微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法
【課題】撮像素子の露光時間を短縮でき、低倍率のレンズの使用や、観察対象の速い変化の撮影が可能な微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法を提供する。
【解決手段】対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂと撮像素子１ｃとからなる結像光学系１を有し、結像光学系１を介して観察対象１０から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光観察顕微鏡であって、第２の対物レンズ２ａと第２の結像レンズ２ｂと観察対象１０と共役な位置に配置されるミラー２ｃとを有する光戻し用光学系２を、観察対象１０に対して結像光学系１の反対側に有する。結像光学系１を用いて、観察対象１０から第１の対物レンズ１ａに入射する所定の微弱光を取得するとともに、光戻し用光学系２を用いて、観察対象１０から結像光学系１とは異なる側に発せられた所定の微弱光を観察対象１０に戻し、観察対象１０から第１の対物レンズ１ａに入射させる。
【解決手段】対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂと撮像素子１ｃとからなる結像光学系１を有し、結像光学系１を介して観察対象１０から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光観察顕微鏡であって、第２の対物レンズ２ａと第２の結像レンズ２ｂと観察対象１０と共役な位置に配置されるミラー２ｃとを有する光戻し用光学系２を、観察対象１０に対して結像光学系１の反対側に有する。結像光学系１を用いて、観察対象１０から第１の対物レンズ１ａに入射する所定の微弱光を取得するとともに、光戻し用光学系２を用いて、観察対象１０から結像光学系１とは異なる側に発せられた所定の微弱光を観察対象１０に戻し、観察対象１０から第１の対物レンズ１ａに入射させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察対象から発せられる微弱光を取得して観察する微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、微弱光の観察として、例えば、発光顕微鏡を用いた細胞や組織の微細構造レベルの変化の長時間観察が行われている。
発光顕微鏡は、例えば、図５に示すように、対物レンズ５１ａと結像レンズ５１ｂと撮像素子５１ｃからなる撮像光学系５１を有する。図５中、６０は観察対象としての細胞・組織などのサンプル、６０ａは観察対象６０における発光部、６１は図示しないステージ上に載置された、観察対象６０を収容するシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート等の容器、６０ａ’は撮像素子５１で撮像される発光部６０ａ’の像である。そして、発光顕微鏡を用いた観察では、発行試薬等との化学反応によって観察対象から発せられる所定波長の微弱光を所定時間（例えば、１５分等）露光し、これを数十回繰り返すことで、組織や細胞の変化を捉える。
従来、この種の発光顕微鏡としては、例えば、次の特許文献１，２に記載のものが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１０８１５４号公報
【特許文献２】ＷＯ０７／０７４９２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、発光顕微鏡を用いて観察対象からの発光像を画像化する場合においては、微弱な発光の強度を補うために、撮像素子の露光時間を長くして受光される光量を増加させるといった手法が用いられる。また、微弱な発光像を極力明るく取得するために、対物レンズ及び結像レンズには、高ＮＡのものが用いられる。
【０００５】
ここで、対物レンズのＮＡが大きいほど、明るい発光像が得られる。
しかし、低倍率の対物レンズで広い範囲を観察する場合、ＮＡを高くすることは困難である。また、高倍率の対物レンズを用いてもＮＡには限界がある。
このため、従来の発光顕微鏡では、上記のように撮像素子の露光時間を長くすることで、明るさ不足を補わざるを得ない。しかし、撮像素子の露光時間が長いと、観察対象の速い変化を撮影することが難しい。
【０００６】
ところで、特許文献２には、観察対象に対して、発光画像を撮像するユニットと蛍光画像を撮像するユニットとが対向配置された構成が開示されている。
ここで、本件出願人は、特許文献２に開示の上記構成を応用し、観察対象に対して、２つの発光画像を撮像するユニットを対向配置し、２つのユニットで取得した発光画像を合成することで発光強度を補うことを着想した。
【０００７】
しかし、２つの発光画像を撮像するユニットを対向配置しても、夫々のユニットで撮像される発光強度が弱く、夫々のユニットにおける撮像素子の露光時間を短くすることができないため、観察対象の速い変化を撮影することが難しいという問題を解消できない。
【０００８】
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、撮像素子の露光時間を短縮でき、低倍率のレンズの使用や、観察対象の速い変化の撮影が可能な微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明による微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法は、対物レンズと結像レンズと撮像素子とからなる結像光学系を有し、前記結像光学系を介して観察対象から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光観察顕微鏡であって、第２の対物レンズと第２の結像レンズと前記観察対象と共役な位置に配置されるミラーとを有する光戻し用光学系を、前記観察対象に対して前記結像光学系の反対側に有することを特徴としている。
【００１０】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記ミラーが、可変形状ミラーからなるのが好ましい。
【００１１】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、さらに、前記光戻し用光学系の光路中に、前記所定の微弱光の波長を透過させ、前記所定の微弱光の波長以外の波長を反射する光路分割手段を備えるとともに、前記所定の微弱光の波長とは異なる波長からなる照明光を前記光路分割部材に向けて出射する照明光学系を有するのが好ましい。
【００１２】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記光路分割手段が、前記第２の対物レンズと前記第２の結像レンズとの間に備えられ、前記照明光学系が、前記光戻し用光学系の側方に備えられているのが好ましい。
【００１３】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記光路分割手段が、前記ミラーからなり、前記照明光学系が、前記ミラーに対して前記第２の結像レンズとは反対側に備えられているのが好ましい。
【００１４】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、さらに、前記結像光学系が、前記照明光の波長を遮光し、前記所定の微弱光の波長を透過させる波長選択素子を挿脱可能に備えるのが好ましい。
【００１５】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、収差補正手段を前記第２の対物レンズの瞳位置に備えるのが好ましい。
【００１６】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記収差補正手段が、補正環であるのが好ましい。
【００１７】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記収差補正手段が、位相変調器であるのが好ましい。
【００１８】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記所定の微弱光が、化学反応により前記観察対象から発せられる発光であるのが好ましい。
【００１９】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記所定の微弱光が、励起波長の照射により前記観察対象から発せられる蛍光であり、前記照明光が、前記観察対象を励起する励起波長からなるのが好ましい。
【００２０】
また、本発明による微弱光取得方法は、観察対象から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光取得方法であって、第１の対物レンズと第１の結像レンズと撮像素子とからなる結像光学系を用いて、前記観察対象から前記第１の対物レンズに入射する前記所定の微弱光を取得するとともに、第２の対物レンズと第２の結像レンズと前記観察対象と共役な位置に配置されるミラーとを有する光戻し用光学系を用いて、該観察対象から前記結像光学系とは異なる側に発せられた前記所定の微弱光を該観察対象に戻し、該観察対象から前記第１の対物レンズに入射させることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、撮像素子の露光時間を短縮でき、低倍率のレンズの使用や、観察対象の速い変化の撮影が可能な微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
【図２】本発明の第２実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
【図３】本発明の第３実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
【図４】本発明の第４実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
【図５】従来の発光顕微鏡の一構成例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。
第１実施形態
図１は本発明の第１実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、結像光学系１と、光戻し用光学系２を有する。
結像光学系１は、対物レンズ１ａと、結像レンズ１ｂと、撮像素子１ｃとで構成されている。
光戻し用光学系２は、第２の対物レンズ２ａと、第２の結像レンズ２ｂと、平面ミラー２ｃとで構成され、観察対象１０に対して結像光学系１の反対側に設けられている。
ミラー２ｃは、観察対象１０と共役な位置に配置されている。
観察対象１０には、発光試薬等との化学反応によって所定の微弱光を発光する発光部１０ａを含んだ細胞・組織等であって、所定の微弱光の波長に対する光透過性のあるサンプルを用いている。なお、観察対象１０は、シャーレ、スライドガラス、マイクロプレート等の容器１１に収容されている。容器１１は、図示しないステージ上に載置されている。
また、対物レンズ１ａ、第２の対物レンズ２ａは、夫々ステージ１２との相対的距離を変動させることによって、観察対象１０に対してピントを調整することができるようになっている。
【００２４】
このように構成された第１実施形態の微弱光観察顕微鏡では、観察対象１０の発光部１０ａから結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。図１中、１０ａ’は撮像素子１ｃの撮像面に結像した発光部１０の像である。
一方、観察対象１０の発光部１０ａから光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａ、第２の結像レンズ２ｂを経て、ミラー２ｃの面に結像し、ミラー２ｃで反射され、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻される。図１中、１０ａ”はミラー２ｃの面に結像した発光部１０ａの像である。観察対象１０に戻された所定の微弱光は、さらに、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過し、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
これにより、撮像素子１ｃには、従来の微弱光観察顕微鏡と比べて約２倍の光量の所定の微弱光が入射することになり、撮像素子１ｃの露光時間を約半分に短縮できる。
その結果、ＮＡを大きくできない低倍率の対物レンズを用いても、発光像を撮像することが可能となり、また、観察対象（における発光部）の速い変化を撮影することができるようになる。
【００２５】
第２実施形態
図２は本発明の第２実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。なお、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と同じ構成部材については、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、光戻し用光学系２において観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーが、可変形状ミラー２ｃ’で構成されている。その他の構成は、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と略同じである。
【００２６】
光戻し用光学系２における観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーとして平面ミラー２ｃを用いた構成においては、観察対象１０の厚みが一定でない場合、観察対象１０の一部の発光部１０ａから結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、平面ミラー２ｃを前後する位置に結像する。そして、平面ミラー２ｃで反射された光が、観察対象１０における発光部１０ａの発光点に戻らず、発光点を前後する位置に結像してしまう。その光が、結像光学系側に向けて透過し、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像しない状態で入射する。その結果、撮像素子１で撮像した像がボケてしまう。
しかるに、第２実施形態の微弱光観察顕微鏡によれば、可変形状ミラー２ｃ’の反射面を観察対象１０の厚み又は光路長に合せて変形させることで、可変形状ミラー２ｃ’で反射された所定の微弱光を、観察対象１０の発光点の位置に正確に戻すことができる。このため、観察対象１０の厚みが一定でない場合であっても、像のボケを防止することができる。
その他の作用効果は、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と略同じである。
【００２７】
第３実施形態
図３は本発明の第３実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。なお、第２実施形態の微弱光観察顕微鏡と同じ構成部材については、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、第２実施形態の構成に加えて、さらに、光路分割部材３と、照明光学系４を有している。
光路分割部材３は、所定の微弱光の波長を透過し、所定の微弱光の波長以外の波長を反射する光学特性を持つダイクロイックミラーで構成され、第２の対物レンズ２ａと第２の結像レンズ２ｂとの間に配置されている。
照明光学系４は、所定の微弱光の波長とは異なる波長からなる照明光を光路分割部材３に向けて出射するように構成され、光戻し用光学系２の側方に設けられている。
図３の例では、照明光学系４は、光源４ａと、光源からの光を平行光束に変換するコリメートレンズ４ｂと、バンドパスフィルタ４ｃを備えている。光源４ａは、通常の白色光を出射する。バンドパスフィルタ４ｃは、所定の微弱光波長を遮光し、所定の微弱光波長以外の波長を透過する光学特性を持っている。また、バンドパスフィルタ４ｃは、照明光学系４の光路中に挿脱可能に設けられている。
【００２８】
また、結像光学系１は、さらに、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間に、照明光カットフィルタ１ｄを挿脱可能に備えている。照明光カットフィルタ１ｄは、照明光の波長を遮光し、所定の微弱光の波長を透過する特性を持っている。
その他の構成は、第２実施形態の微弱光観察顕微鏡と略同じである。
【００２９】
このように構成された第３実施形態の微弱光観察顕微鏡においては、微弱光観察及び通常光による透過照明観察を次の２つの方法で切替えて行うことができる。
第１の方法は、照明光カットフィルタ１ｄを、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間に挿入し、かつ、照明光学系４の光源４ａをＯＮにした状態で、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間において照明光カットフィルタ１ｄを挿脱する方法である。
微弱光観察を行う場合には、照明光カットフィルタ１ｄを挿入する。観察対象１０から光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａを経て、光路分割部材３を透過し、第２の結像レンズ２ｂを経て、ミラー２ｃの面に結像し、ミラー２ｃで反射され、第２の結像レンズ２ｂを経て、光路分割部材３を透過し、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻る。また、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過した所定の微弱光及び、観察対象１０から結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａを経て、照明光カットフィルタ１ｄを透過し、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。なお、照明光学系４からの照明光は、光路分割部材３で反射されて、第２の対物レンズ２ａ、観察対象１０に入射する。観察対象１０を透過した光は、対物レンズ１ａを経て、照明光カットフィルタ１ｄに入射するが、照明光カットフィルタ１ｄで遮光される。
一方、通常光による透過照明観察を行う場合には、照明光カットフィルタ１ｄを抜き出す。照明光学系４からの照明光は、光路分割部材３で反射され、対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に入射する。観察対象１０を透過した光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
【００３０】
第２の方法は、照明光カットフィルタ１ｄを、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間から抜き出した状態で、照明光学系４の光源４ａのＯＮ／ＯＦＦを切り替える方法である。
微弱光観察を行う場合には、照明光学系４の光源４ａをＯＦＦにする。観察対象１０から光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａを経て、光路分割部材３を透過し、第２の結像レンズ２ｂを経て、ミラー２ｃの面に結像し、ミラー２ｃで反射され、第２の結像レンズ２ｂを経て、光路分割部材３を透過し、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻る。また、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過した所定の微弱光及び、観察対象１０から結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
一方、通常光による透過照明観察を行う場合には、照明光学系４の光源４ａをＯＮにする。照明光学系４からの照明光は、第１の方法と同様の経路を辿り、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
【００３１】
第３実施形態の微弱光観察顕微鏡によれば、微弱光観察と透過照明観察とを切替えることができる上、第１及び第２実施形態の微弱光観察顕微鏡と同様の効果が得られる。即ち、従来の微弱光観察顕微鏡と比べて約２倍の光量の所定の微弱光が入射することになり、撮像素子１ｃの露光時間を約半分に短縮でき、ＮＡを大きくできない低倍率の対物レンズを用いても、発光像を撮像することが可能となり、また、観察対象（における発光部）の速い変化を撮影することができるようになり、しかも、可変形状ミラー２ｃ’の反射面を観察対象１０の厚み又は光路長に合せて変形させることで、可変形状ミラー２ｃ’で反射された所定の微弱光を、観察対象１０の発光点の位置に正確に戻すことができ、観察対象１０の厚みが一定でない場合であっても、像のボケを防止することができる。
【００３２】
なお、図３の例では、所定の微弱波長は、発光試薬等との化学反応によって観察対象から発せられる発光波長として説明したが、所定の微弱波長は、励起波長の照射により観察対象から発せられる蛍光波長であってもよい。
その場合には、バンドパスフィルタ４ｃは、所定の蛍光波長を遮光し、所定の励起光波長を透過する光学特性を持つものを用いればよい。
また、第３実施形態においては、光戻し用光学系２において観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーを、可変形状ミラー２ｃ’で構成したが、平面ミラー２ｃで構成してもよい。
【００３３】
第４実施形態
図４は本発明の第４実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。なお、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と同じ構成部材については、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、光戻し用光学系２における観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーが、所定の微弱光波長を反射し、所定の微弱光波長以外の波長を透過する特性を持つ光路分割部材としての機能を併せ持つ、ダイクロイックミラー２ｃ”で構成されている。
また、本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、第１実施形態の構成に加えて、さらに、ダイクロイックミラー２ｃ”に対して第２の結像レンズ２ｂとは反対側に、照明光学系４’を有している。
図４の例では、照明光学系４’は、光源４ａ’と、光源４ａ’からの光をダイクロイックミラー２ｃ”に集光させる集光レンズ４ｂ’を備えている。光源４ａ’は、所定の微弱光波長とは異なる波長からなる照明光を出射する。なお、照明光学系４’における光源４ａ’の代わりに、図３の例と同様の通常の白色光を出射する光源４ａを用いるとともに、バンドパスフィルタ４ｃを備えてもよい。
【００３４】
また、結像光学系１は、さらに、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間に、照明光カットフィルタ１ｄを挿脱可能に備えている。照明光カットフィルタ１ｄは、照明光の波長を遮光し、所定の微弱光の波長を透過する特性を持っている。
その他の構成は、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と略同じである。
【００３５】
このように構成された第４実施形態の微弱光観察顕微鏡においては、微弱光観察及び通常光による透過照明観察を次の２つの方法で切替えて行うことができる。
第１の方法は、照明光カットフィルタ１ｄを、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間に挿入し、かつ、照明光学系４’の光源４ａ’をＯＮにした状態で、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間において照明光カットフィルタ１ｄを挿脱する方法である。
微弱光観察を行う場合には、照明光カットフィルタ１ｄを挿入する。観察対象１０から光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａ、第２の結像レンズ２ｂを経て、ダイクロイックミラー２ｃ”の面に結像し、ダイクロイックミラー２ｃ”で反射され、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻る。また、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過した所定の微弱光及び、観察対象１０から結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａを経て、照明光カットフィルタ１ｄを透過し、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。なお、照明光学系４’からの照明光は、ダイクロイックミラー２ｃ”を透過し、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａ、観察対象１０、対物レンズ１ａを経て、照明光カットフィルタ１ｄに入射するが、照明光カットフィルタ１ｄで遮光される。
一方、通常光による透過照明観察を行う場合には、照明光カットフィルタ１ｄを抜き出す。照明光学系４’からの光は、ダイクロイックミラー２ｃ”を透過し、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａ、観察対象１０、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
【００３６】
第２の方法は、照明光カットフィルタ１ｄを、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間から抜き出した状態で、照明光学系４’の光源４ａ’のＯＮ／ＯＦＦを切り替える方法である。
微弱光観察を行う場合には、照明光学系４’の光源４ａ’をＯＦＦにする。観察対象１０から光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａ、第２の結像レンズ２ｂを経て、ダイクロイックミラー２ｃ”の面に結像し、ダイクロイックミラー２ｃ”で反射され、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻る。また、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過した所定の微弱光及び、観察対象１０から結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
一方、通常光による透過照明観察を行う場合には、照明光学系４’の光源４ａ’をＯＮにする。照明光学系４’からの照明光は、ダイクロイックミラー２ｃ”の面に集光し、ダイクロイックミラー２ｃ”を透過し、第２の結像レンズ、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に入射し、観察対象１０を透過した光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
【００３７】
第４実施形態の微弱光観察顕微鏡によれば、極めて少ない部材点数で微弱光観察と透過照明観察とを切替えることができる上、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と同様の効果が得られる。即ち、従来の微弱光観察顕微鏡と比べて約２倍の光量の所定の微弱光が入射することになり、撮像素子１ｃの露光時間を約半分に短縮でき、ＮＡを大きくできない低倍率の対物レンズを用いても、発光像を撮像することが可能となり、また、観察対象（における発光部）の速い変化を撮影することができるようになる。
【００３８】
なお、図４の例では、所定の微弱波長は、発光試薬等との化学反応によって観察対象から発せられる発光波長として説明したが、所定の微弱波長は、励起波長の照射により観察対象から発せられる蛍光波長であってもよい。
その場合には、光源４ａ’と集光レンズ４ｂ’との間に、所定の蛍光波長を遮光し、所定の励起光波長を透過する光学特性を持つバンドパスフィルタを挿脱可能に備えるとよい。
また、第４実施形態においては、光戻し用光学系２において観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーを、平面形状のダイクロイックミラー２ｃ”で構成したが、可変形状のダイクロイックミラーで構成してもよい。
そのようにすれば、可変形状ダイクロイックミラー２ｃ”の反射面を観察対象１０の厚み又は光路長に合せて変形させることで、可変形状ダイクロイックミラー２ｃ”で反射された所定の微弱光を、観察対象１０の発光点の位置に正確に戻すことができ、観察対象１０の厚みが一定でない場合であっても、像のボケを防止することができる。
【００３９】
以上、本発明の微弱光観察顕微鏡の実施形態について説明したが、本発明の微弱光観察顕微鏡は、これらの構成に限定されるものではない。
例えば、各実施形態における第２の対物レンズ２ａの瞳位置に、補正環や位相変調器などの収差補正手段を備えると好ましい。
観察対象１０を収容する容器１１が、シャーレやマイクロプレートの場合、容器１１中の液面が表面張力で曲がり、収差が発生しうる。第２の対物レンズ２ａの瞳位置に収差補正手段を備えれば、液面の曲がりによる収差を補正してミラー２ｃ（２ｃ’，２ｃ”）に結像することができる。
【００４０】
また、図１〜図４に示す各実施形態においては、ミラー２ｃ，２ｃ’，２ｃ”が観察対象１０と共役な位置に配置されるものであれば、光戻し用光学系２は、どのような倍率で構成してもよい。なお、微弱光の像を極力明るくするためには、第２の対物レンズ２ａには、ＮＡが対物レンズ１ａよりも大きいものを用いるのが好ましい。
【００４１】
また、図１〜図４の例では、光戻し用光学系２が、観察対象１０に対して、結像光学系１の反対側に備えたが、本発明の微弱光観察顕微鏡における光戻し用光学系２は、このような配置に限定されるものではない。
例えば、透明なキューブ状の容器に収容された観察対象に対し、観察対象の側方にも光戻し光学系２を設けてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法は、例えば、発光による細胞や組織の微細構造レベルの変化の長時間観察や、蛍光観察等、非常に微弱な光を発する観察対象を観察することが求められるあらゆる分野に有用である。
【符号の説明】
【００４３】
１ 結像光学系
１ａ 対物レンズ
１ｂ 結像レンズ
１ｃ 撮像素子
１ｄ 照明光カットフィルタ
２ 光戻し用光学系
２ａ 第２の対物レンズ
２ｂ 第２の結像レンズ
２ｃ （平面）ミラー
２ｃ’ 可変形状ミラー
２ｃ” ダイクロイックミラー
３ 光路分割部材
４、４’ 照明光学系
４ａ、４ａ’ 光源
４ｂ コリメートレンズ
４ｂ’ 集光レンズ
４ｃ バンドパスフィルタ
１０ 観察対象（サンプル）
１０ａ 発光部
１０ａ’、１０ａ” 発光部の像
１１ 容器
５１ 撮像光学系
５１ａ 対物レンズ
５１ｂ 結像レンズ
５１ｃ 撮像素子
６０ 観察対象（サンプル）
６０ａ 発光部
６０ａ’ 発光部の像
６１ 容器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察対象から発せられる微弱光を取得して観察する微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、微弱光の観察として、例えば、発光顕微鏡を用いた細胞や組織の微細構造レベルの変化の長時間観察が行われている。
発光顕微鏡は、例えば、図５に示すように、対物レンズ５１ａと結像レンズ５１ｂと撮像素子５１ｃからなる撮像光学系５１を有する。図５中、６０は観察対象としての細胞・組織などのサンプル、６０ａは観察対象６０における発光部、６１は図示しないステージ上に載置された、観察対象６０を収容するシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート等の容器、６０ａ’は撮像素子５１で撮像される発光部６０ａ’の像である。そして、発光顕微鏡を用いた観察では、発行試薬等との化学反応によって観察対象から発せられる所定波長の微弱光を所定時間（例えば、１５分等）露光し、これを数十回繰り返すことで、組織や細胞の変化を捉える。
従来、この種の発光顕微鏡としては、例えば、次の特許文献１，２に記載のものが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１０８１５４号公報
【特許文献２】ＷＯ０７／０７４９２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、発光顕微鏡を用いて観察対象からの発光像を画像化する場合においては、微弱な発光の強度を補うために、撮像素子の露光時間を長くして受光される光量を増加させるといった手法が用いられる。また、微弱な発光像を極力明るく取得するために、対物レンズ及び結像レンズには、高ＮＡのものが用いられる。
【０００５】
ここで、対物レンズのＮＡが大きいほど、明るい発光像が得られる。
しかし、低倍率の対物レンズで広い範囲を観察する場合、ＮＡを高くすることは困難である。また、高倍率の対物レンズを用いてもＮＡには限界がある。
このため、従来の発光顕微鏡では、上記のように撮像素子の露光時間を長くすることで、明るさ不足を補わざるを得ない。しかし、撮像素子の露光時間が長いと、観察対象の速い変化を撮影することが難しい。
【０００６】
ところで、特許文献２には、観察対象に対して、発光画像を撮像するユニットと蛍光画像を撮像するユニットとが対向配置された構成が開示されている。
ここで、本件出願人は、特許文献２に開示の上記構成を応用し、観察対象に対して、２つの発光画像を撮像するユニットを対向配置し、２つのユニットで取得した発光画像を合成することで発光強度を補うことを着想した。
【０００７】
しかし、２つの発光画像を撮像するユニットを対向配置しても、夫々のユニットで撮像される発光強度が弱く、夫々のユニットにおける撮像素子の露光時間を短くすることができないため、観察対象の速い変化を撮影することが難しいという問題を解消できない。
【０００８】
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、撮像素子の露光時間を短縮でき、低倍率のレンズの使用や、観察対象の速い変化の撮影が可能な微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明による微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法は、対物レンズと結像レンズと撮像素子とからなる結像光学系を有し、前記結像光学系を介して観察対象から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光観察顕微鏡であって、第２の対物レンズと第２の結像レンズと前記観察対象と共役な位置に配置されるミラーとを有する光戻し用光学系を、前記観察対象に対して前記結像光学系の反対側に有することを特徴としている。
【００１０】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記ミラーが、可変形状ミラーからなるのが好ましい。
【００１１】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、さらに、前記光戻し用光学系の光路中に、前記所定の微弱光の波長を透過させ、前記所定の微弱光の波長以外の波長を反射する光路分割手段を備えるとともに、前記所定の微弱光の波長とは異なる波長からなる照明光を前記光路分割部材に向けて出射する照明光学系を有するのが好ましい。
【００１２】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記光路分割手段が、前記第２の対物レンズと前記第２の結像レンズとの間に備えられ、前記照明光学系が、前記光戻し用光学系の側方に備えられているのが好ましい。
【００１３】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記光路分割手段が、前記ミラーからなり、前記照明光学系が、前記ミラーに対して前記第２の結像レンズとは反対側に備えられているのが好ましい。
【００１４】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、さらに、前記結像光学系が、前記照明光の波長を遮光し、前記所定の微弱光の波長を透過させる波長選択素子を挿脱可能に備えるのが好ましい。
【００１５】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、収差補正手段を前記第２の対物レンズの瞳位置に備えるのが好ましい。
【００１６】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記収差補正手段が、補正環であるのが好ましい。
【００１７】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記収差補正手段が、位相変調器であるのが好ましい。
【００１８】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記所定の微弱光が、化学反応により前記観察対象から発せられる発光であるのが好ましい。
【００１９】
また、本発明の微弱光観察顕微鏡においては、前記所定の微弱光が、励起波長の照射により前記観察対象から発せられる蛍光であり、前記照明光が、前記観察対象を励起する励起波長からなるのが好ましい。
【００２０】
また、本発明による微弱光取得方法は、観察対象から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光取得方法であって、第１の対物レンズと第１の結像レンズと撮像素子とからなる結像光学系を用いて、前記観察対象から前記第１の対物レンズに入射する前記所定の微弱光を取得するとともに、第２の対物レンズと第２の結像レンズと前記観察対象と共役な位置に配置されるミラーとを有する光戻し用光学系を用いて、該観察対象から前記結像光学系とは異なる側に発せられた前記所定の微弱光を該観察対象に戻し、該観察対象から前記第１の対物レンズに入射させることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、撮像素子の露光時間を短縮でき、低倍率のレンズの使用や、観察対象の速い変化の撮影が可能な微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
【図２】本発明の第２実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
【図３】本発明の第３実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
【図４】本発明の第４実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
【図５】従来の発光顕微鏡の一構成例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。
第１実施形態
図１は本発明の第１実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、結像光学系１と、光戻し用光学系２を有する。
結像光学系１は、対物レンズ１ａと、結像レンズ１ｂと、撮像素子１ｃとで構成されている。
光戻し用光学系２は、第２の対物レンズ２ａと、第２の結像レンズ２ｂと、平面ミラー２ｃとで構成され、観察対象１０に対して結像光学系１の反対側に設けられている。
ミラー２ｃは、観察対象１０と共役な位置に配置されている。
観察対象１０には、発光試薬等との化学反応によって所定の微弱光を発光する発光部１０ａを含んだ細胞・組織等であって、所定の微弱光の波長に対する光透過性のあるサンプルを用いている。なお、観察対象１０は、シャーレ、スライドガラス、マイクロプレート等の容器１１に収容されている。容器１１は、図示しないステージ上に載置されている。
また、対物レンズ１ａ、第２の対物レンズ２ａは、夫々ステージ１２との相対的距離を変動させることによって、観察対象１０に対してピントを調整することができるようになっている。
【００２４】
このように構成された第１実施形態の微弱光観察顕微鏡では、観察対象１０の発光部１０ａから結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。図１中、１０ａ’は撮像素子１ｃの撮像面に結像した発光部１０の像である。
一方、観察対象１０の発光部１０ａから光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａ、第２の結像レンズ２ｂを経て、ミラー２ｃの面に結像し、ミラー２ｃで反射され、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻される。図１中、１０ａ”はミラー２ｃの面に結像した発光部１０ａの像である。観察対象１０に戻された所定の微弱光は、さらに、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過し、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
これにより、撮像素子１ｃには、従来の微弱光観察顕微鏡と比べて約２倍の光量の所定の微弱光が入射することになり、撮像素子１ｃの露光時間を約半分に短縮できる。
その結果、ＮＡを大きくできない低倍率の対物レンズを用いても、発光像を撮像することが可能となり、また、観察対象（における発光部）の速い変化を撮影することができるようになる。
【００２５】
第２実施形態
図２は本発明の第２実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。なお、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と同じ構成部材については、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、光戻し用光学系２において観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーが、可変形状ミラー２ｃ’で構成されている。その他の構成は、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と略同じである。
【００２６】
光戻し用光学系２における観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーとして平面ミラー２ｃを用いた構成においては、観察対象１０の厚みが一定でない場合、観察対象１０の一部の発光部１０ａから結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、平面ミラー２ｃを前後する位置に結像する。そして、平面ミラー２ｃで反射された光が、観察対象１０における発光部１０ａの発光点に戻らず、発光点を前後する位置に結像してしまう。その光が、結像光学系側に向けて透過し、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像しない状態で入射する。その結果、撮像素子１で撮像した像がボケてしまう。
しかるに、第２実施形態の微弱光観察顕微鏡によれば、可変形状ミラー２ｃ’の反射面を観察対象１０の厚み又は光路長に合せて変形させることで、可変形状ミラー２ｃ’で反射された所定の微弱光を、観察対象１０の発光点の位置に正確に戻すことができる。このため、観察対象１０の厚みが一定でない場合であっても、像のボケを防止することができる。
その他の作用効果は、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と略同じである。
【００２７】
第３実施形態
図３は本発明の第３実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。なお、第２実施形態の微弱光観察顕微鏡と同じ構成部材については、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、第２実施形態の構成に加えて、さらに、光路分割部材３と、照明光学系４を有している。
光路分割部材３は、所定の微弱光の波長を透過し、所定の微弱光の波長以外の波長を反射する光学特性を持つダイクロイックミラーで構成され、第２の対物レンズ２ａと第２の結像レンズ２ｂとの間に配置されている。
照明光学系４は、所定の微弱光の波長とは異なる波長からなる照明光を光路分割部材３に向けて出射するように構成され、光戻し用光学系２の側方に設けられている。
図３の例では、照明光学系４は、光源４ａと、光源からの光を平行光束に変換するコリメートレンズ４ｂと、バンドパスフィルタ４ｃを備えている。光源４ａは、通常の白色光を出射する。バンドパスフィルタ４ｃは、所定の微弱光波長を遮光し、所定の微弱光波長以外の波長を透過する光学特性を持っている。また、バンドパスフィルタ４ｃは、照明光学系４の光路中に挿脱可能に設けられている。
【００２８】
また、結像光学系１は、さらに、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間に、照明光カットフィルタ１ｄを挿脱可能に備えている。照明光カットフィルタ１ｄは、照明光の波長を遮光し、所定の微弱光の波長を透過する特性を持っている。
その他の構成は、第２実施形態の微弱光観察顕微鏡と略同じである。
【００２９】
このように構成された第３実施形態の微弱光観察顕微鏡においては、微弱光観察及び通常光による透過照明観察を次の２つの方法で切替えて行うことができる。
第１の方法は、照明光カットフィルタ１ｄを、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間に挿入し、かつ、照明光学系４の光源４ａをＯＮにした状態で、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間において照明光カットフィルタ１ｄを挿脱する方法である。
微弱光観察を行う場合には、照明光カットフィルタ１ｄを挿入する。観察対象１０から光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａを経て、光路分割部材３を透過し、第２の結像レンズ２ｂを経て、ミラー２ｃの面に結像し、ミラー２ｃで反射され、第２の結像レンズ２ｂを経て、光路分割部材３を透過し、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻る。また、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過した所定の微弱光及び、観察対象１０から結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａを経て、照明光カットフィルタ１ｄを透過し、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。なお、照明光学系４からの照明光は、光路分割部材３で反射されて、第２の対物レンズ２ａ、観察対象１０に入射する。観察対象１０を透過した光は、対物レンズ１ａを経て、照明光カットフィルタ１ｄに入射するが、照明光カットフィルタ１ｄで遮光される。
一方、通常光による透過照明観察を行う場合には、照明光カットフィルタ１ｄを抜き出す。照明光学系４からの照明光は、光路分割部材３で反射され、対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に入射する。観察対象１０を透過した光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
【００３０】
第２の方法は、照明光カットフィルタ１ｄを、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間から抜き出した状態で、照明光学系４の光源４ａのＯＮ／ＯＦＦを切り替える方法である。
微弱光観察を行う場合には、照明光学系４の光源４ａをＯＦＦにする。観察対象１０から光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａを経て、光路分割部材３を透過し、第２の結像レンズ２ｂを経て、ミラー２ｃの面に結像し、ミラー２ｃで反射され、第２の結像レンズ２ｂを経て、光路分割部材３を透過し、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻る。また、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過した所定の微弱光及び、観察対象１０から結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
一方、通常光による透過照明観察を行う場合には、照明光学系４の光源４ａをＯＮにする。照明光学系４からの照明光は、第１の方法と同様の経路を辿り、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
【００３１】
第３実施形態の微弱光観察顕微鏡によれば、微弱光観察と透過照明観察とを切替えることができる上、第１及び第２実施形態の微弱光観察顕微鏡と同様の効果が得られる。即ち、従来の微弱光観察顕微鏡と比べて約２倍の光量の所定の微弱光が入射することになり、撮像素子１ｃの露光時間を約半分に短縮でき、ＮＡを大きくできない低倍率の対物レンズを用いても、発光像を撮像することが可能となり、また、観察対象（における発光部）の速い変化を撮影することができるようになり、しかも、可変形状ミラー２ｃ’の反射面を観察対象１０の厚み又は光路長に合せて変形させることで、可変形状ミラー２ｃ’で反射された所定の微弱光を、観察対象１０の発光点の位置に正確に戻すことができ、観察対象１０の厚みが一定でない場合であっても、像のボケを防止することができる。
【００３２】
なお、図３の例では、所定の微弱波長は、発光試薬等との化学反応によって観察対象から発せられる発光波長として説明したが、所定の微弱波長は、励起波長の照射により観察対象から発せられる蛍光波長であってもよい。
その場合には、バンドパスフィルタ４ｃは、所定の蛍光波長を遮光し、所定の励起光波長を透過する光学特性を持つものを用いればよい。
また、第３実施形態においては、光戻し用光学系２において観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーを、可変形状ミラー２ｃ’で構成したが、平面ミラー２ｃで構成してもよい。
【００３３】
第４実施形態
図４は本発明の第４実施形態にかかる微弱光観察顕微鏡の要部構成を示す説明図である。なお、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と同じ構成部材については、同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、光戻し用光学系２における観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーが、所定の微弱光波長を反射し、所定の微弱光波長以外の波長を透過する特性を持つ光路分割部材としての機能を併せ持つ、ダイクロイックミラー２ｃ”で構成されている。
また、本実施形態の微弱光観察顕微鏡は、第１実施形態の構成に加えて、さらに、ダイクロイックミラー２ｃ”に対して第２の結像レンズ２ｂとは反対側に、照明光学系４’を有している。
図４の例では、照明光学系４’は、光源４ａ’と、光源４ａ’からの光をダイクロイックミラー２ｃ”に集光させる集光レンズ４ｂ’を備えている。光源４ａ’は、所定の微弱光波長とは異なる波長からなる照明光を出射する。なお、照明光学系４’における光源４ａ’の代わりに、図３の例と同様の通常の白色光を出射する光源４ａを用いるとともに、バンドパスフィルタ４ｃを備えてもよい。
【００３４】
また、結像光学系１は、さらに、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間に、照明光カットフィルタ１ｄを挿脱可能に備えている。照明光カットフィルタ１ｄは、照明光の波長を遮光し、所定の微弱光の波長を透過する特性を持っている。
その他の構成は、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と略同じである。
【００３５】
このように構成された第４実施形態の微弱光観察顕微鏡においては、微弱光観察及び通常光による透過照明観察を次の２つの方法で切替えて行うことができる。
第１の方法は、照明光カットフィルタ１ｄを、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間に挿入し、かつ、照明光学系４’の光源４ａ’をＯＮにした状態で、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間において照明光カットフィルタ１ｄを挿脱する方法である。
微弱光観察を行う場合には、照明光カットフィルタ１ｄを挿入する。観察対象１０から光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａ、第２の結像レンズ２ｂを経て、ダイクロイックミラー２ｃ”の面に結像し、ダイクロイックミラー２ｃ”で反射され、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻る。また、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過した所定の微弱光及び、観察対象１０から結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａを経て、照明光カットフィルタ１ｄを透過し、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。なお、照明光学系４’からの照明光は、ダイクロイックミラー２ｃ”を透過し、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａ、観察対象１０、対物レンズ１ａを経て、照明光カットフィルタ１ｄに入射するが、照明光カットフィルタ１ｄで遮光される。
一方、通常光による透過照明観察を行う場合には、照明光カットフィルタ１ｄを抜き出す。照明光学系４’からの光は、ダイクロイックミラー２ｃ”を透過し、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａ、観察対象１０、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
【００３６】
第２の方法は、照明光カットフィルタ１ｄを、対物レンズ１ａと結像レンズ１ｂとの間から抜き出した状態で、照明光学系４’の光源４ａ’のＯＮ／ＯＦＦを切り替える方法である。
微弱光観察を行う場合には、照明光学系４’の光源４ａ’をＯＦＦにする。観察対象１０から光戻し用光学系２側に向けて発せられた所定の微弱光は、第２の対物レンズ２ａ、第２の結像レンズ２ｂを経て、ダイクロイックミラー２ｃ”の面に結像し、ダイクロイックミラー２ｃ”で反射され、第２の結像レンズ２ｂ、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に戻る。また、観察対象１０を結像光学系１側に向けて透過した所定の微弱光及び、観察対象１０から結像光学系１側に向けて発せられた所定の微弱光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
一方、通常光による透過照明観察を行う場合には、照明光学系４’の光源４ａ’をＯＮにする。照明光学系４’からの照明光は、ダイクロイックミラー２ｃ”の面に集光し、ダイクロイックミラー２ｃ”を透過し、第２の結像レンズ、第２の対物レンズ２ａを経て、観察対象１０に入射し、観察対象１０を透過した光は、対物レンズ１ａ、結像レンズ１ｂを経て、撮像素子１ｃの撮像面に結像する。
【００３７】
第４実施形態の微弱光観察顕微鏡によれば、極めて少ない部材点数で微弱光観察と透過照明観察とを切替えることができる上、第１実施形態の微弱光観察顕微鏡と同様の効果が得られる。即ち、従来の微弱光観察顕微鏡と比べて約２倍の光量の所定の微弱光が入射することになり、撮像素子１ｃの露光時間を約半分に短縮でき、ＮＡを大きくできない低倍率の対物レンズを用いても、発光像を撮像することが可能となり、また、観察対象（における発光部）の速い変化を撮影することができるようになる。
【００３８】
なお、図４の例では、所定の微弱波長は、発光試薬等との化学反応によって観察対象から発せられる発光波長として説明したが、所定の微弱波長は、励起波長の照射により観察対象から発せられる蛍光波長であってもよい。
その場合には、光源４ａ’と集光レンズ４ｂ’との間に、所定の蛍光波長を遮光し、所定の励起光波長を透過する光学特性を持つバンドパスフィルタを挿脱可能に備えるとよい。
また、第４実施形態においては、光戻し用光学系２において観察対象１０と共役な位置に配置されるミラーを、平面形状のダイクロイックミラー２ｃ”で構成したが、可変形状のダイクロイックミラーで構成してもよい。
そのようにすれば、可変形状ダイクロイックミラー２ｃ”の反射面を観察対象１０の厚み又は光路長に合せて変形させることで、可変形状ダイクロイックミラー２ｃ”で反射された所定の微弱光を、観察対象１０の発光点の位置に正確に戻すことができ、観察対象１０の厚みが一定でない場合であっても、像のボケを防止することができる。
【００３９】
以上、本発明の微弱光観察顕微鏡の実施形態について説明したが、本発明の微弱光観察顕微鏡は、これらの構成に限定されるものではない。
例えば、各実施形態における第２の対物レンズ２ａの瞳位置に、補正環や位相変調器などの収差補正手段を備えると好ましい。
観察対象１０を収容する容器１１が、シャーレやマイクロプレートの場合、容器１１中の液面が表面張力で曲がり、収差が発生しうる。第２の対物レンズ２ａの瞳位置に収差補正手段を備えれば、液面の曲がりによる収差を補正してミラー２ｃ（２ｃ’，２ｃ”）に結像することができる。
【００４０】
また、図１〜図４に示す各実施形態においては、ミラー２ｃ，２ｃ’，２ｃ”が観察対象１０と共役な位置に配置されるものであれば、光戻し用光学系２は、どのような倍率で構成してもよい。なお、微弱光の像を極力明るくするためには、第２の対物レンズ２ａには、ＮＡが対物レンズ１ａよりも大きいものを用いるのが好ましい。
【００４１】
また、図１〜図４の例では、光戻し用光学系２が、観察対象１０に対して、結像光学系１の反対側に備えたが、本発明の微弱光観察顕微鏡における光戻し用光学系２は、このような配置に限定されるものではない。
例えば、透明なキューブ状の容器に収容された観察対象に対し、観察対象の側方にも光戻し光学系２を設けてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の微弱光観察顕微鏡及び微弱光取得方法は、例えば、発光による細胞や組織の微細構造レベルの変化の長時間観察や、蛍光観察等、非常に微弱な光を発する観察対象を観察することが求められるあらゆる分野に有用である。
【符号の説明】
【００４３】
１ 結像光学系
１ａ 対物レンズ
１ｂ 結像レンズ
１ｃ 撮像素子
１ｄ 照明光カットフィルタ
２ 光戻し用光学系
２ａ 第２の対物レンズ
２ｂ 第２の結像レンズ
２ｃ （平面）ミラー
２ｃ’ 可変形状ミラー
２ｃ” ダイクロイックミラー
３ 光路分割部材
４、４’ 照明光学系
４ａ、４ａ’ 光源
４ｂ コリメートレンズ
４ｂ’ 集光レンズ
４ｃ バンドパスフィルタ
１０ 観察対象（サンプル）
１０ａ 発光部
１０ａ’、１０ａ” 発光部の像
１１ 容器
５１ 撮像光学系
５１ａ 対物レンズ
５１ｂ 結像レンズ
５１ｃ 撮像素子
６０ 観察対象（サンプル）
６０ａ 発光部
６０ａ’ 発光部の像
６１ 容器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズと結像レンズと撮像素子とからなる結像光学系を有し、前記結像光学系を介して観察対象から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光観察顕微鏡であって、
第２の対物レンズと第２の結像レンズと前記観察対象と共役な位置に配置されるミラーとを有する光戻し用光学系を、前記観察対象に対して前記結像光学系の反対側に有することを特徴とする微弱光観察顕微鏡。
【請求項２】
前記ミラーが、可変形状ミラーからなることを特徴とする請求項１に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項３】
さらに、前記光戻し用光学系の光路中に、前記所定の微弱光の波長を透過させ、前記所定の微弱光の波長以外の波長を反射する光路分割手段を備えるとともに、
前記所定の微弱光の波長とは異なる波長からなる照明光を前記光路分割部材に向けて出射する照明光学系を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項４】
前記光路分割手段が、前記第２の対物レンズと前記第２の結像レンズとの間に備えられ、
前記照明光学系が、前記光戻し用光学系の側方に備えられていることを特徴とする請求項３に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項５】
前記光路分割手段が、前記ミラーからなり、
前記照明光学系が、前記ミラーに対して前記第２の結像レンズとは反対側に備えられていることを特徴とする請求項１に従属する請求項３に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項６】
さらに、前記結像光学系が、前記照明光の波長を遮光し、前記所定の微弱光の波長を透過させる波長選択素子を挿脱可能に備えることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項７】
収差補正手段を前記第２の対物レンズの瞳位置に備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項８】
前記収差補正手段が、補正環であることを特徴とする請求項７に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項９】
前記収差補正手段が、位相変調器であることを特徴とする請求項７に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項１０】
前記所定の微弱光が、化学反応により前記観察対象から発せられる発光であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項１１】
前記所定の微弱光が、励起波長の照射により前記観察対象から発せられる蛍光であり、
前記照明光が、前記観察対象を励起する励起波長からなることを特徴とする請求項６、請求項６に従属する請求項７〜９のいずれかに記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項１２】
観察対象から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光取得方法であって、第１の対物レンズと第１の結像レンズと撮像素子とからなる結像光学系を用いて、前記観察対象から前記第１の対物レンズに入射する前記所定の微弱光を取得するとともに、
第２の対物レンズと第２の結像レンズと前記観察対象と共役な位置に配置されるミラーとを有する光戻し用光学系を用いて、該観察対象から前記結像光学系とは異なる側に発せられた前記所定の微弱光を該観察対象に戻し、該観察対象から前記第１の対物レンズに入射させることを特徴とする微弱光取得方法。
【請求項１】
対物レンズと結像レンズと撮像素子とからなる結像光学系を有し、前記結像光学系を介して観察対象から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光観察顕微鏡であって、
第２の対物レンズと第２の結像レンズと前記観察対象と共役な位置に配置されるミラーとを有する光戻し用光学系を、前記観察対象に対して前記結像光学系の反対側に有することを特徴とする微弱光観察顕微鏡。
【請求項２】
前記ミラーが、可変形状ミラーからなることを特徴とする請求項１に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項３】
さらに、前記光戻し用光学系の光路中に、前記所定の微弱光の波長を透過させ、前記所定の微弱光の波長以外の波長を反射する光路分割手段を備えるとともに、
前記所定の微弱光の波長とは異なる波長からなる照明光を前記光路分割部材に向けて出射する照明光学系を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項４】
前記光路分割手段が、前記第２の対物レンズと前記第２の結像レンズとの間に備えられ、
前記照明光学系が、前記光戻し用光学系の側方に備えられていることを特徴とする請求項３に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項５】
前記光路分割手段が、前記ミラーからなり、
前記照明光学系が、前記ミラーに対して前記第２の結像レンズとは反対側に備えられていることを特徴とする請求項１に従属する請求項３に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項６】
さらに、前記結像光学系が、前記照明光の波長を遮光し、前記所定の微弱光の波長を透過させる波長選択素子を挿脱可能に備えることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項７】
収差補正手段を前記第２の対物レンズの瞳位置に備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項８】
前記収差補正手段が、補正環であることを特徴とする請求項７に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項９】
前記収差補正手段が、位相変調器であることを特徴とする請求項７に記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項１０】
前記所定の微弱光が、化学反応により前記観察対象から発せられる発光であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項１１】
前記所定の微弱光が、励起波長の照射により前記観察対象から発せられる蛍光であり、
前記照明光が、前記観察対象を励起する励起波長からなることを特徴とする請求項６、請求項６に従属する請求項７〜９のいずれかに記載の微弱光観察顕微鏡。
【請求項１２】
観察対象から発せられる所定の微弱光を取得する微弱光取得方法であって、第１の対物レンズと第１の結像レンズと撮像素子とからなる結像光学系を用いて、前記観察対象から前記第１の対物レンズに入射する前記所定の微弱光を取得するとともに、
第２の対物レンズと第２の結像レンズと前記観察対象と共役な位置に配置されるミラーとを有する光戻し用光学系を用いて、該観察対象から前記結像光学系とは異なる側に発せられた前記所定の微弱光を該観察対象に戻し、該観察対象から前記第１の対物レンズに入射させることを特徴とする微弱光取得方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２０３１９３（Ｐ２０１２−２０３１９３Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６７６８８（Ｐ２０１１−６７６８８）
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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