形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キット
【課題】 高検出感度で動物核内受容体のリガンドの分析が可能な形質転換酵母を提供する。
【解決手段】 本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含む形質転換酵母である。図１のグラフに示すように、本発明の形質転換酵母を使用すれば、動物核内受容体のリガンドを高感度で分析可能である。前記転写共役因子としては、例えば、ヒトＳＲＣ１が使用でき、前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用できる。
【解決手段】 本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含む形質転換酵母である。図１のグラフに示すように、本発明の形質転換酵母を使用すれば、動物核内受容体のリガンドを高感度で分析可能である。前記転写共役因子としては、例えば、ヒトＳＲＣ１が使用でき、前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中の化学物質の分析において、従来は機器分析が主流であったが、生物的な影響をも評価できる分析手法として核内受容体遺伝子を宿主細胞に組み込み、その発現の程度で化学物質の分析を行う手法が開発されている。宿主細胞としては、ヒト等の動物細胞および酵母が使用されている。動物細胞を用いた分析方法としては、例えば、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）遺伝子をヒト由来細胞株に組み込み、テストステロン（Ｔ）等を分析する方法がある（非特許文献１）。一方、雌化現象等で注目された環境ホルモン（内分泌撹乱物質）のエストロゲン様活性の分析手法として、ブルーギル由来のエストロゲン受容体遺伝子（特許文献１）、オオマキトカゲ由来エストロゲン受容体遺伝子、（特許文献２）、ワニ由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献３）、ファットヘッドミノー由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献４）等の各種野生動物のエストロゲン受容体遺伝子を酵母に組み込み、その発現を測定するという手法が開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。この他、ヒト由来エストロゲン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いてアルキルフェノール化合物のエストロゲン様活性を測定する手法が開発されている（非特許文献２）。また、例えば、ダイオキシン等のアリールハイドロカーボン類を測定するために、モルモット由来のアリールハイドロカーボン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いた手法が開発されている（特許文献５）。これらの酵母を用いた手法では、各種核内受容体遺伝子が発現し、測定対象となるリガンド（化学物質等）が前記核内受容体に結合して複合体を形成し、この複合体がレポーター遺伝子を発現させる。前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が使用されており、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定することで、遺伝子の発現を測定している。酵母を用いた分析は、動物細胞を用いた分析方法に比べて、短時間分析が可能であり、操作の簡便性および低コスト等の利点を有する。しかしながら、酵母を用いた分析方法では、動物細胞を用いた分析手法に比べ、分析感度が低いという問題がある。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−１９７８９０号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４号公報
【特許文献３】特開２００２−３６０２７３号公報
【特許文献４】特開２００１−３５２９９２号公報
【特許文献５】特開２００５−８７０７７号公報
【非特許文献１】Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２２０（２００６）９０−１０３
【非特許文献２】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．６，Ｆｅｂ．７ ｐｐ．３２８０−３２８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の目的は、動物核内受容体リガンドを高感度で分析可能な形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含む形質転換酵母である。
【０００６】
本発明の分析方法は、検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、前記本発明の形質転換酵母を使用することを特徴とする。
【０００７】
本発明の分析キットは、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するためのキットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）本発明の形質転換酵母と、
（ｃ）発色基質と
を備える。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者等は、形質転換酵母を用いた核内受容体リガンドの分析方法の感度向上を目的として、一連の研究を行った。その過程で、形質転換酵母でのレポーター遺伝子の発現に着目し、その転写活性を向上させるという着想を得た。すなわち、レポーター遺伝子の転写は、核内受容体を含む複数のタンパク質で形成される複合体によって開始される。従来の形質転換酵母では、レポーター遺伝子の転写開始のための複合体形成には、導入された動物核内受容体以外は、すべて酵母由来のタンパク質で補われていると考えられる。そこで、本発明者等は、前記複合体を構成するタンパク質のなかで、転写共役因子（コアクチベーター）に着目し、動物転写共役因子遺伝子を形質転換酵母に組み込んだ。その結果、動物転写共役因子遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を使用すれば、動物核内受容体リガンドを高感度で分析できることを見出し、本発明に到達した。したがって、本発明の形質転換酵母を用いれば、動物核内受容体リガンドを、簡単な操作により、低コスト、短時間かつ高感度で分析可能である。また、本発明の分析キットを用いれば、さらに、簡便に動物核内受容体リガンドの分析を実施可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の形質転換酵母において、前記動物核内受容体は、ヒト核内受容体であり、前記動物転写共役因子がヒト転写共役因子であることが好ましい。前記ヒト転写共役因子遺伝子は、ヒトＳＲＣ１遺伝子であることが好ましい。
【００１０】
本発明の形質転換酵母において、前記動物核内受容体遺伝子を常染色体上に有し、前記レポーター遺伝子を第１のプラスミドに有し、前記動物転写共役因子遺伝子を第２のプラスミドに有し、前記第１のプラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた動物核内受容体応答配列を含むことが好ましい。
【００１１】
本発明の形質転換酵母において、前記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であることが好ましい。
【００１２】
本発明において、前記形質転換酵母は、特に制限されないが、例えば、出芽酵母、分裂酵母、糸状酵母等があるが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
【００１３】
本発明の形質転換酵母は、例えば、検体に含まれる動物核内受容体リガンドの分析に使用される。
【００１４】
本発明の分析方法において、前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である場合、前記培地は、ガラクトースおよびグルコースを含むことが好ましい。グルコースを含む培地で前記形質転換酵母を培養すれば、例えば、１８時間の短時間で分析可能なレベルまで増殖させることができる。本発明の分析方法において、前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合は、特に制限されないが、例えば、０を超え６０重量％以下の範囲、好ましくは、０を超え４０重量％以下の範囲、より好ましくは、１０〜３０重量％の範囲である。
【００１５】
本発明の分析方法において、前記形質転換酵母が、グリセロール存在下で保存されていた酵母であることが好ましい。前記のグリセロール存在下で保存されていた形質転換酵母は、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母であることが好ましい。
【００１６】
本発明の分析方法は、例えば、検出、定性分析または定量分析である。また、本発明において、分析は、検出、定性分析および定量分析を含む。
【００１７】
本発明の分析キットにおいて、前記培地は、ガラクトースとグルコースとを含む培地であることが好ましい。前記グルコースの重量割合は、前述のとおりである。
【００１８】
つぎに、本発明について詳しく説明する。
【００１９】
本発明において、前記動物核内受容体および前記動物核内受容体リガンドは、特に制限されず、例えば、下記に示す核内受容体および前記受容体に結合可能なリガンドがあげられる。
【００２０】
（１）ＴＲα：Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
（２）ＴＲβ：Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ
（３）ＲＡＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
（４）ＲＡＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ
（５）ＲＡＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ
（６）ＰＰＡＲα：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ）
（７）ＰＰＡＲδ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｌｔａ（ＰＰＡＲ−ｄｅｌｔａ、ＰＰＡＲ−ｂｅｔａ、Ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ＮＵＣ１）
（８）ＰＰＡＲγ１：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ １（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ１）
（９）ＰＰＡＲγ２：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ２（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ２）
（１０）Ｒｅｖ−ｅｒｂα：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ１Ｄ１（Ｖ−ｅｒｂＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＡＲ−１、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡ−ａｌｐｈａ）
（１１）Ｒｅｖ−ｅｒｂβ：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ１Ｄ２（Ｒｅｖ−ｅｒｂ−ｂｅｔａ、ＥＡＲ−１Ｒ、Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＢＤ７３）
（１２）ＲＯＲα：Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＯＲ−ａｌｐｈａ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＺＲ−ａｌｐｈａ）
（１３）ＲＯＲβ：Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＯＲ−ｂｅｔａ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＺＲ−ｂｅｔａ）
（１４）ＲＯＲγ：Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＯＲ−ｇａｍｍａ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＺＲ−ｇａｍｍａ）
（１５）ＬＸＲβ：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＸＲ−ｂｅｔａ （Ｌｉｖｅｒ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ、Ｎｕｃｌｅａｒ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＸＲ−ｂｅｔａ、Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＥＲ）
（１６）ＬＸＲα：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＸＲ−ａｌｐｈａ（Ｌｉｖｅｒ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、Ｎｕｃｌｅａｒ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＸＲ−ａｌｐｈａ）
（１６）ＦＸＲ：Ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｆａｒｎｅｓｏｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＨＲＲ−１、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １４、ＲＸＲ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １４）
（１７）ＶＤＲ：Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＤＲ、１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（１８）ＰＸＲ−１：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＸＲ−１（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＡＲ−１、Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、ＳＸＲ−１）
（１９）ＰＸＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＸＲ−２（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２、Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＡＲ−２、Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２、ＳＸＲ−２）
（２０）ＣＡＲ：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ１Ｉ３（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ、Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＭＢ６７）
（２１）ＨＮＦ４α：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４−ａｌｐｈａ（ＨＮＦ−４−ａｌｐｈａ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １４）
（２２）ＨＮＦ４γ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４−ｇａｍｍａ（ＨＮＦ−４−ｇａｍｍａ）
（２３）ＲＸＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＸＲ−ａｌｐｈａ
（２４）ＲＸＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＸＲ−ｂｅｔａ
（２５）ＲＸＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＸＲ−ｇａｍｍａ
（２６）ＴＲ２：Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＲ２（Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＲ２）
（２７）ＴＲ４：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＲ４（Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＡＫ１）
（２８）ＴＬＸ：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ２Ｅ１（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＬＸ、Ｔａｉｌｌｅｓｓ ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｔｌｌ、ｈＴｌｌ）
（２９）ＰＮＲ：Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｒｅｔｉｎａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（３０）ＣＯＵＰ−ＴＦ Ｉ：ＣＯＵＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １（ＣＯＵＰ−ＴＦ１、ＣＯＵＰ−ＴＦα、Ｖ−ｅｒｂＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＡＲ−３）
（３１）ＣＯＵＰ−ＴＦ ＩＩ：ＣＯＵＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２（ＣＯＵＰ−ＴＦ２、ＣＯＵＰ−ＴＦβ、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＩ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＡＲＰ−１）
（３２）ＥＡＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＡＲ−２（Ｖ−ｅｒｂＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＡＲ−２、ＣＯＵＰ−ＴＦγ）
（３３）ＥＲα：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲ、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＲ−ａｌｐｈａ）
（３４）ＥＲβ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ（ＥＲ−ｂｅｔａ）
（３５）ＥＲＲα：Ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＲＲ１（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ａｌｐｈａ、ＥＲＲ−ａｌｐｈａ、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ １）
（３６）ＥＲＲβ：Ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＲＲ２（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｂｅｔａ、ＥＲＲ−ｂｅｔａ、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、ＥＲＲ ｂｅｔａ−２）
（３７）ＥＲＲγ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３、ＥＲＲ ｇａｍｍａ−２）
（３８）ＧＲα：Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
（３９）ＧＲβ：Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ
（４０）ＭＲ：Ｍｉｎｅｒａｌｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＲ）
（４１）ＰＲα：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
（４２）ＰＲβ：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ
（４３）ＡＲ：Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４４）ＮＧＦＩ−Ｂα：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＨＭＲ（Ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＡＫ１、ＴＲ３ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４５）ＮＧＦＩ−Ｂβ：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＵＲＲ１（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＯＴ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４６）ＮＧＦＩ−Ｂγ：Ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＯＲ−１（Ｎｅｕｒｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、Ｍｉｔｏｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４７）ＳＦ−１：Ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ １（ＳＴＦ−１、ＳＦ−１、Ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＤ４ＢＰ、Ｆｕｓｈｉ ｔａｒａｚｕ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ １、ＦＴＺ−ＦＩα）
（４８）ＬＲＨ−１：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ５Ａ２（Ａｌｐｈａ−１−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、Ｂ１−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ｈＢ１Ｆ、ＣＹＰ７Ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＦＴＺ−ＦＩβ）
（４９）ＧＣＮＦ：Ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ（Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ６Ａ１、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＴＲ）
（５０）ＤＡＸ１：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＤＡＸ−１
（５１）ＳＨＰ：Ｓｍａｌｌ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｐａｒｔｎｅｒ（Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＳＨＰ）
【００２１】
これらの動物核内受容体は、分析対象となるリガンドに応じて、適宜選択すればよい。
【００２２】
つぎに、本発明において、動物転写共役因子は特に制限されない。動物転写共役因子としては、例えば、下記表１に示す８種類の転写共役因子が使用可能である。
【００２３】
【表１】
【００２４】
本発明の形質転換酵母において、導入する核内受容体および転写共役因子は、分析の対象となるリガンド（化学物質）の種類により適宜決定できる。例えば、本発明の形質転換酵母は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、若しくはレチノイン酸Ｘ受容体α（ＲＸＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）、甲状腺ホルモン受容体α（ＴＲα）を導入した態様がある。
【００２５】
まず、ＡＲ遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＡＲとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＡＲがある。ＡＲは、リガンド（アンドロゲン若しくはアンドロゲン様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これがグルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００２６】
前記ヒトＡＲを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＡＲ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００２７】
前記ヒトＡＲ遺伝子としては、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｂ）のポリヌクレオチドは、下記（ａ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＡＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２８】
前記ＡＲ遺伝子は、配列番号１の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００２９】
ＡＲに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＴＩＦ２がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３０】
前記ＧＲＥ配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＧＲＥ配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３１】
つぎに、ＧＲ遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＧＲとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＧＲがある。ＧＲは、リガンド（グルココルチコイド若しくはグルココルチコイド様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これがグルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００３２】
前記ヒトＧＲを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＧＲ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００３３】
前記ヒトＧＲ遺伝子としては、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｄ）のポリヌクレオチドは、下記（ｃ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＧＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３４】
前記ＧＲ遺伝子は、配列番号２の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００３５】
ＧＲに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＴＩＦ２がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３６】
前記応答配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＧＲＥ配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３７】
つぎに、ＲＸＲα遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＲＸＲαとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＲＸＲαがある。ＲＸＲαは、リガンド（レチノイン酸若しくはレチノイン酸様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これが薬物応答配列（ＤＲ１配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００３８】
前記ヒトＲＸＲαを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＲＸＲα遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００３９】
前記ヒトＲＸＲα遺伝子としては、例えば、下記（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｆ）のポリヌクレオチドは、下記（ｅ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＲＸＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４０】
前記ＲＸＲα遺伝子は、配列番号３の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００４１】
ＲＸＲαに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＡＲＡ７０がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ヒトＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４２】
前記ＤＲ１配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＤＲ１配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４３】
つぎに、ＥＲβ遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＥＲβとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＥＲβがある。ＥＲβは、リガンド（エストロゲン若しくはエストロゲン様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これがエストロゲン応答配列（ＥＲＥ配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００４４】
前記ヒトＥＲβを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＥＲβ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００４５】
前記ヒトＥＲβ遺伝子としては、例えば、下記（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｈ）のポリヌクレオチドは、下記（ｇ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｈ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＥＲβとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４６】
前記ＥＲβ遺伝子は、配列番号４の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００４７】
ＥＲβに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＳＣ２およびＥＲＡＰ１４０がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４８】
前記応答配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＥＲＥ配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４９】
つぎに、ＴＲα遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＴＲαとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＴＲαがある。ＴＲαは、リガンド（甲状腺ホルモン若しくは甲状腺ホルモン様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これが薬物応答配列（ＩＲ０配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００５０】
前記ヒトＴＲαを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＴＲα遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００５１】
前記ヒトＴＲα遺伝子としては、例えば、下記（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｊ）のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｊ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＴＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５２】
前記ＴＲα遺伝子は、配列番号５の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００５３】
ＴＲαに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＩＢ、ＡＲＡ７０およびＡＳＣ２がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００５４】
前記応答配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＩＲ０配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００５５】
前記ヒトＳＲＣ１遺伝子としては、例えば、下記（ｋ）または（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｌ）のポリヌクレオチドは、下記（ｋ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｌ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｋ）配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｌ）配列番号６に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＳＲＣ１として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５６】
本発明の遺伝子組換え細胞の宿主細胞は、酵母であり、好ましいのは、出芽酵母であることは、前述のとおりである。
【００５７】
前記酵母内に、前記動物核内受容体遺伝子を導入する方法としては、特に制限されず、従来公知の遺伝子導入方法により行うことができる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。本発明における核内受容体遺伝子の導入は、そのリガンドの分析に用いることが可能であれば、一過性型の導入でもよく、または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型の導入でもよい。取扱いや保存の容易性およびリガンドの分析の迅速性、正確性、簡便性からは、前述のように、宿主（酵母）染色体への遺伝子導入方法が好ましい。
【００５８】
前記酵母内に導入する前記動物核内受容体遺伝子は、酵母内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞（酵母）内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。本発明において、作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００５９】
前述のように、本発明において、前記核内受容体とリガンドの複合体を検出するためのレポーター遺伝子として、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用することが好ましい。前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、その上流に、前記複合体が認識して結合する応答配列（転写調節配列）と動作的に結合している。前記応答配列（転写調節配列）は、動物核内受容体遺伝子の種類により適宜決定される。前述のように、ＡＲおよびＧＲの場合の応答配列は、ＧＲＥであり、ＲＸＲαの場合は、ＤＲ１であり、ＥＲβの場合は、ＥＲＥであり、ＴＲαの場合は、ＩＲ０である。これらの応答配列（転写調節配列）およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、第１のプラスミドに組み込まれて形質転換酵母に導入されていることが好ましい。前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼに限定されず、その他、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子が使用できる。
【００６０】
前述のように、本発明において、転写共役因子遺伝子は、前記レポーター遺伝子を組み込んだプラスミド（第１のプラスミド）とは別のプラスミド（第２のプラスミド）に組み込んで酵母に導入することが好ましい。
【００６１】
つぎに、本発明の分析方法の一例を示す。
【００６２】
まず、所定の動物核内受容体遺伝子、動物転写共役因子遺伝子、前記動物核内受容体応答配列およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換酵母を準備する。そして、この形質転換酵母のグリセロールストックを調製することが好ましい。グリセロールストックを調製するために使用する培地は、特に制限されず、例えば、窒素源、炭素源、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を含む培地があげられる。グリセロールストックを調製する培地組成の例を、下記表２に示す。
【００６３】
（表２）
成分 配合量
ドロップアウトパウダー （注１） １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、注２） １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．０ｇ
炭素源（グルコースまたはガラクトース） ２０．０ｇ
水 １０００ｍＬ
（注１）ドロップアウトパウダー組成
成分 配合量 成分 配合量
アデニン ２．５ｇ Ｌ−メチオニン １．２ｇ
Ｌ−アルギニン １．２ｇ Ｌ−フェニルアラニン ３．０ｇ
Ｌ−アスパラギン酸 ６．０ｇ Ｌ−セリン ２２．５ｇ
Ｌ−グルタミン酸 ６．０ｇ Ｌ−スレオニン １２．０ｇ
Ｌ−ヒスチジン １．２ｇ Ｌ−チロシン １．８ｇ
Ｌ−リジン １．８ｇ Ｌ−バリン ９．０ｇ
ウラシル １．２ｇ
（注２）窒素源
Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｗ／Ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ＆ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ （Ｄｉｆｃｏ社製）
【００６４】
前記グリセロールストックを調製するための培養は、前記のような培地で継続的に培養された状態のものを利用する場合には、例えば、前記継続培養後の培養液を５０μＬ分取し、前記表２の培地５０００μＬ中に加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって実施する。一方、形質転換酵母として凍結乾燥菌体を利用してグリセロールストックを調製するための培養を行う場合には、例えば、ＹＰＤ培地等の栄養培地を加え、３０℃で２４時間培養した培養液を５０μＬ分取し、前記と同様に前記表２に示す培地５０００μＬに加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養する。
【００６５】
前記グリセロールストックを調製するための培養により、菌体が十分増殖したら、得られた培養液から１０倍濃縮グリセロールストック液を作製する。このグリセロールストック液の組成は、例えば培養液８０％、グリセロール２０％から成り、−８０℃での保存も可能である。そして、このグリセロールストック液から本培養を実施する。前記本培養に使用する培地としては、例えば、前記表２に示す培地において、炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含むものを使用する。ガラクトースとグルコースの比率は、前述のとおりである。また、本培養においては、培地中に、化学物質等の被験物質を添加して行う。前記本培養の温度は、例えば、２８〜３０℃であり、前記本培養時間は、例えば、１０〜４８時間、好ましくは、１５〜３６時間、より好ましくは１８〜２４時間である。すなわち、前記培地にガラクトースとグルコースを添加することにより、本培養における前記形質転換酵母の増殖を促進させることができるので、短時間の本培養で、被験物質を高感度かつ高信頼性で分析可能である。また、本培養は、振とう培養でもよいし、静置培養でもよい。なお、前記被験物質が固体の場合には、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の形質転換酵母に対して毒性を示さない溶媒を用いて前記被験物質を溶解してから前記培地と混合することが好ましい。
【００６６】
つぎに、本培養後の前記形質転換酵母を、公知の手法により溶菌させる。この溶菌には、例えば、下記に示すような、Ｚバッファーに界面活性剤（サルコシル）を添加した溶菌液等が使用できる。
【００６７】
（溶菌液：Ｚバッファー）
成分 配合量（最終濃度）
Ｎａ２ＨＰＯ４ ６０ｍＭ
ＮａＨ２ＳＯ４ ４０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
ＫＣｌ １０ｍＭ
ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ） ２ｍＭ
サルコシル（注３） ０．２０％
（注３）Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ
【００６８】
そして、前記溶菌後の溶菌液を適量採取し、産生されたβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定する。β−ガラクトシダーゼの活性は、例えば、ＯＮＰＧ（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）やＣＰＲＧ（クロロフェノールレッドガラクトピラノシド）等の発色試薬を作用させ、その吸光度を測定すればよい。この測定において、予め、標準物質を用いて検量線を作成しておくことが好ましく、前記検量線は、被験物質の測定と同時に作成することが好ましい。さらに、測定に際しては、用量作用関係の範囲内に納まるように被験物質を適宜希釈することが好ましい。このような分析方法であれば、吸光度を測定するだけでよく、簡便かつ迅速に分析できる。
【００６９】
本発明の分析用キットは、本発明の分析方法を簡単に実施するためのキットであって、前述のように、培地、本発明の前記形質転換酵母および発色基質（発色試薬）を含むキットである。前記発色基質（発色試薬）としては、例えば、ＯＮＰＧやＣＰＲＧ等があげられる。さらに、本発明の分析キットは、検量線作成のための標準物質等を含んでいても良い。前記形質転換酵母は、凍結乾燥させて粉末状にしてもよい。
【００７０】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例および比較例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７１】
本実施例では、下記の手順によりヒトＡＲ遺伝子、ヒトＧＲ遺伝子、ヒトＲＸＲα、ヒトＥＲβ遺伝子およびヒトＴＲα遺伝子を組み込んだ五種類の形質転換酵母を作製した。
【００７２】
（１） レポータープラスミドの作製
酵母チトクロームＣ遺伝子のプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミド（ｐＹＴ−β；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２０、５６８−５７４）を準備した。ＧＲおよびＡＲに応答する配列としてＧＲＥを使用し、ＲＸＲαに応答する配列としてＤＲ１を使用し、ＥＲβに応答する配列としてＥＲＥを使用し、ＴＲαに応答する配列としてＩＲ０を使用した。ＧＲＥ、ＤＲ１、ＥＲＥもしくはＩＲ０を含む下記のリン酸化合成オリゴＤＮＡ（配列番号７、９、１１および１３）およびその相補鎖ＤＮＡ（配列番号８、１０、１２および１４）を作製した。これらのオリゴＤＮＡをアニーリングした。アニーリングは、９４℃で１分間を１サイクルで実施した。アニーリング後、ＧＲＥは、ｐＹＴ−βのＢｇｌ ＩＩサイトに挿入した。ＤＲ１は、ｐＹＴ−βのＳｐｅＩサイトに挿入した。ＥＲＥは、ｐＹＴ−βのＳｐｅＩ−ＳａｌＩサイトに挿入した。ＩＲ０は、ｐＹＴ−βのＳｐｅＩサイトに挿入した。ＧＲＥが連続して８個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＢｇｌ ＩＩサイトに挿入した。同様に、ＤＲ１が連続して４個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＳｐｅＩサイトに挿入した。ＥＲＥが１個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＳｐｅＩ−ＳａｌＩサイトに挿入した。ＩＲ０が連続して５個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＳｐｅＩサイトに挿入した。そして、ＧＲＥが連続して８個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−βＧＲＥｃｓ８とし、ＤＲ１が４個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−βＤＲ１×４とし、ＥＲＥが１個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−βＥＲＥ×１とし、ＩＲ０が５個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−βＩＲ０×５とした。
【００７３】
（ＧＲＥ）
ＧＲＥｃｓｆＢｇ：５´−gatctttgagaacaaactgttcttaaat−３´（配列番号７）
ＧＲＥｃｓｒＢｃ：３´−aaactcttgtttgacaagaatttactag−５´（配列番号８）
【００７４】
（ＤＲ１）
ＲＸＲＥ−ＤＲ１Ｎｈ：５´−ctagcaggtcagaggtcagatgct−３´（配列番号９）
ＲＸＲＥ−ＤＲ１Ｘｂ：３´−gtccagtctccagtctacgagatc−５´（配列番号１０）
【００７５】
（ＥＲＥ）
ＥＲＥ−ＳｐｅＩ：５´−ctagttagcaggtcacagtgacctacgcg−３´（配列番号１１）
ＥＲＥ−ＳａｌＩ：３´−aatcgtccagtgtcactggatgcgcagct−５´（配列番号１２）
【００７６】
（ＩＲ０）
ＩＲ０ＸｂａＦ：５´−ctagatctcaggtcatgacctttcatcca−３´（配列番号１３）
ＩＲ０ＳｐｅＲ：３´−tagagtccagtactggaaagtaggtgatc−５´（配列番号１４）
【００７７】
（２） 動物核内受容体発現プラスミドの作製
ＧＲ、ＡＲ、ＲＸＲα、ＥＲβ、ＴＲαの各ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をヒト精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社製）よりｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法（ＰＣＲ法）にて増幅した。用いたプライマー（配列番号１５〜２４）及びＰＣＲの条件を以下に示す。
【００７８】
（ＧＲ）
ＧＲｆＲｂＢｍ：５´−tcgaggatccaacaaaatggactccaaagaatcattaact−３´（配列番号１５）
ＧＲｒＸｈ：５´−attcttctcgaggcagtcacttttgatgaaac−３´（配列番号１６）
【００７９】
（ＡＲ）
ＡＲｆＲｂＢｍ：５´−tcgaggatccaacaaaatggaagtgcagttagggctggg−３´（配列番号１７）
ＡＲｒＸｈ：５´−agggggctcgagctggggtggggaaatagg−３´（配列番号１８）
【００８０】
（ＲＸＲα）
ＲＸＲａＲｂＫｐｎＦ：５´−aaaggggtacctcaaaaatggacaccaaacatttcctgcc−３´（配列番号１９）
ＲＸＲａＥｃｒ：５´−cttaagaattctaagtcatttggtgcggc−３´（配列番号２０）
【００８１】
（ＥＲβ）
ＥＲｂｅｔａｆＸｂ：５´−gcctcttctagaaaggtgttttctcagc−３´（配列番号２１）
ＥＲｂｅｔａｒＨｄ：５´−acgcttaagcttgtgacctctgtgggcc−３´（配列番号２２）
【００８２】
（ＴＲα）
ＴＲａＲｂＳｐＦ:５´−gggcactagtaacaaaatggaacagaagccaagca−３´（配列番号２３）
ＴＲａＨｄＲ:５´−ggccaagcttgctttagacttcctgatcctcaaag−３´（配列番号２４）
【００８３】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭ ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ｃＤＮＡ １μＬ、５％ ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００８４】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５８℃で２０秒、６８℃で３分のサイクルを４０サイクル実施した。
【００８５】
つぎに、核内受容体ｃＤＮＡを増幅後、制限酵素にて切断した。この切断したｃＤＮＡを、両方向プロモーター領域Ｇａｌ１、１０を持つプラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０（ＧｅｎＢａｎｋ、ｐＭＣ２６２）の前記両プロモーターの下流に位置する部位に挿入し、核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターが介在したプラスミドＹＥｐＬａｃを得た。なお、クローニングには大腸菌ＨＢ１０１株を使用した。ｃＤＮＡおよびＹＥｐＬａｃの切断に用いた制限酵素を以下に示す。作製したプラスミドをそれぞれＹｅｐＬａｃＧＲ、ＹｅｐＬａｃＡＲ、ＹｅｐＬａｃＲＸＲα、ＹｅｐＬａｃＥＲβ、ＹｅｐＬａｃＴＲαとした。
【００８６】
（制限酵素）
挿入したｃＤＮＡ ｃＤＮＡ切断用制限酵素 ＹＥｐＬａｃ切断用制限酵素
ＧＲ ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
ＡＲ ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
ＲＸＲα ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ
ＥＲβ ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ
ＴＲα ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ
【００８７】
つぎに、これらのプラスミドからｇａｌ１およびｇａｌ１０プロモーター領域および受容体ｃＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにて切り出し、ｐＡＵＲ１０１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトの間に挿入した。作製したプラスミドを、それぞれｐＡＵＲ１０１ＧＲ、ｐＡＵＲ１０１ＡＲ、ｐＡＵＲ１０１ＲＸＲα、ｐＡＵＲ１０１ＥＲβ、ｐＡＵＲ１０１ＴＲαとした。
【００８８】
（３） ＳＲＣ１プラスミドの作製
ＳＲＣ１ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ヒト精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社製）よりＰＣＲ法を用いて増幅した。用いたプライマー（配列番号２５および２６）及びＰＣＲの条件を以下に示す。
【００８９】
ｈＳＲＣ１ｂｇＦ：５´−tggaactcaagatttgaccatatc−３´（配列番号２５）
ｈＳＲＣ１ｘｈＲ：５´−gagcattcctctagtctgtagtc−３´（配列番号２６）
【００９０】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭ ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ｃＤＮＡ １μＬ、５％ ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００９１】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５６℃で２０秒、６８℃で５分のサイクルを４０サイクル実施した。
【００９２】
増幅したＳＲＣ−１ ｃＤＮＡを精製し、さらに以下のプライマー（配列番号２７および２８）を用いたＰＣＲ法にてｃＤＮＡに制限酵素サイトを付加した。増幅したｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断後、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕベクターのｇａｌ１プロモーター下流に挿入した。本プラスミドＤＮＡをｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１とした。
【００９３】
ＳＲＣ−１ｅＦｂｇ２：５´−caaagaagatctcccaggtgtgaag−３´（配列番号２７）
ＳＲＣ−１ｅＲｘｈ２：５´−agggccctcgagactctagtctgtag−３´（配列番号２８）
【００９４】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭ ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ） １μＬ、５％ ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００９５】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５６℃で２０秒、６８℃で５分のサイクルを２０サイクル実施した。
【００９６】
（４） 形質転換酵母の作製
前記ｐＡＵＲ１０１ＧＲ、ｐＡＵＲ１０１ＡＲ、ｐＡＵＲ１０１ＲＸＲα、ｐＡＵＲ１０１ＥＲβ、ｐＡＵＲ１０１ＴＲαを、制限酵素ＥｃｏＯ６５Ｉで処理して直鎖状とし、以下のように酢酸リチウム法にて宿主となる酵母へ導入し、さらに、染色体への組込みを行った。宿主株として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３ａ株を使用した。
【００９７】
まず、前記宿主となる酵母を、３０℃でＯＤ６６０が１〜２になるまでＹＰＤ培地中で培養し、ソリューションＡ（０．１Ｍ Ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ いずれも最終濃度）で洗浄後、ＯＤ６６０＝１５０となるようにソリューションＡに再懸濁し、１．５ｍＬマイクロチューブに１００μＬずつ分注して、３０℃で１時間インキュベートした。その後、直鎖状の前記の各ｐＡＵＲ１０１ベクター ５μｇと、キャリアーＤＮＡ（商品名：ＳＡＬＭＯＮ ＴＥＳＴＥＳ ＤＮＡ ｆｏｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社製）１５０μｇ（合計２０μＬ）を加え、さらに、ソリューションＢ（ソリューションＡ１００ｍＬにポリエチレングリコール４０００を溶解したもの）を８５０μＬ添加し、緩やかに混合した。
【００９８】
つぎに、前記混合液を３０℃で３０分インキュベートして４２℃で１５分熱処理した後、さらに、１０分室温に放置してから、５０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離で集菌し、それらを５〜１０ｍＬのＹＰＤ培地に懸濁し、３０℃で一晩培養した。そして、培養後集菌して洗浄した酵母を、０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ（０．５ｇ／ｍＬ）を含むＹＰＤ選択プレートに１００μＬずつ塗布して培養した。そして、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性株をＧａｌ１プロモーターとＡＲなどのｃＤＮＡ領域が染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。
【００９９】
つぎに、前記形質転換酵母に、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１プラスミド ＤＮＡを導入した。このときの形質転換酵母選択培地は、後述する前培養培地にトリプトファンを１００ｍｇ添加したものである。
【０１００】
つぎに、前記形質転換酵母に、酢酸リチウム法にてｐＹＴβＧＲＥｃｓ８、ｐＹＴβＤＲ１×４、ｐＹＴβＥＲＥ×１もしくはｐＹＴβＩＲ０×５プラスミドＤＮＡを導入した。このときの形質転換酵母選択培地は、後述する前培養培地である。以上の操作により、レポーター遺伝子としてｐＹＴβＧＲＥｃｓ８、ｐＹＴβＤＲ１×４、ｐＹＴβＥＲＥ×１もしくはｐＹＴβＩＲ０×５、およびｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１ＤＮＡをプラスミドとして保持し、ゲノム中よりヒトＧＲ、ＡＲ、ＲＸＲα、ＥＲβ、ＴＲαを発現する酵母菌株を作製した。
【実施例２】
【０１０１】
本実施例では、前記実施例１で作製した形質転換酵母を用いて、リガンドの分析を行った。なお、比較例として、ＳＲＣ１遺伝子を導入しなかった他は、実施例１と同様にして作製した形質転換酵母を用いて、同様にリガンドの分析を行った。
【０１０２】
（形質転換酵母の前培養）
前記形質転換酵母を、下記に示す前培養用の培地にて２４時間前培養を行った。培養の結果、濁度（Ａｂｓ５９５ｎｍ）が１．０程度に形質転換酵母が増殖した。
【０１０３】
（前培養の培地）
成分 配合量
ドロップアウトパウダー（前記注１） １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、前記注２） １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．０ｇ
ウラシル ０．０２ｇ
グルコース ２０．０ｇ
水 １Ｌ
【０１０４】
（形質転換酵母の本培養）
９６穴プレートを用い、１ウエルあたり以下の構成で、リガンド溶液、前培養した菌体液および本培養培地を混合し、３０℃で１８時間、静置培養を行った。
【０１０５】
リガンド溶液：１μＬ（ＧＲ：デキサメサゾン、ＡＲ：テストステロン、ＲＸＲα：９−ｃｉｓレチノイン酸、ＥＲβ：１７−β−エストラジオール、ＴＲα：チロキシン、それぞれＤＭＳＯに溶解）
菌体液（Ｏ．Ｄ．１〜１．５）：５μＬ
本培養培地：下記組成の培地１００μＬ
【０１０６】
（本培養培地組成）
成分 配合量
ドロップアウトパウダー（前記注１） １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、前記注２） １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．０ｇ
ウラシル ０．０２ｇ
グルコース ２．０ｇ
ガラクトース １８．０ｇ
水 １Ｌ
【０１０７】
（β−ガラクトシダーゼ活性の測定）
前記本培養の後、各ウエルから培養液を５μＬずつ採取し、新たな９６穴プレートの各ウエルに移し、下記の測定試薬を１００μＬ加えた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、前記反応液のβ−ガラクトシダーゼ活性および菌体量を測定した。前記β−ガラクトシダーゼ活性は、ｏ−ニトロフェノールの生成量から算出するため、４０５ｎｍにおける反応液の吸光度を測定した。また、前記菌体量は、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。分析結果は、４０５ｎｍの吸光度／５９５ｎｍの吸光度の比を算出し、リガンド非添加（溶媒であるＤＭＳＯのみを添加）での値を１とした誘導率で示した。これらの結果を、下記の表３、図１および図２に示す。図１において、（Ａ）が、ＧＲ導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、（Ｂ）が、ＡＲ導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、（Ｃ）が、ＲＸＲα導入形質転換酵母の結果を示すグラフである。また、図２において、（Ｄ）が、ＥＲβ導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、（Ｅ）が、ＴＲα導入形質転換酵母の結果を示すグラフである。各グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（ｌｏｇ Ｍ）であり、縦軸は、前記誘導率である。また、各グラフにおいて、実線で示したＳＲＣ＋は、ＳＲＣ導入酵母の結果であり、点線で示したＳＲＣ−は、ＳＲＣ非導入酵母の結果である。
【０１０８】
（測定試薬組成）
成分 配合量（最終濃度）
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５、注４） １００ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
ＫＣｌ １０ｍＭ
ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ） ２ｍＭ
サルコシル（前記注３） ０．４％
ＯＮＰＧ １ｍｇ／ｍＬ
（注４）６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および４０ｍＭ ＮａＨ２ＳＯ４を用いて調製
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
前記表３および図１に示すように、まず、ＧＲ導入酵母において、ＳＲＣ−１導入前の酵母では検出が可能なデキサメサゾン濃度は１００ｎＭ以上であるが、ＳＲＣ−１を導入した酵母ではデキサメサゾン濃度１０ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＥＣ５０は、ＳＲＣ−１導入前の酵母では３．５μＭ、導入後に１．８μＭであり、ＳＲＣ−１の導入により、１／２に低下した。１μＭ以上の濃度では、ＳＲＣ−１導入酵母は、ＳＲＣ−１非導入酵母に比べて３〜４倍程度高いβ−ガラクトシダーゼ活性が認められた。
【０１１１】
ＡＲ挿入酵母では、ＳＲＣ−１導入前の酵母では検出が可能なテストステロン濃度は１００ｎＭであるが、ＳＲＣ−１を導入した酵母ではテストステロン濃度１ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＥＣ５０については、ＳＲＣ−１の導入により、１／２０程度の低下が認められた。
【０１１２】
ＲＸＲα導入酵母においては検出が可能な９−ｃｉｓレチノイン酸濃度は１００ｎＭであるが、ＳＲＣ−１を導入した酵母では９−ｃｉｓレチノイン濃度１０ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＥＣ５０は、ＳＲＣ−１導入前の酵母では１４５．４ｎＭ、導入後には７８．２ｎＭとなり、ＳＲＣ−１の導入により約１／２に低下した。
【０１１３】
また、前記表３および図２に示すように、ＥＲβ導入酵母では、ＳＲＣ−１導入前の酵母には、リガンド応答性が認められなかった。ＳＲＣ−１を導入した酵母では１７−β−エストラジオール濃度１ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＥＲβ導入酵母においては、ＳＲＣ−１の導入により始めて、リガンド添加による誘導が認められた。
【０１１４】
ＴＲα導入酵母では、ＳＲＣ−１導入前の酵母には、リガンド応答性が認められなかった。ＳＲＣ−１を導入した酵母ではチロキシン濃度１０ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＴＲα導入酵母においては、ＥＲβ導入酵母と同様に、ＳＲＣ−１の導入により始めて、リガンド添加による誘導が認められた。
【０１１５】
以上の結果は、本発明の形質転換酵母を用いることにより、リガンドを高感度で分析できることを実証しているといえる。さらに、例えば、前記非特許文献１のＴａｂｌｅ２においてもＡＲをヒト由来細胞に導入してテストステロン（Ｔ）を分析しているが、ＥＣ５０の値は、本発明の前記実施例２（表１）の値より大きい。このことから、本発明の形質転換酵母を用いた分析方法は、動物細胞を用いた分析方法と同等もしくはそれ以上の感度を有するといえる。しかも、本発明の形質転換酵母を用いた分析方法は、操作が簡単であり、短時間で分析ができ、低コストであるという利点もある。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
以上のように、本発明の形質転換酵母を用いれば、高検出感度で動物核内受容体のリガンドの分析が可能となる。したがって、本発明の分析方法は、化学物質やタンパク質等のリガンドの分析の分野において有用な方法であり、その用途は制限されず広い。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１の（Ａ）、（Ｂ）および(Ｃ)は、本発明の一実施例におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２の（Ｄ）および（Ｅ）は、本発明の一実施例におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中の化学物質の分析において、従来は機器分析が主流であったが、生物的な影響をも評価できる分析手法として核内受容体遺伝子を宿主細胞に組み込み、その発現の程度で化学物質の分析を行う手法が開発されている。宿主細胞としては、ヒト等の動物細胞および酵母が使用されている。動物細胞を用いた分析方法としては、例えば、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）遺伝子をヒト由来細胞株に組み込み、テストステロン（Ｔ）等を分析する方法がある（非特許文献１）。一方、雌化現象等で注目された環境ホルモン（内分泌撹乱物質）のエストロゲン様活性の分析手法として、ブルーギル由来のエストロゲン受容体遺伝子（特許文献１）、オオマキトカゲ由来エストロゲン受容体遺伝子、（特許文献２）、ワニ由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献３）、ファットヘッドミノー由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献４）等の各種野生動物のエストロゲン受容体遺伝子を酵母に組み込み、その発現を測定するという手法が開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。この他、ヒト由来エストロゲン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いてアルキルフェノール化合物のエストロゲン様活性を測定する手法が開発されている（非特許文献２）。また、例えば、ダイオキシン等のアリールハイドロカーボン類を測定するために、モルモット由来のアリールハイドロカーボン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いた手法が開発されている（特許文献５）。これらの酵母を用いた手法では、各種核内受容体遺伝子が発現し、測定対象となるリガンド（化学物質等）が前記核内受容体に結合して複合体を形成し、この複合体がレポーター遺伝子を発現させる。前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が使用されており、β−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定することで、遺伝子の発現を測定している。酵母を用いた分析は、動物細胞を用いた分析方法に比べて、短時間分析が可能であり、操作の簡便性および低コスト等の利点を有する。しかしながら、酵母を用いた分析方法では、動物細胞を用いた分析手法に比べ、分析感度が低いという問題がある。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−１９７８９０号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４号公報
【特許文献３】特開２００２−３６０２７３号公報
【特許文献４】特開２００１−３５２９９２号公報
【特許文献５】特開２００５−８７０７７号公報
【非特許文献１】Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２２０（２００６）９０−１０３
【非特許文献２】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．６，Ｆｅｂ．７ ｐｐ．３２８０−３２８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の目的は、動物核内受容体リガンドを高感度で分析可能な形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含む形質転換酵母である。
【０００６】
本発明の分析方法は、検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、前記本発明の形質転換酵母を使用することを特徴とする。
【０００７】
本発明の分析キットは、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するためのキットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）本発明の形質転換酵母と、
（ｃ）発色基質と
を備える。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者等は、形質転換酵母を用いた核内受容体リガンドの分析方法の感度向上を目的として、一連の研究を行った。その過程で、形質転換酵母でのレポーター遺伝子の発現に着目し、その転写活性を向上させるという着想を得た。すなわち、レポーター遺伝子の転写は、核内受容体を含む複数のタンパク質で形成される複合体によって開始される。従来の形質転換酵母では、レポーター遺伝子の転写開始のための複合体形成には、導入された動物核内受容体以外は、すべて酵母由来のタンパク質で補われていると考えられる。そこで、本発明者等は、前記複合体を構成するタンパク質のなかで、転写共役因子（コアクチベーター）に着目し、動物転写共役因子遺伝子を形質転換酵母に組み込んだ。その結果、動物転写共役因子遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を使用すれば、動物核内受容体リガンドを高感度で分析できることを見出し、本発明に到達した。したがって、本発明の形質転換酵母を用いれば、動物核内受容体リガンドを、簡単な操作により、低コスト、短時間かつ高感度で分析可能である。また、本発明の分析キットを用いれば、さらに、簡便に動物核内受容体リガンドの分析を実施可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の形質転換酵母において、前記動物核内受容体は、ヒト核内受容体であり、前記動物転写共役因子がヒト転写共役因子であることが好ましい。前記ヒト転写共役因子遺伝子は、ヒトＳＲＣ１遺伝子であることが好ましい。
【００１０】
本発明の形質転換酵母において、前記動物核内受容体遺伝子を常染色体上に有し、前記レポーター遺伝子を第１のプラスミドに有し、前記動物転写共役因子遺伝子を第２のプラスミドに有し、前記第１のプラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた動物核内受容体応答配列を含むことが好ましい。
【００１１】
本発明の形質転換酵母において、前記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であることが好ましい。
【００１２】
本発明において、前記形質転換酵母は、特に制限されないが、例えば、出芽酵母、分裂酵母、糸状酵母等があるが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
【００１３】
本発明の形質転換酵母は、例えば、検体に含まれる動物核内受容体リガンドの分析に使用される。
【００１４】
本発明の分析方法において、前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である場合、前記培地は、ガラクトースおよびグルコースを含むことが好ましい。グルコースを含む培地で前記形質転換酵母を培養すれば、例えば、１８時間の短時間で分析可能なレベルまで増殖させることができる。本発明の分析方法において、前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合は、特に制限されないが、例えば、０を超え６０重量％以下の範囲、好ましくは、０を超え４０重量％以下の範囲、より好ましくは、１０〜３０重量％の範囲である。
【００１５】
本発明の分析方法において、前記形質転換酵母が、グリセロール存在下で保存されていた酵母であることが好ましい。前記のグリセロール存在下で保存されていた形質転換酵母は、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母であることが好ましい。
【００１６】
本発明の分析方法は、例えば、検出、定性分析または定量分析である。また、本発明において、分析は、検出、定性分析および定量分析を含む。
【００１７】
本発明の分析キットにおいて、前記培地は、ガラクトースとグルコースとを含む培地であることが好ましい。前記グルコースの重量割合は、前述のとおりである。
【００１８】
つぎに、本発明について詳しく説明する。
【００１９】
本発明において、前記動物核内受容体および前記動物核内受容体リガンドは、特に制限されず、例えば、下記に示す核内受容体および前記受容体に結合可能なリガンドがあげられる。
【００２０】
（１）ＴＲα：Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
（２）ＴＲβ：Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ
（３）ＲＡＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
（４）ＲＡＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ
（５）ＲＡＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ
（６）ＰＰＡＲα：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ）
（７）ＰＰＡＲδ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｌｔａ（ＰＰＡＲ−ｄｅｌｔａ、ＰＰＡＲ−ｂｅｔａ、Ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ＮＵＣ１）
（８）ＰＰＡＲγ１：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ １（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ１）
（９）ＰＰＡＲγ２：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ２（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ２）
（１０）Ｒｅｖ−ｅｒｂα：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ１Ｄ１（Ｖ−ｅｒｂＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＡＲ−１、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡ−ａｌｐｈａ）
（１１）Ｒｅｖ−ｅｒｂβ：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ１Ｄ２（Ｒｅｖ−ｅｒｂ−ｂｅｔａ、ＥＡＲ−１Ｒ、Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＢＤ７３）
（１２）ＲＯＲα：Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＯＲ−ａｌｐｈａ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＺＲ−ａｌｐｈａ）
（１３）ＲＯＲβ：Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＯＲ−ｂｅｔａ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＺＲ−ｂｅｔａ）
（１４）ＲＯＲγ：Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＯＲ−ｇａｍｍａ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＺＲ−ｇａｍｍａ）
（１５）ＬＸＲβ：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＸＲ−ｂｅｔａ （Ｌｉｖｅｒ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ、Ｎｕｃｌｅａｒ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＸＲ−ｂｅｔａ、Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＥＲ）
（１６）ＬＸＲα：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＸＲ−ａｌｐｈａ（Ｌｉｖｅｒ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、Ｎｕｃｌｅａｒ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＸＲ−ａｌｐｈａ）
（１６）ＦＸＲ：Ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｆａｒｎｅｓｏｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＨＲＲ−１、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １４、ＲＸＲ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １４）
（１７）ＶＤＲ：Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＤＲ、１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（１８）ＰＸＲ−１：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＸＲ−１（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＡＲ−１、Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、ＳＸＲ−１）
（１９）ＰＸＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＸＲ−２（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２、Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＡＲ−２、Ｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２、ＳＸＲ−２）
（２０）ＣＡＲ：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ１Ｉ３（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ、Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＭＢ６７）
（２１）ＨＮＦ４α：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４−ａｌｐｈａ（ＨＮＦ−４−ａｌｐｈａ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １４）
（２２）ＨＮＦ４γ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４−ｇａｍｍａ（ＨＮＦ−４−ｇａｍｍａ）
（２３）ＲＸＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＸＲ−ａｌｐｈａ
（２４）ＲＸＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＸＲ−ｂｅｔａ
（２５）ＲＸＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＲＸＲ−ｇａｍｍａ
（２６）ＴＲ２：Ｎｕｃｌｅａｒ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＲ２（Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＲ２）
（２７）ＴＲ４：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＲ４（Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＡＫ１）
（２８）ＴＬＸ：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ２Ｅ１（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＬＸ、Ｔａｉｌｌｅｓｓ ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｔｌｌ、ｈＴｌｌ）
（２９）ＰＮＲ：Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｒｅｔｉｎａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（３０）ＣＯＵＰ−ＴＦ Ｉ：ＣＯＵＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １（ＣＯＵＰ−ＴＦ１、ＣＯＵＰ−ＴＦα、Ｖ−ｅｒｂＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＡＲ−３）
（３１）ＣＯＵＰ−ＴＦ ＩＩ：ＣＯＵＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２（ＣＯＵＰ−ＴＦ２、ＣＯＵＰ−ＴＦβ、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ＡＩ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＡＲＰ−１）
（３２）ＥＡＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＡＲ−２（Ｖ−ｅｒｂＡ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＡＲ−２、ＣＯＵＰ−ＴＦγ）
（３３）ＥＲα：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲ、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＲ−ａｌｐｈａ）
（３４）ＥＲβ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ（ＥＲ−ｂｅｔａ）
（３５）ＥＲＲα：Ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＲＲ１（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ａｌｐｈａ、ＥＲＲ−ａｌｐｈａ、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ １）
（３６）ＥＲＲβ：Ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＲＲ２（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｂｅｔａ、ＥＲＲ−ｂｅｔａ、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、ＥＲＲ ｂｅｔａ−２）
（３７）ＥＲＲγ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３、ＥＲＲ ｇａｍｍａ−２）
（３８）ＧＲα：Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
（３９）ＧＲβ：Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ
（４０）ＭＲ：Ｍｉｎｅｒａｌｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＲ）
（４１）ＰＲα：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ
（４２）ＰＲβ：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ
（４３）ＡＲ：Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４４）ＮＧＦＩ−Ｂα：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＨＭＲ（Ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＡＫ１、ＴＲ３ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４５）ＮＧＦＩ−Ｂβ：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＵＲＲ１（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＯＴ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４６）ＮＧＦＩ−Ｂγ：Ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＯＲ−１（Ｎｅｕｒｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、Ｍｉｔｏｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４７）ＳＦ−１：Ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ １（ＳＴＦ−１、ＳＦ−１、Ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＤ４ＢＰ、Ｆｕｓｈｉ ｔａｒａｚｕ ｆａｃｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ １、ＦＴＺ−ＦＩα）
（４８）ＬＲＨ−１：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ５Ａ２（Ａｌｐｈａ−１−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、Ｂ１−ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ｈＢ１Ｆ、ＣＹＰ７Ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＦＴＺ−ＦＩβ）
（４９）ＧＣＮＦ：Ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ（Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＲ６Ａ１、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＴＲ）
（５０）ＤＡＸ１：Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＤＡＸ−１
（５１）ＳＨＰ：Ｓｍａｌｌ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｐａｒｔｎｅｒ（Ｏｒｐｈａｎ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＳＨＰ）
【００２１】
これらの動物核内受容体は、分析対象となるリガンドに応じて、適宜選択すればよい。
【００２２】
つぎに、本発明において、動物転写共役因子は特に制限されない。動物転写共役因子としては、例えば、下記表１に示す８種類の転写共役因子が使用可能である。
【００２３】
【表１】
【００２４】
本発明の形質転換酵母において、導入する核内受容体および転写共役因子は、分析の対象となるリガンド（化学物質）の種類により適宜決定できる。例えば、本発明の形質転換酵母は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、若しくはレチノイン酸Ｘ受容体α（ＲＸＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）、甲状腺ホルモン受容体α（ＴＲα）を導入した態様がある。
【００２５】
まず、ＡＲ遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＡＲとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＡＲがある。ＡＲは、リガンド（アンドロゲン若しくはアンドロゲン様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これがグルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００２６】
前記ヒトＡＲを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＡＲ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００２７】
前記ヒトＡＲ遺伝子としては、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｂ）のポリヌクレオチドは、下記（ａ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＡＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２８】
前記ＡＲ遺伝子は、配列番号１の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００２９】
ＡＲに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＴＩＦ２がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３０】
前記ＧＲＥ配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＧＲＥ配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３１】
つぎに、ＧＲ遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＧＲとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＧＲがある。ＧＲは、リガンド（グルココルチコイド若しくはグルココルチコイド様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これがグルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００３２】
前記ヒトＧＲを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＧＲ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００３３】
前記ヒトＧＲ遺伝子としては、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｄ）のポリヌクレオチドは、下記（ｃ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＧＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３４】
前記ＧＲ遺伝子は、配列番号２の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００３５】
ＧＲに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＴＩＦ２がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３６】
前記応答配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＧＲＥ配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００３７】
つぎに、ＲＸＲα遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＲＸＲαとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＲＸＲαがある。ＲＸＲαは、リガンド（レチノイン酸若しくはレチノイン酸様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これが薬物応答配列（ＤＲ１配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００３８】
前記ヒトＲＸＲαを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＲＸＲα遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００３９】
前記ヒトＲＸＲα遺伝子としては、例えば、下記（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｆ）のポリヌクレオチドは、下記（ｅ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＲＸＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４０】
前記ＲＸＲα遺伝子は、配列番号３の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００４１】
ＲＸＲαに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＡＲＡ７０がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ヒトＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４２】
前記ＤＲ１配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＤＲ１配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４３】
つぎに、ＥＲβ遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＥＲβとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＥＲβがある。ＥＲβは、リガンド（エストロゲン若しくはエストロゲン様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これがエストロゲン応答配列（ＥＲＥ配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００４４】
前記ヒトＥＲβを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＥＲβ遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００４５】
前記ヒトＥＲβ遺伝子としては、例えば、下記（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｈ）のポリヌクレオチドは、下記（ｇ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｈ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＥＲβとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４６】
前記ＥＲβ遺伝子は、配列番号４の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００４７】
ＥＲβに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＳＣ２およびＥＲＡＰ１４０がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４８】
前記応答配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＥＲＥ配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００４９】
つぎに、ＴＲα遺伝子を導入した形質転換酵母について説明する。ＴＲαとしては、特に制限されないが、例えば、ヒトＴＲαがある。ＴＲαは、リガンド（甲状腺ホルモン若しくは甲状腺ホルモン様化学物質）および転写共役因子と複合体を形成し、これが薬物応答配列（ＩＲ０配列）を認識して結合し、これにより、応答配列の下流に存在するレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）が発現する。レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子により活性化される。
【００５０】
前記ヒトＴＲαを酵母で発現させるためには、例えば、ヒトＴＲα遺伝子を前記酵母の染色体遺伝子内に導入すればよい。
【００５１】
前記ヒトＴＲα遺伝子としては、例えば、下記（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｊ）のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｊ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＴＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５２】
前記ＴＲα遺伝子は、配列番号５の塩基配列に基づいて、ヒトのトータルＲＮＡ等を使用してクローニングしてもよく、また、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００５３】
ＴＲαに対する転写共役因子としては、特に制限されないが、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＩＢ、ＡＲＡ７０およびＡＳＣ２がある。したがって、これらの転写共役因子の遺伝子を形質転換酵母に組み込めばよい。これらの中で、好ましいのは、ＳＲＣ１である。転写共役因子遺伝子は、第２のプラスミドに組み込んで形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００５４】
前記応答配列およびレポーター遺伝子は、作動的に連結して、第１のプラスミドに組み込み、この第１のプラスミドを形質転換細胞に導入することが好ましい。前記ＩＲ０配列は、繰り返し配列として組み込むことが好ましい。また、第１のプラスミドは、低コピー型プラスミドであることが好ましい。
【００５５】
前記ヒトＳＲＣ１遺伝子としては、例えば、下記（ｋ）または（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。下記（ｌ）のポリヌクレオチドは、下記（ｋ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。また、下記（ｌ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、前記相同性に対応した数である。
（ｋ）配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｌ）配列番号６に記載の塩基配列の少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＳＲＣ１として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５６】
本発明の遺伝子組換え細胞の宿主細胞は、酵母であり、好ましいのは、出芽酵母であることは、前述のとおりである。
【００５７】
前記酵母内に、前記動物核内受容体遺伝子を導入する方法としては、特に制限されず、従来公知の遺伝子導入方法により行うことができる。前記遺伝子導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。本発明における核内受容体遺伝子の導入は、そのリガンドの分析に用いることが可能であれば、一過性型の導入でもよく、または、宿主染色体への組込み型もしくは自律複製・分配可能な人工染色体もしくはプラスミド型の導入でもよい。取扱いや保存の容易性およびリガンドの分析の迅速性、正確性、簡便性からは、前述のように、宿主（酵母）染色体への遺伝子導入方法が好ましい。
【００５８】
前記酵母内に導入する前記動物核内受容体遺伝子は、酵母内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、宿主細胞（酵母）内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列であって、例えば、真核細胞に適した調節配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。本発明において、作動的に連結とは、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【００５９】
前述のように、本発明において、前記核内受容体とリガンドの複合体を検出するためのレポーター遺伝子として、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用することが好ましい。前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、その上流に、前記複合体が認識して結合する応答配列（転写調節配列）と動作的に結合している。前記応答配列（転写調節配列）は、動物核内受容体遺伝子の種類により適宜決定される。前述のように、ＡＲおよびＧＲの場合の応答配列は、ＧＲＥであり、ＲＸＲαの場合は、ＤＲ１であり、ＥＲβの場合は、ＥＲＥであり、ＴＲαの場合は、ＩＲ０である。これらの応答配列（転写調節配列）およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、第１のプラスミドに組み込まれて形質転換酵母に導入されていることが好ましい。前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼに限定されず、その他、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子が使用できる。
【００６０】
前述のように、本発明において、転写共役因子遺伝子は、前記レポーター遺伝子を組み込んだプラスミド（第１のプラスミド）とは別のプラスミド（第２のプラスミド）に組み込んで酵母に導入することが好ましい。
【００６１】
つぎに、本発明の分析方法の一例を示す。
【００６２】
まず、所定の動物核内受容体遺伝子、動物転写共役因子遺伝子、前記動物核内受容体応答配列およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した形質転換酵母を準備する。そして、この形質転換酵母のグリセロールストックを調製することが好ましい。グリセロールストックを調製するために使用する培地は、特に制限されず、例えば、窒素源、炭素源、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を含む培地があげられる。グリセロールストックを調製する培地組成の例を、下記表２に示す。
【００６３】
（表２）
成分 配合量
ドロップアウトパウダー （注１） １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、注２） １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．０ｇ
炭素源（グルコースまたはガラクトース） ２０．０ｇ
水 １０００ｍＬ
（注１）ドロップアウトパウダー組成
成分 配合量 成分 配合量
アデニン ２．５ｇ Ｌ−メチオニン １．２ｇ
Ｌ−アルギニン １．２ｇ Ｌ−フェニルアラニン ３．０ｇ
Ｌ−アスパラギン酸 ６．０ｇ Ｌ−セリン ２２．５ｇ
Ｌ−グルタミン酸 ６．０ｇ Ｌ−スレオニン １２．０ｇ
Ｌ−ヒスチジン １．２ｇ Ｌ−チロシン １．８ｇ
Ｌ−リジン １．８ｇ Ｌ−バリン ９．０ｇ
ウラシル １．２ｇ
（注２）窒素源
Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｗ／Ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ＆ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ （Ｄｉｆｃｏ社製）
【００６４】
前記グリセロールストックを調製するための培養は、前記のような培地で継続的に培養された状態のものを利用する場合には、例えば、前記継続培養後の培養液を５０μＬ分取し、前記表２の培地５０００μＬ中に加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養することによって実施する。一方、形質転換酵母として凍結乾燥菌体を利用してグリセロールストックを調製するための培養を行う場合には、例えば、ＹＰＤ培地等の栄養培地を加え、３０℃で２４時間培養した培養液を５０μＬ分取し、前記と同様に前記表２に示す培地５０００μＬに加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養する。
【００６５】
前記グリセロールストックを調製するための培養により、菌体が十分増殖したら、得られた培養液から１０倍濃縮グリセロールストック液を作製する。このグリセロールストック液の組成は、例えば培養液８０％、グリセロール２０％から成り、−８０℃での保存も可能である。そして、このグリセロールストック液から本培養を実施する。前記本培養に使用する培地としては、例えば、前記表２に示す培地において、炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含むものを使用する。ガラクトースとグルコースの比率は、前述のとおりである。また、本培養においては、培地中に、化学物質等の被験物質を添加して行う。前記本培養の温度は、例えば、２８〜３０℃であり、前記本培養時間は、例えば、１０〜４８時間、好ましくは、１５〜３６時間、より好ましくは１８〜２４時間である。すなわち、前記培地にガラクトースとグルコースを添加することにより、本培養における前記形質転換酵母の増殖を促進させることができるので、短時間の本培養で、被験物質を高感度かつ高信頼性で分析可能である。また、本培養は、振とう培養でもよいし、静置培養でもよい。なお、前記被験物質が固体の場合には、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の形質転換酵母に対して毒性を示さない溶媒を用いて前記被験物質を溶解してから前記培地と混合することが好ましい。
【００６６】
つぎに、本培養後の前記形質転換酵母を、公知の手法により溶菌させる。この溶菌には、例えば、下記に示すような、Ｚバッファーに界面活性剤（サルコシル）を添加した溶菌液等が使用できる。
【００６７】
（溶菌液：Ｚバッファー）
成分 配合量（最終濃度）
Ｎａ２ＨＰＯ４ ６０ｍＭ
ＮａＨ２ＳＯ４ ４０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
ＫＣｌ １０ｍＭ
ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ） ２ｍＭ
サルコシル（注３） ０．２０％
（注３）Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ
【００６８】
そして、前記溶菌後の溶菌液を適量採取し、産生されたβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定する。β−ガラクトシダーゼの活性は、例えば、ＯＮＰＧ（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）やＣＰＲＧ（クロロフェノールレッドガラクトピラノシド）等の発色試薬を作用させ、その吸光度を測定すればよい。この測定において、予め、標準物質を用いて検量線を作成しておくことが好ましく、前記検量線は、被験物質の測定と同時に作成することが好ましい。さらに、測定に際しては、用量作用関係の範囲内に納まるように被験物質を適宜希釈することが好ましい。このような分析方法であれば、吸光度を測定するだけでよく、簡便かつ迅速に分析できる。
【００６９】
本発明の分析用キットは、本発明の分析方法を簡単に実施するためのキットであって、前述のように、培地、本発明の前記形質転換酵母および発色基質（発色試薬）を含むキットである。前記発色基質（発色試薬）としては、例えば、ＯＮＰＧやＣＰＲＧ等があげられる。さらに、本発明の分析キットは、検量線作成のための標準物質等を含んでいても良い。前記形質転換酵母は、凍結乾燥させて粉末状にしてもよい。
【００７０】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例および比較例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７１】
本実施例では、下記の手順によりヒトＡＲ遺伝子、ヒトＧＲ遺伝子、ヒトＲＸＲα、ヒトＥＲβ遺伝子およびヒトＴＲα遺伝子を組み込んだ五種類の形質転換酵母を作製した。
【００７２】
（１） レポータープラスミドの作製
酵母チトクロームＣ遺伝子のプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミド（ｐＹＴ−β；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２０、５６８−５７４）を準備した。ＧＲおよびＡＲに応答する配列としてＧＲＥを使用し、ＲＸＲαに応答する配列としてＤＲ１を使用し、ＥＲβに応答する配列としてＥＲＥを使用し、ＴＲαに応答する配列としてＩＲ０を使用した。ＧＲＥ、ＤＲ１、ＥＲＥもしくはＩＲ０を含む下記のリン酸化合成オリゴＤＮＡ（配列番号７、９、１１および１３）およびその相補鎖ＤＮＡ（配列番号８、１０、１２および１４）を作製した。これらのオリゴＤＮＡをアニーリングした。アニーリングは、９４℃で１分間を１サイクルで実施した。アニーリング後、ＧＲＥは、ｐＹＴ−βのＢｇｌ ＩＩサイトに挿入した。ＤＲ１は、ｐＹＴ−βのＳｐｅＩサイトに挿入した。ＥＲＥは、ｐＹＴ−βのＳｐｅＩ−ＳａｌＩサイトに挿入した。ＩＲ０は、ｐＹＴ−βのＳｐｅＩサイトに挿入した。ＧＲＥが連続して８個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＢｇｌ ＩＩサイトに挿入した。同様に、ＤＲ１が連続して４個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＳｐｅＩサイトに挿入した。ＥＲＥが１個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＳｐｅＩ−ＳａｌＩサイトに挿入した。ＩＲ０が連続して５個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＳｐｅＩサイトに挿入した。そして、ＧＲＥが連続して８個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−βＧＲＥｃｓ８とし、ＤＲ１が４個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−βＤＲ１×４とし、ＥＲＥが１個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−βＥＲＥ×１とし、ＩＲ０が５個挿入されたプラスミドをｐＹＴ−βＩＲ０×５とした。
【００７３】
（ＧＲＥ）
ＧＲＥｃｓｆＢｇ：５´−gatctttgagaacaaactgttcttaaat−３´（配列番号７）
ＧＲＥｃｓｒＢｃ：３´−aaactcttgtttgacaagaatttactag−５´（配列番号８）
【００７４】
（ＤＲ１）
ＲＸＲＥ−ＤＲ１Ｎｈ：５´−ctagcaggtcagaggtcagatgct−３´（配列番号９）
ＲＸＲＥ−ＤＲ１Ｘｂ：３´−gtccagtctccagtctacgagatc−５´（配列番号１０）
【００７５】
（ＥＲＥ）
ＥＲＥ−ＳｐｅＩ：５´−ctagttagcaggtcacagtgacctacgcg−３´（配列番号１１）
ＥＲＥ−ＳａｌＩ：３´−aatcgtccagtgtcactggatgcgcagct−５´（配列番号１２）
【００７６】
（ＩＲ０）
ＩＲ０ＸｂａＦ：５´−ctagatctcaggtcatgacctttcatcca−３´（配列番号１３）
ＩＲ０ＳｐｅＲ：３´−tagagtccagtactggaaagtaggtgatc−５´（配列番号１４）
【００７７】
（２） 動物核内受容体発現プラスミドの作製
ＧＲ、ＡＲ、ＲＸＲα、ＥＲβ、ＴＲαの各ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をヒト精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社製）よりｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法（ＰＣＲ法）にて増幅した。用いたプライマー（配列番号１５〜２４）及びＰＣＲの条件を以下に示す。
【００７８】
（ＧＲ）
ＧＲｆＲｂＢｍ：５´−tcgaggatccaacaaaatggactccaaagaatcattaact−３´（配列番号１５）
ＧＲｒＸｈ：５´−attcttctcgaggcagtcacttttgatgaaac−３´（配列番号１６）
【００７９】
（ＡＲ）
ＡＲｆＲｂＢｍ：５´−tcgaggatccaacaaaatggaagtgcagttagggctggg−３´（配列番号１７）
ＡＲｒＸｈ：５´−agggggctcgagctggggtggggaaatagg−３´（配列番号１８）
【００８０】
（ＲＸＲα）
ＲＸＲａＲｂＫｐｎＦ：５´−aaaggggtacctcaaaaatggacaccaaacatttcctgcc−３´（配列番号１９）
ＲＸＲａＥｃｒ：５´−cttaagaattctaagtcatttggtgcggc−３´（配列番号２０）
【００８１】
（ＥＲβ）
ＥＲｂｅｔａｆＸｂ：５´−gcctcttctagaaaggtgttttctcagc−３´（配列番号２１）
ＥＲｂｅｔａｒＨｄ：５´−acgcttaagcttgtgacctctgtgggcc−３´（配列番号２２）
【００８２】
（ＴＲα）
ＴＲａＲｂＳｐＦ:５´−gggcactagtaacaaaatggaacagaagccaagca−３´（配列番号２３）
ＴＲａＨｄＲ:５´−ggccaagcttgctttagacttcctgatcctcaaag−３´（配列番号２４）
【００８３】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭ ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ｃＤＮＡ １μＬ、５％ ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００８４】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５８℃で２０秒、６８℃で３分のサイクルを４０サイクル実施した。
【００８５】
つぎに、核内受容体ｃＤＮＡを増幅後、制限酵素にて切断した。この切断したｃＤＮＡを、両方向プロモーター領域Ｇａｌ１、１０を持つプラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０（ＧｅｎＢａｎｋ、ｐＭＣ２６２）の前記両プロモーターの下流に位置する部位に挿入し、核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターが介在したプラスミドＹＥｐＬａｃを得た。なお、クローニングには大腸菌ＨＢ１０１株を使用した。ｃＤＮＡおよびＹＥｐＬａｃの切断に用いた制限酵素を以下に示す。作製したプラスミドをそれぞれＹｅｐＬａｃＧＲ、ＹｅｐＬａｃＡＲ、ＹｅｐＬａｃＲＸＲα、ＹｅｐＬａｃＥＲβ、ＹｅｐＬａｃＴＲαとした。
【００８６】
（制限酵素）
挿入したｃＤＮＡ ｃＤＮＡ切断用制限酵素 ＹＥｐＬａｃ切断用制限酵素
ＧＲ ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
ＡＲ ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
ＲＸＲα ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ
ＥＲβ ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ
ＴＲα ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ
【００８７】
つぎに、これらのプラスミドからｇａｌ１およびｇａｌ１０プロモーター領域および受容体ｃＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにて切り出し、ｐＡＵＲ１０１のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトの間に挿入した。作製したプラスミドを、それぞれｐＡＵＲ１０１ＧＲ、ｐＡＵＲ１０１ＡＲ、ｐＡＵＲ１０１ＲＸＲα、ｐＡＵＲ１０１ＥＲβ、ｐＡＵＲ１０１ＴＲαとした。
【００８８】
（３） ＳＲＣ１プラスミドの作製
ＳＲＣ１ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ヒト精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社製）よりＰＣＲ法を用いて増幅した。用いたプライマー（配列番号２５および２６）及びＰＣＲの条件を以下に示す。
【００８９】
ｈＳＲＣ１ｂｇＦ：５´−tggaactcaagatttgaccatatc−３´（配列番号２５）
ｈＳＲＣ１ｘｈＲ：５´−gagcattcctctagtctgtagtc−３´（配列番号２６）
【００９０】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭ ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ｃＤＮＡ １μＬ、５％ ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００９１】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５６℃で２０秒、６８℃で５分のサイクルを４０サイクル実施した。
【００９２】
増幅したＳＲＣ−１ ｃＤＮＡを精製し、さらに以下のプライマー（配列番号２７および２８）を用いたＰＣＲ法にてｃＤＮＡに制限酵素サイトを付加した。増幅したｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断後、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕベクターのｇａｌ１プロモーター下流に挿入した。本プラスミドＤＮＡをｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１とした。
【００９３】
ＳＲＣ−１ｅＦｂｇ２：５´−caaagaagatctcccaggtgtgaag−３´（配列番号２７）
ＳＲＣ−１ｅＲｘｈ２：５´−agggccctcgagactctagtctgtag−３´（配列番号２８）
【００９４】
（ＰＣＲ条件：１×反応バッファー）
１μＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭ ｄＮＴＰ、プライマー各０．３μＭ、ＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ） １μＬ、５％ ＤＭＳＯ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）１ｕｎｉｔを反応液５０μＬ中に含む。
【００９５】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で４０秒、５６℃で２０秒、６８℃で５分のサイクルを２０サイクル実施した。
【００９６】
（４） 形質転換酵母の作製
前記ｐＡＵＲ１０１ＧＲ、ｐＡＵＲ１０１ＡＲ、ｐＡＵＲ１０１ＲＸＲα、ｐＡＵＲ１０１ＥＲβ、ｐＡＵＲ１０１ＴＲαを、制限酵素ＥｃｏＯ６５Ｉで処理して直鎖状とし、以下のように酢酸リチウム法にて宿主となる酵母へ導入し、さらに、染色体への組込みを行った。宿主株として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３ａ株を使用した。
【００９７】
まず、前記宿主となる酵母を、３０℃でＯＤ６６０が１〜２になるまでＹＰＤ培地中で培養し、ソリューションＡ（０．１Ｍ Ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ いずれも最終濃度）で洗浄後、ＯＤ６６０＝１５０となるようにソリューションＡに再懸濁し、１．５ｍＬマイクロチューブに１００μＬずつ分注して、３０℃で１時間インキュベートした。その後、直鎖状の前記の各ｐＡＵＲ１０１ベクター ５μｇと、キャリアーＤＮＡ（商品名：ＳＡＬＭＯＮ ＴＥＳＴＥＳ ＤＮＡ ｆｏｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社製）１５０μｇ（合計２０μＬ）を加え、さらに、ソリューションＢ（ソリューションＡ１００ｍＬにポリエチレングリコール４０００を溶解したもの）を８５０μＬ添加し、緩やかに混合した。
【００９８】
つぎに、前記混合液を３０℃で３０分インキュベートして４２℃で１５分熱処理した後、さらに、１０分室温に放置してから、５０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離で集菌し、それらを５〜１０ｍＬのＹＰＤ培地に懸濁し、３０℃で一晩培養した。そして、培養後集菌して洗浄した酵母を、０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ（０．５ｇ／ｍＬ）を含むＹＰＤ選択プレートに１００μＬずつ塗布して培養した。そして、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性株をＧａｌ１プロモーターとＡＲなどのｃＤＮＡ領域が染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。
【００９９】
つぎに、前記形質転換酵母に、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１プラスミド ＤＮＡを導入した。このときの形質転換酵母選択培地は、後述する前培養培地にトリプトファンを１００ｍｇ添加したものである。
【０１００】
つぎに、前記形質転換酵母に、酢酸リチウム法にてｐＹＴβＧＲＥｃｓ８、ｐＹＴβＤＲ１×４、ｐＹＴβＥＲＥ×１もしくはｐＹＴβＩＲ０×５プラスミドＤＮＡを導入した。このときの形質転換酵母選択培地は、後述する前培養培地である。以上の操作により、レポーター遺伝子としてｐＹＴβＧＲＥｃｓ８、ｐＹＴβＤＲ１×４、ｐＹＴβＥＲＥ×１もしくはｐＹＴβＩＲ０×５、およびｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１ＤＮＡをプラスミドとして保持し、ゲノム中よりヒトＧＲ、ＡＲ、ＲＸＲα、ＥＲβ、ＴＲαを発現する酵母菌株を作製した。
【実施例２】
【０１０１】
本実施例では、前記実施例１で作製した形質転換酵母を用いて、リガンドの分析を行った。なお、比較例として、ＳＲＣ１遺伝子を導入しなかった他は、実施例１と同様にして作製した形質転換酵母を用いて、同様にリガンドの分析を行った。
【０１０２】
（形質転換酵母の前培養）
前記形質転換酵母を、下記に示す前培養用の培地にて２４時間前培養を行った。培養の結果、濁度（Ａｂｓ５９５ｎｍ）が１．０程度に形質転換酵母が増殖した。
【０１０３】
（前培養の培地）
成分 配合量
ドロップアウトパウダー（前記注１） １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、前記注２） １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．０ｇ
ウラシル ０．０２ｇ
グルコース ２０．０ｇ
水 １Ｌ
【０１０４】
（形質転換酵母の本培養）
９６穴プレートを用い、１ウエルあたり以下の構成で、リガンド溶液、前培養した菌体液および本培養培地を混合し、３０℃で１８時間、静置培養を行った。
【０１０５】
リガンド溶液：１μＬ（ＧＲ：デキサメサゾン、ＡＲ：テストステロン、ＲＸＲα：９−ｃｉｓレチノイン酸、ＥＲβ：１７−β−エストラジオール、ＴＲα：チロキシン、それぞれＤＭＳＯに溶解）
菌体液（Ｏ．Ｄ．１〜１．５）：５μＬ
本培養培地：下記組成の培地１００μＬ
【０１０６】
（本培養培地組成）
成分 配合量
ドロップアウトパウダー（前記注１） １．３ｇ
窒素源（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ、前記注２） １．７ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．０ｇ
ウラシル ０．０２ｇ
グルコース ２．０ｇ
ガラクトース １８．０ｇ
水 １Ｌ
【０１０７】
（β−ガラクトシダーゼ活性の測定）
前記本培養の後、各ウエルから培養液を５μＬずつ採取し、新たな９６穴プレートの各ウエルに移し、下記の測定試薬を１００μＬ加えた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、前記反応液のβ−ガラクトシダーゼ活性および菌体量を測定した。前記β−ガラクトシダーゼ活性は、ｏ−ニトロフェノールの生成量から算出するため、４０５ｎｍにおける反応液の吸光度を測定した。また、前記菌体量は、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。分析結果は、４０５ｎｍの吸光度／５９５ｎｍの吸光度の比を算出し、リガンド非添加（溶媒であるＤＭＳＯのみを添加）での値を１とした誘導率で示した。これらの結果を、下記の表３、図１および図２に示す。図１において、（Ａ）が、ＧＲ導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、（Ｂ）が、ＡＲ導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、（Ｃ）が、ＲＸＲα導入形質転換酵母の結果を示すグラフである。また、図２において、（Ｄ）が、ＥＲβ導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、（Ｅ）が、ＴＲα導入形質転換酵母の結果を示すグラフである。各グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（ｌｏｇ Ｍ）であり、縦軸は、前記誘導率である。また、各グラフにおいて、実線で示したＳＲＣ＋は、ＳＲＣ導入酵母の結果であり、点線で示したＳＲＣ−は、ＳＲＣ非導入酵母の結果である。
【０１０８】
（測定試薬組成）
成分 配合量（最終濃度）
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５、注４） １００ｍＭ
ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
ＫＣｌ １０ｍＭ
ジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ） ２ｍＭ
サルコシル（前記注３） ０．４％
ＯＮＰＧ １ｍｇ／ｍＬ
（注４）６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および４０ｍＭ ＮａＨ２ＳＯ４を用いて調製
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
前記表３および図１に示すように、まず、ＧＲ導入酵母において、ＳＲＣ−１導入前の酵母では検出が可能なデキサメサゾン濃度は１００ｎＭ以上であるが、ＳＲＣ−１を導入した酵母ではデキサメサゾン濃度１０ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＥＣ５０は、ＳＲＣ−１導入前の酵母では３．５μＭ、導入後に１．８μＭであり、ＳＲＣ−１の導入により、１／２に低下した。１μＭ以上の濃度では、ＳＲＣ−１導入酵母は、ＳＲＣ−１非導入酵母に比べて３〜４倍程度高いβ−ガラクトシダーゼ活性が認められた。
【０１１１】
ＡＲ挿入酵母では、ＳＲＣ−１導入前の酵母では検出が可能なテストステロン濃度は１００ｎＭであるが、ＳＲＣ−１を導入した酵母ではテストステロン濃度１ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＥＣ５０については、ＳＲＣ−１の導入により、１／２０程度の低下が認められた。
【０１１２】
ＲＸＲα導入酵母においては検出が可能な９−ｃｉｓレチノイン酸濃度は１００ｎＭであるが、ＳＲＣ−１を導入した酵母では９−ｃｉｓレチノイン濃度１０ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＥＣ５０は、ＳＲＣ−１導入前の酵母では１４５．４ｎＭ、導入後には７８．２ｎＭとなり、ＳＲＣ−１の導入により約１／２に低下した。
【０１１３】
また、前記表３および図２に示すように、ＥＲβ導入酵母では、ＳＲＣ−１導入前の酵母には、リガンド応答性が認められなかった。ＳＲＣ−１を導入した酵母では１７−β−エストラジオール濃度１ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＥＲβ導入酵母においては、ＳＲＣ−１の導入により始めて、リガンド添加による誘導が認められた。
【０１１４】
ＴＲα導入酵母では、ＳＲＣ−１導入前の酵母には、リガンド応答性が認められなかった。ＳＲＣ−１を導入した酵母ではチロキシン濃度１０ｎＭでβ−ガラクトシダーゼの誘導が認められた。ＴＲα導入酵母においては、ＥＲβ導入酵母と同様に、ＳＲＣ−１の導入により始めて、リガンド添加による誘導が認められた。
【０１１５】
以上の結果は、本発明の形質転換酵母を用いることにより、リガンドを高感度で分析できることを実証しているといえる。さらに、例えば、前記非特許文献１のＴａｂｌｅ２においてもＡＲをヒト由来細胞に導入してテストステロン（Ｔ）を分析しているが、ＥＣ５０の値は、本発明の前記実施例２（表１）の値より大きい。このことから、本発明の形質転換酵母を用いた分析方法は、動物細胞を用いた分析方法と同等もしくはそれ以上の感度を有するといえる。しかも、本発明の形質転換酵母を用いた分析方法は、操作が簡単であり、短時間で分析ができ、低コストであるという利点もある。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
以上のように、本発明の形質転換酵母を用いれば、高検出感度で動物核内受容体のリガンドの分析が可能となる。したがって、本発明の分析方法は、化学物質やタンパク質等のリガンドの分析の分野において有用な方法であり、その用途は制限されず広い。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１の（Ａ）、（Ｂ）および(Ｃ)は、本発明の一実施例におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２の（Ｄ）および（Ｅ）は、本発明の一実施例におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含む形質転換酵母。
【請求項２】
前記動物核内受容体が、ヒト核内受容体であり、前記動物転写共役因子がヒト転写共役因子である請求項１記載の形質転換酵母。
【請求項３】
前記ヒト転写共役因子遺伝子が、ヒトＳＲＣ１遺伝子である請求項２記載の形質転換酵母。
【請求項４】
前記動物核内受容体遺伝子を常染色体上に有し、
前記レポーター遺伝子を第１のプラスミドに有し、
前記動物転写共役因子遺伝子を第２のプラスミドに有し、
前記第１のプラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた動物核内受容体応答配列を含む請求項１から３のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項１から４のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項６】
前記形質転換酵母が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１から５のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項７】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドの分析に使用される請求項１から６のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項８】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、請求項１から７のいずれか一項に記載の形質転換酵母を使用することを特徴とする方法。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合が、０を超え６０重量％以下の範囲である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換酵母が、予め、グリセロール存在下で保存されていた酵母である請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換酵母が、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母である請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析キットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）請求項１から７のいずれか一項に記載の形質転換酵母と、
（ｃ）発色基質と
を備える分析キット。
【請求項１４】
前記培地が、グルコースおよびガラクトースを含む培地である請求項１３記載の分析キット。
【請求項１】
動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含む形質転換酵母。
【請求項２】
前記動物核内受容体が、ヒト核内受容体であり、前記動物転写共役因子がヒト転写共役因子である請求項１記載の形質転換酵母。
【請求項３】
前記ヒト転写共役因子遺伝子が、ヒトＳＲＣ１遺伝子である請求項２記載の形質転換酵母。
【請求項４】
前記動物核内受容体遺伝子を常染色体上に有し、
前記レポーター遺伝子を第１のプラスミドに有し、
前記動物転写共役因子遺伝子を第２のプラスミドに有し、
前記第１のプラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた動物核内受容体応答配列を含む請求項１から３のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項１から４のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項６】
前記形質転換酵母が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１から５のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項７】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドの分析に使用される請求項１から６のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項８】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、請求項１から７のいずれか一項に記載の形質転換酵母を使用することを特徴とする方法。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合が、０を超え６０重量％以下の範囲である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換酵母が、予め、グリセロール存在下で保存されていた酵母である請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換酵母が、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母である請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析キットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）請求項１から７のいずれか一項に記載の形質転換酵母と、
（ｃ）発色基質と
を備える分析キット。
【請求項１４】
前記培地が、グルコースおよびガラクトースを含む培地である請求項１３記載の分析キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２６３９５６（Ｐ２００８−２６３９５６Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１９６２（Ｐ２００８−５１９６２）
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【出願人】（０００２１４２７２）長瀬産業株式会社 (137)
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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