合成遺伝子
本発明は、合成遺伝子を産生、このような遺伝子のライブラリーの作製、ならびに、それらの遺伝子および対応するコードされたポリマーペプチドの操作および特徴づけのためのストラテジー、方法、ベクター、試薬およびシステムを提供する。１つの局面において、これらの合成遺伝子は、ポリケチドシンターゼポリペプチドをコードし得、そして、治療的学的に重要であるかまたは商業上重要である、ポリケチド化合物の産生を容易にする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在する遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子であって、ここで、該合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とは異なっており、ここで、
ａ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列と約９０％未満の同一性であり、そして／または
ｂ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列において存在しないかまたは特有ではない少なくとも１つの特有な制限部位を含み、そして／または
ｃ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列において存在する少なくとも１つの制限部位を有さない、
合成遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記ポリペプチドセグメントは、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に由来する、合成遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記ポリペプチドセグメントは、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ、およびＴＥから選択されるＰＫＳドメインを含む、合成遺伝子。
【請求項４】
１以上のＰＫＳモジュールをコードする、請求項３に記載の合成遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の合成遺伝子であって、Ｓｐｅ Ｉ認識部位、Ｍｆｅ Ｉ認識部位、Ａｆｉ ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ ＷＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、Ｎｇｏ ＭＩＶ認識部位、ＮｈｅＩ認識部位、ＫｐｎＩ認識部位、ＭｓｃＩ認識部位、Ｂｇｌ ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ ＨＩＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＡｇｅＩ認識部位、ＰｓｔＩ認識部位、ＫａｓＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位、ＳｐｈＩ認識部位、Ｂｓｐ Ｅ認識部位、およびＮｇｏ ＭＩＶ認識部位からなる群より選択される制限酵素認識部位のモジュールコード配列につき多くて１つのコピーを含む、合成遺伝子。
【請求項６】
請求項１に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列が、前記天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列に存在する少なくとも１つのＩＩＳ型酵素制限部位を含まない、合成遺伝子。
【請求項７】
天然に存在するＰＫＳ遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子であって、ここで、該合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在するＰＫＳ遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とはことなり、かつ、以下：
ａ）モジュールのアミノ末端をコードする配列の近位のＳｐｅ Ｉ部位；
ｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｆｅ Ｉ部位；
ｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＫｐｎ Ｉ部位；
ｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｓｃ Ｉ部位；
ｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＰｓｔ Ｉ部位；
ｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＢｓｒＢ Ｉ部位；
ｇ）ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＡｇｅ Ｉ部位；
ｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＸｂａ Ｉ部位
のうち少なくとも２つを含む、合成遺伝子。
【請求項８】
請求項１に記載の合成遺伝子を含む、ベクター。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
各々、請求項１に記載の合成遺伝子を含むベクターのライブラリー。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターであって、第１のＰＫＳモジュールをコードするオープンリーディングフレームならびに以下のａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のうちの１つ以上を含み、
ここで、ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、
ａ）ＰＫＳ伸長モジュール；
ｂ）ＰＫＳローディングモジュール；
ｃ）チオエステラーゼドメイン；および
ｄ）ペプチド間リンカー
である、ベクター。
【請求項１２】
請求項９に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１３】
前記ベクターによってコードされるポリペプチドを含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞であって、機能的ポリケチドシンターゼを含み、前記ＰＫＳが、前記ベクターによってコードされるポリペプチドを含む、細胞。
【請求項１５】
ポリケチドを生成する方法であって、請求項１４に記載の細胞を、ポリケチドが産生される条件の下で培養する工程を包含し、ここで、該ポリケチドは、前記ベクターの非存在の下で該細胞によって産生されない、方法。
【請求項１６】
複数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子を含む遺伝子ライブラリーであって、ここで、該ライブラリーのモジュールコード遺伝子は、共通の制限部位を少なくとも１つ有しており、該制限部位は、各モジュール中で１回を超えて見出されず、そして、該ライブラリーにコードされるモジュールは、５つ以上の異なるポリケチドシンターゼタンパク質由来のモジュールに対応する、遺伝子ライブラリー。
【請求項１７】
前記モジュールコード遺伝子が、共通して少なくとも３つの制限部位を含む、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
請求項１６に記載のライブラリーであって、前記特有の制限は、
Ｓｐｅ Ｉ認識部位、Ｍｆｅ Ｉ認識部位、Ａｆｉ ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ ＷＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、Ｎｇｏ ＭＩＶ認識部位、ＮｈｅＩ認識部位、ＫｐｎＩ認識部位、ＭｓｃＩ認識部位、Ｂｇｌ ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ ＨＩＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＡｇｅＩ認識部位、ＰｓｔＩ認識部位、ＫａｓＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位、ＳｐｈＩ認識部位、Ｂｓｐ Ｅ認識部位、およびＮｇｏ ＭＩＶ認識部位からなる群より選択される、遺伝子ライブラリー。
【請求項１９】
請求項１６に記載のライブラリーであって、ここで、前記共通する少なくとも１つの制限部位は、以下
ａ）モジュールのアミノ末端をコードする配列の近位のＳｐｅ Ｉ部位；および／または
ｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｆｅ Ｉ部位；および／または
ｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＫｐｎ Ｉ部位；および／または
ｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｓｃ Ｉ部位；および／または
ｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＰｓｔ Ｉ部位；および／または
ｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＢｓｒＢ Ｉ部位；および／または
ｇ）ＫＲドメインののアミノ末端をコードする配列の近位のＡｇｅ Ｉ部位；および／または
ｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＸｂａ Ｉ部位
である、ライブラリー。
【請求項２０】
前記遺伝子が、クローンにングベクターまたは発現ベクターに含まれる、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項２１】
請求項２０に記載のライブラリーであって、各ＰＫＳモジュールコード遺伝子は、以下：
ａ）少なくとも第２のＰＫＳ伸長モジュール；または
ｂ）ＰＫＳローディングモジュール；または
ｃ）チオエステラーゼドメインまたは
ｄ）ポリペプチド間リンカー
についてのコード配列をさらに含む、ライブラリー。
【請求項２２】
クローニングベクターであって、示された順序で、
ａ）ＳＭ４−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１または
ｂ）Ｌ−ＳＩＳ−ＳＭ２Ｒ１
を含み、ここで、ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＳＭ２は、第１の選択マーカーをコードする配列であり、ＳＭ４は、第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素のための認識部位であり、そして、Ｌは、様々な制限酵素のための認識部位である、
クローニングベクター。
【請求項２３】
ＳＭ２およびＳＭ４が、薬物耐性を与える遺伝子である、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１に記載のベクターおよびＲ１を認識する制限酵素を含む、組成物。
【請求項２５】
請求項２２に記載のクローニングベクターであって、ここで、前記ＳＩＳは、−Ｎｌ−Ｒ２−Ｎ２−を含み、ここで、Ｎ１およびＮ２は、ニック形成酵素のための認識部位であり、そして、これらは、同じであっても異なってもよく、Ｒ２は、Ｒ１またはＬとも異なる、制限酵素のための認識部位である、クローニングベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターおよびニック形成酵素を含む、組成物。
【請求項２７】
ベクターであって、以下：
ａ）ＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒｌまたは
ｂ）Ｌ−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒｌ
であり、
ここで、２Ｓ１は、第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位であって、
ここで、２Ｓ２は、異なるＩＩＳ制限酵素のための認識部位であり、そして、
Ｓｙは、シントンコード領域である、
ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターであって、Ｓｙが、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをを含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項２６に記載のベクターおよび２Ｓ１または２Ｓ２のいずれかを認識するＩＩＳ型制限酵素を含む、組成物。
【請求項３０】
ベクターの同族対を含む組成物であって、ここで、該同族対は、
ａ）２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含む第１のベクターおよび
２Ｓ３を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ５−２Ｓ３−Ｓｙ２−２Ｓ４−ＳＭ３−Ｒｌを含む第２のベクター；
または
ｂ）２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されるＬ−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含む、第１のベクターおよび
２Ｓ３を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されるＬ’−２Ｓ３−Ｓｙ２−２Ｓ４−ＳＭ３−Ｒｌを含む第２のベクター
であり、
ここで、ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３、ＳＭ４は、異なる選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素についての認識部位であり、ＬおよびＬ’は、Ｒ１と同一でものであるか同じものもしくは異なるものであるか、または各々違うものであり、２Ｓ１、２Ｓ２’、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり、ここで、２Ｓ１と２Ｓ２は、同じもではなく、２Ｓ３と２Ｓ４は、同じものではなく、そして、該２Ｓ２を伴う第１のベクターおよび該２Ｓ３を有する第２のベクターの消化によって、適合性の末端が生じる、
組成物。
【請求項３１】
２Ｓ１と２Ｓ３とは、同じであり、かつ２Ｓ２と２Ｓ４は、同じである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｓｙ１およびＳｙ２は、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードしている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
ベクターであって、第１の選択マーカー、第１の制限酵素によって認識される制限部位（Ｒ１）、第１のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位および第２のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位に隣接するシントンコード領域を含み、
ここで、該第１の制限酵素および該第１のＩＩＳ型制限酵素を用いる該ベクターの消化によって、該第１の選択マーカーおよび該シントンコード領域を含むフラグメントが産生され、
該第１の制限酵素および該第２のＩＩＳ型制限酵素を用いる消化によって、該シントンコード領域を含み該選択マーカーを含まないフラグメントを産生する、ベクター。
【請求項３４】
ベクター対を使用して一連のＤＮＡ単位を連結するための方法であって、
ａ）ＤＮＡ単位の第１のセットを、各々第１の型の選択ベクターで提供し、該第１の選択ベクターは、第１の選択マーカーを含み、そして、ＤＮＡ単位の第２の単位を、各々第２の型の選択ベクターで提供し、該第２の選択ベクターは、該第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーを含む工程であって、ここで、該第１の方の選択ベクターおよび第２の方の選択ベクターは、該異なる選択マーカーに基づき得る、工程
ｂ）該第１セットからのＤＮＡ単位を該第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第３のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択マーカーを生成して、そして、第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；
ｃ）該第３のＤＮＡ単位を第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、第１の選択マーカーについて選択することによって、所望のクローンを得るか、もしくは
該第３のＤＮＡ単位を第２のシリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして、第２の選択マーカーについて選択することによって、所望のクローンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、
工程（ｃ）は、第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得する工程であって、
該方法は、該第４のＤＮＡ単位を第２シリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または
該第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、
工程（ｃ）は、第３のＤＮＡ単位を、第２のシリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得ことを包含し、
該方法は、該第４のＤＮＡ単位を第１のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または
該第３のＤＮＡ単位を、第１セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、前記所望されるクローンが、ＰＫＳドメインをコードする配列を含む、方法。
【請求項３８】
数個のＤＮＡ単位を連続して連結するための方法であって、
該方法は、以下のａ）〜ｅ）の工程：
ａ）アクセプターベクターフラグメントと、ドナーベクターフラグメントとを連結する工程を含む第１ラウンドの編成を実行する工程であって、
該アクセプターベクターフラグメントは、第１のシントンＳＡ０、連結可能末端ＬＡ０、シントンＳＡ０および隣接するシントンＳＤ０の接続部末端、ならびに別の連結可能末端ｌａ０を含み、
該ドナーベクターフラグメントは、第２のシントンＳＤ０、連結可能末端ＬＤ０、シントンＳＤ０およびシントンＳＡ０の接続部末端（ここで、ＬＤ０およびＬＡ０は、適合しており）、別の連結可能末端ｌｄ０（ここで、ｌｄ０とｌａ０は、適合性である）ならびに選択マーカーを含み、
ここで、ＬＡ０とＬＤ０が、連結され、ｌａ０とｌｄ０が連結され、それによって、該第１のシントンと該第２のシントンを連結し、それによって、シントンコード配列Ｓ１を含む第１のベクターを生成する工程；
ｂ）工程（ａ）における選択マーカーについて選択することによって該第１のベクターについて選択する工程；ならびに
ｃ）回数ｎの別のラウンドの編成を実施する工程であって、
ここで、ｎは、１〜２０の整数であり、ここで、Ｓｎは、編成の前のラウンドにおけるシントンを連結することによって生成されるシントンコード配列であり、そして、ここで、
編成の各々のラウンドｎは、以下の１）〜２）：
１）アクセプターベクターＡｎまたはドナーベクターＤｎのいずれかとして該第１のベクターまたは次のベクターを示すこと
２）制限酵素を用いてアクセプターベクターＡｎを消化して、アクセプターベクターフラグメントを生成することであって、該アクセプターベクターフラグメントは、シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＤｎ＋１００との接続末端にある連結可能ＬＡｎ、および別の連結可能末端ｌａｎを含み、
該アクセプターベクターフラグメントをドナーベクターフラグメントに連結し、ここで、該ドナーベクターフラグメントは、シントンＳＤｎ＋１００、シントンＳＤｎ＋１００とシントンＳｎの接続末端にある連結可能末端ＬＤｎ＋１００（ここで、ＬＡｎとＬＤｎ＋１００は適合性である）、別の連結可能末端ｌｄｎ＋１００（ここで、ｌａｎとｌｄｎ＋１００は適合性である）ならびに選択マーカーを含み、
ＬＡｎとＬＤｎ＋１００が、連結され、そして、ｌａｎおよびｌｄｎ＋１００が連結され、それによって次のベクターを生成すること、
あるいは、
制限酵素を用いてドナーベクターＤｎを消化して、ドナーベクターフラグメントを生成し、該ドナーベクターフラグメントは、シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＡｎ＋１００との接続末端にある連結可能ＬＤｎ、および別の連結可能末端ｌｄｎおよび選択マーカーを含み、
該ドナーベクターフラグメントをドナーベクターフラグメントに連結し、ここで、該ドナーベクターフラグメントは、シントンＳＡｎ＋１００、シントンＳＡｎ＋１００とシントンＳｎの接続末端の連結可能末端ＬＡｎ＋１００、別の連結可能末端ｌａｎ＋１００を含み、
ＬＡｎ＋１００とＬＤｎが、適合性であり、そして、連結され、そして、ｌｄｎとｌａｎ＋１００が連結され、それによって次のベクターを生成すること
を含む、工程
ｄ）工程（ｃ）の該ドナーベクターフラグメントの選択マーカーについて選択することによって次のベクターを選択する工程
ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）をｎ−１回繰り返し、それによってマルチシントンを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｄ）の前記選択マーカーが、その前の編成の選択マーカーと同じではなく、そして／または、次の編成工程の選択マーカーと同じではない、方法。
【請求項４０】
ｌａ０、ｌｄ０、ｌａｎ、ｌｄｎが同じであり、そして／またはＬＡ０、ＬＤ０、ＬＡｎ、ＬＤｎがＩＩＳ型制限酵素によって生成される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記シントンであるＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００、およびＳＤｎ＋１００が、合成ＤＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、シントンであるＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００、およびＳＤｎ＋１００のうちの１つ以上が、マルチシントンである、方法。
【請求項４３】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）のマルチシントンが、ＰＫＳドメインを含むポリペプチドをコードする、方法。
【請求項４４】
ＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を生成するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）アセンブリＰＣＲによって複数のＤＮＡ単位を生成する工程であって、ここで、各ＤＮＡ単位は、該ＰＫＳモジュールの一部分をコードする工程；
（ｉｉ）予め決定された配列で、該複数のＤＮＡ単位を組み合わせてＰＫＳモジュールコード遺伝子を産生する工程
を包含する、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、ＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはＰＫＳペプチド間リンカーをコードするヌクレオチド配列とフレームを一致させて前記モジュールコード遺伝子を組み合わせる工程であって、それによって、ＰＫＳオープンリーディングフレームを産生する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４６】
合成遺伝の設計に有用な制限酵素認識部位を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
複数の機能的関連のあるポリペプチドセグメントのためのアミノ酸配列を得る工程；
該アミノ酸配列を逆翻訳して、ポリペプチドセグメントの各々について複数のポリペプチドセグメントコード核酸配列を生成する工程；ならびに
該ポリペプチドセグメントの少なくとも約５０％で、少なくとも１つのポリペプチドセグメントコード核酸配列において見出される制限酵素認識部位を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記機能的に関連するポリペプチドセグメントが、ポリケチドシンターゼのモジュールまたはドメインである、方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法であって、ここで、前記機能的に関連するポリペプチドセグメントが、ＰＫＳモジュールまたはドメインにおいて高い相同性をもつ領域である、方法。
【請求項４９】
異なるポリペプチドをコードする配列を含む複数の異なるＤＮＡ単位のハイスループット合成のための方法であって、以下：
各ＤＮＡ単位について、複数の重複しているオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、ポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ単位を生成して、ＰＣＲ増幅によってＵＤＧ含有リンカーを該ＤＮＡ単位の５’末端および３’末端に加え、それによって、連結されたＤＮＡ単位を生成する工程
を包含し、ここで、該同じＵＤＧ含有リンカーが、該異なるＤＮＡ単位に加えられる、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記複数状態が、異なる５０を超えるＤＮＡ単位を包含する、方法。
【請求項５１】
合成遺伝子を設計するための方法であって、該方法は、以下の工程：
参照アミノ酸配列を提供する工程；
宿主細胞のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたコドンのランダムな選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳する工程；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供する工程；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き、該合成遺伝子の配列を生成する工程；および
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化ヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成する工程；
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記合成遺伝子の配列を一緒に含む重複オリゴヌクレオチド配列のセットを生成する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項５４に記載の方法であって、ここで、該合成遺伝子の配列上の制限部位の位置についての１以上のパラメーターが、選択された位置における１以上の予め選択された制限部位を含む、方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の方法であって、ここで、制限部位を挿入する前記工程が、以下：
前記ランダム化ヌクレオチド配列における選択された制限部位の挿入について選択された位置を同定すること；
該選択された位置でのヌクレオチド配列の置換を実施して、その結果、選択された制限部位配列が、該選択位置で生成される工程；
該置換された配列をアミノ酸配列に翻訳する工程；
該翻訳されたアミノ酸が選択された位置で該参照アミノ酸配列と同一である置換を認める工程；ならびに
該翻訳されたアミノ酸配列が選択された位置で参照のことアミノ酸配列と異なる置換を認めない工程；
を包含する、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、ここで、
前記参照アミノ酸配列に同一である翻訳アミノ酸配列が、選択された位置で類似のアミノ酸とアミノ酸を置換することを包含する、方法。
【請求項５６】
前記参照アミノ酸配列が、天然に存在するアミノ酸セグメントのものである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
合成遺伝子を設計するシステムであって、
該システムは、コンピュータプロセッサを備え、
該コンピュータプロセッサは、
参照アミノ酸配列を提供し；
宿主生物のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたランダムなコドンの選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳し；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供し；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き；
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化したヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成し；そして、
該合成遺伝子の配列を一緒に含む重複したオリゴヌクレオチド配列のセットを生成するように
配置される、
システム。
【請求項５８】
合成遺伝子を設計するためのコンピュータ実行コードを含むコンピュータ読み取り可能記憶媒体であって、該設計は、
以下：
参照アミノ酸配列を提供し；
宿主生物のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたランダムなコドンの選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳し；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供し；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き；
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化したヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成し；そして
該合成遺伝子の配列を一緒に含む重複したオリゴヌクレオチド配列のセットを生成するように
コンピュータが作動することを命令することによる、
コンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項５９】
シントンのヌクレオチド配列を分析するための方法であって、該方法は、以下：
合成遺伝子の配列を提供する工程であって、ここで、該合成遺伝子は、複数のシントンに分割される、工程；
複数のシントンサンプルの配列を提供する工程であって、ここで、該複数のシントンの各々が、ベクター中でクローニングされる、工程；
該ベクターの配列を挿入なしで提供する工程；
該クローンニングしたシントンの配列からベクター配列を取り除く工程；
該複数のシントンの配列のコンティグマップを構築する工程；
該配列のコンティグマップと該合成遺伝子の配列とを並置する工程；および
該複数のシントンの各々についてのアライメントの測定を程度を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、該方法は、以下：
１以上のシントン配列におけるエラーを同定する工程；および
アライメントの程度によるシントンの順位づけ、シントンサンプルの配列におけるエラー、修復され得るシントンの同一性からなる群より選択される１以上の情報を報告する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項６１】
合成遺伝子のハイスループット合成のためのシステムであって、以下：
アセンブリＰＣＲのためのオリゴヌクレオチド含む少なくとも１つの供給源マイクロウェルプレート
アセンブリＰＣＲ増幅混合物のための供給源
ＬＩＣ伸長プライマー混合物ための供給源
オリゴヌクレオチド増幅のための少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレート
液体操作デバイスおよび
少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートを受容するように配置されたＰＣＲ増幅のための熱源
を備え、
該液体操作デバイスは、該供給源マイクロウェルプレートから複数の予め決定されたセットのオリゴヌクレオチドを取り出し；
該予め決定されたセットと、該少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中の増幅混合物とを組み合わせ；
ＬＩＣ伸長プライマー混合物を取り出し；そして
該ＬＩＣ伸長プライマー混合物と、少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中にあるアンプリコンと組み合わせる、
システム。
【請求項６２】
少なくとも２つのアセンブリベクターのための供給源をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６３】
オープンリーディングフレームベクターであって、該ベクターは、
以下のａ）〜ｃ）：
ａ）内部型：４−［７−＊］−［＊−８］−３；
ｂ）左エッジ型：４−［７−１］−［＊−８］−３；および
ｃ）右エッジ型：４−［７−＊］−［６−８］−３；
から選択される構造を含み、
ここで、７および８は、適合性オーバーハング「＊」を生じるように切断するＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり；１および６は、必要に応じて存在するＩＩ型制限部位であり；そして、３および４は、８塩基対認識部位を有する制限酵素のための認識部位である、オープンリーディングフレームベクター。
【請求項６４】
１が、Ｎｄｅ Ｉであり、６が、Ｅｃｏ ＲＩであり、４が、Ｎｏｔ Ｉであり、そして、３がＰａｃ Ｉである、請求項６３に記載のベクター。
【請求項１】
天然に存在する遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子であって、ここで、該合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とは異なっており、ここで、
ａ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列と約９０％未満の同一性であり、そして／または
ｂ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列において存在しないかまたは特有ではない少なくとも１つの特有な制限部位を含み、そして／または
ｃ）該合成遺伝子の該ポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列において存在する少なくとも１つの制限部位を有さない、
合成遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記ポリペプチドセグメントは、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に由来する、合成遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記ポリペプチドセグメントは、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＳ、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ、およびＴＥから選択されるＰＫＳドメインを含む、合成遺伝子。
【請求項４】
１以上のＰＫＳモジュールをコードする、請求項３に記載の合成遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の合成遺伝子であって、Ｓｐｅ Ｉ認識部位、Ｍｆｅ Ｉ認識部位、Ａｆｉ ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ ＷＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、Ｎｇｏ ＭＩＶ認識部位、ＮｈｅＩ認識部位、ＫｐｎＩ認識部位、ＭｓｃＩ認識部位、Ｂｇｌ ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ ＨＩＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＡｇｅＩ認識部位、ＰｓｔＩ認識部位、ＫａｓＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位、ＳｐｈＩ認識部位、Ｂｓｐ Ｅ認識部位、およびＮｇｏ ＭＩＶ認識部位からなる群より選択される制限酵素認識部位のモジュールコード配列につき多くて１つのコピーを含む、合成遺伝子。
【請求項６】
請求項１に記載の合成遺伝子であって、ここで、前記合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列が、前記天然に存在する遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列に存在する少なくとも１つのＩＩＳ型酵素制限部位を含まない、合成遺伝子。
【請求項７】
天然に存在するＰＫＳ遺伝子によってコードされる参照ポリペプチドセグメントに対応するポリペプチドセグメントをコードする合成遺伝子であって、ここで、該合成遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列は、該天然に存在するＰＫＳ遺伝子のポリペプチドセグメントコード配列とはことなり、かつ、以下：
ａ）モジュールのアミノ末端をコードする配列の近位のＳｐｅ Ｉ部位；
ｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｆｅ Ｉ部位；
ｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＫｐｎ Ｉ部位；
ｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｓｃ Ｉ部位；
ｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＰｓｔ Ｉ部位；
ｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＢｓｒＢ Ｉ部位；
ｇ）ＫＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＡｇｅ Ｉ部位；
ｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＸｂａ Ｉ部位
のうち少なくとも２つを含む、合成遺伝子。
【請求項８】
請求項１に記載の合成遺伝子を含む、ベクター。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
各々、請求項１に記載の合成遺伝子を含むベクターのライブラリー。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクターであって、第１のＰＫＳモジュールをコードするオープンリーディングフレームならびに以下のａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のうちの１つ以上を含み、
ここで、ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、
ａ）ＰＫＳ伸長モジュール；
ｂ）ＰＫＳローディングモジュール；
ｃ）チオエステラーゼドメイン；および
ｄ）ペプチド間リンカー
である、ベクター。
【請求項１２】
請求項９に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１３】
前記ベクターによってコードされるポリペプチドを含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞であって、機能的ポリケチドシンターゼを含み、前記ＰＫＳが、前記ベクターによってコードされるポリペプチドを含む、細胞。
【請求項１５】
ポリケチドを生成する方法であって、請求項１４に記載の細胞を、ポリケチドが産生される条件の下で培養する工程を包含し、ここで、該ポリケチドは、前記ベクターの非存在の下で該細胞によって産生されない、方法。
【請求項１６】
複数の異なるＰＫＳモジュールコード遺伝子を含む遺伝子ライブラリーであって、ここで、該ライブラリーのモジュールコード遺伝子は、共通の制限部位を少なくとも１つ有しており、該制限部位は、各モジュール中で１回を超えて見出されず、そして、該ライブラリーにコードされるモジュールは、５つ以上の異なるポリケチドシンターゼタンパク質由来のモジュールに対応する、遺伝子ライブラリー。
【請求項１７】
前記モジュールコード遺伝子が、共通して少なくとも３つの制限部位を含む、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
請求項１６に記載のライブラリーであって、前記特有の制限は、
Ｓｐｅ Ｉ認識部位、Ｍｆｅ Ｉ認識部位、Ａｆｉ ＩＩ認識部位、Ｂｓｉ ＷＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、Ｎｇｏ ＭＩＶ認識部位、ＮｈｅＩ認識部位、ＫｐｎＩ認識部位、ＭｓｃＩ認識部位、Ｂｇｌ ＩＩ認識部位、Ｂｓｓ ＨＩＩ認識部位、ＳａｃＩＩ認識部位、ＡｇｅＩ認識部位、ＰｓｔＩ認識部位、ＫａｓＩ認識部位、ＭｌｕＩ認識部位、ＸｂａＩ認識部位、ＳｐｈＩ認識部位、Ｂｓｐ Ｅ認識部位、およびＮｇｏ ＭＩＶ認識部位からなる群より選択される、遺伝子ライブラリー。
【請求項１９】
請求項１６に記載のライブラリーであって、ここで、前記共通する少なくとも１つの制限部位は、以下
ａ）モジュールのアミノ末端をコードする配列の近位のＳｐｅ Ｉ部位；および／または
ｂ）ＫＳドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｆｅ Ｉ部位；および／または
ｃ）ＫＳドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＫｐｎ Ｉ部位；および／または
ｄ）ＡＴドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＭｓｃ Ｉ部位；および／または
ｅ）ＡＴドメインのカルボキシ末端をコードする配列の近位のＰｓｔ Ｉ部位；および／または
ｆ）ＥＲドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＢｓｒＢ Ｉ部位；および／または
ｇ）ＫＲドメインののアミノ末端をコードする配列の近位のＡｇｅ Ｉ部位；および／または
ｈ）ＡＣＰドメインのアミノ末端をコードする配列の近位のＸｂａ Ｉ部位
である、ライブラリー。
【請求項２０】
前記遺伝子が、クローンにングベクターまたは発現ベクターに含まれる、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項２１】
請求項２０に記載のライブラリーであって、各ＰＫＳモジュールコード遺伝子は、以下：
ａ）少なくとも第２のＰＫＳ伸長モジュール；または
ｂ）ＰＫＳローディングモジュール；または
ｃ）チオエステラーゼドメインまたは
ｄ）ポリペプチド間リンカー
についてのコード配列をさらに含む、ライブラリー。
【請求項２２】
クローニングベクターであって、示された順序で、
ａ）ＳＭ４−ＳＩＳ−ＳＭ２−Ｒ１または
ｂ）Ｌ−ＳＩＳ−ＳＭ２Ｒ１
を含み、ここで、ＳＩＳは、シントン挿入部位であり、ＳＭ２は、第１の選択マーカーをコードする配列であり、ＳＭ４は、第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素のための認識部位であり、そして、Ｌは、様々な制限酵素のための認識部位である、
クローニングベクター。
【請求項２３】
ＳＭ２およびＳＭ４が、薬物耐性を与える遺伝子である、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１に記載のベクターおよびＲ１を認識する制限酵素を含む、組成物。
【請求項２５】
請求項２２に記載のクローニングベクターであって、ここで、前記ＳＩＳは、−Ｎｌ−Ｒ２−Ｎ２−を含み、ここで、Ｎ１およびＮ２は、ニック形成酵素のための認識部位であり、そして、これらは、同じであっても異なってもよく、Ｒ２は、Ｒ１またはＬとも異なる、制限酵素のための認識部位である、クローニングベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターおよびニック形成酵素を含む、組成物。
【請求項２７】
ベクターであって、以下：
ａ）ＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒｌまたは
ｂ）Ｌ−２Ｓ１−Ｓｙ２−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒｌ
であり、
ここで、２Ｓ１は、第１のＩＩＳ型制限酵素の認識部位であって、
ここで、２Ｓ２は、異なるＩＩＳ制限酵素のための認識部位であり、そして、
Ｓｙは、シントンコード領域である、
ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターであって、Ｓｙが、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをを含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項２６に記載のベクターおよび２Ｓ１または２Ｓ２のいずれかを認識するＩＩＳ型制限酵素を含む、組成物。
【請求項３０】
ベクターの同族対を含む組成物であって、ここで、該同族対は、
ａ）２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ４−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含む第１のベクターおよび
２Ｓ３を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されたＳＭ５−２Ｓ３−Ｓｙ２−２Ｓ４−ＳＭ３−Ｒｌを含む第２のベクター；
または
ｂ）２Ｓ２を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されるＬ−２Ｓ１−Ｓｙ１−２Ｓ２−ＳＭ２−Ｒ１を含む、第１のベクターおよび
２Ｓ３を認識するＩＩＳ型制限酵素で消化されるＬ’−２Ｓ３−Ｓｙ２−２Ｓ４−ＳＭ３−Ｒｌを含む第２のベクター
であり、
ここで、ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３、ＳＭ４は、異なる選択マーカーをコードする配列であり、Ｒ１は、制限酵素についての認識部位であり、ＬおよびＬ’は、Ｒ１と同一でものであるか同じものもしくは異なるものであるか、または各々違うものであり、２Ｓ１、２Ｓ２’、２Ｓ３および２Ｓ４は、ＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり、ここで、２Ｓ１と２Ｓ２は、同じもではなく、２Ｓ３と２Ｓ４は、同じものではなく、そして、該２Ｓ２を伴う第１のベクターおよび該２Ｓ３を有する第２のベクターの消化によって、適合性の末端が生じる、
組成物。
【請求項３１】
２Ｓ１と２Ｓ３とは、同じであり、かつ２Ｓ２と２Ｓ４は、同じである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｓｙ１およびＳｙ２は、ポリケチドシンターゼのポリペプチドセグメントをコードしている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
ベクターであって、第１の選択マーカー、第１の制限酵素によって認識される制限部位（Ｒ１）、第１のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位および第２のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位に隣接するシントンコード領域を含み、
ここで、該第１の制限酵素および該第１のＩＩＳ型制限酵素を用いる該ベクターの消化によって、該第１の選択マーカーおよび該シントンコード領域を含むフラグメントが産生され、
該第１の制限酵素および該第２のＩＩＳ型制限酵素を用いる消化によって、該シントンコード領域を含み該選択マーカーを含まないフラグメントを産生する、ベクター。
【請求項３４】
ベクター対を使用して一連のＤＮＡ単位を連結するための方法であって、
ａ）ＤＮＡ単位の第１のセットを、各々第１の型の選択ベクターで提供し、該第１の選択ベクターは、第１の選択マーカーを含み、そして、ＤＮＡ単位の第２の単位を、各々第２の型の選択ベクターで提供し、該第２の選択ベクターは、該第１の選択マーカーとは異なる第２の選択マーカーを含む工程であって、ここで、該第１の方の選択ベクターおよび第２の方の選択ベクターは、該異なる選択マーカーに基づき得る、工程
ｂ）該第１セットからのＤＮＡ単位を該第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第３のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択マーカーを生成して、そして、第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；
ｃ）該第３のＤＮＡ単位を第２のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、第１の選択マーカーについて選択することによって、所望のクローンを得るか、もしくは
該第３のＤＮＡ単位を第２のシリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして、第２の選択マーカーについて選択することによって、所望のクローンを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、
工程（ｃ）は、第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成し、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得する工程であって、
該方法は、該第４のＤＮＡ単位を第２シリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または
該第３のＤＮＡ単位を、第２セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、
工程（ｃ）は、第３のＤＮＡ単位を、第２のシリーズからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結することによって、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成し、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを取得ことを包含し、
該方法は、該第４のＤＮＡ単位を第１のセットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第１の型の選択ベクターを生成して、そして、該第１の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程；または
該第３のＤＮＡ単位を、第１セットからの隣接するＤＮＡ単位と組み換え的に連結して、第４のＤＮＡ単位を含む第２の型の選択ベクターを生成して、そして、該第２の選択マーカーについて選択することによって所望のクローンを得る工程
をさらに包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、前記所望されるクローンが、ＰＫＳドメインをコードする配列を含む、方法。
【請求項３８】
数個のＤＮＡ単位を連続して連結するための方法であって、
該方法は、以下のａ）〜ｅ）の工程：
ａ）アクセプターベクターフラグメントと、ドナーベクターフラグメントとを連結する工程を含む第１ラウンドの編成を実行する工程であって、
該アクセプターベクターフラグメントは、第１のシントンＳＡ０、連結可能末端ＬＡ０、シントンＳＡ０および隣接するシントンＳＤ０の接続部末端、ならびに別の連結可能末端ｌａ０を含み、
該ドナーベクターフラグメントは、第２のシントンＳＤ０、連結可能末端ＬＤ０、シントンＳＤ０およびシントンＳＡ０の接続部末端（ここで、ＬＤ０およびＬＡ０は、適合しており）、別の連結可能末端ｌｄ０（ここで、ｌｄ０とｌａ０は、適合性である）ならびに選択マーカーを含み、
ここで、ＬＡ０とＬＤ０が、連結され、ｌａ０とｌｄ０が連結され、それによって、該第１のシントンと該第２のシントンを連結し、それによって、シントンコード配列Ｓ１を含む第１のベクターを生成する工程；
ｂ）工程（ａ）における選択マーカーについて選択することによって該第１のベクターについて選択する工程；ならびに
ｃ）回数ｎの別のラウンドの編成を実施する工程であって、
ここで、ｎは、１〜２０の整数であり、ここで、Ｓｎは、編成の前のラウンドにおけるシントンを連結することによって生成されるシントンコード配列であり、そして、ここで、
編成の各々のラウンドｎは、以下の１）〜２）：
１）アクセプターベクターＡｎまたはドナーベクターＤｎのいずれかとして該第１のベクターまたは次のベクターを示すこと
２）制限酵素を用いてアクセプターベクターＡｎを消化して、アクセプターベクターフラグメントを生成することであって、該アクセプターベクターフラグメントは、シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＤｎ＋１００との接続末端にある連結可能ＬＡｎ、および別の連結可能末端ｌａｎを含み、
該アクセプターベクターフラグメントをドナーベクターフラグメントに連結し、ここで、該ドナーベクターフラグメントは、シントンＳＤｎ＋１００、シントンＳＤｎ＋１００とシントンＳｎの接続末端にある連結可能末端ＬＤｎ＋１００（ここで、ＬＡｎとＬＤｎ＋１００は適合性である）、別の連結可能末端ｌｄｎ＋１００（ここで、ｌａｎとｌｄｎ＋１００は適合性である）ならびに選択マーカーを含み、
ＬＡｎとＬＤｎ＋１００が、連結され、そして、ｌａｎおよびｌｄｎ＋１００が連結され、それによって次のベクターを生成すること、
あるいは、
制限酵素を用いてドナーベクターＤｎを消化して、ドナーベクターフラグメントを生成し、該ドナーベクターフラグメントは、シントンコード配列Ｓｎ、シントンＳｎと隣接するシントンＳＡｎ＋１００との接続末端にある連結可能ＬＤｎ、および別の連結可能末端ｌｄｎおよび選択マーカーを含み、
該ドナーベクターフラグメントをドナーベクターフラグメントに連結し、ここで、該ドナーベクターフラグメントは、シントンＳＡｎ＋１００、シントンＳＡｎ＋１００とシントンＳｎの接続末端の連結可能末端ＬＡｎ＋１００、別の連結可能末端ｌａｎ＋１００を含み、
ＬＡｎ＋１００とＬＤｎが、適合性であり、そして、連結され、そして、ｌｄｎとｌａｎ＋１００が連結され、それによって次のベクターを生成すること
を含む、工程
ｄ）工程（ｃ）の該ドナーベクターフラグメントの選択マーカーについて選択することによって次のベクターを選択する工程
ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）をｎ−１回繰り返し、それによってマルチシントンを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｄ）の前記選択マーカーが、その前の編成の選択マーカーと同じではなく、そして／または、次の編成工程の選択マーカーと同じではない、方法。
【請求項４０】
ｌａ０、ｌｄ０、ｌａｎ、ｌｄｎが同じであり、そして／またはＬＡ０、ＬＤ０、ＬＡｎ、ＬＤｎがＩＩＳ型制限酵素によって生成される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記シントンであるＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００、およびＳＤｎ＋１００が、合成ＤＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、シントンであるＳＡ０、ＳＤ０、ＳＡｎ＋１００、およびＳＤｎ＋１００のうちの１つ以上が、マルチシントンである、方法。
【請求項４３】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）のマルチシントンが、ＰＫＳドメインを含むポリペプチドをコードする、方法。
【請求項４４】
ＰＫＳモジュールをコードする合成遺伝子を生成するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）アセンブリＰＣＲによって複数のＤＮＡ単位を生成する工程であって、ここで、各ＤＮＡ単位は、該ＰＫＳモジュールの一部分をコードする工程；
（ｉｉ）予め決定された配列で、該複数のＤＮＡ単位を組み合わせてＰＫＳモジュールコード遺伝子を産生する工程
を包含する、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、ＰＫＳ伸長モジュール、ＰＫＳローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、またはＰＫＳペプチド間リンカーをコードするヌクレオチド配列とフレームを一致させて前記モジュールコード遺伝子を組み合わせる工程であって、それによって、ＰＫＳオープンリーディングフレームを産生する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４６】
合成遺伝の設計に有用な制限酵素認識部位を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
複数の機能的関連のあるポリペプチドセグメントのためのアミノ酸配列を得る工程；
該アミノ酸配列を逆翻訳して、ポリペプチドセグメントの各々について複数のポリペプチドセグメントコード核酸配列を生成する工程；ならびに
該ポリペプチドセグメントの少なくとも約５０％で、少なくとも１つのポリペプチドセグメントコード核酸配列において見出される制限酵素認識部位を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記機能的に関連するポリペプチドセグメントが、ポリケチドシンターゼのモジュールまたはドメインである、方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法であって、ここで、前記機能的に関連するポリペプチドセグメントが、ＰＫＳモジュールまたはドメインにおいて高い相同性をもつ領域である、方法。
【請求項４９】
異なるポリペプチドをコードする配列を含む複数の異なるＤＮＡ単位のハイスループット合成のための方法であって、以下：
各ＤＮＡ単位について、複数の重複しているオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施して、ポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ単位を生成して、ＰＣＲ増幅によってＵＤＧ含有リンカーを該ＤＮＡ単位の５’末端および３’末端に加え、それによって、連結されたＤＮＡ単位を生成する工程
を包含し、ここで、該同じＵＤＧ含有リンカーが、該異なるＤＮＡ単位に加えられる、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記複数状態が、異なる５０を超えるＤＮＡ単位を包含する、方法。
【請求項５１】
合成遺伝子を設計するための方法であって、該方法は、以下の工程：
参照アミノ酸配列を提供する工程；
宿主細胞のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたコドンのランダムな選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳する工程；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供する工程；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き、該合成遺伝子の配列を生成する工程；および
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化ヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成する工程；
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記合成遺伝子の配列を一緒に含む重複オリゴヌクレオチド配列のセットを生成する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項５４に記載の方法であって、ここで、該合成遺伝子の配列上の制限部位の位置についての１以上のパラメーターが、選択された位置における１以上の予め選択された制限部位を含む、方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の方法であって、ここで、制限部位を挿入する前記工程が、以下：
前記ランダム化ヌクレオチド配列における選択された制限部位の挿入について選択された位置を同定すること；
該選択された位置でのヌクレオチド配列の置換を実施して、その結果、選択された制限部位配列が、該選択位置で生成される工程；
該置換された配列をアミノ酸配列に翻訳する工程；
該翻訳されたアミノ酸が選択された位置で該参照アミノ酸配列と同一である置換を認める工程；ならびに
該翻訳されたアミノ酸配列が選択された位置で参照のことアミノ酸配列と異なる置換を認めない工程；
を包含する、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、ここで、
前記参照アミノ酸配列に同一である翻訳アミノ酸配列が、選択された位置で類似のアミノ酸とアミノ酸を置換することを包含する、方法。
【請求項５６】
前記参照アミノ酸配列が、天然に存在するアミノ酸セグメントのものである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
合成遺伝子を設計するシステムであって、
該システムは、コンピュータプロセッサを備え、
該コンピュータプロセッサは、
参照アミノ酸配列を提供し；
宿主生物のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたランダムなコドンの選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳し；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供し；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き；
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化したヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成し；そして、
該合成遺伝子の配列を一緒に含む重複したオリゴヌクレオチド配列のセットを生成するように
配置される、
システム。
【請求項５８】
合成遺伝子を設計するためのコンピュータ実行コードを含むコンピュータ読み取り可能記憶媒体であって、該設計は、
以下：
参照アミノ酸配列を提供し；
宿主生物のコドン使用頻度について必要に応じて最適化されたランダムなコドンの選択を使用して、該アミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードするランダム化ヌクレオチド配列へと逆翻訳し；
該合成遺伝子の配列における制限部位の位置について１以上のパラメータを提供し；
該ランダム化ヌクレオチド配列から１以上の選択された制限部位の存在を取り除き；
選択位置において１以上の選択された制限部位を、該ランダム化したヌクレオチド配列に挿入して、該合成遺伝子の配列を生成し；そして
該合成遺伝子の配列を一緒に含む重複したオリゴヌクレオチド配列のセットを生成するように
コンピュータが作動することを命令することによる、
コンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項５９】
シントンのヌクレオチド配列を分析するための方法であって、該方法は、以下：
合成遺伝子の配列を提供する工程であって、ここで、該合成遺伝子は、複数のシントンに分割される、工程；
複数のシントンサンプルの配列を提供する工程であって、ここで、該複数のシントンの各々が、ベクター中でクローニングされる、工程；
該ベクターの配列を挿入なしで提供する工程；
該クローンニングしたシントンの配列からベクター配列を取り除く工程；
該複数のシントンの配列のコンティグマップを構築する工程；
該配列のコンティグマップと該合成遺伝子の配列とを並置する工程；および
該複数のシントンの各々についてのアライメントの測定を程度を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、該方法は、以下：
１以上のシントン配列におけるエラーを同定する工程；および
アライメントの程度によるシントンの順位づけ、シントンサンプルの配列におけるエラー、修復され得るシントンの同一性からなる群より選択される１以上の情報を報告する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項６１】
合成遺伝子のハイスループット合成のためのシステムであって、以下：
アセンブリＰＣＲのためのオリゴヌクレオチド含む少なくとも１つの供給源マイクロウェルプレート
アセンブリＰＣＲ増幅混合物のための供給源
ＬＩＣ伸長プライマー混合物ための供給源
オリゴヌクレオチド増幅のための少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレート
液体操作デバイスおよび
少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートを受容するように配置されたＰＣＲ増幅のための熱源
を備え、
該液体操作デバイスは、該供給源マイクロウェルプレートから複数の予め決定されたセットのオリゴヌクレオチドを取り出し；
該予め決定されたセットと、該少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中の増幅混合物とを組み合わせ；
ＬＩＣ伸長プライマー混合物を取り出し；そして
該ＬＩＣ伸長プライマー混合物と、少なくとも１つのＰＣＲマイクロウェルプレートのウェル中にあるアンプリコンと組み合わせる、
システム。
【請求項６２】
少なくとも２つのアセンブリベクターのための供給源をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６３】
オープンリーディングフレームベクターであって、該ベクターは、
以下のａ）〜ｃ）：
ａ）内部型：４−［７−＊］−［＊−８］−３；
ｂ）左エッジ型：４−［７−１］−［＊−８］−３；および
ｃ）右エッジ型：４−［７−＊］−［６−８］−３；
から選択される構造を含み、
ここで、７および８は、適合性オーバーハング「＊」を生じるように切断するＩＩＳ型制限酵素のための認識部位であり；１および６は、必要に応じて存在するＩＩ型制限部位であり；そして、３および４は、８塩基対認識部位を有する制限酵素のための認識部位である、オープンリーディングフレームベクター。
【請求項６４】
１が、Ｎｄｅ Ｉであり、６が、Ｅｃｏ ＲＩであり、４が、Ｎｏｔ Ｉであり、そして、３がＰａｃ Ｉである、請求項６３に記載のベクター。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１８】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１９】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１８】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１９】
【公表番号】特表２００６−５１７０９０（Ｐ２００６−５１７０９０Ａ）
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４０２９６（Ｐ２００４−５４０２９６）
【出願日】平成１５年９月２６日（２００３．９．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０９４０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２９２２０
【国際公開日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
Ｌｉｎｕｘ
【出願人】（５０００１７８３０）コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月２６日（２００３．９．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０９４０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２９２２０
【国際公開日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
Ｌｉｎｕｘ
【出願人】（５０００１７８３０）コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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