受容体型プロテインチロシンホスファターゼＰｔｐｒｚによるＥｒｂＢ４シグナルの抑制
【課題】ＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤、ＥｒｂＢ４の過剰発現に起因する疾病の予防・治療剤、及びＰｔｐｒｚアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニング方法等を提供すること。
【解決手段】受容体型プロテインチロシンホスファターゼＰｔｐｒｚ遺伝子や、ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターをヒトＥｒｂＢ４の過剰発現に起因する疾病の予防・治療剤に用いる。また、リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚを作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が大きいときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質と評価し、反対に脱リン酸化の程度が小さいときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質と評価する。
【解決手段】受容体型プロテインチロシンホスファターゼＰｔｐｒｚ遺伝子や、ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターをヒトＥｒｂＢ４の過剰発現に起因する疾病の予防・治療剤に用いる。また、リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚを作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が大きいときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質と評価し、反対に脱リン酸化の程度が小さいときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質と評価する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含むＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤、及びＰｔｐｒｚアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内蛋白質のチロシン残基のリン酸化修飾は、細胞の増殖・分化・移動等や様々な細胞活動の制御に関わっている。リン酸化は、タンパク質中の特定のチロシン残基にリン酸基を付加するプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）と、これを除去するプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）によって、可逆的に制御されている。そして、細胞内蛋白質のチロシン残基のリン酸化修飾は、細胞の増殖・分化・移動等や様々な細胞活動の制御に関わっており、リン酸化制御の破綻は、ガン化などの異常な細胞増殖の原因として広く認識されるとともに、神経細胞及びグリア細胞における異常は精神性疾患の原因として報告されている。ヒトゲノム中に同定されているＰＴＫ及びＰＴＰ遺伝子は数百を超えており、それぞれ特有の細胞機能に関与していると考えられる。
【０００３】
上記のＰＴＰの中でも、受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）は細胞膜に発現しており、ヒトにおいては８種のサブファミリーに分類される２１種の分子で構成されている（非特許文献１，２参照）。殆どのＲＰＴＰには、細胞質側にタンデムなＰＴＰドメインが２個存在し、その触媒活性は、細胞膜に近い第１ＰＴＰドメイン（ＰＴＰ−Ｄ１）に保持されている。細胞膜から遠位に位置する第２ＰＴＰドメイン（ＰＴＰ−Ｄ２）の機能については殆ど解明されていないが、Ｄ２ドメインの構造的完全性は、ＲＰＴＰの活性及び安定性に重要であるとされている（非特許文献１，２参照）。
【０００４】
受容体型プロテインチロシンホスファターゼＺ（Ｐｔｐｒｚ、或いはＰＴＰζ又はＲＰＴＰβとも呼ばれる）は、主として中枢神経系で発現するＲＰＴＰだが（非特許文献３参照）、胃などの末梢組織にも発現している（非特許文献４参照）。Ｐｔｐｒｚには、Ｐｔｐｒｚ−Ａ及びＰｔｐｒｚ−Ｂの２種類の受容体アイソフォームがある。このうち、Ｐｔｐｒｚ−Ｂは、Ａ型に比べ、細胞外領域に欠失がある（図１参照）。２１種のＲＰＴＰ（非特許文献１，２参照）のうち、Ｒ５サブファミリーに属するＰｔｐｒｚ／ＰＴＰζとＰｔｐｒｇ／ＰＴＰγだけが、そのカルボキシル末端に一般的なＰＤＺドメイン結合モチーフ（−Ｓ−Ｌ−Ｖ）を有している（非特許文献５参照）。
【０００５】
本発明者らは、Ｐｔｐｒｚのカルボキシル末端が、シナプス可塑性に関与する主要なシナプス足場タンパク質であるＰＳＤ９５の第２ＰＤＺドメインに結合することを既に報告している（非特許文献６参照）。成獣ラット脳では、Ｐｔｐｒｚ及びＰＳＤ９５のいずれも海馬及び大脳新皮質の錐体神経細胞の樹状突起に分布し、シナプス後肥厚部（ＰＳＤ）画分に豊富に認められる。本発明者らはＰｔｐｒｚが、ＰＳＤ９５ファミリー以外にも、膜関連グアニル酸キナーゼ（membrane associated guanylate kinase）ＷＷドメイン及びＰＤＺドメイン含有タンパク質−１／３（ＭＡＧＩ−１／−３）、Ｖｅｌｉ−３、シナプトジャニン２結合タンパク質（Ｓｙｎｊ２ｂｐ：synaptojanin 2 binding protein）、酸性シントロフィン１及び塩基性シントロフィン１（Ｓｎｔａ１及びＳｎｔｂ１：syntrophin acidic 1 and basic 1）、並びにマルチプルＰＤＺタンパク質１（Ｍｕｐｐ１：multiple PDZ protein 1）等、別のＰＤＺドメイン含有タンパク質とも相互作用することを明らかにしている。
【０００６】
本発明者らは最近、ＰＴＰ基質をスクリーニングする遺伝子法を報告し、「酵母基質トラッピング法（非特許文献７，８参照）」と命名した。この方法は、酵母ツーハイブリッドシステムを基本としているが、プレイ（prey）タンパク質をチロシンリン酸化するためにＰＴＫを誘導的に発現させることと、基質−トラップＰＴＰ変異体（非特許文献９参照）をベイト（bait）としてスクリーニングを行うという２つの主要な変更を加えている。この方法によって本発明者らは、Ｇタンパク質共役受容体相互作用因子１（Ｇｉｔ１：G protein-coupled receptor kinase-interactor1）、ｐ１９０ ＲｈｏＧＡＰ、ゴルジ関連ＰＤＺ及びコイルドコイルモチーフ含有タンパク質（ＧＯＰＣ／ＰＩＳＴ：golgi-associated PDZ and coiled-coil motif containing）、及びＭＡＧＩ−１等の、Ｐｔｐｒｚに対する基質をいくつか同定した（非特許文献７，８参照）。他方、別のグループは、β−カテニン（非特許文献１０参照）及びナトリウムチャネルαサブユニット（非特許文献１１参照）もまた基質であることを報告した。上記β−カテニンは上皮細胞のＭＡＧＩ−１の第５ＰＤＺドメインと相互作用することが知られており（非特許文献１２参照）、Ｐｔｐｒｚ及びβ−カテニンがＭＡＧＩ−１足場タンパク質上に安定な酵素−基質複合体を形成することが示唆される。同様に、シントロフィンの第１プレックストリンホモロジー（ＰＨ：pleckstrinhomology）ドメイン及びシントロフィンユニーク（ＳＵ：syntrophin-unique）ドメインがナトリウムチャネルと相互作用し（非特許文献１３参照）、シントロフィンのＰＤＺドメインがＰｔｐｒｚと相互作用することから（非特許文献７参照）、ナトリウムチャネルとＰｔｐｒｚの相互作用は神経細胞のシントロフィンに介されると推測される。
【０００７】
本発明者らは以前、Ｐｔｐｒｚのカルボキシル末端（−Ｓ−Ｌ−Ｖ）が、興奮性シナプスの後肥厚部（ＰＳＤ）において最もよく特徴付けられている構成要素である（非特許文献１８参照）ＰＳＤ９５の２番目のＰＤＺドメインと関連していることを発見した（非特許文献６参照）。一方、ＥｒｂＢ４は、ＰＳＤ９５に結合することによって興奮性シナプスのＰＳＤに集積する受容体型チロシンキナーゼであることが知られている（非特許文献１５参照）。ＥｒｂＢ４もまた、ＰＳＤ９５の１番目及び２番目のＰＤＺドメインとＥｒｂＢ４のカルボキシル末端尾部（−Ｔ−Ｖ−Ｖ）を通して結合することが報告されている（非特許文献１７参照）。ＥｒｂＢ４の細胞質部分は、リガンドに誘導された二量化によって複数箇所でチロシン自己リン酸化される調節配列に隣接する、保存されたチロシンキナーゼドメインを有する（非特許文献１４参照）。ＰＳＤ９５がアミノ末端“head to head”相互作用によって多量体を形成し（非特許文献２２参照）、そのことでＰＳＤに多くのシグナリング分子を凝集させることが報告されている。こうした凝集は、リガンド刺激なしにＥｒｂＢ４の二量化と自己リン酸化を誘導すると考えられる。ＥＧＦＲの細胞内領域（ＩＣＲ）全体もまた、様々な因子によって誘導される凝集によって活性化する（非特許文献１９，２０参照）。さらに最近の研究は、ＥｒｂＢ４と同じファミリーに属する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１）キナーゼが、非対称二量体の形成によりその局所濃度が上昇することで、活性化しうると示唆している（非特許文献２１参照）。その他、本発明者らは、Ｐｔｐｒｚノックアウトマウスを作製しており（非特許文献１６参照）、また、培養細胞において、全長を有するＰｔｐｒｚ−Ｂがオリゴマー化によって不活性化されることを示した（非特許文献２３参照）。
【０００８】
他方、細胞膜上に発現する受容体型のチロシンキナーゼ（Receptor tyrosine kinase, ＲＴＫ）に属する（ＥｒｂＢ／ＥＧＦＲ）サブファミリーは、既に癌などの重篤な疾病の分子標的創薬の主要ターゲットになっている（例えば、特許文献１〜３参照）。ＥｒｂＢファミリーの１つＨｅｒ２（ＥｒｂＢ２）に対する抗体医薬トラスツズマブ（Trastuzumab）/ハーセプチンは、Ｈｅｒ２陽性の乳ガン治療に優れた治療成果を挙げている。しかし肺ガン治療に有用なＥＧＦＲの選択阻害剤ゲフィチニブ(Gefitinib)/イレッサでは、間質性肺炎を中心とした副作用によって多くの死亡例が報告されるなど、元々生体に必須の生理作用をもつＲＴＫを直接阻害する医薬品の高い副作用リスクは問題視されている。
【０００９】
【特許文献１】特表２００６−５０８３３６号公報
【特許文献２】特表２００３−５０８４４７号公報
【特許文献３】特表２００３−５０３３６６号公報
【非特許文献１】Mol. Cell. Biol. 21, 2001, 7117-7136
【非特許文献２】Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 2006, 833-846
【非特許文献３】J. Biochem. 123, 1998, 458-467
【非特許文献４】Nat. Genet. 33, 2003, 375-381
【非特許文献５】Genome Res. 16, 2006, 1056-1072
【非特許文献６】Brain Res. Mol. Brain Res. 72, 1999, 47-54
【非特許文献７】Methods 35, 2005, 54-63
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2001, 6593-6598
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, 1680-1685
【非特許文献１０】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, 2603-2608
【非特許文献１１】Nat. Neurosci. 3, 2000, 437-444
【非特許文献１２】Biochem. Biophys. Res. Commun. 270, 2000, 903-909
【非特許文献１３】J. Neurosci. 18, 1998, 128-137
【非特許文献１４】Trends Cell Biol. 16, 2006, 649-656
【非特許文献１５】Nature 366, 1993, 473-475
【非特許文献１６】Neurosci. Lett. 247, 1998, 135-138
【非特許文献１７】Neuron 26, 2000, 443-455
【非特許文献１８】Nat. Rev. Neurosci. 5, 2004, 771-781
【非特許文献１９】J. Biol. Chem. 264, 1989, 11346-11353
【非特許文献２０】Biochemistry 32, 1993, 8742-8748
【非特許文献２１】Cell 125, 2006, 1137-1149
【非特許文献２２】Neuroscience 127, 2004, 91-100
【非特許文献２３】FEBS Lett. 580, 2006, 4051-4056
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤、及びＰｔｐｒｚアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、Ｐｔｐｒｚについての生体内での役割の研究を進める過程で、ＲＰＴＰは、少なくとも二つの異なる形態によって基質と選択的に相互作用していると考えた。一つは、酵母基質トラッピング系による検出が可能であるＰＴＰ−Ｄ１ドメインとチロシンリン酸化された基質分子との直接相互作用に基づく形態であり、もう一つは、ＰＤＺタンパク質等の足場タンパク質の助けを借りることにより、いくつかの分子が特異的基質となることができる間接的な形態である。本発明者らは、間接的相互作用によるＰｔｐｒｚに対する新たな基質を同定するため、成獣ラット大脳のシナプトソーム画分から得たＰｔｐｒｚのカルボキシル末端領域を用いたプルダウン実験を行ったところ、Ｐｔｐｒｚに対する基質が含まれている可能性がある一連の分子をＰＳＤ９５と共に同定することに成功した。これら分子のうち、本発明ではＥｒｂＢ４に着目した。ＥｒｂＢ４は、ＲＴＫのＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーであり、ニューレグリン（ＮＲＧ）及び他の成長因子によって活性化する。以下に述べるように、ＥｒｂＢ４がＰｔｐｒｚに対する新規な基質であることを確認し、本発明を完成した。
【００１２】
上記のように、本発明者らは、成獣ラットシナプトソーム由来のＰＳＤ９５を含むタンパク質複合体において、ＥｒｂＢ４及びＰｔｐｒｚを同定した。ここで、ＰＳＤ９５はＥｒｂＢ４とＰｔｐｒｚとの相互作用のための足場タンパク質であると考えた。また、ＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化は、野生型マウスと比較して成獣Ｐｔｐｒｚ欠損マウスの大脳シナプトソーム画分において増加した。これらの結果は全て、ＥｒｂＢ４がＰｔｐｒｚの新規基質であることを示している。
【００１３】
また、３２Ｐ標識化ＥｒｂＢ４ＩＣＲに対するＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性は、インビトロでＰＳＤ９５に影響されなかったことから、Ｐｔｐｒｚのホスファターゼ活性はＰＳＤ９５への結合に影響されないことが明らかとなった。インビボ状態においても、カルボキシ末端尾部を通したＰｔｐｒｚのＰＳＤ９５への結合は、ＥｒｂＢ４に対するＰｔｐｒｚの脱リン酸化活性を維持するようである。したがってＰｔｐｒｚは、ＰＳＤ９５による過剰活性化の抑制を通して、ＥｒｂＢ４シグナリングの調節物質として機能すると思われる。これは、ＰＳＤにおいて、リガンド（ＮＲＧ）による刺激を通してＥｒｂＢ４シグナリング経路を調節する重要な機構であると考えられる。
【００１４】
また、３２Ｐ標識化ＥｒｂＢ４ＩＣＲに対するＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性は、インビトロでＰＳＤ９５に影響されなかったことから、Ｐｔｐｒｚのホスファターゼ活性はＰＳＤ９５への結合に影響されないことが明らかとなった。インビボ状態においても、Ｐｔｐｒｚのカルボキシ末端尾部を介したＰＳＤ９５との結合は、ＥｒｂＢ４に対するＰｔｐｒｚの脱リン酸化活性を維持するようである。したがってＰｔｐｒｚは、ＰＳＤ９５による過剰活性化の抑制を通して、ＥｒｂＢ４シグナリングの調節物質として機能すると思われる。これは、ＰＳＤにおいて、リガンド（ＮＲＧ）による刺激を通してＥｒｂＢ４シグナリング経路を調節する重要な機構であると考えられる。
【００１５】
本発明者らは、ＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化レベルが、成獣Ｐｔｐｒｚ欠損マウスの大脳シナプトソーム画分において常に亢進していることを見い出した脳の興奮性シナプスのＰＳＤにおいて、ＥｒｂＢ４は、ＮＭＤＡ受容体と共にＰＳＤ９５と結合している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, 3596-3601）。近年の研究のいくつかは、ＮＲＧ−ＥｒｂＢ４シグナリングがシナプス可塑性の維持及び／又は調節において機能的に重要であるということを示している。本発明者らは、Ｐｔｐｒｚ欠損マウスが、年齢依存的に空間学習能力を低下させ、また海馬ＣＡ１領域におけるＬＴＰに異常な亢進がおこること（J. Neurosci. 25, 2005, 1081-1088）また海馬依存性恐怖学習の障害（Neurosci. Lett. 399, 2006, 33-38）を示すことを明らかにした。ＮＲＧ１及びその受容体であるＥｒｂＢ４は、統合失調症の病因と関連があるとされている（Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 141, 2006, 96-101；Nat. Med. 12, 2006, 824-828）。近年の研究は、ＮＲＧ１‐ＥｒｂＢ４シグナリングの亢進がこの疾患のＮＭＤＡ機能不全の一因であることを示唆している（Mol. Biol. Cell 12, 2001, 615-627）。本発明は、ＮＲＧ１に誘導されたＥｒｂＢ４活性の実質的亢進が、その分子機構は解明されていないとはいえ、統合失調症患者死後脳前頭前野におけるＥｒｂＢ４‐ＰＳＤ９５間相互作用の亢進に依存することを示している。本発明は、Ｐｔｐｒｚの活性又は発現レベルの減少が、こうした精神疾患におけるＥｒｂＢ４シグナリングを亢進させる一因であることを示唆している。
【００１６】
Ｒ５サブファミリー（Ｐｔｐｒｚ及びＰｔｐｒｇ）のみにおいて、一般的なＰＤＺ結合配列が存在するＲＰＴＰファミリーとは対照的に、ＲＴＫファミリーの多くが、ＰＤＺ含有タンパク質にそのカルボキシ末端又は細胞内領域を介して結合する。Ｐｔｐｒｚのカルボキシ末端の‐Ｓ‐Ｌ‐Ｖモチーフは、様々なＰＤＺタンパク質と相互作用可能であるので、Ｐｔｐｒｚ（及びＰｔｐｒｇ）は、異なるＰＤＺ含有タンパク質との結合を介して他のＲＴＫを調節している可能性が考えられる。実際に本発明者らは、培養細胞において、ＧＩＰＣのＰＤＺドメインに結合するＴｒｋ受容体チロシンキナーゼファミリーである（Mol. Biol. Cell 12, 2001, 615-627）ＴｒｋＡのチロシンリン酸化が、Ｐｔｐｒｚの共発現によって効果的に減少することを見い出している。
【００１７】
すなわち本発明は、（１）ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を含むヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤や、（２）ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含むヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤に関する。
【００１８】
また本発明は、（３）ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を含む、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤や、（４）ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含む、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤に関する。
【００１９】
さらに本発明は、（５）リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚをインビトロで作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が大きくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質と評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質のスクリーニング方法や、（６）リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚをインビトロで作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が小さくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質と評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質のスクリーニング方法や、（７）Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス、及び野生型マウスに被検物質を投与し、シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して小さくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚアゴニストと評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質のスクリーニング方法や、（８）Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス、及び野生型マウスに被検物質を投与し、シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して大きくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚアンタゴニストと評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００２０】
ＥｒｂＢファミリーは、発癌や統合失調症などに対する治療薬開発の重要な分子標的である。ＥｒｂＢの異常なリン酸化を、生体が元々持っているＰＴＰの活性機能を高めることによって正常状態に戻す治療戦略が可能になれば、副作用のリスクは著しく回避することができると考えられる。本発明は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）に属するＰｔｐｒｚの細胞内領域を用いて、これに選択的に結合する分子の検索を行い、その中にＥｒｂＢ４が存在すること、加えてＰｔｐｒｚがＥｒｂＢ４を基質として効率的に脱リン酸化することの知見に基づくものであり、本発明によると、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する小児脳腫瘍（髄芽細胞腫や上皮腫）、統合失調症、がん等の疾病の予防・治療や、Ｐｔｐｒｚのアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニング方法などを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤や、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤としては、ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子、又はヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを有効成分として含むものであれば特に制限されず、上記ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病としては、小児脳腫瘍（髄芽細胞腫や上皮腫）、統合失調症、がん等の疾病を例示することができ、上記脱リン酸化剤は、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤として有用である。
【００２２】
上記ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子としては、例えばヒトＰｔｐｒｚをコードする配列番号１で示される塩基配列（ヌクレオチド配列）を有するＤＮＡの他、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる天然型のヒトＰｔｐｒｚタンパク質のアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子や、配列番号１で示される塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ受容体型プロテインチロシンホスファターゼＰｔｐｒｚ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も使用することができる。ここで、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００２３】
上記ヒトＰｔｐｒｚ発現を発現しうる組換えベクターとしては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒトＰｔｐｒｚタンパク質をヒト生体内で発現しうるものであれば特に制限されるものではなく、例えばヒトＰｔｐｒｚをコードする配列番号１で示される塩基配列（ヌクレオチド配列）からなるＤＮＡなど、上記ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、動物細胞において発現しうるものが好ましく、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列の他、選択マーカー遺伝子を導入しておくこともできる。発現ベクターへの抗体遺伝子の導入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる)により行うことができる。
【００２４】
上記動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐＣＲ２．１−ＴＡ（Invitrogen社製）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等のプラスミドベクターや、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）の他、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター等のウイルスベクターを例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
【００２５】
また、上記のヒトＰｔｐｒｚ遺伝子やヒトＰｔｐｒｚ発現を発現しうる組換えベクターを生体にデリバリーする方法としては、従来公知の方法を用いることができ、ウイルスベクターを用いる方法の他、皮膚や筋肉にエレクトロポレーションによりプラスミドＤＮＡを単独で投与する方法や、超音波によるＤＮＡの細胞内への導入方法や、ハイドロダイナミクスインジェクション法、ポリアミドアミン (ＰＡＭＡＭ) デンドリマーなどの遺伝子キャリアー分子を使った方法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＮＡでコートした金粒子を高圧ヘリウムガスで直接細胞に打ち込む遺伝子銃法等を挙げることができ、目的に応じて好適な方法を選択することが好ましい。また、本発明の遺伝子は、ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子やヒトＰｔｐｒｚ発現を発現しうる組換えベクターは、インビボの他にエクスビボ（ex vivo）にても投与することができる。インビボで投与する場合、静脈、皮下、筋肉内に投与、あるいは疾患の対象部位等の局所に直接投与することができ、また、製剤形態として使用する場合、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。
【００２６】
本発明のインビトロ系でのＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚを作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が大きいときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質と評価し、反対に脱リン酸化の程度が小さいときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質と評価する方法であれば特に制限されず、インビトロ脱リン酸化アッセイは、リン酸化したＥｒｂＢ４、あるいはＥｒｂＢ４の細胞内領域（ＥｒｂＢ４ＩＣＲ）とＰｔｐｒｚとを被検物質の存在下で接触させることにより行うことができる。例えば、基質となるリン酸化したＥｒｂＢ４は、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのエピトープタグとの融合タンパク質として昆虫細胞、酵母、大腸菌などの宿主細胞で発現させたＥｒｂＢ４の細胞内領域全体（ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ）を精製後、ＡＴＰと接触させることにより調製することができる。次に、インビトロ脱リン酸化アッセイは、前記ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲとＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲ（ラットＰｔｐｒｚ−Ａの細胞内領域全体もしくはＰＴＰ−Ｄ１ドメイン）とを緩衝液中でインキュベーションして接触させ、ＥｒｂＢ４のリン酸化の減少の程度、もしくは脱離したリン酸濃度を測定することにより行うことができる。なお、用いるＥｒｂＢ４やＥｒｂＢ４遺伝子、ＰｔｐｒｚやＰｔｐｒｚ遺伝子等の由来としては、ヒトに限らずラット、マウス等を有利に挙げることができる。また、リン酸濃度を測定する際に、標識ＡＴＰを使用することもできる。
【００２７】
また、本発明のインビボ系でのＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進又は抑制物質のスクリーニング（同定）方法としては、Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス（ノックアウトマウス）、及び野生型マウスに被検物質を投与し、大脳シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して、小さくなるとき（ノックアウトマウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度は被検物質の有無にかかわらず変わらないのに、野生型マウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度は被検物質の存在下において、Ｐｔｐｒｚによる脱リン酸化が進んだ結果、ＥｒｂＢ４のリン酸化が減少しているとき）に、前記被検物質をＰｔｐｒｚアゴニストと評価し、大きくなるとき（ノックアウトマウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度は被検物質の有無にかかわらず変わらないのに、野生型マウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度は被検物質の存在下において、Ｐｔｐｒｚによる脱リン酸化が抑制された結果、ＥｒｂＢ４のリン酸化が亢進しているとき）に、前記被検物質をＰｔｐｒｚアンタゴニストと評価（同定）する方法であれば特に制限されず、被検物質は経口又は非経口的に投与することができる。シナプトソーム画分は、公知の方法で調製することができ、また、大脳シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の測定も、抗ＥｒｂＢ４抗体を用いた免疫沈殿法によってシナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４を回収し、ウエスタンブロットによってそのチロシンリン酸化レベルを解析するなど公知の方法を用いることができる。
【００２８】
上記インビトロ系やインビボ系でのスクリーニング方法により得られるＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質は、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤となる可能性があり、また、Ｐｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質は、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化抑制に起因する疾病の予防・治療剤となる可能性がある。ＥｒｂＢ４の発現抑制によって、胎生期の心臓に小梁形成(embryonic heart trabeculation)が起こる可能性がある（Experimental Cell Research 284 (2003) 66-77 “ErbB-4: mechanism of action and biology” Graham Carpenter）。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、供試動物として、成獣ラット（Sprague-Dawley、３ヶ月齢）、及び野生型及びＰｔｐｒｚ遺伝子欠損の成獣マウス（Neurosci. Lett. 247, 1998, 135-138）を用いた。すべての動物実験は、自然科学研究機構の動物研究委員会（Committee for Animal Research）の承認を得た動物取り扱い指針（guidelines for Animal Care）に沿って行われた。
【実施例１】
【００３０】
［ＰｔｐｒｚとＥｒｂＢ４の結合及び居局在性；ＧＳＴプルダウン実験］
受容体型チロシンホスファターゼＰｔｐｒｚの分子構造は、大きく細胞外領域、細胞膜貫通ドメイン、細胞内領域に３つに分けられる（図１）。細胞内領域には、チロシンホスファターゼドメイン（ＰＴＰ）がタンデムに並んでおり、細胞内領域のカルボキシル末端はＰＤＺドメイン含有タンパク質との結合に関与するモチーフを有している。ＰｔｐｒｚのＰＴＰ−Ｄ２及びカルボキシル末端に対する細胞内結合分子の同定を目的として、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質を設計した。市販システム（ＧＥヘルスケア）を用いて、ＧＳＴとＰｔｐｒｚのＤ２ドメイン及びカルボキシル末端（ラットＰｔｐｒｚ−Ａ（GenBankアクセッション番号Ｕ０９３５７）のアミノ酸残基２０３０から２３１６）との融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２、図１参照）を、大腸菌株ＢＬ２１中で発現プラスミドpGEX-Ptrprz-D2を使って発現させ、該タンパク質を、クロマトグラフィー装置（AKTA prime plus、GE Healthcare社製）につなげたＧＳＴｒａｐカラムを用いたグルタチオン・アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。pGEX-Ptprz-D2は、pZeoPTPζ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2001, 6593-6598）の適切なｃＤＮＡをpGEX-6P（GE Healthcare社製）にサブクローニングすることで調製した。また、ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２−ＳＡはセリン２３１４がアラニンで置換された変異体である。QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit （Stratagene社製）を用いてpGEX-Ptprz-D2から作製したpGEX-Ptprz-D2-SAから、ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２−ＳＡを発現させた。
【００３１】
プルダウン実験に際して、ＧＳＴ融合タンパク質（５０μｇ）を、GST Orientation Kit（Pierce社製）を用いてグルタチオンセファロースビーズ（５００μｌ）に共有結合で結合させて、ＧＳＴ−Ｄ２結合担体を調製した。ＧＳＴ−Ｄ２カラムと比較対照用のＧＳＴカラムを用いて、文献（Neuron 26, 2000, 443-455）記載の通りに成獣ラット大脳から調製したシナプトソーム溶解液（lysate）（５０ｍｇタンパク／ｍｌビーズ）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ビーズを洗浄後、２％ＳＤＳを含む０．１ＭのTris-HClサンプルバッファー（ｐＨ６．８）で、結合したタンパク質を溶出し、次いでアセトン沈殿を行った。その後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルー染色した。特異的バンドを切り出し、ゲル内トリプシン消化した後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）にかけた（Reflex III, Bruker Daltonics社製）。ＮＣＢＩの非重複タンパク質データベースに対してMascotサーチ（http://www.matrixscience.com/）を行い、ペプチドマスフィンガープリントを行った。
【００３２】
上記のように、成獣ラット脳のシナプトソーム画分におけるＰｔｐｒｚに結合する分子を同定するために、成獣ラット大脳シナプトソームのデオキシコール酸抽出物で、第２ＰＴＰ領域とカルボキシ末端尾部（ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２、図１参照）を含むＧＳＴ融合タンパク質を用いて、プルダウン実験を行った。その結果、図２に示されるように、ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２ビーズでプルダウンした画分で８本のバンドが特異的に観察されたが、ＧＳＴビーズでプルダウンした画分ではバンドは観察されなかった。質量分析により、９５ｋＤａの主要なバンドがＳＡＰ９０Ａ（ＰＳＤ９５のラットオルソログ）であり、１８０ｋＤａのバンドが、ニューレグリンのレセプターとして知られるＥｒｂＢレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのメンバー、ＥｒｂＢ４であることが明らかになった（その他はシナプス性Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質 synaptic Ras GTPaseactivating protein（ＳｙｎＧＡＰ）、及びＰＳＤ９３／ｃｈａｐｓｙｎ−１１０であった；データ非表示）。本発明者らは、ウエスタンブロットにより、プルダウン実験でのＰＳＤ９５、ＥｒｂＢ４及びＰｔｐｒｚ−Ｄ２の特異的な相互作用を確認した（図３）。また、ＰＤＺドメインに対する結合能を消失させた変異タンパク質（ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２−ＳＡ）を用いた場合では、ＥｒｂＢ４及びＰＳＤ９５の結合は検出されず、ＰｔｐｒｚとＥｒｂＢ４との結合は、ＰＳＤ９５などのＰＤＺ含有タンパク質を介して起っていることが判明した（図３）。
【００３３】
カルボキシル末端（−Ｔ−Ｖ−Ｖ）と第１又は第２ＰＤＺ領域との間の相互作用を通して、ＥｒｂＢ４がＰＳＤ９５に結合することが報告されている（Neuron 26, 2000, 443-455）。ＥｒｂＢ４とＰＳＤ９５とも、成獣ラット脳のシナプス後肥厚部（ＰＳＤ）画分に豊富に存在する。文献（Brain Res. Mol. Brain Res. 72, 1999, 47-54）の記載を少し変更を加え、二重染色実験を行った。切片を、Ｐｔｐｒｚの細胞内領域に対するマウスモノクローナル抗体（抗ＲＰＴＰβ抗体、BD transduction laboratories社製）とＥｒｂＢ４細胞内領域に対するウサギポリクローナル抗体（ｓｃ−２８３、Santa Cruz Biotechnology社製）と共に、一晩インキュベートした。結合している抗体を、蛍光アレクサ色素結合二次抗体（Molecular Probes社製）で可視化し、共焦点顕微鏡（LSM510、Carl Zeiss社製）で観察した。ラット大脳組織の二重免疫組織染色の結果、ＥｒｂＢ４とＰｔｐｒｚの局在は非常に良く一致し、ＥｒｂＢ４が、Ｐｔｐｒｚによって脱リン酸化制御を受け生理的な基質分子である可能性が示唆された（図４）。Ｐｔｐｒｚの免疫反応性は、文献（Brain Res. Mol. Brain Res. 72, 1999, 47-54）記載の通り前頭前野のニューロン群の樹状突起及び細胞体と関連性があった。ＥｒｂＢ４の免疫反応性は、同じニューロンの細胞体で主に検出された。
【実施例２】
【００３４】
［Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化レベルの亢進］
生体内において、ＥｒｂＢ４がＰｔｐｒｚによって脱リン酸化されているのか、野生型マウス及びＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスの脳組織サンプルを用いて検討した。野生型マウス（＋／＋）と、Ｐｔｐｒｚ欠損マウス（−／−）から大脳シナプトソームを調製した。可溶化液を用いて、シナプトソームにおけるチロシンリン酸化パターン全体とタンパク質発現とをウエスタンブロットで分析した。Ｐｔｐｒｚの全てのスプライシングアイソフォームは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして発現しているため、シナプトソーム可溶成分を文献（J. Biochem. 123, 1998, 458-467）記載の通りコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した後、Ｐｔｐｒｚ−Ｂを検出した。野生型及びノックアウトマウス間のシナプトソーム全タンパク質のリン酸化状態をウエスタンブロットで見る限り両者間に差異はなく（図５Ａ左側）、シナプトソーム中のＥｒｂＢ４（図５Ａ右側上段）及びＰＳＤ９５（図５右側中段）の含量も同程度であった。Ｐｔｐｒｚは野生型のみに確認された（図５Ａ下段）。
【００３５】
次にシナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４を抗ＥｒｂＢ４抗体を用いた免疫沈殿法によって回収、ウエスタンブロットによってそのチロシンリン酸化レベルを解析した。その結果、ＥｒｂＢ４のリン酸化レベルはＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスで有意に増加していることが判明した（１．３倍増加。Ｐ＝０．０４、ｎ＝７、unpaired Student’s t test、図５Ｂ）。これらの結果は、Ｐｔｐｒｚが脳におけるＥｒｂＢ４のリン酸化（活性）の制御に関連していることを示している。
【実施例３】
【００３６】
［Ｐｔｐｒｚのリン酸化ＥｒｂＢ４に対する脱リン酸化活性］
インビトロにおけるリン酸化アッセイを次のように行った。ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（ＥｒｂＢ４の細胞内領域全体）をCell signaling technology社から購入した。pGEX-6PにラットＰＳＤ９５の全長ｃＤＮＡを含ませたpGEX-PSD95（Brain Res. Mol. Brain Res. 72, 1999, 47-54）を用いて、ＧＳＴ−ＰＳＤ９５を大腸菌で発現させ、グルタチオン・アフィニティークロマトグラフィー（GsTrap FF）、陰イオン交換クロマトグラフィー（Hitrap Q FF）、次いでゲルクロマトグラフィー（Superose 6 10/300 GL）で精製した。自己リン酸化のために、ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（１．２５ｎｇ）を、表示した量のＧＳＴ−ＰＳＤ９５（又はコントロールＧＳＴ）を含み、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１．２５ｍＭ ＤＴＴ、及び１００μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む１０μｌの６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＰＴＫ緩衝液）と氷上で１５分、プレ・インキュベートした。５μｌのＡＴＰ溶液（３０μＣｉ／ｍｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び３０μＭ非標識ＡＴＰを溶かしたＰＴＫ緩衝液）を加え、３０℃で、リン酸化反応を開始させた。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（〜６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はGE Healthcare社製を用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えることで反応を停止させた。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲル上のシグナルを、バイオ・イメージングアナライザー（Fuji Photo Film社製）を用いて、イメージングプレート（BAS-MS 2025）で検出した。
【００３７】
次に、インビトロ脱リン酸化アッセイを次のように行った。ＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲ（ラットＰｔｐｒｚ−Ａの細胞内領域全体）を文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2001, 6593-6598）に記載されている通りに調製した。インビトロ脱リン酸化のために、自己リン酸化されているＥｒｂＢ４を基質として調製した。ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（３００ｎｇ）を、上述の通り１０μＣｉ／ｍｌの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び１０μｌの非標識ＡＴＰを含むＰＴＫ緩衝液１００μｌでリン酸化させた。５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．０）（ＰＴＰ緩衝液）を用いたゲル濾過（Sephadex G-25, GE Healthcare社製）を行い、ＡＴＰと補因子を除去した後、リン酸化された該調整物を、使用まで−８５℃で保存した。ゲル濾過後の３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲの回収率は、放射活性に基づけば５４％であった。脱リン酸化アッセイの前に、表示した量のＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲとＧＳＴ−ＰＳＤ９５を、５μｌのＰＴＰ緩衝液中、氷上で１５分、プレ・インキュベートした。次いで、１０μｌの３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（約２ｎｇ）を加えて、３０℃で、反応を開始させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、上述したオートラジオグラフィーにかけた。
【００３８】
上記のように、脱リン酸化アッセイにおいて、ＥｒｂＢ４ＩＣＲそのもののキナーゼ活性を排除するために、基質調製物からゲルろ過によりＡＴＰを除去した上で、インビトロで、３２Ｐ−標識ＥｒｂＢ４ＩＣＲを用いて、ＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性を調べた結果を図６に示す。ＰｔｐｒｚＩＣＲは、インビトロでＥｒｂＢ４ＩＣＲに対して２時間で、顕著な脱リン酸化活性を示した（図６Ｂ、上）。ＥｒｂＢ４ＩＣＲのリン酸化活性と対照的に、ＥｒｂＢ４ＩＣＲに対するＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性は、ＧＳＴ−ＰＳＤ９５に影響されなかった（６３Ｂ、下）。短時間（０．５時間）のインキュベーションでも同様の結果が得られた。ＰＳＤ９５の存在下でのＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性に影響はなかった（図６Ｂ、下）。さらに、ＰＴＰドメインの活性部位に直接結合する低分子量化合物、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を用いて、ＰＴＰ活性を調べた。しかし、ＰｔｐｒｚＩＣＲによるｐＮＰＰの加水分解は、ＧＳＴ−ＰＳＤ９５を添加しても変化しなかった（データ非表示）。これらの結果は、ＰＳＤ９５の結合が、Ｐｔｐｒｚそのものの脱リン酸化活性に影響しないことを示している。市販のＥｒｂＢ４の細胞内領域のＧＳＴ融合タンパク質（GST-ErbB4ICR, Cell signaling, cat No. 7724）を放射線標識ＡＴＰを用いて試験管内でリン酸化し、これを基質として、Ｐｔｐｒｚ(Ptprz-ICR部分のGSTタンパク質、図１参照)による脱リン酸化を解析した。その結果、ＰｔｐｒｚがＥｒｂＢ４を効率的に脱リン酸化すること、Ｐｔｐｒｚの脱リン酸化活性は、ＰＳＤ９５の共存下で変化しないことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ラットＰｔｐｒｚ−ＡとＰｔｐｒｚ−Ｂアイソフォームの模式図である。プルダウン実験に用いる領域（ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２）と、インビトロ脱リン酸化アッセイに用いる領域（ＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲ）とを下線で示した。Ｐｔｐｒｚ−Ａ及びＰｔｐｒｚ−Ｂは、Ｎ末端炭酸脱水酵素様（ＣＡＨ）ドメイン、フィブロネクチンIII型（ＦＮ）ドメイン、コンドロイチン硫酸の付着用のセリン・グリシンリッチ領域、膜貫通セグメント（ＴＭ）、２つのＰＴＰドメイン（Ｄ１及びＤ２）、及びＣ末端のＰＤＺ結合モチーフで構成されている。
【図２】ＧＳＴプルダウンアッセイによるＧＳＴ−Ｄ２及びコントロールのＧＳＴカラムを用いたラット大脳シナプトソーム画分中の結合成分の単離結果を示す図である。矢頭は、ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２を用いたプルダウンサンプルで特異的に検出されたバンドを示す。
【図３】ＧＳＴで異なる融合タンパク質を用いたプルダウンサンプルのウエスタンブロット分析の結果を示す図である。ＧＳＴ−Ｄ２、コントロールＧＳＴ 及びＰＤＺ結合配列部分の変異体（ＧＳＴ−Ｄ２−ＳＡ）を用いてラットシナプトソーム画分から結合成分の単離を行い、その中に含まれるＥｒｂＢ４（上段）及びＰＳＤ９５（下段）をウエスタンブロットによって解析した。
【図４】成獣ラット前頭前野におけるＰｔｐｒｚ及びＥｒｂＢ４の居局在性を示す図である。切片を抗ＲＰＴＰβマウスモノクローナル抗体（赤色）及び抗ＥｒｂＢ４ウサギポリクロナール抗体（緑色）でラット大脳皮質を免疫染色した。最下段図の黄色部分は両抗体シグナルの分布が一致した場所を意味する。一次抗体なしでは、免疫蛍光は観察されなかった（データは示されていない）。右パネルは、左パネルの囲み部分の拡大図である。スケールバー、２０μｍ。
【図５】野生型マウスとＰｔｐｒｚ欠損マウスにおけるＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化の比較結果を示す図である。（Ａ） 野生型（＋／＋）及びＰｔｐｒｚ遺伝子欠損（−／−）マウスのシナプトソーム画分の全タンパク質のウエスタンブロット解析、抗リン酸化チロシン抗体（左）、ＥｒｂＢ４抗体（右上段）、ＰＳＤ９５抗体（右中段）、Ｐｔｐｒｚ抗体（右下段）。（Ｂ）ＥｒｂＢ４抗体を用いた免疫沈降物を抗リン酸化チロシン抗体（上段）及びＥｒｂＢ４抗体でウエスタンブロットで解析した。
【図６】ＰＳＤ９５によるＥｒｂＢ４のリン酸化とＰｔＰｒｚによる脱リン酸化のインビトロアッセイの結果を示す図である。（Ａ）ＥｒｂＢ４のインビトロリン酸化アッセイ表示の量のＧＳＴ−ＰＳＤ９５又はＧＳＴでプレインキュベートしたＧＳＴ−ＥｒｂＢ４（１．２５ｇ）を、１０μＣｉ／ｍｌの［γ―３２Ｐ］ＡＴＰと１０μＭの非標識ＡＴＰと、１５μｌの容積内で３０℃で３０分間、自己リン酸化に供した。ＳＤＳ―ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加して反応を停止し、ｓＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーで分析した。（Ｂ）ＥｒｂＢ４のインビトロ脱リン酸化アッセイこのアッセイにおけるＥｒｂＢ４そのもののキナーゼ活性の影響を排除するために、ＡＴＰと補助因子（Ｍｇ２＋及びＭｎ２＋）を、３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＳＲからゲルろ過によって除去した。表示量のＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲ、ＧＳＴ−ＰＳＤ９５、及びＧＳＴを混合し、５μｌの容積内で１５分間プレインキュベートし、１０μｌの３２Ｐ標識ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（約２ｎｇ）を添加し、２時間（上）又は３０分間（下）３０℃でインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を追加して反応を停止し、上記のように分析した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含むＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤、及びＰｔｐｒｚアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内蛋白質のチロシン残基のリン酸化修飾は、細胞の増殖・分化・移動等や様々な細胞活動の制御に関わっている。リン酸化は、タンパク質中の特定のチロシン残基にリン酸基を付加するプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）と、これを除去するプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）によって、可逆的に制御されている。そして、細胞内蛋白質のチロシン残基のリン酸化修飾は、細胞の増殖・分化・移動等や様々な細胞活動の制御に関わっており、リン酸化制御の破綻は、ガン化などの異常な細胞増殖の原因として広く認識されるとともに、神経細胞及びグリア細胞における異常は精神性疾患の原因として報告されている。ヒトゲノム中に同定されているＰＴＫ及びＰＴＰ遺伝子は数百を超えており、それぞれ特有の細胞機能に関与していると考えられる。
【０００３】
上記のＰＴＰの中でも、受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）は細胞膜に発現しており、ヒトにおいては８種のサブファミリーに分類される２１種の分子で構成されている（非特許文献１，２参照）。殆どのＲＰＴＰには、細胞質側にタンデムなＰＴＰドメインが２個存在し、その触媒活性は、細胞膜に近い第１ＰＴＰドメイン（ＰＴＰ−Ｄ１）に保持されている。細胞膜から遠位に位置する第２ＰＴＰドメイン（ＰＴＰ−Ｄ２）の機能については殆ど解明されていないが、Ｄ２ドメインの構造的完全性は、ＲＰＴＰの活性及び安定性に重要であるとされている（非特許文献１，２参照）。
【０００４】
受容体型プロテインチロシンホスファターゼＺ（Ｐｔｐｒｚ、或いはＰＴＰζ又はＲＰＴＰβとも呼ばれる）は、主として中枢神経系で発現するＲＰＴＰだが（非特許文献３参照）、胃などの末梢組織にも発現している（非特許文献４参照）。Ｐｔｐｒｚには、Ｐｔｐｒｚ−Ａ及びＰｔｐｒｚ−Ｂの２種類の受容体アイソフォームがある。このうち、Ｐｔｐｒｚ−Ｂは、Ａ型に比べ、細胞外領域に欠失がある（図１参照）。２１種のＲＰＴＰ（非特許文献１，２参照）のうち、Ｒ５サブファミリーに属するＰｔｐｒｚ／ＰＴＰζとＰｔｐｒｇ／ＰＴＰγだけが、そのカルボキシル末端に一般的なＰＤＺドメイン結合モチーフ（−Ｓ−Ｌ−Ｖ）を有している（非特許文献５参照）。
【０００５】
本発明者らは、Ｐｔｐｒｚのカルボキシル末端が、シナプス可塑性に関与する主要なシナプス足場タンパク質であるＰＳＤ９５の第２ＰＤＺドメインに結合することを既に報告している（非特許文献６参照）。成獣ラット脳では、Ｐｔｐｒｚ及びＰＳＤ９５のいずれも海馬及び大脳新皮質の錐体神経細胞の樹状突起に分布し、シナプス後肥厚部（ＰＳＤ）画分に豊富に認められる。本発明者らはＰｔｐｒｚが、ＰＳＤ９５ファミリー以外にも、膜関連グアニル酸キナーゼ（membrane associated guanylate kinase）ＷＷドメイン及びＰＤＺドメイン含有タンパク質−１／３（ＭＡＧＩ−１／−３）、Ｖｅｌｉ−３、シナプトジャニン２結合タンパク質（Ｓｙｎｊ２ｂｐ：synaptojanin 2 binding protein）、酸性シントロフィン１及び塩基性シントロフィン１（Ｓｎｔａ１及びＳｎｔｂ１：syntrophin acidic 1 and basic 1）、並びにマルチプルＰＤＺタンパク質１（Ｍｕｐｐ１：multiple PDZ protein 1）等、別のＰＤＺドメイン含有タンパク質とも相互作用することを明らかにしている。
【０００６】
本発明者らは最近、ＰＴＰ基質をスクリーニングする遺伝子法を報告し、「酵母基質トラッピング法（非特許文献７，８参照）」と命名した。この方法は、酵母ツーハイブリッドシステムを基本としているが、プレイ（prey）タンパク質をチロシンリン酸化するためにＰＴＫを誘導的に発現させることと、基質−トラップＰＴＰ変異体（非特許文献９参照）をベイト（bait）としてスクリーニングを行うという２つの主要な変更を加えている。この方法によって本発明者らは、Ｇタンパク質共役受容体相互作用因子１（Ｇｉｔ１：G protein-coupled receptor kinase-interactor1）、ｐ１９０ ＲｈｏＧＡＰ、ゴルジ関連ＰＤＺ及びコイルドコイルモチーフ含有タンパク質（ＧＯＰＣ／ＰＩＳＴ：golgi-associated PDZ and coiled-coil motif containing）、及びＭＡＧＩ−１等の、Ｐｔｐｒｚに対する基質をいくつか同定した（非特許文献７，８参照）。他方、別のグループは、β−カテニン（非特許文献１０参照）及びナトリウムチャネルαサブユニット（非特許文献１１参照）もまた基質であることを報告した。上記β−カテニンは上皮細胞のＭＡＧＩ−１の第５ＰＤＺドメインと相互作用することが知られており（非特許文献１２参照）、Ｐｔｐｒｚ及びβ−カテニンがＭＡＧＩ−１足場タンパク質上に安定な酵素−基質複合体を形成することが示唆される。同様に、シントロフィンの第１プレックストリンホモロジー（ＰＨ：pleckstrinhomology）ドメイン及びシントロフィンユニーク（ＳＵ：syntrophin-unique）ドメインがナトリウムチャネルと相互作用し（非特許文献１３参照）、シントロフィンのＰＤＺドメインがＰｔｐｒｚと相互作用することから（非特許文献７参照）、ナトリウムチャネルとＰｔｐｒｚの相互作用は神経細胞のシントロフィンに介されると推測される。
【０００７】
本発明者らは以前、Ｐｔｐｒｚのカルボキシル末端（−Ｓ−Ｌ−Ｖ）が、興奮性シナプスの後肥厚部（ＰＳＤ）において最もよく特徴付けられている構成要素である（非特許文献１８参照）ＰＳＤ９５の２番目のＰＤＺドメインと関連していることを発見した（非特許文献６参照）。一方、ＥｒｂＢ４は、ＰＳＤ９５に結合することによって興奮性シナプスのＰＳＤに集積する受容体型チロシンキナーゼであることが知られている（非特許文献１５参照）。ＥｒｂＢ４もまた、ＰＳＤ９５の１番目及び２番目のＰＤＺドメインとＥｒｂＢ４のカルボキシル末端尾部（−Ｔ−Ｖ−Ｖ）を通して結合することが報告されている（非特許文献１７参照）。ＥｒｂＢ４の細胞質部分は、リガンドに誘導された二量化によって複数箇所でチロシン自己リン酸化される調節配列に隣接する、保存されたチロシンキナーゼドメインを有する（非特許文献１４参照）。ＰＳＤ９５がアミノ末端“head to head”相互作用によって多量体を形成し（非特許文献２２参照）、そのことでＰＳＤに多くのシグナリング分子を凝集させることが報告されている。こうした凝集は、リガンド刺激なしにＥｒｂＢ４の二量化と自己リン酸化を誘導すると考えられる。ＥＧＦＲの細胞内領域（ＩＣＲ）全体もまた、様々な因子によって誘導される凝集によって活性化する（非特許文献１９，２０参照）。さらに最近の研究は、ＥｒｂＢ４と同じファミリーに属する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１）キナーゼが、非対称二量体の形成によりその局所濃度が上昇することで、活性化しうると示唆している（非特許文献２１参照）。その他、本発明者らは、Ｐｔｐｒｚノックアウトマウスを作製しており（非特許文献１６参照）、また、培養細胞において、全長を有するＰｔｐｒｚ−Ｂがオリゴマー化によって不活性化されることを示した（非特許文献２３参照）。
【０００８】
他方、細胞膜上に発現する受容体型のチロシンキナーゼ（Receptor tyrosine kinase, ＲＴＫ）に属する（ＥｒｂＢ／ＥＧＦＲ）サブファミリーは、既に癌などの重篤な疾病の分子標的創薬の主要ターゲットになっている（例えば、特許文献１〜３参照）。ＥｒｂＢファミリーの１つＨｅｒ２（ＥｒｂＢ２）に対する抗体医薬トラスツズマブ（Trastuzumab）/ハーセプチンは、Ｈｅｒ２陽性の乳ガン治療に優れた治療成果を挙げている。しかし肺ガン治療に有用なＥＧＦＲの選択阻害剤ゲフィチニブ(Gefitinib)/イレッサでは、間質性肺炎を中心とした副作用によって多くの死亡例が報告されるなど、元々生体に必須の生理作用をもつＲＴＫを直接阻害する医薬品の高い副作用リスクは問題視されている。
【０００９】
【特許文献１】特表２００６−５０８３３６号公報
【特許文献２】特表２００３−５０８４４７号公報
【特許文献３】特表２００３−５０３３６６号公報
【非特許文献１】Mol. Cell. Biol. 21, 2001, 7117-7136
【非特許文献２】Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 2006, 833-846
【非特許文献３】J. Biochem. 123, 1998, 458-467
【非特許文献４】Nat. Genet. 33, 2003, 375-381
【非特許文献５】Genome Res. 16, 2006, 1056-1072
【非特許文献６】Brain Res. Mol. Brain Res. 72, 1999, 47-54
【非特許文献７】Methods 35, 2005, 54-63
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2001, 6593-6598
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, 1680-1685
【非特許文献１０】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, 2603-2608
【非特許文献１１】Nat. Neurosci. 3, 2000, 437-444
【非特許文献１２】Biochem. Biophys. Res. Commun. 270, 2000, 903-909
【非特許文献１３】J. Neurosci. 18, 1998, 128-137
【非特許文献１４】Trends Cell Biol. 16, 2006, 649-656
【非特許文献１５】Nature 366, 1993, 473-475
【非特許文献１６】Neurosci. Lett. 247, 1998, 135-138
【非特許文献１７】Neuron 26, 2000, 443-455
【非特許文献１８】Nat. Rev. Neurosci. 5, 2004, 771-781
【非特許文献１９】J. Biol. Chem. 264, 1989, 11346-11353
【非特許文献２０】Biochemistry 32, 1993, 8742-8748
【非特許文献２１】Cell 125, 2006, 1137-1149
【非特許文献２２】Neuroscience 127, 2004, 91-100
【非特許文献２３】FEBS Lett. 580, 2006, 4051-4056
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤、及びＰｔｐｒｚアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、Ｐｔｐｒｚについての生体内での役割の研究を進める過程で、ＲＰＴＰは、少なくとも二つの異なる形態によって基質と選択的に相互作用していると考えた。一つは、酵母基質トラッピング系による検出が可能であるＰＴＰ−Ｄ１ドメインとチロシンリン酸化された基質分子との直接相互作用に基づく形態であり、もう一つは、ＰＤＺタンパク質等の足場タンパク質の助けを借りることにより、いくつかの分子が特異的基質となることができる間接的な形態である。本発明者らは、間接的相互作用によるＰｔｐｒｚに対する新たな基質を同定するため、成獣ラット大脳のシナプトソーム画分から得たＰｔｐｒｚのカルボキシル末端領域を用いたプルダウン実験を行ったところ、Ｐｔｐｒｚに対する基質が含まれている可能性がある一連の分子をＰＳＤ９５と共に同定することに成功した。これら分子のうち、本発明ではＥｒｂＢ４に着目した。ＥｒｂＢ４は、ＲＴＫのＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーであり、ニューレグリン（ＮＲＧ）及び他の成長因子によって活性化する。以下に述べるように、ＥｒｂＢ４がＰｔｐｒｚに対する新規な基質であることを確認し、本発明を完成した。
【００１２】
上記のように、本発明者らは、成獣ラットシナプトソーム由来のＰＳＤ９５を含むタンパク質複合体において、ＥｒｂＢ４及びＰｔｐｒｚを同定した。ここで、ＰＳＤ９５はＥｒｂＢ４とＰｔｐｒｚとの相互作用のための足場タンパク質であると考えた。また、ＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化は、野生型マウスと比較して成獣Ｐｔｐｒｚ欠損マウスの大脳シナプトソーム画分において増加した。これらの結果は全て、ＥｒｂＢ４がＰｔｐｒｚの新規基質であることを示している。
【００１３】
また、３２Ｐ標識化ＥｒｂＢ４ＩＣＲに対するＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性は、インビトロでＰＳＤ９５に影響されなかったことから、Ｐｔｐｒｚのホスファターゼ活性はＰＳＤ９５への結合に影響されないことが明らかとなった。インビボ状態においても、カルボキシ末端尾部を通したＰｔｐｒｚのＰＳＤ９５への結合は、ＥｒｂＢ４に対するＰｔｐｒｚの脱リン酸化活性を維持するようである。したがってＰｔｐｒｚは、ＰＳＤ９５による過剰活性化の抑制を通して、ＥｒｂＢ４シグナリングの調節物質として機能すると思われる。これは、ＰＳＤにおいて、リガンド（ＮＲＧ）による刺激を通してＥｒｂＢ４シグナリング経路を調節する重要な機構であると考えられる。
【００１４】
また、３２Ｐ標識化ＥｒｂＢ４ＩＣＲに対するＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性は、インビトロでＰＳＤ９５に影響されなかったことから、Ｐｔｐｒｚのホスファターゼ活性はＰＳＤ９５への結合に影響されないことが明らかとなった。インビボ状態においても、Ｐｔｐｒｚのカルボキシ末端尾部を介したＰＳＤ９５との結合は、ＥｒｂＢ４に対するＰｔｐｒｚの脱リン酸化活性を維持するようである。したがってＰｔｐｒｚは、ＰＳＤ９５による過剰活性化の抑制を通して、ＥｒｂＢ４シグナリングの調節物質として機能すると思われる。これは、ＰＳＤにおいて、リガンド（ＮＲＧ）による刺激を通してＥｒｂＢ４シグナリング経路を調節する重要な機構であると考えられる。
【００１５】
本発明者らは、ＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化レベルが、成獣Ｐｔｐｒｚ欠損マウスの大脳シナプトソーム画分において常に亢進していることを見い出した脳の興奮性シナプスのＰＳＤにおいて、ＥｒｂＢ４は、ＮＭＤＡ受容体と共にＰＳＤ９５と結合している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, 3596-3601）。近年の研究のいくつかは、ＮＲＧ−ＥｒｂＢ４シグナリングがシナプス可塑性の維持及び／又は調節において機能的に重要であるということを示している。本発明者らは、Ｐｔｐｒｚ欠損マウスが、年齢依存的に空間学習能力を低下させ、また海馬ＣＡ１領域におけるＬＴＰに異常な亢進がおこること（J. Neurosci. 25, 2005, 1081-1088）また海馬依存性恐怖学習の障害（Neurosci. Lett. 399, 2006, 33-38）を示すことを明らかにした。ＮＲＧ１及びその受容体であるＥｒｂＢ４は、統合失調症の病因と関連があるとされている（Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 141, 2006, 96-101；Nat. Med. 12, 2006, 824-828）。近年の研究は、ＮＲＧ１‐ＥｒｂＢ４シグナリングの亢進がこの疾患のＮＭＤＡ機能不全の一因であることを示唆している（Mol. Biol. Cell 12, 2001, 615-627）。本発明は、ＮＲＧ１に誘導されたＥｒｂＢ４活性の実質的亢進が、その分子機構は解明されていないとはいえ、統合失調症患者死後脳前頭前野におけるＥｒｂＢ４‐ＰＳＤ９５間相互作用の亢進に依存することを示している。本発明は、Ｐｔｐｒｚの活性又は発現レベルの減少が、こうした精神疾患におけるＥｒｂＢ４シグナリングを亢進させる一因であることを示唆している。
【００１６】
Ｒ５サブファミリー（Ｐｔｐｒｚ及びＰｔｐｒｇ）のみにおいて、一般的なＰＤＺ結合配列が存在するＲＰＴＰファミリーとは対照的に、ＲＴＫファミリーの多くが、ＰＤＺ含有タンパク質にそのカルボキシ末端又は細胞内領域を介して結合する。Ｐｔｐｒｚのカルボキシ末端の‐Ｓ‐Ｌ‐Ｖモチーフは、様々なＰＤＺタンパク質と相互作用可能であるので、Ｐｔｐｒｚ（及びＰｔｐｒｇ）は、異なるＰＤＺ含有タンパク質との結合を介して他のＲＴＫを調節している可能性が考えられる。実際に本発明者らは、培養細胞において、ＧＩＰＣのＰＤＺドメインに結合するＴｒｋ受容体チロシンキナーゼファミリーである（Mol. Biol. Cell 12, 2001, 615-627）ＴｒｋＡのチロシンリン酸化が、Ｐｔｐｒｚの共発現によって効果的に減少することを見い出している。
【００１７】
すなわち本発明は、（１）ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を含むヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤や、（２）ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含むヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤に関する。
【００１８】
また本発明は、（３）ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を含む、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤や、（４）ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含む、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤に関する。
【００１９】
さらに本発明は、（５）リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚをインビトロで作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が大きくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質と評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質のスクリーニング方法や、（６）リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚをインビトロで作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が小さくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質と評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質のスクリーニング方法や、（７）Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス、及び野生型マウスに被検物質を投与し、シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して小さくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚアゴニストと評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質のスクリーニング方法や、（８）Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス、及び野生型マウスに被検物質を投与し、シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して大きくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚアンタゴニストと評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００２０】
ＥｒｂＢファミリーは、発癌や統合失調症などに対する治療薬開発の重要な分子標的である。ＥｒｂＢの異常なリン酸化を、生体が元々持っているＰＴＰの活性機能を高めることによって正常状態に戻す治療戦略が可能になれば、副作用のリスクは著しく回避することができると考えられる。本発明は、受容体型プロテインチロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）に属するＰｔｐｒｚの細胞内領域を用いて、これに選択的に結合する分子の検索を行い、その中にＥｒｂＢ４が存在すること、加えてＰｔｐｒｚがＥｒｂＢ４を基質として効率的に脱リン酸化することの知見に基づくものであり、本発明によると、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する小児脳腫瘍（髄芽細胞腫や上皮腫）、統合失調症、がん等の疾病の予防・治療や、Ｐｔｐｒｚのアゴニスト・アンタゴニストのスクリーニング方法などを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤や、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤としては、ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子、又はヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを有効成分として含むものであれば特に制限されず、上記ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病としては、小児脳腫瘍（髄芽細胞腫や上皮腫）、統合失調症、がん等の疾病を例示することができ、上記脱リン酸化剤は、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤として有用である。
【００２２】
上記ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子としては、例えばヒトＰｔｐｒｚをコードする配列番号１で示される塩基配列（ヌクレオチド配列）を有するＤＮＡの他、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる天然型のヒトＰｔｐｒｚタンパク質のアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子や、配列番号１で示される塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ受容体型プロテインチロシンホスファターゼＰｔｐｒｚ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も使用することができる。ここで、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００２３】
上記ヒトＰｔｐｒｚ発現を発現しうる組換えベクターとしては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒトＰｔｐｒｚタンパク質をヒト生体内で発現しうるものであれば特に制限されるものではなく、例えばヒトＰｔｐｒｚをコードする配列番号１で示される塩基配列（ヌクレオチド配列）からなるＤＮＡなど、上記ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、動物細胞において発現しうるものが好ましく、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列の他、選択マーカー遺伝子を導入しておくこともできる。発現ベクターへの抗体遺伝子の導入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる)により行うことができる。
【００２４】
上記動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐＣＲ２．１−ＴＡ（Invitrogen社製）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等のプラスミドベクターや、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）の他、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター等のウイルスベクターを例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
【００２５】
また、上記のヒトＰｔｐｒｚ遺伝子やヒトＰｔｐｒｚ発現を発現しうる組換えベクターを生体にデリバリーする方法としては、従来公知の方法を用いることができ、ウイルスベクターを用いる方法の他、皮膚や筋肉にエレクトロポレーションによりプラスミドＤＮＡを単独で投与する方法や、超音波によるＤＮＡの細胞内への導入方法や、ハイドロダイナミクスインジェクション法、ポリアミドアミン (ＰＡＭＡＭ) デンドリマーなどの遺伝子キャリアー分子を使った方法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＮＡでコートした金粒子を高圧ヘリウムガスで直接細胞に打ち込む遺伝子銃法等を挙げることができ、目的に応じて好適な方法を選択することが好ましい。また、本発明の遺伝子は、ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子やヒトＰｔｐｒｚ発現を発現しうる組換えベクターは、インビボの他にエクスビボ（ex vivo）にても投与することができる。インビボで投与する場合、静脈、皮下、筋肉内に投与、あるいは疾患の対象部位等の局所に直接投与することができ、また、製剤形態として使用する場合、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。
【００２６】
本発明のインビトロ系でのＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚを作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が大きいときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質と評価し、反対に脱リン酸化の程度が小さいときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質と評価する方法であれば特に制限されず、インビトロ脱リン酸化アッセイは、リン酸化したＥｒｂＢ４、あるいはＥｒｂＢ４の細胞内領域（ＥｒｂＢ４ＩＣＲ）とＰｔｐｒｚとを被検物質の存在下で接触させることにより行うことができる。例えば、基質となるリン酸化したＥｒｂＢ４は、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのエピトープタグとの融合タンパク質として昆虫細胞、酵母、大腸菌などの宿主細胞で発現させたＥｒｂＢ４の細胞内領域全体（ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ）を精製後、ＡＴＰと接触させることにより調製することができる。次に、インビトロ脱リン酸化アッセイは、前記ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲとＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲ（ラットＰｔｐｒｚ−Ａの細胞内領域全体もしくはＰＴＰ−Ｄ１ドメイン）とを緩衝液中でインキュベーションして接触させ、ＥｒｂＢ４のリン酸化の減少の程度、もしくは脱離したリン酸濃度を測定することにより行うことができる。なお、用いるＥｒｂＢ４やＥｒｂＢ４遺伝子、ＰｔｐｒｚやＰｔｐｒｚ遺伝子等の由来としては、ヒトに限らずラット、マウス等を有利に挙げることができる。また、リン酸濃度を測定する際に、標識ＡＴＰを使用することもできる。
【００２７】
また、本発明のインビボ系でのＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進又は抑制物質のスクリーニング（同定）方法としては、Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス（ノックアウトマウス）、及び野生型マウスに被検物質を投与し、大脳シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して、小さくなるとき（ノックアウトマウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度は被検物質の有無にかかわらず変わらないのに、野生型マウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度は被検物質の存在下において、Ｐｔｐｒｚによる脱リン酸化が進んだ結果、ＥｒｂＢ４のリン酸化が減少しているとき）に、前記被検物質をＰｔｐｒｚアゴニストと評価し、大きくなるとき（ノックアウトマウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度は被検物質の有無にかかわらず変わらないのに、野生型マウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度は被検物質の存在下において、Ｐｔｐｒｚによる脱リン酸化が抑制された結果、ＥｒｂＢ４のリン酸化が亢進しているとき）に、前記被検物質をＰｔｐｒｚアンタゴニストと評価（同定）する方法であれば特に制限されず、被検物質は経口又は非経口的に投与することができる。シナプトソーム画分は、公知の方法で調製することができ、また、大脳シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の測定も、抗ＥｒｂＢ４抗体を用いた免疫沈殿法によってシナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４を回収し、ウエスタンブロットによってそのチロシンリン酸化レベルを解析するなど公知の方法を用いることができる。
【００２８】
上記インビトロ系やインビボ系でのスクリーニング方法により得られるＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質は、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤となる可能性があり、また、Ｐｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質は、ＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化抑制に起因する疾病の予防・治療剤となる可能性がある。ＥｒｂＢ４の発現抑制によって、胎生期の心臓に小梁形成(embryonic heart trabeculation)が起こる可能性がある（Experimental Cell Research 284 (2003) 66-77 “ErbB-4: mechanism of action and biology” Graham Carpenter）。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、供試動物として、成獣ラット（Sprague-Dawley、３ヶ月齢）、及び野生型及びＰｔｐｒｚ遺伝子欠損の成獣マウス（Neurosci. Lett. 247, 1998, 135-138）を用いた。すべての動物実験は、自然科学研究機構の動物研究委員会（Committee for Animal Research）の承認を得た動物取り扱い指針（guidelines for Animal Care）に沿って行われた。
【実施例１】
【００３０】
［ＰｔｐｒｚとＥｒｂＢ４の結合及び居局在性；ＧＳＴプルダウン実験］
受容体型チロシンホスファターゼＰｔｐｒｚの分子構造は、大きく細胞外領域、細胞膜貫通ドメイン、細胞内領域に３つに分けられる（図１）。細胞内領域には、チロシンホスファターゼドメイン（ＰＴＰ）がタンデムに並んでおり、細胞内領域のカルボキシル末端はＰＤＺドメイン含有タンパク質との結合に関与するモチーフを有している。ＰｔｐｒｚのＰＴＰ−Ｄ２及びカルボキシル末端に対する細胞内結合分子の同定を目的として、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質を設計した。市販システム（ＧＥヘルスケア）を用いて、ＧＳＴとＰｔｐｒｚのＤ２ドメイン及びカルボキシル末端（ラットＰｔｐｒｚ−Ａ（GenBankアクセッション番号Ｕ０９３５７）のアミノ酸残基２０３０から２３１６）との融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２、図１参照）を、大腸菌株ＢＬ２１中で発現プラスミドpGEX-Ptrprz-D2を使って発現させ、該タンパク質を、クロマトグラフィー装置（AKTA prime plus、GE Healthcare社製）につなげたＧＳＴｒａｐカラムを用いたグルタチオン・アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。pGEX-Ptprz-D2は、pZeoPTPζ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2001, 6593-6598）の適切なｃＤＮＡをpGEX-6P（GE Healthcare社製）にサブクローニングすることで調製した。また、ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２−ＳＡはセリン２３１４がアラニンで置換された変異体である。QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit （Stratagene社製）を用いてpGEX-Ptprz-D2から作製したpGEX-Ptprz-D2-SAから、ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２−ＳＡを発現させた。
【００３１】
プルダウン実験に際して、ＧＳＴ融合タンパク質（５０μｇ）を、GST Orientation Kit（Pierce社製）を用いてグルタチオンセファロースビーズ（５００μｌ）に共有結合で結合させて、ＧＳＴ−Ｄ２結合担体を調製した。ＧＳＴ−Ｄ２カラムと比較対照用のＧＳＴカラムを用いて、文献（Neuron 26, 2000, 443-455）記載の通りに成獣ラット大脳から調製したシナプトソーム溶解液（lysate）（５０ｍｇタンパク／ｍｌビーズ）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ビーズを洗浄後、２％ＳＤＳを含む０．１ＭのTris-HClサンプルバッファー（ｐＨ６．８）で、結合したタンパク質を溶出し、次いでアセトン沈殿を行った。その後、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルー染色した。特異的バンドを切り出し、ゲル内トリプシン消化した後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）にかけた（Reflex III, Bruker Daltonics社製）。ＮＣＢＩの非重複タンパク質データベースに対してMascotサーチ（http://www.matrixscience.com/）を行い、ペプチドマスフィンガープリントを行った。
【００３２】
上記のように、成獣ラット脳のシナプトソーム画分におけるＰｔｐｒｚに結合する分子を同定するために、成獣ラット大脳シナプトソームのデオキシコール酸抽出物で、第２ＰＴＰ領域とカルボキシ末端尾部（ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２、図１参照）を含むＧＳＴ融合タンパク質を用いて、プルダウン実験を行った。その結果、図２に示されるように、ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２ビーズでプルダウンした画分で８本のバンドが特異的に観察されたが、ＧＳＴビーズでプルダウンした画分ではバンドは観察されなかった。質量分析により、９５ｋＤａの主要なバンドがＳＡＰ９０Ａ（ＰＳＤ９５のラットオルソログ）であり、１８０ｋＤａのバンドが、ニューレグリンのレセプターとして知られるＥｒｂＢレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのメンバー、ＥｒｂＢ４であることが明らかになった（その他はシナプス性Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質 synaptic Ras GTPaseactivating protein（ＳｙｎＧＡＰ）、及びＰＳＤ９３／ｃｈａｐｓｙｎ−１１０であった；データ非表示）。本発明者らは、ウエスタンブロットにより、プルダウン実験でのＰＳＤ９５、ＥｒｂＢ４及びＰｔｐｒｚ−Ｄ２の特異的な相互作用を確認した（図３）。また、ＰＤＺドメインに対する結合能を消失させた変異タンパク質（ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２−ＳＡ）を用いた場合では、ＥｒｂＢ４及びＰＳＤ９５の結合は検出されず、ＰｔｐｒｚとＥｒｂＢ４との結合は、ＰＳＤ９５などのＰＤＺ含有タンパク質を介して起っていることが判明した（図３）。
【００３３】
カルボキシル末端（−Ｔ−Ｖ−Ｖ）と第１又は第２ＰＤＺ領域との間の相互作用を通して、ＥｒｂＢ４がＰＳＤ９５に結合することが報告されている（Neuron 26, 2000, 443-455）。ＥｒｂＢ４とＰＳＤ９５とも、成獣ラット脳のシナプス後肥厚部（ＰＳＤ）画分に豊富に存在する。文献（Brain Res. Mol. Brain Res. 72, 1999, 47-54）の記載を少し変更を加え、二重染色実験を行った。切片を、Ｐｔｐｒｚの細胞内領域に対するマウスモノクローナル抗体（抗ＲＰＴＰβ抗体、BD transduction laboratories社製）とＥｒｂＢ４細胞内領域に対するウサギポリクローナル抗体（ｓｃ−２８３、Santa Cruz Biotechnology社製）と共に、一晩インキュベートした。結合している抗体を、蛍光アレクサ色素結合二次抗体（Molecular Probes社製）で可視化し、共焦点顕微鏡（LSM510、Carl Zeiss社製）で観察した。ラット大脳組織の二重免疫組織染色の結果、ＥｒｂＢ４とＰｔｐｒｚの局在は非常に良く一致し、ＥｒｂＢ４が、Ｐｔｐｒｚによって脱リン酸化制御を受け生理的な基質分子である可能性が示唆された（図４）。Ｐｔｐｒｚの免疫反応性は、文献（Brain Res. Mol. Brain Res. 72, 1999, 47-54）記載の通り前頭前野のニューロン群の樹状突起及び細胞体と関連性があった。ＥｒｂＢ４の免疫反応性は、同じニューロンの細胞体で主に検出された。
【実施例２】
【００３４】
［Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化レベルの亢進］
生体内において、ＥｒｂＢ４がＰｔｐｒｚによって脱リン酸化されているのか、野生型マウス及びＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスの脳組織サンプルを用いて検討した。野生型マウス（＋／＋）と、Ｐｔｐｒｚ欠損マウス（−／−）から大脳シナプトソームを調製した。可溶化液を用いて、シナプトソームにおけるチロシンリン酸化パターン全体とタンパク質発現とをウエスタンブロットで分析した。Ｐｔｐｒｚの全てのスプライシングアイソフォームは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして発現しているため、シナプトソーム可溶成分を文献（J. Biochem. 123, 1998, 458-467）記載の通りコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した後、Ｐｔｐｒｚ−Ｂを検出した。野生型及びノックアウトマウス間のシナプトソーム全タンパク質のリン酸化状態をウエスタンブロットで見る限り両者間に差異はなく（図５Ａ左側）、シナプトソーム中のＥｒｂＢ４（図５Ａ右側上段）及びＰＳＤ９５（図５右側中段）の含量も同程度であった。Ｐｔｐｒｚは野生型のみに確認された（図５Ａ下段）。
【００３５】
次にシナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４を抗ＥｒｂＢ４抗体を用いた免疫沈殿法によって回収、ウエスタンブロットによってそのチロシンリン酸化レベルを解析した。その結果、ＥｒｂＢ４のリン酸化レベルはＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスで有意に増加していることが判明した（１．３倍増加。Ｐ＝０．０４、ｎ＝７、unpaired Student’s t test、図５Ｂ）。これらの結果は、Ｐｔｐｒｚが脳におけるＥｒｂＢ４のリン酸化（活性）の制御に関連していることを示している。
【実施例３】
【００３６】
［Ｐｔｐｒｚのリン酸化ＥｒｂＢ４に対する脱リン酸化活性］
インビトロにおけるリン酸化アッセイを次のように行った。ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（ＥｒｂＢ４の細胞内領域全体）をCell signaling technology社から購入した。pGEX-6PにラットＰＳＤ９５の全長ｃＤＮＡを含ませたpGEX-PSD95（Brain Res. Mol. Brain Res. 72, 1999, 47-54）を用いて、ＧＳＴ−ＰＳＤ９５を大腸菌で発現させ、グルタチオン・アフィニティークロマトグラフィー（GsTrap FF）、陰イオン交換クロマトグラフィー（Hitrap Q FF）、次いでゲルクロマトグラフィー（Superose 6 10/300 GL）で精製した。自己リン酸化のために、ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（１．２５ｎｇ）を、表示した量のＧＳＴ−ＰＳＤ９５（又はコントロールＧＳＴ）を含み、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１．２５ｍＭ ＤＴＴ、及び１００μｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む１０μｌの６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＰＴＫ緩衝液）と氷上で１５分、プレ・インキュベートした。５μｌのＡＴＰ溶液（３０μＣｉ／ｍｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び３０μＭ非標識ＡＴＰを溶かしたＰＴＫ緩衝液）を加え、３０℃で、リン酸化反応を開始させた。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（〜６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はGE Healthcare社製を用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えることで反応を停止させた。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲル上のシグナルを、バイオ・イメージングアナライザー（Fuji Photo Film社製）を用いて、イメージングプレート（BAS-MS 2025）で検出した。
【００３７】
次に、インビトロ脱リン酸化アッセイを次のように行った。ＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲ（ラットＰｔｐｒｚ−Ａの細胞内領域全体）を文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2001, 6593-6598）に記載されている通りに調製した。インビトロ脱リン酸化のために、自己リン酸化されているＥｒｂＢ４を基質として調製した。ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（３００ｎｇ）を、上述の通り１０μＣｉ／ｍｌの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び１０μｌの非標識ＡＴＰを含むＰＴＫ緩衝液１００μｌでリン酸化させた。５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．０）（ＰＴＰ緩衝液）を用いたゲル濾過（Sephadex G-25, GE Healthcare社製）を行い、ＡＴＰと補因子を除去した後、リン酸化された該調整物を、使用まで−８５℃で保存した。ゲル濾過後の３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲの回収率は、放射活性に基づけば５４％であった。脱リン酸化アッセイの前に、表示した量のＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲとＧＳＴ−ＰＳＤ９５を、５μｌのＰＴＰ緩衝液中、氷上で１５分、プレ・インキュベートした。次いで、１０μｌの３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（約２ｎｇ）を加えて、３０℃で、反応を開始させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、上述したオートラジオグラフィーにかけた。
【００３８】
上記のように、脱リン酸化アッセイにおいて、ＥｒｂＢ４ＩＣＲそのもののキナーゼ活性を排除するために、基質調製物からゲルろ過によりＡＴＰを除去した上で、インビトロで、３２Ｐ−標識ＥｒｂＢ４ＩＣＲを用いて、ＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性を調べた結果を図６に示す。ＰｔｐｒｚＩＣＲは、インビトロでＥｒｂＢ４ＩＣＲに対して２時間で、顕著な脱リン酸化活性を示した（図６Ｂ、上）。ＥｒｂＢ４ＩＣＲのリン酸化活性と対照的に、ＥｒｂＢ４ＩＣＲに対するＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性は、ＧＳＴ−ＰＳＤ９５に影響されなかった（６３Ｂ、下）。短時間（０．５時間）のインキュベーションでも同様の結果が得られた。ＰＳＤ９５の存在下でのＰｔｐｒｚＩＣＲの脱リン酸化活性に影響はなかった（図６Ｂ、下）。さらに、ＰＴＰドメインの活性部位に直接結合する低分子量化合物、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を用いて、ＰＴＰ活性を調べた。しかし、ＰｔｐｒｚＩＣＲによるｐＮＰＰの加水分解は、ＧＳＴ−ＰＳＤ９５を添加しても変化しなかった（データ非表示）。これらの結果は、ＰＳＤ９５の結合が、Ｐｔｐｒｚそのものの脱リン酸化活性に影響しないことを示している。市販のＥｒｂＢ４の細胞内領域のＧＳＴ融合タンパク質（GST-ErbB4ICR, Cell signaling, cat No. 7724）を放射線標識ＡＴＰを用いて試験管内でリン酸化し、これを基質として、Ｐｔｐｒｚ(Ptprz-ICR部分のGSTタンパク質、図１参照)による脱リン酸化を解析した。その結果、ＰｔｐｒｚがＥｒｂＢ４を効率的に脱リン酸化すること、Ｐｔｐｒｚの脱リン酸化活性は、ＰＳＤ９５の共存下で変化しないことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ラットＰｔｐｒｚ−ＡとＰｔｐｒｚ−Ｂアイソフォームの模式図である。プルダウン実験に用いる領域（ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２）と、インビトロ脱リン酸化アッセイに用いる領域（ＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲ）とを下線で示した。Ｐｔｐｒｚ−Ａ及びＰｔｐｒｚ−Ｂは、Ｎ末端炭酸脱水酵素様（ＣＡＨ）ドメイン、フィブロネクチンIII型（ＦＮ）ドメイン、コンドロイチン硫酸の付着用のセリン・グリシンリッチ領域、膜貫通セグメント（ＴＭ）、２つのＰＴＰドメイン（Ｄ１及びＤ２）、及びＣ末端のＰＤＺ結合モチーフで構成されている。
【図２】ＧＳＴプルダウンアッセイによるＧＳＴ−Ｄ２及びコントロールのＧＳＴカラムを用いたラット大脳シナプトソーム画分中の結合成分の単離結果を示す図である。矢頭は、ＧＳＴ−Ｐｔｐｒｚ−Ｄ２を用いたプルダウンサンプルで特異的に検出されたバンドを示す。
【図３】ＧＳＴで異なる融合タンパク質を用いたプルダウンサンプルのウエスタンブロット分析の結果を示す図である。ＧＳＴ−Ｄ２、コントロールＧＳＴ 及びＰＤＺ結合配列部分の変異体（ＧＳＴ−Ｄ２−ＳＡ）を用いてラットシナプトソーム画分から結合成分の単離を行い、その中に含まれるＥｒｂＢ４（上段）及びＰＳＤ９５（下段）をウエスタンブロットによって解析した。
【図４】成獣ラット前頭前野におけるＰｔｐｒｚ及びＥｒｂＢ４の居局在性を示す図である。切片を抗ＲＰＴＰβマウスモノクローナル抗体（赤色）及び抗ＥｒｂＢ４ウサギポリクロナール抗体（緑色）でラット大脳皮質を免疫染色した。最下段図の黄色部分は両抗体シグナルの分布が一致した場所を意味する。一次抗体なしでは、免疫蛍光は観察されなかった（データは示されていない）。右パネルは、左パネルの囲み部分の拡大図である。スケールバー、２０μｍ。
【図５】野生型マウスとＰｔｐｒｚ欠損マウスにおけるＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化の比較結果を示す図である。（Ａ） 野生型（＋／＋）及びＰｔｐｒｚ遺伝子欠損（−／−）マウスのシナプトソーム画分の全タンパク質のウエスタンブロット解析、抗リン酸化チロシン抗体（左）、ＥｒｂＢ４抗体（右上段）、ＰＳＤ９５抗体（右中段）、Ｐｔｐｒｚ抗体（右下段）。（Ｂ）ＥｒｂＢ４抗体を用いた免疫沈降物を抗リン酸化チロシン抗体（上段）及びＥｒｂＢ４抗体でウエスタンブロットで解析した。
【図６】ＰＳＤ９５によるＥｒｂＢ４のリン酸化とＰｔＰｒｚによる脱リン酸化のインビトロアッセイの結果を示す図である。（Ａ）ＥｒｂＢ４のインビトロリン酸化アッセイ表示の量のＧＳＴ−ＰＳＤ９５又はＧＳＴでプレインキュベートしたＧＳＴ−ＥｒｂＢ４（１．２５ｇ）を、１０μＣｉ／ｍｌの［γ―３２Ｐ］ＡＴＰと１０μＭの非標識ＡＴＰと、１５μｌの容積内で３０℃で３０分間、自己リン酸化に供した。ＳＤＳ―ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加して反応を停止し、ｓＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーで分析した。（Ｂ）ＥｒｂＢ４のインビトロ脱リン酸化アッセイこのアッセイにおけるＥｒｂＢ４そのもののキナーゼ活性の影響を排除するために、ＡＴＰと補助因子（Ｍｇ２＋及びＭｎ２＋）を、３２Ｐ標識ＧＳＴ−ＥｒｂＢ４ＩＳＲからゲルろ過によって除去した。表示量のＧＳＴ−ＰｔｐｒｚＩＣＲ、ＧＳＴ−ＰＳＤ９５、及びＧＳＴを混合し、５μｌの容積内で１５分間プレインキュベートし、１０μｌの３２Ｐ標識ＥｒｂＢ４ＩＣＲ（約２ｎｇ）を添加し、２時間（上）又は３０分間（下）３０℃でインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を追加して反応を停止し、上記のように分析した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を含むヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤。
【請求項２】
ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含むヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤。
【請求項３】
ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を含む、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤。
【請求項４】
ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含む、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤。
【請求項５】
リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚをインビトロで作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が大きくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質と評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚをインビトロで作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が小さくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質と評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス、及び野生型マウスに被検物質を投与し、シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して小さくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚアゴニストと評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス、及び野生型マウスに被検物質を投与し、シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して大きくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚアンタゴニストと評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１】
ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を含むヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤。
【請求項２】
ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含むヒトＥｒｂＢ４の脱リン酸化剤。
【請求項３】
ヒトＰｔｐｒｚ遺伝子を含む、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤。
【請求項４】
ヒトＰｔｐｒｚを発現しうる組換えベクターを含む、ヒトＥｒｂＢ４の過剰発現、あるいは過剰活性化に起因する疾病の予防・治療剤。
【請求項５】
リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚをインビトロで作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が大きくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質と評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
リン酸化したＥｒｂＢ４を基質として、被検物質の存在下にＰｔｐｒｚをインビトロで作用させ、ＥｒｂＢ４の脱リン酸化の程度を測定し、被検物質の非存在下の場合と比較して、脱リン酸化の程度が小さくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質と評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス、及び野生型マウスに被検物質を投与し、シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して小さくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚアゴニストと評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
Ｐｔｐｒｚ遺伝子欠損マウス、及び野生型マウスに被検物質を投与し、シナプトソーム画分中のＥｒｂＢ４のリン酸化の程度を測定し、野生型マウスとＰｔｐｒｚ遺伝子欠損マウスとにおけるＥｒｂＢ４のリン酸化の程度の差が、被検物質の非投与の場合と比較して大きくなるときに、前記被検物質をＰｔｐｒｚアンタゴニストと評価することを特徴とするＰｔｐｒｚによる脱リン酸化抑制物質のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１５２１（Ｐ２００９−１５２１Ａ）
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６４０６７（Ｐ２００７−１６４０６７）
【出願日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０４２６１０７７）大学共同利用機関法人自然科学研究機構 (156)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０４２６１０７７）大学共同利用機関法人自然科学研究機構 (156)
【Ｆターム（参考）】
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