安定な水性Ｇ−ＣＳＦ含有組成物
本発明は、緩衝物質としてコハク酸および／または酒石酸を含む、極めて安定な水性Ｇ−ＣＳＦ含有組成物に関する。本発明はまた、前述の組成物から得ることのできる凍結乾燥品および粉末、ならびにこのような凍結乾燥品および粉末を含む薬物キットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦを含む水性組成物、Ｇ−ＣＳＦの凍結乾燥品または粉末、およびこれらの凍結乾燥品または粉末を含む医薬キットに関する。
【発明の詳細な説明】
【０００２】
Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）は、サイトカインのファミリーに属する、天然に存在する増殖因子である。Ｇ−ＣＳＦは、造血において決定的な役割を果たし、好中球および好中球の後続細胞の成熟、増殖、分化、および生存を高める。臨床上では、Ｇ−ＣＳＦは、腫瘍の制御に、特に化学療法後の好中球減少症の治療に主に用いられ、骨髄移植および感染性疾患の治療にも適用される。
【０００３】
天然に存在する形態のヒトＧ−ＣＳＦは、システイン残基を５個有する分子量約２００００の糖タンパク質である。これらの残基のうち４個は、タンパク質の活性に決定的である分子内ジスルフィド結合を２つ形成している。Ｇ−ＣＳＦは、その天然の供給源から少量しか得ることができないので、薬物を調製するためには、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞などの哺乳動物の細胞、または大腸菌などの原核生物の細胞で発現させることにより得ることができるリコンビナントの形態のＧ−ＣＳＦが主に用いられる。哺乳動物の細胞で発現されるリコンビナントのタンパク質は、グリコシル化のパターンが異なるという点で天然に存在するＧ−ＣＳＦと異なるが、大腸菌で発現された、細菌での発現の結果としてさらなるＮ末端のメチオニン残基を有することがあるタンパク質は、完全にグリコシル化を欠いている。
【０００４】
Ｇ−ＣＳＦの製剤は、タンパク質が高度に疎水性であるために、特に、非グリコシル化のリコンビナントの形態のタンパク質の場合は比較的不安定である。分子はバイアル、シリンジなどの壁面に容易に吸着し、二量体またはより高次の凝集体を形成し、脱アミド、酸化、ジスルフィド結合の切断、またはタンパク質分解などの化学的修飾を受けるので、特にタンパク質を長期間貯蔵する際に、活性の損失のあることが多い。これは、例えば、Ｇ−ＣＳＦを一定の投与量で長期間にわたり投与する場合には、一方では費用上の理由で、他方では治療上の理由で不都合である。さらに、例えば、二量体化、酸化、または分解により形成された生成物は、望ましくない免疫反応を引き起こすことがある。加えて、従来のＧ−ＣＳＦ製剤は、例えば、輸送中に液体製剤を振盪した結果生じるかもしれない機械的応力に、および１回のまたは繰返しの凍結および解凍に感受性がある。両者とも、多量体および凝集体の望ましくない形成、ならびに活性の損失をもたらすこともある。
【０００５】
ドイツ特許公開第３７２３７８１号明細書は、有効成分としてＧ−ＣＳＦを含む、少なくとも１つの製薬上許容される界面活性剤、サッカライド、タンパク質、または有効成分を安定化するための高分子量の化合物を含む薬物を記載している。特に有利な界面活性剤として、脂肪族脂肪酸、例えば、モノオレイン酸またはモノラウリル酸の、ポリオキシソルビタンエステルが提唱されており、これらはヒト血清アルブミンおよびマンニトールと一緒に使用される。界面活性剤は、Ｇ−ＣＳＦの重量に対し１〜１００００部の重量の量で用いるのが好ましい。ｐＨ値７．４が特定される水性のリン酸塩で緩衝化した製剤は、長時間にわたり４℃で安定である。
【０００６】
しかし、記載されている医薬製剤にはいくつかの欠点がある。例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）などの界面活性剤が、特により高濃度で存在すると薬物の投与時に局所刺激を生じる可能性があるので、医学上完全に安全というわけではない。さらに、高温では、このような界面活性剤は、記載されているリン酸緩衝液中では、Ｇ−ＣＳＦの遊離システイン残基の接近性がより良くなるので、望ましくない二量体および多量体の形成に好都合に働き、したがってＧ−ＣＳＦの活性は高温では大変速やかに減少する。さらに安定化剤として大量に用いられるヒトおよび動物起源のタンパク質およびペプチドには抗原性の性質があるため、ヒトに免疫反応を引き起こすことがあるので、同様に潜在的なリスクを伴い、ウィルス汚染もまた完全に排除されないことがある。
【０００７】
欧州特許出願公開第０３７３６７９号明細書は、Ｇ−ＣＳＦを、伝導率ができるだけ低いと有利である、ｐＨ値が２．７５〜４．０の溶液中に調合すると、長期間にわたり安定を保つことができることを開示している。これらの製剤では、Ｇ−ＣＳＦの凝集を避けるために緩衝液を使用しないことが好ましいが、カルボン酸、クエン酸、乳酸、または酒石酸を、緩衝物質として２ｍＭ未満の少量で用いてもよい。しかし、生理的ｐＨ値に近いｐＨ値を有する安定な製剤は、これらの条件下では不可能である。
【０００８】
Ｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．ら（「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ），ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ」、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ、ｐ．３０３−ｐ．３２８、Ｒ．ＰｅａｒｌｍａｎおよびＹ．Ｊ．Ｗａｎｇ編集、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９６年）は、酢酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ４．０、０．５％マンニトール、および０．００４％ポリソルベート８０を含む、非グリコシル化のリコンビナントＧ−ＣＳＦの安定化した組成物を記載している。このような組成物は、２〜８℃で、２４ヶ月を超える間安定である。しかし、この系を使用して、よりｐＨ値の高い安定な組成物は可能ではない。
【０００９】
国際公開第９４／１４４６６号パンフレットは、緩衝物質として酢酸、乳酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、アルギニン、およびこれらの塩を含むことができ、ｐＨ値が２．５〜５．０および７〜８であるＧ−ＣＳＦ含有の水性医薬製剤を開示している。これらの製剤では、例えば、溶液の振盪中に起こることがあるような機械的応力によるＧ−ＣＳＦの多量体および凝集体の形成は減少する。しかし、特に高温では、これらの調製物におけるＧ−ＣＳＦの活性は速やかに減少し、長期の安定性は十分ではない。
【００１０】
欧州特許出願公開第０３０６８２４号は、ヒトタンパク質、特に、エリスロポエチンの安定化した調製物を記載しており、この調製物では、尿素、アミノ酸、および洗浄剤を添加することにより安定化が実現される。リン酸緩衝液など、注射用の溶液に用いられる緩衝液では、Ｇ−ＣＳＦはやはり高温では十分に安定ではない。
【００１１】
国際公開第９４／１４４６５号パンフレットは、マルトース、サッカロース、ラフィノース、トレハロース、またはアミノ糖を含む、Ｇ−ＣＳＦの凍結乾燥した医薬製剤を開示している。しかし、これらの凍結乾燥物の水溶液も、長期間にわたり十分に安定ではない。
【００１２】
欧州特許出願公開第１１９７２２１号は、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、およびアスパラギン、ならびに１つまたは複数の疎水性アミノ酸の群の、１つまたは複数のアミノ酸を含む、ｐＨ値が５〜７である長期間安定なＧ−ＣＳＦ製剤を開示している。Ｇ−ＣＳＦ分子のメチオニン残基の酸化を避けるために、製剤にアミノ酸であるメチオニンを加えている。
【００１３】
本発明の目的は、血清タンパク質が存在しなくても、広いｐＨ範囲にわたり、高温で長期間にわたり安定であり、特に、薬剤の適用に有用である水性のＧ−ＣＳＦ含有の組成物を提供することであった。
【００１４】
今や驚くべきことに、緩衝物質としてコハク酸および／または酒石酸を含む水性のＧ−ＣＳＦ含有の組成物では、Ｇ−ＣＳＦ分子の二量体化または酸化などの化学的修飾は殆ど起こらないので、このような組成物は、高温でも、長期間にわたり、広範なｐＨ内で、かつ生理的条件に近いｐＨ値でも安定であることが見出されている。したがって、長期間貯蔵しても、活性の損失は殆どない。Ｇ−ＣＳＦ含有の凍結乾燥品または粉末を、再構成し、または溶解する場合でも、機械的応力の下、例えば、Ｇ−ＣＳＦ含有の組成物をろ過し、バイアルに満たし、シリンジに充填し、輸送する間、および凍結し、解凍する間、コハク酸および／または酒石酸の存在により、Ｇ−ＣＳＦタンパク質の望ましくない凝集または他の二次反応が防止され、したがって活性の損失が防止される。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、緩衝物質として遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性Ｇ−ＣＳＦ含有組成物、その調製方法、ならびに医薬製剤を製造するためのそれらの使用である。
【００１６】
本発明の別の一目的は、Ｇ−ＣＳＦ、ならびに遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む凍結乾燥品および粉末、それらを調製するための方法、ならびに医薬製剤を製造するためのそれらの使用である。
【００１７】
本発明の別の一目的は、物理的に分離したａ）Ｇ−ＣＳＦ含有の凍結乾燥品または粉末、ならびにｂ）遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性溶剤を含む医薬キットである。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、特許請求の範囲、および以下の説明から明らかとなる。
【００１９】
本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦタンパク質は、哺乳動物、特にヒトからのあらゆるＧ−ＣＳＦタンパク質であってもよく、それらに由来する変異体がヒトＧ−ＣＳＦに特徴的である造血において生物学的活性を実質的に有する限り、変異体であってもよい。本明細書で用いられるＧ−ＣＳＦは、したがって、天然起源のＧ−ＣＳＦ、および合成またはリコンビナントのＧ−ＣＳＦ、ならびにこれらの変異体（例えば、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を原核生物で発現させた場合に得られるＮ末端のメチオニン残基を有するリコンビナントのヒトタンパク質、Ｇ−ＣＳＦの融合タンパク質、および天然に発生するＧ−ＣＳＦの１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入により得られるＧ−ＣＳＦタンパク質など）が含まれる。このＧ−ＣＳＦは、グリコシル化されたものでも、非グリコシル化のものでもよい。非グリコシル化のＧ−ＣＳＦは、例えば、大腸菌などの原核生物の細胞で発現させることにより得られるが、グリコシル化されたＧ−ＣＳＦは、天然の供給源から分離することにより、ＣＨＯ細胞などの原核生物の細胞で発現させることにより、または合成的グリコシル化により得ることができる。合成的に修飾されたＧ−ＣＳＦは、例えば、酵素的グリコシル化により、または化学的ペグ化により得ることができる。本発明による組成物に有用なＧ−ＣＳＦの変異体は、例えば、欧州特許公開第０４５６２００号に記載されている。好ましくは、リコンビナントの非グリコシル化のＧ−ＣＳＦが本発明による組成物に用いられ、より好ましい実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは、例えば、ドイツ特許公開第３７２３７８１号に示されたヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列、またはそれらに由来する配列を含む。
【００２０】
本発明による水性組成物、凍結乾燥品、および粉末を調製する場合に、緩衝物質であるコハク酸および酒石酸は、遊離酸の形態で使用してもよく、塩の形態で使用してもよい。コハク酸および酒石酸の塩として、特に生理的に許容される塩、例えば、アルカリ塩、アルカリ土類塩、またはアンモニウム塩が使用される。アルカリ塩およびアンモニウム塩、特に二ナトリウム塩が好ましい。所望により、本発明による水性組成物は、コハク酸および酒石酸の他にさらなる緩衝物質を含むことができるが、これは必須ではない。
【００２１】
緩衝物質であるコハク酸および酒石酸の濃度は、所望のｐＨ値でｐＨ安定化効果も十分な緩衝能も達成されるが、同時に凝集を避けるためにイオン濃度およびそれによる伝導度をできるだけ低く保つように選択すると有利である。通常、水性組成物で緩衝物質が使用される濃度は、０．５〜１５０ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭ、例えば、２〜２０ｍＭである。コハク酸と酒石酸を組み合わせて用いる場合、これらの緩衝物質の全濃度がこれらの範囲内であると有利である。
【００２２】
本発明による組成物のｐＨ値は、通常３．５〜６．０、例えば、４．０〜５．９である。好ましくは、ｐＨは４．０を超え、例えば４．１〜５．７であり、特に４．２〜５．５であり、例えば４．５〜５．５である。所望により、他の酸および塩基を使用して、ｐＨ値を所望の値にさらに調製してもよい。適切な酸は、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、およびリン酸二水素ナトリウムまたはカリウムである。適切な塩基は、例えば、水酸化アルカリおよび水酸化アルカリ土類、炭酸アルカリ、酢酸アルカリ、クエン酸アルカリ、およびリン酸水素二アルカリ、例えば、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよび二カリウム、ならびにアンモニアである。
【００２３】
本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦの濃度は、使用目的に実質的に依存する。濃度の上限は、緩衝液におけるＧ−ＣＳＦの溶解性に起因する。薬剤組成物では、Ｇ−ＣＳＦは薬剤として有効な量で存在し、濃度は通常５ｍｇ／ｍｌ以下であり、例えば、０．０００１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０００５〜４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００１〜２．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．０１〜１．５ｍｇ／ｍｌである。しかし、バルク溶液（より高い濃度の出発溶液）では、濃度は１０ｍｇ／ｍｌおよびそれを超えてもよい。
【００２４】
本発明による組成物は、さらなる一般的な、特に生理的に許容される安定化剤、および／または補助剤、および不活性成分、例えば、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、助溶剤（ｃｏｓｏｌｖｅｎｔｓ）、希釈剤、およびカオトロピック剤を含むことができる。
【００２５】
好ましくは、本発明による組成物は、１つまたは複数の界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、ＥＰ−Ａ−１ １９７ ２２１に記載されているもの、特に脂肪族脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステルを含む。例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ２０の商標名で入手可能）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ６０）、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ６５）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ８０）、およびトリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ８５）を挙げることができ、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンが好ましい。本発明の有利な安定化緩衝系のため、これらの界面活性剤を、所望により、大変少ない量で、例えば、組成物の全体積に対して０．０００５〜０．０４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１〜０．０２％（ｗ／ｖ）の量で用いることができる。
【００２６】
本発明による組成物は、特に薬剤の目的に使用する場合、患者の血液と等張であると有利である。これは、緩衝物質の適切な濃度を選択することにより、早くも実現することができる。しかし、生理的に良好に許容される組成物を製造するために、糖または糖アルコールなどのさらなる等張化剤を加えてもよい。適切な等張化剤は、例えば、ショ糖、マルトース、フルクトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールである。好ましくは、マンニトールおよびソルビトールが用いられる。等張化するために塩を使用することも可能であるが、イオン濃度が大変高いとＧ−ＣＳＦの凝集体の形成に好都合に働くので、塩は通常低濃度でのみ加える。等張化剤は、通常、組成物の全体積に対して１０．０％（ｗ／ｖ）までの量で加える。好ましくは７．５％までの量、より好ましくは６．０％までの量、例えば０．１〜５．５％（ｗ／ｖ）が用いられる。
【００２７】
アミノ酸として、例えば、グリシン、スレオニン、トリプトファン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、オルニチン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、またはこれらの塩が用いられる。アミノ酸またはアミノ酸の塩は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で用いると適切である。
【００２８】
適切な還元剤は、特にイオウ含有の還元剤、例えば、チオグリセロール、グルタチオン、ジチオグリコール、チオジグリコール、Ｎ−アセチルシステイン、チオソルビトール、チオエタノールアミン、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ジチオスレイトール、または特に１〜７個の炭素原子を有するチオアルカン酸（ｔｈｉｏａｌｋａｎｅ ａｃｉｄｓ）がある。還元剤は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で用いると適切である。
【００２９】
抗酸化剤として、例えば、アスコルビン酸またはその塩、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸ステアレート、没食子酸トリアミル（ｔｒｉａｍｙｌ ｇａｌｌａｔｅ）、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、およびブチルヒドロキシアニソールを用いることができる。抗酸化剤は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で用いると適切である。
【００３０】
有用な錯化剤は、例えば、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、またはメタリン酸ナトリウムである。好ましくは、遊離酸またはその塩の形態のクエン酸塩が錯化剤として用いられる。錯化剤は、通常０．０１〜２０ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭ、最も好ましくは０．２〜５ｍＭの濃度で用いられる。
【００３１】
カオトロピック剤として、例えば、尿素、塩酸グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、またはイソシアン酸グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｉｓｏｃｉａｎａｔｅ）を用いることができる。カオトロピック剤は、０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜３０ｍＭの濃度で用いると適切である。
【００３２】
所望により、本発明によるＧ−ＣＳＦ含有組成物は、ヒト血清タンパク質などのさらなるタンパク質も含むことができる。しかし、外来のタンパク質に関連する危険性のため、さらなるタンパク質のない組成物が好ましい。
【００３３】
本発明による組成物の調製は、それ自体が周知の方法で行うことができる。通常は、緩衝物質、ならびに任意選択でさらなる安定化剤、および／または補助剤、および不活性成分を、適切な量で、通常は滅菌水である水性溶剤に最初に溶解する。必要であれば、コハク酸および／または酒石酸の溶液を用いて、あるいは、例として上記に述べたもののような他の酸または塩基を用いてｐＨ値を調整する。滅菌フィルターを通したろ過などの通常の滅菌段階の後、Ｇ−ＣＳＦを所望の濃度で加える。しかし、最初に水性溶剤中のＧ−ＣＳＦを提供し、次いでコハク酸および／または酒石酸でｐＨを所望の値に調整することも可能である。
【００３４】
本発明による組成物は、特に薬剤組成物として使用され、安定化剤、および補助剤、および任意選択で存在する不活性成分は、生理的に許容されなければならない。この薬剤組成物は、様々な適用形態で用いることができる。
【００３５】
例えば、この組成物は、特に、静脈投与、筋肉内投与、または皮下投与のための、注射または注入のための溶液、あるいは経口投与のための組成物であることができる。しかし、この組成物を、ヒドロゲルまたはリポソームなどのさらなる薬剤適用形態を製造するために用いることもできる。これらの医薬製剤を、Ｇ−ＣＳＦを用いることができるあらゆる適応症に、例えば、好中球減少症の治療に、骨髄移植に、および感染性疾患および腫瘍疾患の治療に用いることができる。
【００３６】
さらに、本発明の目的は、遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む、Ｇ−ＣＳＦ含有の凍結乾燥品および粉末である。このような凍結乾燥品および粉末は、例えば、単に凍結乾燥により、または噴霧乾燥などにより、それ自体が周知の方法で、上記に記載された水性組成物から得ることができる。これらの凍結乾燥品および粉末では、Ｇ−ＣＳＦ、コハク酸および／または酒石酸、ならびに任意選択でさらなる緩衝物質、安定化剤、および補助剤、および不活性成分は、水中に再び溶解したときに、対応する水性組成物と同様に高温でも長期間にわたり安定であるＧ−ＣＳＦ含有組成物が得られるような量で存在する。
【００３７】
本発明による凍結乾燥品または粉末を、例えば、凍結乾燥品または粉末が適切な量の水性溶剤から物理的に分離されている医薬キットの形態で提供することができる。次いで、この安定な緩衝化された水性組成物を、あらゆる所望のときに、例えば医療関係者が、調製することができる。
【００３８】
一代替として、安定な水性組成物を調製するために必要な緩衝物質、および任意選択でさらなる安定化剤、補助剤および不活性成分は、水性溶剤のみに存在することができ、凍結乾燥品または粉末はＧ−ＣＳＦを含むにすぎず、あるいは緩衝物質、安定化剤、および補助剤、および不活性成分は、凍結乾燥品または粉末にも、水性溶剤にも存在することができる。
【００３９】
本発明は、ここで以下の実施例により、より詳細に説明するが、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００４０】
１．長期間のインキュベートおよび高ｐＨおよび高温後の、Ｇ−ＣＳＦ含有組成物の安定性
【００４１】
最初に、緩衝物質である二ナトリウム塩の形態のコハク酸および酒石酸を、ポリソルベート８０およびマンニトールの蒸留滅菌水溶液と共に溶解し、次いで、コハク酸または酒石酸の緩衝液を用いてｐＨ値を所望の値に調整して、Ｇ−ＣＳＦ含有組成物を室温で調製した。滅菌フィルター（孔径０．２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を通してろ過した後、市販の非グリコシル化のリコンビナントヒトＧ−ＣＳＦを加えた。
【００４２】
このようにして調製した、本発明による組成物の正確な製剤、およびそのｐＨ値を、以下の表１〜６に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
【表６】
【００４９】
このようにして調製した５００μｌの組成物を、エッペンドルフ管で、４±１℃、２５±１℃、および３７±１℃で８週間インキュベートした。０．５％（ｗ／ｖ）マンニトールおよび０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０中Ｇ−ＣＳＦ０．３ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有製剤、ならびに０．５％（ｗ／ｖ）マンニトールおよび０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ４．０、５．０、および７．５中Ｇ−ＣＳＦ０．３ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有製剤を、対照として使用した。
【００５０】
インキュベートの間、様々な時間点でサンプルを採取し、化学的に非修飾の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量に関して、およびＧ−ＣＳＦの生物学的活性に関して分析した。単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量が多く、および／またはＧ−ＣＳＦタンパク質の生物学的活性が実質的に一定であったことより、タンパク質の化学的修飾がなく、またはわずかな化学的修飾しか生じなかったことが示された。
【００５１】
化学的に非修飾の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量の測定を、Ｃ４ Ｖｙｄａｃカラムを使用して逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で行った。移動相は、溶離液Ａとしてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化した水、および溶離液ＢとしてＴＦＡで酸性化したアセトニトリルを含んでいた。ＡとＢのリニアグラジエントで、流速０．２ｍｌ／分で１時間、クロマトグラフィーを行った。注入量は５μｌだった。検出波長は２０６ｎｍで、外部標準物質として既知のＧ−ＣＳＦの希釈物を用いて評価を行った。Ｇ−ＣＳＦの残留量は、Ｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．の方法（上述）に従って、１００％に設定した０日目の単量体Ｇ−ＣＳＦの初期含有量のピーク面積（ＰＡ）の％として決定した。
【００５２】
長期間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの生物学的活性を決定することによるＧ−ＣＳＦの安定化の証明を、ＮＦＳ−６０バイオアッセイを用いて行った（Ｔｏｈｙａｍａ，Ｋ．ら、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８０巻、３３５〜３４０頁、１９８９年）。このアッセイでは、様々な濃度のＧ−ＣＳＦに対する反応として細胞増殖の誘発を測定することにより、Ｇ−ＣＳＦの活性を決定した。デヒドロゲナーゼの活性を測定することにより、ＮＦＳ−６０細胞の増殖を追跡した。デヒドロゲナーゼは、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）２，５−ジフェニルテトラゾリウム（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｔｈｏｌｙｌ−２）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）（ＭＴＴ）を還元して、ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を生じるが、これを対照波長６２０ｎｍを用い検出波長５７０ｎｍで測光法により決定することができる。デヒドロゲナーゼ活性、および、したがって形成されたホルマザンの量は、ＮＦＳ−６０細胞の細胞計測数に直接相関がある。
【００５３】
得られた結果を、以下に記載する。
【００５４】
＜コハク酸緩衝液を含む製剤において２５℃でインキュベートした後のＧ−ＣＳＦの残留量＞
【００５５】
４週間および８週間インキュベートした後に２５℃でインキュベートした組成物１〜２７をＲＰ−ＨＰＬＣ分析したところ（表１〜３、図１〜３）、２５℃で８週間インキュベートした後でも、２０、１０、および５ｍＭコハク酸緩衝液中におけるＧ−ＣＳＦの含有量は、組成物中の初期含有量に比べて依然として大変高いことが示された。本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦの安定性は、１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．０を含む従来の製剤におけるＧ−ＣＳＦの安定性と比較可能であるが、ただし、かなり高いｐＨ値においてである。図１〜３は、様々なｐＨ値のコハク酸緩衝液を含む製剤の代表例を、ｐＨ４．０の従来の酢酸製剤と比較して示す。図１は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．５、５．０、および６．０の２０ｍＭコハク酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。図２は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．０、４．５、５．０、および６．０の１０ｍＭコハク酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。図３は、試験開始時、ならびにｐＨ４．０、４．５、５．５、および６．０の５ｍＭコハク酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。
【００５６】
４℃でインキュベートした場合、酢酸塩、およびコハク酸／酒石酸で緩衝化したＧ−ＣＳＦ溶液は、記載されたｐＨの範囲内で比較可能であった（データは示さず）。
【００５７】
＜酒石酸緩衝液を含む製剤において２５℃でインキュベートした後のＧ−ＣＳＦの残留量＞
【００５８】
４週間および８週間インキュベートした後に２５℃でインキュベートした、組成物２８〜５４をＲＰ−ＨＰＬＣ分析したところ（表４〜６、図４〜６）、２５℃で８週間インキュベートした後でも、２０、１０、および５ｍＭ酒石酸緩衝液におけるＧ−ＣＳＦの含有量は、組成物中の初期含有量に比べて依然として大変高いことが示された。再度、本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦの安定性は、１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．０を含む従来の製剤におけるＧ−ＣＳＦの安定性と比較可能であった。図４〜６は、ｐＨ４．０の従来の酢酸塩の製剤と比較した、様々なｐＨ値の酒石酸緩衝液を含む製剤の代表例を示す。図４は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．０、５．０、５．５、および６．０の２０ｍＭ酒石酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。図５は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．５、５．５、および６．０の１０ｍＭ酒石酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。図６は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．０、４．５、５．０、および６．０の５ｍＭコハク酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの量を示す。
【００５９】
４℃でインキュベートした場合、酢酸塩、およびコハク酸／酒石酸で緩衝化したＧ−ＣＳＦ溶液は、記載されたｐＨの範囲内で比較可能であった（データは示さず）。
【００６０】
＜様々な緩衝液において３７度でインキュベートした後のＧ−ＣＳＦの残留量＞
【００６１】
さらなる試験では、１０ｍＭコハク酸および酒石酸緩衝液、ｐＨ５．０において（製剤５８および５９）、１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０において（製剤６０）、ならびに１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ４．５、５．０、および７．５において（製剤５５〜５７）、３７℃におけるＧ−ＣＳＦの長期の安定性を測定した（表７）。単量体Ｇ−ＣＳＦの量を、前の試験同様ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて測定し、図７および８に図示する。結果は、コハク酸緩衝液および酒石酸緩衝液を含む製剤中のＧ−ＣＳＦの含有量は、９０日インキュベートした後でも１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０中に観察される含有量と比較可能であったことを示している。それとは対照に、ｐＨ５．０の１０ｍＭリン酸緩衝液を含む製剤中のＧ−ＣＳＦの含有量は１３日後でも劇的に減少し、２０日後では無視できるほどに低値である。
【００６２】
【表７】
【００６３】
＜コハク酸緩衝液および酒石酸緩衝液中で２５℃および３７℃でインキュベートした後のＧ−ＣＳＦの生物学的活性＞
【００６４】
上記２．２の下に記載されたバイオアッセイを用いて、２５℃および３７℃で貯蔵したいくつかの代表的製剤（表１〜６の、３、４、５、１３、１４、２３、３２、および４１）を分析すると、本発明による緩衝物質であるコハク酸または酒石酸を様々な濃度（５〜２０ｍＭ）で、かつ様々なｐＨ値（ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５）で含むＧ−ＣＳＦ製剤の生物学的活性は、９０日のインキュベート後でさえも、かつ２５℃および３７℃のストレスの条件下でも依然として初期の活性の８０〜１２０％であることが示された（表８）。
【００６５】
【表８】
【００６６】
上記に記載した試験は、本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦの活性は、生理的ｐＨ値に近いｐＨ値でも、長期間にわたり、かつ少なくとも３７℃までの温度で安定であることを実証している。結果は、１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．０における製剤と比較可能であり、ｐＨ５．０および７．５の１０ｍＭリン酸緩衝液を含む製剤よりも大幅に優れている。
【００６７】
２．機械的応力に対するＧ−ＣＳＦ製剤の安定性
【００６８】
Ｇ−ＣＳＦ含有組成物を、実施例１に記載したとおりに、室温で、最初に緩衝物質である二ナトリウム塩の形態のコハク酸および酒石酸を、任意選択で界面活性剤（ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）および等張化剤（マンニトールまたはソルビトール）と共に、蒸留滅菌水中に溶解し、次いでコハク酸緩衝液または酒石酸緩衝液を用いてｐＨ値を所望の値に調整することにより調製した。滅菌フィルター（孔径０．２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を通してろ過した後、市販の非グリコシル化リコンビナントヒトＧ−ＣＳＦを加えた。
【００６９】
ＳＣＦインスタントシリンジ（ｉｎｓｔａｎｔ ｓｙｒｉｎｇｅｓ）（フランス、グルノーブル、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、調製した組成物のサンプルを５００μｌ充填し、機械的応力を生じるために、室温で、Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標）装置上で１０秒間撹拌した。
【００７０】
撹拌後の凝集に関するＧ−ＣＳＦ組成物の試験を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １１００装置を用いてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社のＢｉｏＳｅｐ ＳＥＣ Ｓ２０００カラム（７．８×３００ｍｍ、５μｍ）でサイズ排除クロマトグラフィーにより行った。溶離液として、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０を使用した。イソクラティックにより流速０．４ｍｌ／分で４５分間、カラム温度２０℃で分析を行った。注入量は１５〜２５μｌであり、１５μｇのタンパク質量に相当する。検出波長は２１４ｎｍであり、Ｂｉｏｒａｄ社のゲルろ過標準物質（ＢｉｏＲａｄ Ａｒｔ．Ｎｏｓ．１５１〜１９０１）を用い、溶出体積に対する分子量をプロットすることによりサイズの評価を行った。凝集体の形成は％で表され、機械的応力を与える前の単量体Ｇ−ＣＳＦの初期含有量に対する、サンプル中のＧ−ＣＳＦの二量体および高次の凝集体の量を示し、存在する単量体および凝集体に対するピーク面積から計算される。
【００７１】
サンプルの組成、および試験の結果を、以下の表９に示す。示した値は、各３回の試験の平均値を表す。
【００７２】
【表９】
【００７３】
結果は、高温でｐＨ値が５．０でも、コハク酸で緩衝化した製剤では、酢酸塩で緩衝化した製剤よりも、機械的応力を与えた後の凝集が少ないことを示している。したがって、本発明による組成物は、従来の組成物よりも機械的応力に対してより安定している。
【００７４】
３．凍結および解凍後のＧ−ＣＳＦ製剤の安定性
【００７５】
３．１ 低濃度の組成物の安定性
【００７６】
Ｇ−ＣＳＦ濃度が０．６ｍｇ／ｍｌであるＧ−ＣＳＦ含有組成物を調製した。実施例２に記載したとおりに調製を行った。
【００７７】
安定性を試験するために、調製した組成物のサンプル５００μｌを、−７０℃で一晩サンプルを凍結させ翌日２０℃で解凍することにより１回の凍結／解凍サイクル下においた。解凍後、単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量について、実施例２に記載したＳＥＣを用いてサンプルを速やかに分析した。
【００７８】
試験の結果を以下の表１０に示す。示した値は、３回の試験の平均値である。
【００７９】
【表１０】
【００８０】
３．２ 高濃度の組成物の安定性
【００８１】
実施例３．１にしたがって、Ｇ−ＣＳＦ含有組成物を調製した。ただしＧ−ＣＳＦ濃度は３．０ｍｇ／ｍｌとした。
【００８２】
実施例３．１に記載したように安定性の試験を行った。ただし調製した組成物のサンプル１０００μｌを凍結／解凍サイクルに用いた。解凍後、実施例２に記載したようにサンプルをＳＥＣにさらし、サンプル中のＧ−ＣＳＦ２量体および高次の凝集体の含有量を決定し、サンプル中の単量体Ｇ−ＣＳＦの初期含有量に対する％で表した。
【００８３】
試験の結果を、以下の表１１に示す。示された値は、３回の試験の平均値である。
【００８４】
【表１１】
【００８５】
２量体および高次の凝集体の形成は、また、等電点電気泳動法により確認した（結果は示さず）。
【００８６】
結果は、１回の凍結／解凍サイクル後、コハク酸で緩衝化したＧ−ＣＳＦ製剤は、４．０を超えるｐＨ値でも殆ど未変化の形態のＧ−ＣＳＦを依然として含むが、酢酸塩で緩衝化した製剤中の単量体Ｇ−ＣＳＦの含有量は大幅に減少することを示している。本発明による組成物は、したがって、従来の組成物よりも大幅に凍結／解凍サイクルに安定である。
【００８７】
結論として、上記の試験は、本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦは、生理的ｐＨ値に近いｐＨ値において、かつ少なくとも３７℃までの温度で、長期間にわたり安定であることを示している。したがって、本発明による組成物は、例えば、生理的ｐＨ値による皮膚刺激を避けることができる注射用溶液に大変有用である。コハク酸および／または酒石酸の存在により、タンパク質を再構成する場合、例えば溶解中に、望ましくないＧ−ＣＳＦの反応をさらに防止する。加えて、本発明による組成物は機械的応力に対して安定であり、そのためこれらの製剤は、難なくろ過し、バイアルに満たし、またはシリンジに充填することができるだけではなく、あらゆる危険性なしに長距離にわたり輸送することもできる。本発明による組成物は、繰返しの凍結および解凍に対しても安定であり、このためＧ−ＣＳＦ製剤の貯蔵安定性をさらにもっと延長することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＲＰ−ＨＰＬＣで測定し、０日目の単量体Ｇ−ＣＳＦ（１００％）の初期含有量のピーク面積（ＰＡ）の％として表した、ｐＨ値４．５〜６．０の２０ｍＭコハク酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図２】ｐＨ値４．０〜６．０の１０ｍＭコハク酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図３】ｐＨ値４．０〜６．０の５ｍＭコハク酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図４】ｐＨ値４．０〜６．０の２０ｍＭ酒石酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図５】ｐＨ値４．５〜６．０の１０ｍＭ酒石酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図６】ｐＨ値４．０〜６．０の５ｍＭ酒石酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図７】ｐＨ４．５、５．０、および７．５の１０ｍＭリン酸緩衝液で３７℃で１３日および２０日インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を示す図である。
【図８】ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸緩衝液または酒石酸緩衝液で３７℃で３０日および９０日インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦを含む水性組成物、Ｇ−ＣＳＦの凍結乾燥品または粉末、およびこれらの凍結乾燥品または粉末を含む医薬キットに関する。
【発明の詳細な説明】
【０００２】
Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）は、サイトカインのファミリーに属する、天然に存在する増殖因子である。Ｇ−ＣＳＦは、造血において決定的な役割を果たし、好中球および好中球の後続細胞の成熟、増殖、分化、および生存を高める。臨床上では、Ｇ−ＣＳＦは、腫瘍の制御に、特に化学療法後の好中球減少症の治療に主に用いられ、骨髄移植および感染性疾患の治療にも適用される。
【０００３】
天然に存在する形態のヒトＧ−ＣＳＦは、システイン残基を５個有する分子量約２００００の糖タンパク質である。これらの残基のうち４個は、タンパク質の活性に決定的である分子内ジスルフィド結合を２つ形成している。Ｇ−ＣＳＦは、その天然の供給源から少量しか得ることができないので、薬物を調製するためには、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞などの哺乳動物の細胞、または大腸菌などの原核生物の細胞で発現させることにより得ることができるリコンビナントの形態のＧ−ＣＳＦが主に用いられる。哺乳動物の細胞で発現されるリコンビナントのタンパク質は、グリコシル化のパターンが異なるという点で天然に存在するＧ−ＣＳＦと異なるが、大腸菌で発現された、細菌での発現の結果としてさらなるＮ末端のメチオニン残基を有することがあるタンパク質は、完全にグリコシル化を欠いている。
【０００４】
Ｇ−ＣＳＦの製剤は、タンパク質が高度に疎水性であるために、特に、非グリコシル化のリコンビナントの形態のタンパク質の場合は比較的不安定である。分子はバイアル、シリンジなどの壁面に容易に吸着し、二量体またはより高次の凝集体を形成し、脱アミド、酸化、ジスルフィド結合の切断、またはタンパク質分解などの化学的修飾を受けるので、特にタンパク質を長期間貯蔵する際に、活性の損失のあることが多い。これは、例えば、Ｇ−ＣＳＦを一定の投与量で長期間にわたり投与する場合には、一方では費用上の理由で、他方では治療上の理由で不都合である。さらに、例えば、二量体化、酸化、または分解により形成された生成物は、望ましくない免疫反応を引き起こすことがある。加えて、従来のＧ−ＣＳＦ製剤は、例えば、輸送中に液体製剤を振盪した結果生じるかもしれない機械的応力に、および１回のまたは繰返しの凍結および解凍に感受性がある。両者とも、多量体および凝集体の望ましくない形成、ならびに活性の損失をもたらすこともある。
【０００５】
ドイツ特許公開第３７２３７８１号明細書は、有効成分としてＧ−ＣＳＦを含む、少なくとも１つの製薬上許容される界面活性剤、サッカライド、タンパク質、または有効成分を安定化するための高分子量の化合物を含む薬物を記載している。特に有利な界面活性剤として、脂肪族脂肪酸、例えば、モノオレイン酸またはモノラウリル酸の、ポリオキシソルビタンエステルが提唱されており、これらはヒト血清アルブミンおよびマンニトールと一緒に使用される。界面活性剤は、Ｇ−ＣＳＦの重量に対し１〜１００００部の重量の量で用いるのが好ましい。ｐＨ値７．４が特定される水性のリン酸塩で緩衝化した製剤は、長時間にわたり４℃で安定である。
【０００６】
しかし、記載されている医薬製剤にはいくつかの欠点がある。例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）などの界面活性剤が、特により高濃度で存在すると薬物の投与時に局所刺激を生じる可能性があるので、医学上完全に安全というわけではない。さらに、高温では、このような界面活性剤は、記載されているリン酸緩衝液中では、Ｇ−ＣＳＦの遊離システイン残基の接近性がより良くなるので、望ましくない二量体および多量体の形成に好都合に働き、したがってＧ−ＣＳＦの活性は高温では大変速やかに減少する。さらに安定化剤として大量に用いられるヒトおよび動物起源のタンパク質およびペプチドには抗原性の性質があるため、ヒトに免疫反応を引き起こすことがあるので、同様に潜在的なリスクを伴い、ウィルス汚染もまた完全に排除されないことがある。
【０００７】
欧州特許出願公開第０３７３６７９号明細書は、Ｇ−ＣＳＦを、伝導率ができるだけ低いと有利である、ｐＨ値が２．７５〜４．０の溶液中に調合すると、長期間にわたり安定を保つことができることを開示している。これらの製剤では、Ｇ−ＣＳＦの凝集を避けるために緩衝液を使用しないことが好ましいが、カルボン酸、クエン酸、乳酸、または酒石酸を、緩衝物質として２ｍＭ未満の少量で用いてもよい。しかし、生理的ｐＨ値に近いｐＨ値を有する安定な製剤は、これらの条件下では不可能である。
【０００８】
Ｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．ら（「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ），ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ」、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇｓ、ｐ．３０３−ｐ．３２８、Ｒ．ＰｅａｒｌｍａｎおよびＹ．Ｊ．Ｗａｎｇ編集、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９６年）は、酢酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ４．０、０．５％マンニトール、および０．００４％ポリソルベート８０を含む、非グリコシル化のリコンビナントＧ−ＣＳＦの安定化した組成物を記載している。このような組成物は、２〜８℃で、２４ヶ月を超える間安定である。しかし、この系を使用して、よりｐＨ値の高い安定な組成物は可能ではない。
【０００９】
国際公開第９４／１４４６６号パンフレットは、緩衝物質として酢酸、乳酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、アルギニン、およびこれらの塩を含むことができ、ｐＨ値が２．５〜５．０および７〜８であるＧ−ＣＳＦ含有の水性医薬製剤を開示している。これらの製剤では、例えば、溶液の振盪中に起こることがあるような機械的応力によるＧ−ＣＳＦの多量体および凝集体の形成は減少する。しかし、特に高温では、これらの調製物におけるＧ−ＣＳＦの活性は速やかに減少し、長期の安定性は十分ではない。
【００１０】
欧州特許出願公開第０３０６８２４号は、ヒトタンパク質、特に、エリスロポエチンの安定化した調製物を記載しており、この調製物では、尿素、アミノ酸、および洗浄剤を添加することにより安定化が実現される。リン酸緩衝液など、注射用の溶液に用いられる緩衝液では、Ｇ−ＣＳＦはやはり高温では十分に安定ではない。
【００１１】
国際公開第９４／１４４６５号パンフレットは、マルトース、サッカロース、ラフィノース、トレハロース、またはアミノ糖を含む、Ｇ−ＣＳＦの凍結乾燥した医薬製剤を開示している。しかし、これらの凍結乾燥物の水溶液も、長期間にわたり十分に安定ではない。
【００１２】
欧州特許出願公開第１１９７２２１号は、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、およびアスパラギン、ならびに１つまたは複数の疎水性アミノ酸の群の、１つまたは複数のアミノ酸を含む、ｐＨ値が５〜７である長期間安定なＧ−ＣＳＦ製剤を開示している。Ｇ−ＣＳＦ分子のメチオニン残基の酸化を避けるために、製剤にアミノ酸であるメチオニンを加えている。
【００１３】
本発明の目的は、血清タンパク質が存在しなくても、広いｐＨ範囲にわたり、高温で長期間にわたり安定であり、特に、薬剤の適用に有用である水性のＧ−ＣＳＦ含有の組成物を提供することであった。
【００１４】
今や驚くべきことに、緩衝物質としてコハク酸および／または酒石酸を含む水性のＧ−ＣＳＦ含有の組成物では、Ｇ−ＣＳＦ分子の二量体化または酸化などの化学的修飾は殆ど起こらないので、このような組成物は、高温でも、長期間にわたり、広範なｐＨ内で、かつ生理的条件に近いｐＨ値でも安定であることが見出されている。したがって、長期間貯蔵しても、活性の損失は殆どない。Ｇ−ＣＳＦ含有の凍結乾燥品または粉末を、再構成し、または溶解する場合でも、機械的応力の下、例えば、Ｇ−ＣＳＦ含有の組成物をろ過し、バイアルに満たし、シリンジに充填し、輸送する間、および凍結し、解凍する間、コハク酸および／または酒石酸の存在により、Ｇ−ＣＳＦタンパク質の望ましくない凝集または他の二次反応が防止され、したがって活性の損失が防止される。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、緩衝物質として遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性Ｇ−ＣＳＦ含有組成物、その調製方法、ならびに医薬製剤を製造するためのそれらの使用である。
【００１６】
本発明の別の一目的は、Ｇ−ＣＳＦ、ならびに遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む凍結乾燥品および粉末、それらを調製するための方法、ならびに医薬製剤を製造するためのそれらの使用である。
【００１７】
本発明の別の一目的は、物理的に分離したａ）Ｇ−ＣＳＦ含有の凍結乾燥品または粉末、ならびにｂ）遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性溶剤を含む医薬キットである。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、特許請求の範囲、および以下の説明から明らかとなる。
【００１９】
本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦタンパク質は、哺乳動物、特にヒトからのあらゆるＧ−ＣＳＦタンパク質であってもよく、それらに由来する変異体がヒトＧ−ＣＳＦに特徴的である造血において生物学的活性を実質的に有する限り、変異体であってもよい。本明細書で用いられるＧ−ＣＳＦは、したがって、天然起源のＧ−ＣＳＦ、および合成またはリコンビナントのＧ−ＣＳＦ、ならびにこれらの変異体（例えば、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を原核生物で発現させた場合に得られるＮ末端のメチオニン残基を有するリコンビナントのヒトタンパク質、Ｇ−ＣＳＦの融合タンパク質、および天然に発生するＧ−ＣＳＦの１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入により得られるＧ−ＣＳＦタンパク質など）が含まれる。このＧ−ＣＳＦは、グリコシル化されたものでも、非グリコシル化のものでもよい。非グリコシル化のＧ−ＣＳＦは、例えば、大腸菌などの原核生物の細胞で発現させることにより得られるが、グリコシル化されたＧ−ＣＳＦは、天然の供給源から分離することにより、ＣＨＯ細胞などの原核生物の細胞で発現させることにより、または合成的グリコシル化により得ることができる。合成的に修飾されたＧ−ＣＳＦは、例えば、酵素的グリコシル化により、または化学的ペグ化により得ることができる。本発明による組成物に有用なＧ−ＣＳＦの変異体は、例えば、欧州特許公開第０４５６２００号に記載されている。好ましくは、リコンビナントの非グリコシル化のＧ−ＣＳＦが本発明による組成物に用いられ、より好ましい実施形態では、Ｇ−ＣＳＦは、例えば、ドイツ特許公開第３７２３７８１号に示されたヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列、またはそれらに由来する配列を含む。
【００２０】
本発明による水性組成物、凍結乾燥品、および粉末を調製する場合に、緩衝物質であるコハク酸および酒石酸は、遊離酸の形態で使用してもよく、塩の形態で使用してもよい。コハク酸および酒石酸の塩として、特に生理的に許容される塩、例えば、アルカリ塩、アルカリ土類塩、またはアンモニウム塩が使用される。アルカリ塩およびアンモニウム塩、特に二ナトリウム塩が好ましい。所望により、本発明による水性組成物は、コハク酸および酒石酸の他にさらなる緩衝物質を含むことができるが、これは必須ではない。
【００２１】
緩衝物質であるコハク酸および酒石酸の濃度は、所望のｐＨ値でｐＨ安定化効果も十分な緩衝能も達成されるが、同時に凝集を避けるためにイオン濃度およびそれによる伝導度をできるだけ低く保つように選択すると有利である。通常、水性組成物で緩衝物質が使用される濃度は、０．５〜１５０ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭ、例えば、２〜２０ｍＭである。コハク酸と酒石酸を組み合わせて用いる場合、これらの緩衝物質の全濃度がこれらの範囲内であると有利である。
【００２２】
本発明による組成物のｐＨ値は、通常３．５〜６．０、例えば、４．０〜５．９である。好ましくは、ｐＨは４．０を超え、例えば４．１〜５．７であり、特に４．２〜５．５であり、例えば４．５〜５．５である。所望により、他の酸および塩基を使用して、ｐＨ値を所望の値にさらに調製してもよい。適切な酸は、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、およびリン酸二水素ナトリウムまたはカリウムである。適切な塩基は、例えば、水酸化アルカリおよび水酸化アルカリ土類、炭酸アルカリ、酢酸アルカリ、クエン酸アルカリ、およびリン酸水素二アルカリ、例えば、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよび二カリウム、ならびにアンモニアである。
【００２３】
本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦの濃度は、使用目的に実質的に依存する。濃度の上限は、緩衝液におけるＧ−ＣＳＦの溶解性に起因する。薬剤組成物では、Ｇ−ＣＳＦは薬剤として有効な量で存在し、濃度は通常５ｍｇ／ｍｌ以下であり、例えば、０．０００１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０００５〜４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００１〜２．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、０．０１〜１．５ｍｇ／ｍｌである。しかし、バルク溶液（より高い濃度の出発溶液）では、濃度は１０ｍｇ／ｍｌおよびそれを超えてもよい。
【００２４】
本発明による組成物は、さらなる一般的な、特に生理的に許容される安定化剤、および／または補助剤、および不活性成分、例えば、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、助溶剤（ｃｏｓｏｌｖｅｎｔｓ）、希釈剤、およびカオトロピック剤を含むことができる。
【００２５】
好ましくは、本発明による組成物は、１つまたは複数の界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、ＥＰ−Ａ−１ １９７ ２２１に記載されているもの、特に脂肪族脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタンエステルを含む。例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ２０の商標名で入手可能）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ４０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ６０）、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ６５）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ８０）、およびトリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート ８５）を挙げることができ、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンが好ましい。本発明の有利な安定化緩衝系のため、これらの界面活性剤を、所望により、大変少ない量で、例えば、組成物の全体積に対して０．０００５〜０．０４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１〜０．０２％（ｗ／ｖ）の量で用いることができる。
【００２６】
本発明による組成物は、特に薬剤の目的に使用する場合、患者の血液と等張であると有利である。これは、緩衝物質の適切な濃度を選択することにより、早くも実現することができる。しかし、生理的に良好に許容される組成物を製造するために、糖または糖アルコールなどのさらなる等張化剤を加えてもよい。適切な等張化剤は、例えば、ショ糖、マルトース、フルクトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールである。好ましくは、マンニトールおよびソルビトールが用いられる。等張化するために塩を使用することも可能であるが、イオン濃度が大変高いとＧ−ＣＳＦの凝集体の形成に好都合に働くので、塩は通常低濃度でのみ加える。等張化剤は、通常、組成物の全体積に対して１０．０％（ｗ／ｖ）までの量で加える。好ましくは７．５％までの量、より好ましくは６．０％までの量、例えば０．１〜５．５％（ｗ／ｖ）が用いられる。
【００２７】
アミノ酸として、例えば、グリシン、スレオニン、トリプトファン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、オルニチン、フェニルアラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、またはこれらの塩が用いられる。アミノ酸またはアミノ酸の塩は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で用いると適切である。
【００２８】
適切な還元剤は、特にイオウ含有の還元剤、例えば、チオグリセロール、グルタチオン、ジチオグリコール、チオジグリコール、Ｎ−アセチルシステイン、チオソルビトール、チオエタノールアミン、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ジチオスレイトール、または特に１〜７個の炭素原子を有するチオアルカン酸（ｔｈｉｏａｌｋａｎｅ ａｃｉｄｓ）がある。還元剤は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で用いると適切である。
【００２９】
抗酸化剤として、例えば、アスコルビン酸またはその塩、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸ステアレート、没食子酸トリアミル（ｔｒｉａｍｙｌ ｇａｌｌａｔｅ）、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、およびブチルヒドロキシアニソールを用いることができる。抗酸化剤は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で用いると適切である。
【００３０】
有用な錯化剤は、例えば、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、またはメタリン酸ナトリウムである。好ましくは、遊離酸またはその塩の形態のクエン酸塩が錯化剤として用いられる。錯化剤は、通常０．０１〜２０ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭ、最も好ましくは０．２〜５ｍＭの濃度で用いられる。
【００３１】
カオトロピック剤として、例えば、尿素、塩酸グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、またはイソシアン酸グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｉｓｏｃｉａｎａｔｅ）を用いることができる。カオトロピック剤は、０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜３０ｍＭの濃度で用いると適切である。
【００３２】
所望により、本発明によるＧ−ＣＳＦ含有組成物は、ヒト血清タンパク質などのさらなるタンパク質も含むことができる。しかし、外来のタンパク質に関連する危険性のため、さらなるタンパク質のない組成物が好ましい。
【００３３】
本発明による組成物の調製は、それ自体が周知の方法で行うことができる。通常は、緩衝物質、ならびに任意選択でさらなる安定化剤、および／または補助剤、および不活性成分を、適切な量で、通常は滅菌水である水性溶剤に最初に溶解する。必要であれば、コハク酸および／または酒石酸の溶液を用いて、あるいは、例として上記に述べたもののような他の酸または塩基を用いてｐＨ値を調整する。滅菌フィルターを通したろ過などの通常の滅菌段階の後、Ｇ−ＣＳＦを所望の濃度で加える。しかし、最初に水性溶剤中のＧ−ＣＳＦを提供し、次いでコハク酸および／または酒石酸でｐＨを所望の値に調整することも可能である。
【００３４】
本発明による組成物は、特に薬剤組成物として使用され、安定化剤、および補助剤、および任意選択で存在する不活性成分は、生理的に許容されなければならない。この薬剤組成物は、様々な適用形態で用いることができる。
【００３５】
例えば、この組成物は、特に、静脈投与、筋肉内投与、または皮下投与のための、注射または注入のための溶液、あるいは経口投与のための組成物であることができる。しかし、この組成物を、ヒドロゲルまたはリポソームなどのさらなる薬剤適用形態を製造するために用いることもできる。これらの医薬製剤を、Ｇ−ＣＳＦを用いることができるあらゆる適応症に、例えば、好中球減少症の治療に、骨髄移植に、および感染性疾患および腫瘍疾患の治療に用いることができる。
【００３６】
さらに、本発明の目的は、遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む、Ｇ−ＣＳＦ含有の凍結乾燥品および粉末である。このような凍結乾燥品および粉末は、例えば、単に凍結乾燥により、または噴霧乾燥などにより、それ自体が周知の方法で、上記に記載された水性組成物から得ることができる。これらの凍結乾燥品および粉末では、Ｇ−ＣＳＦ、コハク酸および／または酒石酸、ならびに任意選択でさらなる緩衝物質、安定化剤、および補助剤、および不活性成分は、水中に再び溶解したときに、対応する水性組成物と同様に高温でも長期間にわたり安定であるＧ−ＣＳＦ含有組成物が得られるような量で存在する。
【００３７】
本発明による凍結乾燥品または粉末を、例えば、凍結乾燥品または粉末が適切な量の水性溶剤から物理的に分離されている医薬キットの形態で提供することができる。次いで、この安定な緩衝化された水性組成物を、あらゆる所望のときに、例えば医療関係者が、調製することができる。
【００３８】
一代替として、安定な水性組成物を調製するために必要な緩衝物質、および任意選択でさらなる安定化剤、補助剤および不活性成分は、水性溶剤のみに存在することができ、凍結乾燥品または粉末はＧ−ＣＳＦを含むにすぎず、あるいは緩衝物質、安定化剤、および補助剤、および不活性成分は、凍結乾燥品または粉末にも、水性溶剤にも存在することができる。
【００３９】
本発明は、ここで以下の実施例により、より詳細に説明するが、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００４０】
１．長期間のインキュベートおよび高ｐＨおよび高温後の、Ｇ−ＣＳＦ含有組成物の安定性
【００４１】
最初に、緩衝物質である二ナトリウム塩の形態のコハク酸および酒石酸を、ポリソルベート８０およびマンニトールの蒸留滅菌水溶液と共に溶解し、次いで、コハク酸または酒石酸の緩衝液を用いてｐＨ値を所望の値に調整して、Ｇ−ＣＳＦ含有組成物を室温で調製した。滅菌フィルター（孔径０．２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を通してろ過した後、市販の非グリコシル化のリコンビナントヒトＧ−ＣＳＦを加えた。
【００４２】
このようにして調製した、本発明による組成物の正確な製剤、およびそのｐＨ値を、以下の表１〜６に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
【表６】
【００４９】
このようにして調製した５００μｌの組成物を、エッペンドルフ管で、４±１℃、２５±１℃、および３７±１℃で８週間インキュベートした。０．５％（ｗ／ｖ）マンニトールおよび０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０中Ｇ−ＣＳＦ０．３ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有製剤、ならびに０．５％（ｗ／ｖ）マンニトールおよび０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ４．０、５．０、および７．５中Ｇ−ＣＳＦ０．３ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ含有製剤を、対照として使用した。
【００５０】
インキュベートの間、様々な時間点でサンプルを採取し、化学的に非修飾の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量に関して、およびＧ−ＣＳＦの生物学的活性に関して分析した。単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量が多く、および／またはＧ−ＣＳＦタンパク質の生物学的活性が実質的に一定であったことより、タンパク質の化学的修飾がなく、またはわずかな化学的修飾しか生じなかったことが示された。
【００５１】
化学的に非修飾の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量の測定を、Ｃ４ Ｖｙｄａｃカラムを使用して逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で行った。移動相は、溶離液Ａとしてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化した水、および溶離液ＢとしてＴＦＡで酸性化したアセトニトリルを含んでいた。ＡとＢのリニアグラジエントで、流速０．２ｍｌ／分で１時間、クロマトグラフィーを行った。注入量は５μｌだった。検出波長は２０６ｎｍで、外部標準物質として既知のＧ−ＣＳＦの希釈物を用いて評価を行った。Ｇ−ＣＳＦの残留量は、Ｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．の方法（上述）に従って、１００％に設定した０日目の単量体Ｇ−ＣＳＦの初期含有量のピーク面積（ＰＡ）の％として決定した。
【００５２】
長期間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの生物学的活性を決定することによるＧ−ＣＳＦの安定化の証明を、ＮＦＳ−６０バイオアッセイを用いて行った（Ｔｏｈｙａｍａ，Ｋ．ら、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８０巻、３３５〜３４０頁、１９８９年）。このアッセイでは、様々な濃度のＧ−ＣＳＦに対する反応として細胞増殖の誘発を測定することにより、Ｇ−ＣＳＦの活性を決定した。デヒドロゲナーゼの活性を測定することにより、ＮＦＳ−６０細胞の増殖を追跡した。デヒドロゲナーゼは、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）２，５−ジフェニルテトラゾリウム（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｔｈｏｌｙｌ−２）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）（ＭＴＴ）を還元して、ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を生じるが、これを対照波長６２０ｎｍを用い検出波長５７０ｎｍで測光法により決定することができる。デヒドロゲナーゼ活性、および、したがって形成されたホルマザンの量は、ＮＦＳ−６０細胞の細胞計測数に直接相関がある。
【００５３】
得られた結果を、以下に記載する。
【００５４】
＜コハク酸緩衝液を含む製剤において２５℃でインキュベートした後のＧ−ＣＳＦの残留量＞
【００５５】
４週間および８週間インキュベートした後に２５℃でインキュベートした組成物１〜２７をＲＰ−ＨＰＬＣ分析したところ（表１〜３、図１〜３）、２５℃で８週間インキュベートした後でも、２０、１０、および５ｍＭコハク酸緩衝液中におけるＧ−ＣＳＦの含有量は、組成物中の初期含有量に比べて依然として大変高いことが示された。本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦの安定性は、１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．０を含む従来の製剤におけるＧ−ＣＳＦの安定性と比較可能であるが、ただし、かなり高いｐＨ値においてである。図１〜３は、様々なｐＨ値のコハク酸緩衝液を含む製剤の代表例を、ｐＨ４．０の従来の酢酸製剤と比較して示す。図１は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．５、５．０、および６．０の２０ｍＭコハク酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。図２は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．０、４．５、５．０、および６．０の１０ｍＭコハク酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。図３は、試験開始時、ならびにｐＨ４．０、４．５、５．５、および６．０の５ｍＭコハク酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。
【００５６】
４℃でインキュベートした場合、酢酸塩、およびコハク酸／酒石酸で緩衝化したＧ−ＣＳＦ溶液は、記載されたｐＨの範囲内で比較可能であった（データは示さず）。
【００５７】
＜酒石酸緩衝液を含む製剤において２５℃でインキュベートした後のＧ−ＣＳＦの残留量＞
【００５８】
４週間および８週間インキュベートした後に２５℃でインキュベートした、組成物２８〜５４をＲＰ−ＨＰＬＣ分析したところ（表４〜６、図４〜６）、２５℃で８週間インキュベートした後でも、２０、１０、および５ｍＭ酒石酸緩衝液におけるＧ−ＣＳＦの含有量は、組成物中の初期含有量に比べて依然として大変高いことが示された。再度、本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦの安定性は、１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．０を含む従来の製剤におけるＧ−ＣＳＦの安定性と比較可能であった。図４〜６は、ｐＨ４．０の従来の酢酸塩の製剤と比較した、様々なｐＨ値の酒石酸緩衝液を含む製剤の代表例を示す。図４は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．０、５．０、５．５、および６．０の２０ｍＭ酒石酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。図５は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．５、５．５、および６．０の１０ｍＭ酒石酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの含有量を示す。図６は、試験開始時（１００％）、ならびにｐＨ４．０、４．５、５．０、および６．０の５ｍＭコハク酸緩衝液で４週間および８週間インキュベートした後のＧ−ＣＳＦの量を示す。
【００５９】
４℃でインキュベートした場合、酢酸塩、およびコハク酸／酒石酸で緩衝化したＧ−ＣＳＦ溶液は、記載されたｐＨの範囲内で比較可能であった（データは示さず）。
【００６０】
＜様々な緩衝液において３７度でインキュベートした後のＧ−ＣＳＦの残留量＞
【００６１】
さらなる試験では、１０ｍＭコハク酸および酒石酸緩衝液、ｐＨ５．０において（製剤５８および５９）、１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０において（製剤６０）、ならびに１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ４．５、５．０、および７．５において（製剤５５〜５７）、３７℃におけるＧ−ＣＳＦの長期の安定性を測定した（表７）。単量体Ｇ−ＣＳＦの量を、前の試験同様ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて測定し、図７および８に図示する。結果は、コハク酸緩衝液および酒石酸緩衝液を含む製剤中のＧ−ＣＳＦの含有量は、９０日インキュベートした後でも１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０中に観察される含有量と比較可能であったことを示している。それとは対照に、ｐＨ５．０の１０ｍＭリン酸緩衝液を含む製剤中のＧ−ＣＳＦの含有量は１３日後でも劇的に減少し、２０日後では無視できるほどに低値である。
【００６２】
【表７】
【００６３】
＜コハク酸緩衝液および酒石酸緩衝液中で２５℃および３７℃でインキュベートした後のＧ−ＣＳＦの生物学的活性＞
【００６４】
上記２．２の下に記載されたバイオアッセイを用いて、２５℃および３７℃で貯蔵したいくつかの代表的製剤（表１〜６の、３、４、５、１３、１４、２３、３２、および４１）を分析すると、本発明による緩衝物質であるコハク酸または酒石酸を様々な濃度（５〜２０ｍＭ）で、かつ様々なｐＨ値（ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５）で含むＧ−ＣＳＦ製剤の生物学的活性は、９０日のインキュベート後でさえも、かつ２５℃および３７℃のストレスの条件下でも依然として初期の活性の８０〜１２０％であることが示された（表８）。
【００６５】
【表８】
【００６６】
上記に記載した試験は、本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦの活性は、生理的ｐＨ値に近いｐＨ値でも、長期間にわたり、かつ少なくとも３７℃までの温度で安定であることを実証している。結果は、１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．０における製剤と比較可能であり、ｐＨ５．０および７．５の１０ｍＭリン酸緩衝液を含む製剤よりも大幅に優れている。
【００６７】
２．機械的応力に対するＧ−ＣＳＦ製剤の安定性
【００６８】
Ｇ−ＣＳＦ含有組成物を、実施例１に記載したとおりに、室温で、最初に緩衝物質である二ナトリウム塩の形態のコハク酸および酒石酸を、任意選択で界面活性剤（ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）および等張化剤（マンニトールまたはソルビトール）と共に、蒸留滅菌水中に溶解し、次いでコハク酸緩衝液または酒石酸緩衝液を用いてｐＨ値を所望の値に調整することにより調製した。滅菌フィルター（孔径０．２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を通してろ過した後、市販の非グリコシル化リコンビナントヒトＧ−ＣＳＦを加えた。
【００６９】
ＳＣＦインスタントシリンジ（ｉｎｓｔａｎｔ ｓｙｒｉｎｇｅｓ）（フランス、グルノーブル、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、調製した組成物のサンプルを５００μｌ充填し、機械的応力を生じるために、室温で、Ｖｏｒｔｅｘ（登録商標）装置上で１０秒間撹拌した。
【００７０】
撹拌後の凝集に関するＧ−ＣＳＦ組成物の試験を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｒｉｅｓ １１００装置を用いてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社のＢｉｏＳｅｐ ＳＥＣ Ｓ２０００カラム（７．８×３００ｍｍ、５μｍ）でサイズ排除クロマトグラフィーにより行った。溶離液として、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０を使用した。イソクラティックにより流速０．４ｍｌ／分で４５分間、カラム温度２０℃で分析を行った。注入量は１５〜２５μｌであり、１５μｇのタンパク質量に相当する。検出波長は２１４ｎｍであり、Ｂｉｏｒａｄ社のゲルろ過標準物質（ＢｉｏＲａｄ Ａｒｔ．Ｎｏｓ．１５１〜１９０１）を用い、溶出体積に対する分子量をプロットすることによりサイズの評価を行った。凝集体の形成は％で表され、機械的応力を与える前の単量体Ｇ−ＣＳＦの初期含有量に対する、サンプル中のＧ−ＣＳＦの二量体および高次の凝集体の量を示し、存在する単量体および凝集体に対するピーク面積から計算される。
【００７１】
サンプルの組成、および試験の結果を、以下の表９に示す。示した値は、各３回の試験の平均値を表す。
【００７２】
【表９】
【００７３】
結果は、高温でｐＨ値が５．０でも、コハク酸で緩衝化した製剤では、酢酸塩で緩衝化した製剤よりも、機械的応力を与えた後の凝集が少ないことを示している。したがって、本発明による組成物は、従来の組成物よりも機械的応力に対してより安定している。
【００７４】
３．凍結および解凍後のＧ−ＣＳＦ製剤の安定性
【００７５】
３．１ 低濃度の組成物の安定性
【００７６】
Ｇ−ＣＳＦ濃度が０．６ｍｇ／ｍｌであるＧ−ＣＳＦ含有組成物を調製した。実施例２に記載したとおりに調製を行った。
【００７７】
安定性を試験するために、調製した組成物のサンプル５００μｌを、−７０℃で一晩サンプルを凍結させ翌日２０℃で解凍することにより１回の凍結／解凍サイクル下においた。解凍後、単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量について、実施例２に記載したＳＥＣを用いてサンプルを速やかに分析した。
【００７８】
試験の結果を以下の表１０に示す。示した値は、３回の試験の平均値である。
【００７９】
【表１０】
【００８０】
３．２ 高濃度の組成物の安定性
【００８１】
実施例３．１にしたがって、Ｇ−ＣＳＦ含有組成物を調製した。ただしＧ−ＣＳＦ濃度は３．０ｍｇ／ｍｌとした。
【００８２】
実施例３．１に記載したように安定性の試験を行った。ただし調製した組成物のサンプル１０００μｌを凍結／解凍サイクルに用いた。解凍後、実施例２に記載したようにサンプルをＳＥＣにさらし、サンプル中のＧ−ＣＳＦ２量体および高次の凝集体の含有量を決定し、サンプル中の単量体Ｇ−ＣＳＦの初期含有量に対する％で表した。
【００８３】
試験の結果を、以下の表１１に示す。示された値は、３回の試験の平均値である。
【００８４】
【表１１】
【００８５】
２量体および高次の凝集体の形成は、また、等電点電気泳動法により確認した（結果は示さず）。
【００８６】
結果は、１回の凍結／解凍サイクル後、コハク酸で緩衝化したＧ−ＣＳＦ製剤は、４．０を超えるｐＨ値でも殆ど未変化の形態のＧ−ＣＳＦを依然として含むが、酢酸塩で緩衝化した製剤中の単量体Ｇ−ＣＳＦの含有量は大幅に減少することを示している。本発明による組成物は、したがって、従来の組成物よりも大幅に凍結／解凍サイクルに安定である。
【００８７】
結論として、上記の試験は、本発明による組成物におけるＧ−ＣＳＦは、生理的ｐＨ値に近いｐＨ値において、かつ少なくとも３７℃までの温度で、長期間にわたり安定であることを示している。したがって、本発明による組成物は、例えば、生理的ｐＨ値による皮膚刺激を避けることができる注射用溶液に大変有用である。コハク酸および／または酒石酸の存在により、タンパク質を再構成する場合、例えば溶解中に、望ましくないＧ−ＣＳＦの反応をさらに防止する。加えて、本発明による組成物は機械的応力に対して安定であり、そのためこれらの製剤は、難なくろ過し、バイアルに満たし、またはシリンジに充填することができるだけではなく、あらゆる危険性なしに長距離にわたり輸送することもできる。本発明による組成物は、繰返しの凍結および解凍に対しても安定であり、このためＧ−ＣＳＦ製剤の貯蔵安定性をさらにもっと延長することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＲＰ−ＨＰＬＣで測定し、０日目の単量体Ｇ−ＣＳＦ（１００％）の初期含有量のピーク面積（ＰＡ）の％として表した、ｐＨ値４．５〜６．０の２０ｍＭコハク酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図２】ｐＨ値４．０〜６．０の１０ｍＭコハク酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図３】ｐＨ値４．０〜６．０の５ｍＭコハク酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図４】ｐＨ値４．０〜６．０の２０ｍＭ酒石酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図５】ｐＨ値４．５〜６．０の１０ｍＭ酒石酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図６】ｐＨ値４．０〜６．０の５ｍＭ酒石酸緩衝液で２５℃で４週間および８週間インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【図７】ｐＨ４．５、５．０、および７．５の１０ｍＭリン酸緩衝液で３７℃で１３日および２０日インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を示す図である。
【図８】ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸緩衝液または酒石酸緩衝液で３７℃で３０日および９０日インキュベートした後の単量体Ｇ−ＣＳＦの残留量を、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液と比較して示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝物質として、遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性Ｇ−ＣＳＦ含有組成物であって、酒石酸濃度が２ｍＭ未満であり、ｐＨ値が４．０以下であり、緩衝物質としてコハク酸を含まない組成物は除外する組成物。
【請求項２】
組成物のｐＨ値が３．５〜６．０、好ましくは４．０〜５．８、より好ましくは４．５〜５．５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
コハク酸および／または酒石酸の塩が、アルカリ塩、アルカリ土類塩、またはアンモニウム塩から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
コハク酸および／または酒石酸の塩が二ナトリウム塩である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
コハク酸および／または酒石酸が、０．５〜１５０ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｇ−ＣＳＦが、０．０００１〜５ｍｇ／ｍｌ、特に０．０００５〜４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
１種または複数のさらなる安定化剤および／または補助剤、ならびに不活性成分、特に、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、およびカオトロピック剤からなる群から選択される不活性成分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、およびトリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタンからなる群から選択される非イオン性界面活性剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
錯化剤がクエン酸塩である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
等張化剤が、マンニトールおよび／またはソルビトールである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬製剤としての、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
医薬製剤が、注射または注入のための溶液である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｇ−ＣＳＦ、ならびに遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む、凍結乾燥品または粉末。
【請求項１４】
コハク酸および／または酒石酸の塩が、アルカリ塩、アルカリ土類塩、またはアンモニウム塩から選択される、請求項１３に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１５】
コハク酸および／または酒石酸の塩が、二ナトリウム塩である、請求項１３または１４のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１６】
１種または複数のさらなる安定化剤、および／または補助剤、ならびに、特に、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、およびカオトロピック剤からなる群から選択される不活性成分をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１７】
錯化剤がクエン酸塩である、請求項１６に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１８】
緩衝物質として遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性Ｇ−ＣＳＦ含有組成物を、それぞれ凍結乾燥または噴霧乾燥することにより得ることができる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１９】
物理的に分離された、
ａ）Ｇ−ＣＳＦ含有凍結乾燥品または粉末、および
ｂ）遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性溶剤
を含む、医薬キット。
【請求項２０】
Ｇ−ＣＳＦ含有凍結乾燥品または粉末が、遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む、請求項１９に記載の医薬キット。
【請求項２１】
凍結乾燥品もしくは粉末、および／または水性溶剤が、１種または複数のさらなる安定化剤、および／または補助剤、ならびに、特に、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、およびカオトロピック剤からなる群から選択される不活性成分をさらに含む、請求項１９または２０に記載の医薬キット。
【請求項２２】
緩衝物質として遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性溶剤中にＧ−ＣＳＦを溶解するステップを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を調製するための方法。
【請求項２３】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物を凍結乾燥または噴霧乾燥するステップを含む、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末を調製するための方法。
【請求項２４】
Ｇ−ＣＳＦを安定化するための、遊離酸および／またはその塩の形態の、コハク酸および／または酒石酸の使用。
【請求項２５】
医薬製剤を製造するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用、または請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末の使用。
【請求項２６】
医薬製剤がヒドロゲルまたはリポソームを含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項１】
緩衝物質として、遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性Ｇ−ＣＳＦ含有組成物であって、酒石酸濃度が２ｍＭ未満であり、ｐＨ値が４．０以下であり、緩衝物質としてコハク酸を含まない組成物は除外する組成物。
【請求項２】
組成物のｐＨ値が３．５〜６．０、好ましくは４．０〜５．８、より好ましくは４．５〜５．５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
コハク酸および／または酒石酸の塩が、アルカリ塩、アルカリ土類塩、またはアンモニウム塩から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
コハク酸および／または酒石酸の塩が二ナトリウム塩である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
コハク酸および／または酒石酸が、０．５〜１５０ｍＭ、好ましくは１〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｇ−ＣＳＦが、０．０００１〜５ｍｇ／ｍｌ、特に０．０００５〜４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
１種または複数のさらなる安定化剤および／または補助剤、ならびに不活性成分、特に、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、およびカオトロピック剤からなる群から選択される不活性成分をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
界面活性剤が、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、およびトリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタンからなる群から選択される非イオン性界面活性剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
錯化剤がクエン酸塩である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
等張化剤が、マンニトールおよび／またはソルビトールである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬製剤としての、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
医薬製剤が、注射または注入のための溶液である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｇ−ＣＳＦ、ならびに遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む、凍結乾燥品または粉末。
【請求項１４】
コハク酸および／または酒石酸の塩が、アルカリ塩、アルカリ土類塩、またはアンモニウム塩から選択される、請求項１３に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１５】
コハク酸および／または酒石酸の塩が、二ナトリウム塩である、請求項１３または１４のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１６】
１種または複数のさらなる安定化剤、および／または補助剤、ならびに、特に、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、およびカオトロピック剤からなる群から選択される不活性成分をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１７】
錯化剤がクエン酸塩である、請求項１６に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１８】
緩衝物質として遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性Ｇ−ＣＳＦ含有組成物を、それぞれ凍結乾燥または噴霧乾燥することにより得ることができる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末。
【請求項１９】
物理的に分離された、
ａ）Ｇ−ＣＳＦ含有凍結乾燥品または粉末、および
ｂ）遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性溶剤
を含む、医薬キット。
【請求項２０】
Ｇ−ＣＳＦ含有凍結乾燥品または粉末が、遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む、請求項１９に記載の医薬キット。
【請求項２１】
凍結乾燥品もしくは粉末、および／または水性溶剤が、１種または複数のさらなる安定化剤、および／または補助剤、ならびに、特に、界面活性剤、等張化剤、アミノ酸、還元剤、抗酸化剤、錯化剤、およびカオトロピック剤からなる群から選択される不活性成分をさらに含む、請求項１９または２０に記載の医薬キット。
【請求項２２】
緩衝物質として遊離酸および／またはその塩の形態のコハク酸および／または酒石酸を含む水性溶剤中にＧ−ＣＳＦを溶解するステップを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を調製するための方法。
【請求項２３】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物を凍結乾燥または噴霧乾燥するステップを含む、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末を調製するための方法。
【請求項２４】
Ｇ−ＣＳＦを安定化するための、遊離酸および／またはその塩の形態の、コハク酸および／または酒石酸の使用。
【請求項２５】
医薬製剤を製造するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用、または請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥品または粉末の使用。
【請求項２６】
医薬製剤がヒドロゲルまたはリポソームを含む、請求項２５に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５０９１０１（Ｐ２００７−５０９１０１Ａ）
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３６０４０（Ｐ２００６−５３６０４０）
【出願日】平成１６年１０月２０日（２００４．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１８７５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３９６２０
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０６１３６３０２）ヘキサル バイオテック フォルシュング ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２０日（２００４．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１８７５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３９６２０
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０６１３６３０２）ヘキサル バイオテック フォルシュング ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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