増強した細胞結合性を有するＲＧＤエンリッチゼラチン様タンパク質
本発明は、天然ゼラチンと比較してＲＧＤ配列の均等な分布を有し、最低限レベルのＲＧＤ配列を有するＲＧＤエンリッチゼラチンを含むセルサポートに関する。具体的には、アミノ酸総数に対するＲＧＤ配列の割合が少なくとも０．４であり、ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合には、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含む。好ましくは、ＲＧＤエンリッチゼラチンは、組換え技術によって調製され、ヒトゼラチン又はコラーゲンアミノ酸配列に由来する配列を有する。本発明は、インテグリンの付着に使用されるＲＧＤエンリッチゼラチンにも関する。特に、本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、アンカー依存細胞を増殖するための細胞培養サポートをコーティングするのに適している。さらに、本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、医学的な適用、特に、インプラント又は移植材料のコーティングやドラッグデリバリーシステムの構成要素として使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリンへの結合に用いられるＲＧＤエンリッチゼラチンに関する。本発明はさらにＲＧＤエンリッチゼラチンでコーティングされたセルサポートにも関する。かかるセルサポートは、細胞培養の研究に使用されたり、アンカー依存細胞の細胞培養や、広い範囲の医薬用途に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞、特に哺乳類の細胞の培養は、ワクチン、酵素、ホルモン、抗体等の重要な（遺伝子組換えによる）生物材料の生産にとって重要である。動物細胞の大部分は、足場依存的（anchorage-dependent）であり、細胞が生存、増殖するには、ある表面に結合することが必要である。
【０００３】
足場依存的な細胞は、日常的に例えば組織培養用フラスコやローラーボトルの壁面で培養されてきた。いくつかの抗ウイルスワクチン、遺伝子改変したタンパク質及び他の細胞由来の製品を大量に提供することが必要になったため、細胞を大量に生産する新しいシステムを開発させるための改善が行われた。
【０００４】
かかる改善は、１９６７年にVan Wezel （Van Wezel, A. L. Nature 216:64-65 (1967)）によるマイクロキャリアの開発から始まった。Van Wezelは、三級アミノ基（ＤＥＡＥ）をチャージした、クロスリンクしたデキストランビーズからなるマイクロキャリアを製造した。Van Wezelは、攪拌した容器内の培養培地に懸濁した、かかる正電荷を有するＤＥＡＥ−デキストランビーズ上への細胞の付着と増殖を立証した。したがって、マイクロキャリアにおける細胞培養では、細胞は懸濁された小さな球に単層として増殖する。マイクロキャリアを使用することにより、１ミリリットルあたり数百万個の細胞といった収率を達成することができる。長年にわたって、様々なタイプのマイクロキャリアが開発されてきた。例えば、ガラスビーズやポリスチレンビーズが記載されている。初期のマイクロキャリアのようなクロスリンクしたデキストランは、依然として一番人気のあるビーズ材料である。
【０００５】
他の大量の培養方法と比較した、マイクロキャリア培養の利点として、以下のものが挙げられる。
i）容積に対する表面積の高い割合。これは、マイクロキャリアの密度を変化させることにより、変動可能であり、単位容積あたり高い細胞密度となり、高密度の細胞製品を得られる可能性がある。ii)多数の低生産性容器を使用せずに、単一の高生産性容器で細胞を伝播することができる。その結果、培地を有効に使用することができ、著しく節約することができる。iii)マイクロキャリア培養はよく混合されているため、ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２等の様々な環境条件を容易にモニター、制御することができる。iv)細胞のサンプリングを容易に行うことができる。v)ビーズを容易に設置できるので、細胞の回収及び製品のダウンストリーム処理を容易に行うことができる。vi)適切に改善された例えば醗酵槽等の従来の装置使用して、マイクロキャリア培養を比較的容易にスケールアップすることができる。
【０００６】
さらなる改善を行うときに、最適なマイクロキャリアは以下の要件をみたさなければならない。
i)ビーズの表面の特性は、細胞が迅速に付着し、増殖できなくてはならない。外形は均等であることが好ましい。ii)容易に単離できるように、ビーズの密度は、培養培地より若干高くなければならない。従来の天然の培養培地は水性であり、密度は１．０３〜１．０９ｇ／ｃｃである。しかし、密度は、１．０３〜１．０４５ｇ／ｍｌである適切な範囲を一定以上超えてはならない。剪断に感受性を有する細胞を傷つけないような緩やかな攪拌で、懸濁状態を維持することができ、ビーズが配置された場合には、細胞の増殖が抑制される。iii)ビーズのサイズの分布は、全てのマイクロキャリアの懸濁が達成され、細胞が同時にコンフルエントになるように、小さくなければならない。さらに、溶液内のマイクロキャリアのクラスター形成を防止しなければならない。iv) 光学特性は、顕微鏡で、容易に観察できなければならない。v)細胞の生存と増殖のためだけでなく、獣医学的又は臨床目的で使用される細胞培養製品のためにも、毒性であってはならない。vi）ビーズのマトリックスは、培養の攪拌中に起きる衝突が、ビーズを断片化しないようなものでなければならない。
【０００７】
改善されたマイクロキャリアにおける重要な変更としては、コア粒子がコラーゲンでコーティングされたことである。コラーゲンの利点は、コラーゲンが細胞の付着と、細胞の増殖両方のプロモーターである点である。さらに、タンパク分解酵素で細胞を容易に剥離することができる。また、細胞付着プロモーターであるフィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャリアについても記載されている。
【０００８】
結合に関与する細胞表面レセプターは、インテグリンとして同定されている。２０以上のインテグリンが知られており、それぞれ異なるリガンド特性を有する。多くのインテグリンは、アミノ酸配列ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を認識することができる。ＲＧＤ配列を含むことが知られているタンパク質の数は限定されており、およそ４００個と推測されている。また、発生するすべてのＲＧＤ配列が結合機能に関与している訳ではない。特に、ＲＧＤＳは細胞付着に関与していることが知られている。天然の未変性コラーゲンが、アミノ酸配列ＲＧＤを含むことは知られている。具体的な例としては、マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯＬ１Ａ１−３、ラットＣＯＬ３Ａ１、ヒトＣＯＬ１Ａ−１、ＣＯＬ２Ａ−１及びＣＯＬ１Ａ１−２が挙げられる。細胞が、コラーゲンに対する特異的な親和性を有するタンパク質フィブロネクチンを分泌するので、細胞のコラーゲンへの付着は、非常に特異的な機構を持つ。コラーゲンへの付着直後、フィブロネクチンは、細胞内のインテグリンタンパク質に結合する。
【０００９】
ゼラチンは、コラーゲンの分解産物であり、かかる用語は、５，０００〜４００，０００ダルトン超の分子量（ＭＷ）を有するタンパク質とペプチドとの不均一な混合物に関する。これらのゼラチンポリマーのいくつかの断片は、ＲＧＤモチーフ（RGD motive）を含むが、加水分解された分子のいくつかの断片はこのようなＲＧＤモチーフ（RGD motif）を含まない。
【００１０】
Burgess 及びMylesは、ペプチドからタイプＩコラーゲンを含むＲＧＤの化学共役について記載しており、かかる方法は、複雑で、標的物質に不純物を導入し、変更の自由が制限されている（Ann Biomed Eng 2000 Jan; 28(1):110-118）。
【００１１】
米国特許第５，５１２，４７４号は、細胞培養サポートの表面に細胞付着因子と、正電荷を有する分子を組み合わせることによって、良好な細胞付着を得ることを目的としている。フィブロネクチンは、細胞付着の中間物質として同定されている。
【００１２】
米国特許第５，５１４，５８１号は、ＤＮＡの化学合成の自動化法と、遺伝子組換技術とを組み合わせた、実質的に新しいポリペプチドの製造に関している。かかる特許は、既知で、天然発生のポリペプチドは適切でない、業務用に適用することができる非天然ポリペプチドに関して記載している。人工タンパク質が、ＲＧＤ配列を含むことがあるとはいえ、結果として生じるバイオポリマーは、天然発生タンパク質とあまり類似していないので、医学的な適用の際には、免疫学的な問題を起こすであろう。
【００１３】
細胞付着は、創傷治療（人工皮膚材料を含む）、骨や軟骨の成長（再生）、移植、人工血液材料等の医学的な適用にも重要な役割を演じている。したがって、医学的な適用においては、細胞付着の観点からは、物質が生体適合性のあるコーティングを有することがしばしば要求される。通常、コラーゲンが、米国特許第５，５１４，５８１号に記載されているものと比べて、構造的に好ましい。なぜなら、コラーゲンは抗原性が低く、皮膚及び骨又は軟骨の両方に存在しているからである。ゼラチンでコーティングされたマイクロキャリアが使用されているが、コラーゲンの多孔性マトリックスも使用されている。一例としては、ケラチノサイトを増殖するコラーゲンでコーティングしたビーズがあり、ケラチノサイトを含むビーズの移植が、創傷の治癒を早めることは、米国特許第５，９７２，３３２号に記載されている。細胞付着に関連した他の関心領域としては、細胞の付着レセプターのブロッキングである。例えば、付着レセプターをブロッキングすることにより、ガンの転移に影響又はそれを阻害することができる。ＲＧＤ配列を有する、より小さいペプチドが、細胞上の結合部位をブロックするために使用され、例えば欧州特許第０，６２８，５７１号に記載される凝集や凝固のような好ましくない相互作用を予防している。
【００１４】
しかしながら、細胞付着に関する適用の際に使用される物質のさらなる改善が、早急に必要である。フィブロネクチンが媒介する細胞付着メカニズムは、細胞を天然ゼラチンに付着させるために用いられる。しかし、天然ゼラチンは、プリオンやウイルス等の不純物の点から、安全ではない。細胞付着のＲＧＤ媒介メカニズムには、化学的又は遺伝子組換え技術によって産出される複数の人工バイオポリマーを用いる。しかし、これらの物質は、非天然の配列を有し、深刻な医学的問題を引き起こす免疫学的反応を引き起こす可能性がある。
【００１５】
「コラーゲン（collagen）」、「コラーゲンが関与する（collagen-related）」、「コラーゲン由来（collagen-derived）」等の用語は、当該技術でも使用され、「ゼラチン（gelatine）」、「ゼラチン様（gelatine-like）」タンパク質なる用語は、本明細書を通して使用される。天然ゼラチンは、５，０００〜４００，０００ダルトン超の分子量（ＭＷ）を有する個別ポリマーの混合物である。細胞付着（cell adhesion）と細胞接着（cell attachment）なる用語は、同義的に使用される。また、ＲＧＤ配列（RGD sequence）とＲＧＤモチーフ（RGD motif）なる用語も、同義的に使用される。
【特許文献１】米国特許第５，５１２，４７４号
【特許文献２】米国特許第５，５１４，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，９７２，３３２号
【特許文献４】欧州特許第０，６２８，５７１号
【非特許文献１】Van Wezel, A. L. Nature 216:64-65 (1967)
【非特許文献２】Ann Biomed Eng 2000 Jan; 28(1):110-118
【発明の開示】
【００１６】
本発明の目的は、改善された、好ましくは高度の細胞結合能力と選択性を有するポリペプチド又はペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、ウイルスや他の病原菌による感染、又はプリオン等健康に有害な物質の危険性のない、細胞結合ペプチド又はポリペプチドを提供することである。また、ヒトの免疫系と直接若しくは間接的に接触したときに免疫応答を誘引しないペプチド又はポリペプチドを提供することも、本発明の目的である。
【００１７】
驚くことに、これら全ての目的は、天然のゼラチンよりもＲＧＤ配列の均等な分布を有し、最低限レベルのＲＧＤ配列を有する、ＲＧＤエンリッチゼラチンによって達成された。ＲＧＤ配列レベルは、百分率で表す。この百分率は、ＲＧＤモチーフの数を、アミノ酸の総数で割り、商を１００倍して算出される。ＲＧＤモチーフの最大比率、すなわち、ＲＧＤモチーフのみで構成されるゼラチンにおいては、３３．３３である。また、ＲＧＤモチーフの数は、１、２、３・・・に始まる整数である。
【００１８】
本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、足場依存性の細胞タイプを増殖する細胞培養サポート（cell culture support）をコーティングするのに非常に適している。したがって、本発明は、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４であり、ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチは少なくとも１つのモチーフを含むＲＧＤエンリッチゼラチンを含む細胞培養サポートに関する。
【００１９】
本発明は、インテグリンに結合するためのＲＧＤエンリッチゼラチンで、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が、少なくとも０．４であり、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのモチーフを含み、かかるゼラチンが、１又は複数の未変性ヒトコラーゲン配列の少なくとも８０％からなり、未変性コラーゲン配列のかかる部分が少なくとも３０アミノ酸の長さを有している、ＲＧＤエンリッチゼラチンを提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンの、組織工学用の足場、又はインプラント若しくは移植材料のコーティング剤としての使用に関する。
【００２１】
さらに、本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、特に、インプラント若しくは移植材料、又はドラッグデリバリーシステムの組成物、ガン転移の抑制剤、血小板の凝集予防剤、アンチトロンビン剤（antithrombic agent）としての使用、組織接着剤としての使用、歯科製品、人工皮膚マトリックス材料としての使用、及び手術後の組織接着予防剤としての使用等、医学的用途にデザインされている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、細胞接着に非常に適している、医学的、生命工学的に適用できるペプチドポリペプチド又はタンパク質、特に、ゼラチン又はゼラチン様タンパク質に関している。さらに具体的に、本発明は、抗原性が低く、ウイルス、プリオン等の病原菌を伝達する危険性がなく使用できる細胞結合ペプチド又はポリペプチドに関している。
【００２３】
驚くことに、優れた細胞付着特性を有し、ＲＧＤエンリッチゼラチンの製造により、健康に関する危険性を示さないペプチド又はポリペプチドで、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４であるペプチド又はポリペプチドを得ることができることを見い出した。ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチは、少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含む。ＲＧＤモチーフの割合は、好ましくは、少なくとも０．６であり、より好ましくは少なくとも０．８、さらに好ましくは少なくとも１．０、さらに好ましくは少なくとも１．２、最も好ましくは少なくとも１．５である。かかる（組換え）ゼラチンは、生命工学的処理又は医学的用途に用いることができる細胞培養サポートをコーティングするのに、非常に適している。本発明に記載される「セルサポート（cell support）」は、細胞にその増殖や繁殖に対するサポートを与える物質である。
【００２４】
ＲＧＤモチーフの０．４という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のＲＧＤエンリッチ組換えゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００２５】
本発明に使用される「ＲＧＤエンリッチゼラチン」なる用語は、本発明のゼラチンが、１分子あたりのアミノ酸総数の割合として算出されたＲＧＤモチーフを一定レベル含み、天然ゼラチンと比べてアミノ酸鎖におけるＲＧＤ配列がより均等に分布されていることを意味する。現在までに、ヒトにおいて、タンパク質又はＤＮＡ配列情報から、２６の明確に区別できるコラーゲンの種類が見い出されている（K. Gelse et al, Collagens-structure, function and byosynthesis, Advanced Drug Delivery reviews 55 (2003) 1531-1546参照）。ヒト由来、非ヒト由来両方の天然ゼラチンの配列が、スイスプロット（Swiss-Prot）のタンパク質データベースに記載されている。以下に、適切なヒト天然配列を列挙する。それらは、スイスプロットのデータベースでエントリー名と最初のアクセッション番号で同定されており、本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンに含まれる天然配列の一部の起源として用いることができる。
【００２６】
ＣＡ１１＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２４５２）コラーゲンα１（Ｉ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１２＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２４５８）コラーゲンα１（II）鎖前駆物質［コンドロカルシンを含む］｛遺伝子：ＣＯＬ２Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１３＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２４６１）コラーゲンα１（III）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ３Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２４６２）コラーゲンα１（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１５＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２０９０８）コラーゲンα１（Ｖ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ５Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１６＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１０９）コラーゲンα１（VI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ６Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１７＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０２３８８）コラーゲンα１（VII）鎖前駆物質(長鎖コラーゲン)（ＬＣコラーゲン）｛遺伝子：ＣＯＬ７Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１８＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２７６５８）コラーゲンα１（VIII）鎖前駆物質(内皮コラーゲン)｛遺伝子：ＣＯＬ８Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１９＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２０８４９）コラーゲンα１（IX）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ９Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０３６９２）コラーゲンα１（Ｘ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１０Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｂ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１０７）コラーゲンα１（XI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１１Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｃ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ９９７１５）コラーゲンα１（XII）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１２Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｅ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ３９０５９）コラーゲンα１（XV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１５Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｆ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０７０９２）コラーゲンα１（XVI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１６Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｇ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ９ＵＭＤ９）コラーゲンα１（XVII）鎖（類天疱瘡抗原２）（１８０ｋＤａ類天疱瘡抗原２）｛遺伝子：ＣＯＬ１７Ａ１又はＢＰＡＧ２又はＢＰ１８０｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｈ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ３９０６０）コラーゲンα１（XVIII）鎖前駆物質（エンドスタチンを含む）｛遺伝子：ＣＯＬ１８Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｉ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ１４９９３）コラーゲンα１（IXI）鎖前駆物質（コラーゲンα１（Ｙ）鎖）｛遺伝子：ＣＯＬ１９Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２１＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０８１２３）コラーゲンα２（Ｉ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０８５７２）コラーゲンα２（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２５＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０５９９７）コラーゲンα２（Ｖ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ５Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２６＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１１０）コラーゲンα２（VI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ６Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２８＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２５０６７）コラーゲンα２（VIII）鎖前駆物質（内皮コラーゲン）｛遺伝子：ＣＯＬ８Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２９＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ１４０５５）コラーゲンα２（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ９Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２Ｂ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１３９４２）コラーゲンα２（XI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１１Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ３４＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０１９５５）コラーゲンα３（IV）鎖前駆物質（グットパスチャー抗原）｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ３｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ３５＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２５９４０）コラーゲンα３（Ｖ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ５Ａ３｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ３６＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１１１）コラーゲンα３（VI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ６Ａ３｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ３９＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ１４０５０）コラーゲンα３（IX）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ９Ａ３｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ４４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ５３４２０）コラーゲンα４（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ４｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ５４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２９４００）コラーゲンα５（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ５｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ６４＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ１４０３１）コラーゲンα６（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ６｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＥＭＤ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ９６Ａ８３）コラーゲンα１（XXVI）鎖前駆物質（タンパク質２を含むＥＭＩ領域）（Ｅｍｕ２タンパク質）（タンパク質２を含むエミリン（emilin）及びマルチメリン（multimerin）領域）｛遺伝子：ＥＭＩＤ２又はＣＯＬ２６Ａ１又はＥＭＵ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
【００２７】
天然ゼラチンが、ＲＧＤ配列を含むことは知られている。しかし、ゼラチン分子がＲＧＤモチーフの存在しない大きな部分を含まないことが重要である。ＲＧＤ配列の存在しない大きすぎる部分は、かかるゼラチンが例えばマイクロキャリアのコーティングとして用いられている場合に、細胞が付着する可能性を低くする。一見したところ、ゼラチンの全てのＲＧＤ配列は、どのような状況においても細胞付着が可能なわけではない。本発明のゼラチンは、３５０以上のアミノ酸のストレッチを有する、ＲＧＤ配列を含まないゼラチンと比較して、細胞付着が著しく改善していることを見い出した。３５０以下のアミノ酸のゼラチンにとって、ＲＧＤ配列の割合が、少なくとも０．４であれば十分である。つまり、２５１〜３５０のアミノ酸のゼラチンでは、少なくとも２つのＲＧＤモチーフが存在することを意味する。
【００２８】
より好ましい態様では、ＲＧＤエンリッチゼラチンは、遺伝子組換え技術によって調製される。本発明の組換えゼラチンは、好ましくはコラーゲン性配列に由来する。コラーゲンをコードする核酸配列は、当該技術において一般的に報告されている（Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259: 13668-13673; French et al. (1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol Chem 266: 16862-16869; Metsaranta et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1089:241-243; Wood et al. (1987) Gene 61: 225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J 253: 919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J 252: 633640; Ala-Kokko et al. (1989) Biochem J 260: 509-516参照のこと）。
【００２９】
薬学的、医学的用途には、天然ヒトコラーゲンのアミノ酸に関連若しくはそれと同一のアミノ酸配列を有する組換えゼラチンが好ましい。より好ましくは、本発明のゼラチンのアミノ酸は、ヒトコラーゲンの選択されたアミノ酸配列を繰り返し使用して、デザインされている。ＲＧＤモチーフを含む天然コラーゲン配列の一部が選択されている。このような選択された配列のＲＧＤモチーフの割合は、選択される配列の選択される長さに依存する。短い配列を選択すると、ＲＧＤの割合が高くなる。選択されるアミノ酸配列を繰り返し使用すると、高分子量で、（天然ゼラチン又はコラーゲンと比較し）抗原性がなく、ＲＧＤモチーフの数が増加したゼラチンとなる。天然の非ヒトの起源としては、ウシ、ブタやウマなどの非ヒト哺乳動物や、トリ、マウス、ラット及びサカナ等の他の動物が含まれる。
【００３０】
したがって、より好ましい態様では本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、未変性ヒトコラーゲン配列の一部を含む。好ましくは、ＲＧＤエンリッチゼラチンは、１又は複数の未変性ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分を少なくとも８０％含む。ヒトコラーゲン配列のかかる部分はそれぞれ、少なくとも３０アミノ酸の長さ、より好ましくは４５のアミノ酸、さらに好ましくは６０のアミノ酸、例えば２４０以下、好ましくは１５０以下、最も好ましくは１２０以下のアミノ酸の長さを有し、好ましくはそれぞれが１又は複数のＲＧＤ配列を含む。ＲＧＤエンリッチゼラチンは、好ましくは１又は複数の未変性ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなる。
【００３１】
本発明のゼラチンの適切な起源の１つの例として、ヒトＣＯＬ１Ａ１−１が挙げられる。ＲＧＤ配列を含む２５０のアミノ酸の一部は、配列番号１に示される。
【００３２】
ゼラチンのＲＧＤ配列は、インテグリンと呼ばれる細胞壁の特異的レセプターに付着することができる。これらのインテグリンは、細胞結合アミノ酸配列を認識する上で、その特異性により区別される。天然ゼラチンと、例えばフィブロネクチンとの両方ともに、ＲＧＤ配列を含むことができるが、ゼラチンは、フィブロネクチンに結合しない細胞に結合することができ、その逆もありうる。したがって、ＲＧＤ配列を含むフィブロネクチンは、細胞付着を目的として常にゼラチンの代わりになるものではない。
【００３３】
組換えによって産出されたゼラチンは、ゼラチンが由来する動物の病原菌で汚染されるという不利な点はない。
【００３４】
細胞培養サポートとして、またはそれと組み合わせて使用されるときには、ゼラチンは、細胞結合ポリペプチドとして機能する。その上で増殖する細胞によって代謝されうるという点で他のポリペプチドと比べて利点がある。さらなる利点は、容易な酵素的処理ができ、ほぼ１００％の収率で細胞を回収できることである。組換えによって産出されたゼラチンのさらなる利点は、分子量（ＭＷ）を一定に保てることである。製造方法にもよるが、天然ゼラチンは、分子量が５，０００ｋＤより小さいペプチドから、４００，０００ｋＤより大きいポリマーまで、幅広い範囲の分子量を不可避的に有する。特に、細胞培養サポートとして、マイクロキャリアコアビーズと組み合わせたときの、小さいペプチドの不利な点は、細胞が到達できないマイクロキャリアの細い孔内に付着し、その結果添加したゼラチンの一部分が使用されないことである。組換えによる製造方法では、ゼラチンを、所望の分子量でデザインすることができ、望まない物質の損失を防ぐことができる。
【００３５】
本発明のゼラチンはさらなる態様では、マイクロキャリアとして細胞培養サポートとなるコアビーズをコーティングするために、約３０ｋＤａ〜約２００ｋＤａの分子量を有する。
【００３６】
ＲＧＤ配列の存在に加えて、ゼラチンの分子量の範囲は、際立った利点を与え、さらに有利な特性を持つマイクロキャリアを提供する。マイクロキャリアコアビーズのコーティング処理における主要な問題は、ビーズの凝集である。特に、かかる凝集は、細胞付着が可能な表面積を減少させ、マイクロキャリアのサイズ分布を損ない、使用を不可能にする。
【００３７】
１つの天然ゼラチンバッチにおける高分子量のゼラチンポリマー分子の比較的小さい断片は、マイクロキャリア製造処理中のビーズの凝集に対して大いに関与している。このような高分子量のゼラチンポリマーがコアビーズに付着する場合、ペプチド鎖の一部がコアビーズの表面から離脱（point away）し、他のビーズの足場となり、その結果凝集が起きる可能性がある。
【００３８】
つまり、本発明にしたがって、２００ｋＤa以下、より好ましくは１５０ｋＤaの分子量を有するゼラチンでコアビーズをコーティングすることが好ましい。
【００３９】
さらに、天然ゼラチンの分子量の低い断片が、好ましくないマイクロキャリアのコーティング特性を示すことが見い出された。かかる低分子量の断片は、マイクロキャリアビーズに対し低い付着力を示したので、付着しない場合には、化学的クロスリンク段階後のマイクロキャリア凝集を促進する。さらに、凝集を予防するためにマイクロキャリアのコーティング処理において低濃度のゼラチンを用いる場合には、低分子量の断片は、先ずマイクロキャリアに付着するが、マイクロキャリアの多孔性コアビーズの小さな孔に入るという好ましくない特性を有する。その結果、細胞培養段階において、マイクロキャリアへの細胞の付着に寄与しない。したがって、ゼラチンの分子量は、コアビーズの凝集を防ぎ、ゼラチンの損失を防ぐ効果的なコーティングを効率的に行うために、十分に高くなければならない。したがって、ゼラチンの分子量は、３０ｋＤａ以上、好ましくは６０ｋＤa以上、最も好ましくは７０ｋＤa以上である。
【００４０】
ゼラチン又はゼラチン様タンパク質の分子量は均一であることが好ましい。７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらには少なくとも９８％のゼラチン又はゼラチン様タンパク質が、選択された分子量の２０％以内の均一な分子量を有することが好ましい。
【００４１】
上記の具体的範囲から分子量を選択することにより、コーティング処理中のゼラチン又はゼラチン様タンパク質コーティング溶液の粘着性を正確に制御することができる。できるだけ高いゼラチンの濃度を選択することにより、かかるゼラチン溶液の完全な、又はさらに重要なことには、部分的なジェル化（gelling）を防止することができる。
【００４２】
均一なゼラチンにより、等しくコーティングされたマイクロキャリアの処理が確実となる。均一なコーティング処理は、ゼラチンの最小量の使用、ゼラチンコーティング溶液の最小量の使用を可能にする。これら全ては、当該技術で知られているよりも、非常に効果的なコーティング処理を導く。
【００４３】
本発明の１つの態様では、非多孔性のコアビーズを、本発明のビーズでコーティングする。適切な非多孔性のコアビーズは、ポリスチレン又はガラス製である。他の適切な非多孔性の材料は、当該技術で既知のものである。
【００４４】
特に好ましい態様は、修飾したデキストラン又はクロスリンクしたセルロース、（多孔性）ポリスチレン、特にＤＥＡＥデキストラン等由来のビーズ等の多孔性コアビーズが本発明のゼラチンでコーティングされている、本発明の処理である。他の適切な多孔性物質は、当該技術で既知であり、例えば、他の化学的に修飾された、又は修飾されていない多糖類を含む。分子量の下限は、ゼラチン又はゼラチン用タンパク質が多孔性のコアビーズに入ることを防止し、その結果効果的でないビーズのコーティングや、ゼラチン又はゼラチン様タンパク質が不必要な損失を防ぐ。
【００４５】
ビーズのサイズは、５０μｍ〜１００μｍの範囲内である。典型的な平均ビーズのサイズは、生理食塩水内で約１００、約１５０、又は約２００μｍである。ビーズの少なくとも９０％のサイズの範囲は、８０〜１２０μｍ、１００〜１５０μｍ、１２５〜１７５μｍ、又は１５０〜２００μｍの範囲内で変動できる。
【００４６】
広範囲の細胞を、マイクロキャリア上で培養することができる。例えば、無脊椎動物、魚、鳥の細胞及び哺乳動物の細胞を、マイクロキャリア上で培養することができる。形質転換した細胞株、並びに通常の細胞株、繊維細胞及び上皮細胞、さらに遺伝的操作を行った細胞でさえも、インターフェロン、インターロイキン、成長因子等の免疫学的要素（immunologicals）の産出等の生化学的な適用のために、マイクロキャリア上で培養することができる。さらに、マイクロキャリア上で培養された細胞は、口蹄疫又は狂犬病等のワクチンとして使用される各種ウイルスの宿主として用いることもできる。
【００４７】
マイクロキャリア培養は、大量培養以外にも多くの用途がある。マイクロキャリア上で増殖した細胞は、細胞間又は細胞基層間相互作用等の細胞生物学の様々な特徴を研究するための優れた道具として用いることができる。細胞の分化及び成熟、代謝研究もマイクロキャリアを使用して行うことができる。かかる細胞は、電子顕微鏡による研究や、細胞膜等の細胞小器官の分離等にも用いることもできる。また、このシステム三次元のシステムであり、優れた３Ｄモデルとして役立つ。同様に、このシステムを用いることにより、細胞の共培養も行うことができる。したがって、その用途には、細胞、ウイルス及び細胞製品（例えば、インターフェロン、酵素、核酸、ホルモン）の大量生産、細胞接着、分化及び細胞機能に関する研究、灌流カラム培養システム、顕微鏡観察、有糸分裂細胞の回収、細胞の単離、膜の研究、細胞の保存及び輸送、細胞伝達に関する分析及び標識化合物の取り込みに関する研究、が含まれる。
【００４８】
マイクロキャリアは、脾臓細胞群からのマクロファージの欠乏にも用いることができる。ＤＥＡＥ−デキストランマイクロキャリアは、コンカナバリンＡ（con A）によるリンパ球の刺激を可能にする。同種腫瘍細胞（allogenic tumour cell）とコンフルエントなマイクロキャリアビーズをマウスに注入し、液性及び細胞媒介免疫を増加することができる。植物プロトプラストは、ＤＥＡＤ−デキストランマイクロキャリア上で固定することができる。
【００４９】
マイクロキャリアによる容積に対する表面積の高い割合の結果、研究所規模の様々な生物学的生産や、例えば４０００リットル以上の工業規模にも成功裏に適用することができる。
【００５０】
発現物質の大規模な産出は、ゼラチンでコーティングしたマイクロキャリアによって達成することができる。生産規模バイオリアクターのマイクロキャリアの負荷（loading）は、通常２０ｇ／ｌであるが、４０ｇ／ｌまで増加することができる。マイクロキャリアは、バッチで、還流システム、攪拌培養（stirred cultures）やウェーブバイオリアクター（wave bioreactor）に用いることができ、定常単層（stationary monolayer）とローラー培養の表面積を増加するために用いることができる。
【００５１】
さらに好ましい態様では、ゼラチン又はゼラチン様タンパク質は、ヒドロキシポリン残基を含まない。ヒドロキシル化は、コラーゲンの三重螺旋の形成に必要であり、ゼラチンのゲル化に重要な役割を演じている。特に組換えゼラチンのアミノ酸残基に含まれるヒドロキシプロリンは１０％未満、より好ましくは５％未満であり、好ましくは、組換えゼラチンは、組換えゼラチンのゲル化能力が好ましくない場所に使用する際にはヒドロキシプロリンを含まない。ヒドロキシプロリンを含まない組換えゼラチンは、より高い濃度で用いることができ、溶液の粘性が少なくなり、激しい攪拌の必要がなくなり、その結果培養した細胞の剪断力（shear force）が少なくなる。ＷＯ０２／０７００００Ａ１に記載されているように、主としてヒドロキシプロリンを含まない組換えゼラチンは、天然ゼラチンとは対照的にＩｇＥに対して免疫反応を示さない。
【００５２】
コラーゲンでコーティングしたマイクロキャリアの調製方法は、米国特許第４，９９４，３８８号に記載されている。要約すると、コアビーズへのコラーゲンでのコーティングには、２つのステップ、すなわちコーティングと固定とが含まれる。コアビーズを酸性の水性コラーゲン溶液（０．０１〜０．１Ｎの酢酸）に懸濁し、溶液が乾燥するまで蒸発させる。乾燥した、コラーゲンでコーティングされたビーズはその後グルタルアルデヒド等のタンパク質クロスリンク剤を含む溶液に懸濁し、その結果コラーゲンコーティングがクロスリンクされる。または、コラーゲン溶液で湿らせたコアビーズは、固定化ステップの開始前に完全に乾燥されていない。コーティング条件の変化及びコーティング処理の代替案は、当業者の能力の範囲内である。
【００５３】
組換構造を、米国特許第５，５１２，４７４号のように、追加的なアルギニン、リシン又はヒスチジンを組入れることによって、追加的な、正電荷を有する群を組み込むようにデザインすることもできる。ゼラチンの組換え生産は、生産されたタンパク質内の、正電荷を有するアミノ酸、すなわち細胞培養のｐＨでの正電荷を有するアミノ酸の数を操作しやすくしている。特に、アルギニン、リシン及びヒスチジンは正電荷を有する。所望の特別な細胞培養のｐＨで正味の正電荷を有するゼラチンをデザインすることは、当業者の能力の範囲内である。細胞は、通常ｐＨ７〜７．５で培養される。したがって、本発明のさらなる態様において使用されるゼラチン又はゼラチン様タンパク質は、ｐＨ７〜７．５で正味の正電荷を有する。好ましくは、正味の正電荷は、＋２、＋３、＋４、＋５、＋１０又はそれ以上である。したがって、さらなる態様においては、本発明は、ｐＨ７〜７．５で正味の正電荷を有するゼラチンに関する。好ましくは、正味の正電荷は＋２、＋３、＋４、＋５、＋１０又はそれ以上である。
【００５４】
さらなる態様では、本発明は、最大１０ｋＤa、好ましくは最大５ｋＤaであるＲＧＤエンリッチゼラチンに関する。少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むこのようなＲＧＤゼラチンは、細胞上の表面レセプターをブロックするために用いることができる。細胞のレセプターのブロッキングは、例えば血管新成を阻害したり、心臓繊維芽細胞上のインテグリンをブロックしたりするのに用いられる。
【００５５】
その上で細胞が増殖した、本発明の組換えゼラチンでコーティングしたセルサポートは、例えば皮膚移植、創傷治癒又は骨若しくは軟骨の成長（再生）を増強するときに用いることができる。移植を促進する細胞を付着するためにインプラント材料を本発明の組換えゼラチンでコーティングすることもできる。
【００５６】
したがって、特別な態様は、本発明のセルサポートであり、かかるセルサポートはマイクロキャリアである。
【００５７】
他の特別な態様は、ＲＧＤエンリッチでコーティングされたインプラント又は移植材料、ＲＧＤエンリッチでコーティングした組織工学用の足場、歯科製品（一部）、創傷治癒用製品（一部）、人工皮膚マトリックス材料（一部）及び組織接着剤（一部）からなる群から選択されるセルサポートである。
【００５８】
一次アミノ酸配列の天然ゼラチン分子は、基本的にＧＸＹトリプレットの繰り返しからなり、したがって、アミノ酸総数の約３分の１はグリシンである。ゼラチンの分子量は、典型的に大きく、分子量は１０，０００〜３００，０００ダルトン内で変動するか、それ以上である。
【００５９】
さらなる態様において、本発明は、グリコシル化していないＲＧＤエンリッチゼラチンに関する。グリコシル化は、アミノ酸ＡｓＮ（Ｎ−グリコシド構造）又はＳｅｒ若しくはＴｈｒ（Ｏ−グリコシド構造）で起こる。グリコシル化は、免疫応答が望ましくない場所での使用の際には防止することが好ましい。一次配列においてＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒアミノ酸を欠如させることは、例えば酵母細胞培養を用いた生命工学的な生産システムにおけるグリコシル化を防止するのに有効な手段である。
【００６０】
さらに、ゼラチンの特徴はプロリン残基の著しい高含量である。さらなる特徴としては、天然ゼラチンにおいて、多くのプロリン残基はヒドロキシル化されている。ヒドロキシル化が最も顕著な部位は、通常ではないアミノ酸４−ヒドロキシプロリンのゼラチン分子が存在する時の４番目の位置である。トリプレット４−ヒドロキシプロリンは常にＹ位置に存在する。ヒドロキシプロリン残基の存在は、ゼラチン分子が二次構造が螺旋構造を適用できることに寄与している。したがって、ゲル化が好ましくない適用に用いられる本発明のゼラチンが、ヒドロキシプロリン残基を５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満しか含まないことが望ましい。
【００６１】
本発明において、ゼラチン様タンパク質は、ＧＸＹトリプレット又はＧＸＹトリプレットのストレッチが１又は複数のアミノ酸で分離されているタンパク質であるとして理解される。
【００６２】
本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６又はＷＯ０１／３４６４６で開示されている組換方法によって生産することができる。本発明のゼラチンの生産及び生成の実施可能性については、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６の実施例を参照されたい。
【００６３】
ＲＧＤアミノ酸配列を含むコラーゲンタンパク質の一部をコードする天然核酸配列からＲＧＤエンリッチゼラチンを生産する方法が好ましい。この配列を繰り返すことにより、ＲＧＤエンリッチゼラチンを得ることができる。
【００６４】
Ｘ−ＲＧＤ−Ｙが、天然コラーゲンアミノ酸配列の一部であれば、ＲＧＤアミノ酸配列を３つ有するゼラチン（一部）の構造は、−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙ−（ＧＸＹＧ）ｎ−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙ−（ＧＸＹＧ）ｎ−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙとなるだろう。かかる構造では、ｎは０から始まる整数である。ｎを変動させることにより、アミノ酸総数のおけるＲＧＤ配列の数を制御することができる。この方法の明らかな利点は、アミノ酸配列はおおむね天然として保持され、臨床適用した際に免疫応答を誘導する危険性が最も少ないことである。
【００６５】
コラーゲン（の一部）をコードする天然核酸配列から開始し、ＲＧＤ配列をコードする配列を産出するために、点変異を適用できる。既知のコドンに基づいて、変異後にＲＧＸ配列がＲＧＤ配列を産出するためにポイント変異を行ってもよく、又はＹＧＤ配列がＲＧＤ配列を産出するために変異するために行ってもよい。さらに、ＹＧＸ配列がＲＧＤ配列を産出するために、変異を２つ行ってもよい。さらに、所望のＲＧＤ配列を産出するように、１又は複数のヌクレオチドを挿入、或いは１又は複数のヌクレオチドを削除することができる。
【００６６】
したがって、ゼラチン様タンパク質は、適切な微生物により、かかるポリペプチドをコードする核酸配列の発現によって産出することができる。かかる処理は、菌細胞又は酵母細胞を用いて適切に行うことができる。宿主細胞は、好ましくは、ハンゼヌラ（hansenula）、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、サッカロミセス（Saccharromyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ニューロスポラ（Neurospora）、ピキア（Pichia）等の発現率が高い宿主細胞である。菌細胞及び酵母細胞の、繰り返し配列の不適切な発現に対する感受性が、細菌より少ないので、細菌より好ましい。宿主は、発現するコラーゲン構造を攻撃するプロテアーゼを高いレベルでは含まないことがさらに好ましい。この点に関して、ピキア又はハンゼヌラは、非常に適切な発現システムの例を提供している。発現システムにピキア・パストリス（Pichia pastoris）を使用することは、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６に開示されている。一つの態様において、微生物は、プロリンのヒドロキシル化やリシンのヒドロキスル化等の活動的な転写後の処理メカニズムを有さない。他の態様において、宿主システムは、組換えゼラチンが非常に効率的にヒドロキシル化されている、内在性プロリンヒドロキシル化活性を有する。当業者であれば、本発明の組成物に適切な組換えゼラチン様タンパク質を適切に発現させるための本明細書中に記載されている必要なパラメーターと、宿主細胞に関する知識と、発現される配列とを組み合わせて、菌性宿主細胞を産出する既知の工業用酵素、特に酵母細胞の中から適切な宿主細胞を選択することができるであろう。
【実施例１】
【００６７】
ＲＧＤエンリッチゼラチンを、ヒトＣＯＬ１Ａ１−１のゼラチンアミノ酸配列の一部をコードする核酸配列から産出した。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６及びＷＯ０１／３４６４６に開示されている方法を用いた。本発明のかかるＲＧＤエンリッチゼラチンの配列は配列番号２に示されている。分子に合計４つのＲＧＤ配列が存在し、２５０のアミノ酸あたり４つのＲＧＤ配列に相当する。同様に、２５０のアミノ酸あたり１及び２のＲＧＤ配列を有するゼラチンを作製した。
【実施例２】
【００６８】
マイクロキャリアビーズの調製
平均直径が１００マイクロメートルのポリスチレンビーズを用いた。ポリスチレンビーズ上にゼラチンをコバレントに固定するためにヘテロ二機能性クロスリンク剤であるＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳを用いた。ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳをポリスチレンビーズに添加し、吸着させる。次に、ゼラチンを添加し、ＮＯＳ合成ポリマーと反応させ、スペーサーにコバレントなカップリングを産出した。スペーサー（及びコバレントにカップリングしたゼラチン）をコバレントにポリスチレンビーズに固定するために、感光（３２０ｎｍ）した。最後に、接着の弱いゼラチンを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）内で弱い漂白剤Ｔｗｅｅｎ ２０で一晩洗浄して取り除いた。
【００６９】
細胞の種類及び培養条件
【００７０】
ミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、正常ラット腎臓繊維芽（ＮＲＫ−４９Ｆ)細胞、コッカスパニエル雌犬腎臓（ＭＤＣＫ)細胞はＡＴＣＣから購入した。４種類全ての種類をパッセージさせ、７５ｃｍ＠２フラスコに、３７℃で５％ＣＯ２環境下で維持した。Ｖｅｒｏ細胞及びＮＲＫ４９Ｆ細胞は、ダベルコ変法イーグル培地 （ＤＭＥＭ）内で培養し、ＣＨＯ細胞は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２ 栄養混合培地で培養し、ＭＤＣＫ細胞は最小必須培地（ＭＥＭ)内でアール塩（Earle’s salt）と共に培養した。
【００７１】
Ｖｅｒｏ細胞及びＣＨＯ細胞には、培地に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００ユニット／ｍｌのペニシリン（最終ｐＨ７．１）を添加した。ＮＲＫ−４９Ｆ細胞には、ＤＭＥＭに５％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸（各０．１ｍＭ）、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び０．２５ｕｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（最終ｐＨ７．１)を添加した。ＭＤＣＫ細胞には、ＭＥＭに１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸（各０．１ｍＭ）、及び１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット/ｍｌのペニシリン及び０．２５ｕｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（最終ｐＨ７．１）を添加した。
【００７２】
それぞれの実験の前に細胞を生理的に標準化するために、マイクロキャリアビーズの播種の２〜３日前に細胞を１５０ｃｍ＠２フラスコ内に通過させた。細胞をフラスコから取り除くために、トリプシン処理（ＰＢＳ内０．０５％のトリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）を行った。マイクロキャリアの実験用に、トリプシン培地を除去するために細胞を遠心分離し、培養培地内に１×１０＠６細胞／ｍｌで再懸濁した。生細胞の密度は、トリパン色素排除(０．４％トリパンブルー、０．９％サリン内)で測定した。
【００７３】
細胞培養及び、スピナフラスコ内分析
【００７４】
細胞付着分析には、コーティングしたポリスチレンビーズ２０ｍｇ／ｍｌを使用し、細胞密度は、それぞれの細胞の種類で、１．５×１０＠５細胞／ｍｌであった。マイクロキャリアを、２５０ｍｌのスピナ容器に維持された１００ｍｌの培養物と培養し、懸濁した磁気インペラー（５０ ｒｐｍ）で攪拌した。
【００７５】
細胞付着の運動を、上清細胞密度の低下として分析した。サンプルを除去するために、攪拌を一時的に停止し（約３０秒）、その間、設置したマイクロキャリア及び上清サンプルを、下記の細胞定量化のために除去した。
細胞数の計数には、細胞を、０．１Ｍのクエン酸内にクリスタルバイオレット（０．１％ｗ／ｗ）を等量混合して染色し、血球計数器で計数した。培地からの細胞の減少は、ビーズに付着した細胞の指標として用いた。
【００７６】
培地から除去した細胞がマイクロキャリアに（溶解せずに）付着していることを確認するために、マイクロキャリアに付着した細胞の数を、各細胞付着分析後に定量化した。よく攪拌した媒体培地の１ｍｌの分割量を除去し、マイクロキャリアを配置し、配置したマイクロキャリアを、上記のクリスタルバイオレット／クエン酸に再懸濁した。１時間３７℃でインキュベートした後、血球計数器で定量化した核酸を開放するために、懸濁液をパスツールピペットから出し入れして除去した。
【００７７】
異なるＲＧＤ含量のゼラチンを、前記処理にしたがって、マイクロキャリアコーティングのコーティングに使用した。２５０のアミノ酸あたり、０、１、２及び４のＲＧＤ配列を有する組換えゼラチンを検査した。ＲＧＤ部位の数と細胞付着との間に、明らかな相関関係を見い出した。２５０のアミノ酸あたり４つのＲＧＤ部位のレベルの時に最もよい結果が得られた。
【実施例３】
【００７８】
ＲＧＤエンリッチゼラチンを、ヒトＣＯＬ５Ａ２のゼラチン配列の一部をコードする核酸配列から産出した。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６及びＷＯ０１／３４６４６に開示されている方法を用いた。本発明のかかるＲＧＤエンリッチゼラチンの配列は配列番号３に示されている。この配列内のＲＧＤモチーフの割合は０．８であり、ＲＧＤ配列を含まない４３５のアミノ酸のストレッチが存在する。
【００７９】
上記ゼラチンを、実施例２の行程に従って、マイクロコーティングのコーティングとして用いた。このゼラチンの細胞接着と、実施例１に記載された２５０のアミノ酸あたり２つのＲＧＤモチーフを有するゼラチンとを比較した。両方のゼラチン内のＲＧＤモチーフの割合は同一（０．８％）であったが、実施例１のゼラチンの方が明らかに優れた細胞付着を示した。これは、ＲＧＤモチーフをさらに均一な分配を行ったことによる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリンへの結合に用いられるＲＧＤエンリッチゼラチンに関する。本発明はさらにＲＧＤエンリッチゼラチンでコーティングされたセルサポートにも関する。かかるセルサポートは、細胞培養の研究に使用されたり、アンカー依存細胞の細胞培養や、広い範囲の医薬用途に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞、特に哺乳類の細胞の培養は、ワクチン、酵素、ホルモン、抗体等の重要な（遺伝子組換えによる）生物材料の生産にとって重要である。動物細胞の大部分は、足場依存的（anchorage-dependent）であり、細胞が生存、増殖するには、ある表面に結合することが必要である。
【０００３】
足場依存的な細胞は、日常的に例えば組織培養用フラスコやローラーボトルの壁面で培養されてきた。いくつかの抗ウイルスワクチン、遺伝子改変したタンパク質及び他の細胞由来の製品を大量に提供することが必要になったため、細胞を大量に生産する新しいシステムを開発させるための改善が行われた。
【０００４】
かかる改善は、１９６７年にVan Wezel （Van Wezel, A. L. Nature 216:64-65 (1967)）によるマイクロキャリアの開発から始まった。Van Wezelは、三級アミノ基（ＤＥＡＥ）をチャージした、クロスリンクしたデキストランビーズからなるマイクロキャリアを製造した。Van Wezelは、攪拌した容器内の培養培地に懸濁した、かかる正電荷を有するＤＥＡＥ−デキストランビーズ上への細胞の付着と増殖を立証した。したがって、マイクロキャリアにおける細胞培養では、細胞は懸濁された小さな球に単層として増殖する。マイクロキャリアを使用することにより、１ミリリットルあたり数百万個の細胞といった収率を達成することができる。長年にわたって、様々なタイプのマイクロキャリアが開発されてきた。例えば、ガラスビーズやポリスチレンビーズが記載されている。初期のマイクロキャリアのようなクロスリンクしたデキストランは、依然として一番人気のあるビーズ材料である。
【０００５】
他の大量の培養方法と比較した、マイクロキャリア培養の利点として、以下のものが挙げられる。
i）容積に対する表面積の高い割合。これは、マイクロキャリアの密度を変化させることにより、変動可能であり、単位容積あたり高い細胞密度となり、高密度の細胞製品を得られる可能性がある。ii)多数の低生産性容器を使用せずに、単一の高生産性容器で細胞を伝播することができる。その結果、培地を有効に使用することができ、著しく節約することができる。iii)マイクロキャリア培養はよく混合されているため、ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２等の様々な環境条件を容易にモニター、制御することができる。iv)細胞のサンプリングを容易に行うことができる。v)ビーズを容易に設置できるので、細胞の回収及び製品のダウンストリーム処理を容易に行うことができる。vi)適切に改善された例えば醗酵槽等の従来の装置使用して、マイクロキャリア培養を比較的容易にスケールアップすることができる。
【０００６】
さらなる改善を行うときに、最適なマイクロキャリアは以下の要件をみたさなければならない。
i)ビーズの表面の特性は、細胞が迅速に付着し、増殖できなくてはならない。外形は均等であることが好ましい。ii)容易に単離できるように、ビーズの密度は、培養培地より若干高くなければならない。従来の天然の培養培地は水性であり、密度は１．０３〜１．０９ｇ／ｃｃである。しかし、密度は、１．０３〜１．０４５ｇ／ｍｌである適切な範囲を一定以上超えてはならない。剪断に感受性を有する細胞を傷つけないような緩やかな攪拌で、懸濁状態を維持することができ、ビーズが配置された場合には、細胞の増殖が抑制される。iii)ビーズのサイズの分布は、全てのマイクロキャリアの懸濁が達成され、細胞が同時にコンフルエントになるように、小さくなければならない。さらに、溶液内のマイクロキャリアのクラスター形成を防止しなければならない。iv) 光学特性は、顕微鏡で、容易に観察できなければならない。v)細胞の生存と増殖のためだけでなく、獣医学的又は臨床目的で使用される細胞培養製品のためにも、毒性であってはならない。vi）ビーズのマトリックスは、培養の攪拌中に起きる衝突が、ビーズを断片化しないようなものでなければならない。
【０００７】
改善されたマイクロキャリアにおける重要な変更としては、コア粒子がコラーゲンでコーティングされたことである。コラーゲンの利点は、コラーゲンが細胞の付着と、細胞の増殖両方のプロモーターである点である。さらに、タンパク分解酵素で細胞を容易に剥離することができる。また、細胞付着プロモーターであるフィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャリアについても記載されている。
【０００８】
結合に関与する細胞表面レセプターは、インテグリンとして同定されている。２０以上のインテグリンが知られており、それぞれ異なるリガンド特性を有する。多くのインテグリンは、アミノ酸配列ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を認識することができる。ＲＧＤ配列を含むことが知られているタンパク質の数は限定されており、およそ４００個と推測されている。また、発生するすべてのＲＧＤ配列が結合機能に関与している訳ではない。特に、ＲＧＤＳは細胞付着に関与していることが知られている。天然の未変性コラーゲンが、アミノ酸配列ＲＧＤを含むことは知られている。具体的な例としては、マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯＬ１Ａ１−３、ラットＣＯＬ３Ａ１、ヒトＣＯＬ１Ａ−１、ＣＯＬ２Ａ−１及びＣＯＬ１Ａ１−２が挙げられる。細胞が、コラーゲンに対する特異的な親和性を有するタンパク質フィブロネクチンを分泌するので、細胞のコラーゲンへの付着は、非常に特異的な機構を持つ。コラーゲンへの付着直後、フィブロネクチンは、細胞内のインテグリンタンパク質に結合する。
【０００９】
ゼラチンは、コラーゲンの分解産物であり、かかる用語は、５，０００〜４００，０００ダルトン超の分子量（ＭＷ）を有するタンパク質とペプチドとの不均一な混合物に関する。これらのゼラチンポリマーのいくつかの断片は、ＲＧＤモチーフ（RGD motive）を含むが、加水分解された分子のいくつかの断片はこのようなＲＧＤモチーフ（RGD motif）を含まない。
【００１０】
Burgess 及びMylesは、ペプチドからタイプＩコラーゲンを含むＲＧＤの化学共役について記載しており、かかる方法は、複雑で、標的物質に不純物を導入し、変更の自由が制限されている（Ann Biomed Eng 2000 Jan; 28(1):110-118）。
【００１１】
米国特許第５，５１２，４７４号は、細胞培養サポートの表面に細胞付着因子と、正電荷を有する分子を組み合わせることによって、良好な細胞付着を得ることを目的としている。フィブロネクチンは、細胞付着の中間物質として同定されている。
【００１２】
米国特許第５，５１４，５８１号は、ＤＮＡの化学合成の自動化法と、遺伝子組換技術とを組み合わせた、実質的に新しいポリペプチドの製造に関している。かかる特許は、既知で、天然発生のポリペプチドは適切でない、業務用に適用することができる非天然ポリペプチドに関して記載している。人工タンパク質が、ＲＧＤ配列を含むことがあるとはいえ、結果として生じるバイオポリマーは、天然発生タンパク質とあまり類似していないので、医学的な適用の際には、免疫学的な問題を起こすであろう。
【００１３】
細胞付着は、創傷治療（人工皮膚材料を含む）、骨や軟骨の成長（再生）、移植、人工血液材料等の医学的な適用にも重要な役割を演じている。したがって、医学的な適用においては、細胞付着の観点からは、物質が生体適合性のあるコーティングを有することがしばしば要求される。通常、コラーゲンが、米国特許第５，５１４，５８１号に記載されているものと比べて、構造的に好ましい。なぜなら、コラーゲンは抗原性が低く、皮膚及び骨又は軟骨の両方に存在しているからである。ゼラチンでコーティングされたマイクロキャリアが使用されているが、コラーゲンの多孔性マトリックスも使用されている。一例としては、ケラチノサイトを増殖するコラーゲンでコーティングしたビーズがあり、ケラチノサイトを含むビーズの移植が、創傷の治癒を早めることは、米国特許第５，９７２，３３２号に記載されている。細胞付着に関連した他の関心領域としては、細胞の付着レセプターのブロッキングである。例えば、付着レセプターをブロッキングすることにより、ガンの転移に影響又はそれを阻害することができる。ＲＧＤ配列を有する、より小さいペプチドが、細胞上の結合部位をブロックするために使用され、例えば欧州特許第０，６２８，５７１号に記載される凝集や凝固のような好ましくない相互作用を予防している。
【００１４】
しかしながら、細胞付着に関する適用の際に使用される物質のさらなる改善が、早急に必要である。フィブロネクチンが媒介する細胞付着メカニズムは、細胞を天然ゼラチンに付着させるために用いられる。しかし、天然ゼラチンは、プリオンやウイルス等の不純物の点から、安全ではない。細胞付着のＲＧＤ媒介メカニズムには、化学的又は遺伝子組換え技術によって産出される複数の人工バイオポリマーを用いる。しかし、これらの物質は、非天然の配列を有し、深刻な医学的問題を引き起こす免疫学的反応を引き起こす可能性がある。
【００１５】
「コラーゲン（collagen）」、「コラーゲンが関与する（collagen-related）」、「コラーゲン由来（collagen-derived）」等の用語は、当該技術でも使用され、「ゼラチン（gelatine）」、「ゼラチン様（gelatine-like）」タンパク質なる用語は、本明細書を通して使用される。天然ゼラチンは、５，０００〜４００，０００ダルトン超の分子量（ＭＷ）を有する個別ポリマーの混合物である。細胞付着（cell adhesion）と細胞接着（cell attachment）なる用語は、同義的に使用される。また、ＲＧＤ配列（RGD sequence）とＲＧＤモチーフ（RGD motif）なる用語も、同義的に使用される。
【特許文献１】米国特許第５，５１２，４７４号
【特許文献２】米国特許第５，５１４，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，９７２，３３２号
【特許文献４】欧州特許第０，６２８，５７１号
【非特許文献１】Van Wezel, A. L. Nature 216:64-65 (1967)
【非特許文献２】Ann Biomed Eng 2000 Jan; 28(1):110-118
【発明の開示】
【００１６】
本発明の目的は、改善された、好ましくは高度の細胞結合能力と選択性を有するポリペプチド又はペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、ウイルスや他の病原菌による感染、又はプリオン等健康に有害な物質の危険性のない、細胞結合ペプチド又はポリペプチドを提供することである。また、ヒトの免疫系と直接若しくは間接的に接触したときに免疫応答を誘引しないペプチド又はポリペプチドを提供することも、本発明の目的である。
【００１７】
驚くことに、これら全ての目的は、天然のゼラチンよりもＲＧＤ配列の均等な分布を有し、最低限レベルのＲＧＤ配列を有する、ＲＧＤエンリッチゼラチンによって達成された。ＲＧＤ配列レベルは、百分率で表す。この百分率は、ＲＧＤモチーフの数を、アミノ酸の総数で割り、商を１００倍して算出される。ＲＧＤモチーフの最大比率、すなわち、ＲＧＤモチーフのみで構成されるゼラチンにおいては、３３．３３である。また、ＲＧＤモチーフの数は、１、２、３・・・に始まる整数である。
【００１８】
本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、足場依存性の細胞タイプを増殖する細胞培養サポート（cell culture support）をコーティングするのに非常に適している。したがって、本発明は、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４であり、ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチは少なくとも１つのモチーフを含むＲＧＤエンリッチゼラチンを含む細胞培養サポートに関する。
【００１９】
本発明は、インテグリンに結合するためのＲＧＤエンリッチゼラチンで、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が、少なくとも０．４であり、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのモチーフを含み、かかるゼラチンが、１又は複数の未変性ヒトコラーゲン配列の少なくとも８０％からなり、未変性コラーゲン配列のかかる部分が少なくとも３０アミノ酸の長さを有している、ＲＧＤエンリッチゼラチンを提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンの、組織工学用の足場、又はインプラント若しくは移植材料のコーティング剤としての使用に関する。
【００２１】
さらに、本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、特に、インプラント若しくは移植材料、又はドラッグデリバリーシステムの組成物、ガン転移の抑制剤、血小板の凝集予防剤、アンチトロンビン剤（antithrombic agent）としての使用、組織接着剤としての使用、歯科製品、人工皮膚マトリックス材料としての使用、及び手術後の組織接着予防剤としての使用等、医学的用途にデザインされている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、細胞接着に非常に適している、医学的、生命工学的に適用できるペプチドポリペプチド又はタンパク質、特に、ゼラチン又はゼラチン様タンパク質に関している。さらに具体的に、本発明は、抗原性が低く、ウイルス、プリオン等の病原菌を伝達する危険性がなく使用できる細胞結合ペプチド又はポリペプチドに関している。
【００２３】
驚くことに、優れた細胞付着特性を有し、ＲＧＤエンリッチゼラチンの製造により、健康に関する危険性を示さないペプチド又はポリペプチドで、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４であるペプチド又はポリペプチドを得ることができることを見い出した。ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチは、少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含む。ＲＧＤモチーフの割合は、好ましくは、少なくとも０．６であり、より好ましくは少なくとも０．８、さらに好ましくは少なくとも１．０、さらに好ましくは少なくとも１．２、最も好ましくは少なくとも１．５である。かかる（組換え）ゼラチンは、生命工学的処理又は医学的用途に用いることができる細胞培養サポートをコーティングするのに、非常に適している。本発明に記載される「セルサポート（cell support）」は、細胞にその増殖や繁殖に対するサポートを与える物質である。
【００２４】
ＲＧＤモチーフの０．４という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のＲＧＤエンリッチ組換えゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００２５】
本発明に使用される「ＲＧＤエンリッチゼラチン」なる用語は、本発明のゼラチンが、１分子あたりのアミノ酸総数の割合として算出されたＲＧＤモチーフを一定レベル含み、天然ゼラチンと比べてアミノ酸鎖におけるＲＧＤ配列がより均等に分布されていることを意味する。現在までに、ヒトにおいて、タンパク質又はＤＮＡ配列情報から、２６の明確に区別できるコラーゲンの種類が見い出されている（K. Gelse et al, Collagens-structure, function and byosynthesis, Advanced Drug Delivery reviews 55 (2003) 1531-1546参照）。ヒト由来、非ヒト由来両方の天然ゼラチンの配列が、スイスプロット（Swiss-Prot）のタンパク質データベースに記載されている。以下に、適切なヒト天然配列を列挙する。それらは、スイスプロットのデータベースでエントリー名と最初のアクセッション番号で同定されており、本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンに含まれる天然配列の一部の起源として用いることができる。
【００２６】
ＣＡ１１＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２４５２）コラーゲンα１（Ｉ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１２＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２４５８）コラーゲンα１（II）鎖前駆物質［コンドロカルシンを含む］｛遺伝子：ＣＯＬ２Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１３＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２４６１）コラーゲンα１（III）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ３Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０２４６２）コラーゲンα１（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１５＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２０９０８）コラーゲンα１（Ｖ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ５Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１６＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１０９）コラーゲンα１（VI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ６Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１７＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０２３８８）コラーゲンα１（VII）鎖前駆物質(長鎖コラーゲン)（ＬＣコラーゲン）｛遺伝子：ＣＯＬ７Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１８＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２７６５８）コラーゲンα１（VIII）鎖前駆物質(内皮コラーゲン)｛遺伝子：ＣＯＬ８Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１９＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２０８４９）コラーゲンα１（IX）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ９Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０３６９２）コラーゲンα１（Ｘ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１０Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｂ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１０７）コラーゲンα１（XI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１１Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｃ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ９９７１５）コラーゲンα１（XII）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１２Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｅ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ３９０５９）コラーゲンα１（XV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１５Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｆ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０７０９２）コラーゲンα１（XVI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１６Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｇ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ９ＵＭＤ９）コラーゲンα１（XVII）鎖（類天疱瘡抗原２）（１８０ｋＤａ類天疱瘡抗原２）｛遺伝子：ＣＯＬ１７Ａ１又はＢＰＡＧ２又はＢＰ１８０｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｈ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ３９０６０）コラーゲンα１（XVIII）鎖前駆物質（エンドスタチンを含む）｛遺伝子：ＣＯＬ１８Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ１Ｉ＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ１４９９３）コラーゲンα１（IXI）鎖前駆物質（コラーゲンα１（Ｙ）鎖）｛遺伝子：ＣＯＬ１９Ａ１｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２１＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０８１２３）コラーゲンα２（Ｉ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０８５７２）コラーゲンα２（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２５＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ０５９９７）コラーゲンα２（Ｖ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ５Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２６＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１１０）コラーゲンα２（VI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ６Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２８＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２５０６７）コラーゲンα２（VIII）鎖前駆物質（内皮コラーゲン）｛遺伝子：ＣＯＬ８Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２９＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ１４０５５）コラーゲンα２（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ９Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ２Ｂ＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１３９４２）コラーゲンα２（XI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ１１Ａ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ３４＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ０１９５５）コラーゲンα３（IV）鎖前駆物質（グットパスチャー抗原）｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ３｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ３５＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２５９４０）コラーゲンα３（Ｖ）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ５Ａ３｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ３６＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ１２１１１）コラーゲンα３（VI）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ６Ａ３｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ３９＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ１４０５０）コラーゲンα３（IX）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ９Ａ３｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ４４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ５３４２０）コラーゲンα４（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ４｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ５４＿ＨＵＭＡＮ（Ｐ２９４００）コラーゲンα５（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ５｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＣＡ６４＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ１４０３１）コラーゲンα６（IV）鎖前駆物質｛遺伝子：ＣＯＬ４Ａ６｝−ホモサピエンス（ヒト）
ＥＭＤ２＿ＨＵＭＡＮ（Ｑ９６Ａ８３）コラーゲンα１（XXVI）鎖前駆物質（タンパク質２を含むＥＭＩ領域）（Ｅｍｕ２タンパク質）（タンパク質２を含むエミリン（emilin）及びマルチメリン（multimerin）領域）｛遺伝子：ＥＭＩＤ２又はＣＯＬ２６Ａ１又はＥＭＵ２｝−ホモサピエンス（ヒト）
【００２７】
天然ゼラチンが、ＲＧＤ配列を含むことは知られている。しかし、ゼラチン分子がＲＧＤモチーフの存在しない大きな部分を含まないことが重要である。ＲＧＤ配列の存在しない大きすぎる部分は、かかるゼラチンが例えばマイクロキャリアのコーティングとして用いられている場合に、細胞が付着する可能性を低くする。一見したところ、ゼラチンの全てのＲＧＤ配列は、どのような状況においても細胞付着が可能なわけではない。本発明のゼラチンは、３５０以上のアミノ酸のストレッチを有する、ＲＧＤ配列を含まないゼラチンと比較して、細胞付着が著しく改善していることを見い出した。３５０以下のアミノ酸のゼラチンにとって、ＲＧＤ配列の割合が、少なくとも０．４であれば十分である。つまり、２５１〜３５０のアミノ酸のゼラチンでは、少なくとも２つのＲＧＤモチーフが存在することを意味する。
【００２８】
より好ましい態様では、ＲＧＤエンリッチゼラチンは、遺伝子組換え技術によって調製される。本発明の組換えゼラチンは、好ましくはコラーゲン性配列に由来する。コラーゲンをコードする核酸配列は、当該技術において一般的に報告されている（Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259: 13668-13673; French et al. (1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol Chem 266: 16862-16869; Metsaranta et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1089:241-243; Wood et al. (1987) Gene 61: 225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J 253: 919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J 252: 633640; Ala-Kokko et al. (1989) Biochem J 260: 509-516参照のこと）。
【００２９】
薬学的、医学的用途には、天然ヒトコラーゲンのアミノ酸に関連若しくはそれと同一のアミノ酸配列を有する組換えゼラチンが好ましい。より好ましくは、本発明のゼラチンのアミノ酸は、ヒトコラーゲンの選択されたアミノ酸配列を繰り返し使用して、デザインされている。ＲＧＤモチーフを含む天然コラーゲン配列の一部が選択されている。このような選択された配列のＲＧＤモチーフの割合は、選択される配列の選択される長さに依存する。短い配列を選択すると、ＲＧＤの割合が高くなる。選択されるアミノ酸配列を繰り返し使用すると、高分子量で、（天然ゼラチン又はコラーゲンと比較し）抗原性がなく、ＲＧＤモチーフの数が増加したゼラチンとなる。天然の非ヒトの起源としては、ウシ、ブタやウマなどの非ヒト哺乳動物や、トリ、マウス、ラット及びサカナ等の他の動物が含まれる。
【００３０】
したがって、より好ましい態様では本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、未変性ヒトコラーゲン配列の一部を含む。好ましくは、ＲＧＤエンリッチゼラチンは、１又は複数の未変性ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分を少なくとも８０％含む。ヒトコラーゲン配列のかかる部分はそれぞれ、少なくとも３０アミノ酸の長さ、より好ましくは４５のアミノ酸、さらに好ましくは６０のアミノ酸、例えば２４０以下、好ましくは１５０以下、最も好ましくは１２０以下のアミノ酸の長さを有し、好ましくはそれぞれが１又は複数のＲＧＤ配列を含む。ＲＧＤエンリッチゼラチンは、好ましくは１又は複数の未変性ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなる。
【００３１】
本発明のゼラチンの適切な起源の１つの例として、ヒトＣＯＬ１Ａ１−１が挙げられる。ＲＧＤ配列を含む２５０のアミノ酸の一部は、配列番号１に示される。
【００３２】
ゼラチンのＲＧＤ配列は、インテグリンと呼ばれる細胞壁の特異的レセプターに付着することができる。これらのインテグリンは、細胞結合アミノ酸配列を認識する上で、その特異性により区別される。天然ゼラチンと、例えばフィブロネクチンとの両方ともに、ＲＧＤ配列を含むことができるが、ゼラチンは、フィブロネクチンに結合しない細胞に結合することができ、その逆もありうる。したがって、ＲＧＤ配列を含むフィブロネクチンは、細胞付着を目的として常にゼラチンの代わりになるものではない。
【００３３】
組換えによって産出されたゼラチンは、ゼラチンが由来する動物の病原菌で汚染されるという不利な点はない。
【００３４】
細胞培養サポートとして、またはそれと組み合わせて使用されるときには、ゼラチンは、細胞結合ポリペプチドとして機能する。その上で増殖する細胞によって代謝されうるという点で他のポリペプチドと比べて利点がある。さらなる利点は、容易な酵素的処理ができ、ほぼ１００％の収率で細胞を回収できることである。組換えによって産出されたゼラチンのさらなる利点は、分子量（ＭＷ）を一定に保てることである。製造方法にもよるが、天然ゼラチンは、分子量が５，０００ｋＤより小さいペプチドから、４００，０００ｋＤより大きいポリマーまで、幅広い範囲の分子量を不可避的に有する。特に、細胞培養サポートとして、マイクロキャリアコアビーズと組み合わせたときの、小さいペプチドの不利な点は、細胞が到達できないマイクロキャリアの細い孔内に付着し、その結果添加したゼラチンの一部分が使用されないことである。組換えによる製造方法では、ゼラチンを、所望の分子量でデザインすることができ、望まない物質の損失を防ぐことができる。
【００３５】
本発明のゼラチンはさらなる態様では、マイクロキャリアとして細胞培養サポートとなるコアビーズをコーティングするために、約３０ｋＤａ〜約２００ｋＤａの分子量を有する。
【００３６】
ＲＧＤ配列の存在に加えて、ゼラチンの分子量の範囲は、際立った利点を与え、さらに有利な特性を持つマイクロキャリアを提供する。マイクロキャリアコアビーズのコーティング処理における主要な問題は、ビーズの凝集である。特に、かかる凝集は、細胞付着が可能な表面積を減少させ、マイクロキャリアのサイズ分布を損ない、使用を不可能にする。
【００３７】
１つの天然ゼラチンバッチにおける高分子量のゼラチンポリマー分子の比較的小さい断片は、マイクロキャリア製造処理中のビーズの凝集に対して大いに関与している。このような高分子量のゼラチンポリマーがコアビーズに付着する場合、ペプチド鎖の一部がコアビーズの表面から離脱（point away）し、他のビーズの足場となり、その結果凝集が起きる可能性がある。
【００３８】
つまり、本発明にしたがって、２００ｋＤa以下、より好ましくは１５０ｋＤaの分子量を有するゼラチンでコアビーズをコーティングすることが好ましい。
【００３９】
さらに、天然ゼラチンの分子量の低い断片が、好ましくないマイクロキャリアのコーティング特性を示すことが見い出された。かかる低分子量の断片は、マイクロキャリアビーズに対し低い付着力を示したので、付着しない場合には、化学的クロスリンク段階後のマイクロキャリア凝集を促進する。さらに、凝集を予防するためにマイクロキャリアのコーティング処理において低濃度のゼラチンを用いる場合には、低分子量の断片は、先ずマイクロキャリアに付着するが、マイクロキャリアの多孔性コアビーズの小さな孔に入るという好ましくない特性を有する。その結果、細胞培養段階において、マイクロキャリアへの細胞の付着に寄与しない。したがって、ゼラチンの分子量は、コアビーズの凝集を防ぎ、ゼラチンの損失を防ぐ効果的なコーティングを効率的に行うために、十分に高くなければならない。したがって、ゼラチンの分子量は、３０ｋＤａ以上、好ましくは６０ｋＤa以上、最も好ましくは７０ｋＤa以上である。
【００４０】
ゼラチン又はゼラチン様タンパク質の分子量は均一であることが好ましい。７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらには少なくとも９８％のゼラチン又はゼラチン様タンパク質が、選択された分子量の２０％以内の均一な分子量を有することが好ましい。
【００４１】
上記の具体的範囲から分子量を選択することにより、コーティング処理中のゼラチン又はゼラチン様タンパク質コーティング溶液の粘着性を正確に制御することができる。できるだけ高いゼラチンの濃度を選択することにより、かかるゼラチン溶液の完全な、又はさらに重要なことには、部分的なジェル化（gelling）を防止することができる。
【００４２】
均一なゼラチンにより、等しくコーティングされたマイクロキャリアの処理が確実となる。均一なコーティング処理は、ゼラチンの最小量の使用、ゼラチンコーティング溶液の最小量の使用を可能にする。これら全ては、当該技術で知られているよりも、非常に効果的なコーティング処理を導く。
【００４３】
本発明の１つの態様では、非多孔性のコアビーズを、本発明のビーズでコーティングする。適切な非多孔性のコアビーズは、ポリスチレン又はガラス製である。他の適切な非多孔性の材料は、当該技術で既知のものである。
【００４４】
特に好ましい態様は、修飾したデキストラン又はクロスリンクしたセルロース、（多孔性）ポリスチレン、特にＤＥＡＥデキストラン等由来のビーズ等の多孔性コアビーズが本発明のゼラチンでコーティングされている、本発明の処理である。他の適切な多孔性物質は、当該技術で既知であり、例えば、他の化学的に修飾された、又は修飾されていない多糖類を含む。分子量の下限は、ゼラチン又はゼラチン用タンパク質が多孔性のコアビーズに入ることを防止し、その結果効果的でないビーズのコーティングや、ゼラチン又はゼラチン様タンパク質が不必要な損失を防ぐ。
【００４５】
ビーズのサイズは、５０μｍ〜１００μｍの範囲内である。典型的な平均ビーズのサイズは、生理食塩水内で約１００、約１５０、又は約２００μｍである。ビーズの少なくとも９０％のサイズの範囲は、８０〜１２０μｍ、１００〜１５０μｍ、１２５〜１７５μｍ、又は１５０〜２００μｍの範囲内で変動できる。
【００４６】
広範囲の細胞を、マイクロキャリア上で培養することができる。例えば、無脊椎動物、魚、鳥の細胞及び哺乳動物の細胞を、マイクロキャリア上で培養することができる。形質転換した細胞株、並びに通常の細胞株、繊維細胞及び上皮細胞、さらに遺伝的操作を行った細胞でさえも、インターフェロン、インターロイキン、成長因子等の免疫学的要素（immunologicals）の産出等の生化学的な適用のために、マイクロキャリア上で培養することができる。さらに、マイクロキャリア上で培養された細胞は、口蹄疫又は狂犬病等のワクチンとして使用される各種ウイルスの宿主として用いることもできる。
【００４７】
マイクロキャリア培養は、大量培養以外にも多くの用途がある。マイクロキャリア上で増殖した細胞は、細胞間又は細胞基層間相互作用等の細胞生物学の様々な特徴を研究するための優れた道具として用いることができる。細胞の分化及び成熟、代謝研究もマイクロキャリアを使用して行うことができる。かかる細胞は、電子顕微鏡による研究や、細胞膜等の細胞小器官の分離等にも用いることもできる。また、このシステム三次元のシステムであり、優れた３Ｄモデルとして役立つ。同様に、このシステムを用いることにより、細胞の共培養も行うことができる。したがって、その用途には、細胞、ウイルス及び細胞製品（例えば、インターフェロン、酵素、核酸、ホルモン）の大量生産、細胞接着、分化及び細胞機能に関する研究、灌流カラム培養システム、顕微鏡観察、有糸分裂細胞の回収、細胞の単離、膜の研究、細胞の保存及び輸送、細胞伝達に関する分析及び標識化合物の取り込みに関する研究、が含まれる。
【００４８】
マイクロキャリアは、脾臓細胞群からのマクロファージの欠乏にも用いることができる。ＤＥＡＥ−デキストランマイクロキャリアは、コンカナバリンＡ（con A）によるリンパ球の刺激を可能にする。同種腫瘍細胞（allogenic tumour cell）とコンフルエントなマイクロキャリアビーズをマウスに注入し、液性及び細胞媒介免疫を増加することができる。植物プロトプラストは、ＤＥＡＤ−デキストランマイクロキャリア上で固定することができる。
【００４９】
マイクロキャリアによる容積に対する表面積の高い割合の結果、研究所規模の様々な生物学的生産や、例えば４０００リットル以上の工業規模にも成功裏に適用することができる。
【００５０】
発現物質の大規模な産出は、ゼラチンでコーティングしたマイクロキャリアによって達成することができる。生産規模バイオリアクターのマイクロキャリアの負荷（loading）は、通常２０ｇ／ｌであるが、４０ｇ／ｌまで増加することができる。マイクロキャリアは、バッチで、還流システム、攪拌培養（stirred cultures）やウェーブバイオリアクター（wave bioreactor）に用いることができ、定常単層（stationary monolayer）とローラー培養の表面積を増加するために用いることができる。
【００５１】
さらに好ましい態様では、ゼラチン又はゼラチン様タンパク質は、ヒドロキシポリン残基を含まない。ヒドロキシル化は、コラーゲンの三重螺旋の形成に必要であり、ゼラチンのゲル化に重要な役割を演じている。特に組換えゼラチンのアミノ酸残基に含まれるヒドロキシプロリンは１０％未満、より好ましくは５％未満であり、好ましくは、組換えゼラチンは、組換えゼラチンのゲル化能力が好ましくない場所に使用する際にはヒドロキシプロリンを含まない。ヒドロキシプロリンを含まない組換えゼラチンは、より高い濃度で用いることができ、溶液の粘性が少なくなり、激しい攪拌の必要がなくなり、その結果培養した細胞の剪断力（shear force）が少なくなる。ＷＯ０２／０７００００Ａ１に記載されているように、主としてヒドロキシプロリンを含まない組換えゼラチンは、天然ゼラチンとは対照的にＩｇＥに対して免疫反応を示さない。
【００５２】
コラーゲンでコーティングしたマイクロキャリアの調製方法は、米国特許第４，９９４，３８８号に記載されている。要約すると、コアビーズへのコラーゲンでのコーティングには、２つのステップ、すなわちコーティングと固定とが含まれる。コアビーズを酸性の水性コラーゲン溶液（０．０１〜０．１Ｎの酢酸）に懸濁し、溶液が乾燥するまで蒸発させる。乾燥した、コラーゲンでコーティングされたビーズはその後グルタルアルデヒド等のタンパク質クロスリンク剤を含む溶液に懸濁し、その結果コラーゲンコーティングがクロスリンクされる。または、コラーゲン溶液で湿らせたコアビーズは、固定化ステップの開始前に完全に乾燥されていない。コーティング条件の変化及びコーティング処理の代替案は、当業者の能力の範囲内である。
【００５３】
組換構造を、米国特許第５，５１２，４７４号のように、追加的なアルギニン、リシン又はヒスチジンを組入れることによって、追加的な、正電荷を有する群を組み込むようにデザインすることもできる。ゼラチンの組換え生産は、生産されたタンパク質内の、正電荷を有するアミノ酸、すなわち細胞培養のｐＨでの正電荷を有するアミノ酸の数を操作しやすくしている。特に、アルギニン、リシン及びヒスチジンは正電荷を有する。所望の特別な細胞培養のｐＨで正味の正電荷を有するゼラチンをデザインすることは、当業者の能力の範囲内である。細胞は、通常ｐＨ７〜７．５で培養される。したがって、本発明のさらなる態様において使用されるゼラチン又はゼラチン様タンパク質は、ｐＨ７〜７．５で正味の正電荷を有する。好ましくは、正味の正電荷は、＋２、＋３、＋４、＋５、＋１０又はそれ以上である。したがって、さらなる態様においては、本発明は、ｐＨ７〜７．５で正味の正電荷を有するゼラチンに関する。好ましくは、正味の正電荷は＋２、＋３、＋４、＋５、＋１０又はそれ以上である。
【００５４】
さらなる態様では、本発明は、最大１０ｋＤa、好ましくは最大５ｋＤaであるＲＧＤエンリッチゼラチンに関する。少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むこのようなＲＧＤゼラチンは、細胞上の表面レセプターをブロックするために用いることができる。細胞のレセプターのブロッキングは、例えば血管新成を阻害したり、心臓繊維芽細胞上のインテグリンをブロックしたりするのに用いられる。
【００５５】
その上で細胞が増殖した、本発明の組換えゼラチンでコーティングしたセルサポートは、例えば皮膚移植、創傷治癒又は骨若しくは軟骨の成長（再生）を増強するときに用いることができる。移植を促進する細胞を付着するためにインプラント材料を本発明の組換えゼラチンでコーティングすることもできる。
【００５６】
したがって、特別な態様は、本発明のセルサポートであり、かかるセルサポートはマイクロキャリアである。
【００５７】
他の特別な態様は、ＲＧＤエンリッチでコーティングされたインプラント又は移植材料、ＲＧＤエンリッチでコーティングした組織工学用の足場、歯科製品（一部）、創傷治癒用製品（一部）、人工皮膚マトリックス材料（一部）及び組織接着剤（一部）からなる群から選択されるセルサポートである。
【００５８】
一次アミノ酸配列の天然ゼラチン分子は、基本的にＧＸＹトリプレットの繰り返しからなり、したがって、アミノ酸総数の約３分の１はグリシンである。ゼラチンの分子量は、典型的に大きく、分子量は１０，０００〜３００，０００ダルトン内で変動するか、それ以上である。
【００５９】
さらなる態様において、本発明は、グリコシル化していないＲＧＤエンリッチゼラチンに関する。グリコシル化は、アミノ酸ＡｓＮ（Ｎ−グリコシド構造）又はＳｅｒ若しくはＴｈｒ（Ｏ−グリコシド構造）で起こる。グリコシル化は、免疫応答が望ましくない場所での使用の際には防止することが好ましい。一次配列においてＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒアミノ酸を欠如させることは、例えば酵母細胞培養を用いた生命工学的な生産システムにおけるグリコシル化を防止するのに有効な手段である。
【００６０】
さらに、ゼラチンの特徴はプロリン残基の著しい高含量である。さらなる特徴としては、天然ゼラチンにおいて、多くのプロリン残基はヒドロキシル化されている。ヒドロキシル化が最も顕著な部位は、通常ではないアミノ酸４−ヒドロキシプロリンのゼラチン分子が存在する時の４番目の位置である。トリプレット４−ヒドロキシプロリンは常にＹ位置に存在する。ヒドロキシプロリン残基の存在は、ゼラチン分子が二次構造が螺旋構造を適用できることに寄与している。したがって、ゲル化が好ましくない適用に用いられる本発明のゼラチンが、ヒドロキシプロリン残基を５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満しか含まないことが望ましい。
【００６１】
本発明において、ゼラチン様タンパク質は、ＧＸＹトリプレット又はＧＸＹトリプレットのストレッチが１又は複数のアミノ酸で分離されているタンパク質であるとして理解される。
【００６２】
本発明のＲＧＤエンリッチゼラチンは、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６又はＷＯ０１／３４６４６で開示されている組換方法によって生産することができる。本発明のゼラチンの生産及び生成の実施可能性については、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６の実施例を参照されたい。
【００６３】
ＲＧＤアミノ酸配列を含むコラーゲンタンパク質の一部をコードする天然核酸配列からＲＧＤエンリッチゼラチンを生産する方法が好ましい。この配列を繰り返すことにより、ＲＧＤエンリッチゼラチンを得ることができる。
【００６４】
Ｘ−ＲＧＤ−Ｙが、天然コラーゲンアミノ酸配列の一部であれば、ＲＧＤアミノ酸配列を３つ有するゼラチン（一部）の構造は、−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙ−（ＧＸＹＧ）ｎ−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙ−（ＧＸＹＧ）ｎ−Ｘ−ＲＧＤ−Ｙとなるだろう。かかる構造では、ｎは０から始まる整数である。ｎを変動させることにより、アミノ酸総数のおけるＲＧＤ配列の数を制御することができる。この方法の明らかな利点は、アミノ酸配列はおおむね天然として保持され、臨床適用した際に免疫応答を誘導する危険性が最も少ないことである。
【００６５】
コラーゲン（の一部）をコードする天然核酸配列から開始し、ＲＧＤ配列をコードする配列を産出するために、点変異を適用できる。既知のコドンに基づいて、変異後にＲＧＸ配列がＲＧＤ配列を産出するためにポイント変異を行ってもよく、又はＹＧＤ配列がＲＧＤ配列を産出するために変異するために行ってもよい。さらに、ＹＧＸ配列がＲＧＤ配列を産出するために、変異を２つ行ってもよい。さらに、所望のＲＧＤ配列を産出するように、１又は複数のヌクレオチドを挿入、或いは１又は複数のヌクレオチドを削除することができる。
【００６６】
したがって、ゼラチン様タンパク質は、適切な微生物により、かかるポリペプチドをコードする核酸配列の発現によって産出することができる。かかる処理は、菌細胞又は酵母細胞を用いて適切に行うことができる。宿主細胞は、好ましくは、ハンゼヌラ（hansenula）、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、サッカロミセス（Saccharromyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ニューロスポラ（Neurospora）、ピキア（Pichia）等の発現率が高い宿主細胞である。菌細胞及び酵母細胞の、繰り返し配列の不適切な発現に対する感受性が、細菌より少ないので、細菌より好ましい。宿主は、発現するコラーゲン構造を攻撃するプロテアーゼを高いレベルでは含まないことがさらに好ましい。この点に関して、ピキア又はハンゼヌラは、非常に適切な発現システムの例を提供している。発現システムにピキア・パストリス（Pichia pastoris）を使用することは、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３及びＥＰ−Ａ−１０１４１７６に開示されている。一つの態様において、微生物は、プロリンのヒドロキシル化やリシンのヒドロキスル化等の活動的な転写後の処理メカニズムを有さない。他の態様において、宿主システムは、組換えゼラチンが非常に効率的にヒドロキシル化されている、内在性プロリンヒドロキシル化活性を有する。当業者であれば、本発明の組成物に適切な組換えゼラチン様タンパク質を適切に発現させるための本明細書中に記載されている必要なパラメーターと、宿主細胞に関する知識と、発現される配列とを組み合わせて、菌性宿主細胞を産出する既知の工業用酵素、特に酵母細胞の中から適切な宿主細胞を選択することができるであろう。
【実施例１】
【００６７】
ＲＧＤエンリッチゼラチンを、ヒトＣＯＬ１Ａ１−１のゼラチンアミノ酸配列の一部をコードする核酸配列から産出した。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６及びＷＯ０１／３４６４６に開示されている方法を用いた。本発明のかかるＲＧＤエンリッチゼラチンの配列は配列番号２に示されている。分子に合計４つのＲＧＤ配列が存在し、２５０のアミノ酸あたり４つのＲＧＤ配列に相当する。同様に、２５０のアミノ酸あたり１及び２のＲＧＤ配列を有するゼラチンを作製した。
【実施例２】
【００６８】
マイクロキャリアビーズの調製
平均直径が１００マイクロメートルのポリスチレンビーズを用いた。ポリスチレンビーズ上にゼラチンをコバレントに固定するためにヘテロ二機能性クロスリンク剤であるＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳを用いた。ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳをポリスチレンビーズに添加し、吸着させる。次に、ゼラチンを添加し、ＮＯＳ合成ポリマーと反応させ、スペーサーにコバレントなカップリングを産出した。スペーサー（及びコバレントにカップリングしたゼラチン）をコバレントにポリスチレンビーズに固定するために、感光（３２０ｎｍ）した。最後に、接着の弱いゼラチンを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）内で弱い漂白剤Ｔｗｅｅｎ ２０で一晩洗浄して取り除いた。
【００６９】
細胞の種類及び培養条件
【００７０】
ミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、正常ラット腎臓繊維芽（ＮＲＫ−４９Ｆ)細胞、コッカスパニエル雌犬腎臓（ＭＤＣＫ)細胞はＡＴＣＣから購入した。４種類全ての種類をパッセージさせ、７５ｃｍ＠２フラスコに、３７℃で５％ＣＯ２環境下で維持した。Ｖｅｒｏ細胞及びＮＲＫ４９Ｆ細胞は、ダベルコ変法イーグル培地 （ＤＭＥＭ）内で培養し、ＣＨＯ細胞は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２ 栄養混合培地で培養し、ＭＤＣＫ細胞は最小必須培地（ＭＥＭ)内でアール塩（Earle’s salt）と共に培養した。
【００７１】
Ｖｅｒｏ細胞及びＣＨＯ細胞には、培地に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００ユニット／ｍｌのペニシリン（最終ｐＨ７．１）を添加した。ＮＲＫ−４９Ｆ細胞には、ＤＭＥＭに５％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸（各０．１ｍＭ）、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び０．２５ｕｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（最終ｐＨ７．１)を添加した。ＭＤＣＫ細胞には、ＭＥＭに１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸（各０．１ｍＭ）、及び１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ユニット/ｍｌのペニシリン及び０．２５ｕｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（最終ｐＨ７．１）を添加した。
【００７２】
それぞれの実験の前に細胞を生理的に標準化するために、マイクロキャリアビーズの播種の２〜３日前に細胞を１５０ｃｍ＠２フラスコ内に通過させた。細胞をフラスコから取り除くために、トリプシン処理（ＰＢＳ内０．０５％のトリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ）を行った。マイクロキャリアの実験用に、トリプシン培地を除去するために細胞を遠心分離し、培養培地内に１×１０＠６細胞／ｍｌで再懸濁した。生細胞の密度は、トリパン色素排除(０．４％トリパンブルー、０．９％サリン内)で測定した。
【００７３】
細胞培養及び、スピナフラスコ内分析
【００７４】
細胞付着分析には、コーティングしたポリスチレンビーズ２０ｍｇ／ｍｌを使用し、細胞密度は、それぞれの細胞の種類で、１．５×１０＠５細胞／ｍｌであった。マイクロキャリアを、２５０ｍｌのスピナ容器に維持された１００ｍｌの培養物と培養し、懸濁した磁気インペラー（５０ ｒｐｍ）で攪拌した。
【００７５】
細胞付着の運動を、上清細胞密度の低下として分析した。サンプルを除去するために、攪拌を一時的に停止し（約３０秒）、その間、設置したマイクロキャリア及び上清サンプルを、下記の細胞定量化のために除去した。
細胞数の計数には、細胞を、０．１Ｍのクエン酸内にクリスタルバイオレット（０．１％ｗ／ｗ）を等量混合して染色し、血球計数器で計数した。培地からの細胞の減少は、ビーズに付着した細胞の指標として用いた。
【００７６】
培地から除去した細胞がマイクロキャリアに（溶解せずに）付着していることを確認するために、マイクロキャリアに付着した細胞の数を、各細胞付着分析後に定量化した。よく攪拌した媒体培地の１ｍｌの分割量を除去し、マイクロキャリアを配置し、配置したマイクロキャリアを、上記のクリスタルバイオレット／クエン酸に再懸濁した。１時間３７℃でインキュベートした後、血球計数器で定量化した核酸を開放するために、懸濁液をパスツールピペットから出し入れして除去した。
【００７７】
異なるＲＧＤ含量のゼラチンを、前記処理にしたがって、マイクロキャリアコーティングのコーティングに使用した。２５０のアミノ酸あたり、０、１、２及び４のＲＧＤ配列を有する組換えゼラチンを検査した。ＲＧＤ部位の数と細胞付着との間に、明らかな相関関係を見い出した。２５０のアミノ酸あたり４つのＲＧＤ部位のレベルの時に最もよい結果が得られた。
【実施例３】
【００７８】
ＲＧＤエンリッチゼラチンを、ヒトＣＯＬ５Ａ２のゼラチン配列の一部をコードする核酸配列から産出した。ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６及びＷＯ０１／３４６４６に開示されている方法を用いた。本発明のかかるＲＧＤエンリッチゼラチンの配列は配列番号３に示されている。この配列内のＲＧＤモチーフの割合は０．８であり、ＲＧＤ配列を含まない４３５のアミノ酸のストレッチが存在する。
【００７９】
上記ゼラチンを、実施例２の行程に従って、マイクロコーティングのコーティングとして用いた。このゼラチンの細胞接着と、実施例１に記載された２５０のアミノ酸あたり２つのＲＧＤモチーフを有するゼラチンとを比較した。両方のゼラチン内のＲＧＤモチーフの割合は同一（０．８％）であったが、実施例１のゼラチンの方が明らかに優れた細胞付着を示した。これは、ＲＧＤモチーフをさらに均一な分配を行ったことによる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４であり、ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むＲＧＤエンリッチゼラチンを含むセルサポート。
【請求項２】
ＲＧＤエンリッチゼラチン内の割合が、少なくとも０．６、好ましくは少なくとも０．８、さらに好ましくは少なくとも１．０、さらに好ましくは少なくとも１．２、最も好ましくは少なくとも１．５であることを特徴とする、請求項１記載のセルサポート。
【請求項３】
ＲＧＤエンリッチゼラチン内のＲＧＤモチーフの数が、２５０のアミノ酸あたり少なくとも４であることを特徴とする、請求項１又は２記載のセルサポート。
【請求項４】
ＲＧＤエンリッチゼラチンが、ＲＧＤモチーフを少なくとも４、好ましくは６、さらに好ましくは８、より好ましくは１２以上１６以下含むことを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載のセルサポート。
【請求項５】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの分子量が約３０ｋＤa〜約２００ｋＤａであることを特徴とする、請求項１〜４いずれかに記載のセルサポート。
【請求項６】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの分子量が、６０ｋＤａ超、好ましくは７０ｋＤa超であることを特徴とする、請求項１〜５いずれかに記載のセルサポート。
【請求項７】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの分子量が、約１５０ｋＤａ未満であることを特徴とする、請求項１〜６いずれかに記載のセルサポート。
【請求項８】
ＲＧＤエンリッチゼラチンが、５％未満、好ましくは３％未満のヒドロキシプロリン残基を含むことを特徴とする、請求項１〜７いずれかに記載のセルサポート。
【請求項９】
ＲＧＤエンリッチゼラチンが、ｐＨ７〜７．５において正味の正電荷を有することを特徴とする、請求項１〜８いずれかに記載のセルサポート。
【請求項１０】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの少なくとも８０％が、天然ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなり、該天然ヒトコラーゲン配列が少なくとも３０のアミノ酸の長さを有することを特徴とする、請求項１〜９いずれかに記載のセルサポート。
【請求項１１】
ＲＧＤエンリッチゼラチンが、天然ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなることを特徴とする、請求項１０記載のセルサポート。
【請求項１２】
アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４であり、ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含み、かつ、該ゼラチンの少なくとも８０％が、天然ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなり、該天然ヒトコラーゲン配列が、少なくとも３０のアミノ酸の長さを有することを特徴とする、ＲＧＤエンリッチゼラチン。
【請求項１３】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの分子量が、最大１０ｋＤa、好ましくは最大５ｋＤａであることを特徴とする、請求項１２記載のＲＧＤエンリッチゼラチン。
【請求項１４】
セルサポートがマイクロキャリアであることを特徴とする、請求項１〜１１いずれかに記載のセルサポート、又はクレーム１２記載のＲＧＤエンリッチゼラチンを含むセルサポート。
【請求項１５】
セルサポートが、ＲＧＤエンリッチでコーティングしたインプラント又は移植材料、ＲＧＤエンリッチでコーティングした組織工学用の足場、歯科製品（一部）、創傷治癒用製品（一部）、人工皮膚マトリックス材料（一部）及び組織接着剤（一部）からなる群から選択されることを特徴とする、クレーム１〜１１いずれかに記載のセルサポート、又はクレーム１２又は１３記載のＲＧＤエンリッチゼラチンを含むサポート。
【請求項１６】
クレーム１２記載のＲＧＤエンリッチゼラチンの、トラッグデリバリーシステム成分としての使用。
【請求項１７】
クレーム１３記載のＲＧＤエンリッチゼラチンの、ガン転移抑制剤としての使用。
【請求項１８】
クレーム１２又は１３記載のＲＧＤエンリッチゼラチンの、血小板凝集予防剤としての使用。
【請求項１９】
クレーム１３記載のＲＧＤエンリッチゼラチンの、手術後の組織接着予防剤としての使用。
【請求項１】
アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４であり、ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むＲＧＤエンリッチゼラチンを含むセルサポート。
【請求項２】
ＲＧＤエンリッチゼラチン内の割合が、少なくとも０．６、好ましくは少なくとも０．８、さらに好ましくは少なくとも１．０、さらに好ましくは少なくとも１．２、最も好ましくは少なくとも１．５であることを特徴とする、請求項１記載のセルサポート。
【請求項３】
ＲＧＤエンリッチゼラチン内のＲＧＤモチーフの数が、２５０のアミノ酸あたり少なくとも４であることを特徴とする、請求項１又は２記載のセルサポート。
【請求項４】
ＲＧＤエンリッチゼラチンが、ＲＧＤモチーフを少なくとも４、好ましくは６、さらに好ましくは８、より好ましくは１２以上１６以下含むことを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載のセルサポート。
【請求項５】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの分子量が約３０ｋＤa〜約２００ｋＤａであることを特徴とする、請求項１〜４いずれかに記載のセルサポート。
【請求項６】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの分子量が、６０ｋＤａ超、好ましくは７０ｋＤa超であることを特徴とする、請求項１〜５いずれかに記載のセルサポート。
【請求項７】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの分子量が、約１５０ｋＤａ未満であることを特徴とする、請求項１〜６いずれかに記載のセルサポート。
【請求項８】
ＲＧＤエンリッチゼラチンが、５％未満、好ましくは３％未満のヒドロキシプロリン残基を含むことを特徴とする、請求項１〜７いずれかに記載のセルサポート。
【請求項９】
ＲＧＤエンリッチゼラチンが、ｐＨ７〜７．５において正味の正電荷を有することを特徴とする、請求項１〜８いずれかに記載のセルサポート。
【請求項１０】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの少なくとも８０％が、天然ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなり、該天然ヒトコラーゲン配列が少なくとも３０のアミノ酸の長さを有することを特徴とする、請求項１〜９いずれかに記載のセルサポート。
【請求項１１】
ＲＧＤエンリッチゼラチンが、天然ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなることを特徴とする、請求項１０記載のセルサポート。
【請求項１２】
アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４であり、ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含み、かつ、該ゼラチンの少なくとも８０％が、天然ヒトコラーゲン配列の１又は複数の部分からなり、該天然ヒトコラーゲン配列が、少なくとも３０のアミノ酸の長さを有することを特徴とする、ＲＧＤエンリッチゼラチン。
【請求項１３】
ＲＧＤエンリッチゼラチンの分子量が、最大１０ｋＤa、好ましくは最大５ｋＤａであることを特徴とする、請求項１２記載のＲＧＤエンリッチゼラチン。
【請求項１４】
セルサポートがマイクロキャリアであることを特徴とする、請求項１〜１１いずれかに記載のセルサポート、又はクレーム１２記載のＲＧＤエンリッチゼラチンを含むセルサポート。
【請求項１５】
セルサポートが、ＲＧＤエンリッチでコーティングしたインプラント又は移植材料、ＲＧＤエンリッチでコーティングした組織工学用の足場、歯科製品（一部）、創傷治癒用製品（一部）、人工皮膚マトリックス材料（一部）及び組織接着剤（一部）からなる群から選択されることを特徴とする、クレーム１〜１１いずれかに記載のセルサポート、又はクレーム１２又は１３記載のＲＧＤエンリッチゼラチンを含むサポート。
【請求項１６】
クレーム１２記載のＲＧＤエンリッチゼラチンの、トラッグデリバリーシステム成分としての使用。
【請求項１７】
クレーム１３記載のＲＧＤエンリッチゼラチンの、ガン転移抑制剤としての使用。
【請求項１８】
クレーム１２又は１３記載のＲＧＤエンリッチゼラチンの、血小板凝集予防剤としての使用。
【請求項１９】
クレーム１３記載のＲＧＤエンリッチゼラチンの、手術後の組織接着予防剤としての使用。
【公表番号】特表２００７−５２８６９９（Ｐ２００７−５２８６９９Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７８５９（Ｐ２００６−５０７８５９）
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００２０８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５４７３
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０５２３２７８２）フジフィルム マニュファクチャリング ユーロプ ビー．ブイ． (50)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００２０８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５４７３
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０５２３２７８２）フジフィルム マニュファクチャリング ユーロプ ビー．ブイ． (50)
【Ｆターム（参考）】
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