合成された哺乳動物のレトロトランスポゾン遺伝子
本発明は、天然のトランスポゾン及びレトロトランスポゾン遺伝子と比較して、高い発現レベルを示す合成のトランスポゾン及びレトロトランスポゾン遺伝子に関する。本発明はさらに、このような合成遺伝子を包含するトランスポゾン及びレトロトランスポゾンに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／４７３，６５８号の利益を主張するもので、その全ては参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
トランスポゾンは、プラスミド、ウイルス及び細菌の染色体に共通する構成因子である、個別の可動遺伝因子（ＤＮＡ）である。これらの因子は、自身をコードする表現型特性を、レプリコンからレプリコンへと転位させる能力、又は、公知の遺伝子へと転位しそれを不活性化する能力によって検出される。トランスポゾンには２つのタイプがあり、大きさは約７５０から５０，０００ヌクレオチド塩基対以上にも及ぶ。小さな挿入配列又はＩＳ因子として知られる一つのタイプでは、如何なる公知の表現型特性もコードしてはいない。もう一方のタイプでは抗菌耐性等の表現型特性をコードする比較的大きなユニットを含んでいる（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃ．Ｓｔｕｔｔａｒｄ ａｎｄ Ｋ．Ｒｏｚｅｅ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐａｇｅｓ１６５−２０５）。トランスポゾン又は転位因子は、反復配列が結合した核酸の一部分を含むものである。活性なトランスポゾンは、ＤＮＡ配列に核酸を組込むのを助ける酵素をコードする。
【０００３】
脊椎動物において、ＤＮＡトランスポゾン、すなわちＤＮＡの媒介によって移動する可動性因子の発見は、比較的最近のことである（Ｒａｄｉｃｅ，Ａ．Ｄ．ら，１９９４．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４ ６０６−６１２）。それ以来、真核生物トランスポゾンのｈＡＴ（ｈｏｂｏ／Ａｃ／Ｔａｍ）スーパーファミリーと同様、不活性で、高度に変異したＴｃｌ／ｍａｒｉｎｅｒのメンバーが、魚類の異なる種、アフリカツメガエル、ヒトのゲノムから単離された（Ｏｏｓｕｍｉら，１９９５．Ｎａｔｕｒｅ３７８，８７３；Ｉｖｉｃｓら，１９９５．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４７ ３１２−３２２；Ｋｏｇａら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８３，３０；Ｌａｍら，１９９６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５７，３５９−３６６及びＬａｍ，Ｗ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１０８７０−１０８７５）。
【０００４】
レトロトランスポゾンは、現在までに試験されたほとんど全ての動物、植物、細菌種の細胞で見出される、天然のＤＮＡ因子である。それらは、細胞内で発現し、染色体外因子に逆転写され、同じゲノム内の他の部位に再度組込まれる。
【０００５】
レトロトランスポゾンは、レトロウイルス様のＬＴＲレトロトランスポゾンと、ヒトＬ１因子、アカパンカビＴＡＤ因子（Ｋｉｎｓｅｙ，１９９０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２６：３１７−３２６）、ショウジョウバエのＩ因子（Ｂｕｃｈｅｔｏｎ ら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：１５３−１６３）、及びカイコのＲ２Ｂｍ（Ｌｕａｎ ら，１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：５９５−６０５）等の非ＬＴＲ因子の２つのクラスに分けることができる。レトロトランスポゾンのこれら２つのタイプは、構造的に異なり、また根本的に異なるメカニズムでレトロトランスポーズする。
【０００６】
ＬＴＲレトロトランスポゾンとは異なり、非ＬＴＲ因子（ポリＡ因子とも呼ばれる）はＬＴＲを欠き、代わりに末端はポリＡ又はＡに富んだ配列となっている。ＬＴＲレトロトランスポゾンの転位メカニズムは比較的よく理解されている。対照的に、非ＬＴＲレトロトランスポゾンによる転位メカニズムは解明が始まったところである（Ｌｕａｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３８８２−３８９１；Ｌｕａｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：５９５−６０５）。非ＬＴＲレトロトランスポゾンはさらに配列特異的な及び非−配列特異的なタイプに分けることができる。Ｌ１は、ヒト、マウス及び他の哺乳動物全ての染色体において散在的に組込まれていることが見出された、後者のタイプに属する。
【０００７】
Ｌ１因子（ＬＩＮＥとしても知られる）はヒトゲノムへの定着に極めて成功している。初期の概算では、Ｌ１はヒトゲノム中に１００，０００コピー存在し、核ＤＮＡの５％を構成すると、見られていた（Ｆａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ，１９８７，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９１０：２０３−１２１）。しかしながら、最近の研究によれば、８５０，０００もの多くのＬ１がヒトゲノム中に存在するようである（Ｓｍｉｔら，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）。これらコピーの大部分は５’末端が切り詰められていて、欠陥があると推定されている。完全な長さの因子と同様に、５’末端が切り詰められているコピーもしばしば短い標的部位との重複（ＴＳＤｓ）によって挟まれている。
【０００８】
完全長６．１ｋｂのＬ１コンセンサス配列は、以下の保全機構（conserved organization）：内部プロモーターを有する５’非翻訳リーダー領域（ＵＴＲ）、２つの重複していないＯＲＦ（ＯＲＦ１及びＯＲＦ２）、２００ｂｐの３’ＵＴＲ及び３’ポリＡテイル、を示している。ＯＲＦ１は４０ｋｄタンパク質をコードし、ＲＮＡに対してパッケージング機能を提供しているようである（Ｍａｒｔｉｎ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：４８０４−４８０７；Ｈｏｈｊｏｈら，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：６３０−６３９）。一方、ＯＲＦ２は逆転写酵素をコードしている（Ｍａｔｈｉａｓら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０８−１８１０）。ＯＲＦ１タンパク質、そしておそらくＯＲＦ２タンパク質もＬ１ ＲＮＡと結合し、リボ核タンパク質の粒子を形成する。ＯＲＦ２タンパク質による逆転写が起こり、Ｌ１ ｃＤＮＡが生じ、そして、そのＬ１ ｃＤＮＡがゲノムに組込まれる（Ｍａｒｔｉｎ，１９９１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１：５０５−５０８）。さらに、Ｌ１因子は通常、７から２０ｂｐのＴＳＤによって挟まれている。完全長のＬ１及び他の非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、レトロウイルスインテグラーゼ、プロテアーゼ及びＲＮアーゼＨと認識されるホモログを欠いている。この因子群においては、ＬＴＲレトロトランスポゾンとは根本的に異なる転位メカニズムが採用されている。
【０００９】
ヒトＬ１因子の幾つかは、ヒトゲノムの新たな部位へ、レトロトランスポーズ（発現し、それらの標的部位を切断し、切断された標的部位をプライマーとして用いて自身のＲＮＡを逆転写すること）可能であり、遺伝的な疾患を引き起こす。例えば、生殖細胞系列に於けるＶＩＩＩ因子及びジストロフィン遺伝子へのＬ１挿入は、それぞれ血友病Ａ及び筋ジストロフィーを引き起こす（Ｋａｚａｚｉａｎら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：１６４−１６６；Ｎａｒｉｔａら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１８６２−１８６７；Ｈｏｌｍｅｓら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１４３−１４８）。一方、体細胞でのｃ−ｍｙｃ及びＡＰＣ腫瘍抑制遺伝子へのＬ１挿入は、それぞれ乳癌及び結腸癌の珍しい例に関与する（Ｍｏｒｓｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３３：８７−９０；Ｍｉｋｉら，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：６４３−６４５）。Ｌ１レトロトランスポゾンは、直接又は間接に、質量によって（Ｌａｎｄｅｒら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：８６０−９２１）、Ａｌｕ因子の自己動員及びトランス動員によって（Ｄｅｗａｎｎｉｅｕｘら，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３５：４１−４８）、哺乳動物のゲノムの３０％以上を占めいている。完全な長さ（約６ｋｂ）のＬ１は、レトロトランスポーズするためのタンパク質をコードする２つのオープンリーデングフレーム、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２から成る（Ｆｅｎｇら，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７：９０５−９１６；Ｍｏｒａｎら，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７：９１７−９２７）。
【００１０】
このように、高度に活性なＬ１因子は、哺乳動物の遺伝学に於ける手段（tool）として有望な有用性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の要約）
一態様に於いては、本発明は、合成されたトランスポゾン遺伝子に関する。別の態様に於いては、本発明は、合成された哺乳動物のトランスポゾン遺伝子に関する。
【００１２】
本発明者らは、合成されたトランスポゾン及びレトロトランスポゾン遺伝子が遺伝子治療への応用及び本明細書に記載の他の遺伝学的な応用に有用であることを見出した。
【００１３】
更なる態様では、本発明は、合成されたレトロトランスポゾン遺伝子に関するものである。本発明の更なる態様は、哺乳動物の合成されたレトロトランスポゾン遺伝子を提供することである。
【００１４】
一態様では、本発明は、合成されたＯＲＦ２遺伝子に関する。別の態様では、本発明は、合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子に関する。合成遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子に比較してより高レベルな発現を示す。
【００１５】
一態様では、本発明は、合成されたＯＲＦ１遺伝子に関する。別の態様では、本発明は、合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子に関する。合成遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子に比較してより高レベルな発現を示す。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、ヒトと関連のあるコドンを含む合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子に関する。本発明の更なる態様は、合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子は、ヒトと関連のあるコドンのみを含む。これらの態様では、ヒトと関連のあるコドンとは、高度に発現される哺乳動物の遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンを指す。注目すべきは、それぞれのアミノ酸をコードする２又はそれ以上のこのようなコドンがしばしば存在し、それゆえ多くの可能な合成因子が存在しうるのである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、配列番号１を含む合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、配列番号２を含む合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、配列番号３を含む合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、配列番号４を含む合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、合成されたトランスポゾン遺伝子を含むトランスポゾンに関する。別の態様では、本発明は、合成されたレトロトランスポゾン遺伝子を含むレトロトランスポゾンに関する。更なる態様では、本発明は、合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子を含むＬ１レトロトランスポゾンに関する。別の態様では、本発明は、合成されたＯＲＦ２及び合成されたＯＲＦ１遺伝子を含むＬ１レトロトランスポゾンに関する。本発明の更なる態様は、合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子、合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子、又は合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子及び合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子の両者を含む哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾンを提供する。レトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンと少なくとも同程度の効率でレトロトランスポーズする。本発明の更なる態様では、レトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする。
【００２２】
別の態様では、本発明は合成されたＯＲＦ２遺伝子を含むリコンビナントベクター構築物を提供する。別の実施例では、本発明は合成されたＯＲＦ１遺伝子を含むリコンビナントベクター構築物を提供する。別の態様では、本発明は合成されたＯＲＦ２遺伝子及び合成されたＯＲＦ１遺伝子を含むリコンビナントベクター構築物を提供する。これらの構築物で形質導入され、形質転換され又は感染された真核細胞が同様に提供される。
【００２３】
更なる態様では、本発明は、合成のＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子を調製するための方法を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、望ましい遺伝子又はその生物学的に活性な断片を哺乳動物の細胞へ送達する方法に関する。本発明の方法は、該哺乳動物へ、合成されたＯＲＦ２若しくはＯＲＦ１遺伝子、又はそれらの組合せを望ましい遺伝子と共に投与することを包含する。
【００２５】
本発明の更なる態様は、合成されたＯＲＦ２若しくはＯＲＦ１遺伝子、又はそれらの組合せ、並びに望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体を含むカセットを更に含んで成る組成物を提供する。別の態様では、本発明は、哺乳動物の遺伝的な疾患を治療する方法に関する。本発明の方法は、問題の遺伝的な疾患を有する哺乳動物へ、合成されたＯＲＦ２若しくはＯＲＦ１遺伝子、又はそれらの組合せ、並びに望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを包含する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、特徴付けされていない遺伝子又はそれらの生物学的に活性な断片を細胞中で同定する方法に関する。本発明の方法は、合成されたＯＲＦ２若しくはＯＲＦ１遺伝子又はそれらの組合せ及び検出可能なタグ配列を投与すること、並びにタグ配列を発現する細胞を同定すること及びタグ配列に隣接するＤＮＡを特徴付けることを包含する。
本発明の他の態様は、以下に開示される。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本明細書は、合成されたトランスポゾン遺伝子を開示する。さらに、本明細書は、合成された哺乳動物のトランスポゾン遺伝子を開示する。加えて、本明細書は、合成されたレトロトランスポゾン遺伝子を開示する。さらに、本明細書は、合成された哺乳動物のレトロトランスポゾン遺伝子を開示する。
【００２８】
合成されたレトロトランスポゾンは、一態様では、天然のレトロトランスポゾンと少なくとも同様の効率でレトロトランスポーズする。別の態様では、合成されたレトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明の合成レトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより約２倍以上効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明の合成レトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより約２５倍以上効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明の合成レトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより約１００から２００倍以上効率よくレトロトランスポーズする。
【００２９】
合成トランスポゾンは、一態様で、天然のトランスポゾンと少なくとも同様の効率で転位する。別の態様では、合成トランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより効率よく転位する。更に別の態様では、本発明の合成トランスポゾンは、天然のトランスポゾンより約２倍以上効率よく転位する。更に別の態様では、本発明の合成トランスポゾンは、天然のトランスポゾンより約２５倍以上効率よく転位する。更に別の態様では、本発明の合成レトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより約１００から２００倍以上効率よく転位する。
【００３０】
本明細書は、合成されたＯＲＦ２遺伝子を開示する。一態様では、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子は、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、昆虫等の脊椎動物のものである。一態様では、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子は、マウス（murine）、ウシ、ウマ等の哺乳動物のものである。合成遺伝子の一態様は、ヒトに対して最適なコドンを使用するのみならず、発現量が低い原因となるおそれがある核酸配列の偏りを無くしている。
【００３１】
一態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子と比較して、より高レベルの発現を示す。
【００３２】
本発明の別の態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然の遺伝子と同じタンパク質をコードしており、更にヒトに関連したコドンをも含んでいる。
本発明の別の態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、ヒトに関連したコドンのみを含んでいる。「ヒトに関連したコドン」とは、高度に発現される哺乳動物の遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンを指す。当業者であれば、どのコドンが特定の遺伝子で最も頻繁に関連付けられているか決定することができる。注目すべきは、それぞれのアミノ酸をコードする２又はそれ以上のこのようなコドンがしばしば存在し、それゆえ多くの可能な合成因子が存在しうることである。例えば、それぞれのアミノ酸に対するヒトに関連したコドンは、以下を含んでいてもよい。アラニンＧＣＣ、アルギニンＣＧＣ又はＣＧＧ、アスパラギンＡＡＣ、アスパラギン酸ＧＡＣ、システインＴＧＣ、グルタミンＣＡＧ、グルタミン酸ＧＡＧ、グリシンＧＧＣ又はＧＧＧ、ヒスチジンＣＡＣ、イソロイシンＡＴＣ、ロイシンＣＴＧ又はＣＴＣ、リジンＡＡＧ、メチオニンＡＴＧ、プロリンＣＣＣ、フェニルアラニンＴＴＣ、セリンＡＧＣ又はＴＣＣ、トレオニンＡＣＣ、トリプトファンＴＧＧ、チロシンＴＡＣ、及び、バリンＧＴＧ又はＧＴＣ。
【００３３】
一態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子の配列と１００％の相同性を示すＤＮＡ配列は有していない。別の態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子の配列と約９０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。別の態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子の配列と約８０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。
【００３４】
別の態様では、合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子は、配列番号１と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。更に別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子は、配列番号１を包含する。
【００３５】
さらに本明細書は、合成されたＯＲＦ１遺伝子を開示する。本発明の別の態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、昆虫等の脊椎動物のものである。本発明の別の態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、マウス、ウシ、ウマ等の哺乳動物のものである。本発明の更なる態様では、合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子と比較して、より高レベルの発現を示す。
【００３６】
本発明の別の態様では、合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然の遺伝子と同じタンパク質をコードしているが、ヒトに関連したコドンをも含んでいる。本発明の別の態様では、合成されたＯＲＦ１遺伝子は、ヒトに関連したコドンのみを含んでいる。
【００３７】
一態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子の配列と１００％の相同性を示すＤＮＡ配列は有していない。別の態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子の配列と９０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。別の態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子の配列と約８０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。
【００３８】
別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子は、配列番号２と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。更に別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子は、配列番号２を包含する。
【００３９】
別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子は、配列番号３と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。更に別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子は、配列番号３を包含する。
【００４０】
別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子は、配列番号４と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。更に別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子は、配列番号４を包含する。
【００４１】
一態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子はヒトのものである。本発明の別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子はヒトのものである。
【００４２】
一態様に於いて、本発明の合成トランスポゾン遺伝子を包含するトランスポゾンが提供される。別の態様に於いて、本発明の合成レトロトランスポゾン遺伝子を包含するレトロトランスポゾンが提供される。
【００４３】
更なる態様に於いて、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子を包含するＬ１レトロトランスポゾンが提供される。更なる態様に於いては、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子を包含するＬ１レトロトランスポゾンが提供される。更に別の態様は、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子及び本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子の両者を包含するＬ１レトロトランスポゾンを提供する。トランスポゾン又はレトロトランスポゾンは、一態様では、天然のトランスポゾン又はレトロトランスポゾンと少なくとも同様の効率で、それぞれトランスポーズ又はレトロトランスポーズする。別の態様では、トランスポゾン又はレトロトランスポゾンは、天然のトランスポゾン又はレトロトランスポゾンより効率よく、それぞれトランスポーズ又はレトロトランスポーズする。
【００４４】
更なる態様に於いて、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子を包む哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾンが提供される。更なる態様に於いては、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子を包む哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾンが提供される。更に別の態様は、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子及び本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子の両者を含む哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾンを提供する。哺乳動物のレトロトランスポゾンは、一態様では、天然のＬ１レトロトランスポゾンと少なくとも同様の効率でレトロトランスポーズする。別の態様では、哺乳動物のレトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明のレトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約２倍以上効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明のレトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約２５倍以上効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明のレトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約１００から２００倍以上効率よくレトロトランスポーズする。
【００４５】
更なる態様に於いて、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子を包むリコンビナントベクター構築物が提供される。本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子を包むリコンビナントベクター構築物が更なる態様で提供される。本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子及び本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子の両者を含むリコンビナントベクター構築物が更なる態様で提供される。リコンビナントベクターは、化学的に結合されたもの；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ポリオーマ性ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、パルボウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイスル、ポックスウイルス等の（ＤＮＡ又はＲＮＡ）ウイルスベクター；融合タンパク質；プラスミド；ファージから選択されてもよいがそれらに限定はされない。ベクター配列は自然に生じた真核細胞のウイルス因子に限定される必要はない。哺乳類の人工染色体を含む人工染色体も本発明の範囲のものとする。
【００４６】
一態様では、目的のプラスミドは、天然のｍＯＲＦ２配列を、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子のＤＮＡ配列で置き換えたｐＣＥＰ４である。
【００４７】
本発明のリコンビナントベクター構築物は、天然のベクターで観察されのよりも、より頻繁にレトロトランスポーズする。一態様では、本発明の構築物は、天然のベクターで観察されるより約２から約１００倍の頻度でレトロトランスポーズする。
【００４８】
別の態様に於いて、本発明のリコンビナントベクター構築物によって形質導入、形質転換又は感染された真核細胞が提供される。
【００４９】
本発明の合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子の調製方法を提供する。一態様では、本発明の方法は、「ヒトに関連したコドン」を含む本発明の合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子の調製を包含する。別の態様では、本発明の方法は、「ヒトに関連したコドン」のみを含む本発明の合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子の調製を包含する。別の態様では、本発明の方法はさらに、約４００から約６００塩基対の間隔でユニークな制限酵素部位を組み込む工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、１つ以上のユニークな制限酵素部位を有する核酸配列からなる３’非翻訳領域を再合成するか、又は細胞の遺伝子の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）を使用する工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、前記配列のセンス及び相補鎖の両者について約３０塩基対から約９０塩基対の長さのオリゴヌクレオチドを設計する工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、それぞれの長さが約４００から約６００塩基対である約６から約１２個のＤＮＡフラグメントを合成するためにオリゴヌクレオチドを使用する工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、前記フラグメントのそれぞれに対応するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むほぼ等モル濃度の混合物を使用するＰＣＲを実施する工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、完全な遺伝子を作成するために、ユニークな制限酵素部位を使用してＰＣＲにより得られたフラグメントをサブクローニングする工程を包含する。
【００５０】
合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子は、「ヒトに関連したコドン」を含むように調製されてもよい。結果として得られる核酸配列は、およそ５００塩基対間隔でユニークな制限酵素部位が組み込まれるように、さらに改変されていてもよい。さらに、３’非翻訳領域は、サブクローニングを容易にするために、複数のユニークな制限酵素部位で再合成されてもよい。オリゴヌクレオチドは、この新しい配列の両方の鎖を完全にカバーするように設計されてもよく、例えば、約３０から約９０塩基対のオリゴヌクレオチドが設計されてもよい。約６５℃より高い融解温度を有するこれらのオリゴヌクレオチド内のヘアピン構造（例えば、コンピュータープログラムＯｌｉｇｏ５．０で予測されるような）は、アミノ酸配列を保存する突然変異で破壊されるであろう。これらの突然変異は、最適なコドンをそれより劣る改変されたコドンへと変更するであろう。
【００５１】
結果として得られる最適化されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１核酸配列は、その後修飾されたポリメラーゼ連鎖反応（Ｓｔｅｍｍｅｒら，１９９５，Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３）に供されてもよい。例えば、約４０塩基対から約８０塩基対のセンス鎖全体をカバーするオリゴヌクレオチドが合成されてもよい。相補鎖もまた、センス鎖オリゴヌクレオチドに対して約３０塩基対ずらして、約４０塩基対から約８０塩基対のオリゴヌクレオチドで、合成されてもよい。オリゴヌクレオチドは、相補鎖由来の２つのオリゴヌクレオチドからなる、約２０から約５０塩基対のハイブリッドであってもよい。これらのオリゴヌクレオチドを使用して、ＯＲＦ２又はＯＲＦ１核酸配列は、それぞれの長さが約４００から約６００塩基対である約６から約１２個の間のフラグメントとして合成されてもよい。それぞれのフラグメントに対応するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ほぼ等モル量で混合されてもよく、ＰＣＲ反応が実施されてもよい。例えば、２５サイクルの会合ＰＣＲを行ってもよい。他のＰＣＲサイクルが実施されてもよく、本明細書で開示される利益を享受する当業者であれば、目的に応じて最適なサイクル数を決定することが可能である。この会合反応物は、例えば、増幅プライマーとしてのフラグメントである最も外側のオリゴヌクレオチドを含んでいるＰＣＲ反応物中に希釈されてもよい。
【００５２】
結果として得られるフラグメントは、例えば、別々にプラスミド中にクローン化され、約２０−３０クローンはそれぞれ配列決定されてもよい。標準的なサブクローニングの手順に従って、オリゴ合成、会合又はＰＣＲの際に導入された突然変異は取り除かれてもよい。結果として得られるフラグメントは、あらかじめ配列中に設計されているユニークな制限酵素部位を使用してサブクローニングされ、プラスミド中に、最適化された完全なＯＲＦ２又はＯＲＦ１核酸配列を作成する。
【００５３】
哺乳動物の細胞中に、望ましい遺伝子又はそれらの生物学的に活性なフラグメントを送達する方法は、同様に、本発明の態様中で提供される。本発明の一態様では、望ましい遺伝子は、治療のための遺伝子である。本発明は、本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子を哺乳動物へ投与することを包含する。遺伝子治療の方法もまた、本発明の態様に従って意図されている。レトロトランスポジションで遺伝子治療を通して送達される遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、チロシン水酸化酵素、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子−１−優性抑制阻害剤（Ａｐａｆ−１−ＤＮ）、アルファ−ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡ）を含むがそれらに限定されるものではない。レトロトランスポジションを用いる遺伝子治療に於いて標的とさる障害及び／又は疾病は、血友病、パーキンソン病、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、ゴーシェ病、嚢胞性繊維症及び副腎白質ジストロトフィー、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＳＣＩＤ）、アルファ−抗トリプシン欠損症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ−サックス病及びサラセミア、を含むがそれらに限定されない。
【００５４】
別の態様は、本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体からなるカセットを含む組成物を提供する。一態様では、カセットは細胞のゲノムに挿入されてもよい異種又は同種のＤＮＡ（Ｌ１ ＤＮＡではない）を包含していてもよい。このＤＮＡは、３’ＵＴＲ配列内、又は３’ＵＴＲとポリＡシグナルの間に、ＤＮＡの発現がプロモーターに制御されるよう部位に配置されてもよい。挿入されるＤＮＡの種類は、挿入部位を同定するためのマーカーとして機能するＤＮＡ、例えば、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子又は他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ｚｅｏ、ｈｙｇｒｏ、ｇｐｔ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ｌａｃＺ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子、及び、限定はされないがＴ細胞受容体遺伝子等の細胞表面受容体遺伝子も含むが、それらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明に従った組成物の投与経路も、治療される疾患によって異なってもよい。組成物は、従来の方法（例えば、経口、非経口、経皮又は粘膜を通して）のうちの１つの形態、生分解性で生物学的適合性のあるポリマーを用いた持効性の製剤で、又は、ミセル、ゲル及びリポソームを用いた現場への送達によって患者に投与されてもよいし、又は、直腸へ（例えば、座薬又は浣腸によって）投与されてもよい。一態様では、肺感染症の患者の治療には、例えばエアロゾルによる鼻腔内への送達であるか、血管を通して投与されてもよい。適した薬学的に許容される担体は、当業者に明らかであり、投与経路に大いに依存するであろう。
【００５６】
本発明の一態様では、プロモーターが以下から選択されるかもしれないが、それらに限定されない。アクチン、ＰＧＫ、ＤＮＡｐｏｌＩＩ又はユビキチンプロモーター等のハウスキーピングプロモーターのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、アルブミン、グロビン、オボアルブミンプロモーター配列等の組織特異的プロモーター、Ｋ１２又はＫ１４等の皮膚特異的プロモーター、ステロイド誘導プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター等の誘導プロモーターなど、及び、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及びサイトメガロウイルス極初期プロモーター（ＣＭＶ）等と同様に、Ｌ１因子プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及び５ＳＲＮＡプロモーター等の他のレトロウイルスＬＴＲ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター等のウイルスプロモーター。望ましいＤＮＡの最適な発現を提供するプロモーターの種類は、望まれる結果に依存するであろうし、当業者に明らかであろう。
【００５７】
細胞内でのレトロトランスポジションと、その結果である望ましいＤＮＡの細胞ゲノム中への挿入を達成するため、本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子からなるカセットは、細胞によるＤＮＡの取り込みが達成されるのに適した組成物で細胞集団へ添加されてもよい。例えば、リコンビナントベクターがプラスミドである場合、インビトロでの細胞へのトランスフェクションに際して、カルシウムリン酸トランスフェクション混合物、リポソームトランスフェクション製剤等を含むがそれらに限定されない多数の製剤によって、カセットが細胞に添加されてもよい。この種のトランスフェクションの手順は、当業界で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら,（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。前記カセットは、カセットに適応した組換えＤＮＡ技術を用いて製造され、望ましい細胞にカセットを送達するのに適したウイルスの形で細胞に添加されてもよい。
【００５８】
宿主細胞ＤＮＡの不活化領域にＤＮＡの挿入をするために、ＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１タンパク質が特に害のない配列、例えばリボソームＲＮＡ遺伝子配列中で、宿主細胞ＤＮＡを切断するようにそれらを改変することが可能である。あるいは、ＯＲＦ２又はＯＲＦ１のエンドヌクレアーゼドメインを、特に害のない配列で特異的にＤＮＡを切断する別の酵素のドメインで置換することが可能である。このような酵素は、アデノ随伴ウイルスのｒｅｐ遺伝子及びあるグループＩイントロンにコードされる部位特異的なエンドヌクレアーゼ、例えば酵母ミトコンドリアＳＣＥ１遺伝子の普遍的なコード等価物を含むがそれらに限定はされない。
【００５９】
別の態様では、カセットに含まれるＤＮＡは、挿入される細胞中の遺伝学的な欠陥を修正するのに有用である。このような遺伝学的な欠陥の修正に使用することができるＤＮＡは、細胞内で突然変異し、その結果として遺伝学的な欠陥を引き起こした遺伝子の野生型又はその派生物を含む。このようなＤＮＡは、欠陥を有する細胞で遺伝学的な欠陥を修正するのに使用できる公知の又は未知の如何なるＤＮＡも限定されることなく包含するものである。このようなＤＮＡの例は、嚢胞性線維症膜貫通伝導性調節因子（ＣＦＴＲ）をコードするｃＤＮＡ、ベータグロビンをコードするｃＤＮＡ、血液凝固タンパク質をコードするｃＤＮＡ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）等（これらに限定はされないが）の酵素をコードするｃＤＮＡ、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６、網膜芽腫、ウィルムス腫瘍等（これらに限定されないが）このような癌で役割を果たすｃＤＮＡ、そしてまた、サイトカイン、インターロイキン及び治療用のペプチドをコードする遺伝子等が含まれる。
【００６０】
したがって、一態様では、本発明は哺乳動物における遺伝的な障害を治療するための方法を提供し、そこでは、本発明の方法は本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体からなるカセットを含む組成物を前記の遺伝的な障害を有する哺乳動物に投与することを包含する。
【００６１】
別の態様では、本発明は、動物において遺伝学的な欠陥を修正することに関する。更に関連する態様に於いては、哺乳動物及び、より好ましくはヒトが意図されている。動物の遺伝学的な欠陥を修正するために、上述した遺伝子送達の方法は、望ましい遺伝子又はその生物学的に活性なフラグメントをレトロトランスポジションによって遺伝学的な欠陥を有する動物の細胞に送達することに基づく本発明に包含される。治療する動物に於けるインビボでの細胞内のレトロトランスポジションを達成するために、本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子を含むカセットは、当業界で公知の技術、例えば、参照により本明細書に取り込まれている国際公開第９４／２８９３８号及び米国特許第５，２４０，８４６号に記載される技術を用いて動物に投与される。本明細書に記載の組成物を動物に投与することにより、標的とされた細胞にカセットが取り込まれ、次いでレトロトランスポジションを引き起こす。
【００６２】
レトロトランスポジションを用いて修正される遺伝学的な欠陥は、嚢胞性線維症、ジストロフィン遺伝子の突然変異、血液凝固に関連する遺伝学的な欠陥及びその他の公知又は未知の遺伝学的な欠陥（例えば、リソソーム蓄積症及び他の代謝性疾患）を含むがそれらに限定はされない。
【００６３】
更に別の態様では、未だ特徴付けられていない遺伝子又はそれらの生物学的に活性なフラグメントを細胞中で同定するための方法が提供されるが、当該方法は、本発明の合成ＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び検出可能なタグ配列を投与し、そのタグ配列を発現している細胞を同定し、そのタグ配列に隣接するＤＮＡを単離して特徴付ける方法である。別の態様では、本発明の方法は未だに知られていない又はクローン化できていない遺伝子をクローニングすることを包含してもよい。「タグ」ＤＮＡは、ｎｅｏＲ、ＧＦＰ遺伝子、ｌａｃＺ等から選択されてもよいが、これらに限定はされない。
【００６４】
細胞中へのタグＤＮＡのレトロトランスポジションに次いで、ゲノムに挿入されたタグ配列を有する細胞を同定する際に、当業界で周知の多くの手法を用いてもよい。例えば、ハイブリダイゼーションが使用されてもよく、そこではタグＤＮＡからなるプローブがタグＤＮＡ又はＲＮＡを有する細胞を同定するために使用される。タグＤＮＡがタンパク質として発現される場合、タグタンパク質を発現している細胞の同定にあったて多様な免疫学的手法を用いてもよい。このような手法は当業界で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ら,（上記）に記載されている。タグＤＮＡに隣接するＤＮＡは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（上記）に記載されている一般的な手法で単離されクローン化されてもよく、その結果未だに知られていないＤＮＡの遺伝子及び領域の同定及び特徴付けが達成される。
【００６５】
本明細書で使用される「レトロトランスポジション」は、ゲノム中へ配列を組込み、ゲノム中で前記配列を発現させ、当該配列の染色体外コピーを作成するために組込まれた配列を逆転写し、ゲノム中へ配列を再組込みする過程を包含する。
【００６６】
本明細書で使用される「遺伝子」は、遺伝子のエクソン及びイントロンの両者を含む現実の遺伝子を包含する。
【００６７】
本明細書で使用される「異種のＤＮＡ」は、それが挿入された細胞で天然には見出されないＤＮＡを包含する。例えば、マウス又は細菌のＤＮＡがヒト細胞のゲノムに挿入されたとき、本明細書では、これらのＤＮＡは「異種のＤＮＡ」とされる。一方、本明細書で使用される「同種のＤＮＡ」なる用語は、それが挿入された細胞で天然に見出されるＤＮＡを意味する。例えば、マウス細胞のゲノムにマウスＤＮＡが挿入されることは、その細胞への「同種のＤＮＡ」の挿入を意味する。後者の場合、同種のＤＮＡが天然に見出される細胞ゲノム中での部位に、それが挿入される必要はなく、むしろ、同種のＤＮＡは、天然に見出されるのとは異なる部位に挿入され、それによって、挿入部位に遺伝的な改変（突然変異）を生じさせてもよい。
【００６８】
本明細書で使用される「Ｌ１ではないＤＮＡ」は、Ｌ１因子には天然で生じていないＤＮＡを包含する。
【００６９】
本発明の態様が、本明細書中で開示されるＤＮＡ配列に限定して解釈されるべきではないものと認識されたい。開示されたＤＮＡ配列と同様の機能を実質的に有する同種のＤＮＡ配列も、本発明に包含されるとみなされる。さらに、（本質的に同じ機能を有するレトロトランスポゾンＯＲＦ等の）密接に関連する構造間の遺伝子配列は非常に多様であるが、このような配列も本発明に同様に包含されるものと認識されている。
【００７０】
本明細書で使用されるように、「相同性」なる用語は、２つの重合分子間の、例えば２つの核酸分子間の、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのポリペプチド分子間の、サブユニット配列の相同性又は類似性を指す。２つの分子の両者でサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められているとき、例えば２つのポリペプチド分子のそれぞれにおいて一つの部位がフェニルアラニンで占められているならば、それらはその部位において相同である。％相同性で最も明確に定義される２つの配列間の相同性は、同一である位置の数に直接相関している。例えば、２つのポリペプチド配列中で半分の位置（例えば、１０サブユニットの長さのポリマー中で５つの位置）が同一であるならば、２つの配列は５０％の相同性を示すものであり、７０％の部位、例えば１０のうち７、が一致又は相同ならば、２つの配列は７０％の相同性を有するものである。例として挙げると、ポリペプチド配列ＡＣＤＥＦＧとＡＣＤＨＩＫは５０％の相同性を有し、ヌクレオチド配列ＣＡＡＴＣＧとＣＡＡＧＡＣは５０％の相同性を有する。
【００７１】
本明細書で使用される「相補性」は、２つの核酸、例えば２つのＤＮＡ分子間のサブユニット配列の相補性を指す。例えば、両方の分子においてヌクレオチドの位置が、常態で互いに塩基対を形成できるヌクレオチドで占められているとき、核酸はその位置で互いに相補的であるとみなされる。このように、それぞれの分子において実質的な数（少なくとも５０％）の対応する位置が、常態で互いに塩基対を形成するヌクレオチド（例えば、Ａ：Ｔ及びＧ：Ｃ）で占められているとき、２つの核酸は互いに相補的である。
【００７２】
本明細書中で考察されるように、本発明のある態様は、細胞中で遺伝的な疾患を修正するために遺伝子治療で使用してもよいタンパク質産生物をコードするＤＮＡを提供する。このようなタンパク質は、天然のポリペプチド配列を包含してもよく、又、一般に遺伝子治療剤としてより適し細胞中でより安定なタンパク質を提供する修飾体を包含してもよいと理解されるべきである。
【００７３】
本発明の更なる態様は、細胞のゲノム中に挿入されるＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質又はペプチドのアナログを提供する。アナログは、保存的なアミノ酸配列の差異によって又は配列に影響を与えない修飾によって、又はその両者によって、天然に生じるタンパク質又はペプチドとは異なることができる。例えば、保存的なアミノ酸変化はタンパク質又はペプチドの一次配列を改変するが、その機能はそのまま改変しないものであるが、そのような保存的なアミノ酸変化が為されるかもしれない。保存的なアミノ酸置換は、一般的に以下のグループ間：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン；での置換を含むがこれらのグループに限定はされない。
【００７４】
（一次配列をそのまま改変しない）修飾は、例えば、アセチル化又はカルボキシル化のようなインビボ又はインビトロでのポリペプチドの化学的な誘導体を包含する。糖付加の修飾、例えばポリペプチド合成及びプロセッシングの間に又は更なるプロセッシング過程において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、例えば糖付加に影響を与える酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化又は脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝すことによる糖付加の修飾も、包含される。リン酸化アミノ酸残基、例えばリン酸化チロシン、リン酸化セリン、リン酸化トレオニンを有する配列も包含される。後者の例において、再構成された核酸／タンパク質粒子が送達に使用されるならば、これは最も適用できるであろう。それは、インビボ送達が後に続く、本質的なインビトロでの修飾である。
【００７５】
タンパク質分解に対する耐性を改良するために又は溶解特性を最適化するために又は治療剤としてそれらをより適合させるために、一般的な分子生物学的な技術を用いて修飾されたポリペプチドも包含される。このようなポリペプチドのアナログは、天然に生じるＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸又は天然には生じない合成アミノ酸を含むものを包含する。本発明のペプチドは、本明細書中に列挙された特定の例示的な工程のいずれの産生物にも限定されない。
【００７６】
本明細書で使用される「遺伝学的な欠陥の修正」なる用語は、遺伝学的な欠陥により機能が異常とみなされた細胞に対して、正常な機能を回復する量で細胞中に野生型遺伝子産物を発現することを包含する。この用語は、実際に欠陥タンパク質を発現している細胞以外の細胞タイプに欠陥遺伝子の野生型コピーを送達することによって、動物の遺伝学的な欠陥が修正されるという状況にも適用される。他の細胞に遺伝子の野生型コピーを発現させること、及び、そこで発現された野生型タンパク質を分泌することも、動物で遺伝学的な欠陥を修正するために役立つものである。
（実施例）
【００７７】
本発明はここに記載される実施例に限定されて解釈されるべきではなく、むしろ、本発明は本明細書中で提供される全ての適用及び当業者の技術の範囲内にある全ての均等物のいずれをも含むと解釈されるべきであると認識されたい。
【実施例１】
【００７８】
ｓｍＯＲＦ２及びＯＲＦ１配列は、マウスＬ１ ＯＲＦｓ内のそれぞれのコドンを、高発現しているヒト遺伝子内の好まれるコドンで置換することによって作成された（Ｈａａｓら，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３１５−３２４）。配列は、ユニークな切断部位を導入し、遺伝子の会合を阻害したかもしれない潜在的なヘアピン構造を排除するサイレント突然変異でさらに改変された。ｓｍＯＲＦ２の両方の鎖を集合的にコードする６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドはキアゲン社のものを用い、遺伝子合成（Ｓｔｅｍｍｅｒ ら，１９９５，Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３）が図１ｂに示されるようにそれぞれ５００ｂｐセグメントで実施された。
【００７９】
会合反応液は、全量２５μｌ中にそれぞれのプライマー３０ｎＭと１×ＥｘＴａｑ ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を含んでいた。増幅反応液は、全量２５μｌ中にそれぞれのアウタープライマー０．５μＭ、２．５μｌの会合反応液及び１×ＥｘＴａｑ ｍｉｘを含んでいた。ＰＣＲ条件は、９４℃４分間、９４℃３０秒間−６５℃３０秒間−７２℃３０秒間が２５サイクルで７２℃７分間がそれに続いた。ＰＣＲ産生物は、ｐＣＲＩＩ中にＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローン化された。２４−４８クローンの全てがそれぞれのフラグメントについて配列決定され、突然変異が標準的なクローニング技術によって取り除かれた。最後に、合成されたフラグメントはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−中に共に連結された。使用されたオリゴヌクレオチド配列は図１０に示される。
【００８０】
融合ベクターが（図１ｃに示されるように）調製され、そこではテスト配列（ｌａｃＺ、ｍＯＲＦ２又はｓｍＯＲＦ２）がＧＦＰ ＯＲＦの下流にフレームに合わせて繋がれた。独立したｎｅｏ転写物も挿入された。
【００８１】
ｓｍＯＲＦ２の発現が、次いでイムノブロット解析によって解析された。細胞は、５％のＳＤＳ／ＰＢＳ中に回収され、次いで超音波処理された。全溶解産物は、７．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供され、ポリフッ化ビニリデン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写された。抗体とのインキュベーションが０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０及び５％のミルクを含むＰＢＳ中で実施された。０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄された。抗ＧＦＰ（ＦＬ）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）が１：２５０希釈で使用された。抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）が１：５０００希釈で使用された。ブロットはＥＣＬ−ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出された。
【００８２】
ヒト及びマウス両者の細胞において、ＧＦＰｓｍＯＲＦ２の形質導入は野生型ＧＦＰｍＯＲＦ２と比較してＲＮＡ量の大規模な増加を引き起こした（図１ｄ、上段、レーン３及び４）。ｍＯＲＦ２のエンドヌクレアーゼ活性及び逆転写酵素活性を破壊する２つの突然変異の導入は、さらにｓｍＯＲＦ２ ＲＮＡレベルのわずかな増加を提供した（図１ｄ、上段、レーン５）。ベクターにコードされるｎｅｏ転写物に対するプローブは、これらのＲＮＡの増加が形質導入効率又は負荷の違いによらないことを示していた（図１ｄ、中段）。抗ＧＦＰを用いたこれらの試料のイムノブロット（図１ｄ、下段）は、タンパク質のレベルがＲＮＡの増加と相関することを示し、哺乳動物のシステムでリコンビナントの全長ＯＲＦ２タンパク質が検出可能な量で再現可能に発現できることを示した注目すべき最初の例であることを示した。
【実施例２】
【００８３】
増加したＲＮＡレベルがレトロトランスポゾンによる転位効率の改変を引き起こしたか否かを決定するために、確立された組織培養アッセイ、レトロトランスポジションアッセイ（図２ａ）が、ＨｅＬａ細胞で相対的なレトロトランスポゾンによる転位頻度を測定するのに使用された。ＨｅＬａ細胞での標準的なレトロトランスポジションアッセイは、基本的にはＭｏｒａｎら，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７：９１７−９２７に記載されるように実施した。形質導入された細胞は、１０−１２日間２００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンで選択され、それから計数され、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８で１０日間培養された。コロニーは０．４％ギムザを含むＰＢＳで染色された。
【００８４】
ｍＯＲＦ２は、全長のマウスＬ１中でｓｍＯＲＦ２と置換され、部分的に合成されたマウスＬ１（ｐｓｍＬ１）が作成された。再コードされたｍＯＲＦ２はレトロトランスポジションに必要とされる潜在的に重要なシス作用配列（例えば、内部リボゾーム挿入部位）を欠いているかもしれないと考えられたので、ｍＯＲＦ２の最初の約５００ｂｐが野生型のＬ１配列からなり残りが合成である、部分的に合成されたＯＲＦ２の変形物（ｐｓｍＬ１−２）も構築した。ＨｅＬａ細胞で、ｐｓｍＬ１及びｐｓｍＬ１−２の両者が野生型のｍＬ１より約２０−２５倍以上活性であった（図２ｂ）。合成されたｍＯＲＦ１（ｓｍＯＲＦ１）及び部分的に合成されたｍＯＲＦ１の変形物の合成と取り込みは、更なるレトロトランスポジションの増加を引き起こし、２つの完全に合成されたＯＲＦを有する因子で、野生型に対して最大で２００倍以上の増加に達した（図２ｂ）。
【００８５】
ＨｅＬａ、３Ｔ３及びＬ細胞における一過性のレトロトランスポジションアッセイが、基本的にはＷｅｉら，２０００，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８４：４３５−４３８に記載されるように実施された。それぞれの転位構築物は、ＧＦＰ発現プラスミドｐＴｒａｃｅｒＥＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて共に形質導入され、形質導入効率が標準化された。形質導入後２４時間で、細胞は１００ｍｍ皿に１：２、１：２０及び１：２００に分割された。形質導入後３６時間で、希釈された細胞はＧ４１８で選択され、残った細胞はフローサイトメトリーでＧＦＰの発現について解析され、形質導入効率が標準化された。３Ｔ３細胞は１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で選択され、Ｌ細胞は４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で選択された。コロニーは０．４％のギムザ又は０．５％のクマシーブリリアントブルーで染色された。
【００８６】
一過性アッセイの使用により、合成のマウスＬ１（ｐＣＥＰｓｍＬｌ）レトロトランスポジション頻度が、野生型の天然のヒトＬ１及び野生型の天然のマウスＬ１のそれと比較された（Ｎ＝３）。ＨｅＬａ、３Ｔ３及びＬ細胞に対するｐＪＭ１０１Ｌｌｒｐコロニーの平均的な絶対値（形質導入された１０６細胞当たりのコロニー数）は、それぞれ２９０４、１０８及び１５６８であった。
【表１】
【実施例３】
【００８７】
ｓｍＬ１のＧ４１８耐性コロニーが真正なＬ１レトロトランスポーズによるものであることを確認するために、６つのｓｍＬ１挿入を特徴付けた。完全な挿入と隣接している配列のそれぞれを増幅することができるインバースポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、突然変異部位が同定された。それぞれのプライマー対に対して、親のＨｅＬａ細胞は空の部位を示す産物のみを産生した（図３ａ、奇数レーン）が、一方対応するＧ４１８耐性コロニーは空の部位（empty site）及び予想されるサイズの完全長ｓｍＬ１挿入産物の両者を産生した（図３ａ、偶数レーン）。
【００８８】
一般的な構造とゲノム隣接部を決定するために、アンプリコンがクローン化され配列決定された。組込み部位は、基本的にＭｏｒｒｉｓｈら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３１：１５９−１６５に記載されるようにインバースＰＣＲによって決定された。それぞれのクローンから得られたゲノムＤＮＡ（５μｇ）がＥｃｏＲＩで消化され、熱で不活化され、１ｍｌに希釈され、一晩連結され、エタノールで沈殿され、３０μｌの水に再懸濁され、オリゴヌクレオチドＪＢ６４６６／６４６７（１回目）及びＪＢ６４６８／６４６９（２回目）を用いる２回のインバースＰＣＲに供された。ＪＢ３５２９、ＪＢ３５３０及びＪＢ３５３１での配列決定は３０の隣接配列を同定した。隣接配列に基づくプライマーが、無傷のｓｍＬ１挿入を増幅するのに使用され、増幅されたｓｍＬ１挿入物は続けて配列決定された。
【００８９】
図３ｂに要約するように、全てのアンプリコンが適切にスプライシングされたｎｅｏ遺伝子、ポリＡテイルを示し、ほとんど（６のうち５）が５〜１０８ｂｐの長さの標的部位複製物を有していた。挿入番号１０は１０ｂｐの標的欠失を有し、挿入番号１８は５’Ｌ１逆位を有し、特徴はＬ１挿入に共通して見出された。
【００９０】
さらに、様々な染色体が標的として使用され、標的部位複製物から推測されるエンドヌクレアーゼ切断部位は以前に報告された変性コンセンサス（下の鎖において５’−ＴＴＴＴ／ＡＡ−３’）（図３ｃ）に一致した。
【実施例４】
【００９１】
合成のマウスＬ１レトロトランスポゾンの活性が、野生型のヒト及びマウスＬ１とマウス細胞において比較された。標識されたレトロトランスポゾンを導入するために使用されたエピソーム性のプラスミドはマウス細胞中で効率よく複製されないので、３Ｔ３及びＬ細胞中での一過性レトロトランスポジションアッセイが使用された。（図２ｂ及び表１のｐＴＮ２０１及びｐＣＥＰｓｍＬ１を比較し）標準的なアッセイで得られる相対的なレトロトランスポジション頻度を確認するために、ＨｅＬａ細胞での一過性レトロトランスポジションアッセイも実施された。合成のマウスＬ１（ｐＣＥＰｓｍＬ１）は、マウス細胞で野生型の対応物より非常に高い頻度で（２００倍以上）レトロトランスポジションを行った。
【００９２】
さらに、ｓｍＬ１をヒトＬ１（ｐＪＭ１０１Ｌ１ｒｐ）と比較した。Ｌ１ｒｐは以前にトランスジェニックマウス系統を作成するのに使用され、マウスでレトロトランスポジション頻度の基準として使用されるからである。Ｌ１ｒｐが従来知られていた最も活性なＬ１因子であった全ての細胞タイプの試験において、ｓｍＬ１はＬ１ｒｐより非常に活性が高かった。ｓｍＬ１ｍｕｔ２を産生するためにｓｍＬ１に導入された触媒作用の突然変異は、実質的にレトロトランスポジションを消滅させた。
【実施例５】
【００９３】
野生型の全長ｍＬ１及びその合成の対応物のノーザンブロット解析が実施された。全ＲＮＡが製造者の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離された。それぞれのサンプルから得られた全ＲＮＡ（６μｇ）は、１０単位のＤＮａｓｅＩで３７℃で１５分間処理され、０．８％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で泳動され、Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ ｐｌｕｓ ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＮＥＮ）へ１０× ＳＳＣ中で一晩ブロットされ、紫外線照射により架橋された。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションが共に４２℃でＵＬＴＲＡｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ）中で実施された。続いて［’ｙ−３２Ｐ］ＡＴＰ末端ラベルされたオリゴヌクレオチドがプローブとして使用された。ＧＦＰプローブとしてＪＢ４０５７、ＧＦＰプラスミドｎｅｏプローブとしてＪＢ４０５９、トランスポジションプラスミドｎｅｏプローブとしてＪＢ４５４１、ｈｙｇプローブとしてＪＢ６３４１が使用された。洗浄が２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ及び０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで実施された。放射性シグナルは、Ｆｕｊｉイメージングプレート（Fuji imaging plates）及びＦｕｊｉスキャナー（Fuji scanner）（ＢＡＳ−１５００）で測定した。次いで再度プローブするために、沸騰した０．１×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中で１０分間３回洗浄することにより、膜からプローブが除去された。
【００９４】
野生型の全長ｍＬ１及びその合成の対応物のノーザンブロット解析によれば、合成のＬ１配列の長さの増加は全長Ｌ１ＲＮＡレベルの増加を導くことが明かとなった（図４）。ｈｙｇｒｏ形質導入／負荷コントロールによって決定されるように（データ示さず）、ｐＣＥＰｓｍＬ１はエピソームで維持することが困難なので、ｐＣＥＰｓｍＬ１ｍｕｔ２がｐＣＥＰｓｍＬ１の代わりに使用された。無傷のｐＣＥＰｓｍＬ１プラスミドは形質導入された細胞で長期間、維持されない。
【実施例６】
【００９５】
ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質に曝されたときのみレトロトランスポーズする、合成マウスレトロトランスポゾンの条件的に活性化する変形物が構築された（図５ａ）。未成熟なＲＮＡの切断を導く配列に操作可能に結合された、介在性のレポーター遺伝子（β−ＧＥＯ等）によって、合成のレトロトランスポゾンが不活性化されている構築物が作成された。このカセットには、ｌｏｘＰ組換え部位が隣接している。このＤＮＡセグメントはｃｒｅタンパク質（インビトロで提供されるか、同時トランスフェクションにより又はｃｒｅ発現トランスジェニックマウスの交配により提供される）の存在下で、ｃｒｅがｌｏｘＰ部位で組換えを行うことにより、β−ｇｅｏを欠失し、合成レトロトランスポゾンを活性化するだろう。
【００９６】
レトロトランスポジションに対するレポーターは、ＵＶで励起される緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）であり、このタンパク質は単に紫外線を照射することにより新たな突然変異を視覚的に追跡することを可能にする。これは図５ｂに示される。不活性化された及び活性化されたＤＮＡ構築物（図５ａに表される）はＨＥＬＡ細胞に形質導入され、表現型はβ−ｇｅｏ発現に対してＸ−ｇａｌ染色、トランスポジション（ｇｆｐ活性）に対して蛍光顕微鏡を用いて評価された。
【実施例７】
【００９７】
ヒト（human version）の合成Ｌ１因子が上記と同じ方法を用いて合成された。この因子はヒトＬ１因子コンセンサス（Ｂｒｏｕｈａら，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：５２８０−５２８５）のアミノ酸配列に基づいている。ＯＲＦ１及びＯＲＦ２が、内部ＯＲＦ領域及び３’ＵＴＲと同様に再度コードされ、完全な合成ヒトＬ１を作製した。
【００９８】
レトロトランスポジション活性が測定され、天然のヒトＬ１と比較して活性が数倍増加することが明らかとなった。
【００９９】
本明細書で引用されるそれぞれの特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全てが参照により本明細書中に取り込まれる。
【０１００】
本発明は特定の態様に言及することで開示されているが、本発明の他の態様及び改変が本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく当業者によって工夫されることは明かなことである。添付の特許請求の範囲は、このような態様及び均等な改変の全てを包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１ａ】図１ａは、Ｌ１構造の模式図を示すものである。ＴＳＤは標的部位の重複を、ＵＴＲは非翻訳領域を表す。
【図１ｂ】図１ｂは哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子の合成について概略図を示す。それぞれの断片をコードするオリゴヌクレオチドはＰＣＲ会合反応（PCR assembly reaction）で混合され、次いで増幅の鋳型として用いる。増幅産物はクローン化され唯一の制限部位（ＡからＪとラベルされた）で繋がれた。
【図１ｃ】図１ｃはプラスミドの構造を示す。テスト配列（ｌａｃＺ，ｍＯＲＦ２又はｓｍＯＲＦ２）がＧＦＰ ＯＲＦの下流にインフレームで挿入される。それぞれのｎｅｏ転写物は、形質転換の効率と負荷をモニターするのに使用された。プラスミドに沿って延びる短い線は、図１ｄで示された、プローブを表す。
【図１ｄ】図１ｄはｓｍＯＲＦ２発現解析を示す。上段は、ＧＦＰｌａｃＺ、ＧＦＰｍＯＲＦ２及びＧＦＰｓｍＯＲＦ２のＲＮＡ発現。中段は、負荷コントロールのＲＮＡ発現。下段は、ＧＦＰｌａｃＺ、ＧＦＰｍＯＲＦ２及びＧＦＰｓｍＯＲＦ２のタンパク質発現を示す。
【図２ａ】図２ａはレトロトランスポゾンアッセイの概略図を示す。Ｌ１因子は、それ自身のプロモーターとポリアデニル化シグナルを有する３’非翻訳領域に、イントロンで中断されたｎｅｏレポーターを含む。ｎｅｏがＬ１プロモーターから転写され、スプライシングされ、逆転写され、ゲノムに組込まれると、細胞はＧ４１８耐性となる。プラスミドの部分に沿って延びる短い線は、ＲＮＡ解析のためのプローブを表す。ＳＤはスプライスドナーを、ＳＡはスプライスアクセプターを示す。
【図２ｂ】図２ｂは、レトロトランスポゾンがＨｅＬａ細胞でアッセイされた際に得られた結果を示している（Ｎ＝３）。ｐＴＮ２０１は野生型の天然のマウスＬ１配列のみを含み、ｐＴＮ２０３は野生型の天然のマウスＬ１配列と共にＤ７０９Ｙ逆転写酵素の点突然変異を含む。ｐＴＮ２０１のコロニーの平均絶対数は、形質導入された１０６個の細胞当たり４４０である。
【図３ａ】図３ａは、それぞれ完全な挿入配列とフランキング配列を増幅したインバースポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す。それぞれの挿入配列に隣接するプライマーは、Ｇ４１８耐性クローンから増幅するために使用された。奇数のレーンは、それぞれのプライマーについて、親のＨｅＬａ細胞が空の部位の産物のみを産生したことを示している。偶数のレーンは、それぞれのＧ４１８耐性クローンが、空の部位の産物及び予想されるサイズの完全長ｓｍＬ１挿入産物の両方を産生したことを示している。
【図３ｂ】図３ｂは、クローン化された挿入物の特徴を提供する。ＴＳＤは標的部位の重複を示す。
【図３ｃ】図３ｃは、クローン化された挿入物の構造と隣接する配列の概略図を示す。挿入物ｎｏ．８はヒトゲノム配列には見られない７ｂｐ（青で強調された）の付加配列を含む。挿入物ｎｏ．１０は、ヒトゲノム配列データベースと比較して、１組の鋳型と異なる塩基対を含み、それにＬ１挿入物の直ぐ上流の１０ｂｐの欠失（青で示された）が続いている。ＴＳＤｓは赤で強調され、推定されるエンドヌクレアーゼ切断部位は下線で示されている。
【図４】図４は、マウス細胞でのｓｍＬ１発現の全ＲＮＡ解析による、高頻度なレトロトランスポジションを表している。天然、部分的に合成された及び完全に合成されたｍＬ１の発現がＨｅＬａ細胞で比較された。
【図５ａ】図５ａは、ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質に曝された時のみレトロトランスポーズする、条件的に活性化するマウスレトロトランスポゾンの概略図を表す。
【図５ｂ】図５ｂは、組織培養細胞での結果を示す。
【図６ａ】図６ａは、配列番号１（合成されたマウスＯＲＦ２）の前半部分を記載する。
【図６ｂ】図６ｂは、配列番号１（合成されたマウスＯＲＦ２）の残りの部分を記載する。
【図７】図７は、配列番号２（合成されたマウスＯＲＦ１）を記載する。
【図８ａ】図８ａは、配列番号３（合成されたヒトＯＲＦ２）の前半部分を記載する。
【図８ｂ】図８ｂは、配列番号３（合成されたヒトＯＲＦ２）の残りの部分を記載する。
【図９】図９は、配列番号４（合成されたヒトＯＲＦ１）を記載する。
【図１０ａ】図１０ａは、マウスでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号５−７２）を記載する。
【図１０ｂ】図１０ｂは、マウスでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号７３−１４３）を記載する。
【図１０ｃ】図１０ｃは、マウスでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号１４４−２０９）を記載する。
【図１１ａ】図１１ａは、ヒトでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号２１０−２６２）を記載する。
【図１１ｂ】図１１ｂは、ヒトでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号２６３−３１９）を記載する。
【図１１ｃ】図１１ｃは、ヒトでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号３２０−３７６）を記載する。
【図１１ｄ】図１１ｄは、ヒトでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号３７７−４１１）を記載する。
【図１２ａ】図１２は、合成のマウスＬ１と天然のマウスＬ１の配列アラインメントを提供する。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．５．３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用して、ＯＲＦ１のＡＴＧで開始し、ＯＲＦ２の終始コドンで終了する、天然のマウスＬ１と合成のマウスＬ１の核酸ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを作成した。これらの配列について、Ｌ１ ｓｐａの塩基構成は、４１％Ａ、２０％Ｔ、２１％Ｃ、１８％Ｇである。ｓｍＬ１の塩基構成は、２７％Ａ、１４％Ｔ、３３％Ｃ、２６％Ｇである。Ｌ１ ｓｐａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号＃ＡＦ０１６０９９）が天然のマウスＬ１の配列として使用された。一致部分は灰色の陰影を付けて示されている。
【図１２ｂ】図１２ｂは、図１２ａの続きである。
【図１２ｃ】図１２ｃは、図１２ｂの続きである。
【図１２ｄ】図１２ｄは、図１２ｃの続きである。
【図１２ｅ】図１２ｅは、図１２ｄの続きである。
【図１２ｆ】図１２ｆは、図１２ｅの続きである。
【図１２ｇ】図１２ｇは、図１２ｆの続きである。
【図１２ｈ】図１２ｈは、図１２ｇの続きである。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／４７３，６５８号の利益を主張するもので、その全ては参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
トランスポゾンは、プラスミド、ウイルス及び細菌の染色体に共通する構成因子である、個別の可動遺伝因子（ＤＮＡ）である。これらの因子は、自身をコードする表現型特性を、レプリコンからレプリコンへと転位させる能力、又は、公知の遺伝子へと転位しそれを不活性化する能力によって検出される。トランスポゾンには２つのタイプがあり、大きさは約７５０から５０，０００ヌクレオチド塩基対以上にも及ぶ。小さな挿入配列又はＩＳ因子として知られる一つのタイプでは、如何なる公知の表現型特性もコードしてはいない。もう一方のタイプでは抗菌耐性等の表現型特性をコードする比較的大きなユニットを含んでいる（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ；Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃ．Ｓｔｕｔｔａｒｄ ａｎｄ Ｋ．Ｒｏｚｅｅ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐａｇｅｓ１６５−２０５）。トランスポゾン又は転位因子は、反復配列が結合した核酸の一部分を含むものである。活性なトランスポゾンは、ＤＮＡ配列に核酸を組込むのを助ける酵素をコードする。
【０００３】
脊椎動物において、ＤＮＡトランスポゾン、すなわちＤＮＡの媒介によって移動する可動性因子の発見は、比較的最近のことである（Ｒａｄｉｃｅ，Ａ．Ｄ．ら，１９９４．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４ ６０６−６１２）。それ以来、真核生物トランスポゾンのｈＡＴ（ｈｏｂｏ／Ａｃ／Ｔａｍ）スーパーファミリーと同様、不活性で、高度に変異したＴｃｌ／ｍａｒｉｎｅｒのメンバーが、魚類の異なる種、アフリカツメガエル、ヒトのゲノムから単離された（Ｏｏｓｕｍｉら，１９９５．Ｎａｔｕｒｅ３７８，８７３；Ｉｖｉｃｓら，１９９５．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４７ ３１２−３２２；Ｋｏｇａら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８３，３０；Ｌａｍら，１９９６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５７，３５９−３６６及びＬａｍ，Ｗ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１０８７０−１０８７５）。
【０００４】
レトロトランスポゾンは、現在までに試験されたほとんど全ての動物、植物、細菌種の細胞で見出される、天然のＤＮＡ因子である。それらは、細胞内で発現し、染色体外因子に逆転写され、同じゲノム内の他の部位に再度組込まれる。
【０００５】
レトロトランスポゾンは、レトロウイルス様のＬＴＲレトロトランスポゾンと、ヒトＬ１因子、アカパンカビＴＡＤ因子（Ｋｉｎｓｅｙ，１９９０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２６：３１７−３２６）、ショウジョウバエのＩ因子（Ｂｕｃｈｅｔｏｎ ら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：１５３−１６３）、及びカイコのＲ２Ｂｍ（Ｌｕａｎ ら，１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：５９５−６０５）等の非ＬＴＲ因子の２つのクラスに分けることができる。レトロトランスポゾンのこれら２つのタイプは、構造的に異なり、また根本的に異なるメカニズムでレトロトランスポーズする。
【０００６】
ＬＴＲレトロトランスポゾンとは異なり、非ＬＴＲ因子（ポリＡ因子とも呼ばれる）はＬＴＲを欠き、代わりに末端はポリＡ又はＡに富んだ配列となっている。ＬＴＲレトロトランスポゾンの転位メカニズムは比較的よく理解されている。対照的に、非ＬＴＲレトロトランスポゾンによる転位メカニズムは解明が始まったところである（Ｌｕａｎ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３８８２−３８９１；Ｌｕａｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：５９５−６０５）。非ＬＴＲレトロトランスポゾンはさらに配列特異的な及び非−配列特異的なタイプに分けることができる。Ｌ１は、ヒト、マウス及び他の哺乳動物全ての染色体において散在的に組込まれていることが見出された、後者のタイプに属する。
【０００７】
Ｌ１因子（ＬＩＮＥとしても知られる）はヒトゲノムへの定着に極めて成功している。初期の概算では、Ｌ１はヒトゲノム中に１００，０００コピー存在し、核ＤＮＡの５％を構成すると、見られていた（Ｆａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ，１９８７，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９１０：２０３−１２１）。しかしながら、最近の研究によれば、８５０，０００もの多くのＬ１がヒトゲノム中に存在するようである（Ｓｍｉｔら，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）。これらコピーの大部分は５’末端が切り詰められていて、欠陥があると推定されている。完全な長さの因子と同様に、５’末端が切り詰められているコピーもしばしば短い標的部位との重複（ＴＳＤｓ）によって挟まれている。
【０００８】
完全長６．１ｋｂのＬ１コンセンサス配列は、以下の保全機構（conserved organization）：内部プロモーターを有する５’非翻訳リーダー領域（ＵＴＲ）、２つの重複していないＯＲＦ（ＯＲＦ１及びＯＲＦ２）、２００ｂｐの３’ＵＴＲ及び３’ポリＡテイル、を示している。ＯＲＦ１は４０ｋｄタンパク質をコードし、ＲＮＡに対してパッケージング機能を提供しているようである（Ｍａｒｔｉｎ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：４８０４−４８０７；Ｈｏｈｊｏｈら，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：６３０−６３９）。一方、ＯＲＦ２は逆転写酵素をコードしている（Ｍａｔｈｉａｓら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０８−１８１０）。ＯＲＦ１タンパク質、そしておそらくＯＲＦ２タンパク質もＬ１ ＲＮＡと結合し、リボ核タンパク質の粒子を形成する。ＯＲＦ２タンパク質による逆転写が起こり、Ｌ１ ｃＤＮＡが生じ、そして、そのＬ１ ｃＤＮＡがゲノムに組込まれる（Ｍａｒｔｉｎ，１９９１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１：５０５−５０８）。さらに、Ｌ１因子は通常、７から２０ｂｐのＴＳＤによって挟まれている。完全長のＬ１及び他の非ＬＴＲレトロトランスポゾンは、レトロウイルスインテグラーゼ、プロテアーゼ及びＲＮアーゼＨと認識されるホモログを欠いている。この因子群においては、ＬＴＲレトロトランスポゾンとは根本的に異なる転位メカニズムが採用されている。
【０００９】
ヒトＬ１因子の幾つかは、ヒトゲノムの新たな部位へ、レトロトランスポーズ（発現し、それらの標的部位を切断し、切断された標的部位をプライマーとして用いて自身のＲＮＡを逆転写すること）可能であり、遺伝的な疾患を引き起こす。例えば、生殖細胞系列に於けるＶＩＩＩ因子及びジストロフィン遺伝子へのＬ１挿入は、それぞれ血友病Ａ及び筋ジストロフィーを引き起こす（Ｋａｚａｚｉａｎら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：１６４−１６６；Ｎａｒｉｔａら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１８６２−１８６７；Ｈｏｌｍｅｓら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１４３−１４８）。一方、体細胞でのｃ−ｍｙｃ及びＡＰＣ腫瘍抑制遺伝子へのＬ１挿入は、それぞれ乳癌及び結腸癌の珍しい例に関与する（Ｍｏｒｓｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３３：８７−９０；Ｍｉｋｉら，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：６４３−６４５）。Ｌ１レトロトランスポゾンは、直接又は間接に、質量によって（Ｌａｎｄｅｒら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：８６０−９２１）、Ａｌｕ因子の自己動員及びトランス動員によって（Ｄｅｗａｎｎｉｅｕｘら，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３５：４１−４８）、哺乳動物のゲノムの３０％以上を占めいている。完全な長さ（約６ｋｂ）のＬ１は、レトロトランスポーズするためのタンパク質をコードする２つのオープンリーデングフレーム、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２から成る（Ｆｅｎｇら，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７：９０５−９１６；Ｍｏｒａｎら，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７：９１７−９２７）。
【００１０】
このように、高度に活性なＬ１因子は、哺乳動物の遺伝学に於ける手段（tool）として有望な有用性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の要約）
一態様に於いては、本発明は、合成されたトランスポゾン遺伝子に関する。別の態様に於いては、本発明は、合成された哺乳動物のトランスポゾン遺伝子に関する。
【００１２】
本発明者らは、合成されたトランスポゾン及びレトロトランスポゾン遺伝子が遺伝子治療への応用及び本明細書に記載の他の遺伝学的な応用に有用であることを見出した。
【００１３】
更なる態様では、本発明は、合成されたレトロトランスポゾン遺伝子に関するものである。本発明の更なる態様は、哺乳動物の合成されたレトロトランスポゾン遺伝子を提供することである。
【００１４】
一態様では、本発明は、合成されたＯＲＦ２遺伝子に関する。別の態様では、本発明は、合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子に関する。合成遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子に比較してより高レベルな発現を示す。
【００１５】
一態様では、本発明は、合成されたＯＲＦ１遺伝子に関する。別の態様では、本発明は、合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子に関する。合成遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子に比較してより高レベルな発現を示す。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、ヒトと関連のあるコドンを含む合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子に関する。本発明の更なる態様は、合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子は、ヒトと関連のあるコドンのみを含む。これらの態様では、ヒトと関連のあるコドンとは、高度に発現される哺乳動物の遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンを指す。注目すべきは、それぞれのアミノ酸をコードする２又はそれ以上のこのようなコドンがしばしば存在し、それゆえ多くの可能な合成因子が存在しうるのである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、配列番号１を含む合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、配列番号２を含む合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、配列番号３を含む合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、配列番号４を含む合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、合成されたトランスポゾン遺伝子を含むトランスポゾンに関する。別の態様では、本発明は、合成されたレトロトランスポゾン遺伝子を含むレトロトランスポゾンに関する。更なる態様では、本発明は、合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子を含むＬ１レトロトランスポゾンに関する。別の態様では、本発明は、合成されたＯＲＦ２及び合成されたＯＲＦ１遺伝子を含むＬ１レトロトランスポゾンに関する。本発明の更なる態様は、合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子、合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子、又は合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子及び合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子の両者を含む哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾンを提供する。レトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンと少なくとも同程度の効率でレトロトランスポーズする。本発明の更なる態様では、レトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする。
【００２２】
別の態様では、本発明は合成されたＯＲＦ２遺伝子を含むリコンビナントベクター構築物を提供する。別の実施例では、本発明は合成されたＯＲＦ１遺伝子を含むリコンビナントベクター構築物を提供する。別の態様では、本発明は合成されたＯＲＦ２遺伝子及び合成されたＯＲＦ１遺伝子を含むリコンビナントベクター構築物を提供する。これらの構築物で形質導入され、形質転換され又は感染された真核細胞が同様に提供される。
【００２３】
更なる態様では、本発明は、合成のＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子を調製するための方法を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、望ましい遺伝子又はその生物学的に活性な断片を哺乳動物の細胞へ送達する方法に関する。本発明の方法は、該哺乳動物へ、合成されたＯＲＦ２若しくはＯＲＦ１遺伝子、又はそれらの組合せを望ましい遺伝子と共に投与することを包含する。
【００２５】
本発明の更なる態様は、合成されたＯＲＦ２若しくはＯＲＦ１遺伝子、又はそれらの組合せ、並びに望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体を含むカセットを更に含んで成る組成物を提供する。別の態様では、本発明は、哺乳動物の遺伝的な疾患を治療する方法に関する。本発明の方法は、問題の遺伝的な疾患を有する哺乳動物へ、合成されたＯＲＦ２若しくはＯＲＦ１遺伝子、又はそれらの組合せ、並びに望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体を含む組成物を投与することを包含する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、特徴付けされていない遺伝子又はそれらの生物学的に活性な断片を細胞中で同定する方法に関する。本発明の方法は、合成されたＯＲＦ２若しくはＯＲＦ１遺伝子又はそれらの組合せ及び検出可能なタグ配列を投与すること、並びにタグ配列を発現する細胞を同定すること及びタグ配列に隣接するＤＮＡを特徴付けることを包含する。
本発明の他の態様は、以下に開示される。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本明細書は、合成されたトランスポゾン遺伝子を開示する。さらに、本明細書は、合成された哺乳動物のトランスポゾン遺伝子を開示する。加えて、本明細書は、合成されたレトロトランスポゾン遺伝子を開示する。さらに、本明細書は、合成された哺乳動物のレトロトランスポゾン遺伝子を開示する。
【００２８】
合成されたレトロトランスポゾンは、一態様では、天然のレトロトランスポゾンと少なくとも同様の効率でレトロトランスポーズする。別の態様では、合成されたレトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明の合成レトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより約２倍以上効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明の合成レトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより約２５倍以上効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明の合成レトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより約１００から２００倍以上効率よくレトロトランスポーズする。
【００２９】
合成トランスポゾンは、一態様で、天然のトランスポゾンと少なくとも同様の効率で転位する。別の態様では、合成トランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより効率よく転位する。更に別の態様では、本発明の合成トランスポゾンは、天然のトランスポゾンより約２倍以上効率よく転位する。更に別の態様では、本発明の合成トランスポゾンは、天然のトランスポゾンより約２５倍以上効率よく転位する。更に別の態様では、本発明の合成レトロトランスポゾンは、天然のレトロトランスポゾンより約１００から２００倍以上効率よく転位する。
【００３０】
本明細書は、合成されたＯＲＦ２遺伝子を開示する。一態様では、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子は、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、昆虫等の脊椎動物のものである。一態様では、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子は、マウス（murine）、ウシ、ウマ等の哺乳動物のものである。合成遺伝子の一態様は、ヒトに対して最適なコドンを使用するのみならず、発現量が低い原因となるおそれがある核酸配列の偏りを無くしている。
【００３１】
一態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子と比較して、より高レベルの発現を示す。
【００３２】
本発明の別の態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然の遺伝子と同じタンパク質をコードしており、更にヒトに関連したコドンをも含んでいる。
本発明の別の態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、ヒトに関連したコドンのみを含んでいる。「ヒトに関連したコドン」とは、高度に発現される哺乳動物の遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンを指す。当業者であれば、どのコドンが特定の遺伝子で最も頻繁に関連付けられているか決定することができる。注目すべきは、それぞれのアミノ酸をコードする２又はそれ以上のこのようなコドンがしばしば存在し、それゆえ多くの可能な合成因子が存在しうることである。例えば、それぞれのアミノ酸に対するヒトに関連したコドンは、以下を含んでいてもよい。アラニンＧＣＣ、アルギニンＣＧＣ又はＣＧＧ、アスパラギンＡＡＣ、アスパラギン酸ＧＡＣ、システインＴＧＣ、グルタミンＣＡＧ、グルタミン酸ＧＡＧ、グリシンＧＧＣ又はＧＧＧ、ヒスチジンＣＡＣ、イソロイシンＡＴＣ、ロイシンＣＴＧ又はＣＴＣ、リジンＡＡＧ、メチオニンＡＴＧ、プロリンＣＣＣ、フェニルアラニンＴＴＣ、セリンＡＧＣ又はＴＣＣ、トレオニンＡＣＣ、トリプトファンＴＧＧ、チロシンＴＡＣ、及び、バリンＧＴＧ又はＧＴＣ。
【００３３】
一態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子の配列と１００％の相同性を示すＤＮＡ配列は有していない。別の態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子の配列と約９０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。別の態様では、合成されたＯＲＦ２遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子の配列と約８０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。
【００３４】
別の態様では、合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子は、配列番号１と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。更に別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子は、配列番号１を包含する。
【００３５】
さらに本明細書は、合成されたＯＲＦ１遺伝子を開示する。本発明の別の態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、昆虫等の脊椎動物のものである。本発明の別の態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、マウス、ウシ、ウマ等の哺乳動物のものである。本発明の更なる態様では、合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子と比較して、より高レベルの発現を示す。
【００３６】
本発明の別の態様では、合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然の遺伝子と同じタンパク質をコードしているが、ヒトに関連したコドンをも含んでいる。本発明の別の態様では、合成されたＯＲＦ１遺伝子は、ヒトに関連したコドンのみを含んでいる。
【００３７】
一態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子の配列と１００％の相同性を示すＤＮＡ配列は有していない。別の態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子の配列と９０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。別の態様では、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子は、天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子の配列と約８０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。
【００３８】
別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子は、配列番号２と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。更に別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子は、配列番号２を包含する。
【００３９】
別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子は、配列番号３と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。更に別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子は、配列番号３を包含する。
【００４０】
別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子は、配列番号４と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有している。更に別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子は、配列番号４を包含する。
【００４１】
一態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子はヒトのものである。本発明の別の態様では、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子はヒトのものである。
【００４２】
一態様に於いて、本発明の合成トランスポゾン遺伝子を包含するトランスポゾンが提供される。別の態様に於いて、本発明の合成レトロトランスポゾン遺伝子を包含するレトロトランスポゾンが提供される。
【００４３】
更なる態様に於いて、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子を包含するＬ１レトロトランスポゾンが提供される。更なる態様に於いては、本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子を包含するＬ１レトロトランスポゾンが提供される。更に別の態様は、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子及び本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子の両者を包含するＬ１レトロトランスポゾンを提供する。トランスポゾン又はレトロトランスポゾンは、一態様では、天然のトランスポゾン又はレトロトランスポゾンと少なくとも同様の効率で、それぞれトランスポーズ又はレトロトランスポーズする。別の態様では、トランスポゾン又はレトロトランスポゾンは、天然のトランスポゾン又はレトロトランスポゾンより効率よく、それぞれトランスポーズ又はレトロトランスポーズする。
【００４４】
更なる態様に於いて、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子を包む哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾンが提供される。更なる態様に於いては、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子を包む哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾンが提供される。更に別の態様は、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子及び本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子の両者を含む哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾンを提供する。哺乳動物のレトロトランスポゾンは、一態様では、天然のＬ１レトロトランスポゾンと少なくとも同様の効率でレトロトランスポーズする。別の態様では、哺乳動物のレトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明のレトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約２倍以上効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明のレトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約２５倍以上効率よくレトロトランスポーズする。更に別の態様では、本発明のレトロトランスポゾンは、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約１００から２００倍以上効率よくレトロトランスポーズする。
【００４５】
更なる態様に於いて、本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子を包むリコンビナントベクター構築物が提供される。本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子を包むリコンビナントベクター構築物が更なる態様で提供される。本発明の合成されたＯＲＦ２遺伝子及び本発明の合成されたＯＲＦ１遺伝子の両者を含むリコンビナントベクター構築物が更なる態様で提供される。リコンビナントベクターは、化学的に結合されたもの；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ポリオーマ性ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、パルボウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイスル、ポックスウイルス等の（ＤＮＡ又はＲＮＡ）ウイルスベクター；融合タンパク質；プラスミド；ファージから選択されてもよいがそれらに限定はされない。ベクター配列は自然に生じた真核細胞のウイルス因子に限定される必要はない。哺乳類の人工染色体を含む人工染色体も本発明の範囲のものとする。
【００４６】
一態様では、目的のプラスミドは、天然のｍＯＲＦ２配列を、本発明の合成された哺乳動物のＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子のＤＮＡ配列で置き換えたｐＣＥＰ４である。
【００４７】
本発明のリコンビナントベクター構築物は、天然のベクターで観察されのよりも、より頻繁にレトロトランスポーズする。一態様では、本発明の構築物は、天然のベクターで観察されるより約２から約１００倍の頻度でレトロトランスポーズする。
【００４８】
別の態様に於いて、本発明のリコンビナントベクター構築物によって形質導入、形質転換又は感染された真核細胞が提供される。
【００４９】
本発明の合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子の調製方法を提供する。一態様では、本発明の方法は、「ヒトに関連したコドン」を含む本発明の合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子の調製を包含する。別の態様では、本発明の方法は、「ヒトに関連したコドン」のみを含む本発明の合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子の調製を包含する。別の態様では、本発明の方法はさらに、約４００から約６００塩基対の間隔でユニークな制限酵素部位を組み込む工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、１つ以上のユニークな制限酵素部位を有する核酸配列からなる３’非翻訳領域を再合成するか、又は細胞の遺伝子の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）を使用する工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、前記配列のセンス及び相補鎖の両者について約３０塩基対から約９０塩基対の長さのオリゴヌクレオチドを設計する工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、それぞれの長さが約４００から約６００塩基対である約６から約１２個のＤＮＡフラグメントを合成するためにオリゴヌクレオチドを使用する工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、前記フラグメントのそれぞれに対応するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むほぼ等モル濃度の混合物を使用するＰＣＲを実施する工程を包含する。更に別の態様では、本発明の方法はさらに、完全な遺伝子を作成するために、ユニークな制限酵素部位を使用してＰＣＲにより得られたフラグメントをサブクローニングする工程を包含する。
【００５０】
合成されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１遺伝子は、「ヒトに関連したコドン」を含むように調製されてもよい。結果として得られる核酸配列は、およそ５００塩基対間隔でユニークな制限酵素部位が組み込まれるように、さらに改変されていてもよい。さらに、３’非翻訳領域は、サブクローニングを容易にするために、複数のユニークな制限酵素部位で再合成されてもよい。オリゴヌクレオチドは、この新しい配列の両方の鎖を完全にカバーするように設計されてもよく、例えば、約３０から約９０塩基対のオリゴヌクレオチドが設計されてもよい。約６５℃より高い融解温度を有するこれらのオリゴヌクレオチド内のヘアピン構造（例えば、コンピュータープログラムＯｌｉｇｏ５．０で予測されるような）は、アミノ酸配列を保存する突然変異で破壊されるであろう。これらの突然変異は、最適なコドンをそれより劣る改変されたコドンへと変更するであろう。
【００５１】
結果として得られる最適化されたＯＲＦ２又はＯＲＦ１核酸配列は、その後修飾されたポリメラーゼ連鎖反応（Ｓｔｅｍｍｅｒら，１９９５，Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３）に供されてもよい。例えば、約４０塩基対から約８０塩基対のセンス鎖全体をカバーするオリゴヌクレオチドが合成されてもよい。相補鎖もまた、センス鎖オリゴヌクレオチドに対して約３０塩基対ずらして、約４０塩基対から約８０塩基対のオリゴヌクレオチドで、合成されてもよい。オリゴヌクレオチドは、相補鎖由来の２つのオリゴヌクレオチドからなる、約２０から約５０塩基対のハイブリッドであってもよい。これらのオリゴヌクレオチドを使用して、ＯＲＦ２又はＯＲＦ１核酸配列は、それぞれの長さが約４００から約６００塩基対である約６から約１２個の間のフラグメントとして合成されてもよい。それぞれのフラグメントに対応するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ほぼ等モル量で混合されてもよく、ＰＣＲ反応が実施されてもよい。例えば、２５サイクルの会合ＰＣＲを行ってもよい。他のＰＣＲサイクルが実施されてもよく、本明細書で開示される利益を享受する当業者であれば、目的に応じて最適なサイクル数を決定することが可能である。この会合反応物は、例えば、増幅プライマーとしてのフラグメントである最も外側のオリゴヌクレオチドを含んでいるＰＣＲ反応物中に希釈されてもよい。
【００５２】
結果として得られるフラグメントは、例えば、別々にプラスミド中にクローン化され、約２０−３０クローンはそれぞれ配列決定されてもよい。標準的なサブクローニングの手順に従って、オリゴ合成、会合又はＰＣＲの際に導入された突然変異は取り除かれてもよい。結果として得られるフラグメントは、あらかじめ配列中に設計されているユニークな制限酵素部位を使用してサブクローニングされ、プラスミド中に、最適化された完全なＯＲＦ２又はＯＲＦ１核酸配列を作成する。
【００５３】
哺乳動物の細胞中に、望ましい遺伝子又はそれらの生物学的に活性なフラグメントを送達する方法は、同様に、本発明の態様中で提供される。本発明の一態様では、望ましい遺伝子は、治療のための遺伝子である。本発明は、本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子を哺乳動物へ投与することを包含する。遺伝子治療の方法もまた、本発明の態様に従って意図されている。レトロトランスポジションで遺伝子治療を通して送達される遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、チロシン水酸化酵素、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子−１−優性抑制阻害剤（Ａｐａｆ−１−ＤＮ）、アルファ−ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡ）を含むがそれらに限定されるものではない。レトロトランスポジションを用いる遺伝子治療に於いて標的とさる障害及び／又は疾病は、血友病、パーキンソン病、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、ゴーシェ病、嚢胞性繊維症及び副腎白質ジストロトフィー、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＳＣＩＤ）、アルファ−抗トリプシン欠損症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ−サックス病及びサラセミア、を含むがそれらに限定されない。
【００５４】
別の態様は、本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体からなるカセットを含む組成物を提供する。一態様では、カセットは細胞のゲノムに挿入されてもよい異種又は同種のＤＮＡ（Ｌ１ ＤＮＡではない）を包含していてもよい。このＤＮＡは、３’ＵＴＲ配列内、又は３’ＵＴＲとポリＡシグナルの間に、ＤＮＡの発現がプロモーターに制御されるよう部位に配置されてもよい。挿入されるＤＮＡの種類は、挿入部位を同定するためのマーカーとして機能するＤＮＡ、例えば、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子又は他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ｚｅｏ、ｈｙｇｒｏ、ｇｐｔ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ｌａｃＺ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子、及び、限定はされないがＴ細胞受容体遺伝子等の細胞表面受容体遺伝子も含むが、それらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明に従った組成物の投与経路も、治療される疾患によって異なってもよい。組成物は、従来の方法（例えば、経口、非経口、経皮又は粘膜を通して）のうちの１つの形態、生分解性で生物学的適合性のあるポリマーを用いた持効性の製剤で、又は、ミセル、ゲル及びリポソームを用いた現場への送達によって患者に投与されてもよいし、又は、直腸へ（例えば、座薬又は浣腸によって）投与されてもよい。一態様では、肺感染症の患者の治療には、例えばエアロゾルによる鼻腔内への送達であるか、血管を通して投与されてもよい。適した薬学的に許容される担体は、当業者に明らかであり、投与経路に大いに依存するであろう。
【００５６】
本発明の一態様では、プロモーターが以下から選択されるかもしれないが、それらに限定されない。アクチン、ＰＧＫ、ＤＮＡｐｏｌＩＩ又はユビキチンプロモーター等のハウスキーピングプロモーターのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、アルブミン、グロビン、オボアルブミンプロモーター配列等の組織特異的プロモーター、Ｋ１２又はＫ１４等の皮膚特異的プロモーター、ステロイド誘導プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター等の誘導プロモーターなど、及び、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及びサイトメガロウイルス極初期プロモーター（ＣＭＶ）等と同様に、Ｌ１因子プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及び５ＳＲＮＡプロモーター等の他のレトロウイルスＬＴＲ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター等のウイルスプロモーター。望ましいＤＮＡの最適な発現を提供するプロモーターの種類は、望まれる結果に依存するであろうし、当業者に明らかであろう。
【００５７】
細胞内でのレトロトランスポジションと、その結果である望ましいＤＮＡの細胞ゲノム中への挿入を達成するため、本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子からなるカセットは、細胞によるＤＮＡの取り込みが達成されるのに適した組成物で細胞集団へ添加されてもよい。例えば、リコンビナントベクターがプラスミドである場合、インビトロでの細胞へのトランスフェクションに際して、カルシウムリン酸トランスフェクション混合物、リポソームトランスフェクション製剤等を含むがそれらに限定されない多数の製剤によって、カセットが細胞に添加されてもよい。この種のトランスフェクションの手順は、当業界で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら,（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。前記カセットは、カセットに適応した組換えＤＮＡ技術を用いて製造され、望ましい細胞にカセットを送達するのに適したウイルスの形で細胞に添加されてもよい。
【００５８】
宿主細胞ＤＮＡの不活化領域にＤＮＡの挿入をするために、ＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１タンパク質が特に害のない配列、例えばリボソームＲＮＡ遺伝子配列中で、宿主細胞ＤＮＡを切断するようにそれらを改変することが可能である。あるいは、ＯＲＦ２又はＯＲＦ１のエンドヌクレアーゼドメインを、特に害のない配列で特異的にＤＮＡを切断する別の酵素のドメインで置換することが可能である。このような酵素は、アデノ随伴ウイルスのｒｅｐ遺伝子及びあるグループＩイントロンにコードされる部位特異的なエンドヌクレアーゼ、例えば酵母ミトコンドリアＳＣＥ１遺伝子の普遍的なコード等価物を含むがそれらに限定はされない。
【００５９】
別の態様では、カセットに含まれるＤＮＡは、挿入される細胞中の遺伝学的な欠陥を修正するのに有用である。このような遺伝学的な欠陥の修正に使用することができるＤＮＡは、細胞内で突然変異し、その結果として遺伝学的な欠陥を引き起こした遺伝子の野生型又はその派生物を含む。このようなＤＮＡは、欠陥を有する細胞で遺伝学的な欠陥を修正するのに使用できる公知の又は未知の如何なるＤＮＡも限定されることなく包含するものである。このようなＤＮＡの例は、嚢胞性線維症膜貫通伝導性調節因子（ＣＦＴＲ）をコードするｃＤＮＡ、ベータグロビンをコードするｃＤＮＡ、血液凝固タンパク質をコードするｃＤＮＡ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）等（これらに限定はされないが）の酵素をコードするｃＤＮＡ、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６、網膜芽腫、ウィルムス腫瘍等（これらに限定されないが）このような癌で役割を果たすｃＤＮＡ、そしてまた、サイトカイン、インターロイキン及び治療用のペプチドをコードする遺伝子等が含まれる。
【００６０】
したがって、一態様では、本発明は哺乳動物における遺伝的な障害を治療するための方法を提供し、そこでは、本発明の方法は本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体からなるカセットを含む組成物を前記の遺伝的な障害を有する哺乳動物に投与することを包含する。
【００６１】
別の態様では、本発明は、動物において遺伝学的な欠陥を修正することに関する。更に関連する態様に於いては、哺乳動物及び、より好ましくはヒトが意図されている。動物の遺伝学的な欠陥を修正するために、上述した遺伝子送達の方法は、望ましい遺伝子又はその生物学的に活性なフラグメントをレトロトランスポジションによって遺伝学的な欠陥を有する動物の細胞に送達することに基づく本発明に包含される。治療する動物に於けるインビボでの細胞内のレトロトランスポジションを達成するために、本発明の合成されたＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び望ましい遺伝子を含むカセットは、当業界で公知の技術、例えば、参照により本明細書に取り込まれている国際公開第９４／２８９３８号及び米国特許第５，２４０，８４６号に記載される技術を用いて動物に投与される。本明細書に記載の組成物を動物に投与することにより、標的とされた細胞にカセットが取り込まれ、次いでレトロトランスポジションを引き起こす。
【００６２】
レトロトランスポジションを用いて修正される遺伝学的な欠陥は、嚢胞性線維症、ジストロフィン遺伝子の突然変異、血液凝固に関連する遺伝学的な欠陥及びその他の公知又は未知の遺伝学的な欠陥（例えば、リソソーム蓄積症及び他の代謝性疾患）を含むがそれらに限定はされない。
【００６３】
更に別の態様では、未だ特徴付けられていない遺伝子又はそれらの生物学的に活性なフラグメントを細胞中で同定するための方法が提供されるが、当該方法は、本発明の合成ＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１遺伝子及び検出可能なタグ配列を投与し、そのタグ配列を発現している細胞を同定し、そのタグ配列に隣接するＤＮＡを単離して特徴付ける方法である。別の態様では、本発明の方法は未だに知られていない又はクローン化できていない遺伝子をクローニングすることを包含してもよい。「タグ」ＤＮＡは、ｎｅｏＲ、ＧＦＰ遺伝子、ｌａｃＺ等から選択されてもよいが、これらに限定はされない。
【００６４】
細胞中へのタグＤＮＡのレトロトランスポジションに次いで、ゲノムに挿入されたタグ配列を有する細胞を同定する際に、当業界で周知の多くの手法を用いてもよい。例えば、ハイブリダイゼーションが使用されてもよく、そこではタグＤＮＡからなるプローブがタグＤＮＡ又はＲＮＡを有する細胞を同定するために使用される。タグＤＮＡがタンパク質として発現される場合、タグタンパク質を発現している細胞の同定にあったて多様な免疫学的手法を用いてもよい。このような手法は当業界で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ら,（上記）に記載されている。タグＤＮＡに隣接するＤＮＡは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（上記）に記載されている一般的な手法で単離されクローン化されてもよく、その結果未だに知られていないＤＮＡの遺伝子及び領域の同定及び特徴付けが達成される。
【００６５】
本明細書で使用される「レトロトランスポジション」は、ゲノム中へ配列を組込み、ゲノム中で前記配列を発現させ、当該配列の染色体外コピーを作成するために組込まれた配列を逆転写し、ゲノム中へ配列を再組込みする過程を包含する。
【００６６】
本明細書で使用される「遺伝子」は、遺伝子のエクソン及びイントロンの両者を含む現実の遺伝子を包含する。
【００６７】
本明細書で使用される「異種のＤＮＡ」は、それが挿入された細胞で天然には見出されないＤＮＡを包含する。例えば、マウス又は細菌のＤＮＡがヒト細胞のゲノムに挿入されたとき、本明細書では、これらのＤＮＡは「異種のＤＮＡ」とされる。一方、本明細書で使用される「同種のＤＮＡ」なる用語は、それが挿入された細胞で天然に見出されるＤＮＡを意味する。例えば、マウス細胞のゲノムにマウスＤＮＡが挿入されることは、その細胞への「同種のＤＮＡ」の挿入を意味する。後者の場合、同種のＤＮＡが天然に見出される細胞ゲノム中での部位に、それが挿入される必要はなく、むしろ、同種のＤＮＡは、天然に見出されるのとは異なる部位に挿入され、それによって、挿入部位に遺伝的な改変（突然変異）を生じさせてもよい。
【００６８】
本明細書で使用される「Ｌ１ではないＤＮＡ」は、Ｌ１因子には天然で生じていないＤＮＡを包含する。
【００６９】
本発明の態様が、本明細書中で開示されるＤＮＡ配列に限定して解釈されるべきではないものと認識されたい。開示されたＤＮＡ配列と同様の機能を実質的に有する同種のＤＮＡ配列も、本発明に包含されるとみなされる。さらに、（本質的に同じ機能を有するレトロトランスポゾンＯＲＦ等の）密接に関連する構造間の遺伝子配列は非常に多様であるが、このような配列も本発明に同様に包含されるものと認識されている。
【００７０】
本明細書で使用されるように、「相同性」なる用語は、２つの重合分子間の、例えば２つの核酸分子間の、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのポリペプチド分子間の、サブユニット配列の相同性又は類似性を指す。２つの分子の両者でサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められているとき、例えば２つのポリペプチド分子のそれぞれにおいて一つの部位がフェニルアラニンで占められているならば、それらはその部位において相同である。％相同性で最も明確に定義される２つの配列間の相同性は、同一である位置の数に直接相関している。例えば、２つのポリペプチド配列中で半分の位置（例えば、１０サブユニットの長さのポリマー中で５つの位置）が同一であるならば、２つの配列は５０％の相同性を示すものであり、７０％の部位、例えば１０のうち７、が一致又は相同ならば、２つの配列は７０％の相同性を有するものである。例として挙げると、ポリペプチド配列ＡＣＤＥＦＧとＡＣＤＨＩＫは５０％の相同性を有し、ヌクレオチド配列ＣＡＡＴＣＧとＣＡＡＧＡＣは５０％の相同性を有する。
【００７１】
本明細書で使用される「相補性」は、２つの核酸、例えば２つのＤＮＡ分子間のサブユニット配列の相補性を指す。例えば、両方の分子においてヌクレオチドの位置が、常態で互いに塩基対を形成できるヌクレオチドで占められているとき、核酸はその位置で互いに相補的であるとみなされる。このように、それぞれの分子において実質的な数（少なくとも５０％）の対応する位置が、常態で互いに塩基対を形成するヌクレオチド（例えば、Ａ：Ｔ及びＧ：Ｃ）で占められているとき、２つの核酸は互いに相補的である。
【００７２】
本明細書中で考察されるように、本発明のある態様は、細胞中で遺伝的な疾患を修正するために遺伝子治療で使用してもよいタンパク質産生物をコードするＤＮＡを提供する。このようなタンパク質は、天然のポリペプチド配列を包含してもよく、又、一般に遺伝子治療剤としてより適し細胞中でより安定なタンパク質を提供する修飾体を包含してもよいと理解されるべきである。
【００７３】
本発明の更なる態様は、細胞のゲノム中に挿入されるＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質又はペプチドのアナログを提供する。アナログは、保存的なアミノ酸配列の差異によって又は配列に影響を与えない修飾によって、又はその両者によって、天然に生じるタンパク質又はペプチドとは異なることができる。例えば、保存的なアミノ酸変化はタンパク質又はペプチドの一次配列を改変するが、その機能はそのまま改変しないものであるが、そのような保存的なアミノ酸変化が為されるかもしれない。保存的なアミノ酸置換は、一般的に以下のグループ間：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン；での置換を含むがこれらのグループに限定はされない。
【００７４】
（一次配列をそのまま改変しない）修飾は、例えば、アセチル化又はカルボキシル化のようなインビボ又はインビトロでのポリペプチドの化学的な誘導体を包含する。糖付加の修飾、例えばポリペプチド合成及びプロセッシングの間に又は更なるプロセッシング過程において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、例えば糖付加に影響を与える酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化又は脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝すことによる糖付加の修飾も、包含される。リン酸化アミノ酸残基、例えばリン酸化チロシン、リン酸化セリン、リン酸化トレオニンを有する配列も包含される。後者の例において、再構成された核酸／タンパク質粒子が送達に使用されるならば、これは最も適用できるであろう。それは、インビボ送達が後に続く、本質的なインビトロでの修飾である。
【００７５】
タンパク質分解に対する耐性を改良するために又は溶解特性を最適化するために又は治療剤としてそれらをより適合させるために、一般的な分子生物学的な技術を用いて修飾されたポリペプチドも包含される。このようなポリペプチドのアナログは、天然に生じるＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸又は天然には生じない合成アミノ酸を含むものを包含する。本発明のペプチドは、本明細書中に列挙された特定の例示的な工程のいずれの産生物にも限定されない。
【００７６】
本明細書で使用される「遺伝学的な欠陥の修正」なる用語は、遺伝学的な欠陥により機能が異常とみなされた細胞に対して、正常な機能を回復する量で細胞中に野生型遺伝子産物を発現することを包含する。この用語は、実際に欠陥タンパク質を発現している細胞以外の細胞タイプに欠陥遺伝子の野生型コピーを送達することによって、動物の遺伝学的な欠陥が修正されるという状況にも適用される。他の細胞に遺伝子の野生型コピーを発現させること、及び、そこで発現された野生型タンパク質を分泌することも、動物で遺伝学的な欠陥を修正するために役立つものである。
（実施例）
【００７７】
本発明はここに記載される実施例に限定されて解釈されるべきではなく、むしろ、本発明は本明細書中で提供される全ての適用及び当業者の技術の範囲内にある全ての均等物のいずれをも含むと解釈されるべきであると認識されたい。
【実施例１】
【００７８】
ｓｍＯＲＦ２及びＯＲＦ１配列は、マウスＬ１ ＯＲＦｓ内のそれぞれのコドンを、高発現しているヒト遺伝子内の好まれるコドンで置換することによって作成された（Ｈａａｓら，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３１５−３２４）。配列は、ユニークな切断部位を導入し、遺伝子の会合を阻害したかもしれない潜在的なヘアピン構造を排除するサイレント突然変異でさらに改変された。ｓｍＯＲＦ２の両方の鎖を集合的にコードする６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドはキアゲン社のものを用い、遺伝子合成（Ｓｔｅｍｍｅｒ ら，１９９５，Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３）が図１ｂに示されるようにそれぞれ５００ｂｐセグメントで実施された。
【００７９】
会合反応液は、全量２５μｌ中にそれぞれのプライマー３０ｎＭと１×ＥｘＴａｑ ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を含んでいた。増幅反応液は、全量２５μｌ中にそれぞれのアウタープライマー０．５μＭ、２．５μｌの会合反応液及び１×ＥｘＴａｑ ｍｉｘを含んでいた。ＰＣＲ条件は、９４℃４分間、９４℃３０秒間−６５℃３０秒間−７２℃３０秒間が２５サイクルで７２℃７分間がそれに続いた。ＰＣＲ産生物は、ｐＣＲＩＩ中にＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローン化された。２４−４８クローンの全てがそれぞれのフラグメントについて配列決定され、突然変異が標準的なクローニング技術によって取り除かれた。最後に、合成されたフラグメントはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−中に共に連結された。使用されたオリゴヌクレオチド配列は図１０に示される。
【００８０】
融合ベクターが（図１ｃに示されるように）調製され、そこではテスト配列（ｌａｃＺ、ｍＯＲＦ２又はｓｍＯＲＦ２）がＧＦＰ ＯＲＦの下流にフレームに合わせて繋がれた。独立したｎｅｏ転写物も挿入された。
【００８１】
ｓｍＯＲＦ２の発現が、次いでイムノブロット解析によって解析された。細胞は、５％のＳＤＳ／ＰＢＳ中に回収され、次いで超音波処理された。全溶解産物は、７．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供され、ポリフッ化ビニリデン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写された。抗体とのインキュベーションが０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０及び５％のミルクを含むＰＢＳ中で実施された。０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄された。抗ＧＦＰ（ＦＬ）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）が１：２５０希釈で使用された。抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）が１：５０００希釈で使用された。ブロットはＥＣＬ−ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出された。
【００８２】
ヒト及びマウス両者の細胞において、ＧＦＰｓｍＯＲＦ２の形質導入は野生型ＧＦＰｍＯＲＦ２と比較してＲＮＡ量の大規模な増加を引き起こした（図１ｄ、上段、レーン３及び４）。ｍＯＲＦ２のエンドヌクレアーゼ活性及び逆転写酵素活性を破壊する２つの突然変異の導入は、さらにｓｍＯＲＦ２ ＲＮＡレベルのわずかな増加を提供した（図１ｄ、上段、レーン５）。ベクターにコードされるｎｅｏ転写物に対するプローブは、これらのＲＮＡの増加が形質導入効率又は負荷の違いによらないことを示していた（図１ｄ、中段）。抗ＧＦＰを用いたこれらの試料のイムノブロット（図１ｄ、下段）は、タンパク質のレベルがＲＮＡの増加と相関することを示し、哺乳動物のシステムでリコンビナントの全長ＯＲＦ２タンパク質が検出可能な量で再現可能に発現できることを示した注目すべき最初の例であることを示した。
【実施例２】
【００８３】
増加したＲＮＡレベルがレトロトランスポゾンによる転位効率の改変を引き起こしたか否かを決定するために、確立された組織培養アッセイ、レトロトランスポジションアッセイ（図２ａ）が、ＨｅＬａ細胞で相対的なレトロトランスポゾンによる転位頻度を測定するのに使用された。ＨｅＬａ細胞での標準的なレトロトランスポジションアッセイは、基本的にはＭｏｒａｎら，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７：９１７−９２７に記載されるように実施した。形質導入された細胞は、１０−１２日間２００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンで選択され、それから計数され、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８で１０日間培養された。コロニーは０．４％ギムザを含むＰＢＳで染色された。
【００８４】
ｍＯＲＦ２は、全長のマウスＬ１中でｓｍＯＲＦ２と置換され、部分的に合成されたマウスＬ１（ｐｓｍＬ１）が作成された。再コードされたｍＯＲＦ２はレトロトランスポジションに必要とされる潜在的に重要なシス作用配列（例えば、内部リボゾーム挿入部位）を欠いているかもしれないと考えられたので、ｍＯＲＦ２の最初の約５００ｂｐが野生型のＬ１配列からなり残りが合成である、部分的に合成されたＯＲＦ２の変形物（ｐｓｍＬ１−２）も構築した。ＨｅＬａ細胞で、ｐｓｍＬ１及びｐｓｍＬ１−２の両者が野生型のｍＬ１より約２０−２５倍以上活性であった（図２ｂ）。合成されたｍＯＲＦ１（ｓｍＯＲＦ１）及び部分的に合成されたｍＯＲＦ１の変形物の合成と取り込みは、更なるレトロトランスポジションの増加を引き起こし、２つの完全に合成されたＯＲＦを有する因子で、野生型に対して最大で２００倍以上の増加に達した（図２ｂ）。
【００８５】
ＨｅＬａ、３Ｔ３及びＬ細胞における一過性のレトロトランスポジションアッセイが、基本的にはＷｅｉら，２０００，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８４：４３５−４３８に記載されるように実施された。それぞれの転位構築物は、ＧＦＰ発現プラスミドｐＴｒａｃｅｒＥＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて共に形質導入され、形質導入効率が標準化された。形質導入後２４時間で、細胞は１００ｍｍ皿に１：２、１：２０及び１：２００に分割された。形質導入後３６時間で、希釈された細胞はＧ４１８で選択され、残った細胞はフローサイトメトリーでＧＦＰの発現について解析され、形質導入効率が標準化された。３Ｔ３細胞は１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で選択され、Ｌ細胞は４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で選択された。コロニーは０．４％のギムザ又は０．５％のクマシーブリリアントブルーで染色された。
【００８６】
一過性アッセイの使用により、合成のマウスＬ１（ｐＣＥＰｓｍＬｌ）レトロトランスポジション頻度が、野生型の天然のヒトＬ１及び野生型の天然のマウスＬ１のそれと比較された（Ｎ＝３）。ＨｅＬａ、３Ｔ３及びＬ細胞に対するｐＪＭ１０１Ｌｌｒｐコロニーの平均的な絶対値（形質導入された１０６細胞当たりのコロニー数）は、それぞれ２９０４、１０８及び１５６８であった。
【表１】
【実施例３】
【００８７】
ｓｍＬ１のＧ４１８耐性コロニーが真正なＬ１レトロトランスポーズによるものであることを確認するために、６つのｓｍＬ１挿入を特徴付けた。完全な挿入と隣接している配列のそれぞれを増幅することができるインバースポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、突然変異部位が同定された。それぞれのプライマー対に対して、親のＨｅＬａ細胞は空の部位を示す産物のみを産生した（図３ａ、奇数レーン）が、一方対応するＧ４１８耐性コロニーは空の部位（empty site）及び予想されるサイズの完全長ｓｍＬ１挿入産物の両者を産生した（図３ａ、偶数レーン）。
【００８８】
一般的な構造とゲノム隣接部を決定するために、アンプリコンがクローン化され配列決定された。組込み部位は、基本的にＭｏｒｒｉｓｈら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３１：１５９−１６５に記載されるようにインバースＰＣＲによって決定された。それぞれのクローンから得られたゲノムＤＮＡ（５μｇ）がＥｃｏＲＩで消化され、熱で不活化され、１ｍｌに希釈され、一晩連結され、エタノールで沈殿され、３０μｌの水に再懸濁され、オリゴヌクレオチドＪＢ６４６６／６４６７（１回目）及びＪＢ６４６８／６４６９（２回目）を用いる２回のインバースＰＣＲに供された。ＪＢ３５２９、ＪＢ３５３０及びＪＢ３５３１での配列決定は３０の隣接配列を同定した。隣接配列に基づくプライマーが、無傷のｓｍＬ１挿入を増幅するのに使用され、増幅されたｓｍＬ１挿入物は続けて配列決定された。
【００８９】
図３ｂに要約するように、全てのアンプリコンが適切にスプライシングされたｎｅｏ遺伝子、ポリＡテイルを示し、ほとんど（６のうち５）が５〜１０８ｂｐの長さの標的部位複製物を有していた。挿入番号１０は１０ｂｐの標的欠失を有し、挿入番号１８は５’Ｌ１逆位を有し、特徴はＬ１挿入に共通して見出された。
【００９０】
さらに、様々な染色体が標的として使用され、標的部位複製物から推測されるエンドヌクレアーゼ切断部位は以前に報告された変性コンセンサス（下の鎖において５’−ＴＴＴＴ／ＡＡ−３’）（図３ｃ）に一致した。
【実施例４】
【００９１】
合成のマウスＬ１レトロトランスポゾンの活性が、野生型のヒト及びマウスＬ１とマウス細胞において比較された。標識されたレトロトランスポゾンを導入するために使用されたエピソーム性のプラスミドはマウス細胞中で効率よく複製されないので、３Ｔ３及びＬ細胞中での一過性レトロトランスポジションアッセイが使用された。（図２ｂ及び表１のｐＴＮ２０１及びｐＣＥＰｓｍＬ１を比較し）標準的なアッセイで得られる相対的なレトロトランスポジション頻度を確認するために、ＨｅＬａ細胞での一過性レトロトランスポジションアッセイも実施された。合成のマウスＬ１（ｐＣＥＰｓｍＬ１）は、マウス細胞で野生型の対応物より非常に高い頻度で（２００倍以上）レトロトランスポジションを行った。
【００９２】
さらに、ｓｍＬ１をヒトＬ１（ｐＪＭ１０１Ｌ１ｒｐ）と比較した。Ｌ１ｒｐは以前にトランスジェニックマウス系統を作成するのに使用され、マウスでレトロトランスポジション頻度の基準として使用されるからである。Ｌ１ｒｐが従来知られていた最も活性なＬ１因子であった全ての細胞タイプの試験において、ｓｍＬ１はＬ１ｒｐより非常に活性が高かった。ｓｍＬ１ｍｕｔ２を産生するためにｓｍＬ１に導入された触媒作用の突然変異は、実質的にレトロトランスポジションを消滅させた。
【実施例５】
【００９３】
野生型の全長ｍＬ１及びその合成の対応物のノーザンブロット解析が実施された。全ＲＮＡが製造者の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離された。それぞれのサンプルから得られた全ＲＮＡ（６μｇ）は、１０単位のＤＮａｓｅＩで３７℃で１５分間処理され、０．８％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で泳動され、Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ ｐｌｕｓ ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＮＥＮ）へ１０× ＳＳＣ中で一晩ブロットされ、紫外線照射により架橋された。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションが共に４２℃でＵＬＴＲＡｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ）中で実施された。続いて［’ｙ−３２Ｐ］ＡＴＰ末端ラベルされたオリゴヌクレオチドがプローブとして使用された。ＧＦＰプローブとしてＪＢ４０５７、ＧＦＰプラスミドｎｅｏプローブとしてＪＢ４０５９、トランスポジションプラスミドｎｅｏプローブとしてＪＢ４５４１、ｈｙｇプローブとしてＪＢ６３４１が使用された。洗浄が２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ及び０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで実施された。放射性シグナルは、Ｆｕｊｉイメージングプレート（Fuji imaging plates）及びＦｕｊｉスキャナー（Fuji scanner）（ＢＡＳ−１５００）で測定した。次いで再度プローブするために、沸騰した０．１×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中で１０分間３回洗浄することにより、膜からプローブが除去された。
【００９４】
野生型の全長ｍＬ１及びその合成の対応物のノーザンブロット解析によれば、合成のＬ１配列の長さの増加は全長Ｌ１ＲＮＡレベルの増加を導くことが明かとなった（図４）。ｈｙｇｒｏ形質導入／負荷コントロールによって決定されるように（データ示さず）、ｐＣＥＰｓｍＬ１はエピソームで維持することが困難なので、ｐＣＥＰｓｍＬ１ｍｕｔ２がｐＣＥＰｓｍＬ１の代わりに使用された。無傷のｐＣＥＰｓｍＬ１プラスミドは形質導入された細胞で長期間、維持されない。
【実施例６】
【００９５】
ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質に曝されたときのみレトロトランスポーズする、合成マウスレトロトランスポゾンの条件的に活性化する変形物が構築された（図５ａ）。未成熟なＲＮＡの切断を導く配列に操作可能に結合された、介在性のレポーター遺伝子（β−ＧＥＯ等）によって、合成のレトロトランスポゾンが不活性化されている構築物が作成された。このカセットには、ｌｏｘＰ組換え部位が隣接している。このＤＮＡセグメントはｃｒｅタンパク質（インビトロで提供されるか、同時トランスフェクションにより又はｃｒｅ発現トランスジェニックマウスの交配により提供される）の存在下で、ｃｒｅがｌｏｘＰ部位で組換えを行うことにより、β−ｇｅｏを欠失し、合成レトロトランスポゾンを活性化するだろう。
【００９６】
レトロトランスポジションに対するレポーターは、ＵＶで励起される緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）であり、このタンパク質は単に紫外線を照射することにより新たな突然変異を視覚的に追跡することを可能にする。これは図５ｂに示される。不活性化された及び活性化されたＤＮＡ構築物（図５ａに表される）はＨＥＬＡ細胞に形質導入され、表現型はβ−ｇｅｏ発現に対してＸ−ｇａｌ染色、トランスポジション（ｇｆｐ活性）に対して蛍光顕微鏡を用いて評価された。
【実施例７】
【００９７】
ヒト（human version）の合成Ｌ１因子が上記と同じ方法を用いて合成された。この因子はヒトＬ１因子コンセンサス（Ｂｒｏｕｈａら，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：５２８０−５２８５）のアミノ酸配列に基づいている。ＯＲＦ１及びＯＲＦ２が、内部ＯＲＦ領域及び３’ＵＴＲと同様に再度コードされ、完全な合成ヒトＬ１を作製した。
【００９８】
レトロトランスポジション活性が測定され、天然のヒトＬ１と比較して活性が数倍増加することが明らかとなった。
【００９９】
本明細書で引用されるそれぞれの特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全てが参照により本明細書中に取り込まれる。
【０１００】
本発明は特定の態様に言及することで開示されているが、本発明の他の態様及び改変が本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく当業者によって工夫されることは明かなことである。添付の特許請求の範囲は、このような態様及び均等な改変の全てを包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１ａ】図１ａは、Ｌ１構造の模式図を示すものである。ＴＳＤは標的部位の重複を、ＵＴＲは非翻訳領域を表す。
【図１ｂ】図１ｂは哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子の合成について概略図を示す。それぞれの断片をコードするオリゴヌクレオチドはＰＣＲ会合反応（PCR assembly reaction）で混合され、次いで増幅の鋳型として用いる。増幅産物はクローン化され唯一の制限部位（ＡからＪとラベルされた）で繋がれた。
【図１ｃ】図１ｃはプラスミドの構造を示す。テスト配列（ｌａｃＺ，ｍＯＲＦ２又はｓｍＯＲＦ２）がＧＦＰ ＯＲＦの下流にインフレームで挿入される。それぞれのｎｅｏ転写物は、形質転換の効率と負荷をモニターするのに使用された。プラスミドに沿って延びる短い線は、図１ｄで示された、プローブを表す。
【図１ｄ】図１ｄはｓｍＯＲＦ２発現解析を示す。上段は、ＧＦＰｌａｃＺ、ＧＦＰｍＯＲＦ２及びＧＦＰｓｍＯＲＦ２のＲＮＡ発現。中段は、負荷コントロールのＲＮＡ発現。下段は、ＧＦＰｌａｃＺ、ＧＦＰｍＯＲＦ２及びＧＦＰｓｍＯＲＦ２のタンパク質発現を示す。
【図２ａ】図２ａはレトロトランスポゾンアッセイの概略図を示す。Ｌ１因子は、それ自身のプロモーターとポリアデニル化シグナルを有する３’非翻訳領域に、イントロンで中断されたｎｅｏレポーターを含む。ｎｅｏがＬ１プロモーターから転写され、スプライシングされ、逆転写され、ゲノムに組込まれると、細胞はＧ４１８耐性となる。プラスミドの部分に沿って延びる短い線は、ＲＮＡ解析のためのプローブを表す。ＳＤはスプライスドナーを、ＳＡはスプライスアクセプターを示す。
【図２ｂ】図２ｂは、レトロトランスポゾンがＨｅＬａ細胞でアッセイされた際に得られた結果を示している（Ｎ＝３）。ｐＴＮ２０１は野生型の天然のマウスＬ１配列のみを含み、ｐＴＮ２０３は野生型の天然のマウスＬ１配列と共にＤ７０９Ｙ逆転写酵素の点突然変異を含む。ｐＴＮ２０１のコロニーの平均絶対数は、形質導入された１０６個の細胞当たり４４０である。
【図３ａ】図３ａは、それぞれ完全な挿入配列とフランキング配列を増幅したインバースポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す。それぞれの挿入配列に隣接するプライマーは、Ｇ４１８耐性クローンから増幅するために使用された。奇数のレーンは、それぞれのプライマーについて、親のＨｅＬａ細胞が空の部位の産物のみを産生したことを示している。偶数のレーンは、それぞれのＧ４１８耐性クローンが、空の部位の産物及び予想されるサイズの完全長ｓｍＬ１挿入産物の両方を産生したことを示している。
【図３ｂ】図３ｂは、クローン化された挿入物の特徴を提供する。ＴＳＤは標的部位の重複を示す。
【図３ｃ】図３ｃは、クローン化された挿入物の構造と隣接する配列の概略図を示す。挿入物ｎｏ．８はヒトゲノム配列には見られない７ｂｐ（青で強調された）の付加配列を含む。挿入物ｎｏ．１０は、ヒトゲノム配列データベースと比較して、１組の鋳型と異なる塩基対を含み、それにＬ１挿入物の直ぐ上流の１０ｂｐの欠失（青で示された）が続いている。ＴＳＤｓは赤で強調され、推定されるエンドヌクレアーゼ切断部位は下線で示されている。
【図４】図４は、マウス細胞でのｓｍＬ１発現の全ＲＮＡ解析による、高頻度なレトロトランスポジションを表している。天然、部分的に合成された及び完全に合成されたｍＬ１の発現がＨｅＬａ細胞で比較された。
【図５ａ】図５ａは、ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質に曝された時のみレトロトランスポーズする、条件的に活性化するマウスレトロトランスポゾンの概略図を表す。
【図５ｂ】図５ｂは、組織培養細胞での結果を示す。
【図６ａ】図６ａは、配列番号１（合成されたマウスＯＲＦ２）の前半部分を記載する。
【図６ｂ】図６ｂは、配列番号１（合成されたマウスＯＲＦ２）の残りの部分を記載する。
【図７】図７は、配列番号２（合成されたマウスＯＲＦ１）を記載する。
【図８ａ】図８ａは、配列番号３（合成されたヒトＯＲＦ２）の前半部分を記載する。
【図８ｂ】図８ｂは、配列番号３（合成されたヒトＯＲＦ２）の残りの部分を記載する。
【図９】図９は、配列番号４（合成されたヒトＯＲＦ１）を記載する。
【図１０ａ】図１０ａは、マウスでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号５−７２）を記載する。
【図１０ｂ】図１０ｂは、マウスでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号７３−１４３）を記載する。
【図１０ｃ】図１０ｃは、マウスでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号１４４−２０９）を記載する。
【図１１ａ】図１１ａは、ヒトでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号２１０−２６２）を記載する。
【図１１ｂ】図１１ｂは、ヒトでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号２６３−３１９）を記載する。
【図１１ｃ】図１１ｃは、ヒトでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号３２０−３７６）を記載する。
【図１１ｄ】図１１ｄは、ヒトでの実験で使用されたオリゴヌクレオチドの配列（配列番号３７７−４１１）を記載する。
【図１２ａ】図１２は、合成のマウスＬ１と天然のマウスＬ１の配列アラインメントを提供する。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ６．５．３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用して、ＯＲＦ１のＡＴＧで開始し、ＯＲＦ２の終始コドンで終了する、天然のマウスＬ１と合成のマウスＬ１の核酸ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを作成した。これらの配列について、Ｌ１ ｓｐａの塩基構成は、４１％Ａ、２０％Ｔ、２１％Ｃ、１８％Ｇである。ｓｍＬ１の塩基構成は、２７％Ａ、１４％Ｔ、３３％Ｃ、２６％Ｇである。Ｌ１ ｓｐａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号＃ＡＦ０１６０９９）が天然のマウスＬ１の配列として使用された。一致部分は灰色の陰影を付けて示されている。
【図１２ｂ】図１２ｂは、図１２ａの続きである。
【図１２ｃ】図１２ｃは、図１２ｂの続きである。
【図１２ｄ】図１２ｄは、図１２ｃの続きである。
【図１２ｅ】図１２ｅは、図１２ｄの続きである。
【図１２ｆ】図１２ｆは、図１２ｅの続きである。
【図１２ｇ】図１２ｇは、図１２ｆの続きである。
【図１２ｈ】図１２ｈは、図１２ｇの続きである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のトランスポゾン遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成されたトランスポゾン遺伝子。
【請求項２】
天然のレトロトランスポゾン遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成されたレトロトランスポゾン遺伝子。
【請求項３】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項４】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子。
【請求項５】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項６】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子。
【請求項７】
ヒトに関連したコドンを包含する、請求項１から６のいずれかに記載の合成遺伝子。
【請求項８】
それぞれのアミノ酸に対応するヒトに関連したコドンが、アラニンＧＣＣ、アルギニンＣＧＣ又はＣＧＧ、アスパラギンＡＡＧ、アスパラギン酸ＧＡＣ、システインＴＧＣ、グルタミンＣＡＧ、グルタミン酸ＧＡＧ、グリシンＧＧＣ又はＧＧＧ、ヒスチジンＣＡＣ、イソロイシンＡＴＣ、ロイシンＣＴＧ又はＣＴＣ、リジンＡＡＧ、メチオニンＡＴＧ、プロリンＣＣＣ、フェニルアラニンＴＴＣ、セリンＡＧＣ又はＴＣＣ、トレオニンＡＣＣ、トリプトファンＴＧＧ、チロシンＴＡＣ、及び、バリンＧＴＧ又はＧＴＣから選択される、請求項７に記載の合成遺伝子。
【請求項９】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子のＤＮＡ配列と約９０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項３に記載の合成遺伝子。
【請求項１０】
配列番号１と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項４に記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項１１】
配列番号１を包含する、請求項４に記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項１２】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子のＤＮＡ配列と約８０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項５に記載の合成遺伝子。
【請求項１３】
配列番号２と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項６に記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項１４】
配列番号２を包含する、請求項６に記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項１５】
前記遺伝子がマウスの遺伝子である、請求項１から１４のいずれかに記載の合成遺伝子。
【請求項１６】
配列番号３と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項４に記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項１７】
配列番号３を包含する、請求項４に記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項１８】
配列番号４と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項６に記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項１９】
配列番号４を包含する、請求項６に記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項２０】
前記遺伝子がヒトの遺伝子である、請求項１から９、１２及び１６から１９のいずれかに記載の合成遺伝子。
【請求項２１】
請求項１に記載の合成遺伝子を包含する、トランスポゾン。
【請求項２２】
請求項２に記載の合成遺伝子を包含する、レトロトランスポゾン。
【請求項２３】
請求項２から２０のいずれかに記載の合成遺伝子を包含する、哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾン。
【請求項２４】
ｉ）請求項３、７から１１、１５から１７及び２０のいずれかに記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子、及び
ｉｉ）請求項５から８、１２から１５及び１８から２０のいずれかに記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子、
を包含する、哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾン。
【請求項２５】
トランスポゾンが、天然のトランスポゾンと少なくとも同程度、効率よく転位する、請求項２１に記載のトランスポゾン。
【請求項２６】
レトロトランスポゾンが、天然のレトロトランスポゾンと少なくとも同程度、効率よくレトロトランスポーズする、請求項２２に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項２７】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンと少なくとも同程度、効率よくレトロトランスポーズする、請求項２３又は２４に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項２８】
トランスポゾンが、天然のトランスポゾンより効率よく転位する、請求項２５に記載のトランスポゾン。
【請求項２９】
レトロトランスポゾンが、天然のレトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする、請求項２６に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３０】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする、請求項２７に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３１】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより少なくとも２倍以上効率よくレトロトランスポーズする、請求項３０に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３２】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより少なくとも２５倍以上効率よくレトロトランスポーズする、請求項３１に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３３】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約１００倍以上効率よくレトロトランスポーズする、請求項３２に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３４】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約２００倍以上効率よくレトロトランスポーズする、請求項３３に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３５】
請求項１から２０のいずれかに記載の合成遺伝子を包含する、リコンビナントベクター構築物。
【請求項３６】
ベクターがサブクローニングのためのプラスミドである、請求項３５に記載の構築物。
【請求項３７】
レトロトランスポーズする頻度が、天然のベクターで観察される頻度より活性である、請求項３５又は３６に記載の構築物。
【請求項３８】
レトロトランスポーズする頻度が、天然のベクターで観察される頻度より約１００倍以上活性である、請求項３７に記載の構築物。
【請求項３９】
請求項３５から３８のいずれかに記載のリコンビナントベクター構築物で、形質導入され、形質転換され又は感染された真核細胞。
【請求項４０】
請求項１から２０のいずれかに記載の遺伝子及び望ましい遺伝子を哺乳動物に投与することを包含する、望ましい遺伝子又はその生物学的に活性なフラグメントを哺乳動物の細胞へ送達する方法。
【請求項４１】
請求項１から２０のいずれかに記載の遺伝子、望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体を包含するカセットを包含する、組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の組成物を遺伝的な疾患を有する動物に投与することを包含する、哺乳動物において遺伝的な疾患を治療する方法。
【請求項４３】
遺伝的な疾患が、血友病、パーキンソン病、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、ゴーシェ病、嚢胞性繊維症、副腎脳白質ジストロフィー、ジストロフィン遺伝子中の突然変異に関連した欠陥、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＳＣＩＤ）、アルファ−抗トリプシン欠損症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ−サックス病、サラセミア、リソソーム蓄積症及び代謝性疾患からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１から２０のいずれかに記載の遺伝子及び検出可能なタグを投与すること、タグ配列を発現する細胞を同定すること及びタグ配列に隣接するＤＮＡを特徴付けることからなる、細胞中で未だに特徴付けられていない遺伝子又はその生物学的に活性なフラグメントを同定する方法。
【請求項１】
天然のトランスポゾン遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成されたトランスポゾン遺伝子。
【請求項２】
天然のレトロトランスポゾン遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成されたレトロトランスポゾン遺伝子。
【請求項３】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項４】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成された哺乳動物のＯＲＦ２遺伝子。
【請求項５】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項６】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子と比較して高い発現レベルを示す合成された哺乳動物のＯＲＦ１遺伝子。
【請求項７】
ヒトに関連したコドンを包含する、請求項１から６のいずれかに記載の合成遺伝子。
【請求項８】
それぞれのアミノ酸に対応するヒトに関連したコドンが、アラニンＧＣＣ、アルギニンＣＧＣ又はＣＧＧ、アスパラギンＡＡＧ、アスパラギン酸ＧＡＣ、システインＴＧＣ、グルタミンＣＡＧ、グルタミン酸ＧＡＧ、グリシンＧＧＣ又はＧＧＧ、ヒスチジンＣＡＣ、イソロイシンＡＴＣ、ロイシンＣＴＧ又はＣＴＣ、リジンＡＡＧ、メチオニンＡＴＧ、プロリンＣＣＣ、フェニルアラニンＴＴＣ、セリンＡＧＣ又はＴＣＣ、トレオニンＡＣＣ、トリプトファンＴＧＧ、チロシンＴＡＣ、及び、バリンＧＴＧ又はＧＴＣから選択される、請求項７に記載の合成遺伝子。
【請求項９】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ２遺伝子のＤＮＡ配列と約９０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項３に記載の合成遺伝子。
【請求項１０】
配列番号１と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項４に記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項１１】
配列番号１を包含する、請求項４に記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項１２】
天然のＬ１レトロトランスポゾンＯＲＦ１遺伝子のＤＮＡ配列と約８０％未満の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項５に記載の合成遺伝子。
【請求項１３】
配列番号２と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項６に記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項１４】
配列番号２を包含する、請求項６に記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項１５】
前記遺伝子がマウスの遺伝子である、請求項１から１４のいずれかに記載の合成遺伝子。
【請求項１６】
配列番号３と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項４に記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項１７】
配列番号３を包含する、請求項４に記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子。
【請求項１８】
配列番号４と少なくとも約７０％の相同性を示すＤＮＡ配列を有する、請求項６に記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項１９】
配列番号４を包含する、請求項６に記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子。
【請求項２０】
前記遺伝子がヒトの遺伝子である、請求項１から９、１２及び１６から１９のいずれかに記載の合成遺伝子。
【請求項２１】
請求項１に記載の合成遺伝子を包含する、トランスポゾン。
【請求項２２】
請求項２に記載の合成遺伝子を包含する、レトロトランスポゾン。
【請求項２３】
請求項２から２０のいずれかに記載の合成遺伝子を包含する、哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾン。
【請求項２４】
ｉ）請求項３、７から１１、１５から１７及び２０のいずれかに記載の合成されたＯＲＦ２遺伝子、及び
ｉｉ）請求項５から８、１２から１５及び１８から２０のいずれかに記載の合成されたＯＲＦ１遺伝子、
を包含する、哺乳動物のＬ１レトロトランスポゾン。
【請求項２５】
トランスポゾンが、天然のトランスポゾンと少なくとも同程度、効率よく転位する、請求項２１に記載のトランスポゾン。
【請求項２６】
レトロトランスポゾンが、天然のレトロトランスポゾンと少なくとも同程度、効率よくレトロトランスポーズする、請求項２２に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項２７】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンと少なくとも同程度、効率よくレトロトランスポーズする、請求項２３又は２４に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項２８】
トランスポゾンが、天然のトランスポゾンより効率よく転位する、請求項２５に記載のトランスポゾン。
【請求項２９】
レトロトランスポゾンが、天然のレトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする、請求項２６に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３０】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより効率よくレトロトランスポーズする、請求項２７に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３１】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより少なくとも２倍以上効率よくレトロトランスポーズする、請求項３０に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３２】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより少なくとも２５倍以上効率よくレトロトランスポーズする、請求項３１に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３３】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約１００倍以上効率よくレトロトランスポーズする、請求項３２に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３４】
レトロトランスポゾンが、天然のＬ１レトロトランスポゾンより約２００倍以上効率よくレトロトランスポーズする、請求項３３に記載のレトロトランスポゾン。
【請求項３５】
請求項１から２０のいずれかに記載の合成遺伝子を包含する、リコンビナントベクター構築物。
【請求項３６】
ベクターがサブクローニングのためのプラスミドである、請求項３５に記載の構築物。
【請求項３７】
レトロトランスポーズする頻度が、天然のベクターで観察される頻度より活性である、請求項３５又は３６に記載の構築物。
【請求項３８】
レトロトランスポーズする頻度が、天然のベクターで観察される頻度より約１００倍以上活性である、請求項３７に記載の構築物。
【請求項３９】
請求項３５から３８のいずれかに記載のリコンビナントベクター構築物で、形質導入され、形質転換され又は感染された真核細胞。
【請求項４０】
請求項１から２０のいずれかに記載の遺伝子及び望ましい遺伝子を哺乳動物に投与することを包含する、望ましい遺伝子又はその生物学的に活性なフラグメントを哺乳動物の細胞へ送達する方法。
【請求項４１】
請求項１から２０のいずれかに記載の遺伝子、望ましい遺伝子及び薬学的に許容される担体を包含するカセットを包含する、組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の組成物を遺伝的な疾患を有する動物に投与することを包含する、哺乳動物において遺伝的な疾患を治療する方法。
【請求項４３】
遺伝的な疾患が、血友病、パーキンソン病、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、ゴーシェ病、嚢胞性繊維症、副腎脳白質ジストロフィー、ジストロフィン遺伝子中の突然変異に関連した欠陥、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＳＣＩＤ）、アルファ−抗トリプシン欠損症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ−サックス病、サラセミア、リソソーム蓄積症及び代謝性疾患からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１から２０のいずれかに記載の遺伝子及び検出可能なタグを投与すること、タグ配列を発現する細胞を同定すること及びタグ配列に隣接するＤＮＡを特徴付けることからなる、細胞中で未だに特徴付けられていない遺伝子又はその生物学的に活性なフラグメントを同定する方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１２ｅ】
【図１２ｆ】
【図１２ｇ】
【図１２ｈ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１２ｅ】
【図１２ｆ】
【図１２ｇ】
【図１２ｈ】
【公表番号】特表２００７−５１５９４１（Ｐ２００７−５１５９４１Ａ）
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３３２３９（Ｐ２００６−５３３２３９）
【出願日】平成１６年５月１８日（２００４．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１５８１０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９７８９
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５０５０４５９０８）ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１８日（２００４．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１５８１０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９７８９
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５０５０４５９０８）ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ (21)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]