好熱性好酸性菌の識別方法
【課題】好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの芽胞耐熱性を迅速かつ簡便に識別する方法の提供。
【解決手段】特定の塩基配列における、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子多型を検出することを含む、試料中の好熱性好酸性菌を識別する方法。（１）塩基番号６７の塩基がＣ若しくはＴである遺伝子多型（２）塩基番号６８の塩基がＧ若しくはＴである遺伝子多型（３）塩基番号７３の塩基がＴ若しくはＧである遺伝子多型（４）塩基番号１７５の塩基がＣ若しくはＧである遺伝子多型（５）塩基番号１７６の塩基がＴ若しくはＣである遺伝子多型（６）塩基番号１９５の塩基がＴ若しくはＡである遺伝子多型（７）塩基番号２３９の塩基がＡ若しくはＧである遺伝子多型。
【解決手段】特定の塩基配列における、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子多型を検出することを含む、試料中の好熱性好酸性菌を識別する方法。（１）塩基番号６７の塩基がＣ若しくはＴである遺伝子多型（２）塩基番号６８の塩基がＧ若しくはＴである遺伝子多型（３）塩基番号７３の塩基がＴ若しくはＧである遺伝子多型（４）塩基番号１７５の塩基がＣ若しくはＧである遺伝子多型（５）塩基番号１７６の塩基がＴ若しくはＣである遺伝子多型（６）塩基番号１９５の塩基がＴ若しくはＡである遺伝子多型（７）塩基番号２３９の塩基がＡ若しくはＧである遺伝子多型。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱性好酸性菌の識別方法、特に該菌の芽胞耐熱性の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好熱性好酸性菌は土壌や温泉等から分離され、好気的に高温・酸性下で増殖する芽胞形成細菌である。土壌等に存在する好熱性好酸性菌芽胞が果汁に混入した場合、その果汁を使用した飲料水や食品において、製造工程で加熱殺菌が行われていたとしても、菌の耐熱性芽胞が生き残り、製品中で発芽・増殖し、変敗事故を引き起こす可能性がある。
【０００３】
好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス属細菌は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris、以下、A. acidoterrestrisとも記載）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）等種々の菌種が分離されているが、そのうち異臭物質グアヤコールを生成するアリサイクロバチルス・アシドテレストリス菌が、汚染事故の原因菌として報告されており、問題視されている。
【０００４】
好熱性好酸性菌による汚染事故を未然に防ぐために、アリサイクロバチルス属細菌の検出方法が提案されてきた。例えば、選択培地（非特許文献１、２）が報告されているが、検査結果を得るまでに数日を必要とする他、詳細な菌種同定のためには生化学試験等が必要である。
【０００５】
そこで、近年、遺伝子解析的手法を用いた検出方法が提案されてきた。例えば、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の比較による方法（非特許文献３）、ＰＣＲ法を用いた方法（特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献４）、ＬＡＭＰ法を用いた方法（特許文献４、特許文献５）などである。
【０００６】
これらの方法で、試料中に好熱性好酸性菌、特にアリサイクロバチルス・アシドテレストリスが混入しているか否かを迅速且つ簡便に検出できるが、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの詳細な菌株、特に芽胞耐熱性を識別することは不可能であった。
【０００７】
芽胞耐熱性評価は、従来、培養による芽胞形成と耐熱性試験に依存してきた。しかし、これらの検査は時間がかかる、検査結果が培養条件等の影響を受けやすい、などの問題があった。
【０００８】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ０１／６８９１４号
【特許文献２】特開平１１−１３７２５９号
【特許文献３】特開２００５−４６０３５号
【特許文献４】特開２００５−１１０５８７号
【特許文献５】特開２００６−８７４０７号
【非特許文献１】G.Deinhard et al., System. Appl. Microbiol., 10, 47-53, 1987
【非特許文献２】B.Hippchen et al., Arch. Microbiol., 129, 53-55, 1981
【非特許文献３】K.Goto et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 48, 243-250, 2002
【非特許文献４】K.Yamazaki et al., Lett. Appl. Microbiol., 23, 350-354, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
好熱性好酸性菌の識別、その菌株の識別、特に芽胞耐熱性の識別は、酸性飲料の変敗事故を未然に防止する上で欠かせない技術である。本発明は、好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス・アシドテレストリス菌株の芽胞耐熱性を迅速かつ簡便に識別する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス・アシドテレストリスにおいて芽胞耐熱性が高い菌株と低い菌株が存在することを見出した。更にアリサイクロバチルス・アシドテレストリスの１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列について、５箇所・７塩基の相違を見出し、検出された配列に基づいて前記アリサイクロバチルス・アシドテレストリス菌株の芽胞耐熱性を識別することに成功した。本発明はこの成果に基づいて完成された。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕配列番号１又は２に示される塩基配列における、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子多型を検出することを含む、試料中の好熱性好酸性菌を識別する方法。
（１）塩基番号６７の塩基がＣ若しくはＴである遺伝子多型
（２）塩基番号６８の塩基がＧ若しくはＴである遺伝子多型
（３）塩基番号７３の塩基がＴ若しくはＧである遺伝子多型
（４）塩基番号１７５の塩基がＣ若しくはＧである遺伝子多型
（５）塩基番号１７６の塩基がＴ若しくはＣである遺伝子多型
（６）塩基番号１９５の塩基がＴ若しくはＡである遺伝子多型
（７）塩基番号２３９の塩基がＡ若しくはＧである遺伝子多型
【００１２】
〔２〕前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌が芽胞耐熱性の低い菌であると判定することを更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
【００１３】
〔４〕下記（ｈ）〜（ｎ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌が芽胞耐熱性の高い菌であると判定することを更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
【００１４】
〔５〕下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスＩＡＭ１５０８７株、ＤＳＭ３９２２株、ＤＳＭ３９２３株及びＤＳＭ３９２４株のいずれかであると識別することを更に含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
【００１５】
〔６〕下記（ｈ）〜（ｎ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスＩＡＭ１５０８５株、ＩＡＭ１５０８６株及びＤＳＭ２４９８株のいずれかであると識別することを更に含む、〔１〕、〔２〕及び〔４〕のいずれかに記載の方法。
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
【００１６】
〔７〕配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基の５’側にある５〜５０塩基長の部分配列と、前記塩基の３’側にある５〜５０塩基長の部分配列に相補的な配列とからなる、前記塩基を含む塩基配列断片を増幅し得る１対のプライマーセット。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【００１７】
〔８〕配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【００１８】
〔９〕配列番号１又は２に示される塩基配列に相補的な配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基に相補的な塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【００１９】
〔１０〕〔８〕又は〔９〕に記載のオリゴヌクレオチドを固定化した固定化基板。
〔１１〕〔７〕に記載のプライマーセット、〔８〕若しくは〔９〕に記載のオリゴヌクレオチド又はその標識物及び〔１０〕に記載の固定化基板の少なくとも１つを含む、好熱性好酸性菌検出キット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、好熱性好酸性菌、特にアリサイクロバチルス・アシドテレストリスの検出、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス菌株の識別、更に芽胞耐熱性の識別を、迅速、簡便かつ高精度に行なうことを可能にする。本発明によれば、煩雑で不正確な耐熱性試験を行なわずにして、芽胞耐熱性の識別が可能となる。
【００２１】
更に本発明によれば、特に、酸性飲料の生産において適切な殺菌条件を設定することにより変敗事故を未然に防止することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の好熱性好酸性菌を識別する方法は、試料中の好熱性好酸性菌の遺伝子の塩基配列、具体的には１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を判別して、好熱性好酸性菌のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスを識別し、更にその菌株及び芽胞耐熱性を識別する方法である。
【００２３】
本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）、及び連続した複数ヌクレオチドにわたる多型、の両方を含むものとする。すなわち、ある塩基配列を基準として、該塩基配列の１又は複数の特定部位に、１又は複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異を「遺伝子多型」とする。
【００２４】
「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含むものとする。従って、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｃＲＮＡの全てが含まれる。
【００２５】
配列表の塩基配列はすべてＤＮＡ配列として記載し、それにより特定される塩基配列及びオリゴヌクレオチドはＤＮＡで示されるが、配列表の塩基配列をＲＮＡに読み替えた場合も本発明に含まれる。従って、配列表の塩基配列、それにより特定される塩基配列及びオリゴヌクレオチドがＲＮＡを示す場合は、配列表中の塩基記号「ｔ」を「ｕ」に読み替えるものとする。
【００２６】
また、配列の検出若しくは判別とは、識別、分類を行う好熱性好酸性菌の核酸について、多型を有する配列を検出することをいい、また、多型部位の塩基を検出、判定することでもある。更に、該配列に相補的な配列において、多型を有する配列を検出し、多型部位の塩基を検出、判定することも含む。
【００２７】
試料とは、好適には、好熱性好酸性菌細胞の遺伝子を含む試料をいう。好熱性好酸性菌細胞からの遺伝子を含む試料の調製は、例えば、通常公知の核酸の抽出・精製方法（例えば、Sambrook, J. et al. (1989)：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)” Cold Spring Harbor Laboratory, NY）に従って行なうことが可能である。例えば、核酸を含む溶液にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノム核酸を得る。また、市販の核酸の抽出・精製キットを用いて、遺伝子を含む試料の調製を行なうことも可能である。
【００２８】
本発明において利用される好熱性好酸性菌の遺伝子多型は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の、配列番号１と２に示された塩基配列における塩基の違いであって、具体的には下記（１）〜（７）である。本発明では、このうち少なくとも１つの多型を検出する。
（１）塩基番号６７の塩基がＣ若しくはＴである遺伝子多型
（２）塩基番号６８の塩基がＧ若しくはＴである遺伝子多型
（３）塩基番号７３の塩基がＴ若しくはＧである遺伝子多型
（４）塩基番号１７５の塩基がＣ若しくはＧである遺伝子多型
（５）塩基番号１７６の塩基がＴ若しくはＣである遺伝子多型
（６）塩基番号１９５の塩基がＴ若しくはＡである遺伝子多型
（７）塩基番号２３９の塩基がＡ若しくはＧである遺伝子多型
【００２９】
上記（１）〜（７）は、多型の存在に感受性が認められる手段を駆使することにより得ることができる。具体的には、ダイレクト・シーケンシング法（Biotechniques, 11, 246-249 (1991)）、ＤＨＰＬＣ（Denaturing High Performance Liquid Chromatography）法（Underhill, P.A. et al., Genome Res. 7:996-1005 (1997)）、Surveyor Nucleaseを用いる方法（Qui P, et al., Biotechniques, 2004 Apr;36(4);702-7）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Science, 5109, 778-783(1993), J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999), Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)）、プライマー伸長法（米国特許第６，２１０，８８４号、同第６，１８３，９６０号、Lizardi, P. M. et al., Nature Genet., 19, 225-232 (1998); Piated, A. S. et al., Nature Biotech., 16, 359-363 (1998)）、ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism)法（Biotechniques, 16,296-297 (1994), Biotechniques, 21, 510-514 (1996)）、ＤＮＡチップを用いる方法、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法（Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)）、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法（Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991), Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法（Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)）、ＲＮａｓｅＡ切断法（DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)）、化学切断法（Biotechniques, 21, 216-218 (1996)）、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法（Genome Res., 8, 549-556 (1998)）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法（Genome Res., 7, 378-388 (1997), Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)）、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)）、モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法（Nat. Biotechnol.，1, p49-53 (1998)、遺伝子医学、4, p46-48(2000)）、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法(Dynamic Allele-Specific Hybridization(DASH))法（Nat. Biotechnol.，1, p87-88, (1999)、遺伝子医学, 4, p47-48 (2000)）、パドロック・プローブ(Padlock Probe)法（Nat. Genet., 3, p225-232 (1998)、遺伝子医学, 4, p50-51 (2000)）、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ（Electrochemical Array）法（Anal. Chem., 72, p1334-1341, 2000）等を例示することができる。
【００３０】
例えば、ＤＨＰＬＣ法及びSurveyor Nucleaseを用いる方法については、Transgenomic社(USA)の製品を用い、そのプロトコールに従って行なうことができる。
【００３１】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法及びＩｎｖａｄｅｒ法に関しては、例えば「ＳＮＰ 遺伝子多型の戦略」(編集:中村祐輔、中山書店)ｐ．９４〜１０５の記載に従って行うことができる。
【００３２】
またプライマー伸長法に関しては、例えば「ＳＮＰ 遺伝子多型の戦略」（編集：中村祐輔、中山書店）ｐ．１０６〜１１７の記載に従って行なうことができる。
【００３３】
ＳＳＣＰ法に関しては、例えばBio Rad社のDCodeシステムを用いて、そのプロトコールに従って行なうことができる。
【００３４】
ＤＮＡチップを用いる方法に関しては、例えば「ＳＮＰ 遺伝子多型の戦略」（編集：中村祐輔、中山書店）ｐ．１２８〜１３５の記載に従って行なうことができる。その際、ＤＮＡチップに貼り付けるオリゴヌクレオチドプローブとしては、例えば、後述の多型の存在する塩基を含む５〜５０ヌクレオチドを用いることができる。
【００３５】
本発明において最も典型的、かつ、好適な手段として、例えば配列番号１又は２に示される塩基配列を含む領域を後述の増幅可能な遺伝子増幅用プライマーを用いて増幅し、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ）及びGeneAmp PCRシステム9700（アプライドバイオシステムズ）を用いて、定法に従って遺伝子増幅産物のＤＮＡ塩基配列をダイレクト・シーケンシング法により決定し、所望する配列の判別方法として用いる方法が挙げられる。
【００３６】
また、本発明の好熱性好酸性菌を識別する方法は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスが芽胞耐熱性の低い菌であるか、高い菌であるかを判定することを更に含むことができる。
【００３７】
具体的には、配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
の少なくとも１つの塩基が検出された場合、好熱性好酸性菌は、芽胞耐熱性の低い菌であると判定でき、下記（ｈ）〜（ｎ）：
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
の少なくとも１つの塩基が検出された場合、好熱性好酸性菌は、芽胞耐熱性の高い菌であると判定できる。
【００３８】
更に、本発明の好熱性好酸性菌を識別する方法は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスが芽胞耐熱性の低い菌株であるＩＡＭ１５０８７株、ＤＳＭ３９２２株、ＤＳＭ３９２３株及びＤＳＭ３９２４株のいずれかであるか、又は芽胞耐熱性の高い菌株であるＩＡＭ１５０８５株、ＩＡＭ１５０８６株及びＤＳＭ２４９８株のいずれかであるかを識別することを更に含むことができる。
【００３９】
例えば、配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
の少なくとも１つの塩基が検出された場合、好熱性好酸性菌は、芽胞耐熱性の低いＩＡＭ１５０８７株、ＤＳＭ３９２２株、ＤＳＭ３９２３株及びＤＳＭ３９２４株のいずれかであると識別でき、下記（ｈ）〜（ｎ）：
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
の少なくとも１つの塩基が検出された場合、好熱性好酸性菌は、芽胞耐熱性の高いＩＡＭ１５０８５株、ＩＡＭ１５０８６株及びＤＳＭ２４９８株のいずれかであると識別できる。
【００４０】
本発明は、上記多型部位を含む塩基配列断片を増幅する、１対のプライマーセットを含み、具体的に以下のものが挙げられる。
配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）：
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
から選ばれる少なくとも１つの塩基の５’側にある５〜５０塩基長の部分配列と、前記塩基の３’側にある５〜５０塩基長の部分配列に相補的な配列とからなる、前記塩基を含む塩基配列断片を増幅し得る１対のプライマーセット。
【００４１】
本発明のプライマーセットの設計は、(i)配列番号１又は２に示される塩基配列において、上記（１）〜（７）の少なくとも１つの多型部位の塩基の５’側にある５〜５０塩基長の連続した部分配列と、(ii)配列番号１又は２に示される塩基配列において、(i)で選択した多型部位の塩基の３’側にある５〜５０塩基長の連続した部分配列に相補的な配列とを、プライマーとしてセットにすればよい。
【００４２】
また、上記多型部位の塩基が２つ以上含まれる塩基配列断片を増幅するプライマーを設計する場合、上記(i)では、それらの塩基のうち一番５’側に存在する塩基の５’側の、５〜５０塩基長の連続した部分配列をプライマーとすればよく、上記(ii)では、それらの塩基のうち一番３’側に存在する塩基の３’側の、５〜５０塩基長の連続した部分配列に相補的な配列をプライマーとすればよい。
【００４３】
更に、上記少なくとも１つの多型部位の塩基を含む塩基配列断片を増幅するためのプライマー配列中に、他の多型部位の塩基を含んでいてもよい。
【００４４】
プライマーを構成する塩基の数は、５〜５０、好ましくは１０〜３０、更に好ましくは１４〜２５である。また、増幅させる塩基配列の長さは限定されない。プライマーを用いたＤＮＡの増幅は、公知の手法で行うことができる。
【００４５】
プライマーセットの配列の具体例としては、例えば
５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号３）と５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号４）、
５’−ＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＡＣＧＣＴＧＧ−３’（配列番号５）と５’−ＧＧＣＡＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＧＧＣ−３’（配列番号６）、
５’−ＧＣＧＴＧＣＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧ−３’（配列番号７）と５’−ＴＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴＣＴＣ−３’（配列番号８）、
５’−ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＡＣＧ−３’（配列番号９）と５’−ＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１０）
などが挙げられる。
【００４６】
なお、プライマーの塩基配列に上記多型部位の塩基が含まれる場合は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの上記多型、菌株又は萌芽耐熱性を識別するプローブとして用いてもよい。
【００４７】
本発明は、上記多型を判別し、好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの菌株を識別し、芽胞耐熱性を識別する、プローブとして用いられるオリゴヌクレオチド又はその標識物を含む。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチド又はその標識物は、具体的に以下のものが挙げられる。
配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）：
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物、
配列番号１又は２に示される塩基配列に相補的な配列において、下記（１）〜（７）
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
から選ばれる少なくとも１つの塩基に相補的な塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
【００４９】
上記オリゴヌクレオチド又はその標識物は、上記（１）〜（７）の多型部位の塩基の複数を含んでいてもよい。また、上記オリゴヌクレオチド又はその標識物を構成する塩基の数は５〜５０、好ましくは１０〜３０、更に好ましくは１５〜２５である。
【００５０】
上記オリゴヌクレオチド又はその標識物をプローブとして用いるハイブリダイゼーションアッセイは、公知の手法で行うことができる。
【００５１】
オリゴヌクレオチド又はその標識物の配列の具体例としては、例えば
５’−ＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＴ−３’（配列番号１１）、
５’−ＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号１２）、
５’−ＣＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１３）、
５’−ＧＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１４）
などが挙げられる。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成により作製することもできるし、上記プライマーを用いてＰＣＲ等により遺伝子を増幅させた増幅産物として作製することもできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、検出のために、例えば蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等で標識されていてもよい。標識に用いる標識物質は、公知のものを用い、公知の方法で標識することができる（Nature Biotechnology, 14, p303-308 (1996)参照）。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製 オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’-オリゴラベリングシステム等）。蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレセイン等が挙げられる。
【００５３】
なお、上記オリゴヌクレオチドは、任意に組合わせてプライマーとして用いることもできる。
【００５４】
更に、本発明は上記オリゴヌクレオチドを固定化した固定化基板を含む。オリゴヌクレオチドを固定化する基板としては、スライドガラス、ニトロセルロース膜、マイクロビーズ等種々のものを用いることができる。固定化基板上に複数のオリゴヌクレオチドを整列固定化した場合、該固定化基板は、ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドは基板上で合成してもよいし、また合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化してもよい。基板上への固定化は、例えば市販のスポッター（Amersham社製等）やアレイヤーを用いて行うことができ、オリゴヌクレオチドの固定化は吸着や共有結合を介した結合により行うことができ、共有結合を介した結合により固定化する場合は、基板表面及びオリゴヌクレオチドに共有結合用のアミノ基、ＳＨ基等の官能基を導入すればよい。
【００５５】
オリゴヌクレオチドを固定化した固定化基板を用いる上記配列の検出は公知の方法で行うことができる。
【００５６】
本発明の好熱性好酸性菌検出キットは、上記プライマーセット、上記オリゴヌクレオチド又はその標識物及び上記固定化基板の少なくとも１つを含む。本発明のキットは、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明の識別方法に必要な他の試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。
【００５７】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
A. acidoterrestris芽胞の調製
A. acidoterrestris保存菌株（ＩＡＭ１５０８５、ＩＡＭ１５０８６、ＩＡＭ１５０８７、ＤＳＭ２４９８、ＤＳＭ３９２２、ＤＳＭ３９２３、ＤＳＭ３９２４）をＹＳＧ平板培地（酵母エキス０．２％、グルコース０．１％、可溶性でんぷん０．２％、寒天１．５％、ｐＨ３．７）で４５℃で２日間培養した。平板培地上の菌体を滅菌水に懸濁し、新たなＹＳＧ平板培地に塗布し、４５℃で５日間培養した。平板上の菌体をかきとり、滅菌水に懸濁し、遠心分離後、上清を除去した。滅菌水に懸濁し、遠心分離後、上清を除去する操作を３回行い、ＰＢＳに懸濁した。
【００５９】
調製した芽胞の９５℃での耐熱性をスポア実験マニュアル（近藤雅臣と渡部一仁編集、技報堂出版）の５５〜５９ページに記載された方法に従って調べた。加熱処理した芽胞溶液をＹＳＧ平板培地培養し、生存芽胞を計数した。９５℃でのＤ値（ある温度において生存数を１０分の１に減少させるのに要する加熱時間、スポア実験マニュアル（近藤雅臣と渡部一仁編集、技報堂出版の５８〜５９ページ）を以下に示す。
ＩＡＭ１５０８７ ３．８５分
ＤＳＭ３９２２ ３．２０分
ＤＳＭ３９２３ ３．６６分
ＤＳＭ３９２４ ２．９２分
ＩＡＭ１５０８５ ８．４０分
ＩＡＭ１５０８６ ９．５６分
ＤＳＭ２４９８ ９．６０分
【００６０】
９５℃でのＤ値が３〜４分の菌株（ＩＡＭ１５０８７、ＤＳＭ３９２２、ＤＳＭ３９２３、ＤＳＭ３９２４）と、８〜１０分の菌株（ＩＡＭ１５０８５、ＩＡＭ１５０８６、ＤＳＭ２４９８）が見られた。
【実施例２】
【００６１】
A. acidoterrestris １６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の決定
A. acidoterrestris保存菌株（ＩＡＭ１５０８５、ＩＡＭ１５０８６、ＩＡＭ１５０８７、ＤＳＭ２４９８、ＤＳＭ３９２２、ＤＳＭ３９２３、ＤＳＭ３９２４）をＹＳＧ液体培地で４５℃、２４時間振とう培養した。培養液０．１ｍｌを遠心分離し、培養上清を除去した。得られた菌体からPrepManTMUltra Reagent（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００６２】
得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてA. acidoterrestris １６Ｓ ｒＤＮＡの５’上流約０．５ｋｂをＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲのためのプライマーとして２０Ｆ：５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号３）と５３１Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号４）、ＤＮＡポリメラーゼとしてEx-Taq（タカラバイオ社）を用いた。
【００６３】
ＰＣＲ条件は、９４℃３０秒間、５５℃６０秒間、７２℃３０秒間を３０サイクル繰り返した。High Pure PCR Product Purification Kit（ロッシュ社）を用いて、増幅ＤＮＡ断片を精製した。増幅ＤＮＡ断片を鋳型としてBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いてＤＮＡシーケンシング反応を行なった。
【００６４】
得られたＤＮＡ塩基配列を比較したところ、２種類の配列（前述の９５℃でのＤ値が３〜４分の菌株（ＩＡＭ１５０８７、ＤＳＭ３９２２、ＤＳＭ３９２３、ＤＳＭ３９２４）から得られる配列と８〜１０分の菌株（ＩＡＭ１５０８５、ＩＡＭ１５０８６、ＤＳＭ２４９８）から得られる配列）が得られた（図１）。
【００６５】
すなわち、配列番号１及び２の塩基番号６７の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＣ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＴであり、塩基番号６８の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＧ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＴであり、塩基番号７３の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＴ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＧであり、塩基番号１７５の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＣ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＧであり、１７６の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＴ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＣであり、塩基番号１９５の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＴ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＡであり、塩基番号２３９の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＡ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＧであった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の好熱性好酸性菌を識別する方法は、特に飲食品における検査、品質管理などに適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】A. acidoterrestris株のＤＮＡ塩基配列（配列番号１及び２の塩基番号１から塩基番号２７０）比較を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱性好酸性菌の識別方法、特に該菌の芽胞耐熱性の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好熱性好酸性菌は土壌や温泉等から分離され、好気的に高温・酸性下で増殖する芽胞形成細菌である。土壌等に存在する好熱性好酸性菌芽胞が果汁に混入した場合、その果汁を使用した飲料水や食品において、製造工程で加熱殺菌が行われていたとしても、菌の耐熱性芽胞が生き残り、製品中で発芽・増殖し、変敗事故を引き起こす可能性がある。
【０００３】
好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス属細菌は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris、以下、A. acidoterrestrisとも記載）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）等種々の菌種が分離されているが、そのうち異臭物質グアヤコールを生成するアリサイクロバチルス・アシドテレストリス菌が、汚染事故の原因菌として報告されており、問題視されている。
【０００４】
好熱性好酸性菌による汚染事故を未然に防ぐために、アリサイクロバチルス属細菌の検出方法が提案されてきた。例えば、選択培地（非特許文献１、２）が報告されているが、検査結果を得るまでに数日を必要とする他、詳細な菌種同定のためには生化学試験等が必要である。
【０００５】
そこで、近年、遺伝子解析的手法を用いた検出方法が提案されてきた。例えば、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の比較による方法（非特許文献３）、ＰＣＲ法を用いた方法（特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献４）、ＬＡＭＰ法を用いた方法（特許文献４、特許文献５）などである。
【０００６】
これらの方法で、試料中に好熱性好酸性菌、特にアリサイクロバチルス・アシドテレストリスが混入しているか否かを迅速且つ簡便に検出できるが、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの詳細な菌株、特に芽胞耐熱性を識別することは不可能であった。
【０００７】
芽胞耐熱性評価は、従来、培養による芽胞形成と耐熱性試験に依存してきた。しかし、これらの検査は時間がかかる、検査結果が培養条件等の影響を受けやすい、などの問題があった。
【０００８】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ０１／６８９１４号
【特許文献２】特開平１１−１３７２５９号
【特許文献３】特開２００５−４６０３５号
【特許文献４】特開２００５−１１０５８７号
【特許文献５】特開２００６−８７４０７号
【非特許文献１】G.Deinhard et al., System. Appl. Microbiol., 10, 47-53, 1987
【非特許文献２】B.Hippchen et al., Arch. Microbiol., 129, 53-55, 1981
【非特許文献３】K.Goto et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 48, 243-250, 2002
【非特許文献４】K.Yamazaki et al., Lett. Appl. Microbiol., 23, 350-354, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
好熱性好酸性菌の識別、その菌株の識別、特に芽胞耐熱性の識別は、酸性飲料の変敗事故を未然に防止する上で欠かせない技術である。本発明は、好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス・アシドテレストリス菌株の芽胞耐熱性を迅速かつ簡便に識別する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス・アシドテレストリスにおいて芽胞耐熱性が高い菌株と低い菌株が存在することを見出した。更にアリサイクロバチルス・アシドテレストリスの１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列について、５箇所・７塩基の相違を見出し、検出された配列に基づいて前記アリサイクロバチルス・アシドテレストリス菌株の芽胞耐熱性を識別することに成功した。本発明はこの成果に基づいて完成された。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕配列番号１又は２に示される塩基配列における、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子多型を検出することを含む、試料中の好熱性好酸性菌を識別する方法。
（１）塩基番号６７の塩基がＣ若しくはＴである遺伝子多型
（２）塩基番号６８の塩基がＧ若しくはＴである遺伝子多型
（３）塩基番号７３の塩基がＴ若しくはＧである遺伝子多型
（４）塩基番号１７５の塩基がＣ若しくはＧである遺伝子多型
（５）塩基番号１７６の塩基がＴ若しくはＣである遺伝子多型
（６）塩基番号１９５の塩基がＴ若しくはＡである遺伝子多型
（７）塩基番号２３９の塩基がＡ若しくはＧである遺伝子多型
【００１２】
〔２〕前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌が芽胞耐熱性の低い菌であると判定することを更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
【００１３】
〔４〕下記（ｈ）〜（ｎ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌が芽胞耐熱性の高い菌であると判定することを更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
【００１４】
〔５〕下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスＩＡＭ１５０８７株、ＤＳＭ３９２２株、ＤＳＭ３９２３株及びＤＳＭ３９２４株のいずれかであると識別することを更に含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
【００１５】
〔６〕下記（ｈ）〜（ｎ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスＩＡＭ１５０８５株、ＩＡＭ１５０８６株及びＤＳＭ２４９８株のいずれかであると識別することを更に含む、〔１〕、〔２〕及び〔４〕のいずれかに記載の方法。
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
【００１６】
〔７〕配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基の５’側にある５〜５０塩基長の部分配列と、前記塩基の３’側にある５〜５０塩基長の部分配列に相補的な配列とからなる、前記塩基を含む塩基配列断片を増幅し得る１対のプライマーセット。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【００１７】
〔８〕配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【００１８】
〔９〕配列番号１又は２に示される塩基配列に相補的な配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基に相補的な塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【００１９】
〔１０〕〔８〕又は〔９〕に記載のオリゴヌクレオチドを固定化した固定化基板。
〔１１〕〔７〕に記載のプライマーセット、〔８〕若しくは〔９〕に記載のオリゴヌクレオチド又はその標識物及び〔１０〕に記載の固定化基板の少なくとも１つを含む、好熱性好酸性菌検出キット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、好熱性好酸性菌、特にアリサイクロバチルス・アシドテレストリスの検出、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス菌株の識別、更に芽胞耐熱性の識別を、迅速、簡便かつ高精度に行なうことを可能にする。本発明によれば、煩雑で不正確な耐熱性試験を行なわずにして、芽胞耐熱性の識別が可能となる。
【００２１】
更に本発明によれば、特に、酸性飲料の生産において適切な殺菌条件を設定することにより変敗事故を未然に防止することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の好熱性好酸性菌を識別する方法は、試料中の好熱性好酸性菌の遺伝子の塩基配列、具体的には１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を判別して、好熱性好酸性菌のアリサイクロバチルス・アシドテレストリスを識別し、更にその菌株及び芽胞耐熱性を識別する方法である。
【００２３】
本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）、及び連続した複数ヌクレオチドにわたる多型、の両方を含むものとする。すなわち、ある塩基配列を基準として、該塩基配列の１又は複数の特定部位に、１又は複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異を「遺伝子多型」とする。
【００２４】
「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含むものとする。従って、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｃＲＮＡの全てが含まれる。
【００２５】
配列表の塩基配列はすべてＤＮＡ配列として記載し、それにより特定される塩基配列及びオリゴヌクレオチドはＤＮＡで示されるが、配列表の塩基配列をＲＮＡに読み替えた場合も本発明に含まれる。従って、配列表の塩基配列、それにより特定される塩基配列及びオリゴヌクレオチドがＲＮＡを示す場合は、配列表中の塩基記号「ｔ」を「ｕ」に読み替えるものとする。
【００２６】
また、配列の検出若しくは判別とは、識別、分類を行う好熱性好酸性菌の核酸について、多型を有する配列を検出することをいい、また、多型部位の塩基を検出、判定することでもある。更に、該配列に相補的な配列において、多型を有する配列を検出し、多型部位の塩基を検出、判定することも含む。
【００２７】
試料とは、好適には、好熱性好酸性菌細胞の遺伝子を含む試料をいう。好熱性好酸性菌細胞からの遺伝子を含む試料の調製は、例えば、通常公知の核酸の抽出・精製方法（例えば、Sambrook, J. et al. (1989)：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)” Cold Spring Harbor Laboratory, NY）に従って行なうことが可能である。例えば、核酸を含む溶液にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノム核酸を得る。また、市販の核酸の抽出・精製キットを用いて、遺伝子を含む試料の調製を行なうことも可能である。
【００２８】
本発明において利用される好熱性好酸性菌の遺伝子多型は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の、配列番号１と２に示された塩基配列における塩基の違いであって、具体的には下記（１）〜（７）である。本発明では、このうち少なくとも１つの多型を検出する。
（１）塩基番号６７の塩基がＣ若しくはＴである遺伝子多型
（２）塩基番号６８の塩基がＧ若しくはＴである遺伝子多型
（３）塩基番号７３の塩基がＴ若しくはＧである遺伝子多型
（４）塩基番号１７５の塩基がＣ若しくはＧである遺伝子多型
（５）塩基番号１７６の塩基がＴ若しくはＣである遺伝子多型
（６）塩基番号１９５の塩基がＴ若しくはＡである遺伝子多型
（７）塩基番号２３９の塩基がＡ若しくはＧである遺伝子多型
【００２９】
上記（１）〜（７）は、多型の存在に感受性が認められる手段を駆使することにより得ることができる。具体的には、ダイレクト・シーケンシング法（Biotechniques, 11, 246-249 (1991)）、ＤＨＰＬＣ（Denaturing High Performance Liquid Chromatography）法（Underhill, P.A. et al., Genome Res. 7:996-1005 (1997)）、Surveyor Nucleaseを用いる方法（Qui P, et al., Biotechniques, 2004 Apr;36(4);702-7）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Science, 5109, 778-783(1993), J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999), Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)）、プライマー伸長法（米国特許第６，２１０，８８４号、同第６，１８３，９６０号、Lizardi, P. M. et al., Nature Genet., 19, 225-232 (1998); Piated, A. S. et al., Nature Biotech., 16, 359-363 (1998)）、ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism)法（Biotechniques, 16,296-297 (1994), Biotechniques, 21, 510-514 (1996)）、ＤＮＡチップを用いる方法、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法（Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)）、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法（Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991), Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法（Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)）、ＲＮａｓｅＡ切断法（DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)）、化学切断法（Biotechniques, 21, 216-218 (1996)）、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法（Genome Res., 8, 549-556 (1998)）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法（Genome Res., 7, 378-388 (1997), Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)）、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)）、モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法（Nat. Biotechnol.，1, p49-53 (1998)、遺伝子医学、4, p46-48(2000)）、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法(Dynamic Allele-Specific Hybridization(DASH))法（Nat. Biotechnol.，1, p87-88, (1999)、遺伝子医学, 4, p47-48 (2000)）、パドロック・プローブ(Padlock Probe)法（Nat. Genet., 3, p225-232 (1998)、遺伝子医学, 4, p50-51 (2000)）、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ（Electrochemical Array）法（Anal. Chem., 72, p1334-1341, 2000）等を例示することができる。
【００３０】
例えば、ＤＨＰＬＣ法及びSurveyor Nucleaseを用いる方法については、Transgenomic社(USA)の製品を用い、そのプロトコールに従って行なうことができる。
【００３１】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法及びＩｎｖａｄｅｒ法に関しては、例えば「ＳＮＰ 遺伝子多型の戦略」(編集:中村祐輔、中山書店)ｐ．９４〜１０５の記載に従って行うことができる。
【００３２】
またプライマー伸長法に関しては、例えば「ＳＮＰ 遺伝子多型の戦略」（編集：中村祐輔、中山書店）ｐ．１０６〜１１７の記載に従って行なうことができる。
【００３３】
ＳＳＣＰ法に関しては、例えばBio Rad社のDCodeシステムを用いて、そのプロトコールに従って行なうことができる。
【００３４】
ＤＮＡチップを用いる方法に関しては、例えば「ＳＮＰ 遺伝子多型の戦略」（編集：中村祐輔、中山書店）ｐ．１２８〜１３５の記載に従って行なうことができる。その際、ＤＮＡチップに貼り付けるオリゴヌクレオチドプローブとしては、例えば、後述の多型の存在する塩基を含む５〜５０ヌクレオチドを用いることができる。
【００３５】
本発明において最も典型的、かつ、好適な手段として、例えば配列番号１又は２に示される塩基配列を含む領域を後述の増幅可能な遺伝子増幅用プライマーを用いて増幅し、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ）及びGeneAmp PCRシステム9700（アプライドバイオシステムズ）を用いて、定法に従って遺伝子増幅産物のＤＮＡ塩基配列をダイレクト・シーケンシング法により決定し、所望する配列の判別方法として用いる方法が挙げられる。
【００３６】
また、本発明の好熱性好酸性菌を識別する方法は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスが芽胞耐熱性の低い菌であるか、高い菌であるかを判定することを更に含むことができる。
【００３７】
具体的には、配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
の少なくとも１つの塩基が検出された場合、好熱性好酸性菌は、芽胞耐熱性の低い菌であると判定でき、下記（ｈ）〜（ｎ）：
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
の少なくとも１つの塩基が検出された場合、好熱性好酸性菌は、芽胞耐熱性の高い菌であると判定できる。
【００３８】
更に、本発明の好熱性好酸性菌を識別する方法は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスが芽胞耐熱性の低い菌株であるＩＡＭ１５０８７株、ＤＳＭ３９２２株、ＤＳＭ３９２３株及びＤＳＭ３９２４株のいずれかであるか、又は芽胞耐熱性の高い菌株であるＩＡＭ１５０８５株、ＩＡＭ１５０８６株及びＤＳＭ２４９８株のいずれかであるかを識別することを更に含むことができる。
【００３９】
例えば、配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
の少なくとも１つの塩基が検出された場合、好熱性好酸性菌は、芽胞耐熱性の低いＩＡＭ１５０８７株、ＤＳＭ３９２２株、ＤＳＭ３９２３株及びＤＳＭ３９２４株のいずれかであると識別でき、下記（ｈ）〜（ｎ）：
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
の少なくとも１つの塩基が検出された場合、好熱性好酸性菌は、芽胞耐熱性の高いＩＡＭ１５０８５株、ＩＡＭ１５０８６株及びＤＳＭ２４９８株のいずれかであると識別できる。
【００４０】
本発明は、上記多型部位を含む塩基配列断片を増幅する、１対のプライマーセットを含み、具体的に以下のものが挙げられる。
配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）：
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
から選ばれる少なくとも１つの塩基の５’側にある５〜５０塩基長の部分配列と、前記塩基の３’側にある５〜５０塩基長の部分配列に相補的な配列とからなる、前記塩基を含む塩基配列断片を増幅し得る１対のプライマーセット。
【００４１】
本発明のプライマーセットの設計は、(i)配列番号１又は２に示される塩基配列において、上記（１）〜（７）の少なくとも１つの多型部位の塩基の５’側にある５〜５０塩基長の連続した部分配列と、(ii)配列番号１又は２に示される塩基配列において、(i)で選択した多型部位の塩基の３’側にある５〜５０塩基長の連続した部分配列に相補的な配列とを、プライマーとしてセットにすればよい。
【００４２】
また、上記多型部位の塩基が２つ以上含まれる塩基配列断片を増幅するプライマーを設計する場合、上記(i)では、それらの塩基のうち一番５’側に存在する塩基の５’側の、５〜５０塩基長の連続した部分配列をプライマーとすればよく、上記(ii)では、それらの塩基のうち一番３’側に存在する塩基の３’側の、５〜５０塩基長の連続した部分配列に相補的な配列をプライマーとすればよい。
【００４３】
更に、上記少なくとも１つの多型部位の塩基を含む塩基配列断片を増幅するためのプライマー配列中に、他の多型部位の塩基を含んでいてもよい。
【００４４】
プライマーを構成する塩基の数は、５〜５０、好ましくは１０〜３０、更に好ましくは１４〜２５である。また、増幅させる塩基配列の長さは限定されない。プライマーを用いたＤＮＡの増幅は、公知の手法で行うことができる。
【００４５】
プライマーセットの配列の具体例としては、例えば
５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号３）と５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号４）、
５’−ＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＡＣＧＣＴＧＧ−３’（配列番号５）と５’−ＧＧＣＡＣＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＧＧＧＧＣ−３’（配列番号６）、
５’−ＧＣＧＴＧＣＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧ−３’（配列番号７）と５’−ＴＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴＣＴＣ−３’（配列番号８）、
５’−ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＡＣＧ−３’（配列番号９）と５’−ＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号１０）
などが挙げられる。
【００４６】
なお、プライマーの塩基配列に上記多型部位の塩基が含まれる場合は、アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの上記多型、菌株又は萌芽耐熱性を識別するプローブとして用いてもよい。
【００４７】
本発明は、上記多型を判別し、好熱性好酸性菌アリサイクロバチルス・アシドテレストリスの菌株を識別し、芽胞耐熱性を識別する、プローブとして用いられるオリゴヌクレオチド又はその標識物を含む。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチド又はその標識物は、具体的に以下のものが挙げられる。
配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）：
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物、
配列番号１又は２に示される塩基配列に相補的な配列において、下記（１）〜（７）
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
から選ばれる少なくとも１つの塩基に相補的な塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
【００４９】
上記オリゴヌクレオチド又はその標識物は、上記（１）〜（７）の多型部位の塩基の複数を含んでいてもよい。また、上記オリゴヌクレオチド又はその標識物を構成する塩基の数は５〜５０、好ましくは１０〜３０、更に好ましくは１５〜２５である。
【００５０】
上記オリゴヌクレオチド又はその標識物をプローブとして用いるハイブリダイゼーションアッセイは、公知の手法で行うことができる。
【００５１】
オリゴヌクレオチド又はその標識物の配列の具体例としては、例えば
５’−ＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＴ−３’（配列番号１１）、
５’−ＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号１２）、
５’−ＣＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１３）、
５’−ＧＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１４）
などが挙げられる。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成により作製することもできるし、上記プライマーを用いてＰＣＲ等により遺伝子を増幅させた増幅産物として作製することもできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、検出のために、例えば蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等で標識されていてもよい。標識に用いる標識物質は、公知のものを用い、公知の方法で標識することができる（Nature Biotechnology, 14, p303-308 (1996)参照）。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製 オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’-オリゴラベリングシステム等）。蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレセイン等が挙げられる。
【００５３】
なお、上記オリゴヌクレオチドは、任意に組合わせてプライマーとして用いることもできる。
【００５４】
更に、本発明は上記オリゴヌクレオチドを固定化した固定化基板を含む。オリゴヌクレオチドを固定化する基板としては、スライドガラス、ニトロセルロース膜、マイクロビーズ等種々のものを用いることができる。固定化基板上に複数のオリゴヌクレオチドを整列固定化した場合、該固定化基板は、ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップとして用いることができる。また、オリゴヌクレオチドは基板上で合成してもよいし、また合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化してもよい。基板上への固定化は、例えば市販のスポッター（Amersham社製等）やアレイヤーを用いて行うことができ、オリゴヌクレオチドの固定化は吸着や共有結合を介した結合により行うことができ、共有結合を介した結合により固定化する場合は、基板表面及びオリゴヌクレオチドに共有結合用のアミノ基、ＳＨ基等の官能基を導入すればよい。
【００５５】
オリゴヌクレオチドを固定化した固定化基板を用いる上記配列の検出は公知の方法で行うことができる。
【００５６】
本発明の好熱性好酸性菌検出キットは、上記プライマーセット、上記オリゴヌクレオチド又はその標識物及び上記固定化基板の少なくとも１つを含む。本発明のキットは、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明の識別方法に必要な他の試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。
【００５７】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
A. acidoterrestris芽胞の調製
A. acidoterrestris保存菌株（ＩＡＭ１５０８５、ＩＡＭ１５０８６、ＩＡＭ１５０８７、ＤＳＭ２４９８、ＤＳＭ３９２２、ＤＳＭ３９２３、ＤＳＭ３９２４）をＹＳＧ平板培地（酵母エキス０．２％、グルコース０．１％、可溶性でんぷん０．２％、寒天１．５％、ｐＨ３．７）で４５℃で２日間培養した。平板培地上の菌体を滅菌水に懸濁し、新たなＹＳＧ平板培地に塗布し、４５℃で５日間培養した。平板上の菌体をかきとり、滅菌水に懸濁し、遠心分離後、上清を除去した。滅菌水に懸濁し、遠心分離後、上清を除去する操作を３回行い、ＰＢＳに懸濁した。
【００５９】
調製した芽胞の９５℃での耐熱性をスポア実験マニュアル（近藤雅臣と渡部一仁編集、技報堂出版）の５５〜５９ページに記載された方法に従って調べた。加熱処理した芽胞溶液をＹＳＧ平板培地培養し、生存芽胞を計数した。９５℃でのＤ値（ある温度において生存数を１０分の１に減少させるのに要する加熱時間、スポア実験マニュアル（近藤雅臣と渡部一仁編集、技報堂出版の５８〜５９ページ）を以下に示す。
ＩＡＭ１５０８７ ３．８５分
ＤＳＭ３９２２ ３．２０分
ＤＳＭ３９２３ ３．６６分
ＤＳＭ３９２４ ２．９２分
ＩＡＭ１５０８５ ８．４０分
ＩＡＭ１５０８６ ９．５６分
ＤＳＭ２４９８ ９．６０分
【００６０】
９５℃でのＤ値が３〜４分の菌株（ＩＡＭ１５０８７、ＤＳＭ３９２２、ＤＳＭ３９２３、ＤＳＭ３９２４）と、８〜１０分の菌株（ＩＡＭ１５０８５、ＩＡＭ１５０８６、ＤＳＭ２４９８）が見られた。
【実施例２】
【００６１】
A. acidoterrestris １６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の決定
A. acidoterrestris保存菌株（ＩＡＭ１５０８５、ＩＡＭ１５０８６、ＩＡＭ１５０８７、ＤＳＭ２４９８、ＤＳＭ３９２２、ＤＳＭ３９２３、ＤＳＭ３９２４）をＹＳＧ液体培地で４５℃、２４時間振とう培養した。培養液０．１ｍｌを遠心分離し、培養上清を除去した。得られた菌体からPrepManTMUltra Reagent（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００６２】
得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてA. acidoterrestris １６Ｓ ｒＤＮＡの５’上流約０．５ｋｂをＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲのためのプライマーとして２０Ｆ：５’−ＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号３）と５３１Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号４）、ＤＮＡポリメラーゼとしてEx-Taq（タカラバイオ社）を用いた。
【００６３】
ＰＣＲ条件は、９４℃３０秒間、５５℃６０秒間、７２℃３０秒間を３０サイクル繰り返した。High Pure PCR Product Purification Kit（ロッシュ社）を用いて、増幅ＤＮＡ断片を精製した。増幅ＤＮＡ断片を鋳型としてBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いてＤＮＡシーケンシング反応を行なった。
【００６４】
得られたＤＮＡ塩基配列を比較したところ、２種類の配列（前述の９５℃でのＤ値が３〜４分の菌株（ＩＡＭ１５０８７、ＤＳＭ３９２２、ＤＳＭ３９２３、ＤＳＭ３９２４）から得られる配列と８〜１０分の菌株（ＩＡＭ１５０８５、ＩＡＭ１５０８６、ＤＳＭ２４９８）から得られる配列）が得られた（図１）。
【００６５】
すなわち、配列番号１及び２の塩基番号６７の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＣ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＴであり、塩基番号６８の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＧ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＴであり、塩基番号７３の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＴ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＧであり、塩基番号１７５の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＣ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＧであり、１７６の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＴ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＣであり、塩基番号１９５の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＴ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＡであり、塩基番号２３９の位置に存在する塩基が芽胞耐熱性の低い菌株ではＡ、芽胞耐熱性の高い菌株ではＧであった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の好熱性好酸性菌を識別する方法は、特に飲食品における検査、品質管理などに適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】A. acidoterrestris株のＤＮＡ塩基配列（配列番号１及び２の塩基番号１から塩基番号２７０）比較を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２に示される塩基配列における、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子多型を検出することを含む、試料中の好熱性好酸性菌を識別する方法。
（１）塩基番号６７の塩基がＣ若しくはＴである遺伝子多型
（２）塩基番号６８の塩基がＧ若しくはＴである遺伝子多型
（３）塩基番号７３の塩基がＴ若しくはＧである遺伝子多型
（４）塩基番号１７５の塩基がＣ若しくはＧである遺伝子多型
（５）塩基番号１７６の塩基がＴ若しくはＣである遺伝子多型
（６）塩基番号１９５の塩基がＴ若しくはＡである遺伝子多型
（７）塩基番号２３９の塩基がＡ若しくはＧである遺伝子多型
【請求項２】
前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌が芽胞耐熱性の低い菌であると判定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
【請求項４】
下記（ｈ）〜（ｎ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌が芽胞耐熱性の高い菌であると判定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスＩＡＭ１５０８７株、ＤＳＭ３９２２株、ＤＳＭ３９２３株及びＤＳＭ３９２４株のいずれかであると識別することを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
【請求項６】
下記（ｈ）〜（ｎ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスＩＡＭ１５０８５株、ＩＡＭ１５０８６株及びＤＳＭ２４９８株のいずれかであると識別することを更に含む、請求項１、２及び４のいずれか１項に記載の方法。
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
【請求項７】
配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基の５’側にある５〜５０塩基長の部分配列と、前記塩基の３’側にある５〜５０塩基長の部分配列に相補的な配列とからなる、前記塩基を含む塩基配列断片を増幅し得る１対のプライマーセット。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【請求項８】
配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【請求項９】
配列番号１又は２に示される塩基配列に相補的な配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基に相補的な塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のオリゴヌクレオチドを固定化した固定化基板。
【請求項１１】
請求項７に記載のプライマーセット、請求項８若しくは９に記載のオリゴヌクレオチド又はその標識物及び請求項１０に記載の固定化基板の少なくとも１つを含む、好熱性好酸性菌検出キット。
【請求項１】
配列番号１又は２に示される塩基配列における、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子多型を検出することを含む、試料中の好熱性好酸性菌を識別する方法。
（１）塩基番号６７の塩基がＣ若しくはＴである遺伝子多型
（２）塩基番号６８の塩基がＧ若しくはＴである遺伝子多型
（３）塩基番号７３の塩基がＴ若しくはＧである遺伝子多型
（４）塩基番号１７５の塩基がＣ若しくはＧである遺伝子多型
（５）塩基番号１７６の塩基がＴ若しくはＣである遺伝子多型
（６）塩基番号１９５の塩基がＴ若しくはＡである遺伝子多型
（７）塩基番号２３９の塩基がＡ若しくはＧである遺伝子多型
【請求項２】
前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌が芽胞耐熱性の低い菌であると判定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
【請求項４】
下記（ｈ）〜（ｎ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌が芽胞耐熱性の高い菌であると判定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｇ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスＩＡＭ１５０８７株、ＤＳＭ３９２２株、ＤＳＭ３９２３株及びＤＳＭ３９２４株のいずれかであると識別することを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）塩基番号６７の塩基がＣ
（ｂ）塩基番号６８の塩基がＧ
（ｃ）塩基番号７３の塩基がＴ
（ｄ）塩基番号１７５の塩基がＣ
（ｅ）塩基番号１７６の塩基がＴ
（ｆ）塩基番号１９５の塩基がＴ
（ｇ）塩基番号２３９の塩基がＡ
【請求項６】
下記（ｈ）〜（ｎ）から選ばれる少なくとも１つの塩基が検出された場合に、前記好熱性好酸性菌がアリサイクロバチルス・アシドテレストリスＩＡＭ１５０８５株、ＩＡＭ１５０８６株及びＤＳＭ２４９８株のいずれかであると識別することを更に含む、請求項１、２及び４のいずれか１項に記載の方法。
（ｈ）塩基番号６７の塩基がＴ
（ｉ）塩基番号６８の塩基がＴ
（ｊ）塩基番号７３の塩基がＧ
（ｋ）塩基番号１７５の塩基がＧ
（ｌ）塩基番号１７６の塩基がＣ
（ｍ）塩基番号１９５の塩基がＡ
（ｎ）塩基番号２３９の塩基がＧ
【請求項７】
配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基の５’側にある５〜５０塩基長の部分配列と、前記塩基の３’側にある５〜５０塩基長の部分配列に相補的な配列とからなる、前記塩基を含む塩基配列断片を増幅し得る１対のプライマーセット。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【請求項８】
配列番号１又は２に示される塩基配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【請求項９】
配列番号１又は２に示される塩基配列に相補的な配列において、下記（１）〜（７）から選ばれる少なくとも１つの塩基に相補的な塩基を含む５〜５０塩基長の部分配列からなる、オリゴヌクレオチド又はその標識物。
（１）配列番号１又は２の塩基番号６７の塩基
（２）配列番号１又は２の塩基番号６８の塩基
（３）配列番号１又は２の塩基番号７３の塩基
（４）配列番号１又は２の塩基番号１７５の塩基
（５）配列番号１又は２の塩基番号１７６の塩基
（６）配列番号１又は２の塩基番号１９５の塩基
（７）配列番号１又は２の塩基番号２３９の塩基
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のオリゴヌクレオチドを固定化した固定化基板。
【請求項１１】
請求項７に記載のプライマーセット、請求項８若しくは９に記載のオリゴヌクレオチド又はその標識物及び請求項１０に記載の固定化基板の少なくとも１つを含む、好熱性好酸性菌検出キット。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２８９３６５（Ｐ２００８−２８９３６５Ａ）
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３４８６９（Ｐ２００７−１３４８６９）
【出願日】平成１９年５月２２日（２００７．５．２２）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【出願人】（３９１０５８３８１）キリンビバレッジ株式会社 (94)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２２日（２００７．５．２２）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【出願人】（３９１０５８３８１）キリンビバレッジ株式会社 (94)
【Ｆターム（参考）】
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