喘息及びアレルギー性鼻炎の治療におけるアルギナーゼ阻害剤の使用
本発明は、上気道及び下気道の閉塞、特にアレルゲン誘発性の気管支閉塞及び気道過敏反応性を防ぐことによる喘息又はアレルギー患者の予防的維持療法用の薬剤の調製のためのアルギナーゼ阻害剤の使用に関する。患者は、喘息である又はアレルギー性鼻炎に罹患している。好ましくは、アルギナーゼ阻害剤は２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息及びアレルギー性鼻炎の予防的治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性喘息は、気道の慢性炎症性疾患である。この疾患の特徴的な性質は、気道での炎症性細胞（特にＴｈ２リンパ球及び好酸球）の浸潤及び活性化、ならびに、アレルゲン、化学性刺激物、冷たい空気及び薬理学的物質（ヒスタミン及びメタコリンなど）を含む様々な刺激に対する気道過敏反応性の出現に関与する、アレルゲン誘発性の早発性及び遅発性気管支閉塞性反応である。
【０００３】
気道平滑筋機能の神経性及び非神経性制御における変化ならびに気道における物理的変化（上皮の損傷を含む。）、浮腫及び局所的血管拡張による粘膜の肥厚及び気道内腔における粘液分泌は、急性喘息における早発性及び遅発性喘息反応後の気道過敏反応性の出現に関与し得る。
【０００４】
慢性喘息において、基底膜の肥厚、粘液腺過形成、上皮下線維症及び気道平滑筋質量増加を含む気道壁の不可逆的構造変化による気道リモデリングは、重要なものとして、持続性の気道過敏反応性及び肺機能の低下に関与し得る。
【０００５】
これらの変化は全て、様々なアレルギー性メディエーター、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子及び反応性酸素及び窒素種を含む炎症性反応の複雑なカスケードにより誘導される。
【０００６】
アレルギー性鼻炎は、埃、鱗屑又は植物の花粉の浮遊微小粒子により起こる、これらの物質にアレルギーがあるヒトにおける、主に鼻での症状の一群である。これらの症状が花粉により引き起こされる場合、アレルギー性鼻炎は一般に「枯草熱」として知られる。アレルギー性鼻炎は、喘息と関与し得る、よく見られる問題である。喘息の患者において、鼻炎がコントロール不良であると喘息が悪化すると考えられる。
【０００７】
集団内での喘息の発生率が比較的高いため、休職又は、労働不能ならびに直接的医療保険支出及び投薬による経済的負担は高い。従って、この症状を予防することが必要とされている。さらに、症状の出現が予防的治療により回避され得た場合、喘息及びアレルギー患者のクオリティー・オブ・ライフが非常に向上するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、喘息及びアレルギー性鼻炎に対する新規予防的治療を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
初めて本発明に導いた研究によって、インビボでの喘息の病態生理学におけるアルギナーゼの重要性が示された。アレルギー性喘息のモルモットモデルを用いて、発明者らは、アレルゲン誘発性の早発性（ＥＡＲ）及び遅発性（ＬＡＲ）喘息反応後、特異的なアイソザイム−非選択的アルギナーゼ阻害剤ＡＢＨの吸入によってアレルゲン誘発性の気道過敏反応性（ＡＨＲ）が急速に改善され、一方、アルギナーゼ阻害剤での前処置によって、吸入アレルゲンに対する気道過敏性が顕著に低下し、アレルゲン誘発性ＥＡＲ及びＬＡＲ及び両反応後のＡＨＲの出現が阻止されることを明らかにした。
【００１０】
吸入ＡＢＨでの前処置により吸入アレルゲンに対する気道の過敏性が顕著に低下すること（予防法）がより具体的に分かった。ＡＢＨでの前処置によって、生理食塩水処置対照で気道閉塞を誘発したアレルゲン用量で動物にアレルゲンを付与した場合にアレルゲン誘発性気管支閉塞及びＡＨＲの出現が阻止された。
【００１１】
さらに、生理食塩水処置対照よりも高用量のアレルゲンを用いて動物において気道閉塞を引き起こした場合、吸入ＡＢＨでの前処置によって、また、早発性及び遅発性喘息反応後、ＡＨＲの出現が阻止された。さらに、ＡＢＨにより、早発性ならびに遅発性喘息反応後、急速に、既存のアレルゲン誘発性ＡＨＲが改善された。
【００１２】
アルギナーゼ阻害剤の上記の効果は、ｃＮＯＳ及び／又はｉＮＯＳに対するＬ−アルギニンのバイオアベイラビリティー向上により気道でのＮＯ産生が上昇し、それにより、アレルゲン誘発性の肥満細胞活性化が減弱され、収縮刺激に対する気管支保護が誘導されることにより説明され得る。特に遅発性喘息反応後、後者の効果はまた、ペルオキシ亜硝酸のｉＮＯＳ介在性産生、ＮＯのプロ収縮性及びプロ炎症性代謝産物の低下も含む。
【００１３】
上述の作用機構は、抗アレルギー性（及び抗炎症性）特性を収縮刺激に対する（急性）気管支保護と組み合わさるので、魅力的である。さらに、ポリアミン及びＬ−プロリンのアルギナーゼ介在性合成の阻害に基づき、ＡＢＨは慢性喘息における肺機能の不可逆的低下に関与する気道リモデリングを阻害し得る。
【００１４】
ＡＢＨはアレルギー性喘息患者において特に有効である。アレルゲン誘発性気管支閉塞及びアレルゲン誘発性ＡＨＲの両方に対する保護効果の場合、ＡＢＨを用いた吸入療法は主に、症状を治療するための（短期作用）気管支拡張剤（即ち、アレルゲン誘発性気管支閉塞及びＡＨＲの出現を防ぐための予防的維持療法）を定期的に使用する持続性のアレルギー性喘息患者に対するものである。喘息治療において、ＡＨＲは、喘息の重症度の主要な決定因子なので、標的とされるべき重要な特色である。ＡＢＨによる治療は、Ｍｏｒｒｉｓら（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００４；１７０：１４８−１５３）の研究により重症喘息憎悪の患者におけるアルギナーゼの重要な役割が指摘されているように、軽度、中等度ならびに重症の持続性喘息の患者を対象としたものである。
【００１５】
その抗アレルギー性効果を考えると、アレルギー性鼻炎（アレルギー性喘息と関連することが多い。）の患者におけるＡＢＨの有益な効果もまた本発明の一部である。
【００１６】
従って、本発明は、上気道及び下気道の閉塞、特にアレルゲン誘発性気管支閉塞及び／又は気道過敏反応性を阻止することによる、喘息又はアレルギー患者の予防的維持療法用の薬剤の調製のためのアルギナーゼ阻害剤の使用に関する。治療すべき患者は、特に、その疾患の症状又は原因としてアルギナーゼ活性が上昇しているアレルギー患者である。アルギナーゼ活性が上昇している患者は通常、喘息又はアレルギー性鼻炎があるが、その疾患の症状又は原因として気道においてアルギナーゼ活性が上昇している非アレルギー性喘息患者でもあり得る。
【００１７】
原則として、本発明により、何らかのアルギナーゼ阻害剤を使用し得る。本発明での使用に好ましいアルギナーゼ阻害剤は、次の式：
ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｂ（ＯＨ）２
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４のそれぞれは、−（ＣＨ２）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−（ＮＨ）−及び−（Ｎ−アルキル）からなる群から選択する。）
を有するＵＳ−６，７２３，７１０に記載のものである。「アルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、線状又は分枝状、非置換又は例えばＦ、Ｓ、Ｏ又はＮにより置換の、何らかのＣ１からＣ２０炭素骨格及び医薬的に許容可能なその塩を指す。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明は、上記一般式（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４の１つは、−Ｓ−、−Ｏ−、−（ＮＨ）−からなる群から選択され、残りのＸ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４は−（ＣＨ２）−である。）によるアルギナーゼ阻害剤及び医薬的に許容可能なその塩の使用に関する。
【００１９】
特に好ましい実施形態によると、本発明は、次の式：
ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−Ｂ（ＯＨ）２によるアルギナーゼ阻害剤及び医薬的に許容可能なその塩の使用に関する。この化合物は、２（Ｓ）-アミノ−６−ボロノヘキサン酸又はＡＢＨとも呼ばれる。ＡＢＨ及び対応する化合物の調製は例えば、米国特許第６，７２３，７１０号、特に２５段、３４行目から２６段、６７行目及び図６に記載されている。本発明による使用に対するその他の好ましいアルギナーゼ阻害剤は、Ｎω−ＯＨ−Ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）、Ｎω−ヒドロキシ−ノル−Ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）、Ｌ−ノルバリン、ヨードアセチル−Ｌ−オルニチン、ヨードアセチル−Ｌ−リジン、Ｌ−リジン及びＬ−シトルリン及び医薬的に許容可能なその塩からなる群から選択される化合物である。
【００２０】
好ましくは、本アルギナーゼ阻害剤は、薬剤中の唯一の活性成分として使用される。アルギナーゼ阻害剤、特にＡＢＨ、は、他の活性成分と組み合わせずに使用することができる。しかし、本アルギナーゼ阻害剤は、予防製剤において適切な不活性添加物と組み合わせられる。
【００２１】
ＷＯ２００４／０７３６２３は、アルギニン阻害剤及び／又はマグネシウムと場合によっては組み合わせられるアルギニンによる、喘息を含むアルギニン上昇に関与する状態の治療を開示する。この公報は予防ではなく治療に関する。基本的治療はアルギニンを用いるものである。さらなる活性成分としてアルギナーゼ阻害剤を添加し得るが、主要な又は唯一の活性成分ではない。
【００２２】
本発明の予防薬剤は、好ましくは、吸入により経口投与されるか又は皮下投与される。吸入製剤は、例えば、エアロゾル、溶液もしくは懸濁液の液滴又は粉末の形態で活性成分を提供し、吸入装置により投与され得る。添加物は、界面活性剤、保存料、香料、緩衝剤などを含み得る。活性成分の濃度は、例えば、吸入あたり０．１μｇから５ｍｇ、特に吸入あたり１μｇから２ｍｇ、とりわけ吸入あたり１０μｇから１ｍｇの範囲から選択される。その他の投与経路に対する適切な用量は、活性成分０．０００１から２５ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【００２３】
ＡＢＨのＣＡ索引名は６−ボロノ−Ｌ−ノルロイシンである。その構造式を図１で示す。
【００２４】
続く実施例において本発明をさらに例示する。実施例において、次の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＡＢＨの構造式。
【図２Ａ】この試験において使用されるプロトコールの概略図。ＯＡ：オボアルブミン接種；ＰＣ１００：ヒスタミンＰＣ１００測定結果。
【図２Ｂ】この試験において使用されるプロトコールの概略図。ＯＡ：オボアルブミン接種；ＰＣ１００：ヒスタミンＰＣ１００測定結果。
【図２Ｃ】この試験において使用されるプロトコールの概略図。ＯＡ：オボアルブミン接種；ＰＣ１００：ヒスタミンＰＣ１００測定結果。
【図３】吸入ヒスタミンに対する基礎気道反応性における、ならびにＥＡＲ及びＬＡＲ後のヒスタミン過敏反応性における、食塩水（左パネル）又はアルギナーゼ阻害剤ＡＢＨ（２５ｍＭ噴霧器濃度；右パネル）吸入の影響。食塩水又はＡＢＨの吸入３０分前（白いバー）及び３０分後（黒いバー）に２回続けてＰＣ１００測定を行った。データは３から５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【図４】ＥＡＲ（パネルＡ）及びＬＡＲ（パネルＢ）後のＡＨＲにおけるＡＢＨ吸入（２５ｍＭ噴霧器濃度）の影響。ＡＨＲは、アレルゲン接種前（基礎）及び後（それぞれＥＡＲ又はＬＡＲ後）に得られたヒスタミンＰＣ１００値の比として定義される。データは３から５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。前処置に対して、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＃Ｐ＝０．１０。
【図５】吸入ヒスタミンに対する基礎気道反応性における、及びＥＡＲ及びＬＡＲ後のヒスタミンＡＨＲにおける、食塩水（左パネル）又はＬ−アルギニン（１Ｍ噴霧器濃度；右パネル）の吸入の影響。食塩水又はＬ−アルギニンの吸入３０分前（白いバー）及び３０分後（黒いバー）に、２回続けてＰＣ１００測定を行った。データは、９匹の動物の平均±ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図６】ＥＡＲ（パネルＡ）及びＬＡＲ（パネルＢ）後のＡＨＲにおけるＬ−アルギニン吸入の影響（１Ｍ噴霧器濃度）。ＡＨＲは、アレルゲン接種前（基礎）及び後（それぞれＥＡＲ又はＬＡＲ後）に得られたヒスタミンＰＣ１００値の比として定義される。１という値は正常な反応性に相当する。データは９匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。前処置に対して、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】吸入ヒスタミンに対する基礎気道反応性における、及びＥＡＲ及びＬＡＲ後のヒスタミンＡＨＲにおける、食塩水（左パネル）又はＤ−アルギニン（１Ｍ噴霧器濃度；右パネル）の吸入の影響。食塩水又はＤ−アルギニンの吸入３０分前（白いバー）及び３０分後（黒いバー）に、２回続けてＰＣ１００測定を行った。データは３匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８】１週間前に同じ動物で得られた食塩水の影響（白いバー）と比較した、ＥＡＲ（６時間）及びＬＡＲ（２４時間）後の、ヒスタミンに対する気道反応性におけるアレルゲン吸入０．５時間前及び８時間後での、食塩水（黒いバー；左パネル）又はＡＢＨ（２５ｍＭ；噴霧器濃度；黒いバー、右パネル）の吸入の影響。データは５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【図９】１週間前に同じ動物で得られた食塩水対照（白いバー）と比較した、ＥＡＲ（黒いバー、パネルＡ）及びＬＡＲ（黒いバー、パネルＢ）後の、ヒスタミンに対するＡＨＲにおける、アレルゲン吸入の０．５時間前及び８時間後での、食塩水又はＡＢＨ（２５ｍＭ噴霧器濃度）の吸入の影響。ＡＨＲは、アレルゲン接種前（基礎）及び後（それぞれＥＡＲ又はＬＡＲ後）に得られたヒスタミンＰＣ１００値の比として定義される。１という値は正常な反応性に相当する。データは５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。対照に対して、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０】１週間前に同じ動物から得られた食塩水対照（白いバー）と比較した、気道閉塞誘発に必要とされるオボアルブミン用量における、食塩水又はＡＢＨ（２５ｍＭ噴霧器濃度）での前処理（黒いバー）の影響。オボアルブミン用量が対数的にプロットされることに注意。データは５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【図１１】ＥＡＲ（アレルゲン接種後６時間）及びＬＡＲ（アレルゲン接種後２４時間）後の、ヒスタミンに対する気道反応性における、アレルゲン吸入の０．５時間前及び８時間後での、吸入食塩水又はＡＢＨ（２５ｍＭ；噴霧器濃度）による処置の影響。両治療群に、食塩水処置動物において気道閉塞を誘発したものと同じアレルゲン用量を接種した。データは５−６匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１２】（ａ）アレルゲン接種後の意識のある非拘束モルモットでのＰｐｌの代表的オンライン登録（ｔ＝０時間）。アレルゲン曝露の０．５時間前又は８時間後に、食塩水又は２５ｍＭ ＡＢＨ（噴霧器濃度）の何れかで動物を処置した。両処置群を同じアレルゲン用量に曝露した。（ｂ）最初のピークにおける食塩水又はＡＢＨでの前処理の影響がアレルゲン接種後に生じる。データは５−６匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。食塩水処置動物と比較して＊＊Ｐ＜０．０１。
【実施例】
【００２６】
実施例
導入
アレルギー性喘息のモルモットモデルを用いて、この実施例は、ＥＡＲ及びＬＡＲ（これはＬ−アルギニンにより模倣することができる。）後、ＡＢＨの吸入によりアレルゲン誘発性ＡＨＲが急激に改善されることを示すインビボデータを報告する。さらに、ＡＢＨでの前処理により、吸入アレルゲンに対する気道の過敏性が顕著に低下し、アレルゲン誘発性ＥＡＲ及びＬＡＲ及び両反応後のＡＨＲの出現が阻止されることが分かった。
【００２７】
方法
動物及び感作手順
この実施例において、非近交系雄の特定病原体不含Ｄｕｎｋｉｎ Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（Ｈａｒｌａｎ Ｈｅａｔｈｆｉｅｌｄ、ＵＫ）を使用した。Ｖａｎ Ａｍｓｔｅｒｄａｍら［Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ １９８９、２６：４８−５１］に記載のように、およそ２５０ｇの体重の全動物にオボアルブミンに対して積極的にＩｇＥ感作を行った。感作から２週間後、動物の手術を行い、感作後第４及び第５週に実験に使用した。温度湿度が調節された動物舎の個別ケージにこの動物を収容し、不断給餌で水及び餌を与え、同時に、１２時間オン／１２時間オフの光サイクルを維持した。この試験において記載される全てのプロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎから承認を得た。
【００２８】
気道機能の測定
以前に記載のように［Ｓａｎｔｉｎｇら、Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９２、５：２６５−２７２；Ｍｅｕｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００６、１：８４０−８４７］、無拘束状態下で、胸腔内圧（Ｐｐｌ）のオンライン測定により、気道機能を評価した。
【００２９】
手短に述べると、液体を満たした小型のラテックスバルーンカテーテルを手術により胸腔内に移植した。皮下に通してカテーテルの自由端を動物の頸部へと通し、そこでそれを露出させ取り外せないように連結した。外部の液体を満たしたカニューレを介して、胸膜バルーンカテーテルを圧力トランスデューサーに連結した（ＴＸＸ−Ｒ、Ｖｉｇｇｏ−Ｓｐｅｃｔｒａｍｅｄ、Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。オンラインコンピュータシステムを用いて、（ｃｍＨ２Ｏでの）Ｐｐｌを連続的に測定した。
【００３０】
気管に埋め込まれた呼吸気流計での流体測定及び胸膜バルーンカテーテルでの圧力測定の組み合わせを用いたところ、Ｐｐｌの変化は気道抵抗における変化に直線的に相関し、ゆえに、アレルゲン及びヒスタミン誘発性の気管支収縮に対する感度指標として使用され得ることが分かった［Ｓａｎｔｉｎｇら、前出］。この方法において、長期間にわたり気道機能を繰り返し、連続して監視することができ、一方で動物は行われる測定に気付かない。
【００３１】
実験プロトコールの間（手術後１−４週間）、ベースラインＰｐｌ−測定結果は安定したままであり、手術部位において炎症の徴候は観察されなかった。
【００３２】
誘発手順
エアロゾル化溶液の吸入により、アレルゲン及びヒスタミン誘発を行った。既に記載［Ｓａｎｔｉｎｇら；Ｍｅｕｒｓら、両方とも前出］のように、９Ｌの特別に設計された風防ガラスケージ中（その中でモルモットは自由に動くことができた。）でこれらの誘発をおこなった。８Ｌ／分の気流により推進されるＤｅＶｉｌｂｉｓｓ噴霧器（タイプ６４６）は、０．３３ｍＬ／分の出力でエアロゾルを与えた。既に記載のように［Ｍｅｕｒｓら、前出］術前体重を保存したら、手術後少なくとも１週間、動物を実験状態及び誘発手順に馴らした。
【００３３】
馴らし手順後、実験日に、下記に記載のように、アレルゲン及び／又はヒスタミン誘発を行った。全ての誘発の前に少なくとも３０分間の適応期間を置き、その後、食塩水で２回連続的対照誘発を行い、各誘発を７分間隔で３分間続けた。適応期間の最後の２０分間からのＰｐｌ値の平均を取ることによって、ベースラインＰｐｌ値を計算した。
【００３４】
ヒスタミンに対する気道反応性を評価するために、食塩水中の漸増濃度段階（６．２５、１２．５、２５、５０、７５、１００及び１２５μｇ／ｍＬ）での誘発を行った。ヒスタミン誘発を３分間続け、７分間の間隔を置いた。Ｐｐｌが少なくとも連続３分間、ベースラインを１００％以上上回り上昇するまで、動物に接種した。Ｐｐｌの１００％上昇（ＰＣ１００）を引き起こすヒスタミンの濃度は、濃度−Ｐｐｌ曲線の線形補間から得られ、これをヒスタミンに対する気道反応性についての指標として使用した。Ｐｐｌは、最後のヒスタミン誘発後１５分以内にベースラインに戻った。
【００３５】
食塩水中０．５、１．０又は３．０ｍｇ／ｍＬオボアルブミンの漸増濃度の吸入により、アレルゲン誘発を行い、呼吸困難の最初の徴候が観察され、１００％を超えるＰｐｌの上昇に到達した際、中止した。
【００３６】
実験プロトコール
ＡＢＨ及びＬ−アルギニンによるアレルゲン誘発性ＡＨＲの改善
ヒスタミンに対する基礎気道反応性におけるならびにＥＡＲ及びＬＡＲ後のアレルゲン誘発性気道過敏反応性（ＡＨＲ）における、これらの薬物（ＡＢＨ、Ｌ−アルギニン又はＤ−アルギニン）の急性効果を調べるために、１週間の間隔を置いた２つの異なる実験において、ビヒクル（食塩水）又は薬物（ＡＢＨ、Ｌ−アルギニン又はＤ−アルギニン）の何れかで、モルモットを処置した（図２）。
【００３７】
最初の実験日に、基礎ヒスタミン反応における食塩水又は薬物により誘発される影響を調べた。基礎ヒスタミンＰＣ１００の評価から３０分後、食塩水（対照）又は２５ｍＭ ＡＢＨ、１．０Ｍ Ｌ−アルギニン又は１．０Ｍ Ｄ−アルギニン（噴霧器濃度）のエアロゾルを１５分間吸入させた。これらの吸入後、第二のヒスタミンＰＣ１００測定を１５分後に開始して行った。第２日に、アレルゲン誘発を行った。オボアルブミン誘発から５時間及び２３時間後、それぞれＥＡＲ及びＬＡＲの後、アレルゲン誘発性ＡＨＲを決定するために、ヒスタミンＰＣ１００値を測定した。
【００３８】
オボアルブミン誘発から５．５時間及び２３．５時間後、食塩水、ＡＢＨ及びＬ−又はＤ−アルギニン吸入を行い、続くヒスタミンＰＣ１００値をアレルゲン誘発から６時間及び２４時間後に再評価した。無作為クロスオーバー計画で、１週間間隔で、食塩水及び薬物吸入を交互に行った（図２）。
【００３９】
ＡＢＨによるアレルゲン誘発性ＡＨＲの予防
最初の実験日に、基礎ヒスタミンＰＣ１００を評価した。翌日、アレルゲン吸入の０．５時間前及び８時間後に、１５分間、食塩水を吸入させ、アレルゲン接種から６時間及び２４時間後、ヒスタミンＰＣ１００測定を行った。１週間後、ｔ＝−０．５及び８時間で、２５ｍＭ ＡＢＨ（噴霧器濃度）又は食塩水の何れかの吸入により、同じプロトコールを繰り返した。閉塞まで、アレルゲンの漸増用量（０．５、１及び３ｍｇ／ｍＬ）を全動物に接種した。
【００４０】
第二の実験において、アレルゲンを１回動物に接種した。最初の実験日に、基礎ヒスタミンＰＣ１００を評価した。翌日、アレルゲン吸入の０．５時間前及び８時間後に、食塩水又はＡＢＨ（２５ｍＭ；噴霧器濃度）の何れかで動物を前処置した。食塩水処置モルモットで気道閉塞を引き起こした同じアレルゲン用量をＡＢＨ前処置動物に接種した。このプロトコールにおいて、連続的Ｐｐｌ登録により、アレルゲン誘発性ＥＡＲ（アレルゲン誘発後０から５時間の間）及びＬＡＲ（アレルゲン誘発後８時間から２４時間の間）を測定し、アレルゲン接種から６時間及び２４時間後に、ヒスタミンに対する気道反応性を評価した（図２）。
【００４１】
データ分析
気道閉塞を起こすために噴霧したアレルゲンの総量（ｍｇ）として、吸入アレルゲンに対する過敏性を表したが、これは、噴霧時間、噴霧器中のアレルゲン用量（ｍｇ／ｍＬ）及びエアロゾル出力（ｍＬ／分）の関数である。
【００４２】
ＥＡＲ及びＬＡＲの大きさは、アレルゲン誘発後０から５時間の間（ＥＡＲ）及び８から２４時間の間（ＬＡＲ）の、Ｐｐｌ時間−反応曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。Ｐｐｌはベースラインからの％変化として表し、ＡＵＣは、不連続の５分間の台形積分により計算した（Ｓａｎｔｉｎｇら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、９３：１０２１−１０３０）。
【００４３】
データは全て、平均±ＳＥＭとして表す。対応のある両側スチューデントｔ−検定を用いて統計学的有意性を評価し、Ｐ＜０．０５の場合に有意であるとした。
【００４４】
化学物質
ヒスタミン二塩酸塩、オボアルブミン（グレードＩＩＩ）、水酸化アルミニウム、Ｌ−アルギニン塩酸塩及びＤ−アルギニン塩酸塩は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から得た。食塩水はＢｒａｕｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸は、Ｏｒｇａｎｏｎ（Ｏｓｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より提供された。
【００４５】
結果
回復プロトコール
図３は、ＥＡＲ及びＬＡＲ反応後、ヒスタミンに対するＰＣ１００値が顕著に低下することにより示されるように、ＥＡＲ及びＬＡＲの両方の後、オボアルブミンが顕著なＡＨＲを誘発することを示す。食塩水の吸入は、ヒスタミンに対する基礎反応にもＥＡＲ及びＬＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲに対する基礎反応にも影響を与えなかった。アルギナーゼ阻害剤ＡＢＨの吸入は、基礎気道反応性において影響はなかったが、このＥＡＲ反応後の対照測定結果と比較してＰＣ１００値が顕著に上昇したことにより示されるように、ＥＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲを改善した。
【００４６】
さらに、ＬＡＲ後のＡＨＲの低下傾向が観察され、一方で、基礎反応性と比較した場合、ＡＢＨ吸入後、もはや顕著なＡＨＲはなかった（図３）。
【００４７】
図４は、ＡＢＨが、ＥＡＲ後、４．７７±０．５６倍から２．０４±０．３４倍（Ｐ＜０．００１）に、ＬＡＲ後、１．９５±０．２３倍から１．５６±０．４７倍（Ｐ＜０．１０）に、ＰＣ１００比 接種前／接種後として表されるアレルゲン誘発性ＡＨＲを低下させることを示す。ＡＢＨのように、Ｌ−アルギニンの吸入は、ヒスタミンに対する基礎気道反応性に影響を与えなかった（図５）。珍しいことに、ＥＡＲ後及びＬＡＲ後のＡＨＲがＡＢＨと同程度に改善された（図５及び６）。
【００４８】
食塩水の場合のように、生物学的に不活性であるアルギニンのＤ−エナンチオマーは基礎気道反応性及びアレルゲン誘発性ＡＨＲに全く影響を与えなかった（図７）。
【００４９】
予防プロトコール
興味深いことに、アレルゲン接種０．５時間前の２５ｍＭ ＡＢＨでの前処置によって、食塩水対照処置と比較して、ＥＡＲ後のＡＨＲが顕著に阻止された（図８）。さらに、アレルゲン接種から８時間後の２５ｍＭ ＡＢＨのさらなる吸入によって、ＬＡＲ後のＡＨＲの発生がほぼ完全に阻止された。食塩水での前処置は、ＥＡＲ又はＬＡＲ後のＡＨＲに影響を与えなかった（図８）。
【００５０】
図９は、ＡＢＨによって、ＥＡＲ後に６．３３±１.３０倍（食塩水対照、第１週）から３．０５±０．５１倍（Ｐ＜０．０５）へ、ＬＡＲ後に２．０８±０．３１倍から１．４１±０．２５倍（Ｐ＜０．００５）へ、アレルゲン誘発性ＡＨＲが有意に低下したことを示す。
【００５１】
珍しいことに、第２週のＡＢＨでの前処置後、第１週での同じ動物の食塩水処置と比較して（０．０４±０．０１ｍｇ；Ｐ＜０．０１）、気道閉塞を誘発するために、オボアルブミンの３２．８倍高い濃度が必要であり（１．３１±０．６９ｍｇ）、このことから、ＡＢＨがアレルゲンに対する過敏性を顕著に低下させることが示される。食塩水処置動物に対して、オボアルブミン用量の有意な増加は観察されなかった（図１０）。
【００５２】
通常は閉塞を引き起こすアレルゲン投与量でのＡＢＨの影響を完全に理解するために、食塩水処置（閉塞を起こさせるもの）及びＡＢＨ処置動物において、等しい用量のアレルゲンで誘発を行った。この条件下で、アレルゲン接種０．５時間前のＡＢＨでの前処置によって、ＥＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲがより顕著に阻止され、一方、アレルゲン接種から８時間後のＡＢＨでのさらなる処置によって、基礎レベルに対するＬＡＲ後の気道反応性が完全に正常値に戻った（図１１、表１）。従って、ＡＢＨでの処置により、ＥＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲが４．１４±０．５９倍（食塩水処置）から１．５８±０．２４倍；Ｐ＜０．０１）に低下し、ＬＡＲ後のＡＨＲの出現が完全に阻止された（食塩水処置動物での１．６８±０．１４倍からＡＢＨ処置動物での１．０２±０．０２倍へ；Ｐ＜０．００５）。
【００５３】
アレルゲン接種したモルモットにおけるＰｐｌの代表的なオンライン記録を図１２で示す。食塩水処置と比較して、同じアレルゲン用量でのＡＢＨ処置では、ＥＡＲならびにＬＡＲが大きく低下した。予想されるように、アレルゲン誘発性急性管支閉塞を反映する、Ｐｐｌにおける最初のピーク反応の非常に顕著な低下が観察され（Ｐ＜０．０１、図１２）、一方で、同様に、ＥＡＲ及びＬＡＲ両方のＡＵＣが顕著に低下した（表１）。
【００５４】
【表１】
【００５５】
結論
アレルギー性喘息のモルモットモデルを用いて、本明細書中で、特異的なアイソザイム−非選択的アルギナーゼ阻害剤ＡＢＨが、ＥＡＲ及びＬＡＲ後にアレルゲン誘発性ＡＨＲを急速に改善し、一方で、アルギナーゼ阻害剤での前処置により吸入アレルゲンに対する気道の過敏性が顕著に低下し、アレルゲン誘発性ＥＡＲ及びＬＡＲ及び両反応後のＡＨＲの出現が阻止されることが示された。
【００５６】
理論に縛られることなく、気道におけるＮＯシンターゼアイソザイムに対するアルギナーゼ誘発性の基質欠乏を減弱させることにより、ＡＢＨの吸入によってＥＡＲ及びＬＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲが急速に改善されることが推測される。さらに、ＮＯシンターゼに対する基質利用可能性の向上及び続くＮＯ産生の増加によって、ＡＢＨは、気道へのアレルゲン誘発性（特に肥満細胞由来）メディエーター放出を減弱させ得る。喘息患者におけるいくつかの研究から、気管支拡張（ｃＮＯＳ由来）ＮＯの欠乏が、アレルゲン誘発性ＡＨＲの出現に関与することが示されている。さらに、それぞれ喘息患者の気道及び血液で、アルギナーゼ発現又は活性の上昇が観察された。従って、上記の結果は、喘息患者におけるＡＢＨでの予防的治療の有用性を示唆する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息及びアレルギー性鼻炎の予防的治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性喘息は、気道の慢性炎症性疾患である。この疾患の特徴的な性質は、気道での炎症性細胞（特にＴｈ２リンパ球及び好酸球）の浸潤及び活性化、ならびに、アレルゲン、化学性刺激物、冷たい空気及び薬理学的物質（ヒスタミン及びメタコリンなど）を含む様々な刺激に対する気道過敏反応性の出現に関与する、アレルゲン誘発性の早発性及び遅発性気管支閉塞性反応である。
【０００３】
気道平滑筋機能の神経性及び非神経性制御における変化ならびに気道における物理的変化（上皮の損傷を含む。）、浮腫及び局所的血管拡張による粘膜の肥厚及び気道内腔における粘液分泌は、急性喘息における早発性及び遅発性喘息反応後の気道過敏反応性の出現に関与し得る。
【０００４】
慢性喘息において、基底膜の肥厚、粘液腺過形成、上皮下線維症及び気道平滑筋質量増加を含む気道壁の不可逆的構造変化による気道リモデリングは、重要なものとして、持続性の気道過敏反応性及び肺機能の低下に関与し得る。
【０００５】
これらの変化は全て、様々なアレルギー性メディエーター、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子及び反応性酸素及び窒素種を含む炎症性反応の複雑なカスケードにより誘導される。
【０００６】
アレルギー性鼻炎は、埃、鱗屑又は植物の花粉の浮遊微小粒子により起こる、これらの物質にアレルギーがあるヒトにおける、主に鼻での症状の一群である。これらの症状が花粉により引き起こされる場合、アレルギー性鼻炎は一般に「枯草熱」として知られる。アレルギー性鼻炎は、喘息と関与し得る、よく見られる問題である。喘息の患者において、鼻炎がコントロール不良であると喘息が悪化すると考えられる。
【０００７】
集団内での喘息の発生率が比較的高いため、休職又は、労働不能ならびに直接的医療保険支出及び投薬による経済的負担は高い。従って、この症状を予防することが必要とされている。さらに、症状の出現が予防的治療により回避され得た場合、喘息及びアレルギー患者のクオリティー・オブ・ライフが非常に向上するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、喘息及びアレルギー性鼻炎に対する新規予防的治療を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
初めて本発明に導いた研究によって、インビボでの喘息の病態生理学におけるアルギナーゼの重要性が示された。アレルギー性喘息のモルモットモデルを用いて、発明者らは、アレルゲン誘発性の早発性（ＥＡＲ）及び遅発性（ＬＡＲ）喘息反応後、特異的なアイソザイム−非選択的アルギナーゼ阻害剤ＡＢＨの吸入によってアレルゲン誘発性の気道過敏反応性（ＡＨＲ）が急速に改善され、一方、アルギナーゼ阻害剤での前処置によって、吸入アレルゲンに対する気道過敏性が顕著に低下し、アレルゲン誘発性ＥＡＲ及びＬＡＲ及び両反応後のＡＨＲの出現が阻止されることを明らかにした。
【００１０】
吸入ＡＢＨでの前処置により吸入アレルゲンに対する気道の過敏性が顕著に低下すること（予防法）がより具体的に分かった。ＡＢＨでの前処置によって、生理食塩水処置対照で気道閉塞を誘発したアレルゲン用量で動物にアレルゲンを付与した場合にアレルゲン誘発性気管支閉塞及びＡＨＲの出現が阻止された。
【００１１】
さらに、生理食塩水処置対照よりも高用量のアレルゲンを用いて動物において気道閉塞を引き起こした場合、吸入ＡＢＨでの前処置によって、また、早発性及び遅発性喘息反応後、ＡＨＲの出現が阻止された。さらに、ＡＢＨにより、早発性ならびに遅発性喘息反応後、急速に、既存のアレルゲン誘発性ＡＨＲが改善された。
【００１２】
アルギナーゼ阻害剤の上記の効果は、ｃＮＯＳ及び／又はｉＮＯＳに対するＬ−アルギニンのバイオアベイラビリティー向上により気道でのＮＯ産生が上昇し、それにより、アレルゲン誘発性の肥満細胞活性化が減弱され、収縮刺激に対する気管支保護が誘導されることにより説明され得る。特に遅発性喘息反応後、後者の効果はまた、ペルオキシ亜硝酸のｉＮＯＳ介在性産生、ＮＯのプロ収縮性及びプロ炎症性代謝産物の低下も含む。
【００１３】
上述の作用機構は、抗アレルギー性（及び抗炎症性）特性を収縮刺激に対する（急性）気管支保護と組み合わさるので、魅力的である。さらに、ポリアミン及びＬ−プロリンのアルギナーゼ介在性合成の阻害に基づき、ＡＢＨは慢性喘息における肺機能の不可逆的低下に関与する気道リモデリングを阻害し得る。
【００１４】
ＡＢＨはアレルギー性喘息患者において特に有効である。アレルゲン誘発性気管支閉塞及びアレルゲン誘発性ＡＨＲの両方に対する保護効果の場合、ＡＢＨを用いた吸入療法は主に、症状を治療するための（短期作用）気管支拡張剤（即ち、アレルゲン誘発性気管支閉塞及びＡＨＲの出現を防ぐための予防的維持療法）を定期的に使用する持続性のアレルギー性喘息患者に対するものである。喘息治療において、ＡＨＲは、喘息の重症度の主要な決定因子なので、標的とされるべき重要な特色である。ＡＢＨによる治療は、Ｍｏｒｒｉｓら（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００４；１７０：１４８−１５３）の研究により重症喘息憎悪の患者におけるアルギナーゼの重要な役割が指摘されているように、軽度、中等度ならびに重症の持続性喘息の患者を対象としたものである。
【００１５】
その抗アレルギー性効果を考えると、アレルギー性鼻炎（アレルギー性喘息と関連することが多い。）の患者におけるＡＢＨの有益な効果もまた本発明の一部である。
【００１６】
従って、本発明は、上気道及び下気道の閉塞、特にアレルゲン誘発性気管支閉塞及び／又は気道過敏反応性を阻止することによる、喘息又はアレルギー患者の予防的維持療法用の薬剤の調製のためのアルギナーゼ阻害剤の使用に関する。治療すべき患者は、特に、その疾患の症状又は原因としてアルギナーゼ活性が上昇しているアレルギー患者である。アルギナーゼ活性が上昇している患者は通常、喘息又はアレルギー性鼻炎があるが、その疾患の症状又は原因として気道においてアルギナーゼ活性が上昇している非アレルギー性喘息患者でもあり得る。
【００１７】
原則として、本発明により、何らかのアルギナーゼ阻害剤を使用し得る。本発明での使用に好ましいアルギナーゼ阻害剤は、次の式：
ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｂ（ＯＨ）２
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４のそれぞれは、−（ＣＨ２）−、−Ｓ−、−Ｏ−、−（ＮＨ）−及び−（Ｎ−アルキル）からなる群から選択する。）
を有するＵＳ−６，７２３，７１０に記載のものである。「アルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、線状又は分枝状、非置換又は例えばＦ、Ｓ、Ｏ又はＮにより置換の、何らかのＣ１からＣ２０炭素骨格及び医薬的に許容可能なその塩を指す。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明は、上記一般式（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４の１つは、−Ｓ−、−Ｏ−、−（ＮＨ）−からなる群から選択され、残りのＸ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４は−（ＣＨ２）−である。）によるアルギナーゼ阻害剤及び医薬的に許容可能なその塩の使用に関する。
【００１９】
特に好ましい実施形態によると、本発明は、次の式：
ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−Ｂ（ＯＨ）２によるアルギナーゼ阻害剤及び医薬的に許容可能なその塩の使用に関する。この化合物は、２（Ｓ）-アミノ−６−ボロノヘキサン酸又はＡＢＨとも呼ばれる。ＡＢＨ及び対応する化合物の調製は例えば、米国特許第６，７２３，７１０号、特に２５段、３４行目から２６段、６７行目及び図６に記載されている。本発明による使用に対するその他の好ましいアルギナーゼ阻害剤は、Ｎω−ＯＨ−Ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）、Ｎω−ヒドロキシ−ノル−Ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）、Ｌ−ノルバリン、ヨードアセチル−Ｌ−オルニチン、ヨードアセチル−Ｌ−リジン、Ｌ−リジン及びＬ−シトルリン及び医薬的に許容可能なその塩からなる群から選択される化合物である。
【００２０】
好ましくは、本アルギナーゼ阻害剤は、薬剤中の唯一の活性成分として使用される。アルギナーゼ阻害剤、特にＡＢＨ、は、他の活性成分と組み合わせずに使用することができる。しかし、本アルギナーゼ阻害剤は、予防製剤において適切な不活性添加物と組み合わせられる。
【００２１】
ＷＯ２００４／０７３６２３は、アルギニン阻害剤及び／又はマグネシウムと場合によっては組み合わせられるアルギニンによる、喘息を含むアルギニン上昇に関与する状態の治療を開示する。この公報は予防ではなく治療に関する。基本的治療はアルギニンを用いるものである。さらなる活性成分としてアルギナーゼ阻害剤を添加し得るが、主要な又は唯一の活性成分ではない。
【００２２】
本発明の予防薬剤は、好ましくは、吸入により経口投与されるか又は皮下投与される。吸入製剤は、例えば、エアロゾル、溶液もしくは懸濁液の液滴又は粉末の形態で活性成分を提供し、吸入装置により投与され得る。添加物は、界面活性剤、保存料、香料、緩衝剤などを含み得る。活性成分の濃度は、例えば、吸入あたり０．１μｇから５ｍｇ、特に吸入あたり１μｇから２ｍｇ、とりわけ吸入あたり１０μｇから１ｍｇの範囲から選択される。その他の投与経路に対する適切な用量は、活性成分０．０００１から２５ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【００２３】
ＡＢＨのＣＡ索引名は６−ボロノ−Ｌ−ノルロイシンである。その構造式を図１で示す。
【００２４】
続く実施例において本発明をさらに例示する。実施例において、次の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＡＢＨの構造式。
【図２Ａ】この試験において使用されるプロトコールの概略図。ＯＡ：オボアルブミン接種；ＰＣ１００：ヒスタミンＰＣ１００測定結果。
【図２Ｂ】この試験において使用されるプロトコールの概略図。ＯＡ：オボアルブミン接種；ＰＣ１００：ヒスタミンＰＣ１００測定結果。
【図２Ｃ】この試験において使用されるプロトコールの概略図。ＯＡ：オボアルブミン接種；ＰＣ１００：ヒスタミンＰＣ１００測定結果。
【図３】吸入ヒスタミンに対する基礎気道反応性における、ならびにＥＡＲ及びＬＡＲ後のヒスタミン過敏反応性における、食塩水（左パネル）又はアルギナーゼ阻害剤ＡＢＨ（２５ｍＭ噴霧器濃度；右パネル）吸入の影響。食塩水又はＡＢＨの吸入３０分前（白いバー）及び３０分後（黒いバー）に２回続けてＰＣ１００測定を行った。データは３から５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【図４】ＥＡＲ（パネルＡ）及びＬＡＲ（パネルＢ）後のＡＨＲにおけるＡＢＨ吸入（２５ｍＭ噴霧器濃度）の影響。ＡＨＲは、アレルゲン接種前（基礎）及び後（それぞれＥＡＲ又はＬＡＲ後）に得られたヒスタミンＰＣ１００値の比として定義される。データは３から５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。前処置に対して、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＃Ｐ＝０．１０。
【図５】吸入ヒスタミンに対する基礎気道反応性における、及びＥＡＲ及びＬＡＲ後のヒスタミンＡＨＲにおける、食塩水（左パネル）又はＬ−アルギニン（１Ｍ噴霧器濃度；右パネル）の吸入の影響。食塩水又はＬ−アルギニンの吸入３０分前（白いバー）及び３０分後（黒いバー）に、２回続けてＰＣ１００測定を行った。データは、９匹の動物の平均±ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図６】ＥＡＲ（パネルＡ）及びＬＡＲ（パネルＢ）後のＡＨＲにおけるＬ−アルギニン吸入の影響（１Ｍ噴霧器濃度）。ＡＨＲは、アレルゲン接種前（基礎）及び後（それぞれＥＡＲ又はＬＡＲ後）に得られたヒスタミンＰＣ１００値の比として定義される。１という値は正常な反応性に相当する。データは９匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。前処置に対して、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】吸入ヒスタミンに対する基礎気道反応性における、及びＥＡＲ及びＬＡＲ後のヒスタミンＡＨＲにおける、食塩水（左パネル）又はＤ−アルギニン（１Ｍ噴霧器濃度；右パネル）の吸入の影響。食塩水又はＤ−アルギニンの吸入３０分前（白いバー）及び３０分後（黒いバー）に、２回続けてＰＣ１００測定を行った。データは３匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８】１週間前に同じ動物で得られた食塩水の影響（白いバー）と比較した、ＥＡＲ（６時間）及びＬＡＲ（２４時間）後の、ヒスタミンに対する気道反応性におけるアレルゲン吸入０．５時間前及び８時間後での、食塩水（黒いバー；左パネル）又はＡＢＨ（２５ｍＭ；噴霧器濃度；黒いバー、右パネル）の吸入の影響。データは５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【図９】１週間前に同じ動物で得られた食塩水対照（白いバー）と比較した、ＥＡＲ（黒いバー、パネルＡ）及びＬＡＲ（黒いバー、パネルＢ）後の、ヒスタミンに対するＡＨＲにおける、アレルゲン吸入の０．５時間前及び８時間後での、食塩水又はＡＢＨ（２５ｍＭ噴霧器濃度）の吸入の影響。ＡＨＲは、アレルゲン接種前（基礎）及び後（それぞれＥＡＲ又はＬＡＲ後）に得られたヒスタミンＰＣ１００値の比として定義される。１という値は正常な反応性に相当する。データは５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。対照に対して、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０】１週間前に同じ動物から得られた食塩水対照（白いバー）と比較した、気道閉塞誘発に必要とされるオボアルブミン用量における、食塩水又はＡＢＨ（２５ｍＭ噴霧器濃度）での前処理（黒いバー）の影響。オボアルブミン用量が対数的にプロットされることに注意。データは５匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【図１１】ＥＡＲ（アレルゲン接種後６時間）及びＬＡＲ（アレルゲン接種後２４時間）後の、ヒスタミンに対する気道反応性における、アレルゲン吸入の０．５時間前及び８時間後での、吸入食塩水又はＡＢＨ（２５ｍＭ；噴霧器濃度）による処置の影響。両治療群に、食塩水処置動物において気道閉塞を誘発したものと同じアレルゲン用量を接種した。データは５−６匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１２】（ａ）アレルゲン接種後の意識のある非拘束モルモットでのＰｐｌの代表的オンライン登録（ｔ＝０時間）。アレルゲン曝露の０．５時間前又は８時間後に、食塩水又は２５ｍＭ ＡＢＨ（噴霧器濃度）の何れかで動物を処置した。両処置群を同じアレルゲン用量に曝露した。（ｂ）最初のピークにおける食塩水又はＡＢＨでの前処理の影響がアレルゲン接種後に生じる。データは５−６匹の動物の平均±ＳＥＭを表す。食塩水処置動物と比較して＊＊Ｐ＜０．０１。
【実施例】
【００２６】
実施例
導入
アレルギー性喘息のモルモットモデルを用いて、この実施例は、ＥＡＲ及びＬＡＲ（これはＬ−アルギニンにより模倣することができる。）後、ＡＢＨの吸入によりアレルゲン誘発性ＡＨＲが急激に改善されることを示すインビボデータを報告する。さらに、ＡＢＨでの前処理により、吸入アレルゲンに対する気道の過敏性が顕著に低下し、アレルゲン誘発性ＥＡＲ及びＬＡＲ及び両反応後のＡＨＲの出現が阻止されることが分かった。
【００２７】
方法
動物及び感作手順
この実施例において、非近交系雄の特定病原体不含Ｄｕｎｋｉｎ Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（Ｈａｒｌａｎ Ｈｅａｔｈｆｉｅｌｄ、ＵＫ）を使用した。Ｖａｎ Ａｍｓｔｅｒｄａｍら［Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ １９８９、２６：４８−５１］に記載のように、およそ２５０ｇの体重の全動物にオボアルブミンに対して積極的にＩｇＥ感作を行った。感作から２週間後、動物の手術を行い、感作後第４及び第５週に実験に使用した。温度湿度が調節された動物舎の個別ケージにこの動物を収容し、不断給餌で水及び餌を与え、同時に、１２時間オン／１２時間オフの光サイクルを維持した。この試験において記載される全てのプロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎから承認を得た。
【００２８】
気道機能の測定
以前に記載のように［Ｓａｎｔｉｎｇら、Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９２、５：２６５−２７２；Ｍｅｕｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００６、１：８４０−８４７］、無拘束状態下で、胸腔内圧（Ｐｐｌ）のオンライン測定により、気道機能を評価した。
【００２９】
手短に述べると、液体を満たした小型のラテックスバルーンカテーテルを手術により胸腔内に移植した。皮下に通してカテーテルの自由端を動物の頸部へと通し、そこでそれを露出させ取り外せないように連結した。外部の液体を満たしたカニューレを介して、胸膜バルーンカテーテルを圧力トランスデューサーに連結した（ＴＸＸ−Ｒ、Ｖｉｇｇｏ−Ｓｐｅｃｔｒａｍｅｄ、Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。オンラインコンピュータシステムを用いて、（ｃｍＨ２Ｏでの）Ｐｐｌを連続的に測定した。
【００３０】
気管に埋め込まれた呼吸気流計での流体測定及び胸膜バルーンカテーテルでの圧力測定の組み合わせを用いたところ、Ｐｐｌの変化は気道抵抗における変化に直線的に相関し、ゆえに、アレルゲン及びヒスタミン誘発性の気管支収縮に対する感度指標として使用され得ることが分かった［Ｓａｎｔｉｎｇら、前出］。この方法において、長期間にわたり気道機能を繰り返し、連続して監視することができ、一方で動物は行われる測定に気付かない。
【００３１】
実験プロトコールの間（手術後１−４週間）、ベースラインＰｐｌ−測定結果は安定したままであり、手術部位において炎症の徴候は観察されなかった。
【００３２】
誘発手順
エアロゾル化溶液の吸入により、アレルゲン及びヒスタミン誘発を行った。既に記載［Ｓａｎｔｉｎｇら；Ｍｅｕｒｓら、両方とも前出］のように、９Ｌの特別に設計された風防ガラスケージ中（その中でモルモットは自由に動くことができた。）でこれらの誘発をおこなった。８Ｌ／分の気流により推進されるＤｅＶｉｌｂｉｓｓ噴霧器（タイプ６４６）は、０．３３ｍＬ／分の出力でエアロゾルを与えた。既に記載のように［Ｍｅｕｒｓら、前出］術前体重を保存したら、手術後少なくとも１週間、動物を実験状態及び誘発手順に馴らした。
【００３３】
馴らし手順後、実験日に、下記に記載のように、アレルゲン及び／又はヒスタミン誘発を行った。全ての誘発の前に少なくとも３０分間の適応期間を置き、その後、食塩水で２回連続的対照誘発を行い、各誘発を７分間隔で３分間続けた。適応期間の最後の２０分間からのＰｐｌ値の平均を取ることによって、ベースラインＰｐｌ値を計算した。
【００３４】
ヒスタミンに対する気道反応性を評価するために、食塩水中の漸増濃度段階（６．２５、１２．５、２５、５０、７５、１００及び１２５μｇ／ｍＬ）での誘発を行った。ヒスタミン誘発を３分間続け、７分間の間隔を置いた。Ｐｐｌが少なくとも連続３分間、ベースラインを１００％以上上回り上昇するまで、動物に接種した。Ｐｐｌの１００％上昇（ＰＣ１００）を引き起こすヒスタミンの濃度は、濃度−Ｐｐｌ曲線の線形補間から得られ、これをヒスタミンに対する気道反応性についての指標として使用した。Ｐｐｌは、最後のヒスタミン誘発後１５分以内にベースラインに戻った。
【００３５】
食塩水中０．５、１．０又は３．０ｍｇ／ｍＬオボアルブミンの漸増濃度の吸入により、アレルゲン誘発を行い、呼吸困難の最初の徴候が観察され、１００％を超えるＰｐｌの上昇に到達した際、中止した。
【００３６】
実験プロトコール
ＡＢＨ及びＬ−アルギニンによるアレルゲン誘発性ＡＨＲの改善
ヒスタミンに対する基礎気道反応性におけるならびにＥＡＲ及びＬＡＲ後のアレルゲン誘発性気道過敏反応性（ＡＨＲ）における、これらの薬物（ＡＢＨ、Ｌ−アルギニン又はＤ−アルギニン）の急性効果を調べるために、１週間の間隔を置いた２つの異なる実験において、ビヒクル（食塩水）又は薬物（ＡＢＨ、Ｌ−アルギニン又はＤ−アルギニン）の何れかで、モルモットを処置した（図２）。
【００３７】
最初の実験日に、基礎ヒスタミン反応における食塩水又は薬物により誘発される影響を調べた。基礎ヒスタミンＰＣ１００の評価から３０分後、食塩水（対照）又は２５ｍＭ ＡＢＨ、１．０Ｍ Ｌ−アルギニン又は１．０Ｍ Ｄ−アルギニン（噴霧器濃度）のエアロゾルを１５分間吸入させた。これらの吸入後、第二のヒスタミンＰＣ１００測定を１５分後に開始して行った。第２日に、アレルゲン誘発を行った。オボアルブミン誘発から５時間及び２３時間後、それぞれＥＡＲ及びＬＡＲの後、アレルゲン誘発性ＡＨＲを決定するために、ヒスタミンＰＣ１００値を測定した。
【００３８】
オボアルブミン誘発から５．５時間及び２３．５時間後、食塩水、ＡＢＨ及びＬ−又はＤ−アルギニン吸入を行い、続くヒスタミンＰＣ１００値をアレルゲン誘発から６時間及び２４時間後に再評価した。無作為クロスオーバー計画で、１週間間隔で、食塩水及び薬物吸入を交互に行った（図２）。
【００３９】
ＡＢＨによるアレルゲン誘発性ＡＨＲの予防
最初の実験日に、基礎ヒスタミンＰＣ１００を評価した。翌日、アレルゲン吸入の０．５時間前及び８時間後に、１５分間、食塩水を吸入させ、アレルゲン接種から６時間及び２４時間後、ヒスタミンＰＣ１００測定を行った。１週間後、ｔ＝−０．５及び８時間で、２５ｍＭ ＡＢＨ（噴霧器濃度）又は食塩水の何れかの吸入により、同じプロトコールを繰り返した。閉塞まで、アレルゲンの漸増用量（０．５、１及び３ｍｇ／ｍＬ）を全動物に接種した。
【００４０】
第二の実験において、アレルゲンを１回動物に接種した。最初の実験日に、基礎ヒスタミンＰＣ１００を評価した。翌日、アレルゲン吸入の０．５時間前及び８時間後に、食塩水又はＡＢＨ（２５ｍＭ；噴霧器濃度）の何れかで動物を前処置した。食塩水処置モルモットで気道閉塞を引き起こした同じアレルゲン用量をＡＢＨ前処置動物に接種した。このプロトコールにおいて、連続的Ｐｐｌ登録により、アレルゲン誘発性ＥＡＲ（アレルゲン誘発後０から５時間の間）及びＬＡＲ（アレルゲン誘発後８時間から２４時間の間）を測定し、アレルゲン接種から６時間及び２４時間後に、ヒスタミンに対する気道反応性を評価した（図２）。
【００４１】
データ分析
気道閉塞を起こすために噴霧したアレルゲンの総量（ｍｇ）として、吸入アレルゲンに対する過敏性を表したが、これは、噴霧時間、噴霧器中のアレルゲン用量（ｍｇ／ｍＬ）及びエアロゾル出力（ｍＬ／分）の関数である。
【００４２】
ＥＡＲ及びＬＡＲの大きさは、アレルゲン誘発後０から５時間の間（ＥＡＲ）及び８から２４時間の間（ＬＡＲ）の、Ｐｐｌ時間−反応曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。Ｐｐｌはベースラインからの％変化として表し、ＡＵＣは、不連続の５分間の台形積分により計算した（Ｓａｎｔｉｎｇら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、９３：１０２１−１０３０）。
【００４３】
データは全て、平均±ＳＥＭとして表す。対応のある両側スチューデントｔ−検定を用いて統計学的有意性を評価し、Ｐ＜０．０５の場合に有意であるとした。
【００４４】
化学物質
ヒスタミン二塩酸塩、オボアルブミン（グレードＩＩＩ）、水酸化アルミニウム、Ｌ−アルギニン塩酸塩及びＤ−アルギニン塩酸塩は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から得た。食塩水はＢｒａｕｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸は、Ｏｒｇａｎｏｎ（Ｏｓｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より提供された。
【００４５】
結果
回復プロトコール
図３は、ＥＡＲ及びＬＡＲ反応後、ヒスタミンに対するＰＣ１００値が顕著に低下することにより示されるように、ＥＡＲ及びＬＡＲの両方の後、オボアルブミンが顕著なＡＨＲを誘発することを示す。食塩水の吸入は、ヒスタミンに対する基礎反応にもＥＡＲ及びＬＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲに対する基礎反応にも影響を与えなかった。アルギナーゼ阻害剤ＡＢＨの吸入は、基礎気道反応性において影響はなかったが、このＥＡＲ反応後の対照測定結果と比較してＰＣ１００値が顕著に上昇したことにより示されるように、ＥＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲを改善した。
【００４６】
さらに、ＬＡＲ後のＡＨＲの低下傾向が観察され、一方で、基礎反応性と比較した場合、ＡＢＨ吸入後、もはや顕著なＡＨＲはなかった（図３）。
【００４７】
図４は、ＡＢＨが、ＥＡＲ後、４．７７±０．５６倍から２．０４±０．３４倍（Ｐ＜０．００１）に、ＬＡＲ後、１．９５±０．２３倍から１．５６±０．４７倍（Ｐ＜０．１０）に、ＰＣ１００比 接種前／接種後として表されるアレルゲン誘発性ＡＨＲを低下させることを示す。ＡＢＨのように、Ｌ−アルギニンの吸入は、ヒスタミンに対する基礎気道反応性に影響を与えなかった（図５）。珍しいことに、ＥＡＲ後及びＬＡＲ後のＡＨＲがＡＢＨと同程度に改善された（図５及び６）。
【００４８】
食塩水の場合のように、生物学的に不活性であるアルギニンのＤ−エナンチオマーは基礎気道反応性及びアレルゲン誘発性ＡＨＲに全く影響を与えなかった（図７）。
【００４９】
予防プロトコール
興味深いことに、アレルゲン接種０．５時間前の２５ｍＭ ＡＢＨでの前処置によって、食塩水対照処置と比較して、ＥＡＲ後のＡＨＲが顕著に阻止された（図８）。さらに、アレルゲン接種から８時間後の２５ｍＭ ＡＢＨのさらなる吸入によって、ＬＡＲ後のＡＨＲの発生がほぼ完全に阻止された。食塩水での前処置は、ＥＡＲ又はＬＡＲ後のＡＨＲに影響を与えなかった（図８）。
【００５０】
図９は、ＡＢＨによって、ＥＡＲ後に６．３３±１.３０倍（食塩水対照、第１週）から３．０５±０．５１倍（Ｐ＜０．０５）へ、ＬＡＲ後に２．０８±０．３１倍から１．４１±０．２５倍（Ｐ＜０．００５）へ、アレルゲン誘発性ＡＨＲが有意に低下したことを示す。
【００５１】
珍しいことに、第２週のＡＢＨでの前処置後、第１週での同じ動物の食塩水処置と比較して（０．０４±０．０１ｍｇ；Ｐ＜０．０１）、気道閉塞を誘発するために、オボアルブミンの３２．８倍高い濃度が必要であり（１．３１±０．６９ｍｇ）、このことから、ＡＢＨがアレルゲンに対する過敏性を顕著に低下させることが示される。食塩水処置動物に対して、オボアルブミン用量の有意な増加は観察されなかった（図１０）。
【００５２】
通常は閉塞を引き起こすアレルゲン投与量でのＡＢＨの影響を完全に理解するために、食塩水処置（閉塞を起こさせるもの）及びＡＢＨ処置動物において、等しい用量のアレルゲンで誘発を行った。この条件下で、アレルゲン接種０．５時間前のＡＢＨでの前処置によって、ＥＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲがより顕著に阻止され、一方、アレルゲン接種から８時間後のＡＢＨでのさらなる処置によって、基礎レベルに対するＬＡＲ後の気道反応性が完全に正常値に戻った（図１１、表１）。従って、ＡＢＨでの処置により、ＥＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲが４．１４±０．５９倍（食塩水処置）から１．５８±０．２４倍；Ｐ＜０．０１）に低下し、ＬＡＲ後のＡＨＲの出現が完全に阻止された（食塩水処置動物での１．６８±０．１４倍からＡＢＨ処置動物での１．０２±０．０２倍へ；Ｐ＜０．００５）。
【００５３】
アレルゲン接種したモルモットにおけるＰｐｌの代表的なオンライン記録を図１２で示す。食塩水処置と比較して、同じアレルゲン用量でのＡＢＨ処置では、ＥＡＲならびにＬＡＲが大きく低下した。予想されるように、アレルゲン誘発性急性管支閉塞を反映する、Ｐｐｌにおける最初のピーク反応の非常に顕著な低下が観察され（Ｐ＜０．０１、図１２）、一方で、同様に、ＥＡＲ及びＬＡＲ両方のＡＵＣが顕著に低下した（表１）。
【００５４】
【表１】
【００５５】
結論
アレルギー性喘息のモルモットモデルを用いて、本明細書中で、特異的なアイソザイム−非選択的アルギナーゼ阻害剤ＡＢＨが、ＥＡＲ及びＬＡＲ後にアレルゲン誘発性ＡＨＲを急速に改善し、一方で、アルギナーゼ阻害剤での前処置により吸入アレルゲンに対する気道の過敏性が顕著に低下し、アレルゲン誘発性ＥＡＲ及びＬＡＲ及び両反応後のＡＨＲの出現が阻止されることが示された。
【００５６】
理論に縛られることなく、気道におけるＮＯシンターゼアイソザイムに対するアルギナーゼ誘発性の基質欠乏を減弱させることにより、ＡＢＨの吸入によってＥＡＲ及びＬＡＲ後のアレルゲン誘発性ＡＨＲが急速に改善されることが推測される。さらに、ＮＯシンターゼに対する基質利用可能性の向上及び続くＮＯ産生の増加によって、ＡＢＨは、気道へのアレルゲン誘発性（特に肥満細胞由来）メディエーター放出を減弱させ得る。喘息患者におけるいくつかの研究から、気管支拡張（ｃＮＯＳ由来）ＮＯの欠乏が、アレルゲン誘発性ＡＨＲの出現に関与することが示されている。さらに、それぞれ喘息患者の気道及び血液で、アルギナーゼ発現又は活性の上昇が観察された。従って、上記の結果は、喘息患者におけるＡＢＨでの予防的治療の有用性を示唆する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上気道及び下気道の閉塞、特にアレルゲン誘発性の気管支閉塞及び気道過敏反応性を防ぐことによる喘息又はアレルギー患者の予防的維持療法用の薬剤の調製のためのアルギナーゼ阻害剤の使用。
【請求項２】
患者が、その疾患の症状又は原因としてアルギナーゼ活性が上昇しているアレルギー疾患患者である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
患者が喘息患者である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
患者がアレルギー性鼻炎を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
患者が、その疾患の症状又は原因としてアルギナーゼ活性が上昇している非アレルギー性喘息患者である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
アルギナーゼ阻害剤が、２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）、Ｓ−（２−ボロノエチル）−Ｌ−システイン（ＢＥＣ）、Ｎω−ＯＨ−Ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）、Ｎω−ヒドロキシ−ノル−Ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）、Ｌ−ノルバリン、ヨードアセチル−Ｌ−オルニチン、ヨードアセチル−Ｌ−リジン、Ｌ−リジン、Ｌ−シトルリンからなる群から選択される、請求項１から請求項５の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が、唯一の活性成分としてアルギナーゼ阻害剤を含む、請求項１から請求項６の何れか１項に記載の使用。
【請求項８】
薬剤が局所吸入により投与される、請求項１から請求項７の何れか１項に記載の使用。
【請求項１】
上気道及び下気道の閉塞、特にアレルゲン誘発性の気管支閉塞及び気道過敏反応性を防ぐことによる喘息又はアレルギー患者の予防的維持療法用の薬剤の調製のためのアルギナーゼ阻害剤の使用。
【請求項２】
患者が、その疾患の症状又は原因としてアルギナーゼ活性が上昇しているアレルギー疾患患者である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
患者が喘息患者である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
患者がアレルギー性鼻炎を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
患者が、その疾患の症状又は原因としてアルギナーゼ活性が上昇している非アレルギー性喘息患者である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
アルギナーゼ阻害剤が、２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）、Ｓ−（２−ボロノエチル）−Ｌ−システイン（ＢＥＣ）、Ｎω−ＯＨ−Ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）、Ｎω−ヒドロキシ−ノル−Ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）、Ｌ−ノルバリン、ヨードアセチル−Ｌ−オルニチン、ヨードアセチル−Ｌ−リジン、Ｌ−リジン、Ｌ−シトルリンからなる群から選択される、請求項１から請求項５の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が、唯一の活性成分としてアルギナーゼ阻害剤を含む、請求項１から請求項６の何れか１項に記載の使用。
【請求項８】
薬剤が局所吸入により投与される、請求項１から請求項７の何れか１項に記載の使用。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５１０２５７（Ｐ２０１０−５１０２５７Ａ）
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３７５０１（Ｐ２００９−５３７５０１）
【出願日】平成１９年１０月３０日（２００７．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００９４４９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６１６１２
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５０４０１８１０５）レイクスウニフェルジテイト・フローニンゲン (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月３０日（２００７．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００９４４９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６１６１２
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５０４０１８１０５）レイクスウニフェルジテイト・フローニンゲン (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ
【Ｆターム（参考）】
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