子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法
【課題】子宮体部類内膜腺癌の術後判定について、高精度で、かつ特異性の高い癌の予後判定法を提供する。
【解決手段】癌組織において、扁平上皮癌の腫瘍マーカーとしてよく知られているＳＣＣ抗原に結合する分子カルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体を用いた免疫組織染色法により測定し、得られた発現パターンをスコア化し、陰性であるか、弱陽性である場合を、予後不良と判定することを特徴とする子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法を提供する。
【解決手段】癌組織において、扁平上皮癌の腫瘍マーカーとしてよく知られているＳＣＣ抗原に結合する分子カルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体を用いた免疫組織染色法により測定し、得られた発現パターンをスコア化し、陰性であるか、弱陽性である場合を、予後不良と判定することを特徴とする子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮体部類内膜腺癌の予後を判定する方法に関し、詳しくは、特異的な腫瘍マーカーが存在しない子宮体部類内膜腺癌組織におけるカルボニルレダクターゼ（ｃａｒｂｏｎｙｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＣＲ）の発現状況をスコア化することにより、子宮体部類内膜腺癌の予後を判定する方法に関する。さらにまた、ＣＲと特異的に結合する抗体、当該抗体を作製するためのペプチド、当該抗体を用いてＣＲを検出するための検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年わが国では、子宮体癌が急激に増加している。欧米において、子宮体癌は最も頻度が高い婦人科悪性腫瘍であり、女性の悪性腫瘍の中では、乳癌、肺癌、大腸癌に次いで4番目の発症率である。日本においては子宮体癌のさらなる増加が危惧されている。実際、子宮体癌の人口１０万対の罹患率は、１９７５年と１９９８年を比較すると１．４から４．５に増加していると報告されている。増加原因としては食生活の欧米化による肥満傾向、晩婚化、少子化等が挙げられている。このような状況の中で、子宮体癌の臨床的な重要性はますます高くなると考えられている。
【０００３】
子宮体癌を検出するための腫瘍マーカーとして、現在よく知られているものは、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ等があげられる。しかしながら、検出を表す陽性率はＣＡ１２５では２１．１〜４３．０％、ＣＡ１９−９では２４．０〜３１．０％、ＣＡ７２−４では２１．４〜３３．３％であり、ＣＥＡでは２．１〜１４％と低い（非特許文献１）。このように、子宮体癌に対する特異性の高い腫瘍マーカーは存在しているとは言い難い。
【０００４】
また、子宮体癌は根治手術を行い、摘出した臓器の病理組織学的検索の結果から、予後予測を行っているのが現状である。従って、術後の化学療法や放射線療法等の補助療法の必要性については摘出手術をするまでは判断できない。不要な治療を受ける患者数を減らし得るような、癌の予後を予測して判定する方法が望まれている。
【０００５】
これまで、癌の予後を判定する方法について、いくつかの報告がある。膀胱癌の予後に関しては、尿中に存在する細胞の中心体複製異常の有無の検出による判定方法が明らかにされており（特許文献１）、メラノーマ又は肺癌の発症や進行については、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ：ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：活性化白血球接着分子）を血液中から検出し、この検出結果に応じて予後の状況を判定する方法が開示されている（特許文献２）。また、乳癌、肺癌、前立腺癌、または胃癌等の癌から骨転移のリスクが高いと予測する方法として、尿や癌細胞中のγ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）レベルを測定し、該γ−ＧＴＰレベルが設定値より高い場合に、骨転移のリスクが高いと予測する方法が開示されている（特許文献３）。食道扁平上皮癌に関しては、特定の染色体の特異的な構造変化を検出する方法による予後の診断方法が開示されている（特許文献４）。本発明者らは、先に、子宮頸部扁平上皮癌のＩ・ＩＩ期に関して、原発部位のＣＲの免疫組織染色による発現パターンを分類し、予後の判定方法を明らかにした（特許文献５）。
【０００６】
ＣＲについては、ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究で、高転移能を有する細胞では、発現が低下すること、過剰発現によって、転移能は低下することが報告されている（非特許文献２）。このことから、ＣＲは癌の悪性度や転移に関与することが推察されるが、子宮体癌の大部分を占める子宮体部類内膜腺癌患者の予後判定方法を開示した知見はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２７５９８９号公報(表２)
【特許文献２】特許第３７７９２９４号公報（図２）
【特許文献３】特開２００６−１５３４９９号公報（図２）
【特許文献４】特開２００２−２７２４９７号公報（表２、３）
【特許文献５】特開２００８−１８２９８７号公報（図６〜８、表２）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】村上 明弘 他 女性外来診療マニュアル 産婦人科と腫瘍マーカー 産婦人科治療 ９４：６１９−６２３，２００７
【非特許文献２】Ｉｓｍａｉｌ，Ｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：１１７３−１１７６，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
子宮体部類内膜腺癌については、癌の予後を予測して、不要な治療を受ける患者数を減らし得るような術後判定の方法は知られていない。本発明は、高精度で、かつ特異性の高い癌の予後判定法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＣＲは、扁平上皮癌の腫瘍マーカーとしてよく知られているＳＣＣ抗原に結合する分子であることが、本発明者らにより見出されている（Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ３４： １３９５−１４００， ２０１０）。ＣＲの発現パターンは、癌組織において同一ではなく、発現が強い細胞と弱い細胞が存在する。さらに、原発組織におけるＣＲの免疫組織染色では、発現が低下している症例では予後不良の結果となった。本発明者らは、その点に着眼して、発現パターンと子宮体部類内膜癌の予後の密接な関連を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）を提供する。
【００１２】
（１）癌の予後を判定する方法であって、癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを指標とする子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法。
【００１３】
（２）癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、染色強度と染色陽性細胞の割合でスコア化し、陰性であるか、弱陽性である場合を、予後不良と判定することを特徴とする上記（１）に記載の予後判定方法。
【００１４】
（３）癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する下記のいずれかのペプチドを基に得られた抗体を用い、免疫組織染色法により測定することを特徴とする上記（１）または（２）のいずれかに記載の予後判定方法。
（ａ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１５】
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体、免疫組織染色用の試薬および器具類を含有する予後判定用キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、癌の予後判定法、特に子宮体部類内膜腺癌の高精度かつ高特異度の予後判定法を提供することができ、さらに、簡便に判定するための判定用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】正常子宮内膜で強く発現するＣＲの局在についての検出を示す図である。
【図２】正常子宮内膜で性周期の変化における変化免疫組織染色によるＣＲの発現パターンを示す図である（Ａ，Ｂ；増殖期、Ｃ，Ｄ；分泌期）。
【図３】子宮体部類内膜腺癌における免疫組織染色によるＣＲの発現パターンで、陰性の検出結果を示す図である。
【図４】子宮体部類内膜腺癌における免疫組織染色によるＣＲの発現パターンで、弱陽性の検出結果を示す図である。
【図５】子宮体部類内膜腺癌における免疫組織染色によるＣＲの発現パターンで、強陽性の検出結果を示す図である。
【図６】子宮体部類内膜腺癌における進行期別のＣＲの発現パターンを示す図である。
【図７】子宮体部類内膜腺癌患者におけるＣＲ染色スコア別のＰＦＳを示す図である（Ａ；強陽性、弱陽性、陰性の３群で検討、Ｂ；強陽性、弱陽性＋陰性の２群で検討）。
【図８】子宮体部類内膜腺癌患者におけるＣＲ染色スコア別のＯＳを示す図である（Ａ；強陽性、弱陽性、陰性の３群で検討、Ｂ；強陽性、弱陽性＋陰性の２群で検討）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
子宮体癌のうち、組織学的に最も頻度多くみられるのが、子宮体部類内膜腺癌である。本発明は、子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法であり、判定に用いるためのペプチドを作製し、該ペプチドに対する抗体を作製する。次いで、該抗体を用いて癌組織内のＣＲの発現パターンを測定し、癌組織内のＣＲの発現パターンを解析することにより、癌の予後を判定するものである。
【００１９】
ＣＲは、ヒトの脳より精製され、分子量が約３０ｋＤａの分子で、２７７のアミノ酸からなる（Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｂ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６：１２０６−１２１３，１９８１、Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｂ．ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：１６１８５−１６１８８，１９８８）。その遺伝子は２１番染色体長腕２２．１２に位置し、マウスの遺伝子とは８２％の相同性を持つことが明らかにされている（Ｆｏｒｒｅｓｔ，ＧＬ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０４８：１４９−１５５，１９９０）。ＣＲは、カルボニル化合物を基質とする細胞質に局在しているＮＡＤＰＨ依存性の酵素である。脳ではプロスタグランジンやステロイドの還元を触媒する作用を有すること、また、肝臓では解毒作用に関与することが知られている。
【００２０】
ＣＲの遺伝子に関する情報は、ヒトＣＲとして公知であり、ＮＣＢＩの遺伝子データベースにおいて、アクセッションナンバーＪ０４０５６として登録されている。それによると、配列表の配列番号１に示すＤＮＡとアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがわかる。
【００２１】
ヒトＣＲは、公知の方法により調整することができる。Ｗｅｒｍｕｔｈらが明らかにしているように、ヒト胎盤から得られたｃＤＮＡのライブラリーからクローンを用いて生産する方法がある（Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｂ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６：１２０６−１２１３，１９８１）。あるいは、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）蛋白質との融合として、大腸菌等の宿主細胞内で発現させ、グルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することもできる。
【００２２】
ＣＲの発現パターンの測定は、ＣＲと同様の免疫原性を有する、少なくとも８アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて行う。上記ペプチドは、所望の免疫原性を有する限り、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が修飾されていてもよく、例えば、配列表の配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをあげることができる。あるいは、上記ペプチドは、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたペプチドであってもよい。このような変異体は、配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであっても良い。
【００２３】
配列番号２のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の第１８４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から第１９５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸配列部位を抗原決定部位とみなし、Ｎ末端側のヒスチジンの前にシステインを付加して、化学的に合成されたものであり、ＣＨＱＫＥＧＷＰＳＳＡＹＧのアミノ酸配列を有する。
【００２４】
また、配列番号３のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の第９９番目のアスパラギン（Ａｓｐ）酸から第１１３番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列部位が、別のもう１つの抗原決定部位とみなし、Ｃ末端側のスレオニンの後にシステインを付加して、化学的に合成されたものであり、ＤＰＴＰＦＨＩＱＡＥＶＴＭＫＴＣのアミノ酸配列を有する。
【００２５】
上記ペプチドの作製法としてはいくつかの方法があげられる。例えば、ＣＲの遺伝子情報を基にマーカー遺伝子又はその部分遺伝子を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体又は培養上清から精製することにより得る方法、あるいは、ＣＲのアミノ酸配列情報を基にオリゴペプチドを化学的に合成する方法があげられる。さらにまた、ＣＲの蛋白質を適切な蛋白切断酵素を用いて切断して得ることもできる。
【００２６】
本発明に使用する抗体は、上記ペプチドを認識する抗体であり、癌組織内のＣＲと特異的に結合し、ＣＲの発現パターンを測定することができる抗体である。該抗体は、公知の方法を用いて作製することができ、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、ＣＲを認識する特性を失わない限り、低分子化抗体や、修飾された抗体などの抗体フラグメントであってもよい。
【００２７】
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原性を有する配列表の配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、あるいは、配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたペプチドを、必要に応じて適当なアジュバントを用いて、ウサギ、ラット、マウス、サル、ヒツジなどの哺乳動物の皮下あるいは腹腔内に投与して感作し、感作した動物から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離して得られる。ポリクローナル抗体としては、分離した血清をそのまま使用することができるが、さらに、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動）や、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャム社製）を使用するＡｆｆｉｎｉｔｙ法で精製して使用することもできる。
【００２８】
上記抗体を用いたＣＲの発現パターンの測定は、公知の蛋白質の測定方法に従って行うことができる。例えば、ウェスタンブロッティング法、ドットブロット法や、免疫沈降法、酵素免疫測定法 （ＥＩＡ； ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、蛍光抗体法（ＦＩＡ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、免疫組織染色等の免疫学的測定法が挙げられる。
【００２９】
上記測定法においては、ＣＲと特異的に結合する抗体を検出可能な物質で標識する。標識としては、放射性同位体や例えばビオチン、アビジン等のアフィニティー標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識、例えばＦＩＴＣ、ローダミン等蛍光標識、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｉｍｉ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）による化学発光標識等があげられる。そのような標識は組み合わせても良く、標識を行う方法は、すでによく知られている方法で行う。
【００３０】
免疫学的測定法の例としては、競合アッセイ法やサンドイッチ法があげられる。当該サンドイッチ法のＥＬＩＳＡ法では、結合した酵素標識抗体に、酵素基質となる物質を加えて発色あるいは発光させ、その後に反応停止液を加え、発色あるいは発光の強さやパターンを測定する。試料中の抗原濃度に比例した強さやパターンが得られるため、対照物質との比較に基づいて試料中の抗原の発現状況を把握することができる。
【００３１】
本発明の、抗体を用いたＣＲの発現解析は、ヒト組織染色用キットを用いることもできる。免疫組織化学染色用キットのヒストファイン（ニチレイ社製）を使用する場合は、ＣＲと結合した抗体に、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として結合させ、そこへ酵素試薬であるペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンを結合させる。次いで、ＤＡＢ（３，３−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）によりペルオキシターゼを染色することにより、癌組織中のＣＲの発現パターンを観察することができる。
【００３２】
癌患者の組織を用いて、癌の予後を判定する場合は、インフォームド・コンセントが得られた患者の癌組織を用いる。子宮体癌類内膜腺癌患者の進行期区分は、ＦＩＧＯ（国際産科婦人科連合：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｒｉｃｓ）の基準により、進行期Ｉ〜ＩＶまでの４段階に区分できる。進行期Ｉは、癌が子宮体部に限局するもの、進行期ＩＩは、癌が子宮体部および頸部に及ぶもの、進行期ＩＩＩは、癌が子宮外に広がるが、小骨盤腔を越えていないもの、または所属リンパ節転移のあるもの、進行期ＩＶは、癌が小骨盤腔を越えているか、明らかに膀胱または腸粘膜を侵すものと定められている。
【００３３】
本発明の子宮体部類内膜腺癌の予後を判定するための、癌組織におけるＣＲの発現は、患者から得られた癌組織に由来する試料に、本発明の抗体組成物を接触させてＣＲの免疫複合体を形成させ、当該免疫結合体を染色させて検出することができ、ＣＲの発現パターンを測定することにより該癌の予後を判定することができる。評価法は、例えばＵｍｅｍｏｔｏらの方法（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：１０３２−１０３６， ２００１）に準じて行うことができる。すなわち、ＣＲの発現パターンを、染色強度（Ｈｉｇｈ：＋３、Ｍｏｄｅｒａｔｅ：＋２、Ｗｅａｋ：＋１、Ｎｅｇａｔｉｖｅ：＋０)と、染色陽性細胞の割合(５０％以上：＋２、５０％ 未満：＋１、全く染色されない：＋０)）でスコア化し、合計したものを３つのパターン（Ａ）強陽性、（Ｂ）弱陽性、（Ｃ）陰性に分けて評価する。各々のパターンから、（１）無進行生存（ＰＦＳ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ、手術日から臨床的に再発が確認されるまでの期間）、および（２）全生存（ＯＳ：ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ、手術日から死亡までの期間）について、統計学的に解析し、予後を判定する方法である。
【００３４】
癌組織のＣＲの発現パターンが、（Ａ）強陽性である場合には、ＰＦＳおよびＯＳは延長しており、予後良好であると予測でき、ＣＲの発現パターンが、（Ｂ）弱陽性、あるいは（Ｃ）陰性である場合には、ＰＦＳおよびＯＳは低く、予後不良と予測することができる。
【００３５】
本発明はまた、子宮体部類内膜腺癌の高精度かつ高特異度の予後判定を行うための試薬を予め組み合わせたキットを提供する。該キットには、抗体のほか、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物等を含めることもできる。
【００３６】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３７】
＜ペプチドの合成＞
配列番号１に示すＣＲのアミノ酸配列の情報を解析し、ＣＲの抗原決定部位を検索した。その結果、配列番号１のアミノ酸配列の第１８４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から第１９５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸配列部位が優れた抗原決定部位と分かった。そこで、ＣＲの抗体を作成するために、Ｎ末端側のヒスチジンの前にシステインを付加した合成ペプチドＣＨＱＫＥＧＷＰＳＳＡＹＧ（配列表の配列番号２）を作製した。
【実施例２】
【００３８】
＜ＣＲの抗体作製＞
実施例１で作成した合成ペプチドを、フロイントアジュバントを用いてエマルジョンを作製し、当該エマルジョンをウサギの皮下に注射して免疫した。免疫は、第１回目に０．１５ｍｇの合成ペプチドを投与し、２週間後に０．３ｍｇ、その後は２週間おきに計４回の投与を行った。採血は、合成ペプチドを投与する前、合成ペプチドを３回投与した１週間後、さらに４回目を投与した１週間後に各１ｃｃずつ、計３回の試験採血を行った。各試験採血におけるＣＲの抗体価はＥＬＩＳＡ法で測定した。最終免疫終了の１週間後に、免疫したウサギから全血を最終採血した。最終採血分はＣＮＢｒ−ａｃｖｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャム・ファルマシア社製）によるａｆｆｉｎｉｔｙ精製を実施し、ＣＲのポリクローナル抗体を得た。
【実施例３】
【００３９】
＜正常子宮内膜上皮組織中のＣＲの検出＞
実施例２で作製した抗体を用いて、患者の同意を得て採取した正常子宮内膜上皮組織におけるＣＲの発現を免疫染色により確認した。実験法は、精製したポリクローナル抗体と、ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット（ニチレイ社）を用いて、プロトコールに従い、免疫組織染色を（１）〜（８）の手順に従って実施した。（１）ホルマリン固定パラフィン包埋組織を５μｍ厚に切り出し、キシレンに３回浸した後、１００％エタノールに浸して、脱パラフィン操作を行う。（２）０．３％過酸化水素入りメタノールに組織切片を５０分浸し、内因性ペルオキシダーゼを失活させる。（３）組織切片をＰＢＳで３回洗浄後、作製した抗ＣＲ抗体の非特異的吸着を防ぐため、ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キットに付属する１０％ヤギ正常血清を用いて室温で１０分間ブロッキングを行う。（４）一次抗体反応として、１％ウシアルブミン含有ＰＢＳで２μｇ／ｍｌの濃度に調整した抗ＣＲポリクローナル抗体と４℃で一晩反応させる。（５）組織切片をＰＢＳで３回洗浄後、キットに含まれる二次抗体ビオチン標識ヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体と室温で１０分間反応させる。（６）終了後、組織切片をＰＢＳで３回洗浄し、キットに含まれるペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液を添加する。室温で５分間反応させる。（７）終了後、組織切片をＰＢＳで３回洗浄し０．０２％ ＤＡＢ液（３０ｍｇＤＡＢを、１３０ｍｌの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒと、２０ｍｌの０．０５ＭＴｒｉｓｍａ ｂａｓｅに溶解する。）に１分間浸す。終了後、５分間流水で洗浄する。（８）へマトキシリン染色し、流水で１０分間洗浄し、封入する。
【００４０】
以上の結果より、ＣＲは正常子宮内膜上皮の細胞質に局在しており（図１）、正常子宮内膜上皮においては増殖期と比較して分泌期で強く発現していることが明らかとなった（図２Ａ〜Ｄ）。
【実施例４】
【００４１】
＜子宮体部類内膜腺癌組織中のＣＲの検出＞
組織の採取および検討に対し、インフォームド・コンセントが得られた手術前未治療で予後の追跡が可能である子宮体部類内膜腺癌患者１０９名を対象に行った。各進行期における癌患者例数は表１のとおりであった。
【００４２】
【表１】
【００４３】
上記患者の初回手術症例より採取した癌組織を用いて、実施例３と同様に、免疫組織染色を（１）〜（８）の手順に従って実施した。免疫組織染色によるＣＲの発現パターンを、図３、図４、図５に示した。ＣＲの発現パターンは、Ｕｍｅｍｏｔｏらの方法（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：１０３２−１０３６，２００１）に準じて、スコア化し、３種類に分類した。すなわち、染色強度（Ｈｉｇｈ：＋３、Ｍｏｄｅｒａｔｅ：＋２、Ｗｅａｋ：＋１、Ｎｅｇａｔｉｖｅ：＋０)および染色陽性細胞の割合(５０％以上：＋２、５０％未満：＋１、全く染色されない：＋０)の合計により、表２のようにスコアリングして分類した。ＣＲの発現が低下している陰性＋弱陽性群とＣＲの発現が保たれている陽性群の２群に分類すると、図６に示すように進行期が進むにつれて、明らかにＣＲ陰性＋弱陽性群の割合が増加した。
【００４４】
【表２】
【実施例５】
【００４５】
＜ＣＲ発現パターン別の予後＞
実施例４で、癌組織を提供した癌患者について、予後最長１７５ヶ月間の追跡を行い、各染色パターン（強陽性、弱陽性、陰性）におけるＰＦＳとＯＳを調べた結果を、図７、８に示した。弱陽性と陰性を示した群では、ＰＦＳの低下が認められ、さらに、ＯＳも低下が認められた。また、強陽性群と発現が低下している弱陽性＋陰性群の２群で比較してもＰＦＳおよびＯＳともに低下が認められた。Ｐ値（母集団を比較した統計学的有意性）からも明らかなように、子宮体部類内膜腺癌原発巣におけるＣＲの発現減弱を示す弱陽性と陰性の症例では、再発・死亡に至るなど、予後不良であった。以上の結果より、ＣＲは子宮体部類内膜腺癌の予後を判定し、治療の個別化を検討する上で新たな指標となりうることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の、癌組織中のＣＲの発現パターンを指標とする子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法は、細胞の状況を肉眼的に行うため、精度のよい判定が可能になり、癌患者に対し、予後に関する重要な情報を与えることができ、術後補助療法の必要性を検討する判断材料になりうる。また、癌治療や癌転移抑制をもたらす創薬のスクリーニングについても、ＣＲの発現パターンを指標にして行うことが可能になると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮体部類内膜腺癌の予後を判定する方法に関し、詳しくは、特異的な腫瘍マーカーが存在しない子宮体部類内膜腺癌組織におけるカルボニルレダクターゼ（ｃａｒｂｏｎｙｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＣＲ）の発現状況をスコア化することにより、子宮体部類内膜腺癌の予後を判定する方法に関する。さらにまた、ＣＲと特異的に結合する抗体、当該抗体を作製するためのペプチド、当該抗体を用いてＣＲを検出するための検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年わが国では、子宮体癌が急激に増加している。欧米において、子宮体癌は最も頻度が高い婦人科悪性腫瘍であり、女性の悪性腫瘍の中では、乳癌、肺癌、大腸癌に次いで4番目の発症率である。日本においては子宮体癌のさらなる増加が危惧されている。実際、子宮体癌の人口１０万対の罹患率は、１９７５年と１９９８年を比較すると１．４から４．５に増加していると報告されている。増加原因としては食生活の欧米化による肥満傾向、晩婚化、少子化等が挙げられている。このような状況の中で、子宮体癌の臨床的な重要性はますます高くなると考えられている。
【０００３】
子宮体癌を検出するための腫瘍マーカーとして、現在よく知られているものは、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＥＡ等があげられる。しかしながら、検出を表す陽性率はＣＡ１２５では２１．１〜４３．０％、ＣＡ１９−９では２４．０〜３１．０％、ＣＡ７２−４では２１．４〜３３．３％であり、ＣＥＡでは２．１〜１４％と低い（非特許文献１）。このように、子宮体癌に対する特異性の高い腫瘍マーカーは存在しているとは言い難い。
【０００４】
また、子宮体癌は根治手術を行い、摘出した臓器の病理組織学的検索の結果から、予後予測を行っているのが現状である。従って、術後の化学療法や放射線療法等の補助療法の必要性については摘出手術をするまでは判断できない。不要な治療を受ける患者数を減らし得るような、癌の予後を予測して判定する方法が望まれている。
【０００５】
これまで、癌の予後を判定する方法について、いくつかの報告がある。膀胱癌の予後に関しては、尿中に存在する細胞の中心体複製異常の有無の検出による判定方法が明らかにされており（特許文献１）、メラノーマ又は肺癌の発症や進行については、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ：ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：活性化白血球接着分子）を血液中から検出し、この検出結果に応じて予後の状況を判定する方法が開示されている（特許文献２）。また、乳癌、肺癌、前立腺癌、または胃癌等の癌から骨転移のリスクが高いと予測する方法として、尿や癌細胞中のγ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）レベルを測定し、該γ−ＧＴＰレベルが設定値より高い場合に、骨転移のリスクが高いと予測する方法が開示されている（特許文献３）。食道扁平上皮癌に関しては、特定の染色体の特異的な構造変化を検出する方法による予後の診断方法が開示されている（特許文献４）。本発明者らは、先に、子宮頸部扁平上皮癌のＩ・ＩＩ期に関して、原発部位のＣＲの免疫組織染色による発現パターンを分類し、予後の判定方法を明らかにした（特許文献５）。
【０００６】
ＣＲについては、ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究で、高転移能を有する細胞では、発現が低下すること、過剰発現によって、転移能は低下することが報告されている（非特許文献２）。このことから、ＣＲは癌の悪性度や転移に関与することが推察されるが、子宮体癌の大部分を占める子宮体部類内膜腺癌患者の予後判定方法を開示した知見はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２７５９８９号公報(表２)
【特許文献２】特許第３７７９２９４号公報（図２）
【特許文献３】特開２００６−１５３４９９号公報（図２）
【特許文献４】特開２００２−２７２４９７号公報（表２、３）
【特許文献５】特開２００８−１８２９８７号公報（図６〜８、表２）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】村上 明弘 他 女性外来診療マニュアル 産婦人科と腫瘍マーカー 産婦人科治療 ９４：６１９−６２３，２００７
【非特許文献２】Ｉｓｍａｉｌ，Ｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：１１７３−１１７６，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
子宮体部類内膜腺癌については、癌の予後を予測して、不要な治療を受ける患者数を減らし得るような術後判定の方法は知られていない。本発明は、高精度で、かつ特異性の高い癌の予後判定法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＣＲは、扁平上皮癌の腫瘍マーカーとしてよく知られているＳＣＣ抗原に結合する分子であることが、本発明者らにより見出されている（Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ３４： １３９５−１４００， ２０１０）。ＣＲの発現パターンは、癌組織において同一ではなく、発現が強い細胞と弱い細胞が存在する。さらに、原発組織におけるＣＲの免疫組織染色では、発現が低下している症例では予後不良の結果となった。本発明者らは、その点に着眼して、発現パターンと子宮体部類内膜癌の予後の密接な関連を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）を提供する。
【００１２】
（１）癌の予後を判定する方法であって、癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを指標とする子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法。
【００１３】
（２）癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、染色強度と染色陽性細胞の割合でスコア化し、陰性であるか、弱陽性である場合を、予後不良と判定することを特徴とする上記（１）に記載の予後判定方法。
【００１４】
（３）癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する下記のいずれかのペプチドを基に得られた抗体を用い、免疫組織染色法により測定することを特徴とする上記（１）または（２）のいずれかに記載の予後判定方法。
（ａ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００１５】
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体、免疫組織染色用の試薬および器具類を含有する予後判定用キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、癌の予後判定法、特に子宮体部類内膜腺癌の高精度かつ高特異度の予後判定法を提供することができ、さらに、簡便に判定するための判定用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】正常子宮内膜で強く発現するＣＲの局在についての検出を示す図である。
【図２】正常子宮内膜で性周期の変化における変化免疫組織染色によるＣＲの発現パターンを示す図である（Ａ，Ｂ；増殖期、Ｃ，Ｄ；分泌期）。
【図３】子宮体部類内膜腺癌における免疫組織染色によるＣＲの発現パターンで、陰性の検出結果を示す図である。
【図４】子宮体部類内膜腺癌における免疫組織染色によるＣＲの発現パターンで、弱陽性の検出結果を示す図である。
【図５】子宮体部類内膜腺癌における免疫組織染色によるＣＲの発現パターンで、強陽性の検出結果を示す図である。
【図６】子宮体部類内膜腺癌における進行期別のＣＲの発現パターンを示す図である。
【図７】子宮体部類内膜腺癌患者におけるＣＲ染色スコア別のＰＦＳを示す図である（Ａ；強陽性、弱陽性、陰性の３群で検討、Ｂ；強陽性、弱陽性＋陰性の２群で検討）。
【図８】子宮体部類内膜腺癌患者におけるＣＲ染色スコア別のＯＳを示す図である（Ａ；強陽性、弱陽性、陰性の３群で検討、Ｂ；強陽性、弱陽性＋陰性の２群で検討）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
子宮体癌のうち、組織学的に最も頻度多くみられるのが、子宮体部類内膜腺癌である。本発明は、子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法であり、判定に用いるためのペプチドを作製し、該ペプチドに対する抗体を作製する。次いで、該抗体を用いて癌組織内のＣＲの発現パターンを測定し、癌組織内のＣＲの発現パターンを解析することにより、癌の予後を判定するものである。
【００１９】
ＣＲは、ヒトの脳より精製され、分子量が約３０ｋＤａの分子で、２７７のアミノ酸からなる（Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｂ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６：１２０６−１２１３，１９８１、Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｂ．ｅｔ ａｌ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：１６１８５−１６１８８，１９８８）。その遺伝子は２１番染色体長腕２２．１２に位置し、マウスの遺伝子とは８２％の相同性を持つことが明らかにされている（Ｆｏｒｒｅｓｔ，ＧＬ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０４８：１４９−１５５，１９９０）。ＣＲは、カルボニル化合物を基質とする細胞質に局在しているＮＡＤＰＨ依存性の酵素である。脳ではプロスタグランジンやステロイドの還元を触媒する作用を有すること、また、肝臓では解毒作用に関与することが知られている。
【００２０】
ＣＲの遺伝子に関する情報は、ヒトＣＲとして公知であり、ＮＣＢＩの遺伝子データベースにおいて、アクセッションナンバーＪ０４０５６として登録されている。それによると、配列表の配列番号１に示すＤＮＡとアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがわかる。
【００２１】
ヒトＣＲは、公知の方法により調整することができる。Ｗｅｒｍｕｔｈらが明らかにしているように、ヒト胎盤から得られたｃＤＮＡのライブラリーからクローンを用いて生産する方法がある（Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｂ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５６：１２０６−１２１３，１９８１）。あるいは、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）蛋白質との融合として、大腸菌等の宿主細胞内で発現させ、グルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することもできる。
【００２２】
ＣＲの発現パターンの測定は、ＣＲと同様の免疫原性を有する、少なくとも８アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて行う。上記ペプチドは、所望の免疫原性を有する限り、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が修飾されていてもよく、例えば、配列表の配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをあげることができる。あるいは、上記ペプチドは、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたペプチドであってもよい。このような変異体は、配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであっても良い。
【００２３】
配列番号２のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の第１８４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から第１９５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸配列部位を抗原決定部位とみなし、Ｎ末端側のヒスチジンの前にシステインを付加して、化学的に合成されたものであり、ＣＨＱＫＥＧＷＰＳＳＡＹＧのアミノ酸配列を有する。
【００２４】
また、配列番号３のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の第９９番目のアスパラギン（Ａｓｐ）酸から第１１３番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列部位が、別のもう１つの抗原決定部位とみなし、Ｃ末端側のスレオニンの後にシステインを付加して、化学的に合成されたものであり、ＤＰＴＰＦＨＩＱＡＥＶＴＭＫＴＣのアミノ酸配列を有する。
【００２５】
上記ペプチドの作製法としてはいくつかの方法があげられる。例えば、ＣＲの遺伝子情報を基にマーカー遺伝子又はその部分遺伝子を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体又は培養上清から精製することにより得る方法、あるいは、ＣＲのアミノ酸配列情報を基にオリゴペプチドを化学的に合成する方法があげられる。さらにまた、ＣＲの蛋白質を適切な蛋白切断酵素を用いて切断して得ることもできる。
【００２６】
本発明に使用する抗体は、上記ペプチドを認識する抗体であり、癌組織内のＣＲと特異的に結合し、ＣＲの発現パターンを測定することができる抗体である。該抗体は、公知の方法を用いて作製することができ、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、ＣＲを認識する特性を失わない限り、低分子化抗体や、修飾された抗体などの抗体フラグメントであってもよい。
【００２７】
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原性を有する配列表の配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、あるいは、配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたペプチドを、必要に応じて適当なアジュバントを用いて、ウサギ、ラット、マウス、サル、ヒツジなどの哺乳動物の皮下あるいは腹腔内に投与して感作し、感作した動物から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離して得られる。ポリクローナル抗体としては、分離した血清をそのまま使用することができるが、さらに、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動）や、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャム社製）を使用するＡｆｆｉｎｉｔｙ法で精製して使用することもできる。
【００２８】
上記抗体を用いたＣＲの発現パターンの測定は、公知の蛋白質の測定方法に従って行うことができる。例えば、ウェスタンブロッティング法、ドットブロット法や、免疫沈降法、酵素免疫測定法 （ＥＩＡ； ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、蛍光抗体法（ＦＩＡ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、免疫組織染色等の免疫学的測定法が挙げられる。
【００２９】
上記測定法においては、ＣＲと特異的に結合する抗体を検出可能な物質で標識する。標識としては、放射性同位体や例えばビオチン、アビジン等のアフィニティー標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識、例えばＦＩＴＣ、ローダミン等蛍光標識、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｉｍｉ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）による化学発光標識等があげられる。そのような標識は組み合わせても良く、標識を行う方法は、すでによく知られている方法で行う。
【００３０】
免疫学的測定法の例としては、競合アッセイ法やサンドイッチ法があげられる。当該サンドイッチ法のＥＬＩＳＡ法では、結合した酵素標識抗体に、酵素基質となる物質を加えて発色あるいは発光させ、その後に反応停止液を加え、発色あるいは発光の強さやパターンを測定する。試料中の抗原濃度に比例した強さやパターンが得られるため、対照物質との比較に基づいて試料中の抗原の発現状況を把握することができる。
【００３１】
本発明の、抗体を用いたＣＲの発現解析は、ヒト組織染色用キットを用いることもできる。免疫組織化学染色用キットのヒストファイン（ニチレイ社製）を使用する場合は、ＣＲと結合した抗体に、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として結合させ、そこへ酵素試薬であるペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンを結合させる。次いで、ＤＡＢ（３，３−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）によりペルオキシターゼを染色することにより、癌組織中のＣＲの発現パターンを観察することができる。
【００３２】
癌患者の組織を用いて、癌の予後を判定する場合は、インフォームド・コンセントが得られた患者の癌組織を用いる。子宮体癌類内膜腺癌患者の進行期区分は、ＦＩＧＯ（国際産科婦人科連合：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｒｉｃｓ）の基準により、進行期Ｉ〜ＩＶまでの４段階に区分できる。進行期Ｉは、癌が子宮体部に限局するもの、進行期ＩＩは、癌が子宮体部および頸部に及ぶもの、進行期ＩＩＩは、癌が子宮外に広がるが、小骨盤腔を越えていないもの、または所属リンパ節転移のあるもの、進行期ＩＶは、癌が小骨盤腔を越えているか、明らかに膀胱または腸粘膜を侵すものと定められている。
【００３３】
本発明の子宮体部類内膜腺癌の予後を判定するための、癌組織におけるＣＲの発現は、患者から得られた癌組織に由来する試料に、本発明の抗体組成物を接触させてＣＲの免疫複合体を形成させ、当該免疫結合体を染色させて検出することができ、ＣＲの発現パターンを測定することにより該癌の予後を判定することができる。評価法は、例えばＵｍｅｍｏｔｏらの方法（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：１０３２−１０３６， ２００１）に準じて行うことができる。すなわち、ＣＲの発現パターンを、染色強度（Ｈｉｇｈ：＋３、Ｍｏｄｅｒａｔｅ：＋２、Ｗｅａｋ：＋１、Ｎｅｇａｔｉｖｅ：＋０)と、染色陽性細胞の割合(５０％以上：＋２、５０％ 未満：＋１、全く染色されない：＋０)）でスコア化し、合計したものを３つのパターン（Ａ）強陽性、（Ｂ）弱陽性、（Ｃ）陰性に分けて評価する。各々のパターンから、（１）無進行生存（ＰＦＳ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ、手術日から臨床的に再発が確認されるまでの期間）、および（２）全生存（ＯＳ：ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ、手術日から死亡までの期間）について、統計学的に解析し、予後を判定する方法である。
【００３４】
癌組織のＣＲの発現パターンが、（Ａ）強陽性である場合には、ＰＦＳおよびＯＳは延長しており、予後良好であると予測でき、ＣＲの発現パターンが、（Ｂ）弱陽性、あるいは（Ｃ）陰性である場合には、ＰＦＳおよびＯＳは低く、予後不良と予測することができる。
【００３５】
本発明はまた、子宮体部類内膜腺癌の高精度かつ高特異度の予後判定を行うための試薬を予め組み合わせたキットを提供する。該キットには、抗体のほか、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物等を含めることもできる。
【００３６】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３７】
＜ペプチドの合成＞
配列番号１に示すＣＲのアミノ酸配列の情報を解析し、ＣＲの抗原決定部位を検索した。その結果、配列番号１のアミノ酸配列の第１８４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から第１９５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸配列部位が優れた抗原決定部位と分かった。そこで、ＣＲの抗体を作成するために、Ｎ末端側のヒスチジンの前にシステインを付加した合成ペプチドＣＨＱＫＥＧＷＰＳＳＡＹＧ（配列表の配列番号２）を作製した。
【実施例２】
【００３８】
＜ＣＲの抗体作製＞
実施例１で作成した合成ペプチドを、フロイントアジュバントを用いてエマルジョンを作製し、当該エマルジョンをウサギの皮下に注射して免疫した。免疫は、第１回目に０．１５ｍｇの合成ペプチドを投与し、２週間後に０．３ｍｇ、その後は２週間おきに計４回の投与を行った。採血は、合成ペプチドを投与する前、合成ペプチドを３回投与した１週間後、さらに４回目を投与した１週間後に各１ｃｃずつ、計３回の試験採血を行った。各試験採血におけるＣＲの抗体価はＥＬＩＳＡ法で測定した。最終免疫終了の１週間後に、免疫したウサギから全血を最終採血した。最終採血分はＣＮＢｒ−ａｃｖｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（アマシャム・ファルマシア社製）によるａｆｆｉｎｉｔｙ精製を実施し、ＣＲのポリクローナル抗体を得た。
【実施例３】
【００３９】
＜正常子宮内膜上皮組織中のＣＲの検出＞
実施例２で作製した抗体を用いて、患者の同意を得て採取した正常子宮内膜上皮組織におけるＣＲの発現を免疫染色により確認した。実験法は、精製したポリクローナル抗体と、ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット（ニチレイ社）を用いて、プロトコールに従い、免疫組織染色を（１）〜（８）の手順に従って実施した。（１）ホルマリン固定パラフィン包埋組織を５μｍ厚に切り出し、キシレンに３回浸した後、１００％エタノールに浸して、脱パラフィン操作を行う。（２）０．３％過酸化水素入りメタノールに組織切片を５０分浸し、内因性ペルオキシダーゼを失活させる。（３）組織切片をＰＢＳで３回洗浄後、作製した抗ＣＲ抗体の非特異的吸着を防ぐため、ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キットに付属する１０％ヤギ正常血清を用いて室温で１０分間ブロッキングを行う。（４）一次抗体反応として、１％ウシアルブミン含有ＰＢＳで２μｇ／ｍｌの濃度に調整した抗ＣＲポリクローナル抗体と４℃で一晩反応させる。（５）組織切片をＰＢＳで３回洗浄後、キットに含まれる二次抗体ビオチン標識ヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体と室温で１０分間反応させる。（６）終了後、組織切片をＰＢＳで３回洗浄し、キットに含まれるペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液を添加する。室温で５分間反応させる。（７）終了後、組織切片をＰＢＳで３回洗浄し０．０２％ ＤＡＢ液（３０ｍｇＤＡＢを、１３０ｍｌの０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒと、２０ｍｌの０．０５ＭＴｒｉｓｍａ ｂａｓｅに溶解する。）に１分間浸す。終了後、５分間流水で洗浄する。（８）へマトキシリン染色し、流水で１０分間洗浄し、封入する。
【００４０】
以上の結果より、ＣＲは正常子宮内膜上皮の細胞質に局在しており（図１）、正常子宮内膜上皮においては増殖期と比較して分泌期で強く発現していることが明らかとなった（図２Ａ〜Ｄ）。
【実施例４】
【００４１】
＜子宮体部類内膜腺癌組織中のＣＲの検出＞
組織の採取および検討に対し、インフォームド・コンセントが得られた手術前未治療で予後の追跡が可能である子宮体部類内膜腺癌患者１０９名を対象に行った。各進行期における癌患者例数は表１のとおりであった。
【００４２】
【表１】
【００４３】
上記患者の初回手術症例より採取した癌組織を用いて、実施例３と同様に、免疫組織染色を（１）〜（８）の手順に従って実施した。免疫組織染色によるＣＲの発現パターンを、図３、図４、図５に示した。ＣＲの発現パターンは、Ｕｍｅｍｏｔｏらの方法（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：１０３２−１０３６，２００１）に準じて、スコア化し、３種類に分類した。すなわち、染色強度（Ｈｉｇｈ：＋３、Ｍｏｄｅｒａｔｅ：＋２、Ｗｅａｋ：＋１、Ｎｅｇａｔｉｖｅ：＋０)および染色陽性細胞の割合(５０％以上：＋２、５０％未満：＋１、全く染色されない：＋０)の合計により、表２のようにスコアリングして分類した。ＣＲの発現が低下している陰性＋弱陽性群とＣＲの発現が保たれている陽性群の２群に分類すると、図６に示すように進行期が進むにつれて、明らかにＣＲ陰性＋弱陽性群の割合が増加した。
【００４４】
【表２】
【実施例５】
【００４５】
＜ＣＲ発現パターン別の予後＞
実施例４で、癌組織を提供した癌患者について、予後最長１７５ヶ月間の追跡を行い、各染色パターン（強陽性、弱陽性、陰性）におけるＰＦＳとＯＳを調べた結果を、図７、８に示した。弱陽性と陰性を示した群では、ＰＦＳの低下が認められ、さらに、ＯＳも低下が認められた。また、強陽性群と発現が低下している弱陽性＋陰性群の２群で比較してもＰＦＳおよびＯＳともに低下が認められた。Ｐ値（母集団を比較した統計学的有意性）からも明らかなように、子宮体部類内膜腺癌原発巣におけるＣＲの発現減弱を示す弱陽性と陰性の症例では、再発・死亡に至るなど、予後不良であった。以上の結果より、ＣＲは子宮体部類内膜腺癌の予後を判定し、治療の個別化を検討する上で新たな指標となりうることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の、癌組織中のＣＲの発現パターンを指標とする子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法は、細胞の状況を肉眼的に行うため、精度のよい判定が可能になり、癌患者に対し、予後に関する重要な情報を与えることができ、術後補助療法の必要性を検討する判断材料になりうる。また、癌治療や癌転移抑制をもたらす創薬のスクリーニングについても、ＣＲの発現パターンを指標にして行うことが可能になると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の予後を判定する方法であって、癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを指標とする子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法。
【請求項２】
癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、染色強度と染色陽性細胞の割合でスコア化し、陰性であるか、弱陽性である場合を、予後不良と判定することを特徴とする請求項１に記載の予後判定方法。
【請求項３】
癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する下記のいずれかのペプチドを基に得られた抗体を用い、免疫組織染色法により測定することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の予後判定方法。
（ａ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体、免疫組織染色用の試薬および器具類を含有する予後判定用キット。
【請求項１】
癌の予後を判定する方法であって、癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを指標とする子宮体部類内膜腺癌の予後判定方法。
【請求項２】
癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、染色強度と染色陽性細胞の割合でスコア化し、陰性であるか、弱陽性である場合を、予後不良と判定することを特徴とする請求項１に記載の予後判定方法。
【請求項３】
癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する下記のいずれかのペプチドを基に得られた抗体を用い、免疫組織染色法により測定することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の予後判定方法。
（ａ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体、免疫組織染色用の試薬および器具類を含有する予後判定用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１３５０４（Ｐ２０１２−１３５０４Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４９３６９（Ｐ２０１０−１４９３６９）
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 社団法人日本産科婦人科学会、日本産科婦人科学会雑誌 第６２巻 第２号 第６２回学術講演会抄録、Ｓ−３９３（Ｐ５２７）、平成２２年２月１日発行
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 社団法人日本産科婦人科学会、日本産科婦人科学会雑誌 第６２巻 第２号 第６２回学術講演会抄録、Ｓ−３９３（Ｐ５２７）、平成２２年２月１日発行
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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