配列の中に完全な改変ヌクレオチド三リン酸が組み込まれているアプタマー治療薬を生産するための材料と方法が提供される。より詳細には、本発明は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに関する。これを、精製すること、単離すること、そして／または組み換えることができる。１つの実施形態においては、６３９位と７８４位とに改変アミノ酸を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ここでは、７８４位の改変アミノ酸がアラニンである場合には、６３９の改変アミノ酸はフェニルアラニンではない）が提供される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本仮特許出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、次の仮特許出願：２００５年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／６９６，２９２号の優先権を主張し、その全体は本明細書中に参考として援用される。本発明は一般に、核酸の分野、より詳細にはアプタマーに関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、核酸（具体的には、修飾された酵素）を転写するための材料と方法、および修飾されたヌクレオチドの核酸（具体的には、アプタマー）への取り込みを増大させるための鋳型特異的重合において修飾された酵素を使用するための材料と方法に関する。加えて、本発明は、転写鋳型成分配列を選択するための方法と材料、転写物量を増大させるための（具体的には、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法の際の転写物量を増大させるための）そのような成分配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
定義によると、アプタマーは、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対合以外の相互作用によってタンパク質のようないくつかの標的に対して高い特異性および親和性で結合する、単離された核酸分子である。アプタマーは核酸をベースとする分子であるが、アプタマーと他の核酸分子（例えば、遺伝子およびｍＲＮＡ）の間には根本的に違いがある。後者においては、核酸構造は、その直鎖状の塩基配列を通じて情報をコードしており、したがって、この配列は、情報の保存機能に重要な配列である。全く対照的に、アプタマーの機能は、標的分子の特異的結合に基づき、これは、保存された直鎖状の塩基配列に依存するのではなく、むしろ、特定の二次構造／三次構造に依存する。すなわち、アプタマーは非コード配列である。アプタマーが有する場合がある何らかをコードする可能性は完全に偶然のものであり、そしてどんな形であっても、その同種の標的に対するアプタマーの結合において役割を担うことはない。したがって、同じ標的に対して、さらにその標的上の同じ部位に対して結合するアプタマーは、類似する直鎖状の塩基配列を共有する場合があるが、ほとんどの場合はそうではない。
【０００４】
アプタマーはまた、特定のタンパク質に結合する自然界に存在している核酸配列とは異なっていなければならない。これらの後者の配列は、自然界に存在している核酸の転写、翻訳、および輸送に関係しているタンパク質の特定のサブグループ（すなわち、核酸結合タンパク質）に結合する生物体のゲノムの中に埋め込まれている自然界に存在している配列である。一方、アプタマーは、短い、単離された、自然界には存在しない核酸分子である。核酸結合タンパク質に結合するアプタマーを同定することができるが、ほとんどの場合は、そのようなアプタマーは、自然界において核酸結合タンパク質によって認識される配列に対しては、配列同一性をほとんど有していないか、または全く同一性はない。最も重要なことは、アプタマーは、（単に核酸結合タンパク質だけではなく）実質的に全てのタンパク質に結合することができ、さらには、目的の任意の標的（低分子、炭水化物、ペプチドなどを含む）のほとんどにも結合することができる。ほとんどの標的について、さらにはタンパク質についても、それに結合する自然界に存在している核酸配列は存在しない。そのような配列を有するこれらの標的（すなわち、核酸結合タンパク質）については、そのような配列は、堅く結合しているアプタマーと比較して、実際に使用される比較的低い結合親和性の結果として、アプタマーとは異なるであろう。
【０００５】
アプタマーは、ファージディスプレイによって作成されるペプチドまたは抗体と同様に、選択された標的に特異的に結合すること、および標的の活性または結合相互作用を調節することができる。これは、例えば、アプタマーの結合によってそれらの標的の機能する能力をブロックすることができることによる。抗体と同様に、標的に対する特異的結合のこの機能的特性は固有の性質である。また、抗体と同様に、当業者は、標的に対するアプタマーに特徴的などの正確な構造を有するかを知ることはできない場合があるが、当業者は、正確な構造の定義が存在しない条件下でそのような分子を同定し、作成し、そして使用するための方法を知っている。
【０００６】
アプタマーはまた、小さい分子治療薬のアナログでもあり、その中の１つの構造変化（しかし、一見、重要ではない）が、アプタマーの結合および／または他の活性（単数または複数）に劇的な効果（数桁）を及ぼす場合がある。一方、いくつかの構造変化は、どのような形でもほとんど、または全く効果がない場合もある。これは、アプタマーの二次構造／三時構造の重要性によって生じる。言い換えると、アプタマーは、その任意の標的に特異的に結合する化学的な接触を提供する、固定された立体構造で維持されている三次元構造である。結果として：（１）いくつかの領域または特定の配列は、（ａ）標的との接触の特異的な点として、および／または（ｂ）標的と接触する分子の位置である配列として、不可欠であり；（２）いくつかの領域または特定の配列は一定の範囲の可変性を有しており、例えば、ヌクレオチドＸはピリミジンでなければならないか、またはヌクレオチドＹはプリンでなければならないか、または、ヌクレオチドＸとＹは相補的でなければならず；そして（３）いくつかの領域または特定の配列はいずれのものであってもよく、すなわち、これらは、原則的には、スペースエレメントであり、例えば、これらは、任意の長さのヌクレオチドの任意の並び、またはさらには、ＰＥＧ分子のようなヌクレオチド以外のスペーサーでもあり得る。
【０００７】
ランダムな配列のオリゴヌクレオチドのプールからインビトロでの選択プロセスによって発見された、成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、および受容体を含む１３０個を超えるタンパク質についてアプタマーが作成されている。典型的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａの大きさ（２０〜４５ヌクレオチド）であり、これは、ナノモルからナノモル未満の親和性でその標的に結合し、そして密接に関係している標的を区別する（例えば、アプタマーは、通常は、同じ遺伝子ファミリーに由来する他のタンパク質には結合しないであろう）。一連の構造実験は、アプタマーが同じタイプの結合相互作用（例えば、水素結合、静電気的相補性、疎水的接触、立体排除）を使用することができ、これにより、抗体−抗原複合体における親和性および特異性が駆動されることを示している。
【０００８】
アプタマーは、治療薬および診断薬としての使用のための多数の所望される特性（高い特異性および親和性、生物学的効力、ならびに優れた薬物動態特性を含む）を有する。加えて、これらは、抗体および他のタンパク質生物製剤を上回る、例えば、以下のような特異的な競合する利点を付与する：
１）速度および制御。アプタマーは、完全なるインビトロでのプロセスによって生産することができ、それにより、最初のリード化合物（ｌｅａｄ）（治療薬のリード化合物を含む）の迅速な作成が可能になる。インビトロでの選択により、アプタマーの特異性および親和性をきっちりと制御することができ、そして、リード化合物（毒素標的および非免疫原性標的の両方に対するリード化合物を含む）の作成が可能となる。
【０００９】
２）毒性および免疫原性。１つのクラスとしてのアプタマーは、治療上許容される毒性、または免疫原性が無いことが明らかにされている。多くのモノクローナル抗体の効力は、抗体自体に対する免疫応答によって厳密に制限され得るが、アプタマーに対する抗体を誘発することは極めて困難である。その理由は、ほぼおそらく、アプタマーがＭＨＣを介してＴ細胞によっては提示され得ないこと、および免疫応答が通常は、核酸断片を認識することに慣れていないことである。
【００１０】
３）投与。ほとんどの現在承認されている抗体療法は静脈内への注入（通常は、２〜４時間）によって投与されるが、アプタマーは、皮下注射によって投与することができる（皮下投与によるアプタマーの生体利用性は、サルでの実験においては＞８０％である（非特許文献１）。この差は、主に、比較的低い溶解度、したがって、ほとんどの治療用ｍＡｂについて必要な大きい容量が原因である。良好な可溶性（＞１５０ｍｇ／ｍＬ）と比較的低い分子量（アプタマー：１０〜１５ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）を有するアプタマーの１週間の用量は、０．５ｍＬ未満の容量で注射によって投与することができる。加えて、小さいサイズのアプタマーは、抗体または抗体断片が入ることができない立体構造上の狭窄の領域に入り込むことができて、アプタマーに基づく治療薬または予防薬のなおさらに別の利点を示す。
【００１１】
４）拡張性およびコスト。治療用のアプタマーは化学合成され、結果として、生産の要望を満たすために必要に応じて容易に拡張縮小する（ｓｃａｌｅｄ）ことができる。生産の拡張縮小における問題点は、現在、いくつかの生物製剤の有用性を制限しており、そして大規模なタンパク質の生産用プラントの資本コストは膨大であるが、１つの大規模なオリゴヌクレオチド合成装置によっては、１００ｋｇ／年、生産を上昇させることができ、比較的少ない初期投資しか必要ではない。キログラム規模でのアプタマーの合成のための物品についての現在のコストは、＄５００／ｇと概算され、高度に最適化された抗体のコストに匹敵する。プロセスの開発において改善を続けることにより、物品のコストは、５年間で、＜＄１００／ｇに下げられると予想される。
【００１２】
５）安定性。治療用のアプタマーは化学的に頑丈である。これらは、本質的に、熱および変性剤のような要因に曝された後に活性を回復するように適応しており、そして、凍結乾燥させられた粉末として、室温で長時間（＞１年）保存することができる。対照的に、抗体は、冷蔵して保存しなければならない。
【００１３】
アプタマーの本来の安定性に加えて、修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−修飾されたヌクレオチド）（これは、安価であり、毒性はなく、そして酵素的、化学的、熱的、および物理的分解に対する抵抗性を高めることができる）を、２００２年１２月３日に提出された米国特許出願第１０／７２９，８５１号、および２００４年６月２１に提出された米国特許出願第１０／８７３，８５６号に記載されているような、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法の間に取り込ませることができる。ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスの間に修飾されたヌクレオチドを取り込ませることは、多くの場合に、ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択の後に起こり得る結合親和性および活性の消失の可能性があるので、ＳＥＬＥＸ（登録商標）後の修飾に好ましいが、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスの間の修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（「２−ＯＭｅ」）の取り込みは、少ない転写物量の理由から、歴史的に困難である。溶液の条件および転写混合物は、２００２年１２月３日に提出された米国特許出願第１０／７２９，８５１号、および２００４年６月２１に提出された米国特許出願第１０／８７３，８５６号に記載されている。これらによっては、２’−ＯＭｅヌクレオチドが取り込まれているアプタマーについて、改善された転写物量が得られている。しかし、完全に２’−Ｏ−メチル化されたアプタマーについての転写物量は依然として解決できていない。
【００１４】
治療薬としてのアプタマーの利点に加えて、安価な性質、低い毒性、そしてアプタマーの中への２’−ＯＭｅヌクレオチドの取り込みにより付与された高いヌクレアーゼ耐性を前提とすると、例えば、インビボでのアプタマー治療薬の安定性を長くするまたは増大させるために、完全に２’−Ｏ−メチル化されたアプタマーの転写物量を増大させるための材料および方法を得ることが有効であろう。本発明により、これらと他の要件を満たす改良された材料と方法が提供される。
【非特許文献１】Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．（１９９９）７３２：２０３−２１２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに関する。これは、精製することができ、単離することができ、そして／また、組み換え体でもあり得る。本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」には、細胞または組織の中で組み換えによって発現させられた、本発明のポリメラーゼを含む。本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」には、細胞または組織の中に入るように操作された本発明の核酸配列を含む。１つの実施形態においては、６３９位と７８４位とに改変アミノ酸を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ここでは、７８４位の改変アミノ酸がアラニンである場合には、６３９の改変アミノ酸はフェニルアラニンではない）が提供される。別の実施形態においては、３７８位に改変アミノ酸がさらに含まれている上記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが提供される。別の実施形態においては、２６６位に改変アミノ酸がさらに含まれている上記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが提供される。特定の実施形態においては、６３９位の改変アミノ酸はロイシンであり、７８４位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、２６６位の改変アミノ酸はロイシンである。さらなる実施形態においては、３７８位の改変アミノ酸はアルギニンである。
【００１６】
好ましい実施形態においては、改変アミノ酸は、２’−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸のみを含む転写反応においては、ポリメラーゼによる、２’−ＯＭｅ修飾を含む核酸の転写量を増大させる。特定の実施形態においては、転写量の増大は、転写が、アミノ酸が変化させられたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと改変アミノ酸を欠くＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの両方について同じ転写条件下で行われた場合の、改変アミノ酸を欠くＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する比較である。別の実施形態においては、改変アミノ酸は、２’−Ｏｍｅヌクレオチド三リン酸に対する識別を低下させる。特定の実施形態においては、２’−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸の識別の低下は、両方のポリメラーゼが同じ転写条件下で使用された場合の、改変アミノ酸を欠くＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する比較である。この態様の特定の実施形態においては、改変アミノ酸を欠くＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位のアミノ酸がフェニルアラニンに変化させられており、そして、７８４位のアミノ酸がアラニンに変更されている野生型のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、または、６３９位でチロシンがフェニルアラニンで置換されており、そして７８４位のヒスチジンがアラニンで置換されており、そして３７８位のリジン残基がアルギニン残基で置換されていることを除いて野生型のアミノ酸配列を有する変異体ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）である。
【００１７】
特定の実施形態においては、配列番号１、配列番号２、配列番号１０２、および配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドが提供される。特定の実施形態においては、本発明のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む容器を含むキットが提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態においては、一本鎖の核酸を転写する方法が提供され、これには、変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを鋳型核酸とともに、転写を生じるために十分な反応条件下でインキュベートする工程を含む。
【００１９】
別の実施形態においては、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。特定の実施形態においては、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、および、配列番号１２５からなる群より選択される核酸配列が提供される。いくつかの実施形態においては、本発明の単離された核酸配列を含むベクターが提供される。特定の実施形態においては、プロモーターに動作可能であるように連結された本発明の核酸を含む発現ベクターが提供される。本発明の別の実施形態においては、本発明の発現ベクターを含む細胞が提供される。特定の実施形態においては、本発明の変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼがその細胞によって発現される細胞が提供される。いくつかの実施形態においては、本発明のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含む容器を含むキットが提供される。
【００２０】
別の実施形態においては、完全な２’−ＯＭｅ核酸を転写する方法が提供される。この方法には以下の工程を含む：ａ）鋳型核酸を反応混合物中で、変異体ＲＮＡポリメラーゼ、核酸転写鋳型、およびヌクレオシド三リン酸を含む条件下でインキュベートする工程であって、ここでは、ヌクレオシド三リン酸は２’ＯＭｅである工程；ならびに、ｂ）一本鎖の核酸が得られるように転写反応混合物を転写する工程であって、ここでは、転写物の最初のヌクレオチドを２’修飾され得ないことを除いて、一本鎖核酸のヌクレオチドの全てが２’−ＯＭｅ修飾される工程。いくつかの実施形態においては、転写物の最初のヌクレオシドは２’−ＯＨグアノシンであり得る。この方法のいくつかの実施形態においては、変異体ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位と７８４位とに改変アミノ酸を含む変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、具体的には、７８４位の改変アミノ酸がアラニンである場合には、６３９位の改変アミノ酸はフェニルアラニンではない、６３９位と７８４位とに改変アミノ酸を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）であり、特に、３７８位に改変アミノ酸、および／または２６６位に改変アミノ酸がさらに含まれているＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態においては、本発明の方法で使用されるポリメラーゼにおいては、６３９位の改変アミノ酸はロイシンであり、７８４位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、２６６位の改変アミノ酸は、本発明の方法で使用されるポリメラーゼについては、ロイシンである。さらなる実施形態においては、３７８位の改変アミノ酸は、本発明の方法で使用されるポリメラーゼについては、アルギニンである。特定の実施形態においては、配列番号１、配列番号２、配列番号１０２、および配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００２１】
本発明の方法のいくつかの実施形態においては、転写反応には、さらにマグネシウムイオンを含む。別の実施形態においては、転写反応には、マンガンイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、マグネシウムイオンは、マンガンイオンよりも３．０から３．５倍高い濃度で、転写反応の中に存在する。個々のヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．０ｍＭである。個々のヌクレオチド三リン酸が１．５ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は８ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．５ｍＭである。個々のヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は９．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は３．０ｍＭである。
【００２２】
別の実施形態においては、転写反応にはさらに、非２’−ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基（具体的には、以下からなる群より選択される非２’−ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基：グアノシン一リン酸、グアノシンニリン酸、２’−フルオログアノシン一リン酸、２’−フルオログアノシン二リン酸、２’−アミノグアノシン一リン酸、２’−アミノグアノシンニリン酸、２’−デオキシグアノシン一リン酸、および２’−デオキシグアノシンニリン酸）を含む。別の実施形態においては、転写鋳型には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。別の実施形態においては、転写反応にはさらに、ポリエチレングリコールを含む。別の実施形態においては、転写反応には、無機ピロホスファターゼを含む。
【００２３】
本発明の別の態様においては、アプタマーを同定するための方法が提供される。１つの実施形態においては、以下の工程を含む、アプタマーを同定するための方法が提供される：ａ）本発明の変異体ポリメラーゼ、および１種類以上の核酸転写鋳型を含む転写反応混合物を調製する工程、ｂ）転写反応混合物を転写して、一本鎖の核酸の候補混合物を得る工程であって、ここでは、一本鎖の核酸のヌクレオチドのうち、必要に応じて１つを除く全てが２’修飾される工程、ｃ）候補混合物を標的分子と接触させる工程、ｄ）候補混合物から、候補混合物の親和性と比較して、標的分子に対して高い親和性を有する核酸を分ける工程、ならびに、ｅ）高い親和性を有する核酸を増幅して、アプタマーを多く含む混合物を得る工程であって、ここでは、アプタマーの最初のヌクレオチドを２’修飾され得ないことを除き、標的分子に対する得プタマーに全て２’修飾されたヌクレオチドを含む工程。いくつかの実施形態においては、増幅工程ｆ）には、（ｉ）必要に応じて、標的に由来する親和性が高い核酸を解離させる工程、ｉｉ）核酸−標的複合体から解離した親和性が高い核酸を逆転写する工程、ｉｉｉ）逆転写された親和性が高い核酸を増幅する工程；ならびに、（ｉｉ）転写鋳型として増幅かつ逆転写された親和性が高い核酸を含む転写反応混合物を調製し、そして転写混合物を転写する工程を含む。
【００２４】
本発明のアプタマーの同定方法のいくつかの実施形態においては、変異体ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位と７８４位とに改変アミノ酸を含む変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、特に、６３９位と７８４位とに改変アミノ酸が含まれており、７８４位の改変アミノ酸がアラニンである場合には６３９位の改変アミノ酸はフェニルアラニンではないＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり、特に、３７８位に改変アミノ酸および／または２６６位に改変アミノ酸がさらに含まれているＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態においては、本発明の方法で使用されるポリメラーゼにおいては、６３９位の改変アミノ酸はロイシンであり、７８４位の改変アミノ酸はアラニンである。さらなる実施形態においては、２６６位の改変アミノ酸は、本発明の方法で使用されるポリメラーゼについてはロイシンである。さらなる実施形態においては、３７８位の改変アミノ酸は、本発明の方法で使用されるポリメラーゼについてはアルギニンである。特定の実施形態においては、配列番号１、配列番号２、配列番号１０２、および配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドが、本発明のアプタマーの同定方法において使用される。
【００２５】
いくつかの実施形態においては、転写反応の中のヌクレオチド三リン酸は全て、２’−ＯＭｅ修飾される。１つの実施形態においては、１つ以上の核酸転写鋳型にはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれ、そしてリーダー配列は、Ｔ７ ＲＮａポリメラーゼプロモーターのすぐ３’側にある。この態様のいくつかの実施形態においては、この方法には、工程ａ）からｅ）を反復して繰り返す工程を含む。
【００２６】
本発明のアプタマーの同定方法のいくつかの実施形態においては、転写反応にはさらに、マグネシウムイオンを含む。別の実施形態においては、転写反応には、マンガンイオンがさらに含まれる。別の実施形態においては、マグネシウムイオンは、マンガンイオンよりも３．０から３．５倍高い濃度で、転写反応の中に存在する。個々のヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．０ｍＭである。個々のヌクレオチド三リン酸が１．５ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は８ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．５ｍＭである。個々のヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する別の実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は９．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は３．０ｍＭである。
【００２７】
この態様の別の実施形態においては、本発明のアプタマーの同定方法において使用される転写反応にはさらに、非２’−ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基（特に、以下からなる群より選択される非２’−ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基：グアノシン一リン酸、グアノシンニリン酸、２’−フルオログアノシン一リン酸、２’−フルオログアノシン二リン酸、２’−アミノグアノシン一リン酸、２’−アミノグアノシンニリン酸、２’−デオキシグアノシン一リン酸、および２’−デオキシグアノシンニリン酸）を含む。別の実施形態においては、転写鋳型には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。別の実施形態においては、転写反応にはさらに、ポリエチレングリコールを含む。別の実施形態においては、転写反応には、無機ピロホスファターゼを含む。
【００２８】
本発明はまた、特異的転写のための核酸鋳型の成分配列を選択する方法にも関する。１つの実施形態においては、成分配列は、鋳型特異的転写の転写物量を増大させる。特定の実施形態においては、本発明は、転写物量を増大させるためのリーダー配列を選択する方法、およびリーダー配列に対して、リーダー配列を含む核酸鋳型、および、本発明のリーダー配列と核酸鋳型を使用する方法に関する。本発明はまた、新規の変異体ポリメラーゼ、および転写におけるそれらの使用、特に、２’修飾されたヌクレオチドが取り込まれている（より具体的には、取り込まれているヌクレオチドの全てが２’修飾されている、例えば、２’−ＯＭｅである場合）転写物量を増大させるためのその使用にも関する。本発明はまた、転写物量を増大させるための改良された転写反応条件にも関する。本発明は、具体的には、上記の態様の２つおよび３つの組み合わせ、具体的には転写物の最初のヌクレオチド以外の全てが２’修飾、具体的には、２’−ＯＭｅ修飾されている転写物（「完全なる２’−ＯＭｅ」または「ｍＲｍＹ」または「ＭＮＡ」転写物）の量を改善することに関する。
【００２９】
本発明の第１の態様の１つの実施形態においては、転写を促進するための核酸鋳型成分配列を同定する方法が提供される。この方法には、以下の工程を含む：ａ）転写鋳型の候補のライブラリーを調製する工程であって、ここでは、鋳型には、プロモーター、プロモーターのすぐ３’側にある第１の固定された領域、第１の固定された領域のすぐ３’側にある縮重領域、および縮重領域の３’側にある第２の固定された領域を含む工程；ｂ）転写反応において転写鋳型の候補のライブラリーを転写して、転写物のライブラリーを得る工程；ｃ）転写混合物を逆転写して、ｃＤＮＡの候補混合物を得る工程であって、ここでは、ｃＤＮＡ鋳型には５’末端と３’末端を含む工程；ｄ）連結反応において、プロモーターをコードするＤＮＡ配列をｃＤＮＡ鋳型の３’末端に連結する工程；ｅ）ｃＤＮＡ鋳型を増幅して、転写鋳型の候補のライブラリーを得る工程；ならびに、ｆ）転写鋳型の候補のライブラリーからの転写を増強するための核酸配列成分を同定する工程であって、ここでは、核酸配列成分には、縮重領域の少なくとも一部に由来する配列を含む工程。本発明のこの方法の１つの実施形態においては、工程ｆ）には、ｉ）個々の転写鋳型に転写鋳型の候補のライブラリーをクローニングする工程；ｉｉ）転写反応において個々の転写鋳型を転写して、転写物の量を得る工程；ｉｉｉ）個々の転写鋳型の転写物量を評価する工程；ならびに、ｉｖ）所定の転写物量を生じる転写鋳型中の核酸配列成分を同定する工程。本発明のこの方法の特定の実施形態においては、所定の転写物量は、転写鋳型の候補混合物を転写することにより工程ｂ）で得られる転写物量よりも多い量である。
【００３０】
本発明のこの方法の別の実施形態においては、工程ｆ）には、転写鋳型の候補のライブラリーの縮重領域の塩基組成を分析する工程、および転写鋳型の候補のライブラリーの平均の塩基組成に基づいて核酸配列成分を同定する工程を含む。
【００３１】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態においては、この方法の工程ｂ）にはさらに、転写された転写混合物をＤＮａｓｅで処理する工程が府生まれる。本発明のこの方法のさらなる実施形態においては、工程ｂ）にはさらに、転写された転写混合物を、転写された転写鋳型を転写反応の他の成分から分けることによって精製する工程を含む。本発明のこの方法の特定の実施形態においては、精製工程には、転写反応物を脱塩カラムを通過させることによって、転写反応緩衝液を置換することを含む。
【００３２】
本発明のこの態様の別の実施形態においては、この方法の工程ｄ）には、工程ｃ）の前に行われる。本発明のこの態様の別の実施形態においては、この方法には、工程ｆ）が行われる前に、工程ｂ）からｅ）を１回以上繰り返す工程を含む。
【００３３】
本発明のこの態様のさらなる実施形態においては、連結反応は、添え木で支えられた連結反応（ｓｐｌｉｎｔｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）であり、この連結反応には、核酸である添え木と、プロモーターをコードする５’−一リン酸化オリゴヌクレオチドを含む。
【００３４】
本発明のこの態様の特定の実施形態においては、この方法で使用される転写反応には、１つ以上の改変ヌクレオチド三リン酸と変異したポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態においては、改変ヌクレオチド三リン酸は、２’改変ヌクレオチド三リン酸、特に、２’−ＯＭｅ改変ヌクレオチド三リン酸である。いくつかの実施形態においては、変異したポリメラーゼは、変異したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態においては、本発明の方法において使用される転写反応には、マグネシウムイオンおよびマンガンイオン（Ｍｎ^２＋）が含まれ、変異したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号１００、および配列番号１０１からなる群より選択される。
【００３５】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態においては、マグネシウムイオンは、マンガンイオン（Ｍｎ^２＋）よりも３．０から３．５倍高い濃度で、転写反応の中に存在する。個々のヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する本発明のこの態様のさらなる実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．０ｍＭである。個々のヌクレオチド三リン酸が１．５ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する本発明のこの態様のさらなる実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は８ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は２．５ｍＭである。個々のヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で転写反応の中に存在する本発明のこの態様のなおさらなる実施形態においては、マグネシウムイオンの濃度は９．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度は３．０ｍＭである。この方法のいくつかの実施形態においては、転写反応にはさらに、ポリアルキレングリコール、特に、ポリエチレングリコールを含む。この方法のいくつかの実施形態、具体的には、完全なる２’−ＯＭｅ転写物が所望される実施形態においては、転写反応にはさらに、以下からなる群より選択されるグアノシン残基を含む：グアノシン一リン酸、グアノシンニリン酸、２’−フルオログアノシン一リン酸または２’−フルオログアノシン二リン酸、２’−アミノグアノシン一リン酸または２’−アミノグアノシンニリン酸、２’−デオキシグアノシン一リン酸または２’−デオキシグアノシンニリン酸、あるいは他の修飾されたヌクレオチド。さらなる実施形態においては、本発明の方法の転写反応には、無機ピロホスファターゼを含む。さらなる実施形態においては、本発明の方法の転写反応には、必要に応じて、以下からなる群に由来する組み合わせを含む：緩衝液、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ポリアミン（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）、および還元剤（例えば、ＤＴＴまたはβＭＥ）。なおさらなる実施形態においては、本発明の方法の転写反応には、ヌクレオチド三リン酸、マグネシウムイオン、マンガンイオン（例えば、Ｍｎ^２＋）、ポリエチレングリコール、グアノシン一リン酸、無機ピロホスファターゼ、緩衝液、界面活性剤、ポリアミン、およびＤＴＴ、ならびに１種類以上のオリゴヌクレオチド転写鋳型、ならびに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１、２、１００、および１０１からなる群より選択される変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ））を含む。
【００３６】
本発明の同定方法のいくつかの実施形態においては、転写鋳型の候補のライブラリーの第１の固定された領域は、２個、３個、４個、または５個のグアノシン残基から構成される。本発明のいくつかの実施形態においては、転写鋳型の候補のライブラリーの縮重領域には、少なくとも４個、１０個、２０個、または３０個のヌクレオチドを含む。
【００３７】
この方法のいくつかの実施形態においては、同定される核酸鋳型成分配列はリーダー配列である。いくつかの実施形態においては、リーダー配列には第１の固定された領域と、転写鋳型の候補のライブラリーの縮重領域の少なくとも一部に由来する配列を含む。いくつかの実施形態においては、本発明の方法にはさらに、同定されたリーダー配列をオリゴヌクレオチド転写鋳型の中に取り込ませる工程を含む。
【００３８】
本発明によってはまた、本発明の同定方法によって同定されたリーダー配列も提供される。いくつかの実施形態においては、本発明のリーダー配列には、配列番号１０から９９からなる群より選択される配列のいずれか１つの中のヌクレオチド２２からヌクレオチド３２までの核酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、本発明のリーダー配列には、配列番号１０〜９９からなる群より選択される配列の任意の１つの中のヌクレオチド１８からヌクレオチド３２までの核酸配列を含む。本発明によってはまた、本発明のリーダー配列を含むオリゴヌクレオチド転写鋳型も提供される。特定の実施形態においては、本発明により、配列番号３から６、および配列番号１０６からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド転写鋳型が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様においては、核酸の転写物量を増大させるための方法が提供され、ここでは、転写は、オリゴヌクレオチド転写鋳型によって行われる。本発明のこの態様のいくつかの実施形態においては、転写物量を増大させる方法には、リーダー配列を含むオリゴヌクレオチド転写鋳型を用いて転写を行う工程を含む。ここでは、リーダー配列は、それについての転写物量の増大が所望される転写反応において使用されるものと同じヌクレオチド組成および／またはポリメラーゼおよび／または条件を使用して、本発明の同定方法によって同定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、以下の付随する記載に示される。本明細書中に記載されるものと類似する、または同等の任意の方法と材料を本発明の実施および試験において使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載から明らかであろう。明細書中では、単数形には、状況が別の場所に明確に示されていない限りは、複数形も含まれる。他の場所で定義されていない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合には、本明細書が支配するであろう。
【００４１】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）法
アプタマーを作成するための好ましい方法は、図１に概要が示される「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」（「ＳＥＬＥＸ（登録商標）」）と題されており、また、インビトロ選択とも呼ばれるプロセスを用いる。ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスは、標的分子に対して高度に特異的な結合を用いた核酸分子のインビトロでの発達のための方法であり、例えば、１９９０年６月１１日に提出された米国特許出願番号０７／５３６，４２８（現在は放棄されている）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」と題されている米国特許第５，４７５，０９６号、および「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」と題されている米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３もまた参照のこと）に記載されている。選択と増幅の反復サイクルを行うことにより、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を使用してアプタマーを得ることができ、これは、本明細書中では、何らかの所望されるレベルの標的結合親和性を有する「核酸リガンド」とも呼ばれる。
【００４２】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスは、核酸が様々な二次元構造および三次元構造を形成する十分な能力と、実質的にあらゆる化合物（モノマーであるか、またはポリマーであるかには問わない）とともにリガンドとして作用する（すなわち、特異的な結合対を形成する）それらのモノマーにおいて利用できる十分な化学的多用途性を有するという、独自の見識に基づく。任意の大きさの分子または組成物を、標的とすることができる。
【００４３】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスは、標的に結合する能力に基づく。したがって、ＳＥＬＥＸ（登録商標）手順によって得られたアプタマーは、標的結合特性を有するであろう。しかし、珍しい標的結合は、もし存在するとしても、アプタマーの結合の作用によって標的に対して発揮されるであろう機能的作用に対して何の情報も提供しない。
【００４４】
標的分子の特性の変更には、標的の特性を変化させるために、標的上の特定の位置に結合するアプタマーが必要である。理論的には、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法によっては、多数のアプタマーの同定が生じる場合があり、この場合は、個々のアプタマーが標的上の異なる部位に結合する。実際には、アプタマー−標的結合相互作用は、多くの場合は、標的上の１つ、または比較的少数の好ましい結合部位で起こり、これによって、相互作用についての安定であり、利用しやすい構造界面が提供される。さらに、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法が生理学的標的分子について行われる場合には、当業者は通常は、標的に対するアプタマーの位置を制御することはできない。したがって、標的上のアプタマー結合部位の位置は、所望される効果を導くことができるか、または標的分子に対して何の効果も有していない可能性のあるいくつかの結合部位の１つである場合も、またそのような部位ではない場合も、あるいは、そのような部位に近い場合もある。
【００４５】
標的に結合するその能力により、アプタマーが効果を有することが明らかになっている場合にもなお、その効果の存在を予測する、または前もって効果があるかどうかを知る方法はない。ＳＥＬＥＸ（登録商標）実験を行うことにおいては、当業者は、一定の確実性で、標的に対するアプタマーを得ることができる限りは、そのアプタマーが標的結合の特性を有するであろうことを知ることだけが可能である。同定されたアプタマーのいくつかはまた、それに対する結合を上回る効果をもまた標的に対して有しているであろうという期待においてＳＥＬＥＸ（登録商標）実験を行うことができるが、これは不明確である。
【００４６】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスは、ランダマイズされた配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールについての開始点に依存している。オリゴヌクレオチドは、修飾された、または未修飾のＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。いくつかの例においては、プールには、１００％縮重または部分縮重オリゴヌクレオチドを含む。他の例においては、プールには、ランダマイズされた配列の中に組み込まれた少なくとも１つの固定された配列および／または保存された配列を含む、縮重または部分縮重オリゴヌクレオチドを含む。他の例においては、プールには、その５’末端および／もしくは３’末端に少なくとも１つの固定された配列および／または保存された配列を含む縮重または部分縮重オリゴヌクレオチドを含む。これには、オリゴヌクレオチドプールの分子全てによって共有されている配列を含む場合がある。固定された配列は、予め選択された目的のために取り込まれている、プールの中のオリゴヌクレオチドに共通している配列であり、例えば、以下にさらに記載されるＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、およびＳＰ６）、制限部位、またはホモポリマー配列（例えば、ポリＡもしくはポリＴ帯（ｔｒａｃｔ）、触媒コア、アフィニティーカラムに対する選択的結合のための部位、転写を促進するリーダー配列、および目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にするための他の配列である。保存されている配列は、同じ標的に結合する多数のアプタマーによって共有されている、先に記載された固定された配列以外の配列である。
【００４７】
プールのオリゴヌクレオチドには、好ましくは、縮重配列部分ならびに効率的な増幅に不可欠な固定された配列を含む。通常、最初のプールのオリゴヌクレオチドには、３０〜４０個のランダムなヌクレオチドの内部領域に隣接している固定された５’末端配列と３’末端配列を含む。縮重ヌクレオチドは、化学合成、およびランダムに切断された細胞性の核酸からの大きさによる選択を含む多数の方法で生産することができる。試験核酸における配列のバリエーションもまた、選択／増幅の繰り返しの前または間に、突然変異誘発によって導入、または、増大させることができる。
【００４８】
オリゴヌクレオチドの縮重配列部分は任意の長さであり得、これには、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドが含まれ得、そして修飾された、または自然界には存在しないヌクレオチドあるいはヌクレオチドアナログが含まれ得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；同第５，６６０，９８５号；同第５，９５８，６９１号；同第５，６９８，６８７号；同第５，８１７，６３５号；同第５，６７２，６９５号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０７０６５を参照のこと。縮重オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用してホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成することができる。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）およびＦｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６）を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、液相方法（例えば、トリエステル合成法）を使用して合成することもできる。例えば、Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）およびＨｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）を参照のこと。自動合成装置上で行われる典型的な合成によっては、１０^１６〜１０^１７個の個々の分子が生じ、この数は、ほとんどのＳＥＬＥＸ（登録商標）実験について十分である。配列の設計における縮重配列の十分に大きな領域によって、個々の合成された分子が特有の配列を示す可能性が高まる。
【００４９】
オリゴヌクレオチドの最初のライブラリーは、ＤＮＡ合成装置上での自動的な化学合成によって作成することができる。縮重配列を合成するためには、４種類のヌクレオチド全ての混合物が、合成プロセスの間にそれぞれのヌクレオチドの付加工程で添加され、それによってヌクレオチドの確率論的な取り込みが可能となる。上記のように、１つの実施形態においては、ランダムオリゴヌクレオチドには、完全なる縮重配列を含む；しかし、他の実施形態においては、縮重オリゴヌクレオチドには、ランダムではないかまたは部分的にランダムな配列のストレッチが含まれ得る。部分的にランダムな配列は、個々の付加工程で、様々なモル比で４種類のヌクレオチドを添加することによって作成することができる。
【００５０】
ＲＮＡライブラリーが最初のライブラリーとして使用されるそのような例においては、これは典型的には、ＤＮＡライブラリーを合成すること、必要に応じて、ＰＣＲ増幅を行うこと、その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたは修飾されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＤＮＡライブラリーを転写すること、そして転写されたライブラリーを精製することによって作成される。ＲＮＡライブラリーまたはＤＮＡライブラリーは、その後、結合に好ましい条件下で標的と混合され、そして結合親和性および選択性の実質的な任意の所望される基準を満たすための同じ一般的な選択スキームを使用して、結合相互作用、分離、および増幅の段階的な繰り返しに供される。より具体的には、核酸の最初のプールを含む混合物を用いて開始されるＳＥＬＥＸ（登録商標）法には、以下の工程を含む：（ａ）結合に好ましい条件下で、混合物を標的と接触させる工程；（ｂ）標的分子に特異的に結合したそのような核酸から結合していない核酸を分離する工程；（ｃ）必要に応じて、核酸−標的複合体を解離させる工程；（ｄ）核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドが多く含まれている核酸の混合物を得る工程；ならびに、（ｅ）標的分子に対する特異性が高く、親和性が高い、核酸リガンドを得るために所望されるサイクル数と同じサイクル数、結合、分離、解離、および増幅の工程を繰り返す工程。ＲＮＡアプタマーが選択される場合には、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法にはさらに、以下の工程を含む：（ｉ）工程（ｄ）の増幅の前に、核酸−標的複合体から解離した核酸を逆転写する工程；および（ｉｉ）プロセスを繰り返す前に、工程（ｄ）による増幅させられた核酸を転写する工程。
【００５１】
多数の可能性のある配列および構造を含む核酸混合物においては、所定の標的に対する結合親和性は広範囲に及ぶ。例えば、２０ヌクレオチドのランダマイズされたセグメントを含む核酸混合物は、４^２０種類の候補の可能性を有し得る。標的に対して高い親和性（低い解離定数）を有するものが、標的に結合する可能性が最も高い。分離、解離、および増幅の後、第２の核酸混合物が作成され、高い結合親和性を有する候補について富化させられる。得られる核酸混合物が主にわずか１種類または数種類の配列だけから構成されるまで、さらなる回の選択が最良のリガンドに段階的に有利に働く。これらは、その後、クローニングされ、配列決定され、そして１）標的結合親和性および／または２）標的機能に影響を与える能力について、リガンドまたはアプタマーとして個々に試験される。
【００５２】
選択および増幅のサイクルは、所望される目的が達成されるまで繰り返される。最も一般的な場合には、選択／増幅は、結合強度においてそれ以上の有意な改善が、サイクルを繰り返しても得られなくなるまで続けられる。この方法では、通常、およそ１０^１４種類の様々な核酸種の試料をサンプリングするために使用されるが、これは、約１０^１８種類の核酸種のような多い試料にも使用される場合がある。一般的には、核酸アプタマー分子は、５から２０サイクルの手順で選択される。１つの実施形態においては、不均質性は、最初の選択段階にのみ導入され、反復プロセス全体を通じては行われない。
【００５３】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）法の１つの実施形態においては、選択プロセスは、選択された標的に対して最も強く結合するそのような核酸リガンドを単離することについては十分に効果的であり、ここでは、わずかに１回の選択と増幅のサイクルが必要である。このような効率的な選択は、例えば、クロマトグラフィー型のプロセスにおいて起こり得、この場合、カラム上に結合させられた標的と会合する核酸の能力は、カラムによって親和性が最も高い核酸リガンドを十分に分離および単離できるそのような様式で操作される。
【００５４】
多くの場合には、１つの核酸リガンドが同定されるまでにＳＥＬＥＸ（登録商標）の反復工程を行うことは、必ずしも所望されない。標的特異的核酸リガンドの溶液には、保存されている多数の配列と、標的に対する核酸リガンドの親和性に有意な影響を与えることなく置換または付加することができる多数の配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーが含まれ得る。完了する前にＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスを終わらせることにより、核酸リガンドの溶液のファミリーの多数のメンバーの配列を決定することができる。
【００５５】
様々な核酸の一次構造、二次構造、および三次構造が存在することが知られている。ワトソン−クリック型以外の相互作用に関係していることが最も一般的に示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称隆起（ｂｕｌｇｅ）、偽結節、およびそれらの無数の組み合わせと呼ばれる。そのようなモチーフのほぼ全ての明らかになっているケースは、それらが、３０個を越えないヌクレオチドの核酸配列の中で形成され得ることを示唆している。この理由について、連続するランダマイズされたセグメントを用いるＳＥＬＥＸ（登録商標）手順が、約２０個から約５０個の間のヌクレオチド、そしていくつかの実施形態においては、約３０個から約４０個の間のヌクレオチドのランダマイズされたセグメントを含む核酸配列を用いて開始されることが、多くの場合に好ましい。１つの例においては、５’−固定された：ランダム：３’−固定された配列には、約３０個から約４０個のヌクレオチドのランダムな配列を含む。
【００５６】
コアＳＥＬＥＸ（登録商標）（ｃｏｒｅ ＳＥＬＥＸ（登録商標））法は、多数の特異的な目的を達成するために改良されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号には、特異的な構造特性（例えば、湾曲したＤＮＡ）を有する核酸分子を選択するために、ゲル電気泳動と組み合わせてＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスを使用することが記載されている。米国特許第５，７６３，１７７号には、標的分子に結合することができる、および／または標的分子を光架橋させることができる、および／または標的分子を光不活化させることができる光反応性の基を含む核酸リガンドを選択するための、ＳＥＬＥＸ（登録商標）をベースとする方法が記載されている。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許第５，８６１，２５４号には、これにより、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと低い親和性を有するオリゴヌクレオチドを非常に効率よく分離することができるＳＥＬＥＸ（登録商標）をベースとする方法が記載されている。米国特許第５，４９６，９３８号には、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスが行われた後に、改良された核酸リガンドを得るための方法が記載されている。米国特許第５，７０５，３３７号には、その標的に対してリガンドを共有結合させるための方法が記載されている。
【００５７】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）法はまた、標的分子上の１つ以上の部位に結合する核酸リガンドを得るため、および標的上の特異的な部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るためにも使用することができる。ＳＥＬＥＸ（登録商標）法によっては、いずれかの予想される標的（核酸結合タンパク質のような大きい生体分子および小さい生体分子、ならびに、それらの生物学的機能の一部として核酸に結合することは知られていないタンパク質、ならびに補因子および他の低分子を含む）に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段が提供される。例えば、米国特許第５，５８０，７３７号には、カフェインおよび密接に関係しているアナログであるテオフィリンに対して高い親和性で結合することができる、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法によって同定された核酸配列が開示されている。
【００５８】
Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスは、１つ以上の非標的分子に対して交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することにより、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善するための方法である。Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスには、以下の工程を含む：（ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；（ｂ）候補混合物を標的と接触させる工程であって、ここでは、候補混合物と比較して標的に対して高い親和性を有する核酸を、候補混合物の残りから分離することができる工程；（ｃ）候補混合物の残りから高い親和性を有する核酸を分離する工程；（ｄ）必要に応じて、高い親和性を有する核酸を標的から解離させる工程；（ｅ）高い親和性を有する核酸を１つ以上の非標的分子と接触させる工程であって、その結果、非標的分子（単数または複数）に対して特異的な親和性を有する核酸リガンドが除去される工程；ならびに、（ｆ）標的分子に対してのみ特異的な親和性を有する核酸を増幅して、標的分子に対して比較的高い親和性と結合特異性を有する核酸配列について富化させられた核酸の混合物を得る工程。ＳＥＬＥＸ（登録商標）法について上記に記載されたように、選択と増幅のサイクルは、所望される目的が達成されるまで、必要に応じて繰り返される。
【００５９】
治療薬およびワクチンとしての核酸の使用において起こる可能性がある１つの問題点は、それらのホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが細胞内酵素および細胞外酵素（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ）によって、所望される効果が発現される前に体液中で迅速に分解されてしまう可能性があることである。したがって、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法には、リガンドに対して改善された特性（例えば、改善されたインビボでの安定性または改善された送達特性）を付与する修飾されたヌクレオチドを含む親和性が高い核酸リガンドの同定を含む。このような修飾の例としては、糖および／またはリン酸および／または塩基部分での化学的置換が挙げられる。修飾されたヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ（登録商標）によって同定された核酸リガンドは、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号（ここでは、リボースの２’位、ピリミジンの５位、およびプリンの８位が化学修飾されているヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている）、米国特許第５，７５６，７０３号（ここでは、様々な２’−修飾されたピリミジンを含むオリゴヌクレオチドが記載されている）、および米国特許第５，５８０，７３７号（ここでは、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む特異性が高い核酸リガンドが記載されている）に記載されている。
【００６０】
本発明において意図される核酸リガンドの修飾としては、さらなる変化、極性、疎水性、水素結合、静電気相互作用、および流動特性を、核酸リガンドの塩基に、または核酸リガンド全体に取り込ませる他の化学基を提供するものが挙げられるが、これらに限定はされない。ヌクレアーゼに耐性である縮重オリゴヌクレオチドの集団に対する修飾としてはまた、１つ以上の代わりのヌクレオチド間結合、別の糖、別の塩基、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。このような修飾としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：２’位置での糖修飾、５位でのピリミジンの修飾、８位でのプリンの修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモウラシルもしくは５−ヨードウラシルの置換；骨格の修飾、ホスホロチオエート、またはアルキルホスフェート修飾、メチル化、ならびに、特有の塩基の対合の組み合わせ（例えば、イソ塩基（ｉｓｏｂａｓｅ）であるイソシチジンとイソグアノシン）。修飾にはまた、３’および５’修飾（例えば、キャッピング）も含まれ得る。修飾にはまた、３’および５’修飾も含まれ得、例えば、キャッピング、例えば、エキソヌクレアーゼ耐性を高めるための３’−３’−ｄＴキャップの付加も含まれ得る（例えば、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号；および同第６，２２９，００２号を参照のこと、これらのそれぞれはそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）。
【００６１】
１つの実施形態においては、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）もしくは３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）によって置き換えられているオリゴヌクレオチドが提供される。式中、ＲまたはＲ’はそれぞれ独立して、Ｈ、または置換されたもしくは未置換のアルキルである。結合基は、−Ｏ−、−Ｎ−、または−Ｓ−結合によって隣接するヌクレオチドに結合させることができる。オリゴヌクレオチド中の全ての結合が同じである必要ではない。
【００６２】
さらなる実施形態においては、オリゴヌクレオチドには修飾された糖基を含む。例えば、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン、脂肪族基で置き換えられるか、またはエーテルもしくはアミンとして機能化させられる。１つの実施形態においては、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル、またはハロ基のいずれかによって置換される。２’−修飾された糖の合成方法は、例えば、Ｓｐｒｏａｔ，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎ，ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；および、Ｈｏｂｂｓ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載されている。他の修飾は当業者に公知である。このような修飾は、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスの前の修飾である場合も、また、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスの後の修飾（以前に同定された未修飾のリガンドの修飾）である場合も、あるいは、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスに組み込むことによって作成される場合もある。
【００６３】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセス前の修飾、またはＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスに組み込むことによって作成されるものによっては、それらのＳＥＬＥＸ（登録商標）標的についての特異性と、改善された安定性（例えば、インビボでの安定性）の両方を有する核酸リガンドが得られる。核酸リガンドに対するＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセス後の修飾（例えば、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスの前の修飾によって取り込ませられたヌクレオチドを有する以前に同定されたリガンドの短縮、欠失、置換、またはさらなるヌクレオチド修飾によっては、改善された安定性（例えば、核酸リガンドの結合能力に有害な影響を与えることのないインビボでの安定性）が生じ得る。必要に応じて、修飾されたヌクレオチドがＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセス前の修飾によって取り込まれているアプタマーは、さらに、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセス後の修飾（すなわち、ＳＥＬＥＸ後のＳＥＬＥＸ（登録商標）後修飾プロセス）によって修飾することができる。
【００６４】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）方法には、米国特許第５，６３７，４５９号および同第５，６８３，８６７号に記載されているように、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と選択されたオリゴヌクレオチドを組み合わせることを含む。ＳＥＬＥＸ（登録商標）法にはさらに、例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、同第６，０５１，６９８号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１８４８０に記載されているように、診断用または治療用複合体の中で、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性の高分子量の化合物と混合する工程を含む。これらの特許および特許出願には、広範な形状と他の特性、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製の特性と、ならびに、他の分子の所望される特性との組み合わせが教示されている。
【００６５】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）法による小さい可撓性のペプチドに対する核酸リガンドの同定もまた、研究されている。小さいペプチドは可撓性の構造を有しており、通常は、複数の立体構造の平衡状態で溶液中に存在している。したがって、結合親和性が、可撓性のペプチドに結合すると立体構造のエントロピーが失われることによって制限される可能性があると最初は考えられた。しかし、溶液中での小さいペプチドに対する核酸リガンドの同定の実現可能性は、米国特許第５，６４８，２１４号において明らかにされた。この特許では、物質Ｐに対する親和性が高いＲＮＡ核酸リガンドである１１アミノ酸のペプチドが同定された。
【００６６】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスの一部として、標的に結合するように選択された配列は、その後、必要に応じて、所望される結合親和性を有する最小配列を決定するために最小化させられる。選択された配列および／または最小化された配列は、必要に応じて、例えば、結合親和性を高めるために、あるいは、配列中のどの位置が結合活性に不可欠であるかを決定するために、配列のランダム突然変異または特異的突然変異をおこなうことによって修飾される。
【００６７】
２’−修飾されたＳＥＬＥＸ（登録商標）法
治療薬としての使用、および／または特定のタイプの診断薬に適しているアプタマーにするためには、合成が安価であること、インビボで安全であり、そして安定であることが好ましい。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは、通常、インビボでは安定ではない。これは、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感度がその原因である。ヌクレアーゼによる分解に対する耐性は、２’位置での修飾基の取り込みによって大幅に高めることができる。
【００６８】
２’−フルオロ基および２’−アミノ基は、オリゴヌクレオチドのプールの中にうまく取り込ませられており、続いて、ここからアプタマーが選択されている。しかし、これらの修飾によっては、得られるアプタマーの合成のコストも大幅に上昇してしまい、いくつかの場合には、修飾されたヌクレオチドが、修飾されたオリゴヌクレオチドの分解によって宿主ＤＮＡの中に再循環する場合があり、続いてヌクレオチドがＤＮＡ合成のために基質として使用されてしまう可能性の理由から、安全性についての懸念を生じる可能性がある。
【００６９】
本明細書中で提供されるような２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」）ヌクレオチドを含むアプタマーによって、これらの欠点の多くが克服される。２’−ＯＭｅヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性であり、合成は安価である。２’−ＯＭｅヌクレオチドは生物学的システムの至るところに存在しているが、自然界に存在しているポリメラーゼは生理学的条件下での基質としての２’−ＯＭｅ ＮＴＰを受け取ることはなく、したがって、宿主ＤＮＡへの２’−ＯＭｅヌクレオチドの再循環に関する安全性の懸念はない。２’−修飾されたアプタマーを作成するために使用されるＳＥＬＥＸ（登録商標）法は、例えば、２００２年１２月３日に提出された米国仮特許出願番号６０／４３０，７６１、２００３年７月１５日に提出された米国仮特許出願番号６０／４８７，４７４号、２００３年１１月４日に提出された米国仮特許出願番号６０／５１７，０３９号、２００３年１２月３日に提出された米国特許出願番号１０／７２９，５８１、および、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題された２００４年６月２１日に提出された米国特許出願番号１０／８７３，８５６に記載されている。これらのそれぞれは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【００７０】
本発明には、アプタマーの標的に結合し、その機能を調節するアプタマーが含まれ、これには、酵素による分解および化学的分解、ならびに、熱的および物理的分解に対して未修飾のオリゴヌクレオチドよりも安定なオリゴヌクレオチドを作成するための、修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−位置に修飾を有するヌクレオチド）を含む。文献（例えば、Ｒｕｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８ ２７３，２０５５６−２０５６７−６９５を参照のこと）の中には２’−ＯＭｅを含むアプタマーのいくつかの例があるが、これらは、修飾された転写物のライブラリーのインビトロでの選択によって作成されたものである。ここでは、Ｃ残基およびＵ残基は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換されており、そしてＡ残基およびＧ残基は２’−ＯＨである。一旦、機能的配列が同定されると、その後、Ａ残基およびＧ残基はそれぞれ、２’−ＯＭｅ置換に対する耐容性について試験された。２’−ＯＭｅ残基としての２’−ＯＭｅ置換を寛容化する全てのＡ残基とＧ残基を有するアプタマーが再度合成された。この２段階の様式で作成されたアプタマーのＡ残基とＧ残基のほとんどは、２’−ＯＭｅ残基での置換を寛容化するが、平均するとおよそ２０％は寛容化しない。結果として、この方法を使用して作成されたアプタマーは、２個から４個の２’−ＯＨ残基を含む傾向にあり、そして安定性および合成のコストは、結果として危うくなる。それからアプタマーが選択され、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法（および／またはそのバリエーションのいずれかおよび改善（本明細書中に記載されるものを含む））によって富化させられるオリゴヌクレオチドのプールの中で使用される安定化させられたオリゴヌクレオチドを生じる転写反応に修飾されたヌクレオチドを取り込ませることによって、本発明の方法は、２’−ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを有するアプタマーオリゴヌクレオチドを再度合成することにより、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化させる必要性を排除する。
【００７１】
１つの実施形態においては、本発明により、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、および２’−ＯＭｅ修飾の組み合わせを含むアプタマーが提供される。別の実施形態においては、本発明により、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ_２、および２’−メトキシエチル修飾の組み合わせを含むアプタマーが提供される。好ましい実施形態においては、本発明により、全て、または実質的に全てが２’−ＯＭｅで修飾されたＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、および／またはＵＴＰヌクレオチドを含むアプタマーが提供される。
【００７２】
修飾されたポリメラーゼ
本発明の２’−修飾されたアプタマーは、修飾されたポリメラーゼ（例えば、フラノースの２’位置にブチル置換を有する修飾されたヌクレオチドが一定の割合での取り込まれている（これは野生型ポリメラーゼよりも高い割合である）修飾されたＴ７ポリメラーゼを使用して作成される。例えば、６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化させられている変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は、２’デオキシ、２’アミノ、および２’−フルオロヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を基質として容易に利用することができ、そして様々な用途について修飾されたＲＮＡを合成するために広く使用されている。しかし、この変異体Ｔ７ポリメラーゼは、報告によると、ブチル２’置換基（例えば、２’−ＯＭｅまたは２’−アジド（２’−Ｎ_３）置換基）を有するＮＴＰを容易に利用する（すなわち取り込む）ことはできない。ブチル２’置換基の取り込みについては、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化させられている変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が記載されており、そして、修飾されたピリミジンＮＴＰを取り込ませるための限られた状況において使用されている。Ｐａｄｉｌｌａ，Ｒ．ａｎｄ Ｓｏｕｓａ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００２，３０（２４）：１３８を参照のこと。６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化させられており、７８４位のヒスチジン残基がアラニンに変化させられており、そして３７８位のリジン残基がアルギニンに変化させられている変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）は、修飾されたプリンおよびピリミジンＮＴＰ（例えば、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ）を取り込ませるための限られた状況において使用されているが、これには、転写のための２’−ＯＨ ＧＴＰのスパイクを含む。Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、（２００５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：２５−３３を参照のこと。転写のための２’−ＯＨ ＧＴＰスパイクを含めることによって、完全なる２’−ＯＭｅではなく、むしろ、２’−ＯＨ ＧＴＰの存在に依存し得るアプタマーを得ることができる。
【００７３】
７８４位のヒスチジンがアラニン残基に変化させられている変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載されている。Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７ポリメラーゼおよびＨ７８４Ａ変異体Ｔ７ポリメラーゼのいずれにおいても、アラニンのような小さいアミノ酸残基への変化によって、よりかさの大きいヌクレオチド基質（例えば、２’−ＯＭｅ置換されたヌクレオチド）の取り込みが可能となる。Ｃｈｅｌｌｉｓｅｒｒｙ，Ｋ．ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，９：１１５５−６０を参照のこと。かさの大きい２’修飾された基質を容易に取り込む変異をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの活性部位の中に有しているさらに別のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが記載されている。例えば、６３９位のチロシン残基がロイシンに変化させられた変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ）である。しかし、活性は、多くの場合は、このような変異によって付与される高い基質特異性を犠牲にし、それによって、転写物量の減少を導く。Ｐａｄｉｌｌａ Ｒ ａｎｄ Ｓｏｕｓａ，Ｒ．，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７（６）：１５６１を参照のこと。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体Ｐ２６６Ｌは、プロモーターのクリアランスを促進することが記載されている（Ｇｕｉｌｌｅｒｅｚら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２（１７）５９５８）。このポリメラーゼはプロモーターに結合している最初の立体構造から、プロモーターに結合していない伸張した立体構造への移行を生じる。上記の変異体ポリメラーゼはいずれも、完全なる２’−ＯＭｅ転写物を生じることは報告されていない。
【００７４】
本発明によっては、オリゴヌクレオチドの転写量を増大させるための材料と方法が提供される。１つの実施形態においては、本発明により、オリゴヌクレオチドの中に修飾されたヌクレオチドを酵素的に取り込ませるために、修飾されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するための方法および条件が提供される。好ましい実施形態においては、本発明の転写方法と共に使用される修飾されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼには、２’−ＯＨ ＧＴＰの存在は必要ない。好ましい実施態様においては、修飾されたポリメラーゼは、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変化させられており、７８４位のヒスチジン残基がアラニン残基に変化させられている変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）である。別の好ましい実施形態においては、修飾されたポリメラーゼは、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変化させられており、７８４位のヒスチジン残基がアラニン残基に変化させられており、そして３７８位のリジン残基がアルギニン残基に変化させられている変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）である。別の実施形態においては、本発明の方法で使用される修飾されたポリメラーゼは、６３９位のチロシン残基がロイシンに変化させられている変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ）であるが、なお別の実施形態においては、変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変化させられており、そして３７８位のリジン残基がアルギニン残基に変化させられている変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ）である。いずれの理論にも束縛されることは望ましくないが、Ｋ３７８Ｒ変異は、ポリメラーゼの活性部位付近ではなく、したがって、サイレント変異であると考えられる。別の実施形態においては、本発明の方法において使用される修飾されたポリメラーゼは、２６６位のプロリン残基がロイシンに変化させられており、６３９位のチロシン残基がロイシンに変化させられており、そして７８４位のヒスチジン残基がアラニン残基に変化させられている変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）であるが、なお別の実施形態においては、変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、２６６位のプロリン残基がロイシンに変化させられており、６３９位のチロシン残基がロイシン残基に変化させられており、７８４位のヒスチジン残基がアラニン残基に変化させられており、そして３７８位のリジン残基がアルギニン残基に変化させられている（Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３８７Ｒ）。
【００７５】
変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は以下に示される：
【００７６】
【化１】

【００７７】
【化２】

【００７８】
【化３】

２’−修飾された（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物のプールを、ポリメラーゼが２’−修飾されたＮＴＰを受け取る条件下で作成するために、Ｙ６３９Ｆ、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ、Ｙ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、またはＰ２２６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。好ましいポリメラーゼは、Ｙ３６９Ｌ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。別の好ましいポリメラーゼは、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。本発明の別の好ましいポリメラーゼは、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。他のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（具体的には、かさの大きい２’置換基について高い慣用性を示すもの）もまた、本発明の方法において使用することができる。本明細書中に開示される条件が使用される鋳型特異的重合に使用される場合は、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、またはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、全ての２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（２’−ＯＭｅ ＧＴＰを含む）の取り込みのために使用することができ、これには、Ｙ６３９Ｆ、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ、またはＹ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して得られるよりも多い転写物量が伴う。Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、またはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、多量の２’−修飾（例えば、２’−ＯＭｅ）を含むオリゴヌクレオチドを得るために使用することができるが、これには、２’−ＯＨ ＧＴＰは必要ではない。
【００７９】
好ましい実施形態においては、本発明のＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、多量の完全なる２’−ＯＭｅ転写物量を促進するために、ＭＮＡ転写混合物と共に使用される。いくつかの実施形態においては、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、ｒＲｍＹ、ｄＲｍＹ、ｒＧｍＨ、ｆＧｍＨ、ｄＧｍＨ、ｄＡｍＢ、ｒＲｄＹ、ｄＲｄＹ、またはｒＮ転写混合物と共に使用される場合もある。
【００８０】
本明細書中で使用される場合は、２’−ＯＭｅ Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ三リン酸のみを含む転写混合物はＭＮＡ混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーはＭＮＡアプタマーと呼ばれ、これには、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドだけを含む。２’−ＯＭｅ ＣおよびＵと、２’−ＯＨ ＡおよびＧを含む転写混合物は「ｒＲｍＹ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｒＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡおよびＧと、２’−ＯＭｅ ＵおよびＣを含む転写混合物は「ｄＲｍＹ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｄＲｍＹ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｃ、およびＵと、２’−ＯＨ Ｇを含む転写混合物は「ｄＧｍＨ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｄＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧと、２’−ＯＭｅ Ａ、Ｕ、およびＣと２’−Ｆ Ｇが交互に含まれている転写混合物は「オルタネイティング混合物」と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「オルタネイティング混合物」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｕ、およびＣと、２’−Ｆ Ｇを含む転写混合物は「ｆＧｍＨ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｆＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＭｅ Ａ、Ｕ、およびＣと、デオキシＧを含む転写混合物は「ｄＧｍＨ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｄＧｍＨ」アプタマーと呼ばれる。デオキシＡと、２’−ＯＭｅ Ｃ、Ｇ、およびＵを含む転写混合物は「ｄＡｍＢ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｄＡｍＢ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＨ Ａと、２’−ＯＭｅ Ｃ、Ｇ、およびＵを含む転写混合物は「ｒＡｍＢ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｒＡｍＢ」アプタマーと呼ばれる。２’−ＯＨアデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸と、デオキシシチジン三リン酸およびチミジン三リン酸を含む転写混合物は「ｒＲｄＹ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｒＲｄＹ」アプタマーと呼ばれる。全てが２’−ＯＨヌクレオチドである転写混合物は「ｒＮ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｒＮ」、「ｒＲｒＹ」、またはＲＮＡアプタマーと呼ばれる。そして、全てがデオキシヌクレオチドである転写混合物は「ｄＮ」混合物と呼ばれ、それから選択されたアプタマーは「ｄＮ」、または「ｄＲｄＹ」、またはＤＮＡアプタマーと呼ばれる。
【００８１】
２’−修飾されたオリゴヌクレオチドは、全てが修飾されたヌクレオチドから合成される場合も、また、修飾されたヌクレオチドのサブセットを有する場合もある。全てのヌクレオチドを修飾することができ、そして全てが同じ修飾を含む場合もある。全てのヌクレオチドは修飾することができるが、様々な修飾を含む場合がある。例えば、同じ塩基を含む全てのヌクレオチドは、１つの修飾のタイプを有することができ、一方、他の塩基を含むヌクレオチドは異なるタイプの修飾を有することができる。全てのプリンヌクレオチドは１つのタイプの修飾を有することができ（または、未修飾である）、一方、全てのピリミジンヌクレオチドは別の異なるタイプの修飾を有することができる（または、未修飾である）。この様式では、転写物、または転写物のプールは、修飾の任意の組み合わせ（例えば、リボヌクレオチド（２’−ＯＨ）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆ、および２’−ＯＭｅヌクレオチドを含む）を使用して作成される。さらに別の修飾されたヌクレオチドには、１つ以上の修飾を同時に有しているヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエート）での修飾と、糖（例えば、２−ＯＭｅ）と塩基（例えば、イノシン）での修飾）が含まれ得る。
【００８２】
転写条件
多数の要因が、２’−修飾されたＳＥＬＥＸ（登録商標）法の転写条件に重要であることが決定されている。これはまた、以下に記載されるＴｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ＳＥＬＥＸ法に適用することもできる。例えば、修飾された転写物の量の増大が、特定のリーダー配列／変異体ポリメラーゼの組み合わせが使用されるいくつかの条件下で観察され得る。リーダー配列は、ＤＮＡ転写鋳型の５’末端にある固定された配列の３’末端に取り込ませることができる配列である。リーダー配列は、通常、６〜１５ヌクレオチドの長さであり、所定のヌクレオチド組成から構成され得る。例えば、これは、全てがプリンである場合も、また、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドの特定の混合物である場合もある。
【００８３】
変異体ポリメラーゼと本発明の転写条件とともに使用することができる鋳型の例（具体的には、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、またはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒとの組み合わせ）は、ＡＲＣ２１１８（配列番号３）、ＡＲＣ２１１９（配列番号４）、およびＡＲＣ３４２８
【００８４】
【化４】

である。
【００８５】
加えて、２’−ＯＨ ＧＴＰの存在は、歴史的に、修飾されたヌクレオチドが取り込まれている転写物を得ることにおいて重要な要因である。転写は２つの期に分けることができる：第１期は開始期であり、この間に、ＮＴＰがＧＴＰの３’−末端（または別の置換されたグアノシン）に付加されて、ジヌクレオチドが得られ、これは次いで、約１０〜１２ヌクレオチドに伸張させられる；第２期は伸張期であり、この間に、転写が最初の約１０〜１２ヌクレオチドの付加を超えて進行する。Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ変異体またはＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと過剰の２’−ＯＭｅ ＧＴＰを含む転写混合物に対して添加された少量の２’−ＯＨ ＧＴＰは、ポリメラーゼが２’−ＯＨ ＧＴＰを使用する転写を開始できるようにする（そして、２’−ＯＨ ＧＴＰを用いない場合よりも多量の２’−ＯＭｅを含む転写物を生じる）ために十分であったが、一旦転写が伸張期に入ると、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨ ＧＴＰの間での識別の低さと、２’−ＯＨ ＧＴＰを上回る過剰の２’−ＯＭｅ ＧＴＰによって、主に２’−ＯＭｅ ＧＴＰの取り込みが可能となる。
【００８６】
本発明により、変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、またはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ（これらは、多量の２’−ＯＭｅ転写物を得るためには転写混合物中に２’−ＯＨ ＧＴＰは必要としない））が提供される。１つの実施形態においては、多量は、入力する転写鋳型あたりの平均の少なくとも１つの転写物を意味する。
【００８７】
２’−ＯＭｅで置換されたヌクレオチドの転写物への取り込みにおける別の要因は、転写混合物中での２価のマグネシウムとマンガン（Ｍｎ^２＋）の両方の使用である。様々な濃度の塩化マグネシウムと塩化マンガンの様々な組み合わせが、２’−Ｏ−メチル化転写物の収量に影響を与えることが明らかにされており、塩化マグネシウムと塩化マンガンの最適濃度は、２価の金属イオンを錯化させるＮＴＰの転写反応混合物中での濃度に依存する。完全なる２’−Ｏ−メチル化転写物（すなわち、全てが２’−ＯＭｅ Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧヌクレオチド）の最大量を得るためには、個々のＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在する場合には、およそ５ｍＭの塩化マグネシウムと１．５ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。個々のＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合には、およそ６．５ｍＭの塩化マグネシウムと２．０ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。個々のＮＴＰが１．５ｍＭの濃度で存在する場合には、およそ８ｍＭの塩化マグネシウムと２．５ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。個々のＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合には、およそ９．５ｍＭの塩化マグネシウムと３．０ｍＭの塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合には、２倍までのこれらの濃度から出発することによってもなお、有意な量の修飾された転写物が得られる。
【００８８】
２’−ＯＨ ＧＭＰ、グアノシン、または２’−ＯＨ糖部分以外の部位で置換された他の２’−ＯＨグアノシンで転写を感作させることもまた、２’−ＯＨ ＧＴＰが含まれていない転写混合物については重要である。この効果は、ヌクレオチドを開始させるためのポリメラーゼの特異性によって生じる。結果として、この様式で作成された任意の転写物の５’−末端ヌクレオチドは、おそらく２’−ＯＨ Ｇである。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、なおさらに好ましくは１ｍＭである。転写反応物中にＰＥＧ、好ましくは、ＰＥＧ−８０００を含めることが、修飾されたヌクレオチドの最大の取り込みに有用であることもまた明らかになっている。
【００８９】
転写物の中への２’−ＯＭｅ ＡＴＰ（１００％）、２’−ＯＭｅ ＵＴＰ（１００％）、２’−ＯＭｅ ＣＴＰ（１００％）、および２’−ＯＭｅ ＧＴＰ（１００％）（「ＭＮＡ」）の最大の取り込みのためには、以下の条件を使用することができる：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ８ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．５ｍＭ、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（それぞれ）１．５ｍＭ、２’−ＯＨ ＧＭＰ、１ｍＭ（ｐＨ７．５）、Ｙ３６９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍｌ、およびＤＮＡ鋳型。いくつかの実施態様においては、ＤＮＡ鋳型は、好ましくは約５から５００ｎＭの濃度で存在し得る。必要に応じて、上記の転写条件と共に使用されるＤＮＡ鋳型には、両方の鋳型が同じ条件下で転写された場合に、そのようなリーダー配列が含まれていない鋳型と比較して転写量を増大させる、全てがプリンであるリーダー配列を含む。別の実施形態においては、リーダー配列は、プリンとピリミジンの混合物であり、これは、両方が同じ条件下で転写された場合に、そのようなリーダー配列が含まれていない鋳型と比較して転写量を増大させる。本明細書中で使用される場合は、１単位の無機ピロホスファターゼのは、ｐＨ７．２および２５℃で１分あたりに１．０モルの無機オルトリン酸塩を遊離させるであろう酵素の量として定義される。反応は、約１から２４時間行われ得る。
【００９０】
個々の場合において、転写産物は、その後、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスへの投入のために使用されて、所定の標的に対する結合特異性を有するアプタマーを同定することができる、および／または保存されている配列を決定することができる。得られる配列はすでに安定化させられており、それによってＳＥＬＥＸ（登録商標）後の修飾プロセスからこの工程が排除され、結果としてさらに高度に安定化させられたアプタマーが提供される。
【００９１】
以下に記載されるように、２’置換されたヌクレオチドが完全に取り込まれている転写物の有用な量は、上記に記載される条件以外の条件下でも得ることができる。例えば、上記の転写条件についてのバリエーションとしては以下が挙げられる：
ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度は０から１Ｍまでの範囲であり得る。本発明によってはまた、５から１０の間のｐＫａを有する他の緩衝物質（例えば、Ｔｒｉｓ−ヒドロキシメチル−アミノメタンを含む）の使用も意図される。
【００９２】
ＤＴＴ濃度は０から４００ｍＭの範囲であり得る。本発明の方法によってはまた、他の還元剤（例えば、メルカプトエタノールを含む）の使用も提供される。
【００９３】
スペルミジンおよび／またはスペルミン濃度は０から２０ｍＭの範囲であり得る。
【００９４】
ＰＥＧ−８０００濃度は、０から５０％（Ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法によってはまた、他の親水性ポリマー（例えば、他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールを含む）の使用も提供される。
【００９５】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００濃度は、０から０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法によってはまた、他の非イオン性界面活性剤（例えば、他のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ界面活性剤を含む他の界面活性剤）の使用も提供される。
【００９６】
ＭｇＣｌ_２濃度は、０．５ｍＭから５０ｍＭの範囲であり得る。ＭｎＣｌ_２濃度は、０．１５ｍＭから１５ｍＭの範囲であり得る。ＭｇＣｌ_２およびＭｎＣｌ_２はいずれも、記載される範囲で存在しなければならず、好ましい実施形態においては、約１０から約３のＭｇＣｌ_２：ＭｎＣｌ_２の割合で存在し、好ましくは、約３〜５：１の割合、より好ましくは約３〜４：１の割合である。
【００９７】
２’−ＯＭｅ ＮＴＰ濃度（各ＮＴＰ）は、５μＭから５ｍＭの範囲であり得る。
【００９８】
２’−ＯＨ ＧＴＰ濃度は、０μＭから３００μＭの範囲であり得る。好ましい実施形態においては、転写は、２’−ＯＨ ＧＴＰが存在しない（０μＭ）条件で起こる。
【００９９】
２’−ＯＨ ＧＭＰ、グアノシン、または２’糖位置以外の位置で置換された２’−ＯＨ Ｇの濃度は、０から５ｍＭの範囲であり得る。２’−ＯＨ ＧＴＰが反応に含まれない場合は、２’−ＯＨ ＧＭＰが必要であり、これは５μＭから５ｍＭの範囲であり得る。
【０１００】
ＤＮＡ鋳型濃度は、５ｎＭから５μＭの範囲であり得る。
【０１０１】
変異体ポリメラーゼ濃度は、２ｎＭから２０μＭの範囲であり得る。
【０１０２】
無機ピロホスファターゼは０から１００単位／ｍｌの範囲であり得る。
【０１０３】
ｐＨは、ｐＨ６からｐＨ９の範囲であり得る。本発明の方法は、修飾されたヌクレオチドを取り込むほとんどのポリメラーゼの活性のｐＨ範囲内で行うことができる。
【０１０４】
転写反応は約１時間から数週間、好ましくは、約１時間から約２４時間生じることができる。
【０１０５】
加えて、本発明の方法により、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＴＴを含む転写反応においてキレート剤の状況に応じた使用が提供される。
【０１０６】
ＴＥＲＭＩＮＡＬ ＲＥＧＩＯＮ ＳＥＬＥＸ（登録商標）法
いくつかの実施形態において鋳型特異的ヌクレオチド三リン酸の重合をプログラムするために使用される核酸転写鋳型配列の発見のための方法によっては、転写物量が増大させられ、これは、Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ＳＥＬＥＸ（登録商標）法（ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）法）として知られているＳＥＬＥＸ（登録商標）法の変異形式である。本発明によっては、核酸転写鋳型成分配列（例えば、リーダー配列）を同定するための方法が提供され、その使用によって、転写物量、具体的には、ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）法を使用する鋳型特異的重合をプログラムするために使用される場合には、２’−修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−ＯＭｅヌクレオチド）を含む転写物の量が増大する。
【０１０７】
２’−修飾されたヌクレオチドを含む転写物の量の増大を促進するリーダー配列を選択するために、オリゴヌクレオチド転写鋳型の候補のライブラリーが作成される。これには、鋳型依存性の様式での転写を可能にするプロモーター配列、添え木が当てられた連結を生じることができ、それによって、連結させられた鋳型上のプライマー結合部位に結合したプライマーの伸張による増幅を可能にするためのプロモーターのすぐ３’側にある１つ以上の固定されたヌクレオチドを含む第１の固定された領域；リーダー配列がそれから選択されるであろう縮重領域；および増幅を可能にするための３’末端に存在する固定された配列を含む。好ましい実施形態においては、ライブラリー鋳型の縮重領域は５’末端付近にあり、それによって５’固定された配列の長さが短くなる。
【０１０８】
転写鋳型のこのライブラリーは、必要に応じてＰＣＲ増幅させられ、その後、本明細書中に開示される条件下での、ポリメラーゼ（変異したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含むがこれに限定はされない）、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）（１つ以上の２’−修飾されたＮＴＰを含むがこれに限定はされない）、およびマグネシウムイオンを含む転写反応混合物を使用する転写を、プログラムするために使用される。得られる転写混合物は逆転写させられて、ｃＤＮＡはいの候補混合物が得られ、これはその後、Ｔ７プロモーターをコードするＤＮＡ配列に連結させられる。必要に応じて、得られる転写混合物は最初に連結させられ、その後、逆転写させられる。転写物をコードするｃＤＮＡは、その後、ＰＣＲによって増幅させられ、クローンが、ゲル分析を使用して転写量についてアッセイされる。この様式で増幅させられた転写鋳型は、必要に応じて、さらに多量の転写物を得る必要がある場合には、さらなる回のＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスを行うために使用することができる（図２を参照のこと）。
【０１０９】
増幅させられた転写物のクローンの配列を分析して、転写（１つ以上の２’−修飾されたヌクレオチドが取り込まれている転写を含むが、これに限定はされない）を可能にする５’−リーダー配列エレメントを同定することができる。これらの５’リーダー配列エレメントは、２’−修飾されたヌクレオチドを含む核酸転写物の量の増大を促進するためにＳＥＬＥＸ（登録商標）において使用することができるオリゴヌクレオチド転写鋳型の候補のライブラリーを設計するために有用である。ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）法によって同定された５’リーダー配列エレメント（下線で示される）が取り込まれており、そして、本明細書中に開示される条件を使用する２’−修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−ＯＭｅヌクレオチド）を含むより転写物の量のさらなる増大を促進する好ましいＤＮＡ転写鋳型のライブラリーの例が以下に記載される。
【０１１０】
以下に列挙されるＤＮＡ転写鋳型のライブラリーの配列のそれぞれについて、５’リーダー配列エレメントは下線で示され、そして全ての配列は、５’−３’方向である。
【０１１１】
【化５】

２’−修飾された（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物の転写混合物を、ポリメラーゼが２’−修飾されたＮＴＰを受け取る条件下で作成するために、Ｙ６３９Ｆ、Ｙ６３９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、またはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、本発明によって提供される方法によって同定された５’−リーダー配列とともに使用することができる。本発明の５’リーダー配列と共に使用される好ましいポリメラーゼは、２’−修飾されたヌクレオチドを含む最も多量の核酸転写物を提供する、先に記載されたＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ変異体ＲＮＡポリメラーゼである。本発明の５’−リーダー配列と共に使用される別の好ましいポリメラーゼは、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。他のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、具体的には、かさの大きい２’−置換に高い慣用性を示すものもまた、本発明において使用することができる。
【０１１２】
候補のライブラリーの中にリーダー配列を取り込ませること、および２’−修飾されたヌクレオチドを含む核酸転写物の量の増大を促進する変異体ポリメラーゼ（例えば、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４ＡおよびＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）に加えて、転写条件に重要であることが決定されている上記の多数の要因を使用して、２’−修飾されたヌクレオチドを含む転写物の量をさらに増大させることができる。
【０１１３】
同定されたリーダー配列と、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ、Ｙ６３９Ｌ／Ｋ３７８Ｒ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ８７４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ８７４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、またはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、２’−修飾されたヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰヌクレオチドの２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、および２’−ＮＨ_２修飾）の任意の組み合わせを含むアプタマーを作成するために、本明細書中に記載される条件と共にＳＥＬＥＸ（登録商標）において使用することができる。取り込まれている２’−修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。１つ以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むアプタマー組成物が好ましい。第１位のヌクレオチドを除き、１００％の２’−Ｏ−プリンおよびピリミジンを含むアプタマー組成物が好ましい。１つの好ましい実施形態においては、同定されたリーダー配列の１つと、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ８７４Ａ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ、Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ、またはＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｌ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、完全なる２’−ＯＭｅヌクレオチドを含むさらに多量のアプタマーの転写物を生じるために、本明細書中に記載される条件と共にＳＥＬＥＸ（登録商標）法において使用される。
【０１１４】
転写物への２’−ＯＭｅ ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）、およびＧＴＰ（１００％）（ＭＮＡ）の最大の取り込みのためには、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ_２ ８ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．５ｍＭ、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（それぞれ）１．５ｍＭ、２’−ＯＨ ＧＭＰ １ｍＭ（ｐＨ７．５）、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ２００ｎＭ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍｌ、および誘導される転写条件下で転写量を増大させるリーダー配列。１つの実施形態においては、リーダー配列は、全てがプリンであるリーダー配列である。別の実施形態においては、リーダー配列は、プリンとピリミジンの混合物である。本明細書中で使用される場合は、１単位の無機ピロホスファターゼは、ｐＨ７．２および２５℃で１分あたりに１．０モルの無機オルトリン酸塩を遊離させるであろう酵素の量として定義される。
【０１１５】
アプタマーの医薬品化学
一旦、所望される標的に結合するアプタマーが同定されると、いくつかの技術を、必要に応じて、同定されたアプタマーの配列の結合特性および／または機能的特性をさらに高めるために行うことができる。ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセス（例えば、２’−修飾されたＳＥＬＥＸ（登録商標）法）によって同定された所望される標的に結合するアプタマー（例えば、ＭＮＡアプタマー）は、所望される結合特性および／または機能的特性を有する最小のアプタマー配列（本明細書中では「最小化された構築物」とも呼ばれる）を得るために、必要に応じて短縮させることができる。これを行うための１つの方法は、折り畳みプログラムおよび配列分析（例えば、保存されているモチーフおよび／または共変動を見るための選択によって得られるクローン配列をアラインメントすること）を使用して、最小化させた構築物の設計についての情報を得ることによる。生化学的プローブ実験もまた、最小化された構築物の設計についての情報を得るために、アプタマー配列の５’境界および３’境界を決定するために行うことができる。最小化された構築物は、その後、化学合成することができ、そしてそれらが由来する最小化されていない配列と比較して、結合特性および機能的特性について試験される。５’、３’、および／または内部欠失のシリーズを含むアプタマー配列の変異体もまた、直接化学的に合成することができ、それらが由来する最小化されていないアプタマー配列と比較して、結合特性および／または機能的特性について試験される。
【０１１６】
加えて、ドープされた（ｄｏｐｅｄ）再選択が、ＭＮＡアプタマーのような１つの活性のあるアプタマー配列（例えば、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセス（２’−修飾されたＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスを含む）によって同定された、所望される標的に結合するアプタマー）、または１つの最小化されたアプタマー配列の中での配列要件を研究するために使用される場合がある。ドープされた再選択は、目的の１つの配列に基づいて設計された合成の縮重プールを使用して行われる。縮重のレベルは、通常、野生型のヌクレオチド（すなわち、目的の１つの配列）とは７０％から８５％異なる。一般的には、自然界での変異を有する配列は、ドープされた再選択プロセスによって同定されるが、いくつかの場合には、配列の変化は親和性の改善を生じる。ドープされた再選択を使用して同定されたクローンによる複合配列情報は、次いで、最小結合モチーフを同定するために使用することができ、そして医薬品化学の研究を助けることができる。
【０１１７】
ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセス（２’−修飾されたＳＥＬＥＸプロセスおよびドープされた再選択を含む）を使用して同定されたアプタマー配列（例えば、ＭＮＡアプタマー）、および／または最小化されたアプタマー配列もまた、結合親和性および／または機能的特性を高めるための配列のランダム変異誘発または特異的変異誘発を行うため、あるいは、配列中のどの位置が結合活性および／または機能的特性に不可欠であるかを決定するために、アプタマーの医薬品化学（Ａｐｔｅｒｍｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を使用する、必要に応じて修飾されたＳＥＬＥＸ（登録商標）選択であり得る。
【０１１８】
アプタマーの医薬品化学はアプタマー改良技術であり、ここでは、変異体アプタマーのセットが化学合成される。これらの変異体のセットは、通常、１つの置換の導入によってもとのアプタマーとは異なり、そして、この置換の位置によって互いに異なる。その後、これらの変異体は互いに、そしてもとのものと比較される。特性の改良は、１つの置換を含めることが、特定の治療基準を満たすために必要なことの全てであり得ることが十分に確信される。
【０１１９】
あるいは、１変異体のセットから集められた情報は、１つ以上の置換が同時に導入された、変異体の更なるセットを設計するために使用することができる。１つの設計ストラテジーにおいては、１置換変異体は全て順位化され、上位の４つが選択され、これらの４つの１置換変異体の可能な二重（６種類）、三重（４種類）、および四重（１種類）の組み合わせ全てが合成され、アッセイされる。第２の設計ストラテジーにおいては、最上位の１置換変異体が新しい親と見なされ、この最高位に順位化された１置換変異体を含む、全ての可能な二重置換変異体が合成され、アッセイされる。他のストラテジーが使用される場合もあり、そしてこれらのストラテジーは、さらに改良された変異体が同定されることが続けられつつ、置換の数が段階的に増えるように繰り返して適用することができる。
【０１２０】
アプタマーの医薬品化学は、具体的には、置換の広範囲ではなく局所への導入を研究するための方法として使用され得る。アプタマーは、転写によって作成されるライブラリーの中で発見されるので、ＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスの間に導入される任意の置換は広範囲に導入されなければならない。例えば、ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を導入することが所望される場合には、これらは、全てのＡにだけ（または全てのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）導入することができる（広範囲で置換される）。いくつかのＡ（またはいくつかのＧ、Ｃ、Ｔ、Ｕなど）にホスホロチオエートを必要とする（局所的に置換された）が、他のＡではこれを寛容化できないアプタマーは、このプロセスによって容易に発見することができる。
【０１２１】
アプタマーの医薬品化学プロセスによって利用することができる置換基の種類は、固相合成試薬としてそれらを作成し、そしてそれらをオリゴマー合成スキームに導入する能力によってのみ、制限される。このプロセスは、必ずしもヌクレオチドのみに限定されない。アプタマーの医薬品化学のスキームには、立体的大きさ、疎水性、親水性、親油性、疎油性、正電荷、負電荷、中性電荷、双性イオン、極性、ヌクレアーゼ耐性、立体構造の剛性、立体構造の可撓性、タンパク質結合特性、質量などを導入する置換が含まれ得る。アプタマーの医薬品化学のスキームには、塩基修飾、糖修飾、またはホスホジエステル結合修飾を含む場合がある。
【０１２２】
治療用のアプタマーの状況で有用であろう置換基の種類を考える場合には、以下のカテゴリーの１つ以上に入る置換基を導入することが所望され得る：
（１）体内にすでに存在している置換基、例えば、２’−でオキシ、２’−リボ、２’−メチルプリンもしくはピリミジン、または５−メチルシトシン。
【０１２３】
（２）承認されている治療薬のすでに一部である置換基、例えば、ホスホロチオエート結合させられたオリゴヌクレオチド。
【０１２４】
（３）上記の２つのカテゴリーの１つになるように加水分解されるかまたは分解される置換基、例えば、メチルホスホネート結合させられたオリゴヌクレオチド。
【０１２５】
（４）本発明のアプタマーには、本明細書中に記載されるアプタマーの医薬品化学によって開発されたアプタマーを含む。
【０１２６】
本発明のアプタマーの標的結合親和性は、アプタマーと標的（例えば、タンパク質）との間での一連の結合反応によって評価することができる。この場合、微量のＰ^３２−標識されたアプタマーが、緩衝化させられた媒体の中の標的の稀釈系列とともにインキュベートされ、その後、減圧濾過連結管を使用するニトロセルロース濾過によって分析される。本明細書中でドットブロット結合アッセイと記載されるこの方法では、（上から下に向かって）ニトロセルロース、ナイロンフィルター、およびゲルブロット紙からなる３層の濾過媒体が使用される。標的に結合したＲＮＡはニトロセルロースフィルター上に捕捉され、一方、標的に結合していないＲＮＡはナイロンフィルター上に捕捉される。ゲルブロット紙は、他のフィルターについての支持媒体として含まれる。濾過後、フィルター層は分離され、乾燥させられ、蛍光スクリーンに感光させられ、そしてｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇシステムを使用してそれから定量される。定量された結果は、アプタマー結合曲線を作成するために使用することができ、これから解離定数（Ｋ_Ｄ）を計算することができる。好ましい実施形態においては、結合反応を行うために使用される緩衝化された媒体は、１×ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）ＰＢＳ（Ｃａ^＋＋とＭｇ^＋＋を含む）と０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡである。
【０１２７】
一般的には、標的の機能的活性を調節するアプタマーの能力（すなわち、アプタマーの機能的活性）は、インビトロおよびインビボのモデルを使用して評価することができる。これらのモデルは、標的の生物学的機能に応じて様々であろう。いくつかの実施形態においては、本発明のアプタマーは、標的の公知の生物学的機能を阻害する場合があり、一方、他の実施形態においては、本発明のアプタマーは、標的の公知の生物学的活性を刺激する場合もある。本発明のアプタマーの機能的活性は、アプタマー標的の公知の機能を測定するために設計されたインビトロおよびインビボでのモデルを使用して評価することができる。
【０１２８】
本発明のアプタマーは、当業者によって使用される多数の技術にしたがって診断目的のために、日常的に行われているように適応させることができる。診断的利用には、インビボまたはインビトロでの診断用途の両方が含まれ得る。使用者が、特定の位置または濃度で所定の標的の存在を同定できるようにするための診断薬だけが必要である。単に、標的との結合対を形成する能力だけで、診断目的のためのポジティブシグナルを誘発するには十分である場合がある。当業者は、当該分野で公知の手順によって、そのようなリガンドの存在を追跡するための標識タグを取り込むように、任意のアプタマーを適応させることもできるであろう。このようなタグは、多数の診断手順において使用することができる。
【０１２９】
免疫刺激モチーフを有するアプタマー
脊椎動物の免疫システムによる細菌のＤＮＡの認識は、特定の配列の状況の中のメチル化されていないＣＧヌクレオチド（「ＣｐＧモチーフ」）の認識に基づく。このようなモチーフを認識する１つの受容体はＴｏｌｌ様受容体９（「ＴＬＲ９」）であり、これは、異なる微生物成分を認識することによって先天性免疫応答に関与しているＴｏｌｌ様受容体のファミリー（およそ１０種類のメンバー）のうちの１つのメンバーである。ＴＬＲ９は、配列特異的様式で、メチル化されていないオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）ＣｐＧ配列に結合する。ＣｐＧモチーフの認識によって防御機構が始動させられ、これによって、先天性免疫応答と究極の後天性免疫応答が導かれる。例えば、マウスでのＴＬＲ９の活性化によっては、抗原提示細胞の活性化、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子のアップレギュレーション、ならびに、重要な共刺激分子およびサイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−２３を含む）の発現が誘導される。この活性化によっては、Ｂ細胞応答とＴ細胞応答が、直接的にも、そして間接的にも高められ、これには、ＴＨ１サイトカインＩＦＮ−γの活発なアップレギュレーションを含む。まとめると、ＣｐＧ配列に対する応答によっては、感染性疾患に対する防御、ワクチンに対する改善された免疫応答、喘息に対する有効な応答、および改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性が導かれる。したがって、ＣｐＧ ＯＤＮは、感染性疾患に対する防御、免疫アジュバントまたはガン治療薬（単剤療法、またはｍＡｂもしくは他の治療薬との組み合わせ）としての機能を提供することができ、そして、喘息およびアレルギー性の反応を軽減することができる。
【０１３０】
本発明のアプタマー（例えば、ＭＮＡアプタマー）には、１つ以上のＣｐＧ、または他の免疫刺激配列を含む場合がある。このようなアプタマーは、例えば、本明細書中に記載されるＳＥＬＥＸ（登録商標）プロセスを使用して、様々なストラテジーによって同定または作成することができる。一般的には、これらのストラテジーは２つのグループに分けることができる。グループ１においては、ストラテジーは、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列、ならびに標的に対する結合部位の両方を含むアプタマーを同定または作成することに関する。この場合、標的（本明細書中以後、「非ＣｐＧ標的」と呼ばれる）は、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列を認識することが知られているもの以外の標的であり、ＣｐＧモチーフに結合すると免疫応答を刺激することが公知である。
このグループの第１のストラテジーには、オリゴヌクレオチドのプールを使用してＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、特異的な非ＣｐＧ標的に対するアプタマーを得る工程（この場合、ＣｐＧモチーフは、固定された領域として、またはその一部として、プールの個々のメンバーの中に取り込まれており、例えば、いくつかの実施形態においては、プールのメンバーのランダマイズされた領域にはその中にＣｐＧモチーフが取り込まれている固定された領域を含む）、ならびに、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第２のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、特異的な非ＣｐＧ標的（好ましくは、標的）に対するアプタマーを得、続いて、ＣｐＧモチーフの５’および／または３’末端への付加、あるいは、アプタマーの１つの領域（好ましくは、必須ではない領域）の中へのＣｐＧモチーフの操作の選択を含む。このグループの第３のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、特異的な非ＣｐＧ標的に対するアプタマーを得る工程（この場合、プールの合成の間に、様々なヌクレオチドのモル比が１つ以上のヌクレオチドの付加において偏らせられ、その結果、プールの個々のメンバーのランダマイズされた領域はＣｐＧモチーフについて富化させられる）、ならびに、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第４のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、特異的な非ＣｐＧ標的に対するアプタマーを得る工程、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第５のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、特異的な非ＣｐＧ標的に対するアプタマーを得る工程と、結合すると免疫応答を刺激するが、ＣｐＧモチーフが含まれていないアプタマーを同定する工程を含む。
【０１３１】
グループ２においては、ストラテジーは、ＣｐＧモチーフおよび／またはＣｐＧモチーフの受容体（例えば、ＴＬＲ９、または他のｔｏｌｌ様受容体）が結合する他の配列が含まれており、結合すると免疫応答を刺激するアプタマーを同定または作成することに関する。このグループの第１のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合し、そして結合すると、オリゴヌクレオチドのプールを使用して免疫応答を刺激することが公知である、標的に対するアプタマーを得る工程（この場合は、ＣｐＧモチーフは、固定された領域として、またはその一部として、プールの個々のメンバーの中に取り込まれており、例えば、いくつかの実施形態においては、プールのメンバーのランダマイズされた領域にはその中にＣｐＧモチーフが取り込まれている固定された領域を含む）、ならびに、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第２のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合し、そして結合すると免疫応答を刺激し、その後、ＣｐＧモチーフをアプタマーの１つの領域（好ましくは、必須ではない領域）の５’末端および／または３’末端に付加するか、あるいはＣｐＧモチーフをその領域の中に操作することが公知である、標的に対するアプタマーを得る工程を含む。このグループの第３のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合し、そして結合すると免疫応答を刺激することが公知である、標的に対するアプタマーを得る工程（この場合、プールの合成の間に、様々なヌクレオチドのモル比が１つ以上のヌクレオチドの付加において偏らせられ、その結果、プールの個々のメンバーのランダマイズされた領域はＣｐＧモチーフの中で富化させられる）、ならびに、ＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第４のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、特異的なＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合し、そして結合すると免疫応答を刺激することが公知である、標的に対するアプタマーを得る工程、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定する工程を含む。このグループの第５のストラテジーには、ＳＥＬＥＸ（登録商標）を行って、ＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激配列に結合することが公知である、標的に対するアプタマーを得る工程、および結合すると免疫応答を刺激するが、ＣｐＧモチーフが含まれていないアプタマーを同定する工程を含む。
【０１３２】
ＣｐＧモチーフの多種多様なクラスが同定されており、それぞれが、複数の事象の様々なカスケードにおいて認識されると、サイトカインおよび他の分子の放出、ならびに特定の細胞のタイプの活性化を生じる。例えば、ＣｐＧ Ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，２０：７０９−７６０（引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。さらなる免疫刺激モチーフは、以下の米国特許に開示されており、これらのそれぞれは引用により本明細書中に組み入れられる：米国特許第６，２０７，６４６号；同第６，２３９，１１６号；同第６，４２９，１９９号；同第６，２１４，８０６号；同第６，６５３，２９２号；同第６，４２６，４３４号；同第６，５１４，９４８号；および同第６，４９８，１４８号。これらのＣｐＧまたは他の免疫刺激モチーフのうちの任意のものを、アプタマーに取り込ませることができる。アプタマーの選択は、処置される疾患または障害に応じて様々である。好ましい免疫刺激モチーフは以下であり（左から右に５’から３’方向で示される）、式中、「ｒ」はプリンを示し、「ｙ」はピリミジンを示し、そして「Ｘ」は任意のヌクレオチドを示す：ＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧ（配列番号１３６）；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＣＧＴ、ｒＣＧｙ；ｒｒＣＧｙｙ、ＸＣＧＸ、ＸＸＣＧＸＸ、およびＸ_１Ｘ_２ＣＧＹ_１Ｙ_２（式中、Ｘ_１はＧまたはＡであり、Ｘ_２はＣではなく、Ｙ_１はＧではなく、そしてＹ_２は好ましくはＴである）。
【０１３３】
ＣｐＧモチーフが、ＣｐＧモチーフに結合し、結合すると免疫応答を刺激することが公知である標的以外の特異的標的（「非ＣｐＧ標的」）に結合するアプタマーに取り込まれている場合には、ＣｐＧは、好ましくは、アプタマーの必須ではない領域に存在する。アプタマーの必須ではない領域は、部位特異的変異誘発、欠失分析、および／または置換分析によって同定することができる。しかし、非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力を有意には妨害しない任意の位置が使用される場合がある。アプタマー配列の中に埋め込まれていることに加えて、ＣｐＧモチーフは、アプタマーの５’末端および３’末端のいずれかまたは両方に付加させることができ、あるいは、別の方法でアプタマーに結合させることもできる。任意の結合位置または手段を、非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力がそれにより有意に妨害されない限りは、使用することができる。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合は、「免疫応答の刺激」は、（１）特異的応答の誘導（例えば、Ｔｈ１応答の誘導）または特定の分子の生産の誘導、あるいは（２）特異的応答もしくは特定の分子の阻害もしくは抑制（例えば、Ｔｈ２応答の阻害もしくは抑制）のいずれかを意味することができる。
【０１３５】
アプタマー治療薬の薬物動態および生体分布の調節
オリゴヌクレオチドをベースとする全ての治療薬（アプタマーを含む）の薬物動態特性を、所望される薬学的用途に適合するように合わせられることが重要である。細胞外標的に特異的なアプタマーは、細胞内送達に伴う問題に悩まされることはない（アンチセンスおよびＲＮＡｉをベースとする治療薬が用いられる場合と同様に）が、そのようなアプタマーは、なおも標的の臓器および組織に分布されることが可能でなければならず、そして所望される投与レジュメと一致する時間の間、体内に留まらなければならない（未修飾で）。
【０１３６】
したがって、本発明により、アプタマー組成物の薬物動態、具体的には、アプタマーの薬物動態を調整する能力に影響を与える材料および方法が提供される。アプタマーの薬物動態の調整能力（すなわち、それを調整する能力）は、アプタマーへの修飾部分（例えば、ＰＥＧポリマー）の結合、および／または修飾されたヌクレオチド（例えば、２’−フルオロもしくは２’−Ｏ−メチル）の取り込みによって行われて、核酸の化学的組成が変化させられる。アプタマーの薬物動態を調整する能力は、既存の治療的用途の改善において、あるいは、新しい治療的用途の開発において使用される。例えば、いくつかの治療的用途において、例えば、迅速な薬物のクリアランスまたは遮断が望まれる場合がある、抗新生物または救急処置の設定においては、循環中でのアプタマーの滞留時間を短くすることが望まれる。あるいは、他の治療的用途、例えば、治療薬の全身的循環が所望される維持療法においては、循環中でのアプタマーの滞留時間を長くすることが所望される場合がある。
【０１３７】
加えて、アプタマーの薬物動態の調整能力は、被験体の中でのアプタマー治療薬の生体分布を改善するために使用される。例えば、いくつかの治療的用途においては、特定のタイプの組織または特異的器官（または器官のセット）を標的化させるために、アプタマー治療薬の生体分布を変化させることが所望される場合がある。これらの用途においては、アプタマー治療薬は、特異的組織または器官（単数または複数）に優先的に蓄積する。他の治療的用途においては、所定の疾患、細胞の損傷、もしくは他の異常な病状を伴う、細胞マーカーまたは症状を示している組織に対して標的化させられることが所望される場合があり、その結果、アプタマー治療薬は、罹患した組織の中に優先的に蓄積する。例えば、２００４年３月５日に提出された、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｔａｍｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題された米国仮特許出願番号６０／５５０７９０、および２００５年３月７日に提出された、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｔａｍｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題された米国特許出願番号１０／−−−，−−−に記載されているように、アプタマー治療薬のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａのＰＥＧポリマーでのＰＥＧ化）は、炎症をおこしている組織を標的化するために使用され、その結果、ＰＥＧ化されたアプタマー治療薬は、炎症を起こしている組織の中に優先的に蓄積する。
【０１３８】
アプタマー治療薬（例えば、アプタマー結合体または化学的性質が変化させられたアプタマー、例えば、修飾されたヌクレオチド）の薬物動態および生体分布プロフィールを決定するためには、様々なパラメーターがモニターされる。このようなパラメーターとしては、例えば、アプタマー組成物の半減期（ｔ_１／２）、血漿クリアランス（Ｃ１）、分布量（Ｖｓｓ）、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、観察される最大の血清濃度または血漿濃度（Ｃ_ｍａｘ）、および平均滞留時間（ＭＲＴ）が挙げられる。本明細書中で使用される場合は、用語「ＡＵＣ」は、アプタマーの投与後の時間に対するアプタマー治療薬の血漿濃度のプロットの下の面積を意味する。ＡＵＣ値は、所定のアプタマー治療薬の生体利用性（すなわち、アプタマー投与後に循環の中にある投与されたアプタマー治療薬の割合）および／または総クリアランス（Ｃ１）（すなわち、アプタマー治療薬が循環から除去される速度）を推測するために使用される。分布量は、体内に存在しているアプタマーの量に対するアプタマー治療薬の血漿濃度に関係する。Ｖｓｓが大きければ大きいほど、より多量のアプタマーが血漿の外側で見られる（すなわち、管外遊出がより多い）。
【０１３９】
本発明により、インビボでの安定化させられたアプタマー組成物（例えば、ＭＮＡアプタマー）の薬物動態および生体分布を、アプタマー（例えば、ＭＮＡアプタマー）を調節部分（例えば、低分子、ペプチド、またはポリマーの末端基）に結合させることによって、あるいは、アプタマーの中に修飾されたヌクレオチドを取り込ませることによって、制御された様式で調節するための材料と方法が提供される。本明細書中に記載されるように、修飾部分の結合、および／またはヌクレオチド（単数または複数）の化学的組成を変化させることによって、循環の中でのアプタマーの滞留時間、および組織への分布の基本となる態様が変化させられる。
【０１４０】
ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療薬は、腎臓濾過による排除の対象である。このように、濾過をブロックすることはできない限りは、静脈内に投与されたヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、通常、＜１０分のインビボでの半減期を示す。これには、血流から組織への迅速な分布を促進すること、または糸球体の有効なサイズカットオフを上回るようにオリゴヌクレオチドのみかけの分子量を大きくすることのいずれかによって行うことができる。以下に記載されるＰＥＧポリマーに対する小さい治療薬の結合（ＰＥＧ化）によっては、循環の中でのアプタマーの滞留時間を劇的に長くすることができ、それによって、投与頻度を減少させ、そして血管標的に対する有効性を高めることができる。
【０１４１】
アプタマーは、様々な修飾部分、例えば、高分子量のポリマー（例えば、ＰＥＧ；ペプチド（例えば、Ｔａｔ（ＨＩＶ ＴＡｔタンパク質の１３アミノ酸の断片（Ｖｉｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７））、Ａｎｔ（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ホメオチックタンパク質の第３のヘリックスに由来する１６アミノ酸の配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９（１１−１２）：１３９７−４０５））、およびＡｒｇ_７（ポリアルギニン（Ａｒｇ_７）から構成される、短い、正電荷を有する細胞に浸透するペプチド（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊら、（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８）））；ならびに、低分子（例えば、親油性化合物（例えば、コレステロール））に結合させることができる。本明細書中に記載される様々な結合体の間でも、アプタマーのインビボでの特性は、ＰＥＧ基との複合体形成によって、最も大きく変化させられる。例えば、２’Ｆ修飾と２’−ＯＭｅ修飾が混合されているアプタマー治療薬の２０ｋＤａのＰＥＧポリマーとの複合体形成によって、腎臓濾過が邪魔され、そして健常な組織と炎症を起こしている組織の両方に対するアプタマーの分布が促進される。さらに、２０ｋＤａのＰＥＧポリマー−アプタマー結合体は、アプタマーの腎臓濾過を防ぐことにおいて、４０ｋＤａのＰＥＧポリマーとほぼ同等に有効であることが明らかにされている。ＰＥＧ化の１つの効果は、アプタマーのクリアランスに対する効果であるが、２０ｋＤａ部分の存在によって与えられた全身暴露の延長もまた、組織、特に、高度にかん流された器官の組織、および炎症を起こしている部位の組織へのアプタマーの分布を促進する。アプタマー−２０ｋＤａのＰＥＧポリマー結合体は、炎症の部位へのアプタマーの分布を指示し、その結果、ＰＥＧ化されたアプタマーは、炎症を起こしている組織に優先的に蓄積する。いくつかの場合には、２０ｋＤａのＰＥＧ化されたアプタマー結合体は、細胞（例えば、腎臓細胞）の内部に接近することができる。
【０１４２】
修飾されたヌクレオチドはまた、アプタマーの血漿クリアランスを調節するためにも使用することができる。例えば、２’−Ｆと２’−ＯＭｅの両方を安定化させる化学的特性が取り込ませられた結合していないアプタマー（これは、インビトロおよびインビボで高度なヌクレアーゼ安定性を示すので、現在のアプタマーの典型である）は、未修飾のアプタマーと比較すると、血漿からの迅速な消滅（すなわち、迅速な血漿クリアランス）と、組織内（主に、腎臓内）への迅速な分布を示す。
【０１４３】
ＰＥＧ誘導核酸
上記のように、高分子量の非免疫原性ポリマーでの核酸の誘導には、核酸の薬物動態特性および薬力学的特性を変化させて、それらをさらに有効な治療薬とする可能性がある。活性についての好ましい変化としては、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性の増大、腎臓による濾過の減少、免疫システムへの暴露の減少、および体全体への治療薬の分布の変化を挙げることができる。
【０１４４】
本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）部分を用いて誘導することができる。ＰＡＧ誘導核酸の例は、２００３年１１月２１日に提出された米国特許出願番号１０／７１８，８３３に見られる。これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる。本発明で使用される典型的なポリマーとしては、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）が挙げられ、これは、ポリエチレンオキサイド（「ＰＥＯ」）およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）としても知られている。さらに、様々なアルキレンオキサイド（例えば、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド）のランダムコポリマーまたはブロックコポリマーを、多くの用途において使用することができる。その最も一般的な形態では、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）は、ヒドロキシル基でそれぞれの末端が終わる直鎖状ポリマーである：ＨＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＯＨ。このポリマー、α−、ω−ジヒドロキシポリエチレングリコールもまた、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして提示され、ここでは、ＰＥＧ−の記号は以下の構造単位：−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２−を示し、式中、ｎは、通常は、約４から約１０，０００の範囲である。
【０１４５】
示されるように、ＰＥＧ分子は二官能性であり、しばしば「ＰＥＧジオール」と呼ばれる。ＰＥＧ分子の末端部分は、比較的非反応性であるヒドロキシル部分（−ＯＨ基）であり、これは、他の化合物に対してその化合物の反応性部分にＰＥＧを結合させるために、活性化させることも、または官能性部分に変換させることもできる。このような活性化させられたＰＥＧジオールは、本明細書中ではニ活性化ＰＥＧと呼ばれる。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、比較的非反応性であるヒドロキシル部分（−ＯＨ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドに由来するスクシンイミジル活性エステル部分での置換によって、アミノ部分との選択的反応のために、活性のあるカルボン酸エステルとして官能化させられている。
【０１４６】
多くの用途においては、原則的に非反応性である部分でＰＥＧ分子の一方の末端をキャップすることが所望され、その結果、ＰＥＧ分子は一官能性（またはモノ活性化される）となる。活性化されたＰＥＧに対して通常は複数の反応部位を示すタンパク質治療薬の場合には、二官能性の活性化させられたＰＥＧによって、広範囲の架橋が導かれ、それによって得られる機能性凝集物の量は少ない。一活性化ＰＥＧを作成するためには、ＰＥＧジオールの末端上の１つのヒドロキシル部分が、通常は、非反応性メトキシ末端部分（−ＯＣＨ_３）で置換される。他方、ＰＥＧ分子のキャップされていない末端は、通常、反応性末端部分になるように変換され、これは、タンパク質のような分子の表面上の反応性部位への結合のために活性化させることができる。
【０１４７】
ＰＡＧは、水および多くの有機溶媒の中での可溶性、毒性がない、および免疫原性がないという特性を通常有しているポリマーである。ＰＡＧの１つの用途は、不溶性分子に対してポリマーを共有結合させて、得られるＰＡＧ−分子「結合体」を可溶性にすることである。例えば、水不溶性の薬物であるパクリタキセルは、ＰＥＧに結合させられると水溶性になることが示されている。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧ結合体は、多くの場合は、可溶性および安定性を高めるためのみならず、分子の血液循環半減期を長くするためにも使用される。
【０１４８】
本発明のポリアルキル化化合物は、通常、５から８０ｋＤａの間の大きさであるが、任意の大きさを使用することができ、選択は、アプタマーと用途に応じて様々である。本発明の他のＰＡＧ化合物は、１０から８０ｋＤａの間の大きさである。本発明のなお他のＰＡＧ化合物は、１０から６０ｋＤａの間の大きさである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤａの大きさであり得る。このようなポリマーは、直鎖状であっても、また、分岐していてもよい。いくつかの実施形態においては、ポリマーはＰＥＧである。
【０１４９】
生物学的に発現させられたタンパク質治療薬とは対照的に、核酸治療薬は通常、活性化させられたモノマーヌクレオチドから化学合成される。ＰＥＧ−核酸結合体は、同じ繰り返しによるモノマー合成を使用してＰＥＧを取り込ませることによって調製することができる。例えば、ホスホルアミダイトの形態へと変換させられることにより活性化させられたＰＥＧを、固相オリゴヌクレオチド合成に組み込ませることができる。あるいは、オリゴヌクレオチドの合成は、反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的取り込みを用いて完了することができる。最も一般的には、これには、５’末端での遊離の第１級アミンの付加が伴う（固相合成の最後のカップリング工程において修飾因子を使用してホスホルアミダイトが取り込まれる）。このアプローチを使用して、反応性ＰＥＧ（例えば、アミンと反応し、結合を形成するように活性化させられたもの）が、精製されたオリゴヌクレオチドと混合され、そしてカップリング反応が溶液中で行われる。
【０１５０】
治療薬の生体分布を変化させるＰＥＧ結合体の能力は、（例えば、流体力学半径について測定された）結合体の見かけの大きさを含む多数の要因に関係する。より大きい結合体（＞１０ｋＤａ）は、腎臓による濾過をより効率よくブロックすること、そして結果として、小さい高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を長くすることが公知である。濾過をブロックするＰＥＧ結合体の能力が、およそ５０ｋＤａまでの大きさ（半減期は腎臓による排除ではなく、マクロファージによって媒介される代謝によって定義されるので、さらなる増大によっては最小の有益な効果しかない）のＰＥＧを用いた場合に高まることが示されている。
【０１５１】
高分子量のＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の生産は難しく、非効率的であり、そして高価であり得る。高分子量のＰＥＧ−核酸結合体の合成のための経路として、これまでの研究では、高分子量の活性化ＰＥＧの作成に集中している。このような分子を作成するための１つの方法には、分岐している活性化ＰＥＧの形成が含まれ、その中では、２つ以上のＰＥＧが活性化させられた基を有する中心のコアに結合させられている。これらの高分子量のＰＥＧ分子の末端部分（すなわち、比較的非反応性であるヒドロキシル（−ＯＨ）部分）は、他の化合物へのその化合物の反応部位での１つ以上のＰＥＧの結合のために、活性化させることも、また官能性部分になるように変換することもできる。分岐している活性化ＰＥＧは２つ以上の末端を有する場合があり、そして、２つ以上の末端が活性化されている場合には、そのような活性化させられた高分子量ＰＥＧ分子は、本明細書中では、マルチ活性化ＰＥＧ（ｍｕｌｔｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＥＧ）と呼ばれる。いくつかの場合には、分岐しているＰＥＧ分子の中の全てではない末端が活性化させられる。分岐しているＰＥＧ分子の任意の２つの末端が活性化させられている場合には、そのようなＰＥＧ分子は、ニ活性化ＰＥＧと呼ばれる。分岐しているＰＥＧ分子の１つの末端だけが活性化させられているいくつかの場合には、そのようなＰＥＧ分子は一活性化と呼ばれる。このアプローチの一例として、リジンコアに対する２つのモノメトキシＰＥＧの結合によって調製された活性化ＰＥＧ（これは続いて、反応のために活性化させられる）が記載されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ 第２巻：２１４−２２１，２００３）。
【０１５２】
本発明によって、マルチＰＥＧ化核酸を含む高分子量のＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）結合体の合成のための別のコスト効果の高い経路が提供される。本発明にはまた、ＰＥＧ結合多量体オリゴヌクレオチド（例えば、二量体アプタマー）も含まれる。本発明はまた高分子量の組成物にも関し、ここでは、ＰＥＧ安定化部分は、アプタマーの様々な部分を分けるリンカーである。例えば、ＰＥＧは、１つのアプタマー配列の中に結合させられ、その結果、高分子量のアプタマー組成物の直鎖状の並びは、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸（−ＰＥＧ−核酸）_ｎであり、式中、ｎは１以上である。
【０１５３】
本発明の高分子量の組成物には、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものを含む。組成物は通常は、１０から８０ｋＤａの間の大きさの分子量を有する。本発明の高分子量の組成物は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤａの大きさである。
【０１５４】
安定化部分は、本発明の高分子量のアプタマー組成物の薬物動態特性および薬力学特性を改善する分子または分子の一部である。いくつかの場合には、安定化部分は、２つ以上のアプタマーもしくはアプタマードメインを本発明の高分子量のアプタマー組成物の近くにもたらすか、または本発明の高分子量のアプタマー組成物の全体的な回転の自由度の低下を提供する分子または分子の一部である。安定化部分は、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）（これは、直鎖状であっても、分岐していてもよい）、ホモポリマー、またはヘテロポリマーであり得る。他の安定化部分としては、ポリマー（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））が挙げられる。オリゴヌクレオチドもまた安定化部分であり得る。そのようなオリゴヌクレオチドとしては、修飾されたヌクレオチド、および／または修飾された結合（例えば、ホスホロチオエート）を挙げることができる。安定化部分は、アプタマー組成物の欠くことができない部分であり得、すなわち、これはアプタマーに共有結合させられる。
【０１５５】
本発明の組成物には、高分子量のアプタマー組成物が含まれ、その中では、２つ以上の核酸部分が少なくとも１つのポリアルキレングリコール部分に共有結合させられる。ポリアルキレングリコール部分は安定化部分としての役割を果たす。ポリアルキレングリコール部分がアプタマーのいずれかの末端に共有結合させられており、その結果、ポリアルキレングリコールが１つの分子の中で複数の核酸部分を結合させている組成物においては、ポリアルキレングリコールは連結部分と言われる。このような組成物においては、共有分子の一次構造には、直鎖状の並びの核酸−ＰＡＧ−核酸を含む。１つの例は、核酸−ＰＥＧ−核酸の一次構造を有する組成物である。別の例は、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸の直鎖状の配置である。
【０１５６】
核酸−ＰＥＧ−核酸結合体を生産するためには、１つの反応性部位（例えば、これは、一活性化させられている）を有するように核酸が最初に合成される。好ましい実施形態においては、この反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成の最後の工程として、修飾因子であるホスホルアミダイトの付加によって５’末端に導入されたアミノ基である。修飾されたオリゴヌクレオチドの脱保護および精製の後、これは、溶液中に高濃度（これは活性化させられたＰＥＧの自発的な加水分解を最小にする）で再構成される。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、そして再構成された溶液には２００ｍＭのＮａＨＣＯ_３−緩衝液（ｐＨ８．３）を含む。結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧのゆっくりとした段階的付加によって開始される。好ましい実施形態においては、ＰＥＧジオールは、プロピオン酸スクシンイミジルでの誘導によって両方の末端で活性化させられる（ニ活性化させられる）。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体は、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製されて、完全に結合した種、部分的に結合した種、および未結合の種が分離される。連結された複数のＰＡＧ分子（例えば、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーとして）、または小さいＰＡＧ鎖を連結させて、様々な長さ（または分子量）を得ることができる。様々な長さのＰＡＧ鎖の間では、非ＰＡＧリンカーを使用することができる。
【０１５７】
２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、および他の修飾されたヌクレオチド修飾は、ヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化させ、そしてそのインビボでの半減期を長くする。３’−３’−ｄＴキャップもまた、エキソヌクレアーゼ耐性を高めることができる。例えば、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号；および同第６，２２９，００２号を参照のこと。これらはそれぞれ、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１５８】
反応性核酸のＰＡＧ誘導
高分子量のＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ結合体は、一官能性の活性化ＰＥＧの、１つ以上の反応部位を含む核酸との反応によって調製することができる。１つの実施形態においては、核酸はニ反応性であるかまたはニ活性化されたものであり、これには、以下の２つの反応部位を含む：従来のホスホルアミダイト合成（例えば、図１３に示されるような３’−５’−ジ−ＰＥＧ化）によってオリゴヌクレオチドの中に導入された５’−アミノ基と３’−アミノ基。別の実施形態においては、反応部位は、例えば、ピリミジンの５位、プリンの８位、または第１級アミンの結合のための部位としてのリボースの２’位を使用して、内部部位に導入することができる。このような実施形態においては、核酸はいくつかの活性化された部位または反応部位を有することができ、マルチ活性化と言われる。合成および精製の後、修飾されたオリゴヌクレオチドは、自発的な加水分解を最小限にしつつ、オリゴヌクレオチドの反応部位との選択的な反応を促進する条件下で、一活性化ＰＥＧと混合される。好ましい実施形態においては、モノメトキシ−ＰＥＧが、プロピオン酸スクシンイミジルで活性化させられ、そしてカップリング反応がｐＨ８．３で行われる。二置換されたＰＥＧの合成を駆動するためには、オリゴヌクレオチドと比較して立体量論的に過剰なＰＥＧが提供される。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体が、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製されて、完全に結合した種、部分的に結合した種、および未結合の種が分離される。
【０１５９】
結合ドメインはまた、それに結合させられた１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有することもできる。そのようなＰＡＧは様々な長さであり得、そして、適切な組み合わせで使用して、所望される分子量の組成物を得ることができる。
【０１６０】
特定のリンカーの作用は、その化学的組成および長さの両方により影響を受け得る。長すぎる、短すぎる、または標的と好ましくない立体的相互作用もしくはイオン性相互作用を形成するリンカーは、アプタマーと標的との間での複合体の形成を妨げるであろう。核酸の間の距離を開けるために必要であるよりも長いリンカーは、リガンドの有効濃度を下げることによって結合安定性を低下させる可能性がある。したがって、多くの場合には、標的に対するアプタマーの親和性を最大にするために、リンカーの組成および長さを最適化することが必要である。
【０１６１】
本明細書中で引用される全ての刊行物および特許文献は、個々のそのような刊行物または文献が具体的かつ個別に、引用により本明細書中に組み入れられることが示されているかのように、引用により本明細書中に組み入れられる。刊行物および特許文献の引用は、任意のものが適切な先行技術であることの承認として意図されるものではなく、その内容または日付としての何らかの承認を構成するものでもない。本発明はここに明細書によって記載されているが、当業者は、本発明は様々な実施形態において実施することができること、そして以下の記載と以下の実施例が説明の目的のためのものであって、以下の特許請求の範囲の限定ではないことを理解するであろう。
【０１６２】
本明細書中で引用される全ての刊行物および特許文献は、個々のそのような刊行物または文献が具体的かつ個別に、引用により本明細書中に組み入れられることが示されているかのように、引用により本明細書中に組み入れられる。刊行物および特許文献の引用は、任意のものが適切な先行技術であることの承認として意図されるものではなく、その内容または日付としての何らかの承認を構成するものでもない。本発明はここに明細書によって記載されているが、当業者は、本発明は様々な実施形態において実施することができること、そして以下の記載と以下の実施例が説明の目的のためのものであって、以下の特許請求の範囲の限定ではないことを理解するであろう。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１）
ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）法を使用した５’−リーダー配列の同定
以下の構造（５’から３’方向で示す）を有する縮重ＤＮＡライブラリー：
Ｔ７プロモーター／Ｇ_４／縮重２０ヌクレオチド／３’−固定配列
を、以下の配列を用いて合成した：
【０１６４】
【化６】

このライブラリーを、３’−プライマーＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号１０４）と５’−プライマーＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号１０５）を使用して増幅させた。次いで、二本鎖のライブラリーを、１×転写緩衝液（ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％）を使用して、以下の条件下で３７℃で一晩転写させた：２’−ＯＭｅ ＡＴＰ ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、それぞれ１ｍＭ、２’−ＯＨ ＧＴＰ ３０μＭ、ＭｇＣｌ_２ ６．５ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．０ｍＭ、１０％ｗ／ｖのＰＥＧ−８０００、１ｍＭのＧＭＰ、無機ピロホスファターゼ １００μＬの反応物について０．５単位、およびＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２００ｎＭ。
【０１６５】
次いで、得られた混合物を沈殿させ（イソプロパノール、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ）、ゲルで精製し（１０％ＰＡＧＥ）、ゲルから切り出して抽出し、ＤＮａｓｅ（ＲＱ１、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で処理し、ＰＣＲに使用した３’−プライマーを使用して６５℃で逆転写させ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｅｓｂａｄ，ＣＡ）、そして以下のオリゴヌクレオチドを用いた添え木を当てられた連結反応物（ｓｐｌｉｎｔｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の中に直接稀釈した。
Ｔ７プロモーターをコードする５’リン酸化オリゴヌクレオチド（ここでは、ｐは５’リン酸化される可能性がある）」
【０１６６】
【化７】

連結のための添え木
【０１６７】
【化８】

この混合物を熱で変性させ、アニーリングさせ、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ Ｂｅｖｅｒｌｅｙ ＭＡ）を添加し、その後、１６℃で一晩インキュベーションした。連結工程に続いて、反応物を、ＳＥＬＥＸ（登録商標）法の次の回への投入のために転写された配列を増幅させるための、すでに記載したプライマーを用いるＰＣＲの中に直接稀釈した。この反応図式を図２に示す。
【０１６８】
３回のＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択後、ライブラリーを、製造業者による説明書にしたがってＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してクローニングし、配列決定し、そして縮重領域の中でのヌクレオチドの出現頻度を統計分析した。個々のクローンを、高濃度の転写物の転写の鋳型となるそれらの能力についてＰＡＧＥ−ゲル分析によって評価し、次いで、最も多量の転写物を生じたそのような配列をライブラリーの設計に利用し、これを次いで、多量の転写物の転写の鋳型となるそれらの能力についてゲル分析によってアッセイした。図３は、３回のＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択の前および後の、２０個の縮重位置の領域のヌクレオチド組成の平均の割合を示す。図３に示すように、転写物の中の５位から１３位（縮重領域の中の１位から９位）までには、Ｇについての強い好みが記載され、それより後のヌクレオチドについては優先的に記載されたものはなかった。
【０１６９】
３回のＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択の後に配列決定によって発見されたクローンを、約２００ｎＭの鋳型、１×転写緩衝液（ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％）、２’−ＯＭｅ ＡＴＰ ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、それぞれ１ｍＭ、２’−ＯＨ ＧＴＰ ３０μＭ、ＭｇＣｌ_２ ６．５ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２ｍＭ、１０％ｗ／ｖのＰＥＧ−８０００、１ｍＭのＧＭＰ、無機ピロホスファターゼ １００μＬの反応物について０．５単位、およびＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２００ｎＭを使用して、２’−ＯＭｅヌクレオチドを転写するそれらの能力についてＰＡＧＥ−ゲル分析によって、３７℃で一晩、スクリーニングした。０回目によるクローンと比較した場合には、ＰＡＧＥ−ゲルによって見ることができるように、３回目からの１つのクローンの一例であるクローンＡＭＸ４１１．Ｄ６は、有意により多いＭＮＡ転写物を生じた。３回目から得られたクローンのＤＮＡ配列を以下に列挙する（全ての配列が５’から３’方向である）：
【０１７０】
【化９】

【０１７１】
【化１０】

【０１７２】
【化１１】

【０１７３】
【化１２】

【０１７４】
【化１３】

【０１７５】
【化１４】

【０１７６】
【化１５】

（実施例２）
ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）法によって同定されたリーダー配列が取り込まれているライブラリー
実施例１に記載したようにＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択を使用して同定されたより高度に２’−修飾された転写物を生じるクローンから同定した５’−リーダー配列エレメント（縮重領域の最初の１０ヌクレオチド）を利用して、２’−修飾されたヌクレオチドを含む転写物の量を増大させる目的で５’−固定領域にリーダー配列エレメントを取り込ませたライブラリーを設計した。１つの実施形態においては、設計ストラテジーにより、その後のＰＣＲ増幅を促進するためのさらに６〜８個の固定されたヌクレオチドがすぐ続く５’リーダー配列として、同定したクローンの最初の１４ヌクレオチド（４個のグアノシンを含む５’固定領域と縮重領域の最初の１０個のヌクレオチド）、このすぐ後ろに続く３０〜４０ヌクレオチドの長さの縮重領域、そのすぐ後に続く、これもまたその後のＰＣＲ増幅を促進する３’−固定領域を取り込ませた。
【０１７７】
同定したリーダー配列エレメントを取り込むように設計したライブラリーのＤＮＡ配列の例を以下に列挙する。
【０１７８】
以下に列挙するＤＮＡ転写鋳型のライブラリーの配列のそれぞれについて、５’−リーダー配列エレメントは下線で示し、そして全ての配列は５’から３’方向である。
【０１７９】
【化１６】

リーダー配列が含まれていない制御ＤＮＡ転写鋳型を、５’から３’方向で以下に列挙する。
【０１８０】
【化１７】

新しく設計したライブラリーが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む転写物の量の増大を促進するかどうかを試験するために、ライブラリーを、比較のために、２種類の修飾されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体ポリメラーゼ）（ポリメラーゼが含まれていない転写反応混合物をネガティブ対照として使用した）を使用して、約２００ｎＭの鋳型、１×転写緩衝液（ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％）、２’−ＯＭｅ ＡＴＰ ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、それぞれ１ｍＭ、２’−ＯＨ ＧＴＰ ３０μＭ、ＭｇＣｌ_２ ６．５ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．０ｍＭ、１０％ｗ／ｖのＰＥＧ−８０００、１ｍＭのＧＭＰ、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２００ｍＭ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬを含む転写混合物の中で、３７℃で一晩、転写させた。個々の条件についての転写物量を、２００μＬの反応混合物を使用したＰＡＧＥ−ゲル分析によって評価し、それぞれの条件についての転写物量を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔバージョン５．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してＰＡＧＥ−ゲル分析のＵＶ−シャドウイングによって定量した。
【０１８１】
図４には、ＰＡＧＥ−ゲル分析の定量結果をまとめる。これは、ポリメラーゼが含まれていない対照と比較した、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ（「ＦＡＲ」）変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ（「ＬＡＲ」）変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの両方を用いて得られた転写物量の倍数増加を示している。図４に見ることができるように、完全なる２’−ＯＭｅを含む転写物の量の有意な改善が、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、新しいリーダー配列エレメントが取り込まれている新しいライブラリーを転写させた場合に、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体ポリメラーゼと比較して、見られた。注目すべきは、ＡＲＣ２１１８、ＡＲＣ２１１９、ＡＲＣ２１２０によっては、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと組み合わせた場合に、有意に多い量の、２’−ＯＭｅを含む転写物が得られた。Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することによって得られた転写物量の増加はまた、ＡＲＣ２１１７を用いた場合にも見られた。これは、対照として使用した、新しく同定したリーダー配列エレメントが含まれていない、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体ポリメラーゼを含む所定の条件下で転写されることが公知である以前に設計されたライブラリーである。これらの結果は、２’−ＯＭｅを含む転写物の収量を、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを利用することによって増大させることができることを示している。加えて、ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）法によって同定したリーダー配列エレメントが取り込まれているいくつかの新しいライブラリー（ＡＲＣ２１１８およびＡＲＣ２１１９）のいくつかもまた、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合には、対照ライブラリーＡＲＣ２１１７よりも多量の、２’−ＯＭｅを含む転写物を生じた。このことは、２’−ＯＭｅを含む転写物の収量の改善を、本発明の特定の新しく同定したリーダー配列と組み合わせてＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体を利用することによって行うことができることを示している。
【０１８２】
（実施例３）
ポリメラーゼの発現および精製
変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、本発明の方法での使用のためには、以下のように調製することができる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれ図５Ａおよび５Ｂに示されており、そしてＢｕｌｌ，Ｊ．Ｊら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，５７（３），２４１−２４８（２００３）に記載されている）は、ＬＡ変異体（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）、ＬＡＲ変異体（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）、ＬＬＡ変異体（Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ）、またはＬＬＡＲ変異体（Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）を生じるように変異させることができる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、発現ベクター（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターの一例は、米国特許出願番号５，８６９，３２０（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている）の中に含めることができ、また、突然変異誘発の後に発現ベクターに挿入することもできる。変異させたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、必要に応じて、タンパク質精製の際の使用を容易にするためのＨｉｓ−タグを含むように操作することができる。
【０１８３】
６３９位にロイシン変異を含む相補的なオリゴヌクレオチド配列
【０１８４】
【化１８】

を合成することができる。Ｐ２２６Ｌ変異のための相補的なオリゴヌクレオチド配列
【０１８５】
【化１９】

を合成することができる。Ｈ７８４Ａ変異のための相補的なオリゴヌクレオチド配列
【０１８６】
【化２０】

を合成することができる。Ｋ３７８Ｒ変異のための相補的なオリゴヌクレオチド配列
【０１８７】
【化２１】

を合成することができる。部位特異的変異は、製造業者の説明書に従ってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して行うことができ、上記に示した変異の組み合わせを有する変異体ポリメラーゼをコードする核酸配列（図６）が得られる。本発明の変異体ポリメラーゼをコードする得られた核酸配列は、発現および精製のための標準的な技術を使用して、所望される発現ベクターの中に挿入することができる。
【０１８８】
発現および精製
変異体Ｔ７ポリメラーゼ核酸配列を含む発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）に形質転換し、氷上で２０分間インキュベートした。熱ショックを、４２℃の中に試験管を２分間、差し込むことによって行った。氷上に試験管を１分間、差し込んだ後、１ｍＬの培養液（「ＬＢ」）を添加し、３７℃の震盪装置の中で４５分間インキュベートした。１００μｌの培養液をＬＢ＋Ａｍｐ寒天プレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８９】
一晩培養したプレートからの１つのコロニーを、１００ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ＋（１５０μｇ／ｍｌ）に接種し、３７℃で一晩おいた。２日目に、２リットルの予め温めておいたＬＢ＋Ａｍｐを含む２つの４リットルのフラスコに、５０ｍｌの一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで、３７℃で増殖させた。２００μｌの１ＭのＩＰＴＧを、それぞれの２Ｌの細胞培養物に、１００μＭの最終濃度で添加し、３７℃でさらに３時間増殖させた。細胞を、５０００ｒｐｍで１０分間回転させることによってペレットとした。細胞を、２００ｍｌの溶解緩衝液（溶解緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのイミダゾール、βメルカプトエタノール（「ＢＭＥ」）５ｍＭ）の中に再度懸濁させ、６本の５０ｍｌの円錐菅に分けた。細胞を、それぞれのチューブについて出力レベル８で３×３０”、超音波処理し、その後、細菌の破片を１１，０００ｒｐｍで６０分間スピンダウンさせ、上清を０．２２μＭのフィルターを通して濾過した。イミダゾールを濾液に添加し、１０ｍＭの最終濃度とした。
【０１９０】
フィルターを、試料ポンプを使用して５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）上にロードした。カラムを１０倍容量（ＣＶ）の、２０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、ＢＭＥ １０ｍＭ）で洗浄した。その後、カラムを、緩衝液Ａ中の４０ｍＭから７０ｍＭのイミダゾール濃度の直線勾配を有する１０ＣＶの緩衝液で洗浄した。タンパク質を６ＣＶの緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、２５０ｍＭのイミダゾール、ＢＭＥ １０ｍＭ）で溶出させた。４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で５μｌの試料を用いた回収画分のチェックの後、目的の画分を全て混合し、１Ｌの透析緩衝液（透析緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０％のグリセロール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＢＭＥ ２０ｍＭ）中で一晩透析した（透析管：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＶＷＲ）ＭＷＣＯ：１２−１４０００）。透析緩衝液を１２時間後に交換し、透析をさらに４時間行った。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８に記載されているようにＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して測定した。
【０１９１】
（実施例４）
２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを１００％取り込む転写
実施例４Ａ：２’−ＯＨ ＧＴＰを用いない２’−Ｏ−メチル転写
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体ポリメラーゼの、２’−ＯＨ ＧＴＰの濃度に対する感度を試験するための実験を、２’−ＯＨ ＧＴＰの滴定を使用して行った。
【０１９２】
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合に高い転写物量を示した、ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択によって同定した新しいリーダー配列エレメント（実施例１に記載した）を取り込ませたＡＲＣ２１１８とＡＲＣ２１１９の２つのライブラリー（実施例２を参照のこと）を使用して、２’−ＯＨ ＧＴＰの濃度に対するＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写物の感度を試験した。転写は、２’−ＯＨ ＧＴＰ（０〜１６０μＭ）の、１×転写緩衝液（ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％）、約２００ｎＭの鋳型、２’−ＯＭｅ ＡＴＰ ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ、それぞれ１ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ ６．５ｍＭ、ＭｎＣｌ_２ ２．０ｍＭ、ＰＥＧ−８０００ １０％ｗ／ｖ、ＧＭＰ １ｍＭ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２００ｎＭでの、３７℃で一晩の滴定を使用して行った。
【０１９３】
それぞれの条件下での転写物量は、２００μＬの反応混合物を使用したＰＡＧＥ−ゲル分析によってアッセイし、それぞれの条件についての転写物量を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔバージョン５．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用したＰＡＧＥ−ゲル分析のＵＶ−シャドウイングによって定量した。図７に、ＰＡＧＥ−ゲル分析の定量結果をまとめ、これは、バックグラウンドと比較した、それぞれの条件を用いた場合の転写物量の倍数増加を示している。図７に見ることができるように、２’−ＯＨ ＧＴＰが含まれていない全ての条件下でＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒを用いて転写させたＡＲＣ２１１８およびＡＲＣ２１１９と、２’−ＯＨ ＧＴＰが存在しない場合の収量は、２’−ＯＨ ＧＴＰが反応混合物中に含まれている場合の転写量に匹敵していた。これらの結果は、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（これは、転写に２’−ＯＨ ＧＴＰが必要である）とは対照的に、高い転写物量のために２’−ＯＨ ＧＴＰの存在を必要とはしないことを示している。
【０１９４】
ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択によって同定したリーダー配列（実施例１に記載した）と組み合わせた場合に、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に使用する最適な転写条件を決定するための実験を続けて行った。ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択によって同定した新しいリーダー配列エレメントを取り込ませたライブラリーであるＡＲＣ２１１９（これは、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼとともに使用すると有意に高い転写物量を示した）（実施例２を参照のこと）を使用して、転写物量に対する、２’−ＯＭｅ ＮＴＰ、マグネシウム、およびマンガンの濃度を変化させることの効果を試験した。
【０１９５】
転写は、１×転写緩衝液（ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％）、約２００ｎＭの鋳型、２’−ＯＭｅ ＡＴＰ ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ（それぞれ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、および２ｍＭ）、ＭｇＣｌ_２（５ｍＭ、６．５ｍＭ、８ｍＭ、および９．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２ （１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ）、ＰＥＧ−８０００ １０％ｗ／ｖ、ＧＭＰ １ｍＭ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２００ｍＭを使用して、３７℃で一晩行った。
【０１９６】
それぞれの条件下での転写物量は、２００μＬの反応混合物を使用したＰＡＧＥ−ゲル分析によってアッセイし、それぞれの条件についての転写物量を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔバージョン５．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用したＰＡＧＥ−ゲル分析のＵＶ−シャドウイングによって定量した。図８に、ＰＡＧＥ−ゲル分析の定量結果をまとめ、これは、バックグラウンドと比較した、それぞれの条件を用いた場合の転写物量の倍数増加を示している。２’−Ｏｍｅ ＮＴＰのコストとこの実験の結果に基づいて、１．５ｍＭの各２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（および８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭのＭｎＣｌ_２）を、本発明のリーダー配列とＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる使用に好ましい条件として採用した。
【０１９７】
実施例４Ｂ：Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するＭＮＡ転写の忠実性と偏り：
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用し、２’−ＯＨ ＧＴＰを使用しないＭＮＡの転写の忠実性と偏りを評価するためのさらなる実験を行った。忠実性を試験するために、ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択によって同定した１つのクローニングした配列（実施例１に記載した）をＰＣＲによって増幅させ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒポリメラーゼを使用し、そして２−ＯＨ ＧＴＰを使用しないＭＮＡ転写をプログラムするために使用し、ＰＡＧＥによって精製し、残っているＤＮＡ鋳型をＲＱ１ ＤＮａｓｅを使用して消化させ（その後、ＤＮＡ鋳型が存在していないことをＰＣＲによってアッセイした）、そして転写された材料を逆転写させ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、次いでＰＣＲによって増幅させた。このＰＣＲ産物を配列決定し、次いで、欠失、挿入、および置換の統計データを計算した。この実験で配列決定した１３００塩基の中では、欠失および挿入は観察されず、３個の置換が観察された（図９を参照のこと）。これらの数は、３０ヌクレオチドの縮重領域の中にコードされている配列情報が、９３％の忠実性でＳＥＬＥＸ（登録商標）の次の回に伝達されることを示唆している。この数は、野生型ＲＮＡについて測定される数を上回るほどに高い。
【０１９８】
ヌクレオチドの偏りを試験するためには、ライブラリーＡＲＣ２１１８を以下の条件下で、３７℃で一晩、転写させた：ＨＥＰＥＳ ２００ｍＭ、ＤＴＴ ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．０１％、約２００ｎＭの鋳型、２’−ＯＭｅ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ 各１ｍＭ（２’−ＯＨ ＧＴＰは含まれていない）、ＭｇＣｌ_２（６．５ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２（２ｍＭ）、ＰＥＧ−８０００ｗ／ｖ １０％、ＧＭＰ １ｍＭ、無機ピロホスファターゼ ５単位／ｍＬ、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２００ｎＭ。これをＰＡＧＥによって精製し、残っているＤＮＡ鋳型をＲＱ１ ＤＮａｓｅを使用して消化させ（その後、ＤＮＡ鋳型が存在していないことをＰＣＲによってアッセイした）、そして転写された材料を逆転写させ、ＰＣＲを使用して増幅させ、その後、クローニングおよび配列決定を行った。増幅させたライブラリーに由来する４８個のクローンと最初のライブラリーに由来する４８個のクローンを配列決定した。縮重領域の中でのヌクレオチドの出現率の統計データを、偏りが存在するかどうかを見るために試験した。図１０に示したように、転写後のヌクレオチドの組成の割合は、それぞれのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）の割合がほぼ等しい最初のライブラリーのヌクレオチド組成の割合と非常に似ていた。このことは、転写にＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合には、ヌクレオチドの偏りは生じないことを示している。
【０１９９】
実施例４Ｃ：様々なリーダー配列を用いた場合の転写物量の比較
鋳型１から４：
多種多様のリーダー配列とともにＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合の転写量を比較するために、リーダー配列（配列番号１２６から１２９の１位から１４位、以下）中のピリミジンに対して様々な割合のプリンを含む４種類の鋳型を、様々な定常領域を用いて合成した。ＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。配列（５’から３’方向で示す）は以下である：
【０２００】
【化２２】

鋳型を以下に示すそれらのそれぞれのプライマーを用いて増幅させた：
【０２０１】
【化２３】

【０２０２】
【化２４】

鋳型を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）を含む１５ｍＬのインビトロでの転写反応において使用した。転写は、２００ｍＭのＨｅｐｅｓ、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のＰＥＧ−８０００、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭのＭｎＣｌ_２、１．５ｍＭのｍＣＴＰ、１．５ｍＭのｍＵＴＰ、１．５ｍＭのｍＧＴＰ、１．５ｍＭのｍＡＴＰ、１ｍＭのＧＭＰ、０．０１単位／μＬの無機ピロホスファターゼ、および約９μｇ／ｍＬのＴ７ ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）、ならびに、０．２μＭの鋳型ＤＮＡを使用して行った。ＲＮＡを沈殿させ、そして、１０％の変性ＰＡＧＥ上で精製した。ＲＮＡを、３００ｍＭのＮａＯＡｃ、２０ｍＭのＥＤＴＡ中でゲルから一晩かけて溶出させ、沈殿させ、そしてＵＶ Ｓｐｅｃを用いて定量した。収量は、試験した４種類のリーダー配列の間で大きくは異ならず、そして以下の表１Ａに示す。
【０２０３】
【化２５】

鋳型５から８
上記の鋳型１から４と同様に、複数のリーダー配列についての転写量を評価した。４種類の鋳型を様々な定常領域を用いて合成した。ＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。配列（５’から３’方向で示す）は以下である：
【０２０４】
【化２６】

鋳型をそれらのそれぞれのプライマーを用いて増幅させた：
【０２０５】
【化２７】

【０２０６】
【化２８】

その後、鋳型を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）を含む０．５ｍＬのインビトロでの転写に使用した。転写は、２００ｍＭのＨｅｐｅｓ、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のＰＥＧ−８０００、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭのＭｎＣｌ_２、１．５ｍＭのｍＣＴＰ、１．５ｍＭのｍＵＴＰ、１．５ｍＭのｍＧＴＰ、１．５ｍＭのｍＡＴＰ、１ｍＭのＧＭＰ、０．０１単位／μＬの無機ピロホスファターゼ、および約９μｇ／ｍＬのＴ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）、ならびに、０．２μＭの鋳型ＤＮＡを使用して行った。ＲＮＡを沈殿させ、そして、１０％の変性ＰＡＧＥ上にロードした。ＲＮＡを、ゲル上でＵＶ吸光度によって視覚化した。収量は、収量は、試験した４種類のリーダー配列の間で大きくは異ならず、そして以下の表１Ａに示す（相対的な転写量を示す）。
【０２０７】
【化２９】

特定の実施形態においては、上記で同定した鋳型が、本発明の転写方法および／またはアプタマー選択方法において使用され得る。
【０２０８】
実施例４Ｄ：Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したＭＮＡ転写
以下のＤＮＡ鋳型およびプライマーを使用して、二本鎖の転写鋳型を生じるためのポリメラーゼ連鎖反応をプログラムした。Ｎは、ＡＴＧＣのそれぞれが存在する可能性がほぼ等しい縮重位置を示しており、全ての配列を、５’から３’方向で列挙する。ＰＣＲ鋳型（ＡＲＣ２１１８）
【０２０９】
【化３０】

【０２１０】
【化３１】

得られた二本鎖の転写鋳型を、その後、以下のようなそれぞれの試料についての２００μＬの転写混合物をプログラムするために使用した：ＨＥＰＥＳ（２００ｍＭ）、ＤＴＴ（４０ｍＭ）、スペルミジン（２ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．０１％）、ＭｇＣｌ_２（８ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２（２．５ｍＭ）、ＰＥＧ−８０００（１０％ｗ／ｖ）、１．５ｍＭの各２’−ＯＭｅ ＮＴＰ、ＧＭＰ １ｍＭ、１００〜２００ｎＭの転写鋳型、無機ピロホスファターゼ（１単位）、ｐＨ７．５、以下に示すように稀釈したＴ７変異体ポリメラーゼ（Ｐ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）。転写混合物を３７℃で一晩インキュベートした（１６時間）。
【０２１１】
インキュベーション後、混合物をイソプロパノールで沈殿させ、得られたペレットを溶解させ、変性ＰＡＧＥ（１２．５％のアクリルアミド）を使用して６０分間、２５Ｗで変性させた。試料を視覚化させ、２６０ｎｍでのＵＶシャドウによって定量した。
【０２１２】
【化３２】

（実施例５）
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したアプタマーの選択
ヒトＡｎｇ２（本明細書中以後、「ｈ−Ａｎｇ２」）に対するアプタマーを同定するための選択を、２’−ＯＭｅプリンヌクレオチドおよび２’−ＯＭｅピリミジンヌクレオチドからなるプール（本明細書中以後、「ＭＮＡ」）を使用して行った。この選択ストラテジーによって、ｈ−Ａｎｇ２に特異的な高親和性アプタマーが得られた。
【０２１３】
ヒトＡｎｇ２は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）を発現させ、そして上記の実施例３に記載したように精製した。２’−ＯＭｅプリンおよび２’−ＯＭｅピリミジンヌクレオチドは、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【０２１４】
Ａｎｇ２アプタマーの選択
プールの調製
配列
【０２１５】
【化３３】

を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。鋳型を、プライマー
【０２１６】
【化３４】

を用いて増幅させ、その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）でのインビトロでの転写のための鋳型として使用した。転写は、２００ｍＭのＨｅｐｅｓ、４０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のＰＥＧ−８０００、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭのＭｎＣｌ_２、１．５ｍＭのｍＣＴＰ、１．５ｍＭのｍＵＴＰ、１．５ｍＭのｍＧＴＰ、１．５ｍＭのｍＡＴＰ、１ｍＭのＧＭＰ、０．０１単位／μＬの無機ピロホスファターゼ、および約９μｇ／ｍＬのＴ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）、ならびに、０．５μＭの鋳型ＤＮＡを使用して行って、ＡＲＣ２１１８ ｍＲｍＹプールを作成した。
【０２１７】
選択
選択は、３３０ｐｍｏｌｅ（２×１０^１４個の分子）のＭＮＡ ＡＲＣ２１１８プールを、１００μＬの最終容量の選択緩衝液（１×ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ））の中で１００ｐｍｏｌｅのタンパク質と共に、室温で１時間インキュベートすることによって開始した。ＲＮＡ−タンパク質複合体と、結合していないＲＮＡ分子を、０．４５マイクロンのニトロセルローススピンカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を使用して分離させた。カラムをＫＯＨで前処理し（１ｍＬの０．５Ｍ ＫＯＨ中のＳｏａｋカラムフィルター ＲＴで１５分間；スピンスルー（ｓｐｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ）、１ｍＬのｄＨ２Ｏ中のＳｏａｋフィルター、ＲＴで５分間；スピンスルー）、１ｍＬの１×ＰＢＳで２回洗浄し、その後、プール：Ａｎｇ２複合体を含む溶液をカラムに添加し、１５００×ｇで２分間遠心分離した。フィルターを、５００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄して、非特異的結合剤を除去した。ＲＮＡを、２×１００μＬの溶出緩衝液（７Ｍの尿素、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、予め９５℃に加熱した）の添加によって溶出させ、その後、エタノールで沈殿させた。ＲＮＡを、製造業者の説明書にしたがって、プライマー（配列番号１１９）を使用して、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて逆転写させた。ｃＤＮＡを、製造業者の説明書にしたがって、配列番号１１８および配列番号１１９を使用して、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてＰＣＲによって増幅させた。鋳型を、プールの調製のために上記に記載したように転写させ、そして変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。
【０２１８】
２回目を、１回目と同じ方法で行った。３回目〜１２回目は、疎水性プレート上に固定したｈ−Ａｎｇ２を用いて行った。各回の選択は、１００μＬの１×ＤＰＢＳ中で室温で１時間、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面上に２０ｐｍｏｌｅのｈ−Ａｎｇ２を固定させることによって開始した。プレートを、１２０μＬのＤＰＢＳで５回洗浄し、その後、ブロック緩衝液（１×ＤＰＢＳ、および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）とともに１時間インキュベートした。その後、上清を除去し、ウェルを、１２０μＬのＤＰＢＳで５回洗浄した。プールのＲＮＡを、空のウェルの中で室温で１時間、次いで、１００μＬのブロック緩衝液で予めブロックされたウェルの中で１時間、インキュベートした。３回目以降は、標的を固定したウェルを、ポジティブ選択工程の前に１００μＬのブロック緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ、および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）の中で室温で１時間ブロックした。全ての場合に、固定されたｈ−Ａｎｇ２に結合したプールのＲＮＡを、逆転写（「ＲＴ」）混合物（３’プライマー、配列番号１１９、およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の添加によって選択プレート中で直接逆転写させ、その後、６５℃で１時間インキュベーションした。得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲのための鋳型として使用し（Ｔａｑポリメラーゼ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、そして転写は１回目について記載したものと同じとした。それぞれの回についての条件は表３に示す。
【０２１９】
【化３５】

【０２２０】
【化３６】

ＭＮＡアプタマー結合分析
ドットブロット結合アッセイを、プールのタンパク質結合親和性をモニターするために、選択によって行った。微量の^３２Ｐで末端標識したプールのＲＮＡをｈ−Ａｎｇ２と混合し、３０μＬの最終容量においてＤＰＢＳ緩衝液中で３０分間、室温でインキュベートした。混合物をニトロセルロース膜、ナイロン膜、およびゲルブロット膜（上から下に）でアセンブリしたドットブロット装置（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１ Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）にアプライした。タンパク質に結合したＲＮＡはニトロセルロースフィルター上に捕捉され、一方、タンパク質に結合していないＲＮＡはナイロンフィルター上に捕捉される。ｈ−Ａｎｇ２結合の富化は、９回目から見られた。９回目、１０回目、および１２回目のプールの鋳型を、製造業者による説明書にしたがってＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してクローニングし、そして２６個の特有のクローンを化学合成のために選択し、解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。簡単に説明すると、合成のＲＮＡをγ−^３２Ｐ ＡＴＰで５’末端を標識し、Ｋ_Ｄ値を、ドットブロットアッセイと１×ＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１４０４０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の緩衝液条件を使用して決定した。Ｋ_Ｄは、データを以下の方程式にフィットさせることによって概算した：結合したＲＮＡの割合＝ａｍｐｌｉｔｕｄｅ^＊（（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ−Ａｎｇ２］＋Ｋ_Ｄ）−ＳＱＲＴ（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ−Ａｎｇ２］＋Ｋ_Ｄ）^２−４（ＡｐｔＣｏｎｃ^＊［ｈ−Ａｎｇ２］）））／２^＊ＡｐｔＣｏｎｃ））＋バックグラウンド。結果を以下の表４に報告する。
【０２２１】
２６種類の特有の配列の中では、８種類は類似するモチーフを共有しており、そして類似する結合活性および阻害活性を有していた。これらの配列を、ファミリーＩと同定した。ファミリーＩＩには、類似する結合活性および阻害活性を有していたモチーフを共有していた２種類の配列を含めた。
【０２２２】
ＭＮＡアプタマー機能の分析
Ｅｌｉｓａアッセイ
いくつかのアプタマーをＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｔｉｅ２受容体に対するＡｎｇ２の結合を妨害するそれらの能力を測定するように設定した。Ｔｉｅ２受容体を捕捉するために、１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）の中の１５０ｎｇのＴｉｅ２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ３１３−ＴＩ−１００−ＣＦ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＹ）を９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレート（ＮＵＮＣ＃４４６６１２，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）上にのせ、そして４℃で一晩インキュベートした。捕捉の際には、５０μＬの様々な濃度の合成のＲＮＡを、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中の１．８ｎＭ（１００ｎｇ／ｍＬの最終Ａｎｇ２濃度を有する５０μＬの３．６ｎＭのＡｎｇ２（２００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ６２３−ＡＮ−０２５／ＣＦ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＹ）と混合し、そして室温で１時間インキュベートした。捕捉溶液を一晩のインキュベーション後に除去し、そしてプレートを２００μＬのＴＢＳＴ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した。その後、プレートを、５％の無脂肪粉乳を含む２００μＬのＴＢＳＴで、室温で３０分間ブロックした。ブロック後、プレートを、２００μＬのＴＢＳＴで再度３回、室温で洗浄し、合成のＲＮＡ：Ａｎｇ２混合物をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを、２００μＬのＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬのビオチニル化ヤギ抗Ａｎｇ２抗体（１：１０００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＦ６２３，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。２００μＬのＴＢＳＴでの３回の洗浄後、１００μＬのＨＲＰ結合ストレプトアビジン（１：２００；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＤＹ９９８，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を添加し、そして室温で０．５時間インキュベートした。その後、プレートを再び２００μＬのＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬのＴＭＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，＃３４０２８）を添加し、そして、室温で５分間、暗所でインキュベートした。２ＮのＨ_２ＳＯ_４を含む１００μＬの溶液を反応を停止させるために添加し、そしてプレートをＳｐｅｃｔｒｏＭａｘによって４５０ｎｍで読み取った。結果を、以下の表４の最後の列に示す。
【０２２３】
ＦＡＣＳアッセイ
ヒトの臍帯血内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）（ＡＴＣＣ）およびＫ２９３細胞（ヒトＴｉｅ２受容体を過剰発現している細胞株）を使用して、細胞膜上のＴｉｅ２受容体に対するＡｎｇ２の結合を阻害する特異的ＭＮＡ Ａｎｇ２アプタマーのＩＣ_５０を決定した。簡単に説明すると、組み換え体哺乳動物発現ベクターｐＣＤＭＡ３．１−Ｔｉｅ２を２９３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）にトランスフェクトし、次いで、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）での選択後に安定なクローンを得た。フローサイトメトリーは、ＨＵＶＥＣおよびＫ２８３細胞の両方の上でのＴｉｅ２タンパク質の発現を示した。Ａｎｇ２の滴定アッセイによって、さらに、ＨＵＶＥＣおよびＫ２９３細胞上でのアプタマー阻害アッセイのためにＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の量を決定した。これはそれぞれ、１μｇ／ｍＬおよび０．１μｇ／ｍＬであった。
【０２２４】
フローサイトメトリー結合アッセイにおいて、ＨＵＶＥＣおよびＫ２９３細胞（２×１０^５細胞／ウェル）を、Ｖ底９６ウェルプレートの中でペレット化させ、これを続いて、ＭＮＡアプタマー／Ａｎｇ２溶液の中に再度懸濁させ、そして２時間インキュベートした。アプタマー／Ａｎｇ２溶液を、ＦＡＣｓ緩衝液（ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ、０．２％のアジ化ナトリウム）中のＡｎｇ２と共に、様々な投与量のアプタマー（１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ、１．２ｎＭ、０．４１１ｎＭ、０．１３７ｎＭ、および０．０４５６ｎＭ）を、氷上で３０分間プレインキュベーションすることによって調製した。ＦＡＣｓ緩衝液での３回の洗浄の後、細胞を、ビオチニル化抗ヒトＡｎｇ２抗体（５μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と共に３０分間インキュベートし、続いて、ストレプトアビジンＰＥ（１：１０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともにさらに３０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳ分析は、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して完了した。結果を以下の表４に報告する。
【０２２５】
（表４ 抗Ａｎｇ２ ＭＮＡアプタマーについての結合および機能の結果のまとめ）
【０２２６】
【化３７】

【０２２７】
【化３８】

（実施例６）
Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したアプタマーの選択
ヒトＩｇＥ（本明細書中以後「ｈ−ＩｇＥ」）に対するアプタマーを同定するための選択を２’−ＯＭｅプリンヌクレオチドおよび２’−ＯＭｅピリミジンヌクレオチドからなるプール（本明細書中以後、「ｍＲｍＹ」）を使用して行った。この選択ストラテジーによって、ｈ−ＩｇＥに特異的な高親和性アプタマーが得られた。
【０２２８】
ヒトＩｇＥは、Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号１６−１６−０９０７０５ Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）から購入した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）を発現させ、そして上記の実施例３に記載したように精製した。２’−ＯＭｅプリンおよび２’−ＯＭｅピリミジンヌクレオチドは、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【０２２９】
ＩｇＥアプタマーの選択
プールの調製
配列
【０２３０】
【化３９】

を有するＤＮＡ鋳型を、ＡＢＩ ＥＸＰＥＤＩＴＥ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法によって脱保護した。この鋳型を、プライマー
【０２３１】
【化４０】

を用いて増幅させ、その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）でのインビトロでの転写のための鋳型として使用した。転写は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのスペルミジン、０．００２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のＰＥＧ−８０００、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭのＭｎＣｌ_２、１．５ｍＭのｍＣＴＰ、１．５ｍＭのｍＵＴＰ、１．５ｍＭのｍＧＴＰ、１．５ｍＭのｍＡＴＰ、１ｍＭのＧＭＰ、０．０１単位／μＬの無機ピロホスファターゼ、および約９μｇ／ｍＬのＴ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ）、ならびに、０．３μＭの鋳型ＤＮＡを使用して行って、ＡＲＣ２１１８ ＭＮＡプールを作成した。
【０２３２】
選択
選択は、３３０ｐｍｏｌｅ（２×１０^１４個の分子）のＭＮＡ ＡＲＣ２１１８プールを、１００μＬの最終容量の選択緩衝液（１×ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ））の中のＢＳＡでブロックした疎水性プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート，Ｎｕｎｃ，Ｒｐｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に結合させた２４ｐｍｏｌｅのタンパク質とともに、室温で１時間インキュベートすることによって開始した。ウェルを、１２０μＬのＤＰＢＳで４回洗浄して、非特異的結合剤を除去した。ＲＮＡを溶出させ、そして製造業者の説明書にしたがって、プライマー（配列番号１１９）を使用して、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて逆転写させた。ｃＤＮＡを、製造業者の説明書にしたがって、配列番号１１８および配列番号１１９を使用して、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてＰＣＲによって増幅させた。鋳型を、プールの調製のために上記に記載したように転写させ、そして変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。
【０２３３】
全ての回を、疎水性プレート上に固定したｈ−ＩｇＥを用いて行った。各回の選択は、１００μＬの１×ＤＰＢＳ中で室温で１時間、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ疎水性プレートの表面上に２４ｐｍｏｌｅのｈ−ＩｇＥを固定させることによって開始した。プレートを、１２０μＬのＤＰＢＳで４回洗浄し、その後、ブロック緩衝液（１×ＤＰＢＳ、および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）とともに１時間インキュベートした。その後、上清を除去し、ウェルを、１２０μＬの１×ＤＰＢＳで４回洗浄した。２回目からは、プールのＲＮＡを、空のウェルの中で室温で１時間、次いで、１００μＬのブロック緩衝液で予めブロックされたウェルの中で１時間、インキュベートした。２回目以降は、非特異的競合剤をポジティブ対照工程（０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ，および０．１ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ）に加えた。全ての場合に、固定されたｈ−ＩｇＥに結合したプールのＲＮＡを、逆転写（「ＲＴ」）混合物（３’プライマー、配列番号１１９、およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の添加によって選択プレート中で直接逆転写させ、その後、６５℃で１時間インキュベーションした。得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲのための鋳型として使用し（Ｔａｑポリメラーゼ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、そして転写は１回目について記載したものと同じとした。それぞれの回についての条件は表５に示す。
【０２３４】
【化４１】

ＭＮＡアプタマーの結合分析
ドットブロット結合アッセイを、プールのタンパク質結合親和性をモニターするための選択によって行った。微量の３２Ｐで末端標識したプールのＲＮＡをｈ−ＩｇＥと混合し、３０μＬの最終容量においてＤＰＢＳ緩衝液中で３０分間、室温でインキュベートした。この混合物をニトロセルロース膜、ナイロン膜、およびゲルブロット膜（上から下に）でアセンブリしたドットブロット装置（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１ Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）にアプライした。タンパク質に結合したＲＮＡはニトロセルロースフィルター上に捕捉され、一方、タンパク質に結合していないＲＮＡはナイロンフィルター上に捕捉される。ｈ−ＩｇＥ結合の富化は、８回目から見られた。５回目、８回目、および１２回目のプールの鋳型を、製造業者による説明書にしたがってＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してクローニングした。配列決定データは、８回目のプールが、配列全体の５９％を含む、１つの主要なクローンに集中していたことを明らかにした。この主要なクローンと３個の可能性のあるミニマー（ｍｉｎｉｍｅｒ）を化学合成のために選択し、解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。簡単に説明すると、合成のＲＮＡをγ−^３２Ｐ ＡＴＰで５’末端標識し、Ｋ_Ｄ値を、ドットブロットアッセイと１×ＤＰＢＳ（ｗ／Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋）（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１４０４０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の緩衝液条件を使用して決定した。Ｋ_Ｄは、データを以下の方程式にフィットさせることによって概算した：結合したＲＮＡの割合＝ａｍｐｌｉｔｕｄｅ^＊（（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ−ＩｇＥ］＋Ｋ_Ｄ）−ＳＱＲＴ（（ＡｐｔＣｏｎｃ＋［ｈ−ＩｇＥ］＋Ｋ_Ｄ）^２−４（ＡｐｔＣｏｎｃ^＊［ｈ−ＩｇＥ］）））／２^＊ＡｐｔＣｏｎｃ））＋バックグラウンド。主要なクローンは、約８００ｐＭのＫ_Ｄを有していた。最もよく結合したミニマーもまた、サルＩｇＥ（ｍ−ＩｇＥ）に対する結合について試験したが、サルＩｇＥタンパク質に対して交差反応性である結合は示さなかった。この交差反応性がないことを、ＥＬＩＳＡによっても確認した。３’末端上に反転したｄＴを有するミニマーを、医薬品化学プロセスのための親分子として使用した。
【０２３５】
医薬品化学
ＩｇＥ特異的ＭＮＡミニマーの１つの化学的組成（図１１）を、化合物の血漿安定性を維持したまま、親和性および効力を改善するために変化させた。このプロセスには最小化させたＩｇＥアプタマーの誘導体のシリーズの設計、合成、および評価を含めた。ここでは、このシリーズの個々の誘導体には、どの残基が置換を寛容化するかを決定するために、予め決定したヌクレオチドの個々の出現頻度の１つの修飾を含めた。修飾の最初のセットは、個々の特有の２’−ＯＭｅヌクレオチドについてのデオキシヌクレオチドの置換とした。別の回の修飾においては、誘導体の１つのシリーズを合成した。ここでは、個々の誘導体に、様々なヌクレオチド間結合部位に１つのホスホロチオエート修飾を含めた。これらの初期段階での修飾において得られたデータを使用して、最小化したアプタマーについての構造と活性の関係（ＳＡＲ）を確立した。続く段階での修飾においてはアプタマーを合成し、そして、最初のＳＡＲデータに基づいて設計した置換の複合的なセットを用いて試験した。複合的な置換のパネルから、その組成の中に導入された２’−デオキシ置換に対して２つの２’−ＯＭｅを有する３９ヌクレオシドの長さのアプタマーを同定した。加えて、その組成の中に、１つの２’−ＯＭｅから２’−デオキシへの置換と、その中に取り込ませた４個のリン酸基からホスホロチオエートへの置換基を有する、３９ヌクレオチドの長さの、得られた修飾された最小化したアプタマーを同定した。図１２に示したように、このデオキシ／ホスホロチオエート修飾されたアプタマーは、最小化したが未修飾のもとのアプタマー、ならびに、２’−ＯＭｅ置換について２つのデオキシを有するもとの最小化したアプタマーのいずれと比較しても、高い結合親和性を示した。
【０２３６】
血清安定性
最小化した未修飾の元のアプタマー、およびデオキシ／ホスホロチオエート修飾されたアプタマーを、ヒト、ラット、およびサルの血清の中でのそれらの安定性を決定するためにアッセイした。個々のアプタマーを、９０％の血清中に５μＭの最終濃度のなるように、１ｍｌのプールした血清に添加した。アプタマーを、震盪させながら３７℃でインキュベートし、そして時点は、０、０．５、１、４、２４、４８、７２、および９８時間とした。それぞれの時点で、インキュベートした試料からの９０μｌのストックを、１０μｌの０．５ＭのＥＤＡＴに添加し、ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００システムを使用する後の安定性についての分析のために、−２０℃で凍結させた。
【０２３７】
全てのバイオセンサーによる結合の測定は、研究グレードのＣＭ５バイオセンサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を取り付けたＢＩＡＣＯＲＥ ２０００を使用して、２５℃で行った。精製した組み換え体ヒトＩｇＥ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）を、アミノ−カプリング化学反応を使用してバイオセンサーの表面に固定した。これを行うために、２つのフローセルの表面を最初に、０．１ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と０．４ＭのＥＤＣ（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミド）の１：１混合物を、５μｌ／分の流速で７分間、最初に活性化させた。表面の活性化後、１つのフローセルに５０μｇ／ｍｌのＩｇＥを、１０μｌ／分で２０分間かけて注入して、活性化さた表面に対する共有結合を確立させた。次に、１Ｍの塩酸エタノールアミン（ｐＨ８．５）を５μｌ／分で７分間かけて注入して、残っているエステルを不活化させた。ブランクとして使用したフローセルについては、１Ｍの塩酸エタノールアミン（ｐＨ８．５）を７分間かけて注入して、タンパク質の注入を行わずに、残っているエステルを不活化させた。
【０２３８】
アプタマーの鎖のセットを、標準曲線を作成するために調製したチップを通して進ませ、その後、全ての時点を分析した。標準曲線を確立するために、アプタマーを、４％のヒト血清と５０ｍＭのＥＤＡＴを補充したＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ ２０）の中に段階稀釈した（２００ｎＭから１２．５ｎＭ）。全ての稀釈した試料を、２０μｌ／分で５分間かけてＢｉａｃｏｒｅ ２０００に注入し、３分間待った。チップを作成するために１ＮのＮａＣｌを、３０μｌ／分で６０秒間注入した。結合段階の最後に、ＲＵピークの応答をアプタマーの濃度に対してプロットし、そして、標準曲線を４パラメーターロジステッィク関数（Ｆｏｕｒ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を使用して作成した。ヒト、ラット、およびサルの血清の中での活性なアプタマーの濃度を測定するために、時点の試料を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００への注入の直前に、ＨＢＳ−Ｐの中に２２．５倍に稀釈して、４％の最終血清濃度とした。個々の血清インキュベーション時間での機能的なアプタマーの濃度を、上記で作成した標準曲線を使用してＲＵ応答単位を濃度に変換することによって計算した。さらなる量の対照測定として、２つのアプタマー標準物を、実験の最後に別々に試験して、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定した濃度が標準物の２０％未満となることを確実にした。最小化した未修飾の元のアプタマーと、デオキシ／ホスホロチオエート修飾されたアプタマーはいずれも、ヒト、ラット、およびサルの血清において、９８時間で９０％を上回る活性であることを決定した。
【０２３９】
本発明は、記載および実施例によってここに記載されており、当業者は、本発明を様々な実施形態で行うことができること、そして上記の記載および実施例は説明の目的のためのものであり、以下の特許請求の範囲を限定する目的のためのものではないことを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２４０】

【図１】図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロでのアプタマーの選択（ＳＥＬＥＸ（登録商標））プロセスの模式図である。
【図２】図２は、Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｇｉｏｎ ＳＥＬＥＸ（登録商標）（ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標））法のフロー図を示す。
【図３】図３は、ＴＲ−ＳＥＬＥＸ（登録商標）選択の前（Ｒ０）および後（Ｒ３）の、転写鋳型の候補のライブラリーの２０個の縮重位置から選択された領域の組み合わせられた平均のヌクレオチド組成のグラフによる分析を示す。
【図４】図４は、転写混合物の中での２’−ＯＨ ＧＴＰスパイク用いた、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ（「ＦＡＲ」）変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ（「ＬＡＲ」）変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用した、ＡＲＣ２１１８、ＡＲＣ２１１９、ＡＲＣ２１２０、およびＡＲＣ２１２１についてのＰＡＧＥゲル分析のＵＶシャドウイングによって定量した、相対的な転写物量を示す。^＊は、所定の量が、ＬＡＲ変異体ポリメラーゼを用いて転写されたＡＲＣ２１１８に対する比較であることを示しており、これは、ＵＶ−シャドウによる最も多い定量された量を示す。
【図５】図５Ａは、野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの核酸配列（配列番号１２０）を示し、そして図５Ｂはアミノ酸配列（配列番号１２１）を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａの核酸配列（配列番号１２２）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｔ７変異体ポリメラーゼＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒの核酸配列（配列番号１２３）を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、変異体Ｔ７ポリメラーゼＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａの核酸配列（配列番号１２４）を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、変異体Ｔ７ポリメラーゼＰ２６６Ｌ／Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒの核酸配列（配列番号１２５）を示す。
【図７】図７は、転写混合物の中でのｒＧＴＰ（２’−ＯＨ ＧＴＰ）の滴定を用いた、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用した、ＡＲＣ２１１８およびＡＲＣ２１１９についてのＰＡＧＥゲル分析のＵＶシャドウイング（ＵＶ ｓｈａｄｏｗｉｎｇ）によって定量した、相対的な転写物量を示す。^＊は、所定の量が２０μＭのｒＧＴＰを用いて転写されたＡＲＣ２１１８に対する比較であることを示しており、これは、ＵＶ−シャドウによる最も多い定量された量を示した。
【図８】図８は、転写混合物の中で様々な濃度の２’−ＯＭｅ ＮＴＰ（Ａ、Ｕ、Ｃ、およびＧ）、ＭｇＣｌ_２、およびＭｎＣｌ_２、ならびに、ｒＧＴＰを含まないもの（２’−ＯＨ ＧＴＰ）を用いた、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したＡＲＣ２１１９についてのＰＡＧＥゲル分析のＵＶシャドウイングによって定量した、相対的な転写物量を示す。所定の量は、１ｍＭの各２’−ＯＭｅ ＮＴＰ、６．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、および２ｍＭのＭｎＣｌ_２の転写条件に対する比較である。
【図９】図９は、Ｙ３６９Ｆ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用した全てのＲＮＡまたは２’−ＯＭｅ転写物の厳密性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）と比較した、Ｙ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた完全なる２’−ＯＭｅ転写物（１００％の２’−ＯＭｅ Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ）のヌクレオチドの挿入、欠失、および置換の分析を示す表である。表中、（１）は、「Ｄｉｒｅｃｔ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ Ａｐｔａｍｅｒ ｔｏ ＶＥＧＦ」Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、（２００５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：２５−３３によるデータを示す。ここでは、転写はＦＡＲ Ｔ７変異体ポリメラーゼを用いて行われた。そして（２）は、転写がＬＡＲ Ｔ７変異体ポリメラーゼを用いて行われたことを示す。
【図１０】図１０は、１回のＹ６３９Ｌ／Ｈ７８４Ａ／Ｋ３７８Ｒ変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた完全なる２’−ＯＭｅ転写、その後のＤＮａｓｅ処理、逆転写、添え木で支えられた連結反応、およびＰＣＲ増幅の前、ならびに後の、完全なる２’−ＯＭｅ転写物（１００％の２’−ＯＭｅ Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）のヌクレオチド組成の割合の分析を示す表である。
【図１１】図１１は、５’から３’方向で示された、その３’末端にキャップ（黒色の丸）を有する最も小さいＭＮＡ抗ＩｇＥアプタマーの図である。
【図１２】図１２は、最小のＭＮＡ抗ＩｇＥアプタマー、２つのデオキシ置換を有する最小のＭＮＡ抗ＩｇＥアプタマー、および１つのデオキシ置換と複数のホスホロチオエート置換を有する最小のＭＮＡ抗ＩｇＥアプタマーの模式図である。それぞれが５’から３’方向で示されており、そしてそれぞれが、その３’末端にキャップ（黒色の丸）を有する。
【図１３】図１３は、標準的なモノＰＥＧ化（ｍｏｎｏ−ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、マルチＰＥＧ化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、およびＰＥＧ化による二量体化を示す、様々なＰＥＧ化のストラテジーを示している図である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
６３９位と７８４位とに改変アミノ酸を含む、単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであって、該７８４位の改変アミノ酸がアラニンである場合には、該６３９位の改変アミノ酸はフェニルアラニンではない、単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
さらに３７８位に改変アミノ酸を含む、請求項１に記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
さらに２６６位に改変アミノ酸を含む、請求項１〜２のいずれかに記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記６３９位の改変アミノ酸がロイシンであり、前記７８４位の改変アミノ酸がアラニンである、請求項１〜３のいずれかに記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記２６６位の改変アミノ酸がロイシンである、請求項１〜４のいずれかに記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記３７８位の改変アミノ酸がアルギニンである、請求項１〜５のいずれかに記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記改変アミノ酸が、２’−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸のみを含む転写反応において、ポリメラーゼによる、２’−ＯＭｅ修飾を含む核酸の転写量を増大させる、請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記転写量の増大が、転写が同じ転写条件下で行われた場合の、前記改変アミノ酸を欠くＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する比較である、請求項８に記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記改変アミノ酸によって、２’−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸に対する識別が低下する、請求項１〜８のいずれかに記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記２’−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸に対する識別の低下が、前記改変アミノ酸を欠くＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する比較である、請求項９に記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記改変アミノ酸を欠くＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位のアミノ酸がフェニルアラニンに変化しており、そして７８４位のアミノ酸がアラニンに変化している野生型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項８または１０に記載の単離されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号２、配列番号１０２、および配列番号１０３からなる群より選択されるアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリメラーゼを、転写を生じるために十分な反応条件下で鋳型核酸とともにインキュベートする工程を含む、一本鎖核酸を転写する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、および配列番号１２５からなる群より選択される、単離された核酸配列。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の単離された核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１７】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１４または１５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１９】
変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが前記細胞によって発現される、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む容器を含む、キット。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含む容器を含む、キット。
【請求項２２】
完全な２’−ＯＭｅ核酸を転写する方法であって、
ａ）変異体ＲＮＡポリメラーゼ、核酸転写鋳型、およびヌクレオシド三リン酸を含む反応混合物中で鋳型核酸をインキュベートする工程であって、該ヌクレオシド三リン酸が２’−ＯＭｅである、工程、ならびに、
ｂ）一本鎖核酸を生じるために十分な時間の間、該転写反応混合物を転写する工程であって、該一本鎖核酸のヌクレオチドは、該転写物の最初のヌクレオチドが２’修飾され得ないことを除き、全てが２’−ＯＭｅ修飾される、工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記変異体ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位と７８４位とに改変アミノ酸を含む変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、請求項１から１２のいずれか１項に記載の変異体Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記転写反応が、さらにマグネシウムイオンを含む、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記転写反応が、さらにマンガンイオンを含む、請求項２２から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記転写反応が、さらに非２’−ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基を含む、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写鋳型がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、請求項２２から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記マグネシウムイオンが、前記マンガンイオンよりも３．０から３．５倍高い濃度で前記転写反応の中に存在する、請求項２６から２８に記載の方法。
【請求項３０】
各ヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が６．５ｍＭであり、そしてマンガンイオンの濃度が２．０ｍＭである、請求項２６から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
各ヌクレオチド三リン酸が１．５ｍＭの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が８ｍＭであり、そしてマンガンイオンの濃度が２．５ｍＭである、請求項２６から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
各ヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が９．５ｍＭであり、そしてマンガンイオンの濃度が３．０ｍＭである、請求項２６から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記転写反応がポリエチレングリコールをさらに含む、請求項２２から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記非２’−ＯＭｅグアノシン非三リン酸残基が、グアノシン一リン酸、グアノシンニリン酸、２’−フルオログアノシン一リン酸、２’−フルオログアノシン二リン酸、２’−アミノグアノシン一リン酸、２’−アミノグアノシンニリン酸、２’−デオキシグアノシン一リン酸、および２’−デオキシグアノシンニリン酸からなる群より選択される、請求項２２から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記転写反応が無機ピロホスファターゼを含む、請求項２２から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
アプタマーを同定するための方法であって、
ａ）請求項１から１２のいずれか１項に記載の変異体ポリメラーゼと、１つ以上の核酸転写鋳型を含む転写反応混合物を調製する工程；
ｂ）該転写反応混合物を転写して、一本鎖核酸の候補混合物を生じる工程であって、該一本鎖核酸のヌクレオチドのうち、必要に応じて１つを除く全てが２’修飾される、工程；
ｃ）該候補混合物を標的分子と接触させる工程；
ｄ）該候補混合物の親和性と比較して、該標的分子に対して高い親和性を有する核酸を、該候補混合物から分離する工程；ならびに、
ｅ）該親和性が高い核酸を増幅して、アプタマーが富化した混合物を得る工程であって、それによって、該アプタマーの最初のヌクレオチドが２’修飾され得ないことを除き、全て２’修飾されたヌクレオチドを含む、該標的分子に対するアプタマーが同定される、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記増幅工程が
（ｉ）必要に応じて、前記親和性が高い核酸を前記標的から解離させること；
ｉｉ）該核酸−標的複合体から解離した該親和性が高い核酸を逆転写すること；
ｉｉｉ）該逆転写された親和性が高い核酸を増幅すること；および
（ｉｉ）前記転写鋳型として該増幅かつ逆転写された親和性が高い核酸を含む転写反応混合物を調製し、前記転写混合物を転写すること、
を包含する、請求項３６に記載の方法：
【請求項３８】
前記転写反応物中のヌクレオチド三リン酸が全て２’−ＯＭｅ修飾される、請求項３６から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上の核酸転写鋳型が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、該Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのすぐ３’側にあるリーダー配列を含む、請求項３６から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
工程ａ）からｅ）を繰り返し行うことを含む、請求項３７から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
転写を増強するための核酸鋳型成分配列を同定する方法であって、
ａ）転写鋳型の候補のライブラリーを調製する工程であって、該鋳型が、プロモーター、該プロモーターのすぐ３’側にある第１の固定領域、該第１の固定領域のすぐ３’側にある縮重領域、および該縮重領域の３’側にある第２の固定領域を含む、工程；
ｂ）転写反応において該転写鋳型の候補のライブラリーを転写して、ある転写物量を有する転写混合物を得る工程；
ｃ）該転写混合物を逆転写して、ｃＤＮＡ鋳型の候補混合物を得る工程であって、該ｃＤＮＡ鋳型が５’末端と３’末端を含む、工程；
ｄ）連結反応において、該プロモーターをコードするＤＮＡ配列を該ｃＤＮＡ鋳型の３’末端に連結する工程；
ｅ）該ｃＤＮＡ鋳型を増幅して、転写鋳型の候補のライブラリーを得る工程；ならびに
ｆ）該転写鋳型の候補のライブラリーから転写を増強するための核酸配列成分を同定する工程であって、該核酸配列成分が、該縮重領域の少なくとも一部に由来する配列を含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
工程ｆ）が、
ｉ）個々の転写鋳型に前記転写鋳型の候補のライブラリーをクローニングする工程；
ｉｉ）転写反応において該個々の転写鋳型を転写して、ある転写物量を生じる工程；
ｉｉｉ）該個々の転写鋳型の転写物量を評価する工程；および
ｉｖ）所定の転写物量を生じる転写鋳型中の前記核酸配列成分を同定する工程
を包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４３】
前記所定の転写物量が、前記転写鋳型の候補混合物を転写することにより工程ｂ）で得られた転写物量よりも多い量である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
工程ｆ）が、前記転写鋳型の候補のライブラリーの縮重領域の塩基組成を分析することと、該転写鋳型の候補のライブラリーの平均の塩基組成に基づいて前記核酸配列成分を同定することとを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
工程ｂ）が、転写された転写混合物をＤＮａｓｅで処理することをさらに含む、請求項４１から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記工程が、前記転写された転写鋳型を前記転写反応の他の成分から分離することによって、該転写された転写混合物を精製することをさらに含む、請求項４１から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記精製工程に、前記転写反応物を脱塩カラムに通過させることによって転写反応緩衝液を置換することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
工程ｄ）が工程ｃ）の前に行われる、請求項４１から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記連結反応が添え木をあてられた連結反応であり、該連結反応が、核酸添え木と、前記プロモーターをコードする５’−一リン酸化オリゴヌクレオチドとを含む、請求項４１から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
工程ｆ）を行う前に、工程ｂ）からｅ）を２回以上繰り返すことをさらに含む、請求項４１から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記転写反応が、１つ以上の改変ヌクレオチド三リン酸と変異したポリメラーゼとを含む、請求項４１から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ以上の改変ヌクレオチド三リン酸が２’改変ヌクレオチド三リン酸である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記変異したポリメラーゼが変異したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記改変ヌクレオチド三リン酸が２’−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸である、請求項５１から５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記転写反応が、マグネシウムイオンとマンガンイオンを含む、請求項５１から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記変異したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、および配列番号１０３からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記マグネシウムイオンが、前記マンガンイオン濃度よりも３．０から３．５倍高い濃度で前記転写反応の中に存在する、請求項５５から５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
各ヌクレオチド三リン酸が１．０ｍＭの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が６．５ｍＭであり、そしてマンガンイオンの濃度が２．０ｍＭである、請求項５５から５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
各ヌクレオチド三リン酸が１．５ｍＭの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が８ｍＭであり、そしてマンガンイオンの濃度が２．５ｍＭである、請求項５５から５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
各ヌクレオチド三リン酸が２．０ｍＭの濃度で前記転写反応の中に存在し、マグネシウムイオンの濃度が９．５ｍＭであり、そしてマンガンイオンの濃度が３．０ｍＭである、請求項５５から５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記転写反応がポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項４１から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記転写反応が、グアノシン一リン酸、グアノシンニリン酸、２’−フルオログアノシン一リン酸、２’−フルオログアノシン二リン酸、２’−アミノグアノシン一リン酸、２’−アミノグアノシンニリン酸、２’−デオキシグアノシン一リン酸、および２’−デオキシグアノシンニリン酸からなる群より選択されるグアノシン残基をさらに含む、請求項４１から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記転写反応が無機ピロホスファターゼを含む、請求項４１から６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１の固定領域が、２個、３個、４個、または５個のグアノシン残基から構成される、請求項４１から６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記縮重領域が、少なくとも４個、１０個、２０個、または３０個のヌクレオチドを含む、請求項４１から６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
同定される前記核酸鋳型成分配列がリーダー配列である、請求項４１から６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記リーダー配列が、前記第１の固定領域と、前記転写鋳型の候補のライブラリーの縮重領域に由来する配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項４１から６８のいずれか１項に記載の方法によって同定された、リーダー配列。
【請求項７０】
配列番号１０から９９からなる群より選択される配列のいずれか１つのヌクレオチド２２からヌクレオチド３２までの核酸配列を含む、リーダー配列。
【請求項７１】
配列番号１０から９９からなる群より選択される配列のいずれか１つのヌクレオチド１８からヌクレオチド３２までの核酸配列を含む、リーダー配列。
【請求項７２】
請求項７０から７１のいずれか１項に記載のリーダー配列を含む、転写鋳型。
【請求項７３】
配列番号３から６および１０６からなる群より選択される、オリゴヌクレオチド転写鋳型。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【公表番号】特表２００９−５０４１３９（Ｐ２００９−５０４１３９Ａ）
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１９６２７（Ｐ２００８−５１９６２７）
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２５６５３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００５６４５
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０７２７２８９８）アーケミックス　コーポレイション (7)
【Ｆターム（参考）】