNAもしくは全細胞RNAからの配列を含む）を増幅することができる。種々のPCR技法が、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach, C. & Dveksler, G.編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995などに記載されている。一般に、対象の領域またはそれを越えた領域の両端からの配列情報を用いて、増幅されるテンプレートの相対する鎖と配列が同一であるかまたは類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。テンプレート核酸に部位特異的ヌクレオチド配列改変を導入することができる種々のPCR戦略が利用可能である。
【００７１】
核酸の検出は、アガロースゲルの臭化エチジウム染色、サザンもしくはノーザンブロットハイブリダイゼーション、PCR、またはin situハイブリダイゼーションなどの手法により行うことができる。ハイブリダイゼーションは典型的にはサザンまたはノーザンブロット法を必要とする。プローブは、核酸またはその相補体に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるべきである。高度にストリンジェントな条件は、低いイオン強度の使用および高温での洗浄（例えば、65℃で0.015 M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム(0.1×SSC)、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)）を含みうる。さらに、ホルムアミドなどの変性剤を、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの過程で使用することができ、例えば、42℃で750 mM NaCl、75 mMクエン酸ナトリウムを含む、0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％ポリビニルピロリドン/pH 6.5の50 mM リン酸ナトリウムバッファーと共に50％ホルムアミドを使用する。
【００７２】
Ｉ. 調節エレメント
異種受容体のコード配列は、その受容体コード配列の転写および翻訳を促進する１以上の調節エレメントに機能的に連結される。典型的には、受容体コード配列は構成的に(例えばCaMV 35Sプロモーターによって)発現される。しかしながら、構成的な発現が、枯死や緩慢な成長などといった望ましくない生理学的または形態学的作用をもたらす場合には、発現を誘導性にしてもよい。
【００７３】
調節エレメントとしては、プロモーター配列、エンハンサー配列、インスレーターエレメント、応答エレメント、タンパク質認識部位、核酸配列の発現をモジュレートする誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、5'および3'UTR、転写開始部位、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、イントロンおよびアミノ酸コード配列中の特定の配列(分泌シグナルなど)、ならびにプロテアーゼ切断部位などが挙げられる。本明細書において用いる「機能的に連結された」とは、構築物中の調節エレメントが、ある核酸に対して、その核酸の転写および／または翻訳を可能にするかまたは促進するように位置づけられている、ことを意味する。追加するエレメントの選択は、いくつかの要因に依存するが、そうした要因としては、限定するものではないが、複製効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および細胞もしくは組織特異性が挙げられる。
【００７４】
一般的には、プロモーターは転写される配列の5'側に位置し、該配列の転写開始部位に近接している。プロモーターはコード配列の第１エキソンの上流にあり、かつ多重転写開始部位の最初の部位の上流にある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、コード配列の第１エキソンのATGから約3000ヌクレオチド上流に配置される。他の実施形態では、プロモーターは多重転写開始部位の最初の部位よりも約2000ヌクレオチド上流に配置される。本発明のプロモーターは少なくともコアプロモーターを含む。さらに、プロモーターはまた、上流エレメントなどの制御エレメントを少なくとも１つ含んでもよい。そのようなエレメントとして上流活性化領域(UAR)が挙げられ、場合によりポリヌクレオチドの転写に影響を及ぼす、合成上流エレメントのような、他のDNA配列が挙げられる。
【００７５】
5'非翻訳領域(UTR)は、転写されるものの翻訳はされず、転写産物の開始部位と翻訳開始コドンの間に介在し、+1ヌクレオチドを含む。翻訳終結コドンと転写産物の終端の間には3'UTRが配置され得る。UTRは、mRNAの安定性を高めるまたは翻訳を減衰させるなどといった特別の機能を有し得る。3'UTRの例としては、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列などが挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施形態においては、特定の細胞型、組織、または発達段階における転写を優先的に駆動する調節エレメントが使用される。例えば、栄養組織由来の細胞(例えば葉細胞または根細胞)における転写を駆動するプロモーターを使用することができる。細胞型特異的または組織特異的プロモーターは標的組織以外の組織中で機能的に連結された配列の発現を駆動することが、往々にして観察されている。従って、本明細書中で用いる細胞型特異的または組織特異的プロモーターは、標的組織で優先的に発現を駆動するものではあるが、さらに他の細胞型または組織でも若干の発現をもたらし得るものである。植物ゲノムDNA中の調節エレメントを同定して特徴づける方法は知られている。
【００７７】
II. レポーター構築物
本明細書に記載する方法に使用する植物細胞は、典型的にはレポーター構築物を含有する。レポーター構築物は、異種受容体／リガンド複合体が結合するためのcis-応答性受容体エレメント(受容体応答エレメント、RRE)、および該RREに機能的に連結された転写される配列を含む。候補リガンドと異種受容体ポリペプチドの相互作用は、RREに機能的に連結されたプロモーターからの転写の活性化と、転写される配列の発現をもたらす。転写される配列は、容易に検出できる性質を示すタンパク質のコード配列でありうる。あるいは、転写される配列はレポーター遺伝子を抑制するアンチセンス、RNAi、またはセンス抑制構築物であってもよい。従って、レポーター活性は、リガンドによる異種受容体のシグナル伝達活性のモジュレーションに応答する。特定のレポーターの安定性は、生物種間で、または同じ種の栽培品種間で様々であることが理解されよう。さらに、他の要因（例えば、形質転換条件、形質転換法など）もレポーターコード配列の安定性および発現レベルに影響を及ぼしうる。かくして、適当なレポーターコード配列は所定の使用のために選択することができる。
【００７８】
Ａ. 受容体応答エレメント(RRE)
cis-応答性受容体エレメントは、多くの核ホルモン受容体ポリペプチドについて知られており、典型的には該エレメントの半分としてのヘキサヌクレオチド配列を含む。半エレメントは、多くの場合ヘキサヌクレオチドAGGTCAのバリエーションであるが、いくつかの受容体ポリペプチド、例えばグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、プロゲステロン受容体およびアンドロゲン受容体などは、AGAACA半部位に結合する。cis-作動性受容体応答エレメントの代表的配列を以下の表３に示す。
【表３】
【００７９】
リガンドを伴った異種受容体ポリペプチドがヘテロ二量体としてそのコグネイト受容体応答エレメントに結合する場合、結合はいくつかのパターンのうちの１つとして起こりうる。いくつかの受容体はヘテロ二量体として、直接(縦列)反復半応答エレメントに結合する。縦列反復配列は典型的には約１〜５ヌクレオチドだけ離れている。あるいは、ヘテロ二量体としての結合は、１塩基対だけ離れた逆方向(パリンドローム)応答エレメントで起こる。RXR/RAR、RXR/VDR、RXR/LXR、RXR/PXR、RXR/CAR、PPAR/RXR、およびRXR/PPARヘテロ二量体は直接反復配列に結合するのに対して、RXR/THRおよびUSP/EcRは逆方向半反復配列に結合する。１つ以上のこのような反復配列は、受容体応答エレメントを構成する。典型的には、cis応答性受容体エレメントは１〜５個の反復配列を含むが、５個以上 (例えば、７、８、９、10、12、15、17、18、19または20) の反復配列を含んでもよい。
【００８０】
他の実施形態において、本明細書に記載する方法に用いる異種受容体は、ホモ二量体としてそのコグネイト応答エレメントに結合する。このような異種受容体は、例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲスチン、またはミネラルコルチコイド受容体であり得る。リガンドを伴った異種受容体ポリペプチドがホモ二量体として、そのコグネイト受容体応答エレメントに結合する場合、結合は、ホモ二量体として３塩基対だけ離れた逆方向反復配列で起こるか、ホモ二量体として１塩基対だけ離れた直接反復配列で起こるか、または単量体として単一の半部位(２ヌクレオチドの5'伸長を含みうる)で起こる。ホモ二量体の活性のためには、おそらく、ホモ二量体の両方の受容体がリガンドと結合するのに対して、ヘテロ二量体の活性のためには、一般に、3'半エレメント上に存在する一次受容体のリガンド結合で十分である。
【００８１】
Ｂ. 転写される配列
典型的には、転写される配列はレポーターポリペプチドのコード配列である。適当なレポーターポリペプチドはいくつか存在しており、そのコード配列を１以上の受容体応答エレメントに機能的に連結することができる。例えば、細胞において発現させた場合、適当な励起波長の光に曝露したときに蛍光を発するポリペプチドが適している。このようなポリペプチドとしては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)および黄色蛍光タンパク質(YFP)が挙げられる。このような蛍光タンパク質は、クラゲAequorea victoria由来の野生型GFP、または腔腸動物の他のメンバー由来のもの、例えばDiscosoma spp.由来の赤色蛍光タンパク質、ウミシイタケRenilla reniformis由来のGFP、Renilla muelleri由来のGFP、あるいは他の動物、菌類もしくは植物由来の蛍光タンパク質であってもよい。天然に存在するアミノ酸配列から改変されたポリペプチドもまた使用可能であり、例えば、GFPの青色蛍光変異体などの改変体、GFP蛍光のスペクトル特性を変更する改変体、または約30℃より高い温度で細胞内に発現させたときに増大した蛍光を示す改変体が使用可能である。例えば、WO 97/11094を参照されたい。GFP変異体の例はF64L-GFP、F64L-Y66H-GFP F64L-S65T-GFP、およびF64L-E222G-GFPである。いくつかの変異体は、InvitrogenまたはClontechから市販されている。GenBank登録番号U55762およびU55763も参照のこと。他の適当なレポーターポリペプチドとしては、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ(GUS)、ホタルルシフェラーゼ、ならびにエピトープタグ、膜局在化セグメントおよびレポーターセグメントを含んでなるキメラポリペプチドが挙げられる。例えば米国特許出願第10/046,660号を参照されたい。レポーターポリペプチドはまた、カルシウム流出をモジュレートするかまたは内因性受容体の発現を誘導するポリペプチドであり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、転写される配列は、キメラレポーターポリペプチドをコードする。例えば、キメラレポーターポリペプチドは、レポーターセグメントと、エピトープタグを有するセグメントを含み得る。当技術分野では種々のエピトープタグが公知で使用されており、例えば、FLAG(登録商標)タグ(DYKDDDDK；配列番号36)、HAタグ(YPYDVPDYA；配列番号37)、c-Mycエピトープ(EQKLISEEDL；配列番号38)、AU1タグ(DTYRYI；配列番号39)、および6-HISタグ(HHHHHH；配列番号40)などがある。特定の場合においては、エピトープタグを含むセグメントがレポーターセグメントのＮ末端に隣接して位置する。他の事例では、エピトープタグを含むセグメントはレポーターセグメントのＣ末端に隣接して位置する。例えば、キメラルシフェラーゼレポーターポリペプチドは、そのＮ末端にHAタグを有してもよく、キメラGFPレポーターポリペプチドは、そのＣ末端に6-HISタグを有してもよい。他の場合には、キメラポリペプチドはレポーターセグメントと２つの追加セグメントを含み、それぞれの追加セグメントがエピトープタグを含む。
【００８３】
III. トランスジェニック植物および植物細胞
本明細書に記載する方法に有用な植物および植物細胞は、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸、および、場合によりレポーターポリペプチドをコードする核酸を含有する。このような核酸は、別々の構築物として、または同一の構築物として植物細胞に導入することができる。一般に、核酸分子はプラスミドの形態である。植物の形質転換を成功させるための核酸分子の組成物および該核酸分子の構築方法は当業者に知られており、例えばプロモーター、ポリアデニル化配列、選択マーカー配列、エンハンサー、イントロンなどといった適当な核酸構成要素の使用が知られている。導入された核酸配列がゲノムに組み込まれている細胞のことを、安定に形質転換された細胞と呼ぶ。安定に形質転換された細胞は典型的には、細胞分裂が起こっても導入された核酸配列を保持している。導入された核酸配列がゲノムに組み込まれていない細胞は、一過性に形質転換された細胞と呼ばれる。一過性に形質転換された細胞は典型的には、細胞分裂が起こるたびに、導入された核酸配列の一部を失い、十分な回数の細胞分裂後には娘細胞から導入核酸を検出することができない。したがって、形質転換細胞は一過性におよび／または安定に形質転換されたものであり得る。一過性に形質転換されたおよび安定に形質転換されたトランスジェニック植物細胞は、どちらも本明細書に記載する方法に有用であり得る。
【００８４】
懸濁培養、または組織もしくは器官培養で生育するトランスジェニック植物細胞は、受容体ポリペプチドと相互作用するリガンドを同定するために使用することができる。本発明のために、固体および／または液体組織培養技術を使用することができる。固形の培地を使用する場合には、トランスジェニック植物細胞を培地上に直接播種してもよく、またはフィルター膜上に配置し、次いでその膜を培地と接触させるように配置してもよい。液体培地を使用する場合には、トランスジェニック植物細胞を、液体培地に接触する浮揚装置(例えば多孔質膜)上に配置しうる。固形培地は典型的には液体培地に寒天を加えることにより調製する。例えば、固形培地は、寒天および適当な濃度のオーキシン(例えば2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D))および適当な濃度のサイトカイニン(例えばカイネチン)を含有するムラシゲ・スクーグ(MS)培地であり得る。いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物細胞はプロトプラストである。
【００８５】
他の実施形態において、受容体ポリペプチドと相互作用するリガンドを同定するのに適当なトランスジェニック植物細胞は、植物体の一部または全部を構成する。トランスジェニック植物は、例えば、核酸を他の系統に導入するために、核酸を他の種に導入するために、または他の望ましい特性をさらに選択するために、本明細書に開示する方法で使用する前に、生育させることができる。あるいは、トランスジェニック植物は、そのような技術に適している種について栄養繁殖させてもよい。後代には、特定の植物または植物系統の子孫が含まれる。現存の植物の後代には、F1、F2、F3および後続世代の植物に形成された種子、またはBC1、BC2、BC3および後続世代の植物に形成された種子が含まれる。トランスジェニック植物により産生された種子を育てて、その後自家受粉(または異系交配および自家受粉)させることにより、異種受容体ポリペプチドをコードする核酸についてホモ接合性の種子を得ることができる。
【００８６】
一過性に形質転換された植物細胞を使用する場合、形質転換後の適当な時期にレポーター活性についてのアッセイをおこなってもよい。アッセイを行うのに適当な時期は、典型的には形質転換後から約１〜21日、例えば約１〜14日、約１〜７日または約１〜３日である。一過性アッセイの使用は、異なる種における候補リガンドの迅速な解析のために、または、受容細胞中でそれまで確認されたことのない異種受容体の発現を確認するために、特に好都合である。いくつかの場合において、一過性アッセイを行うためには葉組織(例えばリーフディスク)が適当である。他の場合には、根、根毛、花粉または種子組織など他の植物組織が適している。
【００８７】
単子葉および双子葉植物に外因性核酸を導入する技術は当技術分野で知られており、限定するものではないが、アグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介形質転換、ウイルスベクター仲介形質転換、エレクトロポレーション、パーティクルガン形質転換などが挙げられる。例えば米国特許第5,538,880号、第5,204,253号、第6,329,571号および第6,013,863号を参照されたい。細胞または組織培養物を形質転換の受容組織として使用する場合は、所望により、当業者に知られた技術を用いて形質転換培養物から植物を再生することができる。
【００８８】
植物種の適当なグループには、ベニバナ、アルファルファ、ダイズ、セイヨウアブラナ(高エルカ酸品種およびキャノーラ)、ヒマワリなどの双子葉植物が含まれる。単子葉植物、例えば、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、イネ、キビ、アマランス、ソルガムなども適している。他の適当な種として挙げられるのは、ニチニチソウ（Catharanthus roseus）、ツルニチニチソウ（Vinca major）、ハナビシソウ（Eschscholtzia californica）、ポピー（Papaver spp.、例えばケシ(P. somniferum)）、カンレンボク（Camptotheca accuminata）、ラウォルフィア（Rauwolfia spp.）、ジギタリス（Digitalis spp.）、スペアミント（Mentha spicata）、ペニーロイヤルミント（M. pulegium）、ペパーミント（M. piperita）、タイム（Thymus vulgaris L.）、オレガノ（Origanum vulgare）、ローズマリー（Rosmarinus officinalis）、レモンバーム（Melissa officinalis）、ラベンダー（Lavandula augustifolia）、コモンセージ（Salvia officinalis）などである。野菜および根菜もまた適しており、例えばブロッコリー、エンドウマメ、スイートコーン、ポップコーン、トマト、豆類(インゲンマメ、ライマメ、乾燥シロインゲンマメ、グリーンビーンズを含む)などが挙げられる。果実作物もまた適しており、モモ、ナシ、リンゴ、サクランボ、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、プラム、マンゴーおよびヤシなどが挙げられる。したがって、本発明は広範な植物に対して使用でき、次の属からの種が含まれる；Arabidopsis、Agastache、Anacardium、Arachis、Asparagus、Atropa、Avena、Brassica、Citrus、Citrullus、Capsicum、Catharanthus、Carthamus、Cocos、Coffea、Cucumis、Cucurbita、Datura、Daucus、Elaeis、Echinacea、Eschscholtzia、Fragaria、Glycine、Gossypium、Helianthus、Heterocallis、Hordeum、Hyoscyamus、Hyssopus、Lactuca、Linum、Lolium、Lupinus、Lycopersicon、Malus、Manihot、Majorana、Medicago、Mentha、Nicotiana、Ocimum、Olea、Oenothera、Oryza、Panicum、Pannesetum、Papaver、Persea、Phaseolus、Pinus、Pistachia、Pisum、Plantago、Pyrus、Prunella、Prunus、Raphanus、Rheum、Ricinus、Salvia、Secale、Senecio、Sinapis、Solanum、Sorghum、Theobromus、Trifolium、Trigonella、Triticum、Vicia、Vinca、Vitex、Vitis、Vigna、Withania、およびZea。
【００８９】
Ａ． 異種シグナル伝達ポリペプチド
いくつかの実施形態において、トランスジェニック植物はまた、異種受容体と相互作用して異種受容体のシグナル伝達活性を仲介することのできる異種シグナル伝達ポリペプチドを含むことができる。このようなポリペプチドとしては、転写コアクチベーターおよびシャペロニンが挙げられる。いくつかの実施形態において、異種シグナル伝達ポリペプチドは、非植物性シグナル伝達ポリペプチドと植物性シグナル伝達ポリペプチドのキメラである。
【００９０】
IV．候補リガンド／レポーター活性
Ａ． レポーター活性の検出
候補リガンドは、本明細書に記載するトランスジェニック植物細胞中でレポーター活性の増大が検出された場合に同定される。レポーター活性は、１以上のリガンドが受容体ポリペプチドに接触した後に測定される。リガンドと受容体ポリペプチドとの相互作用があるならば、受容体のシグナル伝達活性はモジュレートされ、結果的にレポーター活性が変化する。相互作用は典型的にはリガンドと受容体ポリペプチドの特異的結合によって生じる。典型的には、異種受容体ポリペプチド／リガンド複合体は、コグネイトRREに機能的に連結されたプロモーターからの転写の活性化と、その結果生じる転写産物によりコードされるレポーターポリペプチドの翻訳をもたらす。
【００９１】
レポーター活性の検出は、使用するレポーターによって変化する。例えば、レポーターとしてGFPを使用する場合は、当業者に知られた種々の装置を用いて発光を測定することができる。典型的にはこのような装置は、光源、発光団の発光を励起する光源からの光の波長を選択する手段、励起光を迅速に遮断するまたはシステムの他の部分に送るための機器、励起光を検体に伝達し、発生した蛍光を空間的に分離された様式で集光し、この蛍光発光から画像(または検出及び測定法に適した別の種類の強度マップ)を作成するための一連の光学素子、光強度を好ましくは画像の形で記録する検出器、ならびに記録された情報および／または画像を取得して記憶し、記録された画像から再分布の程度を計算するコンピューターまたは電子システムおよび関連ソフトウェアを含む。ある実施形態においては、レポーター活性を蛍光顕微鏡により検出する。別の実施形態では、レポーター活性をCCD（charged coupled device）カメラで検出する。装置一式のシステムは自動化されたものでもよい。あるいは、レポーター活性を定性的に、例えば顕微鏡下で蛍光強度を視覚的に観察することにより確認することもできる。いくつかの実施形態では、１以上の候補リガンドを受容体ポリペプチドと接触させた後のレポーター活性を、対照におけるレポーター活性(例えば、リガンドと受容体ポリペプチドの接触の不在下でのレポーター活性)と比較する。
【００９２】
候補リガンドは、異種受容体ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物細胞により合成される化合物であり得る。このようなリガンドは内因性リガンドとみなすことができる。候補リガンドは小有機化合物またはタンパク質もしくはペプチドなどの生体高分子であり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、内因性リガンドは、異種受容体を発現するのと同じ植物細胞によって合成される化合物である。他の実施形態では、内因性リガンドは、異種受容体を発現するトランスジェニック細胞以外の植物細胞によって合成される化合物である。例えば、内因性リガンドは植物の第１の組織、例えば根組織または葉組織で合成され、一方異種受容体は該植物の第２の組織、例えば分裂組織または花の組織で優先的に発現される。内因性リガンドは植物の第２の組織へ輸送され、第２の組織の細胞により取り込まれ、レポーター活性の増加をもたらし得る。別の例として、第１のトランスジェニック植物組織または器官培養物を、第２の植物組織または器官培養物の存在下で、支持細胞層として生育させることができる。第１の組織または器官培養物からの内因性リガンドは培地中に拡散し、第２の組織または器官培養物の細胞により取り込まれ、レポーター活性の増加をもたらし得る。第１の組織または器官は異種受容体を発現してもしなくてもよいことが理解されよう。レポーター活性が検出された植物細胞を、レポーター活性に起因するリガンドを特徴付けするために、分画に供することができる。あるいは、内因性リガンドを合成することが知られているかまたは推測される植物細胞を、レポーター活性に起因するリガンドを特徴付けするために分画に供してもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態では、植物細胞を、増加した量の内因性リガンドの合成を促進する環境条件に供する。植物または植物培養物もしくは細胞培養物を生育させる環境条件は、例えば対照の温度もしくは散水率と比較して、温度を上げたり、散水率を増加させたり、または散水率を減少させることにより、変更可能である。内因性リガンドの量または合成率を増加させるために変更することのできる他の環境条件としては、塩、ミネラル、ホルモン、窒素、炭素、浸透圧調節物質、または酵母エキス、サリチル酸、およびジャスモン酸メチルなどの既知の誘導因子の濃度が挙げられる。
【００９５】
他の実施形態においては、１以上の候補リガンドは抽出物中に存在する。適当な供給源としては、植物細胞型、組織または器官からの抽出物が挙げられる。このような抽出物は粗抽出物であってもよく、または部分的に精製もしくは徹底的に精製されたものであってもよい。このような抽出物は、水性抽出物または非水性抽出物であり得る。植物抽出物を調製するのに適した組織または器官としては、葉、根、茎、皮、花、種子、胚、内胚乳、子葉、毛状突起、分裂組織、胚発生培養物、器官形成培養物、または形成層細胞が挙げられる。このような抽出物を、異種受容体ポリペプチドを発現する植物細胞に接触させてもよい。
【００９６】
Ｂ． リガンド合成ポリペプチド
いくつかの実施形態において、候補リガンドは、増加した量の天然の内因性化合物の合成を仲介するか、または新規な内因性化合物の合成を仲介するポリペプチドをコードする組換え核酸構築物を含む植物細胞から得られる。このような化合物は、本明細書に記載するように、その活性についてスクリーニングすることのできる候補リガンドである。
【００９７】
例えば、ステロール生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にステロール量の増加および／または新規ステロールの合成がもたらされる。このような増加したステロールまたは新規ステロールは、ステロイド受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。ステロール生合成に関与するポリペプチドとしては、スクアレンシンターゼポリペプチド、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis)、トマト(tomato)およびアブラナ(Brassica)由来のSQS1およびSQS2遺伝子によりコードされるポリペプチドが挙げられる。ステロール量を増加させる、および／または新規ステロールを産生させるために適当な他のポリペプチドとしては、限定するものではないが、ルペオールシンターゼ遺伝子、シクロアルテノールシンターゼ遺伝子、ステロールメチルオキシダーゼ遺伝子、ならびに前記遺伝子およびステロール生合成経路に関与する遺伝子の発現を制御する調節因子遺伝子が挙げられる。
【００９８】
別の例として、フラボノイド生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にフラボノイド量の増加および／または新規フラボノイドの合成がもたらされる。このような増加したフラボノイドまたは新規フラボノイドは、フラボノイド受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。イソフラボンは潜在的な植物エストロゲンであり、エストロゲン受容体の可能性のあるリガンドである。フラボノイド生合成に関与するポリペプチドとしては、限定するものではないが、カルコンイソメラーゼ遺伝子、カルコンレダクターゼ遺伝子、ジヒドロフラボノールレダクターゼ遺伝子、イソフラボンシンターゼ遺伝子、イソフラボンレダクターゼ遺伝子、フラボノイド３-ヒドロキシラーゼ遺伝子、ならびに前記遺伝子およびフラボノイド生合成経路に関与する遺伝子の発現を制御する調節因子遺伝子が挙げられる。
【００９９】
いくつかの事例においては、フェノール類の生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にフェノール系化合物(例えばアントシアニン、クマリンおよびプソラレンを含む)の量の増加がもたらされる。このような遺伝子の過剰発現はまた新規フェノール類の合成をもたらし得る。このような増加したフェノール類または新規フェノール類は、フェノール系受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。
【０１００】
いくつかの場合において、テルペノイド生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にテルペノイド量の増加および／または新規テルペノイドの合成がもたらされる。このような増加したテルペノイドまたは新規テルペノイドは、テルペノイド受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態においては、アルカロイド生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にアルカロイド量の増加および／または新規アルカロイドの合成がもたらされる。このような増加したアルカロイドまたは新規アルカロイドは、アルカロイド受容体のリガンドとしての活性についてスクリーニングすることができる。
【０１０２】
さらに他の場合においては、ポリチエニル、イソチオシアネート、グルコシノレート、シアン発生グリコシド、ポリアセチレン、脂質、セスキテルペノイド、またはクアシノイドの生合成に関わるポリペプチドをコードする遺伝子を植物中で過剰発現させることができ、結果的にこれらの化合物の量の増加および／または新規化合物の合成がもたらされる。
【０１０３】
このようなポリペプチドをコードする核酸は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、温度の上昇もしくは誘導物質の存在に応答して転写レベルの増加を付与するようなプロモーターなど）の制御下におくことができる。このような遺伝子を含む植物細胞は、異種受容体をコードする核酸を含む植物細胞と同一でも異なっていてもよい。
【０１０４】
Ｃ． 分画
レポーター活性が検出された植物細胞、または内因性リガンドを合成することが知られているかまたは推測される植物細胞は、レポーター活性に起因するリガンドを特徴付けするために分画に供することができる。一般的には、分画は、画分のin vivoレポーター活性、または画分のin vitroアッセイによって導かれる。いくつかの事例においては、１以上の候補リガンドを含有し、かつレポーター活性を示す細胞は、レポーター活性を示さない細胞から分離することができる。かかる分離により、リガンドを含有する細胞または細胞型が富化される。特定の細胞型または細胞層を分離するためのいくつかの方法が当業者に知られている。例えば、レポーター活性を示す細胞型を、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションを用いて切り出したり、またはレポーターもしくは受容体中のエピトープタグを利用するセルソーターを用いて回収したりすることができる。
【０１０５】
分画は当技術分野で知られた方法を用いて行うことができる。例えば、サンプルを100％MeOHで抽出して粗製の油を得、この油を慣用方法で複数の溶媒間に分配する。代替方法として、ヘキサンおよび塩化メチレン分画を、ゲルカラムで塩化メチレンおよび酢酸エチル／ヘキサン溶媒を用いて行ってもよい。
【０１０６】
候補リガンドを同定するためのin vitroアッセイは、対象の異種受容体の転写活性に基づくものであってもよい。他の実施形態では、in vitroアッセイは、ある画分中の化合物が対象の異種受容体と特異的に結合する能力を、例えば競合的均質生化学アッセイで、測定するアッセイに基づく。例えば、リガンドを含有すると推測される植物組織または器官を分画し、分画の流出液をリガンドに結合すると推測される所定量の受容体と接触させる。該受容体に結合する所定量の既知リガンドを、既知リガンドと受容体の複合体が混合物中で形成される条件下で加える。混合物中の結合していない既知リガンドの量を、例えば、既知リガンド上の蛍光標識または固有の蛍光を有する既知リガンドを用いることにより、検出する。
【０１０７】
他の実施形態においては、分画されたもしくはされていない植物組織もしくは器官を、候補リガンドを同定し特徴付けするために、質量分析に供する。例えばWO 02/37111を参照のこと。質量分析は、しばしば、レポーター活性に起因する特定のリガンドを特徴付けし同定するのに適している。いくつかの実施形態では、エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析を使用することができる。他の実施形態では、大気圧化学イオン化(APCI)質量分析が使用される。抽出物中の比較的高分子量の分子を同定したいのであれば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析法が有用であり得る。
【０１０８】
本明細書に記載する方法は、他のタイプのリガンド同定法と比較して、より迅速な候補リガンドの同定を促進することができる。本明細書に開示する方法は、リガンドを含有することが知られているかまたは推測される植物の広範なグループのスクリーニングを可能にし、また所望により、そのような植物中の特定の組織または器官に焦点を合わせたスクリーニングを可能にする。それにひきかえ、多くの公知の方法は、特定の組織または器官を用いて実施することが比較的困難であり、しかも本明細書に記載する新規方法で達成できる感度が得られない。
【０１０９】
核内受容体に対する新規リガンドは、例えば癌を治療もしくは検出するための医薬または診断薬として、使用することができる。乳癌細胞および前立腺癌細胞は、それぞれエストロゲン受容体およびテストステロン受容体を発現することが明らかにされている。そのような受容体に対する新規リガンドを放射性同位体とコンジュゲートさせて、乳癌細胞および前立腺癌細胞へと標的化された放射線治療を送達することができる。また、そのような受容体に対する新規リガンドを発蛍光団とコンジュゲートさせて、エストロゲン受容体およびテストステロン受容体の増加したレベルを検出することができるが、かかる受容体レベルの増加は患者における癌性の乳腺細胞または前立腺細胞の数の増加に関係している可能性がある。新規リガンドはまた、新規リガンドのアナログを合成するための基礎として使用可能である。このようなアナログは、新規なまたは改変された治療活性を有し得る。
【０１１０】
本発明を以下の実施例でさらに詳述するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１．VP16ER核酸構築物および形質転換
VP16-ヒトエストロゲン受容体α(ERα)キメラポリペプチドのコード配列がCaMV35Sプロモーターおよびノパリンシンターゼ(NOS)ターミネーターに機能的に連結されている受容体核酸構築物を作製した。VP16活性化ドメインがヒトERαポリペプチドの最初の90アミノ酸を置き換える。このキメラポリペプチドのコード配列を図１および配列番号１に示す。アミノ酸配列は配列番号２に示す。下線のあるヌクレオチドがVP16活性化ドメイン配列に対応し、下線のないヌクレオチドがヒトエストロゲン受容体配列に対応する。
【０１１２】
５コピーのヒトエストロゲン応答エレメントに機能的に連結されたキメラ緑色蛍光タンパク質のコード配列を含むレポーター核酸構築物を作製した。ERE-GFP構築物のヌクレオチド配列を図２および配列番号３に示す。５コピーのエストロゲン応答エレメントに下線を引いた。最小TATA配列を波線の下線で示す。大文字のヌクレオチドがキメラ緑色蛍光タンパク質(GFP)のコード配列であり、この配列は5'末端にキチナーゼシグナル配列を、そして3'末端にHDEL(配列番号48)シグナル配列を含む。アミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１１３】
VP16ERα構築物およびERE-GFP構築物をアグロバクテリウムバイナリーベクター内にクローニングし、Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81と命名されたベクターを作製した。このベクターは、合成ホスフィノトリシン(phosphinothricin)耐性遺伝子の発現を駆動する28716プロモーターと、それに続くオクトピンシンターゼ(OCS)ターミネーターを含んでなる。ホスフィノトリシン耐性遺伝子は、形質転換された植物細胞の選択を可能にする。このベクターはまた、アグロバクテリウム中での選択のためのスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む。対照のアグロバクテリウムバイナリーベクターもまた作製し、Bin4-EUTG-101と命名した。Bin4-EUTG-101はホスフィノトリシン耐性遺伝子およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むものの、VP16ERα配列およびERE-GFP配列を欠く。Bin4-EUTG-101を有するトランスジェニック植物を対照として用いた。
【０１１４】
イネの形質転換は、米国特許第5,591,616号に記載の方法と同様に行った。形質転換体は、ホスフィノトリシン耐性遺伝子および選択物質としてのビアラホスを用いて選択した。シロイヌナズナ（Arabidopsis）の形質転換は、本質的にBechtoldら, C.R. Acad. Sci. Paris, 316:1194-1199 (1993)に記載された方法で行った。一次形質転換体により形成された種子をT1世代と言い、そのような種子から発芽した植物をT1植物と言う。
【０１１５】
実施例２．VP16ER構築物を含むトランスジェニックイネ
Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81ベクターを含むトランスジェニックイネのカルスを作製した。選択した約50個の系統を取得し、5mg/mlビアラホスを含有するN6培地上で27℃にて培養し、約２週間毎に新鮮な培地に移し換えた。形質転換から約45日後、６系統からのカルスを約５μMのエストラジオールまたは５μMの4-ヒドロキシタモキシフェンと共にインキュベートした。約40時間インキュベートした後、カルス細胞を解剖顕微鏡下で10×〜60×倍率で検査した。
【０１１６】
検査した６系統中の４系統である、系統１、２、５および６は、外因性化合物の存在下で中位から非常に明るい緑色蛍光を示したが、外因性化合物の不在下では全く蛍光を示さなかった。これらの実験の結果は、外因的に加えたエストラジオールまたは4-ヒドロキシタモキシフェンがこれら４つのトランスジェニック系統中に存在するGFPコード配列の転写を活性化できることを示す。
【０１１７】
検査した６つのイネカルス系統中の２系統は、外因性化合物の不在下でさえも弱いから中位の緑色蛍光を示し、外因性化合物の存在下では中位から明るい緑色蛍光を示した。この結果から、この２系統は、これらの培養条件下でBin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81中に存在するGFPコード配列の転写を活性化する内因性化合物を有することが示された。
【０１１８】
実施例３．VP16ER構築物を含むトランスジェニックシロイヌナズナ
Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81ベクターを含んでなるトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）植物を、実施例１に記載の通り作製した。３つの独立したT1植物からのそれぞれ約100個のトランスジェニックT2種子を、22℃で、MS寒天培地のみで、または約５μMのエストラジオールもしくは５μMの4-ヒドロキシタモキシフェンを含むMS寒天培地で発芽させた。PCR解析は、受容体構築物配列がヘテロ接合およびホモ接合状態で苗中に存在することを示した。苗を、発芽後５日目から開始して、解剖顕微鏡下で緑色蛍光について検査した。エストラジオールまたは4-ヒドロキシタモキシフェンの存在下で生育させた全てのT2苗は中位から強い緑色蛍光を示したのに対して、エストラジオールまたは4-ヒドロキシタモキシフェンの不在下で生育させたT2苗はいずれも緑色蛍光を示さなかった。
【０１１９】
イソフラボン抽出物を調製するために、乾燥ダイズ種子を液体窒素下に粉砕機で挽いた。約３gの挽いた種子を、メタノールにより室温で約10分間抽出した。その後メタノール抽出物を、室温で約10分間酢酸エチルと共にインキュベートした。酢酸エチル可溶性化合物を真空乾燥により濃縮した。乾燥させたペレットを200μlのDMSO中に再懸濁し、粗イソフラボン抽出物を４℃で保存した。この抽出物は調製から２日以内に使用した。
【０１２０】
上述の３つのT1植物からの約100個のT2種子を、22℃で、約100μlイソフラボン抽出物/350ml培地を含むMS寒天培地上で発芽させた。また、対照としてT2種子を、100μl DMSO/350ml培地を含むMS寒天培地上で発芽させた。苗の根を、発芽後５日目から開始して、解剖顕微鏡下で緑色蛍光について検査した。抽出物の存在下で生育させた全てのT2苗は中位から強い緑色蛍光を示した。抽出物の不在下で生育させたT2苗はいずれも緑色蛍光を示さなかった。Bin4-EUTG-101対照構築物を含むT2トランスジェニックシロイヌナズナ植物は、抽出物の存在下でも不在下でも緑色蛍光を示さなかった。これらの結果が示すのは、ダイズイソフラボン抽出物が、Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81トランスジェニック植物中に存在するGFPコード配列の転写を活性化する化合物を含有する、ということである。
【０１２１】
実施例４．VP16ER構築物を含有するトランスジェニックハナビシソウ
無菌的に発芽させたハナビシソウ（California poppy）苗からの根の外植片を、Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81ベクターを含有するアグロバクテリウムと共存培養した。２日後、処理した根外植片を液体組織培養培地で洗ってアグロバクテリウムを除去し、0.5mg/mlオーキシン、0.5mg/mlサイトカイニンおよび2.5mg/mlビアラホスを含有するカルス誘導培地(CIM)に移した。ビアラホスの存在下で生存していると見られた20を超えるカルスクラスター(推定上の形質転換体)を、CIMに移した後３日目から開始して、解剖顕微鏡下で10×〜60×倍率で検査した。検査したカルスクラスターのいくつかは、中位から強い緑色蛍光を示した。Bin4-EUTG-101対照構築物で形質転換された対照植物からの外植片はいずれも緑色蛍光を示さなかった。
【０１２２】
実施例５．VP16ER構築物を含有するトランスジェニックダイズ
無菌的に発芽させたダイズ苗からの子葉および根の外植片を、Bin4-EUTG-10::VPCR-ER-1#81ベクターを含有するアグロバクテリウムと共存培養した。２日後、処理した子葉および根の外植片を液体組織培養培地で洗ってアグロバクテリウムを除去し、0.5mg/mlオーキシン、0.5mg/mlサイトカイニンおよび2.5mg/mlビアラホスを含有するカルス誘導培地(CIM)に移した。ビアラホスの存在下で生存していると見られた20を超えるカルスクラスター(推定上の形質転換体)を、CIMに移した後３日目から開始して、解剖顕微鏡下で10×〜60×倍率で検査した。検査したカルスクラスターのいくつかは、中位から強い緑色蛍光を示した。Bin4-EUTG-101対照構築物で形質転換された対照植物からの外植片はいずれも緑色蛍光を示さなかった。
【０１２３】
実施例６．RXRα／VP16THRβ核酸構築物
RXRαおよびキメラVP16THRβを両方ともコードするT-DNAバイナリーベクターヘテロ二量体核内受容体構築物を、標準的な分子生物学的手法に沿って調製した。この構築物をBin4-35S::RXRa-35S::VP16THRb-3RXRE::Luc #12と命名した。この構築物は、RXRαコード配列に機能的に連結された35Sプロモーターを含んでいた。配列番号５および配列番号６を参照のこと。この構築物はまた、VP16THRβコード配列に機能的に連結された35Sプロモーターを含んでいた。配列番号７および配列番号８を参照のこと。キメラVP16THRβ受容体コード配列には、THRβコード配列に機能的に連結されたVP16活性化ドメインコード配列が含まれていた。それぞれの受容体コード配列は35Sプロモーターに機能的に連結されていた。また、このバイナリーベクターは、３つの反復配列を含むcis RXR応答エレメント(RXRE)(表３を参照のこと、ここでn=C)により駆動されるレポータールシフェラーゼ(Luc)コード配列を含有しており、これはRXRE::Lucと命名された。配列番号９および配列番号10を参照のこと。また、35Sにより駆動されるLucコード配列をコードする構築物を作製して陽性対照処理のために使用し、35Sにより駆動されるGFPコード配列をコードする構築物を作製して陰性対照処理のために使用した。
【０１２４】
実施例７．RXRα／VP16THRβ構築物を用いたタバコの一過性形質転換
植物組織を以下のように一過性に形質転換した。実施例６に記載のBin4-35S::RXRa-35S::VP16THRb-3RXRE::Luc #12構築物を含むアグロバクテリウム菌株のYEB培養物(4ml)を、28℃で振とうしながら一晩培養した。アグロバクテリウムを4000rpmで25分間遠心分離し、細菌ペレットを浸潤培地（MS溶液に0.25μg/ml NAAおよび0.1μg/ml BAPを加えたもの）に再懸濁した。アグロバクテリウムの最終0.05-OD希釈物を、同じ浸潤培地を用いて調製した。次に、タバコのリーフディスクをペーパーパンチャーで切り出し、直ちに浸潤培地に浸した。その後リーフディスクを希釈したアグロバクテリウム培地に約５分間浸し、次いでペーパータオル上でブロット乾燥させてから、浸潤培地にあらかじめ浸したペーパータオルを敷いたペトリ皿に移した。処理したリーフディスクを、27℃で16時間の光周期に維持した生育チャンバーの中で４日間インキュベートした。
【０１２５】
インキュベートした後、リーフディスクを外因性リガンドによる処理に供した。リガンドの適当なストックをDMSOに溶解させ、調製したばかりの新鮮な浸潤培地を用いて５μMの濃度へと希釈した。一過性に形質転換されたリーフディスクを次に、希釈リガンド溶液を含むペトリ皿に移した。その後ディスクをリガンド溶液で手短にすすぎ、希釈リガンド溶液にあらかじめ浸したペーパータオルを敷しいた新しいペトリ皿に移した。処理されたリーフディスクまたは対照リーフディスクのプレートをアルミホイルで包んで、27℃に設定した生育チャンバーの中で１〜２日間インキュベートした。インキュベートした後、リーフディスクを、硬化させた0.5％アガロースの薄層を重層したプレートに移した。次にリーフディスクに10μMルシフェリン(0.01％Triton X-100中)調製物を噴霧し、CCD撮像装置を用いて発光画像を撮った。これらの実験結果を表４にまとめた。
【表４】
【０１２６】
これらの実験結果からは、タバコではトリヨードチロニンのキメラVP16THRβ受容体への結合が起こること、また、キメラVP16THRβ受容体はRXRα受容体と機能的に会合してヘテロ二量体を形成し、このヘテロ二量体が次にRXR応答エレメントに機能的に連結されたレポーター遺伝子の転写を増加させること、が示される。
【０１２７】
実施例８．RXRα／VP16THRβヘテロ二量体構築物のin planta試験
実施例６に記載のBin4-35S::RXRa-35S::VP16THRb-3RXRE::Luc #12構築物を含むアグロバクテリウムを用いて次の植物を一過性に形質転換した：ベラドンナ（Atropa belladonna）、ジギタリス（Digitalis purpurea）、イネ（Oryza sativa (ジャポニカ)）、ヘラオオバコ（Plantago lanceolata）、サルビアコクシネア（Salvia coccinea (スペインサルビア、カタログ番号1835、レディーインレッド変種)）、サルビアコクシネア（Salvia coccinea (スペインサルビア、カタログ番号1831、チェリーブロッサム変種)）、およびウィタニアソムニフェラ（Withania somniferum）。種子はThompson & Morgan Seedsmen Inc. (Jackson, NJ)およびSand Mountain Herbs (Fyffe, AL)から購入した。一過的形質転換は実施例７に記載の方法と同様に行った。インキュベートした後、様々な種のリーフディスクをリガンドとしてのトリヨードチロニンによる処理に供したが、これも実施例７に記載のように行った。トリヨードチロニンとのインキュベーション後、リーフディスクを硬化させた0.5％アガロースの薄層を重層したプレートに移し、10μMルシフェリン(0.01％Triton X-100中)調製物を噴霧し、CCD撮像装置を用いて発光画像を撮った。これらの実験結果を表５にまとめた。
【表５】
【０１２８】
これらの実験結果からは、トリヨードチロニンが種々の植物種中のキメラVP16THRβ受容体に結合すること、また、キメラVP16THRβ受容体がRXRα受容体と機能的に会合してヘテロ二量体を形成し、このヘテロ二量体は次にRXR応答エレメントに機能的に連結されたレポーター遺伝子の転写を増加させること、が示される。ジギタリスでは、Lucレポーター活性が、トリヨードチロニンの存在下よりも不在下でより高レベルに検出された。これらの結果は、トリヨードチロニンがジギタリス中で発揮し得る負の効果によるものかもしれず、またはこの植物種におけるレポーター安定性の低下によるものかもしれない。トリヨードチロニンの不在下では、Sc1835はレポーター発現を示したのに対して、Sc1831は示さなかった。この違いは、一方の品種に存在し、もう一方には存在しない１以上の候補リガンドによるものかもしれない。このようなリガンドは、外因性リガンドの不在下でレポーター遺伝子転写を活性化し得る。
【０１２９】
実施例９．VP16ERホモ二量体構築物のin planta試験
キメラERホルモン受容体をコードするT-DNAバイナリーベクター核内受容体構築物を、標準的な分子生物学的手法により作製した。この構築物をBin4-35S::VP16ER-ERE::Luc #3と命名した。キメラVP16ER受容体コード配列は35Sプロモーターに機能的に連結させた。配列番号11および配列番号12を参照されたい。このバイナリーベクターはまた、５つの反復配列を含むcis ER応答エレメント(ERE)により駆動されるLucコード配列を含んでいた。表３（ここで、nnn=GGG）、ならびに配列番号13および配列番号14を参照のこと。
【０１３０】
Bin4-35S::VP16ER-ERE::Luc #3構築物を、本質的に上記のようないくつかの植物種へと一過性に形質転換した。種子は、Thompson & Morgan Seedsmen Inc. (Jackson, NJ)およびSand Mountain Herbs (Fyffe, AL)から購入した。
【０１３１】
対照リーフディスクは、浸潤培地中でのインキュベーションに供した。試験リーフディスクは、浸潤培地中でのインキュベーションに供した後、エストラジオールと共にインキュベートした。リーフディスクを次に、硬化させた0.5％アガロースの薄層を重層したプレートに移し、10μMルシフェリン(0.01％Triton X-100中)調製物を噴霧した。対照および試験リーフの両方の発光画像を、CCD撮像装置を用いて撮った。これらの実験結果を表６にまとめた。
【表６】
【０１３２】
これらの実験結果からは、チョウセンアサガオ（Datura sp.）、ハナビシソウ（Eschscholtzia californica）、マツヨイグサ（Oenothera odorata (Oo6739)）、マツヨイグサ（Oenothera odorata (Oo8881)）、およびダイオウ（Rheum palmatum）がエストロゲン核内受容体ポリペプチドに結合する候補リガンドを保有すること、が示唆される。これらの結果からは、そのようなリガンドが植物中での転写を活性化するように該ポリペプチドを誘導しうること、がさらに示唆される。
【０１３３】
実施例１０．AR核酸構築物
アンドロゲン受容体(AR)をコードするT-DNAバイナリーベクター核内受容体構築物であるBin4-Ins5ARE::Luc-35S::AR#2を、標準的な分子生物学的手法により作製した。受容体コード配列は、35Sプロモーターに機能的に連結させた(配列番号15および配列番号16)。このバイナリーベクターはまた、cis アンドロゲン受容体応答エレメント(ARE)により駆動されるレポータールシフェラーゼ(Luc)コード配列を含有した。配列番号17および配列番号18を参照のこと。AREは、インスレーター配列に機能的に連結された5’-AGAACACTGTGTACC-3’(配列番号19)の５つの反復配列を含んでいた。
【０１３４】
実施例１１．AR構築物を用いたタバコの一過性形質転換
植物組織を、実施例１０に記載のBin4-Ins5ARE::Luc-35S::AR#2構築物を含有するアグロバクテリウム菌株を用いて、本質的に実施例７に記載された方法で一過性に形質転換した。これらの実験結果を表７にまとめた。
【表７】
【０１３５】
これらの実験結果から、フルタミド、9-cisレチノイン酸、および13-cisレチノイン酸のAR受容体への結合がタバコ内で起こることが示される。
【０１３６】
実施例１２．AR構築物のin planta試験
実施例１０に記載のBin4-Ins5ARE::Luc-35S::AR#2構築物を含有するアグロバクテリウムを用いて、ベラドンナ（Atropa belladonna）、エキナセアプルプレア（Echinacea purpurea）、バジル（Ocimum basilicum）、マツヨイグサ（Oenothera odorata）、イネ（Oryza sativa）、およびヘラオオバコ（Plantago lanceolata）を一過性に形質転換した。一過性形質転換は実施例７に記載の方法と同様に行った。インキュベーション後、実施例７に記載のように、様々な種のリーフディスクを、リガンドとしてのフルタミドによる処理に供した。フルタミドとのインキュベーション後、リーフディスクを、硬化させた0.5％アガロースの薄層を重層したプレートに移し、10μMルシフェリン(0.01％Triton X-100中)調製物を噴霧し、CCD撮像装置を用いて発光画像を撮った。これらの実験結果を表８にまとめた。
【表８】
【０１３７】
これらの実験結果から、バジル（Ocimum basilicum）およびイネ（Oryza sativa）は、アンドロゲン核内受容体ポリペプチドに結合する候補リガンドを保有することが示唆される。これらの結果からはさらに、そのようなリガンドが植物中での転写を活性化するように該ポリペプチドを誘導しうることが示唆される。これらの結果はさらに、トランスジェニックヘラオオバコ（Plantago lanceolata）へのフルタミドの添加が、レポーター遺伝子転写を活性化したことを示唆している。
【０１３８】
実施例１３．エストロゲン受容体リガンド活性を有する内因性リガンドの同定
実施例４に記載のハナビシソウのカルス250mgを凍結乾燥させ、Dionex ASE(登録商標)200高速溶媒抽出機(Sunnyvale, CA)を用いてメタノールでの抽出に供した。粗抽出物を乾燥させ、純粋メタノールに再懸濁させた。再懸濁させた粗抽出物を、Dionex Summit(登録商標)HPLC装置を用いて、Alltima 150×10mm-5μm C18カラムにかけ、55分間で0.1％ギ酸中の20％から95％アセトニトリルの準分取HPLC勾配により、4.7ml／画分で分画した。溶出した画分を真空下で乾燥させ、画分あたり100μlのDMSOに再懸濁させた。どの画分がERリガンド活性を有するのかを確認するために、画分を用いて、HitHunterエストロゲンキット(Discoverx, Fremont, CA)および精製エストロゲン受容体タンパク質(Panvera/Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてin vitroアッセイを行った。各画分の２μlアリコートをアッセイに使用し、各アッセイを三回反復して行った。結果は、いくつかの画分がERリガンド活性を保有することを示した。
【０１３９】
活性画分中の化合物の正体を突き止めるために、上述のようにハナビシソウカルスの粗抽出物を調製してメタノール中に再懸濁させた。粗抽出物の液体クロマトグラフィー分画および質量分析(LC-MS)を、Waters Micromass(登録商標)ZQTM質量分析器(単一四重極、ベンチトップMS検出器; Milford, MA)を用いて行った。LC勾配は、上記の準分取HPLC分画に使用したのと同じ勾配であり、Alltima 150×4.6mm-5μm C18カラムを用いた。ピークのうちの３つはサンギナリン誘導体であると同定された。これらの結果から、核ホルモン受容体ポリペプチドを発現する植物細胞は候補リガンドのスクリーニングに使用することができ、また、そのような受容体に結合するリガンドを同定することができることが実証された。
【０１４０】
他の実施形態
以上の説明は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を説明するためのもので、限定するものではない。他の態様、効果および改変も特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】VP16ERαキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２】５コピーのヒトエストロゲン応答エレメントに機能的に連結された緑色蛍光タンパク質のコード配列を示す。下線（直線）を引いたヌクレオチドは、５コピーのエストロゲン応答エレメントを示す。下線（波線）を引いたヌクレオチドは、最小TATA配列を示す。緑色のフォントのヌクレオチドは、キメラ緑色蛍光タンパク質(GFP)のコード配列に対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核ホルモン受容体ポリペプチドのリガンドを同定するための方法であって、
a) 異種の核ホルモン受容体ポリペプチドをコードする核酸を含む複数個の植物細胞を用意すること、
b) 該受容体のシグナル伝達活性に応答するレポーターを用いて、１以上の候補リガンドが該受容体と相互作用するか否かを確認すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
前記植物細胞が少なくとも１つの植物体の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞が組織培養下の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織培養がカルス培養である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記異種受容体が哺乳動物の核ホルモン受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記異種受容体がAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、およびRXRからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数個の植物細胞が二量体化受容体ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記異種受容体がキメラ受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記異種受容体が第1セグメント、第2セグメント、および第3セグメントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第1セグメントがリガンド結合ドメインを含み、第2セグメントがDNA結合ドメインを含み、第3セグメントがトランス活性化ドメインを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記キメラ受容体のトランス活性化ドメインがVP16トランス活性化ドメインまたはトウモロコシ転写因子Cトランス活性化ドメインである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記キメラ受容体のDNA結合ドメインがAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRのDNA結合ドメインである、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記１以上の候補リガンドが前記植物細胞によって合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーターが分光測光的に測定可能な活性を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
分光測光的に測定可能な前記活性が蛍光または生物発光である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーターがエピトープタグを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーターを発現する細胞を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
質量分析を用いて前記リガンドを同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が植物細胞において発現を付与することができる調節エレメントに機能的に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数個の植物細胞が、テルペノイド生合成ポリペプチド、フラボノイド生合成ポリペプチド、フェノール系生合成ポリペプチド、およびアルカロイド生合成ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
核ホルモン受容体リガンドについてスクリーニングする方法であって、
a) 核ホルモン受容体ポリペプチドのコード配列およびレポーターとして転写される配列を含む少なくとも１つの構築物を含有する１個以上の植物細胞を用意すること、
ここで、該核ホルモン受容体ポリペプチドはリガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含み、該レポーターとして転写される配列が該DNA結合ドメインと相互作用することができる受容体応答エレメントに機能的に連結されており、該レポーターの活性が該配列の受容体/リガンド結合依存性転写のときに検出可能となること、
b) 該構築物からの該受容体ポリペプチドの転写および該受容体ポリペプチドへの該リガンドの結合を可能にする条件下で、候補リガンドを該受容体ポリペプチドに接触させること、
c) 該レポーターの活性が検出されるか否かを確認すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２２】
前記植物細胞が少なくとも１つの植物体の一部である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物細胞が組織培養下の細胞である、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記組織培養がカルス培養である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記核ホルモン受容体が哺乳動物の核ホルモン受容体である、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記核ホルモン受容体がAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、およびRXRからなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記核ホルモン受容体がキメラ受容体である、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】
前記キメラ受容体のトランス活性化ドメインがVP16トランス活性化ドメインまたはトウモロコシ転写因子Cトランス活性化ドメインである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記キメラ受容体のDNA結合ドメインがAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRのDNA結合ドメインである、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
前記１以上の候補リガンドが前記植物細胞によって合成される、請求項21に記載の方法。
【請求項３１】
前記レポーターとして転写される配列が分光測光的に測定可能な活性を有するポリペプチドをコードする、請求項21に記載の方法。
【請求項３２】
前記レポーターとして転写される配列がさらにエピトープタグをコードする、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
分光測光的に測定可能な前記活性が蛍光または生物発光である、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
核ホルモン受容体の前記コード配列が構成的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結されている、請求項21に記載の方法。
【請求項３５】
質量分析を用いて前記リガンドを同定することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項３６】
前記レポーターを発現する細胞を単離することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項３７】
核ホルモン受容体ポリペプチドに対して40％を超える配列同一性を有するポリペプチドのコード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む第1組換え核酸、およびレポーターコード配列に機能的に連結された核内受容体応答エレメントを含む第2組換え核酸を含有するトランスジェニック植物細胞。
【請求項３８】
前記核ホルモン受容体ポリペプチドがAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、およびRXRからなる群より選択される、請求項37に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３９】
植物細胞が一過性に形質転換された植物細胞である、請求項37に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４０】
前記植物細胞が植物体の一部である、請求項37に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４１】
前記植物細胞が組織培養下の細胞である、請求項37に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１】
核ホルモン受容体ポリペプチドのリガンドを同定するための方法であって、
a) 異種の核ホルモン受容体ポリペプチドをコードする核酸を含む複数個の植物細胞を用意すること、
b) 該受容体のシグナル伝達活性に応答するレポーターを用いて、１以上の候補リガンドが該受容体と相互作用するか否かを確認すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
前記植物細胞が少なくとも１つの植物体の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞が組織培養下の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織培養がカルス培養である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記異種受容体が哺乳動物の核ホルモン受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記異種受容体がAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、およびRXRからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数個の植物細胞が二量体化受容体ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記異種受容体がキメラ受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記異種受容体が第1セグメント、第2セグメント、および第3セグメントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第1セグメントがリガンド結合ドメインを含み、第2セグメントがDNA結合ドメインを含み、第3セグメントがトランス活性化ドメインを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記キメラ受容体のトランス活性化ドメインがVP16トランス活性化ドメインまたはトウモロコシ転写因子Cトランス活性化ドメインである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記キメラ受容体のDNA結合ドメインがAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRのDNA結合ドメインである、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記１以上の候補リガンドが前記植物細胞によって合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーターが分光測光的に測定可能な活性を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
分光測光的に測定可能な前記活性が蛍光または生物発光である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーターがエピトープタグを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーターを発現する細胞を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
質量分析を用いて前記リガンドを同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が植物細胞において発現を付与することができる調節エレメントに機能的に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数個の植物細胞が、テルペノイド生合成ポリペプチド、フラボノイド生合成ポリペプチド、フェノール系生合成ポリペプチド、およびアルカロイド生合成ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
核ホルモン受容体リガンドについてスクリーニングする方法であって、
a) 核ホルモン受容体ポリペプチドのコード配列およびレポーターとして転写される配列を含む少なくとも１つの構築物を含有する１個以上の植物細胞を用意すること、
ここで、該核ホルモン受容体ポリペプチドはリガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含み、該レポーターとして転写される配列が該DNA結合ドメインと相互作用することができる受容体応答エレメントに機能的に連結されており、該レポーターの活性が該配列の受容体/リガンド結合依存性転写のときに検出可能となること、
b) 該構築物からの該受容体ポリペプチドの転写および該受容体ポリペプチドへの該リガンドの結合を可能にする条件下で、候補リガンドを該受容体ポリペプチドに接触させること、
c) 該レポーターの活性が検出されるか否かを確認すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２２】
前記植物細胞が少なくとも１つの植物体の一部である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物細胞が組織培養下の細胞である、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記組織培養がカルス培養である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記核ホルモン受容体が哺乳動物の核ホルモン受容体である、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記核ホルモン受容体がAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、およびRXRからなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記核ホルモン受容体がキメラ受容体である、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】
前記キメラ受容体のトランス活性化ドメインがVP16トランス活性化ドメインまたはトウモロコシ転写因子Cトランス活性化ドメインである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記キメラ受容体のDNA結合ドメインがAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、またはRXRのDNA結合ドメインである、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
前記１以上の候補リガンドが前記植物細胞によって合成される、請求項21に記載の方法。
【請求項３１】
前記レポーターとして転写される配列が分光測光的に測定可能な活性を有するポリペプチドをコードする、請求項21に記載の方法。
【請求項３２】
前記レポーターとして転写される配列がさらにエピトープタグをコードする、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
分光測光的に測定可能な前記活性が蛍光または生物発光である、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
核ホルモン受容体の前記コード配列が構成的発現を付与する調節エレメントに機能的に連結されている、請求項21に記載の方法。
【請求項３５】
質量分析を用いて前記リガンドを同定することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項３６】
前記レポーターを発現する細胞を単離することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項３７】
核ホルモン受容体ポリペプチドに対して40％を超える配列同一性を有するポリペプチドのコード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む第1組換え核酸、およびレポーターコード配列に機能的に連結された核内受容体応答エレメントを含む第2組換え核酸を含有するトランスジェニック植物細胞。
【請求項３８】
前記核ホルモン受容体ポリペプチドがAR、RAR、ROR、LRH-1、THR、VDR、PPAR、LXR、ER、CAR、FXR、およびRXRからなる群より選択される、請求項37に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３９】
植物細胞が一過性に形質転換された植物細胞である、請求項37に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４０】
前記植物細胞が植物体の一部である、請求項37に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４１】
前記植物細胞が組織培養下の細胞である、請求項37に記載のトランスジェニック植物細胞。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５２１８０６（Ｐ２００７−５２１８０６Ａ）
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４９６１１（Ｐ２００６−５４９６１１）
【出願日】平成１７年１月１４日（２００５．１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００１１５３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７３３９６
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０６２４３１４９）セレス，インコーポレーテッド (2)
【出願人】（５０６２４３１５０）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月１４日（２００５．１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００１１５３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７３３９６
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０６２４３１４９）セレス，インコーポレーテッド (2)
【出願人】（５０６２４３１５０）
【Ｆターム（参考）】
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