変異サイクリンＧ１タンパク質
【課題】サイクリンＧ１タンパク質の機能を阻害することによる異常細胞増殖を伴う病的状態および疾患の処置であって、動物において増殖中の上記細胞に突然変異体サイクリンＧ１タンパク質を投与することによる処置を提供すること。
【解決手段】動物に変異サイクリンＧ１タンパク質を投与することによる、腫瘍の処置、癌の予防、および過形成、再狭窄、角膜の濁りおよび白内障の処置のための方法。変異サイクリンＧ１タンパク質は、動物に、変異サイクリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むレトロウイルスベクターのような発現媒体を投与することにより投与し得る。
【解決手段】動物に変異サイクリンＧ１タンパク質を投与することによる、腫瘍の処置、癌の予防、および過形成、再狭窄、角膜の濁りおよび白内障の処置のための方法。変異サイクリンＧ１タンパク質は、動物に、変異サイクリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むレトロウイルスベクターのような発現媒体を投与することにより投与し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
この発明は、突然変異サイクリンＧ１タンパク質を罹患動物に提供することに
より天然サイクリンＧ１タンパク質の機能を阻害することによる、異常な細胞増
殖を伴う病状および疾患、例えば腫瘍、癌、再狭窄、過形成、角膜混濁および白
内障の処置に関するものである。さらに具体的には、この発明は、突然変異サイ
クリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む、発現ビークル(
伝達体)、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを動物
に投与することによる上記病状および疾患の処置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
サイクリン類として知られている新種のタンパク質をコード化する遺伝子は、
新種のプロトオンコジーンとして同定されており、サイクリン依存的キナーゼ(
またはＣdk)阻害剤が腫瘍サプレッサーとして同定されている結果、細胞形質転
換および腫瘍発生の分子機構が細胞周期制御をつかさどる酵素学と結びつけられ
た。(非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４)。特異的サイクリン類の逐次発現および特異的Ｃdk複合体の本質的機能については既に特定されているため(Ｗuら、Ｉnt.Ｊ.Ｏncol.、第３巻、８５９−８６７頁(１９９３)、Ｐinesら、Ｎew Ｂiologist、第２巻、３８９−４０１頁(１９９０)、Ｐines、Ｃell Ｇrowth and Ｄifferentiation、第２巻、３０５−３１０頁(１９９１)、Ｒeed、Ａnn.Ｒev.Ｃell Ｂiol.、第８巻、５２９−５６１頁(１９９２)、Ｓherr、Ｃell、第７９巻、５５１−５５５頁(１９９４))、ＤＮＡ複製、転写、修復、遺伝子不安定性およびアポトーシスの基本機構との直接的関連づけが行なわれた。(Ｄ'Ｕrsoら、Ｓcience、第２５０巻、７８６−７９１(１９９０)、Ｗuら、Ｏncogene、第９巻、２０８９−２０９６頁(１９９４)、Ｒoy、Ｃell、第７９巻、１０９３−１１０１頁(１９９４)、Ｍeikrantzら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.、第９１巻
、３７５４−３７５８頁(１９９４))。
【０００３】
転移性癌腫は、悪い結果を伴う疾患であるため、遺伝子療法にとっては重要な
標的である。例えば、結腸直腸癌は、合衆国では肺癌に次ぐ癌死の第２の主要原
因であり、乳癌および膵臓癌がこれに続く(Ｓilberbergら、Ｃancer Ｃlin.、
第４０巻、９−２６頁(１９９０))。これらの癌腫のうち、膵臓癌の予後は最悪
である。転移性膵臓癌患者の生存中央値は３〜６ヶ月であり、事実上患者は総べ
て１年以内に死亡している(Ｍerrickら、Ｇastrenterol.Ｃlin.Ｎ.Ａmer.、第１
９巻、９３５−９６２頁(１９９０))。患者の約４０％は、診断時点で肝臓また
は腹腔またはその両方への転移性癌を呈する。転移性癌に対する化学療法は、多
モード療法にも拘わらず有効ではない。このため、転移性癌に対する別の治療法
が要望され得る。
【０００４】
Ｗuら(Ｏncol.Ｒeports、第１巻、７０５−７１１頁(１９９４))は、ヒトサイ
クリンＧ１タンパク質に関する推定アミノ酸配列およびcＤＮＡ配列を開示して
いる。Ｗuらはまた、正常な二倍体ヒト線維芽細胞における場合よりも高いサイ
クリンＧ１発現レベルが骨肉腫細胞およびユーイング肉腫細胞から見出されたこ
とを開示している。Ｗuらは、ヒト骨肉腫細胞におけるサイクリンＧ１タンパク
質の過剰発現が癌への潜在的関連性をもたらすと主張しているが、Ｗuらは、癌
細胞におけるサイクリンＧ１タンパク質の機能に干渉またはそれを阻害すること
による癌の処置について開示してはいない。
【０００５】
心筋および脳の両梗塞の主原因であるアテローム性硬化症は、合衆国およびヨ
ーロッパにおける全死亡数の〜５０％に関与している(Ｒoss、Ｎature、第３６
２巻、８０１−８０９頁(１９９３)、ＭurrayおよびＬopez、Ｔhe Ｇlobal Ｂ
urden of Ｄisease、ハーバード・ユニバーシティー・プレス、ケンブリッジ
、マサチューセッツ(１９９６))。バイパス移植および動脈内膜切除に加えて、
経皮的経管的冠動脈形成術(ＰＴＣＡ)は、血管狭窄症に対する標準的処置となっ
ている(Ｆitz Ｇibbonら、Ｃan.Ｊ.Ｃardiol.、第１２巻、８９３−９００頁(
１９９６))。初回ＰＴＣＡの成功率は９０％を優に越える程度まで増加している
が、この方法の長期有効性は、患者の〜３０−５０％における新生内膜過形成お
よび再狭窄の起こり得る発生により制限されており(Ｇlagov、Ｃirculation、第
８９巻、２８８８−２８９１頁(１９９４)、Ｓchwartzら、Ａm.Ｃoll.Ｃardiol.
、第１７巻、１２８４−１２９３頁(１９９２)、Ｍyersら、Ｗound Ｈealing
Ｒesponses in Ｃardiovascular Ｄisease、Ｗeber編、フツーラ・パブリッ
シング・カンパニー、マウント・キスコ、ニューヨーク、１３７−１５０頁(１
９９５)、Ｃhenら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.、第９９巻、２３３４−２３４１頁(１９
９７))、第２のＰＴＣＡが必要となるような程度に至ることも多い(Ｋirchengas
tら、Ｃardiovasc.Ｒes.、第３９巻、５５０−５５５頁(１９９８))。現在まで
のところ、広範囲に及ぶその用途を保証するのに充分有効な薬理学的戦略は無い
(Ｈerrmanら、Ｄrugs、第４６巻、１８−５２頁(１９９３)、Ｄe Ｍeyerおよび
Ｂult、Ｖascul.Ｍed.、第２巻、１７９−１８９頁(１９９７))。すなわち、新
生内膜形成の制御は、血管生物学における最新研究の主目標(Ｓchwartzら、Ｔhe
Ｉntima,Ｃirculation Ｒes.、第７７巻、４４５−４６５頁(１９９５))およ
び新規分子医薬の開発用モデルシステム(Ｇibbonsら、Ｓcience、２７２巻、６
８９−６９３頁(１９９６))を代表する。
【０００６】
成長因子シグナル伝達経路における高度の複雑度および重複性により、新規静
細胞療法の設計において保存された細胞周期制御経路の試験が促進された(Ｂarr
およびＬeiden、Ｔrends Ｃardiovasc.Ｍed.、第４巻、５７頁(１９９４)、Ａn
dres、Ｉnt.Ｊ.Ｍolecular,Ｍed.、第２巻、８１−８４頁(１９９８)、Ｂraun−
Ｄullaeusら、Ｃirculation、第９８巻、８２−８９頁(１９９８))。従って、Ｓ
ＭＣ増殖および新生内膜形成を阻止するための若干の新規遺伝子治療方法は、サ
イクリン依存的プロテインキナーゼ(ＣＤＫ)サブユニットのアンチセンス構築物
を代表するオリゴデオキシヌクレオチド(Ｍorishitaら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci
.、第９０巻、８４７４−８４７８頁(１９９３)、Ｍorishitaら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnv
est.、第９３巻、１４５８−１４６４頁(１９９４)、Ａbe、１９９４)、Ｃdk阻
害剤を担うアデノウイルスベクター(Ｃhangら、Ｓcience、第２６７巻、５１８
−５２２頁(１９９５)、Ｃhenら、１９９７)またはＲbタンパク質の構成的活性
形態を担うベクター(Ｃhangら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.、第９６巻、２２６０−２２
６８頁(１９９５)、Ｓmithら、Ｅxp.Ｃell Ｒes.、第２３０巻、６１−６８頁(
１９９７))を含む、特異的細胞周期制御エレメントに集中している。他の試験は
、多細胞周期制御遺伝子の誘導を調節する、転写因子Ｅ２Ｆに対して向けられた
分子「おとり」オリゴデオキシヌクレオチド戦略を採用している(Ｍorishitaら
、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.、第９２巻、５８５５−５８５９頁(１９９５))。こ
れらの実験的方法の報告された効力は、新生内膜病変で選択的にアップレギュレ
ーションされている細胞周期制御エレメントが戦略的治療標的を表すという概念
を裏付けしている。
最近の研究は、げっ歯動物(Ｚhuら、２０００、提示)および非ヒト霊長類(Ｋa
ijin Ｗuら、１９９９、提示)におけるバルーンカテーテル創傷後の、誘導可能
な細胞周期制御エレメントである、サイクリンＧ１のアップレギュレーションを
特徴としている(Ｔamuraら、Ｏncogene、第８巻、２１１３−２１１８頁(１９９
３)、Ｗuら、１９９４、Ｈomeら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、第２７１巻、６０５０−６
０６１頁(１９９６)、Ｍorishitaら、１９９５)。インビトロでのトランスフェ
クション細胞におけるサイクリンＧ１の強制発現により、細胞周期は加速され、
クローン伸展は促進され(Ｓmithら、Ｅxp.Ｃell,Ｒes.、第２３０巻、６１−６
８頁(１９９７))、そしてアンチセンス戦略によるサイクリンＧ１発現の遮断に
より、細胞性塞栓および細胞崩壊が誘導される(Ｓkotzkoら、Ｃancer Ｒes.、
５５巻、６１−６８頁(１９９５)、Ｃhenら、Ｈum.Ｇene Ｔher.、第８巻、１
６６７−１６７４頁(１９９７)、Ｈungら、Ｉnt.Ｊ.Ｐediatr.Ｈematol.Ｏncol.
、第４巻、３１７−３２５頁(１９９７))。ＳＭＣ増殖に関連して、(i)充分に高
い力価(１０８cfu／ml)に濃縮されたアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイル
スベクターは、形質導入ラット(Ｚhuら、Ｃirculation、第４６巻、６２８−６
３５頁(１９９７))および霊長類血管ＳＭＣの生存および増殖を阻害すること(観
察結果は未発表)、および(ii)バルーン創傷ラット頚動脈におけるこの濃縮アン
チセンスサイクリンＧ１ベクターの管内送達により、インビボ新生内膜形成の顕
著な縮小が誘発されること(Ｚhuら、１９９７)が示された。従って、サイクリン
Ｇ１は、血管再狭窄の治療技術における治療的介入にとって適切かつ有利な座で
あると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈallら、Ｃurr.Ｏpin.Ｃell Ｂiol.、第３巻、１７６−１８４頁(１９９１)
【非特許文献２】Ｈunterら、Ｃell、第７９巻、５７３−５８２頁(１９９４)
【非特許文献３】Ｅlledgeら、Ｃurr.Ｏpin.Ｃell.Ｂiol.、第６巻、８７４−８７８頁(１９９４)
【非特許文献４】Ｐeterら、Ｃell、第７９巻、１８１−１８４頁(１９９４)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
(発明の要約)
出願者らは、癌細胞におけるサイクリンＧ１タンパク質の機能に干渉および／
またはこれを阻害することにより、上記癌細胞の増殖および／または生存が阻止
、予防または破壊され得ることを発見した。すなわち、本発明は、サイクリンＧ
１タンパク質の機能を阻害することによる異常細胞増殖を伴う病的状態および疾
患の処置であって、動物において増殖中の上記細胞に突然変異体サイクリンＧ１
タンパク質を投与することによる処置に関するものである。上記病的状態および
疾患には、癌、腫瘍、過形成、再狭窄、角膜混濁および白内障があるが、これら
に限定されるわけではない。好ましい態様では、突然変異体または変異体サイク
リンＧ１タンパク質は、突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリ
ヌクレオチドを含む発現ビークルの送達により罹患動物に投与される。上記発現
ビークルには、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターおよびアデノ
ウイルスベクター、および合成ベクターがあるが、これらに限定されるわけでは
ない。本発明方法により有効に処置され得る動物には、哺乳類、例えばヒトおよ
び非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシおよびヒツジがあるが、これらに限定
されるわけではない。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１） 動物における異常細胞増殖が関与する病理学的状態または疾
患を処置または予防する方法であり、該動物に変異サイクリンＧ１タンパク質を
投与し、該変異サイクリンＧ１タンパク質は、該病理学的状態または疾患を処置
または予防するのに有効な量で投与される、方法。
（項目２） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、該動物に、該変異サイ
クリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を送達させるこ
とにより投与される、項目１に記載の方法。
（項目３） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、該動物に、該動物の異
常増殖細胞に、該変異サイクリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含
む発現媒体を形質導入することにより投与される、項目１に記載の方法。
（項目４） 該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目２に記
載の方法。
（項目５） 該発現媒体がマトリックス−標的化レトロウイルスベクター
である、項目４に記載の方法。
（項目６） 該マトリックス標的化レトロウイルスベクターを、動物に全
身的に投与する、項目５に記載の方法。
（項目７） 該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目２に記
載の方法。
（項目８） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、アミノ末端切断サイク
リンＧ１タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目９） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１タ
ンパク質のアミノ酸残基４１から２４９に対応するサイクリンＧ１タンパク質の
アミノ酸残基を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質のアミノ酸残基４１から２４９を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、少なくとも一つのア
ミノ酸置換を有するサイクリンＧ１タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２） 該置換がヒトサイクリンＧ１タンパク質の残基６１に対応
する残基においてである、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 該変異サイクリンＧ１タンパク質がヒトサイクリンＧ１タ
ンパク質である、項目１１に記載の方法。
（項目１４） 該置換がアラニンである、項目１２に記載の方法。
（項目１５） 該病理学的状態または疾患が、腫瘍、癌、過形成、再狭窄
、角膜の濁りおよび白内障からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１６） 該病理学的状態または疾患が、腫瘍および癌からなる群か
ら選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目１８） 変異サイクリンＧ１タンパク質をコードする、遺伝子構築
物。
（項目１９） 変異サイクリンＧ１が野生型サイクリンＧ１の優勢な陰性
阻害剤である、項目１８に記載の遺伝子構築物。
（項目２０） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、野生型サイクリンＧ
１のサイクリンボックスに欠失を含む、項目１８に記載の遺伝子構築物。
（項目２１） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、アミノ末端切断サイ
クリンＧ１タンパク質を含む、項目１８に記載の遺伝子構築物。
（項目２２） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質の残基４１から２４９に対応するサイクリンＧ１タンパク質のアミノ
酸残基を含む、項目２１に記載の遺伝子構築物。
（項目２３） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質の残基４１から２４９を含む、項目２２に記載の遺伝子構築物。
（項目２４） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、少なくとも一つのア
ミノ酸置換を有するサイクリンＧ１タンパク質を含む、項目１８に記載の遺伝
子構築物。
（項目２５） 該置換がヒトサイクリンＧ１タンパク質の残基６１に対応
する残基においてである、項目２４に記載の遺伝子構築物。
（項目２６） 該変異サイクリンＧ１タンパク質がヒトサイクリンＧ１タ
ンパク質である、項目２５に記載の遺伝子構築物。
（項目２７） 該置換がアラニンである、項目２６に記載の遺伝子構築
物。
（項目２８） 項目１８に記載の遺伝子構築物を含む、発現媒体。
（項目２９） 該発現媒体がウイルスベクターである、項目２８に記載
の発現媒体。
（項目３０） 該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目２９
に記載の発現媒体。
（項目３１） 該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目２９
に記載の発現媒体。
（項目３２） 細胞に変異サイクリンＧ１タンパク質を投与し、該変異サ
イクリンＧ１タンパク質が細胞分割を防止するのに有効な量で投与される、細胞
の分割を防止する方法。
（項目３３） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、該細胞に、該変異サ
イクリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を送達させる
ことにより投与される、項目３２に記載の方法。
（項目３４） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、該細胞に、該細胞を
該変異サイクリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を形
質導入することにより投与される、項目３２に記載の方法。
（項目３５） 該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目３３
に記載の方法。
（項目３６） 該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目３３
に記載の方法。
（項目３７） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、アミノ末端切断サイ
クリンＧ１タンパク質を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３８） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質のアミノ酸残基４１から２４９に対応するサイクリンＧ１タンパク質
のアミノ酸残基を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質のアミノ酸残基４１から２４９を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、少なくとも一つのア
ミノ酸置換を有するサイクリンＧ１タンパク質を含む、項目３２に記載の方法
。
（項目４１） 該置換がヒトサイクリンＧ１タンパク質の残基６１に対応
する残基においてである、項目４０に記載の方法。
（項目４２） 該変異サイクリンＧ１タンパク質がヒトサイクリンＧ１タ
ンパク質である、項目４０に記載の方法。
（項目４３） 該置換がアラニンである、項目４１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ＭiaＰaca２細胞におけるマトリックス標的レトロウイルスベクターの形質導入効率。β−ガラクトシダーゼ発現性細胞は、青色染色核により示されている。
【図１Ｂ】ＭiaＰaca癌細胞における突然変異体サイクリンＧ１構築物を担うマトリックス標的レトロウイルスベクターの細胞増殖抑制効果。縦軸でプロットされた１ウェル当たりの細胞数は、横軸でプロットされた時間(形質導入後の日数)の関数として表されている。Ｄ１０培地対照、neor遺伝子のみを担うヌルベクター、アンチセンスサイクリンＧ１構築物を担うＡＳ５８７およびＡＳ６９３ベクター、ＤＮＴ４１〜２４９、またはヒトサイクリンＧ１のＮ末端に欠失をもつdnＧ１ベクター。
【図１Ｃ】Ｇ４１８選択を伴わないdnＧ１ベクター‐対ヌルベクター‐形質導入癌細胞におけるヒトサイクリンＧ１タンパク質発現のウエスタン分析。免疫反応性dnＧ１(サイクリンＧ１ ＤＮ４１)は、２０kＤaの領域における明染色バンドとして検出され(レーン２)、内在性サイクリンＧ１タンパク質は、〜３０kＤaの領域における強染色バンドとして見られる(レーン１−３)。
【図２】転移性腫瘍病巣におけるヒトサイクリンＧ１タンパク質発現。抗ヒトサイクリンＧ１抗体との免疫反応性サイクリンＧ１(褐色染色物質)の強度染色により証明されているＰＢＳ処置動物の腫瘍病巣(Ａ；t)および低用量dnＧ１ベクター処置動物の残留腫瘍病巣(Ｂ；矢印)における高レベルヒトサイクリンＧ１タンパク質発現。
【図３−１】肝臓の組織断片のヘマトキシリン‐エオシン染色は、ＰＢＳ対照群(Ａ＆Ｃ、４０Ｘおよび１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｂ＆Ｄ、４０Ｘおよび１００Ｘ)からの腫瘍病巣を表す。ＰＢＳ対照群(Ｅ、１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｆ＆Ｈ：１００Ｘおよび２００Ｘ；矢印)の腫瘍病巣におけるアポトーシスは、ＡpopＴagＰlusペルオキシダーゼ原位置(in situ)アポトーシス検定において帯赤褐色免疫染色物質として描かれている。(Ｇ)末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼＴdＴ酵素を伴わない負の染色対照、t＝腫瘍病巣、h＝肝臓実質における肝細胞。
【図３−２】肝臓の組織断片のヘマトキシリン‐エオシン染色は、ＰＢＳ対照群(Ａ＆Ｃ、４０Ｘおよび１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｂ＆Ｄ、４０Ｘおよび１００Ｘ)からの腫瘍病巣を表す。ＰＢＳ対照群(Ｅ、１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｆ＆Ｈ：１００Ｘおよび２００Ｘ；矢印)の腫瘍病巣におけるアポトーシスは、ＡpopＴagＰlusペルオキシダーゼ原位置(in situ)アポトーシス検定において帯赤褐色免疫染色物質として描かれている。(Ｇ)末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼＴdＴ酵素を伴わない負の染色対照、t＝腫瘍病巣、h＝肝臓実質における肝細胞。
【図４】ヒトサイクリンＧ１配列は、ヒトサイクリンＩ、ヒトサイクリンＡおよびＳ.ＰomＣig１の場合と比較して示されている。保存領域は灰色四角により示されている。
【図５】pＲＥＸレトロウイルス発現ベクターへのヒトサイクリンＧ１cＤＮＡのクローニング。図は、pＧ１ＰＭ６１Ａ／ＲＥＸへの点突然変異体サイクリンＧ１(ＰＭ６１)の段階クローニングを示す。
【図６】pＲＥＸ、アンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１構築物の概略図。(Ａ)pＲＥＸレトロウイルス発現ベクターの地図および制限クローニング部位(Ｂ)アンチセンスサイクリンＧ１フラグメントの概略図(Ｃ)突然変異体サイクリンＧ１フラグメントの概略図。
【図７】マーカー遺伝子および突然変異体サイクリンＧ１構築物をもつマトリックス標的レトロウイルスベクターによるラットＡ１０およびサルＳＭＣのプラスミドＤＮＡトランスフェクション、形質導入効率および形質導入のインビトロ試験。(Ａ)突然変異体サイクリンＧ１プラスミドＤＮＡ構築物によりトランスフェクションされたラットＡ１０ ＳＭＣの増殖。縦軸でプロットされた細胞数は、横軸でプロットされた時間、すなわち形質導入後の日数の関数として表されている。(Ｂ)核標的β−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつマトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型レトロウイルスベクターを用いた単一２時間形質導入後のラットＡ１０細胞培養物における形質導入効率。形質導入効率％は、感染多重度の関数(logＭＯＩ)として表されている、(Ｃ)突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクターにより形質導入されたヒトＭiaＰaca細胞の増殖、(Ｄ)突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣの増殖。
【図８】二重エンベロープ立体配置でマトリックス‐ターゲッティングモチーフおよびＶＳＶＧタンパク質を表すアンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１ベクターの一時的トランスフェクション計画およびビリオン組込み。(Ａ)各々ＣＭＶプロモーターから発現された、パッケージング成分gag‐pol、マトリックス標的(ＣＢＤ)env、融合誘導性ＶＳＶＧenv、およびサイクリンＧ１構築物をもつレトロウイルスベクターが別々のプラスミドに配置されており、各々ＳＶ４０複製起点を含んでいる、一時的４プラスミド同時トランスフェクションシステム(Ｓoneokaら、１９９５)を用いてレトロウイルスストックが作製された。(Ｂ)ウエスタン分析は、〜７０kＤaの領域、〜６４kＤaでのＶＳＶＧタンパク質、および３６および５０kＤa間のウイルスgag(ＣＡ)タンパク質対照へ移動する免疫反応性バンドとしてＭＬＶベースのgp７０envタンパク質を示す。モック(模擬)＝エンベロープ対照無し、ＣＡＥ１０９対照＝ＷＴ ＭＬＶenvを伴う非標的ヌルベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ１０９対照＝二重env立体配置でコラーゲン結合性モチーフおよびＶＳＶＧタンパク質を表すＭＬＶenvを伴うマトリックス標的ヌルベクター、ＣＡＥ５８７＝ＷＴenvを伴う非標的アンチセンスサイクリンＧ１−５８７ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ５８７＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型アンチセンスサイクリンＧ１−５８７、ＣＡＥ６９３＝ＷＴenvを伴う非標的アンチセンスサイクリンＧ１−６９３ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ６９３＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型アンチセンスサイクリンＧ１−６９３、ＣＡＥ Ｄ／Ｎ(４１−２４９)＝ＷＴenvを伴う非標的突然変異体Ｄ／Ｎ(４１−２４９)ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ Ｄ／Ｎ(４１−２４９)＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型突然変異体Ｄ／Ｎ(４１−２４９)ベクター。
【図９】アンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクターによる形質導入後のラットＡ１０細胞培養物におけるシンシチウム形成。光学顕微鏡写真は、形質導入されたラットＡ１０細胞の形態学的外見を表し、(Ａ＆Ｂ)ヌルベクター、(Ｃ＆Ｄ)アンチセンスサイクリンＧ１−６９３ベクター、(Ｄ＆Ｅ)突然変異体サイクリンＧ１(dnＧ１)ベクターによる場合である。シンシチウムは矢印により示されている。
【図１０】突然変異体サイクリンＧ１ベクターにより形質導入されたサルおよびラットＡ１０細胞におけるサイクリンＧ１発現のウェスタンブロット分析。形質導入の１２、２４および４８時間後における形質導入細胞の細胞性タンパク質を、ヌル対照ベクターにより形質導入された細胞の場合と比較した。(Ａ)ヌルベクター(「ベクター」)による場合と比較した、アンチセンスサイクリンＧ１−６９３レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣ培養物における免疫反応性ヒトサイクリンＧ１タンパク質の発現減少(Ｂ)対照ベクター(「ベクター」)により形質導入された細胞には存在しなかった、dnＧ１レトロウイルスベクターによる形質導入の２４および４８時間後のラットＡ１０細胞培養物における２０kＤaでの免疫反応性突然変異体ヒトサイクリンＧ１(p２０突然変異体)の外観。
【図１１】バルーン創傷ラット動脈におけるラットサイクリンＧ１タンパク質の免疫組織化学的染色。(Ａ)ヌルベクター‐(Ｂ)ＰＢＳおよび(Ｄ)dnＧ１ベクター‐処理動脈切片の新生内膜細胞におけるサイクリンＧ１核免疫反応性増強(帯赤褐色核染色により示されている)。(Ｃ)アンチセンスサイクリンＧ１−６９３処理動脈切片におけるサイクリンＧ１免疫反応性の強度減少。
【図１２】マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型dnＧ１ベクターを用いた１ヶ月インビボ効率試験。(Ａ)ＰＢＳ対照、(Ｂ)食塩水、(Ｃ)ヌルベクターおよび(Ｄ)dnＧ１ベクターのバルーン創傷および管内滴中の１ヶ月後に採取されたラット頚動脈からのエラスチン染色組織断片。
【図１３】Ｍx−dnＧ１ベクターの一(７日)処理周期による腫瘍増殖の抑止。細胞致死性ベクターを合計７日間毎日尾部静脈へ直接注射した。ノギスを用いて腫瘍体積の測定結果を得た後、８日目に動物を殺した。ただし、図１３Ａにおける動物の処理開始時における腫瘍体積は、図１３Ｂにおける場合よりもかなり大きかった。しかしながら、両実験とも、Ｍx−dnＧ１ベクターによる処理の４日目までに腫瘍サイズのかなりの減少が観察され(n＝６)、腫瘍サイズの漸進的増加が対照Ｍx−nＢgベクターにより処理された動物で認められた(n＝４)。腫瘍体積(mm３；縦軸でプロットされている)は、時間(日数；横軸でプロットされている)の関数として表された。
【図１４】(Ａ)Ｍx−dnＧ１ベクターを用いた長期効率試験。確立された腫瘍異種移植片(腫瘍体積〜５０mm３)をもつマウスに対し無作為に偽薬(ＰＢＳ；n＝３)、非標的ＣＡＥ−dnＧ１ベクター(n＝４)またはマトリックス標的Ｍx−dnＧ１ベクター(n＝４)を投与した。２００μlベクター(ベクター用量：８×１０６cfu)または等量の偽薬を、１０服用期間(１処理周期)(偽薬群)または２処理周期間(ＣＡＥ−dnＧ１またはＭx−dnＧ１群)毎日または隔日に末梢(背側尾部)静脈に直接注射し、合間に２週間休止期間をおいた。腫瘍体積(mm３、縦軸でプロットされている)は、時間(日数、横軸でプロットされている)の関数として表されている。(Ｂ)Ｍx−dnＧ１ベクター処理マウスにおけるカプラン‐マイヤー生存試験。(Ａ)では動物のカプラン‐マイヤー生存曲線(終点として腫瘍が４倍になるまでの時間を表す)が示されている。偽薬群は連続線により表され、ＣＡＥ−dnＧ１群は短い点線により表され、Ｍx−dnＧ１群は長い点線により表されている。生存フラクション(４倍にはなっていない腫瘍を伴う動物を表す；縦軸でプロットされている)は、時間(日数；横軸でプロットされている)の関数として表されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
(図面の簡単な記載)
以下、図面に関して本発明を説明する。
図１ (Ａ) ＭiaＰaca２細胞におけるマトリックス標的レトロウイルスベク
ターの形質導入効率。β−ガラクトシダーゼ発現性細胞は、青色染色核により示
されている。(Ｂ)ＭiaＰaca癌細胞における突然変異体サイクリンＧ１構築物を
担うマトリックス標的レトロウイルスベクターの細胞増殖抑制効果。縦軸でプロ
ットされた１ウェル当たりの細胞数は、横軸でプロットされた時間(形質導入後
の日数)の関数として表されている。Ｄ１０培地対照、neor遺伝子のみを担うヌ
ルベクター、アンチセンスサイクリンＧ１構築物を担うＡＳ５８７およびＡＳ６
９３ベクター、ＤＮＴ４１〜２４９、またはヒトサイクリンＧ１のＮ末端に欠失
をもつdnＧ１ベクター。(Ｃ)Ｇ４１８選択を伴わないdnＧ１ベクター‐対ヌルベ
クター‐形質導入癌細胞におけるヒトサイクリンＧ１タンパク質発現のウエスタ
ン分析。免疫反応性dnＧ１(サイクリンＧ１ ＤＮ４１)は、２０kＤaの領域にお
ける明染色バンドとして検出され(レーン２)、内在性サイクリンＧ１タンパク質
は、〜３０kＤaの領域における強染色バンドとして見られる(レーン１−３)。
図２ 転移性腫瘍病巣におけるヒトサイクリンＧ１タンパク質発現。抗ヒトサ
イクリンＧ１抗体との免疫反応性サイクリンＧ１(褐色染色物質)の強度染色によ
り証明されているＰＢＳ処置動物の腫瘍病巣(Ａ；t)および低用量dnＧ１ベクタ
ー処置動物の残留腫瘍病巣(Ｂ；矢印)における高レベルヒトサイクリンＧ１タン
パク質発現。
【００１１】
図３ 肝臓の組織断片のヘマトキシリン‐エオシン染色は、ＰＢＳ対照群(Ａ
＆Ｃ、４０Ｘおよび１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｂ＆Ｄ、４０Ｘお
よび１００Ｘ)からの腫瘍病巣を表す。ＰＢＳ対照群(Ｅ、１００Ｘ)およびdnＧ
１ベクター処置動物(Ｆ＆Ｈ：１００Ｘおよび２００Ｘ；矢印)の腫瘍病巣におけ
るアポトーシスは、ＡpopＴagＰlusペルオキシダーゼ原位置(in situ)アポトー
シス検定において帯赤褐色免疫染色物質として描かれている。(Ｇ)末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼＴdＴ酵素を伴わない負の染色対照、t＝腫瘍
病巣、h＝肝臓実質における肝細胞。
【００１２】
図４ ヒトサイクリンＧ１配列は、ヒトサイクリンＩ、ヒトサイクリンＡおよ
びＳ.ＰomＣig１の場合と比較して示されている。保存領域は灰色四角により示
されている。
【００１３】
図５ pＲＥＸレトロウイルス発現ベクターへのヒトサイクリンＧ１cＤＮＡの
クローニング。図は、pＧ１ＰＭ６１Ａ／ＲＥＸへの点突然変異体サイクリンＧ
１(ＰＭ６１)の段階クローニングを示す。
【００１４】
図６ pＲＥＸ、アンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１構築物の概略
図。(Ａ)pＲＥＸレトロウイルス発現ベクターの地図および制限クローニング部
位(Ｂ)アンチセンスサイクリンＧ１フラグメントの概略図(Ｃ)突然変異体サイク
リンＧ１フラグメントの概略図。
【００１５】
図７ マーカー遺伝子および突然変異体サイクリンＧ１構築物をもつマトリッ
クス標的レトロウイルスベクターによるラットＡ１０およびサルＳＭＣのプラス
ミドＤＮＡトランスフェクション、形質導入効率および形質導入のインビトロ試
験。(Ａ)突然変異体サイクリンＧ１プラスミドＤＮＡ構築物によりトランスフェ
クションされたラットＡ１０ ＳＭＣの増殖。縦軸でプロットされた細胞数は、
横軸でプロットされた時間、すなわち形質導入後の日数の関数として表されてい
る。(Ｂ)核標的β−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつマトリックス標的ＶＳＶＧ偽
類型レトロウイルスベクターを用いた単一２時間形質導入後のラットＡ１０細胞
培養物における形質導入効率。形質導入効率％は、感染多重度の関数(logＭＯＩ
)として表されている、(Ｃ)突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクター
により形質導入されたヒトＭiaＰaca細胞の増殖、(Ｄ)突然変異体サイクリンＧ
１レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣの増殖。
【００１６】
図８ 二重エンベロープ立体配置でマトリックス‐ターゲッティングモチーフ
およびＶＳＶＧタンパク質を表すアンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１
ベクターの一時的トランスフェクション計画およびビリオン組込み。(Ａ)各々Ｃ
ＭＶプロモーターから発現された、パッケージング成分gag‐pol、マトリックス
標的(ＣＢＤ)env、融合誘導性ＶＳＶＧenv、およびサイクリンＧ１構築物をもつ
レトロウイルスベクターが別々のプラスミドに配置されており、各々ＳＶ４０複
製起点を含んでいる、一時的４プラスミド同時トランスフェクションシステム(
Ｓoneokaら、１９９５)を用いてレトロウイルスストックが作製された。(Ｂ)ウ
エスタン分析は、〜７０kＤaの領域、〜６４kＤaでのＶＳＶＧタンパク質、およ
び３６および５０kＤa間のウイルスgag(ＣＡ)タンパク質対照へ移動する免疫反
応性バンドとしてＭＬＶベースのgp７０envタンパク質を示す。モック(模擬)＝
エンベロープ対照無し、ＣＡＥ１０９対照＝ＷＴ ＭＬＶenvを伴う非標的ヌル
ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ１０９対照＝二重env立体配置でコラーゲン結合性モ
チーフおよびＶＳＶＧタンパク質を表すＭＬＶenvを伴うマトリックス標的ヌル
ベクター、ＣＡＥ５８７＝ＷＴenvを伴う非標的アンチセンスサイクリンＧ１−
５８７ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ５８７＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型ア
ンチセンスサイクリンＧ１−５８７、ＣＡＥ６９３＝ＷＴenvを伴う非標的アン
チセンスサイクリンＧ１−６９３ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ６９３＝マトリッ
クス標的ＶＳＶＧ偽類型アンチセンスサイクリンＧ１−６９３、ＣＡＥ Ｄ／Ｎ
(４１−２４９)＝ＷＴenvを伴う非標的突然変異体Ｄ／Ｎ(４１−２４９)ベクタ
ー、Ｈs２＋ＶＳＶＧ Ｄ／Ｎ(４１−２４９)＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類
型突然変異体Ｄ／Ｎ(４１−２４９)ベクター。
【００１７】
図９ アンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクター
による形質導入後のラットＡ１０細胞培養物におけるシンシチウム形成。光学顕
微鏡写真は、形質導入されたラットＡ１０細胞の形態学的外見を表し、(Ａ＆Ｂ)
ヌルベクター、(Ｃ＆Ｄ)アンチセンスサイクリンＧ１−６９３ベクター、(Ｄ＆
Ｅ)突然変異体サイクリンＧ１(dnＧ１)ベクターによる場合である。シンシチウ
ムは矢印により示されている。
【００１８】
図１０ 突然変異体サイクリンＧ１ベクターにより形質導入されたサルおよび
ラットＡ１０細胞におけるサイクリンＧ１発現のウェスタンブロット分析。形質
導入の１２、２４および４８時間後における形質導入細胞の細胞性タンパク質を
、ヌル対照ベクターにより形質導入された細胞の場合と比較した。(Ａ)ヌルベク
ター(「ベクター」)による場合と比較した、アンチセンスサイクリンＧ１−６９
３レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣ培養物における免疫
反応性ヒトサイクリンＧ１タンパク質の発現減少(Ｂ)対照ベクター(「ベクター
」)により形質導入された細胞には存在しなかった、dnＧ１レトロウイルスベク
ターによる形質導入の２４および４８時間後のラットＡ１０細胞培養物における
２０kＤaでの免疫反応性突然変異体ヒトサイクリンＧ１(p２０突然変異体)の外
観。
【００１９】
図１１ バルーン創傷ラット動脈におけるラットサイクリンＧ１タンパク質の
免疫組織化学的染色。(Ａ)ヌルベクター‐(Ｂ)ＰＢＳおよび(Ｄ)dnＧ１ベクター
‐処理動脈切片の新生内膜細胞におけるサイクリンＧ１核免疫反応性増強(帯赤
褐色核染色により示されている)。(Ｃ)アンチセンスサイクリンＧ１−６９３処
理動脈切片におけるサイクリンＧ１免疫反応性の強度減少。
【００２０】
図１２ マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型dnＧ１ベクターを用いた１ヶ月イン
ビボ効率試験。(Ａ)ＰＢＳ対照、(Ｂ)食塩水、(Ｃ)ヌルベクターおよび(Ｄ)dnＧ
１ベクターのバルーン創傷および管内滴中の１ヶ月後に採取されたラット頚動脈
からのエラスチン染色組織断片。
【００２１】
図１３ Ｍx−dnＧ１ベクターの一(７日)処理周期による腫瘍増殖の抑止。細
胞致死性ベクターを合計７日間毎日尾部静脈へ直接注射した。ノギスを用いて腫
瘍体積の測定結果を得た後、８日目に動物を殺した。ただし、図１３Ａにおける
動物の処理開始時における腫瘍体積は、図１３Ｂにおける場合よりもかなり大き
かった。しかしながら、両実験とも、Ｍx−dnＧ１ベクターによる処理の４日目
までに腫瘍サイズのかなりの減少が観察され(n＝６)、腫瘍サイズの漸進的増加
が対照Ｍx−nＢgベクターにより処理された動物で認められた(n＝４)。腫瘍体積
(mm３；縦軸でプロットされている)は、時間(日数；横軸でプロットされている)
の関数として表された。
【００２２】
図１４ (Ａ)Ｍx−dnＧ１ベクターを用いた長期効率試験。確立された腫瘍異
種移植片(腫瘍体積〜５０mm３)をもつマウスに対し無作為に偽薬(ＰＢＳ；n＝３
)、非標的ＣＡＥ−dnＧ１ベクター(n＝４)またはマトリックス標的Ｍx−dnＧ１
ベクター(n＝４)を投与した。２００μlベクター(ベクター用量：８×１０６cfu
)または等量の偽薬を、１０服用期間(１処理周期)(偽薬群)または２処理周期間(
ＣＡＥ−dnＧ１またはＭx−dnＧ１群)毎日または隔日に末梢(背側尾部)静脈に直
接注射し、合間に２週間休止期間をおいた。腫瘍体積(mm３、縦軸でプロットさ
れている)は、時間(日数、横軸でプロットされている)の関数として表されてい
る。(Ｂ)Ｍx−dnＧ１ベクター処理マウスにおけるカプラン‐マイヤー生存試験
。(Ａ)では動物のカプラン‐マイヤー生存曲線(終点として腫瘍が４倍になるま
での時間を表す)が示されている。偽薬群は連続線により表され、ＣＡＥ−dnＧ
１群は短い点線により表され、Ｍx−dnＧ１群は長い点線により表されている。
生存フラクション(４倍にはなっていない腫瘍を伴う動物を表す；縦軸でプロッ
トされている)は、時間(日数；横軸でプロットされている)の関数として表され
ている。
【００２３】
(発明の詳細な説明)
本発明の一態様によると、異常な細胞増殖を伴う病的状態または疾患に罹患し
た動物の処置方法が提供される。上記状態および疾患には、腫瘍、癌、過形成、
再狭窄、角膜混濁および白内障が含まれる。この方法は、突然変異サイクリンＧ
１タンパク質を動物または動物における病的細胞、組織または臓器に投与するこ
とを含む。突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、異常な細胞増殖を低減化また
は阻害するかまたは病状もしくは疾患を改善、治癒または予防するのに有効な量
で投与される。好ましい態様において、本発明方法は、特に腫瘍および癌の処置
に関するものである。
【００２４】
ここで使用されている「腫瘍または癌を処置する」の語は、腫瘍または癌細胞
の増殖の阻止、予防または破壊がもたらされることを意味する。本発明方法によ
り有益に処置され得る腫瘍および癌には、リンパ腫、白血病、肉腫および癌腫が
あるが、これらに限定されるわけではない。
【００２５】
ここで使用されている「過形成」の語は、組織または臓器における細胞の異常
増殖を伴う非腫瘍性病的状態または疾患を意味する。本発明方法により有益に処
置され得る過形成には、脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖症、木村病、血管類リンパ
組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、キャッスルマン病、
セメント質肥大、先天性副腎過形成、先天性脂腺増生症、先天性男性化副腎過形
成、嚢胞性増殖症、線維筋過形成、ヘック病、血管内乳頭状内皮過形成、神経過
形成、扁平上皮過形成およびゆうぜい性肥厚があるがこれらに限定されるわけで
はない。
【００２６】
ここで使用されている「突然変異サイクリンＧ１タンパク質」の語は、真核生
物体からの天然サイクリンＧ１タンパク質を意味するが、１個またはそれ以上の
アミノ酸欠失、置換、付加、および／またはそれらの組合わせを伴う。ある種の
態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は動物に由来する。好ましい
態様において、サイクリンＧ１タンパク質は処置されている動物と密接に関連し
た動物種に由来する(例、突然変異チンパンジーサイクリンＧ１タンパク質がヒ
トの処置に使用されている)。最も好ましい態様において、突然変異サイクリン
Ｇ１タンパク質は、処置されている動物と同じ動物種に由来する。
【００２７】
ヒトサイクリンＧ１タンパク質のアミノ酸配列は、図４に示されている。一態
様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、アミノ末端先端切除サイク
リンＧ１タンパク質を含む。一態様において、サイクリンＧ１タンパク質のＮ−
末端における初めの１１７までのアミノ酸残基が欠失され得る。好ましい態様に
おいて、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、アミノ酸残基４０を含むそれ以
下のＮ−末端欠失を含むサイクリンＧ１タンパク質である。最も好ましい態様に
おいて、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、アミノ酸残基１から４０までの
Ｎ−末端欠失を含むヒトサイクリンＧ１タンパク質である。実施態様において、
突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、ヒトサイクリンＧ１タンパク質のアミノ
酸残基４１〜２４９により構成される。
【００２８】
他の態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、ヒトサイクリンＧ
１タンパク質の残基６１に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む完全長ま
たは先端切除サイクリンＧ１タンパク質である。好ましい態様において、突然変
異サイクリンＧ１タンパク質は、その残基にアラニン置換を有する。実施態様に
おいて、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、残基６１にリシンまたはアラニ
ン置換を有する完全長または先端切除ヒトサイクリンＧ１タンパク質である。
【００２９】
突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、当業界における熟練者には公知の技術
により製造され得る。例えば、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、自動ペプ
チドまたはタンパク質合成装置により製造され得る。別法として、突然変異サイ
クリンＧ１タンパク質は、遺伝子工学技術により製造され得る。
【００３０】
一態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、突然変異サイクリン
Ｇ１タンパク質をコード化する遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドの送達によ
り、病的状態または疾患を発現している動物または細胞、組織または臓器に直接
投与される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、適当な発現ビークルを含む。
【００３１】
ここで使用されている「ポリヌクレオチド」の語は、あらゆる長さのヌクレオ
チドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチド類およびデオキシリボヌクレオ
チド類を包含する。上記の語はまた、１本および２本鎖ＤＮＡ、並びに１本およ
び２本鎖ＲＮＡを包含する。この語はまた、修飾ポリヌクレオチド、例えばメチ
ル化またはキャップポリヌクレオチド類を包含する。
【００３２】
突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード化する遺伝子構築物は、適当なプ
ロモーターを機能し得るように随伴した突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコ
ード化する配列を含む。本発明によると、適当なプロモーターは、処置動物にお
いて活性を示すものであればいずれのものでもよい。好ましい態様において、プ
ロモーターは、異常増殖している細胞において高い活性を呈するか、および／ま
たはそれに特異的なものである。しかしながら、本発明の範囲は特異的プロモー
ターに限定されるわけではないものと理解すべきである。一実施態様においては
、プロモーターはサイクリンＧ１プロモーターである。突然変異サイクリンＧ１
タンパク質をコード化する配列は、所望の突然変異(複数も可)を有する天然サイ
クリンＧ１遺伝子配列または突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード化する
合成配列を含み得る。
【００３３】
好ましい態様において、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌク
レオチドは、異常増殖している細胞へ形質導入されている適当な発現ビークルに
含まれている。上記発現ビークルには、プラスミド、真核生物ベクター、原核生
物ベクター(例えば、細菌性ベクター)およびウイルス性ベクターがあるが、これ
らに限定されるわけではない。
【００３４】
一態様において、ベクターはウイルス性ベクターである。使用され得るウイル
ス性ベクターには、ＲＮＡウイルスベクター(例えばレトロウイルスベクター)お
よびＤＮＡウイルスベクター(例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクタ
ー)が含まれる。ベクターの構築においてＲＮＡウイルスベクターが使用される
とき、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドはＲＮＡの
形態である。ベクターの構築においてＤＮＡウイルスベクターが使用されるとき
、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドはＤＮＡの形態
である。
【００３５】
一態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。使用さ
れ得るレトロウイルスベクターの例には、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓
壊死ウイルス、およびレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイ
肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺癌ウイ
ルスから誘導されたベクターがあるが、これらに限定されるわけではない。ベク
ターは一般的に複製能の無いレトロウイルス粒子である。本発明の意味の中に含
まれるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、例えばＨＩＶウイ
ルスまたは動物レンチウイルスに基いたベクター、例えばＢＩＶベースのベクタ
ーを包含する。レンチウイルスベクターの構築は、特に米国特許番号５６６５５
７７７、５９９４１３６および６０１３５１６に開示されており、出典明示によ
り本明細書の一部とする。
【００３６】
一態様において、レトロウイルスベクターは、モロニーネズミ白血病ウイルス
から誘導され、ＬＮ系列のベクターに属するレトロウイルスプラスミドベクター
から作製され得、これらについてはＢenderら、Ｊ.Ｖirol.、第６１巻、１６３
９−６４９頁(１９８７)およびＭillerら、Ｂiotechniques、第７巻、９８０−
９９０頁(１９８９)にさらに記載されている。上記ベクターは、マウス肉腫ウイ
ルスから誘導されたパッケージングシグナルの一部および突然変異gag開始コド
ンを有する。ここで使用されている「突然変異」の語は、gagタンパク質または
そのフラグメントまたは先端切除形態が発現されないようにgag開始コドンが欠
失または改変されていることを意味する。
【００３７】
別の態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、少なくとも４つの
クローニングまたは制限酵素認識部位を含み得、部位の少なくとも２つは真核生
物遺伝子における平均出現頻度が１００００塩基対において１回未満である、す
なわち制限産物は少なくとも１００００塩基対の平均ＤＮＡサイズを有する。好
ましいクローニング部位は、ＮotＩ、ＳnaＢＩ、ＳalＩおよびＸhoＩから成る群
から選択される。好ましい態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは
、これらのクローニング部位の各々を含む。上記ベクターについては、米国特許
第５６７２５１０号にさらに記載されており、出典明示により本明細書の一部と
する。
【００３８】
上記クローニング部位を含むレトロウイルスプラスミドベクターを使用すると
き、レトロウイルスプラスミドベクターにあるＮotＩ、ＳnaＢＩ、ＳalＩおよび
ＸhoＩから成る群から選択された少なくとも２つのクローニング部位と適合し得
る少なくとも２つのクローニング部位を含むシャトルクローニングベクターが提
供され得る。シャトルクローニングベクターはまた、シャトルクローニングベク
ターからレトロウイルスプラスミドベクターへ移入され得る突然変異体サイクリ
ンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
シャトルクローニングベクターは、クローニングまたは制限酵素認識部位を含
む１個またはそれ以上のリンカーに連結されている基本的「バックボーン」ベク
ターまたはフラグメントから構築され得る。上述された適合性または相補的クロ
ーニング部位もクローニング部位に含まれる。突然変異サイクリンＧ１タンパク
質をコード化するポリヌクレオチドおよび／またはシャトルベクターの制限部位
に対応する末端を有するプロモーターは、当業界公知の技術を通じてシャトルベ
クターへ連結され得る。
【００４０】
シャトルクローニングベクターは、原核生物系におけるＤＮＡ配列の増幅に使
用され得る。シャトルクローニングベクターは、原核生物系および特に細菌で常
用されるプラスミドから製造され得る。すなわち、例えば、シャトルクローニン
グベクターは、プラスミド、例えばpＢＲ３２２、pＵＣ１８などから誘導され得
る。
【００４１】
レトロウイルスプラスミドベクターは、突然変異サイクリンＧ１タンパク質コ
ーディング配列を発現させるためのプロモーターを含み得る。使用され得る適当
なプロモーターには、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、およびＭ
illerら、Ｂiotechniques、第７巻、９号、９８０−９９０(１９８９)に記載さ
れたヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、または他のいずれかのプ
ロモーター(例、細胞性プロモーター、例えば真核生物細胞性プロモーター、例
えば限定されるわけではないが、ヒストン、polIII、サイクリンＧ１、およびβ
−アクチンプロモーター)があるが、これらに限定されるわけではない。使用さ
れ得る他のウイルスプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロ
モーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターがあるが、これらに限定さ
れるわけではない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれている教示
内容から当業界の熟練者には明白なものである。
【００４２】
突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含むレトロウ
イルスプラスミドベクターは、gag、polおよびenvレトロウイルスタンパク質を
コード化する核酸配列を含むパッケージングセルラインへ形質導入される。上記
パッケージングセルラインの例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７(ＡＴＣＣ番
号ＣＲＬ９０７８)、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１
９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋envＡm１２お
よびＤＡＮセルライン(Ｍiller、Ｈuman Ｇene Ｔherapy、第１巻、５−１４
頁(１９９０)に記載、出典明示により本明細書の一部とする)、または２９３Ｔ
セルライン(米国特許第５９５２２２５号)があるが、これらに限定されるわけで
はない。ベクターは、当業界公知のいずれかの手段を通じてパッケージング細胞
に形質導入し得る。上記手段には、電気穿孔、リポソームの使用およびＣaＰＯ
４沈澱があるが、これらに限定されるわけではない。上記プロデューサー細胞は
、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を生成する。
【００４３】
別法として、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド、
非レトロウイルスペプチド不含有の第１レトロウイルスエンベロープタンパク質
(一態様では、野生型レトロウイルスエンベロープタンパク質であり得る)、およ
び修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質、または野生型レトロウイルスエ
ンベロープタンパク質のアミノ酸残基が除去され、所望の分子に結合するターゲ
ッティングタンパク質またはペプチド、例えば細胞性受容体または細胞外成分、
例えば細胞外マトリックス成分により置換された「エスコート」タンパク質を含
むレトロウイルスベクター粒子が生成され得る。ターゲッティングタンパク質ま
たはポリペプチドが結合し得る細胞外マトリックス成分の例には、コラーゲンが
あるがこれに限定されるわけではない。
【００４４】
かかるレトロウイルスベクター粒子は、突然変異サイクリンＧ１タンパク質を
コード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクター、およ
び修飾レトロウイルスエンベロープペプチドをコード化するポリヌクレオチドを
含む、適当な発現ビークル、例えばプラスミドによりパッケージング細胞、例え
ば上記のものへ形質導入することにより生成され得る。次いで、生成したプロデ
ューサー細胞は、非レトロウイルスペプチド不含有の第１レトロウイルスエンベ
ロープタンパク質、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質、および突然変
異サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む感染性レト
ロウイルスベクター粒子を生産する。
【００４５】
別の方法では、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド
を含むレトロウイルスプラスミドベクターは、gagおよびpolレトロウイルスタン
パク質をコード化するポリヌクレオチド、非レトロウイルスペプチド不含有の第
１レトロウイルスエンベロープタンパク質をコード化するポリヌクレオチド、お
よび修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質をコード化するポリヌクレオチ
ドを含むパッケージング細胞へ形質導入される。生成したプロデューサー細胞は
、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド、非レトロウイ
ルスペプチド不含有の第１レトロウイルスエンベロープタンパク質および修飾レ
トロウイルスエンベロープタンパク質を含むレトロウイルスベクター粒子を生産
する。
【００４６】
レトロウイルスベクター粒子は、異常増殖している細胞を阻害、防止または破
壊するのに有効な量で罹患動物に投与される。本発明の範囲は理論的推論に限定
されるわけではないが、突然変異サイクリンＧ１タンパク質が天然サイクリンＧ
１タンパク質とそのサイクリン依存的キナーゼ結合相手に関して競争することに
より、細胞分裂の推進における天然サイクリンＧ１タンパク質の機能が阻止され
ると考えられる。レトロウイルスベクター粒子の投与は、全身投与により、例え
ば静脈内、動脈内または腹腔内投与により、または腫瘍でのレトロウイルスベク
ターの直接注射により行われ得る。一般的に、レトロウイルスベクターは、少な
くとも１０６cfu／mlの量で投与され、一般に上記の量は１０１１cfu／mlを越え
ない。好ましくは、レトロウイルスベクターは、約１０８cfu／ml〜約１０９cfu
／mlの量で投与される。投与すべき正確な用量は、処置される動物または患者の
年齢、体重および性別、並びに処置されている病的組織(腫瘍または臓器)のサイ
ズおよび重症度を含む様々な因子により変化する。
【００４７】
レトロウイルスベクターはまた、許容し得る医薬用担体、例えば食塩水溶液、
プロタミンスルフェート(エルキンス‐シン、インコーポレイテッド、チェリー
・ヒル、ニュージャージー)、水、水性緩衝液、例えば燐酸緩衝液およびトリス
緩衝液、またはポリブレン(シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ)と共に
投与され得る。適当な医薬用担体の選択は、本明細書に含まれている教示内容か
ら当業界の熟練者にとっては明白なものであると思われる。
【００４８】
従って、本発明はまた、特に腫瘍および癌の処置を目的とする、突然変異サイ
クリンＧ１タンパク質の医薬における用途、突然変異サイクリンＧ１タンパク質
をコード化する遺伝子構築物の用途および本発明の上記遺伝子構築物を含む発現
ビークルの用途を提供する。
【００４９】
さらに、疾患、例えば腫瘍および癌処置用医薬の製造を目的とする、突然変異
サイクリンＧ１タンパク質の用途、突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード
化する遺伝子構築物の用途および本発明の上記遺伝子構築物を含む発現ビークル
の用途が、本発明により提供される。
【００５０】
別の態様において、上記レトロウイルスベクター、または突然変異サイクリン
Ｇ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、リポソーム内に封入され得
る。レトロウイルスベクターまたは突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード
化するポリヌクレオチドを封入しているリポソームは、上記の医薬用担体と共に
宿主に投与され得る。
【００５１】
別の態様において、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオ
チドを含む、レトロウイルスプロデューサー細胞、例えば上記のパッケージング
セルラインに由来するものは、動物に投与され得る。上記プロデューサー細胞は
、一態様において、病的組織または臓器に極めて近位の箇所で全身的に(例、静
脈内または動脈内により)投与され得るか、またはプロデューサー細胞は病的組
織または臓器に直接投与され得る。次いで、プロデューサーセルラインは、イン
ビボで突然変異Ｇ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含むレトロウイルス
ベクターを生産し、次いでその結果上記レトロウイルスベクターは病的組織また
は臓器の異常増殖中の細胞へ形質導入する。
【００５２】
本発明に従い処置され得る病的状態および疾患には、非悪性および悪性または
癌性腫瘍が含まれる。処置され得る癌性腫瘍には、骨原性肉腫およびユーイング
肉腫およびサイクリンＧ１が発現される他の腫瘍性疾患、例えば神経膠芽細胞腫
、神経芽細胞腫、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫(ホジキンおよび非ホジキ
ンリンパ腫を含む)、線維肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、肝癌、例えば肝
細胞癌および腺癌があるが、これらに限定はされない。
【００５３】
上記腫瘍処置はまた、腫瘍の他の処置、例えば(i)放射線、(ii)化学療法、ま
たは(iii)負の選択マーカー、例えばウイルス性チミジンキナーゼ遺伝子をコー
ド化するポリヌクレオチドによる腫瘍細胞の形質導入後の、相互作用剤、例えば
負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドにより形質導入された細胞を
殺すガンシクロビルの投与と組合わせて使用され得る。
【００５４】
一態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、上記方法の一つに従
い宿主に投与される。薬剤を含む腫瘍細胞の増殖は阻害、防止または破壊される
。さらに、腫瘍細胞は、負の選択マーカーまたは「自殺」遺伝子をコード化する
ポリヌクレオチドにより形質導入される。負の選択マーカーをコード化するポリ
ヌクレオチドは、発現ビークル、例えば上記のものに含まれ得る。一旦腫瘍細胞
が負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドにより形質導入されると、
相互作用剤が宿主に投与され、そこで相互作用剤が負の選択マーカーと相互作用
することにより、腫瘍細胞の増殖が阻害、防止または破壊され得る。
【００５５】
使用され得る負の選択マーカーには、チミジンキナーゼ、例えば単純疱疹ウイ
ルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−
帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ、およびシトシンデアミナーゼがあるが、こ
れらに限定されるわけではない。
【００５６】
一態様において、負の選択マーカーは、単純疱疹チミジンキナーゼ、サイトメ
ガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状疱疹ウイルスチミジンキナー
ゼから成る群から選択されたウイルス性チミジンキナーゼである。上記ウイルス
性チミジンキナーゼが使用されるとき、相互作用または化学療法薬剤は、好まし
くはヌクレオシド類似体、例えばガンシクロビル、アシクロビルおよび１−２−
デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル(
ＦＩＡＵ)から成る群から選択されるものである。上記相互作用剤は、基質とし
てウイルス性チミジンキナーゼにより有効に利用され、すなわち上記相互作用剤
がウイルス性チミジンキナーゼを発現する腫瘍細胞のＤＮＡへ致死的に組込まれ
ることにより、腫瘍細胞の死が誘発される。
【００５７】
別の態様において、負の選択マーカーは、シトシンデアミナーゼである。シト
シンデアミナーゼが負の選択マーカーであるとき、好ましい相互作用剤は５−フ
ルオロシトシンである。シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシンを高度
細胞傷害性の５−フルオロウラシルに変換する。すなわち、シトシンデアミナー
ゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞は５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに
変換し、殺される。
【００５８】
相互作用剤は、形質導入腫瘍細胞の増殖を阻害、防止または破壊するのに有効
な量で投与される。例えば、相互作用剤は、患者に対する全体的毒性により、５
mg〜１０mg／kg(体重)の量で投与され得る。相互作用剤は、好ましくは全身投与
、例えば静脈内投与、非経口投与、腹腔内投与または筋肉内投与される。
【００５９】
負の選択マーカーを含む発現ビークル、例えば上述のものが腫瘍細胞に投与さ
れるとき、「傍観者効果」が誘発され得る、すなわち、もともと負の選択マーカ
ーをコード化する核酸配列により形質導入されてはいない腫瘍細胞は相互作用剤
投与後に殺され得る。出願者らはいかなる理論的推論にも制限されるつもりは無
いが、形質導入腫瘍細胞は、相互作用剤に対して細胞外で作用するか、または隣
接する非形質導入腫瘍細胞に吸収され、次いで相互作用剤の作用に対して感受性
になる負の選択マーカーの拡散性形態を生産することになり得る。また、負の選
択マーカーおよび相互作用剤の一方または両方が腫瘍細胞間で通じ合うことも可
能である。
【００６０】
突然変異サイクリンＧ１タンパク質はまた、侵襲性血管手術、例えば血管形成
術、血管移植、例えば動脈移植、または冠動脈バイパス手術後の血管再狭窄の予
防に使用され得る。すなわち、本発明の別の態様によると、動物、または侵襲性
血管手術または血管病変部位に突然変異サイクリンＧ１タンパク質を投与するこ
とを含む再狭窄の予防方法が提供される。突然変異サイクリンＧ１タンパク質は
、動物において再狭窄を予防するのに有効な量で投与される。突然変異サイクリ
ンＧ１タンパク質は、侵襲性血管手術中または後に投与され得る。ここで使用さ
れている「侵襲性血管手術」の語は、限定的ではないが動脈および静脈を含む血
管系の一部の修復、切除、置換および／または再血管方向づけ(例、バイパスま
たはシャント)を含むあらゆる手術を包含する。上記手術には、血管形成術、血
管移植、例えば動脈移植、血餅の除去、動脈または静脈の一部切除、および冠動
脈バイパス手術があるが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
好ましい態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、突然変異サイ
クリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドにより侵襲性血管手術または血
管病変部位の血管細胞へ形質導入することにより動物に投与される。上記ポリヌ
クレオチドは、上記の通り適当な発現ビークルに含まれ得、侵襲性血管手術また
は血管病変部位の細胞へ形質導入される。一態様において、発現ビークルは、ウ
イルス性ベクター、例えば上述のものである。一態様において、ウイルス性ベク
ターは、レトロウイルスベクターであり、上記と同様であり得る。
【００６２】
レトロウイルスベクターが使用されるとき、上記レトロウイルスベクターは、
上記の量で投与され、血管内投与される。一態様において、レトロウイルスベク
ターは、侵襲性血管手術または血管病変部位に投与される。ベクターが侵襲性血
管手術または血管病変部位の血管細胞へ形質導入することにより、突然変異サイ
クリンＧ１タンパク質が上記細胞で生産され、それによって天然サイクリンＧ１
タンパク質の機能が阻害されるため、上記細胞の増殖を阻止することにより再狭
窄が予防される。
【００６３】
この方法は、限定するわけではないが、心臓血管形成術、動脈移植および冠動
脈バイパス手術を含む様々な侵襲性血管手術後における再狭窄の阻止および処置
並びに血管病変の阻止または処置に適用可能である。この方法はまた、限定する
わけではないが、大腿、頚または腎動脈、特に腎臓透析フィステルに伴う腎動脈
の病変を含む、血管病変の阻止および処置に適用される。
【００６４】
突然変異サイクリンＧ１タンパク質はまた、多くの場合角膜実質細胞の増殖に
より誘発される、角膜ヘーズ(曇り)または角膜混濁の予防および／または処置、
並びに白内障の処置および／または予防で使用され得る。すなわち、本発明の別
の態様によると、角膜ヘーズおよび／または白内障の予防または処置方法であっ
て、突然変異サイクリンＧ１タンパク質を罹患動物または患部の目に直接投与す
ることを含む方法が提供される。突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、動物に
おける角膜ヘーズまたは白内障の予防または処置に有効な量で投与される。
【００６５】
好ましい態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、突然変異サイ
クリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドによる眼の細胞の形質導入によ
り、動物に投与される。上記ポリヌクレオチドは、上記の通り適当な発現ビーク
ルに含まれ得る。発現ビークルは、眼の細胞へ形質導入される。一態様において
、発現ビークルは、上記のウイルス性ベクターである。一態様において、ウイル
ス性ベクターはレトロウイルスベクターであり、上記のものと同じであり得る。
【００６６】
レトロウイルスベクターが使用されるとき、上記レトロウイルスベクターは、
体重７０kgまたはそれ以上の成人の場合一用量当たり血液量の約１０％、または
約５００ml〜約１０００mlの量で全身(静脈内または動脈内)投与され得る。レト
ロウイルスベクターはまた、例えば点眼液形態で眼に局所投与され得る。レトロ
ウイルスベクターはまた眼内投与され得る。ベクターは、眼の細胞、例えば角膜
実質細胞および／または水晶体上皮細胞へ形質導入することにより、天然サイク
リンＧ１タンパク質の機能を阻害し、そうして角膜実質細胞または水晶体上皮細
胞の増殖を阻止することにより角膜ヘーズまたは白内障を予防または処置する。
【実施例】
【００６７】
(実施例)
実施例に関して本発明の記載を行うが、本発明の範囲はそれによって制限され
るわけではないものとする。
実施例１：癌細胞における突然変異サイクリンＧ１タンパク質の殺細胞および
細胞増殖抑制(cystostatic)効果。
(材料および方法)
細胞、細胞培養条件、マーカーおよび細胞周期制御遺伝子を担うプラスミドお
よびベクター。ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔおよびヒト膵臓癌ＭiaＰaca２細胞はＡ
ＴＣＣにより供給された。ＮＩＨ３Ｔ３および２９３Ｔ細胞は、１０％胎児ウシ
血清(Ｄ１０；バイオウィッテイカー)を補ったダルベッコ修飾イーグル培地で維
持された。ウイルス性gag pol遺伝子を含むプラスミドpcgp、および核標的β−ガラクトシダーゼ構築物を発現するレトロウイルスベクターpcnＢgは、それぞれパウラ・キャノン(Ｐaula Ｃannon)およびリン・リー(Ｌing Ｌi)両博士のご厚意により提供された(ＵＳＣジーン・セラピー・ラボラトリーズ、ロスアンゼルス、カリフォルニア)。水疱性口内炎ウイルスＧ(ＶＳＶＧ)envタンパク質を含むプラスミドは、テオドア・フリードマン(Ｔheodore Ｆriedmann)博士のご厚意により提供された(ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア、サンディエゴ、カリフォルニア)。先端切除(a.a.４１−２４９)サイクリンＧ１(dnＧ１)構築物は、レトロウイルス発現ベクターpＲＥＸにクローン化された。
【００６８】
突然変異体サイクリンＧ１構築物を担うマトリックス標的レトロウイルスベク
ターの製造。パッケージング成分gag−pol、およびＣＭＶプロモーターから発現
されたフォンビルブラント因子誘導コラーゲン結合性(マトリックス−ターゲッ
ティング)モチーフを担うキメラＭＬＶベースのenvが別々のプラスミドに配置さ
れ、各々ＳＶ４０複製起点を含む、一時的３または４プラスミド同時トランスフ
ェクションシステム(Ｓoneokaら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６２８−６３３頁(１
９９５))を用いて、高力価ベクターを製造した。ＷＴenvを伴わずに発現された
ベクターは、Ｂv１またはＨs２と命名された(Ｂv＝ウシvＷＦに由来、Ｈs＝ヒト
vＷＦに由来、ＬＦまたは１＝天然vＷＦ配列から誘導されたリンカー；ＬＳまた
は２＝標準リンカー)。ウイルス力価をさらに高めるため、融合誘導性ＶＳＶＧe
nvタンパク質(Ｙeeら、Ｍethods Ｃell Ｂiol.、第４３巻、９９−１１２頁(
１９９４))が、４プラスミド同時トランスフェクションプロトコルにおいてＢv
１またはＨs２envタンパク質と共に発現された。
【００６９】
ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるウイルス力価は、β−ガラクトシダーゼまた
はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性、neor遺伝子の発現に基き前記要
領で測定された(Ｓkotzkoら、Ｃancer Ｒes.、第５５巻、５４９３−５４９８(
１９９５))。ウイルス力価は、Ｇ４１８耐性コロニー形成単位(cfu)／mlの数と
して表され、トランスフェクションプロトコルで使用されたプラスミドＤＮＡの
性質および量により、１０６〜１０８cfu／mlの範囲で変化した。
【００７０】
インビトロ効率試験。dnＧ１ベクターの殺細胞／細胞増殖抑制効果を評価する
ため、Ｇ４１８選択を伴わない形質導入後連続間隔(４日以下)で各培養において
生存できる細胞の数を数えることにより、増殖可能性について形質導入細胞を評
価した。内在性および突然変異体サイクリンＧ１タンパク質発現のウエスタン分
析は、前記要領(Ｓkotzkoら、１９９５)で遂行された。
【００７１】
インビボ効率試験は、ユニバーシティー・オブ・サザーンカリフォルニア・イ
ンスティテューション・アニマル・ケア・アンド・ユース・コミッティーにより
是認されたプロトコルに従って行なわれた。インビボでのdnＧ１ベクター処置の
抗腫瘍効果に基いた標的遺伝子送達の効率を評価するため、ヒト結腸癌の転移経
路をシミュレーションする肝臓転移モデルをヌードマウスで確立した。簡単に述
べると、１４日間定位置に設置した内在型カテーテルにより、７×１０５腫瘍細
胞をゆっくりと門脈へ注入した。低または高用量dnＧ１ベクター(力価：２００
μl／日で３×１０６または９×１０８cfu／ml)または等量の燐酸緩衝食塩水(Ｐ
ＢＳ、pＨ７.４)のカテーテル内注入を３日後に開始し、全部で９日間続行した
。処置完了の１日後頚部脱臼によりマウスを殺した。
【００７２】
組織学的および形態計測分析。肝臓葉を切除し、１０％ホルマリンに固定し、
右および尾状葉にはＡ、左葉にはＢおよび中葉にはＣと標識し、別々に処理して
、パラフィンブロックに埋封した。dnＧ１ベクター処置の抗腫瘍効果は、次の要
領で評価された。ＨおよびＥ染色組織薄片を光学顕微鏡により調べ、代表的肝臓
部分およびＡ、ＢおよびＣ葉からの腫瘍フォーカスの表面領域を、オプティマス
画像分析システムを用いた形態計測分析により測定した。レトロウイルスの安全
性の評価は、肝臓構造の完全性の評価、肝細胞腫大または壊死、炎症性浸潤、胆
汁うっ滞および／または血栓症の存在に関する検査を含んでいた。また、組織薄
片をサイトケラチン、ヒトサイクリンＧ１、アポトーシス、ＰＡＳ、ビメンチン
およびＣＤ６８に関して免疫染色した。
【００７３】
統計分析。インビボ効率試験のために、３処置群を比較した：低用量Ｂv１／d
nＧ１(力価：３×１０６cfu／ml)、高用量Ｈs２／ＶＳＶＧ／dnＧ１(力価：９.
５×１０８cfu／ml)およびＰＢＳ対照。ヌルベクターは、インビトロ殺細胞活性
の不存在に基いたインビボ試験については使用されず、その後ヌルベクターは結
局臨床試験でも使用されない。最初に、８匹のマウスを試験した。４匹を高用量
dnＧ１ベクターで処置し、そして４匹をＰＢＳで処置した。それに続いて、４匹
の追加マウスを低用量dnＧ１ベクターで処置した。応答変数、肝臓の総表面積(
Ｓ.Ａ.)、腫瘍の総Ｓ.Ａ.、腫瘍Ｓ.Ａ.対肝臓Ｓ.Ａ.比、および平均Ｓ.Ａ.腫瘍
フォーカスを、形式分析前に対数変換した。反復測定因子として葉を用いた反復
測定分析を用いて、この処置が応答変数の各々に対する効果を有したか否かを測
定した。また、ペアワイズ比較をアウトカム変数に関して遂行し、群間では全体
的p−値＜０.０５であった。
【００７４】
(結果)
突然変異体ヒトサイクリンＧ１(dnＧ１)は、サイクリンボックスにおける欠失
、Ｃdk活性化を誘導するサイクリン−Ｃdk結合を部分的に決定するサイクリン間
の保存領域により作製された。予備試験は、dnＧ１が血管平滑筋細胞において抗
増殖特性を呈することを立証した。それらの発見は、dnＧ１が野生型サイクリン
Ｇ１の機能を阻害すべく、または標的Ｃdk分子との不活性複合体を形成すべく作
用し得ることを示唆している。このため、一連の殺細胞性突然変異体サイクリン
Ｇ１構築物の性能をインビトロで試験することにより、さらなるインビボ試験に
最適な構築物を決定した。
【００７５】
膵臓に由来するヒト未分化癌セルラインを、転移性胃腸癌の始原型として選択
した。これらの癌細胞におけるレトロウイルス形質導入効率は優秀であり、感染
多重度により２６％〜８５％の範囲に及んだ(それぞれ４および２５０、図１Ａ)
。最適な治療遺伝子を選択するため、様々なサイクリンＧ１構築物を担うベクタ
ーを用いて細胞増殖試験を形質導入細胞で行った。図１Ｂは、形質導入癌細胞に
おける突然変異体およびアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターの
殺細胞／細胞増殖抑制効果を示す。標準条件下では、dnＧ１ベクターは、一貫し
て最大の抗増殖効果を呈し、dnＧ１タンパク質を表す２０kＤa領域における免疫
反応性サイクリンＧ１の出現を伴った(図１Ｃ)。これらの結果に基づき、dnＧ１
ベクターは、後続のインビボ効率試験用に選択された。
【００７６】
ＰＢＳまたは低用量dnＧ１ベクターで処置されたマウスからの転移性腫瘍フォ
ーカスの組織学的および免疫細胞化学的評価を遂行し、オプティマスイメージン
グシステムにより評価した。ＰＢＳ処置動物(図２Ａ)、およびdnＧ１ベクター処
置動物の残留腫瘍フォーカス(図２Ｂ)での高いサイクリンＧ１核免疫反応性(褐
色染色物質)により証明されたように、図２は、ヒトサイクリンＧ１タンパク質
が転移性腫瘍フォーカスで高度発現されることを示す。対照動物からの肝臓薄片
の組織学的試験は、血管形成および支質形成の付随領域を伴うかなりの腫瘍フォ
ーカスを表しており(図３ＡおよびＣ)、上皮成分はサイトケラチンについて陽性
染色し、付随した腫瘍支質／内皮細胞はビメンチンおよびＦＬＫ受容体について
陽性染色した(図示せず)。対照的に、低用量dnＧ１処置動物における腫瘍フォー
カスの平均サイズはＰＢＳ対照と比べて顕著に低減化され(図３ＢおよびＤ、矢
印により示されている、p＝０.００１)、同時にＰＢＳ対照群(図３Ｅ)と比べて
アポトーシス核の密度における焦点増加を表した(図３ＦおよびＨ、矢印により
示されている)。さらに、ＰＡＳ＋、ＣＤ６８＋およびヘモシデリン‐積載マク
ロファージによる浸潤(図３Ｄ、矢印により示されている)が、dnＧ１ベクター処
置動物の残留腫瘍フォーカスで観察されたことから、肝臓細網内皮系による変性
している腫瘍細胞および腫瘍屑の能動的クリアランスが示唆された。
【００７７】
腫瘍フォーカスの形態計測分析は、高用量マトリックス標的dnＧ１ベクターの
門脈注入(内在型カテーテルによる)が、全応答変数に基いた対照動物の場合と比
べたとき腫瘍フォーカスサイズの劇的な低減化を誘発する(p＜.００５、表１)と
いう点で、治療遺伝子送達に関するターゲッティング戦略が有効であることを確
認した。３アウトカム変数に関するペアワイズ比較では、dnＧ１ベクター処置に
対する用量依存的腫瘍応答が明白であり、腫瘍縮小対腫瘍フォーカスの完全消滅
に関して様々なベクター用量に対するより良い腫瘍応答性を測定し、Ｉ／II期遺
伝子療法試験において所望の腫瘍応答を達成し得る最少有効ベクター用量を予測
するための追加試験は現在進行中である。重要なことに、肝細胞損傷、壊死、血
栓症または胆汁うっ滞の証拠は、dnＧ１ベクター処置動物からの組織薄片からは
全く検出されなかったことから、マトリックス標的dnＧ１ベクター(累積用量：
１０６〜１０９cfu)が広く余裕のある安全性を有し得ることが示された。
【００７８】
(検討)
インビボ効率および安全性試験は、肝臓転移の特有なヌードマウスモデルで行
われ、(i)対照動物の場合と比べてdnＧ１ベクター処置マウスにおける腫瘍フォ
ーカスサイズの統計的に有意な低減化により証明されたように、治療遺伝子送達
が、殺細胞性突然変異体サイクリンＧ１構築物を担うマトリックス標的レトロウ
イルスベクターの反復門脈注入(内在型カテーテルによる)により達成され得るこ
と、および(ii)付随する肝細胞壊死、血栓症または胆汁うっ滞の不存在により示
されたように、マトリックス標的dnＧ１ベクターが広く余裕のある安全性を伴っ
て全身投与され得るという原理の証拠を確立した。まとめて考え合わせると、こ
れらの発見は、転移性癌に対する標的注射可能遺伝子治療ベクターの開発に向け
た明確な進歩を表している。
【００７９】
実施例２ 細胞致死性サイクリンＧ１構築物を有するマトリックス・ターゲッ
テッド・レトロウイルスベクターの内腔内注入による、バルーン損傷ラット動脈
における新生内膜形成の長期阻害
この実施例はラット血管再狭窄モデルにおける変異サイクリンＧ１タンパク質
による新生内膜形成の阻害を証明する。
【００８０】
材料および方法
細胞および細胞培養条件 ラット大動脈平滑筋Ａ１０細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
４７６)を、密集前の単層として２０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を添加した血清ダ
ルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)(Ｇibco ＢＲＬ)中で維持した。マウス胚
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞(ＡＴＣ ＣＲＬ １６５８)、ヒト２９３Ｔ細胞胎児腎臓２
９３細胞(厚意により、Ｄr. Ｍichele Ｇalos,Ｓtanford Ｕniversity, Ｐa
lo Ａlto, ＣＡから提供)をＳＶ４０大型Ｔ抗原で形質転換し、ヒト膵臓腫瘍Ｍ
iaＰaca２細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４２０)を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、
およびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で同様に維持した。サル平滑筋
一次細胞を、バルーン損傷後７日に回収した左総頚動脈から、３０％ＦＢＳを添
加したＷilliams Ｅ培地(Ｇibco ＢＲＬ)中の２mm動脈切片を培養することで
調製した。細胞が移動して組織培養ディッシュで接着単層細胞として増殖した後
に動脈切片を除去し、細胞をさらにＷilliams Ｅ培地−２０％ＦＢＳ中で維持
した。マウスモノクローナル抗ヒトα平滑筋アクチン(ＤＡＫＯ)での免疫染色で
は、一次培養から回収した細胞の９５％が平滑筋αアクチンに対して陽性であっ
た、これはその起源を示すものである。
【００８１】
プラスミド構築物 アミノ酸４１〜２４９をコードするサイクリンＧ１ cＤＮ
Ａの６３０bp Ｃ末端断片(ヌクレオチド１２１〜７５０)(Ｗu et al.,１９
９４)をはじめとするサイクリンＧ１変異構築物(図５参照)をＰＣＲにより作製
し、ＴＡベクター(Ｉnvitrogen)へクローニングし、シーケンシングにより確認
し、pＧ１ＸＳvＮaレトロウイルスベクター(Ｓkotzko et al.,１９９５)に再
びクローニングした。pＧ１ＸsvＮaおよび挿入サイクリンＣ１ cＤＮＡからな
る成分配列をパッケージングするレトロウイルスを含む得られた構築物を消化す
ることでＫpnＩ断片を得、pＲＶ１０９(Ｓoneoka,et al, １９９５)ヘクロー
ニングしてＳＶ４０起源の複製物(ori)およびＣＭＶプロモーターを含んだレト
ロウイルス発現プラスミドpＧ１ＤＮＴ４１〜２４９／ＲＥＸを得た。
【００８２】
gag、pol、envおよびb−ガラクトシダーゼタンパク質の発現プラスミド pcgpは
、ＭＬＶ gagおよびpolを発現するＣＭＶ由来プラスミドである。pcnＢgは、Ｈ
an, et al., Ｊ. Ｖirol.,Ｖol. ７１, pgs. ８１０３−８１０８ (１９
７７)に記載されているpＧ１ＸsvＮa、次いでpＲＶ１０９中での段階的構築によ
り作製したpＲＥＸレトロウイルスベクター中のβ−gal発現構築物である。pcgp
およびpcnＢgは双方とも厚意によりＤr. Ｐaula Ｃannon (ＵＳＣ Ｇene
Ｔherapy Ｌaboratories,Ｌos Ａngeles ＣＡ)から提供されたものであった
。プラスミドpＣＶＧは、pＣＥＥ＋のＥcoＲＩ断片(ＭacＫrell,et al., Ｊ.
Ｖirol,. Ｖol. ７０,pgs. １７６８−１７７９ (１９９６))を、ＶＳＶ
−ＧをコードするcＤＮＡ(Ｙee,et a., １９９４)を含有するpＨＣＭＶ−Ｇの
ＥcoＲＩ断片(Ｔheodore Ｆriedman,Ｕ. Ｃ. Ｓan Ｄiegoから譲渡)で置換
して作出した水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質(ＶＳＶ−Ｇ)を発現するＣＭ
Ｖ由来プラスミドである。ＣＡＥＰはマトリックス標的(すなわち、コラーゲン
結合ドメイン、ＣＢＤ)モチーフを含む両種性４０７０Ａ (ＣＡＥ) ＭＬＶ g
p７０を発現するＣＭＶ由来プラスミドである。ＣＡＥＰは、ヒト・フォン・ヴ
ィレブランド因子(Ｔakagi,et al., Ｊ. Ｂiol. Ｃhem., Ｖol.２６６, pgs
, ５５７５−５５７９ (１９９１))由来の最小コラーゲン結合ドメイン(ＷＲＥ
ＰＧＲ[Ｍ]ＥＬＮ)を、レトロウイルス外被タンパク質の、成熟タンパク質のＮ
末端ドメインへ導入した特有のＰstＩクローニング部位へ挿入して作製した。メ
チオニン残基(Ｍ)を最少ＣＢＤ内の野生型システイン残基(Ｃ)の場所へ保存的に
挿入した(そうしなければ、キメラ外被タンパク質内の分子内ジスルフィド結合
の適切な形成が妨げられる)(データは示されていない)。
【００８３】
レトロウイルスベクターの作製 ヒト２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの前
日に３x１０６細胞／ディッシュの密度で１０cm細胞培養ディッシュにプレーテ
ィングした。pcgp １５mg、pＣＶＧ １０mg、ＣＡＥＰ ５mgおよびpcnＢgま
たはpＧ１ＤＮＴ４１〜２４９／ＲＥＸのいずれか１５mgを用い、リン酸カルシ
ウム／ＤＮＡ共沈殿法(Ｓoneoka, et al., １９９５)によって一時的同時トラ
ンスフェクションを行った。トランスフェクション細胞を３７℃で１６時間イン
キュベートし、１０mＭ酪酸ナトリウムを含有する培地６mlに移してウイルス粒
子の形成を促進させた。約１０〜１２時間後、産生細胞培養培地を新鮮培地８.
５mlと交換し、さらに２４時間インキュベートしてベクター産生を行った。得ら
れたレトロウイルスの上清を回収し、０.４５mＭフィルターで濾過し、アリコー
トに分け、使用まで７０℃で保存した。
【００８４】
レトロウイルスベクター力価の決定 ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を形質導入の前日に２
.５x１０４細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレートにプレーティングした。
細胞の形質導入のため、８μg／mＬポリブレンを含むレトロウイルス上清の連続
希釈物を細胞培養物に加えた後、３７℃で２時間インキュベートし、新鮮培地２
mlを添加した。２４時間後、細胞を８００μg／mＬ Ｇ４１８を含有する新鮮培
地と交換し、この培地を３日毎に交換した。形質導入後１０日目に１０％ホルマ
リンで固定し、１００％メタノール中の１％メチレンブルーで染色してＧ４１８
耐性コロニーを計数した。レトロウイルスベクターの力価は、生存コロニー総数
に個々の細胞培養に用いたレトロウイルス上清の希釈倍率を掛けることで求めた
。
【００８５】
ラットＡ１０細胞における形質導入効率の決定 Ａ１０ ＳＭＣを形質導入の前
日に３x１０４細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレートにプレーティングし
た。β−gal発現構築物および８mg／mＬポリブレンを含むレトロウイルス上清の
連続希釈物を細胞に加えた。７２時間後、細胞を２％ホルムアルデヒド、０.２
％グルタルアルデヒド中で固定し、４mＭフェリシアン化カリウム、４mＭフェロ
シアン化物、２mＭ ＭgＣl２および４００mg／mＬ Ｘ−galで染色した。青く
染まった核を示す細胞の割合によって形質導入効率を求めた。
【００８６】
ベクターにより形質導入した細胞培養物における細胞増殖アッセイ Ａ１０細胞
を１.４x１０４細胞／ウェルの密度で１２ウェル培養ディッシュにプレーティン
グした。接着させ、一晩インキュベートした後、８μg／mＬポリブレンを含むレ
トロウイルス上清それぞれ０.５ml中、３７℃で２時間、細胞をインキュベート
し、次いで新鮮培地１mＬを加えた。細胞の形質導入後連日、各処置群(３反復で
調製)の生存細胞数を測定した。サルＳＭＣおよびＭiaＰaca２細胞を、３x１０
３細胞／ウェルの密度で２４ウェル培養プレートに同様にプレーティングした。
上記の通り、細胞を８μg／mＬポリブレンを含むレトロウイルス上清０.２mlと
ともにインキュベートし、２時間後、新鮮培地０.５mlを加え、連日、細胞培養
物を回収して生存細胞数を測定した。
【００８７】
抗体の作製および精製 特異的抗サイクリンＧ１抗体を作製するため、ヒトサイ
クリンＧ１のＣ末端の端にある１８残基を表す合成ペプチド([Ｃ]ＫＨＳＹＹＲ
ＩＴＨＬＰＴＩＰＥＭＶＰ)を合成し、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬ
Ｈ)と共役させ、ウサギで免疫原として用いてポリクローナル抗体を作製した。
システイン残基[Ｃ]をペプチドのＮ末端に付加してＫＬＨとの単一部位の結合容
易にした。免疫ウサギ血清由来のポリクローナル抗サイクリンＧ１抗体を以下の
ようにアフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した：濾過したウサギ血
清を、サイクリンＧ１免疫ペプチドを共有結合的させたＡffi−Ｇel １０カラ
ム(Ｂio−Ｒad)に添加した。十分洗浄した後、結合抗体を溶出バッファー(０.１
mＭグリシン、pＨ２.７)から回収し、ＰＢＳ中１Ｍ Ｔris ＨＣl(pＨ８.０)で
１：１０希釈することで中和した。アフィニティー精製された抗サイクリンＧ１
抗体を含有するピーク画分をプールし、使用まで−７０℃で保存した。
【００８８】
ウェスタンブロット解析 形質導入細胞由来の界面活性剤溶解物として得た約１
５mgの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。次いでこのゲルを
Ｔris−グリシンバッファー系(２５mＭ Ｔris ＨＣl、pＨ８.３、１９２mＭグ
リシン、１５％メタノール)を用いて、フッ化ポリビニリデン(ＰＶＤＦ)メンブ
ラン(Ｍillipore)に室温にて１２０mＡで１.５時間移した。このメンブランをＰ
ＢＳ中３％ウシアルブミンでブロックし、１時間後に、ウェスタンブロット法バ
ッファー(１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０.０５％ＴＷＥＥＮ−２０、pＨ７.４)中に希
釈した一次抗体とともに３０分間インキュベートした。メンブランをＰＢＳで３
回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼ共役２次抗体とともに３０分間インキ
ュベートした。さらにＰＢＳで３回洗浄した後、不溶性の反応生成物を、基質バ
ッファー(１００mＭ Ｔris ＨＣl pＨ９.５、１００mＭ ＮaＣlおよび５mＭ
ＭgＣl２)中の０.２５mg／mＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ
ン酸(ＢＣＩＰ)および０.５mg／mＬニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)の存在
下で顕色させた。
【００８９】
血管再狭窄のラット頚動脈損傷モデルにおけるサイクリンＧ１変異構築物のレト
ロウイルスを介した導入 全身麻酔(ケタミン１００mg／Ｋg、ロンプン １０mg
／Ｋg)下で、ＵＳＣ Ｉnstitutional Ａnimal Ｃare and Ｕse Ｃommitte
e(ＬＡＣＵＣ)により承認された遺伝子療法プロトコールに従い、２Ｆ Ｉntima
x動脈塞栓摘出用カテーテル(Ａpplied Ｍedical Ｒesources Ｃorp)を用いて
３５０〜４５０gのウィスターラットの頚動脈内皮を剥いだ。末端を結紮した頚
動脈ヘカテーテルを挿入し、総頸動脈へ通した。バルーンを直径〜７ユニット(
カテーテルはフレンチスケール)まで膨らませて、頚動脈に沿って３回通した。
バルーン損傷後、塞栓摘出用カテーテルを除去し、頚動脈を一次的にクランプし
、レトロウイルスベクターに３０分間曝した。ラット群に生理食塩水(n＝６)、
変異サイクリンＧ１構築物を有するレトロウイルスベクター(n＝９)、または対
照ベクター(n＝８)のいずれか〜３０mlを注入し、さらに実験対照として非処理
ラット群(n＝７)を用意した。ちょうど４週間後にラットを過剰量のペントバル
ビタールナトリウム(１２０mg／Ｋg ＩＭ)で犠牲にした。ホルマリンで固定し
た非処理頚動脈およびベクターで処理した頚動脈の双方の切片をＶerhoeffのエ
ラスチン染色剤で染色し、組織学的切片を光学顕微鏡で調査し、Ｏptimas画像解
析システムを用いて培地表面域に対する新生内膜の形態計測評価を行なった。脈
管内膜の肥厚程度をＩ：Ｍ比で表す。非処理動脈、ＰＢＳ処理動脈およびベクタ
ー処理動脈の間のＩ：Ｍ比の有意差を両側 t検定で求めた。
【００９０】
結論
サイクリンＧ１構築物の設計および操作 ヒトサイクリンＧ１配列由来の数個の
アンチセンス断片(図４)を、全長および／または上流配列の組み込みを変化させ
て構築した(図５)。さらに、一連の変異サイクリンＧ１発現構築物に操作を加え
、ドミナントネガティブ様式で機能する可能性を評価した。図５Ｃで模式的に示
すように、これらの発現構築物は、サイクリンとＣＤＫとの結合に関与する保存
された「サイクリンボックス」ドメインを包含する領域において変異したか、ま
たは末端切断されたものであった(Ｌees and Ｈarlow, Ｍol. Ｃell Ｂiol.
, vol. １３, pgs. １１９４−１２０１ (１９９３))。ＰＭ ６１Ｋ／Ａお
よびＰＭ ９２Ｅ／Ａでそれぞれ示された２つの点突然変異体は、サイクリンＡ
−ＣＤＫ２との接触に重要であると予測され(Ｂrown et al., Ｊ. Ｂiol.
Ｃhen., vol. ２６７,pgs. ４６２５−４６３０ (１９９２)；Ｊeffrey et
al., Ｎature,Ｖol. ３７６, pgs. ３１３−３２０ (１９９５))、ヒトサ
イクリンＧ１内で保存されている(Ｗu et al., １９９４)残基の改変を示して
いる。
【００９１】
複雑な(８段階)クローニング戦略を用い(図６参照)、(ＮotＩ／ＳalＩにフラ
ンクされた)ＰＣＲ産物として製造した種々のアンチセンスおよび変異サイクリ
ンＧ１構築物を、pＢＳＫII(Ｓtratagene)のＮotＩ／ＳalＩ部位へクローニング
してpＧ１／ＢＳＫII構築物を作出し、次ぎに、これらを切り出し、これらのク
ローニング部位で、線状化したpＧ１ＸＳvＮaレトロウイルスベクター(Ｇenetic
Ｔherapy,Ｉnc)へ連結してpＧ１Ｇ１ＳvＮa構築物を作出した。これらのpＧ
１Ｇ１ＳvＮa発現プラスミドをＫpnＩで消化し(２箇所)、ＬＴＲプロモーターと
Ｐsi包膜配列でフランクされた実験用のサイクリンＧ１構築物をはじめ、得られ
たpＧ１Ｇ１ＳvＮaセグメントをpＲＶ１０９レトロウイルスベクター(Ｓoneoka
et al., １９９５)に連結して合成レトロウイルス発現ベクターpＧ１／ＲＥ
Ｘを作出した。得られたpＧ１／ＲＥＸベクターは、ＳＶ４０ori配列および抗生
物質耐性遺伝子に加えて、治療遺伝子を駆動する強力なハイブリッド５'ＣＭＶ
／ＬＴＲプロモーターを含み、これがベクター産生を促進する。代表的なサイク
リンＧ１点突然変異体であるＰＭ６１ Ｋ／ＡのpＲＥＸへのクローニングが図
６に示されている。
【００９２】
サイクリンＧ１構築物の細胞増殖抑効力の比較 平滑筋の細胞増殖に対する種々
のアンチセンスおよび変異Ｇ１構築物の相対的効力を調べるため、個々のＤＮＡ
断片の各々をpＲＥＸレトロウイルス発現ベクターに適当な配向でクローニング
し(上記参照)、これをスクリーニング研究のトランスフェクト可能なプラスミド
として最初に用いた。リン酸カルシウムトランスフェクション実験をラットＡ１
０平滑筋細胞培養物で３回行なって次の動物実験で用いるのに最適なサイクリン
Ｇ１ノックアウト構築物を決定した。これらの実験では、ＡＳ５８７およびＡＳ
６９３(図７Ａ参照)で示される適度な長さのアンチセンス構築物が、それより短
いＡＳ４２３構築物よりも大きな細胞致死活性を示した。これまでの(pＧ１aＧ
１ＳvＮaプラスミドを用いた)研究では、アンチセンス方向のヒトサイクリンＧ
１全長コード配列は比較的効果がないことが示されていない(データは示されて
いない)。これらの比較評価に基くと、ＡＳ５８７(既に動物実験で用いられてい
る：Ｓkotzko Ｅt al.,１９９５, Ｚhu et al., Ｃirculation, Ｖol. ９
６, pgs. ６２８−６３５ (１９９７))と同じコード領域にわたってなお、さ
らに５'配列を含む構築物であるＡＳ６９３が最も有効なアンチセンスデザイン
であると考えられた。試験した変異サイクリンＧ１構築物のうちで、ある特定の
変異構築物ＤＮＴ４１〜２４９、および点突然変異構築物であるＰＭ ６１Ｋ／
Ａが、平滑筋細胞の増殖抑制において少なくともアンチセンス構築物と同程度の
効力があることがわかった。点突然変異体ＰＭ ６１Ｋ／Ａの効力には、このア
ミノ酸Ｌys−６１が推定されるサイクリンＧ１会合キナーゼとの物理的結合に重
要であるとことが示唆されることから関心が持たれている(Ｓmith et al., Ｅ
xp. Ｃell Ｒes. Ｖol. ２３０,pgs. ６１−６８ (１９９７))。これら
の比較スクリーニング研究を基に、ＤＮＴ４１−２４９およびＰＭ ６１Ｋ／Ａ
もまた、さらなる研究対象として選択された。
【００９３】
選択されたサイクリンＧ１構築物を有するマトリックス・ターゲッテッド・レト
ロウイルスベクターの同定 それぞれＣＭＶプロモーターによって駆動されるパ
ッケージング成分のgag−pol、マトリックス・ターゲッテッド(ＣＢＤ)−env、
融合誘導ＶＳＶＧ env、および指定のサイクリンＧ１構築物を有するレトロウ
イルスベクターを個別のプラスミドに配置した(図８Ａ)、一時的４プラスミド同
時トランスフェクション系(Ｓoneoka et al., １９９５より採用)を用いてヒ
ト２９３Ｔ細胞上清からレトロウイルスの保存株を作製した。ウエスタン解析は
、ＭＬＶ gp７０envおよびＶＳＶ−Ｇタンパク質免疫反応性の状態を精製ベク
ター調製物中のレトロウイルスgagタンパク質に対してノーマライズしたもので
示されるように、レトロウイルス産生細胞中で２つの外被タンパク質の均一な発
現およびウイルス粒子への安定した組み込み(図８Ｂ)を証明した。
【００９４】
この外被構造を用いて、ネオマイシン耐性(サイクリンＧ１構築物)またはβ−
ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の発現により求められる、感染力のある力価１
０７を常に達成した。ラットＡ１０ ＳＭＣ中のマトリックス・ターゲッテッド
・ＶＳＶＧ偽型レトロウイルスベクターの形質導入効率を決定するため、細胞を
種々のＭＯＩ(０.００５〜５００の範囲)で形質導入したところ、著しい濃度依
存を示し(図８参照)、ＳＭＣの７５％〜９６％がこれらのマトリックス・ターゲ
ッテッド・ベクターによりそれぞれ５０(力価＝３×１０６cfu／ml)から５００(
力価＝３×１０７cfu／ml)までのＭＯＩで形質導入されたことを示した。
【００９５】
サイクリンＧ１構築物の細胞傷害性と作用機構 これまでのレトロウイルスに媒
介されるアンチセンスサイクリンＧ１(すなわちＡＳ５８７)の細胞傷害性の研究
では、細胞周期の休止(Ｃhen, et al., Ｈum. Ｇene Ｔher., Ｖol. ８, pg
s. １６６７−１６７４(１９９７))および明白なアポトーシス(Ｚhu,et al.,
１９９７)に加えて、形質導入された細胞におけるシンシチウム形成が記載され
ている。注目すべきことに、変異サイクリンＧ１構築物の細胞増殖抑制性効力に
もまた、pＧ１ＤＮＴ４１〜２４９／ＲＥＸベクターによる形質導入後t＝４８時
間で見られるラットＡ１０細胞培養物におけるシンシチウム形成が伴い(図９)、
アンチセンス(ＡＳ５８７およびＡＳ６９３)構築物で見られたものと形態学上類
似する大型の多核細胞を呈した。これに対して、対照とする形質導入法でもヌル
ベクター(pＲＥＸ)でもラットＡ１０細胞でシンシチウム形成を誘導することは
なく(図９Ａ−Ｂ)、これは変異体およびアンチセンス構築物が同様に細胞の生存
力に影響していることを示唆する。サイクリンＧ１ノックアウト構築物の抗増殖
作用はヒト膵臓癌細胞(図８Ｃ)およびサルＳＭＣ(図８Ｄ)で確認し、ここでもＤ
ＮＴ４１−２４９発現変異体の相対的効力がほとんどの強力なアンチセンス構築
物よりも大きいことが分かった。
【００９６】
個々のサイクリンＧ１構築物の作用機構を実証するため、サイクリンＧ１タン
パク質発現のダウンレギュレーションを、ＡＳ６９３／ＲＥＸアンチセンスベク
ターにより形質導入した平滑筋細胞のウエスタン解析により証明した。図１０Ａ
に示す通り、サイクリンＧ１発現のダウンレギュレーションは、対照ベクターに
比べてアンチセンスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣ培養物で観察され
、最大阻害は形質導入後t＝４８時間で見られた。逆に、変異発現ベクターによ
る形質導入後２４時間および４８時間に見られる形質導入細胞培養物中の、適宜
、〜２０kＤaの免疫応答バンドの出現により示されるように、サイクリンＧ１変
異構築物の強制発現が、ベクターによって形質導入されたＡ１０細胞において確
認された(図１０Ｂ)。タンパク質発現を指示するという点ではベクターの性能の
証明は有意義であるが、ある時点における(細胞死の前)推定(細胞傷害性の)表現
型を一時的に発現する細胞の割合は小さいであろう。インビボでのバルーン損傷
動脈についての急性研究では、サイクリンＧ１タンパク質発現のアップレギュレ
ーションが新生内膜ＳＭＣで見られる。この特徴的なサイクリンＧ１タンパク質
発現のアップレギュレーションはヌルベクター(図１１Ａ)、ＰＢＳ対照(図１１
Ｂ)、または変異発現ベクター(図８Ｄ)のいずれかで処理したバルーン損傷動脈
では減退しなかった。これに対して、アンチセンスサイクリンＧ１(ＡＳ６９３
／ＲＥＸ)ベクターで処理した動脈においては、サイクリンＧ１発現の著しいダ
ウンレギュレーションが明白であった。これらを総合すると、これらのデータは
サイクリンＧ１構築物の細胞致死作用が形質導入細胞でのサイクリンＧ１発現の
直接調節によるものであることを示す。
【００９７】
ラット動脈再狭窄モデルにおけるpＤＮＴＧ１／ＲＥＸの評価 最後に、制御下
の２つの１ヶ月のインビボ効力研究において、サイクリンＧ１(ＤＮＴ４１−２
４９／ＲＥＸ)のＮ末端欠失変異を有するマトリックス・ターゲッテッド・ＶＳ
ＶＧ偽型ベクターの、バルーン損傷ラット動脈内への内腔内注入が、ヌルベクタ
ー、生理食塩水対照、および損傷／未処理群と比較した場合、新生内膜損傷の形
成を阻害した(図１２)。脈管に大量の傷および変形を生じる(この知見は未発表)
細胞傷害性ＨＳtkベクター(ガンシクロビルを含む)戦略とは違い、ＤＮＴ４１−
２４９／ＲＥＸベクター処理された動脈で動脈壁の壊死、繊維形成または変形の
証拠はなく、このアプローチが比較的安全であることを証明している。さらに、
長期(３０日)の効力データ(表１および２)は、ＤＮＴ４１−２４９／ＲＥＸベク
ター処理された動物において新生内膜損傷内でＳＭＣ増殖の「巻き返し」がほと
んど発生しなかったことを示し、活性化ＳＭＣにおける標的形質導入および細胞
致死性サイクリンＧ１変異タンパク質の発現が動脈再狭窄の後遺症の原因である
細胞力学にかなりの影響力を持つであろうと示唆される。
【００９８】
【表１】
１対照群(損傷のみ、生理食塩水およびヌルベクター)の脈管内膜：媒体比に有意
な差はなかった。
２dnＧ１ベクター処理群を３つの対照群と比較した。結果の変数に関して両側検
定を行った(脈管内膜：媒体比)。
【００９９】
【表２】
１対照群(損傷のみ、生理食塩水およびヌルベクター)の脈管内膜：媒体比に有意
な差はなかった。
２dnＧ１ベクター処理群を３つの対照群と比較した。結果の変数に関して両側検
定を行った(脈管内膜：媒体比)
【０１００】
考察
本開示は、変異サイクリンＧ１タンパク質を用いて優性様式でその正規の対応
部分の機能を阻害することの有用性を証明する。かかる変異タンパク質の適用に
は、密接に関連する(縮重)エレメントの機能をブロックし、かつ、検出可能な遺
伝子産物を産生するという２重の利点がある(図１０参照)。ここで、サイクリン
Ｇ１の欠失変異体および点突然変異体は明白な抗増殖特性を示し、これは最も強
力なアンチセンスサイクリンＧ１構築物と少なくとも同程度の作用であった。選
択した変異サイクリンＧ１構築物(ＤＮＴ４１−２４９)を含むマトリックス・タ
ーゲッテッド・レトロウイルスベクターをまずインビトロで試験したところ、細
胞増殖の著しい阻害が見られた。アンチセンスサイクリンＧ１構築物(Ｚhu et
al., １９９７)に匹敵する様式で、ドミナントネガティブサイクリンＧ１構築
物は形質導入されたＳＭＣにおいてシンシチア形成およびプログラムされていな
いアポトーシスを引き起こし、機構上の類似性を示唆した。
【０１０１】
治療用遺伝子構築物に加え、ベクターのバイオアベイラビリティの向上に役立
つウイルス粒子へのマトリックス・テーゲッティング技術(以下参照)の組み込み
により、レトロウイルスを媒介とする損傷動脈への遺伝子送達効率に著しい改良
がなされた。レトロウイルスベクター・ターゲッティング技術における最近の進
展は、フォン・ヴィレブランド因子の一次構造に内在する生理学的監視機能(Ｍo
ntgomery et al.,Ｈemophilia and von Ｗillebrand Ｄisease, Ｃhapte
r ４４, pgs. １６３１−１６７５,Ｗ. Ｂ. Ｓaunders Ｃo., Ｐhiladelp
hia (１９９８)；Ｇinsburg,Ｄ, et al., Ｐroc. Ｎat. Ａsal. Ｓci.
Ｖol. ８６,pgs. ３７２３−３７２７ (１９８９)；Ｒuggeri ＆ Ｚimmer
man, Ｂlood, Ｖol. ７０,pgs. ８９５−９０４ (１９８７))をマトリック
ス・ターゲッテッド・レトロウイルスベクターの開発に採用し得ることが証明さ
れている(Ｈall,et al. Ｈuman Ｇene Ｔherapy, Ｖol. ８, pgs. ２１
８３−２１９２ (１９９７)；Ａnderson,Ｎature, Ｖol. ３９２ (Ｓuppl.)
, pgs. ２５−３０ (１９９８))。vＷＦ由来マトリックス・ターゲッティング
(すなわちコラーゲン結合)モチーフの操作およびレトロウイルス外被への挿入は
、都合のよい機能獲得表現型、すなわちバルーンカテーテル損傷に曝された細胞
外マトリックス成分との高親和性結合を有するＭＬＶに基づくベクターを利用す
ることによって、インビボでの遺伝子送達を向上させる。これらの研究に用いた
マトリックス・ターゲッテッド両種性外被(Ｈall et al., ２０００参照)は、
２週間のアンチセンスサイクリンＧ１の効力研究(Ｚhu et al., ２０００；提
示)において血管損傷部位に集積すること(Ｈall et al.,１９９７)と内在Ｓ
ＭＣの効果的な形質導入を可能にすることがこれまでに示されている本来のエコ
トロピック(齧歯類特異的)ベクターに取って代わる。損傷後１時間以内に平均的
なＳＭＣの活性化および増殖が始まる限り、新生内膜への移動は４日目までに起
こり(Ｃlowes et al. Ｌab. Ｉnvest.,Ｖol. ４９, pgs. ３２７−３７
３ (１９８３),Ｃlowes et al., Ｃirc Ｒes., Ｖol. ５６, pgs. １３
９−１４５ (１９８５))、複製は次の２週間にわたり著しく増加し(Ｓchwartz
et al., １９９５；ＤeＭeyer and Ｂlut,１９９７)、ベクター浸潤およ
び細胞の形質導入は、(i)バルーン損傷時(Ｚhu et al., １９９７)および(ii)
新生内膜内でのＳＭＣの移動および増殖が最大となる血管形成後７日(Ｈall
et al., ２０００)の時点でのマトリックス・ターゲッテッド両種性ベクターの
内腔内注入によってさらに至適化される。
【０１０２】
本開示では、Ｓoneoka et al.,１９９５から採用した一時的トランスフェ
クション系を用いて高力価レトロウイルスベクターを作製したが、ここでは、パ
ッケージング成分ならびに治療遺伝子の発現は強力なＣＭＶプロモーターによっ
て駆動し、各構築物がヒト２９３Ｔ産生細胞におけるプラスミド発現を助ける働
きをするＳＶ４０複製起点(ori)を含む。これらの試薬を用いて３x１０６〜３x
１０８cfu／mlの範囲のウイルス力価を常に達成した。さらに、融合誘導ＶＳＶ
Ｇ envタンパク質の同時発現(Ｉida,et al., Ｊ. Ｖirol., Ｖol. ７０, p
gs. ６０５４−６０５９ (１９９６)；Ｌaitinen,et al., Ｈum. Ｇene
Ｔher., Ｖol. ８,pgs. １６４５−１６５９ (１９９７)；Ｙu, et al.,
Ｇene Ｔherapy,Ｖol. ６, pgs. １８７６−１８８３ (１９９９))が、ベ
クターをさらに濃縮せずともウイルス力価をさらに向上させた(９x１０８cfu／m
lまで)ことから、ベクター作製および予測治療構築物の同定が容易となった。
【０１０３】
総合すると、レトロウイルスベクターの設計、操作、および展開におけるこれ
らの改良点により、至適化された遺伝子療法プロトコールの開発およびバルーン
血管形成ラットモデルでの新生内膜形成の阻害における長期作用の達成が可能と
なった(表１参照)。２例の制御下の１ヵ月の効力研究において、マトリックス・
ターゲッテッドdnＧ１レトロウイルスベクターのバルーン損傷ラット頚動脈への
内腔内送達は、他の唯一の薬剤であるタンパク質キナーゼＣ阻害剤(Ｐrescott,
et al., Ａnn. Ｎ.Ｙ. Ａcad. Ｓci.,Ｖol. ８７８, pgs. １７９−１９
０ (１９９０))および一酸化窒素シンターゼ構築物を有するアデノウイルスベ
クター(Ｓhears,et al., Ｊ. Ａm. Ｃoll. Ｓurg., Ｖol. １８７, pgs.
２９５−３０６ (１９９９))により誘導される応答の大きさとしての、ＳＭ
Ｃ増殖の「巻き返し」と混同することなく新生内膜損傷形成の〜５０％阻害を生
じた。動脈組織学を都合悪く歪曲させる(ガンシクロビル投与後の)ＨＳtＫベク
ターとは異なり(Ｎabel,Ｎature Ｖol. ３６２, pgs. ８４４−８４６ (１
９９３))、dnＧ１ベクター処理された動脈で動脈壁の壊死、繊維形成または変形
は明らかに存在せず(図１２参照)、インビボ臨床使用におけるこのアプローチの
安全性を証明している。結論として、この研究は、血管再狭窄の治療のための細
胞致死性遺伝子療法の有用性を拡大するため、治療サイクリンＧ１構築物におけ
る著しい改良とマトリックス・ターゲッティング技術、ベクター作製方法、およ
び点滴注入法プロトコールにおける進歩とを組み合わせたものである。
【０１０４】
実施例３ マトリックス・ターゲッテッド・レトロウイルスベクターの全身投与
はマウスにおける癌遺伝子療法に有効である
材料および方法
細胞、細胞培養条件、マーカーを含むプラスミドおよびベクター、ならびに細胞
周期制御遺伝子 ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔおよびヒト膵臓癌ＭiaＰaca２細胞を
ＡＴＣＣから入手した。ＮＩＨ３Ｔ３および２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血
清(Ｄ１０；Ｂiowhittaker,Ｗalkersville, ＭＤ, ＵＳＡ)を添加したダルベッ
コ改変イーグル培地で維持した。ウイルスgag pol遺伝子を含むプラスミドpcgp
、および核ターゲッテッドb−ガラクトシダーゼ構築物を発現するレトロウイル
スベクターpcnＢgは厚意によりそれぞれＤrs. Ｐaula ＣannonおよびＬing
Ｌiより提供されたものであった(ＵＳＣ Ｇene Ｔherapy Ｌaboratories,Ｌ
os Ａngeles, ＣＡ)。末端切断した(a.a. ４１−２４９)サイクリンＧ１(dnＧ
１)構築物を、Ｇ１ＸＳvＮa(Ｇenetic Ｔherapy,Ｉnc., Ｇaithersburg, ＭＤ
, ＵＳＡから譲渡)のレトロウイルスパッケージング成分配列を含むようにpＨＩ
Ｔ１０９(Ｓoneoka et al.,Ｎucl. Ａcid Ｒes. ２３, ６２８−６３３,
１９９５)を改変したレトロウイルス発現ベクターpＲＥＸへクローニングした。
【０１０５】
変異サイクリンＧ１構築物を有するマトリックス・ターゲッテッド・レトロウイ
ルスベクターの作製 パッケージング成分gag−pol、およびＣＭＶプロモーター
から発現したフォン・ヴィレブランド因子由来のコラーゲン結合(マトリックス
・ターゲッティング)モチーフを有するキメラ両種性モロニーネズミ白血病ウイ
ルス(ＭulＶ)に基づくenv、およびレトロウイルスベクターを、各々ＳＶ４０複
製起点を有する個々のプラスミドに配置した、３または４プラスミドの一時的同
時トランスフェクション系(Ｓoneoka et al., Ｎucl. Ａcid Ｒes. ２３,
６２８−６３３, １９９５)を用いて高力価ベクターを作製した。ベクターは、
用いる特定の外被を表すＭx−nＢg、Ｍx−dnＧ１、およびＣＡＥ−dnＧ１と呼び
、遺伝子発現構築物を各ベクターに組み込んだ。Ｍx−nＢgはその外被にマトリ
ックス・ターゲッティングモチーフおよび核ターゲッテッドb−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を有するＭuＬＶに基づく改変型ベクターである。Ｍx−dnＧ１はＮ末端
欠失変異サイクリンＧ１構築物を有するマトリックス・ターゲッテッド細胞致死
性ベクターである(Ｇordon et al.,Ｃancer Ｒes. ６０, ３３４３−３３
４７. ２０００)。ＣＡＥ−dnＧ１は野生型の両種性ＭulＶに基づく外被(Ｍorg
an et al., Ｊ. Ｖiol. ６７,４７１２−４７２１. １９９３)およびＭx
−dnＧ１と同じ細胞致死性サイクリンＧ１構築物を有する非ターゲッテッドベク
ターである。
【０１０６】
ウイルス力価 ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞中のウイルス力価は、βガラクトシダー
ゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性、neor遺伝子の発現を基に
、これまでに記載されたようにして求めた(Ｓkotzko et al., Ｃancer Ｒes.
５５, ５４９３−５４９８,１９９５)。ウイルス力価はＧ４１８耐性コロニ
ー形成単位の数(cfu)／mlとして表し、１０７ないし１０８cfu／mlの範囲であっ
た。
【０１０７】
インビボ効力研究 これらの研究は、the Ｕniversity of Ｓouthern Ｃali
fornia Ｉnstitution Ａnimal Ｃare and Ｕse Ｃommitteeに承認された
プロトコールに従って行った。インビボ Ｍx−dnＧ１ベクター治療の抗腫瘍作
用に基づいた標的遺伝子送達効率を評価するため、１〜９x１０７のヒトＭiaＰa
ca２癌細胞を胸腺欠損nu／nuマウスに皮下移植することで皮下腫瘍異種移植を行
なった。腫瘍が〜５０mm３の大きさに達したところで、Ｍx−dnＧ１ベクター(力
価：８x１０６cfu／２５gmマウス)、同様の力価のＭx−nＢg対照ベクター、非タ
ーゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター、またはリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ、p
Ｈ７.４)プラセボ対照のいずれか２００μlを尾の静脈に７〜１０日間毎日直接
注射した(１治療周期)。腫瘍の大きさをノギスで２〜４日ごとに測定し、楕円対
象物の容積を算出する公式：腫瘍体積、mm３＝４／３ p r１ r２ r３を用い
た。マウスをそれぞれ、１または２治療周期が終わった翌日または１週間後に頸
椎脱臼により犠牲にした。
【０１０８】
アポトーシスアッセイ 腫瘍小節由来の組織片を、Ａpoptagキット(Ｉntergen,
Ｐurchase,ＮＹ, ＵＳＡ)を用いてアポトーシスの誘導について評価した。急速
凍結した腫瘍小節をパラホルムアルデヒドで固定し、膜をエタノールおよび酢酸
で透過処理した。ＴdＴ酵素を加えた後、抗ジドキシゲニン(didoxygenin)ペルオ
キシダーゼコンジュゲートを加えた。次いでこれらの組織片をペルオキシダーゼ
基質で染色し、メチルグリーンで対比染色した。
【０１０９】
統計分析 (i)経時的な腫瘍容積の変化(腫瘍増殖率)を簡約するため、最少二乗
直線を対数変換値に当てはめた。すなわち、各マウスについて、最初の経時的な
５回の測定値を用いて傾きを推定した。計算したこれらの傾きを真数を用いて元
の倍率に変換し直し、一日あたりの平均腫瘍増殖率(％)とする。３回の実験の各
々の中で異なるベクターを比較するには、分散の荷重分析を独立変数として推定
した傾きとともに用いた。各マウスに対し、加重は傾きの推定値(最初の最少二
乗直線分析で計算したもの)の標準誤差の和の逆数に３回全ての実験に基づく傾
き間の分散の推定値を加えたものである。実験Ｉ およびII に関しては、分散
分析に基づくＦ検定を用いてＭx−nＢgおよびＭx−dnＧ１ベクターを比較し、実
験IIIに関しては、Ｆ検定の後に多重比較の最少有意差法を用いてＭx−dnＧ１と
ＣＡＥ−dnＧ１ベクターおよびプラセボ処置を比較した。解析したデータを組み
合わせた結果を表３に示す。(ii)カプラン・マイヤー・プロダクト・リミット法
(Ｋaplan−Ｍeier product limit method)(Ｋaplan ＆ Ｍeier Ｊ. Ａme
r. Ｓtatist. Ａssoc. ５３,４５７, １９５８)を用いて腫瘍が４倍になる
確率を時間(日数)の関数として推定した。(iii)傾向に関するタロン検定(ログラ
ンク検定に基づく；Ｔarone, Ｂiometrika ６２, ６７９,１９７５)を用いてプ
ラセボ(ＰＢＳ)−処置群、非ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター処置群、お
よびマトリックス・ターゲッテッドＭx−dnＧ１ベクター処置群が４倍になる時
間を比較した。
【０１１０】
結果
短期の効力研究では、Ｍx−nＢg対照ベクター、非ターゲッテッドＣＡＥ−dn
Ｇ１ベクターまたはＭx−dnＧ１細胞致死性ベクター(各ベクター＝〜８x１０６c
fu／用量)、かまたは同量のＰＢＳプラセボのいずれかの静注を１〜９x１０７の
ヒトＭiaＰaca２膵臓癌細胞の移植後６日目に開始し、マウスの部分集合に総計
７ベクターの注入を毎日継続した。Ｍx−nＢgベクター(図１３)、非ターゲッテ
ッドＣＡＥ−dnＧ１ベクターおよびプラセボＰＢＳで処置したマウスでは、腫瘍
サイズに進行性の増殖が見られた(表３)。これに対して、Ｍx−dnＧ１ベクター
で処置した動物では腫瘍退縮が見られた(図１３；表３)。免疫組織化学染色では
、対照ベクター処置マウスの大型腫瘍で発現したヒトサイクリンＧ１タンパク質
に対する核の強い免疫反応性が明らかとなったが、一方でＭx−dnＧ１ベクター
で処置した動物の残存腫瘍にサイクリンＧ１発現の減少が認められた。
【０１１１】
マトリックス・ターゲッテッド・レトロウイルスベクターによる固形腫瘍への
遺伝子送達の効率を評価するため、７種のベクター用量を投与した後に２群の動
物の部分集合を犠牲にした(図１３)。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した
、Ｍx−nＢg対照ベクターで処置した動物から得た腫瘍組織切片の組織病理学検
査により、腫瘍小節が腫瘍および腫瘍関連細胞、すなわち薄い結合組織被膜に囲
まれた活性脈管形成介在域を持ち比較的分裂速度の速い優勢な悪性類上皮細胞集
団からなることが明らかとなった。これに対して、Ｍx−dnＧ１ベクターで処置
した動物から得た腫瘍小節では、大量の腫瘍破壊、残存腫瘍細胞内でのアポトー
シスの多発、および反応性間質の肥厚化の形跡が見られた。多くの腫瘍小節が、
大きな中央壊死域、活性腫瘍の中間域、および多数のアポトーシス細胞を含む末
梢域を示した。消散している他の腫瘍小節はほぼ完全に緻密な結合組織に囲まれ
ているが、これにより、かなりの割合の残存腫瘍が明白なアポトーシス細胞の小
領域を示し、また、急性および慢性炎症の程度が多様であることが説明される。
【０１１２】
形質導入効率は、b−ガラクトシダーゼ抗原(ＧＡＬ−４０,Ｓigma, Ｓt. Ｌ
ouis ＭＯ, ＵＳＡ)に対するマウスモノクローナル抗体を用いる腫瘍小節の免
疫組織化学染色と、その後のＯptimas画像解析システム(Ｏptimas Ｃorporatio
n, Ｂothell, Ｗashington,ＵＳＡ)を用いる解析により求めた。腫瘍小節あた
り３つの高電場でb−ガラクトシダーゼ陽性細胞の数を計数し、細胞総数で割っ
て×１００倍することで形質導入効率(％で表す)を求めた。高レベルの細胞の形
質導入(３５.７±１.４％；表４)がＭx−nＢgベクターで処置した動物の腫瘍小
節のいたるところで認められた。
【０１１３】
この腫瘍小節に見られた高い形質導入効率をさらに調べるため、犠牲にする１
時間前および２４時間前にＭx−nＢgベクターを静注してベクター分布試験を行
なった。８３Ａ２５ラットモノクローナル抗体を用いるレトロウイルス外被タン
パク質の免疫組織化学染色は、１時間では、ベクター粒子の集積は腫瘍小節全体
に絡み合う脈管形成域において顕著であったが、２４時間では、ベクター粒子の
免疫反応は見られず、このことは腫瘍および腫瘍関連細胞へのウイルスの侵入が
起こったことを示している。腫瘍小節のマッソン・トリクローム染色は、脈管形
成血管床が内皮細胞に完全には覆われていないことから、細胞外マトリックス成
分は循環血液成分に曝されていることを明らかにした。考えうるところでは、透
過性の腫瘍脈管構造内でのコラーゲンが露出していることがマトリックス・ター
ゲッテッド・レトロウイルス粒子の局所濃度を高め、それが腫瘍小節内で見られ
た高い分裂指数とあいまって、腫瘍細胞および関連する脈管構造の効果的な形質
導入を促進した。マッソン・トリクローム染色で、豊富なコラーゲン沈着を含む
活発な繊維形成が、実際の腫瘍塊に対してかなりの割合の残存小節を構成してい
たことが確認された。
【０１１４】
アポトーシスは腫瘍性細胞(Ｓkotzko et al., Ｃancer Ｒes. ５５, ５４
９３−５４９８, １９９５)においても増殖性の血管細胞(Ｚhu et al.,Ｃirc
ulation ９６, ６２８−６３５. １９９７)においても、サイクリンＧ１阻害
の結果であることが知られている。従って、Ｍx−dnＧ１ベクターで処置した腫
瘍の免疫組織化学染色では、対照ベクターで処置した動物のものと比較した場合
、ＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞の発生率が著しく増加することが明らかにな
った。アポトーシスは対照ベクターで処置したマウスの脈管形成の血管では認め
られなかった。これに対して、間質コンパートメントと同様に脈管形成域の内皮
細胞の多数のアポトーシス(３６±５％)がＭx−dnＧ１ベクターで処置した動物
において見られた。特に、アポトーシス発生の増加は、腫瘍小節の周辺表層に限
らず、腫瘍小節の奥深くの多くの細胞層にまで及んでいた。Ｍx−dnＧ１ベクタ
ーの腫瘍小節への浸透能は、コラーゲン沈着および／または露出、ならびに固形
腫瘍の中心部内の血管浸透性によって明らかに促進された。この観点はベクター
粒子の集積が脈管形成域で最も顕著であることを示した免疫組織化学研究結果と
一致する。さらに、認められた増殖性内皮細胞および間質細胞の破壊はそれ自身
、血管供給の枯渇により(Ｆolkman, Ｎature Ｍed. １, ２７−３.１９９５；
Ｈanahan ＆ Ｆolkman,Ｃell ８６, ３５３−３６４, １９９６；Ｆidler,
Ｊ. Ｎatl. Ｃancer Ｉnst. ８７,１５８８−１５９２. １９９５)または
増殖因子の刺激により(Ｆukumura et al., Ｃell ９４, ７１５−７２５.１
９９８)、不均衡な量の腫瘍細胞死を誘発し得るものであった。
【０１１５】
Ｍx−dnＧ１ベクター(ベクター用量：１x１０７cfu)、同等の用量の非ターゲ
ッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター、または等量のＰＢＳプラセボを用いる、休止
期を挟んで２回(１０日)の治療サイクルからなる長期効力研究で、治療効率が両
種性ＭＬＶ外被タンパク質の一次構造内に組み込まれたコラーゲン・ターゲッテ
ィングペプチドモチーフに依存していることが確認された(図１４Ａおよび１４
Ｂ)。プラセボ処置したマウスでは腫瘍サイズの急速な増大が見られたが、非タ
ーゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター処置した動物では、ＰＢＳ対照と比較した
場合に腫瘍増殖の下限阻害が認められた(p＝０.１０；表３)。これに対して、非
ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター処置マウス(p＝０.０１４)、対照ターゲ
ッテッドＭx−nＢgベクター処置マウス(p＝０.００４)、およびＰＢＳ処置マウ
ス(p＝０.００１；表３)と比較すると、Ｍx−dnＧ１ベクター処置マウスにおけ
る腫瘍増殖は有意に阻害された。さらに、Ｍx−dnＧ１ベクター処置マウスにお
ける腫瘍増殖率は、〜７週間の追跡期間を通して非ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ
１ベクター処置動物(図１４Ａ)のものより常に低く維持されていた。
【０１１６】
カプラン・マイヤー生存研究は、ＰＢＳプラセボ、非ターゲッテッドＣＡＥ−
dnＧ１ベクターまたはマトリックス・ターゲッテッドＭx−dnＧ１ベクターで処
置したマウスで行った(図１４Ｂ)。倫理上の理由から、実際に動物を死亡させる
ではなく、生存のエンドポイントを実際の対象の死亡の代わりに、腫瘍が４倍に
なった時点と定めた(まず、腫瘍負荷が最初の基準よりも４倍大きくなったと認
められたときに記録)。もし腫瘍容積が４７日で４倍に増えなかった場合、その
動物を犠牲にし、４倍増殖時間を４７日で打ち切った。カプラン・マイヤー・プ
ロダクト・リミット法(Ｋaplan ＆ Ｍeier Ｊ. Ａmer. Ｓtatist. Ａssoc
. ５３, ４５７, １９５８)を用いて腫瘍が４倍になる確率を時間(日数)の関数
として推定した。傾向に関するタロン検定(ログランク検定に基づく；Ｔarone,
Ｂiometrika ６２,６７９,１９７５)を用いてプラセボ(ＰＢＳ)−処置群、非
ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター処置群、およびマトリックス・ターゲッ
テッドＭx−dnＧ１ベクター処置群の４倍増殖時間を比較した。ログランク検定
を用いると、３つ全ての群を同時に比較する総合的なＰ値は０.００３であり、
傾向を含めるとその有意水準は０.００４であった。これらのデータは、長期の
腫瘍増殖制御の可能性は、非ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクターまたはＰＢ
Ｓプラセボよりもマトリックス・ターゲッテッドＭx−dnＧ１ベクターを用いる
方が有意に高いことを示している。
【０１１７】
マトリックス・ターゲッテッド・ベクターの潜在的毒性を評価するため、１ま
たは２回の治療サイクルの終了時に非標的臓器を回収した(累積のベクター用量
はそれぞれ８×１０７または１.６×１０８cfu)。血清化学プロフィールは正常
で、骨髄、肺、心臓、脳、肝臓、腎臓、精巣、結腸および皮膚の組織検査では臓
器損傷の形跡はなかった。これらの結果はＭx−dnＧ１レトロウイルスベクター
の静注が広範囲の安全性を持つようであるとの考え(Ｇordon et al., Ｃancer
Ｒes. ６０,３３４３−３３４７, ２０００)をさらに裏付けるものである。
【０１１８】
【表３】
注：３つの別々の実験の結果を合わせた。３つの実験中の異なるベクターを比較
するために、分散の重量分析を、独立分散としての概算した傾斜と共に使用した
。実験ＩおよびIIに関して、分散の分析に基づいたＦ検定を使用して、Ｍx−nＢ
gおよびＭx−dnＧ１ベクターを比較し、実験IIIに関して、Ｆ検定、続く複数の
比較の最小有意差法を使用して、Ｍx−dnＧ１を、ＣＡＥ−dnＧ１ベクターおよ
びプラセボ処置と比較した。分析データの合わせた結果を上記に示す。
【０１１９】
【表４】
注：Ｍx−nＢgレトロウイルスベクターによる固体腫瘍内への遺伝子送達の効果
を、７種のベクター投与量を投与した後に二つのサブセットの動物で評価した(
図１３も参照)。形質導入効率は、腫瘍小瘤の免疫組織化学的染色により、b−ガ
ラクトシダーゼ抗原に対するマウスモノクローナル抗体、続くＯptimas造影シス
テムを使用して測定した。形質導入効率(％で示す)は、腫瘍小瘤当たりの３つの
ハイパワー場におけるb−ガラクトシダーゼ陽性細胞を計数し、細胞の総数で割
り、１００を掛けて測定した。
【０１２０】
考察
実施例３の結果は、末端静脈注射により分散させたマトリックス標的化レトロ
ウイルスベクターが、(i)１時間以内に血管形成性腫瘍血管構造に蓄積される、(
ii)腫瘍細胞が高レベルの効率で形質導入される、そして(iii)目に見える毒性を
誘発することなく、治療的遺伝子送達および長期効果を促進することを証明する
。一緒にして、これらの結果は、末梢静脈に直接注射したマトリックス標的化レ
トロウイルスベクターが、固体腫瘍内への治療的遺伝子送達を改善するという原
則の最初の決定的証拠を提供する。
【０１２１】
全ての特許、刊行物(公開特許出願も含む)、データベース受け入れ番号および
受託所受け入れ番号の記載は、各特許、刊行物、データベース受け入れ番号およ
び受託所受け入れ番号が個々に特記され、個々に出展明示により本明細書に包含
されるのと同程度に出展明示により本明細書に包含させる。
【０１２２】
しかし、本発明の範囲は、上記の具体的実施態様に限定されないことは理解す
べきである。本発明は、特別に記載されているのと異なって実施し得、まだ特許
請求の範囲の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
この発明は、突然変異サイクリンＧ１タンパク質を罹患動物に提供することに
より天然サイクリンＧ１タンパク質の機能を阻害することによる、異常な細胞増
殖を伴う病状および疾患、例えば腫瘍、癌、再狭窄、過形成、角膜混濁および白
内障の処置に関するものである。さらに具体的には、この発明は、突然変異サイ
クリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む、発現ビークル(
伝達体)、例えばレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを動物
に投与することによる上記病状および疾患の処置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
サイクリン類として知られている新種のタンパク質をコード化する遺伝子は、
新種のプロトオンコジーンとして同定されており、サイクリン依存的キナーゼ(
またはＣdk)阻害剤が腫瘍サプレッサーとして同定されている結果、細胞形質転
換および腫瘍発生の分子機構が細胞周期制御をつかさどる酵素学と結びつけられ
た。(非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４)。特異的サイクリン類の逐次発現および特異的Ｃdk複合体の本質的機能については既に特定されているため(Ｗuら、Ｉnt.Ｊ.Ｏncol.、第３巻、８５９−８６７頁(１９９３)、Ｐinesら、Ｎew Ｂiologist、第２巻、３８９−４０１頁(１９９０)、Ｐines、Ｃell Ｇrowth and Ｄifferentiation、第２巻、３０５−３１０頁(１９９１)、Ｒeed、Ａnn.Ｒev.Ｃell Ｂiol.、第８巻、５２９−５６１頁(１９９２)、Ｓherr、Ｃell、第７９巻、５５１−５５５頁(１９９４))、ＤＮＡ複製、転写、修復、遺伝子不安定性およびアポトーシスの基本機構との直接的関連づけが行なわれた。(Ｄ'Ｕrsoら、Ｓcience、第２５０巻、７８６−７９１(１９９０)、Ｗuら、Ｏncogene、第９巻、２０８９−２０９６頁(１９９４)、Ｒoy、Ｃell、第７９巻、１０９３−１１０１頁(１９９４)、Ｍeikrantzら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.、第９１巻
、３７５４−３７５８頁(１９９４))。
【０００３】
転移性癌腫は、悪い結果を伴う疾患であるため、遺伝子療法にとっては重要な
標的である。例えば、結腸直腸癌は、合衆国では肺癌に次ぐ癌死の第２の主要原
因であり、乳癌および膵臓癌がこれに続く(Ｓilberbergら、Ｃancer Ｃlin.、
第４０巻、９−２６頁(１９９０))。これらの癌腫のうち、膵臓癌の予後は最悪
である。転移性膵臓癌患者の生存中央値は３〜６ヶ月であり、事実上患者は総べ
て１年以内に死亡している(Ｍerrickら、Ｇastrenterol.Ｃlin.Ｎ.Ａmer.、第１
９巻、９３５−９６２頁(１９９０))。患者の約４０％は、診断時点で肝臓また
は腹腔またはその両方への転移性癌を呈する。転移性癌に対する化学療法は、多
モード療法にも拘わらず有効ではない。このため、転移性癌に対する別の治療法
が要望され得る。
【０００４】
Ｗuら(Ｏncol.Ｒeports、第１巻、７０５−７１１頁(１９９４))は、ヒトサイ
クリンＧ１タンパク質に関する推定アミノ酸配列およびcＤＮＡ配列を開示して
いる。Ｗuらはまた、正常な二倍体ヒト線維芽細胞における場合よりも高いサイ
クリンＧ１発現レベルが骨肉腫細胞およびユーイング肉腫細胞から見出されたこ
とを開示している。Ｗuらは、ヒト骨肉腫細胞におけるサイクリンＧ１タンパク
質の過剰発現が癌への潜在的関連性をもたらすと主張しているが、Ｗuらは、癌
細胞におけるサイクリンＧ１タンパク質の機能に干渉またはそれを阻害すること
による癌の処置について開示してはいない。
【０００５】
心筋および脳の両梗塞の主原因であるアテローム性硬化症は、合衆国およびヨ
ーロッパにおける全死亡数の〜５０％に関与している(Ｒoss、Ｎature、第３６
２巻、８０１−８０９頁(１９９３)、ＭurrayおよびＬopez、Ｔhe Ｇlobal Ｂ
urden of Ｄisease、ハーバード・ユニバーシティー・プレス、ケンブリッジ
、マサチューセッツ(１９９６))。バイパス移植および動脈内膜切除に加えて、
経皮的経管的冠動脈形成術(ＰＴＣＡ)は、血管狭窄症に対する標準的処置となっ
ている(Ｆitz Ｇibbonら、Ｃan.Ｊ.Ｃardiol.、第１２巻、８９３−９００頁(
１９９６))。初回ＰＴＣＡの成功率は９０％を優に越える程度まで増加している
が、この方法の長期有効性は、患者の〜３０−５０％における新生内膜過形成お
よび再狭窄の起こり得る発生により制限されており(Ｇlagov、Ｃirculation、第
８９巻、２８８８−２８９１頁(１９９４)、Ｓchwartzら、Ａm.Ｃoll.Ｃardiol.
、第１７巻、１２８４−１２９３頁(１９９２)、Ｍyersら、Ｗound Ｈealing
Ｒesponses in Ｃardiovascular Ｄisease、Ｗeber編、フツーラ・パブリッ
シング・カンパニー、マウント・キスコ、ニューヨーク、１３７−１５０頁(１
９９５)、Ｃhenら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.、第９９巻、２３３４−２３４１頁(１９
９７))、第２のＰＴＣＡが必要となるような程度に至ることも多い(Ｋirchengas
tら、Ｃardiovasc.Ｒes.、第３９巻、５５０−５５５頁(１９９８))。現在まで
のところ、広範囲に及ぶその用途を保証するのに充分有効な薬理学的戦略は無い
(Ｈerrmanら、Ｄrugs、第４６巻、１８−５２頁(１９９３)、Ｄe Ｍeyerおよび
Ｂult、Ｖascul.Ｍed.、第２巻、１７９−１８９頁(１９９７))。すなわち、新
生内膜形成の制御は、血管生物学における最新研究の主目標(Ｓchwartzら、Ｔhe
Ｉntima,Ｃirculation Ｒes.、第７７巻、４４５−４６５頁(１９９５))およ
び新規分子医薬の開発用モデルシステム(Ｇibbonsら、Ｓcience、２７２巻、６
８９−６９３頁(１９９６))を代表する。
【０００６】
成長因子シグナル伝達経路における高度の複雑度および重複性により、新規静
細胞療法の設計において保存された細胞周期制御経路の試験が促進された(Ｂarr
およびＬeiden、Ｔrends Ｃardiovasc.Ｍed.、第４巻、５７頁(１９９４)、Ａn
dres、Ｉnt.Ｊ.Ｍolecular,Ｍed.、第２巻、８１−８４頁(１９９８)、Ｂraun−
Ｄullaeusら、Ｃirculation、第９８巻、８２−８９頁(１９９８))。従って、Ｓ
ＭＣ増殖および新生内膜形成を阻止するための若干の新規遺伝子治療方法は、サ
イクリン依存的プロテインキナーゼ(ＣＤＫ)サブユニットのアンチセンス構築物
を代表するオリゴデオキシヌクレオチド(Ｍorishitaら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci
.、第９０巻、８４７４−８４７８頁(１９９３)、Ｍorishitaら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnv
est.、第９３巻、１４５８−１４６４頁(１９９４)、Ａbe、１９９４)、Ｃdk阻
害剤を担うアデノウイルスベクター(Ｃhangら、Ｓcience、第２６７巻、５１８
−５２２頁(１９９５)、Ｃhenら、１９９７)またはＲbタンパク質の構成的活性
形態を担うベクター(Ｃhangら、Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.、第９６巻、２２６０−２２
６８頁(１９９５)、Ｓmithら、Ｅxp.Ｃell Ｒes.、第２３０巻、６１−６８頁(
１９９７))を含む、特異的細胞周期制御エレメントに集中している。他の試験は
、多細胞周期制御遺伝子の誘導を調節する、転写因子Ｅ２Ｆに対して向けられた
分子「おとり」オリゴデオキシヌクレオチド戦略を採用している(Ｍorishitaら
、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.、第９２巻、５８５５−５８５９頁(１９９５))。こ
れらの実験的方法の報告された効力は、新生内膜病変で選択的にアップレギュレ
ーションされている細胞周期制御エレメントが戦略的治療標的を表すという概念
を裏付けしている。
最近の研究は、げっ歯動物(Ｚhuら、２０００、提示)および非ヒト霊長類(Ｋa
ijin Ｗuら、１９９９、提示)におけるバルーンカテーテル創傷後の、誘導可能
な細胞周期制御エレメントである、サイクリンＧ１のアップレギュレーションを
特徴としている(Ｔamuraら、Ｏncogene、第８巻、２１１３−２１１８頁(１９９
３)、Ｗuら、１９９４、Ｈomeら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、第２７１巻、６０５０−６
０６１頁(１９９６)、Ｍorishitaら、１９９５)。インビトロでのトランスフェ
クション細胞におけるサイクリンＧ１の強制発現により、細胞周期は加速され、
クローン伸展は促進され(Ｓmithら、Ｅxp.Ｃell,Ｒes.、第２３０巻、６１−６
８頁(１９９７))、そしてアンチセンス戦略によるサイクリンＧ１発現の遮断に
より、細胞性塞栓および細胞崩壊が誘導される(Ｓkotzkoら、Ｃancer Ｒes.、
５５巻、６１−６８頁(１９９５)、Ｃhenら、Ｈum.Ｇene Ｔher.、第８巻、１
６６７−１６７４頁(１９９７)、Ｈungら、Ｉnt.Ｊ.Ｐediatr.Ｈematol.Ｏncol.
、第４巻、３１７−３２５頁(１９９７))。ＳＭＣ増殖に関連して、(i)充分に高
い力価(１０８cfu／ml)に濃縮されたアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイル
スベクターは、形質導入ラット(Ｚhuら、Ｃirculation、第４６巻、６２８−６
３５頁(１９９７))および霊長類血管ＳＭＣの生存および増殖を阻害すること(観
察結果は未発表)、および(ii)バルーン創傷ラット頚動脈におけるこの濃縮アン
チセンスサイクリンＧ１ベクターの管内送達により、インビボ新生内膜形成の顕
著な縮小が誘発されること(Ｚhuら、１９９７)が示された。従って、サイクリン
Ｇ１は、血管再狭窄の治療技術における治療的介入にとって適切かつ有利な座で
あると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈallら、Ｃurr.Ｏpin.Ｃell Ｂiol.、第３巻、１７６−１８４頁(１９９１)
【非特許文献２】Ｈunterら、Ｃell、第７９巻、５７３−５８２頁(１９９４)
【非特許文献３】Ｅlledgeら、Ｃurr.Ｏpin.Ｃell.Ｂiol.、第６巻、８７４−８７８頁(１９９４)
【非特許文献４】Ｐeterら、Ｃell、第７９巻、１８１−１８４頁(１９９４)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
(発明の要約)
出願者らは、癌細胞におけるサイクリンＧ１タンパク質の機能に干渉および／
またはこれを阻害することにより、上記癌細胞の増殖および／または生存が阻止
、予防または破壊され得ることを発見した。すなわち、本発明は、サイクリンＧ
１タンパク質の機能を阻害することによる異常細胞増殖を伴う病的状態および疾
患の処置であって、動物において増殖中の上記細胞に突然変異体サイクリンＧ１
タンパク質を投与することによる処置に関するものである。上記病的状態および
疾患には、癌、腫瘍、過形成、再狭窄、角膜混濁および白内障があるが、これら
に限定されるわけではない。好ましい態様では、突然変異体または変異体サイク
リンＧ１タンパク質は、突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリ
ヌクレオチドを含む発現ビークルの送達により罹患動物に投与される。上記発現
ビークルには、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターおよびアデノ
ウイルスベクター、および合成ベクターがあるが、これらに限定されるわけでは
ない。本発明方法により有効に処置され得る動物には、哺乳類、例えばヒトおよ
び非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシおよびヒツジがあるが、これらに限定
されるわけではない。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１） 動物における異常細胞増殖が関与する病理学的状態または疾
患を処置または予防する方法であり、該動物に変異サイクリンＧ１タンパク質を
投与し、該変異サイクリンＧ１タンパク質は、該病理学的状態または疾患を処置
または予防するのに有効な量で投与される、方法。
（項目２） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、該動物に、該変異サイ
クリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を送達させるこ
とにより投与される、項目１に記載の方法。
（項目３） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、該動物に、該動物の異
常増殖細胞に、該変異サイクリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含
む発現媒体を形質導入することにより投与される、項目１に記載の方法。
（項目４） 該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目２に記
載の方法。
（項目５） 該発現媒体がマトリックス−標的化レトロウイルスベクター
である、項目４に記載の方法。
（項目６） 該マトリックス標的化レトロウイルスベクターを、動物に全
身的に投与する、項目５に記載の方法。
（項目７） 該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目２に記
載の方法。
（項目８） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、アミノ末端切断サイク
リンＧ１タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目９） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１タ
ンパク質のアミノ酸残基４１から２４９に対応するサイクリンＧ１タンパク質の
アミノ酸残基を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質のアミノ酸残基４１から２４９を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、少なくとも一つのア
ミノ酸置換を有するサイクリンＧ１タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２） 該置換がヒトサイクリンＧ１タンパク質の残基６１に対応
する残基においてである、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 該変異サイクリンＧ１タンパク質がヒトサイクリンＧ１タ
ンパク質である、項目１１に記載の方法。
（項目１４） 該置換がアラニンである、項目１２に記載の方法。
（項目１５） 該病理学的状態または疾患が、腫瘍、癌、過形成、再狭窄
、角膜の濁りおよび白内障からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１６） 該病理学的状態または疾患が、腫瘍および癌からなる群か
ら選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目１８） 変異サイクリンＧ１タンパク質をコードする、遺伝子構築
物。
（項目１９） 変異サイクリンＧ１が野生型サイクリンＧ１の優勢な陰性
阻害剤である、項目１８に記載の遺伝子構築物。
（項目２０） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、野生型サイクリンＧ
１のサイクリンボックスに欠失を含む、項目１８に記載の遺伝子構築物。
（項目２１） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、アミノ末端切断サイ
クリンＧ１タンパク質を含む、項目１８に記載の遺伝子構築物。
（項目２２） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質の残基４１から２４９に対応するサイクリンＧ１タンパク質のアミノ
酸残基を含む、項目２１に記載の遺伝子構築物。
（項目２３） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質の残基４１から２４９を含む、項目２２に記載の遺伝子構築物。
（項目２４） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、少なくとも一つのア
ミノ酸置換を有するサイクリンＧ１タンパク質を含む、項目１８に記載の遺伝
子構築物。
（項目２５） 該置換がヒトサイクリンＧ１タンパク質の残基６１に対応
する残基においてである、項目２４に記載の遺伝子構築物。
（項目２６） 該変異サイクリンＧ１タンパク質がヒトサイクリンＧ１タ
ンパク質である、項目２５に記載の遺伝子構築物。
（項目２７） 該置換がアラニンである、項目２６に記載の遺伝子構築
物。
（項目２８） 項目１８に記載の遺伝子構築物を含む、発現媒体。
（項目２９） 該発現媒体がウイルスベクターである、項目２８に記載
の発現媒体。
（項目３０） 該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目２９
に記載の発現媒体。
（項目３１） 該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目２９
に記載の発現媒体。
（項目３２） 細胞に変異サイクリンＧ１タンパク質を投与し、該変異サ
イクリンＧ１タンパク質が細胞分割を防止するのに有効な量で投与される、細胞
の分割を防止する方法。
（項目３３） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、該細胞に、該変異サ
イクリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を送達させる
ことにより投与される、項目３２に記載の方法。
（項目３４） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、該細胞に、該細胞を
該変異サイクリンＧ１タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む発現媒体を形
質導入することにより投与される、項目３２に記載の方法。
（項目３５） 該発現媒体がレトロウイルスベクターである、項目３３
に記載の方法。
（項目３６） 該発現媒体がアデノウイルスベクターである、項目３３
に記載の方法。
（項目３７） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、アミノ末端切断サイ
クリンＧ１タンパク質を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３８） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質のアミノ酸残基４１から２４９に対応するサイクリンＧ１タンパク質
のアミノ酸残基を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、ヒトサイクリンＧ１
タンパク質のアミノ酸残基４１から２４９を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 該変異サイクリンＧ１タンパク質が、少なくとも一つのア
ミノ酸置換を有するサイクリンＧ１タンパク質を含む、項目３２に記載の方法
。
（項目４１） 該置換がヒトサイクリンＧ１タンパク質の残基６１に対応
する残基においてである、項目４０に記載の方法。
（項目４２） 該変異サイクリンＧ１タンパク質がヒトサイクリンＧ１タ
ンパク質である、項目４０に記載の方法。
（項目４３） 該置換がアラニンである、項目４１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ＭiaＰaca２細胞におけるマトリックス標的レトロウイルスベクターの形質導入効率。β−ガラクトシダーゼ発現性細胞は、青色染色核により示されている。
【図１Ｂ】ＭiaＰaca癌細胞における突然変異体サイクリンＧ１構築物を担うマトリックス標的レトロウイルスベクターの細胞増殖抑制効果。縦軸でプロットされた１ウェル当たりの細胞数は、横軸でプロットされた時間(形質導入後の日数)の関数として表されている。Ｄ１０培地対照、neor遺伝子のみを担うヌルベクター、アンチセンスサイクリンＧ１構築物を担うＡＳ５８７およびＡＳ６９３ベクター、ＤＮＴ４１〜２４９、またはヒトサイクリンＧ１のＮ末端に欠失をもつdnＧ１ベクター。
【図１Ｃ】Ｇ４１８選択を伴わないdnＧ１ベクター‐対ヌルベクター‐形質導入癌細胞におけるヒトサイクリンＧ１タンパク質発現のウエスタン分析。免疫反応性dnＧ１(サイクリンＧ１ ＤＮ４１)は、２０kＤaの領域における明染色バンドとして検出され(レーン２)、内在性サイクリンＧ１タンパク質は、〜３０kＤaの領域における強染色バンドとして見られる(レーン１−３)。
【図２】転移性腫瘍病巣におけるヒトサイクリンＧ１タンパク質発現。抗ヒトサイクリンＧ１抗体との免疫反応性サイクリンＧ１(褐色染色物質)の強度染色により証明されているＰＢＳ処置動物の腫瘍病巣(Ａ；t)および低用量dnＧ１ベクター処置動物の残留腫瘍病巣(Ｂ；矢印)における高レベルヒトサイクリンＧ１タンパク質発現。
【図３−１】肝臓の組織断片のヘマトキシリン‐エオシン染色は、ＰＢＳ対照群(Ａ＆Ｃ、４０Ｘおよび１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｂ＆Ｄ、４０Ｘおよび１００Ｘ)からの腫瘍病巣を表す。ＰＢＳ対照群(Ｅ、１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｆ＆Ｈ：１００Ｘおよび２００Ｘ；矢印)の腫瘍病巣におけるアポトーシスは、ＡpopＴagＰlusペルオキシダーゼ原位置(in situ)アポトーシス検定において帯赤褐色免疫染色物質として描かれている。(Ｇ)末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼＴdＴ酵素を伴わない負の染色対照、t＝腫瘍病巣、h＝肝臓実質における肝細胞。
【図３−２】肝臓の組織断片のヘマトキシリン‐エオシン染色は、ＰＢＳ対照群(Ａ＆Ｃ、４０Ｘおよび１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｂ＆Ｄ、４０Ｘおよび１００Ｘ)からの腫瘍病巣を表す。ＰＢＳ対照群(Ｅ、１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｆ＆Ｈ：１００Ｘおよび２００Ｘ；矢印)の腫瘍病巣におけるアポトーシスは、ＡpopＴagＰlusペルオキシダーゼ原位置(in situ)アポトーシス検定において帯赤褐色免疫染色物質として描かれている。(Ｇ)末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼＴdＴ酵素を伴わない負の染色対照、t＝腫瘍病巣、h＝肝臓実質における肝細胞。
【図４】ヒトサイクリンＧ１配列は、ヒトサイクリンＩ、ヒトサイクリンＡおよびＳ.ＰomＣig１の場合と比較して示されている。保存領域は灰色四角により示されている。
【図５】pＲＥＸレトロウイルス発現ベクターへのヒトサイクリンＧ１cＤＮＡのクローニング。図は、pＧ１ＰＭ６１Ａ／ＲＥＸへの点突然変異体サイクリンＧ１(ＰＭ６１)の段階クローニングを示す。
【図６】pＲＥＸ、アンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１構築物の概略図。(Ａ)pＲＥＸレトロウイルス発現ベクターの地図および制限クローニング部位(Ｂ)アンチセンスサイクリンＧ１フラグメントの概略図(Ｃ)突然変異体サイクリンＧ１フラグメントの概略図。
【図７】マーカー遺伝子および突然変異体サイクリンＧ１構築物をもつマトリックス標的レトロウイルスベクターによるラットＡ１０およびサルＳＭＣのプラスミドＤＮＡトランスフェクション、形質導入効率および形質導入のインビトロ試験。(Ａ)突然変異体サイクリンＧ１プラスミドＤＮＡ構築物によりトランスフェクションされたラットＡ１０ ＳＭＣの増殖。縦軸でプロットされた細胞数は、横軸でプロットされた時間、すなわち形質導入後の日数の関数として表されている。(Ｂ)核標的β−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつマトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型レトロウイルスベクターを用いた単一２時間形質導入後のラットＡ１０細胞培養物における形質導入効率。形質導入効率％は、感染多重度の関数(logＭＯＩ)として表されている、(Ｃ)突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクターにより形質導入されたヒトＭiaＰaca細胞の増殖、(Ｄ)突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣの増殖。
【図８】二重エンベロープ立体配置でマトリックス‐ターゲッティングモチーフおよびＶＳＶＧタンパク質を表すアンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１ベクターの一時的トランスフェクション計画およびビリオン組込み。(Ａ)各々ＣＭＶプロモーターから発現された、パッケージング成分gag‐pol、マトリックス標的(ＣＢＤ)env、融合誘導性ＶＳＶＧenv、およびサイクリンＧ１構築物をもつレトロウイルスベクターが別々のプラスミドに配置されており、各々ＳＶ４０複製起点を含んでいる、一時的４プラスミド同時トランスフェクションシステム(Ｓoneokaら、１９９５)を用いてレトロウイルスストックが作製された。(Ｂ)ウエスタン分析は、〜７０kＤaの領域、〜６４kＤaでのＶＳＶＧタンパク質、および３６および５０kＤa間のウイルスgag(ＣＡ)タンパク質対照へ移動する免疫反応性バンドとしてＭＬＶベースのgp７０envタンパク質を示す。モック(模擬)＝エンベロープ対照無し、ＣＡＥ１０９対照＝ＷＴ ＭＬＶenvを伴う非標的ヌルベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ１０９対照＝二重env立体配置でコラーゲン結合性モチーフおよびＶＳＶＧタンパク質を表すＭＬＶenvを伴うマトリックス標的ヌルベクター、ＣＡＥ５８７＝ＷＴenvを伴う非標的アンチセンスサイクリンＧ１−５８７ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ５８７＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型アンチセンスサイクリンＧ１−５８７、ＣＡＥ６９３＝ＷＴenvを伴う非標的アンチセンスサイクリンＧ１−６９３ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ６９３＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型アンチセンスサイクリンＧ１−６９３、ＣＡＥ Ｄ／Ｎ(４１−２４９)＝ＷＴenvを伴う非標的突然変異体Ｄ／Ｎ(４１−２４９)ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ Ｄ／Ｎ(４１−２４９)＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型突然変異体Ｄ／Ｎ(４１−２４９)ベクター。
【図９】アンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクターによる形質導入後のラットＡ１０細胞培養物におけるシンシチウム形成。光学顕微鏡写真は、形質導入されたラットＡ１０細胞の形態学的外見を表し、(Ａ＆Ｂ)ヌルベクター、(Ｃ＆Ｄ)アンチセンスサイクリンＧ１−６９３ベクター、(Ｄ＆Ｅ)突然変異体サイクリンＧ１(dnＧ１)ベクターによる場合である。シンシチウムは矢印により示されている。
【図１０】突然変異体サイクリンＧ１ベクターにより形質導入されたサルおよびラットＡ１０細胞におけるサイクリンＧ１発現のウェスタンブロット分析。形質導入の１２、２４および４８時間後における形質導入細胞の細胞性タンパク質を、ヌル対照ベクターにより形質導入された細胞の場合と比較した。(Ａ)ヌルベクター(「ベクター」)による場合と比較した、アンチセンスサイクリンＧ１−６９３レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣ培養物における免疫反応性ヒトサイクリンＧ１タンパク質の発現減少(Ｂ)対照ベクター(「ベクター」)により形質導入された細胞には存在しなかった、dnＧ１レトロウイルスベクターによる形質導入の２４および４８時間後のラットＡ１０細胞培養物における２０kＤaでの免疫反応性突然変異体ヒトサイクリンＧ１(p２０突然変異体)の外観。
【図１１】バルーン創傷ラット動脈におけるラットサイクリンＧ１タンパク質の免疫組織化学的染色。(Ａ)ヌルベクター‐(Ｂ)ＰＢＳおよび(Ｄ)dnＧ１ベクター‐処理動脈切片の新生内膜細胞におけるサイクリンＧ１核免疫反応性増強(帯赤褐色核染色により示されている)。(Ｃ)アンチセンスサイクリンＧ１−６９３処理動脈切片におけるサイクリンＧ１免疫反応性の強度減少。
【図１２】マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型dnＧ１ベクターを用いた１ヶ月インビボ効率試験。(Ａ)ＰＢＳ対照、(Ｂ)食塩水、(Ｃ)ヌルベクターおよび(Ｄ)dnＧ１ベクターのバルーン創傷および管内滴中の１ヶ月後に採取されたラット頚動脈からのエラスチン染色組織断片。
【図１３】Ｍx−dnＧ１ベクターの一(７日)処理周期による腫瘍増殖の抑止。細胞致死性ベクターを合計７日間毎日尾部静脈へ直接注射した。ノギスを用いて腫瘍体積の測定結果を得た後、８日目に動物を殺した。ただし、図１３Ａにおける動物の処理開始時における腫瘍体積は、図１３Ｂにおける場合よりもかなり大きかった。しかしながら、両実験とも、Ｍx−dnＧ１ベクターによる処理の４日目までに腫瘍サイズのかなりの減少が観察され(n＝６)、腫瘍サイズの漸進的増加が対照Ｍx−nＢgベクターにより処理された動物で認められた(n＝４)。腫瘍体積(mm３；縦軸でプロットされている)は、時間(日数；横軸でプロットされている)の関数として表された。
【図１４】(Ａ)Ｍx−dnＧ１ベクターを用いた長期効率試験。確立された腫瘍異種移植片(腫瘍体積〜５０mm３)をもつマウスに対し無作為に偽薬(ＰＢＳ；n＝３)、非標的ＣＡＥ−dnＧ１ベクター(n＝４)またはマトリックス標的Ｍx−dnＧ１ベクター(n＝４)を投与した。２００μlベクター(ベクター用量：８×１０６cfu)または等量の偽薬を、１０服用期間(１処理周期)(偽薬群)または２処理周期間(ＣＡＥ−dnＧ１またはＭx−dnＧ１群)毎日または隔日に末梢(背側尾部)静脈に直接注射し、合間に２週間休止期間をおいた。腫瘍体積(mm３、縦軸でプロットされている)は、時間(日数、横軸でプロットされている)の関数として表されている。(Ｂ)Ｍx−dnＧ１ベクター処理マウスにおけるカプラン‐マイヤー生存試験。(Ａ)では動物のカプラン‐マイヤー生存曲線(終点として腫瘍が４倍になるまでの時間を表す)が示されている。偽薬群は連続線により表され、ＣＡＥ−dnＧ１群は短い点線により表され、Ｍx−dnＧ１群は長い点線により表されている。生存フラクション(４倍にはなっていない腫瘍を伴う動物を表す；縦軸でプロットされている)は、時間(日数；横軸でプロットされている)の関数として表されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
(図面の簡単な記載)
以下、図面に関して本発明を説明する。
図１ (Ａ) ＭiaＰaca２細胞におけるマトリックス標的レトロウイルスベク
ターの形質導入効率。β−ガラクトシダーゼ発現性細胞は、青色染色核により示
されている。(Ｂ)ＭiaＰaca癌細胞における突然変異体サイクリンＧ１構築物を
担うマトリックス標的レトロウイルスベクターの細胞増殖抑制効果。縦軸でプロ
ットされた１ウェル当たりの細胞数は、横軸でプロットされた時間(形質導入後
の日数)の関数として表されている。Ｄ１０培地対照、neor遺伝子のみを担うヌ
ルベクター、アンチセンスサイクリンＧ１構築物を担うＡＳ５８７およびＡＳ６
９３ベクター、ＤＮＴ４１〜２４９、またはヒトサイクリンＧ１のＮ末端に欠失
をもつdnＧ１ベクター。(Ｃ)Ｇ４１８選択を伴わないdnＧ１ベクター‐対ヌルベ
クター‐形質導入癌細胞におけるヒトサイクリンＧ１タンパク質発現のウエスタ
ン分析。免疫反応性dnＧ１(サイクリンＧ１ ＤＮ４１)は、２０kＤaの領域にお
ける明染色バンドとして検出され(レーン２)、内在性サイクリンＧ１タンパク質
は、〜３０kＤaの領域における強染色バンドとして見られる(レーン１−３)。
図２ 転移性腫瘍病巣におけるヒトサイクリンＧ１タンパク質発現。抗ヒトサ
イクリンＧ１抗体との免疫反応性サイクリンＧ１(褐色染色物質)の強度染色によ
り証明されているＰＢＳ処置動物の腫瘍病巣(Ａ；t)および低用量dnＧ１ベクタ
ー処置動物の残留腫瘍病巣(Ｂ；矢印)における高レベルヒトサイクリンＧ１タン
パク質発現。
【００１１】
図３ 肝臓の組織断片のヘマトキシリン‐エオシン染色は、ＰＢＳ対照群(Ａ
＆Ｃ、４０Ｘおよび１００Ｘ)およびdnＧ１ベクター処置動物(Ｂ＆Ｄ、４０Ｘお
よび１００Ｘ)からの腫瘍病巣を表す。ＰＢＳ対照群(Ｅ、１００Ｘ)およびdnＧ
１ベクター処置動物(Ｆ＆Ｈ：１００Ｘおよび２００Ｘ；矢印)の腫瘍病巣におけ
るアポトーシスは、ＡpopＴagＰlusペルオキシダーゼ原位置(in situ)アポトー
シス検定において帯赤褐色免疫染色物質として描かれている。(Ｇ)末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼＴdＴ酵素を伴わない負の染色対照、t＝腫瘍
病巣、h＝肝臓実質における肝細胞。
【００１２】
図４ ヒトサイクリンＧ１配列は、ヒトサイクリンＩ、ヒトサイクリンＡおよ
びＳ.ＰomＣig１の場合と比較して示されている。保存領域は灰色四角により示
されている。
【００１３】
図５ pＲＥＸレトロウイルス発現ベクターへのヒトサイクリンＧ１cＤＮＡの
クローニング。図は、pＧ１ＰＭ６１Ａ／ＲＥＸへの点突然変異体サイクリンＧ
１(ＰＭ６１)の段階クローニングを示す。
【００１４】
図６ pＲＥＸ、アンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１構築物の概略
図。(Ａ)pＲＥＸレトロウイルス発現ベクターの地図および制限クローニング部
位(Ｂ)アンチセンスサイクリンＧ１フラグメントの概略図(Ｃ)突然変異体サイク
リンＧ１フラグメントの概略図。
【００１５】
図７ マーカー遺伝子および突然変異体サイクリンＧ１構築物をもつマトリッ
クス標的レトロウイルスベクターによるラットＡ１０およびサルＳＭＣのプラス
ミドＤＮＡトランスフェクション、形質導入効率および形質導入のインビトロ試
験。(Ａ)突然変異体サイクリンＧ１プラスミドＤＮＡ構築物によりトランスフェ
クションされたラットＡ１０ ＳＭＣの増殖。縦軸でプロットされた細胞数は、
横軸でプロットされた時間、すなわち形質導入後の日数の関数として表されてい
る。(Ｂ)核標的β−ガラクトシダーゼ遺伝子をもつマトリックス標的ＶＳＶＧ偽
類型レトロウイルスベクターを用いた単一２時間形質導入後のラットＡ１０細胞
培養物における形質導入効率。形質導入効率％は、感染多重度の関数(logＭＯＩ
)として表されている、(Ｃ)突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクター
により形質導入されたヒトＭiaＰaca細胞の増殖、(Ｄ)突然変異体サイクリンＧ
１レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣの増殖。
【００１６】
図８ 二重エンベロープ立体配置でマトリックス‐ターゲッティングモチーフ
およびＶＳＶＧタンパク質を表すアンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１
ベクターの一時的トランスフェクション計画およびビリオン組込み。(Ａ)各々Ｃ
ＭＶプロモーターから発現された、パッケージング成分gag‐pol、マトリックス
標的(ＣＢＤ)env、融合誘導性ＶＳＶＧenv、およびサイクリンＧ１構築物をもつ
レトロウイルスベクターが別々のプラスミドに配置されており、各々ＳＶ４０複
製起点を含んでいる、一時的４プラスミド同時トランスフェクションシステム(
Ｓoneokaら、１９９５)を用いてレトロウイルスストックが作製された。(Ｂ)ウ
エスタン分析は、〜７０kＤaの領域、〜６４kＤaでのＶＳＶＧタンパク質、およ
び３６および５０kＤa間のウイルスgag(ＣＡ)タンパク質対照へ移動する免疫反
応性バンドとしてＭＬＶベースのgp７０envタンパク質を示す。モック(模擬)＝
エンベロープ対照無し、ＣＡＥ１０９対照＝ＷＴ ＭＬＶenvを伴う非標的ヌル
ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ１０９対照＝二重env立体配置でコラーゲン結合性モ
チーフおよびＶＳＶＧタンパク質を表すＭＬＶenvを伴うマトリックス標的ヌル
ベクター、ＣＡＥ５８７＝ＷＴenvを伴う非標的アンチセンスサイクリンＧ１−
５８７ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ５８７＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型ア
ンチセンスサイクリンＧ１−５８７、ＣＡＥ６９３＝ＷＴenvを伴う非標的アン
チセンスサイクリンＧ１−６９３ベクター、Ｈs２＋ＶＳＶＧ６９３＝マトリッ
クス標的ＶＳＶＧ偽類型アンチセンスサイクリンＧ１−６９３、ＣＡＥ Ｄ／Ｎ
(４１−２４９)＝ＷＴenvを伴う非標的突然変異体Ｄ／Ｎ(４１−２４９)ベクタ
ー、Ｈs２＋ＶＳＶＧ Ｄ／Ｎ(４１−２４９)＝マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類
型突然変異体Ｄ／Ｎ(４１−２４９)ベクター。
【００１７】
図９ アンチセンスおよび突然変異体サイクリンＧ１レトロウイルスベクター
による形質導入後のラットＡ１０細胞培養物におけるシンシチウム形成。光学顕
微鏡写真は、形質導入されたラットＡ１０細胞の形態学的外見を表し、(Ａ＆Ｂ)
ヌルベクター、(Ｃ＆Ｄ)アンチセンスサイクリンＧ１−６９３ベクター、(Ｄ＆
Ｅ)突然変異体サイクリンＧ１(dnＧ１)ベクターによる場合である。シンシチウ
ムは矢印により示されている。
【００１８】
図１０ 突然変異体サイクリンＧ１ベクターにより形質導入されたサルおよび
ラットＡ１０細胞におけるサイクリンＧ１発現のウェスタンブロット分析。形質
導入の１２、２４および４８時間後における形質導入細胞の細胞性タンパク質を
、ヌル対照ベクターにより形質導入された細胞の場合と比較した。(Ａ)ヌルベク
ター(「ベクター」)による場合と比較した、アンチセンスサイクリンＧ１−６９
３レトロウイルスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣ培養物における免疫
反応性ヒトサイクリンＧ１タンパク質の発現減少(Ｂ)対照ベクター(「ベクター
」)により形質導入された細胞には存在しなかった、dnＧ１レトロウイルスベク
ターによる形質導入の２４および４８時間後のラットＡ１０細胞培養物における
２０kＤaでの免疫反応性突然変異体ヒトサイクリンＧ１(p２０突然変異体)の外
観。
【００１９】
図１１ バルーン創傷ラット動脈におけるラットサイクリンＧ１タンパク質の
免疫組織化学的染色。(Ａ)ヌルベクター‐(Ｂ)ＰＢＳおよび(Ｄ)dnＧ１ベクター
‐処理動脈切片の新生内膜細胞におけるサイクリンＧ１核免疫反応性増強(帯赤
褐色核染色により示されている)。(Ｃ)アンチセンスサイクリンＧ１−６９３処
理動脈切片におけるサイクリンＧ１免疫反応性の強度減少。
【００２０】
図１２ マトリックス標的ＶＳＶＧ偽類型dnＧ１ベクターを用いた１ヶ月イン
ビボ効率試験。(Ａ)ＰＢＳ対照、(Ｂ)食塩水、(Ｃ)ヌルベクターおよび(Ｄ)dnＧ
１ベクターのバルーン創傷および管内滴中の１ヶ月後に採取されたラット頚動脈
からのエラスチン染色組織断片。
【００２１】
図１３ Ｍx−dnＧ１ベクターの一(７日)処理周期による腫瘍増殖の抑止。細
胞致死性ベクターを合計７日間毎日尾部静脈へ直接注射した。ノギスを用いて腫
瘍体積の測定結果を得た後、８日目に動物を殺した。ただし、図１３Ａにおける
動物の処理開始時における腫瘍体積は、図１３Ｂにおける場合よりもかなり大き
かった。しかしながら、両実験とも、Ｍx−dnＧ１ベクターによる処理の４日目
までに腫瘍サイズのかなりの減少が観察され(n＝６)、腫瘍サイズの漸進的増加
が対照Ｍx−nＢgベクターにより処理された動物で認められた(n＝４)。腫瘍体積
(mm３；縦軸でプロットされている)は、時間(日数；横軸でプロットされている)
の関数として表された。
【００２２】
図１４ (Ａ)Ｍx−dnＧ１ベクターを用いた長期効率試験。確立された腫瘍異
種移植片(腫瘍体積〜５０mm３)をもつマウスに対し無作為に偽薬(ＰＢＳ；n＝３
)、非標的ＣＡＥ−dnＧ１ベクター(n＝４)またはマトリックス標的Ｍx−dnＧ１
ベクター(n＝４)を投与した。２００μlベクター(ベクター用量：８×１０６cfu
)または等量の偽薬を、１０服用期間(１処理周期)(偽薬群)または２処理周期間(
ＣＡＥ−dnＧ１またはＭx−dnＧ１群)毎日または隔日に末梢(背側尾部)静脈に直
接注射し、合間に２週間休止期間をおいた。腫瘍体積(mm３、縦軸でプロットさ
れている)は、時間(日数、横軸でプロットされている)の関数として表されてい
る。(Ｂ)Ｍx−dnＧ１ベクター処理マウスにおけるカプラン‐マイヤー生存試験
。(Ａ)では動物のカプラン‐マイヤー生存曲線(終点として腫瘍が４倍になるま
での時間を表す)が示されている。偽薬群は連続線により表され、ＣＡＥ−dnＧ
１群は短い点線により表され、Ｍx−dnＧ１群は長い点線により表されている。
生存フラクション(４倍にはなっていない腫瘍を伴う動物を表す；縦軸でプロッ
トされている)は、時間(日数；横軸でプロットされている)の関数として表され
ている。
【００２３】
(発明の詳細な説明)
本発明の一態様によると、異常な細胞増殖を伴う病的状態または疾患に罹患し
た動物の処置方法が提供される。上記状態および疾患には、腫瘍、癌、過形成、
再狭窄、角膜混濁および白内障が含まれる。この方法は、突然変異サイクリンＧ
１タンパク質を動物または動物における病的細胞、組織または臓器に投与するこ
とを含む。突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、異常な細胞増殖を低減化また
は阻害するかまたは病状もしくは疾患を改善、治癒または予防するのに有効な量
で投与される。好ましい態様において、本発明方法は、特に腫瘍および癌の処置
に関するものである。
【００２４】
ここで使用されている「腫瘍または癌を処置する」の語は、腫瘍または癌細胞
の増殖の阻止、予防または破壊がもたらされることを意味する。本発明方法によ
り有益に処置され得る腫瘍および癌には、リンパ腫、白血病、肉腫および癌腫が
あるが、これらに限定されるわけではない。
【００２５】
ここで使用されている「過形成」の語は、組織または臓器における細胞の異常
増殖を伴う非腫瘍性病的状態または疾患を意味する。本発明方法により有益に処
置され得る過形成には、脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖症、木村病、血管類リンパ
組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、キャッスルマン病、
セメント質肥大、先天性副腎過形成、先天性脂腺増生症、先天性男性化副腎過形
成、嚢胞性増殖症、線維筋過形成、ヘック病、血管内乳頭状内皮過形成、神経過
形成、扁平上皮過形成およびゆうぜい性肥厚があるがこれらに限定されるわけで
はない。
【００２６】
ここで使用されている「突然変異サイクリンＧ１タンパク質」の語は、真核生
物体からの天然サイクリンＧ１タンパク質を意味するが、１個またはそれ以上の
アミノ酸欠失、置換、付加、および／またはそれらの組合わせを伴う。ある種の
態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は動物に由来する。好ましい
態様において、サイクリンＧ１タンパク質は処置されている動物と密接に関連し
た動物種に由来する(例、突然変異チンパンジーサイクリンＧ１タンパク質がヒ
トの処置に使用されている)。最も好ましい態様において、突然変異サイクリン
Ｇ１タンパク質は、処置されている動物と同じ動物種に由来する。
【００２７】
ヒトサイクリンＧ１タンパク質のアミノ酸配列は、図４に示されている。一態
様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、アミノ末端先端切除サイク
リンＧ１タンパク質を含む。一態様において、サイクリンＧ１タンパク質のＮ−
末端における初めの１１７までのアミノ酸残基が欠失され得る。好ましい態様に
おいて、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、アミノ酸残基４０を含むそれ以
下のＮ−末端欠失を含むサイクリンＧ１タンパク質である。最も好ましい態様に
おいて、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、アミノ酸残基１から４０までの
Ｎ−末端欠失を含むヒトサイクリンＧ１タンパク質である。実施態様において、
突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、ヒトサイクリンＧ１タンパク質のアミノ
酸残基４１〜２４９により構成される。
【００２８】
他の態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、ヒトサイクリンＧ
１タンパク質の残基６１に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む完全長ま
たは先端切除サイクリンＧ１タンパク質である。好ましい態様において、突然変
異サイクリンＧ１タンパク質は、その残基にアラニン置換を有する。実施態様に
おいて、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、残基６１にリシンまたはアラニ
ン置換を有する完全長または先端切除ヒトサイクリンＧ１タンパク質である。
【００２９】
突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、当業界における熟練者には公知の技術
により製造され得る。例えば、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、自動ペプ
チドまたはタンパク質合成装置により製造され得る。別法として、突然変異サイ
クリンＧ１タンパク質は、遺伝子工学技術により製造され得る。
【００３０】
一態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、突然変異サイクリン
Ｇ１タンパク質をコード化する遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドの送達によ
り、病的状態または疾患を発現している動物または細胞、組織または臓器に直接
投与される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、適当な発現ビークルを含む。
【００３１】
ここで使用されている「ポリヌクレオチド」の語は、あらゆる長さのヌクレオ
チドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチド類およびデオキシリボヌクレオ
チド類を包含する。上記の語はまた、１本および２本鎖ＤＮＡ、並びに１本およ
び２本鎖ＲＮＡを包含する。この語はまた、修飾ポリヌクレオチド、例えばメチ
ル化またはキャップポリヌクレオチド類を包含する。
【００３２】
突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード化する遺伝子構築物は、適当なプ
ロモーターを機能し得るように随伴した突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコ
ード化する配列を含む。本発明によると、適当なプロモーターは、処置動物にお
いて活性を示すものであればいずれのものでもよい。好ましい態様において、プ
ロモーターは、異常増殖している細胞において高い活性を呈するか、および／ま
たはそれに特異的なものである。しかしながら、本発明の範囲は特異的プロモー
ターに限定されるわけではないものと理解すべきである。一実施態様においては
、プロモーターはサイクリンＧ１プロモーターである。突然変異サイクリンＧ１
タンパク質をコード化する配列は、所望の突然変異(複数も可)を有する天然サイ
クリンＧ１遺伝子配列または突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード化する
合成配列を含み得る。
【００３３】
好ましい態様において、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌク
レオチドは、異常増殖している細胞へ形質導入されている適当な発現ビークルに
含まれている。上記発現ビークルには、プラスミド、真核生物ベクター、原核生
物ベクター(例えば、細菌性ベクター)およびウイルス性ベクターがあるが、これ
らに限定されるわけではない。
【００３４】
一態様において、ベクターはウイルス性ベクターである。使用され得るウイル
ス性ベクターには、ＲＮＡウイルスベクター(例えばレトロウイルスベクター)お
よびＤＮＡウイルスベクター(例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクタ
ー)が含まれる。ベクターの構築においてＲＮＡウイルスベクターが使用される
とき、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドはＲＮＡの
形態である。ベクターの構築においてＤＮＡウイルスベクターが使用されるとき
、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドはＤＮＡの形態
である。
【００３５】
一態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。使用さ
れ得るレトロウイルスベクターの例には、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓
壊死ウイルス、およびレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイ
肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺癌ウイ
ルスから誘導されたベクターがあるが、これらに限定されるわけではない。ベク
ターは一般的に複製能の無いレトロウイルス粒子である。本発明の意味の中に含
まれるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、例えばＨＩＶウイ
ルスまたは動物レンチウイルスに基いたベクター、例えばＢＩＶベースのベクタ
ーを包含する。レンチウイルスベクターの構築は、特に米国特許番号５６６５５
７７７、５９９４１３６および６０１３５１６に開示されており、出典明示によ
り本明細書の一部とする。
【００３６】
一態様において、レトロウイルスベクターは、モロニーネズミ白血病ウイルス
から誘導され、ＬＮ系列のベクターに属するレトロウイルスプラスミドベクター
から作製され得、これらについてはＢenderら、Ｊ.Ｖirol.、第６１巻、１６３
９−６４９頁(１９８７)およびＭillerら、Ｂiotechniques、第７巻、９８０−
９９０頁(１９８９)にさらに記載されている。上記ベクターは、マウス肉腫ウイ
ルスから誘導されたパッケージングシグナルの一部および突然変異gag開始コド
ンを有する。ここで使用されている「突然変異」の語は、gagタンパク質または
そのフラグメントまたは先端切除形態が発現されないようにgag開始コドンが欠
失または改変されていることを意味する。
【００３７】
別の態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、少なくとも４つの
クローニングまたは制限酵素認識部位を含み得、部位の少なくとも２つは真核生
物遺伝子における平均出現頻度が１００００塩基対において１回未満である、す
なわち制限産物は少なくとも１００００塩基対の平均ＤＮＡサイズを有する。好
ましいクローニング部位は、ＮotＩ、ＳnaＢＩ、ＳalＩおよびＸhoＩから成る群
から選択される。好ましい態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは
、これらのクローニング部位の各々を含む。上記ベクターについては、米国特許
第５６７２５１０号にさらに記載されており、出典明示により本明細書の一部と
する。
【００３８】
上記クローニング部位を含むレトロウイルスプラスミドベクターを使用すると
き、レトロウイルスプラスミドベクターにあるＮotＩ、ＳnaＢＩ、ＳalＩおよび
ＸhoＩから成る群から選択された少なくとも２つのクローニング部位と適合し得
る少なくとも２つのクローニング部位を含むシャトルクローニングベクターが提
供され得る。シャトルクローニングベクターはまた、シャトルクローニングベク
ターからレトロウイルスプラスミドベクターへ移入され得る突然変異体サイクリ
ンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
シャトルクローニングベクターは、クローニングまたは制限酵素認識部位を含
む１個またはそれ以上のリンカーに連結されている基本的「バックボーン」ベク
ターまたはフラグメントから構築され得る。上述された適合性または相補的クロ
ーニング部位もクローニング部位に含まれる。突然変異サイクリンＧ１タンパク
質をコード化するポリヌクレオチドおよび／またはシャトルベクターの制限部位
に対応する末端を有するプロモーターは、当業界公知の技術を通じてシャトルベ
クターへ連結され得る。
【００４０】
シャトルクローニングベクターは、原核生物系におけるＤＮＡ配列の増幅に使
用され得る。シャトルクローニングベクターは、原核生物系および特に細菌で常
用されるプラスミドから製造され得る。すなわち、例えば、シャトルクローニン
グベクターは、プラスミド、例えばpＢＲ３２２、pＵＣ１８などから誘導され得
る。
【００４１】
レトロウイルスプラスミドベクターは、突然変異サイクリンＧ１タンパク質コ
ーディング配列を発現させるためのプロモーターを含み得る。使用され得る適当
なプロモーターには、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、およびＭ
illerら、Ｂiotechniques、第７巻、９号、９８０−９９０(１９８９)に記載さ
れたヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、または他のいずれかのプ
ロモーター(例、細胞性プロモーター、例えば真核生物細胞性プロモーター、例
えば限定されるわけではないが、ヒストン、polIII、サイクリンＧ１、およびβ
−アクチンプロモーター)があるが、これらに限定されるわけではない。使用さ
れ得る他のウイルスプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロ
モーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターがあるが、これらに限定さ
れるわけではない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれている教示
内容から当業界の熟練者には明白なものである。
【００４２】
突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含むレトロウ
イルスプラスミドベクターは、gag、polおよびenvレトロウイルスタンパク質を
コード化する核酸配列を含むパッケージングセルラインへ形質導入される。上記
パッケージングセルラインの例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７(ＡＴＣＣ番
号ＣＲＬ９０７８)、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１
９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋envＡm１２お
よびＤＡＮセルライン(Ｍiller、Ｈuman Ｇene Ｔherapy、第１巻、５−１４
頁(１９９０)に記載、出典明示により本明細書の一部とする)、または２９３Ｔ
セルライン(米国特許第５９５２２２５号)があるが、これらに限定されるわけで
はない。ベクターは、当業界公知のいずれかの手段を通じてパッケージング細胞
に形質導入し得る。上記手段には、電気穿孔、リポソームの使用およびＣaＰＯ
４沈澱があるが、これらに限定されるわけではない。上記プロデューサー細胞は
、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を生成する。
【００４３】
別法として、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド、
非レトロウイルスペプチド不含有の第１レトロウイルスエンベロープタンパク質
(一態様では、野生型レトロウイルスエンベロープタンパク質であり得る)、およ
び修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質、または野生型レトロウイルスエ
ンベロープタンパク質のアミノ酸残基が除去され、所望の分子に結合するターゲ
ッティングタンパク質またはペプチド、例えば細胞性受容体または細胞外成分、
例えば細胞外マトリックス成分により置換された「エスコート」タンパク質を含
むレトロウイルスベクター粒子が生成され得る。ターゲッティングタンパク質ま
たはポリペプチドが結合し得る細胞外マトリックス成分の例には、コラーゲンが
あるがこれに限定されるわけではない。
【００４４】
かかるレトロウイルスベクター粒子は、突然変異サイクリンＧ１タンパク質を
コード化するポリヌクレオチドを含むレトロウイルスプラスミドベクター、およ
び修飾レトロウイルスエンベロープペプチドをコード化するポリヌクレオチドを
含む、適当な発現ビークル、例えばプラスミドによりパッケージング細胞、例え
ば上記のものへ形質導入することにより生成され得る。次いで、生成したプロデ
ューサー細胞は、非レトロウイルスペプチド不含有の第１レトロウイルスエンベ
ロープタンパク質、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質、および突然変
異サイクリンＧ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む感染性レト
ロウイルスベクター粒子を生産する。
【００４５】
別の方法では、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド
を含むレトロウイルスプラスミドベクターは、gagおよびpolレトロウイルスタン
パク質をコード化するポリヌクレオチド、非レトロウイルスペプチド不含有の第
１レトロウイルスエンベロープタンパク質をコード化するポリヌクレオチド、お
よび修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質をコード化するポリヌクレオチ
ドを含むパッケージング細胞へ形質導入される。生成したプロデューサー細胞は
、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド、非レトロウイ
ルスペプチド不含有の第１レトロウイルスエンベロープタンパク質および修飾レ
トロウイルスエンベロープタンパク質を含むレトロウイルスベクター粒子を生産
する。
【００４６】
レトロウイルスベクター粒子は、異常増殖している細胞を阻害、防止または破
壊するのに有効な量で罹患動物に投与される。本発明の範囲は理論的推論に限定
されるわけではないが、突然変異サイクリンＧ１タンパク質が天然サイクリンＧ
１タンパク質とそのサイクリン依存的キナーゼ結合相手に関して競争することに
より、細胞分裂の推進における天然サイクリンＧ１タンパク質の機能が阻止され
ると考えられる。レトロウイルスベクター粒子の投与は、全身投与により、例え
ば静脈内、動脈内または腹腔内投与により、または腫瘍でのレトロウイルスベク
ターの直接注射により行われ得る。一般的に、レトロウイルスベクターは、少な
くとも１０６cfu／mlの量で投与され、一般に上記の量は１０１１cfu／mlを越え
ない。好ましくは、レトロウイルスベクターは、約１０８cfu／ml〜約１０９cfu
／mlの量で投与される。投与すべき正確な用量は、処置される動物または患者の
年齢、体重および性別、並びに処置されている病的組織(腫瘍または臓器)のサイ
ズおよび重症度を含む様々な因子により変化する。
【００４７】
レトロウイルスベクターはまた、許容し得る医薬用担体、例えば食塩水溶液、
プロタミンスルフェート(エルキンス‐シン、インコーポレイテッド、チェリー
・ヒル、ニュージャージー)、水、水性緩衝液、例えば燐酸緩衝液およびトリス
緩衝液、またはポリブレン(シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ)と共に
投与され得る。適当な医薬用担体の選択は、本明細書に含まれている教示内容か
ら当業界の熟練者にとっては明白なものであると思われる。
【００４８】
従って、本発明はまた、特に腫瘍および癌の処置を目的とする、突然変異サイ
クリンＧ１タンパク質の医薬における用途、突然変異サイクリンＧ１タンパク質
をコード化する遺伝子構築物の用途および本発明の上記遺伝子構築物を含む発現
ビークルの用途を提供する。
【００４９】
さらに、疾患、例えば腫瘍および癌処置用医薬の製造を目的とする、突然変異
サイクリンＧ１タンパク質の用途、突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード
化する遺伝子構築物の用途および本発明の上記遺伝子構築物を含む発現ビークル
の用途が、本発明により提供される。
【００５０】
別の態様において、上記レトロウイルスベクター、または突然変異サイクリン
Ｇ１タンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、リポソーム内に封入され得
る。レトロウイルスベクターまたは突然変異サイクリンＧ１タンパク質をコード
化するポリヌクレオチドを封入しているリポソームは、上記の医薬用担体と共に
宿主に投与され得る。
【００５１】
別の態様において、突然変異サイクリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオ
チドを含む、レトロウイルスプロデューサー細胞、例えば上記のパッケージング
セルラインに由来するものは、動物に投与され得る。上記プロデューサー細胞は
、一態様において、病的組織または臓器に極めて近位の箇所で全身的に(例、静
脈内または動脈内により)投与され得るか、またはプロデューサー細胞は病的組
織または臓器に直接投与され得る。次いで、プロデューサーセルラインは、イン
ビボで突然変異Ｇ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドを含むレトロウイルス
ベクターを生産し、次いでその結果上記レトロウイルスベクターは病的組織また
は臓器の異常増殖中の細胞へ形質導入する。
【００５２】
本発明に従い処置され得る病的状態および疾患には、非悪性および悪性または
癌性腫瘍が含まれる。処置され得る癌性腫瘍には、骨原性肉腫およびユーイング
肉腫およびサイクリンＧ１が発現される他の腫瘍性疾患、例えば神経膠芽細胞腫
、神経芽細胞腫、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫(ホジキンおよび非ホジキ
ンリンパ腫を含む)、線維肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、肝癌、例えば肝
細胞癌および腺癌があるが、これらに限定はされない。
【００５３】
上記腫瘍処置はまた、腫瘍の他の処置、例えば(i)放射線、(ii)化学療法、ま
たは(iii)負の選択マーカー、例えばウイルス性チミジンキナーゼ遺伝子をコー
ド化するポリヌクレオチドによる腫瘍細胞の形質導入後の、相互作用剤、例えば
負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドにより形質導入された細胞を
殺すガンシクロビルの投与と組合わせて使用され得る。
【００５４】
一態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、上記方法の一つに従
い宿主に投与される。薬剤を含む腫瘍細胞の増殖は阻害、防止または破壊される
。さらに、腫瘍細胞は、負の選択マーカーまたは「自殺」遺伝子をコード化する
ポリヌクレオチドにより形質導入される。負の選択マーカーをコード化するポリ
ヌクレオチドは、発現ビークル、例えば上記のものに含まれ得る。一旦腫瘍細胞
が負の選択マーカーをコード化するポリヌクレオチドにより形質導入されると、
相互作用剤が宿主に投与され、そこで相互作用剤が負の選択マーカーと相互作用
することにより、腫瘍細胞の増殖が阻害、防止または破壊され得る。
【００５５】
使用され得る負の選択マーカーには、チミジンキナーゼ、例えば単純疱疹ウイ
ルスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−
帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ、およびシトシンデアミナーゼがあるが、こ
れらに限定されるわけではない。
【００５６】
一態様において、負の選択マーカーは、単純疱疹チミジンキナーゼ、サイトメ
ガロウイルスチミジンキナーゼ、および水痘−帯状疱疹ウイルスチミジンキナー
ゼから成る群から選択されたウイルス性チミジンキナーゼである。上記ウイルス
性チミジンキナーゼが使用されるとき、相互作用または化学療法薬剤は、好まし
くはヌクレオシド類似体、例えばガンシクロビル、アシクロビルおよび１−２−
デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル(
ＦＩＡＵ)から成る群から選択されるものである。上記相互作用剤は、基質とし
てウイルス性チミジンキナーゼにより有効に利用され、すなわち上記相互作用剤
がウイルス性チミジンキナーゼを発現する腫瘍細胞のＤＮＡへ致死的に組込まれ
ることにより、腫瘍細胞の死が誘発される。
【００５７】
別の態様において、負の選択マーカーは、シトシンデアミナーゼである。シト
シンデアミナーゼが負の選択マーカーであるとき、好ましい相互作用剤は５−フ
ルオロシトシンである。シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシンを高度
細胞傷害性の５−フルオロウラシルに変換する。すなわち、シトシンデアミナー
ゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞は５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに
変換し、殺される。
【００５８】
相互作用剤は、形質導入腫瘍細胞の増殖を阻害、防止または破壊するのに有効
な量で投与される。例えば、相互作用剤は、患者に対する全体的毒性により、５
mg〜１０mg／kg(体重)の量で投与され得る。相互作用剤は、好ましくは全身投与
、例えば静脈内投与、非経口投与、腹腔内投与または筋肉内投与される。
【００５９】
負の選択マーカーを含む発現ビークル、例えば上述のものが腫瘍細胞に投与さ
れるとき、「傍観者効果」が誘発され得る、すなわち、もともと負の選択マーカ
ーをコード化する核酸配列により形質導入されてはいない腫瘍細胞は相互作用剤
投与後に殺され得る。出願者らはいかなる理論的推論にも制限されるつもりは無
いが、形質導入腫瘍細胞は、相互作用剤に対して細胞外で作用するか、または隣
接する非形質導入腫瘍細胞に吸収され、次いで相互作用剤の作用に対して感受性
になる負の選択マーカーの拡散性形態を生産することになり得る。また、負の選
択マーカーおよび相互作用剤の一方または両方が腫瘍細胞間で通じ合うことも可
能である。
【００６０】
突然変異サイクリンＧ１タンパク質はまた、侵襲性血管手術、例えば血管形成
術、血管移植、例えば動脈移植、または冠動脈バイパス手術後の血管再狭窄の予
防に使用され得る。すなわち、本発明の別の態様によると、動物、または侵襲性
血管手術または血管病変部位に突然変異サイクリンＧ１タンパク質を投与するこ
とを含む再狭窄の予防方法が提供される。突然変異サイクリンＧ１タンパク質は
、動物において再狭窄を予防するのに有効な量で投与される。突然変異サイクリ
ンＧ１タンパク質は、侵襲性血管手術中または後に投与され得る。ここで使用さ
れている「侵襲性血管手術」の語は、限定的ではないが動脈および静脈を含む血
管系の一部の修復、切除、置換および／または再血管方向づけ(例、バイパスま
たはシャント)を含むあらゆる手術を包含する。上記手術には、血管形成術、血
管移植、例えば動脈移植、血餅の除去、動脈または静脈の一部切除、および冠動
脈バイパス手術があるが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
好ましい態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、突然変異サイ
クリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドにより侵襲性血管手術または血
管病変部位の血管細胞へ形質導入することにより動物に投与される。上記ポリヌ
クレオチドは、上記の通り適当な発現ビークルに含まれ得、侵襲性血管手術また
は血管病変部位の細胞へ形質導入される。一態様において、発現ビークルは、ウ
イルス性ベクター、例えば上述のものである。一態様において、ウイルス性ベク
ターは、レトロウイルスベクターであり、上記と同様であり得る。
【００６２】
レトロウイルスベクターが使用されるとき、上記レトロウイルスベクターは、
上記の量で投与され、血管内投与される。一態様において、レトロウイルスベク
ターは、侵襲性血管手術または血管病変部位に投与される。ベクターが侵襲性血
管手術または血管病変部位の血管細胞へ形質導入することにより、突然変異サイ
クリンＧ１タンパク質が上記細胞で生産され、それによって天然サイクリンＧ１
タンパク質の機能が阻害されるため、上記細胞の増殖を阻止することにより再狭
窄が予防される。
【００６３】
この方法は、限定するわけではないが、心臓血管形成術、動脈移植および冠動
脈バイパス手術を含む様々な侵襲性血管手術後における再狭窄の阻止および処置
並びに血管病変の阻止または処置に適用可能である。この方法はまた、限定する
わけではないが、大腿、頚または腎動脈、特に腎臓透析フィステルに伴う腎動脈
の病変を含む、血管病変の阻止および処置に適用される。
【００６４】
突然変異サイクリンＧ１タンパク質はまた、多くの場合角膜実質細胞の増殖に
より誘発される、角膜ヘーズ(曇り)または角膜混濁の予防および／または処置、
並びに白内障の処置および／または予防で使用され得る。すなわち、本発明の別
の態様によると、角膜ヘーズおよび／または白内障の予防または処置方法であっ
て、突然変異サイクリンＧ１タンパク質を罹患動物または患部の目に直接投与す
ることを含む方法が提供される。突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、動物に
おける角膜ヘーズまたは白内障の予防または処置に有効な量で投与される。
【００６５】
好ましい態様において、突然変異サイクリンＧ１タンパク質は、突然変異サイ
クリンＧ１遺伝子構築物を含むポリヌクレオチドによる眼の細胞の形質導入によ
り、動物に投与される。上記ポリヌクレオチドは、上記の通り適当な発現ビーク
ルに含まれ得る。発現ビークルは、眼の細胞へ形質導入される。一態様において
、発現ビークルは、上記のウイルス性ベクターである。一態様において、ウイル
ス性ベクターはレトロウイルスベクターであり、上記のものと同じであり得る。
【００６６】
レトロウイルスベクターが使用されるとき、上記レトロウイルスベクターは、
体重７０kgまたはそれ以上の成人の場合一用量当たり血液量の約１０％、または
約５００ml〜約１０００mlの量で全身(静脈内または動脈内)投与され得る。レト
ロウイルスベクターはまた、例えば点眼液形態で眼に局所投与され得る。レトロ
ウイルスベクターはまた眼内投与され得る。ベクターは、眼の細胞、例えば角膜
実質細胞および／または水晶体上皮細胞へ形質導入することにより、天然サイク
リンＧ１タンパク質の機能を阻害し、そうして角膜実質細胞または水晶体上皮細
胞の増殖を阻止することにより角膜ヘーズまたは白内障を予防または処置する。
【実施例】
【００６７】
(実施例)
実施例に関して本発明の記載を行うが、本発明の範囲はそれによって制限され
るわけではないものとする。
実施例１：癌細胞における突然変異サイクリンＧ１タンパク質の殺細胞および
細胞増殖抑制(cystostatic)効果。
(材料および方法)
細胞、細胞培養条件、マーカーおよび細胞周期制御遺伝子を担うプラスミドお
よびベクター。ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔおよびヒト膵臓癌ＭiaＰaca２細胞はＡ
ＴＣＣにより供給された。ＮＩＨ３Ｔ３および２９３Ｔ細胞は、１０％胎児ウシ
血清(Ｄ１０；バイオウィッテイカー)を補ったダルベッコ修飾イーグル培地で維
持された。ウイルス性gag pol遺伝子を含むプラスミドpcgp、および核標的β−ガラクトシダーゼ構築物を発現するレトロウイルスベクターpcnＢgは、それぞれパウラ・キャノン(Ｐaula Ｃannon)およびリン・リー(Ｌing Ｌi)両博士のご厚意により提供された(ＵＳＣジーン・セラピー・ラボラトリーズ、ロスアンゼルス、カリフォルニア)。水疱性口内炎ウイルスＧ(ＶＳＶＧ)envタンパク質を含むプラスミドは、テオドア・フリードマン(Ｔheodore Ｆriedmann)博士のご厚意により提供された(ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア、サンディエゴ、カリフォルニア)。先端切除(a.a.４１−２４９)サイクリンＧ１(dnＧ１)構築物は、レトロウイルス発現ベクターpＲＥＸにクローン化された。
【００６８】
突然変異体サイクリンＧ１構築物を担うマトリックス標的レトロウイルスベク
ターの製造。パッケージング成分gag−pol、およびＣＭＶプロモーターから発現
されたフォンビルブラント因子誘導コラーゲン結合性(マトリックス−ターゲッ
ティング)モチーフを担うキメラＭＬＶベースのenvが別々のプラスミドに配置さ
れ、各々ＳＶ４０複製起点を含む、一時的３または４プラスミド同時トランスフ
ェクションシステム(Ｓoneokaら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６２８−６３３頁(１
９９５))を用いて、高力価ベクターを製造した。ＷＴenvを伴わずに発現された
ベクターは、Ｂv１またはＨs２と命名された(Ｂv＝ウシvＷＦに由来、Ｈs＝ヒト
vＷＦに由来、ＬＦまたは１＝天然vＷＦ配列から誘導されたリンカー；ＬＳまた
は２＝標準リンカー)。ウイルス力価をさらに高めるため、融合誘導性ＶＳＶＧe
nvタンパク質(Ｙeeら、Ｍethods Ｃell Ｂiol.、第４３巻、９９−１１２頁(
１９９４))が、４プラスミド同時トランスフェクションプロトコルにおいてＢv
１またはＨs２envタンパク質と共に発現された。
【００６９】
ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるウイルス力価は、β−ガラクトシダーゼまた
はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性、neor遺伝子の発現に基き前記要
領で測定された(Ｓkotzkoら、Ｃancer Ｒes.、第５５巻、５４９３−５４９８(
１９９５))。ウイルス力価は、Ｇ４１８耐性コロニー形成単位(cfu)／mlの数と
して表され、トランスフェクションプロトコルで使用されたプラスミドＤＮＡの
性質および量により、１０６〜１０８cfu／mlの範囲で変化した。
【００７０】
インビトロ効率試験。dnＧ１ベクターの殺細胞／細胞増殖抑制効果を評価する
ため、Ｇ４１８選択を伴わない形質導入後連続間隔(４日以下)で各培養において
生存できる細胞の数を数えることにより、増殖可能性について形質導入細胞を評
価した。内在性および突然変異体サイクリンＧ１タンパク質発現のウエスタン分
析は、前記要領(Ｓkotzkoら、１９９５)で遂行された。
【００７１】
インビボ効率試験は、ユニバーシティー・オブ・サザーンカリフォルニア・イ
ンスティテューション・アニマル・ケア・アンド・ユース・コミッティーにより
是認されたプロトコルに従って行なわれた。インビボでのdnＧ１ベクター処置の
抗腫瘍効果に基いた標的遺伝子送達の効率を評価するため、ヒト結腸癌の転移経
路をシミュレーションする肝臓転移モデルをヌードマウスで確立した。簡単に述
べると、１４日間定位置に設置した内在型カテーテルにより、７×１０５腫瘍細
胞をゆっくりと門脈へ注入した。低または高用量dnＧ１ベクター(力価：２００
μl／日で３×１０６または９×１０８cfu／ml)または等量の燐酸緩衝食塩水(Ｐ
ＢＳ、pＨ７.４)のカテーテル内注入を３日後に開始し、全部で９日間続行した
。処置完了の１日後頚部脱臼によりマウスを殺した。
【００７２】
組織学的および形態計測分析。肝臓葉を切除し、１０％ホルマリンに固定し、
右および尾状葉にはＡ、左葉にはＢおよび中葉にはＣと標識し、別々に処理して
、パラフィンブロックに埋封した。dnＧ１ベクター処置の抗腫瘍効果は、次の要
領で評価された。ＨおよびＥ染色組織薄片を光学顕微鏡により調べ、代表的肝臓
部分およびＡ、ＢおよびＣ葉からの腫瘍フォーカスの表面領域を、オプティマス
画像分析システムを用いた形態計測分析により測定した。レトロウイルスの安全
性の評価は、肝臓構造の完全性の評価、肝細胞腫大または壊死、炎症性浸潤、胆
汁うっ滞および／または血栓症の存在に関する検査を含んでいた。また、組織薄
片をサイトケラチン、ヒトサイクリンＧ１、アポトーシス、ＰＡＳ、ビメンチン
およびＣＤ６８に関して免疫染色した。
【００７３】
統計分析。インビボ効率試験のために、３処置群を比較した：低用量Ｂv１／d
nＧ１(力価：３×１０６cfu／ml)、高用量Ｈs２／ＶＳＶＧ／dnＧ１(力価：９.
５×１０８cfu／ml)およびＰＢＳ対照。ヌルベクターは、インビトロ殺細胞活性
の不存在に基いたインビボ試験については使用されず、その後ヌルベクターは結
局臨床試験でも使用されない。最初に、８匹のマウスを試験した。４匹を高用量
dnＧ１ベクターで処置し、そして４匹をＰＢＳで処置した。それに続いて、４匹
の追加マウスを低用量dnＧ１ベクターで処置した。応答変数、肝臓の総表面積(
Ｓ.Ａ.)、腫瘍の総Ｓ.Ａ.、腫瘍Ｓ.Ａ.対肝臓Ｓ.Ａ.比、および平均Ｓ.Ａ.腫瘍
フォーカスを、形式分析前に対数変換した。反復測定因子として葉を用いた反復
測定分析を用いて、この処置が応答変数の各々に対する効果を有したか否かを測
定した。また、ペアワイズ比較をアウトカム変数に関して遂行し、群間では全体
的p−値＜０.０５であった。
【００７４】
(結果)
突然変異体ヒトサイクリンＧ１(dnＧ１)は、サイクリンボックスにおける欠失
、Ｃdk活性化を誘導するサイクリン−Ｃdk結合を部分的に決定するサイクリン間
の保存領域により作製された。予備試験は、dnＧ１が血管平滑筋細胞において抗
増殖特性を呈することを立証した。それらの発見は、dnＧ１が野生型サイクリン
Ｇ１の機能を阻害すべく、または標的Ｃdk分子との不活性複合体を形成すべく作
用し得ることを示唆している。このため、一連の殺細胞性突然変異体サイクリン
Ｇ１構築物の性能をインビトロで試験することにより、さらなるインビボ試験に
最適な構築物を決定した。
【００７５】
膵臓に由来するヒト未分化癌セルラインを、転移性胃腸癌の始原型として選択
した。これらの癌細胞におけるレトロウイルス形質導入効率は優秀であり、感染
多重度により２６％〜８５％の範囲に及んだ(それぞれ４および２５０、図１Ａ)
。最適な治療遺伝子を選択するため、様々なサイクリンＧ１構築物を担うベクタ
ーを用いて細胞増殖試験を形質導入細胞で行った。図１Ｂは、形質導入癌細胞に
おける突然変異体およびアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクターの
殺細胞／細胞増殖抑制効果を示す。標準条件下では、dnＧ１ベクターは、一貫し
て最大の抗増殖効果を呈し、dnＧ１タンパク質を表す２０kＤa領域における免疫
反応性サイクリンＧ１の出現を伴った(図１Ｃ)。これらの結果に基づき、dnＧ１
ベクターは、後続のインビボ効率試験用に選択された。
【００７６】
ＰＢＳまたは低用量dnＧ１ベクターで処置されたマウスからの転移性腫瘍フォ
ーカスの組織学的および免疫細胞化学的評価を遂行し、オプティマスイメージン
グシステムにより評価した。ＰＢＳ処置動物(図２Ａ)、およびdnＧ１ベクター処
置動物の残留腫瘍フォーカス(図２Ｂ)での高いサイクリンＧ１核免疫反応性(褐
色染色物質)により証明されたように、図２は、ヒトサイクリンＧ１タンパク質
が転移性腫瘍フォーカスで高度発現されることを示す。対照動物からの肝臓薄片
の組織学的試験は、血管形成および支質形成の付随領域を伴うかなりの腫瘍フォ
ーカスを表しており(図３ＡおよびＣ)、上皮成分はサイトケラチンについて陽性
染色し、付随した腫瘍支質／内皮細胞はビメンチンおよびＦＬＫ受容体について
陽性染色した(図示せず)。対照的に、低用量dnＧ１処置動物における腫瘍フォー
カスの平均サイズはＰＢＳ対照と比べて顕著に低減化され(図３ＢおよびＤ、矢
印により示されている、p＝０.００１)、同時にＰＢＳ対照群(図３Ｅ)と比べて
アポトーシス核の密度における焦点増加を表した(図３ＦおよびＨ、矢印により
示されている)。さらに、ＰＡＳ＋、ＣＤ６８＋およびヘモシデリン‐積載マク
ロファージによる浸潤(図３Ｄ、矢印により示されている)が、dnＧ１ベクター処
置動物の残留腫瘍フォーカスで観察されたことから、肝臓細網内皮系による変性
している腫瘍細胞および腫瘍屑の能動的クリアランスが示唆された。
【００７７】
腫瘍フォーカスの形態計測分析は、高用量マトリックス標的dnＧ１ベクターの
門脈注入(内在型カテーテルによる)が、全応答変数に基いた対照動物の場合と比
べたとき腫瘍フォーカスサイズの劇的な低減化を誘発する(p＜.００５、表１)と
いう点で、治療遺伝子送達に関するターゲッティング戦略が有効であることを確
認した。３アウトカム変数に関するペアワイズ比較では、dnＧ１ベクター処置に
対する用量依存的腫瘍応答が明白であり、腫瘍縮小対腫瘍フォーカスの完全消滅
に関して様々なベクター用量に対するより良い腫瘍応答性を測定し、Ｉ／II期遺
伝子療法試験において所望の腫瘍応答を達成し得る最少有効ベクター用量を予測
するための追加試験は現在進行中である。重要なことに、肝細胞損傷、壊死、血
栓症または胆汁うっ滞の証拠は、dnＧ１ベクター処置動物からの組織薄片からは
全く検出されなかったことから、マトリックス標的dnＧ１ベクター(累積用量：
１０６〜１０９cfu)が広く余裕のある安全性を有し得ることが示された。
【００７８】
(検討)
インビボ効率および安全性試験は、肝臓転移の特有なヌードマウスモデルで行
われ、(i)対照動物の場合と比べてdnＧ１ベクター処置マウスにおける腫瘍フォ
ーカスサイズの統計的に有意な低減化により証明されたように、治療遺伝子送達
が、殺細胞性突然変異体サイクリンＧ１構築物を担うマトリックス標的レトロウ
イルスベクターの反復門脈注入(内在型カテーテルによる)により達成され得るこ
と、および(ii)付随する肝細胞壊死、血栓症または胆汁うっ滞の不存在により示
されたように、マトリックス標的dnＧ１ベクターが広く余裕のある安全性を伴っ
て全身投与され得るという原理の証拠を確立した。まとめて考え合わせると、こ
れらの発見は、転移性癌に対する標的注射可能遺伝子治療ベクターの開発に向け
た明確な進歩を表している。
【００７９】
実施例２ 細胞致死性サイクリンＧ１構築物を有するマトリックス・ターゲッ
テッド・レトロウイルスベクターの内腔内注入による、バルーン損傷ラット動脈
における新生内膜形成の長期阻害
この実施例はラット血管再狭窄モデルにおける変異サイクリンＧ１タンパク質
による新生内膜形成の阻害を証明する。
【００８０】
材料および方法
細胞および細胞培養条件 ラット大動脈平滑筋Ａ１０細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
４７６)を、密集前の単層として２０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を添加した血清ダ
ルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)(Ｇibco ＢＲＬ)中で維持した。マウス胚
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞(ＡＴＣ ＣＲＬ １６５８)、ヒト２９３Ｔ細胞胎児腎臓２
９３細胞(厚意により、Ｄr. Ｍichele Ｇalos,Ｓtanford Ｕniversity, Ｐa
lo Ａlto, ＣＡから提供)をＳＶ４０大型Ｔ抗原で形質転換し、ヒト膵臓腫瘍Ｍ
iaＰaca２細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４２０)を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、
およびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で同様に維持した。サル平滑筋
一次細胞を、バルーン損傷後７日に回収した左総頚動脈から、３０％ＦＢＳを添
加したＷilliams Ｅ培地(Ｇibco ＢＲＬ)中の２mm動脈切片を培養することで
調製した。細胞が移動して組織培養ディッシュで接着単層細胞として増殖した後
に動脈切片を除去し、細胞をさらにＷilliams Ｅ培地−２０％ＦＢＳ中で維持
した。マウスモノクローナル抗ヒトα平滑筋アクチン(ＤＡＫＯ)での免疫染色で
は、一次培養から回収した細胞の９５％が平滑筋αアクチンに対して陽性であっ
た、これはその起源を示すものである。
【００８１】
プラスミド構築物 アミノ酸４１〜２４９をコードするサイクリンＧ１ cＤＮ
Ａの６３０bp Ｃ末端断片(ヌクレオチド１２１〜７５０)(Ｗu et al.,１９
９４)をはじめとするサイクリンＧ１変異構築物(図５参照)をＰＣＲにより作製
し、ＴＡベクター(Ｉnvitrogen)へクローニングし、シーケンシングにより確認
し、pＧ１ＸＳvＮaレトロウイルスベクター(Ｓkotzko et al.,１９９５)に再
びクローニングした。pＧ１ＸsvＮaおよび挿入サイクリンＣ１ cＤＮＡからな
る成分配列をパッケージングするレトロウイルスを含む得られた構築物を消化す
ることでＫpnＩ断片を得、pＲＶ１０９(Ｓoneoka,et al, １９９５)ヘクロー
ニングしてＳＶ４０起源の複製物(ori)およびＣＭＶプロモーターを含んだレト
ロウイルス発現プラスミドpＧ１ＤＮＴ４１〜２４９／ＲＥＸを得た。
【００８２】
gag、pol、envおよびb−ガラクトシダーゼタンパク質の発現プラスミド pcgpは
、ＭＬＶ gagおよびpolを発現するＣＭＶ由来プラスミドである。pcnＢgは、Ｈ
an, et al., Ｊ. Ｖirol.,Ｖol. ７１, pgs. ８１０３−８１０８ (１９
７７)に記載されているpＧ１ＸsvＮa、次いでpＲＶ１０９中での段階的構築によ
り作製したpＲＥＸレトロウイルスベクター中のβ−gal発現構築物である。pcgp
およびpcnＢgは双方とも厚意によりＤr. Ｐaula Ｃannon (ＵＳＣ Ｇene
Ｔherapy Ｌaboratories,Ｌos Ａngeles ＣＡ)から提供されたものであった
。プラスミドpＣＶＧは、pＣＥＥ＋のＥcoＲＩ断片(ＭacＫrell,et al., Ｊ.
Ｖirol,. Ｖol. ７０,pgs. １７６８−１７７９ (１９９６))を、ＶＳＶ
−ＧをコードするcＤＮＡ(Ｙee,et a., １９９４)を含有するpＨＣＭＶ−Ｇの
ＥcoＲＩ断片(Ｔheodore Ｆriedman,Ｕ. Ｃ. Ｓan Ｄiegoから譲渡)で置換
して作出した水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質(ＶＳＶ−Ｇ)を発現するＣＭ
Ｖ由来プラスミドである。ＣＡＥＰはマトリックス標的(すなわち、コラーゲン
結合ドメイン、ＣＢＤ)モチーフを含む両種性４０７０Ａ (ＣＡＥ) ＭＬＶ g
p７０を発現するＣＭＶ由来プラスミドである。ＣＡＥＰは、ヒト・フォン・ヴ
ィレブランド因子(Ｔakagi,et al., Ｊ. Ｂiol. Ｃhem., Ｖol.２６６, pgs
, ５５７５−５５７９ (１９９１))由来の最小コラーゲン結合ドメイン(ＷＲＥ
ＰＧＲ[Ｍ]ＥＬＮ)を、レトロウイルス外被タンパク質の、成熟タンパク質のＮ
末端ドメインへ導入した特有のＰstＩクローニング部位へ挿入して作製した。メ
チオニン残基(Ｍ)を最少ＣＢＤ内の野生型システイン残基(Ｃ)の場所へ保存的に
挿入した(そうしなければ、キメラ外被タンパク質内の分子内ジスルフィド結合
の適切な形成が妨げられる)(データは示されていない)。
【００８３】
レトロウイルスベクターの作製 ヒト２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの前
日に３x１０６細胞／ディッシュの密度で１０cm細胞培養ディッシュにプレーテ
ィングした。pcgp １５mg、pＣＶＧ １０mg、ＣＡＥＰ ５mgおよびpcnＢgま
たはpＧ１ＤＮＴ４１〜２４９／ＲＥＸのいずれか１５mgを用い、リン酸カルシ
ウム／ＤＮＡ共沈殿法(Ｓoneoka, et al., １９９５)によって一時的同時トラ
ンスフェクションを行った。トランスフェクション細胞を３７℃で１６時間イン
キュベートし、１０mＭ酪酸ナトリウムを含有する培地６mlに移してウイルス粒
子の形成を促進させた。約１０〜１２時間後、産生細胞培養培地を新鮮培地８.
５mlと交換し、さらに２４時間インキュベートしてベクター産生を行った。得ら
れたレトロウイルスの上清を回収し、０.４５mＭフィルターで濾過し、アリコー
トに分け、使用まで７０℃で保存した。
【００８４】
レトロウイルスベクター力価の決定 ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を形質導入の前日に２
.５x１０４細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレートにプレーティングした。
細胞の形質導入のため、８μg／mＬポリブレンを含むレトロウイルス上清の連続
希釈物を細胞培養物に加えた後、３７℃で２時間インキュベートし、新鮮培地２
mlを添加した。２４時間後、細胞を８００μg／mＬ Ｇ４１８を含有する新鮮培
地と交換し、この培地を３日毎に交換した。形質導入後１０日目に１０％ホルマ
リンで固定し、１００％メタノール中の１％メチレンブルーで染色してＧ４１８
耐性コロニーを計数した。レトロウイルスベクターの力価は、生存コロニー総数
に個々の細胞培養に用いたレトロウイルス上清の希釈倍率を掛けることで求めた
。
【００８５】
ラットＡ１０細胞における形質導入効率の決定 Ａ１０ ＳＭＣを形質導入の前
日に３x１０４細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレートにプレーティングし
た。β−gal発現構築物および８mg／mＬポリブレンを含むレトロウイルス上清の
連続希釈物を細胞に加えた。７２時間後、細胞を２％ホルムアルデヒド、０.２
％グルタルアルデヒド中で固定し、４mＭフェリシアン化カリウム、４mＭフェロ
シアン化物、２mＭ ＭgＣl２および４００mg／mＬ Ｘ−galで染色した。青く
染まった核を示す細胞の割合によって形質導入効率を求めた。
【００８６】
ベクターにより形質導入した細胞培養物における細胞増殖アッセイ Ａ１０細胞
を１.４x１０４細胞／ウェルの密度で１２ウェル培養ディッシュにプレーティン
グした。接着させ、一晩インキュベートした後、８μg／mＬポリブレンを含むレ
トロウイルス上清それぞれ０.５ml中、３７℃で２時間、細胞をインキュベート
し、次いで新鮮培地１mＬを加えた。細胞の形質導入後連日、各処置群(３反復で
調製)の生存細胞数を測定した。サルＳＭＣおよびＭiaＰaca２細胞を、３x１０
３細胞／ウェルの密度で２４ウェル培養プレートに同様にプレーティングした。
上記の通り、細胞を８μg／mＬポリブレンを含むレトロウイルス上清０.２mlと
ともにインキュベートし、２時間後、新鮮培地０.５mlを加え、連日、細胞培養
物を回収して生存細胞数を測定した。
【００８７】
抗体の作製および精製 特異的抗サイクリンＧ１抗体を作製するため、ヒトサイ
クリンＧ１のＣ末端の端にある１８残基を表す合成ペプチド([Ｃ]ＫＨＳＹＹＲ
ＩＴＨＬＰＴＩＰＥＭＶＰ)を合成し、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬ
Ｈ)と共役させ、ウサギで免疫原として用いてポリクローナル抗体を作製した。
システイン残基[Ｃ]をペプチドのＮ末端に付加してＫＬＨとの単一部位の結合容
易にした。免疫ウサギ血清由来のポリクローナル抗サイクリンＧ１抗体を以下の
ようにアフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した：濾過したウサギ血
清を、サイクリンＧ１免疫ペプチドを共有結合的させたＡffi−Ｇel １０カラ
ム(Ｂio−Ｒad)に添加した。十分洗浄した後、結合抗体を溶出バッファー(０.１
mＭグリシン、pＨ２.７)から回収し、ＰＢＳ中１Ｍ Ｔris ＨＣl(pＨ８.０)で
１：１０希釈することで中和した。アフィニティー精製された抗サイクリンＧ１
抗体を含有するピーク画分をプールし、使用まで−７０℃で保存した。
【００８８】
ウェスタンブロット解析 形質導入細胞由来の界面活性剤溶解物として得た約１
５mgの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。次いでこのゲルを
Ｔris−グリシンバッファー系(２５mＭ Ｔris ＨＣl、pＨ８.３、１９２mＭグ
リシン、１５％メタノール)を用いて、フッ化ポリビニリデン(ＰＶＤＦ)メンブ
ラン(Ｍillipore)に室温にて１２０mＡで１.５時間移した。このメンブランをＰ
ＢＳ中３％ウシアルブミンでブロックし、１時間後に、ウェスタンブロット法バ
ッファー(１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０.０５％ＴＷＥＥＮ−２０、pＨ７.４)中に希
釈した一次抗体とともに３０分間インキュベートした。メンブランをＰＢＳで３
回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼ共役２次抗体とともに３０分間インキ
ュベートした。さらにＰＢＳで３回洗浄した後、不溶性の反応生成物を、基質バ
ッファー(１００mＭ Ｔris ＨＣl pＨ９.５、１００mＭ ＮaＣlおよび５mＭ
ＭgＣl２)中の０.２５mg／mＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ
ン酸(ＢＣＩＰ)および０.５mg／mＬニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)の存在
下で顕色させた。
【００８９】
血管再狭窄のラット頚動脈損傷モデルにおけるサイクリンＧ１変異構築物のレト
ロウイルスを介した導入 全身麻酔(ケタミン１００mg／Ｋg、ロンプン １０mg
／Ｋg)下で、ＵＳＣ Ｉnstitutional Ａnimal Ｃare and Ｕse Ｃommitte
e(ＬＡＣＵＣ)により承認された遺伝子療法プロトコールに従い、２Ｆ Ｉntima
x動脈塞栓摘出用カテーテル(Ａpplied Ｍedical Ｒesources Ｃorp)を用いて
３５０〜４５０gのウィスターラットの頚動脈内皮を剥いだ。末端を結紮した頚
動脈ヘカテーテルを挿入し、総頸動脈へ通した。バルーンを直径〜７ユニット(
カテーテルはフレンチスケール)まで膨らませて、頚動脈に沿って３回通した。
バルーン損傷後、塞栓摘出用カテーテルを除去し、頚動脈を一次的にクランプし
、レトロウイルスベクターに３０分間曝した。ラット群に生理食塩水(n＝６)、
変異サイクリンＧ１構築物を有するレトロウイルスベクター(n＝９)、または対
照ベクター(n＝８)のいずれか〜３０mlを注入し、さらに実験対照として非処理
ラット群(n＝７)を用意した。ちょうど４週間後にラットを過剰量のペントバル
ビタールナトリウム(１２０mg／Ｋg ＩＭ)で犠牲にした。ホルマリンで固定し
た非処理頚動脈およびベクターで処理した頚動脈の双方の切片をＶerhoeffのエ
ラスチン染色剤で染色し、組織学的切片を光学顕微鏡で調査し、Ｏptimas画像解
析システムを用いて培地表面域に対する新生内膜の形態計測評価を行なった。脈
管内膜の肥厚程度をＩ：Ｍ比で表す。非処理動脈、ＰＢＳ処理動脈およびベクタ
ー処理動脈の間のＩ：Ｍ比の有意差を両側 t検定で求めた。
【００９０】
結論
サイクリンＧ１構築物の設計および操作 ヒトサイクリンＧ１配列由来の数個の
アンチセンス断片(図４)を、全長および／または上流配列の組み込みを変化させ
て構築した(図５)。さらに、一連の変異サイクリンＧ１発現構築物に操作を加え
、ドミナントネガティブ様式で機能する可能性を評価した。図５Ｃで模式的に示
すように、これらの発現構築物は、サイクリンとＣＤＫとの結合に関与する保存
された「サイクリンボックス」ドメインを包含する領域において変異したか、ま
たは末端切断されたものであった(Ｌees and Ｈarlow, Ｍol. Ｃell Ｂiol.
, vol. １３, pgs. １１９４−１２０１ (１９９３))。ＰＭ ６１Ｋ／Ａお
よびＰＭ ９２Ｅ／Ａでそれぞれ示された２つの点突然変異体は、サイクリンＡ
−ＣＤＫ２との接触に重要であると予測され(Ｂrown et al., Ｊ. Ｂiol.
Ｃhen., vol. ２６７,pgs. ４６２５−４６３０ (１９９２)；Ｊeffrey et
al., Ｎature,Ｖol. ３７６, pgs. ３１３−３２０ (１９９５))、ヒトサ
イクリンＧ１内で保存されている(Ｗu et al., １９９４)残基の改変を示して
いる。
【００９１】
複雑な(８段階)クローニング戦略を用い(図６参照)、(ＮotＩ／ＳalＩにフラ
ンクされた)ＰＣＲ産物として製造した種々のアンチセンスおよび変異サイクリ
ンＧ１構築物を、pＢＳＫII(Ｓtratagene)のＮotＩ／ＳalＩ部位へクローニング
してpＧ１／ＢＳＫII構築物を作出し、次ぎに、これらを切り出し、これらのク
ローニング部位で、線状化したpＧ１ＸＳvＮaレトロウイルスベクター(Ｇenetic
Ｔherapy,Ｉnc)へ連結してpＧ１Ｇ１ＳvＮa構築物を作出した。これらのpＧ
１Ｇ１ＳvＮa発現プラスミドをＫpnＩで消化し(２箇所)、ＬＴＲプロモーターと
Ｐsi包膜配列でフランクされた実験用のサイクリンＧ１構築物をはじめ、得られ
たpＧ１Ｇ１ＳvＮaセグメントをpＲＶ１０９レトロウイルスベクター(Ｓoneoka
et al., １９９５)に連結して合成レトロウイルス発現ベクターpＧ１／ＲＥ
Ｘを作出した。得られたpＧ１／ＲＥＸベクターは、ＳＶ４０ori配列および抗生
物質耐性遺伝子に加えて、治療遺伝子を駆動する強力なハイブリッド５'ＣＭＶ
／ＬＴＲプロモーターを含み、これがベクター産生を促進する。代表的なサイク
リンＧ１点突然変異体であるＰＭ６１ Ｋ／ＡのpＲＥＸへのクローニングが図
６に示されている。
【００９２】
サイクリンＧ１構築物の細胞増殖抑効力の比較 平滑筋の細胞増殖に対する種々
のアンチセンスおよび変異Ｇ１構築物の相対的効力を調べるため、個々のＤＮＡ
断片の各々をpＲＥＸレトロウイルス発現ベクターに適当な配向でクローニング
し(上記参照)、これをスクリーニング研究のトランスフェクト可能なプラスミド
として最初に用いた。リン酸カルシウムトランスフェクション実験をラットＡ１
０平滑筋細胞培養物で３回行なって次の動物実験で用いるのに最適なサイクリン
Ｇ１ノックアウト構築物を決定した。これらの実験では、ＡＳ５８７およびＡＳ
６９３(図７Ａ参照)で示される適度な長さのアンチセンス構築物が、それより短
いＡＳ４２３構築物よりも大きな細胞致死活性を示した。これまでの(pＧ１aＧ
１ＳvＮaプラスミドを用いた)研究では、アンチセンス方向のヒトサイクリンＧ
１全長コード配列は比較的効果がないことが示されていない(データは示されて
いない)。これらの比較評価に基くと、ＡＳ５８７(既に動物実験で用いられてい
る：Ｓkotzko Ｅt al.,１９９５, Ｚhu et al., Ｃirculation, Ｖol. ９
６, pgs. ６２８−６３５ (１９９７))と同じコード領域にわたってなお、さ
らに５'配列を含む構築物であるＡＳ６９３が最も有効なアンチセンスデザイン
であると考えられた。試験した変異サイクリンＧ１構築物のうちで、ある特定の
変異構築物ＤＮＴ４１〜２４９、および点突然変異構築物であるＰＭ ６１Ｋ／
Ａが、平滑筋細胞の増殖抑制において少なくともアンチセンス構築物と同程度の
効力があることがわかった。点突然変異体ＰＭ ６１Ｋ／Ａの効力には、このア
ミノ酸Ｌys−６１が推定されるサイクリンＧ１会合キナーゼとの物理的結合に重
要であるとことが示唆されることから関心が持たれている(Ｓmith et al., Ｅ
xp. Ｃell Ｒes. Ｖol. ２３０,pgs. ６１−６８ (１９９７))。これら
の比較スクリーニング研究を基に、ＤＮＴ４１−２４９およびＰＭ ６１Ｋ／Ａ
もまた、さらなる研究対象として選択された。
【００９３】
選択されたサイクリンＧ１構築物を有するマトリックス・ターゲッテッド・レト
ロウイルスベクターの同定 それぞれＣＭＶプロモーターによって駆動されるパ
ッケージング成分のgag−pol、マトリックス・ターゲッテッド(ＣＢＤ)−env、
融合誘導ＶＳＶＧ env、および指定のサイクリンＧ１構築物を有するレトロウ
イルスベクターを個別のプラスミドに配置した(図８Ａ)、一時的４プラスミド同
時トランスフェクション系(Ｓoneoka et al., １９９５より採用)を用いてヒ
ト２９３Ｔ細胞上清からレトロウイルスの保存株を作製した。ウエスタン解析は
、ＭＬＶ gp７０envおよびＶＳＶ−Ｇタンパク質免疫反応性の状態を精製ベク
ター調製物中のレトロウイルスgagタンパク質に対してノーマライズしたもので
示されるように、レトロウイルス産生細胞中で２つの外被タンパク質の均一な発
現およびウイルス粒子への安定した組み込み(図８Ｂ)を証明した。
【００９４】
この外被構造を用いて、ネオマイシン耐性(サイクリンＧ１構築物)またはβ−
ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の発現により求められる、感染力のある力価１
０７を常に達成した。ラットＡ１０ ＳＭＣ中のマトリックス・ターゲッテッド
・ＶＳＶＧ偽型レトロウイルスベクターの形質導入効率を決定するため、細胞を
種々のＭＯＩ(０.００５〜５００の範囲)で形質導入したところ、著しい濃度依
存を示し(図８参照)、ＳＭＣの７５％〜９６％がこれらのマトリックス・ターゲ
ッテッド・ベクターによりそれぞれ５０(力価＝３×１０６cfu／ml)から５００(
力価＝３×１０７cfu／ml)までのＭＯＩで形質導入されたことを示した。
【００９５】
サイクリンＧ１構築物の細胞傷害性と作用機構 これまでのレトロウイルスに媒
介されるアンチセンスサイクリンＧ１(すなわちＡＳ５８７)の細胞傷害性の研究
では、細胞周期の休止(Ｃhen, et al., Ｈum. Ｇene Ｔher., Ｖol. ８, pg
s. １６６７−１６７４(１９９７))および明白なアポトーシス(Ｚhu,et al.,
１９９７)に加えて、形質導入された細胞におけるシンシチウム形成が記載され
ている。注目すべきことに、変異サイクリンＧ１構築物の細胞増殖抑制性効力に
もまた、pＧ１ＤＮＴ４１〜２４９／ＲＥＸベクターによる形質導入後t＝４８時
間で見られるラットＡ１０細胞培養物におけるシンシチウム形成が伴い(図９)、
アンチセンス(ＡＳ５８７およびＡＳ６９３)構築物で見られたものと形態学上類
似する大型の多核細胞を呈した。これに対して、対照とする形質導入法でもヌル
ベクター(pＲＥＸ)でもラットＡ１０細胞でシンシチウム形成を誘導することは
なく(図９Ａ−Ｂ)、これは変異体およびアンチセンス構築物が同様に細胞の生存
力に影響していることを示唆する。サイクリンＧ１ノックアウト構築物の抗増殖
作用はヒト膵臓癌細胞(図８Ｃ)およびサルＳＭＣ(図８Ｄ)で確認し、ここでもＤ
ＮＴ４１−２４９発現変異体の相対的効力がほとんどの強力なアンチセンス構築
物よりも大きいことが分かった。
【００９６】
個々のサイクリンＧ１構築物の作用機構を実証するため、サイクリンＧ１タン
パク質発現のダウンレギュレーションを、ＡＳ６９３／ＲＥＸアンチセンスベク
ターにより形質導入した平滑筋細胞のウエスタン解析により証明した。図１０Ａ
に示す通り、サイクリンＧ１発現のダウンレギュレーションは、対照ベクターに
比べてアンチセンスベクターにより形質導入されたサルＳＭＣ培養物で観察され
、最大阻害は形質導入後t＝４８時間で見られた。逆に、変異発現ベクターによ
る形質導入後２４時間および４８時間に見られる形質導入細胞培養物中の、適宜
、〜２０kＤaの免疫応答バンドの出現により示されるように、サイクリンＧ１変
異構築物の強制発現が、ベクターによって形質導入されたＡ１０細胞において確
認された(図１０Ｂ)。タンパク質発現を指示するという点ではベクターの性能の
証明は有意義であるが、ある時点における(細胞死の前)推定(細胞傷害性の)表現
型を一時的に発現する細胞の割合は小さいであろう。インビボでのバルーン損傷
動脈についての急性研究では、サイクリンＧ１タンパク質発現のアップレギュレ
ーションが新生内膜ＳＭＣで見られる。この特徴的なサイクリンＧ１タンパク質
発現のアップレギュレーションはヌルベクター(図１１Ａ)、ＰＢＳ対照(図１１
Ｂ)、または変異発現ベクター(図８Ｄ)のいずれかで処理したバルーン損傷動脈
では減退しなかった。これに対して、アンチセンスサイクリンＧ１(ＡＳ６９３
／ＲＥＸ)ベクターで処理した動脈においては、サイクリンＧ１発現の著しいダ
ウンレギュレーションが明白であった。これらを総合すると、これらのデータは
サイクリンＧ１構築物の細胞致死作用が形質導入細胞でのサイクリンＧ１発現の
直接調節によるものであることを示す。
【００９７】
ラット動脈再狭窄モデルにおけるpＤＮＴＧ１／ＲＥＸの評価 最後に、制御下
の２つの１ヶ月のインビボ効力研究において、サイクリンＧ１(ＤＮＴ４１−２
４９／ＲＥＸ)のＮ末端欠失変異を有するマトリックス・ターゲッテッド・ＶＳ
ＶＧ偽型ベクターの、バルーン損傷ラット動脈内への内腔内注入が、ヌルベクタ
ー、生理食塩水対照、および損傷／未処理群と比較した場合、新生内膜損傷の形
成を阻害した(図１２)。脈管に大量の傷および変形を生じる(この知見は未発表)
細胞傷害性ＨＳtkベクター(ガンシクロビルを含む)戦略とは違い、ＤＮＴ４１−
２４９／ＲＥＸベクター処理された動脈で動脈壁の壊死、繊維形成または変形の
証拠はなく、このアプローチが比較的安全であることを証明している。さらに、
長期(３０日)の効力データ(表１および２)は、ＤＮＴ４１−２４９／ＲＥＸベク
ター処理された動物において新生内膜損傷内でＳＭＣ増殖の「巻き返し」がほと
んど発生しなかったことを示し、活性化ＳＭＣにおける標的形質導入および細胞
致死性サイクリンＧ１変異タンパク質の発現が動脈再狭窄の後遺症の原因である
細胞力学にかなりの影響力を持つであろうと示唆される。
【００９８】
【表１】
１対照群(損傷のみ、生理食塩水およびヌルベクター)の脈管内膜：媒体比に有意
な差はなかった。
２dnＧ１ベクター処理群を３つの対照群と比較した。結果の変数に関して両側検
定を行った(脈管内膜：媒体比)。
【００９９】
【表２】
１対照群(損傷のみ、生理食塩水およびヌルベクター)の脈管内膜：媒体比に有意
な差はなかった。
２dnＧ１ベクター処理群を３つの対照群と比較した。結果の変数に関して両側検
定を行った(脈管内膜：媒体比)
【０１００】
考察
本開示は、変異サイクリンＧ１タンパク質を用いて優性様式でその正規の対応
部分の機能を阻害することの有用性を証明する。かかる変異タンパク質の適用に
は、密接に関連する(縮重)エレメントの機能をブロックし、かつ、検出可能な遺
伝子産物を産生するという２重の利点がある(図１０参照)。ここで、サイクリン
Ｇ１の欠失変異体および点突然変異体は明白な抗増殖特性を示し、これは最も強
力なアンチセンスサイクリンＧ１構築物と少なくとも同程度の作用であった。選
択した変異サイクリンＧ１構築物(ＤＮＴ４１−２４９)を含むマトリックス・タ
ーゲッテッド・レトロウイルスベクターをまずインビトロで試験したところ、細
胞増殖の著しい阻害が見られた。アンチセンスサイクリンＧ１構築物(Ｚhu et
al., １９９７)に匹敵する様式で、ドミナントネガティブサイクリンＧ１構築
物は形質導入されたＳＭＣにおいてシンシチア形成およびプログラムされていな
いアポトーシスを引き起こし、機構上の類似性を示唆した。
【０１０１】
治療用遺伝子構築物に加え、ベクターのバイオアベイラビリティの向上に役立
つウイルス粒子へのマトリックス・テーゲッティング技術(以下参照)の組み込み
により、レトロウイルスを媒介とする損傷動脈への遺伝子送達効率に著しい改良
がなされた。レトロウイルスベクター・ターゲッティング技術における最近の進
展は、フォン・ヴィレブランド因子の一次構造に内在する生理学的監視機能(Ｍo
ntgomery et al.,Ｈemophilia and von Ｗillebrand Ｄisease, Ｃhapte
r ４４, pgs. １６３１−１６７５,Ｗ. Ｂ. Ｓaunders Ｃo., Ｐhiladelp
hia (１９９８)；Ｇinsburg,Ｄ, et al., Ｐroc. Ｎat. Ａsal. Ｓci.
Ｖol. ８６,pgs. ３７２３−３７２７ (１９８９)；Ｒuggeri ＆ Ｚimmer
man, Ｂlood, Ｖol. ７０,pgs. ８９５−９０４ (１９８７))をマトリック
ス・ターゲッテッド・レトロウイルスベクターの開発に採用し得ることが証明さ
れている(Ｈall,et al. Ｈuman Ｇene Ｔherapy, Ｖol. ８, pgs. ２１
８３−２１９２ (１９９７)；Ａnderson,Ｎature, Ｖol. ３９２ (Ｓuppl.)
, pgs. ２５−３０ (１９９８))。vＷＦ由来マトリックス・ターゲッティング
(すなわちコラーゲン結合)モチーフの操作およびレトロウイルス外被への挿入は
、都合のよい機能獲得表現型、すなわちバルーンカテーテル損傷に曝された細胞
外マトリックス成分との高親和性結合を有するＭＬＶに基づくベクターを利用す
ることによって、インビボでの遺伝子送達を向上させる。これらの研究に用いた
マトリックス・ターゲッテッド両種性外被(Ｈall et al., ２０００参照)は、
２週間のアンチセンスサイクリンＧ１の効力研究(Ｚhu et al., ２０００；提
示)において血管損傷部位に集積すること(Ｈall et al.,１９９７)と内在Ｓ
ＭＣの効果的な形質導入を可能にすることがこれまでに示されている本来のエコ
トロピック(齧歯類特異的)ベクターに取って代わる。損傷後１時間以内に平均的
なＳＭＣの活性化および増殖が始まる限り、新生内膜への移動は４日目までに起
こり(Ｃlowes et al. Ｌab. Ｉnvest.,Ｖol. ４９, pgs. ３２７−３７
３ (１９８３),Ｃlowes et al., Ｃirc Ｒes., Ｖol. ５６, pgs. １３
９−１４５ (１９８５))、複製は次の２週間にわたり著しく増加し(Ｓchwartz
et al., １９９５；ＤeＭeyer and Ｂlut,１９９７)、ベクター浸潤およ
び細胞の形質導入は、(i)バルーン損傷時(Ｚhu et al., １９９７)および(ii)
新生内膜内でのＳＭＣの移動および増殖が最大となる血管形成後７日(Ｈall
et al., ２０００)の時点でのマトリックス・ターゲッテッド両種性ベクターの
内腔内注入によってさらに至適化される。
【０１０２】
本開示では、Ｓoneoka et al.,１９９５から採用した一時的トランスフェ
クション系を用いて高力価レトロウイルスベクターを作製したが、ここでは、パ
ッケージング成分ならびに治療遺伝子の発現は強力なＣＭＶプロモーターによっ
て駆動し、各構築物がヒト２９３Ｔ産生細胞におけるプラスミド発現を助ける働
きをするＳＶ４０複製起点(ori)を含む。これらの試薬を用いて３x１０６〜３x
１０８cfu／mlの範囲のウイルス力価を常に達成した。さらに、融合誘導ＶＳＶ
Ｇ envタンパク質の同時発現(Ｉida,et al., Ｊ. Ｖirol., Ｖol. ７０, p
gs. ６０５４−６０５９ (１９９６)；Ｌaitinen,et al., Ｈum. Ｇene
Ｔher., Ｖol. ８,pgs. １６４５−１６５９ (１９９７)；Ｙu, et al.,
Ｇene Ｔherapy,Ｖol. ６, pgs. １８７６−１８８３ (１９９９))が、ベ
クターをさらに濃縮せずともウイルス力価をさらに向上させた(９x１０８cfu／m
lまで)ことから、ベクター作製および予測治療構築物の同定が容易となった。
【０１０３】
総合すると、レトロウイルスベクターの設計、操作、および展開におけるこれ
らの改良点により、至適化された遺伝子療法プロトコールの開発およびバルーン
血管形成ラットモデルでの新生内膜形成の阻害における長期作用の達成が可能と
なった(表１参照)。２例の制御下の１ヵ月の効力研究において、マトリックス・
ターゲッテッドdnＧ１レトロウイルスベクターのバルーン損傷ラット頚動脈への
内腔内送達は、他の唯一の薬剤であるタンパク質キナーゼＣ阻害剤(Ｐrescott,
et al., Ａnn. Ｎ.Ｙ. Ａcad. Ｓci.,Ｖol. ８７８, pgs. １７９−１９
０ (１９９０))および一酸化窒素シンターゼ構築物を有するアデノウイルスベ
クター(Ｓhears,et al., Ｊ. Ａm. Ｃoll. Ｓurg., Ｖol. １８７, pgs.
２９５−３０６ (１９９９))により誘導される応答の大きさとしての、ＳＭ
Ｃ増殖の「巻き返し」と混同することなく新生内膜損傷形成の〜５０％阻害を生
じた。動脈組織学を都合悪く歪曲させる(ガンシクロビル投与後の)ＨＳtＫベク
ターとは異なり(Ｎabel,Ｎature Ｖol. ３６２, pgs. ８４４−８４６ (１
９９３))、dnＧ１ベクター処理された動脈で動脈壁の壊死、繊維形成または変形
は明らかに存在せず(図１２参照)、インビボ臨床使用におけるこのアプローチの
安全性を証明している。結論として、この研究は、血管再狭窄の治療のための細
胞致死性遺伝子療法の有用性を拡大するため、治療サイクリンＧ１構築物におけ
る著しい改良とマトリックス・ターゲッティング技術、ベクター作製方法、およ
び点滴注入法プロトコールにおける進歩とを組み合わせたものである。
【０１０４】
実施例３ マトリックス・ターゲッテッド・レトロウイルスベクターの全身投与
はマウスにおける癌遺伝子療法に有効である
材料および方法
細胞、細胞培養条件、マーカーを含むプラスミドおよびベクター、ならびに細胞
周期制御遺伝子 ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔおよびヒト膵臓癌ＭiaＰaca２細胞を
ＡＴＣＣから入手した。ＮＩＨ３Ｔ３および２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血
清(Ｄ１０；Ｂiowhittaker,Ｗalkersville, ＭＤ, ＵＳＡ)を添加したダルベッ
コ改変イーグル培地で維持した。ウイルスgag pol遺伝子を含むプラスミドpcgp
、および核ターゲッテッドb−ガラクトシダーゼ構築物を発現するレトロウイル
スベクターpcnＢgは厚意によりそれぞれＤrs. Ｐaula ＣannonおよびＬing
Ｌiより提供されたものであった(ＵＳＣ Ｇene Ｔherapy Ｌaboratories,Ｌ
os Ａngeles, ＣＡ)。末端切断した(a.a. ４１−２４９)サイクリンＧ１(dnＧ
１)構築物を、Ｇ１ＸＳvＮa(Ｇenetic Ｔherapy,Ｉnc., Ｇaithersburg, ＭＤ
, ＵＳＡから譲渡)のレトロウイルスパッケージング成分配列を含むようにpＨＩ
Ｔ１０９(Ｓoneoka et al.,Ｎucl. Ａcid Ｒes. ２３, ６２８−６３３,
１９９５)を改変したレトロウイルス発現ベクターpＲＥＸへクローニングした。
【０１０５】
変異サイクリンＧ１構築物を有するマトリックス・ターゲッテッド・レトロウイ
ルスベクターの作製 パッケージング成分gag−pol、およびＣＭＶプロモーター
から発現したフォン・ヴィレブランド因子由来のコラーゲン結合(マトリックス
・ターゲッティング)モチーフを有するキメラ両種性モロニーネズミ白血病ウイ
ルス(ＭulＶ)に基づくenv、およびレトロウイルスベクターを、各々ＳＶ４０複
製起点を有する個々のプラスミドに配置した、３または４プラスミドの一時的同
時トランスフェクション系(Ｓoneoka et al., Ｎucl. Ａcid Ｒes. ２３,
６２８−６３３, １９９５)を用いて高力価ベクターを作製した。ベクターは、
用いる特定の外被を表すＭx−nＢg、Ｍx−dnＧ１、およびＣＡＥ−dnＧ１と呼び
、遺伝子発現構築物を各ベクターに組み込んだ。Ｍx−nＢgはその外被にマトリ
ックス・ターゲッティングモチーフおよび核ターゲッテッドb−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を有するＭuＬＶに基づく改変型ベクターである。Ｍx−dnＧ１はＮ末端
欠失変異サイクリンＧ１構築物を有するマトリックス・ターゲッテッド細胞致死
性ベクターである(Ｇordon et al.,Ｃancer Ｒes. ６０, ３３４３−３３
４７. ２０００)。ＣＡＥ−dnＧ１は野生型の両種性ＭulＶに基づく外被(Ｍorg
an et al., Ｊ. Ｖiol. ６７,４７１２−４７２１. １９９３)およびＭx
−dnＧ１と同じ細胞致死性サイクリンＧ１構築物を有する非ターゲッテッドベク
ターである。
【０１０６】
ウイルス力価 ネズミＮＩＨ３Ｔ３細胞中のウイルス力価は、βガラクトシダー
ゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性、neor遺伝子の発現を基に
、これまでに記載されたようにして求めた(Ｓkotzko et al., Ｃancer Ｒes.
５５, ５４９３−５４９８,１９９５)。ウイルス力価はＧ４１８耐性コロニ
ー形成単位の数(cfu)／mlとして表し、１０７ないし１０８cfu／mlの範囲であっ
た。
【０１０７】
インビボ効力研究 これらの研究は、the Ｕniversity of Ｓouthern Ｃali
fornia Ｉnstitution Ａnimal Ｃare and Ｕse Ｃommitteeに承認された
プロトコールに従って行った。インビボ Ｍx−dnＧ１ベクター治療の抗腫瘍作
用に基づいた標的遺伝子送達効率を評価するため、１〜９x１０７のヒトＭiaＰa
ca２癌細胞を胸腺欠損nu／nuマウスに皮下移植することで皮下腫瘍異種移植を行
なった。腫瘍が〜５０mm３の大きさに達したところで、Ｍx−dnＧ１ベクター(力
価：８x１０６cfu／２５gmマウス)、同様の力価のＭx−nＢg対照ベクター、非タ
ーゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター、またはリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ、p
Ｈ７.４)プラセボ対照のいずれか２００μlを尾の静脈に７〜１０日間毎日直接
注射した(１治療周期)。腫瘍の大きさをノギスで２〜４日ごとに測定し、楕円対
象物の容積を算出する公式：腫瘍体積、mm３＝４／３ p r１ r２ r３を用い
た。マウスをそれぞれ、１または２治療周期が終わった翌日または１週間後に頸
椎脱臼により犠牲にした。
【０１０８】
アポトーシスアッセイ 腫瘍小節由来の組織片を、Ａpoptagキット(Ｉntergen,
Ｐurchase,ＮＹ, ＵＳＡ)を用いてアポトーシスの誘導について評価した。急速
凍結した腫瘍小節をパラホルムアルデヒドで固定し、膜をエタノールおよび酢酸
で透過処理した。ＴdＴ酵素を加えた後、抗ジドキシゲニン(didoxygenin)ペルオ
キシダーゼコンジュゲートを加えた。次いでこれらの組織片をペルオキシダーゼ
基質で染色し、メチルグリーンで対比染色した。
【０１０９】
統計分析 (i)経時的な腫瘍容積の変化(腫瘍増殖率)を簡約するため、最少二乗
直線を対数変換値に当てはめた。すなわち、各マウスについて、最初の経時的な
５回の測定値を用いて傾きを推定した。計算したこれらの傾きを真数を用いて元
の倍率に変換し直し、一日あたりの平均腫瘍増殖率(％)とする。３回の実験の各
々の中で異なるベクターを比較するには、分散の荷重分析を独立変数として推定
した傾きとともに用いた。各マウスに対し、加重は傾きの推定値(最初の最少二
乗直線分析で計算したもの)の標準誤差の和の逆数に３回全ての実験に基づく傾
き間の分散の推定値を加えたものである。実験Ｉ およびII に関しては、分散
分析に基づくＦ検定を用いてＭx−nＢgおよびＭx−dnＧ１ベクターを比較し、実
験IIIに関しては、Ｆ検定の後に多重比較の最少有意差法を用いてＭx−dnＧ１と
ＣＡＥ−dnＧ１ベクターおよびプラセボ処置を比較した。解析したデータを組み
合わせた結果を表３に示す。(ii)カプラン・マイヤー・プロダクト・リミット法
(Ｋaplan−Ｍeier product limit method)(Ｋaplan ＆ Ｍeier Ｊ. Ａme
r. Ｓtatist. Ａssoc. ５３,４５７, １９５８)を用いて腫瘍が４倍になる
確率を時間(日数)の関数として推定した。(iii)傾向に関するタロン検定(ログラ
ンク検定に基づく；Ｔarone, Ｂiometrika ６２, ６７９,１９７５)を用いてプ
ラセボ(ＰＢＳ)−処置群、非ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター処置群、お
よびマトリックス・ターゲッテッドＭx−dnＧ１ベクター処置群が４倍になる時
間を比較した。
【０１１０】
結果
短期の効力研究では、Ｍx−nＢg対照ベクター、非ターゲッテッドＣＡＥ−dn
Ｇ１ベクターまたはＭx−dnＧ１細胞致死性ベクター(各ベクター＝〜８x１０６c
fu／用量)、かまたは同量のＰＢＳプラセボのいずれかの静注を１〜９x１０７の
ヒトＭiaＰaca２膵臓癌細胞の移植後６日目に開始し、マウスの部分集合に総計
７ベクターの注入を毎日継続した。Ｍx−nＢgベクター(図１３)、非ターゲッテ
ッドＣＡＥ−dnＧ１ベクターおよびプラセボＰＢＳで処置したマウスでは、腫瘍
サイズに進行性の増殖が見られた(表３)。これに対して、Ｍx−dnＧ１ベクター
で処置した動物では腫瘍退縮が見られた(図１３；表３)。免疫組織化学染色では
、対照ベクター処置マウスの大型腫瘍で発現したヒトサイクリンＧ１タンパク質
に対する核の強い免疫反応性が明らかとなったが、一方でＭx−dnＧ１ベクター
で処置した動物の残存腫瘍にサイクリンＧ１発現の減少が認められた。
【０１１１】
マトリックス・ターゲッテッド・レトロウイルスベクターによる固形腫瘍への
遺伝子送達の効率を評価するため、７種のベクター用量を投与した後に２群の動
物の部分集合を犠牲にした(図１３)。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した
、Ｍx−nＢg対照ベクターで処置した動物から得た腫瘍組織切片の組織病理学検
査により、腫瘍小節が腫瘍および腫瘍関連細胞、すなわち薄い結合組織被膜に囲
まれた活性脈管形成介在域を持ち比較的分裂速度の速い優勢な悪性類上皮細胞集
団からなることが明らかとなった。これに対して、Ｍx−dnＧ１ベクターで処置
した動物から得た腫瘍小節では、大量の腫瘍破壊、残存腫瘍細胞内でのアポトー
シスの多発、および反応性間質の肥厚化の形跡が見られた。多くの腫瘍小節が、
大きな中央壊死域、活性腫瘍の中間域、および多数のアポトーシス細胞を含む末
梢域を示した。消散している他の腫瘍小節はほぼ完全に緻密な結合組織に囲まれ
ているが、これにより、かなりの割合の残存腫瘍が明白なアポトーシス細胞の小
領域を示し、また、急性および慢性炎症の程度が多様であることが説明される。
【０１１２】
形質導入効率は、b−ガラクトシダーゼ抗原(ＧＡＬ−４０,Ｓigma, Ｓt. Ｌ
ouis ＭＯ, ＵＳＡ)に対するマウスモノクローナル抗体を用いる腫瘍小節の免
疫組織化学染色と、その後のＯptimas画像解析システム(Ｏptimas Ｃorporatio
n, Ｂothell, Ｗashington,ＵＳＡ)を用いる解析により求めた。腫瘍小節あた
り３つの高電場でb−ガラクトシダーゼ陽性細胞の数を計数し、細胞総数で割っ
て×１００倍することで形質導入効率(％で表す)を求めた。高レベルの細胞の形
質導入(３５.７±１.４％；表４)がＭx−nＢgベクターで処置した動物の腫瘍小
節のいたるところで認められた。
【０１１３】
この腫瘍小節に見られた高い形質導入効率をさらに調べるため、犠牲にする１
時間前および２４時間前にＭx−nＢgベクターを静注してベクター分布試験を行
なった。８３Ａ２５ラットモノクローナル抗体を用いるレトロウイルス外被タン
パク質の免疫組織化学染色は、１時間では、ベクター粒子の集積は腫瘍小節全体
に絡み合う脈管形成域において顕著であったが、２４時間では、ベクター粒子の
免疫反応は見られず、このことは腫瘍および腫瘍関連細胞へのウイルスの侵入が
起こったことを示している。腫瘍小節のマッソン・トリクローム染色は、脈管形
成血管床が内皮細胞に完全には覆われていないことから、細胞外マトリックス成
分は循環血液成分に曝されていることを明らかにした。考えうるところでは、透
過性の腫瘍脈管構造内でのコラーゲンが露出していることがマトリックス・ター
ゲッテッド・レトロウイルス粒子の局所濃度を高め、それが腫瘍小節内で見られ
た高い分裂指数とあいまって、腫瘍細胞および関連する脈管構造の効果的な形質
導入を促進した。マッソン・トリクローム染色で、豊富なコラーゲン沈着を含む
活発な繊維形成が、実際の腫瘍塊に対してかなりの割合の残存小節を構成してい
たことが確認された。
【０１１４】
アポトーシスは腫瘍性細胞(Ｓkotzko et al., Ｃancer Ｒes. ５５, ５４
９３−５４９８, １９９５)においても増殖性の血管細胞(Ｚhu et al.,Ｃirc
ulation ９６, ６２８−６３５. １９９７)においても、サイクリンＧ１阻害
の結果であることが知られている。従って、Ｍx−dnＧ１ベクターで処置した腫
瘍の免疫組織化学染色では、対照ベクターで処置した動物のものと比較した場合
、ＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞の発生率が著しく増加することが明らかにな
った。アポトーシスは対照ベクターで処置したマウスの脈管形成の血管では認め
られなかった。これに対して、間質コンパートメントと同様に脈管形成域の内皮
細胞の多数のアポトーシス(３６±５％)がＭx−dnＧ１ベクターで処置した動物
において見られた。特に、アポトーシス発生の増加は、腫瘍小節の周辺表層に限
らず、腫瘍小節の奥深くの多くの細胞層にまで及んでいた。Ｍx−dnＧ１ベクタ
ーの腫瘍小節への浸透能は、コラーゲン沈着および／または露出、ならびに固形
腫瘍の中心部内の血管浸透性によって明らかに促進された。この観点はベクター
粒子の集積が脈管形成域で最も顕著であることを示した免疫組織化学研究結果と
一致する。さらに、認められた増殖性内皮細胞および間質細胞の破壊はそれ自身
、血管供給の枯渇により(Ｆolkman, Ｎature Ｍed. １, ２７−３.１９９５；
Ｈanahan ＆ Ｆolkman,Ｃell ８６, ３５３−３６４, １９９６；Ｆidler,
Ｊ. Ｎatl. Ｃancer Ｉnst. ８７,１５８８−１５９２. １９９５)または
増殖因子の刺激により(Ｆukumura et al., Ｃell ９４, ７１５−７２５.１
９９８)、不均衡な量の腫瘍細胞死を誘発し得るものであった。
【０１１５】
Ｍx−dnＧ１ベクター(ベクター用量：１x１０７cfu)、同等の用量の非ターゲ
ッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター、または等量のＰＢＳプラセボを用いる、休止
期を挟んで２回(１０日)の治療サイクルからなる長期効力研究で、治療効率が両
種性ＭＬＶ外被タンパク質の一次構造内に組み込まれたコラーゲン・ターゲッテ
ィングペプチドモチーフに依存していることが確認された(図１４Ａおよび１４
Ｂ)。プラセボ処置したマウスでは腫瘍サイズの急速な増大が見られたが、非タ
ーゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター処置した動物では、ＰＢＳ対照と比較した
場合に腫瘍増殖の下限阻害が認められた(p＝０.１０；表３)。これに対して、非
ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター処置マウス(p＝０.０１４)、対照ターゲ
ッテッドＭx−nＢgベクター処置マウス(p＝０.００４)、およびＰＢＳ処置マウ
ス(p＝０.００１；表３)と比較すると、Ｍx−dnＧ１ベクター処置マウスにおけ
る腫瘍増殖は有意に阻害された。さらに、Ｍx−dnＧ１ベクター処置マウスにお
ける腫瘍増殖率は、〜７週間の追跡期間を通して非ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ
１ベクター処置動物(図１４Ａ)のものより常に低く維持されていた。
【０１１６】
カプラン・マイヤー生存研究は、ＰＢＳプラセボ、非ターゲッテッドＣＡＥ−
dnＧ１ベクターまたはマトリックス・ターゲッテッドＭx−dnＧ１ベクターで処
置したマウスで行った(図１４Ｂ)。倫理上の理由から、実際に動物を死亡させる
ではなく、生存のエンドポイントを実際の対象の死亡の代わりに、腫瘍が４倍に
なった時点と定めた(まず、腫瘍負荷が最初の基準よりも４倍大きくなったと認
められたときに記録)。もし腫瘍容積が４７日で４倍に増えなかった場合、その
動物を犠牲にし、４倍増殖時間を４７日で打ち切った。カプラン・マイヤー・プ
ロダクト・リミット法(Ｋaplan ＆ Ｍeier Ｊ. Ａmer. Ｓtatist. Ａssoc
. ５３, ４５７, １９５８)を用いて腫瘍が４倍になる確率を時間(日数)の関数
として推定した。傾向に関するタロン検定(ログランク検定に基づく；Ｔarone,
Ｂiometrika ６２,６７９,１９７５)を用いてプラセボ(ＰＢＳ)−処置群、非
ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクター処置群、およびマトリックス・ターゲッ
テッドＭx−dnＧ１ベクター処置群の４倍増殖時間を比較した。ログランク検定
を用いると、３つ全ての群を同時に比較する総合的なＰ値は０.００３であり、
傾向を含めるとその有意水準は０.００４であった。これらのデータは、長期の
腫瘍増殖制御の可能性は、非ターゲッテッドＣＡＥ−dnＧ１ベクターまたはＰＢ
Ｓプラセボよりもマトリックス・ターゲッテッドＭx−dnＧ１ベクターを用いる
方が有意に高いことを示している。
【０１１７】
マトリックス・ターゲッテッド・ベクターの潜在的毒性を評価するため、１ま
たは２回の治療サイクルの終了時に非標的臓器を回収した(累積のベクター用量
はそれぞれ８×１０７または１.６×１０８cfu)。血清化学プロフィールは正常
で、骨髄、肺、心臓、脳、肝臓、腎臓、精巣、結腸および皮膚の組織検査では臓
器損傷の形跡はなかった。これらの結果はＭx−dnＧ１レトロウイルスベクター
の静注が広範囲の安全性を持つようであるとの考え(Ｇordon et al., Ｃancer
Ｒes. ６０,３３４３−３３４７, ２０００)をさらに裏付けるものである。
【０１１８】
【表３】
注：３つの別々の実験の結果を合わせた。３つの実験中の異なるベクターを比較
するために、分散の重量分析を、独立分散としての概算した傾斜と共に使用した
。実験ＩおよびIIに関して、分散の分析に基づいたＦ検定を使用して、Ｍx−nＢ
gおよびＭx−dnＧ１ベクターを比較し、実験IIIに関して、Ｆ検定、続く複数の
比較の最小有意差法を使用して、Ｍx−dnＧ１を、ＣＡＥ−dnＧ１ベクターおよ
びプラセボ処置と比較した。分析データの合わせた結果を上記に示す。
【０１１９】
【表４】
注：Ｍx−nＢgレトロウイルスベクターによる固体腫瘍内への遺伝子送達の効果
を、７種のベクター投与量を投与した後に二つのサブセットの動物で評価した(
図１３も参照)。形質導入効率は、腫瘍小瘤の免疫組織化学的染色により、b−ガ
ラクトシダーゼ抗原に対するマウスモノクローナル抗体、続くＯptimas造影シス
テムを使用して測定した。形質導入効率(％で示す)は、腫瘍小瘤当たりの３つの
ハイパワー場におけるb−ガラクトシダーゼ陽性細胞を計数し、細胞の総数で割
り、１００を掛けて測定した。
【０１２０】
考察
実施例３の結果は、末端静脈注射により分散させたマトリックス標的化レトロ
ウイルスベクターが、(i)１時間以内に血管形成性腫瘍血管構造に蓄積される、(
ii)腫瘍細胞が高レベルの効率で形質導入される、そして(iii)目に見える毒性を
誘発することなく、治療的遺伝子送達および長期効果を促進することを証明する
。一緒にして、これらの結果は、末梢静脈に直接注射したマトリックス標的化レ
トロウイルスベクターが、固体腫瘍内への治療的遺伝子送達を改善するという原
則の最初の決定的証拠を提供する。
【０１２１】
全ての特許、刊行物(公開特許出願も含む)、データベース受け入れ番号および
受託所受け入れ番号の記載は、各特許、刊行物、データベース受け入れ番号およ
び受託所受け入れ番号が個々に特記され、個々に出展明示により本明細書に包含
されるのと同程度に出展明示により本明細書に包含させる。
【０１２２】
しかし、本発明の範囲は、上記の具体的実施態様に限定されないことは理解す
べきである。本発明は、特別に記載されているのと異なって実施し得、まだ特許
請求の範囲の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１６０８１５（Ｐ２０１１−１６０８１５Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１２０５６６（Ｐ２０１１−１２０５６６）
【出願日】平成２３年５月３０日（２０１１．５．３０）
【分割の表示】特願２００１−５６４３５３（Ｐ２００１−５６４３５３）の分割
【原出願日】平成１３年３月１日（２００１．３．１）
【出願人】（５９２０４８８４４）ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア (26)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２０５６６（Ｐ２０１１−１２０５６６）
【出願日】平成２３年５月３０日（２０１１．５．３０）
【分割の表示】特願２００１−５６４３５３（Ｐ２００１−５６４３５３）の分割
【原出願日】平成１３年３月１日（２００１．３．１）
【出願人】（５９２０４８８４４）ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア (26)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]