哺乳類内の赤血球生成を刺激する新規の組成物および方法
本発明は、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化する薬剤を含む組成物に関する。本発明は、ＨＶＥＭのアゴニストを含む組成物にも関する。本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤もしくはＨＶＥＭのアゴニストである薬剤を含む組成物を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法にも関する。本発明は、貧血性疾患を患っている哺乳類にＨＶＥＭを活性化する薬剤を投与する工程を含む、貧血性疾患の治療方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００７年１０月５日出願の米国仮特許出願第６０／９９７，８１８号に基づく優先権を主張するものであり、この出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（連邦政府後援の研究または開発によってなされた発明に対する権利に関する申立て）
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた認可（Ｒ０１ＨＬ０８８９５４）の元に、米国政府の援助によりなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリータンパク質であるヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化させることにより、哺乳類内のエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生を刺激する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
貧血は、単一で最も一般的な血液疾患であり、赤血球内のヘモグロビンが不足することにより起こる。ヘモグロビンは、通常、肺から末梢および他の臓器に酸素を運搬するため、貧血は低酸素症をもたらすことが多い。正常条件下では、循環中のＥＰＯの量は低酸素症に応じて増加する。低酸素症は、例えば、出血による実質的な失血、放射線への過剰曝露による赤血球の破壊、高所もしくは長期の意識消失に起因する酸素の取り込みの減少、または種々の型の貧血により引き起こされる場合がある。このような低酸素ストレスに応答して、赤血球前駆細胞の増殖を刺激することで赤血球の産生が増加し、ＥＰＯレベルが上昇する。逆に、循環中の赤血球数が通常の組織酸素消費に必要な数よりも大きくなると、循環中のＥＰＯレベルは通常は低下する。
【０００５】
赤血球生成、即ち、赤血球の産生は、細胞破壊による赤血球の減少を相殺するためにｉｎ ｖｉｖｏで継続的に起こる。野生型の動物では、赤血球生成は高度に調節された生理学的機序であり、これにより、適当な組織酸素化に十分な赤血球を供給することができる。自然発生のヒトエリスロポエチンは、約３４キロダルトン（ｋＤ）の分子量を持つ糖タンパク質ホルモンとして腎臓内で産生される。自然発生のＥＰＯは、骨髄内で、拘束された赤血球前駆体の分裂や分化を刺激し、赤血球前駆体上の受容体に結合することでその生物活性を発揮する（Ｋｒａｎｔｚら、（１９９１），Ｂｌｏｏｄ，７７：４１９）。より詳細には、赤血球前駆細胞のＥＰＯ誘発分化中、グロビン合成が誘発され、ヘム錯体合成が刺激され、フェリチン受容体の数が増加する。これらの生理学的変化により、細胞はより多くの鉄を取り込み、酸素と結合する機能的ヘモグロビンを合成することができる。従って、赤血球は、体中への酸素運搬に重要な役割を果たしている。かかる変化は、赤血球前駆細胞の細胞表面上の適当な受容体とＥＰＯとの相互作用により開始される（例えば、Ｇｒａｂｅｒ ａｎｄ Ｋｒａｎｔｚ（１９７８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２９．５１−６６を参照されたい）。
【０００６】
ＥＰＯは赤血球形成において必須であるため、赤血球産生の低下あるいは欠乏により特徴付けられる血液疾患の治療にＥＰＯは有用である。臨床的に、ＥＰＯは貧血の治療に用いられる。貧血は、一次疾患（例：鎌状細胞貧血）としても、他の疾患に伴う二次性貧血としても現れ得る（例：慢性腎不全患者；Ｅｓｃｈｂａｃｈら、（１９８７），ＮＥＪＭ，３１６：７３−７８；Ｅｇｒｉｅら、（１９８８），Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．，３３：２６２；Ｌｉｍら、（１９８９），Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１１０：１０８−１１４を参照されたい。これらの出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる）。さらに、貧血は、既存の治療法の副作用としても現れ得る。例えば、ＡＩＤＳや悪性腫瘍を持つ患者は、治療介入の結果として貧血を起こすことが多い（Ｄａｎｎａら、Ｉｎ：Ｍ Ｂ，Ｇａｒｎｉｃｋ，ｅｄ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；１９９０：ｐ．３０１−３２４）。
【０００７】
最近の研究においても、β−サラセミア（Ｖｅｄｏｖａｔｏら、（１９８４），Ａｃｔａ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，７１：２１１−２１３を参照されたい）；嚢胞性線維症（Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙら、（１９８４），Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ．，１０５：１５−２１を参照されたい）；妊娠および生理の障害（Ｃｏｔｅｓら、（１９８３），Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｏｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅａｃｏｌ．，９０：３０４−３１１を参照されたい）； 脊髄損傷（Ｃｌａｕｓ−Ｗａｌｋｅｒら、（１９８４），Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．，６５：３７０−３７４を参照されたい）；急性失血（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８２），Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，５２：５４５−５９０を参照されたい）；異常な赤血球生成に伴う腫瘍性疾患状態（Ｄａｉｎｉａｋら、１９８３，Ｃａｎｃｅｒ，５：１１０１−１１０６およびＳｃｈｗａｒｔｚら、（１９８３），Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．，１０９：２６９−２７２を参照されたい）；および腎不全（Ｅｓｃｈｂａｃｈら、（１９８７），Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１６：７３−７８を参照されたい）を含む種々の疾患状態、障害、および血液学的不整の状態に対するＥＰＯ産生を刺激する治療の投与についての基礎が提供されている。
【０００８】
治療化合物として、ＥＰＯは、組換えＤＮＡ技術を用いて生合成的に製造されており（Ｅｇｒｉｅら、（１９８６），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，７２：２１３ ２２４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で発現させたクローン化ヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。ＥＰＯの生物学的効果は、少なくともある程度は、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）との相互作用により媒介される。マウスおよびヒトのＥＰＯ受容体をコードしている遺伝子は周知であり、ＰＣＴ出願刊行物国際公開第９０／０８８２２号パンフレットに記載されている。ＥＰＯがＥＰＯ−Ｒに結合することで２つのＥＰＯ−Ｒ分子の二量化および活性化をもたらし、次の工程のシグナル伝達をもたらすことが示唆されている（Ｗａｔｏｗｉｃｈら、（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２１４０−２１４４を参照されたい）。
【０００９】
さらに、ＥＰＯ産生を増加させるための別のＥＰＯ−Ｒ結合化合物も同定されており、例えば、米国特許第５，７７３，５６９号；同第５，８３０，８５１号；同第５，９８６，０４７号；ＰＣＴ出願刊行物国際公開第９６／４０７４９号パンフレット；米国特許第５，７６７，０７８号、ＰＣＴ特許出願公開明細書第９６／４０７７２号；ＰＣＴ出願刊行物国際公開第０１／３８３４２号パンフレット；および同第０１／９１７８０号パンフレットに記載されており、これらの出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる。
【００１０】
赤血球の発生におけるＥＰＯの重要な役割を考えると、ｉｎ ｖｉｖｏで赤血球生成を刺激できる有効な治療が必要とされている。本発明の方法および組成物は、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化させることで、赤血球生成の刺激をもたらすかかる治療を提供する。
【００１１】
ＨＶＥＭは、腫瘍壊死因子−受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーの一員であり、ＨＳＶ糖タンパク質Ｄに結合することで、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）の侵入に必要な細胞受容体として本来は同定されていた。ＨＶＥＭは免疫細胞の表面上に広く発現し、特定の非造血細胞上でも同定されている。ＨＶＥＭは、いくつかのＨｅＬａ細胞産物の発現クローニングにより同定されており、非許容ＣＨＯ細胞で発現した場合、多くのＨＳＶ株によりＣＨＯ細胞に侵入しやすくなった。いくつかの研究では、ＨＶＥＭが宿主免疫反応の活性化に関与していることが示唆されている。例えば、ＨＶＥＭはリンパ球富化組織で大部分は発現し、タンパク質のＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）ファミリーのいくつかのメンバーにＨＶＥＭが結合することで、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子を活性化させる。さらに、ＨＶＥＭは、リンホトキシンアルファ（腫瘍壊死因子βとしても知られる）やＬＩＧＨＴ（誘導性発現を示しＨＶＥＭのＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンのような、Ｔリンパ球によって発現される受容体）と呼ばれる膜結合タンパク質に結合する。ＨＶＥＭの構造は、ヒト（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＱ８９２３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、マウス（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＱ０８１８３）、アカゲザル（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＩ１３５８７）、およびドブネズミ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０１５０３４）などのいくつかの哺乳類種に対して同定されており、いくつかの他の哺乳類種に対するヌクレオチド配列に基づいて予測されている。
【００１２】
ＬＩＧＨＴはリンホトキシン同族体であり、１２−ミリスチン酸１３−酢酸ホルボール（ＰＭＡ）による誘導時にＴ細胞により発現される（Ｍａｕｒｉら、（１９９８），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０；Ｍａｒｓｔｅｒｓら、（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４０２９−１４０３２）；Ｈｓｕら、（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３４７１−１３４７４を参照されたい）。ＨＶＥＭはその三量体リガンド（例：ＬＩＧＨＴ）に結合する際に三量化し、この結合はＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン（ＣＲＤ）により媒介されると考えられる。ＬＴαは、ＣＲＤ２とＣＲＤ３との相互作用によりＨＶＥＭに結合する。抗体ブロッキングやペプチドマッピングのいくつかの研究により、ＨＶＥＭへのＬＩＧＨＴおよびＬＴαの結合は、ＣＲＤ２およびＣＲＤ３への結合により媒介され得ることが実証されている。ＨＶＥＭの連結反応（例えば、ＬＩＧＨＴによる）により、ＴＲＡＦ１、２、３、および５が動員され、その後、増殖、生存、およびサイトカイン産生を媒介するＮＦ−κＢおよびＡＰ−１転写因子の発現を上方調節する。
【００１３】
現在、ＨＶＥＭに関するほとんどの研究が、病原体が免疫系に侵入することに反応してＴリンパ球の活性化を調節するＨＶＥＭの役割への理解に向けられている。ＨＶＥＭの役割や、骨髄細胞などの他の細胞型におけるその下流シグナル経路についてはほとんど知られていない。本発明は、ＨＶＥＭの活性化によって、哺乳類内のエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生を刺激する新規の組成物および方法を提供する。
【００１４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献を参照することにより本明細書に組み入れるものとする。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化する薬剤を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する組成物に関する。
【００１６】
本発明は、ＨＶＥＭのアゴニストを含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する組成物にも関する。
【００１７】
本発明はさらに、ＨＶＥＭのアゴニストを含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する組成物にも関する。ここで、アゴニストは、抗体、同族リガンドの融合タンパク質（例：ＬＩＧＨＴまたはリンホトキシンアルファ）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、または小分子であってもよい。
【００１８】
本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を含む組成物を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法に関する。
【００１９】
本発明は、ＨＶＥＭのアゴニストである薬剤を含む組成物を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法にも関する。
【００２０】
本発明はさらに、ＨＶＥＭのアゴニストを含む組成物を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法にも関する。ここで、アゴニストは、抗体、同族リガンドの融合タンパク質（例：ＬＩＧＨＴまたはリンホトキシンアルファ）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、または小分子であってもよい。
【００２１】
本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を貧血性疾患を患っている哺乳類に投与する工程を含む、貧血性疾患の治療方法および該疾患の治療に有用な組成物に関する。特別な実施形態では、貧血性疾患は、例えば、腎不全、化学療法、または薬物療法によってもたらされる。
【００２２】
本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を疾患を患っている哺乳類に投与する工程を含む、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病を含む神経変性疾患の治療方法および該疾患の治療に有用な組成物にも関する。
【００２３】
本発明はさらに、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を疾患を患っている哺乳類に投与する工程を含む、炎症性疾患の治療方法および該疾患の治療用組成物にも関する。ここで、炎症性疾患は、喘息、アレルギー、慢性関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【００２４】
本発明は、ＨＶＥＭに特異的に結合し、なおかつ、哺乳類内の赤血球生成を刺激する抗体に関する。抗体は、哺乳類ＨＶＥＭのアゴニストであり、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、および抗原結合性抗体断片からなる群から選択される抗体である。
【００２５】
本発明は、ヒトＨＶＥＭに特異的に結合し、なおかつ、哺乳類内の赤血球生成を刺激する抗体にも関する。抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。別の態様では、抗体は赤血球生成を刺激する。
【００２６】
本発明はさらに、哺乳類ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体にも関する。ここで、前記抗体は、前記哺乳類ＨＶＥＭのアゴニストであり、（ｉ）哺乳類に哺乳類ＨＶＥＭタンパク質またはその細胞外ドメインで免疫性を与える工程と；（ｉｉ）前記哺乳類ＨＶＥＭタンパク質またはその細胞外ドメインに結合する前記哺乳類から抗体を単離する工程と；（ｉｉｉ）抗ＣＤ３抗体の存在下、工程（ｉｉ）の抗体をＴリンパ球と接触させる工程と；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）が前記Ｔリンパ球の増殖を誘導するかどうか測定する工程と；を含む方法によって生成される。前記Ｔリンパ球の増殖が誘発される場合、工程（ｉｉ）で単離された抗体はＨＶＥＭのアゴニストである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｔｅｒ−１１９＋赤血球系細胞のＨＶＥＭアゴニスト誘導増殖を示す。（Ａ）は、抗Ｔｅｒ−１１９抗体および抗ＣＤ４５抗体で染色した脾細胞のＦＡＣＳ分析である。（Ｂ）は、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与した野生型マウスのＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖である。ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与した場合、ＨＶＥＭノックアウトマウス（ＨＶＥＭ−／−）は、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖を示さなかった。（Ｃ）は、ＨＶＥＭにアゴニスト作用を有する抗体を要する野生型マウスのＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖である。非アゴニスト抗体（ＨＭ２．２）は、アゴニスト抗体ＨＭ３．３０よりもＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖がかなり弱かった。（Ｄ）野生型マウス、ＬＩＧＨＴ−／−マウス、およびＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与したＬＴα−／−マウスのＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖である。
【００２８】
【図２】Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖が骨髄から発生することを示す。（Ａ）ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（黒丸）または対照ＩｇＧ抗体（白丸）を投与した２日、４日、および６日後の骨髄、脾臓、および末梢血におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の分析である。（Ｂ）ＨＭ３．３０ＩｇＧおよび対照ハムスターＩｇＧ注入マウスにおけるベンジジン陽性のＣＦＵ−Ｅ数の分析である。（Ｃ）脾摘マウスの骨髄および血液におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の分析である。
【００２９】
【図３】抗Ｔｅｒ−１１９抗体を用いた骨髄細胞上のＨＶＥＭの発現におけるＦＡＣＳ分析を示す。
【００３０】
【図４】ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与した野生型マウスにおけるＥＰＯ産生を示す。（Ａ）ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与後の野生型マウスの血清におけるＥＰＯの濃度の測定である。（Ｂ）抗ＥＰＯ抗体の存在下でＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体によるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖の阻害である。
【００３１】
【図５】骨髄由来細胞において赤血球生成を誘発したＨＭ３．３０におけるＨＶＥＭの要件を示す。野生型骨髄細胞またはＨＶＥＭ−／−骨髄細胞のいずれかを含むキメラマウスにＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体もしくは対照ＩｇＧ抗体のいずれかを投与し、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖（Ａ）もしくはＥＰＯ産生（Ｂ）を測定した。ＨＶＥＭ−／−マウスを野生型骨髄細胞（ＣおよびＤ）で再構成した場合、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖およびＥＰＯの産生を刺激することができた。
【００３２】
【図６】リンパ球または好中球の不在下で、ＨＭ３．３０が赤血球生成を誘発したことを示す。（Ａ）ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体または対照ＩｇＧ抗体を投与したＲａｇ欠損マウスにおけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖分析である。（Ｂ）ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体または対照ＩｇＧ抗体を投与した、好中球が欠乏したＲａｇ欠損マウスにおけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖分析である。
【００３３】
【図７】ｅＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＡＭＥによるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖阻害を示す。野生型マウスにＬ−ＮＡＭＥを投与し、ＨＭ３．３０抗体または対照ＩｇＧ抗体を投与した後にＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖を測定した。
【００３４】
【図８】貧血マウスをＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体で治療すると、ＥＰＯおよびヘモグロビンが増加したことを示す。野生型マウスにシスプラチンを投与して貧血にさせた後、ＨＭ３．３０抗体で治療した。ＥＰＯ（Ａ）およびヘモグロビン（Ｂ）の血清レベルを測定した。（Ｃ）ＨＶＥＭ−／−マウスおよび野生型マウスを５−フルオロウラシルで治療し、産生したＥＰＯのレベルを測定した。５−フルオロウラシルを投与した場合、ＨＶＥＭ−／−マウスが産生したＥＰＯは、野生型マウスのものよりも少ない。
【００３５】
【図９】ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体の結合特異性を示す。マウスＨＶＥＭ、ヒトＨＶＥＭ、マウスＨＶＥＭのＣＲＤ２〜４に融合したヒトＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン（ＣＲＤ）１のキメラ遺伝子、もしくはヒトＨＶＥＭのＣＲＤ２〜４に融合したマウスＨＶＥＭのＣＲＤ１のキメラ遺伝子をコードしているプラスミドで２９３Ｔ細胞を形質転換した。ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体、続いて、ＰＥ共役抗ハムスターＩｇＧで形質転換細胞を標識し、ＦＡＣＳ分析により結合を測定した。
【００３６】
【図１０】２つの単離されたアゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の特徴を示す。（Ａ）ヒトＨＶＥＭを発現している２９３Ｔ細胞をハイブリドーマクローン２７および６Ｈ９の培養上清で染色した後、ＰＥ共役抗マウスＩｇＧ Ａｂで染色した。ＦＡＣＳ分析により結合を測定した。（Ｂ）ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗体クローン２７ならびに６Ｈ９と共インキュベーションすることにより、抗体クローン２７および６Ｈ９のアゴニスト活性について測定した。抗体を投与した３日後に３Ｈチミジン取り込みを測定することにより、Ｔ細胞の増殖について測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
特に明記しない限り、本明細書で使用する用語は、当該技術分野の当業者による慣例的用法に従って理解されるものである。以下に提供する用語の定義に加えて、分子生物学における一般用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら、（１９９１）Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ； ａｎｄ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）にも記載されている。本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」もしくは「ａｎ」は、それが用いられる文脈に応じて１つ以上を意味し得る。従って、例えば、「抗体」という言及は、少なくとも１つの抗体を利用できることを意味し得ることを理解されたい。
【００３８】
本明細書で使用される「ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化する」という用語は、ＨＶＥＭの活性化による下流シグナル経路の誘発のことを言う。かかる下流シグナル経路としては、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤（例えば、本発明の抗体が挙げられる）は、赤血球生成の刺激を含む、少なくとも１つの他の機能を有する。
【００３９】
本明細書で使用される「アゴニスト」という用語は、ＨＶＥＭに結合し、なおかつ、ＨＶＥＭを誘発して下流シグナル経路を活性化させる能力を有するペプチドおよび非ペプチドリガンドのことを言う。かかる下流シグナル経路としては、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子が挙げられるが、これらに限定されない。アゴニストはペプチドアゴニストであることが好ましい。アゴニストは、ＬＩＧＨＴ（リンホトキシンに対して相同であり、誘導性発現を示し、Ｔリンパ球によって発現される受容体）、リンホトキシンアルファ（ＬＴα）、およびアゴニスト抗体からなる群から選択されるペプチドアゴニストであることがより好ましい。
【００４０】
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」という用語は、ＨＶＥＭに結合し、なおかつ、ＨＶＥＭを誘発して下流シグナル経路を活性化させる能力を有する抗体のことを言う。かかる下流シグナル経路としては、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アゴニスト抗体は、ＨＶＥＭの細胞外ドメインに結合し、少なくとも１つのＣＲＤに結合することが好ましい。「アゴニスト抗体」という用語は、抗ＨＶＥＭアゴニストモノクローナル抗体や、ポリエピトピック特異性を持つ抗ＨＶＥＭアゴニスト抗体組成物を包含する。本発明の好適な実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。抗体は任意の哺乳類ＨＶＥＭに対して産生され得る。抗体は霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、もしくはブタ科のＨＶＥＭに対して産生されることが好ましい。抗体はヒトＨＶＥＭに対して産生されることがより好ましい。ある実施形態では、本発明の抗体により赤血球生成が刺激される。ある実施形態では、赤血球生成を刺激する抗体はＨＶＥＭのアゴニストである。
【００４１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特異性抗原に結合特異性を示すタンパク質のことを言う。天然抗体は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖とからなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と連結し、ジスルフィド結合数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖によって変化する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメインを有し、その後に多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメインを有し、他方の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。
【００４２】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、最も広い意味で使用し、抗体が所望のアゴニスト活性を示し、赤血球生成を刺激する限り、単一のモノクローナル抗体、ポリエピトピック特異性を持つ抗体組成物（即ち、ポリクローナル抗体組成物）、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、および抗体断片（例：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｖ）を包含する。
【００４３】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性および特異性に使用されているという事実のことを言う。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの部分に集中している。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ベータシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより連結されたベータシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接した状態に保たれており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９８７），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、抗体依存性細胞障害への抗体の関与など種々のエフェクター機能を示す。
【００４４】
抗体のパパイン消化は、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは「Ｆｃ」断片である。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００４５】
本明細書で使用される「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗体断片のことを言う。この領域は、非共有結合をなした一つの重鎖および一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識して結合する能力を有していることが当該技術分野において認識されている。
【００４６】
本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」という用語は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメインとを含む抗原結合断片のことを言う。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。本明細書で使用される「Ｆａｂ’−ＳＨ」という用語は、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を担持しているＦａｂ’断片のことを言う。
【００４７】
任意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【００４８】
抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それらのいくつかはさらに、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、およびＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２などのサブクラス（アイソタイプ）に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配位は周知である。
【００４９】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、即ち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一な抗体のことを言う。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。異なるエピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリエピトピック（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに対するものである。モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養から産生し、単離することができる。「モノクローナル」という用語は、抗体の特異性を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を要するものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら、（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。
【００５０】
本明細書で検討されたモノクローナル抗体としては、「キメラ」抗体が挙げられ、その重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、残りの鎖（単数または複数）は、所望のアゴニスト活性を示す限り、かかる抗体の断片のように別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同のものである（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５を参照されたい）。
【００５１】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、非ヒト（例：マウス）抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン鎖またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または他の抗原結合サブ配列など）の形態のことを言う。例えば、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基が、所望の特異性、および親和性を有するマウス、ラット、ヤギ、ロバ、またはウサギなどの非ヒト種（即ち、ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されたヒト免疫グロブリンであってもよい。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入ＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。かかる修飾は、抗体の特性を更に洗練し最適化するために導入され、これは当該技術分野において周知である。ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、なおかつ、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つの可変ドメインを含むことが好ましく、２つの可変ドメインを含むことがより好ましい。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むことがさらにより好ましい。さらなる詳細については、米国特許出願公開第２００３００９６４０３号；米国特許出願公開第２００３０１４４４８３号；米国特許出願公開第２００８００２７１４７号；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら、（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａら、（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６）を参照されたい。
【００５２】
一実施形態では、特許請求される本発明の抗体はモノクローナルであり、赤血球生成を刺激する。別の実施形態では、特許請求される本発明の抗体は、アゴニストのようにヒトＨＶＥＭに結合し、赤血球生成を刺激する。別の実施形態では、抗体は、本明細書に記載されているモノクローナル抗体ＨＭ３．３０、クローン２７、およびクローン６Ｈ９のいずれか１つと同じ生物学的特性を示す。「生物学的特性」という用語は、モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ活性のことを示すものであり、例えば、アゴニストのようにヒトＨＶＥＭに結合する能力、下流シグナル経路を活性化させる能力（その例としては、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子が挙げられるが、これらに限定されない）、およびＥＰＯ産生を刺激する能力である。別の実施形態では、特許請求される本発明の抗体は、本明細書に記載されているモノクローナル抗体ＨＭ３．３０、クローン２７、およびクローン６Ｈ９のいずれか１つと同じエピトープに結合する。モノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＨＭ３．３０、クローン２７、およびクローン６Ｈ９の１つの同じ結合特異性を有するかどうかを測定するため、例えば、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いることができる。
【００５３】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、その自然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたポリペプチドまたは抗体などの薬剤のことを示すものである。例えば、「単離された」本発明のモノクローナル抗体は、細胞培養または他の合成環境から精製され、ローリー法により定量してタンパク質が９５重量％よりも多い純度に、または、クーマシーブルーあるいは銀染色を用いた還元あるいは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるまで精製されることが好ましい。
【００５４】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、特定の生理学的状態または症状の予防、治療、または所望の結果をもたらすのに十分な任意の所与の分子量のことを言うために用いられる。投与される薬剤またはアゴニストの有効量は、治療される疾患、治療される特定の哺乳類、個々の患者の病態、疾患原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師には周知の他の要因などを考慮して定められる。一実施形態では、有効量は、哺乳類内の赤血球生成を刺激するのに必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。
【００５５】
一実施形態では、有効量は、哺乳類内の貧血性疾患の治療に必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、貧血性疾患は、例えば、腎不全、化学療法、薬物療法、失血、食餌、栄養不良、妊娠、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連性貧血、感染、および遺伝的もしくは後天性の貧血性疾患（例えば、鎌状細胞貧血、地中海貧血、溶血性貧血、および再生不良性貧血が挙げられる）によってもたらされる。本発明により包含される他の疾患および疾病は、米国特許出願公開第２００６０１７８３１７号に記載されている。
【００５６】
別の実施形態では、有効量は、哺乳類内の神経変性疾患の治療に必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、精神分裂病、および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される。
【００５７】
さらに別の実施形態では、有効量は、哺乳類内の急性虚血性脳卒中または出血性脳卒中の治療に必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。
【００５８】
別の実施形態では、有効量は、哺乳類内の炎症性疾患の治療に必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、炎症性疾患は、喘息、アレルギー、慢性関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【００５９】
本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、標的物質と錯体を形成することが可能なオリゴヌクレオチドのことを言う。アプタマーは、ＨＶＥＭと錯体を形成し、かつ、ＨＶＥＭのアゴニストであることが好ましい。アプタマーは、任意の周知の方法、例えば、合成方法、組換え方法、および精製方法により調製することができ、単体で用いても、あるいは同じ標的に対して特異的な他のアプタマーと組み合わせて用いてもよい。
【００６０】
本発明のアプタマーは、水素結合または他の分子力によりＨＶＥＭと相互作用または錯体形成し得る。しかしながら、かかる相互作用または錯化は、ＤＮＡ二重鎖形成と従来関連する正常な「ワトソン・クリック」型の結合相互作用（即ち、アデニン−チミンとグアニン−シトシン塩基対合）は除く。一般に、特異結合をもたらすには最低でも約１０個のヌクレオチドが必要である。本明細書に概括的に記載されるオリゴヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖であるが、アプタマーは三本鎖または四本鎖構造であることも考えられる。
【００６１】
本発明のアプタマーは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ部分として合成されてもよく、あるいは当該技術分野において認識されている「修飾」オリゴマーであってもよい。かかる修飾としては、糖（リボースやデオキシリボース）の修飾形もしくは類似形、別の連結基、またはプリンおよびピリミジン塩基の類似形の組み込みが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、１つのタンパク質に対するコード配列が少なくともその一部に融合することで異なる遺伝子からの第２のタンパク質のコード配列に大幅に変化している遺伝子産物のことを言う。融合パートナーは、種々の機能としての役割を果たす。例えば、ＨＶＥＭを活性化するかもしくはＨＶＥＭのアゴニストであるタンパク質の溶解度を高めることのみならず、宿主細胞または培養上清もしくはその両方から組換え融合タンパク質を精製することが可能な「親和性標識」を提供することが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書で使用される「Ｔｅｒ−１１９＋細胞」という用語は、Ｋｉｎａら、（２０００），Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１０９：２８０−７に記載されているＴｅｒ−１１９モノクローナル抗体によって特異的に結合したエピトープを発現する細胞のことを言う。野生型の成体マウスでは、Ｔｅｒ−１１９抗体は、成熟赤血球、２０〜２５％の骨髄細胞、および２〜３％の脾臓細胞と反応するが、胸腺細胞やリンパ節細胞とは反応しない。
【００６４】
本明細書で使用される「投与する」という用語は、哺乳類の体内または体上に組成物を導入する任意のプロセスのことを言い、本明細書に記載の特定の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用される「エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニスト」という用語は、ＥＰＯ受容体の活性化を引き起こすことが可能な分子のことを言い、これは、任意の数のメカニズムからもたらされ得る。ＥＰＯ受容体アゴニストとしては、ダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標））、エポエチンアルファ（ＥＰＯ、ＥＰＯＧＥＮ（商標））、および抗ＥＰＯ受容体アゴニスト抗体（例えば、米国特許第７，０８７，２２４号；国際公開第２０００／０２４８９３号パンフレットを参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用される「機能断片」とは、全長ポリペプチドと同様の生理学的または細胞効果を発揮する、全長ポリペプチドの断片またはスプライス変異のことである。機能断片の生物学的効果は、同様の生理学的または細胞効果が見られる限り、全長ポリペプチドとして範囲もしくは強度が同一である必要はない。例えば、抗ＨＶＥＭ抗体の機能断片は、検出可能な程度にＨＶＥＭを活性化することができる。
【００６７】
本明細書で使用される「変異体」という用語は、キメラまたは融合ポリペプチド、同族体、類似体、オルソログ、およびパラログのことを言う。さらに、基準タンパク質またはポリペプチドの変異体は、アミノ酸配列が基準タンパク質またはポリペプチドと少なくとも約８０％同一であるタンパク質またはポリペプチドである。特定の実施形態では、変異体は、基準タンパク質またはポリペプチドと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％同一である。本明細書で使用される、配列アラインメントに関する「に対応する」および「に対応している」という用語は、基準タンパク質またはポリペプチド、例えば、野生型のヒトまたはマウスＨＶＥＭ内の列挙位置や、基準タンパク質またはポリペプチド上の位置と整列している修飾タンパク質またはポリペプチドにおける位置を意味するものである。従って、対象タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、基準タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と整列している場合、基準タンパク質またはポリペプチド配列の特定の列挙位置「に対応する」配列は、基準配列のこれらの位置と整列しているものであるが、基準配列の数値上の位置が全く同じである必要はない。配列を整列させて配列間の対応アミノ酸を決定する方法を以下に説明する。
【００６８】
例えば、哺乳類ＨＶＥＭをコードしている基準アミノ酸配列と少なくとも、例えば、約９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、基準ＨＶＥＭをコードしている基準アミノ酸配列のアミノ酸１００個当たり約５個までの修飾を含み得る以外は、アミノ酸配列が基準配列と同一であることを意味すると理解される。すなわち、基準アミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを得るため、基準配列の約５％までのアミノ酸残基を削除するかまたは、他のアミノ酸と置換してもよく、あるいは、基準配列における全アミノ酸の多数のアミノ酸（約５％まで）を基準配列に挿入してもよい。これらの基準配列の修飾は、基準アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端位で発生するか、あるい基準配列におけるアミノ酸に個々に点在するかもしくは基準配列内の１つ以上の隣接基に点在するこれらの末端位間のどこにでも発生し得る。
【００６９】
本明細書で使用される「同一性」とは、基準となるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度のことである。一般に、最も高次のマッチングが得られるように配列は整列している。「同一性」それ自体が、当業界で認識された意味を持ち、公開技術を用いて算出することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照されたい）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定する方法がいくつか存在するが、「同一性」という用語は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。２つの配列間の同一性または類似性を決定するのに一般に用いられる方法としては、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４）ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。コンピュータープログラムは、同一性および類似性を算出する方法およびアルゴリズムも含み得る。２つの配列間の同一性または類似性を決定するためのコンピュータープログラム法の例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら、（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（ｉ）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０），Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３）、およびＦＡＳＴＤＢが挙げられるが、これらに限定されない。同一性および類似性を決定する方法の例としては、Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｇ．ａｎｄ Ｇａｒｉａｎ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ １，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一実施形態では、２つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するのに用いるアルゴリズムはＢＬＡＳＴＰである。
【００７０】
Ｉ．抗体の産生
【００７１】
ＨＶＥＭに対するポリクローナル抗体は、抗体産生において当該技術分野で周知の技術のいずれかを用いて、動物で産生される。例えば、ポリクローナル抗体は、ＨＶＥＭまたはその断片とアジュバントとを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより産生される。ある特定の条件下では、二官能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイル硫化コハク酸イミドエステル（システイン残基による共役）、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（リシン残基による）、およびグルタルアルデヒドを用いて、免疫される種に免疫原性があるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターにＨＶＥＭまたはその断片を共役させることが有用である。免疫反応を高めるため、ミョウバンなどの凝集剤を用いてもよい。
【００７２】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法によっても、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によっても作製することができる。
【００７３】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生可能なリンパ球を導き出す。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）］。
【００７４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含む適当な培地に播種し、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたＨＰＲＴ）を欠失する場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含有するであろう。
【００７５】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベル発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性の細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株であり、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．Ｕ．Ｓ．Ａ．から市販されているＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．から市販されているＳＰ−２細胞から誘導されたものである。ヒトモノクローナル抗体を産生するヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、（１９８７），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００７６】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えば放射免疫測定（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定することが好ましい。所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させてもよい。この目的に適当な培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地、またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させてもよい。
【００７７】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、または血清から分離されることが好ましい。
【００７８】
本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来方法（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いること）により容易に単離され、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次いでこれを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１）、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合させることで修飾してもよい。
【００７９】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野では周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト抗体から導入した１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、本質的には、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することによりＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）に従って行うことができる。
【００８０】
抗体・抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット」法では、非ヒト抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に、非ヒト配列のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓら、（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用してもよい。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら、（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３）。
【００８１】
ＩＩ．ＨＶＥＭ活性剤のスクリーニング
【００８２】
アゴニスト抗体などのＨＶＥＭを活性化させる薬剤をスクリーニングするため、当該技術分野では公知の結合アッセイのいずれかを用いて、薬剤のＨＶＥＭに対する特異結合について薬剤を最初に試験してもよい。かかるアッセイとしては、プラズモン共鳴を用いて（即ち、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて）薬剤のＨＶＥＭに対する結合を測定すること、あるいは、薬剤を放射標識または蛍光標識して結合を直接評価することが挙げられる。ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体を検出するため、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、およびウェスタンブロット法などのアッセイを用いてもよい。ＨＶＥＭに結合する薬剤がＨＶＥＭのアゴニストであるかどうか測定するため、抗ＣＤ３抗体と、ＨＶＥＭ活性化について試験される薬剤とが混在した状態で、ＨＶＥＭを発現しているＴリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることができる。かかる方法では、Ｔリンパ球の増殖が誘発されたことで、薬剤がＨＶＥＭのアゴニストであることが示される。Ｔリンパ球の増殖については、例えば、放射標識した３Ｈ−チミジンの組み込みによる測定、ＣＤ３８発現のフローサイトメトリー評価、およびブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組み込みに基づく酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）などの、かかる目的において当該技術分野において周知であるアッセイのいずれかを用いて測定することができる。
【００８３】
薬剤がＨＶＥＭを活性化できるかどうかを測定する他の方法では、Ｔリンパ球などの細胞をＨＶＥＭ＋／＋およびＨＶＥＭ−／−動物から入手し、薬剤に暴露してもよい。ＨＶＥＭの活性化については、上述の抗ＣＤ３抗体を用いた増殖アッセイを使用するかあるいは、ＨＶＥＭ活性化によりもたらされる当該技術分野では公知の下流シグナル伝達イベント、例えば、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子の活性化を測定することによって測定することができる。ＨＶＥＭの活性化の特異性については、結果を薬剤で処理したＨＶＥＭ−／−細胞と比較することで測定することができる。
【００８４】
ＩＩＩ．ＨＶＥＭ活性化による赤血球生成の刺激
【００８５】
本発明は、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法にも関する。一実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤またはＨＶＥＭのアゴニストである薬剤を哺乳類に投与して赤血球生成を増加させることができる。赤血球生成の増加は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤またはＨＶＥＭのアゴニストである薬剤による治療前後に哺乳類の血清中のＥＰＯ濃度を測定するかもしくは、血液中のヘモグロビンまたは赤血球レベルを測定することによって測定することができる。
【００８６】
他の実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、より好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与することによる赤血球生成の刺激は、赤血球産生の低下あるいは欠乏により特徴付けられる血液疾患の治療に用いてもよい。例えば、ＥＰＯは、当業界で認識される貧血の治療である。貧血は、一次疾患（例：鎌状細胞貧血）としても、他の疾患に伴う二次性貧血としても現れ得る（例：慢性腎不全患者；Ｅｓｃｈｂａｃｈら、（１９８７），ＮＥＪＭ，３１６：７３−７８；Ｅｇｒｉｅら、（１９８８），Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．，３３：２６２；Ｌｉｍら、（１９８９），Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１１０：１０８−１１４を参照されたい。これらの出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる）。さらに、貧血は、既存の治療法の副作用としても現れ得る。例えば、ＡＩＤＳや悪性腫瘍を持つ患者は、治療介入の結果として貧血を起こすことが多い（Ｄａｎｎａら、Ｉｎ：Ｍ Ｂ，Ｇａｒｎｉｃｋ，ｅｄ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；１９９０：ｐ．３０１−３２４）。従って、本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与することによって貧血を治療する方法を提供する。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、またはブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、貧血性は、腎不全、化学療法、または薬物療法によってもたらされる。
【００８７】
本発明の別の実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与して、哺乳類内の神経変性疾患を治療する。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、またはブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病からなる群から選択される。
【００８８】
本発明のさらに別の実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与して、哺乳類内の急性虚血性脳卒中または出血性脳卒中を治療する。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、またはブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与して、哺乳類内の炎症性疾患を治療する。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、またはブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、炎症性疾患は、喘息、アレルギー、慢性関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【００９０】
ある実施形態では、本発明は、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、治療分子を集めて調合してもよいし、キットに集めて包装してもよい。ある実施形態では、組成物は、液体もしくは凍結乾燥形態であってもよく、種々のｐＨ値とイオン強度とを有する希釈剤（トリス、酢酸、またはリン酸緩衝剤）と、ツイーンまたはポリソルベートなどの可溶化剤と、ヒト血清アルブミンまたはゼラチンなどの担体と、チメロサールまたはベンジルアルコールなどの防腐剤と、アスコルビン酸またはメタ重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤とを含む。ある実施形態では、溶解度または安定性を高めるため水溶性高分子で修飾した治療分子のいずれかを含む組成物も包含する。ある実施形態では、組成物は、長期間にわたる制御送達のためにリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、または小胞に治療分子のいずれかを組み込んだものも含む。
【００９１】
より詳細には、ある実施形態では、本明細書の組成物は、ヒドロゲル、シリコーン、ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、または生分解性高分子などのポリマーマトリクスに組み込んだものでもよい。ヒドロゲルの例としては、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキル）（ｐ−ＨＥＭＡ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、および種々の高分子電解質錯体が挙げられるが、これらに限定されない。生分解性高分子の例としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡの共重合体、ポリアミド、およびポリアミドとポリエステルの共重合体が挙げられるが、これらに限定されない。他の制御放出製剤としては、注射で投与してもよいマイクロカプセル、マイクロスフェア、高分子錯体、および高分子ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
特定の組成物の選択は、多数の要因に依り、例えば、治療される状態、投与経路、および所望の薬物動態パラメータが挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物に適当な成分のより広範な調査については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）に記載されており、参照することで本明細書に組み入れられる．
【００９３】
ある実施形態では、治療分子の有効量（単数または複数）は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依る。従って、ある実施形態では、治療士は、最適な治療効果を得るために必要に応じて投与量を変えたり、投与経路を変更してもよい。一般的な１日の投与量は、上述の要因に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。ある実施形態では、臨床医は、所望の、赤血球生成の増加もしくは血液疾患の臨床改善を達成する投与量に到達するまで、組成物（単数または複数）を投与してもよい。
【００９４】
ある実施形態では、組成物（単数または複数）は、１つ以上の治療分子を単回用量または複数回用量として投与してもよい。これらの用量は、同一または異なる量の治療分子からなっていてもよく、同一または異なる投与経路を介して同一または異なる回数で投与してもよい。ある実施形態では、組成物は、治療分子のいずれか１つまたは任意の組合せを含む組成物として投与してもよい。ある実施形態では、組合せは、同一または異なる量の治療分子を含み得る。ある実施形態では、組成物（単数または複数）は、埋込器またはカテーテル経由で持続注入で投与してもよい。持続注入が２つ以上の治療分子を含む実施形態では、同一または異なる濃度の治療分子を含んでもよい。
【００９５】
最適な投与量、最適な投与経路、および最適な投与回数を決定することは、当業者の知識の十分範囲内である。例えば、本発明の薬剤は、患者に１回以上に分けて投与しても、持続注入で投与してもよい。数日間またはそれ以上にわたる連続投与では、病徴の所望の抑制が起こる、患者状態の所望の改善が達成される、あるいは所望のＥＰＯ産生レベルが得られるまで、状態に応じて治療を繰り返してもよい。用量は、週に数回から６カ月に１回までの間隔で再投与してもい。
【００９６】
本発明の薬剤の投与は、赤血球生成を高める、あるいは、貧血、神経変性疾患、炎症性疾患、急性虚血性脳卒中もしくは出血性脳卒中を治療するための当業者に周知の他の治療と組み合わせてもよい。好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、赤血球生成を高める１つ以上の治療で投与される。例えば、本発明の一実施形態では、本発明の薬剤と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストとを含む組成物を哺乳類に投与してもよい。エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストは、ダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標））、エポエチンアルファ（ＥＰＯ、ＥＰＯＧＥＮ（商標））、および抗ＥＰＯ受容体アゴニスト抗体であってもよいが、これらに限定されない。
【００９７】
実施例
実施例１：マウスＨＶＥＭに特異的に結合するモノクローナル抗体の生成
【００９８】
抗マウスＨＶＥＭモノクローナル抗体を生成するため、マウスＨＶＥＭの細胞外ドメインがマウスＩｇＧのＦｃ領域に融合した融合タンパク質でハムスターを免疫した。第１の免疫化において、融合タンパク質をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）でエマルション化した。第２および第３の免疫化において、融合タンパク質をフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）でエマルション化した。免疫化は、２週間ごとに皮下投与した。第３の免疫化の後、免疫ハムスターから血清を採取し、抗ＨＶＥＭ抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより測定した。第４の免疫化は、アジュバントの不在下で腹腔内投与した。第４の免疫化から５日後に、脾細胞を採取し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞に融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを生成した。得られたハイブリドーマの培養上清を、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって、マウスＨＶＥＭに特異的に結合する抗体の存在についてスクリーニングした。
【００９９】
実施例２：ＨＶＥＭにアゴニスト作用を有する抗体の同定
【０１００】
実施例１に記載した実験で生成された抗マウスＨＶＥＭ抗体を、抗ＣＤ３抗体でコートした９６ウエルプレートでＴリンパ球によりインキュベートした。Ｔリンパ球の増殖を刺激した抗体は、３Ｈ−チミジンの組み込みの増加について測定し、ＨＶＥＭのアゴニストであると同定された。ＨＶＥＭにアゴニスト作用を有するかかる抗体の１つを単離し、ＨＭ３．３０と呼ばれる別の実験に用いた。
【０１０１】
実施例３：ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＭ３．３０マウスモノクローナル抗体の特徴
【０１０２】
実施例３．１：ＨＭ３．３０抗体の注入による脾臓赤芽球の増加
【０１０３】
ＨＭ３．３０抗体のアゴニスト機能はｉｎ ｖｉｖｏで評価した。１５０μｇの対照ＩｇＧ抗体（図１Ａ、左側の箱）またはＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（図１Ａ、右側の箱）を野生型マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。抗体の投与４日後に、マウスから脾細胞を単離し、Ｔｅｒ−１１９抗体および抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を用いて蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を施した。図１Ａに示すように、ＨＭ３．３０抗体を注射したマウスは、約１０倍のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖を示した。ＨＭ３．３０抗体をＨＶＥＭノックアウトマウスに投与した場合（ＨＶＥＭ−／−）（ｎ＝３）、または、ＨＶＥＭに結合しない対照抗体を野生型マウスに投与した場合（図１Ｂ）（ｎ＝２）、脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖は起きなかったため、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖には、ＨＶＥＭに結合しているＨＭ３．３０抗体を要することが分かった。バーは平均±ＳＥＭを示す。アゴニストである抗ＨＶＥＭ抗体ＨＭ３．３０に対して、ＨＭ２．２と呼ばれる非アゴニスト抗体は、脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖の媒介がかなり弱かった（図１Ｃ）。バーは、グループ当たり２匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。
【０１０４】
ＨＭ３．３０抗体によって誘発されたＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖は、ＨＶＥＭの自然発生リガンドへの結合を阻害することによって媒介されなかった。ＬＩＧＨＴ−／−マウス（Ｔａｍａｄａら．（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：４１０５）、ＬＴα−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｏｒｉｅｓから購入）、または野生型マウスにＨＭ３．３０抗体を投与した。ＬＩＧＨＴ−／−マウスとＬＴα−／−マウスは、野生型対照マウスにＨＭ３．３０抗体を投与後の脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖と同様であることを実証した（図１Ｄ）。Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−脾細胞の絶対数は、平均±ＳＥＭで示す。ＨＭ３．３０抗体の注射２４時間後に貧血の兆候が見られなかったため、赤血球個体群の増殖は、赤血球溶解のフィードバック反応ではないと測定した。
【０１０５】
実施例３．２：骨髄におけるＨＭ３．３０媒介エリスロポエチン増殖の発生
【０１０６】
１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体または１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ抗体を野生型マウスに注射することで、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体の投与時に増殖するＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の発生源について測定した。抗体の投与２日、４日、および６日後に、試験マウスの骨髄、脾臓、および末梢血におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞個体群について測定した（図２Ａ）。各丸は、少なくとも２匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。骨髄におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖は２日および４日にピークであったが、脾臓におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖は抗体投与４日後まで明らかではなかった。末梢血では、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖のピークは抗体投与６日後まで発生しなかった。これらの異なる区画における増殖動態により、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞のＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体誘導による増殖が骨髄で発生したことが示された。
【０１０７】
１２時間前にＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を受けたマウスから採取した骨髄細胞をメチルセルロース培地上にｉｎ ｖｉｔｒｏで載置することで、対照ハムスターＩｇＧ抗体を受けたマウスから採取した骨髄細胞と比較して、ベンジジン陽性のＣＦＵ−Ｅ数がかなり増加したことが実証された（図２Ｂ）。各バーは、２枚のプレートの平均±ＳＥＭを示す。
【０１０８】
ＨＭ３．３０抗体誘導の赤芽球増殖メカニズムが、脾臓内のＨＶＥＭシグナル伝達の下流活性化からもたらされたかどうか測定するため、脾臓摘出２日後の脾摘マウスに、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（黒色バー）または対照ハムスターＩｇＧ抗体（灰色バー）を注射した。抗体投与２日後に、骨髄および末梢血におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖を測定した（図２Ｃ）。バーは、少なくとも３匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体投与後の赤血球増殖は脾摘マウスで起こった。これは、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖に脾臓が必要ではないことを示すものである。
【０１０９】
抗体がＨＶＥＭ発現細胞に直接機能できるかどうか測定するため、Ｔｅｒ−１１９＋骨髄細胞を単離し、抗ＨＶＥＭ抗体で染色した。ＦＡＣＳ分析により、ＨＶＥＭがＴｅｒ−１１９＋細胞で普遍的に発現することが実証され、抗体が骨髄細胞における赤血球増殖に直接作用できることを示唆した（図３）。
【０１１０】
実施例４：ＨＭ３．３０抗体の投与によるＥＰＯ産生の誘発
【０１１１】
骨髄内でＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞個体群が増殖するメカニズムを測定するため、１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ抗体または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を野生型マウスグループに腹腔内注射した。抗体投与８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間後に、マウスを安楽死させ、血清中のＥＰＯレベルを測定した。ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与されたマウスでは、血清のＥＰＯレベルは著しく増加し、抗体投与２４時間後にピークを迎えた（図４Ａ）。各時点は、少なくとも４匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。２つの独立した実験からのプールデータを示す。１５０μｇの抗ＥＰＯ抗体を腹腔内投与し、次いで１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を腹腔内投与したことで、脾臓内のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖が打ち消されたため、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖はＥＰＯに依存すると測定された（図４Ｂ）。抗体投与４日後のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−脾細胞の絶対数を図４Ｂに示す。バーは、１グループ当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。
【０１１２】
実施例５：骨髄細胞でのＨＶＥＭの発現には、ＨＭ３．３０抗体投与時に、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖およびＥＰＯ産生を必要とする。
【０１１３】
アゴニスト抗ＨＶＥＭ抗体が腎臓の間質細胞または上皮細胞を直接誘導してＥＰＯを産生できるかどうか測定するため、野生型またはＨＶＥＭ−／−マウスから放射線照射野生型マウスに骨髄細胞を移すことで骨髄キメラマウスを生成した。照射間に６時間の間隔を開けてマウスを６１０ラジアンで２回照射し、放射線照射マウスを調製した。最後の放射線処理の１時間以内に約５００万個のドナー骨髄細胞を静脈内に移した。６週間後、１５０μｇの対照ＩｇＧ抗体または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体をキメラマウスに腹腔内注射した。造血細胞にＨＶＥＭが無いことで、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体の投与時に、ＥＰＯ産生の増加（図５Ｂ）およびその後の赤血球増殖（図５Ａ）とが取り除かれた。一方、野生型またはＨＶＥＭ−／−マウスから放射線照射ＨＶＥＭ−／−マウスに骨髄を移して生成した逆キメラマウスでは、ドナー骨髄が野生型マウスからであった場合、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体の投与時にＥＰＯ産生の増加（図５Ｄ）およびその後の赤血球増殖（図５Ｃ）が起こった。これらの実験により、骨髄細胞でのＨＶＥＭの発現には、ＨＭ３．３０抗体によって媒介される、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖およびＥＰＯ産生の増加を必要とすることが示唆される。各バーは、少なくとも４匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。
【０１１４】
実施例６：ＨＭ３．３０抗体は、Ｔリンパ球、Ｂ−リンパ球、または好中球の不在下で、脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖を増加させることができる。
【０１１５】
Ｔ−およびＢ−リンパ球の不在下でもアゴニスト抗ＨＶＥＭ抗体が赤血球増殖を誘導できるかどうか測定するため、１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ（ｎ＝２）または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（ｎ＝３）をＲａｇ欠損マウスに腹腔内注射した。抗体投与４日後に、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系脾細胞の数を測定した。Ｔ−およびＢ−リンパ球の欠乏は、ＨＭ３．３０に媒介されるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系脾細胞の増殖に観察可能な効果を有さなかった（図６Ａ）。さらに、ＨＭ３．３０抗体に媒介される、脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖は、Ｒａｇ欠損マウスからの好中球の枯渇により打ち消されなかった（図６Ｂ）。この実験では、０日目および１日目にＲａｇ欠損マウスに抗Ｇｒ１．１抗体を投与することで好中球を枯渇させた。０日目に、１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ（ｎ＝３）または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（ｎ＝３）をＲａｇ欠損マウスに腹腔内注射した。実験により、Ｔリンパ球、Ｂ−リンパ球、または好中球ではない骨髄由来細胞の個体群は、腎ＥＰＯ産生および赤血球増殖を媒介することが示唆される。バーは平均±ＳＥＭを示す。
【０１１６】
実施例７：ｅＮＯＳの阻害により、ＨＭ３．３０抗体媒介の赤血球生成が減少する。
【０１１７】
ＥＰＯ産生のメカニズムをさらに測定するため、ＨＭ３．３０に媒介されるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖におけるＨＶＥＭの下流エフェクターの阻害剤の効果について分析した。以前の研究により、プロスタグランジンおよび一酸化窒素（ＮＯ）がＨＶＥＭの下流エフェクターであると示されている（Ｃｈａｎｇら、（２００５），Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，１２：３６３；Ｈｅｏら、（２００６），Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，７９：３３０）。ｅＮＯＳ（内因性一酸化窒素合成酵素）の阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥ１００ｍｇ／ｋｇを０日目から４日目まで２４時間ごとにマウスに腹腔内投与した。さらに、１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ（ｎ＝３）または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（ｎ＝３）をマウスに腹腔内投与した。ＨＭ３．３０抗体およびＬ−ＮＡＭＥを投与されたマウスは、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞個体群の増殖が約５０％減少し（図７）、ＮＯがＨＶＥＭの活性化により誘導された赤血球生成の下流メディエータであり得ることが示された。バーは平均±ＳＥＭを示す。「＊」は、スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５であることを示す。
【０１１８】
実施例８：ＨＭ３．３０抗体を用いたシスプラチン誘発貧血の治療
【０１１９】
シスプラチンは腎臓毒性の原因となり、ＥＰＯを産生する腎臓細胞を殺すことでＥＰＯ欠乏貧血を引き起こすことが示されている（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら、（２００６），Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，８０：６８０）。抗ＨＶＥＭアゴニスト抗体の投与がｉｎ ｖｉｖｏの貧血性疾患モデルにおいてＥＰＯの産生を誘発し得るかどうか測定するため、０日目に８ｍｇ／ｋｇのシスプラチンをマウスに静脈内注射し、４日、８日、１３日、および１９日目に対照ＩｇＧ抗体（黒丸、図８Ａ）またはＨＭ３．３０抗体（白丸、図８Ａ）を腹腔内注射した。２０日目に、マウスを安楽死させ、血清のＥＰＯレベルを測定した。対照ＩｇＧ抗体で処理したマウスよりもＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体で処理したマウスで血清のＥＰＯレベルは増加した。
【０１２０】
マウスで顕性貧血を誘発するため、１２ｍｇ／ｋｇのシスプラチンをマウスに静脈内投与した。１日目および１９日目に対照ＩｇＧ抗体（黒丸、図８Ｂ）またはＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（白丸、図８Ｂ）をシスプラチン処理マウスに投与した。０日目、２０日目、および２６日目にマウスを安楽死させ、その時点で血中のヘモグロビン値を測定した。対照ＩｇＧ抗体を投与されたシスプラチン処理マウスよりもＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与されたシスプラチン処理マウスで血中ヘモグロビン値が著しく増加した。丸は少なくとも５匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。
【０１２１】
さらに、赤血球生成ストレス誘導のＥＰＯ産生におけるＨＶＥＭの役割について測定した。０日目に１５０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシルを野生型マウスまたはＨＶＥＭ−／−マウスに投与し、血清のＥＰＯレベルを９日目に測定した。ＨＶＥＭ−／−マウスでは、５−フルオロウラシルによる赤血球生成のストレス誘導に応じて血清のＥＰＯレベルが著しく減少した（図８Ｃ）。バーは、少なくとも４匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。「＊」は、ｐ＜０．０５のスチューデントのｔ検定値を示す。
【０１２２】
実施例９：ＨＭ３．３０抗体の結合特異性
【０１２３】
マウスＨＶＥＭ（図９Ａ）、ヒトＨＶＥＭ（図９Ｂ）、マウスＨＶＥＭのＣＲＤ２〜４に融合したヒトＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン（ＣＲＤ）１のキメラ遺伝子（図９Ｃ）、または、ヒトＨＶＥＭのＣＲＤ２〜４に融合したマウスＨＶＥＭのＣＲＤ１のキメラ遺伝子（図９Ｄ）をコードしているプラスミドで２９３Ｔ細胞を形質転換した。ＨＭ３．３０抗体、次いで、ＰＥ共役抗ハムスターＩｇＧで形質転換細胞を標識した。フローサイトメトリーにより抗体標識を分析した。陰性対照として、２９３Ｔ細胞を空ベクトルで形質転換し、ＨＭ３．３０およびＰＥ共役抗ハムスターＩｇＧで標識した（図９、塗りつぶしたヒストグラム）。ＨＭ３．３０は、マウスＨＶＥＭのＣＲＤ１に特異的に結合したが、ヒトＨＶＥＭには特異的に結合しなかった。これは、ＨＭ３．３０抗体がＣＲＤ１との相互作用によりＨＶＥＭに結合することを示唆している。理論に束縛されるものではないが、本発明のアゴニスト抗体は、赤血球生成を刺激する少なくとも１つの要件を有しており、これは、ＣＲＤ１との相互作用を含む（例えば、それとの結合、あるいはそれとの相互作用を含む）。
【０１２４】
実施例１０：アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の生成
【０１２５】
抗ヒトＨＶＥＭモノクローナル抗体を生成するため、ヒトＨＶＥＭの細胞外ドメインがヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合した融合タンパク質でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。第１の免疫化において、融合タンパク質をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）でエマルション化した。第２および第３の免疫化において、融合タンパク質をフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）でエマルション化した。免疫化は、２週間ごとに皮下投与した。第３の免疫化の後、免疫ハムスターから血清を採取し、抗ＨＶＥＭ抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより測定した。第４の免疫化は、アジュバントの不在下で腹腔内投与した。第４の免疫化から５日後に、脾細胞を採取し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞に融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを生成した。得られたハイブリドーマの培養上清を、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって、マウスＨＶＥＭに特異的に結合する抗体の存在についてスクリーニングした。ヒトＨＶＥＭを発現している２９３Ｔ細胞に結合している抗体を測定することによって、ヒトＨＶＥＭ（即ち、クローン２７および６Ｈ９）に特異的に結合した２つのクローンを同定した。フローサイトメトリー分析によって標識の強度を検出した（図１０Ａ）。抗体クローン２７および６Ｈ９についてもヒトＨＶＥＭにアゴニスト作用を有すると測定された（図１０Ｂ）。ヒトＴ細胞を健康なドナーＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＨＶＥＭモノクローナル抗体（黒丸；クローン２７、黒三角；クローン６Ｈ９）または対照マウスＩｇＧ（白丸）の指定用量の存在下、抗マウスＩｇＧ抗体でプレコートした９６ウエル組織培養プレートでインキュベートした。インキュベーションの３日後、３Ｈ−チミジン取り込みによってＴ細胞の増殖活性を評価した。データ点は、３ウエル（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｗｅｌｌ）からの平均±ＳＤを示す。データは、３つの個々に繰り返した実験の１つを示す。
【０１２６】
実施例１１：アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体はｉｎ ｖｉｖｏで赤血球生成を刺激する
【０１２７】
アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体（例えば、本明細書に記載のクローン２７および６Ｈ９から誘導される抗体が挙げられる）がｉｎ ｖｉｖｏで赤血球生成を刺激する能力について前臨床マウス異種移植モデルを用いて評価する。このため、例えば、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２受容体共通γ鎖欠乏マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂから市販）を用いる。比較的少数（例、５００万〜２０００万）のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をこれらのマウスに静脈内注射することで、数週間（これらの実験で十分な時間枠）でヒト造血細胞の効果的な生着がもたらされる。ヒトＰＢＭＣ再構成マウスをアゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体で処理し、リンパ器官における血清Ｅｐｏレベルおよび赤血球生成の増加について本明細書に記載の方法および当業者に公知の他の方法によって評価する。さらに、シスプラチンを注射し、次いで、アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体で治療することで、異種移植モデルにおいて貧血状態が誘発される。造血細胞上のＨＶＥＭ発現は、（本明細書に示す通り）アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の赤血球生成効果に必要かつ十分であるため、このヒトＰＢＭＣ再構成系は、ｉｎ ｖｉｖｏでのアゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の活性をスクリーニングして評価するのに有効な前臨床モデルである。理論に束縛されるものではないが、アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の投与により赤血球生成が促進されるため、貧血を治療することができる。
【０１２８】
参照文献
【０１２９】
本明細書に記載した全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。本明細書で引用した全ての特許および刊行物は、個々の特許および刊行物が特定的におよび別々に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、同じ内容を引用することにより本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００７年１０月５日出願の米国仮特許出願第６０／９９７，８１８号に基づく優先権を主張するものであり、この出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（連邦政府後援の研究または開発によってなされた発明に対する権利に関する申立て）
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた認可（Ｒ０１ＨＬ０８８９５４）の元に、米国政府の援助によりなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリータンパク質であるヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化させることにより、哺乳類内のエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生を刺激する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
貧血は、単一で最も一般的な血液疾患であり、赤血球内のヘモグロビンが不足することにより起こる。ヘモグロビンは、通常、肺から末梢および他の臓器に酸素を運搬するため、貧血は低酸素症をもたらすことが多い。正常条件下では、循環中のＥＰＯの量は低酸素症に応じて増加する。低酸素症は、例えば、出血による実質的な失血、放射線への過剰曝露による赤血球の破壊、高所もしくは長期の意識消失に起因する酸素の取り込みの減少、または種々の型の貧血により引き起こされる場合がある。このような低酸素ストレスに応答して、赤血球前駆細胞の増殖を刺激することで赤血球の産生が増加し、ＥＰＯレベルが上昇する。逆に、循環中の赤血球数が通常の組織酸素消費に必要な数よりも大きくなると、循環中のＥＰＯレベルは通常は低下する。
【０００５】
赤血球生成、即ち、赤血球の産生は、細胞破壊による赤血球の減少を相殺するためにｉｎ ｖｉｖｏで継続的に起こる。野生型の動物では、赤血球生成は高度に調節された生理学的機序であり、これにより、適当な組織酸素化に十分な赤血球を供給することができる。自然発生のヒトエリスロポエチンは、約３４キロダルトン（ｋＤ）の分子量を持つ糖タンパク質ホルモンとして腎臓内で産生される。自然発生のＥＰＯは、骨髄内で、拘束された赤血球前駆体の分裂や分化を刺激し、赤血球前駆体上の受容体に結合することでその生物活性を発揮する（Ｋｒａｎｔｚら、（１９９１），Ｂｌｏｏｄ，７７：４１９）。より詳細には、赤血球前駆細胞のＥＰＯ誘発分化中、グロビン合成が誘発され、ヘム錯体合成が刺激され、フェリチン受容体の数が増加する。これらの生理学的変化により、細胞はより多くの鉄を取り込み、酸素と結合する機能的ヘモグロビンを合成することができる。従って、赤血球は、体中への酸素運搬に重要な役割を果たしている。かかる変化は、赤血球前駆細胞の細胞表面上の適当な受容体とＥＰＯとの相互作用により開始される（例えば、Ｇｒａｂｅｒ ａｎｄ Ｋｒａｎｔｚ（１９７８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．２９．５１−６６を参照されたい）。
【０００６】
ＥＰＯは赤血球形成において必須であるため、赤血球産生の低下あるいは欠乏により特徴付けられる血液疾患の治療にＥＰＯは有用である。臨床的に、ＥＰＯは貧血の治療に用いられる。貧血は、一次疾患（例：鎌状細胞貧血）としても、他の疾患に伴う二次性貧血としても現れ得る（例：慢性腎不全患者；Ｅｓｃｈｂａｃｈら、（１９８７），ＮＥＪＭ，３１６：７３−７８；Ｅｇｒｉｅら、（１９８８），Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．，３３：２６２；Ｌｉｍら、（１９８９），Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１１０：１０８−１１４を参照されたい。これらの出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる）。さらに、貧血は、既存の治療法の副作用としても現れ得る。例えば、ＡＩＤＳや悪性腫瘍を持つ患者は、治療介入の結果として貧血を起こすことが多い（Ｄａｎｎａら、Ｉｎ：Ｍ Ｂ，Ｇａｒｎｉｃｋ，ｅｄ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；１９９０：ｐ．３０１−３２４）。
【０００７】
最近の研究においても、β−サラセミア（Ｖｅｄｏｖａｔｏら、（１９８４），Ａｃｔａ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，７１：２１１−２１３を参照されたい）；嚢胞性線維症（Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙら、（１９８４），Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ．，１０５：１５−２１を参照されたい）；妊娠および生理の障害（Ｃｏｔｅｓら、（１９８３），Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｏｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅａｃｏｌ．，９０：３０４−３１１を参照されたい）； 脊髄損傷（Ｃｌａｕｓ−Ｗａｌｋｅｒら、（１９８４），Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．，６５：３７０−３７４を参照されたい）；急性失血（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８２），Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，５２：５４５−５９０を参照されたい）；異常な赤血球生成に伴う腫瘍性疾患状態（Ｄａｉｎｉａｋら、１９８３，Ｃａｎｃｅｒ，５：１１０１−１１０６およびＳｃｈｗａｒｔｚら、（１９８３），Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．，１０９：２６９−２７２を参照されたい）；および腎不全（Ｅｓｃｈｂａｃｈら、（１９８７），Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１６：７３−７８を参照されたい）を含む種々の疾患状態、障害、および血液学的不整の状態に対するＥＰＯ産生を刺激する治療の投与についての基礎が提供されている。
【０００８】
治療化合物として、ＥＰＯは、組換えＤＮＡ技術を用いて生合成的に製造されており（Ｅｇｒｉｅら、（１９８６），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，７２：２１３ ２２４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で発現させたクローン化ヒトＥＰＯ遺伝子の産物である。ＥＰＯの生物学的効果は、少なくともある程度は、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）との相互作用により媒介される。マウスおよびヒトのＥＰＯ受容体をコードしている遺伝子は周知であり、ＰＣＴ出願刊行物国際公開第９０／０８８２２号パンフレットに記載されている。ＥＰＯがＥＰＯ−Ｒに結合することで２つのＥＰＯ−Ｒ分子の二量化および活性化をもたらし、次の工程のシグナル伝達をもたらすことが示唆されている（Ｗａｔｏｗｉｃｈら、（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２１４０−２１４４を参照されたい）。
【０００９】
さらに、ＥＰＯ産生を増加させるための別のＥＰＯ−Ｒ結合化合物も同定されており、例えば、米国特許第５，７７３，５６９号；同第５，８３０，８５１号；同第５，９８６，０４７号；ＰＣＴ出願刊行物国際公開第９６／４０７４９号パンフレット；米国特許第５，７６７，０７８号、ＰＣＴ特許出願公開明細書第９６／４０７７２号；ＰＣＴ出願刊行物国際公開第０１／３８３４２号パンフレット；および同第０１／９１７８０号パンフレットに記載されており、これらの出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる。
【００１０】
赤血球の発生におけるＥＰＯの重要な役割を考えると、ｉｎ ｖｉｖｏで赤血球生成を刺激できる有効な治療が必要とされている。本発明の方法および組成物は、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化させることで、赤血球生成の刺激をもたらすかかる治療を提供する。
【００１１】
ＨＶＥＭは、腫瘍壊死因子−受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーの一員であり、ＨＳＶ糖タンパク質Ｄに結合することで、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）の侵入に必要な細胞受容体として本来は同定されていた。ＨＶＥＭは免疫細胞の表面上に広く発現し、特定の非造血細胞上でも同定されている。ＨＶＥＭは、いくつかのＨｅＬａ細胞産物の発現クローニングにより同定されており、非許容ＣＨＯ細胞で発現した場合、多くのＨＳＶ株によりＣＨＯ細胞に侵入しやすくなった。いくつかの研究では、ＨＶＥＭが宿主免疫反応の活性化に関与していることが示唆されている。例えば、ＨＶＥＭはリンパ球富化組織で大部分は発現し、タンパク質のＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）ファミリーのいくつかのメンバーにＨＶＥＭが結合することで、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子を活性化させる。さらに、ＨＶＥＭは、リンホトキシンアルファ（腫瘍壊死因子βとしても知られる）やＬＩＧＨＴ（誘導性発現を示しＨＶＥＭのＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンのような、Ｔリンパ球によって発現される受容体）と呼ばれる膜結合タンパク質に結合する。ＨＶＥＭの構造は、ヒト（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＱ８９２３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、マウス（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＱ０８１８３）、アカゲザル（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＩ１３５８７）、およびドブネズミ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０１５０３４）などのいくつかの哺乳類種に対して同定されており、いくつかの他の哺乳類種に対するヌクレオチド配列に基づいて予測されている。
【００１２】
ＬＩＧＨＴはリンホトキシン同族体であり、１２−ミリスチン酸１３−酢酸ホルボール（ＰＭＡ）による誘導時にＴ細胞により発現される（Ｍａｕｒｉら、（１９９８），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：２１−３０；Ｍａｒｓｔｅｒｓら、（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４０２９−１４０３２）；Ｈｓｕら、（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３４７１−１３４７４を参照されたい）。ＨＶＥＭはその三量体リガンド（例：ＬＩＧＨＴ）に結合する際に三量化し、この結合はＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン（ＣＲＤ）により媒介されると考えられる。ＬＴαは、ＣＲＤ２とＣＲＤ３との相互作用によりＨＶＥＭに結合する。抗体ブロッキングやペプチドマッピングのいくつかの研究により、ＨＶＥＭへのＬＩＧＨＴおよびＬＴαの結合は、ＣＲＤ２およびＣＲＤ３への結合により媒介され得ることが実証されている。ＨＶＥＭの連結反応（例えば、ＬＩＧＨＴによる）により、ＴＲＡＦ１、２、３、および５が動員され、その後、増殖、生存、およびサイトカイン産生を媒介するＮＦ−κＢおよびＡＰ−１転写因子の発現を上方調節する。
【００１３】
現在、ＨＶＥＭに関するほとんどの研究が、病原体が免疫系に侵入することに反応してＴリンパ球の活性化を調節するＨＶＥＭの役割への理解に向けられている。ＨＶＥＭの役割や、骨髄細胞などの他の細胞型におけるその下流シグナル経路についてはほとんど知られていない。本発明は、ＨＶＥＭの活性化によって、哺乳類内のエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生を刺激する新規の組成物および方法を提供する。
【００１４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献を参照することにより本明細書に組み入れるものとする。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化する薬剤を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する組成物に関する。
【００１６】
本発明は、ＨＶＥＭのアゴニストを含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する組成物にも関する。
【００１７】
本発明はさらに、ＨＶＥＭのアゴニストを含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する組成物にも関する。ここで、アゴニストは、抗体、同族リガンドの融合タンパク質（例：ＬＩＧＨＴまたはリンホトキシンアルファ）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、または小分子であってもよい。
【００１８】
本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を含む組成物を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法に関する。
【００１９】
本発明は、ＨＶＥＭのアゴニストである薬剤を含む組成物を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法にも関する。
【００２０】
本発明はさらに、ＨＶＥＭのアゴニストを含む組成物を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法にも関する。ここで、アゴニストは、抗体、同族リガンドの融合タンパク質（例：ＬＩＧＨＴまたはリンホトキシンアルファ）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、または小分子であってもよい。
【００２１】
本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を貧血性疾患を患っている哺乳類に投与する工程を含む、貧血性疾患の治療方法および該疾患の治療に有用な組成物に関する。特別な実施形態では、貧血性疾患は、例えば、腎不全、化学療法、または薬物療法によってもたらされる。
【００２２】
本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を疾患を患っている哺乳類に投与する工程を含む、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病を含む神経変性疾患の治療方法および該疾患の治療に有用な組成物にも関する。
【００２３】
本発明はさらに、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を疾患を患っている哺乳類に投与する工程を含む、炎症性疾患の治療方法および該疾患の治療用組成物にも関する。ここで、炎症性疾患は、喘息、アレルギー、慢性関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【００２４】
本発明は、ＨＶＥＭに特異的に結合し、なおかつ、哺乳類内の赤血球生成を刺激する抗体に関する。抗体は、哺乳類ＨＶＥＭのアゴニストであり、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、および抗原結合性抗体断片からなる群から選択される抗体である。
【００２５】
本発明は、ヒトＨＶＥＭに特異的に結合し、なおかつ、哺乳類内の赤血球生成を刺激する抗体にも関する。抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。別の態様では、抗体は赤血球生成を刺激する。
【００２６】
本発明はさらに、哺乳類ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体にも関する。ここで、前記抗体は、前記哺乳類ＨＶＥＭのアゴニストであり、（ｉ）哺乳類に哺乳類ＨＶＥＭタンパク質またはその細胞外ドメインで免疫性を与える工程と；（ｉｉ）前記哺乳類ＨＶＥＭタンパク質またはその細胞外ドメインに結合する前記哺乳類から抗体を単離する工程と；（ｉｉｉ）抗ＣＤ３抗体の存在下、工程（ｉｉ）の抗体をＴリンパ球と接触させる工程と；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）が前記Ｔリンパ球の増殖を誘導するかどうか測定する工程と；を含む方法によって生成される。前記Ｔリンパ球の増殖が誘発される場合、工程（ｉｉ）で単離された抗体はＨＶＥＭのアゴニストである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｔｅｒ−１１９＋赤血球系細胞のＨＶＥＭアゴニスト誘導増殖を示す。（Ａ）は、抗Ｔｅｒ−１１９抗体および抗ＣＤ４５抗体で染色した脾細胞のＦＡＣＳ分析である。（Ｂ）は、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与した野生型マウスのＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖である。ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与した場合、ＨＶＥＭノックアウトマウス（ＨＶＥＭ−／−）は、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖を示さなかった。（Ｃ）は、ＨＶＥＭにアゴニスト作用を有する抗体を要する野生型マウスのＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖である。非アゴニスト抗体（ＨＭ２．２）は、アゴニスト抗体ＨＭ３．３０よりもＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖がかなり弱かった。（Ｄ）野生型マウス、ＬＩＧＨＴ−／−マウス、およびＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与したＬＴα−／−マウスのＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖である。
【００２８】
【図２】Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖が骨髄から発生することを示す。（Ａ）ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（黒丸）または対照ＩｇＧ抗体（白丸）を投与した２日、４日、および６日後の骨髄、脾臓、および末梢血におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の分析である。（Ｂ）ＨＭ３．３０ＩｇＧおよび対照ハムスターＩｇＧ注入マウスにおけるベンジジン陽性のＣＦＵ−Ｅ数の分析である。（Ｃ）脾摘マウスの骨髄および血液におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の分析である。
【００２９】
【図３】抗Ｔｅｒ−１１９抗体を用いた骨髄細胞上のＨＶＥＭの発現におけるＦＡＣＳ分析を示す。
【００３０】
【図４】ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与した野生型マウスにおけるＥＰＯ産生を示す。（Ａ）ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与後の野生型マウスの血清におけるＥＰＯの濃度の測定である。（Ｂ）抗ＥＰＯ抗体の存在下でＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体によるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖の阻害である。
【００３１】
【図５】骨髄由来細胞において赤血球生成を誘発したＨＭ３．３０におけるＨＶＥＭの要件を示す。野生型骨髄細胞またはＨＶＥＭ−／−骨髄細胞のいずれかを含むキメラマウスにＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体もしくは対照ＩｇＧ抗体のいずれかを投与し、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖（Ａ）もしくはＥＰＯ産生（Ｂ）を測定した。ＨＶＥＭ−／−マウスを野生型骨髄細胞（ＣおよびＤ）で再構成した場合、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖およびＥＰＯの産生を刺激することができた。
【００３２】
【図６】リンパ球または好中球の不在下で、ＨＭ３．３０が赤血球生成を誘発したことを示す。（Ａ）ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体または対照ＩｇＧ抗体を投与したＲａｇ欠損マウスにおけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖分析である。（Ｂ）ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体または対照ＩｇＧ抗体を投与した、好中球が欠乏したＲａｇ欠損マウスにおけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖分析である。
【００３３】
【図７】ｅＮＯＳ阻害剤、Ｌ−ＮＡＭＥによるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖阻害を示す。野生型マウスにＬ−ＮＡＭＥを投与し、ＨＭ３．３０抗体または対照ＩｇＧ抗体を投与した後にＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖を測定した。
【００３４】
【図８】貧血マウスをＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体で治療すると、ＥＰＯおよびヘモグロビンが増加したことを示す。野生型マウスにシスプラチンを投与して貧血にさせた後、ＨＭ３．３０抗体で治療した。ＥＰＯ（Ａ）およびヘモグロビン（Ｂ）の血清レベルを測定した。（Ｃ）ＨＶＥＭ−／−マウスおよび野生型マウスを５−フルオロウラシルで治療し、産生したＥＰＯのレベルを測定した。５−フルオロウラシルを投与した場合、ＨＶＥＭ−／−マウスが産生したＥＰＯは、野生型マウスのものよりも少ない。
【００３５】
【図９】ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体の結合特異性を示す。マウスＨＶＥＭ、ヒトＨＶＥＭ、マウスＨＶＥＭのＣＲＤ２〜４に融合したヒトＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン（ＣＲＤ）１のキメラ遺伝子、もしくはヒトＨＶＥＭのＣＲＤ２〜４に融合したマウスＨＶＥＭのＣＲＤ１のキメラ遺伝子をコードしているプラスミドで２９３Ｔ細胞を形質転換した。ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体、続いて、ＰＥ共役抗ハムスターＩｇＧで形質転換細胞を標識し、ＦＡＣＳ分析により結合を測定した。
【００３６】
【図１０】２つの単離されたアゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の特徴を示す。（Ａ）ヒトＨＶＥＭを発現している２９３Ｔ細胞をハイブリドーマクローン２７および６Ｈ９の培養上清で染色した後、ＰＥ共役抗マウスＩｇＧ Ａｂで染色した。ＦＡＣＳ分析により結合を測定した。（Ｂ）ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗体クローン２７ならびに６Ｈ９と共インキュベーションすることにより、抗体クローン２７および６Ｈ９のアゴニスト活性について測定した。抗体を投与した３日後に３Ｈチミジン取り込みを測定することにより、Ｔ細胞の増殖について測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
特に明記しない限り、本明細書で使用する用語は、当該技術分野の当業者による慣例的用法に従って理解されるものである。以下に提供する用語の定義に加えて、分子生物学における一般用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら、（１９９１）Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ； ａｎｄ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）にも記載されている。本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」もしくは「ａｎ」は、それが用いられる文脈に応じて１つ以上を意味し得る。従って、例えば、「抗体」という言及は、少なくとも１つの抗体を利用できることを意味し得ることを理解されたい。
【００３８】
本明細書で使用される「ヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化する」という用語は、ＨＶＥＭの活性化による下流シグナル経路の誘発のことを言う。かかる下流シグナル経路としては、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤（例えば、本発明の抗体が挙げられる）は、赤血球生成の刺激を含む、少なくとも１つの他の機能を有する。
【００３９】
本明細書で使用される「アゴニスト」という用語は、ＨＶＥＭに結合し、なおかつ、ＨＶＥＭを誘発して下流シグナル経路を活性化させる能力を有するペプチドおよび非ペプチドリガンドのことを言う。かかる下流シグナル経路としては、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子が挙げられるが、これらに限定されない。アゴニストはペプチドアゴニストであることが好ましい。アゴニストは、ＬＩＧＨＴ（リンホトキシンに対して相同であり、誘導性発現を示し、Ｔリンパ球によって発現される受容体）、リンホトキシンアルファ（ＬＴα）、およびアゴニスト抗体からなる群から選択されるペプチドアゴニストであることがより好ましい。
【００４０】
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」という用語は、ＨＶＥＭに結合し、なおかつ、ＨＶＥＭを誘発して下流シグナル経路を活性化させる能力を有する抗体のことを言う。かかる下流シグナル経路としては、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アゴニスト抗体は、ＨＶＥＭの細胞外ドメインに結合し、少なくとも１つのＣＲＤに結合することが好ましい。「アゴニスト抗体」という用語は、抗ＨＶＥＭアゴニストモノクローナル抗体や、ポリエピトピック特異性を持つ抗ＨＶＥＭアゴニスト抗体組成物を包含する。本発明の好適な実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。抗体は任意の哺乳類ＨＶＥＭに対して産生され得る。抗体は霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、もしくはブタ科のＨＶＥＭに対して産生されることが好ましい。抗体はヒトＨＶＥＭに対して産生されることがより好ましい。ある実施形態では、本発明の抗体により赤血球生成が刺激される。ある実施形態では、赤血球生成を刺激する抗体はＨＶＥＭのアゴニストである。
【００４１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特異性抗原に結合特異性を示すタンパク質のことを言う。天然抗体は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖とからなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と連結し、ジスルフィド結合数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖によって変化する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメインを有し、その後に多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメインを有し、他方の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。
【００４２】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、最も広い意味で使用し、抗体が所望のアゴニスト活性を示し、赤血球生成を刺激する限り、単一のモノクローナル抗体、ポリエピトピック特異性を持つ抗体組成物（即ち、ポリクローナル抗体組成物）、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、および抗体断片（例：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｖ）を包含する。
【００４３】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性および特異性に使用されているという事実のことを言う。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つの部分に集中している。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ベータシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより連結されたベータシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接した状態に保たれており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９８７），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、抗体依存性細胞障害への抗体の関与など種々のエフェクター機能を示す。
【００４４】
抗体のパパイン消化は、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは「Ｆｃ」断片である。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００４５】
本明細書で使用される「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗体断片のことを言う。この領域は、非共有結合をなした一つの重鎖および一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識して結合する能力を有していることが当該技術分野において認識されている。
【００４６】
本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」という用語は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメインとを含む抗原結合断片のことを言う。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。本明細書で使用される「Ｆａｂ’−ＳＨ」という用語は、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を担持しているＦａｂ’断片のことを言う。
【００４７】
任意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【００４８】
抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それらのいくつかはさらに、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、およびＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２などのサブクラス（アイソタイプ）に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配位は周知である。
【００４９】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、即ち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一な抗体のことを言う。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。異なるエピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリエピトピック（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに対するものである。モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養から産生し、単離することができる。「モノクローナル」という用語は、抗体の特異性を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を要するものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら、（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。
【００５０】
本明細書で検討されたモノクローナル抗体としては、「キメラ」抗体が挙げられ、その重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、残りの鎖（単数または複数）は、所望のアゴニスト活性を示す限り、かかる抗体の断片のように別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同のものである（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５を参照されたい）。
【００５１】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、非ヒト（例：マウス）抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン鎖またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、または他の抗原結合サブ配列など）の形態のことを言う。例えば、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基が、所望の特異性、および親和性を有するマウス、ラット、ヤギ、ロバ、またはウサギなどの非ヒト種（即ち、ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されたヒト免疫グロブリンであってもよい。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入ＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。かかる修飾は、抗体の特性を更に洗練し最適化するために導入され、これは当該技術分野において周知である。ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、なおかつ、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つの可変ドメインを含むことが好ましく、２つの可変ドメインを含むことがより好ましい。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むことがさらにより好ましい。さらなる詳細については、米国特許出願公開第２００３００９６４０３号；米国特許出願公開第２００３０１４４４８３号；米国特許出願公開第２００８００２７１４７号；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら、（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａら、（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６）を参照されたい。
【００５２】
一実施形態では、特許請求される本発明の抗体はモノクローナルであり、赤血球生成を刺激する。別の実施形態では、特許請求される本発明の抗体は、アゴニストのようにヒトＨＶＥＭに結合し、赤血球生成を刺激する。別の実施形態では、抗体は、本明細書に記載されているモノクローナル抗体ＨＭ３．３０、クローン２７、およびクローン６Ｈ９のいずれか１つと同じ生物学的特性を示す。「生物学的特性」という用語は、モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ活性のことを示すものであり、例えば、アゴニストのようにヒトＨＶＥＭに結合する能力、下流シグナル経路を活性化させる能力（その例としては、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子が挙げられるが、これらに限定されない）、およびＥＰＯ産生を刺激する能力である。別の実施形態では、特許請求される本発明の抗体は、本明細書に記載されているモノクローナル抗体ＨＭ３．３０、クローン２７、およびクローン６Ｈ９のいずれか１つと同じエピトープに結合する。モノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＨＭ３．３０、クローン２７、およびクローン６Ｈ９の１つの同じ結合特異性を有するかどうかを測定するため、例えば、競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いることができる。
【００５３】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、その自然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたポリペプチドまたは抗体などの薬剤のことを示すものである。例えば、「単離された」本発明のモノクローナル抗体は、細胞培養または他の合成環境から精製され、ローリー法により定量してタンパク質が９５重量％よりも多い純度に、または、クーマシーブルーあるいは銀染色を用いた還元あるいは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるまで精製されることが好ましい。
【００５４】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、特定の生理学的状態または症状の予防、治療、または所望の結果をもたらすのに十分な任意の所与の分子量のことを言うために用いられる。投与される薬剤またはアゴニストの有効量は、治療される疾患、治療される特定の哺乳類、個々の患者の病態、疾患原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師には周知の他の要因などを考慮して定められる。一実施形態では、有効量は、哺乳類内の赤血球生成を刺激するのに必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。
【００５５】
一実施形態では、有効量は、哺乳類内の貧血性疾患の治療に必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、貧血性疾患は、例えば、腎不全、化学療法、薬物療法、失血、食餌、栄養不良、妊娠、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連性貧血、感染、および遺伝的もしくは後天性の貧血性疾患（例えば、鎌状細胞貧血、地中海貧血、溶血性貧血、および再生不良性貧血が挙げられる）によってもたらされる。本発明により包含される他の疾患および疾病は、米国特許出願公開第２００６０１７８３１７号に記載されている。
【００５６】
別の実施形態では、有効量は、哺乳類内の神経変性疾患の治療に必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、精神分裂病、および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される。
【００５７】
さらに別の実施形態では、有効量は、哺乳類内の急性虚血性脳卒中または出血性脳卒中の治療に必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。
【００５８】
別の実施形態では、有効量は、哺乳類内の炎症性疾患の治療に必要な最小量である。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、およびブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、炎症性疾患は、喘息、アレルギー、慢性関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【００５９】
本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、標的物質と錯体を形成することが可能なオリゴヌクレオチドのことを言う。アプタマーは、ＨＶＥＭと錯体を形成し、かつ、ＨＶＥＭのアゴニストであることが好ましい。アプタマーは、任意の周知の方法、例えば、合成方法、組換え方法、および精製方法により調製することができ、単体で用いても、あるいは同じ標的に対して特異的な他のアプタマーと組み合わせて用いてもよい。
【００６０】
本発明のアプタマーは、水素結合または他の分子力によりＨＶＥＭと相互作用または錯体形成し得る。しかしながら、かかる相互作用または錯化は、ＤＮＡ二重鎖形成と従来関連する正常な「ワトソン・クリック」型の結合相互作用（即ち、アデニン−チミンとグアニン−シトシン塩基対合）は除く。一般に、特異結合をもたらすには最低でも約１０個のヌクレオチドが必要である。本明細書に概括的に記載されるオリゴヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖であるが、アプタマーは三本鎖または四本鎖構造であることも考えられる。
【００６１】
本発明のアプタマーは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ部分として合成されてもよく、あるいは当該技術分野において認識されている「修飾」オリゴマーであってもよい。かかる修飾としては、糖（リボースやデオキシリボース）の修飾形もしくは類似形、別の連結基、またはプリンおよびピリミジン塩基の類似形の組み込みが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、１つのタンパク質に対するコード配列が少なくともその一部に融合することで異なる遺伝子からの第２のタンパク質のコード配列に大幅に変化している遺伝子産物のことを言う。融合パートナーは、種々の機能としての役割を果たす。例えば、ＨＶＥＭを活性化するかもしくはＨＶＥＭのアゴニストであるタンパク質の溶解度を高めることのみならず、宿主細胞または培養上清もしくはその両方から組換え融合タンパク質を精製することが可能な「親和性標識」を提供することが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書で使用される「Ｔｅｒ−１１９＋細胞」という用語は、Ｋｉｎａら、（２０００），Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１０９：２８０−７に記載されているＴｅｒ−１１９モノクローナル抗体によって特異的に結合したエピトープを発現する細胞のことを言う。野生型の成体マウスでは、Ｔｅｒ−１１９抗体は、成熟赤血球、２０〜２５％の骨髄細胞、および２〜３％の脾臓細胞と反応するが、胸腺細胞やリンパ節細胞とは反応しない。
【００６４】
本明細書で使用される「投与する」という用語は、哺乳類の体内または体上に組成物を導入する任意のプロセスのことを言い、本明細書に記載の特定の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用される「エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニスト」という用語は、ＥＰＯ受容体の活性化を引き起こすことが可能な分子のことを言い、これは、任意の数のメカニズムからもたらされ得る。ＥＰＯ受容体アゴニストとしては、ダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標））、エポエチンアルファ（ＥＰＯ、ＥＰＯＧＥＮ（商標））、および抗ＥＰＯ受容体アゴニスト抗体（例えば、米国特許第７，０８７，２２４号；国際公開第２０００／０２４８９３号パンフレットを参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用される「機能断片」とは、全長ポリペプチドと同様の生理学的または細胞効果を発揮する、全長ポリペプチドの断片またはスプライス変異のことである。機能断片の生物学的効果は、同様の生理学的または細胞効果が見られる限り、全長ポリペプチドとして範囲もしくは強度が同一である必要はない。例えば、抗ＨＶＥＭ抗体の機能断片は、検出可能な程度にＨＶＥＭを活性化することができる。
【００６７】
本明細書で使用される「変異体」という用語は、キメラまたは融合ポリペプチド、同族体、類似体、オルソログ、およびパラログのことを言う。さらに、基準タンパク質またはポリペプチドの変異体は、アミノ酸配列が基準タンパク質またはポリペプチドと少なくとも約８０％同一であるタンパク質またはポリペプチドである。特定の実施形態では、変異体は、基準タンパク質またはポリペプチドと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％同一である。本明細書で使用される、配列アラインメントに関する「に対応する」および「に対応している」という用語は、基準タンパク質またはポリペプチド、例えば、野生型のヒトまたはマウスＨＶＥＭ内の列挙位置や、基準タンパク質またはポリペプチド上の位置と整列している修飾タンパク質またはポリペプチドにおける位置を意味するものである。従って、対象タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、基準タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と整列している場合、基準タンパク質またはポリペプチド配列の特定の列挙位置「に対応する」配列は、基準配列のこれらの位置と整列しているものであるが、基準配列の数値上の位置が全く同じである必要はない。配列を整列させて配列間の対応アミノ酸を決定する方法を以下に説明する。
【００６８】
例えば、哺乳類ＨＶＥＭをコードしている基準アミノ酸配列と少なくとも、例えば、約９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、基準ＨＶＥＭをコードしている基準アミノ酸配列のアミノ酸１００個当たり約５個までの修飾を含み得る以外は、アミノ酸配列が基準配列と同一であることを意味すると理解される。すなわち、基準アミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを得るため、基準配列の約５％までのアミノ酸残基を削除するかまたは、他のアミノ酸と置換してもよく、あるいは、基準配列における全アミノ酸の多数のアミノ酸（約５％まで）を基準配列に挿入してもよい。これらの基準配列の修飾は、基準アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端位で発生するか、あるい基準配列におけるアミノ酸に個々に点在するかもしくは基準配列内の１つ以上の隣接基に点在するこれらの末端位間のどこにでも発生し得る。
【００６９】
本明細書で使用される「同一性」とは、基準となるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度のことである。一般に、最も高次のマッチングが得られるように配列は整列している。「同一性」それ自体が、当業界で認識された意味を持ち、公開技術を用いて算出することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照されたい）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定する方法がいくつか存在するが、「同一性」という用語は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。２つの配列間の同一性または類似性を決定するのに一般に用いられる方法としては、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４）ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆ Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。コンピュータープログラムは、同一性および類似性を算出する方法およびアルゴリズムも含み得る。２つの配列間の同一性または類似性を決定するためのコンピュータープログラム法の例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら、（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（ｉ）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０），Ｊ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３）、およびＦＡＳＴＤＢが挙げられるが、これらに限定されない。同一性および類似性を決定する方法の例としては、Ｍｉｃｈａｅｌｓ，Ｇ．ａｎｄ Ｇａｒｉａｎ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ １，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一実施形態では、２つ以上のポリペプチド間の同一性を決定するのに用いるアルゴリズムはＢＬＡＳＴＰである。
【００７０】
Ｉ．抗体の産生
【００７１】
ＨＶＥＭに対するポリクローナル抗体は、抗体産生において当該技術分野で周知の技術のいずれかを用いて、動物で産生される。例えば、ポリクローナル抗体は、ＨＶＥＭまたはその断片とアジュバントとを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより産生される。ある特定の条件下では、二官能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイル硫化コハク酸イミドエステル（システイン残基による共役）、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（リシン残基による）、およびグルタルアルデヒドを用いて、免疫される種に免疫原性があるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターにＨＶＥＭまたはその断片を共役させることが有用である。免疫反応を高めるため、ミョウバンなどの凝集剤を用いてもよい。
【００７２】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法によっても、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によっても作製することができる。
【００７３】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生可能なリンパ球を導き出す。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）］。
【００７４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含む適当な培地に播種し、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたＨＰＲＴ）を欠失する場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含有するであろう。
【００７５】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベル発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性の細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株であり、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．Ｕ．Ｓ．Ａ．から市販されているＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．から市販されているＳＰ−２細胞から誘導されたものである。ヒトモノクローナル抗体を産生するヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、（１９８７），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００７６】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えば放射免疫測定（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定することが好ましい。所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させてもよい。この目的に適当な培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地、またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させてもよい。
【００７７】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、または血清から分離されることが好ましい。
【００７８】
本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来方法（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いること）により容易に単離され、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次いでこれを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１）、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合させることで修飾してもよい。
【００７９】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野では周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト抗体から導入した１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、本質的には、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することによりＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）に従って行うことができる。
【００８０】
抗体・抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット」法では、非ヒト抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に、非ヒト配列のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓら、（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用してもよい。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら、（１９９３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３）。
【００８１】
ＩＩ．ＨＶＥＭ活性剤のスクリーニング
【００８２】
アゴニスト抗体などのＨＶＥＭを活性化させる薬剤をスクリーニングするため、当該技術分野では公知の結合アッセイのいずれかを用いて、薬剤のＨＶＥＭに対する特異結合について薬剤を最初に試験してもよい。かかるアッセイとしては、プラズモン共鳴を用いて（即ち、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて）薬剤のＨＶＥＭに対する結合を測定すること、あるいは、薬剤を放射標識または蛍光標識して結合を直接評価することが挙げられる。ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体を検出するため、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、およびウェスタンブロット法などのアッセイを用いてもよい。ＨＶＥＭに結合する薬剤がＨＶＥＭのアゴニストであるかどうか測定するため、抗ＣＤ３抗体と、ＨＶＥＭ活性化について試験される薬剤とが混在した状態で、ＨＶＥＭを発現しているＴリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることができる。かかる方法では、Ｔリンパ球の増殖が誘発されたことで、薬剤がＨＶＥＭのアゴニストであることが示される。Ｔリンパ球の増殖については、例えば、放射標識した３Ｈ−チミジンの組み込みによる測定、ＣＤ３８発現のフローサイトメトリー評価、およびブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組み込みに基づく酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）などの、かかる目的において当該技術分野において周知であるアッセイのいずれかを用いて測定することができる。
【００８３】
薬剤がＨＶＥＭを活性化できるかどうかを測定する他の方法では、Ｔリンパ球などの細胞をＨＶＥＭ＋／＋およびＨＶＥＭ−／−動物から入手し、薬剤に暴露してもよい。ＨＶＥＭの活性化については、上述の抗ＣＤ３抗体を用いた増殖アッセイを使用するかあるいは、ＨＶＥＭ活性化によりもたらされる当該技術分野では公知の下流シグナル伝達イベント、例えば、核因子ＫＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ、およびＡＰ−１などの転写制御因子の活性化を測定することによって測定することができる。ＨＶＥＭの活性化の特異性については、結果を薬剤で処理したＨＶＥＭ−／−細胞と比較することで測定することができる。
【００８４】
ＩＩＩ．ＨＶＥＭ活性化による赤血球生成の刺激
【００８５】
本発明は、哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法にも関する。一実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤またはＨＶＥＭのアゴニストである薬剤を哺乳類に投与して赤血球生成を増加させることができる。赤血球生成の増加は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤またはＨＶＥＭのアゴニストである薬剤による治療前後に哺乳類の血清中のＥＰＯ濃度を測定するかもしくは、血液中のヘモグロビンまたは赤血球レベルを測定することによって測定することができる。
【００８６】
他の実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、より好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与することによる赤血球生成の刺激は、赤血球産生の低下あるいは欠乏により特徴付けられる血液疾患の治療に用いてもよい。例えば、ＥＰＯは、当業界で認識される貧血の治療である。貧血は、一次疾患（例：鎌状細胞貧血）としても、他の疾患に伴う二次性貧血としても現れ得る（例：慢性腎不全患者；Ｅｓｃｈｂａｃｈら、（１９８７），ＮＥＪＭ，３１６：７３−７８；Ｅｇｒｉｅら、（１９８８），Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．，３３：２６２；Ｌｉｍら、（１９８９），Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１１０：１０８−１１４を参照されたい。これらの出願の全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる）。さらに、貧血は、既存の治療法の副作用としても現れ得る。例えば、ＡＩＤＳや悪性腫瘍を持つ患者は、治療介入の結果として貧血を起こすことが多い（Ｄａｎｎａら、Ｉｎ：Ｍ Ｂ，Ｇａｒｎｉｃｋ，ｅｄ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；１９９０：ｐ．３０１−３２４）。従って、本発明は、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与することによって貧血を治療する方法を提供する。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、またはブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、貧血性は、腎不全、化学療法、または薬物療法によってもたらされる。
【００８７】
本発明の別の実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与して、哺乳類内の神経変性疾患を治療する。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、またはブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病からなる群から選択される。
【００８８】
本発明のさらに別の実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与して、哺乳類内の急性虚血性脳卒中または出血性脳卒中を治療する。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、またはブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＶＥＭを活性化する薬剤、好ましくはＨＶＥＭのアゴニストを投与して、哺乳類内の炎症性疾患を治療する。哺乳類は、霊長類、齧歯類、イヌ科、ネコ科、ウマ科、ウシ科、またはブタ科であることが好ましい。哺乳類はヒトであることがより好ましい。ある実施形態では、炎症性疾患は、喘息、アレルギー、慢性関節リウマチ、および炎症性腸疾患からなる群から選択される。
【００９０】
ある実施形態では、本発明は、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、治療分子を集めて調合してもよいし、キットに集めて包装してもよい。ある実施形態では、組成物は、液体もしくは凍結乾燥形態であってもよく、種々のｐＨ値とイオン強度とを有する希釈剤（トリス、酢酸、またはリン酸緩衝剤）と、ツイーンまたはポリソルベートなどの可溶化剤と、ヒト血清アルブミンまたはゼラチンなどの担体と、チメロサールまたはベンジルアルコールなどの防腐剤と、アスコルビン酸またはメタ重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤とを含む。ある実施形態では、溶解度または安定性を高めるため水溶性高分子で修飾した治療分子のいずれかを含む組成物も包含する。ある実施形態では、組成物は、長期間にわたる制御送達のためにリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、または小胞に治療分子のいずれかを組み込んだものも含む。
【００９１】
より詳細には、ある実施形態では、本明細書の組成物は、ヒドロゲル、シリコーン、ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、または生分解性高分子などのポリマーマトリクスに組み込んだものでもよい。ヒドロゲルの例としては、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキル）（ｐ−ＨＥＭＡ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、および種々の高分子電解質錯体が挙げられるが、これらに限定されない。生分解性高分子の例としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡの共重合体、ポリアミド、およびポリアミドとポリエステルの共重合体が挙げられるが、これらに限定されない。他の制御放出製剤としては、注射で投与してもよいマイクロカプセル、マイクロスフェア、高分子錯体、および高分子ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
特定の組成物の選択は、多数の要因に依り、例えば、治療される状態、投与経路、および所望の薬物動態パラメータが挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物に適当な成分のより広範な調査については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）に記載されており、参照することで本明細書に組み入れられる．
【００９３】
ある実施形態では、治療分子の有効量（単数または複数）は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依る。従って、ある実施形態では、治療士は、最適な治療効果を得るために必要に応じて投与量を変えたり、投与経路を変更してもよい。一般的な１日の投与量は、上述の要因に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。ある実施形態では、臨床医は、所望の、赤血球生成の増加もしくは血液疾患の臨床改善を達成する投与量に到達するまで、組成物（単数または複数）を投与してもよい。
【００９４】
ある実施形態では、組成物（単数または複数）は、１つ以上の治療分子を単回用量または複数回用量として投与してもよい。これらの用量は、同一または異なる量の治療分子からなっていてもよく、同一または異なる投与経路を介して同一または異なる回数で投与してもよい。ある実施形態では、組成物は、治療分子のいずれか１つまたは任意の組合せを含む組成物として投与してもよい。ある実施形態では、組合せは、同一または異なる量の治療分子を含み得る。ある実施形態では、組成物（単数または複数）は、埋込器またはカテーテル経由で持続注入で投与してもよい。持続注入が２つ以上の治療分子を含む実施形態では、同一または異なる濃度の治療分子を含んでもよい。
【００９５】
最適な投与量、最適な投与経路、および最適な投与回数を決定することは、当業者の知識の十分範囲内である。例えば、本発明の薬剤は、患者に１回以上に分けて投与しても、持続注入で投与してもよい。数日間またはそれ以上にわたる連続投与では、病徴の所望の抑制が起こる、患者状態の所望の改善が達成される、あるいは所望のＥＰＯ産生レベルが得られるまで、状態に応じて治療を繰り返してもよい。用量は、週に数回から６カ月に１回までの間隔で再投与してもい。
【００９６】
本発明の薬剤の投与は、赤血球生成を高める、あるいは、貧血、神経変性疾患、炎症性疾患、急性虚血性脳卒中もしくは出血性脳卒中を治療するための当業者に周知の他の治療と組み合わせてもよい。好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、赤血球生成を高める１つ以上の治療で投与される。例えば、本発明の一実施形態では、本発明の薬剤と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストとを含む組成物を哺乳類に投与してもよい。エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストは、ダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（商標））、エポエチンアルファ（ＥＰＯ、ＥＰＯＧＥＮ（商標））、および抗ＥＰＯ受容体アゴニスト抗体であってもよいが、これらに限定されない。
【００９７】
実施例
実施例１：マウスＨＶＥＭに特異的に結合するモノクローナル抗体の生成
【００９８】
抗マウスＨＶＥＭモノクローナル抗体を生成するため、マウスＨＶＥＭの細胞外ドメインがマウスＩｇＧのＦｃ領域に融合した融合タンパク質でハムスターを免疫した。第１の免疫化において、融合タンパク質をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）でエマルション化した。第２および第３の免疫化において、融合タンパク質をフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）でエマルション化した。免疫化は、２週間ごとに皮下投与した。第３の免疫化の後、免疫ハムスターから血清を採取し、抗ＨＶＥＭ抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより測定した。第４の免疫化は、アジュバントの不在下で腹腔内投与した。第４の免疫化から５日後に、脾細胞を採取し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞に融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを生成した。得られたハイブリドーマの培養上清を、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって、マウスＨＶＥＭに特異的に結合する抗体の存在についてスクリーニングした。
【００９９】
実施例２：ＨＶＥＭにアゴニスト作用を有する抗体の同定
【０１００】
実施例１に記載した実験で生成された抗マウスＨＶＥＭ抗体を、抗ＣＤ３抗体でコートした９６ウエルプレートでＴリンパ球によりインキュベートした。Ｔリンパ球の増殖を刺激した抗体は、３Ｈ−チミジンの組み込みの増加について測定し、ＨＶＥＭのアゴニストであると同定された。ＨＶＥＭにアゴニスト作用を有するかかる抗体の１つを単離し、ＨＭ３．３０と呼ばれる別の実験に用いた。
【０１０１】
実施例３：ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＭ３．３０マウスモノクローナル抗体の特徴
【０１０２】
実施例３．１：ＨＭ３．３０抗体の注入による脾臓赤芽球の増加
【０１０３】
ＨＭ３．３０抗体のアゴニスト機能はｉｎ ｖｉｖｏで評価した。１５０μｇの対照ＩｇＧ抗体（図１Ａ、左側の箱）またはＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（図１Ａ、右側の箱）を野生型マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。抗体の投与４日後に、マウスから脾細胞を単離し、Ｔｅｒ−１１９抗体および抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を用いて蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を施した。図１Ａに示すように、ＨＭ３．３０抗体を注射したマウスは、約１０倍のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖を示した。ＨＭ３．３０抗体をＨＶＥＭノックアウトマウスに投与した場合（ＨＶＥＭ−／−）（ｎ＝３）、または、ＨＶＥＭに結合しない対照抗体を野生型マウスに投与した場合（図１Ｂ）（ｎ＝２）、脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖は起きなかったため、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖には、ＨＶＥＭに結合しているＨＭ３．３０抗体を要することが分かった。バーは平均±ＳＥＭを示す。アゴニストである抗ＨＶＥＭ抗体ＨＭ３．３０に対して、ＨＭ２．２と呼ばれる非アゴニスト抗体は、脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖の媒介がかなり弱かった（図１Ｃ）。バーは、グループ当たり２匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。
【０１０４】
ＨＭ３．３０抗体によって誘発されたＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖は、ＨＶＥＭの自然発生リガンドへの結合を阻害することによって媒介されなかった。ＬＩＧＨＴ−／−マウス（Ｔａｍａｄａら．（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：４１０５）、ＬＴα−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｏｒｉｅｓから購入）、または野生型マウスにＨＭ３．３０抗体を投与した。ＬＩＧＨＴ−／−マウスとＬＴα−／−マウスは、野生型対照マウスにＨＭ３．３０抗体を投与後の脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖と同様であることを実証した（図１Ｄ）。Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−脾細胞の絶対数は、平均±ＳＥＭで示す。ＨＭ３．３０抗体の注射２４時間後に貧血の兆候が見られなかったため、赤血球個体群の増殖は、赤血球溶解のフィードバック反応ではないと測定した。
【０１０５】
実施例３．２：骨髄におけるＨＭ３．３０媒介エリスロポエチン増殖の発生
【０１０６】
１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体または１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ抗体を野生型マウスに注射することで、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体の投与時に増殖するＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の発生源について測定した。抗体の投与２日、４日、および６日後に、試験マウスの骨髄、脾臓、および末梢血におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞個体群について測定した（図２Ａ）。各丸は、少なくとも２匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。骨髄におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖は２日および４日にピークであったが、脾臓におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖は抗体投与４日後まで明らかではなかった。末梢血では、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖のピークは抗体投与６日後まで発生しなかった。これらの異なる区画における増殖動態により、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞のＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体誘導による増殖が骨髄で発生したことが示された。
【０１０７】
１２時間前にＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を受けたマウスから採取した骨髄細胞をメチルセルロース培地上にｉｎ ｖｉｔｒｏで載置することで、対照ハムスターＩｇＧ抗体を受けたマウスから採取した骨髄細胞と比較して、ベンジジン陽性のＣＦＵ−Ｅ数がかなり増加したことが実証された（図２Ｂ）。各バーは、２枚のプレートの平均±ＳＥＭを示す。
【０１０８】
ＨＭ３．３０抗体誘導の赤芽球増殖メカニズムが、脾臓内のＨＶＥＭシグナル伝達の下流活性化からもたらされたかどうか測定するため、脾臓摘出２日後の脾摘マウスに、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（黒色バー）または対照ハムスターＩｇＧ抗体（灰色バー）を注射した。抗体投与２日後に、骨髄および末梢血におけるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖を測定した（図２Ｃ）。バーは、少なくとも３匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体投与後の赤血球増殖は脾摘マウスで起こった。これは、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖に脾臓が必要ではないことを示すものである。
【０１０９】
抗体がＨＶＥＭ発現細胞に直接機能できるかどうか測定するため、Ｔｅｒ−１１９＋骨髄細胞を単離し、抗ＨＶＥＭ抗体で染色した。ＦＡＣＳ分析により、ＨＶＥＭがＴｅｒ−１１９＋細胞で普遍的に発現することが実証され、抗体が骨髄細胞における赤血球増殖に直接作用できることを示唆した（図３）。
【０１１０】
実施例４：ＨＭ３．３０抗体の投与によるＥＰＯ産生の誘発
【０１１１】
骨髄内でＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞個体群が増殖するメカニズムを測定するため、１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ抗体または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を野生型マウスグループに腹腔内注射した。抗体投与８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間後に、マウスを安楽死させ、血清中のＥＰＯレベルを測定した。ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与されたマウスでは、血清のＥＰＯレベルは著しく増加し、抗体投与２４時間後にピークを迎えた（図４Ａ）。各時点は、少なくとも４匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。２つの独立した実験からのプールデータを示す。１５０μｇの抗ＥＰＯ抗体を腹腔内投与し、次いで１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を腹腔内投与したことで、脾臓内のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖が打ち消されたため、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖はＥＰＯに依存すると測定された（図４Ｂ）。抗体投与４日後のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−脾細胞の絶対数を図４Ｂに示す。バーは、１グループ当たり３匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。
【０１１２】
実施例５：骨髄細胞でのＨＶＥＭの発現には、ＨＭ３．３０抗体投与時に、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖およびＥＰＯ産生を必要とする。
【０１１３】
アゴニスト抗ＨＶＥＭ抗体が腎臓の間質細胞または上皮細胞を直接誘導してＥＰＯを産生できるかどうか測定するため、野生型またはＨＶＥＭ−／−マウスから放射線照射野生型マウスに骨髄細胞を移すことで骨髄キメラマウスを生成した。照射間に６時間の間隔を開けてマウスを６１０ラジアンで２回照射し、放射線照射マウスを調製した。最後の放射線処理の１時間以内に約５００万個のドナー骨髄細胞を静脈内に移した。６週間後、１５０μｇの対照ＩｇＧ抗体または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体をキメラマウスに腹腔内注射した。造血細胞にＨＶＥＭが無いことで、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体の投与時に、ＥＰＯ産生の増加（図５Ｂ）およびその後の赤血球増殖（図５Ａ）とが取り除かれた。一方、野生型またはＨＶＥＭ−／−マウスから放射線照射ＨＶＥＭ−／−マウスに骨髄を移して生成した逆キメラマウスでは、ドナー骨髄が野生型マウスからであった場合、ＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体の投与時にＥＰＯ産生の増加（図５Ｄ）およびその後の赤血球増殖（図５Ｃ）が起こった。これらの実験により、骨髄細胞でのＨＶＥＭの発現には、ＨＭ３．３０抗体によって媒介される、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖およびＥＰＯ産生の増加を必要とすることが示唆される。各バーは、少なくとも４匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。
【０１１４】
実施例６：ＨＭ３．３０抗体は、Ｔリンパ球、Ｂ−リンパ球、または好中球の不在下で、脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖を増加させることができる。
【０１１５】
Ｔ−およびＢ−リンパ球の不在下でもアゴニスト抗ＨＶＥＭ抗体が赤血球増殖を誘導できるかどうか測定するため、１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ（ｎ＝２）または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（ｎ＝３）をＲａｇ欠損マウスに腹腔内注射した。抗体投与４日後に、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系脾細胞の数を測定した。Ｔ−およびＢ−リンパ球の欠乏は、ＨＭ３．３０に媒介されるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系脾細胞の増殖に観察可能な効果を有さなかった（図６Ａ）。さらに、ＨＭ３．３０抗体に媒介される、脾臓のＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞増殖は、Ｒａｇ欠損マウスからの好中球の枯渇により打ち消されなかった（図６Ｂ）。この実験では、０日目および１日目にＲａｇ欠損マウスに抗Ｇｒ１．１抗体を投与することで好中球を枯渇させた。０日目に、１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ（ｎ＝３）または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（ｎ＝３）をＲａｇ欠損マウスに腹腔内注射した。実験により、Ｔリンパ球、Ｂ−リンパ球、または好中球ではない骨髄由来細胞の個体群は、腎ＥＰＯ産生および赤血球増殖を媒介することが示唆される。バーは平均±ＳＥＭを示す。
【０１１６】
実施例７：ｅＮＯＳの阻害により、ＨＭ３．３０抗体媒介の赤血球生成が減少する。
【０１１７】
ＥＰＯ産生のメカニズムをさらに測定するため、ＨＭ３．３０に媒介されるＴｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞の増殖におけるＨＶＥＭの下流エフェクターの阻害剤の効果について分析した。以前の研究により、プロスタグランジンおよび一酸化窒素（ＮＯ）がＨＶＥＭの下流エフェクターであると示されている（Ｃｈａｎｇら、（２００５），Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，１２：３６３；Ｈｅｏら、（２００６），Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，７９：３３０）。ｅＮＯＳ（内因性一酸化窒素合成酵素）の阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥ１００ｍｇ／ｋｇを０日目から４日目まで２４時間ごとにマウスに腹腔内投与した。さらに、１５０μｇの対照ハムスターＩｇＧ（ｎ＝３）または１５０μｇのＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（ｎ＝３）をマウスに腹腔内投与した。ＨＭ３．３０抗体およびＬ−ＮＡＭＥを投与されたマウスは、Ｔｅｒ−１１９＋／ＣＤ４５−赤血球系細胞個体群の増殖が約５０％減少し（図７）、ＮＯがＨＶＥＭの活性化により誘導された赤血球生成の下流メディエータであり得ることが示された。バーは平均±ＳＥＭを示す。「＊」は、スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５であることを示す。
【０１１８】
実施例８：ＨＭ３．３０抗体を用いたシスプラチン誘発貧血の治療
【０１１９】
シスプラチンは腎臓毒性の原因となり、ＥＰＯを産生する腎臓細胞を殺すことでＥＰＯ欠乏貧血を引き起こすことが示されている（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら、（２００６），Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，８０：６８０）。抗ＨＶＥＭアゴニスト抗体の投与がｉｎ ｖｉｖｏの貧血性疾患モデルにおいてＥＰＯの産生を誘発し得るかどうか測定するため、０日目に８ｍｇ／ｋｇのシスプラチンをマウスに静脈内注射し、４日、８日、１３日、および１９日目に対照ＩｇＧ抗体（黒丸、図８Ａ）またはＨＭ３．３０抗体（白丸、図８Ａ）を腹腔内注射した。２０日目に、マウスを安楽死させ、血清のＥＰＯレベルを測定した。対照ＩｇＧ抗体で処理したマウスよりもＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体で処理したマウスで血清のＥＰＯレベルは増加した。
【０１２０】
マウスで顕性貧血を誘発するため、１２ｍｇ／ｋｇのシスプラチンをマウスに静脈内投与した。１日目および１９日目に対照ＩｇＧ抗体（黒丸、図８Ｂ）またはＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体（白丸、図８Ｂ）をシスプラチン処理マウスに投与した。０日目、２０日目、および２６日目にマウスを安楽死させ、その時点で血中のヘモグロビン値を測定した。対照ＩｇＧ抗体を投与されたシスプラチン処理マウスよりもＨＭ３．３０ＩｇＧ抗体を投与されたシスプラチン処理マウスで血中ヘモグロビン値が著しく増加した。丸は少なくとも５匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。
【０１２１】
さらに、赤血球生成ストレス誘導のＥＰＯ産生におけるＨＶＥＭの役割について測定した。０日目に１５０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシルを野生型マウスまたはＨＶＥＭ−／−マウスに投与し、血清のＥＰＯレベルを９日目に測定した。ＨＶＥＭ−／−マウスでは、５−フルオロウラシルによる赤血球生成のストレス誘導に応じて血清のＥＰＯレベルが著しく減少した（図８Ｃ）。バーは、少なくとも４匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。「＊」は、ｐ＜０．０５のスチューデントのｔ検定値を示す。
【０１２２】
実施例９：ＨＭ３．３０抗体の結合特異性
【０１２３】
マウスＨＶＥＭ（図９Ａ）、ヒトＨＶＥＭ（図９Ｂ）、マウスＨＶＥＭのＣＲＤ２〜４に融合したヒトＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン（ＣＲＤ）１のキメラ遺伝子（図９Ｃ）、または、ヒトＨＶＥＭのＣＲＤ２〜４に融合したマウスＨＶＥＭのＣＲＤ１のキメラ遺伝子（図９Ｄ）をコードしているプラスミドで２９３Ｔ細胞を形質転換した。ＨＭ３．３０抗体、次いで、ＰＥ共役抗ハムスターＩｇＧで形質転換細胞を標識した。フローサイトメトリーにより抗体標識を分析した。陰性対照として、２９３Ｔ細胞を空ベクトルで形質転換し、ＨＭ３．３０およびＰＥ共役抗ハムスターＩｇＧで標識した（図９、塗りつぶしたヒストグラム）。ＨＭ３．３０は、マウスＨＶＥＭのＣＲＤ１に特異的に結合したが、ヒトＨＶＥＭには特異的に結合しなかった。これは、ＨＭ３．３０抗体がＣＲＤ１との相互作用によりＨＶＥＭに結合することを示唆している。理論に束縛されるものではないが、本発明のアゴニスト抗体は、赤血球生成を刺激する少なくとも１つの要件を有しており、これは、ＣＲＤ１との相互作用を含む（例えば、それとの結合、あるいはそれとの相互作用を含む）。
【０１２４】
実施例１０：アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の生成
【０１２５】
抗ヒトＨＶＥＭモノクローナル抗体を生成するため、ヒトＨＶＥＭの細胞外ドメインがヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合した融合タンパク質でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。第１の免疫化において、融合タンパク質をフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）でエマルション化した。第２および第３の免疫化において、融合タンパク質をフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）でエマルション化した。免疫化は、２週間ごとに皮下投与した。第３の免疫化の後、免疫ハムスターから血清を採取し、抗ＨＶＥＭ抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより測定した。第４の免疫化は、アジュバントの不在下で腹腔内投与した。第４の免疫化から５日後に、脾細胞を採取し、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞に融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを生成した。得られたハイブリドーマの培養上清を、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって、マウスＨＶＥＭに特異的に結合する抗体の存在についてスクリーニングした。ヒトＨＶＥＭを発現している２９３Ｔ細胞に結合している抗体を測定することによって、ヒトＨＶＥＭ（即ち、クローン２７および６Ｈ９）に特異的に結合した２つのクローンを同定した。フローサイトメトリー分析によって標識の強度を検出した（図１０Ａ）。抗体クローン２７および６Ｈ９についてもヒトＨＶＥＭにアゴニスト作用を有すると測定された（図１０Ｂ）。ヒトＴ細胞を健康なドナーＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＨＶＥＭモノクローナル抗体（黒丸；クローン２７、黒三角；クローン６Ｈ９）または対照マウスＩｇＧ（白丸）の指定用量の存在下、抗マウスＩｇＧ抗体でプレコートした９６ウエル組織培養プレートでインキュベートした。インキュベーションの３日後、３Ｈ−チミジン取り込みによってＴ細胞の増殖活性を評価した。データ点は、３ウエル（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｗｅｌｌ）からの平均±ＳＤを示す。データは、３つの個々に繰り返した実験の１つを示す。
【０１２６】
実施例１１：アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体はｉｎ ｖｉｖｏで赤血球生成を刺激する
【０１２７】
アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体（例えば、本明細書に記載のクローン２７および６Ｈ９から誘導される抗体が挙げられる）がｉｎ ｖｉｖｏで赤血球生成を刺激する能力について前臨床マウス異種移植モデルを用いて評価する。このため、例えば、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２受容体共通γ鎖欠乏マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂから市販）を用いる。比較的少数（例、５００万〜２０００万）のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をこれらのマウスに静脈内注射することで、数週間（これらの実験で十分な時間枠）でヒト造血細胞の効果的な生着がもたらされる。ヒトＰＢＭＣ再構成マウスをアゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体で処理し、リンパ器官における血清Ｅｐｏレベルおよび赤血球生成の増加について本明細書に記載の方法および当業者に公知の他の方法によって評価する。さらに、シスプラチンを注射し、次いで、アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体で治療することで、異種移植モデルにおいて貧血状態が誘発される。造血細胞上のＨＶＥＭ発現は、（本明細書に示す通り）アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の赤血球生成効果に必要かつ十分であるため、このヒトＰＢＭＣ再構成系は、ｉｎ ｖｉｖｏでのアゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の活性をスクリーニングして評価するのに有効な前臨床モデルである。理論に束縛されるものではないが、アゴニスト抗ヒトＨＶＥＭ抗体の投与により赤血球生成が促進されるため、貧血を治療することができる。
【０１２８】
参照文献
【０１２９】
本明細書に記載した全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。本明細書で引用した全ての特許および刊行物は、個々の特許および刊行物が特定的におよび別々に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、同じ内容を引用することにより本明細書に組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類ＨＶＥＭに特異的に結合する、前記哺乳類ＨＶＥＭのアゴニストである抗体。
【請求項２】
前記ＨＶＥＭがヒトＨＶＥＭである請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が赤血球生成を誘導する請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、およびその抗原結合性抗体断片からなる群から選択される請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン１（ＣＲＤ−１）に結合する請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体の重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、およびその抗原結合性抗体断片からなる群から選択される請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合し、赤血球生成を刺激する抗体。
【請求項１３】
哺乳類ＨＶＥＭに特異的に結合し、前記哺乳類ＨＶＥＭのアゴニストである抗体であって、以下の工程：
（ｉ）哺乳類に哺乳類ＨＶＥＭタンパク質またはその細胞外ドメインで免疫性を与える工程と；
（ｉｉ）前記哺乳類ＨＶＥＭタンパク質またはその細胞外ドメインに結合する前記哺乳類から抗体を単離する工程と；
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３抗体の存在下、工程（ｉｉ）の抗体をＴリンパ球と接触させる工程と；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）が前記Ｔリンパ球の増殖を誘導するかどうか測定する工程と；
を含む方法によって生成され、
前記Ｔリンパ球の増殖が誘発される場合、工程（ｉｉ）で単離された抗体がＨＶＥＭのアゴニストである抗体。
【請求項１４】
前記哺乳類ＨＶＥＭがヒトＨＶＥＭである請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
哺乳類のヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化する薬剤を含む有効量の組成物を前記哺乳類に投与する工程を含む、前記哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法。
【請求項１６】
前記薬剤がＨＶＥＭのアゴニストである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アゴニストが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、その抗原結合性抗体断片、および一本鎖抗体からなる群から選択される抗体である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、請求項１、請求項１２、または請求項１４のいずれか１項に記載の抗体である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体がＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン１（ＣＲＤ−１）に結合する請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記アゴニストが、ＬＩＧＨＴ（誘導性発現を示しＨＶＥＭのＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンのような、Ｔリンパ球によって発現される受容体）；およびリンホトキシンアルファ（ＬＴα）からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記アゴニストが融合タンパク質の形態である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アゴニストが、ＨＶＥＭに結合する小分子である請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
静脈内、血管内、皮下、または腹腔内に前記組成物を投与する請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳類が貧血性疾患を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記貧血性疾患が、腎不全、化学療法、または薬物療法によってもたらされる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＶＥＭがヒトＨＶＥＭである請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＶＥＭを活性化する薬剤を含む組成物の前記投与工程が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストを投与する工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
ＥＰＯ受容体アゴニストの前記投与工程が、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を含む組成物の投与前、投与中、または投与後に、前記ＥＰＯ受容体アゴニストを投与する工程を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項１】
哺乳類ＨＶＥＭに特異的に結合する、前記哺乳類ＨＶＥＭのアゴニストである抗体。
【請求項２】
前記ＨＶＥＭがヒトＨＶＥＭである請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が赤血球生成を誘導する請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、およびその抗原結合性抗体断片からなる群から選択される請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン１（ＣＲＤ−１）に結合する請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体の重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、およびその抗原結合性抗体断片からなる群から選択される請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合し、赤血球生成を刺激する抗体。
【請求項１３】
哺乳類ＨＶＥＭに特異的に結合し、前記哺乳類ＨＶＥＭのアゴニストである抗体であって、以下の工程：
（ｉ）哺乳類に哺乳類ＨＶＥＭタンパク質またはその細胞外ドメインで免疫性を与える工程と；
（ｉｉ）前記哺乳類ＨＶＥＭタンパク質またはその細胞外ドメインに結合する前記哺乳類から抗体を単離する工程と；
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３抗体の存在下、工程（ｉｉ）の抗体をＴリンパ球と接触させる工程と；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）が前記Ｔリンパ球の増殖を誘導するかどうか測定する工程と；
を含む方法によって生成され、
前記Ｔリンパ球の増殖が誘発される場合、工程（ｉｉ）で単離された抗体がＨＶＥＭのアゴニストである抗体。
【請求項１４】
前記哺乳類ＨＶＥＭがヒトＨＶＥＭである請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
哺乳類のヘルペスウイルス侵入メディエータ（ＨＶＥＭ）を活性化する薬剤を含む有効量の組成物を前記哺乳類に投与する工程を含む、前記哺乳類内の赤血球生成を刺激する方法。
【請求項１６】
前記薬剤がＨＶＥＭのアゴニストである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アゴニストが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、その抗原結合性抗体断片、および一本鎖抗体からなる群から選択される抗体である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がＩｇＧ抗体である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、請求項１、請求項１２、または請求項１４のいずれか１項に記載の抗体である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体がＨＶＥＭのシステイン富化ドメイン１（ＣＲＤ−１）に結合する請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記アゴニストが、ＬＩＧＨＴ（誘導性発現を示しＨＶＥＭのＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合するリンホトキシンのような、Ｔリンパ球によって発現される受容体）；およびリンホトキシンアルファ（ＬＴα）からなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記アゴニストが融合タンパク質の形態である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アゴニストが、ＨＶＥＭに結合する小分子である請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
静脈内、血管内、皮下、または腹腔内に前記組成物を投与する請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳類が貧血性疾患を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記貧血性疾患が、腎不全、化学療法、または薬物療法によってもたらされる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＶＥＭがヒトＨＶＥＭである請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＶＥＭを活性化する薬剤を含む組成物の前記投与工程が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体アゴニストを投与する工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
ＥＰＯ受容体アゴニストの前記投与工程が、ＨＶＥＭを活性化する薬剤を含む組成物の投与前、投与中、または投与後に、前記ＥＰＯ受容体アゴニストを投与する工程を含む請求項２９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１０−５４０６６０（Ｐ２０１０−５４０６６０Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２８１６７（Ｐ２０１０−５２８１６７）
【出願日】平成２０年１０月３日（２００８．１０．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８７６９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４６３１３
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５１００９０６３４）ユニバーシティ オブ メリーランド，ボルチモア (1)
【出願人】（５１００９０６５６）ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３日（２００８．１０．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８７６９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４６３１３
【国際公開日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【出願人】（５１００９０６３４）ユニバーシティ オブ メリーランド，ボルチモア (1)
【出願人】（５１００９０６５６）ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ (1)
【Ｆターム（参考）】
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