固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体及びその用途
本発明の課題は、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、この連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップ、ｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップを用いた診断キット、ｍＲＮＡ又はタンパク質の固相固定化法、タンパク質の固相合成法、前記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いるタンパク質と分子との相互作用を解析する方法等によって解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、固定化ｍＲＮＡ／ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、及びこれらの用途に関する。本発明は、より詳しくは、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、この連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップ、ｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップを用いた診断キット、固定化ｍＲＮＡ／ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、ｍＲＮＡ又はタンパク質の固相固定化法、タンパク質の固相合成法、前記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いるタンパク質と分子との相互作用を解析する方法等に関する。
【背景技術】
最近のゲノム科学の領域においては、遺伝子配列を明らかにするという「構造解析」から遺伝子の発現産物による「機能解析」へと研究テーマがシフトしている。遺伝子の機能を具現するのは、基本的に、タンパク質などの発現産物だからである。ゆえに、遺伝子の機能解析にはタンパク質の解析が必須となる。タンパク質の機能解析は、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−核酸相互作用等の解析による生化学的機能解析を通して行われている。
タンパク質−タンパク質相互作用の解析法としては、イーストツーハイブリッド法（Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９５７８−９５８２（１９９１））、ファージディスプレー法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，ｐｐ．１３１５−１３１７（１９８５））、ＧＳＴ−融合タンパク質プルダウン法、免疫共沈法等が知られている。タンパク質−核酸相互作用の解析法としては、電気泳動移動度シフトアッセイ法（Ｒｅｖｚｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５３，１７２（１９８６））、ＤＮａｓｅＩフットプリント法（Ｃａｌａｓ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，５，３１５７（１９７８））、メチル化緩衝法等が知られている。
また、ピューロマイシンの特異的性質を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法（Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）；Ｔａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０８，３０９（２００１）等参照）を用いてタンパク質相互作用の解析方法も開発されている（ＷＯ０１／０１６６００号公報参照）。
一方、ＤＮＡをガラス基板上に合成したＤＮＡチップやタンパク質を基板上に並べたタンパク質チップは、ゲノム解析ツールや遺伝子機能解析ツールとして極めて重要である。また、抗体を含むタンパク質を基板上に機能を失わせずに固定化したものはセンサーチップとしても今後広い範囲にわたる用途が予想される。しかし、タンパク質はＤＮＡに比べて不安定なため長期保存ができず、チップ化した際の取り扱いが極めて難しいという問題がある。
【発明の開示】
上記したように、種々の遺伝子機能解析手法が開発されてきたが、現在でも、遺伝子機能解析をより効率良くより迅速に行うためのツールの開発が望まれている。特にタンパク質の機能を安定に保持したままの発現法、固定化方法の開発が望まれている。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。まず本発明者らは、種々のアミノ酸配列からなるタンパク質と標的物質との相互作用を容易に判定可能なツールの開発を行った。即ち本発明者らは、標的物質との相互作用を判定すべき被検タンパク質をコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）と、該タンパク質を合成する際に連結部としての役割を担うピューロマイシンとの連結体が、固相に固定された構造からなる「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマインシン連結体」を作製した。
上記の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマインシン連結体を翻訳系と接触させることにより、固相上においてタンパク質を合成させることが可能である。合成されたタンパク質は、ピューロマイシンを介して固相に固定される。
上記の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマインシン連結体の好ましい態様としては、チップ等の基板上へ固定化されたマイクロアレイ用チップ（ｍＲＮＡチップ）を例示することができる。当該チップを用いて、翻訳系と接触させることにより適宜、プロテインチップを作製することが可能である。通常、プロテイン（タンパク質）チップは、タンパク質が不安定であることから、保存上あるいは取り扱い上に問題がある。本発明の好ましい態様においては、タンパク質の代わりに比較的安定なｍＲＮＡの形でチップ化し、例えば、使用する直前に翻訳系と接触させることにより、該チップをプロテインチップへ変換させることが可能である。即ち、本発明は、不安定なタンパク質の代わりに比較的安定なｍＲＮＡの形で固相上へ固定化させた、タンパク質相互作用解析ツールを提供する。
また、上記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質が、該ピューロマイシンと結合した「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」は、タンパク質と相互作用し得る分子の解析あるいはスクリーニングに利用することができ、非常に有用である。
さらに本発明者らは、上記「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を、逆転写反応系へ供することにより、該ｍＲＮＡの逆転写産物の相補的ＤＮＡが連結した「固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」の作製に成功した。通常、ＲＮＡに比べてＤＮＡはより安定であることから、タンパク質相互作用解析において、該連結体を被検分子と接触させる際に、該「固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」は非常に有用である。
本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたもので、次に示すような、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、この連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップ、ｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップを用いた診断キット、固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、ｍＲＮＡ又はタンパク質の固相固定化法、タンパク質の固相合成法、前記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いるタンパク質と分子との相互作用を解析する方法等を提供する。より具体的には、本発明は、
〔１〕 ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体を固相に固定してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔２〕 前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、ｍＲＮＡの３’末端にスペーサーを介してピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結したものである〔１〕に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔３〕 前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、前記スペーサーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている、〔１〕又は〔２〕に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔４〕 前記スペーサーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔５〕 前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔６〕 〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質が、該連結体におけるピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を介して連結してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、
〔７〕 〔６〕に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を、逆転写反応系へ供して合成される該ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡが、該連結体と結合してなる、固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、
〔８〕 〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体をマイクロアレイ用基板に固定してなる、ｍＲＮＡチップ、
〔９〕 〔８〕記載のｍＲＮＡチップを用いて作製されるプロテインチップ、
〔１０〕 ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体がビーズに固定してなるｍＲＮＡビーズ、
〔１１〕 〔８〕記載のｍＲＮＡチップ又は〔１０〕記載のｍＲＮＡビーズ、及び無細胞翻訳系を含むタンパク質相互作用解析用キット、
〔１２〕 （ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、及び、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程
を含む、ｍＲＮＡを固相に固定化する方法、
〔１３〕 （ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程；及び
（ｃ）該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と翻訳系とを接触させることによって、タンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を固相に固定化する方法、
〔１４〕 （ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程；及び
（ｃ）該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と翻訳系とを接触させることによって、タンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を固相で合成する方法、
〔１５〕 タンパク質と分子との相互作用を解析する方法であって、
（ａ）一以上の、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｃ）該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
を含む上記解析方法、
〔１６〕 タンパク質と分子との相互作用を解析する方法であって、
（ａ）一以上の、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と、逆転写反応系とを接触させて、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｄ）該連結体におけるタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
を含む上記解析方法、
〔１７〕 さらに、相互作用していると判断されたタンパク質及び／又は標的物質を同定する工程を含む、前記〔１５〕又は〔１６〕に記載の解析方法、
を、提供するものである。
以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
１．固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体
本発明の第１の態様は、ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体を固相に固定してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（以下、「固定化ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体」ともいう）に関する。
本発明で用いられるｍＲＮＡは、配列未知のもの、配列既知のものの両者を含む。すなわち、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いて配列既知のタンパク質に結合する物質を探索あるいは定量する場合は、配列既知のタンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡを用いる。逆に、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いて配列未知のタンパク質の機能を解析する場合は、配列未知のタンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡを用いることができる。ここで用いられる、ｍＲＮＡは、例えば、配列既知の各種レセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、各種抗体又はその断片をコードするｍＲＮＡ、各種酵素をコードするｍＲＮＡ、各種遺伝子ライブラリー中のＤＮＡから転写される配列未知のｍＲＮＡ、有機合成によってランダムに合成された配列を有するＤＮＡから転写されたランダムな配列を有するｍＲＮＡなどから選択される。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体は、通常、ｍＲＮＡの３’末端にスペーサーを介してピューロマイシンを連結したものである。ここで、ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物は、固相に固定されたｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を翻訳系に投入してタンパク質を合成する際に、ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質とを連結するヒンジあるいは連結部の役割をする。すなわち、ｍＲＮＡにスペーサーを介してピューロマイシンを結合したものと翻訳系を接触させると、そのｍＲＮＡがピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質と結合したＩｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓビリオンが生成することが知られている（Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）参照）。ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似している、下記式（Ｉ）：
に示される化合物で、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する。本明細書中、「ピューロマイシン様化合物」とは、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似し、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物をいう。
ピューロマイシン様化合物としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＡＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。なお、上記ピューロマイシン以外に好ましく用いられるピューロマイシン様化合物は、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などであり、下記にその化学構造式を示す。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体においては、ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物（以下、単に「ピューロマイシン」と称する）は、通常、スペーサーを介して連結される。また、この連結体は、通常、このスペーサーに設けられた固相結合部位を介して固相に固定化される。スペーサーは、主として、ピューロマイシンをリボソームのＡサイトと呼ばれる部位に効率良く取り込ませるために用いられる。したがって、スペーサーとしては、そのような性質を有する限り特に限定されないが、柔軟性があり、親水性で、側鎖の少ない単純な構造を有する骨格を有するものが好ましい。具体的には、ここで用いられるスペーサーとして、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ含む）、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリスチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを主骨格として含むものが好ましく用いられる。上記直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、適宜、それらを適当な連結基（−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［ｎは例えば１〜１０、好ましくは１〜３］、−Ｓ−、−ＳＯ−など）で化学的に連結することができる。
ｍＲＮＡとスペーサーとの連結は、公知の手法を用いて直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、ＤＮＡをスペーサーとして用いる場合は、ｍＲＮＡの３’末端にそのＤＮＡスペーサーの末端と相補的な配列を設けておくことにより、両者を連結することができる。また、スペーサーとピューロマイシンを連結する場合は、通常、公知の化学的手法によって連結される。
なお、タンパク質を合成した後に、ｍＲＮＡ−ＰＭ−タンパク質の複合体を固相から切り離す必要がある場合は、スペーサー中に切断可能部位を設けると好ましい。ＤＮＡをスペーサーの一部に用いた場合は、そのような切断可能部位として、ＤＮＡ鎖中に制限酵素認識部位を設けることができる。このような制限酵素認識部位をもつスペーサーを用いた場合は、タンパク質合成後など所望の時に、制限酵素（例えば、ＡｌｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩなど）を投入することによって、ｍＲＮＡ−ＰＭ−タンパク質の複合体を固相から切り離すことができる。制限酵素認識部位とその部位を切断する酵素の組合せは公知である（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ２０００・０１ Ｃａｔａｌｏｇ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ等参照）。
なお、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体には、必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、スペーサー又はピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。
２．ｍＲＮＡの固相固定化方法
本発明の別の態様によれば、上記のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いて、ｍＲＮＡを固相に固定化する方法が提供される。すなわち、本発明のｍＲＮＡの固相固定化法は、
（ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を調製する工程、及び、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定する工程
を含む。
ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体が固定される固相は特に限定されず、その連結体が使用される目的に応じて適宜選択される。本発明で用いられる固相としては、生体分子を固定する担体となるものを用いることができ、例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ；ガラス基板、シリコン（石英）基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。なお、本明細書では、上記ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体がビーズに固定されたものを「ｍＲＮＡビーズ」という。本発明の好ましい態様においては、ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体がビーズに固定してなるｍＲＮＡビーズを提供する。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体は、ｍＲＮＡが翻訳系と接触する際に、その翻訳の障害とならないように固相に固定されれば、その固定化手段は特に限定されない。通常は、ｍＲＮＡとＰＭを連結するスペーサーに固相結合部位を設け、その固相結合部位を、固相に結合させた「固相結合部位認識部位」を介して、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定する。固相結合部位は、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を所望の固相に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、このような固相結合部位として、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、リガンド、抗体など）が用いられ、この場合は、固相表面には固相結合部位認識部位として、その分子と結合する特定のポリペプチドを結合させておく。固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せの例としては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。
上記タンパク質の固相表面への結合は、公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を挙げることができる（Ｐ．Ｍ．Ａｂｄｅｌｌａ，Ｐ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．Ｒｏｙｅｒ，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８７，７３４（１９７９）等参照）。
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレンビーズ、スチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてスペーサーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。なお、本発明においては、固定手段については上記の方法に限定されることなく、当業者に公知である如何なる固定手段をも利用することができる。
３．タンパク質の固相固定化方法及びタンパク質の固相合成方法
本発明の別の態様によれば、タンパク質の固相固定化又は固相合成法であって、上記（ｂ）工程の後に、（ｃ）該ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体と翻訳系とを接触させることにより（例えば、該連結体に翻訳系を投入、あるいは該連結体を翻訳系に投入）、タンパク質を合成する工程を含む、タンパク質の固相固定化又は合成法が提供される。工程（ｂ）において、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体が固相に固定されているので、この連結体を翻訳系に投入した際に、前述のｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法の対応づけ技術を利用して、合成されたタンパク質がピューロマイシンを介して固相に固定化されるのである。
上記（ｃ）工程では、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を翻訳系と接触させることによって、タンパク質の合成を行う。ここで用いることができる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる（Ｌａｍｆｒｏｍ Ｈ，Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ Ｍ．Ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ Ｕ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７ ２７（１）：１−６等参照）。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。本発明においては、取り扱いの容易さから、無細胞系を使用することが好ましい。
ここで、図１に基づいて、本発明のｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いたタンパク質の固定化について簡単に説明する。図１ａは保存時の固定化ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を示す図、図１ｂは無細胞翻訳系を投入し、タンパク質が合成されている状態を示す図、図１ｃはタンパク質の合成が終了した状態を示す図である。図１ａに示すように、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体１は、ｍＲＮＡ１ａとピューロマイシン１ｂが、ＤＮＡスペーサー１ｃを介して連結されたもので、固相結合部位１ｄを介して固相２に結合されている。固相２は、後に、無細胞翻訳系を投入することを考慮して容器の形状をしている。図１ｂに示すように、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体１に、無細胞翻訳系３を投入すると、ｍＲＮＡと無細胞翻訳系を利用した翻訳反応によって、そのｍＲＮＡの核酸配列に対応するタンパク質４が合成される。翻訳終了後は、不要な無細胞翻訳系３の成分を除去し、タンパク質４がピューロマイシン１ｂに結合した、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質複合体が、固相２に固定された状態で形成される。なお、このようなｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質複合体（連結体）に、例えば、標的物質を接触させることによって、合成されたタンパク質と結合し得る標的物質をスクリーニングすることができる。
４．ｍＲＮＡチップ及びプロテインチップ
本発明の別の態様によれば、上記した固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を複数含むｍＲＮＡチップ（ｍＲＮＡマイクロアレイ）に関する。即ち本発明は、本発明の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体をマイクロアレイ用基板に固定してなる、ｍＲＮＡチップを提供する。このｍＲＮＡチップは、上述したｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を複数基板上に固定化したものである。なお、上記「複数」とは、特にその上限の値は制限されるものではないが、通常マイクロアレイとして用いられるチップ上に固定可能な実用的な数を指す。このｍＲＮＡチップを翻訳系に投入することにより、あるいは、翻訳系をｍＲＮＡチップに投入することにより、上述のタンパク質合成がチップ上で起こり、各タンパク質が固相に結合した、いわゆるプロテインチップが作製される。このようにして作製されるプロテインチップもまた、本発明に含まれる。
本発明のｍＲＮＡチップにおいては、機能既知のタンパク質をコードするｍＲＮＡ複数を、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体として固相に固定してもよいし、機能未知のタンパク質をコードするｍＲＮＡ複数をｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体として固相に固定してもよい。例えば、疾病に関与する機能既知のタンパク質をコードするｍＲＮＡを複数チップに固定する場合は、例えば、疾病の診断用ｍＲＮＡチップ、タンパク質相互作用解析用ｍＲＮＡチップ等とすることができる。診断用チップとして用いる場合は、ある特定の疾病の診断マーカーと結合するタンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれプレートの所定の位置に固定しておく。そして、診断を行う直前にこのプレートに無細胞翻訳系を投入して、プレート上の所定の位置に所望の診断マーカーと結合するタンパク質を合成し、固定する。このようにすれば、診断の直前にプロテインチップを作製することができる。プロテインチップは、その保存上あるいは取り扱い上に問題がある。不安定なプロテインの代わりに安定なｍＲＮＡの形でチップ化した点は、本発明の特徴の一つと言える。ゆえに、ｍＲＮＡの固相固定化及びタンパク質の合成・固定化以外の技術（例えば、使用するプレートの材料・サイズ、使用するプロテインの種類・配置、プロテインチップを用いたタンパク質の機能解析方法等）は、公知のプロテインチップの技術をそのまま利用することができる（Ｋｕｋａｒ Ｔ，Ｅｃｋｅｎｒｏｄｅ Ｓ，Ｇｕ Ｙ，Ｌｉａｎ Ｗ，Ｍｅｇｇｉｎｓｏｎ Ｍ，Ｓｈｅ ＪＸ，Ｗｕ Ｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；３０６（１）：５０−４等参照）。なお、上記ｍＲＮＡビーズ又は上記ｍＲＮＡチップと無細胞翻訳系を含む診断キット、あるいは、タンパク質相互作用解析用キットも本発明の範囲内である。このようなｍＲＮＡチップを用いることによって、タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、リガンドの探索、疾病マーカーの探索、疾病の診断、薬効評価、薬物動態の評価などに利用することができる。
また、本発明の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系と接触させることによって合成されるタンパク質が、上記連結体へ付加された構造からなる連結体（「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」と記載する）も、本発明に含まれる。即ち本発明は、本発明の「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体」を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質（ポリペプチド）が、該連結体におけるピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を介して連結してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体に関する。該連結体は、例えば、後述の「タンパク質と標的分子との相互作用を解析する方法」に好適に用いることができる。また上記連結体の一つの態様としては、上述のように、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体がマイクロアレイ用基板へ固定された構造のプロテインチップを例示することができる。
また本発明の好ましい態様においては、上記「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を、逆転写反応系へ供する（逆転写反応系と接触させる）ことにより、該ｍＲＮＡの逆転写産物である相補的ＤＮＡ（該ｍＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ）を合成することが可能である。例えば、本発明の上記スペーサーとして、ｍＲＮＡの３’末端配列と相補的な配列を含むＤＮＡスペーサーを用いる場合、該相補的な配列が該ｍＲＮＡの逆転写反応においてプライマーとして機能することが期待される。即ち、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を逆転写反応系へ供することにより、該プライマーを合成起点とするＤＮＡ合成反応が開始され、該ｍＲＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡが合成される。このようにして合成されるＤＮＡを含む連結体（「ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」と記載する）もまた、本発明に含まれる。即ち本発明は、本発明の「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を、逆転写反応系へ供して合成される該ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡが、該連結体と結合してなる、固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を提供する。
本発明の上記連結体においてピューロマイシンと連結される核酸分子は、通常、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡとの二本鎖核酸分子であるが、当該核酸分子におけるｍＲＮＡは、その後のヌクレアーゼ反応等によって消化されていてもよい。即ち、一本鎖の（ｍＲＮＡと相補的）ＤＮＡ分子がピューロマイシンと連結された構造からなる「固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」もまた、本発明の連結体の一つの態様である。さらに、本発明の上記連結体において、ピューロマイシンと連結される核酸分子は、該ＤＮＡと相補性を有するＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡであってもよい。
なお、本発明において「逆転写反応系」とは、ｍＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する所謂「逆転写」を司る反応系をいい、当該反応系は通常、逆転写酵素を含有する。本発明の逆転写反応は、当業者においては、適宜実施することが可能である。より具体的には、後述の実施例に記載の方法により行うことができる。
５．タンパク質と分子との相互作用を解析する方法
本発明の別の態様によれば、上記したｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いたタンパク質と分子との相互作用を解析する方法が提供される。この解析方法は、
（ａ）一以上の本発明の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を、翻訳系に投入し、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｃ）該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程を含む。
この解析方法は、例えば、（ｉ）配列既知のタンパク質に作用する物質をスクリーニングする場合、（ｉｉ）ある特定の物質（例えば、リガンド）が結合する配列未知のタンパク質をスクリーニングする場合等に用いることができる。例えば、（ｉ）の場合は、配列既知のタンパク質（例えばオーファンレセプタータンパク質）をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡとピューロマイシンとの連結体を複数用意しておき（すなわち、複数のオーファンレセプタータンパク質に対応するｍＲＮＡをそれぞれ有するｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を複数用意）、これを翻訳系に投入する。すると、各ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体のｍＲＮＡから複数のオーファンレセプタータンパク質が合成される。各オーファンレセプタータンパク質は、固相に固定されたｍＲＮＡ−ＰＭ連結体のピューロマイシンにＣ末端が結合することによって固定される。必要に応じて、不要な成分を洗浄除去し、これに標的物質及びバッファー等を加えて、標的物質をオーファンレセプタータンパク質に結合させることによって、結合実験を行う。（ｉｉ）の場合は、例えば、ある遺伝子ライブラリーから複数のｍＲＮＡを取得し、複数のｍＲＮＡとピューロマイシンとの連結体を作成し、固相に固定する。以下、同様にタンパク質の合成を行い、標的物質をそのタンパク質に接触させて結合実験を行う。
上記工程（ｂ）においては、工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる。ここで用いられる「標的物質」とは、本発明において合成されるタンパク質と相互作用するか否か調べるための物質を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。
タンパク質としては、特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、特に制限されることはなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、特に制限されず、機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
なお、これら標的物質とタンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられる。
ここで用いられる標的物質は、必要に応じて標識物質により標識して用いることができる。必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、標的物質に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。これらの標識物質は、標的物質と固定化タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。上記標識物質の標的物質への結合は、公知の手法に基づいて行うことができる。
次いで、本解析方法によれば、工程（ｃ）において、該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する。該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行う。そのような測定手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））、エバネッセント場分子イメージング法（Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５））、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））、蛍光偏光解消法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））、及び蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））等が挙げられる。
本発明の解析方法においては、必要に応じて、さらに、工程（ｃ）において相互作用していると判断されたタンパク質−標的物質結合体中の、タンパク質及び／又は標的物質を同定する。タンパク質の同定は、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともできるし、該タンパク質に結合しているｍＲＮＡからＤＮＡを逆転写し、得られたＤＮＡの塩基配列を解析することによって行うこともできる。標的物質の同定は、ＮＭＲ、ＩＲ、各種質量分析などによって行うことができる。なお、本発明のｍＲＮＡチップ及びプロテインチップを用いて、タンパク質−タンパク質間相互作用を解析する場合は、通常のプロテインチップ上のサンプル解析と同様に、飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いることができる。
また本発明の上記方法は、上記工程（ａ）に続いて、工程（ａ）において合成されるｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を逆転写反応系へ供することにより、該連結体におけるｍＲＮＡと相補的なＤＮＡを含有する連結体（ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体）を作製し、上述のその後の工程を実施させてもよい。即ち本発明の好ましい態様においては、以下の工程を含むタンパク質と分子との相互作用を解析する方法を提供する。
（ａ）一以上の、本発明のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と、逆転写反応系とを接触させて、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｄ）該連結体におけるタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の固定ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いてタンパク質を合成・固定化する方法を示す概略図である。
図２は、実施例１及び２で使用した２種類の遺伝子を示す図である。
図３は、ＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎまたはＧＦＰのｍＲＮＡへ、ピューロマシン付きスペーサーＤＮＡを共有結合させたものの概略図を示す図である。
図４は、実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図５は、実施例２において、ビーズの上で翻訳させたＧＦＰの蛍光を顕微鏡下で観察した写真である。
【符号の説明】
１：固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、１ａ：ｍＲＮＡ、
１ｂ：ピューロマイシン、１ｃ：ＤＮＡスペーサー、
１ｄ：固相結合部位、２：固相、３：無細胞翻訳系、
４：タンパク質。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
１．スペーサーＢｉｏＬｏｏｐ−Ｐｕｒｏ（以下“ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ”と略す）の合成
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ［配列；５’−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’、ＢＥＸ社より購入］１０ｎｍｏｌを、１００μｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かし、１００ｍＭ ＴＣＥＰを１μｌ加え（ｆｉｎａｌ １ｍＭ）、室温で６時間放置し、Ｐｕｒｏ−Ｆ−ＳのＴｈｉｏｌを還元した。架橋反応を行う直前に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ５（アマシャム、１７−０８５３−０２）を用いてＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を除いた。なお、Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓの配列中、（Ｓ）は５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６、（Ｆ）はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＴ、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ ＣＰＧ、Ｓｐａｃｅｒ１８はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅａｒｃｈ社製のスペーサー（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）で次の化学構造を有する。
０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに、５００ｐｍｏｌ／μｌ Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ［（５６ｍｅｒ）配列；５’−ＣＣＣＧＧ ＴＧＣＡＧ ＣＴＧＴＴ ＴＣＡＴＣ（Ｔ−Ｂ）ＣＧＧＡ ＡＡＣＡＧ ＣＴＧＣＡ ＣＣＣＣＣ ＣＧＣＣＧ ＣＣＣＣＣ ＣＧ（Ｔ）ＣＣＴ−３’（配列番号１、ＢＥＸ社より購入），（Ｔ）：Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ，（Ｔ−Ｂ）：Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＴ（アンダーラインは制限酵素ＰｖｕＩＩのサイトを示す）］２０μｌ、１００ｍＭ架橋剤ＥＭＣＳ（３４４−０５０５１；６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）２０μｌ、を加え、良く攪拌した後、３７℃で３０分放置した後に、未反応のＥＭＣＳを取り除いた。沈殿を減圧下で乾燥させた後、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０μｌに溶かし、上記の還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ（〜１０ｎｍｏｌ）を加えて４℃で一晩放置した。サンプルに最終で４ｍＭになるようにＴＣＥＰを加え室温で１５分放置した後、未反応のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓをエタノール沈殿で取り除き、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐを取り除くために以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った。
カラム；ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ ＣＳＯＭＯＳＩＬ ３７９１８−３１ １０ｘ２５０ｍｍ Ｃ１８−ＡＲ−３００（Ｗａｔｅｒｓ）
ＢｕｆｆｅｒＡ；０．１Ｍ ＴＥＡＡ、ＢｕｆｆｅｒＢ；８０％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ（Ｂ％：１５−３５％ ３３ｍｉｎ）
ＨＰＬＣの分画は１８％アクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、６２℃）で解析し、目的の分画を減圧下で乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理水で溶かして、１０ｐｍｏｌ／μｌにした。
２．固相上での翻訳（ＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎ）
２−１ 実験に使用する遺伝子のｍＲＮＡを合成
５’側にＴ７、Ｃａｐ、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列、３’末端に６ｘヒスチジンタグをもち、終止コドンを削ったＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎ（３７１ｂｐ；配列番号２）及び５’末端にＴ７、Ｃａｐ、Ｋｏｚａｋ配列をもち終止コドンを削ったＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（７１７ｂｐ；配列番号３、Ｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９：２６４（２）：５５６−６０に記載の変異体）をクローニングし使用した。共に、スペーサーＤＮＡの一部と相補的であるタグ配列（５’側−ａｇｇａｃｇｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇａａａ（配列番号４）、アンダーラインはスペーサー配列と相補的な部分）を含むように設計したプライマーでＰＣＲ反応を行うことで、３’末端にタグ配列をもつＤＮＡを得た。ＰＣＲ反応はＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社）１ユニットを５０μｌのＰＣＲ反応液に加え、鋳型ＤＮＡは１ｆｍｏｌ加え、下記プライマーを用い、下記条件で行った。
［条件］熱変性９５℃ ２分の後、熱変性９５℃ ３０秒、
アニーリング６９℃ １５秒、伸長反応７２℃ ４５秒
のサイクルを３０回繰返し
得られたＤＮＡの構成を図２に示す。後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐ１３００）でｍＲＮＡを合成した。転写は、プロメガ社のキット付属のプロトコルに従いＤＮＡ１μｇ、２０μｌスケールで次のように行った。すなわち、３７℃で一時間放置した後、キット付属のＤＮａｓｅ（ＲＱ１ ＤＮａｓｅ）を１ユニット加え、さらに３７℃で１５分放置した。合成の際、プロメガ社のプロトコルに従い、ｍ７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐ１７１１）を加えた。５’キャップアナログがついたｍＲＮＡは、ＤＮａｓｅ、フェノール・クロロフォルム処理した後、ＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で精製し定量した。
２−２ ｍＲＮＡとＰＭ付きスペーサーＤＮＡの結合
５’キャップ及び３’にタグ配列を持ったｍＲＮＡ ３００ｐｍｏｌに、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを３００ｐｍｏｌ、１０ｘＬｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）６μｌ、ＤＭＳＯ ２．５μｌ、を加え５５μｌになるようＤＥＰＣ処理水を加えた。熱湯上で８５℃から３５℃へ２０分かけてアニーリングし、１５ｕｎｉｔ Ｔ４ Ｐｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ、２．５μｌ）、１００ｕｎｉｔ Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ、２．５μｌ）を加え、２５℃４５分反応させた。サンプルをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，７４１０４）で処理した後、さらにＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｍｏｖｅｒで精製した。
図３に、ＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎまたはＧＦＰのｍＲＮＡへ、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを共有結合させたものの概略図を示す。図３中、Ｐはピューロマイシン、ＦはＦＩＴＣ、Ｂはビオチン、ＡＴＣＧｕはＤＮＡ、ＲＮＡシーケンスを示している。大文字で示した部分は制限酵素ＰｖｕＩＩサイト（四角枠で囲った部分）を含むＤＮＡ部分、小文字で示した部分はｍＲＮＡで、３’末端側のＤＮＡと相補鎖を形成している部分がＴａｇ配列に結合している。ＲＮＡの３’末端とＤＮＡの５’末端は“Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ”と示した部分でライゲートされている。
２−３ ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体のビーズ上への結合
上記のように合成した、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を、直径２．３μｍ±０．３μｍのアビジンビーズ（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、ＴａＫａＲａ、９０８８）へ、添付のプロトコルに基づき以下のようにして結合させた。
６０μｌのアビジンビーズを２００μｌの１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）で２回、マグネットスタンドを用いてアビジンビーズを沈殿させ、上清を交換することで洗浄した。洗浄後、沈殿させたビーズへ、上記２−２で合成したＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を４８ｐｍｏｌ加え、１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）を合計で１２０μｌになるように加え、１０分間室温で静置した。その後、上記のように、２００μｌの１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）でビーズを洗浄することで、ビーズに結合しなかったＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を取り除いた。さらに、２０ ｘ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ）１０μｌ、ＤＥＰＣ処理水１９０μｌを加え、同様にビーズを洗浄した。
２−４ 翻訳
上記のビーズをマグネットスタンド上で沈殿させ、無細胞翻訳系（Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ社，１２００）を３００μｌ分加え、３０℃１５分翻訳反応を行った。その後、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌをそれぞれ最終で６３ｍＭ、７５０ｍＭになるように加えて３７℃で１．５時間放置した。サンプルは、約１時間毎に軽く攪拌した。上記のようにビーズを沈殿させ、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ社、２６９４）２０ｕｎｉｔを含んだ１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）２００μｌで２回ビーズを洗浄した。
２−５ 逆転写
洗浄後、上記と同様にして沈殿させたビーズに対して、ＴａＫａＲａ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社添付のプロトコルに従い、８０μｌのスケールで逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ（ＴａＫａＲａ、２６４０Ａ）を用いて４２℃１０分間、逆転写反応を行った。その後に上記と同様にして、１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）２００μｌでビーズを洗浄した。
２−６ ビーズからＤＮＡ−タンパク質を回収
沈殿させたビーズに対して、添付のプロトコルに従い、４０μｌのスケールで２４ｕｎｉｔの制限酵素ＰｖｕＩＩ（ＴａＫａＲａ）で３７℃１時間放置することでビーズ上のＤＮＡ−タンパク質をビーズから切り離す処理を行った。ここでは特に、ビーズとＤＮＡ−タンパク質の非特異的な吸着を避けるために、ＢＳＡを最終０．１ｍｇ／ｍｌになるように加えた。その後、上記と同様にしてビーズを沈殿させ、上清を新しいサンプルチューブに移した。逆転写の際、テンプレートとなったｍＲＮＡがＤＮＡ−タンパク質のＤＮＡの部分と相補鎖を作ったままなので、その上清にＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ４２８１）を２ｕｎｉｔ加え、３７℃、２０分反応させることで逆転写後に残っているｍＲＮＡ部分を分解した。
２−７ Ｈｉｓタグ精製
Ｑｕｉａｇｅｎ社のプロトコルに従い、サンプルを等量のＬｙｓｉｓバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ １０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％，ｐＨ８．０）に希釈し、２０μｌのＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡ ＭａｇｎｅｔｉｃＡｇａｒｏｓｅＢｅａｄｓ、ＱＩＡＧＥＮ社、３６１１１）を加え、室温で４０分攪拌しながら放置した。上記と同様にしてマグネットスタンドでＮｉ−ＮＴＡビーズを沈殿させ、１００μｌのＷａｓｈバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ２０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％，ｐＨ８．０）で軽く洗浄した。ビーズを沈殿させた後、Ｅｌｕｔｅバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ２５０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％，ｐＨ８．０）を１５μｌ加え１分間室温で放置し、ＤＮＡ−タンパク質を溶出させた。同様にしてビーズを沈殿させ、ＤＮＡ−タンパク質が溶出した上清をとりわけ、６Ｍ尿素を含んだ５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ゲルのバンドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（Ｂｉｏ ＲＡＤ ｃｏ．）でＦＩＴＣの蛍光を可視化することで定量した。得られた結果を図４に示す。
３．固相上でのタンパク質合成（ＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎ）の結果
図４ａは、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を無細胞翻訳系に加え、溶液中で（通常どおりに）ｍＲＮＡ−タンパク質の複合体を作成した結果であり、ＦＩＴＣの蛍光を可視化したものである。レーン１は翻訳前、２は翻訳後である。翻訳反応後現れた“ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ”と示した位置のバンドは、その分子量から判断して、スペーサーＤＮＡのピューロマイシンを介して、ｍＲＮＡとそのｍＲＮＡがコードするタンパク質が共有結合された複合体であると考えられる。“ｇｅｎｏｍｅ”と記した位置のバンドは、タンパク質が結合していない、スペーサーＤＮＡ、ｍＲＮＡの複合体である。
ビーズ上で翻訳、逆転写反応を行い、制限酵素でビーズから切り離し回収したものも同様に、２本のバンドが観察され（レーン１）、高分子量のバンド（矢じり）が目的とするＤＮＡ−タンパク質の共有結合体、低分子量の太いバンドはタンパク質がつかなかったものであると考えられる（図４ｂ）。このことは、タンパク質のＣ末端側に導入した６ ｘ Ｈｉｓ−ｔａｇで精製した結果、高分子量のバンドのみが溶出されたことから確認される（レーン２、３）。また、この結果は、ここで合成・固定化されたＤＮＡ−タンパク質複合体のタンパク質部分は、通常液相で合成されるタンパク質同様、完全長が合成されたことを示すものである。
これらの結果から、固相上に、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを介してｍＲＮＡを固定し、そこに無細胞翻訳系を加える方法で、そのｍＲＮＡがコードしているタンパク質を翻訳直後に自動的に固相上に固定化できることが示された。
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＦＩＴＣの蛍光で可視化したバンドを基に回収されたＤＮＡ−タンパク質複合体の量を計測した結果、固相上で合成され制限酵素で切り離し回収した時点でのＤＮＡ−タンパク質（図４ｂ矢じり）は、加えたｍＲＮＡの０．４％、さらにＨｉｓ−ｔａｇ精製し抽出されたもの（図４ｂ“ＤＮＡ ｖｉｒｕｓ”）は、加えたｍＲＮＡの０．１％だった。
〔実施列２〕固相上で合成されたタンパク質の機能を検出（ＧＦＰ）
１．スペーサーがついたｍＲＮＡをビーズ上へ固定
実施例１の２−３と同様にＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体をアビジンビーズに固定した。ＧＦＰの蛍光を観察するために、スペーサーＤＮＡは上記２で用いたものとは違い、Ｐｕｒｏ−Ｓ［配列；５’−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’、（Ｓ）：５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６、（Ｐｕｒｏ）：Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ＣＰＧ、ＢＥＸ社より購入］で同様に合成したものを使用した。アビジンビーズはＢａｎｇｓ社の直径４６０ｎｍのものを使用し、以下のようにしてビーズ上に固定化した。
１０μｌ分のビーズを１００μｌの０．５ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，５００ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄した。洗浄は、ビーズを含んだ溶液を１５，０００ｒｐｍ ５分間４℃で遠心分離し、上清を液交換することで行った。洗浄したビーズの沈殿に、実施例１の２−２と同様の方法で合成した、８ｐｍｏｌのＰＭ付きスペーサーＤＮＡとＧＦＰのｍＲＮＡの複合体を加え、１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで４０μｌになるように希釈し、室温で１５分静置してビーズに結合させた。上記のようにして１００μｌの０．５ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１度洗浄し、ビーズに結合しなかったｍＲＮＡを取り除いた。さらに、２０ ｘ ＴｒａｎｓＬａｔｉｏｎＭｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ社）１０μｌ、ＤＥＰＣ処理水１９０μｌを加え、同様にビーズを洗浄した。
２．翻訳
遠心分離で沈殿させたビーズへ無細胞翻訳系（Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ社，１２００）を２０μｌ分加え、３０℃３０分反応させた後、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌをそれぞれ最終で６３ｍＭ、７５０ｍＭになるように加え、２５℃で２時間放置した。サンプルは、約１時間毎に軽く攪拌した。１５，０００ｒｐｍ ６分遠心分離によりビーズを沈殿させ、上記と同様にして遠心分離により、リン酸ＮａＣｌバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で２回ビーズを洗浄した。沈殿させたビーズを２０μｌリン酸ＮａＣｌバッファーに懸濁し、氷上で保存した。
３．顕微鏡下での観察
上記のビーズを含む懸濁液を５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０でさらに１／５に希釈し、活性酸素除去のための酵素系（２５ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，２．５μＭ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ，１０ｎＭ ｃａｔａｌａｓｅ，１０ｍＭ ｄｉｔｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）存在下で顕微観察を行った。顕微鏡はＮｉｃｏｎ、ＴＥ２０００を用い、４７３ｎｍ ０．３５ｍＷの対物エバネッセント照明で励起し、ＧＦＰの蛍光を冷却ＣＣＤカメラＯＲＣＡ−ＥＲ（浜松フォトニクス）で１．０４秒の露光で撮影した。ネガティブなコントロールとして、実施例１の３−１及び３−２と同じ方法で並列してビーズにスペーサーＤＮＡのみを同じ濃度で結合させ、同じ条件で観察を行った。観察結果を図５に示す。図５は、ビーズの上で翻訳させたＧＦＰの蛍光を顕微鏡下で観察した写真である。ビーズ（直径４６０ｎｍ）の明視野像に、４７３ｎｍのレーザーで励起したときの蛍光像を重ね合わせた。図５ａは、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとＧＦＰのｍＲＮＡの複合体８ｐｍｏｌを１０μｌ分のアビジンビーズに結合させ翻訳反応を行ったもの、図５ｂは、ＰＭ付きＤＮＡスペーサーのみ８ｐｍｏｌを１０μｌ分のアビジンビーズに結合させ、同じ条件で翻訳反応を行った結果の顕微観察像を示す。蛍光像は緑の擬似カラーで確認した。
４．結果
実施例１の結果をさらに、確かなものにするために、同じ方法でＧＦＰをビーズ上で翻訳し、翻訳されたビーズ上のＧＦＰの蛍光をエバネッセント顕微鏡下で直視することを試みた。その結果、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡのみをビーズに結合させ観察を行ったときに比べて優位に、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡにＧＦＰのｍＲＮＡをつないだ後ビーズに固定し翻訳させたビーズ上に、ＧＦＰの蛍光を観察することができた。したがって、目的とするタンパク質が固相で合成され固定されたことが再度確認された。
産業上の利用の可能性
以上説明したように、本発明によれば、ｍＲＮＡ及びタンパク質の固相固定化方法、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、この連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップなどを提供することができる。このようなｍＲＮＡチップは、保存が容易であるから、既存のプロテインチップと比較して極めて取り扱いが容易であるという利点がある。
また本発明は、上記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質が、該ピューロマイシンと結合した構造の「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を提供する。該連結体は、タンパク質と相互作用し得る分子の解析あるいはスクリーニングに利用することができる。
さらに本発明は、上記「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を、逆転写反応系へ供することにより、該ｍＲＮＡの逆転写産物の相補的ＤＮＡが連結した構造の「固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を提供する。通常、ＲＮＡに比べてＤＮＡはより安定であることから、タンパク質相互作用解析において、該連結体を被検分子と接触させる際に、該連結体は非常に有用である。
また、本発明のｍＲＮＡチップは、各種疾病の診断マーカーを認識するタンパク質の合成に用いられるｍＲＮＡを固定することによって、各種疾病の診断に利用することができる。さらに、本発明のタンパク質の固相固定化又は合成方法は、タンパク質と分子との相互作用の解析にも好適に利用できる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、固定化ｍＲＮＡ／ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、及びこれらの用途に関する。本発明は、より詳しくは、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、この連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップ、ｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップを用いた診断キット、固定化ｍＲＮＡ／ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、ｍＲＮＡ又はタンパク質の固相固定化法、タンパク質の固相合成法、前記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いるタンパク質と分子との相互作用を解析する方法等に関する。
【背景技術】
最近のゲノム科学の領域においては、遺伝子配列を明らかにするという「構造解析」から遺伝子の発現産物による「機能解析」へと研究テーマがシフトしている。遺伝子の機能を具現するのは、基本的に、タンパク質などの発現産物だからである。ゆえに、遺伝子の機能解析にはタンパク質の解析が必須となる。タンパク質の機能解析は、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用やタンパク質−核酸相互作用等の解析による生化学的機能解析を通して行われている。
タンパク質−タンパク質相互作用の解析法としては、イーストツーハイブリッド法（Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９５７８−９５８２（１９９１））、ファージディスプレー法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，ｐｐ．１３１５−１３１７（１９８５））、ＧＳＴ−融合タンパク質プルダウン法、免疫共沈法等が知られている。タンパク質−核酸相互作用の解析法としては、電気泳動移動度シフトアッセイ法（Ｒｅｖｚｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５３，１７２（１９８６））、ＤＮａｓｅＩフットプリント法（Ｃａｌａｓ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，５，３１５７（１９７８））、メチル化緩衝法等が知られている。
また、ピューロマイシンの特異的性質を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法（Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）；Ｔａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５０８，３０９（２００１）等参照）を用いてタンパク質相互作用の解析方法も開発されている（ＷＯ０１／０１６６００号公報参照）。
一方、ＤＮＡをガラス基板上に合成したＤＮＡチップやタンパク質を基板上に並べたタンパク質チップは、ゲノム解析ツールや遺伝子機能解析ツールとして極めて重要である。また、抗体を含むタンパク質を基板上に機能を失わせずに固定化したものはセンサーチップとしても今後広い範囲にわたる用途が予想される。しかし、タンパク質はＤＮＡに比べて不安定なため長期保存ができず、チップ化した際の取り扱いが極めて難しいという問題がある。
【発明の開示】
上記したように、種々の遺伝子機能解析手法が開発されてきたが、現在でも、遺伝子機能解析をより効率良くより迅速に行うためのツールの開発が望まれている。特にタンパク質の機能を安定に保持したままの発現法、固定化方法の開発が望まれている。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。まず本発明者らは、種々のアミノ酸配列からなるタンパク質と標的物質との相互作用を容易に判定可能なツールの開発を行った。即ち本発明者らは、標的物質との相互作用を判定すべき被検タンパク質をコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）と、該タンパク質を合成する際に連結部としての役割を担うピューロマイシンとの連結体が、固相に固定された構造からなる「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマインシン連結体」を作製した。
上記の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマインシン連結体を翻訳系と接触させることにより、固相上においてタンパク質を合成させることが可能である。合成されたタンパク質は、ピューロマイシンを介して固相に固定される。
上記の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマインシン連結体の好ましい態様としては、チップ等の基板上へ固定化されたマイクロアレイ用チップ（ｍＲＮＡチップ）を例示することができる。当該チップを用いて、翻訳系と接触させることにより適宜、プロテインチップを作製することが可能である。通常、プロテイン（タンパク質）チップは、タンパク質が不安定であることから、保存上あるいは取り扱い上に問題がある。本発明の好ましい態様においては、タンパク質の代わりに比較的安定なｍＲＮＡの形でチップ化し、例えば、使用する直前に翻訳系と接触させることにより、該チップをプロテインチップへ変換させることが可能である。即ち、本発明は、不安定なタンパク質の代わりに比較的安定なｍＲＮＡの形で固相上へ固定化させた、タンパク質相互作用解析ツールを提供する。
また、上記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質が、該ピューロマイシンと結合した「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」は、タンパク質と相互作用し得る分子の解析あるいはスクリーニングに利用することができ、非常に有用である。
さらに本発明者らは、上記「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を、逆転写反応系へ供することにより、該ｍＲＮＡの逆転写産物の相補的ＤＮＡが連結した「固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」の作製に成功した。通常、ＲＮＡに比べてＤＮＡはより安定であることから、タンパク質相互作用解析において、該連結体を被検分子と接触させる際に、該「固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」は非常に有用である。
本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたもので、次に示すような、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、この連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップ、ｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップを用いた診断キット、固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、ｍＲＮＡ又はタンパク質の固相固定化法、タンパク質の固相合成法、前記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いるタンパク質と分子との相互作用を解析する方法等を提供する。より具体的には、本発明は、
〔１〕 ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体を固相に固定してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔２〕 前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、ｍＲＮＡの３’末端にスペーサーを介してピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結したものである〔１〕に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔３〕 前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、前記スペーサーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている、〔１〕又は〔２〕に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔４〕 前記スペーサーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔５〕 前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、
〔６〕 〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質が、該連結体におけるピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を介して連結してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、
〔７〕 〔６〕に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を、逆転写反応系へ供して合成される該ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡが、該連結体と結合してなる、固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体、
〔８〕 〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体をマイクロアレイ用基板に固定してなる、ｍＲＮＡチップ、
〔９〕 〔８〕記載のｍＲＮＡチップを用いて作製されるプロテインチップ、
〔１０〕 ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体がビーズに固定してなるｍＲＮＡビーズ、
〔１１〕 〔８〕記載のｍＲＮＡチップ又は〔１０〕記載のｍＲＮＡビーズ、及び無細胞翻訳系を含むタンパク質相互作用解析用キット、
〔１２〕 （ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、及び、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程
を含む、ｍＲＮＡを固相に固定化する方法、
〔１３〕 （ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程；及び
（ｃ）該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と翻訳系とを接触させることによって、タンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を固相に固定化する方法、
〔１４〕 （ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程；及び
（ｃ）該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と翻訳系とを接触させることによって、タンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を固相で合成する方法、
〔１５〕 タンパク質と分子との相互作用を解析する方法であって、
（ａ）一以上の、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｃ）該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
を含む上記解析方法、
〔１６〕 タンパク質と分子との相互作用を解析する方法であって、
（ａ）一以上の、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と、逆転写反応系とを接触させて、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｄ）該連結体におけるタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
を含む上記解析方法、
〔１７〕 さらに、相互作用していると判断されたタンパク質及び／又は標的物質を同定する工程を含む、前記〔１５〕又は〔１６〕に記載の解析方法、
を、提供するものである。
以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
１．固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体
本発明の第１の態様は、ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体を固相に固定してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（以下、「固定化ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体」ともいう）に関する。
本発明で用いられるｍＲＮＡは、配列未知のもの、配列既知のものの両者を含む。すなわち、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いて配列既知のタンパク質に結合する物質を探索あるいは定量する場合は、配列既知のタンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡを用いる。逆に、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いて配列未知のタンパク質の機能を解析する場合は、配列未知のタンパク質をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡを用いることができる。ここで用いられる、ｍＲＮＡは、例えば、配列既知の各種レセプタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、各種抗体又はその断片をコードするｍＲＮＡ、各種酵素をコードするｍＲＮＡ、各種遺伝子ライブラリー中のＤＮＡから転写される配列未知のｍＲＮＡ、有機合成によってランダムに合成された配列を有するＤＮＡから転写されたランダムな配列を有するｍＲＮＡなどから選択される。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体は、通常、ｍＲＮＡの３’末端にスペーサーを介してピューロマイシンを連結したものである。ここで、ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物は、固相に固定されたｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を翻訳系に投入してタンパク質を合成する際に、ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質とを連結するヒンジあるいは連結部の役割をする。すなわち、ｍＲＮＡにスペーサーを介してピューロマイシンを結合したものと翻訳系を接触させると、そのｍＲＮＡがピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質と結合したＩｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓビリオンが生成することが知られている（Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）参照）。ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似している、下記式（Ｉ）：
に示される化合物で、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する。本明細書中、「ピューロマイシン様化合物」とは、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似し、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物をいう。
ピューロマイシン様化合物としては、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＡＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。なお、上記ピューロマイシン以外に好ましく用いられるピューロマイシン様化合物は、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などであり、下記にその化学構造式を示す。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体においては、ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物（以下、単に「ピューロマイシン」と称する）は、通常、スペーサーを介して連結される。また、この連結体は、通常、このスペーサーに設けられた固相結合部位を介して固相に固定化される。スペーサーは、主として、ピューロマイシンをリボソームのＡサイトと呼ばれる部位に効率良く取り込ませるために用いられる。したがって、スペーサーとしては、そのような性質を有する限り特に限定されないが、柔軟性があり、親水性で、側鎖の少ない単純な構造を有する骨格を有するものが好ましい。具体的には、ここで用いられるスペーサーとして、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ含む）、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリスチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを主骨格として含むものが好ましく用いられる。上記直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、適宜、それらを適当な連結基（−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［ｎは例えば１〜１０、好ましくは１〜３］、−Ｓ−、−ＳＯ−など）で化学的に連結することができる。
ｍＲＮＡとスペーサーとの連結は、公知の手法を用いて直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、ＤＮＡをスペーサーとして用いる場合は、ｍＲＮＡの３’末端にそのＤＮＡスペーサーの末端と相補的な配列を設けておくことにより、両者を連結することができる。また、スペーサーとピューロマイシンを連結する場合は、通常、公知の化学的手法によって連結される。
なお、タンパク質を合成した後に、ｍＲＮＡ−ＰＭ−タンパク質の複合体を固相から切り離す必要がある場合は、スペーサー中に切断可能部位を設けると好ましい。ＤＮＡをスペーサーの一部に用いた場合は、そのような切断可能部位として、ＤＮＡ鎖中に制限酵素認識部位を設けることができる。このような制限酵素認識部位をもつスペーサーを用いた場合は、タンパク質合成後など所望の時に、制限酵素（例えば、ＡｌｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩなど）を投入することによって、ｍＲＮＡ−ＰＭ−タンパク質の複合体を固相から切り離すことができる。制限酵素認識部位とその部位を切断する酵素の組合せは公知である（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ２０００・０１ Ｃａｔａｌｏｇ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ等参照）。
なお、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体には、必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、スペーサー又はピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。
２．ｍＲＮＡの固相固定化方法
本発明の別の態様によれば、上記のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いて、ｍＲＮＡを固相に固定化する方法が提供される。すなわち、本発明のｍＲＮＡの固相固定化法は、
（ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を調製する工程、及び、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定する工程
を含む。
ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体が固定される固相は特に限定されず、その連結体が使用される目的に応じて適宜選択される。本発明で用いられる固相としては、生体分子を固定する担体となるものを用いることができ、例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ；ガラス基板、シリコン（石英）基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。なお、本明細書では、上記ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体がビーズに固定されたものを「ｍＲＮＡビーズ」という。本発明の好ましい態様においては、ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体がビーズに固定してなるｍＲＮＡビーズを提供する。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体は、ｍＲＮＡが翻訳系と接触する際に、その翻訳の障害とならないように固相に固定されれば、その固定化手段は特に限定されない。通常は、ｍＲＮＡとＰＭを連結するスペーサーに固相結合部位を設け、その固相結合部位を、固相に結合させた「固相結合部位認識部位」を介して、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定する。固相結合部位は、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を所望の固相に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、このような固相結合部位として、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、リガンド、抗体など）が用いられ、この場合は、固相表面には固相結合部位認識部位として、その分子と結合する特定のポリペプチドを結合させておく。固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せの例としては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。
上記タンパク質の固相表面への結合は、公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を挙げることができる（Ｐ．Ｍ．Ａｂｄｅｌｌａ，Ｐ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．Ｒｏｙｅｒ，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８７，７３４（１９７９）等参照）。
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレンビーズ、スチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてスペーサーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。なお、本発明においては、固定手段については上記の方法に限定されることなく、当業者に公知である如何なる固定手段をも利用することができる。
３．タンパク質の固相固定化方法及びタンパク質の固相合成方法
本発明の別の態様によれば、タンパク質の固相固定化又は固相合成法であって、上記（ｂ）工程の後に、（ｃ）該ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体と翻訳系とを接触させることにより（例えば、該連結体に翻訳系を投入、あるいは該連結体を翻訳系に投入）、タンパク質を合成する工程を含む、タンパク質の固相固定化又は合成法が提供される。工程（ｂ）において、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体が固相に固定されているので、この連結体を翻訳系に投入した際に、前述のｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉｒｕｓ法の対応づけ技術を利用して、合成されたタンパク質がピューロマイシンを介して固相に固定化されるのである。
上記（ｃ）工程では、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を翻訳系と接触させることによって、タンパク質の合成を行う。ここで用いることができる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる（Ｌａｍｆｒｏｍ Ｈ，Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ Ｍ．Ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ Ｕ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７ ２７（１）：１−６等参照）。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。本発明においては、取り扱いの容易さから、無細胞系を使用することが好ましい。
ここで、図１に基づいて、本発明のｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いたタンパク質の固定化について簡単に説明する。図１ａは保存時の固定化ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を示す図、図１ｂは無細胞翻訳系を投入し、タンパク質が合成されている状態を示す図、図１ｃはタンパク質の合成が終了した状態を示す図である。図１ａに示すように、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体１は、ｍＲＮＡ１ａとピューロマイシン１ｂが、ＤＮＡスペーサー１ｃを介して連結されたもので、固相結合部位１ｄを介して固相２に結合されている。固相２は、後に、無細胞翻訳系を投入することを考慮して容器の形状をしている。図１ｂに示すように、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体１に、無細胞翻訳系３を投入すると、ｍＲＮＡと無細胞翻訳系を利用した翻訳反応によって、そのｍＲＮＡの核酸配列に対応するタンパク質４が合成される。翻訳終了後は、不要な無細胞翻訳系３の成分を除去し、タンパク質４がピューロマイシン１ｂに結合した、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質複合体が、固相２に固定された状態で形成される。なお、このようなｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質複合体（連結体）に、例えば、標的物質を接触させることによって、合成されたタンパク質と結合し得る標的物質をスクリーニングすることができる。
４．ｍＲＮＡチップ及びプロテインチップ
本発明の別の態様によれば、上記した固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を複数含むｍＲＮＡチップ（ｍＲＮＡマイクロアレイ）に関する。即ち本発明は、本発明の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体をマイクロアレイ用基板に固定してなる、ｍＲＮＡチップを提供する。このｍＲＮＡチップは、上述したｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を複数基板上に固定化したものである。なお、上記「複数」とは、特にその上限の値は制限されるものではないが、通常マイクロアレイとして用いられるチップ上に固定可能な実用的な数を指す。このｍＲＮＡチップを翻訳系に投入することにより、あるいは、翻訳系をｍＲＮＡチップに投入することにより、上述のタンパク質合成がチップ上で起こり、各タンパク質が固相に結合した、いわゆるプロテインチップが作製される。このようにして作製されるプロテインチップもまた、本発明に含まれる。
本発明のｍＲＮＡチップにおいては、機能既知のタンパク質をコードするｍＲＮＡ複数を、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体として固相に固定してもよいし、機能未知のタンパク質をコードするｍＲＮＡ複数をｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体として固相に固定してもよい。例えば、疾病に関与する機能既知のタンパク質をコードするｍＲＮＡを複数チップに固定する場合は、例えば、疾病の診断用ｍＲＮＡチップ、タンパク質相互作用解析用ｍＲＮＡチップ等とすることができる。診断用チップとして用いる場合は、ある特定の疾病の診断マーカーと結合するタンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれプレートの所定の位置に固定しておく。そして、診断を行う直前にこのプレートに無細胞翻訳系を投入して、プレート上の所定の位置に所望の診断マーカーと結合するタンパク質を合成し、固定する。このようにすれば、診断の直前にプロテインチップを作製することができる。プロテインチップは、その保存上あるいは取り扱い上に問題がある。不安定なプロテインの代わりに安定なｍＲＮＡの形でチップ化した点は、本発明の特徴の一つと言える。ゆえに、ｍＲＮＡの固相固定化及びタンパク質の合成・固定化以外の技術（例えば、使用するプレートの材料・サイズ、使用するプロテインの種類・配置、プロテインチップを用いたタンパク質の機能解析方法等）は、公知のプロテインチップの技術をそのまま利用することができる（Ｋｕｋａｒ Ｔ，Ｅｃｋｅｎｒｏｄｅ Ｓ，Ｇｕ Ｙ，Ｌｉａｎ Ｗ，Ｍｅｇｇｉｎｓｏｎ Ｍ，Ｓｈｅ ＪＸ，Ｗｕ Ｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；３０６（１）：５０−４等参照）。なお、上記ｍＲＮＡビーズ又は上記ｍＲＮＡチップと無細胞翻訳系を含む診断キット、あるいは、タンパク質相互作用解析用キットも本発明の範囲内である。このようなｍＲＮＡチップを用いることによって、タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、リガンドの探索、疾病マーカーの探索、疾病の診断、薬効評価、薬物動態の評価などに利用することができる。
また、本発明の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系と接触させることによって合成されるタンパク質が、上記連結体へ付加された構造からなる連結体（「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」と記載する）も、本発明に含まれる。即ち本発明は、本発明の「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体」を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質（ポリペプチド）が、該連結体におけるピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を介して連結してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体に関する。該連結体は、例えば、後述の「タンパク質と標的分子との相互作用を解析する方法」に好適に用いることができる。また上記連結体の一つの態様としては、上述のように、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体がマイクロアレイ用基板へ固定された構造のプロテインチップを例示することができる。
また本発明の好ましい態様においては、上記「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を、逆転写反応系へ供する（逆転写反応系と接触させる）ことにより、該ｍＲＮＡの逆転写産物である相補的ＤＮＡ（該ｍＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ）を合成することが可能である。例えば、本発明の上記スペーサーとして、ｍＲＮＡの３’末端配列と相補的な配列を含むＤＮＡスペーサーを用いる場合、該相補的な配列が該ｍＲＮＡの逆転写反応においてプライマーとして機能することが期待される。即ち、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を逆転写反応系へ供することにより、該プライマーを合成起点とするＤＮＡ合成反応が開始され、該ｍＲＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡが合成される。このようにして合成されるＤＮＡを含む連結体（「ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」と記載する）もまた、本発明に含まれる。即ち本発明は、本発明の「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を、逆転写反応系へ供して合成される該ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡが、該連結体と結合してなる、固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を提供する。
本発明の上記連結体においてピューロマイシンと連結される核酸分子は、通常、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡとの二本鎖核酸分子であるが、当該核酸分子におけるｍＲＮＡは、その後のヌクレアーゼ反応等によって消化されていてもよい。即ち、一本鎖の（ｍＲＮＡと相補的）ＤＮＡ分子がピューロマイシンと連結された構造からなる「固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」もまた、本発明の連結体の一つの態様である。さらに、本発明の上記連結体において、ピューロマイシンと連結される核酸分子は、該ＤＮＡと相補性を有するＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡであってもよい。
なお、本発明において「逆転写反応系」とは、ｍＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する所謂「逆転写」を司る反応系をいい、当該反応系は通常、逆転写酵素を含有する。本発明の逆転写反応は、当業者においては、適宜実施することが可能である。より具体的には、後述の実施例に記載の方法により行うことができる。
５．タンパク質と分子との相互作用を解析する方法
本発明の別の態様によれば、上記したｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を用いたタンパク質と分子との相互作用を解析する方法が提供される。この解析方法は、
（ａ）一以上の本発明の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を、翻訳系に投入し、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｃ）該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程を含む。
この解析方法は、例えば、（ｉ）配列既知のタンパク質に作用する物質をスクリーニングする場合、（ｉｉ）ある特定の物質（例えば、リガンド）が結合する配列未知のタンパク質をスクリーニングする場合等に用いることができる。例えば、（ｉ）の場合は、配列既知のタンパク質（例えばオーファンレセプタータンパク質）をコードする核酸配列を有するｍＲＮＡとピューロマイシンとの連結体を複数用意しておき（すなわち、複数のオーファンレセプタータンパク質に対応するｍＲＮＡをそれぞれ有するｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を複数用意）、これを翻訳系に投入する。すると、各ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体のｍＲＮＡから複数のオーファンレセプタータンパク質が合成される。各オーファンレセプタータンパク質は、固相に固定されたｍＲＮＡ−ＰＭ連結体のピューロマイシンにＣ末端が結合することによって固定される。必要に応じて、不要な成分を洗浄除去し、これに標的物質及びバッファー等を加えて、標的物質をオーファンレセプタータンパク質に結合させることによって、結合実験を行う。（ｉｉ）の場合は、例えば、ある遺伝子ライブラリーから複数のｍＲＮＡを取得し、複数のｍＲＮＡとピューロマイシンとの連結体を作成し、固相に固定する。以下、同様にタンパク質の合成を行い、標的物質をそのタンパク質に接触させて結合実験を行う。
上記工程（ｂ）においては、工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる。ここで用いられる「標的物質」とは、本発明において合成されるタンパク質と相互作用するか否か調べるための物質を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。
タンパク質としては、特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、特に制限されることはなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、特に制限されず、機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
なお、これら標的物質とタンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられる。
ここで用いられる標的物質は、必要に応じて標識物質により標識して用いることができる。必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、標的物質に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。これらの標識物質は、標的物質と固定化タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。上記標識物質の標的物質への結合は、公知の手法に基づいて行うことができる。
次いで、本解析方法によれば、工程（ｃ）において、該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する。該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行う。そのような測定手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））、エバネッセント場分子イメージング法（Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５））、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））、蛍光偏光解消法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））、及び蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））等が挙げられる。
本発明の解析方法においては、必要に応じて、さらに、工程（ｃ）において相互作用していると判断されたタンパク質−標的物質結合体中の、タンパク質及び／又は標的物質を同定する。タンパク質の同定は、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともできるし、該タンパク質に結合しているｍＲＮＡからＤＮＡを逆転写し、得られたＤＮＡの塩基配列を解析することによって行うこともできる。標的物質の同定は、ＮＭＲ、ＩＲ、各種質量分析などによって行うことができる。なお、本発明のｍＲＮＡチップ及びプロテインチップを用いて、タンパク質−タンパク質間相互作用を解析する場合は、通常のプロテインチップ上のサンプル解析と同様に、飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いることができる。
また本発明の上記方法は、上記工程（ａ）に続いて、工程（ａ）において合成されるｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を逆転写反応系へ供することにより、該連結体におけるｍＲＮＡと相補的なＤＮＡを含有する連結体（ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体）を作製し、上述のその後の工程を実施させてもよい。即ち本発明の好ましい態様においては、以下の工程を含むタンパク質と分子との相互作用を解析する方法を提供する。
（ａ）一以上の、本発明のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と、逆転写反応系とを接触させて、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｄ）該連結体におけるタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の固定ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を用いてタンパク質を合成・固定化する方法を示す概略図である。
図２は、実施例１及び２で使用した２種類の遺伝子を示す図である。
図３は、ＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎまたはＧＦＰのｍＲＮＡへ、ピューロマシン付きスペーサーＤＮＡを共有結合させたものの概略図を示す図である。
図４は、実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
図５は、実施例２において、ビーズの上で翻訳させたＧＦＰの蛍光を顕微鏡下で観察した写真である。
【符号の説明】
１：固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、１ａ：ｍＲＮＡ、
１ｂ：ピューロマイシン、１ｃ：ＤＮＡスペーサー、
１ｄ：固相結合部位、２：固相、３：無細胞翻訳系、
４：タンパク質。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
１．スペーサーＢｉｏＬｏｏｐ−Ｐｕｒｏ（以下“ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ”と略す）の合成
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ［配列；５’−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’、ＢＥＸ社より購入］１０ｎｍｏｌを、１００μｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かし、１００ｍＭ ＴＣＥＰを１μｌ加え（ｆｉｎａｌ １ｍＭ）、室温で６時間放置し、Ｐｕｒｏ−Ｆ−ＳのＴｈｉｏｌを還元した。架橋反応を行う直前に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ５（アマシャム、１７−０８５３−０２）を用いてＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を除いた。なお、Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓの配列中、（Ｓ）は５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６、（Ｆ）はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＴ、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ ＣＰＧ、Ｓｐａｃｅｒ１８はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅａｒｃｈ社製のスペーサー（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）で次の化学構造を有する。
０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに、５００ｐｍｏｌ／μｌ Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ［（５６ｍｅｒ）配列；５’−ＣＣＣＧＧ ＴＧＣＡＧ ＣＴＧＴＴ ＴＣＡＴＣ（Ｔ−Ｂ）ＣＧＧＡ ＡＡＣＡＧ ＣＴＧＣＡ ＣＣＣＣＣ ＣＧＣＣＧ ＣＣＣＣＣ ＣＧ（Ｔ）ＣＣＴ−３’（配列番号１、ＢＥＸ社より購入），（Ｔ）：Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ，（Ｔ−Ｂ）：Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＴ（アンダーラインは制限酵素ＰｖｕＩＩのサイトを示す）］２０μｌ、１００ｍＭ架橋剤ＥＭＣＳ（３４４−０５０５１；６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）２０μｌ、を加え、良く攪拌した後、３７℃で３０分放置した後に、未反応のＥＭＣＳを取り除いた。沈殿を減圧下で乾燥させた後、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０μｌに溶かし、上記の還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ（〜１０ｎｍｏｌ）を加えて４℃で一晩放置した。サンプルに最終で４ｍＭになるようにＴＣＥＰを加え室温で１５分放置した後、未反応のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓをエタノール沈殿で取り除き、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐを取り除くために以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った。
カラム；ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ ＣＳＯＭＯＳＩＬ ３７９１８−３１ １０ｘ２５０ｍｍ Ｃ１８−ＡＲ−３００（Ｗａｔｅｒｓ）
ＢｕｆｆｅｒＡ；０．１Ｍ ＴＥＡＡ、ＢｕｆｆｅｒＢ；８０％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速；０．５ｍｌ／ｍｉｎ（Ｂ％：１５−３５％ ３３ｍｉｎ）
ＨＰＬＣの分画は１８％アクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、６２℃）で解析し、目的の分画を減圧下で乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理水で溶かして、１０ｐｍｏｌ／μｌにした。
２．固相上での翻訳（ＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎ）
２−１ 実験に使用する遺伝子のｍＲＮＡを合成
５’側にＴ７、Ｃａｐ、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列、３’末端に６ｘヒスチジンタグをもち、終止コドンを削ったＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎ（３７１ｂｐ；配列番号２）及び５’末端にＴ７、Ｃａｐ、Ｋｏｚａｋ配列をもち終止コドンを削ったＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（７１７ｂｐ；配列番号３、Ｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９：２６４（２）：５５６−６０に記載の変異体）をクローニングし使用した。共に、スペーサーＤＮＡの一部と相補的であるタグ配列（５’側−ａｇｇａｃｇｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇａａａ（配列番号４）、アンダーラインはスペーサー配列と相補的な部分）を含むように設計したプライマーでＰＣＲ反応を行うことで、３’末端にタグ配列をもつＤＮＡを得た。ＰＣＲ反応はＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社）１ユニットを５０μｌのＰＣＲ反応液に加え、鋳型ＤＮＡは１ｆｍｏｌ加え、下記プライマーを用い、下記条件で行った。
［条件］熱変性９５℃ ２分の後、熱変性９５℃ ３０秒、
アニーリング６９℃ １５秒、伸長反応７２℃ ４５秒
のサイクルを３０回繰返し
得られたＤＮＡの構成を図２に示す。後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐ１３００）でｍＲＮＡを合成した。転写は、プロメガ社のキット付属のプロトコルに従いＤＮＡ１μｇ、２０μｌスケールで次のように行った。すなわち、３７℃で一時間放置した後、キット付属のＤＮａｓｅ（ＲＱ１ ＤＮａｓｅ）を１ユニット加え、さらに３７℃で１５分放置した。合成の際、プロメガ社のプロトコルに従い、ｍ７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐ１７１１）を加えた。５’キャップアナログがついたｍＲＮＡは、ＤＮａｓｅ、フェノール・クロロフォルム処理した後、ＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で精製し定量した。
２−２ ｍＲＮＡとＰＭ付きスペーサーＤＮＡの結合
５’キャップ及び３’にタグ配列を持ったｍＲＮＡ ３００ｐｍｏｌに、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを３００ｐｍｏｌ、１０ｘＬｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）６μｌ、ＤＭＳＯ ２．５μｌ、を加え５５μｌになるようＤＥＰＣ処理水を加えた。熱湯上で８５℃から３５℃へ２０分かけてアニーリングし、１５ｕｎｉｔ Ｔ４ Ｐｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ、２．５μｌ）、１００ｕｎｉｔ Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ、２．５μｌ）を加え、２５℃４５分反応させた。サンプルをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，７４１０４）で処理した後、さらにＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｍｏｖｅｒで精製した。
図３に、ＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎまたはＧＦＰのｍＲＮＡへ、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを共有結合させたものの概略図を示す。図３中、Ｐはピューロマイシン、ＦはＦＩＴＣ、Ｂはビオチン、ＡＴＣＧｕはＤＮＡ、ＲＮＡシーケンスを示している。大文字で示した部分は制限酵素ＰｖｕＩＩサイト（四角枠で囲った部分）を含むＤＮＡ部分、小文字で示した部分はｍＲＮＡで、３’末端側のＤＮＡと相補鎖を形成している部分がＴａｇ配列に結合している。ＲＮＡの３’末端とＤＮＡの５’末端は“Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ”と示した部分でライゲートされている。
２−３ ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体のビーズ上への結合
上記のように合成した、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を、直径２．３μｍ±０．３μｍのアビジンビーズ（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、ＴａＫａＲａ、９０８８）へ、添付のプロトコルに基づき以下のようにして結合させた。
６０μｌのアビジンビーズを２００μｌの１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）で２回、マグネットスタンドを用いてアビジンビーズを沈殿させ、上清を交換することで洗浄した。洗浄後、沈殿させたビーズへ、上記２−２で合成したＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を４８ｐｍｏｌ加え、１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）を合計で１２０μｌになるように加え、１０分間室温で静置した。その後、上記のように、２００μｌの１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）でビーズを洗浄することで、ビーズに結合しなかったＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を取り除いた。さらに、２０ ｘ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ）１０μｌ、ＤＥＰＣ処理水１９０μｌを加え、同様にビーズを洗浄した。
２−４ 翻訳
上記のビーズをマグネットスタンド上で沈殿させ、無細胞翻訳系（Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ社，１２００）を３００μｌ分加え、３０℃１５分翻訳反応を行った。その後、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌをそれぞれ最終で６３ｍＭ、７５０ｍＭになるように加えて３７℃で１．５時間放置した。サンプルは、約１時間毎に軽く攪拌した。上記のようにビーズを沈殿させ、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ社、２６９４）２０ｕｎｉｔを含んだ１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）２００μｌで２回ビーズを洗浄した。
２−５ 逆転写
洗浄後、上記と同様にして沈殿させたビーズに対して、ＴａＫａＲａ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社添付のプロトコルに従い、８０μｌのスケールで逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ（ＴａＫａＲａ、２６４０Ａ）を用いて４２℃１０分間、逆転写反応を行った。その後に上記と同様にして、１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）２００μｌでビーズを洗浄した。
２−６ ビーズからＤＮＡ−タンパク質を回収
沈殿させたビーズに対して、添付のプロトコルに従い、４０μｌのスケールで２４ｕｎｉｔの制限酵素ＰｖｕＩＩ（ＴａＫａＲａ）で３７℃１時間放置することでビーズ上のＤＮＡ−タンパク質をビーズから切り離す処理を行った。ここでは特に、ビーズとＤＮＡ−タンパク質の非特異的な吸着を避けるために、ＢＳＡを最終０．１ｍｇ／ｍｌになるように加えた。その後、上記と同様にしてビーズを沈殿させ、上清を新しいサンプルチューブに移した。逆転写の際、テンプレートとなったｍＲＮＡがＤＮＡ−タンパク質のＤＮＡの部分と相補鎖を作ったままなので、その上清にＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ４２８１）を２ｕｎｉｔ加え、３７℃、２０分反応させることで逆転写後に残っているｍＲＮＡ部分を分解した。
２−７ Ｈｉｓタグ精製
Ｑｕｉａｇｅｎ社のプロトコルに従い、サンプルを等量のＬｙｓｉｓバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ １０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％，ｐＨ８．０）に希釈し、２０μｌのＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡ ＭａｇｎｅｔｉｃＡｇａｒｏｓｅＢｅａｄｓ、ＱＩＡＧＥＮ社、３６１１１）を加え、室温で４０分攪拌しながら放置した。上記と同様にしてマグネットスタンドでＮｉ−ＮＴＡビーズを沈殿させ、１００μｌのＷａｓｈバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ２０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％，ｐＨ８．０）で軽く洗浄した。ビーズを沈殿させた後、Ｅｌｕｔｅバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４ ５０ｍＭ，ＮａＣｌ ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ２５０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％，ｐＨ８．０）を１５μｌ加え１分間室温で放置し、ＤＮＡ−タンパク質を溶出させた。同様にしてビーズを沈殿させ、ＤＮＡ−タンパク質が溶出した上清をとりわけ、６Ｍ尿素を含んだ５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ゲルのバンドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（Ｂｉｏ ＲＡＤ ｃｏ．）でＦＩＴＣの蛍光を可視化することで定量した。得られた結果を図４に示す。
３．固相上でのタンパク質合成（ＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｂ−ｄｏｍａｉｎ）の結果
図４ａは、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を無細胞翻訳系に加え、溶液中で（通常どおりに）ｍＲＮＡ−タンパク質の複合体を作成した結果であり、ＦＩＴＣの蛍光を可視化したものである。レーン１は翻訳前、２は翻訳後である。翻訳反応後現れた“ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ”と示した位置のバンドは、その分子量から判断して、スペーサーＤＮＡのピューロマイシンを介して、ｍＲＮＡとそのｍＲＮＡがコードするタンパク質が共有結合された複合体であると考えられる。“ｇｅｎｏｍｅ”と記した位置のバンドは、タンパク質が結合していない、スペーサーＤＮＡ、ｍＲＮＡの複合体である。
ビーズ上で翻訳、逆転写反応を行い、制限酵素でビーズから切り離し回収したものも同様に、２本のバンドが観察され（レーン１）、高分子量のバンド（矢じり）が目的とするＤＮＡ−タンパク質の共有結合体、低分子量の太いバンドはタンパク質がつかなかったものであると考えられる（図４ｂ）。このことは、タンパク質のＣ末端側に導入した６ ｘ Ｈｉｓ−ｔａｇで精製した結果、高分子量のバンドのみが溶出されたことから確認される（レーン２、３）。また、この結果は、ここで合成・固定化されたＤＮＡ−タンパク質複合体のタンパク質部分は、通常液相で合成されるタンパク質同様、完全長が合成されたことを示すものである。
これらの結果から、固相上に、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを介してｍＲＮＡを固定し、そこに無細胞翻訳系を加える方法で、そのｍＲＮＡがコードしているタンパク質を翻訳直後に自動的に固相上に固定化できることが示された。
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＦＩＴＣの蛍光で可視化したバンドを基に回収されたＤＮＡ−タンパク質複合体の量を計測した結果、固相上で合成され制限酵素で切り離し回収した時点でのＤＮＡ−タンパク質（図４ｂ矢じり）は、加えたｍＲＮＡの０．４％、さらにＨｉｓ−ｔａｇ精製し抽出されたもの（図４ｂ“ＤＮＡ ｖｉｒｕｓ”）は、加えたｍＲＮＡの０．１％だった。
〔実施列２〕固相上で合成されたタンパク質の機能を検出（ＧＦＰ）
１．スペーサーがついたｍＲＮＡをビーズ上へ固定
実施例１の２−３と同様にＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体をアビジンビーズに固定した。ＧＦＰの蛍光を観察するために、スペーサーＤＮＡは上記２で用いたものとは違い、Ｐｕｒｏ−Ｓ［配列；５’−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’、（Ｓ）：５’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６、（Ｐｕｒｏ）：Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ＣＰＧ、ＢＥＸ社より購入］で同様に合成したものを使用した。アビジンビーズはＢａｎｇｓ社の直径４６０ｎｍのものを使用し、以下のようにしてビーズ上に固定化した。
１０μｌ分のビーズを１００μｌの０．５ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，５００ｍＭ ＮａＣｌ）で２度洗浄した。洗浄は、ビーズを含んだ溶液を１５，０００ｒｐｍ ５分間４℃で遠心分離し、上清を液交換することで行った。洗浄したビーズの沈殿に、実施例１の２−２と同様の方法で合成した、８ｐｍｏｌのＰＭ付きスペーサーＤＮＡとＧＦＰのｍＲＮＡの複合体を加え、１ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで４０μｌになるように希釈し、室温で１５分静置してビーズに結合させた。上記のようにして１００μｌの０．５ ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１度洗浄し、ビーズに結合しなかったｍＲＮＡを取り除いた。さらに、２０ ｘ ＴｒａｎｓＬａｔｉｏｎＭｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ社）１０μｌ、ＤＥＰＣ処理水１９０μｌを加え、同様にビーズを洗浄した。
２．翻訳
遠心分離で沈殿させたビーズへ無細胞翻訳系（Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ社，１２００）を２０μｌ分加え、３０℃３０分反応させた後、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌをそれぞれ最終で６３ｍＭ、７５０ｍＭになるように加え、２５℃で２時間放置した。サンプルは、約１時間毎に軽く攪拌した。１５，０００ｒｐｍ ６分遠心分離によりビーズを沈殿させ、上記と同様にして遠心分離により、リン酸ＮａＣｌバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で２回ビーズを洗浄した。沈殿させたビーズを２０μｌリン酸ＮａＣｌバッファーに懸濁し、氷上で保存した。
３．顕微鏡下での観察
上記のビーズを含む懸濁液を５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０でさらに１／５に希釈し、活性酸素除去のための酵素系（２５ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ，２．５μＭ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ，１０ｎＭ ｃａｔａｌａｓｅ，１０ｍＭ ｄｉｔｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）存在下で顕微観察を行った。顕微鏡はＮｉｃｏｎ、ＴＥ２０００を用い、４７３ｎｍ ０．３５ｍＷの対物エバネッセント照明で励起し、ＧＦＰの蛍光を冷却ＣＣＤカメラＯＲＣＡ−ＥＲ（浜松フォトニクス）で１．０４秒の露光で撮影した。ネガティブなコントロールとして、実施例１の３−１及び３−２と同じ方法で並列してビーズにスペーサーＤＮＡのみを同じ濃度で結合させ、同じ条件で観察を行った。観察結果を図５に示す。図５は、ビーズの上で翻訳させたＧＦＰの蛍光を顕微鏡下で観察した写真である。ビーズ（直径４６０ｎｍ）の明視野像に、４７３ｎｍのレーザーで励起したときの蛍光像を重ね合わせた。図５ａは、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとＧＦＰのｍＲＮＡの複合体８ｐｍｏｌを１０μｌ分のアビジンビーズに結合させ翻訳反応を行ったもの、図５ｂは、ＰＭ付きＤＮＡスペーサーのみ８ｐｍｏｌを１０μｌ分のアビジンビーズに結合させ、同じ条件で翻訳反応を行った結果の顕微観察像を示す。蛍光像は緑の擬似カラーで確認した。
４．結果
実施例１の結果をさらに、確かなものにするために、同じ方法でＧＦＰをビーズ上で翻訳し、翻訳されたビーズ上のＧＦＰの蛍光をエバネッセント顕微鏡下で直視することを試みた。その結果、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡのみをビーズに結合させ観察を行ったときに比べて優位に、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡにＧＦＰのｍＲＮＡをつないだ後ビーズに固定し翻訳させたビーズ上に、ＧＦＰの蛍光を観察することができた。したがって、目的とするタンパク質が固相で合成され固定されたことが再度確認された。
産業上の利用の可能性
以上説明したように、本発明によれば、ｍＲＮＡ及びタンパク質の固相固定化方法、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体、この連結体を含むｍＲＮＡビーズ又はｍＲＮＡチップ、このｍＲＮＡチップから作製されるプロテインチップなどを提供することができる。このようなｍＲＮＡチップは、保存が容易であるから、既存のプロテインチップと比較して極めて取り扱いが容易であるという利点がある。
また本発明は、上記固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質が、該ピューロマイシンと結合した構造の「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を提供する。該連結体は、タンパク質と相互作用し得る分子の解析あるいはスクリーニングに利用することができる。
さらに本発明は、上記「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を、逆転写反応系へ供することにより、該ｍＲＮＡの逆転写産物の相補的ＤＮＡが連結した構造の「固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体」を提供する。通常、ＲＮＡに比べてＤＮＡはより安定であることから、タンパク質相互作用解析において、該連結体を被検分子と接触させる際に、該連結体は非常に有用である。
また、本発明のｍＲＮＡチップは、各種疾病の診断マーカーを認識するタンパク質の合成に用いられるｍＲＮＡを固定することによって、各種疾病の診断に利用することができる。さらに、本発明のタンパク質の固相固定化又は合成方法は、タンパク質と分子との相互作用の解析にも好適に利用できる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体を固相に固定してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、ｍＲＮＡの３’末端にスペーサーを介してピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結したものである請求項１に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、前記スペーサーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている、請求項１又は２に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項４】
前記スペーサーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、請求項１〜３のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項５】
前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質が、該連結体におけるピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を介して連結してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体。
【請求項７】
請求項６に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を、逆転写反応系へ供して合成される該ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡが、該連結体と結合してなる、固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体をマイクロアレイ用基板に固定してなる、ｍＲＮＡチップ。
【請求項９】
請求項８記載のｍＲＮＡチップを用いて作製されるプロテインチップ。
【請求項１０】
ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体がビーズに固定してなるｍＲＮＡビーズ。
【請求項１１】
請求項８記載のｍＲＮＡチップ又は請求項１０記載のｍＲＮＡビーズ、及び無細胞翻訳系を含むタンパク質相互作用解析用キット。
【請求項１２】
（ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、及び、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程
を含む、ｍＲＮＡを固相に固定化する方法。
【請求項１３】
（ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程；及び
（ｃ）該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と翻訳系とを接触させることによって、タンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を固相に固定化する方法。
【請求項１４】
（ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程；及び
（ｃ）該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と翻訳系とを接触させることによって、タンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を固相で合成する方法。
【請求項１５】
タンパク質と分子との相互作用を解析する方法であって、
（ａ）一以上の、請求項１〜５のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｃ）該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
を含む上記解析方法。
【請求項１６】
タンパク質と分子との相互作用を解析する方法であって、
（ａ）一以上の、請求項１〜５のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と、逆転写反応系とを接触させて、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｄ）該連結体におけるタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
を含む上記解析方法。
【請求項１７】
さらに、相互作用していると判断されたタンパク質及び／又は標的物質を同定する工程を含む、前記請求項１５又は１６に記載の解析方法。
【請求項１】
ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体を固相に固定してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、ｍＲＮＡの３’末端にスペーサーを介してピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結したものである請求項１に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、前記スペーサーに設けた固相結合部位を介して固相に結合されている、請求項１又は２に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項４】
前記スペーサーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、請求項１〜３のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項５】
前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系へ供して合成される該ｍＲＮＡの翻訳産物のタンパク質が、該連結体におけるピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を介して連結してなる、固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体。
【請求項７】
請求項６に記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を、逆転写反応系へ供して合成される該ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡが、該連結体と結合してなる、固定化ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体をマイクロアレイ用基板に固定してなる、ｍＲＮＡチップ。
【請求項９】
請求項８記載のｍＲＮＡチップを用いて作製されるプロテインチップ。
【請求項１０】
ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物との連結体がビーズに固定してなるｍＲＮＡビーズ。
【請求項１１】
請求項８記載のｍＲＮＡチップ又は請求項１０記載のｍＲＮＡビーズ、及び無細胞翻訳系を含むタンパク質相互作用解析用キット。
【請求項１２】
（ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、及び、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程
を含む、ｍＲＮＡを固相に固定化する方法。
【請求項１３】
（ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程；及び
（ｃ）該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と翻訳系とを接触させることによって、タンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を固相に固定化する方法。
【請求項１４】
（ａ）固相結合部位を設けたスペーサーを介して、ｍＲＮＡとピューロマイシンを連結して、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を調製する工程、
（ｂ）該スペーサーの固相結合部位を固相に結合させることによって、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を固相に固定する工程；及び
（ｃ）該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と翻訳系とを接触させることによって、タンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を固相で合成する方法。
【請求項１５】
タンパク質と分子との相互作用を解析する方法であって、
（ａ）一以上の、請求項１〜５のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたタンパク質と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｃ）該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
を含む上記解析方法。
【請求項１６】
タンパク質と分子との相互作用を解析する方法であって、
（ａ）一以上の、請求項１〜５のいずれかに記載の固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体と、翻訳系とを接触させて、固相上でタンパク質を合成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において合成されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と、逆転写反応系とを接触させて、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体と一以上の標的物質とを接触させる工程；及び
（ｄ）該連結体におけるタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する工程；
を含む上記解析方法。
【請求項１７】
さらに、相互作用していると判断されたタンパク質及び／又は標的物質を同定する工程を含む、前記請求項１５又は１６に記載の解析方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００１０８６
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【発行日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１１２６（Ｐ２００５−５１１１２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９３９６
【国際出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【出願人】（５０４２１２８１７）有限会社ジーン・フィールド (2)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【発行日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９３９６
【国際出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【出願人】（５０４２１２８１７）有限会社ジーン・フィールド (2)
【Ｆターム（参考）】
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