安定化されたインターフェロン組成物
【課題】さらなるタンパク質薬学的組成物（ＩＦＮ−β組成物を含む）を提供すること。
【解決手段】ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む、安定化された薬学的処方物が提供される。この高度に精製されたマンニトールは、高度に精製されていないマンニトールとともに処方されたＩＦＮ−βと比べてＩＦＮ−β付加物の形成を減少させることによって、その組成物を安定化させる。ＩＦＮ−βまたはその改変体の液体または凍結乾燥組成物における安定性を増大させるための方法およびそのような組成物の貯蔵安定性を増大させるための方法もまた提供される。
【解決手段】ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む、安定化された薬学的処方物が提供される。この高度に精製されたマンニトールは、高度に精製されていないマンニトールとともに処方されたＩＦＮ−βと比べてＩＦＮ−β付加物の形成を減少させることによって、その組成物を安定化させる。ＩＦＮ−βまたはその改変体の液体または凍結乾燥組成物における安定性を増大させるための方法およびそのような組成物の貯蔵安定性を増大させるための方法もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、薬学的組成物に関し、より詳細には、安定化された、液体のまたは凍結乾燥されたタンパク質（インターフェロンβなどを含む）の処方物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インターフェロンは、ウイルス、二本鎖ＲＮＡ、他のポリヌクレオチド、抗原およびマイトジェンを含む多数のシグナルによって、細胞からの分泌が誘導される糖タンパク質のファミリーである。インターフェロンは、多数の生物学的活性を示し、これには、抗ウイルス性、抗増殖性および免疫調節活性が含まれる。少なくとも３つの異なる型のヒトインターフェロンα、βおよびγが、抗ウイルス活性および抗増殖活性を含む多数の因子に基づいて識別されている。
【０００３】
インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）は、多発性硬化症（ＭＳ）を伴う患者にとって初めて有効であると同定された処置であり、そして再発性ＭＳおよび弛張性ＭＳに罹患した患者が受ける攻撃の数を減少することが実証された。ＩＦＮ−β組成物はまた、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の感染の処置において有用である。
【０００４】
すべてのタンパク質ベースの医薬と同様に、治療剤としてＩＦＮ−βの使用において克服されねばならない１つの主要な障壁は、薬学的処方物におけるその不安定性から生じ得る薬学的有用性の喪失である。薬学的処方物におけるポリペプチドの活性および効力を脅かす物理的不安定性としては、変性ならびに可溶性および不溶性の凝集物の形成が挙げられ、他方、化学的不安定性としては、加水分解、イミド形成、酸化、ラセミ化および脱アミド課が挙げられる。これらの変化のいくつかは、目的のタンパク質の薬学的活性の喪失または低減をもたらすことが知られる。他の場合において、これらの変化の正確な効果は知られていないが、得られる分解産物はなおも、所望されない副作用についての可能性に起因して、薬学的に受容可能ではないと考えられるべきである。
【０００５】
薬学的調製物においてポリペプチドの不安定性は、タンパク質ベースの医薬の承認のために設定されたガイドラインは、そのポリペプチドの活性および分子特性における変化が最小限であるべきであることが強調されているように、直接、それらの薬学的有用性に影響を与える。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ（欧州連合、日本および米国における実行のための、医薬に関連する政策提言を行う三極機関）によって発行されたバイオテクノロジー／生物製剤の安定性試験に関する１９９５年１１月３０日の報告は、「分解産物形成の指標となる有意な定量的または定性的な変化が長期間の安定性、加速安定性、および／またはストレス安定性の研究の間に検出される場合、可能な有害性ならびに長期安定性プログラム内の分解産物の特徴づけおよび定量についての必要性に対して考慮が与えられるべきである。」と言及している。
【０００６】
その結果、さらなるタンパク質薬学的組成物（ＩＦＮ−β組成物を含む）についての必要性が存在する。この組成物は、還元性の不純物が実質的にない生理学的に適合可能な安定剤を含み、それにより、そのタンパク質を安定化し、そしてその薬学的有用性を増強する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
治療活性成分としてＩＦＮ−βおよび賦形剤として高度に精製されたマンニトールを含む組成物が提供される。その組成物は、高度に精製されていないマンニトールを含むＩＦＮ−β組成物と比較して、貯蔵の間の安定性の改善によって特徴付けられる。これらの組成物の製造方法もまた提供される。
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１） ＩＦＮ−βまたはその改変体および高度に精製されたマンニトールを含む、組成物。
（項目２） 前記組成物は、安定性が増大していることによって特徴付けられる、項目１に記載の組成物。
（項目３） 前記組成物は、凍結乾燥されている、項目１に記載の組成物。
（項目４） 前記組成物は、液体である、項目１に記載の組成物。
（項目５） 前記高度に精製されたマンニトールは、約０．２５（重量／容積）％〜約５（重量／容積）％の濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目６） 前記ＩＦＮ−βまたはその改変体は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目７） 前記処方物は、ｐＨ約３．０〜ｐＨ約９．０の範囲のｐＨを有する、項目１に記載の組成物。
（項目８） ヒトアルブミンもまた含有する、項目１に記載の組成物。
（項目９） 前記ヒトアルブミンは、約０．０１（重量／容積）％〜約１５（重量／容積）％の濃度で存在する、項目８に記載の組成物。
（項目１０） ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む組成物であって、
該ＩＦＮ−βは、組み換えヒトＩＦＮ−βであり、該組み換えヒトＩＦＮ−βは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、約０．２５（重量／容積）％〜約５（重量／容積）％の濃度で存在し、該組成物のｐＨは、約３．０〜約９．０の範囲にあり、そして
該組成物は、約０．０１（重量／容積）％〜約１５（重量／容積）％の濃度でヒトアルブミンをさらに含有する、
組成物。
（項目１１） 前記組成物は、凍結乾燥されている、項目１０に記載の組成物。
（項目１２） 前記組成物は、液体であるかまたは凍結されている、項目１０に記載の組成物。
（項目１３） ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む組成物であって、
該ＩＦＮ−βは、組み換えヒトＩＦＮ−βであり、該組み換えヒトＩＦＮ−βは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、約０．２５（重量／容積）％〜約５（重量／容積）％の濃度で存在し、該組成物のｐＨは、約３．０〜約９．０の範囲にあり、該組成物は、約０．０１（重量／容積）％〜約１５（重量／容積）％の濃度でヒトアルブミンおよび該組成物を等張性とするのに充分な塩化ナトリウムをさらに含有する、
組成物。
（項目１４） 前記組成物は、凍結乾燥されている、項目１３に記載の組成物。
（項目１５） 前記組成物は、液体であるかまたは凍結されている、項目１３に記載の組成物。
（項目１６） ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む組成物であって、
該ＩＦＮ−βは、組み換えヒトＩＦＮ−βであり、該組み換えヒトＩＦＮ−βは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、約０．２５（重量／容積）％〜約２．５（重量／容積）％の濃度で存在し、該組成物のｐＨは、約６．８〜約８．２の範囲にあり、そして該組成物は、約０．２５（重量／容積）％〜約２．５（重量／容積）％の濃度でヒトアルブミンをさらに含有する、
組成物。
（項目１７） 前記組成物は、該組成物を等張性とするために充分な塩化ナトリウムをさらに含む、項目１６に記載の組成物。
（項目１８） 前記組成物は液体であり、該液体は凍結または凍結乾燥されている、項目１６に記載の組成物。
（項目１９） 前記組成物は液体であり、該液体は凍結または凍結乾燥されている、項目１７に記載の組成物。
（項目２０） ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む組成物であって、
該ＩＦＮ−βは、組み換えヒトＩＦＮ−βであり、該組み換えヒトＩＦＮ−βは、約０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、約１．２５（重量／容積）％の濃度で存在し、該組成物のｐＨは、約７．３〜約７．５の範囲にあり、そして該組成物は、約１．２５（重量／容積）％の濃度でヒトアルブミンをさらに含有する、
組成物。
（項目２１） 前記組成物は、該組成物を等張性とするために充分な塩化ナトリウムをさらに含む、項目２０に記載の組成物。
（項目２２） 前記組成物は、液体であり、該液体は凍結または凍結乾燥されている、項目２０に記載の組成物。
（項目２３） 前記組成物は、液体であり、該液体は凍結または凍結乾燥されている、項目２１に記載の組成物。
（項目２４） 前記ＩＦＮ−βは、成熟したネイティブヒトＩＦＮ−βのアミノ酸配列を有するポリペプチドである、項目１に記載の組成物。
（項目２５） 前記ＩＦＮ−βは、グルコシル化されているかまたはグルコシル化されていない、項目２４に記載の組成物。
（項目２６） 前記ＩＦＮ−βは、組換え産生される、項目１に記載の組成物。
（項目２７） 項目１に記載の組成物を含む、予備充填されたシリンジ。
（項目２８） 前記組成物は凍結されている、項目２７に記載の予備充填されたシリンジ。
（項目２９） ＩＦＮ−βまたはその改変体およびマンニトールを含む組成物であって、該マンニトールは、２０ｐｐｍ未満の還元活性を有する、組成物。
（項目３０） 薬学的ポリペプチドおよび高度に精製されたマンニトールを含む、組成物。
（項目３１） 前記薬学的ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、β−グルコセレブロシダーゼ、チロトロピン、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、モノクローナル抗体、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、ウロキナーゼ、アスパルギナーゼ、アニストレプラーゼ、およびアルテプラーゼからなる群より選択される、項目３０に記載の組成物。
（項目３２） 改善された安定性によって特徴付けられる、ＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体の処方物を生産する方法であって、該方法は：
ＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体および高度に精製されたマンニトールを、該ＩＦＮ−βまたはその改変体を安定化するに充分な量で含む処方物を生産する工程を包含する、方法。
（項目３３） 項目３２に記載の方法によって生産される処方物。
（項目３４） ＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体の処方物を生産する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）クロマトグラフィーによって該ＩＦＮ−βからドデシル硫酸ナトリウムおよび塩を取り除く工程；
ｂ）該ＩＦＮ−βと、ヒトアルブミンの溶液とを、約１１．５〜約１２．０のｐＨで合わせる工程；
ｃ）該溶液のｐＨをＨＣｌで７．５に調整する工程；および
ｄ）高度に精製されたマンニトールの溶液を加える工程、
を包含する、方法。
（項目３５） 項目３４に記載される方法によって生産される処方物。
（項目３６） 前記処方物を凍結乾燥する工程をさらに包含する、項目３４に記載の方法。
（項目３７） 薬学的組成物におけるＩＦＮ−βまたはその改変体の安定性を増大させる方法であって、該方法は：
該組成物中に、該ＩＦＮ−βまたはその改変体を安定化するのに充分な量の高度に精製されたマンニトールを取り込ませる工程、
を包含する、方法。
（項目３８） 前記組成物を等張性にさせるに充分な塩化ナトリウムを加える工程をさらに包含する、項目３４に記載の方法。
（項目３９） 項目３８に記載の方法によって生産される処方物。
（項目４０） 前記処方物を凍結乾燥する工程をさらに包含する、項目３８に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、安定性が増大したＩＦＮ−β薬学的組成物、およびそれらの調製方法に関する。この組成物は、ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む。この高度に精製されたマンニトールは、分解産物の形成を減少させることによってその処方物の安定性を増大させる。安定化されたＩＦＮ−β処方物は、より安全である（可能な有害な副作用が減少することに起因する）、およびより経済的である（処方物の寿命が増大することによる）という点で有利である。
【０００９】
開示された組成物の安定性の増大は、高度に精製されたマンニトールの使用から生じる。本発明の新規な知見は、高度に精製されていないマンニトールがＩＦＮ−βと相互作用して所望されない付加物（分解産物）を生成する還元活性を含むのに対して、他方、高度に精製されたマンニトールは、この還元活性を含まず、そしてＩＦＮ−β処方物におけるこれらの付加物の形成を生じないことである。本明細書において提示される実験結果（実験の節における実施例１を参照のこと）は、ＩＦＮ−β付加物形成を担う精製されていないマンニトール中に存在する還元活性は、還元糖活性ではないことを示す。なぜなら、高度に精製されていないマンニトールの存在下で形成された付加物は、既知の還元糖活性（例えば、デキストロース）を有する賦型剤の存在下で形成される付加物とは明らかに識別され得るからである。
【００１０】
本明細書において用いられる「高度に精製されたマンニトール」とは、低レベルの還元活性を有するマンニトールをいう。高度に精製されたマンニトールの還元活性は、本明細書において別の場所において記載される還元活性アッセイによって測定されると２０ｐｐｍＵＳＰ未満である。種々の実施形態において、高度に精製されたマンニトールの還元活性は、１９ｐｐｍ未満であり、１８ｐｐｍ未満であり、１７ｐｐｍ未満であり、１６ｐｐｍ未満であり、１５ｐｐｍ未満であり、１４ｐｐｍ未満であり、あるいは１３ｐｐｍ未満である。１つの実施形態において、高度に精製されたマンニトールはＵＳＰ（米国薬局方）またはＡＣＳ（米国化学会）等級のマンニトールである。この等級のマンニトールは、１）メタノール抽出；２）炭素処理；３）限外濾過；および４）再結晶化のさらなる工程を受けている。高度に精製されたマンニトールは、その処方物を安定化するために十分な濃度で存在する。本発明に包含される処方物は、約０．１％（ｗ／ｖ）ほどの少なさの高度に精製されたマンニトールを有していてもよく、または約７．５％（ｗ／ｖ）ほどの多さの高度に精製されたマンニトールを有していてもよい。種々の実施形態において、このマンニトールは、約０．２〜約７．０％の濃度で存在し、約０．２５％〜約２．５％の濃度で存在し、そして約１．２５％の濃度で存在する。
【００１１】
治療活性成分としてＩＦＮ−β、および賦型剤として高度に精製されたマンニトールを含む、液体および凍結乾燥の両方の薬学的組成物が開示される。本発明の目的のために、薬学的組成物または処方物に関し、用語「液体」とは、用語「水性」を包含することが意図される。ＩＦＮ−β薬学的処方物に関し用語「凍結乾燥」とは、複数のバイアルの減圧下での迅速な凍結乾燥（フリーズドライ）をいう。このバイアルは各々、本発明のインターフェロン処方物の単位用量をその中に含む。上記凍結乾燥を行う凍結乾燥剤は市販されており、そして当業者によって容易に実施され得る。本発明の１つの実施形態において、液体組成物は凍結乾燥されている。
【００１２】
本発明の液体または凍結乾燥されたＩＦＮ−β処方物は、「安定化される」。「安定化された」組成物あるいは「増大した安定性」または「改善された安定性」を有する組成物とは、高度に精製されていないマンニトールを用いて処方されたＩＦＮ−β組成物に対して貯蔵安定性が増大した組成物を意味する。安定性のこの増大は、高度に精製されていないマンニトールを用いた処方物との比較において、貯蔵の間のＩＦＮ−β付加物または分解産物の処方物における減少によって証明される。付加物または分解産物の形成は、本明細書において記載される質量分析アッセイを用いて測定され得る。安定化された、高度に精製されたマンニトール処方された本発明のＩＦＮ−β組成物は、本明細書において記載される質量分析アッセイによって決定されるように、ＵＳＰマンニトール処方されたＩＦＮ−βにおいて、マンニトールなしで処方されるＩＦＮ−β組成物と比較したときに観察されるさらなるピークの非存在によって特徴付けられる。例えば、図９に示される、高度に精製されたマンニトールを用いて処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルを参照のこと。これは、図１０に示されるマンニトールなしで処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルと比較してさらなるピークを示さない。対照的に、図１１に示される、ＵＳＰマンニトールで処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルは、マンニトールなしで処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルと比較して、多数のさらなるピーク（付加物）を解像する。本発明の安定化されたＩＦＮ−β薬学的処方物は、その効力を保持し、そして３０℃で貯蔵したときに約２年までの期間にわたり、および２５℃で貯蔵したときに少なくとも２年間、０．０２ｍｇ／ｍｌ未満のグルコシル化されたＩＦＮ−βを含む。
【００１３】
本発明の安定化された薬学的処方物は、ＩＦＮ−βおよびその改変体を含む。本明細書において使用される用語「ＩＦＮ−β」とは、ＩＦＮ−βまたはその改変体（これは、ときに、ＩＦＮ−β様ポリペプチドと呼ばれる）をいう。ヒトＩＦＮ−β改変体（これは、天然に存在するもの（例えば、ＩＦＮ−β遺伝子座において生じる対立遺伝子改変体）であり得るか、または組換え産生され得る）は、ネイティブの成熟ＩＦＮ−β配列と同じか、類似するか、または実質的に類似する、アミノ酸配列を有する。活性を保持するＩＦＮ−βフラグメントまたはＩＦＮ−βの短縮形態もまた、包含される。これらの生物学的に活性な、ＩＦＮ−βのフラグメントまたは短縮形態は、全長ＩＦＮ−βアミノ酸配列から、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いてアミノ酸残基を除くことによって生成される。ＩＦＮ−βポリペプチドは、グルコシル化されていてもよく、グルコシル化されていなくてもよい。なぜなら、文献において、グルコシル化されているＩＦＮ−βポリペプチドおよびグルコシル化されていないＩＦＮ−βポリペプチドの両方が質的に類似する特異的活性を示し、そして従ってグルコシル化部分は、ＩＦＮ−βの生物学的活性に関与せず、そして寄与もしていないと報告されているからである。
【００１４】
本明細書において含まれるＩＦＮ−β改変体は、ネイティブの成熟ＩＦＮ−β配列のムテインを含む（例えば、米国特許第５，８１４，４８５号を参照のこと。これは、本明細書において参考として援用される）。ここでは、生物学的活性に必須ではない１つまたは複数のシステイン残基が故意に欠失されているか、または他のアミノ酸で置き換えられ、分子間架橋または不正確な分子間ジスルフィド結合形成のいずれかのための部位が除去されている。この型のＩＦＮ−β改変体は、ネイティブの成熟アミノ酸配列のアミノ酸１７に見出されるシステインに代えて、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、スレオニン、またはメチオニンを含む改変体を包含する。セリンおよびスレオニンは、それらがシステインと化学的に類似することから、もっとも好ましい置換物である。セリン置換がもっとも好ましい。例えば、ネイティブの成熟配列のアミノ酸１７において見出されるシステインがセリンで置換されたＩＦＮ−β改変体を参照のこと（米国特許第５，８１４，４８５号）。システイン１７はまた、当該分野において公知の方法を用いて欠失され得る（例えば、米国特許第４，５８８，５８４号を参照のこと。これは、本明細書において参考として援用される）。このことにより、ネイティブの成熟ＩＦＮ−βよりも１アミノ酸短い成熟ＩＦＮ−βムテインが生じる。例としてはまた、米国特許第４，５３０，７８７号；同第４，５７２，７９８号；および同第４，５８８，５８５号を参照のこと。従って、たとえば、その薬学的有用性を改善する１つまたは複数の改変体を有するＩＦＮ−β改変体もまた、本発明に包含される。
【００１５】
当業者は、更なる変化が、ＩＦＮ−βをコードするヌクレオチド配列への変異によって、インターフェロンの生物学的活性を変化させることなく、ＩＦＮ−βアミノ酸配列における変化を生じることによって導入され得ることを理解する。従って、ネイティブの成熟ＩＦＮ−βについてのアミノ酸配列とは異なる配列を有するＩＦＮ−β改変体をコードする、単離された核酸分子は、１または複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を、本明細書に開示される対応するヌクレオチド配列へと導入し、それにより１または複数のアミノ酸の置換、付加または欠失が、コードされるＩＦＮ−βへと導入されることによって作製され得る。変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって導入され得る。そのようなＩＦＮ−β改変体もまた、本発明に包含される。
【００１６】
例えば、保存的アミノ酸置換は、１または複数の予測された、好ましくは非必須のアミノ酸残基において行われ得る。「非必須」のアミノ酸残基とは、生物学的活性を変化させることなくＩＦＮ−βの野生型配列とは異なり得る残基である。他方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」とは、そのアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換をいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。そのような置換は、保存されたアミノ酸残基に対してはなされないか、あるいは、保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基に対しては行われない。
【００１７】
あるいは、改変体ＩＦＮ−βヌクレオチド配列は、飽和変異誘発のような、ＩＦＮ−βコード配列のすべてまたは部分にわたってランダムに導入される変異によって作製され得る。そして、得られた変異体は、ＩＦＮ−βの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を保持する変異体を同定し得る。変異誘発の後、コードされるタンパク質は、組換え発現され得、そしてそのタンパク質の活性は、本明細書において記載される標準的なアッセイ技術を用いて決定され得る。
【００１８】
ＩＦＮ−βの生物学的に活性な改変体は、一般的に、比較の基礎として作用する、参照ＩＦＮ−βポリペプチド（例えば、ネイティブヒトＩＦＮ−β）に対して、少なくとも８０％、より好ましくは約９０〜約９５％またはそれを超えるか、そしてもっとも好ましくは約９６％〜約９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する。「配列同一性」とは、改変体ポリペプチド、ならびにその改変体のアミノ酸配列の、特定の連続セグメントが参照分子のアミノ酸配列とアラインメントし、そして比較されるとき、参照として作用するポリペプチド分子内に見出される、同じアミノ酸残基を意味する。
【００１９】
配列同一性決定の目的のために２つの配列の最適なアラインメントの目的のために、改変体のアミノ酸配列の連続セグメントは、参照分子のアミノ酸配列に対して、さらなるアミノ酸残基を有し得るかまたはアミノ酸残基の欠失を有し得る。参照アミノ酸配列に対して比較するために使用される連続セグメントは、少なくとも２０の連続アミノ酸残基を含む。改変体アミノ酸配列中へのギャップの挿入に伴う配列同一性の増大に関する補正は、ギャップペナルティを割り当てることによって行われ得る。配列アラインメントの方法は、当該分野において周知である。
【００２０】
従って、任意の２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。配列の比較のために利用される、１つの好ましいが非限定的な数学アルゴリズムの例としては、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１〜７のアルゴリズムが挙げられる。そのようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）において利用される。このプログラムは、ＧＣＧアラインメントソフトウェアパッケージの一部である。ＰＡＭ１２０重量残基の表、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティが、アミノ酸配列の比較のときのＡＬＩＧＮプログラムに対して用いられ得る。２つの配列を比較する際に使用するための、別の好ましい非限定的な数学アルゴリズムの例は、Ｋａｒｌｉｎ
ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムであり、これは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｈｃｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７において改変される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムへと取り込まれている。ＢＬＡＳＴアミノ酸配列検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施され得る。ここで、スコア＝５０であり、ワード長＝３である。その結果、目的のポリペプチドと類似のアミノ酸配列が得られる。比較の目的のためのギャップのあるアラインメントを得るために、ギャップのあるＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の離れた関係を検出するインターレイト検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）前出を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、ギャップのあるＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのプログラムを利用する場合、デフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：Ｓｕｐｐｌ．３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．中のＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８））、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから入手可能）中のプログラム（例えば、ＧＡＰプログラム）もまた参照のこと。ここでは、このプログラムのデフォルトパラメータが利用される。
【００２１】
アミノ酸配列同一性の比率を考慮するとき、いくつかのアミノ酸残基位置は、タンパク質機能の特性に影響を与えない、保存的アミノ酸置換の結果として異なり得る。これらの場合、パーセント配列同一性は、上方に修正されて保存的に置換されたアミノ酸における類似性を説明することができる。そのような修正は当該分野において周知である。例えば、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。
【００２２】
本発明に包含される生物学的に活性なＩＦＮ−β改変体は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルブミンに共有結合架橋されたＩＦＮ−βポリペプチドも含む。これらの共有結合のハイブリッドＩＦＮ−β分子は、特定の所望の薬学的特性（例えば、患者への投与後の血清半減期の延長）を有する。ＰＥＧ−ＩＦＮ付加物を作製するための方法は、モノメトキシポリエチレングリコールを化学改変してＩＦＮ−βと反応する活性化化合物を作製することを含む。ＰＥＧ連結されたポリペプチドを作製および使用するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．９：２４９〜３０４に記載される。アルブミン融合ポリペプチドを作製する方法は、目的のポリペプチド（例えば、ＩＦＮ−β）およびアルブミンのコード配列の融合を包含し、そして米国特許第５，８７６，９６９号に記載されており、これは、本明細書において参考として援用される。これらのハイブリッドＩＦＮ−β分子は、ＵＳＰマンニトール中に存在する不純物と反応し、そして高度に精製されたマンニトールとともに処方されるとき、より安定である。
【００２３】
本発明に包含されるＩＦＮ−βの生物学的に活性な改変体は、ＩＦＮ−β活性（特に、ＩＦＮ−βレセプターへの結合能）を保持するべきである。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ−β改変体は、参照ＩＦＮ−βポリペプチド（たとえば、ネイティブなヒトＩＦＮ−β）の少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％またはそれより高い生物学的活性を保持する。参照ＩＦＮ−βポリペプチドの活性と比較してその活性が増加しているＩＦＮ−β改変体もまた包含される。ＩＦＮ−β改変体の生物学的活性は、当該分野において公知の任意の方法によって測定され得る。そのようなアッセイの例は、以下に見出され得る：Ｆｅｌｌｏｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：３０８２−３０８６；Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９（２）：４９０−４９６；Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２−５６６６；Ｂｒａｎｃａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：２２１−２２３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：５８２−５８６；Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：２２１−２２３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１９）：１１３０１−１１３０４；および本明細書において記載されるＩＦＮ−β効力アッセイ（実施例２を参照のこと）。
【００２４】
本発明の処方物のＩＦＮ−βは、以下を含むがそれらに限定されない任意の動物種に由来し得る：鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒト。好ましくは、ＩＦＮ−βは、その処方物が哺乳動物ＩＦＮ−β障害の処置において使用されるべきときは、哺乳動物種に由来し、より好ましくは、これは、そのような障害について処置を受ける哺乳動物と同じ種の哺乳動物種由来である。
【００２５】
本発明に包含されるＩＦＮ−βポリペプチドおよびＩＦＮ−β改変体ポリペプチドの非限定的な例は、以下に示される：Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４：３１６−３２０；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８７：４１１−４１６；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１−７４１；Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：２８４８−２８５２；ＥＰ０２８０３３ＢｌおよびＥＰ１０９７４８Ｂｌ。以下もまた参照のこと：米国特許第４，５１８，５８４号；第４，５６９，９０８号；第４，５８８，５８５号；第４，７３８，８４４号；第４，７５３，７９５号；第４，７６９，２３３号；第４，７９３，９９５号；第４，９１４，０３３号；第４，９５９，３１４号；第５，５４５，７２３号；および第５，８１４，４８５号。これらの開示は、本明細書において参考として援用される。これらの引用はまた、生物学的活性の喪失なしに変化され得るＩＦＮ−βポリペプチドの残基および領域に関するガイダンスを提供する。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、安定化された薬学的処方物内のＩＦＮ−βは、ネイティブな成熟ＩＦＮ−βポリペプチドである。別の実施形態において、これらの処方物におけるＩＦＮ−βは、成熟ＩＦＮ−βポリペプチドであって、ネイティブの成熟配列のアミノ酸１７に見出されるシステインは、上記に議論したようにセリンで置換される。しかし、本発明は、安定化された薬学的処方物内のＩＦＮ−βが任意の生物学的に活性なＩＦＮ−βポリペプチドであるかまたは本明細書において他の場所に記載される改変体である、他の実施形態を包含する。
【００２７】
本発明のこのいくつかの実施形態において、ＩＦＮ−βは、組換え産生される。「組換え産生されたＩＦＮ−β」とは、ネイティブの成熟なＩＦＮ−βに匹敵する生物学的活性を有し、そして組換えＤＮＡ技術によって調製されているＩＦＮ−βを意図する。ＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって生成され得る。この宿主細胞は、ヌクレオチド配列を転写し得、その所望のタンパク質を産生し得る細胞であり、そして、原核生物（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得、または真核生物（たとえば、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞）であり得る。ＩＦＮ−βの組換え産生の例は、以下に与えられる：Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１２８；Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：９６７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６，ならびに米国特許第４，４６２，９４０号；第５，７０２，６９９号；および第５，８１４，４８５号；これらは、本明細書において参考として援用される。米国特許第 ５，７９５，７７９号もまた参照のこと。ここでは、ＩＦＮ−β−１ａがチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で組換え産生される。これもまた、本明細書において参考として援用される。ヒトインターフェロン遺伝子は、組換えＤＮＡ（「ｒＤＮＡ」）技術を用いてクローニングされ、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されている（Ｎａｇｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４：３１６；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８７：４１１；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．９：７３１；Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：２８４８）。あるいは、ＩＦＮ−βは、当該分野において公知の方法に従って、目的のＩＦＮ−βタンパク質を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物によって産生され得る。
【００２８】
あるいは、ＩＦＮ−βは、ペプチド技術分野における当業者に公知のいくつかの任意の技術により化学合成され得る。たとえば、以下を参照のこと：Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２２１６−２２２０，Ｓｔｅｗａｒｄ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ），およびＢａｒａｎｅｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８０）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０），ｐｐ．３−２５４（これは、固相ペプチド合成技術を議論する）；ならびにＢｏｄａｎｓｋｙ（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）ならびにＧｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（１９８０）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（これは、古典的な溶液合成を議論する）。ＩＦＮ−βはまた、同時複数ペプチド合成の方法により化学的に調製され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５；および米国特許第４，６３１，２１１号。
【００２９】
本発明により包含される組成物は、少なくて約０．０１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮ−β〜多くて約１５ｍｇ／ｍｌ（重量／容量）のＩＦＮ−βを有し得る。種々の実施形態において、ＩＦＮ−βは、約０．０１５ｍｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．０７５ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．１２５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．１７５ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．２２５ｍｇ／ｍｌ〜約０．３ｍｇ／ｍｌの濃度、ならびに約０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明の処方物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、貯蔵、投与、および／または治療成分の治癒効果を容易にするために従来より当該分野において使用されているキャリアを意図する。キャリアはまた、ＩＦＮ−βの所望されない任意の副作用を減少させ得る。適切なキャリアは、安定であるべき、すなわち、処方物における他の成分と反応し得ないべきである。これは、処置のために使用される投薬量および濃度においてレシピエントにおける有意な局所または全身性の有害作用を生成すべきではない。そのようなキャリアはは、一般に、当該分野において知られている。本発明に適切なキャリアは、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、ポリサッカリド、モノサッカリド、ポリビニル−ピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、不揮発性油、オレイン酸エチル、リポソーム、グルコース、スクロース、ラクトース、マンノース、デキストロース、デキストラン、セルロース、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの従来使用される大きな安定した高分子である。徐放性キャリア（例えば、ヒアルロン酸）もまた、適切であり得る。特に、Ｐｒｉｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕ．８５：５１−５６、および米国特許第５，１６６，３３１号を参照のこと。この組成物中の他の受容可能な成分としては、等張性を改変する薬学的に受容可能な薬剤が挙げられるがそれらに限定されず、水、塩、糖、ポリオール、アミノ酸、および緩衝剤が含まれる。適切な緩衝剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、および他の有機酸またはその塩、ならびに等張性を改変する塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウムなど）が挙げられ、そして上記の緩衝剤をも含み得る。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアは、ヒトアルブミンである。ヒトアルブミンは、天然に存在するヒトアルブミンであり得るか、あるいは組換え産生されたヒトアルブミンであり得る。これらの２つの形態は、本明細書において総称して「ヒトアルブミン」と呼ぶ。本発明に包含される処方物は、少なくて約０．０１％（重量／容量）のヒトアルブミン〜多くて約１５％（重量／容量）ヒトアルブミンを有し得る。種々の実施形態において、ヒトアルブミンは、約０．０２５％〜約１２．５％の濃度、約０．０５％〜約１０％の濃度、約０．１％〜約９％の濃度、約０．２５％〜約８％の濃度、約０．５％〜約７％の濃度、約０．６％〜約２％の濃度、約０．７％〜約１．７５％の濃度、約０．７５％〜約１．５％の濃度、約１．２％〜約１．３％の濃度、ならびに約１．２５％の濃度で存在する。
【００３２】
薬学的組成物は、さらに、可溶化剤または可溶性増強剤を含み得る。グアニジウム基を含む化合物（もっとも好ましくは、アルギニン）は、ＩＦＮ−βについて適切な可溶性増強剤である。そのような可溶性増強剤の例としては、アミノ酸アルギニン、およびアルギニンのアミノ酸類似体であって、ＩＦＮ−βの可溶性を増強する能力を保持するものが挙げられる。そのような類似体としては、限定することなく、アルギニンを含むジペプチドおよびトリペプチドが挙げられる。さらなる適切な可溶化剤は、以下に議論される：米国特許第４，８１６，４４０号；第４，８９４，３３０号；同第５，００４，６０５号；同第５，１８３，７４６号；同第５，６４３，５６６号；ならびにＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｓｓｏｃ．３４：４５２−４６２、これらは、本明細書において参考として援用される。
【００３３】
本発明に包含される、非限定的な可溶化剤の例としては、ＩＦＮ−βを可溶化するに適切な疎水性親水性バランスを有する表面活性剤（界面活性剤）が挙げられる。強力な天然のまたは合成のアニオン性表面活性剤（例えば、脂肪酸のアルカリ金属塩およびアルカリ金属アルキル硫酸塩）が使用され得る。そのような薬剤は、通常、１０〜１４の炭素原子を含む。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびラウリル酸ナトリウムは、特に好ましい可溶化剤である。本発明の組成物において使用され得る他の可溶化剤の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ドデシルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、トリデシルスルホン酸ナトリウム、ミルスチン酸ナトリウム、カプロイル酸ナトリウム、ドデシルＮ−サルコシン酸ナトリウム、およびテトラデシルＮ−サルコシン酸ナトリウム。表面活性剤または乳化剤による医薬の古典的な安定化は、例えば、以下に記載される：Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０−１６５。さらなる適切な表面活性剤は、以下に議論される：米国特許第４，５０７，２８１号；同第４，８１６，４４０号；および同第５，１８３，７４６号。これらは、本明細書において参考として援用される。
【００３４】
上記に開示される薬剤に加え、他の安定化剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩の一つ（例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム）を加えて、液体薬学的組成物の安定性をさらに増強することができる。ＥＤＴＡは、多くの酸化反応を触媒することが知られる金属イオンのスカベンジャーとして作用し、したがって、さらなる安定化剤を提供する。
【００３５】
ＩＦＮ−β処方物が、哺乳動物（例えば、ヒト）への送達に使用される場合、その組成物の等張性もまた、考慮事項である。従って、１つの実施形態において、ＩＦＮ−βの注射可能な溶液のための組成物は、患者の血清または体液のものと同じかまたは類似する等張性を提供する。等張性を達成するために、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはリン酸緩衝剤）は適切な濃度でその溶液に加えられ得る。
【００３６】
処方物のｐＨもまた、考慮事項である。本発明の安定化されたＩＦＮ−β処方物は、約３．０〜約９の範囲のｐＨを有する。適切なｐＨの範囲は、例えば、約４．０〜約８．８、約５．０〜約８．６、約６．０〜約８．４、約６．８〜約８．２、約６．９〜約８．０、約７．０〜約７．８、約７．１〜約７．７、約７．２〜約７．６、および約７．３〜約７．５を包含する。
【００３７】
本発明の、安定化された液体ＩＦＮ−β処方物、または再構成された安定化された凍結乾燥されたＩＦＮ−β薬学的処方物の薬学的に有効な量が被検体に投与される。「薬学的に有効な量」とは、疾患または状態の処置、予防または診断において有用な量を意図する。投与の代表的な経路としては、経口投与、経鼻送達、肺送達、および非経口投与（経皮、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内および腹腔内の注射または注入を含む）が挙げられるがそれらに限定されない。１つのそのような実施形態において、投与は、注射、好ましくは皮下注射による。本発明の組成物の注射可能形態としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられるがそれらに限定されない。代表的に、ＩＦＮ−βの治療上有効な量は、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの組成物、好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、さらにより好ましくはなお約０．５μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇを包含する。
【００３８】
１つの実施形態において、ＩＦＮ−βを含む安定化された薬学的組成物は、単位投薬量で処方され、そして溶液、懸濁液またはエマルジョンのような注射可能または注入可能な形態であり得る。さらに、この組成物は、乾燥形態で（例えば、凍結乾燥粉末）凍結貯蔵または調製され得る。これは、経口または非経口の投与経路を含む、種々の方法のいずれかによって、投与前に液体溶液、懸濁液またはエマルジョンへと再構成され得る。安定化された薬学的組成物は、メンブレン濾過によって滅菌され得、そして封入バイアルまたはアンプルのような単位用量または多数回用量の容器中に貯蔵される。当該分野において一般的に公知の薬学的組成物を処方するためのさらなる方法は、それらが開示される高度に精製されたマンニトールの有益な効果に有害に影響しない限り、本明細書に開示された薬学的組成物の貯蔵安定性をさらに増強するために使用され得る。処方物および薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤などの選択の完全な議論は、以下に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）（１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、これは、本明細書において参考として援用される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明の液体組成物は、シリンジ（本発明の「予備充填された」シリンジ）中に包装される。次に、１つの実施形態において、本発明の組成物を含む予備充填されたシリンジは、凍結され得る。この凍結された予備充填されたシリンジは、貯蔵または輸送の目的のために有用である。
【００４０】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【００４１】
（実験）
（実施例１：安定性が増大したＩＦＮ−β薬学的処方物の開発）
Ｉ．序論
賦形剤としてデキストロースを含むＩＦＮ−β薬学的処方物は当該分野において知られている。そのような処方物が３７℃以上の温度でインキュベートされるとき、これらの処方物におけるデキストロースは、ＩＦＮ−βとともに共有結合付加物を形成し、これは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）によって検出され得る。ＵＳＰマンニトールで処方されるＩＦＮ−βは、同じ条件下でＲＰ−ＨＰＬＣ検出可能な共有結合付加物を形成しない。しかし、ＵＳＰマンニトールは、ＩＦＮ−βと合わせて、エレクトロスプレー質量分析によって検出される付加物種を形成する不純物を含む。ＵＳＰマンニトール中の不純物の性質は、知られていない。これらの付加物（または分解産物）の形成は、薬学的に所望されないと考えられており、薬学的に受容可能ではないとまで考えられている。ポリペプチドベースの医薬についての現在のガイドラインは、処方物における分解産物の形成を最小限にすることの重要性を強調しているからである。分解産物は、所望されないかまたは受容可能ではないと考えられている。なぜなら、それらは、そのペプチドベースの医薬が所望されない副作用を生じる機会を増大するからである。本発明の新規な知見は、ＩＦＮ−βがそれが高度に精製されたマンニトールと処方されるとき、安定性の増大を示し、その結果、その還元活性は、高度に精製されていないマンニトールで処方されるときと比べて、２０ｐｐｍ未満であることである。本発明のさらなる新規な知見は、メタノールでの抽出、炭素処理、限外濾過および再結晶化によるＵＳＰマンニトールの精製が、２０ｐｐｍ未満の還元活性を伴うマンニトール調製物を生じることである。
【００４２】
ＩＩ．方法
これらの実験において使用するためのＩＦＮ−β−１ｂを、本質的に米国特許第４，４６２，９４０号および同第５，７０２，６９９号（これらは、参考として援用される）において記載されるようにＥ．ｃｏｌｉにおいて生成した。ドデシル硫酸ナトリウムおよび塩をＩＦＮ−βからクロマトグラフィーにより除き；そしてＩＦＮ−β−１ｂを、ヒトアルブミンの溶液とｐＨ１１．５〜１２．０で合わせた。溶液のｐＨを、ＨＣｌで７．５に調整した。そして賦形剤（（マンニトールまたはデキストロース）を含む溶液を加えて最終濃度を１．２５％にした。その処方物におけるヒトアルブミンの最終濃度は、１．２５％ｗ／ｖであった。
【００４３】
これらの処方物からのＩＦＮ−β−１ｂを、ＲＰ−ＨＰＬＣによる質量分析のために調製した。この方法によって、クロマトグラムにおける分離したピーク（Ｂ１）として分離された後、グルコシル化したＩＦＮ−β−１ｂの定量が可能となる。この方法でのグルコシル化されたＩＦＮ−β−１ｂについての検出限界は、０．０２ｍｇ／ｍｌである。このピークの量が０．０２ｍｇ／ｍｌ未満の場合、２つのピーク面積が合算され、そして処方されていないＩＦＮ−β参照と比較されて、ＩＦＮ−β−１ｂの合計含量を得る。このピーク面積が０．０２ｍｇ／ｍｌを超える場合、その濃度は、独立に決定されそして報告される。
【００４４】
以下の装置およびそのそれぞれの製造業者の指示マニュアルを分析に使用した。
【００４５】
溶媒送達系：Ｗａｔｅｒｓ ６２６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｐｕｍｐ
注射系：Ｗａｔｅｒｓ ７１７およびＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ ２００ ｍｌ注射ループ
ポリプロピレンオートサンプラーバイアル（Ｔｅｆｌｏｎ ｓｅｐｔａ付）
オートサンプラー温度制御を４℃に設定して冷蔵
８４％アセトニトリルを針洗浄として使用する。
【００４６】
カラムヒーター：Ｗａｔｅｒｓ ６００
カラムヒーターを４０℃に設定
カラム：ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ Ｂｕｔｙｌ Ｃ４ ＲＰ−Ｃｏｌｕｍｎ，３００Å ５μｍ，４．６ ｍｍ（ＩＤ）２５０ ｍｍ，Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ ２２０１０。
【００４７】
カラムを、カラム標識において指示されるように溶媒流の方向に接続し、そしてカラムヒーターに配置した。
【００４８】
検出器：Ｗａｔｅｒｓ ４８６ ＵＶ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ。
【００４９】
波長を２１４ｎｍに設定する。
【００５０】
データシステム入力を減衰させない。
【００５１】
データシステム：Ｐ．Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ
凍結乾燥させたＩＦＮ−β処方物サンプルを、１．２０ｍｌの０．５４％塩化ナトリウムで再構成し、緩やかに反転させて混合し、そして雰囲気温度で３０±５分間インキュベートした。キャリブレータは、処方されていないＩＦＮ−β参照である。キャリブレータストック溶液は、約０．５ｍｇ／ｍｌにまで希釈され、そして希釈されたキャリブレータ溶液の濃度は、ＵＶ吸収によって決定される（６連の平均）。希釈されたキャリブレータ溶液の最終濃度は、ＵＶ吸収の読み取りの平均を１．７（ＩＦＮ−β−１ｂ吸光係数）で割ったものである。希釈されたキャリブレータ溶液濃度は、３つの顕著な形態に対する吸収によって決定される。次いで、キャリブレータ溶液を、作業用キャリブレータ溶液として使用するために０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【００５２】
オートサンプラーを、１回の注射あたり２０μｌで７０分の間隔で注射するようにプログラムした。このデータシステム電圧範囲は１ボルトであり、サンプリング速度は、１秒あたり１点であり、そして獲得時間は７０分であった。溶離液Ａは０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、ＨＰＬＣ等級）であり、そして溶離液Ｂは８４％アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）および０．０８４％ ＴＦＡ（ＨＰＬＣ等級）であった。溶出流速を１．０ｍｌ／分（７０％溶離液Ａおよび３０％溶離液Ｂ）に設定し、そしてカラムを１時間平衡化した。検出器の基底線およびシステムを平衡化した後、勾配ブランクを分析した。分析を、第二の勾配ブランクにおいて顕著なピークが存在しないときにはじめた。
【００５３】
ＩＦＮ−β濃度を、改変されていないＩＦＮ−β（「Ｂ」ピーク）およびグルコシル化されたＩＦＮ−β（「Ｂ１」ピーク）に対応するピークの面積の合計から決定する。例えば、キャリブレータ溶液が０．２５ｍｇ／ｍｌの処方されていないＩＦＮ−βである場合、ＩＦＮ−β濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝（試験サンプル合計ピーク面積Ｂ１＋Ｂ／キャリブレータ合計ピーク面積Ｂ１＋Ｂ）×０．２５ｍｇ／ｍｌである。
【００５４】
エレクトロスプレイ質量スペクトル（ＥＳ−ＭＳ）データを、このクロマトグラフィーからの画分を用いて得た。分析の前におのおののピークの画分を収集し、そして濃縮した。エレクトロスプレイ質量スペクトルを、Ｈａｒｖａｒｄ シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）およびＲｈｅｏｄｙｎｅ ８１２５インジェクタ（１００μＭ内径の溶融シリカチューブ付）を装着した、ＡＰＩ １００単一四重極質量スペクトロメータ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて得た。質量スペクトルを、０．２Ｄａの工程サイズを用いて６秒／走査で、１４０〜２５００の範囲の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を走査することによって正モードで記録した。質量スペクトロメータを、２ｍＭ酢酸アンモニウムを含む５０：５０：０．１の水：メタノール：蟻酸（ｖ：ｖ：ｖ）中に３．３×１０−５Ｍ ＰＰＧ４２５、１×１０−４Ｍ ＰＰＧ１０００および２×１０−４Ｍ ＰＰＧ２０００（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含むポリプロピレングリコール混合物を用いて較正した。タンパク質溶液（２μＬ中に２０〜５０ｐＭ）のアリコートを、４９：４０：１の水：アセトニトリル：酢酸中の質量スペクトロメータイオン供給源中に２０μＬ／分で導入した。タンパク質は、低いｐＨでイオン供給源中に導入されることから、塩基性部位（例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンの残基の側鎖における窒素原子）は、種々の程度でプロトン化されて、プロトン化についてアクセス可能な部位の数に依存して、多数の荷電状態を有する分子イオン（例えば、［Ｍ＋Ｈ］＋，［Ｍ＋２Ｈ］２＋）を生じる。検出器は、種々の荷電状態における分子イオンのｍ／ｚ比を記録し、そして質量スペクトルは、Ｂｉｏｔｏｏｌｂｏｘソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデコンボリューションをして、タンパク質の分子量を得ることができる。２０ｋＤａでの分子量測定の質量精度は、２ｋＤａ以内であった。
【００５５】
マンニトールの還元活性を、ＵＳＰプロトコルの改変によって決定した。このプロトコルは、ビシンコニン酸（ＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ、製造業者の指示に従って調製した）の存在下でのアルカリ溶液におけるＣｕ２＋の減少を測定する。ＢＣＡはＣｕ１＋と錯体を形成し、そしてこの錯体は、５６２ｎｍでのピーク吸収（Ａ）を伴う青色を有する。
【００５６】
２つのマンニトールサンプル（５００μｌの１５０ｍｇ／ｍｌマンニトール溶液）を、各々の条件についてアッセイした。標準曲線を、既知の還元活性を用いて、グルコース溶液の連続希釈を用いて作成した。５００μｌの調製されたＢＣＡ溶液を、各々の試験サンプル、標準サンプルおよびブランクに加え、そして６０℃で４０分間インキュベートした。グルコース標準を、線形曲線に適合させ、そしてマンニトール試験サンプルの還元活性（ｐｐｍ）を、（（マンニトールサンプルのＡ５６２／標準曲線の勾配）／（マンニトール含量ｍｇ／ｍｌ（１０００））×１０６）として計算した。
【００５７】
ＩＩＩ．結果および考察
グルコシル化を、ＩＦＮ−β−１ｂの分子量に加えられた１６２ダルトンの乗数として質量分析を用いて、デキストロース処方物において検出した。ＩＦＮ−β−１ｂペプチドの分析によって、これらの付加物がタンパク質のリジン残基と還元糖との反応（アマドリ反応）から生じることが示唆された。図１は、デキストロース処方物の処方されたバルクのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを、５０℃で１週間貯蔵した凍結乾燥処方物に対して比較する。この図は、デキストロース処方物中のＩＦＮ−β−１ｂが５０℃で容易に反応して凍結乾燥状態におけるＢ１ピークを生成することを示す。処方されたバルクのＥＳ−ＭＳ（図２）は、グルコース付加物（プラス１６２）に関連するピークを有しない。対照的に、インキュベートされた凍結乾燥デキストロース処方物の質量スペクトル（図３）は、広汎な改変を示す。従って、グルコースは、ＩＦＮ−β−１ｂと反応して、ＥＳ−ＭＳによってその全体構造が確認される、ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出される種を形成する。
【００５８】
対照的に、ＵＳＰマンニトールを用いて作製されたＩＦＮ−β−１ｂ処方物は、ＲＰ−ＨＰＬＣによってピークＢ１として検出可能である種を形成しない。図４は、５０℃で７日にわたって保持される凍結乾燥処方物に対して、マンニトール処方されたバルクを比較する。明らかにピークＢ１は形成されていない。しかし、図５において処方されたバルクの質量スペクトルは、２００４０におけるピークの存在を示し、そして図６におけるインキュベートされた凍結乾燥マンニトール処方物の質量スペクトルは、２０２０１に新たなピークを有する。マンニトールと形成された付加物の量は、ＥＳ−ＭＳによって定量され得ない。しかし、この付加物のシグナルは、装置の検出限界付近にしばしばある。これらのピークの形成の機構は知られていない。ＩＦＮ−β−１ｂとマンニトールとの反応では、デキストロースと形成された種またはグルコースを用いて形成された種のような種を形成せず、ピークＢ１は形成されない。従って、このデータは、ＩＦＮ−β−１ｂ付加物の形成を妨害するのに、より純粋な形態のマンニトールが必要とされることを示す。
【００５９】
次いで、不純物を減少させるようにメタノール抽出されたマンニトールを、ＩＦＮ−β−１ｂの安定性に対するその効果について試験した。ＩＦＮ−β−１ｂを、メタノール抽出したマンニトールの３つの異なるロットを用いて処方し、そして処方されたバルクおよび最終容器の試験サンプルを、上述のＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳ−ＭＳアッセイを用いてアッセイした。図７は、未処理のマンニトールを用いて処方したＩＦＮ−β−１ｂの質量スペクトルを示し、そして図８は、メタノールを用いて精製された、同じロットのマンニトールを用いて処方されたＩＦＮ−β−１ｂの質量スペクトルを示す。３つすべてのロットのマンニトールが類似のパターンを示した。図１７は、還元活性の半分より多くがメタノール処理によって除去されることを示す。明らかに、メタノール処理は、ＩＦＮ−β−１ｂと複合体を形成する不純物を除去するが、いくらかは、この処理によって完全には除去されないかもしれない。
【００６０】
マンニトールにおける残りの不純物を減少させるために、３つのさらなる工程を、精製プロセスに加えた。これらのさらなる工程は炭素処理、限外濾過および再結晶である。メタノール抽出、炭素抽出、限外濾過および再結晶マンニトールの３つのロットを上記のように試験した。呈色還元活性アッセイは、還元活性含量をさらなる精製工程が約１０ｐｐｍまで低下させることを実証した（図１７を参照のこと、サンプル７〜９）。処方物を、高度に精製されたマンニトールを用いて調製した。高度に精製されたマンニトールを用いて調製され、そしてネガティブコントロールとして同じ日に実行した処方物の質量スペクトル（図９）は、マンニトールなしに調製された処方されたバルク（図１０）において存在しないさらなるピークは示さなかった。ＵＳＰマンニトールを用いて調製された処方物の質量スペクトル（図１１）もまた、ポジティブコントロールとして同じ日に実行した。従って、マンニトールの更なる処理は、還元活性が低く、そしてＥＳ−ＭＳではＩＦＮ−β−１ｂと反応しないようである産物を生じる。
【００６１】
（実施例２：高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物の安定性：短期加速研究）
Ｉ．導入
ＩＦＮ−β−１ｂの実験的処方物を、上述のようにデキストロールおよびマンニトールを用いて調製し、そして加速安定性研究を行って、これらの処方物を比較した。処方物の安定性を、２つの異なる条件下で試験した。第一のものは高温ストレスに対してその処方物を供するためのものであり、そして第二のものは室温での長期貯蔵における安定性を測定するためのものであった。高度に精製されたマンニトールを含む処方物において、２５℃で３ヶ月間後に変化は見られず、そしてその処方物の効力は、３７℃で３ヶ月の貯蔵または５０℃で１ヶ月の貯蔵の後も本質的に変化しないままであった。
【００６２】
ＩＩ．方法
各処方物のサンプルを８℃、２５℃、または３７℃で３ヶ月貯蔵した。さらに、２ヶ月の時点で、各温度からサンプルを採り、そしてさらに１ヶ月間５０℃で貯蔵した。５０℃シフトの目的は、貯蔵の最初の二ヶ月において発生し得た可能な変化を悪化させるためのものであり、従って２５℃または３７℃に２ヶ月配置することによって、８℃というもとの貯蔵温度に返還するときにその産物がより迅速に分解するようになるかどうかをより良好に決定することを可能にする。
【００６３】
ＩＦＮ−β−１ｂの特異的活性を以下のようにアッセイした。Ａ５４９ヒト肺がん細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８５）およびマウス脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ株（ＡＴＣＣ ＶＲ−１２９Ｂ））は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。処方物サンプルを、１．２ｍｌ希釈液（０．５４％ ＮａＣｌ）で再構成し、増殖／アッセイ培地で連続希釈し、そして９６ウェルアッセイプレートに、ＩＦＮ−β−１ｂ標準とともに加えた。各々のウェルにおいて希釈されたＩＦＮ−βの容量は、１００μｌであった。増殖／アッセイ培地（Ｅａｒｌｅ塩および２．２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、８．９％仔ウシ血清、１．７９ｍＭＬ−グルタミン、８９Ｕ／ｍｌペニシリン、および８９μｇストレプトマイシン／ｍｌを伴うＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ）中のＡ５４９細胞に１×１０４細胞／ウェルの濃度で加えた。次いで、このプレートを加湿した３７℃±２℃、５±１％ ＣＯ２のインキュベーター中でインキュベートした。このインキュベーションの終わりに、細胞を、５と１６との間の感染多重度でＥＭＣウイルスに感染させた。次いで、このプレートを、２４±１時間にわたって加湿した３７±２℃、５±１％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。この細胞を、予備加熱した（３７℃）ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾリル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、５ｍｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）を用いて染色し、そして以前と同じように３．５時間〜４．５時間インキュベートした。この培地を、細胞から吸引し、そして１００μｌの染色可溶化溶液（８１％ｖ／ｖ２−プロパノール、３％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム、０．０４Ｎ ＨＣｌ）を、各ウェルに加えた。次いで、プレートを３０〜６０分間雰囲気温度にて暗所にてインキュベートした。次いで、プレートを、８±３分間マイクロプレートシェーカーにて振盪した。最後に、各ウェルの５７０ｎｍでの吸光度をマイクロプレート分光光度計で測定した。ＩＦＮ−β活性標準の活性を、線形回帰曲線に適合させ、そしてその試験サンプルの活性をこの曲線から決定した。各サンプルの特異的活性を、使用したサンプルの質量に基づいて計算した。
【００６４】
ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を上記のように行った。添加物処方物もまた、ＩＦＮ−β−１ｂバンドの分子量における見かけ上の増大として還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットにおけるモニターした。
【００６５】
ＩＩＩ．結果および考察
マンニトール処方物の効力（特異的活性）は、この研究の間本質的に変化ないまま保持された。他方、デキストロース処方物の効力は増大した。３７℃の温度への１ヶ月の暴露は、効力に対して影響がなかった（図１４および１５を参照のこと）。マンニトールＩＦＮ−β−１ｂ処方物について、グリコシル化ＩＦＮ−β−１ｂの量は、この研究の間にわたって、５０℃でさえ、検出限界未満のままであった。対照的に、グリコシル化は、３７℃で２ヶ月および５０℃で２週間後にデキストロース処方物において検出されたが２５℃で３ヶ月の貯蔵の後には検出されなかった。広汎なグリコシル化によって、合計のＩＦＮ−β−１ｂの含量を測定するにはクロマトグラムが多すぎるように改変された。このデキストロース処方物における付加物の形成もまた、３７℃で２ヶ月の貯蔵または５０℃で１ヶ月の貯蔵の後に、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットにおいて検出された。対照的に、どの貯蔵条件でもマンニトール処方物については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットにおいて変化が観察されなかった。
【００６６】
（実施例３：高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物の長期安定性）
高度に精製されたマンニトールを含む３つのロット（Ｎ００６、Ｎ００５およびＮ００９）のＩＦＮ−β−１ｂ処方物を、４℃、２５℃または３０℃において貯蔵し、そしてその安定性を、１年間にわたって３ヶ月の間隔で、およびさらに１年間６ヶ月の間隔でアッセイした。安定性は、上記の方法によってアッセイした。
【００６７】
すべての３つのロットは、４℃および３０℃において、２４ヶ月を通じて効力を保持していた。データは、図１６〜１８に提示される。さらに、すべての３つのロットが、すべての温度およ時点において、ピークＢ１（グルコシル化されたＩＦＮ−β種）が０．０２ｍｇ／ｍｌを超えないことを実証した。
【００６８】
当業者は、単なる慣用される実験を用いて、ＩＦＮ−βについて本明細書において記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識し、または確認することができる。さらに、当業者は、慣用的な実験を超えないものを用いて、例としてＩＦＮ−βを用いて提供される上記実験および処方物がタンパク質一般（もっとも特定すれば、薬学的タンパク質）に適用可能であることを認識し、または確認することができる薬学的タンパク質としては、以下のタンパク質を含むがそれらに限定されない：ヒト成長ホルモン、すべてのインターフェロン、すべてのインターロイキン、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）、βグルコセレブロシダーゼ、チロトロピン、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、モノクローナル抗体（例えば、ａｂｃｉｘｉｍａｂ，ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ，ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ，ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，およびｔｒａｎｓｔｕｚｕｍａｂ）、血液因子（例えば、第ＶＩＩａ因子および第ＶＩＩＩ因子）、酵素（例えば、ウロキナーゼ、アスパルギナーゼ、アニストレプラーゼ、およびアルテプラーゼ）。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されるべきであることが意図される。
【００６９】
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連する分野の当業者のレベルの指標である。すべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願があたかも具体的かつ個々に、参考として援用されるべきと言及されたかのように、同程度に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、１週間にわたって５０℃にてインキュベートされたデキストロース処方されたＩＦＮ−βバルクおよび凍結乾燥された粉末についてのＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムの比較を示す。処方物におけるグルコース化されたＩＦＮ−β付加物の、５０℃に保持される処方物は、（およそ画分４８における）第二のピーク（Ｂ１）の外見として見られ、その後、（およそ画分４９〜５０における）メインのＩＦＮ−βピークが続く。実施例１を参照のこと。
【図２】図２は、バルクのデキストロース処方されたＩＦＮ−βについての質量スペクトルを示す。いくつかの小さなピークが、１９８７８アム（原子質量単位）においてメインのＩＦＮ−βピークに加えて検出可能であった。実施例１を参照のこと。
【図３】図３は、バルク組成物から凍結乾燥され、そして５０℃で１週間格納された、デキストロース処方されたＩＦＮ−βのサンプルについての質量スペクトルを示す。図２とは対照的に、主なピークは、ＩＦＮ−β付加物に対応する。実施例１を参照のこと。
【図４】図４は、５０℃で１週間インキュベートされた、ＵＳＰマンニトール処方されたＩＦＮ−βバルクおよび凍結乾燥粉末についての、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を示す。処方物において５０℃に保持された、グルコシル化されたＩＦＮ−β付加物の処方物（Ｂ１ピークの外見）は、見出されない。実施例１を参照のこと。
【図５】図５は、ＵＳＰマンニトール処方されたＩＦＮ−βバルクの質量スペクトルを示す。ＩＦＮ−βは、１９８８０アムにおけるピークとして検出される。実施例１を参照のこと。
【図６】図６は、凍結乾燥し、そして５０℃で１週間でインキュベートされた、ＵＳＰマンニトール処方されるＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。さらなるピーク（付加物を示す）の形成がスペクトル中に見出され得る。実施例１を参照のこと。
【図７】図７は、精製されていないマンニトール処方されるＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。多数の付加ピーク（付加物を示す）の形成がこのスペクトルにおいて見出され得る。実施例１を参照のこと。
【図８】図８は、図７において使用されるのと同じロットからのメタノール抽出したマンニトールを用いて処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。付加物ピークの大きさおよび数は、実質的に減少した。実施例１を参照のこと。
【図９】図９は、高度に精製された（メタノール抽出、炭素処理、限外濾過、および再結晶化）マンニトールを含むＩＦＮ−β処方物の質量スペクトルを示す。３つの小さなピークのみが、改変されていないＩＦＮ−βを示す主なピークに加えて見られる。実施例１を参照のこと。
【図１０】図１０は、マンニトールの不在下で処方されるＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。このスペクトルから、図９に存在する主な二次ピークは、高度に精製されたマンニトールと相互作用することによって形成されないことが、これらがまた賦形剤の不在下で現れるのと同様に見出され得る。実施例１を参照のこと。
【図１１】図１１は、上記図９と同じ日に実施した、ＵＳＰマンニトールで処方されるＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。このスペクトルは、ＵＳＰマンニトールで処方されるＩＦＮ−βがさらなるピーク（付加物）を形成することを確認する。このピークは、高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物においては存在しない。実施例１を参照のこと。
【図１２】図１２は、実施例２に記載されるようなＩＦＮ−βデキストロース処方物についての安定性評価データを示す。
【図１３】図１３は、実施例２に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物についての安定性評価データを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００６についての安定性評価データを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００６についての安定性評価データを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００８についての安定性評価データを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００８についての安定性評価データを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００９についての安定性評価データを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００９についての安定性評価データを示す。
【図１７】図１７は、還元活性が種々のマンニトールサンプルに存在することを示す。サンプル１−３は、メタノール抽出も、炭素濾過も、限外濾過もされていないＵＳＰマンニトールである。サンプル４−６は、メタノール抽出されたＵＳＰマンニトールである。そしてサンプル７−９は、メタノール抽出され、炭素処理され、限外濾過され、そして再結晶化されたマンニトールである。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、薬学的組成物に関し、より詳細には、安定化された、液体のまたは凍結乾燥されたタンパク質（インターフェロンβなどを含む）の処方物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インターフェロンは、ウイルス、二本鎖ＲＮＡ、他のポリヌクレオチド、抗原およびマイトジェンを含む多数のシグナルによって、細胞からの分泌が誘導される糖タンパク質のファミリーである。インターフェロンは、多数の生物学的活性を示し、これには、抗ウイルス性、抗増殖性および免疫調節活性が含まれる。少なくとも３つの異なる型のヒトインターフェロンα、βおよびγが、抗ウイルス活性および抗増殖活性を含む多数の因子に基づいて識別されている。
【０００３】
インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）は、多発性硬化症（ＭＳ）を伴う患者にとって初めて有効であると同定された処置であり、そして再発性ＭＳおよび弛張性ＭＳに罹患した患者が受ける攻撃の数を減少することが実証された。ＩＦＮ−β組成物はまた、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の感染の処置において有用である。
【０００４】
すべてのタンパク質ベースの医薬と同様に、治療剤としてＩＦＮ−βの使用において克服されねばならない１つの主要な障壁は、薬学的処方物におけるその不安定性から生じ得る薬学的有用性の喪失である。薬学的処方物におけるポリペプチドの活性および効力を脅かす物理的不安定性としては、変性ならびに可溶性および不溶性の凝集物の形成が挙げられ、他方、化学的不安定性としては、加水分解、イミド形成、酸化、ラセミ化および脱アミド課が挙げられる。これらの変化のいくつかは、目的のタンパク質の薬学的活性の喪失または低減をもたらすことが知られる。他の場合において、これらの変化の正確な効果は知られていないが、得られる分解産物はなおも、所望されない副作用についての可能性に起因して、薬学的に受容可能ではないと考えられるべきである。
【０００５】
薬学的調製物においてポリペプチドの不安定性は、タンパク質ベースの医薬の承認のために設定されたガイドラインは、そのポリペプチドの活性および分子特性における変化が最小限であるべきであることが強調されているように、直接、それらの薬学的有用性に影響を与える。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ（欧州連合、日本および米国における実行のための、医薬に関連する政策提言を行う三極機関）によって発行されたバイオテクノロジー／生物製剤の安定性試験に関する１９９５年１１月３０日の報告は、「分解産物形成の指標となる有意な定量的または定性的な変化が長期間の安定性、加速安定性、および／またはストレス安定性の研究の間に検出される場合、可能な有害性ならびに長期安定性プログラム内の分解産物の特徴づけおよび定量についての必要性に対して考慮が与えられるべきである。」と言及している。
【０００６】
その結果、さらなるタンパク質薬学的組成物（ＩＦＮ−β組成物を含む）についての必要性が存在する。この組成物は、還元性の不純物が実質的にない生理学的に適合可能な安定剤を含み、それにより、そのタンパク質を安定化し、そしてその薬学的有用性を増強する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
治療活性成分としてＩＦＮ−βおよび賦形剤として高度に精製されたマンニトールを含む組成物が提供される。その組成物は、高度に精製されていないマンニトールを含むＩＦＮ−β組成物と比較して、貯蔵の間の安定性の改善によって特徴付けられる。これらの組成物の製造方法もまた提供される。
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１） ＩＦＮ−βまたはその改変体および高度に精製されたマンニトールを含む、組成物。
（項目２） 前記組成物は、安定性が増大していることによって特徴付けられる、項目１に記載の組成物。
（項目３） 前記組成物は、凍結乾燥されている、項目１に記載の組成物。
（項目４） 前記組成物は、液体である、項目１に記載の組成物。
（項目５） 前記高度に精製されたマンニトールは、約０．２５（重量／容積）％〜約５（重量／容積）％の濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目６） 前記ＩＦＮ−βまたはその改変体は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目１に記載の組成物。
（項目７） 前記処方物は、ｐＨ約３．０〜ｐＨ約９．０の範囲のｐＨを有する、項目１に記載の組成物。
（項目８） ヒトアルブミンもまた含有する、項目１に記載の組成物。
（項目９） 前記ヒトアルブミンは、約０．０１（重量／容積）％〜約１５（重量／容積）％の濃度で存在する、項目８に記載の組成物。
（項目１０） ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む組成物であって、
該ＩＦＮ−βは、組み換えヒトＩＦＮ−βであり、該組み換えヒトＩＦＮ−βは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、約０．２５（重量／容積）％〜約５（重量／容積）％の濃度で存在し、該組成物のｐＨは、約３．０〜約９．０の範囲にあり、そして
該組成物は、約０．０１（重量／容積）％〜約１５（重量／容積）％の濃度でヒトアルブミンをさらに含有する、
組成物。
（項目１１） 前記組成物は、凍結乾燥されている、項目１０に記載の組成物。
（項目１２） 前記組成物は、液体であるかまたは凍結されている、項目１０に記載の組成物。
（項目１３） ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む組成物であって、
該ＩＦＮ−βは、組み換えヒトＩＦＮ−βであり、該組み換えヒトＩＦＮ−βは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、約０．２５（重量／容積）％〜約５（重量／容積）％の濃度で存在し、該組成物のｐＨは、約３．０〜約９．０の範囲にあり、該組成物は、約０．０１（重量／容積）％〜約１５（重量／容積）％の濃度でヒトアルブミンおよび該組成物を等張性とするのに充分な塩化ナトリウムをさらに含有する、
組成物。
（項目１４） 前記組成物は、凍結乾燥されている、項目１３に記載の組成物。
（項目１５） 前記組成物は、液体であるかまたは凍結されている、項目１３に記載の組成物。
（項目１６） ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む組成物であって、
該ＩＦＮ−βは、組み換えヒトＩＦＮ−βであり、該組み換えヒトＩＦＮ−βは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、約０．２５（重量／容積）％〜約２．５（重量／容積）％の濃度で存在し、該組成物のｐＨは、約６．８〜約８．２の範囲にあり、そして該組成物は、約０．２５（重量／容積）％〜約２．５（重量／容積）％の濃度でヒトアルブミンをさらに含有する、
組成物。
（項目１７） 前記組成物は、該組成物を等張性とするために充分な塩化ナトリウムをさらに含む、項目１６に記載の組成物。
（項目１８） 前記組成物は液体であり、該液体は凍結または凍結乾燥されている、項目１６に記載の組成物。
（項目１９） 前記組成物は液体であり、該液体は凍結または凍結乾燥されている、項目１７に記載の組成物。
（項目２０） ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む組成物であって、
該ＩＦＮ−βは、組み換えヒトＩＦＮ−βであり、該組み換えヒトＩＦＮ−βは、約０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、該高度に精製されたマンニトールは、約１．２５（重量／容積）％の濃度で存在し、該組成物のｐＨは、約７．３〜約７．５の範囲にあり、そして該組成物は、約１．２５（重量／容積）％の濃度でヒトアルブミンをさらに含有する、
組成物。
（項目２１） 前記組成物は、該組成物を等張性とするために充分な塩化ナトリウムをさらに含む、項目２０に記載の組成物。
（項目２２） 前記組成物は、液体であり、該液体は凍結または凍結乾燥されている、項目２０に記載の組成物。
（項目２３） 前記組成物は、液体であり、該液体は凍結または凍結乾燥されている、項目２１に記載の組成物。
（項目２４） 前記ＩＦＮ−βは、成熟したネイティブヒトＩＦＮ−βのアミノ酸配列を有するポリペプチドである、項目１に記載の組成物。
（項目２５） 前記ＩＦＮ−βは、グルコシル化されているかまたはグルコシル化されていない、項目２４に記載の組成物。
（項目２６） 前記ＩＦＮ−βは、組換え産生される、項目１に記載の組成物。
（項目２７） 項目１に記載の組成物を含む、予備充填されたシリンジ。
（項目２８） 前記組成物は凍結されている、項目２７に記載の予備充填されたシリンジ。
（項目２９） ＩＦＮ−βまたはその改変体およびマンニトールを含む組成物であって、該マンニトールは、２０ｐｐｍ未満の還元活性を有する、組成物。
（項目３０） 薬学的ポリペプチドおよび高度に精製されたマンニトールを含む、組成物。
（項目３１） 前記薬学的ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、β−グルコセレブロシダーゼ、チロトロピン、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、モノクローナル抗体、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、ウロキナーゼ、アスパルギナーゼ、アニストレプラーゼ、およびアルテプラーゼからなる群より選択される、項目３０に記載の組成物。
（項目３２） 改善された安定性によって特徴付けられる、ＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体の処方物を生産する方法であって、該方法は：
ＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体および高度に精製されたマンニトールを、該ＩＦＮ−βまたはその改変体を安定化するに充分な量で含む処方物を生産する工程を包含する、方法。
（項目３３） 項目３２に記載の方法によって生産される処方物。
（項目３４） ＩＦＮ−βまたはその生物学的に活性な改変体の処方物を生産する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）クロマトグラフィーによって該ＩＦＮ−βからドデシル硫酸ナトリウムおよび塩を取り除く工程；
ｂ）該ＩＦＮ−βと、ヒトアルブミンの溶液とを、約１１．５〜約１２．０のｐＨで合わせる工程；
ｃ）該溶液のｐＨをＨＣｌで７．５に調整する工程；および
ｄ）高度に精製されたマンニトールの溶液を加える工程、
を包含する、方法。
（項目３５） 項目３４に記載される方法によって生産される処方物。
（項目３６） 前記処方物を凍結乾燥する工程をさらに包含する、項目３４に記載の方法。
（項目３７） 薬学的組成物におけるＩＦＮ−βまたはその改変体の安定性を増大させる方法であって、該方法は：
該組成物中に、該ＩＦＮ−βまたはその改変体を安定化するのに充分な量の高度に精製されたマンニトールを取り込ませる工程、
を包含する、方法。
（項目３８） 前記組成物を等張性にさせるに充分な塩化ナトリウムを加える工程をさらに包含する、項目３４に記載の方法。
（項目３９） 項目３８に記載の方法によって生産される処方物。
（項目４０） 前記処方物を凍結乾燥する工程をさらに包含する、項目３８に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、安定性が増大したＩＦＮ−β薬学的組成物、およびそれらの調製方法に関する。この組成物は、ＩＦＮ−βおよび高度に精製されたマンニトールを含む。この高度に精製されたマンニトールは、分解産物の形成を減少させることによってその処方物の安定性を増大させる。安定化されたＩＦＮ−β処方物は、より安全である（可能な有害な副作用が減少することに起因する）、およびより経済的である（処方物の寿命が増大することによる）という点で有利である。
【０００９】
開示された組成物の安定性の増大は、高度に精製されたマンニトールの使用から生じる。本発明の新規な知見は、高度に精製されていないマンニトールがＩＦＮ−βと相互作用して所望されない付加物（分解産物）を生成する還元活性を含むのに対して、他方、高度に精製されたマンニトールは、この還元活性を含まず、そしてＩＦＮ−β処方物におけるこれらの付加物の形成を生じないことである。本明細書において提示される実験結果（実験の節における実施例１を参照のこと）は、ＩＦＮ−β付加物形成を担う精製されていないマンニトール中に存在する還元活性は、還元糖活性ではないことを示す。なぜなら、高度に精製されていないマンニトールの存在下で形成された付加物は、既知の還元糖活性（例えば、デキストロース）を有する賦型剤の存在下で形成される付加物とは明らかに識別され得るからである。
【００１０】
本明細書において用いられる「高度に精製されたマンニトール」とは、低レベルの還元活性を有するマンニトールをいう。高度に精製されたマンニトールの還元活性は、本明細書において別の場所において記載される還元活性アッセイによって測定されると２０ｐｐｍＵＳＰ未満である。種々の実施形態において、高度に精製されたマンニトールの還元活性は、１９ｐｐｍ未満であり、１８ｐｐｍ未満であり、１７ｐｐｍ未満であり、１６ｐｐｍ未満であり、１５ｐｐｍ未満であり、１４ｐｐｍ未満であり、あるいは１３ｐｐｍ未満である。１つの実施形態において、高度に精製されたマンニトールはＵＳＰ（米国薬局方）またはＡＣＳ（米国化学会）等級のマンニトールである。この等級のマンニトールは、１）メタノール抽出；２）炭素処理；３）限外濾過；および４）再結晶化のさらなる工程を受けている。高度に精製されたマンニトールは、その処方物を安定化するために十分な濃度で存在する。本発明に包含される処方物は、約０．１％（ｗ／ｖ）ほどの少なさの高度に精製されたマンニトールを有していてもよく、または約７．５％（ｗ／ｖ）ほどの多さの高度に精製されたマンニトールを有していてもよい。種々の実施形態において、このマンニトールは、約０．２〜約７．０％の濃度で存在し、約０．２５％〜約２．５％の濃度で存在し、そして約１．２５％の濃度で存在する。
【００１１】
治療活性成分としてＩＦＮ−β、および賦型剤として高度に精製されたマンニトールを含む、液体および凍結乾燥の両方の薬学的組成物が開示される。本発明の目的のために、薬学的組成物または処方物に関し、用語「液体」とは、用語「水性」を包含することが意図される。ＩＦＮ−β薬学的処方物に関し用語「凍結乾燥」とは、複数のバイアルの減圧下での迅速な凍結乾燥（フリーズドライ）をいう。このバイアルは各々、本発明のインターフェロン処方物の単位用量をその中に含む。上記凍結乾燥を行う凍結乾燥剤は市販されており、そして当業者によって容易に実施され得る。本発明の１つの実施形態において、液体組成物は凍結乾燥されている。
【００１２】
本発明の液体または凍結乾燥されたＩＦＮ−β処方物は、「安定化される」。「安定化された」組成物あるいは「増大した安定性」または「改善された安定性」を有する組成物とは、高度に精製されていないマンニトールを用いて処方されたＩＦＮ−β組成物に対して貯蔵安定性が増大した組成物を意味する。安定性のこの増大は、高度に精製されていないマンニトールを用いた処方物との比較において、貯蔵の間のＩＦＮ−β付加物または分解産物の処方物における減少によって証明される。付加物または分解産物の形成は、本明細書において記載される質量分析アッセイを用いて測定され得る。安定化された、高度に精製されたマンニトール処方された本発明のＩＦＮ−β組成物は、本明細書において記載される質量分析アッセイによって決定されるように、ＵＳＰマンニトール処方されたＩＦＮ−βにおいて、マンニトールなしで処方されるＩＦＮ−β組成物と比較したときに観察されるさらなるピークの非存在によって特徴付けられる。例えば、図９に示される、高度に精製されたマンニトールを用いて処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルを参照のこと。これは、図１０に示されるマンニトールなしで処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルと比較してさらなるピークを示さない。対照的に、図１１に示される、ＵＳＰマンニトールで処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルは、マンニトールなしで処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルと比較して、多数のさらなるピーク（付加物）を解像する。本発明の安定化されたＩＦＮ−β薬学的処方物は、その効力を保持し、そして３０℃で貯蔵したときに約２年までの期間にわたり、および２５℃で貯蔵したときに少なくとも２年間、０．０２ｍｇ／ｍｌ未満のグルコシル化されたＩＦＮ−βを含む。
【００１３】
本発明の安定化された薬学的処方物は、ＩＦＮ−βおよびその改変体を含む。本明細書において使用される用語「ＩＦＮ−β」とは、ＩＦＮ−βまたはその改変体（これは、ときに、ＩＦＮ−β様ポリペプチドと呼ばれる）をいう。ヒトＩＦＮ−β改変体（これは、天然に存在するもの（例えば、ＩＦＮ−β遺伝子座において生じる対立遺伝子改変体）であり得るか、または組換え産生され得る）は、ネイティブの成熟ＩＦＮ−β配列と同じか、類似するか、または実質的に類似する、アミノ酸配列を有する。活性を保持するＩＦＮ−βフラグメントまたはＩＦＮ−βの短縮形態もまた、包含される。これらの生物学的に活性な、ＩＦＮ−βのフラグメントまたは短縮形態は、全長ＩＦＮ−βアミノ酸配列から、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いてアミノ酸残基を除くことによって生成される。ＩＦＮ−βポリペプチドは、グルコシル化されていてもよく、グルコシル化されていなくてもよい。なぜなら、文献において、グルコシル化されているＩＦＮ−βポリペプチドおよびグルコシル化されていないＩＦＮ−βポリペプチドの両方が質的に類似する特異的活性を示し、そして従ってグルコシル化部分は、ＩＦＮ−βの生物学的活性に関与せず、そして寄与もしていないと報告されているからである。
【００１４】
本明細書において含まれるＩＦＮ−β改変体は、ネイティブの成熟ＩＦＮ−β配列のムテインを含む（例えば、米国特許第５，８１４，４８５号を参照のこと。これは、本明細書において参考として援用される）。ここでは、生物学的活性に必須ではない１つまたは複数のシステイン残基が故意に欠失されているか、または他のアミノ酸で置き換えられ、分子間架橋または不正確な分子間ジスルフィド結合形成のいずれかのための部位が除去されている。この型のＩＦＮ−β改変体は、ネイティブの成熟アミノ酸配列のアミノ酸１７に見出されるシステインに代えて、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、スレオニン、またはメチオニンを含む改変体を包含する。セリンおよびスレオニンは、それらがシステインと化学的に類似することから、もっとも好ましい置換物である。セリン置換がもっとも好ましい。例えば、ネイティブの成熟配列のアミノ酸１７において見出されるシステインがセリンで置換されたＩＦＮ−β改変体を参照のこと（米国特許第５，８１４，４８５号）。システイン１７はまた、当該分野において公知の方法を用いて欠失され得る（例えば、米国特許第４，５８８，５８４号を参照のこと。これは、本明細書において参考として援用される）。このことにより、ネイティブの成熟ＩＦＮ−βよりも１アミノ酸短い成熟ＩＦＮ−βムテインが生じる。例としてはまた、米国特許第４，５３０，７８７号；同第４，５７２，７９８号；および同第４，５８８，５８５号を参照のこと。従って、たとえば、その薬学的有用性を改善する１つまたは複数の改変体を有するＩＦＮ−β改変体もまた、本発明に包含される。
【００１５】
当業者は、更なる変化が、ＩＦＮ−βをコードするヌクレオチド配列への変異によって、インターフェロンの生物学的活性を変化させることなく、ＩＦＮ−βアミノ酸配列における変化を生じることによって導入され得ることを理解する。従って、ネイティブの成熟ＩＦＮ−βについてのアミノ酸配列とは異なる配列を有するＩＦＮ−β改変体をコードする、単離された核酸分子は、１または複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を、本明細書に開示される対応するヌクレオチド配列へと導入し、それにより１または複数のアミノ酸の置換、付加または欠失が、コードされるＩＦＮ−βへと導入されることによって作製され得る。変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって導入され得る。そのようなＩＦＮ−β改変体もまた、本発明に包含される。
【００１６】
例えば、保存的アミノ酸置換は、１または複数の予測された、好ましくは非必須のアミノ酸残基において行われ得る。「非必須」のアミノ酸残基とは、生物学的活性を変化させることなくＩＦＮ−βの野生型配列とは異なり得る残基である。他方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」とは、そのアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換をいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。そのような置換は、保存されたアミノ酸残基に対してはなされないか、あるいは、保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸残基に対しては行われない。
【００１７】
あるいは、改変体ＩＦＮ−βヌクレオチド配列は、飽和変異誘発のような、ＩＦＮ−βコード配列のすべてまたは部分にわたってランダムに導入される変異によって作製され得る。そして、得られた変異体は、ＩＦＮ−βの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を保持する変異体を同定し得る。変異誘発の後、コードされるタンパク質は、組換え発現され得、そしてそのタンパク質の活性は、本明細書において記載される標準的なアッセイ技術を用いて決定され得る。
【００１８】
ＩＦＮ−βの生物学的に活性な改変体は、一般的に、比較の基礎として作用する、参照ＩＦＮ−βポリペプチド（例えば、ネイティブヒトＩＦＮ−β）に対して、少なくとも８０％、より好ましくは約９０〜約９５％またはそれを超えるか、そしてもっとも好ましくは約９６％〜約９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する。「配列同一性」とは、改変体ポリペプチド、ならびにその改変体のアミノ酸配列の、特定の連続セグメントが参照分子のアミノ酸配列とアラインメントし、そして比較されるとき、参照として作用するポリペプチド分子内に見出される、同じアミノ酸残基を意味する。
【００１９】
配列同一性決定の目的のために２つの配列の最適なアラインメントの目的のために、改変体のアミノ酸配列の連続セグメントは、参照分子のアミノ酸配列に対して、さらなるアミノ酸残基を有し得るかまたはアミノ酸残基の欠失を有し得る。参照アミノ酸配列に対して比較するために使用される連続セグメントは、少なくとも２０の連続アミノ酸残基を含む。改変体アミノ酸配列中へのギャップの挿入に伴う配列同一性の増大に関する補正は、ギャップペナルティを割り当てることによって行われ得る。配列アラインメントの方法は、当該分野において周知である。
【００２０】
従って、任意の２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。配列の比較のために利用される、１つの好ましいが非限定的な数学アルゴリズムの例としては、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１〜７のアルゴリズムが挙げられる。そのようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）において利用される。このプログラムは、ＧＣＧアラインメントソフトウェアパッケージの一部である。ＰＡＭ１２０重量残基の表、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティが、アミノ酸配列の比較のときのＡＬＩＧＮプログラムに対して用いられ得る。２つの配列を比較する際に使用するための、別の好ましい非限定的な数学アルゴリズムの例は、Ｋａｒｌｉｎ
ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムであり、これは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｈｃｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７において改変される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムへと取り込まれている。ＢＬＡＳＴアミノ酸配列検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施され得る。ここで、スコア＝５０であり、ワード長＝３である。その結果、目的のポリペプチドと類似のアミノ酸配列が得られる。比較の目的のためのギャップのあるアラインメントを得るために、ギャップのあるＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の離れた関係を検出するインターレイト検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）前出を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、ギャップのあるＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのプログラムを利用する場合、デフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：Ｓｕｐｐｌ．３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．中のＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８））、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから入手可能）中のプログラム（例えば、ＧＡＰプログラム）もまた参照のこと。ここでは、このプログラムのデフォルトパラメータが利用される。
【００２１】
アミノ酸配列同一性の比率を考慮するとき、いくつかのアミノ酸残基位置は、タンパク質機能の特性に影響を与えない、保存的アミノ酸置換の結果として異なり得る。これらの場合、パーセント配列同一性は、上方に修正されて保存的に置換されたアミノ酸における類似性を説明することができる。そのような修正は当該分野において周知である。例えば、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。
【００２２】
本発明に包含される生物学的に活性なＩＦＮ−β改変体は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルブミンに共有結合架橋されたＩＦＮ−βポリペプチドも含む。これらの共有結合のハイブリッドＩＦＮ−β分子は、特定の所望の薬学的特性（例えば、患者への投与後の血清半減期の延長）を有する。ＰＥＧ−ＩＦＮ付加物を作製するための方法は、モノメトキシポリエチレングリコールを化学改変してＩＦＮ−βと反応する活性化化合物を作製することを含む。ＰＥＧ連結されたポリペプチドを作製および使用するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．９：２４９〜３０４に記載される。アルブミン融合ポリペプチドを作製する方法は、目的のポリペプチド（例えば、ＩＦＮ−β）およびアルブミンのコード配列の融合を包含し、そして米国特許第５，８７６，９６９号に記載されており、これは、本明細書において参考として援用される。これらのハイブリッドＩＦＮ−β分子は、ＵＳＰマンニトール中に存在する不純物と反応し、そして高度に精製されたマンニトールとともに処方されるとき、より安定である。
【００２３】
本発明に包含されるＩＦＮ−βの生物学的に活性な改変体は、ＩＦＮ−β活性（特に、ＩＦＮ−βレセプターへの結合能）を保持するべきである。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ−β改変体は、参照ＩＦＮ−βポリペプチド（たとえば、ネイティブなヒトＩＦＮ−β）の少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％またはそれより高い生物学的活性を保持する。参照ＩＦＮ−βポリペプチドの活性と比較してその活性が増加しているＩＦＮ−β改変体もまた包含される。ＩＦＮ−β改変体の生物学的活性は、当該分野において公知の任意の方法によって測定され得る。そのようなアッセイの例は、以下に見出され得る：Ｆｅｌｌｏｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：３０８２−３０８６；Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９（２）：４９０−４９６；Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：５６６２−５６６６；Ｂｒａｎｃａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：２２１−２２３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：５８２−５８６；Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：２２１−２２３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１９）：１１３０１−１１３０４；および本明細書において記載されるＩＦＮ−β効力アッセイ（実施例２を参照のこと）。
【００２４】
本発明の処方物のＩＦＮ−βは、以下を含むがそれらに限定されない任意の動物種に由来し得る：鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒト。好ましくは、ＩＦＮ−βは、その処方物が哺乳動物ＩＦＮ−β障害の処置において使用されるべきときは、哺乳動物種に由来し、より好ましくは、これは、そのような障害について処置を受ける哺乳動物と同じ種の哺乳動物種由来である。
【００２５】
本発明に包含されるＩＦＮ−βポリペプチドおよびＩＦＮ−β改変体ポリペプチドの非限定的な例は、以下に示される：Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４：３１６−３２０；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８７：４１１−４１６；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１−７４１；Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：２８４８−２８５２；ＥＰ０２８０３３ＢｌおよびＥＰ１０９７４８Ｂｌ。以下もまた参照のこと：米国特許第４，５１８，５８４号；第４，５６９，９０８号；第４，５８８，５８５号；第４，７３８，８４４号；第４，７５３，７９５号；第４，７６９，２３３号；第４，７９３，９９５号；第４，９１４，０３３号；第４，９５９，３１４号；第５，５４５，７２３号；および第５，８１４，４８５号。これらの開示は、本明細書において参考として援用される。これらの引用はまた、生物学的活性の喪失なしに変化され得るＩＦＮ−βポリペプチドの残基および領域に関するガイダンスを提供する。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、安定化された薬学的処方物内のＩＦＮ−βは、ネイティブな成熟ＩＦＮ−βポリペプチドである。別の実施形態において、これらの処方物におけるＩＦＮ−βは、成熟ＩＦＮ−βポリペプチドであって、ネイティブの成熟配列のアミノ酸１７に見出されるシステインは、上記に議論したようにセリンで置換される。しかし、本発明は、安定化された薬学的処方物内のＩＦＮ−βが任意の生物学的に活性なＩＦＮ−βポリペプチドであるかまたは本明細書において他の場所に記載される改変体である、他の実施形態を包含する。
【００２７】
本発明のこのいくつかの実施形態において、ＩＦＮ−βは、組換え産生される。「組換え産生されたＩＦＮ−β」とは、ネイティブの成熟なＩＦＮ−βに匹敵する生物学的活性を有し、そして組換えＤＮＡ技術によって調製されているＩＦＮ−βを意図する。ＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって生成され得る。この宿主細胞は、ヌクレオチド配列を転写し得、その所望のタンパク質を産生し得る細胞であり、そして、原核生物（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得、または真核生物（たとえば、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞）であり得る。ＩＦＮ−βの組換え産生の例は、以下に与えられる：Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１２８；Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：９６７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６，ならびに米国特許第４，４６２，９４０号；第５，７０２，６９９号；および第５，８１４，４８５号；これらは、本明細書において参考として援用される。米国特許第 ５，７９５，７７９号もまた参照のこと。ここでは、ＩＦＮ−β−１ａがチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で組換え産生される。これもまた、本明細書において参考として援用される。ヒトインターフェロン遺伝子は、組換えＤＮＡ（「ｒＤＮＡ」）技術を用いてクローニングされ、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されている（Ｎａｇｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４：３１６；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８７：４１１；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．９：７３１；Ｓｔｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：２８４８）。あるいは、ＩＦＮ−βは、当該分野において公知の方法に従って、目的のＩＦＮ−βタンパク質を発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物によって産生され得る。
【００２８】
あるいは、ＩＦＮ−βは、ペプチド技術分野における当業者に公知のいくつかの任意の技術により化学合成され得る。たとえば、以下を参照のこと：Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２２１６−２２２０，Ｓｔｅｗａｒｄ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ），およびＢａｒａｎｅｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８０）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０），ｐｐ．３−２５４（これは、固相ペプチド合成技術を議論する）；ならびにＢｏｄａｎｓｋｙ（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）ならびにＧｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（１９８０）Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（これは、古典的な溶液合成を議論する）。ＩＦＮ−βはまた、同時複数ペプチド合成の方法により化学的に調製され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５；および米国特許第４，６３１，２１１号。
【００２９】
本発明により包含される組成物は、少なくて約０．０１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮ−β〜多くて約１５ｍｇ／ｍｌ（重量／容量）のＩＦＮ−βを有し得る。種々の実施形態において、ＩＦＮ−βは、約０．０１５ｍｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．０７５ｍｇ／ｍｌ〜約６ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．１２５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．１７５ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度、約０．２２５ｍｇ／ｍｌ〜約０．３ｍｇ／ｍｌの濃度、ならびに約０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明の処方物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、貯蔵、投与、および／または治療成分の治癒効果を容易にするために従来より当該分野において使用されているキャリアを意図する。キャリアはまた、ＩＦＮ−βの所望されない任意の副作用を減少させ得る。適切なキャリアは、安定であるべき、すなわち、処方物における他の成分と反応し得ないべきである。これは、処置のために使用される投薬量および濃度においてレシピエントにおける有意な局所または全身性の有害作用を生成すべきではない。そのようなキャリアはは、一般に、当該分野において知られている。本発明に適切なキャリアは、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、ポリサッカリド、モノサッカリド、ポリビニル−ピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、不揮発性油、オレイン酸エチル、リポソーム、グルコース、スクロース、ラクトース、マンノース、デキストロース、デキストラン、セルロース、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの従来使用される大きな安定した高分子である。徐放性キャリア（例えば、ヒアルロン酸）もまた、適切であり得る。特に、Ｐｒｉｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕ．８５：５１−５６、および米国特許第５，１６６，３３１号を参照のこと。この組成物中の他の受容可能な成分としては、等張性を改変する薬学的に受容可能な薬剤が挙げられるがそれらに限定されず、水、塩、糖、ポリオール、アミノ酸、および緩衝剤が含まれる。適切な緩衝剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、および他の有機酸またはその塩、ならびに等張性を改変する塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウムなど）が挙げられ、そして上記の緩衝剤をも含み得る。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアは、ヒトアルブミンである。ヒトアルブミンは、天然に存在するヒトアルブミンであり得るか、あるいは組換え産生されたヒトアルブミンであり得る。これらの２つの形態は、本明細書において総称して「ヒトアルブミン」と呼ぶ。本発明に包含される処方物は、少なくて約０．０１％（重量／容量）のヒトアルブミン〜多くて約１５％（重量／容量）ヒトアルブミンを有し得る。種々の実施形態において、ヒトアルブミンは、約０．０２５％〜約１２．５％の濃度、約０．０５％〜約１０％の濃度、約０．１％〜約９％の濃度、約０．２５％〜約８％の濃度、約０．５％〜約７％の濃度、約０．６％〜約２％の濃度、約０．７％〜約１．７５％の濃度、約０．７５％〜約１．５％の濃度、約１．２％〜約１．３％の濃度、ならびに約１．２５％の濃度で存在する。
【００３２】
薬学的組成物は、さらに、可溶化剤または可溶性増強剤を含み得る。グアニジウム基を含む化合物（もっとも好ましくは、アルギニン）は、ＩＦＮ−βについて適切な可溶性増強剤である。そのような可溶性増強剤の例としては、アミノ酸アルギニン、およびアルギニンのアミノ酸類似体であって、ＩＦＮ−βの可溶性を増強する能力を保持するものが挙げられる。そのような類似体としては、限定することなく、アルギニンを含むジペプチドおよびトリペプチドが挙げられる。さらなる適切な可溶化剤は、以下に議論される：米国特許第４，８１６，４４０号；第４，８９４，３３０号；同第５，００４，６０５号；同第５，１８３，７４６号；同第５，６４３，５６６号；ならびにＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｓｓｏｃ．３４：４５２−４６２、これらは、本明細書において参考として援用される。
【００３３】
本発明に包含される、非限定的な可溶化剤の例としては、ＩＦＮ−βを可溶化するに適切な疎水性親水性バランスを有する表面活性剤（界面活性剤）が挙げられる。強力な天然のまたは合成のアニオン性表面活性剤（例えば、脂肪酸のアルカリ金属塩およびアルカリ金属アルキル硫酸塩）が使用され得る。そのような薬剤は、通常、１０〜１４の炭素原子を含む。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびラウリル酸ナトリウムは、特に好ましい可溶化剤である。本発明の組成物において使用され得る他の可溶化剤の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ドデシルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、トリデシルスルホン酸ナトリウム、ミルスチン酸ナトリウム、カプロイル酸ナトリウム、ドデシルＮ−サルコシン酸ナトリウム、およびテトラデシルＮ−サルコシン酸ナトリウム。表面活性剤または乳化剤による医薬の古典的な安定化は、例えば、以下に記載される：Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０−１６５。さらなる適切な表面活性剤は、以下に議論される：米国特許第４，５０７，２８１号；同第４，８１６，４４０号；および同第５，１８３，７４６号。これらは、本明細書において参考として援用される。
【００３４】
上記に開示される薬剤に加え、他の安定化剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩の一つ（例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウム）を加えて、液体薬学的組成物の安定性をさらに増強することができる。ＥＤＴＡは、多くの酸化反応を触媒することが知られる金属イオンのスカベンジャーとして作用し、したがって、さらなる安定化剤を提供する。
【００３５】
ＩＦＮ−β処方物が、哺乳動物（例えば、ヒト）への送達に使用される場合、その組成物の等張性もまた、考慮事項である。従って、１つの実施形態において、ＩＦＮ−βの注射可能な溶液のための組成物は、患者の血清または体液のものと同じかまたは類似する等張性を提供する。等張性を達成するために、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはリン酸緩衝剤）は適切な濃度でその溶液に加えられ得る。
【００３６】
処方物のｐＨもまた、考慮事項である。本発明の安定化されたＩＦＮ−β処方物は、約３．０〜約９の範囲のｐＨを有する。適切なｐＨの範囲は、例えば、約４．０〜約８．８、約５．０〜約８．６、約６．０〜約８．４、約６．８〜約８．２、約６．９〜約８．０、約７．０〜約７．８、約７．１〜約７．７、約７．２〜約７．６、および約７．３〜約７．５を包含する。
【００３７】
本発明の、安定化された液体ＩＦＮ−β処方物、または再構成された安定化された凍結乾燥されたＩＦＮ−β薬学的処方物の薬学的に有効な量が被検体に投与される。「薬学的に有効な量」とは、疾患または状態の処置、予防または診断において有用な量を意図する。投与の代表的な経路としては、経口投与、経鼻送達、肺送達、および非経口投与（経皮、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内および腹腔内の注射または注入を含む）が挙げられるがそれらに限定されない。１つのそのような実施形態において、投与は、注射、好ましくは皮下注射による。本発明の組成物の注射可能形態としては、溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられるがそれらに限定されない。代表的に、ＩＦＮ−βの治療上有効な量は、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの組成物、好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、さらにより好ましくはなお約０．５μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇを包含する。
【００３８】
１つの実施形態において、ＩＦＮ−βを含む安定化された薬学的組成物は、単位投薬量で処方され、そして溶液、懸濁液またはエマルジョンのような注射可能または注入可能な形態であり得る。さらに、この組成物は、乾燥形態で（例えば、凍結乾燥粉末）凍結貯蔵または調製され得る。これは、経口または非経口の投与経路を含む、種々の方法のいずれかによって、投与前に液体溶液、懸濁液またはエマルジョンへと再構成され得る。安定化された薬学的組成物は、メンブレン濾過によって滅菌され得、そして封入バイアルまたはアンプルのような単位用量または多数回用量の容器中に貯蔵される。当該分野において一般的に公知の薬学的組成物を処方するためのさらなる方法は、それらが開示される高度に精製されたマンニトールの有益な効果に有害に影響しない限り、本明細書に開示された薬学的組成物の貯蔵安定性をさらに増強するために使用され得る。処方物および薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤などの選択の完全な議論は、以下に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）（１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、これは、本明細書において参考として援用される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明の液体組成物は、シリンジ（本発明の「予備充填された」シリンジ）中に包装される。次に、１つの実施形態において、本発明の組成物を含む予備充填されたシリンジは、凍結され得る。この凍結された予備充填されたシリンジは、貯蔵または輸送の目的のために有用である。
【００４０】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【００４１】
（実験）
（実施例１：安定性が増大したＩＦＮ−β薬学的処方物の開発）
Ｉ．序論
賦形剤としてデキストロースを含むＩＦＮ−β薬学的処方物は当該分野において知られている。そのような処方物が３７℃以上の温度でインキュベートされるとき、これらの処方物におけるデキストロースは、ＩＦＮ−βとともに共有結合付加物を形成し、これは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）によって検出され得る。ＵＳＰマンニトールで処方されるＩＦＮ−βは、同じ条件下でＲＰ−ＨＰＬＣ検出可能な共有結合付加物を形成しない。しかし、ＵＳＰマンニトールは、ＩＦＮ−βと合わせて、エレクトロスプレー質量分析によって検出される付加物種を形成する不純物を含む。ＵＳＰマンニトール中の不純物の性質は、知られていない。これらの付加物（または分解産物）の形成は、薬学的に所望されないと考えられており、薬学的に受容可能ではないとまで考えられている。ポリペプチドベースの医薬についての現在のガイドラインは、処方物における分解産物の形成を最小限にすることの重要性を強調しているからである。分解産物は、所望されないかまたは受容可能ではないと考えられている。なぜなら、それらは、そのペプチドベースの医薬が所望されない副作用を生じる機会を増大するからである。本発明の新規な知見は、ＩＦＮ−βがそれが高度に精製されたマンニトールと処方されるとき、安定性の増大を示し、その結果、その還元活性は、高度に精製されていないマンニトールで処方されるときと比べて、２０ｐｐｍ未満であることである。本発明のさらなる新規な知見は、メタノールでの抽出、炭素処理、限外濾過および再結晶化によるＵＳＰマンニトールの精製が、２０ｐｐｍ未満の還元活性を伴うマンニトール調製物を生じることである。
【００４２】
ＩＩ．方法
これらの実験において使用するためのＩＦＮ−β−１ｂを、本質的に米国特許第４，４６２，９４０号および同第５，７０２，６９９号（これらは、参考として援用される）において記載されるようにＥ．ｃｏｌｉにおいて生成した。ドデシル硫酸ナトリウムおよび塩をＩＦＮ−βからクロマトグラフィーにより除き；そしてＩＦＮ−β−１ｂを、ヒトアルブミンの溶液とｐＨ１１．５〜１２．０で合わせた。溶液のｐＨを、ＨＣｌで７．５に調整した。そして賦形剤（（マンニトールまたはデキストロース）を含む溶液を加えて最終濃度を１．２５％にした。その処方物におけるヒトアルブミンの最終濃度は、１．２５％ｗ／ｖであった。
【００４３】
これらの処方物からのＩＦＮ−β−１ｂを、ＲＰ−ＨＰＬＣによる質量分析のために調製した。この方法によって、クロマトグラムにおける分離したピーク（Ｂ１）として分離された後、グルコシル化したＩＦＮ−β−１ｂの定量が可能となる。この方法でのグルコシル化されたＩＦＮ−β−１ｂについての検出限界は、０．０２ｍｇ／ｍｌである。このピークの量が０．０２ｍｇ／ｍｌ未満の場合、２つのピーク面積が合算され、そして処方されていないＩＦＮ−β参照と比較されて、ＩＦＮ−β−１ｂの合計含量を得る。このピーク面積が０．０２ｍｇ／ｍｌを超える場合、その濃度は、独立に決定されそして報告される。
【００４４】
以下の装置およびそのそれぞれの製造業者の指示マニュアルを分析に使用した。
【００４５】
溶媒送達系：Ｗａｔｅｒｓ ６２６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｐｕｍｐ
注射系：Ｗａｔｅｒｓ ７１７およびＡｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ ２００ ｍｌ注射ループ
ポリプロピレンオートサンプラーバイアル（Ｔｅｆｌｏｎ ｓｅｐｔａ付）
オートサンプラー温度制御を４℃に設定して冷蔵
８４％アセトニトリルを針洗浄として使用する。
【００４６】
カラムヒーター：Ｗａｔｅｒｓ ６００
カラムヒーターを４０℃に設定
カラム：ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ Ｂｕｔｙｌ Ｃ４ ＲＰ−Ｃｏｌｕｍｎ，３００Å ５μｍ，４．６ ｍｍ（ＩＤ）２５０ ｍｍ，Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ ２２０１０。
【００４７】
カラムを、カラム標識において指示されるように溶媒流の方向に接続し、そしてカラムヒーターに配置した。
【００４８】
検出器：Ｗａｔｅｒｓ ４８６ ＵＶ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ。
【００４９】
波長を２１４ｎｍに設定する。
【００５０】
データシステム入力を減衰させない。
【００５１】
データシステム：Ｐ．Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ
凍結乾燥させたＩＦＮ−β処方物サンプルを、１．２０ｍｌの０．５４％塩化ナトリウムで再構成し、緩やかに反転させて混合し、そして雰囲気温度で３０±５分間インキュベートした。キャリブレータは、処方されていないＩＦＮ−β参照である。キャリブレータストック溶液は、約０．５ｍｇ／ｍｌにまで希釈され、そして希釈されたキャリブレータ溶液の濃度は、ＵＶ吸収によって決定される（６連の平均）。希釈されたキャリブレータ溶液の最終濃度は、ＵＶ吸収の読み取りの平均を１．７（ＩＦＮ−β−１ｂ吸光係数）で割ったものである。希釈されたキャリブレータ溶液濃度は、３つの顕著な形態に対する吸収によって決定される。次いで、キャリブレータ溶液を、作業用キャリブレータ溶液として使用するために０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【００５２】
オートサンプラーを、１回の注射あたり２０μｌで７０分の間隔で注射するようにプログラムした。このデータシステム電圧範囲は１ボルトであり、サンプリング速度は、１秒あたり１点であり、そして獲得時間は７０分であった。溶離液Ａは０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、ＨＰＬＣ等級）であり、そして溶離液Ｂは８４％アセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）および０．０８４％ ＴＦＡ（ＨＰＬＣ等級）であった。溶出流速を１．０ｍｌ／分（７０％溶離液Ａおよび３０％溶離液Ｂ）に設定し、そしてカラムを１時間平衡化した。検出器の基底線およびシステムを平衡化した後、勾配ブランクを分析した。分析を、第二の勾配ブランクにおいて顕著なピークが存在しないときにはじめた。
【００５３】
ＩＦＮ−β濃度を、改変されていないＩＦＮ−β（「Ｂ」ピーク）およびグルコシル化されたＩＦＮ−β（「Ｂ１」ピーク）に対応するピークの面積の合計から決定する。例えば、キャリブレータ溶液が０．２５ｍｇ／ｍｌの処方されていないＩＦＮ−βである場合、ＩＦＮ−β濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝（試験サンプル合計ピーク面積Ｂ１＋Ｂ／キャリブレータ合計ピーク面積Ｂ１＋Ｂ）×０．２５ｍｇ／ｍｌである。
【００５４】
エレクトロスプレイ質量スペクトル（ＥＳ−ＭＳ）データを、このクロマトグラフィーからの画分を用いて得た。分析の前におのおののピークの画分を収集し、そして濃縮した。エレクトロスプレイ質量スペクトルを、Ｈａｒｖａｒｄ シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）およびＲｈｅｏｄｙｎｅ ８１２５インジェクタ（１００μＭ内径の溶融シリカチューブ付）を装着した、ＡＰＩ １００単一四重極質量スペクトロメータ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて得た。質量スペクトルを、０．２Ｄａの工程サイズを用いて６秒／走査で、１４０〜２５００の範囲の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を走査することによって正モードで記録した。質量スペクトロメータを、２ｍＭ酢酸アンモニウムを含む５０：５０：０．１の水：メタノール：蟻酸（ｖ：ｖ：ｖ）中に３．３×１０−５Ｍ ＰＰＧ４２５、１×１０−４Ｍ ＰＰＧ１０００および２×１０−４Ｍ ＰＰＧ２０００（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含むポリプロピレングリコール混合物を用いて較正した。タンパク質溶液（２μＬ中に２０〜５０ｐＭ）のアリコートを、４９：４０：１の水：アセトニトリル：酢酸中の質量スペクトロメータイオン供給源中に２０μＬ／分で導入した。タンパク質は、低いｐＨでイオン供給源中に導入されることから、塩基性部位（例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンの残基の側鎖における窒素原子）は、種々の程度でプロトン化されて、プロトン化についてアクセス可能な部位の数に依存して、多数の荷電状態を有する分子イオン（例えば、［Ｍ＋Ｈ］＋，［Ｍ＋２Ｈ］２＋）を生じる。検出器は、種々の荷電状態における分子イオンのｍ／ｚ比を記録し、そして質量スペクトルは、Ｂｉｏｔｏｏｌｂｏｘソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデコンボリューションをして、タンパク質の分子量を得ることができる。２０ｋＤａでの分子量測定の質量精度は、２ｋＤａ以内であった。
【００５５】
マンニトールの還元活性を、ＵＳＰプロトコルの改変によって決定した。このプロトコルは、ビシンコニン酸（ＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ、製造業者の指示に従って調製した）の存在下でのアルカリ溶液におけるＣｕ２＋の減少を測定する。ＢＣＡはＣｕ１＋と錯体を形成し、そしてこの錯体は、５６２ｎｍでのピーク吸収（Ａ）を伴う青色を有する。
【００５６】
２つのマンニトールサンプル（５００μｌの１５０ｍｇ／ｍｌマンニトール溶液）を、各々の条件についてアッセイした。標準曲線を、既知の還元活性を用いて、グルコース溶液の連続希釈を用いて作成した。５００μｌの調製されたＢＣＡ溶液を、各々の試験サンプル、標準サンプルおよびブランクに加え、そして６０℃で４０分間インキュベートした。グルコース標準を、線形曲線に適合させ、そしてマンニトール試験サンプルの還元活性（ｐｐｍ）を、（（マンニトールサンプルのＡ５６２／標準曲線の勾配）／（マンニトール含量ｍｇ／ｍｌ（１０００））×１０６）として計算した。
【００５７】
ＩＩＩ．結果および考察
グルコシル化を、ＩＦＮ−β−１ｂの分子量に加えられた１６２ダルトンの乗数として質量分析を用いて、デキストロース処方物において検出した。ＩＦＮ−β−１ｂペプチドの分析によって、これらの付加物がタンパク質のリジン残基と還元糖との反応（アマドリ反応）から生じることが示唆された。図１は、デキストロース処方物の処方されたバルクのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを、５０℃で１週間貯蔵した凍結乾燥処方物に対して比較する。この図は、デキストロース処方物中のＩＦＮ−β−１ｂが５０℃で容易に反応して凍結乾燥状態におけるＢ１ピークを生成することを示す。処方されたバルクのＥＳ−ＭＳ（図２）は、グルコース付加物（プラス１６２）に関連するピークを有しない。対照的に、インキュベートされた凍結乾燥デキストロース処方物の質量スペクトル（図３）は、広汎な改変を示す。従って、グルコースは、ＩＦＮ−β−１ｂと反応して、ＥＳ−ＭＳによってその全体構造が確認される、ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出される種を形成する。
【００５８】
対照的に、ＵＳＰマンニトールを用いて作製されたＩＦＮ−β−１ｂ処方物は、ＲＰ−ＨＰＬＣによってピークＢ１として検出可能である種を形成しない。図４は、５０℃で７日にわたって保持される凍結乾燥処方物に対して、マンニトール処方されたバルクを比較する。明らかにピークＢ１は形成されていない。しかし、図５において処方されたバルクの質量スペクトルは、２００４０におけるピークの存在を示し、そして図６におけるインキュベートされた凍結乾燥マンニトール処方物の質量スペクトルは、２０２０１に新たなピークを有する。マンニトールと形成された付加物の量は、ＥＳ−ＭＳによって定量され得ない。しかし、この付加物のシグナルは、装置の検出限界付近にしばしばある。これらのピークの形成の機構は知られていない。ＩＦＮ−β−１ｂとマンニトールとの反応では、デキストロースと形成された種またはグルコースを用いて形成された種のような種を形成せず、ピークＢ１は形成されない。従って、このデータは、ＩＦＮ−β−１ｂ付加物の形成を妨害するのに、より純粋な形態のマンニトールが必要とされることを示す。
【００５９】
次いで、不純物を減少させるようにメタノール抽出されたマンニトールを、ＩＦＮ−β−１ｂの安定性に対するその効果について試験した。ＩＦＮ−β−１ｂを、メタノール抽出したマンニトールの３つの異なるロットを用いて処方し、そして処方されたバルクおよび最終容器の試験サンプルを、上述のＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳ−ＭＳアッセイを用いてアッセイした。図７は、未処理のマンニトールを用いて処方したＩＦＮ−β−１ｂの質量スペクトルを示し、そして図８は、メタノールを用いて精製された、同じロットのマンニトールを用いて処方されたＩＦＮ−β−１ｂの質量スペクトルを示す。３つすべてのロットのマンニトールが類似のパターンを示した。図１７は、還元活性の半分より多くがメタノール処理によって除去されることを示す。明らかに、メタノール処理は、ＩＦＮ−β−１ｂと複合体を形成する不純物を除去するが、いくらかは、この処理によって完全には除去されないかもしれない。
【００６０】
マンニトールにおける残りの不純物を減少させるために、３つのさらなる工程を、精製プロセスに加えた。これらのさらなる工程は炭素処理、限外濾過および再結晶である。メタノール抽出、炭素抽出、限外濾過および再結晶マンニトールの３つのロットを上記のように試験した。呈色還元活性アッセイは、還元活性含量をさらなる精製工程が約１０ｐｐｍまで低下させることを実証した（図１７を参照のこと、サンプル７〜９）。処方物を、高度に精製されたマンニトールを用いて調製した。高度に精製されたマンニトールを用いて調製され、そしてネガティブコントロールとして同じ日に実行した処方物の質量スペクトル（図９）は、マンニトールなしに調製された処方されたバルク（図１０）において存在しないさらなるピークは示さなかった。ＵＳＰマンニトールを用いて調製された処方物の質量スペクトル（図１１）もまた、ポジティブコントロールとして同じ日に実行した。従って、マンニトールの更なる処理は、還元活性が低く、そしてＥＳ−ＭＳではＩＦＮ−β−１ｂと反応しないようである産物を生じる。
【００６１】
（実施例２：高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物の安定性：短期加速研究）
Ｉ．導入
ＩＦＮ−β−１ｂの実験的処方物を、上述のようにデキストロールおよびマンニトールを用いて調製し、そして加速安定性研究を行って、これらの処方物を比較した。処方物の安定性を、２つの異なる条件下で試験した。第一のものは高温ストレスに対してその処方物を供するためのものであり、そして第二のものは室温での長期貯蔵における安定性を測定するためのものであった。高度に精製されたマンニトールを含む処方物において、２５℃で３ヶ月間後に変化は見られず、そしてその処方物の効力は、３７℃で３ヶ月の貯蔵または５０℃で１ヶ月の貯蔵の後も本質的に変化しないままであった。
【００６２】
ＩＩ．方法
各処方物のサンプルを８℃、２５℃、または３７℃で３ヶ月貯蔵した。さらに、２ヶ月の時点で、各温度からサンプルを採り、そしてさらに１ヶ月間５０℃で貯蔵した。５０℃シフトの目的は、貯蔵の最初の二ヶ月において発生し得た可能な変化を悪化させるためのものであり、従って２５℃または３７℃に２ヶ月配置することによって、８℃というもとの貯蔵温度に返還するときにその産物がより迅速に分解するようになるかどうかをより良好に決定することを可能にする。
【００６３】
ＩＦＮ−β−１ｂの特異的活性を以下のようにアッセイした。Ａ５４９ヒト肺がん細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８５）およびマウス脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ株（ＡＴＣＣ ＶＲ−１２９Ｂ））は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。処方物サンプルを、１．２ｍｌ希釈液（０．５４％ ＮａＣｌ）で再構成し、増殖／アッセイ培地で連続希釈し、そして９６ウェルアッセイプレートに、ＩＦＮ−β−１ｂ標準とともに加えた。各々のウェルにおいて希釈されたＩＦＮ−βの容量は、１００μｌであった。増殖／アッセイ培地（Ｅａｒｌｅ塩および２．２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、８．９％仔ウシ血清、１．７９ｍＭＬ−グルタミン、８９Ｕ／ｍｌペニシリン、および８９μｇストレプトマイシン／ｍｌを伴うＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ）中のＡ５４９細胞に１×１０４細胞／ウェルの濃度で加えた。次いで、このプレートを加湿した３７℃±２℃、５±１％ ＣＯ２のインキュベーター中でインキュベートした。このインキュベーションの終わりに、細胞を、５と１６との間の感染多重度でＥＭＣウイルスに感染させた。次いで、このプレートを、２４±１時間にわたって加湿した３７±２℃、５±１％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。この細胞を、予備加熱した（３７℃）ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾリル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、５ｍｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）を用いて染色し、そして以前と同じように３．５時間〜４．５時間インキュベートした。この培地を、細胞から吸引し、そして１００μｌの染色可溶化溶液（８１％ｖ／ｖ２−プロパノール、３％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム、０．０４Ｎ ＨＣｌ）を、各ウェルに加えた。次いで、プレートを３０〜６０分間雰囲気温度にて暗所にてインキュベートした。次いで、プレートを、８±３分間マイクロプレートシェーカーにて振盪した。最後に、各ウェルの５７０ｎｍでの吸光度をマイクロプレート分光光度計で測定した。ＩＦＮ−β活性標準の活性を、線形回帰曲線に適合させ、そしてその試験サンプルの活性をこの曲線から決定した。各サンプルの特異的活性を、使用したサンプルの質量に基づいて計算した。
【００６４】
ＩＦＮ−β−１ｂ濃度のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を上記のように行った。添加物処方物もまた、ＩＦＮ−β−１ｂバンドの分子量における見かけ上の増大として還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットにおけるモニターした。
【００６５】
ＩＩＩ．結果および考察
マンニトール処方物の効力（特異的活性）は、この研究の間本質的に変化ないまま保持された。他方、デキストロース処方物の効力は増大した。３７℃の温度への１ヶ月の暴露は、効力に対して影響がなかった（図１４および１５を参照のこと）。マンニトールＩＦＮ−β−１ｂ処方物について、グリコシル化ＩＦＮ−β−１ｂの量は、この研究の間にわたって、５０℃でさえ、検出限界未満のままであった。対照的に、グリコシル化は、３７℃で２ヶ月および５０℃で２週間後にデキストロース処方物において検出されたが２５℃で３ヶ月の貯蔵の後には検出されなかった。広汎なグリコシル化によって、合計のＩＦＮ−β−１ｂの含量を測定するにはクロマトグラムが多すぎるように改変された。このデキストロース処方物における付加物の形成もまた、３７℃で２ヶ月の貯蔵または５０℃で１ヶ月の貯蔵の後に、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットにおいて検出された。対照的に、どの貯蔵条件でもマンニトール処方物については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットにおいて変化が観察されなかった。
【００６６】
（実施例３：高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物の長期安定性）
高度に精製されたマンニトールを含む３つのロット（Ｎ００６、Ｎ００５およびＮ００９）のＩＦＮ−β−１ｂ処方物を、４℃、２５℃または３０℃において貯蔵し、そしてその安定性を、１年間にわたって３ヶ月の間隔で、およびさらに１年間６ヶ月の間隔でアッセイした。安定性は、上記の方法によってアッセイした。
【００６７】
すべての３つのロットは、４℃および３０℃において、２４ヶ月を通じて効力を保持していた。データは、図１６〜１８に提示される。さらに、すべての３つのロットが、すべての温度およ時点において、ピークＢ１（グルコシル化されたＩＦＮ−β種）が０．０２ｍｇ／ｍｌを超えないことを実証した。
【００６８】
当業者は、単なる慣用される実験を用いて、ＩＦＮ−βについて本明細書において記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識し、または確認することができる。さらに、当業者は、慣用的な実験を超えないものを用いて、例としてＩＦＮ−βを用いて提供される上記実験および処方物がタンパク質一般（もっとも特定すれば、薬学的タンパク質）に適用可能であることを認識し、または確認することができる薬学的タンパク質としては、以下のタンパク質を含むがそれらに限定されない：ヒト成長ホルモン、すべてのインターフェロン、すべてのインターロイキン、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）、βグルコセレブロシダーゼ、チロトロピン、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、モノクローナル抗体（例えば、ａｂｃｉｘｉｍａｂ，ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ，ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ，ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，およびｔｒａｎｓｔｕｚｕｍａｂ）、血液因子（例えば、第ＶＩＩａ因子および第ＶＩＩＩ因子）、酵素（例えば、ウロキナーゼ、アスパルギナーゼ、アニストレプラーゼ、およびアルテプラーゼ）。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されるべきであることが意図される。
【００６９】
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連する分野の当業者のレベルの指標である。すべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願があたかも具体的かつ個々に、参考として援用されるべきと言及されたかのように、同程度に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、１週間にわたって５０℃にてインキュベートされたデキストロース処方されたＩＦＮ−βバルクおよび凍結乾燥された粉末についてのＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムの比較を示す。処方物におけるグルコース化されたＩＦＮ−β付加物の、５０℃に保持される処方物は、（およそ画分４８における）第二のピーク（Ｂ１）の外見として見られ、その後、（およそ画分４９〜５０における）メインのＩＦＮ−βピークが続く。実施例１を参照のこと。
【図２】図２は、バルクのデキストロース処方されたＩＦＮ−βについての質量スペクトルを示す。いくつかの小さなピークが、１９８７８アム（原子質量単位）においてメインのＩＦＮ−βピークに加えて検出可能であった。実施例１を参照のこと。
【図３】図３は、バルク組成物から凍結乾燥され、そして５０℃で１週間格納された、デキストロース処方されたＩＦＮ−βのサンプルについての質量スペクトルを示す。図２とは対照的に、主なピークは、ＩＦＮ−β付加物に対応する。実施例１を参照のこと。
【図４】図４は、５０℃で１週間インキュベートされた、ＵＳＰマンニトール処方されたＩＦＮ−βバルクおよび凍結乾燥粉末についての、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの比較を示す。処方物において５０℃に保持された、グルコシル化されたＩＦＮ−β付加物の処方物（Ｂ１ピークの外見）は、見出されない。実施例１を参照のこと。
【図５】図５は、ＵＳＰマンニトール処方されたＩＦＮ−βバルクの質量スペクトルを示す。ＩＦＮ−βは、１９８８０アムにおけるピークとして検出される。実施例１を参照のこと。
【図６】図６は、凍結乾燥し、そして５０℃で１週間でインキュベートされた、ＵＳＰマンニトール処方されるＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。さらなるピーク（付加物を示す）の形成がスペクトル中に見出され得る。実施例１を参照のこと。
【図７】図７は、精製されていないマンニトール処方されるＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。多数の付加ピーク（付加物を示す）の形成がこのスペクトルにおいて見出され得る。実施例１を参照のこと。
【図８】図８は、図７において使用されるのと同じロットからのメタノール抽出したマンニトールを用いて処方されたＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。付加物ピークの大きさおよび数は、実質的に減少した。実施例１を参照のこと。
【図９】図９は、高度に精製された（メタノール抽出、炭素処理、限外濾過、および再結晶化）マンニトールを含むＩＦＮ−β処方物の質量スペクトルを示す。３つの小さなピークのみが、改変されていないＩＦＮ−βを示す主なピークに加えて見られる。実施例１を参照のこと。
【図１０】図１０は、マンニトールの不在下で処方されるＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。このスペクトルから、図９に存在する主な二次ピークは、高度に精製されたマンニトールと相互作用することによって形成されないことが、これらがまた賦形剤の不在下で現れるのと同様に見出され得る。実施例１を参照のこと。
【図１１】図１１は、上記図９と同じ日に実施した、ＵＳＰマンニトールで処方されるＩＦＮ−βの質量スペクトルを示す。このスペクトルは、ＵＳＰマンニトールで処方されるＩＦＮ−βがさらなるピーク（付加物）を形成することを確認する。このピークは、高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物においては存在しない。実施例１を参照のこと。
【図１２】図１２は、実施例２に記載されるようなＩＦＮ−βデキストロース処方物についての安定性評価データを示す。
【図１３】図１３は、実施例２に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物についての安定性評価データを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００６についての安定性評価データを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００６についての安定性評価データを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００８についての安定性評価データを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００８についての安定性評価データを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００９についての安定性評価データを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、実施例３に記載されるような高度に精製されたマンニトールを含むＩＦＮ−β処方物のロット００９についての安定性評価データを示す。
【図１７】図１７は、還元活性が種々のマンニトールサンプルに存在することを示す。サンプル１−３は、メタノール抽出も、炭素濾過も、限外濾過もされていないＵＳＰマンニトールである。サンプル４−６は、メタノール抽出されたＵＳＰマンニトールである。そしてサンプル７−９は、メタノール抽出され、炭素処理され、限外濾過され、そして再結晶化されたマンニトールである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載されるインターフェロン組成物。
【請求項１】
本明細書に記載されるインターフェロン組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−６９１７１（Ｐ２００８−６９１７１Ａ）
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７８２３１（Ｐ２００７−２７８２３１）
【出願日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【分割の表示】特願２００２−５４０７５２（Ｐ２００２−５４０７５２）の分割
【原出願日】平成１３年１１月７日（２００１．１１．７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【分割の表示】特願２００２−５４０７５２（Ｐ２００２−５４０７５２）の分割
【原出願日】平成１３年１１月７日（２００１．１１．７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
【出願人】（５９１０７６８１１）カイロン コーポレイション (265)
【Ｆターム（参考）】
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