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可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第XIII因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法
説明

可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第XIII因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法

【課題】生物学的グルー、第XIII因子、フィブリノーゲンを分離するための方法の開発
【解決手段】本発明は、可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第XIII因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法であって、弱塩基型のアニオン交換体でのクロマトグラフィー精製、該FXIIIを沈殿さ
せる少なくとも1つの化学薬剤の添加によるフィブリノーゲンからのFXIIIの分離、およ
び得られる精製フィブリノーゲン含有上澄み溶液の回収、ダイアフィルトレーションと続いての該溶液の凍結乾燥を包含する方法に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛋白質フィブリノーゲン、第XIII因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の高度に精製された凍結乾燥濃縮物を調製するための方法に関し、そしてまた、該方法によって得られ得る該凍結乾燥濃縮物に関する。
【背景技術】
【0002】
フィブリノーゲンは、血液凝固に必須の蛋白質であり、何故ならば、不溶性フィブリン(これは、凝固を支配する反応カスケードの終了時に形成される)へのその重合が、出血の原因の、血管のギャップを遮断する、血餅の形成へ導くためである。血餅の形成は、出血を停止するに必須である。更には、創傷レベルで形成されるフィブリンは、組織修復(創傷治癒)を確実にする線維性網様構造(fibrillary network)を形成する。
【0003】
先天性フィブリノーゲン欠乏症(congenital fibrinogen deficiencies)は、重篤な疾患へ至り得る。これらの欠乏症を処置するために、処置下で患者へ投与され得る、フィブリノーゲン濃縮物が利用可能であることが必要である。他の病理学もまた、特に、大量の失血(手術、外傷など)の場合、または播種性血管内凝固症候群(CIVD)に続いて、フィブリノーゲンの投与によって処置され得る。
【0004】
更に、第XIII因子(FXIII)と主成分としてフィブリノーゲンを含有する、トロンビン
によって活性化された、生物学的グルー(biological glues)は、例えば特許文献1〜3において記載されるように、病院おける組織修復(例えば、皮膚移植、神経および動脈縫合)において効果的に使用される。これらのプロダクト中の第XIII因子またはトランスグルタミナーゼの存在は、それを不溶性にするインターカテナリー共有結合(intercatenary covalent bindings)の形成によるフィブリンの安定化に寄与する。場合によっては、こ
れらのプロダクトはむしろ、それらの治療作用を実行することができるためには、精製された第XIII因子の外部からの供給を必要とする、複合フィブリノーゲン産生プロセス(complex fibrinogen production processes)によって得られる。
【0005】
従って、特に治療用途のための、フィブリノーゲン、生物学的グルーおよび第XIII因子濃縮物の調製は、これらのプロダクトへ導く精製技術を必要とし、これらは、種々の汚染物質(例えば、共存するかまたは共沈される蛋白質、抗体もしくはプロテアーゼ)が十分にフリーなだけでなく、加えて、それらのウイルス安全性も増加されている。
【0006】
血漿からの、場合によってはFXIIIを含有する、フィブリノーゲンに富むフラクション
の単離は、周知であり、そしてCohnおよびNitschmann(非特許文献1,2)によって最初に記載された。より最近の方法は、種々の血漿源の沈殿技術と、濾過、クロマトグラフィー、ウイルス不活性化技術などとを組み合わせる。特許文献1〜5が、例として引用され得る。
【0007】
にもかかわらず、特許文献6に記載されるようなフィブリノーゲン、あるいは、例えば
、特許EP 0 771 324に従うかまたは関連蛋白質(associated proteins)(例えば、FXIII、第VIII因子、フィブロネクチン、フォン・ビルブラント因子)を更に含有するフィブリノーゲンに富む(特に、特許文献7)生物学的グルーのいずれかの、濃縮物または組成物
を調製する種々の方法が行われている。
【0008】
しかし、これらの方法は、これらの考慮される蛋白質を得るために、原材料の数個の供
給源を利用する異なる方法を結果として使用する別個の製造ラインの使用を必要とする。更に、場合に応じて、これらの方法は、該蛋白質との望まれない反応(例えば、酸化)へ導き得る、残存金属を溶出液へ放出する傾向にあるキレート化金属に基づくアフィニティーゲル(特許文献8)のような、高価なクロマトグラフィー支持体を必要とし得る。この
ことは、これらの3つの精製された有効成分が共に必要である場合、工業規模で行うことの扱いにくさという問題を生じさせる。これらの問題は、このようにして得られる異なる蛋白質をウイルス不活性化ならびに/あるいはウイルスおよび他の望まれない汚染物質(例えば、プリオン)除去処理へ供する場合に、なおより明確である。
【0009】
このために、治療使用に適合する上記濃縮物を製造することが意図される、熱処理(例えば、保護安定剤の存在下での、20時間60℃での低温殺菌)および化学処理(例えば、溶媒−洗浄剤)を実行するいくつかの典型的なウイルス不活性化処理は、ウイルス、特にノン−エンベロープウイルス(パルボウイルスB19、A型およびB型肝炎など)を完全に不活性化することを可能にしない。
【0010】
この欠点に対する解決手段を見つけるために、厳しい条件(80℃、72時間)下での乾熱処理のような、より有効なウイルス不活性化プロセスが、現在使用されている。この工程は、ウイルスが破壊されつつ、例えば、この工程においてフィブリノーゲン安定化のような条件を提供する好適な安定化製剤の組み込みを必要とする。このような製剤は、本出願人によって出願された特許出願FR 04 02001の主題である。しかし、この製剤は、所
定の蛋白質の安定化に適用され得、そしてその特徴がフィブリノーゲンのそれとは異なる共存する(accompanying)蛋白質に適用され得ない。
【0011】
濾過技術、特に、35nmそして更にそれ未満の多孔性を有するフィルターを使用するナノ濾過(nanofiltration)もまた、ウイルスを除去するために行われている。しかし、この技術は、濾過される化合物の回収アウトプットに影響を与える物理的および化学的パラメータを制御すること無しには、有効に使用され得ず、そして、これは、フィルターの目詰まりならびに種々のウイルスおよび汚染物質の通過を回避することによる。これらのパラメータ(例えば、イオン強度、溶液のpH、および濾過プロセス条件)は、同様に、濾過される溶液中に含まれる化合物の性質にも依存する特定のプロセス条件を規定する(lay down)。特許文献9〜11は、15nmのフィルターを使用する、ナノ濾過による、蛋
白質溶液中に存在する非常に小さなサイズのノン−エンベロープウイルス(例えば、A型肝炎ウイルス)のほぼ完全な除去を開示しているが、望まれないウイルスまたはプリオンの透過の危険性が常に存在する。
【0012】
この危険性を回避するために、上述の技術の少なくとも2つを組み合わせる二重または三重ものウイルス不活性化および/または除去が、例えば特許文献8に記載されるように
、行われ得る。このような処理が組み合わされる場合、ウイルス不活性化方法に依存して、例えばナノ濾過を支配する上述の物理的および化学的パラメータに対して、付随する有害な影響を発しない、殺ウイルス性賦形剤および/または保護安定剤を選択することが必須である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】EP 0 305 243
【特許文献2】FR 2 448 900
【特許文献3】FR 2 448 901
【特許文献4】EP 0 359 593
【特許文献5】US 5 099 003
【特許文献6】EP 1 457 497
【特許文献7】US 6 121 232
【特許文献8】WO 2004/007533
【特許文献9】EP 1 348 445 A1
【特許文献10】EP 1 161 958 A1
【特許文献11】WO 99/23111
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】Cohn et al, J. Am, Chem. Soc., 68, 459, 1946
【非特許文献2】Kistler et al, Vox Sang., 7, 1962, 414-424
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
従って、本願出願人は、二重の目的に合う、トロンビンによって活性化された生物学的グルーと、第XIII因子、フィブリノーゲンを分離するための方法の開発を研究した。一方で、フィブリノーゲンおよび第XIII因子を含有する単一の血漿原料から、これらの凍結乾燥されそして高度に精製された蛋白質の濃縮物を共に得ることを可能にする独特な方法の開発、ならびに、他方で、この方法は、更に、少なくとも1つのウイルス不活性化ならびに/あるいはウイルスおよび他の望まれない汚染物質(ポリマー、凝集物、プリオン)除去処理と適合性であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
従って、本発明は、
可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第XIII因子および、フィブリノーゲンおよび第XIII因子に基づく生物学的グルー(biological glue)を分離し、そして
該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法であって、以下の工程:
a)以下の工程を包含するクロマトグラフィー精製工程:
i)弱塩基型のアニオン交換体に該可溶化フラクションをロードする工程(該交換体は、アルカリ性pHの所定のイオン強度を有する緩衝液で予め平衡化されており、従って該生物学的グルーの保持を可能にする)、
ii)該緩衝液のイオン強度の増加による該生物学的グルーの溶出工程、
b)該FXIIIを沈殿させる少なくとも1つの化学薬剤の、該生物学的グルー溶出液の少
なくとも一部への添加による、フィブリノーゲンからのFXIIIの分離、および精製フィブ
リノーゲンの得られる上澄み溶液の回収工程、ならびに
c)該フィブリノーゲン、生物学的グルーおよび再可溶化FXIII溶液のダイアフィルト
レーション、続いての該溶液の凍結乾燥、
を包含する方法に関する。
【0017】
従って、本出願人は、共沈される蛋白質および望まれない汚染物質を含まない、凍結乾燥され、高度に精製された、フィブリノーゲン、第XIII因子および生物学的グルー濃縮物が、原材料の最適な収益性を確保しつつ、各々の考慮される化合物の調製を最適に調節することを要求に応じて可能にする、独特で順応性のある方法によって、工業規模で得られ得ることを見出した。このような簡単で、迅速かつ低コストな方法は、工業規模で実施し易く、そして種々の調製フローチャートの増加した最適化を生じさせる。
【0018】
更に、使用される原材料および意図される用途に応じて、ウイルス不活性化および/または除去の更なるプロセス工程が、治療的使用に好適な、目的の3つの濃縮物を生じる。
【0019】
本発明によれば、フィブリノーゲンおよび第XIII因子を含有するいくつかの原材料の供給源が使用され得る。従って、これらの血漿フラクションは、冷アルコールを使用するCohnプロセスに従う、不安定な蛋白質である第VIII因子の十分な割合を維持するためには好ましくない条件下で回収される、血漿分別によって得られる。上述の分別は、予め可溶化された寒冷沈降物へ適用するか、あるいは第VIII因子の抽出が目的とされない限り、例えば第VIII因子の最小含有量の準拠要件を満たしていないかまたは期限切れの貯蔵寿命を有する寒冷沈降物の場合に寒冷沈降物欠乏血漿へ適用することが可能である。従って、フィブリノーゲンのこれら種々の供給源は、CohnフラクションIの沈殿物を構成し、
これは、洗浄後、当業者によって公知の、中性pHを有する任意の好適な緩衝液中に溶解される。例えば、このような緩衝液は、各成分を、それぞれ、好ましくは0.12M、0.01Mおよび0.05Mの濃度で含有する、約7.4のpHを有する、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウムおよびL−アルギニンに基づく。
【0020】
従って、本発明の方法の順応性は、抽出可能なフィブリノーゲンを含有する傾向にある種々の原材料に関し、この精製は、目標とされる治療的用途に意図される3つの考慮される濃縮物を生じる。
【0021】
本方法はまた、工程a)の前に、水酸化アルミニウムでの典型的な前処理によるおよび/または低温での沈殿による、前記可溶化血漿フラクションの初期プレ精製工程(initial prepurification step)を包含し得る。水酸化アルミニウムの添加は、第II因子(FII
)、第VII因子、第IX因子および第X因子(FX)のような望まれない蛋白質の除去を確実にする。この精製されたフラクションは、本発明の続いてのプロセス工程を行うために、使用されるまで凍結され得る。
【0022】
可溶化された血漿フラクションのクロマトグラフィー精製は、弱塩基型のアニオン交換体(anion exchangers)の基(例えば、DEAE)がグラフトされている、天然または合成ポリマー、樹脂またはゲルに基づく任意のマトリクスにおいて行われる。このタイプの典型的なクロマトグラフィー支持体は、商品名DEAE-Sepharose(登録商標)CL-6B、DEAE-Trisacryl LS、Fractogel TSK-DEAE 650MまたはS、DEAE-Macroprep(Bio-rad, France)
などで入手可能である。
【0023】
アニオン交換体の平衡化緩衝液(equilibrating buffer)は、所定のイオン強度を示し、そしてそのpH値は、アルカリ性範囲内になければならない。
【0024】
平衡化緩衝液は、典型的には0.2以下、そして好ましくは0.06〜0.2の値の範囲内のイオン強度を有する。より特別には、イオン強度は、0.08〜0.15の値の範囲内にある。それは、好ましくは、アルカリまたはアルカリ土類金属の無機塩あるいはそれらの混合物、最も好ましくはアルカリ金属の無機塩、特には塩化ナトリウムの添加によって調節される。
【0025】
平衡化緩衝液の最大pH値は、考慮されるプロダクトの変性を回避するようなもの、即ち、約10である。有利には、該pHは、7を超えて9まで、好ましくは7.5〜8.2の値の範囲内にある。例えば、この緩衝液は、7.9〜8.1のpHを有する0.06Mの濃度の塩化ナトリウムを含有し、そして非常に好ましくは、更に、0.011Mの好ましい濃度でクエン酸三ナトリウムを含む。適合性でありそして目的のプロダクトを変性させない、生物学的に活性な化合物を更に含む、塩化ナトリウムあるいはアルカリまたはアルカリ土類金属の無機塩に基づく他の緩衝液もまた、使用され得る。
【0026】
上記溶液がアニオン交換体へ適用されると、生物学的グルー(biological glue)が支
持体上に保持される。本方法は、前記生物学的グルー溶出工程の前に、保持されていない蛋白質および汚染物質が除去されるまで、前記平衡化緩衝液での前記アニオン交換体の洗浄工程を包含し得る。この洗浄工程は、支持体上でのこの緩衝液のパーコレーション(percolation)によって、該交換体上に保持されていないか弱く保持されている、フィブリ
ノーゲンを含有する溶液中に存在する蛋白質(例えば、免疫グロブリンG(IgG)、A(IgA)およびM(IgM)ならびにアルブミン)ならびに汚染物質(contaminants)(例えば、化学的ウイルス不活性化剤)が濾液中へ通過することを可能にする。洗浄時間は、280nmの波長での濾液の光学密度(OD)を測定することによって、決定される。実際には、ベースラインのそれに対応するODの値は、上述の化合物が有効に排除され
たという良好な指標である。
【0027】
ベースラインへ戻った後、生物学的グルーの溶出が、そのpHが好ましくは7.4〜7.6の値に設定される、平衡化または洗浄緩衝液のイオン強度の増加によって行われる。このイオン強度の値は、この値が考慮されるプロダクトの特性を変化させないことを確実にしつつ、生物学的グルーの効率的な溶出を得るという目的で選択される。有利には、イオン強度の値は、0.5〜1.3、特には0.9〜1.1の範囲内にある。このイオン強度の増加は、本明細書において上述された塩または塩の混合物、特に塩化ナトリウムの添加によって増加される。更に、溶出緩衝液は、クエン酸三ナトリウム(10〜12g/l)、リシン(1〜5g/l)、グリシン(1〜5g/l)、トリス塩(2〜5g/l)、アルギニン(25〜50g/l)およびイソロイシン(5〜15g/l)を含む、混合物Aと呼ばれる成分の混合物のような、更なる賦形剤を含有し得る。該溶出液中の蛋白質濃度は、約4g/lである。
【0028】
生物学的グルー溶出液の回収された量の少なくとも1つの部分は、フィブリノーゲンを伴うFXIIIを分離するために処理へ供される。この分離は、処理される溶出液への、化学
沈殿剤(chemical precipitating agent)(これは、所望の効果を得ることを可能にする濃度で水溶液の形態で存在し得る)の添加による、FXIIIの沈殿によって行われる。好ま
しいのは、例えばクエン酸ナトリウム、そして特にはクエン酸三ナトリウムのような、クエン酸塩1Mに基づく水溶液である。従って、FXIIIの沈殿物と、フィブリノーゲンに高
度に富む上澄みとが分離される。FXIII沈殿物の非常に効率的な回収は、5μmのフィル
ターにおける濾過によって達成され得る。
【0029】
そのように回収されたFXIII沈殿物は、好ましくは水または緩衝液中に、再可溶化され
る。特には、それは、そのpHが6.9〜7.1の範囲内にある、混合物Aの緩衝液中に溶解され、その結果、その濃度が、正常な血漿のそれよりも約100倍高い活性に対応するようになる。そのようなものとして、FXIII沈殿物は、例えば、その濃度が約1〜5g
の総蛋白質/lのものとなる様式で可溶化され得る。
【0030】
本発明によれば、生物学的グルー(生物学的グルー溶出液)およびフィブリノーゲン(フィブリノーゲンに富む上澄み)の溶液は、限外濾過によって、典型的に15〜25gの総蛋白質/lの含有量(当業者に周知の典型的な測定方法によって測定される)まで濃縮され得る。
【0031】
必要に応じて濃縮された、3つの得られたフィブリノーゲン、第XIII因子および生物学的グルー溶液は、ダイアフィルトレーション工程へ供される。この工程は、可能な過剰量の、一方で、0.2Mほどの高さのイオン強度を有する溶液を得るために使用した無機塩、および、他方で、再可溶化された沈殿物中に存在する沈殿剤を除去するように最初は意図される。生物学的グルーを溶出するために必要な、重要な量の無機塩の存在が、凍結乾燥プロセスの効率に対して、およびまた乾燥加熱によるウイルス不活性化に対して、そして好適なナノフィルターのウイルス保持能力に対して、悪影響を有し得ることに注意されるべきである。この工程はまた、必要であれば、好適な賦形剤、安定剤および保護剤を組み込むために必要であり得、これらは、一方で、変性の危険性を回避する、フィブリノーゲン、FXIIIおよび生物学的グルーの乾燥加熱を可能にし、そして、他方で、典型的には
3〜8分の時間での凍結乾燥プロダクトの迅速な可溶化を可能にすべきである。好ましいダイアフィルトレーション緩衝液は、本出願人によって出願された特許出願FR 04 02001
を参照して、混合物Aを含有し、そして6.9〜7.1の範囲内のpHを有する。
【0032】
本発明の他の利点は、本方法の他の好ましい実施形態に従って、混合物Aを含むダイアフィルトレーション緩衝液が生物学的グルー溶出緩衝液の成分として既に存在し得るとい
うことであることに、注意されるべきである。従って、ダイアフィルトレーションの実施は、簡略化されそして最適化されることになる。
【0033】
種々の組成のダイアフィルトレーション緩衝液もまた、要求に応じて、それらが上述の要件を満たす限り、使用され得る。
【0034】
本明細書において上述される限外濾過工程もまた、本方法のこの段階で同一条件下で行われ得る。
【0035】
必要に応じて濃縮された、必要に応じてダイアフィルトレートされた、それぞれの溶液は、典型的な方法によってそして現在の条件下で、即ち、−40℃〜−30℃の範囲内の温度で約48時間、凍結乾燥される。
【0036】
更に、本方法は、ウイルス不活性化ならびに/あるいはウイルスおよび上述の汚染物質(例えば、プリオン)除去処理の少なくとも1つの工程を包含し得る。この処理は、化学的ウイルス不活性化処理、ナノ濾過(nanofiltration)および乾熱ウイルス不活性化処理(dry heat viral inactivation treatment)からなる群から選択され得る。
【0037】
従って、この工程は、特許EP 0 131 740に記載の方法に従う、溶媒−洗浄剤処理(solvent-detergent treatment)から好ましくはなる、典型的な化学的ウイルス不活性化処理
によって行われ得る。好ましくは、ウイルス不活性化化学薬剤は、Tween(登録商標)−TnBPの混合物、より好ましくはTriton(登録商標)(オクトキシノール)−TnBPの混合物であり、これらの典型的な濃度は、それぞれ、0.3%(v/v)および1%(p/v)である。このウイルス不活性化は、本方法のいずれの段階においてでも組み込まれ得るが、それは、賢明には、クロマトグラフィー精製工程の工程a)の前に行われ得る。従って、それは、不活性化剤の効率的な除去に寄与する。
【0038】
本方法の好ましい実施形態において、ナノ濾過工程はまた、ウイルス、特に非エンベロープウイルス(non-enveloped viruses)および他の外因性汚染物質を除去して、事前の
化学的ウイルス不活性化処理を完全にするために、提供され得る。濾過時間およびウイルス保持の効率が最適化される限り、他のナノメーターフィルターが使用され得るが、35nmのフィルターが効率的には使用され得る。ナノ濾過は、工程a)において得られる溶出液を用いて、または、そういう場合が生じるならば、ダイアフィルトレートされたフィブリノーゲン、生物学的グルーおよび再可溶化されたFXIII溶液を用いて、凍結乾燥前に
行われる。クロマトグラフィー精製の化学的パラメータ、およびダイアフィルトレーションのそれらの賢明な選択は、その性能を変化させることなく、ナノ濾過を行うという順応性を可能にする。
【0039】
最後に、乾熱ウイルス不活性化処理(dry heat viral inactivation treatment)は、
前のウイルス不活性化および/または除去工程の少なくとも1つで不活性化および/または除去されなかった、非エンベロープウイルスを不活性化するために、凍結乾燥プロダクトフィブリノーゲン、生物学的グルーおよびFXIIIに対して、典型的な条件下、80℃で
72時間、行われ得る。
【0040】
更に、乾熱凍結乾燥プロダクトは、臨床使用に好適な水性媒体中において、好ましくは注射用精製水(PPI)中において、再構成され得、そして静脈注射のために直接使用され得る。
【0041】
更に、本発明の方法は、不溶性粒子を除去するための、少なくとも1つの透明化濾過(clarifying filtration)工程、および少なくとも1つの滅菌工程を包含し得、これらは
、例えば0.8〜0.1μmのフィルターを使用する現在の様式で行われる。特に、それらは、可溶化されたプレ精製された血漿フラクション、工程b)において得られた生物学的グルーの溶出液および/または問題の3つの化合物のダイアフィルトレートされた溶液に関する。
【0042】
従って、本方法を行うことによって、総蛋白質の含有量と比較して、約90%のフィブリノーゲンのぞれぞれの含有量を有する、凍結乾燥され、高度に精製された、生物学的グルーおよびフィブリノーゲン濃縮物が調製される。更に、該生物学的グルーおよびフィブリノーゲン濃縮物中の第XIII因子活性は、それぞれ、約5U/mlおよび約1.5U/mlである。
【0043】
得られる第XIII因子濃縮物は、汚染蛋白質(contaminating proteins)を含まず、そして、必要であれば、FXIII沈殿物の再可溶化によっておよび/または限外濾過後に得られ
る濃縮物に依存して、約30U/ml〜約700U/ml、好ましくは100U/ml〜400U/mlの値の範囲内の活性を示す。
【0044】
本発明はまた、それらがダイアフィルトレーション緩衝液成分の混合物(混合物A)を含むことを特徴とする、上記方法を実施することによって得られ得る、凍結乾燥されたフィブリノーゲン、生物学的グルーおよび第XIII因子濃縮物に関する。更に、該濃縮物は、本発明の方法へのウイルス不活性化ならびに/あるいはウイルスおよび汚染物質除去処理の少なくとも1つの工程の組み込みのために、治療品質のものであり得る。
【0045】
以下の実施例は、その範囲を限定することなく、本発明の1つの実施形態を例示する。
【実施例】
【0046】
1200 lのヒト寒冷沈降物欠乏血漿(human cryoprecipitate-depleted plasma)を使用する。この血漿を、血漿中の考慮されるエタノール濃度が8%(v/v)でありそして得られる混合物の温度が−3℃である様式で、当業者に公知の条件下で、Cohnの方法に従うエタノールでの沈殿へ供する。
【0047】
更に、このようにして得られた上澄みおよび沈殿物を、遠心分離へ供する。10kgの沈殿物が得られ、これは、純粋ではないCohnフラクションIである。
【0048】
純粋ではないCohnフラクションI(10kg)を、グリシン1M、クエン酸三ナトリウム0.055Mおよびエタノール6.5%(v/v)の混合物を含む、300lの緩衝液≪Blombach≫(pH6.8)で懸濁および洗浄する。
【0049】
遠心分離後、8kgの精製された沈殿物ペースト(精製されたCohnフラクションI)が回収され、次いで、塩化ナトリウム0.12M、クエン酸三ナトリウム0.010Mおよびアルギニン0.05Mの混合物から構成された60lの緩衝液(pH7.4)中に、37℃の温度で、溶解される。
【0050】
このようにして得られた沈殿物溶液を、次いで、沈殿物ペースト1kg当たり108gの割合、25℃の温度、および6.9〜7.1のpHで、アルミナゲルでのプレ−精製処理へ供する。
【0051】
プレ精製処理が達成されるとすぐに、溶液を、0.65μmのセルロース系繊維フィルター(cellulosic fibres filters)(Seitz、タイプK700)によるレンズ様透
明化濾過(lenticular clarifying filtrations)へ、そして0.2μmのフィルターで
の滅菌濾過へ、供する。
【0052】
このプレ精製された溶液を、EP 0 131 740に記載の方法に従って、それぞれ0.3%(v/v)および1%(p/v)の濃度の、Tween(登録商標)−TnBPの存在下での溶媒−洗浄剤による第一ウイルス不活性化処理に供する。
【0053】
このようにして処理されたプレ精製された溶液を、クエン酸三ナトリウム0.010M水溶液の必要量の添加によって、50%まで希釈する。
【0054】
このようにして得られたプレ精製された溶液は、フィブリノーゲンおよび共存する第XIII因子に加えて、更に、望まれない蛋白質(例えば、免疫グロブリンGおよびアルブミン)ならびに汚染物質(例えば、Tween(登録商標)−TnBP)を含有する。その有効な除去は、クロマトグラフィー工程によって行われる。
【0055】
このために、pH8.0へ調整された、塩化ナトリウム0.06Mおよびクエン酸三ナトリウム0.011Mから構成される緩衝液で予め平衡化された、アニオン交換ゲルDEAEMacroprep(Bio-rad, France)が充填されたクロマトグラフィーカラム上
へ、130〜150mosmolkg−1のオスモル濃度で、該プレ精製された溶液を注入する。これらの条件下、生物学的グルーを構成する、フィブリノーゲンおよび第XIII因子が、該支持体に保持される。同一の緩衝液での数回の引き続いての洗浄によって、該支持体に弱く保持されたまたは保持されていない蛋白質は、そしてTween(登録商標)およびTnBPも、濾液中に除去される。
【0056】
280nmで測定されるDOがベースラインに戻ったら、生物学的グルーを構成する、フィブリノーゲンおよび第XIII因子の溶出を、クエン酸三ナトリウム(11.2g/l)、リシン(2.0g/l)、グリシン(2.0g/l)、トリス塩(2.40g/l)、アルギニン(40g/l)およびイソロイシン(10g/l)から構成される混合物A’ならびに塩化ナトリウム1Mを含有する溶出緩衝液(pH7.5に調整される)によって、オスモル濃度>2000mosmolkg−1で行う。
【0057】
このようにして回収された精製生物学的グルー溶出液を、前の溶媒−洗浄剤処理によって不活性されなかったウイルスを除去するために、1mの表面を有する35nmのPLANOVAフィルター(Asahi, Japan)におけるナノ濾過によって処理する。該方法のこの段階
での総蛋白質含有量は、約4.0g/溶液lである。
【0058】
生物学的グルー溶出液の容量の50%を分離し、そしてクエン酸三ナトリウム1Mの溶液を、第XIII因子を沈殿させるために、残りの容量の溶出液へ添加する。第XIII因子の全量が沈殿されたことを確実にした後、5μmのSartopureフィルター(Sartorius - France)における濾過による単離および回収を行った。
【0059】
このようにして回収されたFXIII沈殿物を、約1g/lの割合で、注射用精製水中に可
溶化させる。
【0060】
生物学的グルー(溶出液)およびフィブリノーゲン溶液を、各溶液の蛋白質含有量が15g/lを達成する様式で、5mの表面を有するBiomax Milliporeフィルター100kDaにおける限外濾過によって濃縮する。
【0061】
上記で濃縮された溶液およびFXIIIの溶液を、pH6.9〜7.1、590〜610m
osmolkg−1のオスモル濃度で、上述の混合物A’に対してのダイアフィルトレーションについてそのとき使用したものと同じフィルターにおけるダイアフィルトレーションへ供し、塩化ナトリウムを除去することも可能となる。
【0062】
0.45〜0.2μmフィルターにおける滅菌濾過を行った後、100mlの各ダイアフィルトレートされた溶液を取り、そしてガラスバイアルへ入れ、−40℃〜−30℃の温度で約48時間凍結乾燥を行った。
【0063】
得られた凍結乾燥されたフィブリノーゲン、生物学的グルーおよび第XIII因子を、80℃で72時間の乾燥加熱によるウイルスウ活性化の最終工程へ供し、治療において使用される前に保存した。
【0064】
3つの連続バッチにおいて行った品質制御の結果を、以下の表に示す。
【0065】
【表1】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第XIII因子および、フィブリノーゲンおよび第XIII因子に基づく生物学的グルー(biological glue)を分離し、そして
該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法であって、以下の工程:
a)以下の工程を包含するクロマトグラフィー精製工程:
i)弱塩基型のアニオン交換体に該可溶化フラクションをロードする工程(該交換体は、アルカリ性pHの所定のイオン強度を有する緩衝液で予め平衡化されており、従って該生物学的グルーの保持を可能にする)、
ii)該緩衝液のイオン強度の増加による該生物学的グルーの溶出工程、
b)該FXIIIを沈殿させる少なくとも1つの化学薬剤の、該生物学的グルー溶出液の少
なくとも一部への添加による、フィブリノーゲンからのFXIIIの分離、および精製フィブ
リノーゲンの得られる上澄み溶液の回収工程、ならびに
c)該フィブリノーゲン、生物学的グルーおよび再可溶化FXIII溶液のダイアフィルト
レーション、続いての該溶液の凍結乾燥、
を包含する、方法。
【請求項2】
前記平衡化緩衝液が、0.2以下、そして好ましくは0.06〜0.2の値の範囲内のイオン強度を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記平衡化緩衝液のpHが、7を超えて9まで、好ましくは7.5〜8.2の値の範囲内にある、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
前記方法が、前記生物学的グルー溶出工程の前に、保持されていない蛋白質および汚染物質が除去されるまで、前記平衡化緩衝液での前記アニオン交換体の洗浄工程を包含する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
前記生物学的グルー溶出が、そのpHが7.4〜7.6の値に設定された、0.5〜1.3、特には0.9〜1.1の範囲内のイオン強度を有する平衡化緩衝液で行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項6】
前記溶出緩衝液が、更に、10〜12g/lのクエン酸三ナトリウム、1〜5g/lのリシン、1〜5g/lのグリシン、2〜5g/lのトリス、25〜50g/lのアルギニンおよび5〜15g/lのイソロイシンの混合物を含有する、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
前記FXIIIを沈殿させる化学薬剤が、クエン酸塩1Mに基づく水溶液の形態で存在する
、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項8】
前記FXIIIの沈殿物が、6.9〜7.1のpHの、10〜12g/lのクエン酸三ナト
リウム、1〜5g/lのリシン、1〜5g/lのグリシン、2〜5g/lのトリス、25〜50g/lのアルギニンおよび5〜15g/lのイソロイシンの混合物を含有する緩衝液中にあるいは水中に再可溶化される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項9】
前記ダイアフィルトレーションが、請求項8に記載の緩衝液に対して行われる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項10】
化学的ウイルス不活性化処理、ナノ濾過(nanofiltration)および乾熱ウイルス不活性化処理からなる群から選択される、ウイルス不活性化ならびに/あるいはウイルスおよび汚染物質除去処理の少なくとも1つの工程を包含する、請求項1〜9のいずれか1項に記
載の方法。
【請求項11】
前記化学的ウイルス不活性化処理が工程a)の前に行われる、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
前記化学的ウイルス不活性化処理が、Tween(登録商標)−TnBPまたはTriton(登録商標)−TnBPの混合物であるウイルス不活性化化学薬剤によって行われる溶媒−洗浄剤処理(solvent-detergent treatment)からなる、請求項10または11
に記載の方法。
【請求項13】
前記ナノ濾過が、工程a)において得られる溶出液を用いて、あるいは前記ダイアフィルトレーションされたフィブリノーゲン、生物学的グルーおよび再可溶化FXIII溶液を用
いて、凍結乾燥前に行われる、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項14】
前記乾熱ウイルス不活性化処理が、前記凍結乾燥プロダクト フィブリノーゲン、生物学的グルーおよびFXIIIについて行われる、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方
法。
【請求項15】
限外濾過による濃縮工程が、前記ダイアフィルトレーションの工程の前あるいは該工程に続いて、凍結乾燥前に行われる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項16】
工程a)の前に、水酸化アルミニウムでの典型的な前処理によるおよび/または低温での沈殿による、前記可溶化血漿フラクションの初期プレ精製工程を包含する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項17】
請求項8に記載のダイアフィルトレーション緩衝液成分の混合物を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によって得られ得る、凍結乾燥フィブリノーゲン濃縮物。
【請求項18】
請求項8に記載のダイアフィルトレーション緩衝液成分の混合物を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によって得られ得る、凍結乾燥生物学的グルー濃縮物。
【請求項19】
請求項8に記載のダイアフィルトレーション緩衝液成分の混合物を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によって得られ得る、凍結乾燥FXIII濃縮物。
【請求項20】
請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法を行うことによって得られる、治療品質の、請求項17〜19のいずれか1項に記載の凍結乾燥濃縮物。

【公開番号】特開2013−47273(P2013−47273A)
【公開日】平成25年3月7日(2013.3.7)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−255331(P2012−255331)
【出願日】平成24年11月21日(2012.11.21)
【分割の表示】特願2006−173765(P2006−173765)の分割
【原出願日】平成18年6月23日(2006.6.23)
【出願人】(500280870)ラボラトワール、フランセ、デュ、フラクショヌマン、エ、デ、ビオテクノロジ (12)
【氏名又は名称原語表記】LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES
【Fターム(参考)】