尿路病原性大腸菌由来の免疫原
病原性大腸菌株に特異的な免疫原性組成物に含まれうる各種ポリペプチドが本明細書において開示される。これらのポリペプチドは、それらを免疫系にとって利用可能にする細胞部位を有する。これらのポリペプチドをコードする遺伝子は、尿路病原菌株５３６に存在するが、非病原菌株には存在しないものとしてはじめに同定された。一実施形態において、本発明の医薬組成物または免疫原性組成物を患者に投与するステップを含む、患者に免疫応答を誘発するための方法も提供される。特定の実施形態において、この免疫応答はＥｘＰＥＣ感染症を防御するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で言及する全ての文書は、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【０００２】
本発明は大腸菌生物学の分野に属し、特に、腸管外病原性大腸菌（ＥｘＰＥＣ）株に対する免疫付与に使用するための免疫原に関する。
【背景技術】
【０００３】
大腸菌ほど多様な微生物は少ない。哺乳動物の正常な腸管微生物叢の重要なメンバーであると同時に、大腸菌は組み換えＤＮＡ技術において宿主として広く用いられている。しかしながら、これに加えて、大腸菌は致死的な病原菌にもなりうる。
【０００４】
大腸菌株は、従来共生細菌または病原性細菌のいずれかに分類されており、病原菌株は腸内細菌株または腸管外細菌株としてさらに細分類される。多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）のなどの最新の分類技術では、大腸菌は５つの系統グループ（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ、およびＥ）に分類され、これらのグループ分類は従来の分類とは一致しない。例えば、ＭＬＥＥによるグループＢ１には共生菌株および病原菌株の両方が含まれ、グループＤには腸内細菌株および腸管外細菌株の両方が含まれる。
【０００５】
大腸菌の腸管外病原菌株（または‘ＥｘＰＥＣ’株［１（非特許文献１）］）は、ＭＬＥＥのグループＢ２およびＤに分類され、尿路病原性（ＵＰＥＣ）株および髄膜炎／敗血症関連（ＭＮＥＣ）株の両方を含む。ＵＰＥＣ株は尿路感染症（ＵＴＩ）の原因となり、膀胱炎の最も一般的な型である。この株はまた、腎盂腎炎（およびその合併症、例えば敗血症）およびカテーテル関連感染症の原因にもなる。ＭＮＥＣ株は新生児髄膜炎を引き起こし（生児出生１０００例当たり０．１症例）、その致死率は２５〜４０％に及び、また敗血症症例のおよそ１／６の原因にもなる。
【０００６】
最も新しいこれまでのＥｘＰＥＣワクチンは、細胞ライセートまたは細胞構造に基づいたものであった。ＳＯＬＣＯＵＲＯＶＡＣ（登録商標）は、６つのＥｘＰＥＣ株をはじめとした１０種類の加熱死菌を含み、第ＩＩ相臨床試験の成功が参考文献２（非特許文献２）において報告されている。ＵＲＯ‐ＶＡＸＯＭ（登録商標）は、１８種の特定の大腸菌株の凍結乾燥細菌ライセートを含有する経口錠剤ワクチンである［３（非特許文献３）］。Ｂａｘｔｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓは、６〜１０種類の異なる株由来の線毛をベースとしたＵＴＩワクチンを開発したが、この製品はすでに廃棄されている。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅは、ＦｉｍＨ接着複合体をベースとしたＭＥＤＩ５１６という名称の製品を開発した［４（非特許文献４）］が、第ＩＩ相臨床試験で示された有効性は不十分なものであった。さらにこのワクチンには、正常な腸内細菌叢中の非病原性ＦｉｍＨ＋ｖｅにも影響を与える可能性があるというリスクがあり、またこのワクチンのその膀胱特異的接着メカニズムのためにＵＰＥＣ株にしか効果を発揮せず、その他のＥｘＰＥＣ株を制御できない可能性が予想された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＲｕｓｓｏおよびＪｏｈｎｓｏｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（２０００）１８１：１７５３−１７５４
【非特許文献２】Ｕｅｈｌｉｎｇら、Ｊ Ｕｒｏｌ（１９９７）１５７：２０４９−２０５２
【非特許文献３】Ｔａｍｍｅｎ、Ｂｒ Ｊ Ｕｒｏｌ（１９９０）６５：６−９
【非特許文献４】Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：６０７−６１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
故に、粗細胞ライセートからより詳細に定義された分子へ移行することを含めて、ＥｘＰＥＣワクチンの改良が求められており、またワクチンへの添加に適したさらなる抗原、特に、ＥｘＰＥＣ株に多く認められ、かつ共生菌株には認められていない抗原の同定が求められている。
【０００９】
これらのニーズに応える方法の１つが参考文献５で報告されており、発明者らはＭＬＥＥのタイプＢ２およびＤのゲノムに存在するがＭＬＥＥのタイプＡおよびＢ１には存在しない遺伝子を検索している。サブトラクティブハイブリダイゼーションに基づくさらなる比較手法が参考文献６および７で報告されている。参考文献８では、ＥｘＰＥＣ株内の病原性遺伝子も同定されている。参考文献９は、ＵＰＥＣ大腸菌株５３６の４つの病原性島の解析を開示している。
【００１０】
参考文献１０では、非病原性大腸菌株に存在しない配列を同定するために、ＵＰＥＣ（Ｏ６：Ｋ２：Ｈ１）株ＣＦＴ０７３のゲノム配列［１１、１２］が使用されている。参考文献１３は、ＵＰＥＣである大腸菌ヒト腎盂腎炎分離株５３６（Ｏ６：Ｋ１５：Ｈ３１）のゲノム配列と、ＣＦＴ０７３（ＵＰＥＣ）、ＥＤＬ９３３（腸管出血性）、およびＭＧ１６５５（非病原性の実験室株）株の配列データとの比較を開示している。病原菌株のゲノム配列は、アクセッション番号ＡＥ００５１７４（ｇｉ：５６３８４５８５）、ＢＡ０００００７（ｇｉ：４７１１８３０１）、およびＮＣ‐００４４３１（ｇｉ：２６２４５９１７）でデータベースにおいて入手可能である。非病原菌株由来の配列は、アクセッション番号Ｕ０００９６（ｇｉ：４８９９４８７３）で入手可能である。
【００１１】
本発明の目的は、病原性大腸菌、特にＥｘＰＥＣ株、より詳細にはＵＰＥＣ株に対する免疫付与に使用するためのさらなる抗原を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
要旨
発明者らは、病原性大腸菌株に特異的な免疫原性組成物に添加されうる各種の遺伝子を同定した。遺伝子は尿路病原菌株（ＵＰＥＣ）由来であるが、非病原菌株には存在しないものであり、それらのコード化タンパク質は、それらを免疫系にとって利用可能にする細胞部位を有する。
【００１３】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、および１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。特定の実施形態において、本発明のこの態様のポリペプチドは、少なくとも１つの（ａ）のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを有する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。特定の実施形態において、本発明のこの態様のポリペプチドは、少なくとも１つの（ａ）のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを有する。
【００１５】
本発明は、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を有する、１つ以上のポリペプチドを発現する１つ以上の外膜ベシクル（ＯＭＶ）を有する免疫原性組成物にさらに関する。特定の実施形態において、本発明のこの態様の免疫原性組成物は、少なくとも１つの（ａ）のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを有する１つ以上のポリペプチドを有する。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、医学分野および患者に免疫応答を誘発するための薬剤の製造において使用されうる。
【００１７】
本発明は、薬学的に許容される担体と混合された本発明のポリペプチドを有する医薬組成物にも関する。本発明は、さらに薬学的に許容される担体と混合された２つ以上の本発明のポリペプチドを有する医薬組成物に関する。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物はさらにワクチンアジュバントを有する。
【００１８】
本発明は、本発明の医薬組成物または免疫原性組成物を患者に投与するステップを含む、患者に免疫応答を誘発するための方法にも関する。特定の実施形態において、免疫応答はＥｘＰＥＣ感染症を防御するものである。
【００１９】
本発明のさらなる態様を下記に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
発明者らは、病原性大腸菌株に特異的な免疫原性組成物に添加されうる各種のポリペプチドを同定した。これらのポリペプチドは、それらを免疫系にとって利用可能にする細胞部位を有する。これらのポリペプチドをコードする遺伝子は、尿路病原菌株５３６に存在するが非病原菌株には存在しないものとしてはじめに同定された。
【００２１】
ポリペプチド
本発明は、実施例において開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。これらのアミノ酸配列は、配列番号１〜１６７として配列表に記載される。配列番号１〜１６７の好ましいサブセットは表２に記載される。
【００２２】
本発明は、実施例において開示されるアミノ酸配列（すなわち配列番号１〜１６８）と配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供する。特定の配列によって、配列同一性の度合いは、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）。これらのポリペプチドは、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子多型、および突然変異体を含む。典型的には、２つのポリペプチド配列間の５０％以上の同一性は、機能的に等価であることの指標であると考えられる。ポリペプチド間の同一性は好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に実装されているようなＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムによって、ギャップ・オープン・ペナルティー＝１２およびギャップ・エクステンション・ペナルティー＝１のパラメーターを用いるアフィンギャップサーチを使用して決定される。
【００２３】
これらのポリペプチドは、実施例の配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の保存的アミノ酸置換、すなわち同じ性質の側鎖を持つ別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換を含む。遺伝的にコード化されたアミノ酸は、一般に４つのファミリー：（１）酸性、すなわちアスパラギン、グルタミン、（２）塩基性、すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、一緒に芳香族アミノ酸として分類される場合がある。一般には、これらのファミリー内での単一アミノ酸置換は、生物学的活性に大きな影響を与えない。ポリペプチドは、リファレンス配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の単一アミノ酸欠失を有していてよい。ポリペプチドは、リファレンス配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の挿入（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸のそれぞれ）も有していてよい。
【００２４】
好ましいポリペプチドには、脂質が付加された、外膜中に存在する、内膜中に存在する、またはペリプラズム中に存在するポリペプチドが含まれる。特に好ましいポリペプチドは、これらのカテゴリーのうちの２つ以上に該当するもの、例えば外膜中に存在する脂質付加ポリペプチドである。リポタンパク質は、シグナルペプチドの翻訳後プロセシング後に脂質が共有結合するＮ末端のシステインを有していてよい。
【００２５】
本発明は、実施例において開示されるアミノ酸配列のフラグメントを有するポリペプチドをさらに提供する。これらのフラグメントは、これらの配列由来の少なくともｎ個の連続するアミノ酸を有する必要があり、特定の配列によって、ｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上）である。フラグメントは、これらの配列の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、または好ましくはＢ細胞エピトープを有してよい。Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープは経験的に同定されうる（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［１４、１５］または同様の方法を用いて）、または、それらは予測されうる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ‐Ｗｏｌｆの抗原性インデックス［１６］、マトリックスベースアプローチ［１７］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１８］、ニューラル・ネットワーク［１９］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２０、２１］、ＡＤＥＰＴ［２２］、Ｔｓｉｔｅｓ［２３］、親水性［２４］、抗原性インデックス［２５］、または参考文献２６で開示されている方法等を使用して）。
【００２６】
その他の好ましいフラグメントは、（ａ）本発明のポリペプチドのＮ末端シグナルペプチド、（ｂ）これらのポリペプチドだが、そのＮ末端シグナルペプチドを持たないもの、（ｃ）これらのポリペプチドだが、そのＮ末端アミノ酸残基を持たないものである。故に本発明は、本発明のポリペプチドの切断配列をさらに提供する。配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端で切断されていてよい。切断は、単一のアミノ酸またはそれよりも長い配列を伴っていてよい。切断配列は、好ましくは切断前の配列の少なくとも１つのエピトープを保持する。例えば、本発明は配列番号：５６のアミノ酸２１番〜４７０番である切断配列、配列番号：１６８を提供する。
【００２７】
その他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドならびに参考文献５、６、８、１０、および１１のいずれかで同定されているポリペプチドに共通するものである。
【００２８】
その他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドおよび参考文献２７、参考文献２８、米国特許仮出願第６０／６５４６３２号明細書（２００５年２月１８日出願：参考文献２７および２８の優先出願）、または米国特許仮出願第６０／７１２７２０号明細書（２００５年８月２９日出願：参考文献２８の優先出願）において同定されているポリペプチドに共通するものである。
【００２９】
本発明は、実施例において開示されるアミノ酸配列と配列同一性を有し、それらのアミノ酸のフラグメントを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供する。特定の配列によって、配列同一性の度合いは、好ましくは５０％より大きく（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）、フラグメントは、配列由来の少なくともｎ個の連続するアミノ酸を有している必要があり、特定の配列によって、ｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上）である。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、多くの方法、例えば化学合成（全体または部分的に）によって、プロテアーゼを使用して長いポリペプチドを消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養から精製することによって（例えば、組み換え発現から）、生物そのものから（例えば、微生物培養後、または患者から直接）等で調整されうる。４０より短いアミノ酸長のペプチドの産生に好ましい方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学合成を伴う［２９、３０］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［３１］化学に基づく方法のような、ペプチド固相合成法は特に好ましい。酵素合成［３２］も部分的または全体に用いられてよい。化学合成に代わるものとして生物学的合成が用いられてよく、例えば、ポリペプチドは翻訳によって産生されてよい。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われてよい。生物学的方法は、一般にＬ‐アミノ酸を基本とするポリペプチドの産生に限定されるが、Ｄ‐アミノ酸（またはその他の非天然アミノ酸、例えばヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニン等）の導入を可能にするために、翻訳機構（例えばアミノアシルｔＲＮＡ分子のもの）の操作が用いられうる［３３］。しかし、Ｄ‐アミノ酸が含められる場合、化学合成を用いるのが好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端において共有結合修飾を有していてよい。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、各種形態をとりうる（例えば天然型、融合型、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、非脂質付加、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体、多量体、粒子状、変性体等）。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、好ましくは精製されたまたは実質的に精製された形態、すなわちその他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、天然ポリペプチドを含まない）、特に他のＥｘＰＥＣまたは宿主細胞のポリペプチドを含まない形態で提供され、一般に少なくとも約５０％の純度（重量で）であり、多くの場合少なくとも約９０％の純度であり、すなわち組成物の約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば５％以下）がその他の発現ポリペプチドで構成されている。本発明のポリペプチドは好ましくはＥｘＰＥＣポリペプチドである。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、固体支持体と結合していてよい。本発明のポリペプチドは検出可能な標識（例えば、放射性標識または蛍光標識、またはビオチン標識）を有していてよい。
【００３４】
語句“ポリペプチド”は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを意味する。ポリマーは、直鎖状または分岐状であってよく、修飾アミノ酸を有していてよく、非アミノ酸で中断されていてよい。この語句は、自然に、または操作的に修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、またはその他任意の操作もしくは修飾、例えば標識成分との結合などがある。この定義には、例えばアミノ酸の１つ以上のアナログを含むポリペプチド（例えば非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当該技術分野で既知のその他の修飾も含まれる。ポリペプチドは、単一鎖または結合鎖として起こりうる。本発明のポリペプチドは、天然にまたは非天然にグリコシル化されていてよい（すなわちポリペプチドが、対応する天然型ポリペプチドに認められるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを持つ）。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、少なくとも４０アミノ酸長であってよい（例えば、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上）。本発明のポリペプチドは、５００アミノ酸より短くてよい（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸より長くない）。
【００３６】
本発明は、配列‐Ｘ‐Ｙ‐または‐Ｙ‐Ｘ‐を有するポリペプチドを提供し、ここで、‐Ｘ‐は上記で定めた通りのアミノ酸配列であり、‐Ｙ‐は上記で定めた配列ではない、すなわち、本発明は融合タンパク質を提供する。ポリペプチドをコードする配列のＮ末端のコドンがＡＴＧではない場合、そのコドンは、コドンが開始コドンとして翻訳される場合に現れるメチオニンとしてではなく、そのコドンの基本的なアミノ酸として翻訳される。
【００３７】
本発明は、本発明のポリペプチドを産生するためのプロセスを提供し、このプロセスは、ポリペプチド発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップを含む。
【００３８】
本発明は、本発明のポリペプチドを産生するためのプロセスを提供し、ポリペプチドは化学的手段を使用して部分的または全体が合成される。
【００３９】
本発明は、２つ以上の本発明のポリペプチドを有する組成物を提供する。
【００４０】
本発明は、式ＮＨ２‐Ａ‐［‐Ｘ‐Ｌ‐］ｎ‐Ｂ‐ＣＯＯＨで表されるハイブリッドポリペプチドも提供し、ここで、Ｘは上記で定められた通りの本発明のポリペプチドであり、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは１よりも大きい整数である。ｎの値は２とｘの間であり、ｘの値は典型的に３、４、５、６、７、８、９、または１０である。好ましくは、ｎは２、３、または４であり、より好ましくは２または３であり、最も好ましくはｎ＝２である。それぞれのｎの場合において、‐Ｘ‐は同一または異なっていてよい。［‐Ｘ‐Ｌ‐］のそれぞれのｎの場合において、リンカーアミノ酸配列‐Ｌ‐は存在または非存在であってよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドはＮＨ２‐Ｘ１‐Ｌ１‐Ｘ２‐Ｌ２‐ＣＯＯＨ、ＮＨ２‐Ｘ１‐Ｘ２‐ＣＯＯＨ、ＮＨ２‐Ｘ１‐Ｌ１‐Ｘ２‐ＣＯＯＨ、ＮＨ２‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｌ２‐ＣＯＯＨ等であってよい。リンカーアミノ酸配列（１つまたは複数）‐Ｌ‐は、典型的には短い（例えば、２０個以下のアミノ酸、すなわち１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例には、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ‐グリシンリンカー（すなわち、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であるＧｌｙｎ）、およびヒスチジンタグ（すなわち、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であるＨｉｓｎ）が含まれる。その他の適当なリンカーアミノ酸配列は当業者には明らかであろう。‐Ａ‐および‐Ｂ‐は、典型的には短い（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）任意の配列である。例には、ポリペプチド輸送を導くリーダー配列、またはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわちｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であるＨｉｓｎ）が含まれる。その他の適当なＮ末端およびＣ末端アミノ酸配列は、当業者には明らかであろう。
【００４１】
本発明のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの免疫原性を評価するため、各種試験が用いられうる。例えば、ポリペプチドは、組み換え発現されて、患者の血清をイムノブロットでスクリーニングするために使用されうる。ポリペプチドと患者血清との間の陽性反応は、問題とされているタンパク質に対する免疫応答を患者が以前に開始したことがある、すなわちそのタンパク質が免疫原であることを示唆するものである。この方法は、免疫優性タンパク質を同定するためにも使用されうる。
【００４２】
抗体
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。これらは、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、任意の適当な手段によって産生されてよい（例えば、組み換え発現によって）。ヒト免疫系との適合性を高めるため、抗体はキメラ化もしくはヒト化されていてよい［例えば、参考文献３４および３５］、または完全なヒト抗体が用いられてよい。抗体は、検出可能な標識（例えば、診断アッセイのため）を含んでよい。本発明の抗体は、固体支持体に結合していてよい。本発明の抗体は好ましくは中和抗体である。
【００４３】
モノクローナル抗体は、それらが標的とする個々のポリペプチドの同定および精製に特に有用である。本発明のモノクローナル抗体は、免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等において試薬として用いられてもよい。これらの応用では、抗体は、分析的に検出可能な試薬、例えば放射性同位元素、蛍光分子、または酵素で標識されうる。上記の方法で産生されたモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの分子的同定およびキャラクタリゼーション（エピトープマッピング）にも使用されてよい。
【００４４】
本発明の抗体は好ましくは大腸菌のＥｘＰＥＣ株に特異的である、すなわち、それらは、その他の細菌と比較して（例えば、ＥｘＰＥＣ以外の大腸菌と比較して、および大腸菌以外の細菌と比較して）、ＥｘＰＥＣ大腸菌に選択的に結合する。より好ましくは、抗体はＵＰＥＣ株に特異的である、すなわち、それらは、他のＥｘＰＥＣ大腸菌を含むその他の細菌と比較してＵＰＥＣ細菌に選択的に結合する。
【００４５】
本発明の抗体は、好ましくは精製された、または実質的に精製された形態で提供される。典型的には、抗体は、その他のポリペプチドを実質的に含まない、例えば組成物の９０％未満（重量で）、多くの場合は６０％未満、より多くの場合は５０％未満がその他のポリペプチドで構成されている組成物中に存在する。
【００４６】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、すなわち重鎖α鎖、γ鎖、またはμ鎖）でありうるが、一般的にはＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内において、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスであってよい。本発明の抗体はκまたはλ軽鎖を有していてよい。
【００４７】
本発明の抗体は、完全抗体、抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖフラグメント（非共有結合性ヘテロ二量体）、一本鎖抗体、例えば一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、オリゴボディ等をはじめとする各種の形態をとりうる。語句“抗体”は、いかなる特定の起源も意味せず、従来にないプロセス、例えばファージディスプレイで得られた抗体を含む。
【００４８】
本発明は、本発明のポリペプチドを検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）抗体‐抗原複合体の形成に適した条件下で、本発明の抗体を生体サンプルと接触させるステップと、（ｂ）前述の複合体を検出するステップとを含む。
【００４９】
本発明は、本発明の抗体を検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）抗体‐抗原複合体の形成に適した条件下で、本発明のポリペプチドと生体サンプル（例えば、血液または血清サンプル）を接触させるステップと、（ｂ）前述の複合体を検出するステップとを含む。
【００５０】
好ましい抗体は、当該技術分野で既知の抗体よりも実質的に高い親和性で本発明のポリペプチドに結合する。好ましくは、親和性は、当分野で既知の抗体よりも少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍等強い。
【００５１】
核酸
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸も提供する。本発明は、そのようなヌクレオチド配列と配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸も提供する。配列間の同一性は、好ましくは、上述のようにＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎのホモロジーサーチアルゴリズムによって決定される。そのような核酸は、同じアミノ酸をコードするのに別のコドンを使用するものを含む。
【００５２】
本発明は、これらの核酸にハイブリダイズしうる核酸も提供する。ハイブリダイゼーション反応は、異なる“ストリンジェンシー”条件下で実施されうる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は、当該技術分野で発表されており周知である［例えば、参考文献２９７のページ７．５２］。関連条件の例は（ストリンジェンシーが増加する順に）：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃、および６８℃のインキュベーション温度、１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣのバッファー濃度（このときＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸バッファーである）およびその他のバッファー系を使用したそれらと同等のもの、０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度、５分〜２４時間のインキュベーション時間、１回、２回、またはそれ以上の洗浄ステップ、１、２、または１５分間の洗浄インキュベーション時間、ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液である。ハイブリダイゼーション技術およびそれらの最適化は、当該技術分野で周知である［例えば、参考文献３６、３７、２９７、２９９等を参照。］
いくつかの実施形態において、本発明の核酸は低ストリンジェンシー条件下で標的とハイブリダイズし、他の実施形態において、本発明の核酸は中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、好ましい実施形態において、本発明の核酸は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、５０℃、１０×ＳＳＣである。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、５５℃、１×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、６８℃、０．１×ＳＳＣである。
【００５３】
これらの配列のフラグメントを有する核酸も提供される。これらは、配列由来の少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを有する必要があり、特定の配列によって、ｎは１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００またはそれ以上）である。好ましいフラグメントは、本発明の核酸配列ならびに参考文献５、６、８、１０、および１１のいずれかにおいて同定された核酸配列に共通のものである。
【００５４】
本発明は、式５’‐Ｘ‐Ｙ‐Ｚ‐３’の核酸を提供し、ここで、‐Ｘ‐はｘ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、‐Ｚ‐はｚ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、‐Ｙ‐は（ａ）配列番号：１〜１６８の１つをコードする核酸配列のフラグメントまたは（ｂ）（ａ）の相補体のいずれかからなるヌクレオチド配列であり、前述の核酸５’‐Ｘ‐Ｙ‐Ｚ‐３’は（ｉ）配列番号：１〜１６８の１つをコードする核酸配列のフラグメントでもないし（ｉｉ）（ｉ）の相補体でもない。‐Ｘ‐および／または‐Ｚ‐部分はプロモーター配列（またはその相補体）を有していてよい。
【００５５】
本発明は、これらの配列に相補的な配列を有する核酸を含む（例えば、アンチセンスまたはプロービング用、またはプライマーとしての使用のため）。
【００５６】
本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイまたは‘遺伝子チップ’において）および増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）ならびにその他の核酸技術において使用されうる。
【００５７】
本発明による核酸は各種の形態をとりうる（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識化等）。本発明の核酸は環状または分岐状であってよいが、一般的には線状である。別段の定めまたは求めがない限り、核酸を利用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成する２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれ、の両方を使用してよい。プライマーおよびプローブは、アンチセンス核酸と同様、一般に一本鎖である。
【００５８】
本発明の核酸は好ましくは、精製された、または実質的に精製された形態で提供される、すなわちその他の核酸を実質的に含まない（例えば、天然の核酸を含まない）、特に他のＥｘＰＥＣまたは宿主細胞の核酸を含まず、一般的には少なくとも約５０％の純度（重量で）であり、多くの場合少なくとも約９０％の純度である。本発明の核酸は好ましくはＥｘＰＥＣの核酸である。
【００５９】
本発明の核酸は、多くの方法、例えば全体または部分的な化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホラミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用した長い核酸の消化によって、短い核酸またはヌクレオチドを連結する（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用して）ことによって、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリ等から調製されてよい。
【００６０】
本発明の核酸は、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マイクロアレイ担体、レジン等）に結合していてよい。本発明の核酸は、例えば放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識で標識されてよい。これは、検出技術において核酸が使用される場合、例えば核酸がプライマーまたはプローブとして使用される場合に特に有用である。
【００６１】
語句“核酸”は一般に、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を意味する。これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが含まれる。これには、ＤＮＡもしくはＲＮＡアナログ、例えば修飾骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオアート）または修飾塩基を含むものが含まれる。故に、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リコンビナント核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマー等を含む。本発明の核酸がＲＮＡの形態をとる場合、５’にキャップを有していても、有していなくてもよい。
【００６２】
本発明の核酸は配列を有するが、それらは非ＥｘＰＥＣ配列も有していてよい（例えば、上記で定めたような、式５’‐Ｘ‐Ｙ‐Ｚ‐３’の核酸中に）。これはプライマーにとって特に有用であり、従って核酸ターゲットに相補的な第１の配列および核酸ターゲットに相補的でない第２の配列を有していてよい。プライマー中の任意のそのような非相補的配列は、好ましくは相補的配列の方向に向かって５’である。典型的な非相補的配列は、制限酵素認識部位またはプロモーター配列を有する。
【００６３】
本発明の核酸はベクターの一部であってよい、すなわち１つ以上の細胞種の形質導入／トランスフェクション用にデザインされた核酸構築物の一部であってよい。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖、および複製用にデザインされた“クローニングベクター”、宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現用にデザインされた“発現ベクター”、組み換えウイルスまたはウイルス様粒子の産生をもたらすようデザインされた“ウイルスベクター”、または２種類以上のベクターの特性を有する“シャトルベクター”であってよい。好ましいベクターはプラスミドである。“宿主細胞”は、外来の核酸のレシピエントたりうる、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異および／または変化の結果、子孫は必ずしも元の親細胞と完全に同一でなくてよい（形態的に、または全ＤＮＡ相補体において）。宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明の核酸をトランスフェクトまたは感染させた細胞を含む。
【００６４】
核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列中の“Ｕ”はＤＮＡ中では“Ｔ”に置換されることが理解される。同様に、核酸がＲＮＡの場合、ＤＮＡ配列中の“Ｔ”はＲＮＡ中では“Ｕ”に置換されることが理解される。
【００６５】
核酸に関して使用される場合の語句“相補体”または“相補的”は、ワトソン・クリック型の塩基対を意味する。故に、Ｃの相補体はＧであり、Ｇの相補体はＣであり、Ａの相補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の相補体はＡである。Ｉ（プリンイノシン）のような塩基を、例えばピリミジン（ＣまたはＴ）の相補体として使用することも可能である。この語句は方向も示唆し、５’‐ＡＣＡＧＴ‐３’の相補体は、５’‐ＴＧＴＣＡ‐３’ではなく５’‐ＡＣＴＧＴ‐３’である。
【００６６】
本発明の核酸は、例えば：ポリペプチドを産生するため、生体サンプル中の核酸検出用のハイブリダイゼーションプローブとして、核酸のさらなるコピーを生成するため、リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するため、一本鎖ＤＮＡプライマーもしくはプローブとして、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして使用されうる。
【００６７】
本発明は、本発明の核酸を産生するためのプロセスを提供し、核酸は、化学的手段を使用して部分的にまたは全体が合成される。
【００６８】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を有するベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００６９】
本発明は、ＥｘＰＥＣ核酸配列中に含まれる鋳型配列を増幅するためのプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）を有するキットも提供し、このキットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを有し、第１のプライマーは前述の鋳型配列に実質的に相補的であり、第２のプライマーは前述の鋳型配列の相補体に実質的に相補的であり、実質的な相補性を有する前述のプライマーの部分が、増幅される鋳型配列の末端を定める。第１のプライマーおよび／または第２のプライマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含んでよい。
【００７０】
本発明は、一本鎖または二本鎖核酸（またはそれらの混合）に含まれるＥｘＰＥＣの鋳型核酸配列の増幅を可能にする、第１および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを有するキットも提供し、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドは、前述の鋳型核酸配列に実質的に相補的なプライマー配列を有し、（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドは、前述の鋳型核酸配列の相補体に実質的に相補的なプライマー配列を有し、（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、前述の鋳型核酸に相補的ではない配列を有し、（ｄ）前述のプライマー配列は、増幅される鋳型配列の末端を定める。特徴（ｃ）の非相補的配列（１つまたは複数）は、好ましくはプライマー配列の上流（すなわち５’）である。これらの（ｃ）の配列の１つまたは両方は、制限酵素認識部位［例えば、参考文献３８］またはプロモーター配列［例えば、３９］を有していてよい。第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含んでよい。
【００７１】
本発明は、本発明の核酸を検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、二本鎖を形成するために本発明による核酸プローブを生体サンプルと接触させるステップと、（ｂ）前述の二本鎖を検出するステップとを含む。
【００７２】
本発明は、生体サンプル（例えば、血液）における検出のためのプロセスを提供し、このプロセスは、ハイブリダイゼーション条件下で本発明による核酸を生体サンプルと接触させるステップを含む。このプロセスは、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）またはハイブリダイゼーション（例、マイクロアレイ、ブロット、溶液中でのプローブとのハイブリダイゼーション等）を伴ってよい。臨床サンプル中のＥｘＰＥＣのＰＣＲ検出が報告されている［例えば、参考文献４０を参照］。核酸ベースの臨床アッセイは参考文献４１において一般的な説明がなされている。
【００７３】
本発明は、ターゲット配列のフラグメントを調製するためのプロセスを提供し、フラグメントは核酸プライマーの伸長によって調製される。ターゲット配列および／またはプライマーは、本発明の核酸である。プライマー伸長反応は、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）を伴ってよい。
【００７４】
本発明による核酸増幅は、定量的および／またはリアルタイムであってよい。
【００７５】
本発明のある実施形態において、核酸は好ましくは、長さが少なくとも７ヌクレオチドである（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００ヌクレオチドまたはそれ以上）。
【００７６】
本発明のある実施形態において、核酸は好ましくは、長さが最大で５００ヌクレオチドである（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチドまたはそれより以下）。
【００７７】
本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションに用いられるその他の核酸は、好ましくは長さが１０〜３０ヌクレオチドである（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）。
【００７８】
ベシクル
参考文献４２は、ｍｌｔＡ（ムレイン溶解性トランスクリコシラーゼ）または大腸菌Ｔｏｌ‐Ｐａｌ複合体［４３］の成分の１つ以上、例えばｔｏｌＡ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、および／またはｔｏｌＲのノックアウトによる、尿路病原性（ＵＰＥＣ）株からのベシクルの調製を説明している。ベシクルの表面上の防御性抗原の量および／またはイムノアクセシビリティを高めるために、細菌の染色体に対して１つ以上のさらなる遺伝子変化を起こすことによって、またはエピソーム要素（例えば、発現ベクター）を挿入することでこれらのベシクルが改良されうる。
【００７９】
そのような改良を得る一つの方法は、本発明のポリペプチドの発現を上方制御することである。ターゲットタンパク質の発現を高めるための多くの異なる遺伝学的戦略が当分野で周知であり、２つの大きなカテゴリーに分けられる：１つは、内在性遺伝子の発現を高めるために染色体の改変を利用するもの（例えば、より強力なプロモーターによる野生型プロモーターの置換、天然の抑制遺伝子の不活化等）であり、もう１つはエピソーム要素（例えば、高コピー数プラスミド、遺伝子操作されたターゲット遺伝子を有するベクター等）または染色体への外来遺伝子の組み込みによる組み換え発現に基づくものである。これらのアプローチのそれぞれの実例は、参考文献４４〜５０に認められる。
【００８０】
ベシクルの免疫原性および選択性を高める別の方法は、免疫優性非防御抗原の発現を下方制御すること、または共生菌株に認められるタンパク質と相同なタンパク質を下方制御することである。ＬＰＳのリピドＡ部分の解毒によってさらなる改善が達成されうる。その他のグラム陰性病原菌から改良ベシクルを産生するための同様の変化がこれまでに説明されている（例えば、参考文献５１および５２を参照）。
【００８１】
免疫原性組成物に使用するための改良ベシクルを得るために、上記の全ての戦略が単独で、または組み合わせて使用されうる。本発明は、ｍｌｔＡおよび／またはそのＴｏｌ‐Ｐａｌ複合体の成分がノックアウトされ、（ｉ）ポリペプチドをコードする遺伝子と天然に結合しているプロモーターに比べて高いポリペプチドの発現レベルを提供するプロモーターで制御される、本発明のポリペプチドをコードする染色体性遺伝子、または（ｉｉ）本発明のポリペプチドをコードする自己複製染色体外要素のうちの１つ以上と、場合により（ｉｉｉ）大腸菌ＬＰＳのリピドＡ部分の毒性を、野生型ＬＰＳと比較して低下させるための遺伝子修飾の１つ以上を有する病原性大腸菌（特にＵＰＥＣ）を提供する。
【００８２】
本発明は、そのような細菌を培養することで入手可能なベシクル、例えば細菌の培養中に培地に放出されるベシクルを提供する。
【００８３】
特定の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドを発現する、１つ以上の外膜ベシクル（ＯＭＶ）を有する免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１〜１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を有する１つ以上のポリペプチドを発現する、１つ以上のＯＭＶを有する免疫原性組成物を提供する。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、配列番号１〜１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを有するフラグメントを有するポリペプチドを有する。
【００８４】
医薬組成物
本発明は、（ａ）本発明のポリペプチド、抗体、ベシクル、および／または核酸と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを有する組成物を提供する。これらの組成物は、例えば免疫原性組成物として、または診断用試薬として、またはワクチンとして適していてよい。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち感染を防ぐ）または治療的（すなわち感染を治療する）のいずれかであってよいが、典型的には予防的なものである。
【００８５】
‘薬学的に許容される担体’は、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体が誘導することのない任意の担体を含む。好適な担体は、典型的には大型で、ゆっくりと代謝される高分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、ショ糖、トレハロース、乳糖、および脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）である。そのような担体は当業者に周知である。ワクチンは、希釈剤、例えば水、生理食塩水、グリセロール等も含んでよい。さらに、添加物、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが存在していてよい。パイロジェンフリーの、リン酸緩衝生理食塩水が典型的な担体である。薬学的に許容される賦形剤は、参考文献２９４で詳しく取り上げられている。
【００８６】
本発明の組成物は、特に複数回投与形式に包装される場合、抗菌剤を含んでよい。
【００８７】
本発明の組成物は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を有していてよい。界面活性剤は一般に、例えば＜０．０１％の低いレベルで存在する。
【００８８】
本発明の組成物は、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含んでよい。濃度１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌが典型的である。
【００８９】
本発明の組成物は一般に緩衝液を含む。リン酸緩衝液が典型的である。
【００９０】
本発明の組成物は、特に、もしそれらが凍結乾燥される場合、またはもしそれらが凍結乾燥材料から再構成された材料を含む場合は、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、白糖またはトレハロース）を、例えばおよそ１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で有していてよい。凍結乾燥用の組成物のｐＨは、凍結乾燥の前におよそ６．１に調節されてよい。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、その他の免疫調節物質と併せて投与されてよい。特に、組成物は多くの場合ワクチンアジュバントを含む。アジュバントは、下記でさらに説明するＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる群の１つ以上から選択されてよい。本発明の組成物に用いられてよいアジュバントには：以下が含まれるがこれらに限定されない。
【００９２】
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したミネラル含有組成物には、ミネラル塩、例えばアルミニウム塩およびカルシウム塩が含まれる。本発明は、ミネラル塩、例えば水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスファート、オルトホスファート）、硫酸塩等［例えば、参考文献５３の第８章および第９章参照］、または異なるミネラル化合物の混合物（例えば、リン酸塩および水酸化物アジュバントの混合物、場合によりリン酸塩が過剰量）を含み、化合物は任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質等）をとり、塩（１つまたは複数）への吸着が好ましい。ミネラル含有組成物は、金属塩の粒子として製されてもよい［５４］。
【００９３】
典型的なリン酸アルミニウムアジュバントは、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで添加されたＰＯ４／Ａｌのモル比が０．８４〜０．９２の非晶質アルミニウムヒドロキシホスファートである。例えば１ドーズ当たりの複合体につき５０〜１００μｇＡｌ３＋で、低用量のリン酸アルミニウムでの吸着が用いられてよい。リン酸アルミニウムが用いられ、抗原をアジュバントに吸着させないことが望ましい場合、遊離リン酸イオンが溶液へ添加される（例えば、リン酸バッファーの使用によって）。
【００９４】
リン酸アルミニウムの零電荷点（ＰＺＣ）は、リン酸塩のヒドロキシル基への置換度に反比例し、この置換度は、沈殿による塩の生成に用いられる反応条件および反応物の濃度に応じて変化しうる。ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させることによって（リン酸塩が多い＝ＰＺＣがより酸性になる）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝液を加えることによって（ＰＺＣがより塩基性になる）も、ＰＺＣが変化する。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムのＰＺＣは一般に、４．０〜７．０であり、より好ましくは５．０〜６．５であり、例えば約５．７である。
【００９５】
本発明の組成物を調製するために用いられるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝剤またはトリス緩衝液）を含んでよいが、これは必ずしも必要ではない。懸濁液は好ましくは滅菌済みでパイロジェンフリーである。懸濁液は、例えば１．０〜２０ｍＭの濃度、好ましくは５〜１５ｍＭの濃度、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する水溶性遊離リン酸イオンを含んでいてよい。懸濁液は塩化ナトリウムも有していてよい。
【００９６】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用できる。この場合、水酸化アルミニウムよりもリン酸アルミニウムが多く、例えば重量比で少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１等で存在していてよい。
【００９７】
１ドーズ当たりのＡｌ３＋の用量が０．２〜１．０ｍｇとなるように、アルミニウム塩が本発明のワクチンに添加されてよい。
【００９８】
Ｂ．オイルエマルション
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したオイルエマルション組成物には、スクアレン‐水エマルション、例えばＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に調製された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％スパン８５）が含まれる［参考文献５３の第１０章。参考文献５５〜５７、参考文献５８の第１２章も参照されたい］。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（登録商標）インフルエンザウイルス３価サブユニットワクチンにおいてアジュバントとして用いられる。このエマルションは、遊離にはクエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【００９９】
この組成物において使用するのに特に好ましいアジュバントは、サブミクロンの水中油型エマルションである。本明細書で使用するのに好ましいサブミクロン水中油型エマルションは、場合により各種の量のＭＴＰ‐ＰＥを含むスクアレン／水エマルション、例えば４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、および／または０．２５〜１．０％スパン８５（ソルビタントリオレアート）ならびに、場合によりＮ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミニル‐Ｌ‐アラニン‐２‐（１’‐２’‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ヒドロキシホスホリルオキシ）‐エチルアミン（ＭＴＰ‐ＰＥ）を含む、サブミクロンの水中油型エマルションである。この組成物中に使用するための、サブミクロンの水中油型エマルション、これと免疫刺激物質、例えばムラミルペプチドを調製する方法は参考文献５５および５９〜６０で詳細に説明されている。
【０１００】
スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ８０のエマルションが使用されうる。このエマルションは、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。これは、スパン８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含んでよい。これらのエマルションは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を含んでよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１であり、この値はより安定したエマルションをもたらす。そのようなエマルションの１つは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解して２％溶液を得、この溶液の９０ｍｌを（５ｇのＤＬ‐α‐トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）のミクスチャーと混合した後、このミクスチャーをミクロフルイダイズすることによって調製されうる。得られたエマルションは、例えば平均径が１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍのサブミクロン油滴を有していてよい。
【０１０１】
スクアレン、トコフェロール、およびトリトン界面活性剤（例えば、トリトンＸ‐１００）のエマルションも使用されうる。
【０１０２】
スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（“プルロニック（登録商標）Ｌ１２１”）のエマルションが使用されうる。このエマルションは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で調製されうる。このエマルションは、ムラミルジペプチドの有用な送達担体であり、“ＳＡＦ‐１”アジュバント［６１］においてトレオニル‐ＭＤＰと使用されている（０．０５〜１％Ｔｈｒ‐ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％プルロニックＬ１２１、および０．２％ポリソルベート８０）。これは、“ＡＦ”アジュバント［６２］にみられるようにＴｈｒ‐ＭＤＰなしでも使用されうる（５％スクアラン、１．２５％プルロニックＬ１２１、および０．２％ポリソルベート８０）。ミクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０１０３】
本発明において、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）もアジュバントとして用いてよい。
【０１０４】
Ｃ．サポニン製剤［参考文献５３の第２２章］
サポニン製剤も本発明においてアジュバントとして使用されてよい。サポニンは、幅広い植物種の樹皮、葉、茎、根、および花にも認められるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種のグループである。シャボンのきの樹皮から分離されるサポニンはアジュバントとして広く研究されている。サポニンはスミラックスオルタナ（サルサパリラ）、シュコンカスミソウ（ブライダルベール）、およびサポナリア（サボンソウ）から商業的に得ることも可能である。サポニンアジュバント製剤は、精製製剤、例えばＱＳ２１だけでなく、脂質製剤、例えばＩＳＣＯＭを含む。
【０１０５】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ‐ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を用いた特定の精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ‐Ａ、ＱＨ‐Ｂ、およびＱＨ‐Ｃが含まれる。好ましくは、サポニンはＱＳ‐２１である。ＱＳ‐２１の製造方法は参考文献６３に開示されている。サポニン製剤は、ステロール、例えばコレステロールも有していてよい［６４］。
【０１０６】
サポニンとコレステロールの組み合わせは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成するために使用されうる［参考文献５３の第２３章］。ＩＳＣＯＭは典型的には、リン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンも含む。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭで使用されうる。好ましくは、ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献６４〜６６でさらに説明されている。場合により、ＩＳＣＯＭは追加の界面活性剤（１つまたは複数）を欠いていてよい［６７］。
【０１０７】
サポニン系アジュバントの開発のレビューは、参考文献６８および６９に認められる。
【０１０８】
Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子
ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明においてアジュバントとして使用されうる。これらの構造は一般的に、場合によりリン脂質と組み合わされたまたは製された、ウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。それらは一般に非病原性であり、複製せず、一般にいかなる天然のウイルスゲノムも含まない。ウイルスタンパク質は、組み換えによって産生されてよく、または、全ウイルスから単離されてよい。ビロゾームまたはＶＬＰへの使用に適したこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（例えばＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えばコアタンパク質またはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（例えば外殻タンパク質）、ＧＡファージ、ｆｒ‐ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えばレトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）から得られたタンパク質を含む。ＶＬＰは参考文献７０〜７５でさらに論じられている。ビロゾームは、例えば参考文献７６でさらに論じられている。
【０１０９】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明において使用するのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびＡＤＰ‐リボシル化毒素、ならびにこれらの無毒化誘導体を含む。
【０１１０】
ＬＰＳの非毒性誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３‐Ｏ‐デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、３デ‐Ｏ‐アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５、または６つのアシル化鎖の混合体である。好ましい“小粒子”形態の３デ‐Ｏ‐アシル化モノホスホリルリピドＡは参考文献７７に開示されている。そのような“小粒子”の３ｄＭＰＬは、０．２２μｍメンブレンで滅菌濾過するのに十分な小ささである［７７］。その他の非毒性ＬＰＳ誘導体は、モノホスホリルリピドＡ模倣体、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスファート誘導体、例えばＲＣ‐５２９を含む［７８、７９］。
【０１１１】
リピドＡ誘導体は、ＯＭ‐１７４のような大腸菌由来のリピドＡの誘導体を含む。ＯＭ‐１７４は、例えば参考文献８０および８１で説明されている。
【０１１２】
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンに結合した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含む。回文配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが示されている。
【０１１３】
ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾／アナログ、例えばホスホロチオアート修飾を含むことができ、二本鎖または一本鎖でありうる。参考文献８２、８３、および８４は、可能なアナログ置換、例えば２’‐デオキシ‐７‐デアザグアノシンによるグアノシンの置換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は参考文献８５〜９０でさらに論じられている。
【０１１４】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ等のＴＬＲ９を標的としてよい［９１］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ‐Ａ ＯＤＮのようにＴｈ１免疫応答の誘発に特異的であってよい、またはＣｐＧ‐Ｂ ＯＤＮのようにＢ細胞応答の誘発により特異的であってもよい。ＣｐＧ‐ＡおよびＣｐＧ‐Ｂ ＯＤＮは参考文献９２〜９４で論じられている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ‐Ａ ＯＤＮである。
【０１１５】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用可能となるように構築される。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がそれらの３’末端で結合して、“イムノマー”を形成してもよい。例えば、参考文献９１および９５〜９７を参照されたい。
【０１１６】
その他の免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、二本鎖ＲＮＡ、または回文配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１１７】
細菌性ＡＤＰ‐リボシル化毒素およびその無毒化誘導体が、本発明においてアジュバントとして用いられてよい。好ましくは、タンパク質は大腸菌（大腸菌易熱性エンテロトキシン“ＬＴ”）、コレラ（“ＣＴ”）、または百日咳（“ＰＴ”）由来である。無毒化ＡＤＰ‐リボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用は参考文献９８で、非経口アジュバントとしての使用は参考文献９９で説明されている。毒素またはトキソイドは好ましくは、ホロトキシンの形態であり、ＡおよびＢサブユニットの両方を有する。好ましくは、Ａサブユニットは無毒化変異を有し、好ましくは、Ｂサブユニットは変異していない。好ましくは、アジュバントは無毒化ＬＴ変異体、例えばＬＴ‐Ｋ６３、ＬＴ‐Ｒ７２、およびＬＴ‐Ｇ１９２である。ＡＤＰ‐リボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ‐Ｋ６３およびＬＴ‐Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、参考文献１００〜１０７に認められる。アミノ酸置換の数に関する言及は、好ましくは参考文献１０８で説明されるＡＤＰ‐リボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づいている。
【０１１８】
参考文献１０９で定められているように、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物
【０１１９】
【化１】
、およびこれらの塩もアジュバントとして使用されてよく、例えば‘ＥＲ８０３０５８’、‘ＥＲ８０３７３２’、‘ＥＲ８０４０５３’、‘ＥＲ８０４０５８’、‘ＥＲ８０４０５９’、‘ＥＲ８０４４４２’、‘ＥＲ８０４６８０’、‘ＥＲ８０４７６４’、‘ＥＲ８０３０２２’、または‘ＥＲ８０４０５７’、例として、
【０１２０】
【化２】
がある。
【０１２１】
Ｆ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節物質には、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１２［１１０］等）［１１１］、インターフェロン（例えば、インターフェロン‐γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、ならびにマクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ‐１α）およびＭＩＰ‐１β［１１２］が含まれる。
【０１２２】
Ｇ．生体接着物質および粘膜付着物質
生体接着物質および粘膜付着物質も本発明においてアジュバントとして使用されてよい。好適な生体接着物質には、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［１１３］または粘膜付着物質、例えばポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体が含まれる。キトサンおよびその誘導体も本発明においてアジュバントとして使用されてよい［１１４］。
【０１２３】
Ｈ．ミクロ粒子
ミクロ粒子も本発明においてアジュバントとして使用されてよい。生体分解性で無毒の材料（例えば、ポリ（α‐ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン等）と、ポリ（ラクチド‐ｃｏ‐グリコリド）から形成されたミクロ粒子（すなわち、直径が〜１００ｎｍから〜１５０μｍ、より好ましくは直径が〜２００ｎｍから〜３０μｍ、最も好ましくは直径が〜５００ｎｍから〜１０μｍの粒子）が好ましく、場合により負に帯電した表面（例えば、ＳＤＳで）または正に帯電した表面（例えば、カチオン性界面活性剤、例えばＣＴＡＢで）を持つよう処理される。
【０１２４】
Ｉ．リポソーム（参考文献５３の第１３および第１４章）
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献１１５〜１１７で説明されている。
【０１２５】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明での使用に適したアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが含まれる［１１８］。そのような製剤は、オクトキシノールとの組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１１９］のみならず、少なくとも１つの追加の非イオン界面活性剤、例えばオクトキシノールとの組み合わせのポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［１２０］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ９）、ポリオキシエチレン‐９‐ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン‐８‐ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン‐４‐ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン‐３５‐ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン‐２３‐ラウリルエーテル。
【０１２６】
Ｋ．ホスファゼン、例えばＰＣＰＰ
ホスファゼンアジュバントは、例えば参考文献１２１および１２２で説明されるようなポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（“ＰＣＰＰ”）を含む。
【０１２７】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの例には、Ｎ‐アセチル‐ムラミル‐Ｌ‐トレオニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ｔｈｒ‐ＭＤＰ）、Ｎ‐アセチル‐ノルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ｎｏｒ‐ＭＤＰ）、およびＮ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミニル‐Ｌ‐アラニン‐２‐（１’‐２’‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ヒドロキシホスホリルオキシ）‐エチルアミン ＭＴＰ‐ＰＥが含まれる。
【０１２８】
Ｍ．イミダゾキノリン化合物
イミダゾキノリンアジュバントは、イミキモド（“Ｒ‐８３７”）［１２３、１２４］、レシキモド（“Ｒ‐８４８”）［１２５］、およびこれらのアナログ、ならびにこれらの塩（例えば、塩酸塩）を含む。免疫刺激性イミダゾキノリンの詳細は、参考文献１２６〜１３０に認められる。
【０１２９】
Ｎ．チオセミカルバゾン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した、チオセミカルバゾン化合物の例だけでなく、化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法には、参考文献１３１で説明されているものが含まれる。チオセミカルバゾンは、ヒト末梢血液中の単核球を刺激して、サイトカイン、例えばＴＮＦ‐αを産生させるのに特に効果的である。
【０１３０】
Ｏ．トリプタントリン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した、トリプタントリン化合物の例だけでなく、化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法には、参考文献１３２で説明されているものが含まれる。トリプタントリン化合物は、ヒト末梢血液中の単核球を刺激して、サイトカイン、例えばＴＮＦ‐αを産生させるのに特に効果的である。
【０１３１】
Ｐ．ヌクレオシドアナログ
各種のヌクレオシドアナログがアジュバントとして使用されうる、例えば（ａ）イサトリビン（ＡＮＡ‐２４５、７‐チア‐８‐オキソグアノシン）：
【０１３２】
【化３】
およびそのプロドラッグ、（ｂ）ＡＮＡ９７５、（ｃ）ＡＮＡ‐０２５‐１、（ｄ）ＡＮＡ３８０、（ｅ）参考文献１３３〜１３５に開示の化合物、（ｆ）式
【０１３３】
【化４】
を有する化合物であって、
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ、ハロゲン、‐ＮＲａＲｂ、‐ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり、
Ｒ３は、非存在、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換へテロシクリルであり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＨ、ハロゲン、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒｄ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキルである、または一緒に結合してＲ４〜５
【０１３４】
【化５】
のような５員環を形成し、
結合は
【０１３５】
【化６】
で示される化学結合で達成されており、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立してＮ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり、
Ｒ８は、Ｈ、ハロゲン、‐ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、‐ＯＨ、‐ＮＲａＲｂ、‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｏ‐Ｒｃ、‐Ｏ‐（Ｃ１〜６アルキル）、‐Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒｄであり、
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、またはＲ９ａであり、ここでＲ９ａは
【０１３６】
【化７】
であり、結合は
【０１３７】
【化８】
で示される化学結合で達成されており、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、‐ＮＲａＲｂ、または‐ＯＨであり、
各ＲａおよびＲｂは独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒｄ、Ｃ６〜１０アリールであり、
各Ｒｃは独立して、Ｈ、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり、
各Ｒｄは独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、‐ＮＨ２、‐ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、‐ＮＨ（置換Ｃ１〜６アルキル）、‐Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、‐Ｎ（置換Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ６〜１０アリール、またはヘテロシクリルであり、
各Ｒｅは独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換へテロシクリルであり、
各Ｒｆは独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒｄ、ホスファート、ジホスファート、またはトリホスファートであり、
各ｎは独立して、０、１、２、または３であり、
各ｐは独立して、０、１、または２である、あるいは、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、または互変異性体の薬学的に許容される塩である。
【０１３８】
Ｑ．リン酸含有非環式骨格に結合した脂質
リン酸含有非環式骨格に結合した脂質を含むアジュバントは、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１３６、１３７］：
【０１３９】
【化９】
を含む。
【０１４０】
Ｒ．小分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）
ＳＭＩＰは、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐エチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐ブチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐ブチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐ペンチル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロプ‐２‐エニル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・１‐（２‐メチルプロピル）‐２‐［（フェニルメチル）チオ］‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐４‐アミン、
・１‐（２‐メチルプロピル）‐２‐（プロピルチオ）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐４‐アミン、
・２‐［［４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐イル］（メチル）アミノ］エタノール、
・２‐［［４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐イル］（メチル）アミノ］エチルアセタート、
・４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１，３‐ジヒドロ‐２Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐オン、
・Ｎ２‐ブチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐ブチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・１‐｛４‐アミノ‐２‐［メチル（プロピル）アミノ］‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐１‐イル｝‐２‐メチルプロパン‐２‐オール、
・１‐［４‐アミノ‐２‐（プロピルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐１‐イル］‐２‐メチルプロパン‐２‐オール、
・Ｎ４，Ｎ４‐ジベンジル‐１‐（２‐メトキシ‐２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、を含む。
【０１４１】
Ｓ．プロテオソーム
アジュバントの１つは、第２のグラム陰性細菌から得られたリポサッカライド製剤と組み合わせて第１のグラム陰性細菌から調製された外膜タンパク質プロテオソーム製剤であり、この外膜タンパク質プロテオソームおよびリポサッカライド製剤は、安定した非共有結合性アジュバント複合体を形成する。そのような複合体には“ＩＶＸ‐９０８”が含まれ、これは髄膜炎菌の外膜およびリポ多糖からなる複合体である。これらは、インフルエンザワクチンにアジュバントとして用いられている［１３８］。
【０１４２】
Ｔ．その他のアジュバント
免疫刺激剤として作用するその他の物質は、参考文献５３および５８に開示されている。さらなる有用なアジュバント物質には以下が含まれるがこれらに限定されない：
・メチルイノシン５’モノホスファート（“ＭＩＭＰ”）［１３９］。
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１４０］、例えば、式
【０１４３】
【化１０】
を有するものであって、
式中、Ｒは、水素、直鎖もしくは分岐、非置換または置換、飽和もしくは不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニル、およびアリール基、またはこれらの薬学的に許容される塩もしくは誘導体からなる群から選択される。例には、カスアリン、カスアリン‐６‐α‐Ｄ‐グルコピラノース、３‐ｅｐｉ‐カスアリン、７‐ｅｐｉ‐カスアリン、３，７‐ｄｉｅｐｉ‐カスアリン等が含まれるがこれらに限定されない。
・ガンマイヌリン［１４１］またはその誘導体、例えばアルガムリン。
・参考文献１４２に開示の化合物。
・参考文献１４３に開示の化合物であり、アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１４４、１４５］、ヒドロフタルイミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナゾリノン化合物、ピロール化合物［１４６］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン化合物、およびベンザゾール化合物［１４７］が含まれる。
・ロキソリビン（７‐アリル‐８‐オキソグアノシン）［１４８］。
・カチオン性脂質および（通常は中性の）コリピッドの製剤、例えばアミノプロピル‐ジメチル‐ミリストレイルオキシ‐プロパンアミニウムブロミド‐ジフィタノイルホスファチジル‐エタノールアミン（“Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）”）またはアミノプロピル‐ジメチル‐ビス‐ドデシルオキシ‐プロパンアミニウムブロミド‐ジオレオイルホスファチジル‐エタノールアミン（“ＧＡＰ‐ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ”）である。（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（ｓｙｎ‐９‐テトラデセネイルオキシ）‐１‐プロパンアミニウム塩を含む製剤が好ましい［１４９］。
【０１４４】
本発明は、上記で定めたアジュバントの１つ以上の組み合わせも含んでよい。例えば、以下の組み合わせが本発明においてアジュバント組成物として用いられてよい：（１）サポニンおよび水中油型エマルション［１５０］、（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１５１］、（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール、（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ‐１２（場合により＋ステロール）［１５２］、（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルションの組み合わせ［１５３］、（６）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、５％プルロニックブロック重合体Ｌ１２１、およびｔｈｒ‐ＭＤＰを含有するＳＡＦであって、ミクロフルイダイザーでサブミクロンエマルションにしたもの、またはボルテックスにかけてより大きな粒子サイズのエマルションを調製したもののいずれか、（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（登録商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（登録商標）、（８）１つ以上のミネラル塩（例えばアルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）、および（９）１つ以上のミネラル塩（例えばアルミニウム塩）＋免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１４５】
本発明の組成物は、尿路病原性感染症に効果的に対処するために、好ましくは細胞性免疫応答だけでなく体液性免疫応答の両方を誘発する。この免疫応答は好ましくは、長期持続性（例えば、中和）抗体およびＵＰＥＣ関連抗原への曝露の際に迅速に反応しうる細胞性免疫を誘発する。
【０１４６】
２種類のＴ細胞、ＣＤ４およびＣＤ８細胞は、一般に細胞性免疫および体液性免疫を開始および／または増強するのに必要であると考えられている。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＣＤ８コレセプターを発現でき、一般に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれる。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示された抗原を認識できる、またはその抗原と相互作用可能である。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＣＤ４コレセプターを発現でき、一般にヘルパーＴ細胞と呼ばれる。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原ペプチドを認識する能力を持つ。ＣＤ４細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用の際に、サイトカインなどの因子を分泌しうる。これらの分泌サイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与するその他の細胞を活性化できる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に異なるサブセットにさらに分類されうる：サイトカインおよびエフェクター機能が異なるＴＨ１フェノタイプおよびＴＨ２フェノタイプである。
【０１４７】
活性化ＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増強し（抗原特異的ＣＴＬ産生の増加を含む）、従って細胞内感染への応答において特に有用である。活性化ＴＨ１細胞は、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐γ、およびＴＮＦ‐βの１つ以上を分泌してよい。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することによって局所的な炎症性反応をもたらしてよい。ＴＨ１免疫応答は、ＩＬ‐１２によってＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することにより免疫応答を拡大するように作用してもよい。ＴＨ１によって刺激されたＢ細胞はＩｇＧ２ａを分泌してよい。
【０１４８】
活性化ＴＨ２細胞は、抗体産生を増強し、従って細胞外感染への応答において特に有用である。活性化ＴＨ２細胞は、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０の１つ以上を分泌してよい。ＴＨ２免疫応答は、さらなる防御のためＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞の産生をもたらしてよい。
【０１４９】
増強された免疫応答は、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の１つ以上を含んでよい。増強されたＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答に関与するサイトカイン（例えば、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐γ、およびＴＮＦ‐β）の１つ以上の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａの産生の増加のうちの１つ以上を含んでよい。好ましくは、増強されたＴＨ１免疫応答は、ＩｇＧ２ａ産生の増加を含む。増強されたＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答に関与するサイトカイン（例えば、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０）の１つ以上の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞の産生の増加のうちの１つ以上を含んでよい。好ましくは、増強されたＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１産生の増加を含む。
【０１５０】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発されてよい。ＴＨ１アジュバントは一般に、アジュバントなしでの抗原の免疫付与と比較して、ＩｇＧ２ａ産生レベルの増加を誘発することになる。本発明において使用するのに適したＴＨ１アジュバントは、例えばサポニン製剤、ビロゾームおよびウイルス様粒子、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでよい。免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、本発明で使用するのに好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０１５１】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発されてよい。ＴＨ２アジュバントは一般に、アジュバントなしでの抗原の免疫付与と比較して、ＩｇＧ１産生レベルの増加を誘発することになる。本発明において使用するのに適したＴＨ２アジュバントは、例えば、ミネラル含有組成物、油エマルション、ならびにＡＤＰ‐リボシル化毒素およびその無毒化誘導体を含む。ミネラル含有組成物、例えばアルミニウム塩は、本発明で使用するのに好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０１５２】
好ましくは、本発明は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントの組み合わせを有する組成物を含む。好ましくは、そのような組成物は、増強されたＴＨ１および増強されたＴＨ２応答、すなわちアジュバントなしでの免疫付与と比較して、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ両方の産生の増加を誘発する。さらにより好ましくは、ＴＨ１およびＴＨ２アジュバントの組み合わせを有する組成物は、単独のアジュバントでの免疫付与と比較して（すなわち、ＴＨ１アジュバント単独での免疫付与またはＴＨ２アジュバント単独での免疫付与と比較して）、ＴＨ１免疫応答の増加および／またはＴＨ２免疫応答の増加を誘発する。
【０１５３】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答のうちの１つまたは両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答のうちの１つまたは両方をもたらす。
【０１５４】
増強された免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜性免疫応答のうちの１つまたは両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、増強された全身性免疫応答および増強された粘膜性免疫応答のうちの１つまたは両方をもたらす。好ましくは、粘膜性免疫応答はＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜性免疫応答はＩｇＡ産生の増加を含む。
【０１５５】
水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は特に好ましく、抗原は一般にこれらの塩に吸着される。
【０１５６】
本発明の組成物のｐＨは好ましくは６〜８の間であり、好ましくは約７である。緩衝液の使用によって安定したｐＨが維持されてよい。組成物が水酸化アルミニウム塩を有する場合は、ヒスチジン緩衝剤を使用するのが好ましい［１５４］。組成物は滅菌済みおよび／またはパイロジェンフリーであってよい。本発明の組成物は、ヒトに対して等張である。
【０１５７】
組成物は、バイアルで提供されてよく、または充填済みシリンジで提供されてよい。シリンジは針あり、または針なしで供給されてよい。シリンジが単回用量の組成物を含む一方で、バイアルは単回用量または複数回用量を含んでよい。注射用組成物は、通常は溶液または懸濁液である。あるいは、注射用組成物は、注射の前に、液体溶媒中の溶液または懸濁液用に、固形（例えば、フリーズドライ）の状態で提供されてよい。
【０１５８】
本発明の組成物は、単位用量形態または複数回用量形態に包装されてよい。複数回用量形態では、プレフィルドシリンジよりもバイアルが好ましい。効果的な投薬量は日常的に設定されうるが、注射用の組成物の典型的なヒト用の用量は０．５ｍｌ量である。
【０１５９】
本発明の組成物が使用前に用時調製され（例えば、成分が凍結乾燥形態で提供される場合）、キットとして提供される場合、このキットは２つのバイアルを有していてよく、またはこのキットは１つの充填済みシリンジおよび１つのバイアルを有していてよく、このシリンジの内容物は、注射の前にバイアルの内容物を再活性化するために用いられる。
【０１６０】
故に、本発明は、第１の成分および第２の成分を有するキットを提供し、第１の成分は１つ以上の本発明のポリペプチド、抗体、ベシクル、および／または核酸を有し、第２の成分は、組成物を患者に投与するための使用説明書、シリンジまたはその他の送達用器具、アジュバント、および／または薬学的に許容される調製用溶液のうちの１つ以上を有する。
【０１６１】
本発明は、本発明の免疫原性組成物が予め充填された送達用器具（例えば、シリンジ）も提供する。
【０１６２】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的に効果的な量の１つ以上の抗原、および必要であれば任意のその他の成分を有する。‘免疫学的に効果的な量’とは、その量を、単回投与または一連の投与の一部としてのいずれかで個体に投与すると、治療または予防に効果的であることを意味する。この量は、治療を受ける個体の健康状態および身体状態、年齢、治療を受ける個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類等）、合成抗体に対する個体の免疫系のキャパシティ、所望の防御レベル、ワクチンの調製、治療担当医師による医学的状態の評価、ならびにその他の関連因子に応じて変化する。この量は、日常的な試験によって決定されうる比較的幅広い範囲に含まれることが予想され、１ドーズ当たりの各抗原の典型的な量は、抗原当たり０．１μｇから１ｍｇの間である。
【０１６３】
核酸による免疫付与
上述の免疫原性組成物は、ＵＰＥＣ由来のポリペプチド抗原を含む。本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質抗原の使用に代わるものとして、核酸による免疫付与に基づく組成物、方法、および使用をもたらすために、抗原をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えばプラスミドの形態で）が用いられてよい。核酸による免疫付与は今や発展した分野であり（例えば、参考文献１５５〜１６２等を参照）、多くのワクチンに応用されている。
【０１６４】
免疫原をコードする核酸は、患者へ送達された後ｉｎ ｖｉｖｏで発現され、発現された免疫原は免疫系を刺激する。活性成分は典型的に、（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）プロモーターに操作可能に連結された、免疫原をコードする配列、および場合により（ｉｉｉ）選択可能なマーカーを有する核酸ベクターの形態をとる。好ましいベクターは、（ｉｖ）複製開始点、および（ｖ）（ｉｉ）の下流で（ｉｉ）に操作可能に連結された転写ターミネータをさらに有する。一般に、（ｉ）および（ｖ）は真核生物のものであり、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は原核生物のものである。
【０１６５】
好ましいプロモーターは、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のウイルス性プロモーターである。ベクターは、プロモーターに加えて、プロモーターと機能的に相互作用する転写調節配列（例えば、エンハンサー）も含んでよい。好ましいベクターは、前初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含み、より好ましいベクターはＣＭＶイントロンＡも含む。プロモーターは、免疫原をコードする配列の発現がこのプロモーターによって制御されるように、免疫原をコードする下流配列と操作可能に連結される。
【０１６６】
マーカーが用いられる場合、マーカーは好ましくは微生物宿主中（例えば、原核生物中、細菌中、酵母中）で機能する。マーカーは好ましくは、原核生物の選択可能なマーカーである（例えば、原核生物プロモーターの制御下で転写されたもの）。便宜上、典型的なマーカーは抗生物質抵抗性遺伝子である。
【０１６７】
本発明のベクターは、好ましくは自己複製エピソーム性または染色体外ベクター、例えばプラスミドである。
【０１６８】
本発明のベクターは、好ましくは複製開始点を有する。この複製開始点が、原核生物において活性であるが、真核生物では活性でないことが好ましい。
【０１６９】
故に、好ましいベクターは、ベクター選択のための原核生物マーカー、原核生物複製開始点を有するが、免疫原をコードする配列の転写を誘導するための真核生物プロモーターは含まない。したがって、ベクターは（ａ）ポリペプチド発現なしに原核生物宿主中で増幅され選択されるが（ｂ）増幅されずに真核生物宿主中で発現される。核酸免疫付与ベクターにとってこのアレンジは理想的である。
【０１７０】
本発明のベクターは、コード化配列の下流の真核生物の転写ターミネータ配列を有していてよい。これによって転写レベルが増強されうる。コード化配列が自らのものを持たない場合は、本発明のベクターは、好ましくはポリアデニル化配列を有する。好ましいポリアデニル化配列はウシ成長ホルモン由来である。
【０１７１】
本発明のベクターは複数のクローニングサイトを有していてよい。
【０１７２】
免疫原およびマーカーをコードする配列に加えて、ベクターは第２の真核生物のコード化配列を有していてよい。免疫原と同じ転写物からの第２の真核生物のポリペプチドの翻訳を可能にするために、ベクターは、前述の第２の配列の上流にＩＲＥＳも有していてよい。あるいは、免疫原をコードする配列は、ＩＲＥＳの下流にあってもよい。
【０１７３】
本発明のベクターは、非メチル化ＣｐＧモチーフ、例えば２つの５’側のプリンおよび２つの３’側のピリミジンが隣接する、グアノシンに先行するシトシンを共通して有する非メチル化ＤＮＡ配列を有していてよい。それらの非メチル化形態では、これらのＤＮＡモチーフは複数種の免疫細胞の強力な刺激物質であることが示されている。
【０１７４】
ベクターは、標的化方式で送達されてよい。レセプター介在ＤＮＡ治療法は、例えば参考文献１６３〜１６８で説明されている。遺伝子治療プロトコールにおける局所投与では、核酸を含有する治療用組成物は、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの範囲の濃度も遺伝子治療プロトコールにおいて使用されうる。作用の方法（例えば、コード化された遺伝子産物レベルを増強するまたは抑制するための）および形質転換および発現の有鉤性等の因子は、最終的な有効性に必要となる用量に影響を与えることになる検討事項である。幅広い組織の範囲にわたってより高い発現が望ましい場合、より多量のベクターもしくは一連の投与プロトコールにおいて再投与される同じ量、または異なる隣接または近接する組織部分への複数回の投与が、好ましい治療結果を達成するために必要となる場合がある。全ての場合において、臨床試験における日常的な実験によって、最適な治療効果のための特定の範囲が決定されるであろう。
【０１７５】
遺伝子送達担体を使用してベクターが送達されうる。遺伝子送達担体は、ウイルスが起源またはウイルス以外が起源のものでありうる（概して、参考文献１６９〜１７２を参照）。
【０１７６】
所望の核酸の送達および所望の細胞中での発現のためのウイルス系ベクターは当分野で周知である。典型的なウイルス系担体には、遺伝子組み換えレトロウイルス（例えば、参考文献１７３〜１８３）、アルファウイルス系ベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ‐６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ‐３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ‐１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ‐９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ‐１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ‐１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ‐５３２）、これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラも用いられてよく（例えば、米国特許出願公開第２００３０１４８２６２号、国際公開第ＷＯ０２／０９９０３５号）、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクチニア、鶏痘、カナリア痘、修飾ワクチニアＡ等）、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献１８４〜１８９参照）が含まれるがこれらに限定されない。死滅アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与［１９０］も使用されうる。
【０１７７】
非ウイルス性送達担体および方法も使用可能であり、死滅アデノウイルス単体に連結されたまたは連結されていないポリカチオン性の凝縮ＤＮＡ［例えば、１９０］、リガンド連結ＤＮＡ［１９１］、真核生物細胞の送達担体細胞［例えば、参考文献１９２〜１９６］、および核電荷の中和または細胞膜との融合が含まれるがこれらに限定されない。裸ＤＮＡも使用されうる。典型的な裸ＤＮＡ導入方法は、参考文献１９７および１９８で説明されている。遺伝子送達担体として機能しうるリポソーム（例えば、イムノリポソーム）は参考文献１９９〜２０３で説明されている。さらなるアプローチは参考文献２０４および２０５で説明されている。
【０１７８】
使用に適したさらなる非ウイルス性送達には、機械的送達系、例えば参考文献２０５で説明されるアプローチが含まれる。さらに、コード化配列およびその発現産物は、光重合ヒドロゲル材料の沈着または電離放射線の使用によって送達されうる［例えば、参考文献２０６および２０７］。コード化配列の送達に使用されうる、遺伝子送達のためのその他の従来の方法には、例えば手持ち式の遺伝子導入パーティクルガン［２０８］または導入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用［２０６および２０７］が含まれる。
【０１７９】
ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド‐ｃｏ‐グリコリド）｝ミクロ粒子を使用したＤＮＡも送達は、例えば、負に帯電した表面（例えば、ＳＤＳでの処理）または正に帯電した表面（例えば、カチオン性界面活性剤、例えばＣＴＡＢで処理）を持つよう場合により処理されるミクロ粒子への吸着によって特に好ましい方法である。
【０１８０】
製薬学的用途
本発明は、治療上効果的な量の本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者を治療する方法も提供する。患者は、患者自身が疾患による危険にさらされているか、または妊婦（‘母体免疫’［２０９］）のいずれかであってよい。
【０１８１】
本発明は、薬剤として（例えば、免疫原性組成物として、またはワクチンとして、または患者の治療法において）または診断用試薬として使用するための、本発明の核酸、ポリペプチド、ベシクル、または抗体を提供する。本発明は、（ｉ）ＥｘＰＥＣ細菌が引き起こす疾患および／または感染を治療または予防するための薬剤、（ｉｉ）ＥｘＰＥＣ細菌に対して産生された抗体の存在を検出するための診断用試薬、および／または（ｉｉｉ）ＥｘＰＥＣ細菌に対する抗体を産生させうる試薬の製造における、本発明の核酸、ポリペプチド、ベシクル、または抗体の使用も提供する。前述のＥｘＰＥＣ細菌は、任意の血清型または株でありうる。好ましくは、ＥｘＰＥＣ細菌はＵＰＥＣ株である。
【０１８２】
本発明は、菌血症、髄膜炎、尿路感染症、腎盂腎炎、および／または膀胱炎のような疾患の予防および／または治療に有用である。本発明は、尿路感染症の治療に特に有用である。
【０１８３】
患者は好ましくはヒトである。ヒトは、好ましくは成人である（例えば、年齢が２０歳〜５５歳）。小児または青少年用のワクチンも、例えば安全性、用量、免疫原性等を評価するために成人に投与されてよい。女性患者は好ましいサブセットであり、年齢２０歳〜５５歳の性的活動期の女性は特に好ましい患者グループである。別の患者グループは１２歳〜２０歳の女性であり、特に予防的に使用される。
【０１８４】
その他の可能な患畜には、ＥｘＰＥＣの保有動物であってよいイヌが含まれる［２１０、２１１］。
【０１８５】
治療の有効性をチェックする１つの方法は、本発明の組成物の投与後に感染をモニタリングするステップを伴う。予防的治療の有効性をチェックする１つの方法は、投与後に投与されたポリペプチドに対する免疫応答をモニタリングするステップを伴う。本発明の組成物の免疫原性は、被験者（例えば、１２〜１６ヶ月の幼児、または動物モデル、例えばマウスモデル）にそれらを投与した後で、ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的なパラメーターを決定することによって判定されうる。これらの免疫応答は一般に、組成物の投与のおよそ４週間後に判定され、組成物の投与前に判定された値と比較される。２ドーズ以上の組成物が投与される場合、投与後判定は２回以上行われてよい。ＵＴＩの各種マウスモデルが利用可能である［例えば、参考文献２１２および２１３〜２１４］。
【０１８６】
ポリペプチド抗原の投与は、免疫を誘導するのに好ましい治療方法である。本発明の抗体の投与は、別の好ましい治療方法である。この受動免疫の方法は、新生児または妊婦にとって特に有用である。この方法は典型的に、ヒト化されるまたは完全なヒトモノクローナル抗体を使用する。
【０１８７】
本発明の組成物は一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔へ）、または経直腸的、経口的（例えば、錠剤、スプレー）、経膣的、局所的、経皮的、鼻腔内、舌下、眼球、耳内、肺内、またはその他の粘膜投与によって行われてよい。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、注射針（例えば、皮下注射針）を使用して行われてよいが、無針注射が代わりに用いられてもよい。典型的な筋肉内投与量は０．５ｍｌである。
【０１８８】
本発明は、全身性および／または粘膜性免疫を誘発するために用いられてよい。好ましくは、増強された全身性および／または粘膜性免疫は、増強されたＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答に反映される。好ましくは、増強された免疫応答は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増加を含む。
【０１８９】
投薬治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールでありうる。複数回投与は、初回免疫スケジュールにおいておよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いられてよい。初回投与スケジュール後に、追加投与スケジュールが続いてよい。複数回投与スケジュールでは、同一または異なる経路、例えば非経口初回刺激および粘膜追加免疫、粘膜初回刺激および非経口追加免疫等によって各種用量が与えられてよい。初回刺激投与の間（例えば、４〜１６週間の間）、および初回刺激と追加免疫の間の適当な時期は日常的に決定されうる。例えば、ワクチン接種の初回コースは、１〜１０回の個別投与を含んでよく、この後に、免疫応答を維持するおよび／または強化するのに必要とされる次の時間間隔、例えば２回目の投与では１〜４ヶ月の時点において、また必要であれば数ヵ月後の追加単回投与または複数回投与において他の投与が行われる。単回投与スケジュールは、１回の投与または複数回の投与を有していてよい（まとめて単回投与スケジュール）。複数回投与スケジュールは複数回投与を含み、各投与は１回の投与または複数回の投与を含んでよい。
【０１９０】
細菌感染は身体の各種部位を冒すため、組成物は各種形態に調製されてよい。例えば、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射液として調製されてよい。注射前に、液体担体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製されうる（例えば、凍結乾燥またはスプレー‐フリーズドライ組成物）。組成物は、局所投与用、例えば軟膏剤、クリーム、または散剤として調製されてよい。組成物は、経口投与用、例えば錠剤もしくはカプセル剤、スプレー、またはシロップ剤（場合により香料が添加されたもの）として。組成物は、細顆粒またはスプレーを使用して、肺内投与用、例えば吸入剤として調製されてよい。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製されてよい。組成物は、経鼻的、耳内、または眼球投与用、例えばスプレー、点滴剤、ゲル、または散剤として調製されてよい［例えば、参考文献２１５および２１６］。組成物は、患者への投与の直前に複合組成物が再構成されるようにデザインされたキットの形態であってよい。そのようなキットは、液体の形態の１つ以上の抗原および１つ以上の凍結乾燥抗原を有していてよい。
【０１９１】
本発明の組成物は、その他のワクチンと実質的に同じ時期（例えば、同一の診察時または医療専門家への訪問時）に、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、インフルエンザ菌ｂ型コンジュゲートワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチン等と実質的に同じ時期に患者に投与されてよい。同様に、本発明の組成物は、抗生物質、特にＵＰＥＣに対して活性を持つ抗生物質化合物と実質的に同じ時期（例えば、同一の診察時または医療専門家への訪問時）に患者に投与されてよい。
【０１９２】
本発明の組成物のさらなる抗原成分
本発明は、本発明のポリペプチドおよび１つ以上の下記のさらなる抗原を有する組成物も提供する：
‐髄膜炎菌血清型Ａ株、Ｃ株、Ｗ１３５株、および／またはＹ株（好ましくは４つ全て）由来のサッカライド抗原、例えば血清型Ｃ株由来の参考文献２１７に開示のオリゴ糖［参考文献２１８も参照］または参考文献２１９のオリゴ糖。
‐髄膜炎菌血清型Ｂ株由来の抗原、例えば参考文献２２０〜２２８に開示のもの等。
‐肺炎球菌由来のサッカライド抗原［例えば、２２９、２３０、２３１］。
‐Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば不活化ウイルス［例えば、２３２、２３３］。
‐Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば表面および／またはコア抗原［例えば、２３３、２３４］。
‐Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、２３５］。
‐ＨＩＶ由来の抗原［２３６］。
‐ジフテリア抗原、例えばジフテリアトキソイド［例えば、参考文献２３７の第３章］、例えばＣＲＭ１９７変異体［例えば、２３８］。
‐破傷風抗原、例えば破傷風トキソイド［例えば、参考文献２３７の第４章］。
‐百日咳菌由来の抗原、例えば百日咳菌由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、場合によりパータクチンおよび／または細胞凝集原２および３との組み合わせのもの［例えば、参考文献２３９および２４０］。
‐インフルエンザ菌Ｂ型由来のサッカライド抗原［例えば、２１８］。
‐１つ以上のポリオ抗原［例えば、２４１、２４２］、例えばＩＰＶ。
‐麻疹、流行性耳下腺炎、および／または風疹抗原［例えば、参考文献２３７の第９、１０、および１１章］。
‐水痘抗原。
‐１つ以上のインフルエンザ抗原［例えば、参考文献２３７の第１９章］、例えばヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。インフルエンザ抗原は、大流行間期の（年に１度の）インフルエンザ株由来であってよい。インフルエンザ抗原は、パンデミック流行を引き起こす可能性のある株（すなわち、現在出回っている株に存在するヘマグルチニンと比較して新たなヘマグルチニンを有するインフルエンザ株、または鳥検体において病原性を有し、ヒトの集団において水平伝播される可能性があるインフルエンザ株、またはヒトに対して病原性を持つインフルエンザ株）由来であってよい。インフルエンザ抗原は、鶏卵または細胞培養物中で増殖させたウイルス由来であってよい。
‐モラクセラ・カタラーリス由来の抗原［例えば、２４３］
‐ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｂ群ストレプトコッカス）由来のサッカライド抗原。
‐ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｂ群ストレプトコッカス）由来のタンパク質抗原［例えば、２４４〜２４９］。
‐淋菌由来の抗原［例えば、２２０〜２２２および２５０］。
‐クラミジア肺炎菌由来の抗原［例えば、参考文献２５１〜２５７］またはクラミジア肺炎菌由来の抗原の組み合わせ［例えば、２５８］。
‐クラミジア・トラコマチス由来の抗原、またはクラミジア・トラコマチス由来の抗原の組み合わせ［例えば、２５９］。
‐ポルフィロモナス・ジンジバリス由来の抗原［例えば、２６０］。
‐１つ以上の狂犬病抗原［例えば、２６１］、例えば凍結乾燥不活化ウイルス［例えば、２６２、ＲａｂＡｖｅｒｔ（登録商標）］。
‐パラミクソウイルス由来の１つ以上の抗原、例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ［２６３、２６４］）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［２６５］）。
‐炭疽菌由来の抗原［例えば、２６６、２６７、２６８］。
‐化膿性連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）由来の抗原［例えば、２４５、２６９、２７０］。
‐黄色ブドウ球菌由来の抗原［例えば、２７１］。
‐フラビウイルス科（フラビウイルス属）に存在するウイルス由来の抗原、例えば黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４つの血清型、ダニ媒介脳炎ウイルス、ウエスト・ナイル・ウイルス。
‐ペスチウイルス抗原、例えばブタコレラウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、および／またはボーダー病ウイルス由来のもの。
‐パルボウイルス抗原、例えば、パルボウイルスＢ１９由来のもの。
‐ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原［２７２］。
【０１９３】
組成物は、これらのさらなる抗原のうち１つ以上を含んでいてよい。
【０１９４】
別の実施形態において、本発明の抗原は、泌尿生殖器疾患および／または性行為感染症から女性を防御するようにデザインされたワクチンにおいて使用するのに適した、１つ以上の追加の非大腸菌抗原と組み合わされる。例えば、抗原は、ストレプトコッカス・アガラクティアエ、クラミジア・トラコマチス、淋菌、パピローマウイルス、およびヘルペス単純ウイルスからなる群由来の抗原と組み合わされてよい。ヒトパピローマウイルス抗原が用いられる場合、それらはＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６、および／またはＨＰＶ１１株のうちの１つ以上の由来であってよい。
【０１９５】
好ましい淋菌抗原は、ｎｇｓ１３（ＯｍｐＡ）、ＯｍｐＨ、ｎｇｓ５７６（ペプチジル‐プロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）タンパク質）、ｎｇｓ４１、およびｎｇｓ１１７のうちの１つ以上を含む。
【０１９６】
好ましいＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６、およびＨＰＶ１１株由来の１つ以上を含む。
【０１９７】
好ましいクラミジア・トラコマチス抗原は、参考文献２７３に開示されるような、ＣＴ０４５、ＣＴ０８９、ＣＴ２４２、ＣＴ３１６、ＣＴ３８１、ＣＴ３９６、ＣＴ３９８、ＣＴ４４４、ＣＴ４６７、ＣＴ５４７、ＣＴ５８７、ＣＴ８２３、ＣＴ７６１、およびこれらの抗原の特定の組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【０１９８】
好ましい肺炎クラミジア抗原は、参考文献２７４に開示されるような、ＣＰｎ０３２４、Ｃｐｎ０３０１、Ｃｐｎ０４８２、Ｃｐｎ０５０３、Ｃｐｎ０５２５、Ｃｐｎ０５５８、Ｃｐｎ０５８４、Ｃｐｎ０８００、Ｃｐｎ０９７９、Ｃｐｎ０４９８、Ｃｐｎ０３００、Ｃｐｎ００４２、Ｃｐｎ００１３、Ｃｐｎ４５０、Ｃｐｎ０６６１、Ｃｐｎ０５５７、Ｃｐｎ０９０４、Ｃｌｐｎ０７９５、Ｃｐｎ０１８６、およびＣｐｎ０６０４、ならびにこれらの抗原の特定の組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【０１９９】
好ましいＧＢＳ抗原は、ＧＢＳ８０、ＧＢＳ１０４、ＧＢＳ５９、ＧＢＳ６７、ＧＢＳ３２２、およびＧＢＳ２７６のうちの１つ以上を含む。
【０２００】
別の実施形態において、本発明の抗原の組み合わせは、高齢者または免疫不全の個体を防御するようにデザインされたワクチンにおいて使用するのに適した１つ以上の追加のｎｏｎ−ＥｘＰＥＣ ａｎｔｉｇｅｎと組み合わされる。例えば、抗原の組み合わせは、フェカリス菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑濃菌、在郷軍人病菌、リステリア菌、髄膜炎菌、インフルエンザ、およびパラインフルエンザウイルス（‘ＰＩＶ’）からなる群由来の抗原と組み合わされてよい。
【０２０１】
必要であれば、毒性タンパク質抗原は無毒化されてよい（例えば、化学的および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の無毒化［２４０］）。
【０２０２】
ジフテリア抗原が組成物に添加される場合、破傷風抗原および百日咳抗原も加えるのが好ましい。同様に、破傷風抗原が添加される場合、ジフテリアおよび百日咳抗原も加えるのが好ましい。同様に、百日咳抗原が添加される場合、ジフテリアおよび破傷風抗原も加えるのが好ましい。故に、ＤＴＰ混合が好ましい。
【０２０３】
サッカライド抗原は、好ましくはコンジュゲートの形である。コンジュゲート用の担体タンパク質には、細菌毒素（例えばジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）、髄膜炎菌外膜タンパク質［２７５］、合成ペプチド［２７６、２７７］、熱ショックタンパク質［２７８、２７９］、百日咳タンパク質［２８０、２８１］、インフルエンザ菌由来のプロテインＤ［２８２、２８３］、サイトカイン［２８４］、リンフォカイン［２８４］、インフルエンザ菌タンパク質、ホルモン［２８４］、増殖因子［２８４］、クロストリジウム・ディフィシル由来の毒素ＡまたはＢ［２８５］、鉄取り込みタンパク質［２８６］、各種の病原菌由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを有する人工タンパク質［２８７］、例えばＮ１９タンパク質［２８８］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［２８９］、肺炎球菌溶血素［２９０］等が含まれる。好ましい担体タンパク質はＣＲＭ１９７タンパク質である［２９１］。
【０２０４】
組成物中の抗原は典型的に、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分なものである。
【０２０５】
抗原は、好ましくはアルミニウム塩に吸着される。
【０２０６】
一般的事項
語句“有する”は、“含む”だけでなく“からなる”を包含し、例えばＸを“有する”組成物は、Ｘのみからなっていてもよいし、または他のもの、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【０２０７】
数値ｘに関する語句“約”は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０２０８】
単語“実質的に”は、“完全に”を除外しない、例えばＹを“実質的に含まない”組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要であれば、単語“実質的に”は本発明の定義から削除されてもよい。
【０２０９】
配列表中のアミノ酸配列中のＮ末端残基は、対応するヌクレオチド配列中の第１のコドンによってコード化されるアミノ酸として与えられる。第１のコドンがＡＴＧではない場合、コドンが開始コドンであるときそれはメチオニンに翻訳されるが、配列が融合パートナーのＣ末端にあるとき、示されたメチオニン以外のアミノ酸として翻訳されることが理解されるであろう。本発明は、任意の示されたメチオニン以外の残基の代わりにＮ末端にメチオニン残基（例えば、ホルミル‐メチオニン残基）を有する、配列表の各アミノ酸配列を具体的に開示し、包含する。本発明は、配列中の任意の内部メチオニン残基の位置で始まる配列表の各アミノ酸配列も具体的に開示し、包含する。
【０２１０】
本明細書において開示される配列は、元々は５３６株において同定された。大腸菌のその他複数の株のゲノム配列が入手可能である。任意のこれらの（またはその他の）さらなるゲノム配列において、本発明の任意特定の配列のホモログを同定するために、標準的な検索およびアラインメント法が使用されうる。さらに、その他の株由来の相同配列の増幅用のプライマーをデザインするために配列が使用されうる。故に、本発明は株５３６配列に限定されず、大腸菌のその他の株、特にＥｘＰＥＣおよびＵＰＥＣ株由来のそのようなバリアントおよびホモログを包含する。一般に、特定の配列番号の適当なバリアントは、その対立遺伝子多型、その多型、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その変異体等を含む。
【０２１１】
故に、上記で開示されるように、例えば本発明とともに使用されるポリペプチドは、５３６の配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９等）のアミノ酸置換、挿入、欠失等を含む。
【０２１２】
上記に示されているように、本発明の核酸およびポリペプチドは：
（ａ）配列表で開示される配列と同一（すなわち１００％同一）であり、
（ｂ）配列表で開示される配列と配列同一性を共有し、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、別々の位置にあってよい、または連続していてよい１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の単一ヌクレオチドまたはアミノ酸変化（欠失、挿入、置換）を有する配列を含んでよく、
（ｄ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列表の特定の配列とアラインされたとき、ｘ個のモノマー（アミノ酸またはヌクレオチド）の移動ウインドウは開始点（Ｎ末端または５’）から終了点（３’のＣ末端）へ移動し、ｐ個のモノマーへ伸長するアラインメント（ｐ＞ｘのとき）の場合に、ｐ−ｘ＋１ウインドウなどが存在するようになり、それぞれのウインドウは少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたモノマーを有し、ここでｘは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、もしｘ・ｙが整数ではない場合、最も近い整数の値に切り上げられる。
【０２１３】
好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトのパラメーター（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝１０．０およびギャップ・エクステンション・ペナルティ＝０．５）を使用する、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ‐Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［２９２］である。このアルゴリズムは、好都合なことにＥＭＢＯＳＳパッケージ［２９３］のｎｅｅｄｌｅツールに実装されている。
【０２１４】
本発明の核酸およびポリペプチドはさらに、これらの配列（ａ）〜（ｄ）のＮ末端／５’および／またはＣ末端／３’の方向に向かうさらなる配列を有していてよい。
【０２１５】
本発明の実施では、別段の記載がない限り、当該技術分野の範囲内である化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法を用いる。そのような技法は文献において詳細に説明されている。例えば、参考文献２９４〜３０１等を参照されたい。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、参考文献２７、参考文献２８、米国特許仮出願第６０／６５４６３２号（２００５年２月１８日出願、参考文献２７および２８の優先出願）または米国特許仮出願第６０／７１２７２０（２００５年８月２９日出願、参考文献２８の優先出願）に開示されているポリペプチドを包含しない。
【実施例】
【０２１７】
発明を実施する様式
下記は、本発明を実施するための特定の実施形態または形態の例である。例は、説明を目的としたものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２１８】
使用される数値（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証するための努力が払われたが、多少の実験誤差および偏差は当然のことながら許容されるべきである。
【０２１９】
ＵＰＥＣ５３６株から９３のポリペプチドを同定するために、（ａ）２つの共生菌株（ｍｇ１６５５、ＤＨ１０Ｂ）との９０％未満の配列同一性、（ｂ）１００アミノ酸長より長いこと、（ｃ）細胞質以外の細胞局在を有すること、（ｄ）別のＵＰＥＣ株（ＣＦＴ０７３）に共通するが、ＭＮＥＣ株（ＩＨＥ３０３４）に認められないものなどの基準を使用して、コンピューターを使用した比較および予測ツールが使用された。これらの配列は、配列表に記載されている。それらのアミノ酸配列は配列番号：８〜１００である。
【０２２０】
並行研究において、ＵＰＥＣ株に特異的で、非病原菌株（共生菌株および実験室株）に存在しない表面露出タンパク質を選択するためにアッセイを行った（下記参照）。７６のポリペプチドを同定し、そのうちの１１は共生菌株（ｍｇ１６５５）と８０％未満のホモロジーを有していた。これらの１１のポリペプチドの配列は配列表に記載しており、それらのアミノ酸配列は配列番号１〜１０および配列番号８５である。これらポリペプチドのうちの７つの配列を、コンピューターを使用した方法ではなく、この方法によって同定した。これらの配列は配列表に記載されており、それらのアミノ酸配列は配列番号１〜７である。表１は、このようにして同定された７６のポリペプチドを示す（配列番号１〜１０、８５、および１０１〜１６５）。
【０２２１】
さらなる研究において、配列番号１６６および１６７を同定した。
【０２２２】
配列番号１〜１６７は配列表に記載されている。表４に示すように、それらは‘ＲＥＣＰ’命名法でも呼ばれる。
【０２２３】
本発明は、これらのポリペプチドの確かな実用性、すなわち本明細書で説明されるような免疫原性組成物の供給を提供する。
【０２２４】
これらのポリペプチドはクローン化され、発現され、および精製されてよい。次に、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳで血清が解析されうるマウスの免疫に精製抗原が用いられ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験の両方においてさらに検査されてよい。適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ実験には、補体仲介性細菌殺傷および／またはオプソニン化貪食作用活性を抗体が誘導する能力、ＥｘＰＥＣ株（または精製抗原）のヒト上皮細胞（例えば、膀胱細胞において）またはその他の細胞株への結合を阻害する能力、および／または大腸菌（例えば、Ｋ１株）の脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）への接着／浸潤を抑制する能力の検査が含まれる。適当なｉｎ ｖｉｖｏ実験には、ＵＴＩのマウスモデル（成体マウス）における能動および／または受動全身免疫付与およびチャレンジ、大腸菌Ｋ１株でチャレンジが行われた５日齢のラットにおける菌血症および髄膜炎に対する能動または受動免疫付与による防御、およびＥｘＰＥＣ株での成体マウスの免疫付与および腹腔内感染が含まれる。
【０２２５】
細菌のライフサイクルに対するタンパク質の重要性は、アイソジェニックなノックアウト変異体を作成することによって検査されてよい。変異体は、ある抗原によって産生された血清がその抗原に特異的であることを保証するためにも使用されうる。発現パターンを研究するためにマイクロアレイが用いられてよい。保存性および／または多様性は、複数の異なるＥｘＰＥＣ株由来の遺伝子のシークエンシングを行うことによって評価される。本発明は、本発明のポリペプチドの１つ以上がノックアウトされている大腸菌も提供する。ノックアウト変異は、遺伝子のコード化領域内に位置していてもよいし、またはその転写制御領域内（例えば、そのプロモーター内）にあってもよい。ノックアウト変異は、抗原をコード化するｍＲＮＡのレベルを、野生型細菌によって産生されるレベルの＜１％まで、好ましくは＜０．５％まで、より好ましくは＜０．１％まで、最も好ましくは０％まで低下させる。
【０２２６】
ＵＰＥＣ株に特異的で、非病原菌株（共生菌株および実験室株）に存在しない、予測された表面露出タンパク質を選択するためにプロテオミクスアッセイを実施した。選択が終わると、これらのタンパク質が発現され、精製され、マウスを免疫するのに使用されてよい。
【０２２７】
大腸菌のｔｏｌ‐ｐａｌ遺伝子の任意の部分中の変異が、天然の外膜タンパク質を含有するベシクルの形成をもたらすことが参考文献４３から知られている。ＵＰＥＣ株のベシクル中に存在し、共生菌株、例えばｍｇ１６５５との相同性が低いタンパク質を、潜在的な抗原として使用されうる小ポテンシャルグループのタンパク質として選択した。
【０２２８】
共生および病原性大腸菌におけるラムダレッド仲介遺伝子操作
この方法は、野生型大腸菌株由来のｔｏｌＲ遺伝子を不活化するために用いられるラピッドＰＣＲベース法である［３０２］。簡単に言うと、第１の手順は、標的遺伝子（ｔｏｌＲ）の上流および下流領域およびレジスタンスマーカーカセットを独立して増幅する手順である。手順１で得られた２つのＰＣＲ産物をＡＢカセットの増幅プロデューサーと等モル濃度で混合し、標的遺伝子と相同な上流および下流の５００ｂｐ（またはそれ以上）の領域が隣接するレジスタンスマーカーカセットを作成するために、第２ラウンドのＰＣＲ（スリーウェイＰＣＲ）が行われる。第３の手順において、多量（１μｇ）の所望の線状ＤＮＡがラムダレッドコンピテント細胞にエレクトロポレーションで導入される。
【０２２９】
ベシクルの調製
１．ＴＣＡでの沈殿によるベシクルの調製
プレート上で増殖させた細菌をＬＢ培地に接種し、穏やかに振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。ＯＤ６００が０．１で２００ｍｌのＬＢに接種するために培養物を使用した。細菌をＯＤ６００が０．４（または定められたとおりに）になるまで増殖させた。培養物を４０００×ｇで１０分間遠心し、上清を０．２２ｍｍのフィルターで濾過して残存細菌を除去した。
【０２３０】
ジピリジル（０．２５ｍＭ）をＬＢ培地に添加することによって、同じ実験を鉄制限条件下でも実施した。
【０２３１】
培養物の上清に、最終濃度１０％の溶液を、１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ、０．４％（ｗ／ｖ）デオキシコレートで添加することによって沈殿を行った。４℃で３０分間沈殿を進行させた。４℃、２００００×ｇ、１０分間の遠心分離によって沈殿物を回収した。ペレットを１０％ＴＣＡ（ｗ／ｖ）で一度洗浄し、無水エタノールで２回洗浄した。ペレットをＳｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０２３２】
野生型および変異型株について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、この結果から、野生型株よりも変異型株の上清中により多数のバンドが存在することが認められた。ランダムにピックアップしたバンドから、上清中のタンパク質の大部分が膜タンパク質であることが示され、これは膜内容物の濃縮を示している。
【０２３３】
２．超遠心分離法によるベシクルの調製
培養上清を、４℃、２０００００×ｇで２時間超遠心した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０２３４】
３．ベシクルのグアニジニウム変性
グアニジニウム変性に先立ち、ベシクルをエタノールで沈殿させた。ＰＢＳ中の１０μｇのＯＭＶを、最終濃度９０％となるように冷無水エタノールを添加することによって沈殿させた。−２０℃で２０分間沈殿を進行させた。１３０００×ｇ、１０分間の遠心分離によって沈殿物を回収した。ペレットを５０ｍｌ、６Ｍグアニジニウム、１５ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍＭトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０で再懸濁した。６０℃で６０分間変性を進行させた。消化に先立ち、１．５ＭのトリスｐＨ８．０溶液で、溶液を８倍希釈し、希釈した溶液に５ｍｇのトリプシンを添加した。３７℃で一晩消化を進行させた。最終濃度０．１％のギ酸を添加することで反応を停止した。Ｏａｓｉｓ抽出カートリッジを使用してペプチドを抽出した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでペプチドを解析した。
【０２３５】
４．表面消化
５ｍｇのトリプシンをＰＢＳ中の１０ｍｇのベシクルに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。最終濃度０．１％のギ酸を添加することで反応を停止した。Ｏａｓｉｓ抽出カートリッジでペプチドを回収し、脱塩を行った。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでペプチドを解析した。
【０２３６】
ベシクル解析
タンパク質の定量化
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で、ＢＳＡを標準物質として使用してタンパク質を定量化した。
【０２３７】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
Ｍｉｎｉ‐Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ電気泳動装置を使用して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）４〜１２％ポリアクリルアミドゲルでサンプルを解析した。ＳＤＳサンプルバッファー（０．０６Ｍトリス‐ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ）２‐メルカプトエタノール、１０ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）にサンプルを懸濁し、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動の前に１００℃で５分間熱を加えた。泳動後、クマシーブルーでゲルを染色した。
【０２３８】
ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法
ゲルからタンパク質バンドまたはスポットを切り出し、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム／アセトニトリル（５０／５０、ｖ／ｖ）で２回洗浄し、純アセトニトリルで１回洗浄し、風乾した。５ｍＭ重炭酸アンモニウム、０．０１２ｍｇのシークエンシンググレードのトリプシンを含有する７〜１０ｍｌの溶液を添加することによって、乾燥させたスポットを３７℃で２時間消化した。消化後、０．６ｍｌを、ターゲットを予めスポットしたマトリックス上にロードし、風乾した。７０％エタノール、０．１％トリフルオロ酢酸からなる０．６ｍｌの溶液でスポットを洗浄した。ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析装置上で質量スペクトルを得た。ターゲット上に予めスポットした標準物質の組み合わせを使用して、スペクトルの外部較正を行った。Ｍａｓｃｏｔプログラムを使用して、質量範囲が７００〜３０００Ｄａのペプチドの実験的に作成したモノアイソトピックピークと、コンピューターで作成したフィンガープリントを自動および手動の両方で比較することによってタンパク質の同定を行った。
【０２３９】
二次元電気泳動
２００ｍｇのベシクルをＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ膨潤液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（２％ｗ／ｖ）ＡＳＢ１４、２％（ｖ／ｖ）ＩＰＧバッファーｐＨ３〜１０ＮＬ、２ｍＭ ＴＢＰ、６５ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁し、７ｃｍのＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ｐＨ３〜１０ＮＬ）上に一晩吸着させた。その後、タンパク質を二次元電気泳動で分離した。ＩＰＧｐｈｏｒ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｕｎｉｔを使用して、順番に１５０Ｖ３５分、５００Ｖ３５分、１０００Ｖ３０分、２６００Ｖ１０分、３５００Ｖ１５分、４２００Ｖ１５分、最後に１０ｋＶｈに達するまで５０００Ｖをかけて一次元目の泳動を行った。二次元目では、４Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５ｍＭ ＴＢＰ、５０ＭｍトリスＨＣｌ ｐＨ８．８、２．５％アクリルアミド、ブロモフェノールブルー０．２％中で１０分間のインキュベーションを２回行うことでストリップの平衡化を行った。その後、４〜１２％のプレキャストポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分離した。
【０２４０】
コロイド状クマシーブルーでゲルを染色し、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＳＩでスキャンした。Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄエリートソフトウェアで画像を解析した。
【０２４１】
ナノ‐ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
ナノスプレー源を備えるＱ‐ＴｏＦ Ｍｉｃｒｏ ＥＳＩ質量分析装置と連結したＣａｐＬＣ ＨＰＬＣシステム上でナノ‐ＬＣによってペプチドを分離した。Ｃ１８トラップカラム（３００μｍ ｉ．ｄ．×５ｍｍ）を介してＡｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８ ＮａｎｏＥａｓｅカラム（１００μｍ ｉ．ｄ．×１００ｍｍ）にサンプルをロードした。９５％ＡＣＮを２％〜６０％を含む０．１％ギ酸溶液で、４００ｎｌ／分の流量でペプチドを５０分間グラジエント溶出した。ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（バージョン４．０）を使用して、溶出したペプチドについて自動データ依存収集プログラムを行い、さらなるＭＳ／ＭＳフラグメンテーションを目的として、４００〜２，０００のｍ／ｚレンジにわたって、多価ペプチドを自動で選択するためにＭＳサーベイスキャンを使用した。最大で３つの異なる成分について、同時にＭＳ／ＭＳフラグメンテーションを行った。データ収集後、個々のＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘで統合し、平滑化し、重心化を行った。ライセンスバージョンのＭＡＳＣＯＴを使用して、バッチモードでペプチドの検索および同定を行った。ＭＡＳＣＯＴサーチのパラメーターは、（１）種：ＥｘＰＥＣ（２）欠損した切断の許容数（トリプシン消化のみ）：６、（３）可変翻訳後修飾：メチオニン酸化、（４）ペプチド許容度：±５００ｐｐｍ、（５）ＭＳ／ＭＳ許容度：±０．３Ｄａ、および（６）ペプチド電荷数：＋１〜＋４とした。以前のプラットフォームでは、ＭＡＳＣＯＴ確率分析によってｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｔとして定められたもののみ考慮されていた。少なくとも１つのペプチドからのタンパク質同定の受け入れに関するスコア閾値は、ＭＡＳＣＯＴによって、トリプシン消化の場合は１８、プロテイナーゼＫ消化の場合は３６と設定された。
【０２４２】
結果
上記の解析の結果として、表１に示すように５３６株から７６の抗原が同定された。これらの配列のうち１１は、共生菌株（ｍｇ１６５５）との相同性が非常に低かった（配列番号１〜１０および配列番号８５）。これらのポリペプチドのうちの７つの配列は、コンピューターを用いた方法ではなくこの方法で同定された。これらの配列は配列表に記載されており、それらのアミノ酸配列は配列番号１〜７である。表１は、このようにして同定された７６のポリペプチドを示す。
【０２４３】
抗原の解析
全身感染のマウスモデル
病原性および非病原性大腸菌株間のゲノム比較解析によって選択された多数の抗原をスクリーニングするために、伝統的な病原性解析を基に防御モデルを確立した。使用されうる別の実験モデルには、参考文献２１２〜２１４で概要が説明されているものが含まれる。
【０２４４】
実験モデル（免疫付与および感染）は、病原性ＵＰＥＣ５３６大腸菌株の静脈内接種によるチャレンジを行った５週齢のＣＤ１異系交配マウスを使用する。チャレンジ用量は、４日以内に成体マウスの８０％を死に至らしめる能力を持つ細菌の量として実験的に決定され、５３６株では４×１０７ｃｆｕ／マウスに相当する。
【０２４５】
免疫付与プロトコール
ＵＰＥＣ５３６株由来の多数の抗原をクローン化し、発現させ、精製した。さらに、配列番号５６のＮ末端領域（アミノ酸２１番〜４７０番）に対応する配列番号１６８をクローン化し、発現させ、精製した。精製抗原を、下記の方法で実験マウスモデルにおいてマウスを免疫するのに使用した。以下の表に示すように、フロイントアジュバントを使用した１５０μｌのタンパク質溶液の皮下注射によってマウスを３回免疫化する。
【０２４６】
【化１１】
初回免疫の前日（免疫前の血清）、３４日目、および４８日目（チャレンジ前日）に血液サンプルを採取する。免疫した動物から得られた血清を、抗体力価を決定するためにウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡで検査する。
【０２４７】
チャレンジ
４８日目に、大腸菌ＵＰＥＣ５３６株を凍結ストックからＬＢ寒天培地に画線し、孵卵器内にて３７℃で一晩（ＯＮ）インキュベートする。４９日目に、一晩インキュベートしたプレートの培養物を使用して、Ｏ．Ｄ．６００が０．１になるように５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、細菌培養物が、ＵＰＥＣ５３６株の４×１０８ｃｆｕ／ｍｌに相当するＯ．Ｄ．６００＝１．３に達するまで攪拌しながら３７℃で１．５時間増殖させる。培養物を遠心し、ペレットを同量の生理溶液で再懸濁し、希釈せずにチャレンジに使用する。接種材料を確認するため、標準的なプレートカウント法を使用して培養物をプレーティングする。４×１０７のＵＰＥＣ５３６株を含有する１００μｌの細胞懸濁液を、１ｍｌのシリンジを使用してコントロールおよび免疫付与マウスに静脈内注射する。注射から２４、４８、７２、および９６時後の時点での各動物グループの死亡数を記録する。
【０２４８】
チャレンジから９６時間後の時点での、マウスのワクチン接種グループの生存数とコントロールグループの生存数を比較することでワクチン接種による予防を評価する。コントロールに対する生存率は、式：
【０２４９】
【化１２】
を使用して計算する。
【０２５０】
結果
結果は表３に示され、ＵＰＥＣ５３６でのチャレンジ後のマウスの生存％が、本発明の抗原での免疫付与後に増加することを示している。
【０２５１】
本発明は一例として説明されたにすぎず、本発明の適用範囲および趣旨精神から逸脱することなしに改変が行われてよいことが理解されるであろう。
【０２５２】
【表１−１】
【０２５３】
【表１−２】
【０２５４】
【表１−３】
表２‐７つの好ましい病原性大腸菌５３６株の配列
【０２５５】
【表２−１】
【０２５６】
【表２−２】
【０２５７】
【表３】
【０２５８】
【表４】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０２５９】
【化１３】
【０２６０】
【化１４】
【０２６１】
【化１５】
【０２６２】
【化１６】
【０２６３】
【化１７】
【０２６４】
【化１８】
【０２６５】
【化１９】
【０２６６】
【化２０】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で言及する全ての文書は、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。
【０００２】
本発明は大腸菌生物学の分野に属し、特に、腸管外病原性大腸菌（ＥｘＰＥＣ）株に対する免疫付与に使用するための免疫原に関する。
【背景技術】
【０００３】
大腸菌ほど多様な微生物は少ない。哺乳動物の正常な腸管微生物叢の重要なメンバーであると同時に、大腸菌は組み換えＤＮＡ技術において宿主として広く用いられている。しかしながら、これに加えて、大腸菌は致死的な病原菌にもなりうる。
【０００４】
大腸菌株は、従来共生細菌または病原性細菌のいずれかに分類されており、病原菌株は腸内細菌株または腸管外細菌株としてさらに細分類される。多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）のなどの最新の分類技術では、大腸菌は５つの系統グループ（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ、およびＥ）に分類され、これらのグループ分類は従来の分類とは一致しない。例えば、ＭＬＥＥによるグループＢ１には共生菌株および病原菌株の両方が含まれ、グループＤには腸内細菌株および腸管外細菌株の両方が含まれる。
【０００５】
大腸菌の腸管外病原菌株（または‘ＥｘＰＥＣ’株［１（非特許文献１）］）は、ＭＬＥＥのグループＢ２およびＤに分類され、尿路病原性（ＵＰＥＣ）株および髄膜炎／敗血症関連（ＭＮＥＣ）株の両方を含む。ＵＰＥＣ株は尿路感染症（ＵＴＩ）の原因となり、膀胱炎の最も一般的な型である。この株はまた、腎盂腎炎（およびその合併症、例えば敗血症）およびカテーテル関連感染症の原因にもなる。ＭＮＥＣ株は新生児髄膜炎を引き起こし（生児出生１０００例当たり０．１症例）、その致死率は２５〜４０％に及び、また敗血症症例のおよそ１／６の原因にもなる。
【０００６】
最も新しいこれまでのＥｘＰＥＣワクチンは、細胞ライセートまたは細胞構造に基づいたものであった。ＳＯＬＣＯＵＲＯＶＡＣ（登録商標）は、６つのＥｘＰＥＣ株をはじめとした１０種類の加熱死菌を含み、第ＩＩ相臨床試験の成功が参考文献２（非特許文献２）において報告されている。ＵＲＯ‐ＶＡＸＯＭ（登録商標）は、１８種の特定の大腸菌株の凍結乾燥細菌ライセートを含有する経口錠剤ワクチンである［３（非特許文献３）］。Ｂａｘｔｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓは、６〜１０種類の異なる株由来の線毛をベースとしたＵＴＩワクチンを開発したが、この製品はすでに廃棄されている。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅは、ＦｉｍＨ接着複合体をベースとしたＭＥＤＩ５１６という名称の製品を開発した［４（非特許文献４）］が、第ＩＩ相臨床試験で示された有効性は不十分なものであった。さらにこのワクチンには、正常な腸内細菌叢中の非病原性ＦｉｍＨ＋ｖｅにも影響を与える可能性があるというリスクがあり、またこのワクチンのその膀胱特異的接着メカニズムのためにＵＰＥＣ株にしか効果を発揮せず、その他のＥｘＰＥＣ株を制御できない可能性が予想された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＲｕｓｓｏおよびＪｏｈｎｓｏｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ（２０００）１８１：１７５３−１７５４
【非特許文献２】Ｕｅｈｌｉｎｇら、Ｊ Ｕｒｏｌ（１９９７）１５７：２０４９−２０５２
【非特許文献３】Ｔａｍｍｅｎ、Ｂｒ Ｊ Ｕｒｏｌ（１９９０）６５：６−９
【非特許文献４】Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：６０７−６１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
故に、粗細胞ライセートからより詳細に定義された分子へ移行することを含めて、ＥｘＰＥＣワクチンの改良が求められており、またワクチンへの添加に適したさらなる抗原、特に、ＥｘＰＥＣ株に多く認められ、かつ共生菌株には認められていない抗原の同定が求められている。
【０００９】
これらのニーズに応える方法の１つが参考文献５で報告されており、発明者らはＭＬＥＥのタイプＢ２およびＤのゲノムに存在するがＭＬＥＥのタイプＡおよびＢ１には存在しない遺伝子を検索している。サブトラクティブハイブリダイゼーションに基づくさらなる比較手法が参考文献６および７で報告されている。参考文献８では、ＥｘＰＥＣ株内の病原性遺伝子も同定されている。参考文献９は、ＵＰＥＣ大腸菌株５３６の４つの病原性島の解析を開示している。
【００１０】
参考文献１０では、非病原性大腸菌株に存在しない配列を同定するために、ＵＰＥＣ（Ｏ６：Ｋ２：Ｈ１）株ＣＦＴ０７３のゲノム配列［１１、１２］が使用されている。参考文献１３は、ＵＰＥＣである大腸菌ヒト腎盂腎炎分離株５３６（Ｏ６：Ｋ１５：Ｈ３１）のゲノム配列と、ＣＦＴ０７３（ＵＰＥＣ）、ＥＤＬ９３３（腸管出血性）、およびＭＧ１６５５（非病原性の実験室株）株の配列データとの比較を開示している。病原菌株のゲノム配列は、アクセッション番号ＡＥ００５１７４（ｇｉ：５６３８４５８５）、ＢＡ０００００７（ｇｉ：４７１１８３０１）、およびＮＣ‐００４４３１（ｇｉ：２６２４５９１７）でデータベースにおいて入手可能である。非病原菌株由来の配列は、アクセッション番号Ｕ０００９６（ｇｉ：４８９９４８７３）で入手可能である。
【００１１】
本発明の目的は、病原性大腸菌、特にＥｘＰＥＣ株、より詳細にはＵＰＥＣ株に対する免疫付与に使用するためのさらなる抗原を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
要旨
発明者らは、病原性大腸菌株に特異的な免疫原性組成物に添加されうる各種の遺伝子を同定した。遺伝子は尿路病原菌株（ＵＰＥＣ）由来であるが、非病原菌株には存在しないものであり、それらのコード化タンパク質は、それらを免疫系にとって利用可能にする細胞部位を有する。
【００１３】
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、および１６７からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。特定の実施形態において、本発明のこの態様のポリペプチドは、少なくとも１つの（ａ）のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを有する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。特定の実施形態において、本発明のこの態様のポリペプチドは、少なくとも１つの（ａ）のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを有する。
【００１５】
本発明は、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を有する、１つ以上のポリペプチドを発現する１つ以上の外膜ベシクル（ＯＭＶ）を有する免疫原性組成物にさらに関する。特定の実施形態において、本発明のこの態様の免疫原性組成物は、少なくとも１つの（ａ）のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを有する１つ以上のポリペプチドを有する。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、医学分野および患者に免疫応答を誘発するための薬剤の製造において使用されうる。
【００１７】
本発明は、薬学的に許容される担体と混合された本発明のポリペプチドを有する医薬組成物にも関する。本発明は、さらに薬学的に許容される担体と混合された２つ以上の本発明のポリペプチドを有する医薬組成物に関する。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物はさらにワクチンアジュバントを有する。
【００１８】
本発明は、本発明の医薬組成物または免疫原性組成物を患者に投与するステップを含む、患者に免疫応答を誘発するための方法にも関する。特定の実施形態において、免疫応答はＥｘＰＥＣ感染症を防御するものである。
【００１９】
本発明のさらなる態様を下記に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
発明者らは、病原性大腸菌株に特異的な免疫原性組成物に添加されうる各種のポリペプチドを同定した。これらのポリペプチドは、それらを免疫系にとって利用可能にする細胞部位を有する。これらのポリペプチドをコードする遺伝子は、尿路病原菌株５３６に存在するが非病原菌株には存在しないものとしてはじめに同定された。
【００２１】
ポリペプチド
本発明は、実施例において開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。これらのアミノ酸配列は、配列番号１〜１６７として配列表に記載される。配列番号１〜１６７の好ましいサブセットは表２に記載される。
【００２２】
本発明は、実施例において開示されるアミノ酸配列（すなわち配列番号１〜１６８）と配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供する。特定の配列によって、配列同一性の度合いは、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）。これらのポリペプチドは、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子多型、および突然変異体を含む。典型的には、２つのポリペプチド配列間の５０％以上の同一性は、機能的に等価であることの指標であると考えられる。ポリペプチド間の同一性は好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に実装されているようなＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムによって、ギャップ・オープン・ペナルティー＝１２およびギャップ・エクステンション・ペナルティー＝１のパラメーターを用いるアフィンギャップサーチを使用して決定される。
【００２３】
これらのポリペプチドは、実施例の配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の保存的アミノ酸置換、すなわち同じ性質の側鎖を持つ別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換を含む。遺伝的にコード化されたアミノ酸は、一般に４つのファミリー：（１）酸性、すなわちアスパラギン、グルタミン、（２）塩基性、すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、一緒に芳香族アミノ酸として分類される場合がある。一般には、これらのファミリー内での単一アミノ酸置換は、生物学的活性に大きな影響を与えない。ポリペプチドは、リファレンス配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の単一アミノ酸欠失を有していてよい。ポリペプチドは、リファレンス配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の挿入（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸のそれぞれ）も有していてよい。
【００２４】
好ましいポリペプチドには、脂質が付加された、外膜中に存在する、内膜中に存在する、またはペリプラズム中に存在するポリペプチドが含まれる。特に好ましいポリペプチドは、これらのカテゴリーのうちの２つ以上に該当するもの、例えば外膜中に存在する脂質付加ポリペプチドである。リポタンパク質は、シグナルペプチドの翻訳後プロセシング後に脂質が共有結合するＮ末端のシステインを有していてよい。
【００２５】
本発明は、実施例において開示されるアミノ酸配列のフラグメントを有するポリペプチドをさらに提供する。これらのフラグメントは、これらの配列由来の少なくともｎ個の連続するアミノ酸を有する必要があり、特定の配列によって、ｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上）である。フラグメントは、これらの配列の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、または好ましくはＢ細胞エピトープを有してよい。Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープは経験的に同定されうる（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［１４、１５］または同様の方法を用いて）、または、それらは予測されうる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ‐Ｗｏｌｆの抗原性インデックス［１６］、マトリックスベースアプローチ［１７］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１８］、ニューラル・ネットワーク［１９］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２０、２１］、ＡＤＥＰＴ［２２］、Ｔｓｉｔｅｓ［２３］、親水性［２４］、抗原性インデックス［２５］、または参考文献２６で開示されている方法等を使用して）。
【００２６】
その他の好ましいフラグメントは、（ａ）本発明のポリペプチドのＮ末端シグナルペプチド、（ｂ）これらのポリペプチドだが、そのＮ末端シグナルペプチドを持たないもの、（ｃ）これらのポリペプチドだが、そのＮ末端アミノ酸残基を持たないものである。故に本発明は、本発明のポリペプチドの切断配列をさらに提供する。配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端で切断されていてよい。切断は、単一のアミノ酸またはそれよりも長い配列を伴っていてよい。切断配列は、好ましくは切断前の配列の少なくとも１つのエピトープを保持する。例えば、本発明は配列番号：５６のアミノ酸２１番〜４７０番である切断配列、配列番号：１６８を提供する。
【００２７】
その他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドならびに参考文献５、６、８、１０、および１１のいずれかで同定されているポリペプチドに共通するものである。
【００２８】
その他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドおよび参考文献２７、参考文献２８、米国特許仮出願第６０／６５４６３２号明細書（２００５年２月１８日出願：参考文献２７および２８の優先出願）、または米国特許仮出願第６０／７１２７２０号明細書（２００５年８月２９日出願：参考文献２８の優先出願）において同定されているポリペプチドに共通するものである。
【００２９】
本発明は、実施例において開示されるアミノ酸配列と配列同一性を有し、それらのアミノ酸のフラグメントを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供する。特定の配列によって、配列同一性の度合いは、好ましくは５０％より大きく（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）、フラグメントは、配列由来の少なくともｎ個の連続するアミノ酸を有している必要があり、特定の配列によって、ｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上）である。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、多くの方法、例えば化学合成（全体または部分的に）によって、プロテアーゼを使用して長いポリペプチドを消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養から精製することによって（例えば、組み換え発現から）、生物そのものから（例えば、微生物培養後、または患者から直接）等で調整されうる。４０より短いアミノ酸長のペプチドの産生に好ましい方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学合成を伴う［２９、３０］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［３１］化学に基づく方法のような、ペプチド固相合成法は特に好ましい。酵素合成［３２］も部分的または全体に用いられてよい。化学合成に代わるものとして生物学的合成が用いられてよく、例えば、ポリペプチドは翻訳によって産生されてよい。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われてよい。生物学的方法は、一般にＬ‐アミノ酸を基本とするポリペプチドの産生に限定されるが、Ｄ‐アミノ酸（またはその他の非天然アミノ酸、例えばヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニン等）の導入を可能にするために、翻訳機構（例えばアミノアシルｔＲＮＡ分子のもの）の操作が用いられうる［３３］。しかし、Ｄ‐アミノ酸が含められる場合、化学合成を用いるのが好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端において共有結合修飾を有していてよい。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、各種形態をとりうる（例えば天然型、融合型、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、非脂質付加、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体、多量体、粒子状、変性体等）。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、好ましくは精製されたまたは実質的に精製された形態、すなわちその他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、天然ポリペプチドを含まない）、特に他のＥｘＰＥＣまたは宿主細胞のポリペプチドを含まない形態で提供され、一般に少なくとも約５０％の純度（重量で）であり、多くの場合少なくとも約９０％の純度であり、すなわち組成物の約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば５％以下）がその他の発現ポリペプチドで構成されている。本発明のポリペプチドは好ましくはＥｘＰＥＣポリペプチドである。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、固体支持体と結合していてよい。本発明のポリペプチドは検出可能な標識（例えば、放射性標識または蛍光標識、またはビオチン標識）を有していてよい。
【００３４】
語句“ポリペプチド”は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを意味する。ポリマーは、直鎖状または分岐状であってよく、修飾アミノ酸を有していてよく、非アミノ酸で中断されていてよい。この語句は、自然に、または操作的に修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、またはその他任意の操作もしくは修飾、例えば標識成分との結合などがある。この定義には、例えばアミノ酸の１つ以上のアナログを含むポリペプチド（例えば非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当該技術分野で既知のその他の修飾も含まれる。ポリペプチドは、単一鎖または結合鎖として起こりうる。本発明のポリペプチドは、天然にまたは非天然にグリコシル化されていてよい（すなわちポリペプチドが、対応する天然型ポリペプチドに認められるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを持つ）。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、少なくとも４０アミノ酸長であってよい（例えば、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上）。本発明のポリペプチドは、５００アミノ酸より短くてよい（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸より長くない）。
【００３６】
本発明は、配列‐Ｘ‐Ｙ‐または‐Ｙ‐Ｘ‐を有するポリペプチドを提供し、ここで、‐Ｘ‐は上記で定めた通りのアミノ酸配列であり、‐Ｙ‐は上記で定めた配列ではない、すなわち、本発明は融合タンパク質を提供する。ポリペプチドをコードする配列のＮ末端のコドンがＡＴＧではない場合、そのコドンは、コドンが開始コドンとして翻訳される場合に現れるメチオニンとしてではなく、そのコドンの基本的なアミノ酸として翻訳される。
【００３７】
本発明は、本発明のポリペプチドを産生するためのプロセスを提供し、このプロセスは、ポリペプチド発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップを含む。
【００３８】
本発明は、本発明のポリペプチドを産生するためのプロセスを提供し、ポリペプチドは化学的手段を使用して部分的または全体が合成される。
【００３９】
本発明は、２つ以上の本発明のポリペプチドを有する組成物を提供する。
【００４０】
本発明は、式ＮＨ２‐Ａ‐［‐Ｘ‐Ｌ‐］ｎ‐Ｂ‐ＣＯＯＨで表されるハイブリッドポリペプチドも提供し、ここで、Ｘは上記で定められた通りの本発明のポリペプチドであり、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは１よりも大きい整数である。ｎの値は２とｘの間であり、ｘの値は典型的に３、４、５、６、７、８、９、または１０である。好ましくは、ｎは２、３、または４であり、より好ましくは２または３であり、最も好ましくはｎ＝２である。それぞれのｎの場合において、‐Ｘ‐は同一または異なっていてよい。［‐Ｘ‐Ｌ‐］のそれぞれのｎの場合において、リンカーアミノ酸配列‐Ｌ‐は存在または非存在であってよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドはＮＨ２‐Ｘ１‐Ｌ１‐Ｘ２‐Ｌ２‐ＣＯＯＨ、ＮＨ２‐Ｘ１‐Ｘ２‐ＣＯＯＨ、ＮＨ２‐Ｘ１‐Ｌ１‐Ｘ２‐ＣＯＯＨ、ＮＨ２‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｌ２‐ＣＯＯＨ等であってよい。リンカーアミノ酸配列（１つまたは複数）‐Ｌ‐は、典型的には短い（例えば、２０個以下のアミノ酸、すなわち１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例には、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ‐グリシンリンカー（すなわち、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であるＧｌｙｎ）、およびヒスチジンタグ（すなわち、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であるＨｉｓｎ）が含まれる。その他の適当なリンカーアミノ酸配列は当業者には明らかであろう。‐Ａ‐および‐Ｂ‐は、典型的には短い（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）任意の配列である。例には、ポリペプチド輸送を導くリーダー配列、またはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわちｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上であるＨｉｓｎ）が含まれる。その他の適当なＮ末端およびＣ末端アミノ酸配列は、当業者には明らかであろう。
【００４１】
本発明のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの免疫原性を評価するため、各種試験が用いられうる。例えば、ポリペプチドは、組み換え発現されて、患者の血清をイムノブロットでスクリーニングするために使用されうる。ポリペプチドと患者血清との間の陽性反応は、問題とされているタンパク質に対する免疫応答を患者が以前に開始したことがある、すなわちそのタンパク質が免疫原であることを示唆するものである。この方法は、免疫優性タンパク質を同定するためにも使用されうる。
【００４２】
抗体
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。これらは、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、任意の適当な手段によって産生されてよい（例えば、組み換え発現によって）。ヒト免疫系との適合性を高めるため、抗体はキメラ化もしくはヒト化されていてよい［例えば、参考文献３４および３５］、または完全なヒト抗体が用いられてよい。抗体は、検出可能な標識（例えば、診断アッセイのため）を含んでよい。本発明の抗体は、固体支持体に結合していてよい。本発明の抗体は好ましくは中和抗体である。
【００４３】
モノクローナル抗体は、それらが標的とする個々のポリペプチドの同定および精製に特に有用である。本発明のモノクローナル抗体は、免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等において試薬として用いられてもよい。これらの応用では、抗体は、分析的に検出可能な試薬、例えば放射性同位元素、蛍光分子、または酵素で標識されうる。上記の方法で産生されたモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの分子的同定およびキャラクタリゼーション（エピトープマッピング）にも使用されてよい。
【００４４】
本発明の抗体は好ましくは大腸菌のＥｘＰＥＣ株に特異的である、すなわち、それらは、その他の細菌と比較して（例えば、ＥｘＰＥＣ以外の大腸菌と比較して、および大腸菌以外の細菌と比較して）、ＥｘＰＥＣ大腸菌に選択的に結合する。より好ましくは、抗体はＵＰＥＣ株に特異的である、すなわち、それらは、他のＥｘＰＥＣ大腸菌を含むその他の細菌と比較してＵＰＥＣ細菌に選択的に結合する。
【００４５】
本発明の抗体は、好ましくは精製された、または実質的に精製された形態で提供される。典型的には、抗体は、その他のポリペプチドを実質的に含まない、例えば組成物の９０％未満（重量で）、多くの場合は６０％未満、より多くの場合は５０％未満がその他のポリペプチドで構成されている組成物中に存在する。
【００４６】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、すなわち重鎖α鎖、γ鎖、またはμ鎖）でありうるが、一般的にはＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内において、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスであってよい。本発明の抗体はκまたはλ軽鎖を有していてよい。
【００４７】
本発明の抗体は、完全抗体、抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖフラグメント（非共有結合性ヘテロ二量体）、一本鎖抗体、例えば一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、オリゴボディ等をはじめとする各種の形態をとりうる。語句“抗体”は、いかなる特定の起源も意味せず、従来にないプロセス、例えばファージディスプレイで得られた抗体を含む。
【００４８】
本発明は、本発明のポリペプチドを検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）抗体‐抗原複合体の形成に適した条件下で、本発明の抗体を生体サンプルと接触させるステップと、（ｂ）前述の複合体を検出するステップとを含む。
【００４９】
本発明は、本発明の抗体を検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）抗体‐抗原複合体の形成に適した条件下で、本発明のポリペプチドと生体サンプル（例えば、血液または血清サンプル）を接触させるステップと、（ｂ）前述の複合体を検出するステップとを含む。
【００５０】
好ましい抗体は、当該技術分野で既知の抗体よりも実質的に高い親和性で本発明のポリペプチドに結合する。好ましくは、親和性は、当分野で既知の抗体よりも少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍等強い。
【００５１】
核酸
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸も提供する。本発明は、そのようなヌクレオチド配列と配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸も提供する。配列間の同一性は、好ましくは、上述のようにＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎのホモロジーサーチアルゴリズムによって決定される。そのような核酸は、同じアミノ酸をコードするのに別のコドンを使用するものを含む。
【００５２】
本発明は、これらの核酸にハイブリダイズしうる核酸も提供する。ハイブリダイゼーション反応は、異なる“ストリンジェンシー”条件下で実施されうる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は、当該技術分野で発表されており周知である［例えば、参考文献２９７のページ７．５２］。関連条件の例は（ストリンジェンシーが増加する順に）：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃、および６８℃のインキュベーション温度、１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣのバッファー濃度（このときＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸バッファーである）およびその他のバッファー系を使用したそれらと同等のもの、０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度、５分〜２４時間のインキュベーション時間、１回、２回、またはそれ以上の洗浄ステップ、１、２、または１５分間の洗浄インキュベーション時間、ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液である。ハイブリダイゼーション技術およびそれらの最適化は、当該技術分野で周知である［例えば、参考文献３６、３７、２９７、２９９等を参照。］
いくつかの実施形態において、本発明の核酸は低ストリンジェンシー条件下で標的とハイブリダイズし、他の実施形態において、本発明の核酸は中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、好ましい実施形態において、本発明の核酸は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、５０℃、１０×ＳＳＣである。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、５５℃、１×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、６８℃、０．１×ＳＳＣである。
【００５３】
これらの配列のフラグメントを有する核酸も提供される。これらは、配列由来の少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを有する必要があり、特定の配列によって、ｎは１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００またはそれ以上）である。好ましいフラグメントは、本発明の核酸配列ならびに参考文献５、６、８、１０、および１１のいずれかにおいて同定された核酸配列に共通のものである。
【００５４】
本発明は、式５’‐Ｘ‐Ｙ‐Ｚ‐３’の核酸を提供し、ここで、‐Ｘ‐はｘ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、‐Ｚ‐はｚ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、‐Ｙ‐は（ａ）配列番号：１〜１６８の１つをコードする核酸配列のフラグメントまたは（ｂ）（ａ）の相補体のいずれかからなるヌクレオチド配列であり、前述の核酸５’‐Ｘ‐Ｙ‐Ｚ‐３’は（ｉ）配列番号：１〜１６８の１つをコードする核酸配列のフラグメントでもないし（ｉｉ）（ｉ）の相補体でもない。‐Ｘ‐および／または‐Ｚ‐部分はプロモーター配列（またはその相補体）を有していてよい。
【００５５】
本発明は、これらの配列に相補的な配列を有する核酸を含む（例えば、アンチセンスまたはプロービング用、またはプライマーとしての使用のため）。
【００５６】
本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイまたは‘遺伝子チップ’において）および増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）ならびにその他の核酸技術において使用されうる。
【００５７】
本発明による核酸は各種の形態をとりうる（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識化等）。本発明の核酸は環状または分岐状であってよいが、一般的には線状である。別段の定めまたは求めがない限り、核酸を利用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成する２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれ、の両方を使用してよい。プライマーおよびプローブは、アンチセンス核酸と同様、一般に一本鎖である。
【００５８】
本発明の核酸は好ましくは、精製された、または実質的に精製された形態で提供される、すなわちその他の核酸を実質的に含まない（例えば、天然の核酸を含まない）、特に他のＥｘＰＥＣまたは宿主細胞の核酸を含まず、一般的には少なくとも約５０％の純度（重量で）であり、多くの場合少なくとも約９０％の純度である。本発明の核酸は好ましくはＥｘＰＥＣの核酸である。
【００５９】
本発明の核酸は、多くの方法、例えば全体または部分的な化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホラミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用した長い核酸の消化によって、短い核酸またはヌクレオチドを連結する（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用して）ことによって、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリ等から調製されてよい。
【００６０】
本発明の核酸は、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マイクロアレイ担体、レジン等）に結合していてよい。本発明の核酸は、例えば放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識で標識されてよい。これは、検出技術において核酸が使用される場合、例えば核酸がプライマーまたはプローブとして使用される場合に特に有用である。
【００６１】
語句“核酸”は一般に、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を意味する。これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが含まれる。これには、ＤＮＡもしくはＲＮＡアナログ、例えば修飾骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオアート）または修飾塩基を含むものが含まれる。故に、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リコンビナント核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマー等を含む。本発明の核酸がＲＮＡの形態をとる場合、５’にキャップを有していても、有していなくてもよい。
【００６２】
本発明の核酸は配列を有するが、それらは非ＥｘＰＥＣ配列も有していてよい（例えば、上記で定めたような、式５’‐Ｘ‐Ｙ‐Ｚ‐３’の核酸中に）。これはプライマーにとって特に有用であり、従って核酸ターゲットに相補的な第１の配列および核酸ターゲットに相補的でない第２の配列を有していてよい。プライマー中の任意のそのような非相補的配列は、好ましくは相補的配列の方向に向かって５’である。典型的な非相補的配列は、制限酵素認識部位またはプロモーター配列を有する。
【００６３】
本発明の核酸はベクターの一部であってよい、すなわち１つ以上の細胞種の形質導入／トランスフェクション用にデザインされた核酸構築物の一部であってよい。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖、および複製用にデザインされた“クローニングベクター”、宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現用にデザインされた“発現ベクター”、組み換えウイルスまたはウイルス様粒子の産生をもたらすようデザインされた“ウイルスベクター”、または２種類以上のベクターの特性を有する“シャトルベクター”であってよい。好ましいベクターはプラスミドである。“宿主細胞”は、外来の核酸のレシピエントたりうる、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異および／または変化の結果、子孫は必ずしも元の親細胞と完全に同一でなくてよい（形態的に、または全ＤＮＡ相補体において）。宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明の核酸をトランスフェクトまたは感染させた細胞を含む。
【００６４】
核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列中の“Ｕ”はＤＮＡ中では“Ｔ”に置換されることが理解される。同様に、核酸がＲＮＡの場合、ＤＮＡ配列中の“Ｔ”はＲＮＡ中では“Ｕ”に置換されることが理解される。
【００６５】
核酸に関して使用される場合の語句“相補体”または“相補的”は、ワトソン・クリック型の塩基対を意味する。故に、Ｃの相補体はＧであり、Ｇの相補体はＣであり、Ａの相補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の相補体はＡである。Ｉ（プリンイノシン）のような塩基を、例えばピリミジン（ＣまたはＴ）の相補体として使用することも可能である。この語句は方向も示唆し、５’‐ＡＣＡＧＴ‐３’の相補体は、５’‐ＴＧＴＣＡ‐３’ではなく５’‐ＡＣＴＧＴ‐３’である。
【００６６】
本発明の核酸は、例えば：ポリペプチドを産生するため、生体サンプル中の核酸検出用のハイブリダイゼーションプローブとして、核酸のさらなるコピーを生成するため、リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するため、一本鎖ＤＮＡプライマーもしくはプローブとして、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして使用されうる。
【００６７】
本発明は、本発明の核酸を産生するためのプロセスを提供し、核酸は、化学的手段を使用して部分的にまたは全体が合成される。
【００６８】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を有するベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００６９】
本発明は、ＥｘＰＥＣ核酸配列中に含まれる鋳型配列を増幅するためのプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）を有するキットも提供し、このキットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを有し、第１のプライマーは前述の鋳型配列に実質的に相補的であり、第２のプライマーは前述の鋳型配列の相補体に実質的に相補的であり、実質的な相補性を有する前述のプライマーの部分が、増幅される鋳型配列の末端を定める。第１のプライマーおよび／または第２のプライマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含んでよい。
【００７０】
本発明は、一本鎖または二本鎖核酸（またはそれらの混合）に含まれるＥｘＰＥＣの鋳型核酸配列の増幅を可能にする、第１および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを有するキットも提供し、（ａ）第１のオリゴヌクレオチドは、前述の鋳型核酸配列に実質的に相補的なプライマー配列を有し、（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドは、前述の鋳型核酸配列の相補体に実質的に相補的なプライマー配列を有し、（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、前述の鋳型核酸に相補的ではない配列を有し、（ｄ）前述のプライマー配列は、増幅される鋳型配列の末端を定める。特徴（ｃ）の非相補的配列（１つまたは複数）は、好ましくはプライマー配列の上流（すなわち５’）である。これらの（ｃ）の配列の１つまたは両方は、制限酵素認識部位［例えば、参考文献３８］またはプロモーター配列［例えば、３９］を有していてよい。第１のオリゴヌクレオチドおよび／または第２のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含んでよい。
【００７１】
本発明は、本発明の核酸を検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、（ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、二本鎖を形成するために本発明による核酸プローブを生体サンプルと接触させるステップと、（ｂ）前述の二本鎖を検出するステップとを含む。
【００７２】
本発明は、生体サンプル（例えば、血液）における検出のためのプロセスを提供し、このプロセスは、ハイブリダイゼーション条件下で本発明による核酸を生体サンプルと接触させるステップを含む。このプロセスは、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）またはハイブリダイゼーション（例、マイクロアレイ、ブロット、溶液中でのプローブとのハイブリダイゼーション等）を伴ってよい。臨床サンプル中のＥｘＰＥＣのＰＣＲ検出が報告されている［例えば、参考文献４０を参照］。核酸ベースの臨床アッセイは参考文献４１において一般的な説明がなされている。
【００７３】
本発明は、ターゲット配列のフラグメントを調製するためのプロセスを提供し、フラグメントは核酸プライマーの伸長によって調製される。ターゲット配列および／またはプライマーは、本発明の核酸である。プライマー伸長反応は、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）を伴ってよい。
【００７４】
本発明による核酸増幅は、定量的および／またはリアルタイムであってよい。
【００７５】
本発明のある実施形態において、核酸は好ましくは、長さが少なくとも７ヌクレオチドである（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００ヌクレオチドまたはそれ以上）。
【００７６】
本発明のある実施形態において、核酸は好ましくは、長さが最大で５００ヌクレオチドである（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチドまたはそれより以下）。
【００７７】
本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションに用いられるその他の核酸は、好ましくは長さが１０〜３０ヌクレオチドである（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）。
【００７８】
ベシクル
参考文献４２は、ｍｌｔＡ（ムレイン溶解性トランスクリコシラーゼ）または大腸菌Ｔｏｌ‐Ｐａｌ複合体［４３］の成分の１つ以上、例えばｔｏｌＡ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、および／またはｔｏｌＲのノックアウトによる、尿路病原性（ＵＰＥＣ）株からのベシクルの調製を説明している。ベシクルの表面上の防御性抗原の量および／またはイムノアクセシビリティを高めるために、細菌の染色体に対して１つ以上のさらなる遺伝子変化を起こすことによって、またはエピソーム要素（例えば、発現ベクター）を挿入することでこれらのベシクルが改良されうる。
【００７９】
そのような改良を得る一つの方法は、本発明のポリペプチドの発現を上方制御することである。ターゲットタンパク質の発現を高めるための多くの異なる遺伝学的戦略が当分野で周知であり、２つの大きなカテゴリーに分けられる：１つは、内在性遺伝子の発現を高めるために染色体の改変を利用するもの（例えば、より強力なプロモーターによる野生型プロモーターの置換、天然の抑制遺伝子の不活化等）であり、もう１つはエピソーム要素（例えば、高コピー数プラスミド、遺伝子操作されたターゲット遺伝子を有するベクター等）または染色体への外来遺伝子の組み込みによる組み換え発現に基づくものである。これらのアプローチのそれぞれの実例は、参考文献４４〜５０に認められる。
【００８０】
ベシクルの免疫原性および選択性を高める別の方法は、免疫優性非防御抗原の発現を下方制御すること、または共生菌株に認められるタンパク質と相同なタンパク質を下方制御することである。ＬＰＳのリピドＡ部分の解毒によってさらなる改善が達成されうる。その他のグラム陰性病原菌から改良ベシクルを産生するための同様の変化がこれまでに説明されている（例えば、参考文献５１および５２を参照）。
【００８１】
免疫原性組成物に使用するための改良ベシクルを得るために、上記の全ての戦略が単独で、または組み合わせて使用されうる。本発明は、ｍｌｔＡおよび／またはそのＴｏｌ‐Ｐａｌ複合体の成分がノックアウトされ、（ｉ）ポリペプチドをコードする遺伝子と天然に結合しているプロモーターに比べて高いポリペプチドの発現レベルを提供するプロモーターで制御される、本発明のポリペプチドをコードする染色体性遺伝子、または（ｉｉ）本発明のポリペプチドをコードする自己複製染色体外要素のうちの１つ以上と、場合により（ｉｉｉ）大腸菌ＬＰＳのリピドＡ部分の毒性を、野生型ＬＰＳと比較して低下させるための遺伝子修飾の１つ以上を有する病原性大腸菌（特にＵＰＥＣ）を提供する。
【００８２】
本発明は、そのような細菌を培養することで入手可能なベシクル、例えば細菌の培養中に培地に放出されるベシクルを提供する。
【００８３】
特定の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドを発現する、１つ以上の外膜ベシクル（ＯＭＶ）を有する免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１〜１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を有する１つ以上のポリペプチドを発現する、１つ以上のＯＭＶを有する免疫原性組成物を提供する。さらなる実施形態において、免疫原性組成物は、配列番号１〜１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを有するフラグメントを有するポリペプチドを有する。
【００８４】
医薬組成物
本発明は、（ａ）本発明のポリペプチド、抗体、ベシクル、および／または核酸と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを有する組成物を提供する。これらの組成物は、例えば免疫原性組成物として、または診断用試薬として、またはワクチンとして適していてよい。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち感染を防ぐ）または治療的（すなわち感染を治療する）のいずれかであってよいが、典型的には予防的なものである。
【００８５】
‘薬学的に許容される担体’は、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体が誘導することのない任意の担体を含む。好適な担体は、典型的には大型で、ゆっくりと代謝される高分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、ショ糖、トレハロース、乳糖、および脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）である。そのような担体は当業者に周知である。ワクチンは、希釈剤、例えば水、生理食塩水、グリセロール等も含んでよい。さらに、添加物、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが存在していてよい。パイロジェンフリーの、リン酸緩衝生理食塩水が典型的な担体である。薬学的に許容される賦形剤は、参考文献２９４で詳しく取り上げられている。
【００８６】
本発明の組成物は、特に複数回投与形式に包装される場合、抗菌剤を含んでよい。
【００８７】
本発明の組成物は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を有していてよい。界面活性剤は一般に、例えば＜０．０１％の低いレベルで存在する。
【００８８】
本発明の組成物は、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含んでよい。濃度１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌが典型的である。
【００８９】
本発明の組成物は一般に緩衝液を含む。リン酸緩衝液が典型的である。
【００９０】
本発明の組成物は、特に、もしそれらが凍結乾燥される場合、またはもしそれらが凍結乾燥材料から再構成された材料を含む場合は、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、白糖またはトレハロース）を、例えばおよそ１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で有していてよい。凍結乾燥用の組成物のｐＨは、凍結乾燥の前におよそ６．１に調節されてよい。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、その他の免疫調節物質と併せて投与されてよい。特に、組成物は多くの場合ワクチンアジュバントを含む。アジュバントは、下記でさらに説明するＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる群の１つ以上から選択されてよい。本発明の組成物に用いられてよいアジュバントには：以下が含まれるがこれらに限定されない。
【００９２】
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したミネラル含有組成物には、ミネラル塩、例えばアルミニウム塩およびカルシウム塩が含まれる。本発明は、ミネラル塩、例えば水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスファート、オルトホスファート）、硫酸塩等［例えば、参考文献５３の第８章および第９章参照］、または異なるミネラル化合物の混合物（例えば、リン酸塩および水酸化物アジュバントの混合物、場合によりリン酸塩が過剰量）を含み、化合物は任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質等）をとり、塩（１つまたは複数）への吸着が好ましい。ミネラル含有組成物は、金属塩の粒子として製されてもよい［５４］。
【００９３】
典型的なリン酸アルミニウムアジュバントは、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで添加されたＰＯ４／Ａｌのモル比が０．８４〜０．９２の非晶質アルミニウムヒドロキシホスファートである。例えば１ドーズ当たりの複合体につき５０〜１００μｇＡｌ３＋で、低用量のリン酸アルミニウムでの吸着が用いられてよい。リン酸アルミニウムが用いられ、抗原をアジュバントに吸着させないことが望ましい場合、遊離リン酸イオンが溶液へ添加される（例えば、リン酸バッファーの使用によって）。
【００９４】
リン酸アルミニウムの零電荷点（ＰＺＣ）は、リン酸塩のヒドロキシル基への置換度に反比例し、この置換度は、沈殿による塩の生成に用いられる反応条件および反応物の濃度に応じて変化しうる。ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させることによって（リン酸塩が多い＝ＰＺＣがより酸性になる）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝液を加えることによって（ＰＺＣがより塩基性になる）も、ＰＺＣが変化する。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムのＰＺＣは一般に、４．０〜７．０であり、より好ましくは５．０〜６．５であり、例えば約５．７である。
【００９５】
本発明の組成物を調製するために用いられるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝剤またはトリス緩衝液）を含んでよいが、これは必ずしも必要ではない。懸濁液は好ましくは滅菌済みでパイロジェンフリーである。懸濁液は、例えば１．０〜２０ｍＭの濃度、好ましくは５〜１５ｍＭの濃度、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する水溶性遊離リン酸イオンを含んでいてよい。懸濁液は塩化ナトリウムも有していてよい。
【００９６】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用できる。この場合、水酸化アルミニウムよりもリン酸アルミニウムが多く、例えば重量比で少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１等で存在していてよい。
【００９７】
１ドーズ当たりのＡｌ３＋の用量が０．２〜１．０ｍｇとなるように、アルミニウム塩が本発明のワクチンに添加されてよい。
【００９８】
Ｂ．オイルエマルション
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したオイルエマルション組成物には、スクアレン‐水エマルション、例えばＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に調製された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％スパン８５）が含まれる［参考文献５３の第１０章。参考文献５５〜５７、参考文献５８の第１２章も参照されたい］。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（登録商標）インフルエンザウイルス３価サブユニットワクチンにおいてアジュバントとして用いられる。このエマルションは、遊離にはクエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
【００９９】
この組成物において使用するのに特に好ましいアジュバントは、サブミクロンの水中油型エマルションである。本明細書で使用するのに好ましいサブミクロン水中油型エマルションは、場合により各種の量のＭＴＰ‐ＰＥを含むスクアレン／水エマルション、例えば４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、および／または０．２５〜１．０％スパン８５（ソルビタントリオレアート）ならびに、場合によりＮ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミニル‐Ｌ‐アラニン‐２‐（１’‐２’‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ヒドロキシホスホリルオキシ）‐エチルアミン（ＭＴＰ‐ＰＥ）を含む、サブミクロンの水中油型エマルションである。この組成物中に使用するための、サブミクロンの水中油型エマルション、これと免疫刺激物質、例えばムラミルペプチドを調製する方法は参考文献５５および５９〜６０で詳細に説明されている。
【０１００】
スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ８０のエマルションが使用されうる。このエマルションは、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。これは、スパン８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含んでよい。これらのエマルションは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を含んでよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１であり、この値はより安定したエマルションをもたらす。そのようなエマルションの１つは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解して２％溶液を得、この溶液の９０ｍｌを（５ｇのＤＬ‐α‐トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）のミクスチャーと混合した後、このミクスチャーをミクロフルイダイズすることによって調製されうる。得られたエマルションは、例えば平均径が１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍのサブミクロン油滴を有していてよい。
【０１０１】
スクアレン、トコフェロール、およびトリトン界面活性剤（例えば、トリトンＸ‐１００）のエマルションも使用されうる。
【０１０２】
スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（“プルロニック（登録商標）Ｌ１２１”）のエマルションが使用されうる。このエマルションは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で調製されうる。このエマルションは、ムラミルジペプチドの有用な送達担体であり、“ＳＡＦ‐１”アジュバント［６１］においてトレオニル‐ＭＤＰと使用されている（０．０５〜１％Ｔｈｒ‐ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％プルロニックＬ１２１、および０．２％ポリソルベート８０）。これは、“ＡＦ”アジュバント［６２］にみられるようにＴｈｒ‐ＭＤＰなしでも使用されうる（５％スクアラン、１．２５％プルロニックＬ１２１、および０．２％ポリソルベート８０）。ミクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０１０３】
本発明において、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）もアジュバントとして用いてよい。
【０１０４】
Ｃ．サポニン製剤［参考文献５３の第２２章］
サポニン製剤も本発明においてアジュバントとして使用されてよい。サポニンは、幅広い植物種の樹皮、葉、茎、根、および花にも認められるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種のグループである。シャボンのきの樹皮から分離されるサポニンはアジュバントとして広く研究されている。サポニンはスミラックスオルタナ（サルサパリラ）、シュコンカスミソウ（ブライダルベール）、およびサポナリア（サボンソウ）から商業的に得ることも可能である。サポニンアジュバント製剤は、精製製剤、例えばＱＳ２１だけでなく、脂質製剤、例えばＩＳＣＯＭを含む。
【０１０５】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ‐ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を用いた特定の精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ‐Ａ、ＱＨ‐Ｂ、およびＱＨ‐Ｃが含まれる。好ましくは、サポニンはＱＳ‐２１である。ＱＳ‐２１の製造方法は参考文献６３に開示されている。サポニン製剤は、ステロール、例えばコレステロールも有していてよい［６４］。
【０１０６】
サポニンとコレステロールの組み合わせは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成するために使用されうる［参考文献５３の第２３章］。ＩＳＣＯＭは典型的には、リン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンも含む。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭで使用されうる。好ましくは、ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献６４〜６６でさらに説明されている。場合により、ＩＳＣＯＭは追加の界面活性剤（１つまたは複数）を欠いていてよい［６７］。
【０１０７】
サポニン系アジュバントの開発のレビューは、参考文献６８および６９に認められる。
【０１０８】
Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子
ビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明においてアジュバントとして使用されうる。これらの構造は一般的に、場合によりリン脂質と組み合わされたまたは製された、ウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。それらは一般に非病原性であり、複製せず、一般にいかなる天然のウイルスゲノムも含まない。ウイルスタンパク質は、組み換えによって産生されてよく、または、全ウイルスから単離されてよい。ビロゾームまたはＶＬＰへの使用に適したこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（例えばＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えばコアタンパク質またはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（例えば外殻タンパク質）、ＧＡファージ、ｆｒ‐ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えばレトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）から得られたタンパク質を含む。ＶＬＰは参考文献７０〜７５でさらに論じられている。ビロゾームは、例えば参考文献７６でさらに論じられている。
【０１０９】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明において使用するのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、およびＡＤＰ‐リボシル化毒素、ならびにこれらの無毒化誘導体を含む。
【０１１０】
ＬＰＳの非毒性誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３‐Ｏ‐デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、３デ‐Ｏ‐アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５、または６つのアシル化鎖の混合体である。好ましい“小粒子”形態の３デ‐Ｏ‐アシル化モノホスホリルリピドＡは参考文献７７に開示されている。そのような“小粒子”の３ｄＭＰＬは、０．２２μｍメンブレンで滅菌濾過するのに十分な小ささである［７７］。その他の非毒性ＬＰＳ誘導体は、モノホスホリルリピドＡ模倣体、例えばアミノアルキルグルコサミニドホスファート誘導体、例えばＲＣ‐５２９を含む［７８、７９］。
【０１１１】
リピドＡ誘導体は、ＯＭ‐１７４のような大腸菌由来のリピドＡの誘導体を含む。ＯＭ‐１７４は、例えば参考文献８０および８１で説明されている。
【０１１２】
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンに結合した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含む。回文配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが示されている。
【０１１３】
ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾／アナログ、例えばホスホロチオアート修飾を含むことができ、二本鎖または一本鎖でありうる。参考文献８２、８３、および８４は、可能なアナログ置換、例えば２’‐デオキシ‐７‐デアザグアノシンによるグアノシンの置換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は参考文献８５〜９０でさらに論じられている。
【０１１４】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ等のＴＬＲ９を標的としてよい［９１］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ‐Ａ ＯＤＮのようにＴｈ１免疫応答の誘発に特異的であってよい、またはＣｐＧ‐Ｂ ＯＤＮのようにＢ細胞応答の誘発により特異的であってもよい。ＣｐＧ‐ＡおよびＣｐＧ‐Ｂ ＯＤＮは参考文献９２〜９４で論じられている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ‐Ａ ＯＤＮである。
【０１１５】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用可能となるように構築される。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がそれらの３’末端で結合して、“イムノマー”を形成してもよい。例えば、参考文献９１および９５〜９７を参照されたい。
【０１１６】
その他の免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、二本鎖ＲＮＡ、または回文配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１１７】
細菌性ＡＤＰ‐リボシル化毒素およびその無毒化誘導体が、本発明においてアジュバントとして用いられてよい。好ましくは、タンパク質は大腸菌（大腸菌易熱性エンテロトキシン“ＬＴ”）、コレラ（“ＣＴ”）、または百日咳（“ＰＴ”）由来である。無毒化ＡＤＰ‐リボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用は参考文献９８で、非経口アジュバントとしての使用は参考文献９９で説明されている。毒素またはトキソイドは好ましくは、ホロトキシンの形態であり、ＡおよびＢサブユニットの両方を有する。好ましくは、Ａサブユニットは無毒化変異を有し、好ましくは、Ｂサブユニットは変異していない。好ましくは、アジュバントは無毒化ＬＴ変異体、例えばＬＴ‐Ｋ６３、ＬＴ‐Ｒ７２、およびＬＴ‐Ｇ１９２である。ＡＤＰ‐リボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ‐Ｋ６３およびＬＴ‐Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、参考文献１００〜１０７に認められる。アミノ酸置換の数に関する言及は、好ましくは参考文献１０８で説明されるＡＤＰ‐リボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づいている。
【０１１８】
参考文献１０９で定められているように、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物
【０１１９】
【化１】
、およびこれらの塩もアジュバントとして使用されてよく、例えば‘ＥＲ８０３０５８’、‘ＥＲ８０３７３２’、‘ＥＲ８０４０５３’、‘ＥＲ８０４０５８’、‘ＥＲ８０４０５９’、‘ＥＲ８０４４４２’、‘ＥＲ８０４６８０’、‘ＥＲ８０４７６４’、‘ＥＲ８０３０２２’、または‘ＥＲ８０４０５７’、例として、
【０１２０】
【化２】
がある。
【０１２１】
Ｆ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節物質には、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１２［１１０］等）［１１１］、インターフェロン（例えば、インターフェロン‐γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、ならびにマクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ‐１α）およびＭＩＰ‐１β［１１２］が含まれる。
【０１２２】
Ｇ．生体接着物質および粘膜付着物質
生体接着物質および粘膜付着物質も本発明においてアジュバントとして使用されてよい。好適な生体接着物質には、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［１１３］または粘膜付着物質、例えばポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体が含まれる。キトサンおよびその誘導体も本発明においてアジュバントとして使用されてよい［１１４］。
【０１２３】
Ｈ．ミクロ粒子
ミクロ粒子も本発明においてアジュバントとして使用されてよい。生体分解性で無毒の材料（例えば、ポリ（α‐ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン等）と、ポリ（ラクチド‐ｃｏ‐グリコリド）から形成されたミクロ粒子（すなわち、直径が〜１００ｎｍから〜１５０μｍ、より好ましくは直径が〜２００ｎｍから〜３０μｍ、最も好ましくは直径が〜５００ｎｍから〜１０μｍの粒子）が好ましく、場合により負に帯電した表面（例えば、ＳＤＳで）または正に帯電した表面（例えば、カチオン性界面活性剤、例えばＣＴＡＢで）を持つよう処理される。
【０１２４】
Ｉ．リポソーム（参考文献５３の第１３および第１４章）
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献１１５〜１１７で説明されている。
【０１２５】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明での使用に適したアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが含まれる［１１８］。そのような製剤は、オクトキシノールとの組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１１９］のみならず、少なくとも１つの追加の非イオン界面活性剤、例えばオクトキシノールとの組み合わせのポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［１２０］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ９）、ポリオキシエチレン‐９‐ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン‐８‐ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン‐４‐ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン‐３５‐ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン‐２３‐ラウリルエーテル。
【０１２６】
Ｋ．ホスファゼン、例えばＰＣＰＰ
ホスファゼンアジュバントは、例えば参考文献１２１および１２２で説明されるようなポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（“ＰＣＰＰ”）を含む。
【０１２７】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの例には、Ｎ‐アセチル‐ムラミル‐Ｌ‐トレオニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ｔｈｒ‐ＭＤＰ）、Ｎ‐アセチル‐ノルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミン（ｎｏｒ‐ＭＤＰ）、およびＮ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミニル‐Ｌ‐アラニン‐２‐（１’‐２’‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ヒドロキシホスホリルオキシ）‐エチルアミン ＭＴＰ‐ＰＥが含まれる。
【０１２８】
Ｍ．イミダゾキノリン化合物
イミダゾキノリンアジュバントは、イミキモド（“Ｒ‐８３７”）［１２３、１２４］、レシキモド（“Ｒ‐８４８”）［１２５］、およびこれらのアナログ、ならびにこれらの塩（例えば、塩酸塩）を含む。免疫刺激性イミダゾキノリンの詳細は、参考文献１２６〜１３０に認められる。
【０１２９】
Ｎ．チオセミカルバゾン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した、チオセミカルバゾン化合物の例だけでなく、化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法には、参考文献１３１で説明されているものが含まれる。チオセミカルバゾンは、ヒト末梢血液中の単核球を刺激して、サイトカイン、例えばＴＮＦ‐αを産生させるのに特に効果的である。
【０１３０】
Ｏ．トリプタントリン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した、トリプタントリン化合物の例だけでなく、化合物の処方、製造、およびスクリーニング方法には、参考文献１３２で説明されているものが含まれる。トリプタントリン化合物は、ヒト末梢血液中の単核球を刺激して、サイトカイン、例えばＴＮＦ‐αを産生させるのに特に効果的である。
【０１３１】
Ｐ．ヌクレオシドアナログ
各種のヌクレオシドアナログがアジュバントとして使用されうる、例えば（ａ）イサトリビン（ＡＮＡ‐２４５、７‐チア‐８‐オキソグアノシン）：
【０１３２】
【化３】
およびそのプロドラッグ、（ｂ）ＡＮＡ９７５、（ｃ）ＡＮＡ‐０２５‐１、（ｄ）ＡＮＡ３８０、（ｅ）参考文献１３３〜１３５に開示の化合物、（ｆ）式
【０１３３】
【化４】
を有する化合物であって、
式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨ、ハロゲン、‐ＮＲａＲｂ、‐ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり、
Ｒ３は、非存在、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換へテロシクリルであり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＨ、ハロゲン、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒｄ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキルである、または一緒に結合してＲ４〜５
【０１３４】
【化５】
のような５員環を形成し、
結合は
【０１３５】
【化６】
で示される化学結合で達成されており、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立してＮ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり、
Ｒ８は、Ｈ、ハロゲン、‐ＯＨ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、‐ＯＨ、‐ＮＲａＲｂ、‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｏ‐Ｒｃ、‐Ｏ‐（Ｃ１〜６アルキル）、‐Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒｄであり、
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、ヘテロシクリル、置換へテロシクリル、またはＲ９ａであり、ここでＲ９ａは
【０１３６】
【化７】
であり、結合は
【０１３７】
【化８】
で示される化学結合で達成されており、
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立してＨ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、‐ＮＲａＲｂ、または‐ＯＨであり、
各ＲａおよびＲｂは独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒｄ、Ｃ６〜１０アリールであり、
各Ｒｃは独立して、Ｈ、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、Ｃ１〜６アルキル、または置換Ｃ１〜６アルキルであり、
各Ｒｄは独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、置換Ｃ１〜６アルコキシ、‐ＮＨ２、‐ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、‐ＮＨ（置換Ｃ１〜６アルキル）、‐Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、‐Ｎ（置換Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ６〜１０アリール、またはヘテロシクリルであり、
各Ｒｅは独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、置換Ｃ６〜１０アリール、ヘテロシクリル、または置換へテロシクリルであり、
各Ｒｆは独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、‐Ｃ（Ｏ）‐Ｒｄ、ホスファート、ジホスファート、またはトリホスファートであり、
各ｎは独立して、０、１、２、または３であり、
各ｐは独立して、０、１、または２である、あるいは、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、または互変異性体の薬学的に許容される塩である。
【０１３８】
Ｑ．リン酸含有非環式骨格に結合した脂質
リン酸含有非環式骨格に結合した脂質を含むアジュバントは、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１３６、１３７］：
【０１３９】
【化９】
を含む。
【０１４０】
Ｒ．小分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）
ＳＭＩＰは、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐エチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐ブチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐ブチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐ペンチル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロプ‐２‐エニル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・１‐（２‐メチルプロピル）‐２‐［（フェニルメチル）チオ］‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐４‐アミン、
・１‐（２‐メチルプロピル）‐２‐（プロピルチオ）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐４‐アミン、
・２‐［［４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐イル］（メチル）アミノ］エタノール、
・２‐［［４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐イル］（メチル）アミノ］エチルアセタート、
・４‐アミノ‐１‐（２‐メチルプロピル）‐１，３‐ジヒドロ‐２Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２‐オン、
・Ｎ２‐ブチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐ブチル‐Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２‐メチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・Ｎ２，Ｎ２‐ジメチル‐１‐（２‐メチルプロピル）‐Ｎ４，Ｎ４‐ビス（フェニルメチル）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、
・１‐｛４‐アミノ‐２‐［メチル（プロピル）アミノ］‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐１‐イル｝‐２‐メチルプロパン‐２‐オール、
・１‐［４‐アミノ‐２‐（プロピルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐１‐イル］‐２‐メチルプロパン‐２‐オール、
・Ｎ４，Ｎ４‐ジベンジル‐１‐（２‐メトキシ‐２‐メチルプロピル）‐Ｎ２‐プロピル‐１Ｈ‐イミダゾ［４，５‐ｃ］キノリン‐２，４‐ジアミン、を含む。
【０１４１】
Ｓ．プロテオソーム
アジュバントの１つは、第２のグラム陰性細菌から得られたリポサッカライド製剤と組み合わせて第１のグラム陰性細菌から調製された外膜タンパク質プロテオソーム製剤であり、この外膜タンパク質プロテオソームおよびリポサッカライド製剤は、安定した非共有結合性アジュバント複合体を形成する。そのような複合体には“ＩＶＸ‐９０８”が含まれ、これは髄膜炎菌の外膜およびリポ多糖からなる複合体である。これらは、インフルエンザワクチンにアジュバントとして用いられている［１３８］。
【０１４２】
Ｔ．その他のアジュバント
免疫刺激剤として作用するその他の物質は、参考文献５３および５８に開示されている。さらなる有用なアジュバント物質には以下が含まれるがこれらに限定されない：
・メチルイノシン５’モノホスファート（“ＭＩＭＰ”）［１３９］。
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１４０］、例えば、式
【０１４３】
【化１０】
を有するものであって、
式中、Ｒは、水素、直鎖もしくは分岐、非置換または置換、飽和もしくは不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニル、およびアリール基、またはこれらの薬学的に許容される塩もしくは誘導体からなる群から選択される。例には、カスアリン、カスアリン‐６‐α‐Ｄ‐グルコピラノース、３‐ｅｐｉ‐カスアリン、７‐ｅｐｉ‐カスアリン、３，７‐ｄｉｅｐｉ‐カスアリン等が含まれるがこれらに限定されない。
・ガンマイヌリン［１４１］またはその誘導体、例えばアルガムリン。
・参考文献１４２に開示の化合物。
・参考文献１４３に開示の化合物であり、アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１４４、１４５］、ヒドロフタルイミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナゾリノン化合物、ピロール化合物［１４６］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン化合物、およびベンザゾール化合物［１４７］が含まれる。
・ロキソリビン（７‐アリル‐８‐オキソグアノシン）［１４８］。
・カチオン性脂質および（通常は中性の）コリピッドの製剤、例えばアミノプロピル‐ジメチル‐ミリストレイルオキシ‐プロパンアミニウムブロミド‐ジフィタノイルホスファチジル‐エタノールアミン（“Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）”）またはアミノプロピル‐ジメチル‐ビス‐ドデシルオキシ‐プロパンアミニウムブロミド‐ジオレオイルホスファチジル‐エタノールアミン（“ＧＡＰ‐ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ”）である。（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（ｓｙｎ‐９‐テトラデセネイルオキシ）‐１‐プロパンアミニウム塩を含む製剤が好ましい［１４９］。
【０１４４】
本発明は、上記で定めたアジュバントの１つ以上の組み合わせも含んでよい。例えば、以下の組み合わせが本発明においてアジュバント組成物として用いられてよい：（１）サポニンおよび水中油型エマルション［１５０］、（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１５１］、（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール、（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ‐１２（場合により＋ステロール）［１５２］、（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルションの組み合わせ［１５３］、（６）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、５％プルロニックブロック重合体Ｌ１２１、およびｔｈｒ‐ＭＤＰを含有するＳＡＦであって、ミクロフルイダイザーでサブミクロンエマルションにしたもの、またはボルテックスにかけてより大きな粒子サイズのエマルションを調製したもののいずれか、（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（登録商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（登録商標）、（８）１つ以上のミネラル塩（例えばアルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）、および（９）１つ以上のミネラル塩（例えばアルミニウム塩）＋免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１４５】
本発明の組成物は、尿路病原性感染症に効果的に対処するために、好ましくは細胞性免疫応答だけでなく体液性免疫応答の両方を誘発する。この免疫応答は好ましくは、長期持続性（例えば、中和）抗体およびＵＰＥＣ関連抗原への曝露の際に迅速に反応しうる細胞性免疫を誘発する。
【０１４６】
２種類のＴ細胞、ＣＤ４およびＣＤ８細胞は、一般に細胞性免疫および体液性免疫を開始および／または増強するのに必要であると考えられている。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＣＤ８コレセプターを発現でき、一般に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれる。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示された抗原を認識できる、またはその抗原と相互作用可能である。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＣＤ４コレセプターを発現でき、一般にヘルパーＴ細胞と呼ばれる。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原ペプチドを認識する能力を持つ。ＣＤ４細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用の際に、サイトカインなどの因子を分泌しうる。これらの分泌サイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与するその他の細胞を活性化できる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に異なるサブセットにさらに分類されうる：サイトカインおよびエフェクター機能が異なるＴＨ１フェノタイプおよびＴＨ２フェノタイプである。
【０１４７】
活性化ＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増強し（抗原特異的ＣＴＬ産生の増加を含む）、従って細胞内感染への応答において特に有用である。活性化ＴＨ１細胞は、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐γ、およびＴＮＦ‐βの１つ以上を分泌してよい。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することによって局所的な炎症性反応をもたらしてよい。ＴＨ１免疫応答は、ＩＬ‐１２によってＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することにより免疫応答を拡大するように作用してもよい。ＴＨ１によって刺激されたＢ細胞はＩｇＧ２ａを分泌してよい。
【０１４８】
活性化ＴＨ２細胞は、抗体産生を増強し、従って細胞外感染への応答において特に有用である。活性化ＴＨ２細胞は、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０の１つ以上を分泌してよい。ＴＨ２免疫応答は、さらなる防御のためＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞の産生をもたらしてよい。
【０１４９】
増強された免疫応答は、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の１つ以上を含んでよい。増強されたＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答に関与するサイトカイン（例えば、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐γ、およびＴＮＦ‐β）の１つ以上の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａの産生の増加のうちの１つ以上を含んでよい。好ましくは、増強されたＴＨ１免疫応答は、ＩｇＧ２ａ産生の増加を含む。増強されたＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答に関与するサイトカイン（例えば、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０）の１つ以上の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞の産生の増加のうちの１つ以上を含んでよい。好ましくは、増強されたＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１産生の増加を含む。
【０１５０】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発されてよい。ＴＨ１アジュバントは一般に、アジュバントなしでの抗原の免疫付与と比較して、ＩｇＧ２ａ産生レベルの増加を誘発することになる。本発明において使用するのに適したＴＨ１アジュバントは、例えばサポニン製剤、ビロゾームおよびウイルス様粒子、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでよい。免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、本発明で使用するのに好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０１５１】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発されてよい。ＴＨ２アジュバントは一般に、アジュバントなしでの抗原の免疫付与と比較して、ＩｇＧ１産生レベルの増加を誘発することになる。本発明において使用するのに適したＴＨ２アジュバントは、例えば、ミネラル含有組成物、油エマルション、ならびにＡＤＰ‐リボシル化毒素およびその無毒化誘導体を含む。ミネラル含有組成物、例えばアルミニウム塩は、本発明で使用するのに好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０１５２】
好ましくは、本発明は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントの組み合わせを有する組成物を含む。好ましくは、そのような組成物は、増強されたＴＨ１および増強されたＴＨ２応答、すなわちアジュバントなしでの免疫付与と比較して、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ両方の産生の増加を誘発する。さらにより好ましくは、ＴＨ１およびＴＨ２アジュバントの組み合わせを有する組成物は、単独のアジュバントでの免疫付与と比較して（すなわち、ＴＨ１アジュバント単独での免疫付与またはＴＨ２アジュバント単独での免疫付与と比較して）、ＴＨ１免疫応答の増加および／またはＴＨ２免疫応答の増加を誘発する。
【０１５３】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答のうちの１つまたは両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答のうちの１つまたは両方をもたらす。
【０１５４】
増強された免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜性免疫応答のうちの１つまたは両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、増強された全身性免疫応答および増強された粘膜性免疫応答のうちの１つまたは両方をもたらす。好ましくは、粘膜性免疫応答はＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜性免疫応答はＩｇＡ産生の増加を含む。
【０１５５】
水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は特に好ましく、抗原は一般にこれらの塩に吸着される。
【０１５６】
本発明の組成物のｐＨは好ましくは６〜８の間であり、好ましくは約７である。緩衝液の使用によって安定したｐＨが維持されてよい。組成物が水酸化アルミニウム塩を有する場合は、ヒスチジン緩衝剤を使用するのが好ましい［１５４］。組成物は滅菌済みおよび／またはパイロジェンフリーであってよい。本発明の組成物は、ヒトに対して等張である。
【０１５７】
組成物は、バイアルで提供されてよく、または充填済みシリンジで提供されてよい。シリンジは針あり、または針なしで供給されてよい。シリンジが単回用量の組成物を含む一方で、バイアルは単回用量または複数回用量を含んでよい。注射用組成物は、通常は溶液または懸濁液である。あるいは、注射用組成物は、注射の前に、液体溶媒中の溶液または懸濁液用に、固形（例えば、フリーズドライ）の状態で提供されてよい。
【０１５８】
本発明の組成物は、単位用量形態または複数回用量形態に包装されてよい。複数回用量形態では、プレフィルドシリンジよりもバイアルが好ましい。効果的な投薬量は日常的に設定されうるが、注射用の組成物の典型的なヒト用の用量は０．５ｍｌ量である。
【０１５９】
本発明の組成物が使用前に用時調製され（例えば、成分が凍結乾燥形態で提供される場合）、キットとして提供される場合、このキットは２つのバイアルを有していてよく、またはこのキットは１つの充填済みシリンジおよび１つのバイアルを有していてよく、このシリンジの内容物は、注射の前にバイアルの内容物を再活性化するために用いられる。
【０１６０】
故に、本発明は、第１の成分および第２の成分を有するキットを提供し、第１の成分は１つ以上の本発明のポリペプチド、抗体、ベシクル、および／または核酸を有し、第２の成分は、組成物を患者に投与するための使用説明書、シリンジまたはその他の送達用器具、アジュバント、および／または薬学的に許容される調製用溶液のうちの１つ以上を有する。
【０１６１】
本発明は、本発明の免疫原性組成物が予め充填された送達用器具（例えば、シリンジ）も提供する。
【０１６２】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的に効果的な量の１つ以上の抗原、および必要であれば任意のその他の成分を有する。‘免疫学的に効果的な量’とは、その量を、単回投与または一連の投与の一部としてのいずれかで個体に投与すると、治療または予防に効果的であることを意味する。この量は、治療を受ける個体の健康状態および身体状態、年齢、治療を受ける個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類等）、合成抗体に対する個体の免疫系のキャパシティ、所望の防御レベル、ワクチンの調製、治療担当医師による医学的状態の評価、ならびにその他の関連因子に応じて変化する。この量は、日常的な試験によって決定されうる比較的幅広い範囲に含まれることが予想され、１ドーズ当たりの各抗原の典型的な量は、抗原当たり０．１μｇから１ｍｇの間である。
【０１６３】
核酸による免疫付与
上述の免疫原性組成物は、ＵＰＥＣ由来のポリペプチド抗原を含む。本発明の免疫原性組成物におけるタンパク質抗原の使用に代わるものとして、核酸による免疫付与に基づく組成物、方法、および使用をもたらすために、抗原をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えばプラスミドの形態で）が用いられてよい。核酸による免疫付与は今や発展した分野であり（例えば、参考文献１５５〜１６２等を参照）、多くのワクチンに応用されている。
【０１６４】
免疫原をコードする核酸は、患者へ送達された後ｉｎ ｖｉｖｏで発現され、発現された免疫原は免疫系を刺激する。活性成分は典型的に、（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）プロモーターに操作可能に連結された、免疫原をコードする配列、および場合により（ｉｉｉ）選択可能なマーカーを有する核酸ベクターの形態をとる。好ましいベクターは、（ｉｖ）複製開始点、および（ｖ）（ｉｉ）の下流で（ｉｉ）に操作可能に連結された転写ターミネータをさらに有する。一般に、（ｉ）および（ｖ）は真核生物のものであり、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は原核生物のものである。
【０１６５】
好ましいプロモーターは、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のウイルス性プロモーターである。ベクターは、プロモーターに加えて、プロモーターと機能的に相互作用する転写調節配列（例えば、エンハンサー）も含んでよい。好ましいベクターは、前初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含み、より好ましいベクターはＣＭＶイントロンＡも含む。プロモーターは、免疫原をコードする配列の発現がこのプロモーターによって制御されるように、免疫原をコードする下流配列と操作可能に連結される。
【０１６６】
マーカーが用いられる場合、マーカーは好ましくは微生物宿主中（例えば、原核生物中、細菌中、酵母中）で機能する。マーカーは好ましくは、原核生物の選択可能なマーカーである（例えば、原核生物プロモーターの制御下で転写されたもの）。便宜上、典型的なマーカーは抗生物質抵抗性遺伝子である。
【０１６７】
本発明のベクターは、好ましくは自己複製エピソーム性または染色体外ベクター、例えばプラスミドである。
【０１６８】
本発明のベクターは、好ましくは複製開始点を有する。この複製開始点が、原核生物において活性であるが、真核生物では活性でないことが好ましい。
【０１６９】
故に、好ましいベクターは、ベクター選択のための原核生物マーカー、原核生物複製開始点を有するが、免疫原をコードする配列の転写を誘導するための真核生物プロモーターは含まない。したがって、ベクターは（ａ）ポリペプチド発現なしに原核生物宿主中で増幅され選択されるが（ｂ）増幅されずに真核生物宿主中で発現される。核酸免疫付与ベクターにとってこのアレンジは理想的である。
【０１７０】
本発明のベクターは、コード化配列の下流の真核生物の転写ターミネータ配列を有していてよい。これによって転写レベルが増強されうる。コード化配列が自らのものを持たない場合は、本発明のベクターは、好ましくはポリアデニル化配列を有する。好ましいポリアデニル化配列はウシ成長ホルモン由来である。
【０１７１】
本発明のベクターは複数のクローニングサイトを有していてよい。
【０１７２】
免疫原およびマーカーをコードする配列に加えて、ベクターは第２の真核生物のコード化配列を有していてよい。免疫原と同じ転写物からの第２の真核生物のポリペプチドの翻訳を可能にするために、ベクターは、前述の第２の配列の上流にＩＲＥＳも有していてよい。あるいは、免疫原をコードする配列は、ＩＲＥＳの下流にあってもよい。
【０１７３】
本発明のベクターは、非メチル化ＣｐＧモチーフ、例えば２つの５’側のプリンおよび２つの３’側のピリミジンが隣接する、グアノシンに先行するシトシンを共通して有する非メチル化ＤＮＡ配列を有していてよい。それらの非メチル化形態では、これらのＤＮＡモチーフは複数種の免疫細胞の強力な刺激物質であることが示されている。
【０１７４】
ベクターは、標的化方式で送達されてよい。レセプター介在ＤＮＡ治療法は、例えば参考文献１６３〜１６８で説明されている。遺伝子治療プロトコールにおける局所投与では、核酸を含有する治療用組成物は、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの範囲の濃度も遺伝子治療プロトコールにおいて使用されうる。作用の方法（例えば、コード化された遺伝子産物レベルを増強するまたは抑制するための）および形質転換および発現の有鉤性等の因子は、最終的な有効性に必要となる用量に影響を与えることになる検討事項である。幅広い組織の範囲にわたってより高い発現が望ましい場合、より多量のベクターもしくは一連の投与プロトコールにおいて再投与される同じ量、または異なる隣接または近接する組織部分への複数回の投与が、好ましい治療結果を達成するために必要となる場合がある。全ての場合において、臨床試験における日常的な実験によって、最適な治療効果のための特定の範囲が決定されるであろう。
【０１７５】
遺伝子送達担体を使用してベクターが送達されうる。遺伝子送達担体は、ウイルスが起源またはウイルス以外が起源のものでありうる（概して、参考文献１６９〜１７２を参照）。
【０１７６】
所望の核酸の送達および所望の細胞中での発現のためのウイルス系ベクターは当分野で周知である。典型的なウイルス系担体には、遺伝子組み換えレトロウイルス（例えば、参考文献１７３〜１８３）、アルファウイルス系ベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ‐６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ‐３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ‐１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ‐９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ‐１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ‐１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ‐５３２）、これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラも用いられてよく（例えば、米国特許出願公開第２００３０１４８２６２号、国際公開第ＷＯ０２／０９９０３５号）、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクチニア、鶏痘、カナリア痘、修飾ワクチニアＡ等）、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献１８４〜１８９参照）が含まれるがこれらに限定されない。死滅アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与［１９０］も使用されうる。
【０１７７】
非ウイルス性送達担体および方法も使用可能であり、死滅アデノウイルス単体に連結されたまたは連結されていないポリカチオン性の凝縮ＤＮＡ［例えば、１９０］、リガンド連結ＤＮＡ［１９１］、真核生物細胞の送達担体細胞［例えば、参考文献１９２〜１９６］、および核電荷の中和または細胞膜との融合が含まれるがこれらに限定されない。裸ＤＮＡも使用されうる。典型的な裸ＤＮＡ導入方法は、参考文献１９７および１９８で説明されている。遺伝子送達担体として機能しうるリポソーム（例えば、イムノリポソーム）は参考文献１９９〜２０３で説明されている。さらなるアプローチは参考文献２０４および２０５で説明されている。
【０１７８】
使用に適したさらなる非ウイルス性送達には、機械的送達系、例えば参考文献２０５で説明されるアプローチが含まれる。さらに、コード化配列およびその発現産物は、光重合ヒドロゲル材料の沈着または電離放射線の使用によって送達されうる［例えば、参考文献２０６および２０７］。コード化配列の送達に使用されうる、遺伝子送達のためのその他の従来の方法には、例えば手持ち式の遺伝子導入パーティクルガン［２０８］または導入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用［２０６および２０７］が含まれる。
【０１７９】
ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド‐ｃｏ‐グリコリド）｝ミクロ粒子を使用したＤＮＡも送達は、例えば、負に帯電した表面（例えば、ＳＤＳでの処理）または正に帯電した表面（例えば、カチオン性界面活性剤、例えばＣＴＡＢで処理）を持つよう場合により処理されるミクロ粒子への吸着によって特に好ましい方法である。
【０１８０】
製薬学的用途
本発明は、治療上効果的な量の本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者を治療する方法も提供する。患者は、患者自身が疾患による危険にさらされているか、または妊婦（‘母体免疫’［２０９］）のいずれかであってよい。
【０１８１】
本発明は、薬剤として（例えば、免疫原性組成物として、またはワクチンとして、または患者の治療法において）または診断用試薬として使用するための、本発明の核酸、ポリペプチド、ベシクル、または抗体を提供する。本発明は、（ｉ）ＥｘＰＥＣ細菌が引き起こす疾患および／または感染を治療または予防するための薬剤、（ｉｉ）ＥｘＰＥＣ細菌に対して産生された抗体の存在を検出するための診断用試薬、および／または（ｉｉｉ）ＥｘＰＥＣ細菌に対する抗体を産生させうる試薬の製造における、本発明の核酸、ポリペプチド、ベシクル、または抗体の使用も提供する。前述のＥｘＰＥＣ細菌は、任意の血清型または株でありうる。好ましくは、ＥｘＰＥＣ細菌はＵＰＥＣ株である。
【０１８２】
本発明は、菌血症、髄膜炎、尿路感染症、腎盂腎炎、および／または膀胱炎のような疾患の予防および／または治療に有用である。本発明は、尿路感染症の治療に特に有用である。
【０１８３】
患者は好ましくはヒトである。ヒトは、好ましくは成人である（例えば、年齢が２０歳〜５５歳）。小児または青少年用のワクチンも、例えば安全性、用量、免疫原性等を評価するために成人に投与されてよい。女性患者は好ましいサブセットであり、年齢２０歳〜５５歳の性的活動期の女性は特に好ましい患者グループである。別の患者グループは１２歳〜２０歳の女性であり、特に予防的に使用される。
【０１８４】
その他の可能な患畜には、ＥｘＰＥＣの保有動物であってよいイヌが含まれる［２１０、２１１］。
【０１８５】
治療の有効性をチェックする１つの方法は、本発明の組成物の投与後に感染をモニタリングするステップを伴う。予防的治療の有効性をチェックする１つの方法は、投与後に投与されたポリペプチドに対する免疫応答をモニタリングするステップを伴う。本発明の組成物の免疫原性は、被験者（例えば、１２〜１６ヶ月の幼児、または動物モデル、例えばマウスモデル）にそれらを投与した後で、ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的なパラメーターを決定することによって判定されうる。これらの免疫応答は一般に、組成物の投与のおよそ４週間後に判定され、組成物の投与前に判定された値と比較される。２ドーズ以上の組成物が投与される場合、投与後判定は２回以上行われてよい。ＵＴＩの各種マウスモデルが利用可能である［例えば、参考文献２１２および２１３〜２１４］。
【０１８６】
ポリペプチド抗原の投与は、免疫を誘導するのに好ましい治療方法である。本発明の抗体の投与は、別の好ましい治療方法である。この受動免疫の方法は、新生児または妊婦にとって特に有用である。この方法は典型的に、ヒト化されるまたは完全なヒトモノクローナル抗体を使用する。
【０１８７】
本発明の組成物は一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔へ）、または経直腸的、経口的（例えば、錠剤、スプレー）、経膣的、局所的、経皮的、鼻腔内、舌下、眼球、耳内、肺内、またはその他の粘膜投与によって行われてよい。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、注射針（例えば、皮下注射針）を使用して行われてよいが、無針注射が代わりに用いられてもよい。典型的な筋肉内投与量は０．５ｍｌである。
【０１８８】
本発明は、全身性および／または粘膜性免疫を誘発するために用いられてよい。好ましくは、増強された全身性および／または粘膜性免疫は、増強されたＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答に反映される。好ましくは、増強された免疫応答は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増加を含む。
【０１８９】
投薬治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールでありうる。複数回投与は、初回免疫スケジュールにおいておよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いられてよい。初回投与スケジュール後に、追加投与スケジュールが続いてよい。複数回投与スケジュールでは、同一または異なる経路、例えば非経口初回刺激および粘膜追加免疫、粘膜初回刺激および非経口追加免疫等によって各種用量が与えられてよい。初回刺激投与の間（例えば、４〜１６週間の間）、および初回刺激と追加免疫の間の適当な時期は日常的に決定されうる。例えば、ワクチン接種の初回コースは、１〜１０回の個別投与を含んでよく、この後に、免疫応答を維持するおよび／または強化するのに必要とされる次の時間間隔、例えば２回目の投与では１〜４ヶ月の時点において、また必要であれば数ヵ月後の追加単回投与または複数回投与において他の投与が行われる。単回投与スケジュールは、１回の投与または複数回の投与を有していてよい（まとめて単回投与スケジュール）。複数回投与スケジュールは複数回投与を含み、各投与は１回の投与または複数回の投与を含んでよい。
【０１９０】
細菌感染は身体の各種部位を冒すため、組成物は各種形態に調製されてよい。例えば、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射液として調製されてよい。注射前に、液体担体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製されうる（例えば、凍結乾燥またはスプレー‐フリーズドライ組成物）。組成物は、局所投与用、例えば軟膏剤、クリーム、または散剤として調製されてよい。組成物は、経口投与用、例えば錠剤もしくはカプセル剤、スプレー、またはシロップ剤（場合により香料が添加されたもの）として。組成物は、細顆粒またはスプレーを使用して、肺内投与用、例えば吸入剤として調製されてよい。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製されてよい。組成物は、経鼻的、耳内、または眼球投与用、例えばスプレー、点滴剤、ゲル、または散剤として調製されてよい［例えば、参考文献２１５および２１６］。組成物は、患者への投与の直前に複合組成物が再構成されるようにデザインされたキットの形態であってよい。そのようなキットは、液体の形態の１つ以上の抗原および１つ以上の凍結乾燥抗原を有していてよい。
【０１９１】
本発明の組成物は、その他のワクチンと実質的に同じ時期（例えば、同一の診察時または医療専門家への訪問時）に、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、インフルエンザ菌ｂ型コンジュゲートワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチン等と実質的に同じ時期に患者に投与されてよい。同様に、本発明の組成物は、抗生物質、特にＵＰＥＣに対して活性を持つ抗生物質化合物と実質的に同じ時期（例えば、同一の診察時または医療専門家への訪問時）に患者に投与されてよい。
【０１９２】
本発明の組成物のさらなる抗原成分
本発明は、本発明のポリペプチドおよび１つ以上の下記のさらなる抗原を有する組成物も提供する：
‐髄膜炎菌血清型Ａ株、Ｃ株、Ｗ１３５株、および／またはＹ株（好ましくは４つ全て）由来のサッカライド抗原、例えば血清型Ｃ株由来の参考文献２１７に開示のオリゴ糖［参考文献２１８も参照］または参考文献２１９のオリゴ糖。
‐髄膜炎菌血清型Ｂ株由来の抗原、例えば参考文献２２０〜２２８に開示のもの等。
‐肺炎球菌由来のサッカライド抗原［例えば、２２９、２３０、２３１］。
‐Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば不活化ウイルス［例えば、２３２、２３３］。
‐Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば表面および／またはコア抗原［例えば、２３３、２３４］。
‐Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、２３５］。
‐ＨＩＶ由来の抗原［２３６］。
‐ジフテリア抗原、例えばジフテリアトキソイド［例えば、参考文献２３７の第３章］、例えばＣＲＭ１９７変異体［例えば、２３８］。
‐破傷風抗原、例えば破傷風トキソイド［例えば、参考文献２３７の第４章］。
‐百日咳菌由来の抗原、例えば百日咳菌由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、場合によりパータクチンおよび／または細胞凝集原２および３との組み合わせのもの［例えば、参考文献２３９および２４０］。
‐インフルエンザ菌Ｂ型由来のサッカライド抗原［例えば、２１８］。
‐１つ以上のポリオ抗原［例えば、２４１、２４２］、例えばＩＰＶ。
‐麻疹、流行性耳下腺炎、および／または風疹抗原［例えば、参考文献２３７の第９、１０、および１１章］。
‐水痘抗原。
‐１つ以上のインフルエンザ抗原［例えば、参考文献２３７の第１９章］、例えばヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。インフルエンザ抗原は、大流行間期の（年に１度の）インフルエンザ株由来であってよい。インフルエンザ抗原は、パンデミック流行を引き起こす可能性のある株（すなわち、現在出回っている株に存在するヘマグルチニンと比較して新たなヘマグルチニンを有するインフルエンザ株、または鳥検体において病原性を有し、ヒトの集団において水平伝播される可能性があるインフルエンザ株、またはヒトに対して病原性を持つインフルエンザ株）由来であってよい。インフルエンザ抗原は、鶏卵または細胞培養物中で増殖させたウイルス由来であってよい。
‐モラクセラ・カタラーリス由来の抗原［例えば、２４３］
‐ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｂ群ストレプトコッカス）由来のサッカライド抗原。
‐ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｂ群ストレプトコッカス）由来のタンパク質抗原［例えば、２４４〜２４９］。
‐淋菌由来の抗原［例えば、２２０〜２２２および２５０］。
‐クラミジア肺炎菌由来の抗原［例えば、参考文献２５１〜２５７］またはクラミジア肺炎菌由来の抗原の組み合わせ［例えば、２５８］。
‐クラミジア・トラコマチス由来の抗原、またはクラミジア・トラコマチス由来の抗原の組み合わせ［例えば、２５９］。
‐ポルフィロモナス・ジンジバリス由来の抗原［例えば、２６０］。
‐１つ以上の狂犬病抗原［例えば、２６１］、例えば凍結乾燥不活化ウイルス［例えば、２６２、ＲａｂＡｖｅｒｔ（登録商標）］。
‐パラミクソウイルス由来の１つ以上の抗原、例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ［２６３、２６４］）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［２６５］）。
‐炭疽菌由来の抗原［例えば、２６６、２６７、２６８］。
‐化膿性連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）由来の抗原［例えば、２４５、２６９、２７０］。
‐黄色ブドウ球菌由来の抗原［例えば、２７１］。
‐フラビウイルス科（フラビウイルス属）に存在するウイルス由来の抗原、例えば黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４つの血清型、ダニ媒介脳炎ウイルス、ウエスト・ナイル・ウイルス。
‐ペスチウイルス抗原、例えばブタコレラウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、および／またはボーダー病ウイルス由来のもの。
‐パルボウイルス抗原、例えば、パルボウイルスＢ１９由来のもの。
‐ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原［２７２］。
【０１９３】
組成物は、これらのさらなる抗原のうち１つ以上を含んでいてよい。
【０１９４】
別の実施形態において、本発明の抗原は、泌尿生殖器疾患および／または性行為感染症から女性を防御するようにデザインされたワクチンにおいて使用するのに適した、１つ以上の追加の非大腸菌抗原と組み合わされる。例えば、抗原は、ストレプトコッカス・アガラクティアエ、クラミジア・トラコマチス、淋菌、パピローマウイルス、およびヘルペス単純ウイルスからなる群由来の抗原と組み合わされてよい。ヒトパピローマウイルス抗原が用いられる場合、それらはＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６、および／またはＨＰＶ１１株のうちの１つ以上の由来であってよい。
【０１９５】
好ましい淋菌抗原は、ｎｇｓ１３（ＯｍｐＡ）、ＯｍｐＨ、ｎｇｓ５７６（ペプチジル‐プロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）タンパク質）、ｎｇｓ４１、およびｎｇｓ１１７のうちの１つ以上を含む。
【０１９６】
好ましいＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６、およびＨＰＶ１１株由来の１つ以上を含む。
【０１９７】
好ましいクラミジア・トラコマチス抗原は、参考文献２７３に開示されるような、ＣＴ０４５、ＣＴ０８９、ＣＴ２４２、ＣＴ３１６、ＣＴ３８１、ＣＴ３９６、ＣＴ３９８、ＣＴ４４４、ＣＴ４６７、ＣＴ５４７、ＣＴ５８７、ＣＴ８２３、ＣＴ７６１、およびこれらの抗原の特定の組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【０１９８】
好ましい肺炎クラミジア抗原は、参考文献２７４に開示されるような、ＣＰｎ０３２４、Ｃｐｎ０３０１、Ｃｐｎ０４８２、Ｃｐｎ０５０３、Ｃｐｎ０５２５、Ｃｐｎ０５５８、Ｃｐｎ０５８４、Ｃｐｎ０８００、Ｃｐｎ０９７９、Ｃｐｎ０４９８、Ｃｐｎ０３００、Ｃｐｎ００４２、Ｃｐｎ００１３、Ｃｐｎ４５０、Ｃｐｎ０６６１、Ｃｐｎ０５５７、Ｃｐｎ０９０４、Ｃｌｐｎ０７９５、Ｃｐｎ０１８６、およびＣｐｎ０６０４、ならびにこれらの抗原の特定の組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【０１９９】
好ましいＧＢＳ抗原は、ＧＢＳ８０、ＧＢＳ１０４、ＧＢＳ５９、ＧＢＳ６７、ＧＢＳ３２２、およびＧＢＳ２７６のうちの１つ以上を含む。
【０２００】
別の実施形態において、本発明の抗原の組み合わせは、高齢者または免疫不全の個体を防御するようにデザインされたワクチンにおいて使用するのに適した１つ以上の追加のｎｏｎ−ＥｘＰＥＣ ａｎｔｉｇｅｎと組み合わされる。例えば、抗原の組み合わせは、フェカリス菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑濃菌、在郷軍人病菌、リステリア菌、髄膜炎菌、インフルエンザ、およびパラインフルエンザウイルス（‘ＰＩＶ’）からなる群由来の抗原と組み合わされてよい。
【０２０１】
必要であれば、毒性タンパク質抗原は無毒化されてよい（例えば、化学的および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の無毒化［２４０］）。
【０２０２】
ジフテリア抗原が組成物に添加される場合、破傷風抗原および百日咳抗原も加えるのが好ましい。同様に、破傷風抗原が添加される場合、ジフテリアおよび百日咳抗原も加えるのが好ましい。同様に、百日咳抗原が添加される場合、ジフテリアおよび破傷風抗原も加えるのが好ましい。故に、ＤＴＰ混合が好ましい。
【０２０３】
サッカライド抗原は、好ましくはコンジュゲートの形である。コンジュゲート用の担体タンパク質には、細菌毒素（例えばジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）、髄膜炎菌外膜タンパク質［２７５］、合成ペプチド［２７６、２７７］、熱ショックタンパク質［２７８、２７９］、百日咳タンパク質［２８０、２８１］、インフルエンザ菌由来のプロテインＤ［２８２、２８３］、サイトカイン［２８４］、リンフォカイン［２８４］、インフルエンザ菌タンパク質、ホルモン［２８４］、増殖因子［２８４］、クロストリジウム・ディフィシル由来の毒素ＡまたはＢ［２８５］、鉄取り込みタンパク質［２８６］、各種の病原菌由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを有する人工タンパク質［２８７］、例えばＮ１９タンパク質［２８８］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［２８９］、肺炎球菌溶血素［２９０］等が含まれる。好ましい担体タンパク質はＣＲＭ１９７タンパク質である［２９１］。
【０２０４】
組成物中の抗原は典型的に、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分なものである。
【０２０５】
抗原は、好ましくはアルミニウム塩に吸着される。
【０２０６】
一般的事項
語句“有する”は、“含む”だけでなく“からなる”を包含し、例えばＸを“有する”組成物は、Ｘのみからなっていてもよいし、または他のもの、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【０２０７】
数値ｘに関する語句“約”は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０２０８】
単語“実質的に”は、“完全に”を除外しない、例えばＹを“実質的に含まない”組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要であれば、単語“実質的に”は本発明の定義から削除されてもよい。
【０２０９】
配列表中のアミノ酸配列中のＮ末端残基は、対応するヌクレオチド配列中の第１のコドンによってコード化されるアミノ酸として与えられる。第１のコドンがＡＴＧではない場合、コドンが開始コドンであるときそれはメチオニンに翻訳されるが、配列が融合パートナーのＣ末端にあるとき、示されたメチオニン以外のアミノ酸として翻訳されることが理解されるであろう。本発明は、任意の示されたメチオニン以外の残基の代わりにＮ末端にメチオニン残基（例えば、ホルミル‐メチオニン残基）を有する、配列表の各アミノ酸配列を具体的に開示し、包含する。本発明は、配列中の任意の内部メチオニン残基の位置で始まる配列表の各アミノ酸配列も具体的に開示し、包含する。
【０２１０】
本明細書において開示される配列は、元々は５３６株において同定された。大腸菌のその他複数の株のゲノム配列が入手可能である。任意のこれらの（またはその他の）さらなるゲノム配列において、本発明の任意特定の配列のホモログを同定するために、標準的な検索およびアラインメント法が使用されうる。さらに、その他の株由来の相同配列の増幅用のプライマーをデザインするために配列が使用されうる。故に、本発明は株５３６配列に限定されず、大腸菌のその他の株、特にＥｘＰＥＣおよびＵＰＥＣ株由来のそのようなバリアントおよびホモログを包含する。一般に、特定の配列番号の適当なバリアントは、その対立遺伝子多型、その多型、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その変異体等を含む。
【０２１１】
故に、上記で開示されるように、例えば本発明とともに使用されるポリペプチドは、５３６の配列と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９等）のアミノ酸置換、挿入、欠失等を含む。
【０２１２】
上記に示されているように、本発明の核酸およびポリペプチドは：
（ａ）配列表で開示される配列と同一（すなわち１００％同一）であり、
（ｂ）配列表で開示される配列と配列同一性を共有し、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、別々の位置にあってよい、または連続していてよい１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の単一ヌクレオチドまたはアミノ酸変化（欠失、挿入、置換）を有する配列を含んでよく、
（ｄ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列表の特定の配列とアラインされたとき、ｘ個のモノマー（アミノ酸またはヌクレオチド）の移動ウインドウは開始点（Ｎ末端または５’）から終了点（３’のＣ末端）へ移動し、ｐ個のモノマーへ伸長するアラインメント（ｐ＞ｘのとき）の場合に、ｐ−ｘ＋１ウインドウなどが存在するようになり、それぞれのウインドウは少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたモノマーを有し、ここでｘは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、もしｘ・ｙが整数ではない場合、最も近い整数の値に切り上げられる。
【０２１３】
好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトのパラメーター（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝１０．０およびギャップ・エクステンション・ペナルティ＝０．５）を使用する、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ‐Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［２９２］である。このアルゴリズムは、好都合なことにＥＭＢＯＳＳパッケージ［２９３］のｎｅｅｄｌｅツールに実装されている。
【０２１４】
本発明の核酸およびポリペプチドはさらに、これらの配列（ａ）〜（ｄ）のＮ末端／５’および／またはＣ末端／３’の方向に向かうさらなる配列を有していてよい。
【０２１５】
本発明の実施では、別段の記載がない限り、当該技術分野の範囲内である化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法を用いる。そのような技法は文献において詳細に説明されている。例えば、参考文献２９４〜３０１等を参照されたい。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、参考文献２７、参考文献２８、米国特許仮出願第６０／６５４６３２号（２００５年２月１８日出願、参考文献２７および２８の優先出願）または米国特許仮出願第６０／７１２７２０（２００５年８月２９日出願、参考文献２８の優先出願）に開示されているポリペプチドを包含しない。
【実施例】
【０２１７】
発明を実施する様式
下記は、本発明を実施するための特定の実施形態または形態の例である。例は、説明を目的としたものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２１８】
使用される数値（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証するための努力が払われたが、多少の実験誤差および偏差は当然のことながら許容されるべきである。
【０２１９】
ＵＰＥＣ５３６株から９３のポリペプチドを同定するために、（ａ）２つの共生菌株（ｍｇ１６５５、ＤＨ１０Ｂ）との９０％未満の配列同一性、（ｂ）１００アミノ酸長より長いこと、（ｃ）細胞質以外の細胞局在を有すること、（ｄ）別のＵＰＥＣ株（ＣＦＴ０７３）に共通するが、ＭＮＥＣ株（ＩＨＥ３０３４）に認められないものなどの基準を使用して、コンピューターを使用した比較および予測ツールが使用された。これらの配列は、配列表に記載されている。それらのアミノ酸配列は配列番号：８〜１００である。
【０２２０】
並行研究において、ＵＰＥＣ株に特異的で、非病原菌株（共生菌株および実験室株）に存在しない表面露出タンパク質を選択するためにアッセイを行った（下記参照）。７６のポリペプチドを同定し、そのうちの１１は共生菌株（ｍｇ１６５５）と８０％未満のホモロジーを有していた。これらの１１のポリペプチドの配列は配列表に記載しており、それらのアミノ酸配列は配列番号１〜１０および配列番号８５である。これらポリペプチドのうちの７つの配列を、コンピューターを使用した方法ではなく、この方法によって同定した。これらの配列は配列表に記載されており、それらのアミノ酸配列は配列番号１〜７である。表１は、このようにして同定された７６のポリペプチドを示す（配列番号１〜１０、８５、および１０１〜１６５）。
【０２２１】
さらなる研究において、配列番号１６６および１６７を同定した。
【０２２２】
配列番号１〜１６７は配列表に記載されている。表４に示すように、それらは‘ＲＥＣＰ’命名法でも呼ばれる。
【０２２３】
本発明は、これらのポリペプチドの確かな実用性、すなわち本明細書で説明されるような免疫原性組成物の供給を提供する。
【０２２４】
これらのポリペプチドはクローン化され、発現され、および精製されてよい。次に、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳで血清が解析されうるマウスの免疫に精製抗原が用いられ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験の両方においてさらに検査されてよい。適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ実験には、補体仲介性細菌殺傷および／またはオプソニン化貪食作用活性を抗体が誘導する能力、ＥｘＰＥＣ株（または精製抗原）のヒト上皮細胞（例えば、膀胱細胞において）またはその他の細胞株への結合を阻害する能力、および／または大腸菌（例えば、Ｋ１株）の脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）への接着／浸潤を抑制する能力の検査が含まれる。適当なｉｎ ｖｉｖｏ実験には、ＵＴＩのマウスモデル（成体マウス）における能動および／または受動全身免疫付与およびチャレンジ、大腸菌Ｋ１株でチャレンジが行われた５日齢のラットにおける菌血症および髄膜炎に対する能動または受動免疫付与による防御、およびＥｘＰＥＣ株での成体マウスの免疫付与および腹腔内感染が含まれる。
【０２２５】
細菌のライフサイクルに対するタンパク質の重要性は、アイソジェニックなノックアウト変異体を作成することによって検査されてよい。変異体は、ある抗原によって産生された血清がその抗原に特異的であることを保証するためにも使用されうる。発現パターンを研究するためにマイクロアレイが用いられてよい。保存性および／または多様性は、複数の異なるＥｘＰＥＣ株由来の遺伝子のシークエンシングを行うことによって評価される。本発明は、本発明のポリペプチドの１つ以上がノックアウトされている大腸菌も提供する。ノックアウト変異は、遺伝子のコード化領域内に位置していてもよいし、またはその転写制御領域内（例えば、そのプロモーター内）にあってもよい。ノックアウト変異は、抗原をコード化するｍＲＮＡのレベルを、野生型細菌によって産生されるレベルの＜１％まで、好ましくは＜０．５％まで、より好ましくは＜０．１％まで、最も好ましくは０％まで低下させる。
【０２２６】
ＵＰＥＣ株に特異的で、非病原菌株（共生菌株および実験室株）に存在しない、予測された表面露出タンパク質を選択するためにプロテオミクスアッセイを実施した。選択が終わると、これらのタンパク質が発現され、精製され、マウスを免疫するのに使用されてよい。
【０２２７】
大腸菌のｔｏｌ‐ｐａｌ遺伝子の任意の部分中の変異が、天然の外膜タンパク質を含有するベシクルの形成をもたらすことが参考文献４３から知られている。ＵＰＥＣ株のベシクル中に存在し、共生菌株、例えばｍｇ１６５５との相同性が低いタンパク質を、潜在的な抗原として使用されうる小ポテンシャルグループのタンパク質として選択した。
【０２２８】
共生および病原性大腸菌におけるラムダレッド仲介遺伝子操作
この方法は、野生型大腸菌株由来のｔｏｌＲ遺伝子を不活化するために用いられるラピッドＰＣＲベース法である［３０２］。簡単に言うと、第１の手順は、標的遺伝子（ｔｏｌＲ）の上流および下流領域およびレジスタンスマーカーカセットを独立して増幅する手順である。手順１で得られた２つのＰＣＲ産物をＡＢカセットの増幅プロデューサーと等モル濃度で混合し、標的遺伝子と相同な上流および下流の５００ｂｐ（またはそれ以上）の領域が隣接するレジスタンスマーカーカセットを作成するために、第２ラウンドのＰＣＲ（スリーウェイＰＣＲ）が行われる。第３の手順において、多量（１μｇ）の所望の線状ＤＮＡがラムダレッドコンピテント細胞にエレクトロポレーションで導入される。
【０２２９】
ベシクルの調製
１．ＴＣＡでの沈殿によるベシクルの調製
プレート上で増殖させた細菌をＬＢ培地に接種し、穏やかに振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。ＯＤ６００が０．１で２００ｍｌのＬＢに接種するために培養物を使用した。細菌をＯＤ６００が０．４（または定められたとおりに）になるまで増殖させた。培養物を４０００×ｇで１０分間遠心し、上清を０．２２ｍｍのフィルターで濾過して残存細菌を除去した。
【０２３０】
ジピリジル（０．２５ｍＭ）をＬＢ培地に添加することによって、同じ実験を鉄制限条件下でも実施した。
【０２３１】
培養物の上清に、最終濃度１０％の溶液を、１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ、０．４％（ｗ／ｖ）デオキシコレートで添加することによって沈殿を行った。４℃で３０分間沈殿を進行させた。４℃、２００００×ｇ、１０分間の遠心分離によって沈殿物を回収した。ペレットを１０％ＴＣＡ（ｗ／ｖ）で一度洗浄し、無水エタノールで２回洗浄した。ペレットをＳｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０２３２】
野生型および変異型株について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、この結果から、野生型株よりも変異型株の上清中により多数のバンドが存在することが認められた。ランダムにピックアップしたバンドから、上清中のタンパク質の大部分が膜タンパク質であることが示され、これは膜内容物の濃縮を示している。
【０２３３】
２．超遠心分離法によるベシクルの調製
培養上清を、４℃、２０００００×ｇで２時間超遠心した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０２３４】
３．ベシクルのグアニジニウム変性
グアニジニウム変性に先立ち、ベシクルをエタノールで沈殿させた。ＰＢＳ中の１０μｇのＯＭＶを、最終濃度９０％となるように冷無水エタノールを添加することによって沈殿させた。−２０℃で２０分間沈殿を進行させた。１３０００×ｇ、１０分間の遠心分離によって沈殿物を回収した。ペレットを５０ｍｌ、６Ｍグアニジニウム、１５ｍＭ ＤＴＴ、２００ｍＭトリス‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０で再懸濁した。６０℃で６０分間変性を進行させた。消化に先立ち、１．５ＭのトリスｐＨ８．０溶液で、溶液を８倍希釈し、希釈した溶液に５ｍｇのトリプシンを添加した。３７℃で一晩消化を進行させた。最終濃度０．１％のギ酸を添加することで反応を停止した。Ｏａｓｉｓ抽出カートリッジを使用してペプチドを抽出した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでペプチドを解析した。
【０２３５】
４．表面消化
５ｍｇのトリプシンをＰＢＳ中の１０ｍｇのベシクルに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。最終濃度０．１％のギ酸を添加することで反応を停止した。Ｏａｓｉｓ抽出カートリッジでペプチドを回収し、脱塩を行った。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳでペプチドを解析した。
【０２３６】
ベシクル解析
タンパク質の定量化
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で、ＢＳＡを標準物質として使用してタンパク質を定量化した。
【０２３７】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ
Ｍｉｎｉ‐Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ電気泳動装置を使用して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）４〜１２％ポリアクリルアミドゲルでサンプルを解析した。ＳＤＳサンプルバッファー（０．０６Ｍトリス‐ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ）２‐メルカプトエタノール、１０ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）にサンプルを懸濁し、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動の前に１００℃で５分間熱を加えた。泳動後、クマシーブルーでゲルを染色した。
【０２３８】
ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法
ゲルからタンパク質バンドまたはスポットを切り出し、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム／アセトニトリル（５０／５０、ｖ／ｖ）で２回洗浄し、純アセトニトリルで１回洗浄し、風乾した。５ｍＭ重炭酸アンモニウム、０．０１２ｍｇのシークエンシンググレードのトリプシンを含有する７〜１０ｍｌの溶液を添加することによって、乾燥させたスポットを３７℃で２時間消化した。消化後、０．６ｍｌを、ターゲットを予めスポットしたマトリックス上にロードし、風乾した。７０％エタノール、０．１％トリフルオロ酢酸からなる０．６ｍｌの溶液でスポットを洗浄した。ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析装置上で質量スペクトルを得た。ターゲット上に予めスポットした標準物質の組み合わせを使用して、スペクトルの外部較正を行った。Ｍａｓｃｏｔプログラムを使用して、質量範囲が７００〜３０００Ｄａのペプチドの実験的に作成したモノアイソトピックピークと、コンピューターで作成したフィンガープリントを自動および手動の両方で比較することによってタンパク質の同定を行った。
【０２３９】
二次元電気泳動
２００ｍｇのベシクルをＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ膨潤液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（２％ｗ／ｖ）ＡＳＢ１４、２％（ｖ／ｖ）ＩＰＧバッファーｐＨ３〜１０ＮＬ、２ｍＭ ＴＢＰ、６５ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁し、７ｃｍのＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ｐＨ３〜１０ＮＬ）上に一晩吸着させた。その後、タンパク質を二次元電気泳動で分離した。ＩＰＧｐｈｏｒ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｕｎｉｔを使用して、順番に１５０Ｖ３５分、５００Ｖ３５分、１０００Ｖ３０分、２６００Ｖ１０分、３５００Ｖ１５分、４２００Ｖ１５分、最後に１０ｋＶｈに達するまで５０００Ｖをかけて一次元目の泳動を行った。二次元目では、４Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５ｍＭ ＴＢＰ、５０ＭｍトリスＨＣｌ ｐＨ８．８、２．５％アクリルアミド、ブロモフェノールブルー０．２％中で１０分間のインキュベーションを２回行うことでストリップの平衡化を行った。その後、４〜１２％のプレキャストポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分離した。
【０２４０】
コロイド状クマシーブルーでゲルを染色し、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＳＩでスキャンした。Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄエリートソフトウェアで画像を解析した。
【０２４１】
ナノ‐ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
ナノスプレー源を備えるＱ‐ＴｏＦ Ｍｉｃｒｏ ＥＳＩ質量分析装置と連結したＣａｐＬＣ ＨＰＬＣシステム上でナノ‐ＬＣによってペプチドを分離した。Ｃ１８トラップカラム（３００μｍ ｉ．ｄ．×５ｍｍ）を介してＡｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８ ＮａｎｏＥａｓｅカラム（１００μｍ ｉ．ｄ．×１００ｍｍ）にサンプルをロードした。９５％ＡＣＮを２％〜６０％を含む０．１％ギ酸溶液で、４００ｎｌ／分の流量でペプチドを５０分間グラジエント溶出した。ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（バージョン４．０）を使用して、溶出したペプチドについて自動データ依存収集プログラムを行い、さらなるＭＳ／ＭＳフラグメンテーションを目的として、４００〜２，０００のｍ／ｚレンジにわたって、多価ペプチドを自動で選択するためにＭＳサーベイスキャンを使用した。最大で３つの異なる成分について、同時にＭＳ／ＭＳフラグメンテーションを行った。データ収集後、個々のＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘで統合し、平滑化し、重心化を行った。ライセンスバージョンのＭＡＳＣＯＴを使用して、バッチモードでペプチドの検索および同定を行った。ＭＡＳＣＯＴサーチのパラメーターは、（１）種：ＥｘＰＥＣ（２）欠損した切断の許容数（トリプシン消化のみ）：６、（３）可変翻訳後修飾：メチオニン酸化、（４）ペプチド許容度：±５００ｐｐｍ、（５）ＭＳ／ＭＳ許容度：±０．３Ｄａ、および（６）ペプチド電荷数：＋１〜＋４とした。以前のプラットフォームでは、ＭＡＳＣＯＴ確率分析によってｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｔとして定められたもののみ考慮されていた。少なくとも１つのペプチドからのタンパク質同定の受け入れに関するスコア閾値は、ＭＡＳＣＯＴによって、トリプシン消化の場合は１８、プロテイナーゼＫ消化の場合は３６と設定された。
【０２４２】
結果
上記の解析の結果として、表１に示すように５３６株から７６の抗原が同定された。これらの配列のうち１１は、共生菌株（ｍｇ１６５５）との相同性が非常に低かった（配列番号１〜１０および配列番号８５）。これらのポリペプチドのうちの７つの配列は、コンピューターを用いた方法ではなくこの方法で同定された。これらの配列は配列表に記載されており、それらのアミノ酸配列は配列番号１〜７である。表１は、このようにして同定された７６のポリペプチドを示す。
【０２４３】
抗原の解析
全身感染のマウスモデル
病原性および非病原性大腸菌株間のゲノム比較解析によって選択された多数の抗原をスクリーニングするために、伝統的な病原性解析を基に防御モデルを確立した。使用されうる別の実験モデルには、参考文献２１２〜２１４で概要が説明されているものが含まれる。
【０２４４】
実験モデル（免疫付与および感染）は、病原性ＵＰＥＣ５３６大腸菌株の静脈内接種によるチャレンジを行った５週齢のＣＤ１異系交配マウスを使用する。チャレンジ用量は、４日以内に成体マウスの８０％を死に至らしめる能力を持つ細菌の量として実験的に決定され、５３６株では４×１０７ｃｆｕ／マウスに相当する。
【０２４５】
免疫付与プロトコール
ＵＰＥＣ５３６株由来の多数の抗原をクローン化し、発現させ、精製した。さらに、配列番号５６のＮ末端領域（アミノ酸２１番〜４７０番）に対応する配列番号１６８をクローン化し、発現させ、精製した。精製抗原を、下記の方法で実験マウスモデルにおいてマウスを免疫するのに使用した。以下の表に示すように、フロイントアジュバントを使用した１５０μｌのタンパク質溶液の皮下注射によってマウスを３回免疫化する。
【０２４６】
【化１１】
初回免疫の前日（免疫前の血清）、３４日目、および４８日目（チャレンジ前日）に血液サンプルを採取する。免疫した動物から得られた血清を、抗体力価を決定するためにウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡで検査する。
【０２４７】
チャレンジ
４８日目に、大腸菌ＵＰＥＣ５３６株を凍結ストックからＬＢ寒天培地に画線し、孵卵器内にて３７℃で一晩（ＯＮ）インキュベートする。４９日目に、一晩インキュベートしたプレートの培養物を使用して、Ｏ．Ｄ．６００が０．１になるように５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、細菌培養物が、ＵＰＥＣ５３６株の４×１０８ｃｆｕ／ｍｌに相当するＯ．Ｄ．６００＝１．３に達するまで攪拌しながら３７℃で１．５時間増殖させる。培養物を遠心し、ペレットを同量の生理溶液で再懸濁し、希釈せずにチャレンジに使用する。接種材料を確認するため、標準的なプレートカウント法を使用して培養物をプレーティングする。４×１０７のＵＰＥＣ５３６株を含有する１００μｌの細胞懸濁液を、１ｍｌのシリンジを使用してコントロールおよび免疫付与マウスに静脈内注射する。注射から２４、４８、７２、および９６時後の時点での各動物グループの死亡数を記録する。
【０２４８】
チャレンジから９６時間後の時点での、マウスのワクチン接種グループの生存数とコントロールグループの生存数を比較することでワクチン接種による予防を評価する。コントロールに対する生存率は、式：
【０２４９】
【化１２】
を使用して計算する。
【０２５０】
結果
結果は表３に示され、ＵＰＥＣ５３６でのチャレンジ後のマウスの生存％が、本発明の抗原での免疫付与後に増加することを示している。
【０２５１】
本発明は一例として説明されたにすぎず、本発明の適用範囲および趣旨精神から逸脱することなしに改変が行われてよいことが理解されるであろう。
【０２５２】
【表１−１】
【０２５３】
【表１−２】
【０２５４】
【表１−３】
表２‐７つの好ましい病原性大腸菌５３６株の配列
【０２５５】
【表２−１】
【０２５６】
【表２−２】
【０２５７】
【表３】
【０２５８】
【表４】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０２５９】
【化１３】
【０２６０】
【化１４】
【０２６１】
【化１５】
【０２６２】
【化１６】
【０２６３】
【化１７】
【０２６４】
【化１８】
【０２６５】
【化１９】
【０２６６】
【化２０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、および１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または
（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記フラグメントは、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
医薬に使用するための、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
薬学的に許容される担体と混合された請求項１または請求項２に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される担体と混合された２つ以上の請求項１または請求項２に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項６】
ワクチンアジュバントをさらに含む、請求項４または請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または
（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含む、
１つ以上のポリペプチドを発現する１つ以上の外膜ベシクル（ＯＭＶ）を含む、免疫原性組成物。
【請求項８】
前記フラグメントは、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
患者において免疫応答を誘発するための薬剤の製造における、請求項１もしくは請求項２に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは請求項８に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１０】
患者において免疫応答を誘発するための方法であって、請求項４〜請求項６のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項７または請求項８の免疫原性組成物を該患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記免疫応答は、ＥｘＰＥＣ感染症を防御するものである、請求項９に記載の使用、または請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、および１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または
（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記フラグメントは、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
医薬に使用するための、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
薬学的に許容される担体と混合された請求項１または請求項２に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される担体と混合された２つ以上の請求項１または請求項２に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項６】
ワクチンアジュバントをさらに含む、請求項４または請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸配列、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列、または
（ｄ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、（ａ）のアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含む、
１つ以上のポリペプチドを発現する１つ以上の外膜ベシクル（ＯＭＶ）を含む、免疫原性組成物。
【請求項８】
前記フラグメントは、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
患者において免疫応答を誘発するための薬剤の製造における、請求項１もしくは請求項２に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは請求項８に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１０】
患者において免疫応答を誘発するための方法であって、請求項４〜請求項６のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項７または請求項８の免疫原性組成物を該患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記免疫応答は、ＥｘＰＥＣ感染症を防御するものである、請求項９に記載の使用、または請求項１０に記載の方法。
【公表番号】特表２０１０−５００３９９（Ｐ２０１０−５００３９９Ａ）
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２４２５６（Ｐ２００９−５２４２５６）
【出願日】平成１９年８月１５日（２００７．８．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００３３０６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２０３３０
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１５日（２００７．８．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００３３０６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２０３３０
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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