微生物検出法及び微生物検出キット
【課題】食品や臨床試料中に含まれる微生物の検出法を提供する。
【解決手段】被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料をエチジウムモノアザイドで処理し、可視光を照射する工程と、アムサクリン、カンプトセシン、エリプチシン、エトポシド、ミトキサントロン、及び／又はシプロフロキサシンから選択されるトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で被検試料を処理する工程からなる工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【解決手段】被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料をエチジウムモノアザイドで処理し、可視光を照射する工程と、アムサクリン、カンプトセシン、エリプチシン、エトポシド、ミトキサントロン、及び／又はシプロフロキサシンから選択されるトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で被検試料を処理する工程からなる工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や臨床試料中に含まれる微生物の検出法、及び微生物検出キットに関する。さらに詳しくは、食品や臨床試料中に含まれる微生物の生菌の選択的な検出が可能な検出法及び微生物検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品や臨床試料、又は環境中の一般生菌数の測定には、従来、平板培養法が用いられてきた。しかし、平板培養法は結果が得られるまでに２日間程度の時間を要する。
【０００３】
食品の殺菌技術や加工技術が向上したことにより、微量であっても被検試料中に存在する微生物の生死の状態を識別するニーズが高まっている。特に、食品衛生検査や臨床検査領域においては、細菌の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各細菌の特異遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各細菌の存在の有無を判別及び定量する試みがなされている。しかし、細菌のＤＮＡにターゲットを当てた場合、被検試料に元来含まれている死菌のバックグラウンドまで検出されるため、ＰＣＲで陽性判定がでた場合、必ずしも生きた細菌の存在を示唆しているとは限らなかった。そのために、食品衛生や臨床検査の分野では、ＰＣＲは高感度・迅速でありながら普及していないのが現状であった。
【０００４】
最近では、ｍＲＮＡをターゲットにして、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製後、各細菌の特異プライマーを用いてＰＣＲを行い、被検試料中の生菌のみを検出・定量する試みがなされている。しかし、この方法では死菌のｍＲＮＡの逆転写そのものが阻害されるわけではなく、１０4ｃｆｕ／ｍｌ又は１０4ｃｆｕ／ｇ以上の死菌が被検試料に含まれている場合、死菌のバックグラウンドを検出してしまうため、生死の判別法としては十分なものとは言えなかった。
【０００５】
具体的には、ＰＣＲ法を利用した細菌等の微生物の生死を判別する方法としては、特許文献１又は特許文献２に記載の方法が開示されている。しかしながら、これらのＰＣＲ法を利用した細菌等の微生物の生死を判別する方法には以下に示すような問題が残されていた。
【０００６】
前記特許文献１の技術は、１００℃、１０〜３０分の高温長時間加熱殺菌が施された一部のボイル（煮沸）食品中における死菌や、エタノール殺菌やホルムアルデヒト殺菌を施した食品中の微生物の識別を例示しているが、特に後者については実際そのような殺菌処理を施されている食品は存在しない。また、現在食品業界で主流な殺菌方法である低温保持殺菌（ＬＴＬＴ殺菌）、高温短時間（ＨＴＳＴ殺菌）または超高温瞬間加熱殺菌（ＵＨＴ殺菌）を施された食品中の生きた微生物のみの検出や、抗生物質投与を受けた感染症患者における臨床検体中の生きた特定病原菌等の検出は想定されていない。また、特許文献１の技術では、被検試料中に死菌バックグラウンドが１０4ｃｆｕ／ｍｌ以上の濃度で存在する食品や臨床検体の場合、死菌由来のＰＣＲ最終増幅産物量が検出限界以上になり、被検試料のＰＣＲ陽性反応が生菌由来か死菌由来かの識別が不可能である。
【０００７】
また、前記特許文献２の技術は、死細胞のＲＮＡ／ＤＮＡモル比が生細胞のそれと比較して相対的に低下することを利用した生菌と死菌を識別する方法を開示したものである。この方法は、トータルＲＮＡを抽出し逆転写反応を利用してコンプリメンタリーＤＮＡを作製し、その後ＰＣＲを行ってそのＣｔ値を算出し、別途作製した検量線によりＲＮＡのモル濃度を求め、一方で、このＲＮＡに相当する染色体ＤＮＡの領域をＰＣＲにより増幅してＣｔ値を求め、前記検量線より染色体ＤＮＡのモル濃度を算出することにより、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡのモル比を求めるものである。すなわち、上記操作は、煩雑なトータルＲＮＡ抽出を行う必要があり、逆転写反応−ＰＣＲという２ステップを伴うために、定量性や迅速性で通常のＤＮＡをターゲットにしたＰＣＲより劣る。更に、生菌ではＲＮＡが連続的に産生される一方、死菌由来のＲＮＡは早期に分解されるため安定性に欠ける。また、高濃度の死菌を含む食品や臨床検体においてはその１／１０濃度の生菌しか検出できない。したがって、迅速、高感度、且つ精確性を要求される食品衛生検査や臨床検査においては適用が困難であった。
【特許文献１】特表２００３−５３０１１８号公報
【特許文献２】国際公開第２００２／０５２０３４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、食品や臨床試料中に含まれる微生物の生菌（live cell）（Viable-and-Culturable cell）を死菌（Dead cell）や損傷菌（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell；「VNC cell」）に比べて選択的に検出する方法、すなわち、培養法の特性をそのまま引き継いだ迅速代替検出法、及び同方法を実施するためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、種々の殺菌方法に適用可能な、検出感度が高い食品衛生検査に適した微生物の生死の判別法、及び病院や臨床現場において感染症患者における特定病原菌の検出も可能な方法について鋭意検討したところ、被検試料中の微生物の生菌及び損傷菌を判別する方法において、被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理すること、又は、エチジウムモノアザイド処理と可視光照射、及びエチジウムモノアザイド以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理することにより、生菌染色体ＤＮＡを選択的にＰＣＲ反応により増幅することができ、培養法の迅速代替法となることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
ａ）前記被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【００１１】
前記方法は、前記増幅産物の解析を、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを好ましい態様としている。
【００１２】
また前記方法は、前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲ法により行い、ＰＣＲと増幅産物の解析を同時に行うことを好ましい態様としている。
【００１３】
また前記方法は、前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかであることを好ましい態様としている。
【００１４】
また前記方法は、前記微生物が細菌であることを好ましい態様としている。
【００１５】
また前記方法は、前記ターゲット領域が２３ＳｒＲＮＡ遺伝子であることを好ましい態様としている。この態様においては、前記ＰＣＲを、配列番号１及び２に示すプライマー
セット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットを用いて行うことが好ましい。
【００１６】
また前記方法は、前記微生物が病原性細菌であることを好ましい態様としている。この態様においては、前記ターゲット領域が病原遺伝子であることが好ましい。さらには、この態様においては、前記ＰＣＲを、配列番号７及び８に示すプライマーセットを用いて行うことが好ましい。
【００１７】
また前記方法は、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３から選択されることを好ましい態様としている。
【００１８】
また前記方法は、前記ＤＮＡジャイレース阻害剤が、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）から選択されることを好ましい態様としている。
【００１９】
また前記方法は、前記トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤がエチジウムモノアザイドであり、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に可視光を照射する工程を含むことを好ましい態様としている。
【００２０】
また前記方法は、エチジウムモノアザイドと、エチジウムモノアザイド以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で被検試料を処理することを好ましい態様としている。
【００２１】
また前記方法は、前記ａ）の工程の前に、下記工程を行うことを好ましい態様としている。
ｄ）前記被検試料をトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースで処理する工程。
【００２２】
また前記方法は、被検試料中の微生物の生菌をＰＣＲにより検出するためのキットであって、下記の要素を含むキットを提供する：
トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤、並びに
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅するためのプライマー。
また前記キットは、さらに、トポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースを含むことを好ましい態様としている。
【００２３】
また前記キットは、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３から選択されることを好ましい態様としている。
【００２４】
また前記キットは、前記ＤＮＡジャイレース阻害剤が、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）から選択されることを好ましい態様としている。
【００２５】
また前記キットは、エチジウムモノアザイドと、エチジウムモノアザイド以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤を含むことを好ましい態様としている。
【００２６】
また前記キットは、前記プライマーが、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットであることを好ましい態様としている。
【００２７】
また前記キットは、前記プライマーが、配列番号７及び８に示すプライマーセットであることを好ましい態様としている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００２９】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法である。
ａ）前記被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【００３０】
本明細書において、「被検試料」とは、その中に存在する微生物の生菌を検出する対象であり、ＰＣＲ法による染色体ＤＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されないが、食品、例えば、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料等が挙げられる。特に、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品が好ましい。本発明においては、被検試料は、前記のような製品又は生体試料そのものであってもよく、これを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。
【００３１】
「微生物」は、本発明の方法により検出される対象であり、ＰＣＲ法により検出することが可能であって、かつ、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤の微生物に対する作用が生菌と死菌や損傷菌とで異なるものであれば、特に制限されないが、好ましくは細菌、糸状菌、酵母等が挙げられる。細菌としては、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis））等のスタフィロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Bacillus cereus）等のバチラス属細菌、マイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌等が挙げられる。
【００３２】
本発明において「生菌」（live cell）とは、一般に好適な培養条件によって培養した際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Cultura
ble state）であり、細胞壁の損傷はほとんど無い微生物をいう。なお、ここでいう代謝活性とはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。
【００３３】
「死菌」（Dead cell）とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。
【００３４】
「損傷菌」（Injured cell or Viable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、一般に好適な培養条件によって培養した場合であっても、増殖は困難であるが、その微生物が有する代謝活性は、生菌と比較すると低下しているものの死菌と比較すると有意に活性を有する状態の微生物である。
【００３５】
特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷菌の状態を呈した細菌の検出が注目されており、本発明においては、生菌の検出のみならず、生菌と死菌又は損傷菌との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。
【００３６】
尚、生菌、損傷菌及び死菌の菌数単位は、通常、いずれも細胞数（cells）／ｍｌで表される。生菌の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ（colony formating units / ml））で近似させることができる。また、損傷菌の標準試料は、例えば、生菌懸濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、損傷菌の細胞数は、加熱処理する前の生菌懸濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。尚、損傷菌を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、５０秒程度で損傷菌を調製することができる。さらに、損傷菌の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷菌の細胞数は、生菌懸濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光（波長６００ｎｍ）の透過度、すなわち濁度を測定し、生菌数濃度が予め判っている生菌懸濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ）で近似させることができる。
【００３７】
尚、本発明の方法は、生菌の検出が目的であり、生菌と区別される微生物は、損傷菌であっても死菌であってもよい。
【００３８】
本発明において、「生菌の検出」とは、被検試料中の生菌の有無の判別及び生菌の量の決定のいずれをも含む。また、生菌の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。
【００３９】
（１）ステップａ）
被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する。
本発明に用いるトポイソメラーゼ阻害剤（Topoisomerase poison）及びＤＮＡジャイレース阻害剤（DNA Gyrase poison）とは、それぞれトポイソメラーゼ（Topoisomerase）及びＤＮＡジャイレース（DNA Gyrase）によるＤＮＡを切断する活性は阻害せず、ＤＮＡの再結合を阻害するもの、又はＤＮＡを切断する速度を促進するものをいう。好ましくは、トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、微生物の染色体ＤＮＡに共有結合するか、染色体ＤＮＡにインターカレートし、可視光照射により染色体ＤＮＡに共有結合するもの、単に染色体ＤＮＡにインターカレートするもの、又はトポイソメラーゼもしくはＤＮＡジャイレースと複合体形成するものである。
【００４０】
トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤は、両方を用いてもよく、一方のみを用いてもよい。
【００４１】
前記トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、生菌と、損傷菌又は死菌及びウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等に対する作用が異なるものであることが好ましく、より具体的には、生菌の細胞壁よりも損傷菌もしくは死菌の細胞壁、又はウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。
【００４２】
前記トポイソメラーゼ阻害剤としては、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。
【００４３】
前記ＤＮＡジャイレース阻害剤としては、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）等が挙げられる。ＤＮＡジャイレース阻害剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。
【００４４】
トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌及び死菌もしくは損傷菌の懸濁液に、種々の濃度のトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって菌体を分離し、ＰＣＲで分析することによって、生菌と死菌もしくは損傷菌を区別しやすい条件を決定することができる。さらに、検出対象の微生物の生菌、及びウシ白血球等の体細胞又は血小板等の懸濁液に、種々の濃度のトポイソメラーゼ阻害剤を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって菌体及び前記各種細胞を分離し、ＰＣＲで分析することによって、生菌と各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。このような条件として、具体的には、アムサクリンでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、エリプチシンでは終濃度０．０５〜５μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、カンプトセシンでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、シプロフロキサシンでは終濃度０．４〜４０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、エトポシドでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、ミトキサントロンでは終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間が挙げられる。被検試料を所定条件で処理した後に、希釈及び／又は遠心分離等による除去によって、処理を停止することが好ましい。
【００４５】
上記トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、生菌の細胞壁よりも死菌及び損傷菌の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌もしくは死菌または死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。また、生きた体細胞でも細胞膜のみであって、細胞壁を有さないことから前記阻害剤は透過すると考えられる。その結果、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤は、体細胞の死細胞及び死菌並びに損傷菌の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡと無秩序に共有結合し、もしくはインターカレートし、もしくはトポイソメラーゼと複合体を形成し、さらに、体細胞内のトポイソメラーゼII又はトポイソメラーゼI、死菌又は損傷菌細胞内のトポイソメラーゼIV、もしくはトポイソメラーゼI、III、又は、ＤＮＡジャイレースによるＤＮＡ再結合を阻害すること、又はＤＮ
Ａ切断速度を促進することにより、染色体ＤＮＡが断片化されると推定される。
【００４６】
生菌よりも損傷菌や死菌の染色体ＤＮＡが優先的に断片化されると、生菌では染色体ＤＮＡのターゲット領域がＰＣＲにより増幅されるのに対し、損傷菌や死菌ではターゲット領域が切断される結果ＰＣＲ増幅が阻害され、例えばアムサクリンやカンプトセシンでは、さらにクロスリンクするためにＰＣＲ増幅が阻害される。したがって、ＰＣＲによって、生菌を損傷菌や死菌に比べて選択的に検出することができる。
【００４７】
尚、死菌では、細胞内のトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースの活性が失われていることがある。また、損傷菌でもこれらの酵素の活性が低下又は喪失していることがある。したがって、本発明の好ましい態様においては、ステップａ）に先立って、被検試料をトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースで処理する（ステップｄ））。ステップｄ）については後で詳述する。
【００４８】
本発明の他の好ましい態様は、前記トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤がエチジウムモノアザイドであり、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に可視光を照射する工程を含む。エチジウムモノアザイド（ＥＭＡ）は、微生物の生菌の細胞壁よりも損傷菌や死菌の細胞壁を透過しやすい。したがって、ＥＭＡは生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌や死菌の細胞壁や死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。尚、血液中の白血球、血小板が生細胞の場合、ＥＭＡは滅菌水や低張な塩溶液下で前記細胞の細胞膜をより透過する。ＥＭＡは、体細胞の死細胞及び損傷菌並びに死菌の細胞内に進入して核内ＤＮＡに無秩序にインターカレートした後、可視光照射によりインターカレートしたＥＭＡのみがナイトレンに変換され、核内ＤＮＡに共有結合する。そして、体細胞内のトポイソメラーゼII、損傷菌や死菌細胞内のトポイソメラーゼIV、又は、ＤＮＡジャイレースによるＤＮＡ再結合を阻害することにより、染色体ＤＮＡが断片化されると推定される。
【００４９】
ＥＭＡによる処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌、及び損傷菌や死菌の懸濁液に、種々の濃度のＥＭＡを加えて、種々の時間置いた後、可視光を照射して、必要に応じて遠心分離等によって菌体を分離し、ＰＣＲにより分析することによって、生菌と死菌及び損傷菌とを区別しやすい条件を決定することができる。また、可視光照射の条件も、照射時間を変えて上記の実験を行うことにより、好ましい条件を決定することができる。具体的には、ＥＭＡによる処理は終濃度０．５〜１００μｇ／ｍｌ、４〜１０℃、５分〜４８時間が好ましい。また、ＥＭＡ処理は、遮光下で行うことが好ましい。可視光としては、５００〜７００ｎｍの成分を含む可視光が好ましい。また、可視光照射の条件として具体的には、被検試料から１０〜５０ｃｍの距離から１００〜７５０Ｗの可視光を５分〜２時間照射する条件が挙げられる。可視光照射は、低温下で、例えば試料を氷冷して行うことが好ましい。
【００５０】
本発明の特に好ましい態様は、被検試料に対し、ＥＭＡ処理及び可視光照射処理と、ＥＭＡ以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理を行う。この場合、ＥＭＡ処理及び可視光照射処理と、ＥＭＡ以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理の順序は特に制限されず、また、これらの処理を同時に行ってもよい。
【００５１】
（２）ステップｂ）
ステップａ）で処理された被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲ（White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)）により増幅する。
【００５２】
被検試料からのＤＮＡの抽出は、抽出されたＤＮＡがＰＣＲにおける鋳型として機能し得る限り特に制限されず、一般的に用いられている微生物のＤＮＡの抽出法にしたがって行うことができる。
【００５３】
ＤＮＡの抽出法は、例えば、Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2001に記載されている。
【００５４】
本発明において「ターゲット領域」とは、染色体ＤＮＡのうち、本発明に用いるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅され得る領域であり、検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。検出対象の微生物に特異的なターゲット領域に対応するプライマーセットと、広汎な微生物の染色体ＤＮＡに対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生菌量と、多数種の微生物の生菌量を、同時に測定することができる。ターゲット領域の長さとしては、通常８０〜３０００塩基、好ましくは９００〜３０００塩基、特に好ましくは２０００〜３０００塩基が挙げられる。具体的には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。これらの中では、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が好ましい。
【００５５】
ＰＣＲに用いるプライマーは、上記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。具体的には、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットが挙げられる。また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号５及び６に示すプライマーセットが挙げられる。
【００５６】
また、検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、ターゲット領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のエンテロトキシン遺伝子やｉｎｖＡ遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属細菌のＭＭＳ遺伝子（エンテロバクター・サカザキ菌）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。また、同遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号７及び８に示すプライマーセットが挙げられる。
【００５７】
複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生菌を検出することができる。また、特定の細菌に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生菌を検出することができる。
【００５８】
ＰＣＲの条件は、ＰＣＲの原理に則った特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【００５９】
本発明の各態様のうち、ＥＭＡ処理及び可視光処理を行う態様においては、ターゲット領域が長い場合、例えば２０００以上の場合は、ＥＭＡ処理及び可視光照射処理のみでも効果的に生菌を検出することができる。一方、ターゲット領域が短い場合、例えば２００以下の場合は、ＥＭＡ処理及び可視光処理と、ＥＭＡ以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理を併用することが好ましい。
【００６０】
（３）ステップｃ）
続いて、ＰＣＲ増幅産物を解析する。解析法は、ＰＣＲ増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法（Nogva et al./ Application of 5'-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk. Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al./ Application of the 5'-nuclease PCR assay in evaluation and development of methods for quantitative detection of campylobacter jejuni. Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036）等が挙げられる。電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、及びその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレッショード値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショード値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【００６１】
また、増幅産物の有無は、増幅産物の融解温度（ＴＭ）パターンを解析することによっても行うことができる。
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
【００６２】
本発明の方法によって生菌を検出する場合、ＰＣＲ増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生菌の有無又は定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各ステップを行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＤＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡを標準試料として用いることもできる。
【００６３】
（４）ステップｄ）
前記のとおり、死菌では、細胞内のトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースの活性が失われることがあり、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理しても、染色体ＤＮＡの切断が起らないことがある。このような場合であっても、ステップａ）に先立って、被検試料をトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースで処理すると、死菌に選択的なＤＮＡの切断が起るため、ＰＣＲによるターゲット領域の増幅を阻害することができる。
【００６４】
トポイソメラーゼ及びＤＮＡジャイレースは、両方を用いてもよく、一方のみを用いてもよい。また、各々一種を単独で用いてもよく、２種又はそれ以上を併用してもよい。
トポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレースによる反応条件としては、具体的には後記する参考例に示される条件が例示されるが、一般的には、食品や血液等の臨床検体から回収された微生物を含む上清に対し、４℃にて１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行って上清を除去した後、ＤＮＡ切断用緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．９、５０ｍＭ塩化カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２．５％グリセロール）１ｍｌを添加し、終濃度１〜５０ｍＭとなるようにトポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレースを添加し、さらに終濃度１〜５０ｍＭとなるようにＡＴＰを加えて、３０〜３７℃で、５〜３０分反応させる。尚、トポイソメラーゼ及
びＤＮＡジャイレースの活性にはＡＴＰが必要であるため、これらの酵素で被検試料を処理する際には、ＡＴＰ又はＡＴＰ合成系を添加することが好ましい。
【００６５】
＜２＞本発明のキット
本発明のキットは、被検試料中の微生物の生菌をＰＣＲにより検出するためのキットであって、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤、並びに検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅するためのプライマーを含む。
【００６６】
上記キットにおいて、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤は、本発明の方法で説明したものと同様である。
【００６７】
本発明のキットの好ましい態様は、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤として、ＥＭＡ及びＥＭＡ以外の他のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤を含む。
【００６８】
また、本発明のキットは、上記の各要素に加えて、トポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースを含む。
【００６９】
本発明のキットは、さらに、希釈液、トポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレース反応用の反応液、本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。
【実施例】
【００７０】
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７１】
〔実施例１〕
微生物の生菌と損傷菌をそれぞれトポイソメラーゼ阻害剤で処理し、各染色体ＤＮＡにおける切断の度合いを検討した。
【００７２】
１．試料の調製
１−１）生菌及び損傷菌の懸濁液の調製
グラム陽性細菌であるリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes JCM 2873；以下、「リステリア」と略記することがある）を、ＢＨＩブロスを用いて３０℃で培養し、対数増殖期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に生理食塩水４０ｍｌを加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数を標準寒天平板培地により測定したところ、１．２×１０9ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００７３】
また、上記生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。尚、この懸濁液中の細胞には少数の生菌及び死菌も一部含まれると考えられるが、主に損傷菌であるため、単に「損傷菌」と記載する。尚、本発明の方法は本来生菌を検出する方法であり、生菌と区別される微生物は、損傷菌であるか死菌であるかは問わない。以下に示す他の細菌についても同様である。
【００７４】
１−２）トポイソメラーゼ阻害剤処理
前記で調製したリステリアの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液（それぞれ１．２×１０9ｃｆｕ／ｍｌ）１ｍｌずつを、新しく調製した９ ｍｌのＢＨＩブロスに加え（培地中の生菌及び損傷菌の菌数はともに１．２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）、ＤＭＳＯに溶解した５ｍｇ
／ｍｌのアムサクリン溶液１００μｌを添加した。アムサクリンの終濃度は５０μｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯの終濃度は１％であった。その後、それぞれ３０℃で２４時間、４８時間、又は７２時間インキュベーションした。
【００７５】
損傷菌については、損傷菌体内に残存している活性を有するＤＮａｓｅが損傷菌の染色体ＤＮＡに与える影響を調べるため、損傷菌懸濁液１ｍｌを新しく調製した９ｍｌのＢＨＩブロスに加えた後、上記アムサクリン溶液の代りに１００μｌのＤＭＳＯを加え（ＤＭＳＯ終濃度１％）、３０℃で７２時間インキュベーションした。なお、生菌懸濁液１ｍｌ、及び損傷菌懸濁液１ｍｌをコントロールとした。
【００７６】
１−３）ＤＮＡの抽出
各懸濁液を、４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を完全に除去した。ペレットに０．５ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加え、予め１０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液により５ｍｇ／ｍｌに調製されたアクロモペプチダーゼ溶液（和光純薬社製、カタログ番号： 014-09661）２０μｌを加え、５０℃で３０分間放置した。その後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ｍｌ加え、さらに１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（シグマ社製、E.C.3.4.21.64）を２０μｌ加え、予め滅菌水により１０％（ｗ／ｖ）に調製されたＳＤＳ溶液を４００μｌ加えて、５０℃で一夜処理した。
【００７７】
前記各処理液を２ｍｌ用マイクロチューブ２本に半量ずつ分けて入れ、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／飽和フェノール０．５ｍｌを加え、１５分間穏やかに混合した後、０．５ｍｌのクロロホルムを加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を、新しく用意した２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を７０μｌ、９９．５％冷エタノールを１．２１ｍｌそれぞれ加えて穏やかに混合した。４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄した。ペレットに０．５ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を加え、４℃で一夜放置してＤＮＡを溶解した。
【００７８】
予め滅菌水により１０ｍｇ／ｍｌに調製したＲＮａｓｅ（シグマ社製：EC.3.1.27.5）溶液を５μｌ加え、３７℃で１時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルム（１／１）溶液を０．２５ｍｌ加え、１０分間穏やかに混合し、クロロホルム０．２５ｍｌを更に加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を新しい２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を５０μｌ、９９．５％冷エタノールを１ｍｌそれぞれ加えて穏やかに混合した。４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄してペレットを乾燥させた。
【００７９】
乾燥させたペレットに１２５μｌのＴＥバッファーを加え４℃で一夜放置することによりＤＮＡを溶解させ、抽出ＤＮＡとした。精製ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光値（ＯＤ260、ＯＤ280：ＤＮＡ溶液５０μｇ／ｍｌにおいてＯＤ260＝１．０、セル長１ｃｍ）を測定し、ＤＮＡ濃度をＯＤ260から算出し、精製ＤＮＡの純度をＯＤ260/ＯＤ280により評価した。
【００８０】
２．試験結果
１−３）により抽出した染色体ＤＮＡを０．８ ％アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動完了後、アガロースゲルを１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド水溶液に２０分間浸積し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長２５４ｎｍ）により染色体ＤＮＡの切断の度合いを観察した。
【００８１】
上記各抽出ＤＮＡを電気泳動により解析した。結果を図１に示す。図１は、リステリア（損傷菌）の染色体ＤＮＡに与える損傷菌体内に保持されているＤＮａｓｅの影響、及びリステリア（生菌及び損傷菌）の染色体ＤＮＡに与えるアムサクリンの影響を表す。
【００８２】
その結果、リステリアの損傷菌懸濁液にアムサクリンを添加せずに、７２時間までインキュベーションしても、ウェルに滞留した極めて長いＤＮＡ断片、及び19,329 bp付近に位置する長いＤＮＡ断片に関して、有意な差は見受けられず、損傷菌体内に活性が残存しているＤＮａｓｅにより、リステリア損傷菌の染色体ＤＮＡはほとんど切断を受けていなかった。しかし、同損傷菌にアムサクリンを添加して７２時間までインキュベーションすると、特にウェルに滞留した極めて長いＤＮＡ断片が明らかに減少し、リステリアの損傷菌体内に残存している活性のあるＤＮＡジャイレース又はトポイソメラーゼを介して、アムサクリンが染色体ＤＮＡを至る所で切断状態とすることが示唆された。
【００８３】
また、リステリアの生菌懸濁液にアムサクリンを添加し、７２時間までインキュベーションすると、２４時間でウェルに滞留した極めて長いＤＮＡ断片、及び19,329 bp付近に位置する長いＤＮＡ断片が一時的に減少し、その後、インキュベーションを続けると、双方のＤＮＡ断片はインキュベーション時間に比例して増加した。これにより、アムサクリンは２４時間経過時点で生菌の細胞壁を透過し、生菌内のＤＮＡジャイレース又はトポイソメラーゼを介して染色体ＤＮＡを切断状態にするが、その中で、アムサクリンの作用を僅かしか受けていない、もしくはほとんど受けていないリステリアの残存した生菌が、再度インキュベーションすることにより増殖することが示唆された。
【００８４】
また、アムサクリンは黄色着色物質であり疎水性の極めて高い物質なので、１〜３０分という短時間作用の場合、細胞壁の損傷のない親水性の高い生菌の細胞壁はほとんど透過せず生菌のペレットは白色であるが、損傷菌は細胞壁の損傷があり疎水性も増していることから、損傷菌の細胞壁は透過し、損傷菌のペレットは黄色を呈している。本実施例により、生菌又は損傷菌であっても、アムサクリンが細胞壁を透過すれば、菌体内のＤＮＡジャイレース及び／又はトポイソメラーゼを介して染色体ＤＮＡを至るところで切断状態にすることが確認されたが、短時間作用なら損傷菌の染色体が穏和であるが選択的にランダムに切断されることになり、アムサクリン等の短時間のトポイソメラーゼ阻害剤による追加処理（例えば、ＥＭＡ等のトポイソメラーゼ阻害剤で処理した後、さらに追加で処理）を行えば、ＰＣＲ法を用いて生菌と損傷菌又は死菌を高感度に判別することが可能である。
【００８５】
〔実施例２〕
ＤＮＡジャイレース阻害剤で処理した微生物の生菌と損傷菌の染色体ＤＮＡを用い、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ法による解析を行った。
【００８６】
１．試料の調製
１−１）生菌及び損傷菌の懸濁液の調製
グラム陰性細菌であるエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ATCC 51329株；以下、「エンテロバクター」と略記することがある）をＢＨＩブロスを用いて３７℃で培養し、対数増殖後期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に生理食塩水４０ｍｌを加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数を標準寒天平板培地により測定したところ、４．４×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００８７】
また、上記生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。
リステリア・モノサイトゲネスJCM 2873の生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液を、実施例１と同様にして調製した。尚、生菌懸濁液中の生菌数は４．０×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００８８】
１−２）ＤＮＡジャイレース阻害剤（シプロフロキサシン）処理
エンテロバクター（生菌及び損傷菌）懸濁液、及びリステリア（生菌及び損傷菌）懸濁液のそれぞれ各１ｍｌづつを分取し、９ｍｌの新しく調製したＢＨＩブロスに加え（培地中のエンテロバクターの生菌及び損傷菌の菌数は、それぞれ４．４×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、４．４×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、リステリアの生菌及び損傷菌の菌数は、４．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、４．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ）、シプロフロキサシン溶液（１３０μｇ／ｍｌ；生理食塩水で溶解）２ｍｌをそれぞれに添加した。
【００８９】
損傷菌については、損傷菌体内に残存している活性を有するＤＮａｓｅが損傷菌の染色体ＤＮＡに与える影響を調べるため、エンテロバクター及びリステリアの各損傷菌懸濁液１ｍｌを新しく調製した９ｍｌのＢＨＩブロスにそれぞれ加えた後、上記シプロフロキサシン溶液の代わりに生理食塩水２ ｍｌを加えたものを用意した。
その後、エンテロバクター（生菌及び損傷菌）は３７℃で１時間３０分、３時間３０分、５時間又は７２時間培養した懸濁液をそれぞれ調製した。また、リステリア（生菌及び損傷菌）は３０℃で１時間３０分、３時間３０分、５時間又は７２時間培養した懸濁液をそれぞれ調製した。さらに、０時間培養に相当するコントロールとして、エンテロバクター、リステリアの各々の生菌及び損傷菌懸濁液を、シプロフロキサシン未添加生菌懸濁液、シプロフロキサシン未添加損傷菌懸濁液とした。
【００９０】
各懸濁液を、４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を完全に除去してペレットを回収した。エンテロバクター、及びリステリアそれぞれについて、以下の方法でＤＮＡを抽出した。
【００９１】
１−３）ＤＮＡの抽出
エンテロバクターのＤＮＡの抽出は、下記の方法により行った。
０．５ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を前記ペレットに加え、１０μｌの１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（シグマ社製：EC.3.4.21.64）を加え、予め滅菌水により１０％（ｗ／ｖ）に調製されたＳＤＳ溶液２００μｌを加え、５０℃で一夜処理した。この処理液に、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／飽和フェノール０．５ｍｌを加え、１５分間穏やかに混合した後、０．５ｍｌのクロロホルムを加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を、新しく用意した２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を７０μｌ、９９．５％冷エタノール１．２９ ｍｌ加え、穏やかに混合した。４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄した。ペレットに０．５ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を入れ、４℃で一夜放置してＤＮＡを溶解した。
【００９２】
予め滅菌水により１０ｍｇ／ｍｌに調製したＲＮａｓｅ（シグマ社製：EC.3.1.27.5）溶液５μｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルム（１／１）溶液を０．２５ｍｌ加え、１０分間穏やかに混合し、クロロホルム０．２５ｍｌを更に加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を新しい２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を５０μｌ、９９．５％冷エタノール１ｍｌそれぞれを加え、穏やかに混合した。４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄しペレットを乾燥させた。
【００９３】
乾燥させたペレットに１２５μｌのＴＥバッファーを加え４℃で一夜放置することによりＤＮＡを溶解させ、抽出ＤＮＡとした。精製ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光値（ＯＤ260、ＯＤ280：ＤＮＡ溶液５０μｇ／ｍｌにおいてＯＤ260＝１．０、セル長１ｃｍ）を測定し、ＤＮＡ濃度をＯＤ260から算出し、精製ＤＮＡの純度をＯＤ260/ＯＤ280により評価した。
【００９４】
なお、リステリアのＤＮＡの抽出は、実施例１の「１−３）ＤＮＡの抽出」の方法に準じて行った。
【００９５】
１−４）ＰＣＲ増幅産物の電気泳動
１−３）により抽出した染色体ＤＮＡを０．８ ％アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動完了後、アガロースゲルを１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド水溶液に２０分間浸積し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長２５４ｎｍ）により染色体ＤＮＡの切断の度合いを観察した。
【００９６】
２．試験方法（２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ、及び電気泳動）
２−１）ＰＣＲマスターミックスの調製
下記の組成によりマスターミックス（全量５０μｌ）を調製した。
・Ex-Taq（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：０．２５μｌ
・10×Ex-Taq Buffer（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：５μｌ
・dNTP mixture（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：４μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号１（２３Ｓ−Ｆ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号２（２３Ｓ−Ｒ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号３（２３Ｓ−ＭＦ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号４（２３Ｓ−ＭＲ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・２×ＳＹＢＡ Ｇｒｅｅｎ （ＢＭＡ社製、カタログ番号：５０５１３）：１０μｌ
・滅菌水：１５．７５μｌ
・鋳型ＤＮＡ（１５ｎｇ／μｌ）：１０μｌ
尚、配列番号１、２のプライマーは、２３Ｓ ｒＲＮＡのほぼ全領域を増幅するためのプライマーであり、およそ2840bpの増幅断片がグラム陰性細菌を中心に得られる。配列番号３、４のプライマーは２３Ｓ ｒＲＮＡの中央領域に相当し、約900bpの増幅断片がグラム陽性細菌（グラム陰性細菌も増幅する）から得られる。
【００９７】
２−２）２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
エンテロバクターの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイルは表１に示すとおりである。
【００９８】
【表１】
【００９９】
リステリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイルは表２に示すとおりである。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
２−３）ＰＣＲ反応
前記１−３）で調製した各ＤＮＡ溶液を、ＴＥバッファーで１５ｎｇ／μｌに希釈し、その１０μｌを前記２−１）の鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応液中に１５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む。ネガティブコントロールとしてはＴＥバッファー１０μｌを用いた。
【０１０２】
前記２−２）で示したＰＣＲサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムＰＣＲ装置i Cycler（バイオラッド社製、機種番号：ｉＱ）を用いて、ＰＣＲ反応、及び増幅産物のＴＭ解析（融解温度解析）を行った。リアルタイムＰＣＲのスレッシュホールド値（境界値）は、０サイクル〜１０サイクルまでのSYBA Greenによる蛍光量の標準偏差ＳＤに１０を乗じた値とした。また、各リアルタイムＰＣＲ増幅曲線において、スレッシュホールド値を超えるサイクル数を、以下「Ｃｔ値」と略記する。
【０１０３】
３．試験結果
本実施例における試験結果を図２〜図１１に示す。図２は、エンテロバクター（損傷菌）の染色体ＤＮＡに与える菌体内保持ＤＮａｓｅの影響を示している。図３は、同菌（生菌及び損傷菌）の染色体ＤＮＡに与えるシプロフロキサシンの影響を示している。図４は、リステリア（損傷菌）の染色体ＤＮＡに与える損傷菌体内保持ＤＮａｓｅの影響を示している。図５は、及び同菌（生菌及び損傷菌）の染色体ＤＮＡに与える同薬剤の影響を示している。
【０１０４】
また、図６は、シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター生菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたリアルタイムＰＣＲ曲線を示している。図７は、図６における増幅産物のＴＭパターン解析を示している。同様に、同薬剤で処理された同菌損傷菌のリアルタイムＰＣＲ曲線及び増幅産物のＴＭパターン解析結果を図８、及び図９にそれぞれ示す。さらに、同薬剤で処理されたリステリア生菌及び損傷菌のリアルタイムＰＣＲ曲線を図１０、及び図１１にそれぞれ示す。
【０１０５】
図２より、エンテロバクター損傷菌体内に保持されているＤＮａｓｅにより、損傷菌染色体ＤＮＡは７２時間かけてわずかに切断されていることが確認された。しかしながら、図３より、損傷菌にシプロフロキサシンを１．５〜５時間作用させても上記ＤＮａｓｅより遥かに強いＤＮＡ切断現象が見受けられた。生菌の場合、19329 bp付近の長い染色体Ｄ
ＮＡ断片が逆に増加し、シプロフロキサシンを短時間作用させることにより、バクテリアＤＮＡジャイレースを介して生菌より損傷菌の染色体ＤＮＡをより切断していることが確認された。
図４が示すように、損傷菌染色体ＤＮＡは、19329bp付近の染色体ＤＮＡ由来の長い断片では、７２時間かけてもリステリア損傷菌体内に保持されているＤＮａｓｅによるＤＮＡ切断現象はほとんど見受けられなかった。しかしながら、図５が示すように、損傷菌にシプロフロキサシンを７２時間作用させると、上記ＤＮａｓｅにより、はるかに強いＤＮＡ切断現象が見受けられた。生菌へのシプロフロキサシンの作用効果も同様と解釈される。
【０１０６】
また、エンテロバクターの生菌、損傷菌ともに、７２時間シプロフロキサシンを作用させると、ＰＣＲが大幅に抑制されたが、Ｃｔ（生菌；Ｃｉｐ７２時間）−Ｃｔ（生菌；Ｃｉｐ未）＝１３、及びＣｔ（損傷菌；Ｃｉｐ７２時間）−Ｃｔ（損傷菌；Ｃｉｐ未）＝１７に示されるように、損傷菌の方がよりＰＣＲが抑制された。すなわち、２７サイクルでＰＣＲを打ち切った場合、生菌由来のＰＣＲは陽性、損傷菌由来のＰＣＲは陰性と判断されるため、シプロフロキサシンにより生菌と損傷菌を識別できることが確認された。リステリアについても、同様に、図１０、図１１にそれぞれ示すように、２０サイクルでＰＣＲを打ち切った場合、生菌由来のＰＣＲは陽性、損傷菌由来のＰＣＲは陰性と判断されるため、同薬剤によりリステリアに関しても生菌と損傷菌が識別できることが確認された。
【０１０７】
図７及び図９に示されるように、シプロフロキサシンを７２時間作用させたエンテロバクター・サカザキ生菌と損傷菌の染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物のＴＭパターン解析により、生菌のＰＣＲ増幅産物は、ターゲットである２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当するが、損傷菌のＰＣＲ増幅産物はターゲットとしている増幅産物ではないと推定される。損傷菌のＰＣＲ増幅産物は、鋳型ＤＮＡの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の内部に複数の切断が生じたため、結果として２３Ｓ ｒＲＮＡの一部の領域が増幅されたと考えられる。以上のように、シプロフロキサシン処理により、ＰＣＲによる生菌と損傷菌の識別が可能であることが示された。
【０１０８】
〔実施例３〕
ＥＭＡで処理した微生物の生菌と損傷菌の染色体ＤＮＡを用い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子又は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ法による解析を行った。
【０１０９】
１．試料の調製
１−１)グラム陰性細菌（生菌及び損傷菌）懸濁液の調製
大腸菌ＤＨ５α（以下、「大腸菌」と略記することがある）、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri JCM 1658；以下、「シトロバクター」と略記することがある）、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis IID 604；以下、「サルモネラ」と略記することがある）、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca JCM 1665；以下、「クレブシェラ」と略記することがある）を、ＢＨＩブロスを用いて３７℃で培養し、対数増殖後期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、生理食塩水４０ｍｌを入れよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。これらの生菌懸濁液の生菌数は、大腸菌：３．２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ、シトロバクター：６．７×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、サルモネラ：１．９×１０8ｃｆｕ／ｍｌ、クレブシェラ：４．８×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【０１１０】
また、各生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。
【０１１１】
１−２)グラム陽性細菌（生菌及び損傷菌）懸濁液の調製
バチルス・セレウス（Bacillus cereus JCM 2152；以下、「バチルス」と略記することがある）、及びスタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis KD；以下、「スタフィロコッカス」と略記することがある）を３７℃で、また、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes JCM 2873；以下、「リステリア」と略記することがある）を３０℃で、それぞれＢＨＩブロスで培養した。対数増殖期の各培養液４０ｍｌ（バチルスに関しては栄養型細胞）を４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、生理食塩水４０ｍｌを入れてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数は、バチラス：３．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、リステリア：１．３×１０8ｃｆｕ／ｍｌ、スタフィロコッカス：１．１×１０6ｃｆｕ／ｍｌであった。
また、各生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。
【０１１２】
２．試験方法
２−１）ＥＭＡ処理及び可視光照射工程
１０００μｇ／ｍｌとなるようにＥＭＡ（シグマ社製、カタログ番号：E 2028）を滅菌水に溶解し、０．４５ μｍのマイクロフィルターによりろ過したＥＭＡ水溶液を、前記グラム陰性細菌（生菌及び損傷菌）、及びグラム陽性細菌（生菌及び損傷菌）の各懸濁液１ｍｌに１０μｌずつ添加し、遮光下で、４℃、３０分間放置した。その後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から２０ｃｍの距離に設置した５００Ｗの可視光線（FLOOD PRF：100V、500W、岩崎電気社製）を１０分間照射した。以上のＥＭＡ溶液を添加し、可視光線を照射する工程を、「ＥＭＡ処理」と略記することがある。別途、前記グラム陰性細菌（生菌及び損傷菌）及び前記グラム陽性細菌（生菌及び損傷菌）の懸濁液各１ｍｌにＥＭＡ溶液の代りに１０μｌの滅菌水を加え、以下ＥＭＡ処理と同様に処理した。
【０１１３】
２−２）ＤＮＡ抽出
前記グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌の生菌、損傷菌（それぞれＥＭＡ未処理及びＥＭＡ処理）の入ったマイクロチューブを４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離した。各マイクロチューブに９９０μｌの生理食塩水を加えよく攪拌した後、２ｍｌマイクロチューブに全量移し、４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した。以下、実施例１、「１−３）ＤＮＡの抽出」と同様にしてＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ濃度の測定及び純度の評価を行った。
【０１１４】
３．１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、又は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ
３−１）ＰＣＲマスターミックスの調製
【０１１５】
下記の組成によりマスターミックス（全量５０μｌ）を調製した。
・Ex-Taq（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：０．２５μｌ
・10×Ex-Taq Buffer（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：５μｌ
・dNTP mixture（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：４μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号１（２３Ｓ−Ｆ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号２（２３Ｓ−Ｒ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号３（２３Ｓ−ＭＦ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号４（２３Ｓ−ＭＲ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号５（１６Ｓ−Ｆ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号６（１６Ｓ−Ｒ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・２×ＳＹＢＡ Ｇｒｅｅｎ （ＢＭＡ社製、カタログ番号：５０５１３）：１０μｌ
・滅菌水：１５．７５μｌ
・鋳型ＤＮＡ（１５ｎｇ／μｌ）：１０μｌ
【０１１６】
３−２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイルは表３に示すとおりである。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
３−３）２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
各細菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイルは表４（グラム陰性細菌）、表５（グラム陽性細菌）に示すとおりである。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
【表５】
【０１２１】
３−４）ＰＣＲ反応
前記２−２）で調製した各ＤＮＡ溶液を、ＴＥバッファーにより１５ｎｇ／μｌに希釈し、その１０μｌを前記３−１）の鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応液中に１５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む。ネガティブコントロールとしてはＴＥバッファー１０μｌを用いた。
【０１２２】
前記３−２）、又は３−３）で示したＰＣＲサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムＰＣＲ装置i Cycler（バイオラッド社製、機種番号：ｉＱ）を用いて、ＰＣＲ反応、及び増幅産物のＴＭ解析（融解温度解析）を行った。リアルタイムＰＣＲのスレッシュホールド値（境界値）及びＣｔ値の算出は、実施例２、２−３）と同様である。
３−５）ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動
【０１２３】
Seakem GTG アガロース（ＦＭＣ社製、カタログ番号：50070）とＴＡＥバッファー（Ｔｒｉｓ４．８４ｇ／ｌ、酢酸１．１４２ｍｌ／ｌ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ０．１４９ｇ／ｌ）により０．８％アガロースゲルを作製し、マーカーとしてλ-EcoT14 I digest（宝酒造社製、Code：3401）及び100bp DNA Ladder（宝酒造社製、Code：3407A）を用い、グラム陰性細菌、及びグラム陽性細菌に関してそれぞれ、各ＰＣＲ反応溶液１０μｌをウェルに注入し、電気泳動を行い、ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）がゲルを９割程度泳動した時点で電気泳動を終了させた。
【０１２４】
１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に、電気泳動後のゲルを２０分間浸積し、イオン交換水で２回洗浄し後、ＵＶトランスイルミネーター（２５４ｎｍ）によりＰＣＲ増幅産物を観察した。
【０１２５】
４．試験結果
細菌懸濁液１ｍｌを入れた１．５ｍｌマイクロチューブを沸騰水に浸漬したときの温度の経時変化を図１２に示す。図１２から、損傷菌懸濁液の調製における沸騰水５０秒浸積は、７２〜７５℃、１５〜１６秒の高温短時間殺菌（ＨＴＳＴ殺菌）より、やや激しく加熱処理した方法であり、従って、超高温瞬間殺菌（ＵＨＴ殺菌）と同等の加熱処理に相当することがわかる。
【０１２６】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにした生菌、損傷菌の識別結果を図１３に、及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにした生菌、損傷菌の識別結果を図１４、図１５にそれぞれ示す。図１３〜１５において、各細菌のＰＣＲ反応溶液は、生菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、生菌懸濁液・ＥＭＡ処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ処理の順番でゲルにロードされている。
【０１２７】
図１３より、ターゲットが１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の場合には、シトロバクター及びクレブシェラでは、ＥＭＡ処理した損傷菌ではＰＣＲ増幅産物が見られず、生菌と損傷菌の明確な識別が可能であった。その他の細菌については、ＥＭＡ処理した損傷菌で増幅産物が認められ、生菌と損傷菌との識別が不明確であった。
【０１２８】
一方、図１４及び図１５より、ターゲットが２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の場合は、グラム陰性細菌及び陽性細菌のいずれの細菌においても、ＥＭＡ処理により、生菌と損傷菌の識別を明瞭に行なえることが示された。サンプルバックグラウンドとして１０8ｃｆｕ／ｍｌレベルの細菌の損傷菌を含む被検試料を用いて、１５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを５０μｌのＰＣＲに供しても、損傷菌のＰＣＲ反応は完全に抑制され、生菌のＰＣＲはほぼ完全に抑制されなかった。また、１０5〜１０7ｃｆｕ／ｍｌの損傷菌を含む牛乳においても、損傷菌のＰＣＲは完全に抑制され、生菌を低濃度で検出することが可能であると考えられることから、食品衛生検査の一般細菌のスクリーニング検査として適用することが可能である
。さらに、敗血症で肝機能障害を持つ患者の場合、血液中に生菌及び損傷菌が１０4ｃｆｕ／ｍｌ以上の高濃度で存在する可能性もあり、そのような場合にも本発明により生菌のみを迅速に検出できる。
【０１２９】
〔実施例４〕
病原性細菌をＥＭＡ、及びトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理し、病原遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ法による細菌の生菌・損傷菌の識別を行った。
【０１３０】
１．細菌(生菌)培養液の調製
実施例１と同様にして、リステリア（リステリア・モノサイトゲネス：Listeria monocytogenes JCM 2873）の生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液を調製した。生菌懸濁液の生菌数は、１．３×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった
【０１３１】
２．試験方法
２−１）ＥＭＡ処理及び可視光照射工程
前記で調製したリステリアの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液に対し、実施例３と同様にして、ＥＭＡ処理及び可視光照射を行った。なお、ＥＭＡは細胞壁に外膜を有さないグラム陽性細菌の場合、細胞壁損傷のない生菌であっても、透過しやすい傾向があるので、ＥＭＡ添加後の遮光下４℃での放置時間を５分に短縮し、可視光照射時間も５分に短縮した。また、生菌及び損傷菌懸濁液に対してＥＭＡを添加する代わりに滅菌水１０μｌを添加し、同様の処理を行ったものも用意した。
【０１３２】
２−２）トポイソメラーゼ阻害剤、又はＤＮＡジャイレース阻害剤処理工程
前記のＥＭＡ処理及び可視光照射工程を終えた後、各処理液が入ったマイクロチューブを４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に１ｍｌの生理食塩水を加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離した、上清を除去した後、菌体に生理食塩水１ｍｌを加えてよく攪拌した。こうして、生菌のＥＭＡ未処理１ｍｌ×１本、生菌のＥＭＡ処理１ｍｌ×７本、損傷菌のＥＭＡ未処理１ｍｌ×１本、損傷菌のＥＭＡ処理１ｍｌ×７本作製した。
【０１３３】
ＥＭＡ処理した生菌及び損傷菌の１本づつを１セットとして、６つのセットに分けた。第１セットにＤＮＡジャイレース阻害剤であるシプロフロキサシン（０．５ｍｇ／ｍｌ；生理食塩水により溶解）を８μｌ、第２セットにトポイソメラーゼ阻害剤であるカンプトセシン（１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を１０μｌ、第３セットに対しトポイソメラーゼ阻害剤であるエトポシド（１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を１０μｌ、第４セットにトポイソメラーゼ阻害剤であるエリプチシン（０．１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を５μｌ、第５セットにトポイソメラーゼ阻害剤であるミトキサントロン（０．１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を１０μｌ、第６セットにトポイソメラーゼ阻害剤であるアムサクリン（１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を１０μｌそれぞれ添加した。各試料を、３０℃で３０分間インキュベーションした後、２ｍｌマイクロチューブに全量移し、４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した。
【０１３４】
２−３）ＤＮＡ抽出工程
上記のようにして調製した各試料から、実施例１、「１−３）ＤＮＡの抽出」と同様にしてＤＮＡを抽出した。
【０１３５】
３．リステリア菌の各種遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ
３−１）病原遺伝子リステリア・リステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子増幅
３−１−１）ＰＣＲマスターミックスの調製
【０１３６】
下記の組成によりマスターミックス（全量５０μｌ）を調製した。
・Ex-Taq（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：０．２５μｌ
・10×Ex-Taq Buffer（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：５μｌ
・dNTP mixture（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：４μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号７（ｈｌｙＡ−Ｆ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号８（ｈｌｙＡ−Ｒ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・２×SYBA Green（ＢＭＡ社製、カタログ番号：50513）：１０μｌ
・滅菌水：１５．７５μｌ
・鋳型ＤＮＡ（１５ｎｇ／μｌ）：１０μｌ
３−１−２）ｈｌｙＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
【０１３７】
【表６】
【０１３８】
３−１−３）ＰＣＲ反応
前記２−３）で調製した各ＤＮＡ溶液をＴＥバッファーにより１５ｎｇ／μｌに希釈し、その１０μｌについて前記３−１−１）における鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応液中に１５０ｎｇのＤＮＡを含む。ネガテイブコントロールとしてはＴＥバッファー１０μｌを用いた。
【０１３９】
前記３−１−２）で示したＰＣＲサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムＰＣＲ装置i Cycler（バイオラッド社製、機種番号：ｉＱ）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１４０】
３−２）１６ＳｒＲＮＡ、及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅
３−２−１）ＰＣＲマスターミックスの調製
実施例３、３−１）「ＰＣＲマスターミックスの調製」と同様にしてマスターミックス（全量５０μｌ）を調製した。
３−２−２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
実施例３、３−２）「１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル」（表３）にしたがった。
【０１４１】
３−２−３）グラム陽性細菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
実施例３、３−３）「グラム陽性細菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル」（表５）にしたがって行った。
３−２−４）ＰＣＲ反応
前記２−３）で調製した各ＤＮＡ溶液を、ＴＥバッファーにより１５ｎｇ／μｌに希釈
し、その１０μｌを前記３−１−１）又は３−２−１）の鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応液中に１５０ｎｇのＤＮＡを鋳型を含む。ネガテイブコントロールとしては、ＴＥバッファー１０μｌを用いた。
【０１４２】
前記３−２−２）又は３−２−３）で示したＰＣＲサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムＰＣＲ装置i Cycler（バイオラッド社製、機種番号：ｉＱ）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１４３】
３−３）ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動
電気泳動は、実施例２、１−４）「ＰＣＲ増幅産物の電気泳動」と同様にして行った。なお、ｈｌｙＡ遺伝子増幅産物の検出は、３％アガロースゲルを使用した。
【０１４４】
４．試験結果
ｈｌｙＡ遺伝子がターゲットのときの結果を図１６に、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子がターゲットのときの結果を図１７及び図１８にそれぞれ示す。
【０１４５】
図１６及び図１７より、ｈｌｙＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした場合、ＥＭＡ処理により、損傷菌のＤＮＡ増幅がわずかに阻害される程度であった。しかし、ＥＭＡとともに、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理した場合、損傷菌のＤＮＡ増幅はさらに阻害された。特に、ｈｌｙＡ遺伝子をターゲットにした場合は、エトポシド、ミトキサントロン、又はアムサクリン、及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした場合は、カンプトセシン、エトポシド、エリプチシン、又はアムサクリンを、それぞれＥＭＡと併用することにより、損傷菌のＤＮＡ増幅が著しく阻害された。
また、図１８により、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした生菌の場合、ＥＭＡとその他のトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤を併用することにより、ＰＣＲが同様に著しく阻害された。
【０１４６】
特定病原細菌に焦点を当て生菌と死菌又は損傷菌との識別を迅速に行なう場合、病原遺伝子の特異性を高めるためには１００〜２００ｂｐという短い遺伝子領域をターゲット領域とする傾向がある。ターゲット領域がこのように短い場合は、ＥＭＡが損傷菌の細胞壁を透過してＤＮＡの切断が生じても、ターゲット領域が切断されずに増幅される結果、ＰＣＲは完全に抑制されないと考えられる。一方、ＥＭＡとトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤とを併用することにより、１１３ｂｐの極めて短いｈｌｙＡ遺伝子をターゲットにした場合であっても、１０8ｃｆｕ／ｍｌレベルのリステリア損傷菌のＰＣＲをほぼ完全に抑制し、生菌のＰＣＲはほとんど抑制されなかった。
これは、トポイソメラーゼ阻害剤がＥＭＡと異なった位置にＤＮＡクロスリンクをランダムに行い、損傷菌体内の活性を残存したＤＮＡジャイレース、バクテリア・トポイソメラーゼＩ、III、及びIVの切断−再結合の中でも、再結合を阻害することにより、ＥＭＡ単独によるＤＮＡ切断状態より、さらに激しくあらゆる箇所でＤＮＡ切断状態に至らしめ、100bp〜200bpの短いターゲット遺伝子の中にも切断が生じた結果等と考えられる。
したがって、高濃度の特定病原細菌の損傷菌バックグラウンドを含む食品や各種臨床検体において、特定病原細菌の生菌と損傷菌又は死菌との識別を明瞭に行うことが可能である。ただし、死菌のＰＣＲ増幅産物抑制のためには、損傷菌とは異なり、トポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレースが失活していることもあるので、予めＡＴＰ及びＭｇ2+と、トポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレース（酵素）を添加しておいた方がより好ましい。
例えば、抗結核剤を投与されている結核症の患者においては、治療中後期における検査材料の喀痰において、抗結核剤により結核菌損傷菌が１０8〜１０9ｃｆｕ／ｍｌの濃度で存在しているが、そのような場合であっても、本発明に方法により、生菌のみを検出することが可能である。
【０１４７】
［参考例１］食品からの被検試料の調製
本発明の被検試料の１つである食品として、牛乳中に微生物が混入していた場合を想定した被検試料の調製法を以下に例示する。
【０１４８】
牛乳に、終濃度が１〜５ｍＭ、特に２ｍＭとなるようにＥＤＴＡ溶液、及び終濃度が０．１〜０．５％、特に０．１％となるようにＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ添加し、１０，０００×ｇにて、１０分間、４℃により冷却遠心分離した。なお、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌのリパーゼ（シグマ社製E.C.3.1.1.3）を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理した後、終濃度が２０Ｕ／ｍｌとなるようにプロテイナーゼＫを（シグマ社製E.C.3.4.21.64）添加して３０分〜１時間放置することが好ましい。液表面の脂肪層及び中間部の水層を除去し、沈渣を回収した。この沈渣には、細菌、乳腺上皮細胞、ウシ白血球等の体細胞が含まれており、１０，０００×ｇ以上で遠心分離した場合は、プロテイナーゼＫにより不完全に分解したミセルタンパク質分解物（カゼインミセル不完全分解物）も含まれる。ここで、カゼインミセル不完全分解物は疎水性の高いα、β−カゼインのサブミセルと考えられる。
【０１４９】
前記沈渣に当初と同容量の生理食塩水を添加して懸濁した後、１００×ｇにて、５分間、４℃で冷却遠心分離し、微生物等が存在する上清を回収した。
【０１５０】
［参考例２］血液からの被検試料の調製（１）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加え、１０，０００×ｇにて、５分間、４℃で遠心分離し、上清は除去し、沈渣を回収した。この沈渣には、細菌、血小板、単球やリンパ球等の単核球、顆粒球、及び赤血球が含まれていた。
【０１５１】
［参考例３］血液からの被検試料の調製（２）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加え、１００×ｇにて、５分、４℃で冷却遠心分離し、血漿と血球成分（単球やリンパ球等の単核球、並びに顆粒球及び赤血球）に分離し、微生物が存在する血漿を回収した。
【０１５２】
［参考例４］血液からの被検試料の調製（３）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加えた。滅菌試験管に、まず２倍希釈されたヘパリン加血液と同容量のFicoll-Paque［アマシャムバイオサイエンス社製；Ficoll 400 （フィコール４００）は５．７ｇ／１００ｍｌ、ジアトリゾエートナトリウムは９ｇ／１００ｍｌである。比重１．０７７ｇ／ｍｌ］を充填し、その後、前記の２倍希釈されたヘパリン加血液を、試験管を斜めに傾けながらゆっくりと重層した。続いて、１００×ｇ、５分間、４℃で冷却遠心分離し、微生物が存在する上清を回収した。なお、Ficoll-Paqueに２倍希釈されたヘパリン加血液を重層するする前に、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌのリパーゼ（シグマ社製E.C.3.1.1.3）溶液を添加した後、１０〜５０Ｕ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼI（シグマ社製、EC 3.1.21.1）溶液を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理後、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌとなるようにプロテイナーゼＫ（シグマ社製E.C.3.4.21.64）を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理することが好ましい。
【０１５３】
［参考例５］血液からの被検試料の調製（４）
滅菌試験管に、予めヘパリン加血液の１／２容量となるようにMonopolyTM［アマシャムバイオサイエンス社製； Ficoll（フィコール）とMetrizoate（メトリゾエート）の混合液、比重１．１１５ｇ／ｍｌ］添加しておき、試験管を傾けながらゆっくりとヘパリン加血液を重層した。その後、１００×ｇ、５分、４℃で冷却遠心分離し、細菌が存在する上清を回収した。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明により、培養法の特性をそのまま引き継いだ迅速代替法として、食品や臨床試料中に含まれる微生物の生菌（Viable-and-Culturable）を死菌（Dead）や損傷菌（Injured
or Viable-but-Non Culturable state）に比べて選択的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】リステリア（損傷菌）の染色体DNAに与える損傷菌体内DNaseの影響、リステリア（損傷菌）の染色体DNAに与えるアムサクリンの影響、及び、リステリア（生菌）の染色体DNAに与えるアムサクリンの影響を示す電気泳動写真。未： 未処理；アムサクリン(-): アムサクリン未添加；アムサクリン(+): アムサクリン添加；1: 30 ℃ 24時間インキュベーション；2: 30 ℃ 48時間インキュベーション；3: 30 ℃ 72時間インキュベーション；
【図２】エンテロバクター（損傷菌）の染色体DNAに与える損傷菌体内DNaseの影響を示す電気泳動写真。未： 未処理；1: 37 ℃、24時間インキュベーション；2: 37 ℃、48時間インキュベーション；3: 37 ℃、72時間インキュベーション；
【図３】エンテロバクター（生菌・損傷菌）の染色体DNAに与えるシプロフロキサシンの影響を示す電気泳動写真。未： 未処理；1: 37 ℃、1.5時間インキュベーション；2: 37 ℃、3.5時間インキュベーション；3: 37 ℃、 5時間インキュベーション；4: 37 ℃、72時間インキュベーション；
【図４】リステリア（損傷菌）の染色体DNAに与える損傷菌体内DNaseの影響を示す電気泳動図。未： 未処理；1: 30 ℃、24時間インキュベーション；2: 30 ℃、48時間インキュベーション；3: 30 ℃、72時間インキュベーション；
【図５】リステリア（生菌、損傷菌）の染色体DNAに与えるシプロフロキサシンの影響を示す電気泳動写真。未： 未処理；1: 30 ℃、1.5時間インキュベーション；2: 30 ℃、3.5時間インキュベーション；3: 30 ℃、 5時間インキュベーション；4: 30 ℃、72時間インキュベーション；
【図６】シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター（生菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅曲線（中間調画像の写真）。
【図７】シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター（生菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅産物のTMパターン（中間調画像の写真）。
【図８】シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター（損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅曲線（中間調画像の写真）。
【図９】シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター（損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅産物のTMパターン（中間調画像の写真）。
【図１０】シプロフロキサシン処理されたリステリア（生菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅曲線（中間調画像の写真）。
【図１１】シプロフロキサシン処理されたリステリア（損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅曲線（中間調画像の写真）。
【図１２】細菌懸濁液を入れたマイクロチューブの沸騰水への浸積時間と液温の関係を示す図。
【図１３】EMA未処理又はEMA処理された７種の細菌(生菌・損傷菌)の16S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。各細菌毎に、それぞれ、生菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、生菌懸濁液・ＥＭＡ処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ処理の順序である。図１４及び図１５においても同様である。
【図１４】EMA未処理又はEMA処理された4種の細菌（生菌・損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。
【図１５】EMA未処理又はEMA処理されたリステリア（生菌・損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。
【図１６】EMA未処理又はEMA処理後、DNAジャイレース阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤で処理したリステリア（生菌・損傷菌）のhlyA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。未: 未処理；E: EMA；1: EMA-シプロフロキサシン；2: EMA-カンプトセシン；3: EMA-エトポシド；4: EMA-エリプチシン；5: EMA-ミトキサントロン；6: EMA-アムサクリン
【図１７】EMA未処理又はEMA処理後、DNAジャイレース阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤で処理したリステリア（生菌・損傷菌）の16S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。未: 未処理；E: EMA；1: EMA-シプロフロキサシン；2: EMA-カンプトセシン；3: EMA-エトポシド；4: EMA-エリプチシン；5: EMA-ミトキサントロン；6: EMA-アムサクリン
【図１８】EMA未処理又はEMA処理後、DNAジャイレース阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤で処理したリステリア（生菌・損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。未: 未処理；E: EMA；1: EMA-シプロフロキサシン；2: EMA-カンプトセシン；3: EMA-エトポシド；4: EMA-エリプチシン；5: EMA-ミトキサントロン；6: EMA-アムサクリン；
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や臨床試料中に含まれる微生物の検出法、及び微生物検出キットに関する。さらに詳しくは、食品や臨床試料中に含まれる微生物の生菌の選択的な検出が可能な検出法及び微生物検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品や臨床試料、又は環境中の一般生菌数の測定には、従来、平板培養法が用いられてきた。しかし、平板培養法は結果が得られるまでに２日間程度の時間を要する。
【０００３】
食品の殺菌技術や加工技術が向上したことにより、微量であっても被検試料中に存在する微生物の生死の状態を識別するニーズが高まっている。特に、食品衛生検査や臨床検査領域においては、細菌の迅速検出法として、ＰＣＲ法により各細菌の特異遺伝子を視覚的に捉えられる量まで増幅し、各細菌の存在の有無を判別及び定量する試みがなされている。しかし、細菌のＤＮＡにターゲットを当てた場合、被検試料に元来含まれている死菌のバックグラウンドまで検出されるため、ＰＣＲで陽性判定がでた場合、必ずしも生きた細菌の存在を示唆しているとは限らなかった。そのために、食品衛生や臨床検査の分野では、ＰＣＲは高感度・迅速でありながら普及していないのが現状であった。
【０００４】
最近では、ｍＲＮＡをターゲットにして、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製後、各細菌の特異プライマーを用いてＰＣＲを行い、被検試料中の生菌のみを検出・定量する試みがなされている。しかし、この方法では死菌のｍＲＮＡの逆転写そのものが阻害されるわけではなく、１０4ｃｆｕ／ｍｌ又は１０4ｃｆｕ／ｇ以上の死菌が被検試料に含まれている場合、死菌のバックグラウンドを検出してしまうため、生死の判別法としては十分なものとは言えなかった。
【０００５】
具体的には、ＰＣＲ法を利用した細菌等の微生物の生死を判別する方法としては、特許文献１又は特許文献２に記載の方法が開示されている。しかしながら、これらのＰＣＲ法を利用した細菌等の微生物の生死を判別する方法には以下に示すような問題が残されていた。
【０００６】
前記特許文献１の技術は、１００℃、１０〜３０分の高温長時間加熱殺菌が施された一部のボイル（煮沸）食品中における死菌や、エタノール殺菌やホルムアルデヒト殺菌を施した食品中の微生物の識別を例示しているが、特に後者については実際そのような殺菌処理を施されている食品は存在しない。また、現在食品業界で主流な殺菌方法である低温保持殺菌（ＬＴＬＴ殺菌）、高温短時間（ＨＴＳＴ殺菌）または超高温瞬間加熱殺菌（ＵＨＴ殺菌）を施された食品中の生きた微生物のみの検出や、抗生物質投与を受けた感染症患者における臨床検体中の生きた特定病原菌等の検出は想定されていない。また、特許文献１の技術では、被検試料中に死菌バックグラウンドが１０4ｃｆｕ／ｍｌ以上の濃度で存在する食品や臨床検体の場合、死菌由来のＰＣＲ最終増幅産物量が検出限界以上になり、被検試料のＰＣＲ陽性反応が生菌由来か死菌由来かの識別が不可能である。
【０００７】
また、前記特許文献２の技術は、死細胞のＲＮＡ／ＤＮＡモル比が生細胞のそれと比較して相対的に低下することを利用した生菌と死菌を識別する方法を開示したものである。この方法は、トータルＲＮＡを抽出し逆転写反応を利用してコンプリメンタリーＤＮＡを作製し、その後ＰＣＲを行ってそのＣｔ値を算出し、別途作製した検量線によりＲＮＡのモル濃度を求め、一方で、このＲＮＡに相当する染色体ＤＮＡの領域をＰＣＲにより増幅してＣｔ値を求め、前記検量線より染色体ＤＮＡのモル濃度を算出することにより、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡのモル比を求めるものである。すなわち、上記操作は、煩雑なトータルＲＮＡ抽出を行う必要があり、逆転写反応−ＰＣＲという２ステップを伴うために、定量性や迅速性で通常のＤＮＡをターゲットにしたＰＣＲより劣る。更に、生菌ではＲＮＡが連続的に産生される一方、死菌由来のＲＮＡは早期に分解されるため安定性に欠ける。また、高濃度の死菌を含む食品や臨床検体においてはその１／１０濃度の生菌しか検出できない。したがって、迅速、高感度、且つ精確性を要求される食品衛生検査や臨床検査においては適用が困難であった。
【特許文献１】特表２００３−５３０１１８号公報
【特許文献２】国際公開第２００２／０５２０３４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、食品や臨床試料中に含まれる微生物の生菌（live cell）（Viable-and-Culturable cell）を死菌（Dead cell）や損傷菌（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell；「VNC cell」）に比べて選択的に検出する方法、すなわち、培養法の特性をそのまま引き継いだ迅速代替検出法、及び同方法を実施するためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、種々の殺菌方法に適用可能な、検出感度が高い食品衛生検査に適した微生物の生死の判別法、及び病院や臨床現場において感染症患者における特定病原菌の検出も可能な方法について鋭意検討したところ、被検試料中の微生物の生菌及び損傷菌を判別する方法において、被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理すること、又は、エチジウムモノアザイド処理と可視光照射、及びエチジウムモノアザイド以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理することにより、生菌染色体ＤＮＡを選択的にＰＣＲ反応により増幅することができ、培養法の迅速代替法となることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
ａ）前記被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【００１１】
前記方法は、前記増幅産物の解析を、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを好ましい態様としている。
【００１２】
また前記方法は、前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲ法により行い、ＰＣＲと増幅産物の解析を同時に行うことを好ましい態様としている。
【００１３】
また前記方法は、前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかであることを好ましい態様としている。
【００１４】
また前記方法は、前記微生物が細菌であることを好ましい態様としている。
【００１５】
また前記方法は、前記ターゲット領域が２３ＳｒＲＮＡ遺伝子であることを好ましい態様としている。この態様においては、前記ＰＣＲを、配列番号１及び２に示すプライマー
セット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットを用いて行うことが好ましい。
【００１６】
また前記方法は、前記微生物が病原性細菌であることを好ましい態様としている。この態様においては、前記ターゲット領域が病原遺伝子であることが好ましい。さらには、この態様においては、前記ＰＣＲを、配列番号７及び８に示すプライマーセットを用いて行うことが好ましい。
【００１７】
また前記方法は、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３から選択されることを好ましい態様としている。
【００１８】
また前記方法は、前記ＤＮＡジャイレース阻害剤が、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）から選択されることを好ましい態様としている。
【００１９】
また前記方法は、前記トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤がエチジウムモノアザイドであり、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に可視光を照射する工程を含むことを好ましい態様としている。
【００２０】
また前記方法は、エチジウムモノアザイドと、エチジウムモノアザイド以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で被検試料を処理することを好ましい態様としている。
【００２１】
また前記方法は、前記ａ）の工程の前に、下記工程を行うことを好ましい態様としている。
ｄ）前記被検試料をトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースで処理する工程。
【００２２】
また前記方法は、被検試料中の微生物の生菌をＰＣＲにより検出するためのキットであって、下記の要素を含むキットを提供する：
トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤、並びに
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅するためのプライマー。
また前記キットは、さらに、トポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースを含むことを好ましい態様としている。
【００２３】
また前記キットは、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３から選択されることを好ましい態様としている。
【００２４】
また前記キットは、前記ＤＮＡジャイレース阻害剤が、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）から選択されることを好ましい態様としている。
【００２５】
また前記キットは、エチジウムモノアザイドと、エチジウムモノアザイド以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤を含むことを好ましい態様としている。
【００２６】
また前記キットは、前記プライマーが、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットであることを好ましい態様としている。
【００２７】
また前記キットは、前記プライマーが、配列番号７及び８に示すプライマーセットであることを好ましい態様としている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００２９】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法である。
ａ）前記被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【００３０】
本明細書において、「被検試料」とは、その中に存在する微生物の生菌を検出する対象であり、ＰＣＲ法による染色体ＤＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されないが、食品、例えば、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料等が挙げられる。特に、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品が好ましい。本発明においては、被検試料は、前記のような製品又は生体試料そのものであってもよく、これを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。
【００３１】
「微生物」は、本発明の方法により検出される対象であり、ＰＣＲ法により検出することが可能であって、かつ、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤の微生物に対する作用が生菌と死菌や損傷菌とで異なるものであれば、特に制限されないが、好ましくは細菌、糸状菌、酵母等が挙げられる。細菌としては、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis））等のスタフィロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Bacillus cereus）等のバチラス属細菌、マイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌等が挙げられる。
【００３２】
本発明において「生菌」（live cell）とは、一般に好適な培養条件によって培養した際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Cultura
ble state）であり、細胞壁の損傷はほとんど無い微生物をいう。なお、ここでいう代謝活性とはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。
【００３３】
「死菌」（Dead cell）とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。
【００３４】
「損傷菌」（Injured cell or Viable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、一般に好適な培養条件によって培養した場合であっても、増殖は困難であるが、その微生物が有する代謝活性は、生菌と比較すると低下しているものの死菌と比較すると有意に活性を有する状態の微生物である。
【００３５】
特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷菌の状態を呈した細菌の検出が注目されており、本発明においては、生菌の検出のみならず、生菌と死菌又は損傷菌との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。
【００３６】
尚、生菌、損傷菌及び死菌の菌数単位は、通常、いずれも細胞数（cells）／ｍｌで表される。生菌の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ（colony formating units / ml））で近似させることができる。また、損傷菌の標準試料は、例えば、生菌懸濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、損傷菌の細胞数は、加熱処理する前の生菌懸濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。尚、損傷菌を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、５０秒程度で損傷菌を調製することができる。さらに、損傷菌の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷菌の細胞数は、生菌懸濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光（波長６００ｎｍ）の透過度、すなわち濁度を測定し、生菌数濃度が予め判っている生菌懸濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（ｃｆｕ／ｍｌ）で近似させることができる。
【００３７】
尚、本発明の方法は、生菌の検出が目的であり、生菌と区別される微生物は、損傷菌であっても死菌であってもよい。
【００３８】
本発明において、「生菌の検出」とは、被検試料中の生菌の有無の判別及び生菌の量の決定のいずれをも含む。また、生菌の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。
【００３９】
（１）ステップａ）
被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する。
本発明に用いるトポイソメラーゼ阻害剤（Topoisomerase poison）及びＤＮＡジャイレース阻害剤（DNA Gyrase poison）とは、それぞれトポイソメラーゼ（Topoisomerase）及びＤＮＡジャイレース（DNA Gyrase）によるＤＮＡを切断する活性は阻害せず、ＤＮＡの再結合を阻害するもの、又はＤＮＡを切断する速度を促進するものをいう。好ましくは、トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、微生物の染色体ＤＮＡに共有結合するか、染色体ＤＮＡにインターカレートし、可視光照射により染色体ＤＮＡに共有結合するもの、単に染色体ＤＮＡにインターカレートするもの、又はトポイソメラーゼもしくはＤＮＡジャイレースと複合体形成するものである。
【００４０】
トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤は、両方を用いてもよく、一方のみを用いてもよい。
【００４１】
前記トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、生菌と、損傷菌又は死菌及びウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等に対する作用が異なるものであることが好ましく、より具体的には、生菌の細胞壁よりも損傷菌もしくは死菌の細胞壁、又はウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。
【００４２】
前記トポイソメラーゼ阻害剤としては、アムサクリン（Amsacrine）、カンプトセシン（Camptothecin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、エリプチシン（Ellipticine）、エトポシド（Etoposide）、ミトキサントロン（Mitoxantrone）、サイントピン（Saintopin）、トポテカン（Topotecan）、及びＣＰ−１１５，９５３等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。
【００４３】
前記ＤＮＡジャイレース阻害剤としては、シプロフロキサシン（Ciprofloxacin）、オフロキサシン（Ofloxacin）、エノキサシン（Enoxacin）、ペフロキサシン（Pefloxacin）、フレロキサシン（Fleroxacin）、ノルフロキサシン（Norfloxacin）、ナリジクス酸（Nalidixic acid）、オキソリン酸（Oxolinic acid）、及びピロミド酸（Piromidic acid）等が挙げられる。ＤＮＡジャイレース阻害剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。
【００４４】
トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌及び死菌もしくは損傷菌の懸濁液に、種々の濃度のトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって菌体を分離し、ＰＣＲで分析することによって、生菌と死菌もしくは損傷菌を区別しやすい条件を決定することができる。さらに、検出対象の微生物の生菌、及びウシ白血球等の体細胞又は血小板等の懸濁液に、種々の濃度のトポイソメラーゼ阻害剤を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって菌体及び前記各種細胞を分離し、ＰＣＲで分析することによって、生菌と各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。このような条件として、具体的には、アムサクリンでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、エリプチシンでは終濃度０．０５〜５μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、カンプトセシンでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、シプロフロキサシンでは終濃度０．４〜４０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間、エトポシドでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜４８時間、ミトキサントロンでは終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、１０分〜４８時間が挙げられる。被検試料を所定条件で処理した後に、希釈及び／又は遠心分離等による除去によって、処理を停止することが好ましい。
【００４５】
上記トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、生菌の細胞壁よりも死菌及び損傷菌の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌もしくは死菌または死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。また、生きた体細胞でも細胞膜のみであって、細胞壁を有さないことから前記阻害剤は透過すると考えられる。その結果、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤は、体細胞の死細胞及び死菌並びに損傷菌の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡと無秩序に共有結合し、もしくはインターカレートし、もしくはトポイソメラーゼと複合体を形成し、さらに、体細胞内のトポイソメラーゼII又はトポイソメラーゼI、死菌又は損傷菌細胞内のトポイソメラーゼIV、もしくはトポイソメラーゼI、III、又は、ＤＮＡジャイレースによるＤＮＡ再結合を阻害すること、又はＤＮ
Ａ切断速度を促進することにより、染色体ＤＮＡが断片化されると推定される。
【００４６】
生菌よりも損傷菌や死菌の染色体ＤＮＡが優先的に断片化されると、生菌では染色体ＤＮＡのターゲット領域がＰＣＲにより増幅されるのに対し、損傷菌や死菌ではターゲット領域が切断される結果ＰＣＲ増幅が阻害され、例えばアムサクリンやカンプトセシンでは、さらにクロスリンクするためにＰＣＲ増幅が阻害される。したがって、ＰＣＲによって、生菌を損傷菌や死菌に比べて選択的に検出することができる。
【００４７】
尚、死菌では、細胞内のトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースの活性が失われていることがある。また、損傷菌でもこれらの酵素の活性が低下又は喪失していることがある。したがって、本発明の好ましい態様においては、ステップａ）に先立って、被検試料をトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースで処理する（ステップｄ））。ステップｄ）については後で詳述する。
【００４８】
本発明の他の好ましい態様は、前記トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤がエチジウムモノアザイドであり、エチジウムモノアザイドを添加した被検試料に可視光を照射する工程を含む。エチジウムモノアザイド（ＥＭＡ）は、微生物の生菌の細胞壁よりも損傷菌や死菌の細胞壁を透過しやすい。したがって、ＥＭＡは生菌の細胞壁は実質的に透過せず、損傷菌や死菌の細胞壁や死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。尚、血液中の白血球、血小板が生細胞の場合、ＥＭＡは滅菌水や低張な塩溶液下で前記細胞の細胞膜をより透過する。ＥＭＡは、体細胞の死細胞及び損傷菌並びに死菌の細胞内に進入して核内ＤＮＡに無秩序にインターカレートした後、可視光照射によりインターカレートしたＥＭＡのみがナイトレンに変換され、核内ＤＮＡに共有結合する。そして、体細胞内のトポイソメラーゼII、損傷菌や死菌細胞内のトポイソメラーゼIV、又は、ＤＮＡジャイレースによるＤＮＡ再結合を阻害することにより、染色体ＤＮＡが断片化されると推定される。
【００４９】
ＥＭＡによる処理の条件は、適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌、及び損傷菌や死菌の懸濁液に、種々の濃度のＥＭＡを加えて、種々の時間置いた後、可視光を照射して、必要に応じて遠心分離等によって菌体を分離し、ＰＣＲにより分析することによって、生菌と死菌及び損傷菌とを区別しやすい条件を決定することができる。また、可視光照射の条件も、照射時間を変えて上記の実験を行うことにより、好ましい条件を決定することができる。具体的には、ＥＭＡによる処理は終濃度０．５〜１００μｇ／ｍｌ、４〜１０℃、５分〜４８時間が好ましい。また、ＥＭＡ処理は、遮光下で行うことが好ましい。可視光としては、５００〜７００ｎｍの成分を含む可視光が好ましい。また、可視光照射の条件として具体的には、被検試料から１０〜５０ｃｍの距離から１００〜７５０Ｗの可視光を５分〜２時間照射する条件が挙げられる。可視光照射は、低温下で、例えば試料を氷冷して行うことが好ましい。
【００５０】
本発明の特に好ましい態様は、被検試料に対し、ＥＭＡ処理及び可視光照射処理と、ＥＭＡ以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理を行う。この場合、ＥＭＡ処理及び可視光照射処理と、ＥＭＡ以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理の順序は特に制限されず、また、これらの処理を同時に行ってもよい。
【００５１】
（２）ステップｂ）
ステップａ）で処理された被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲ（White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)）により増幅する。
【００５２】
被検試料からのＤＮＡの抽出は、抽出されたＤＮＡがＰＣＲにおける鋳型として機能し得る限り特に制限されず、一般的に用いられている微生物のＤＮＡの抽出法にしたがって行うことができる。
【００５３】
ＤＮＡの抽出法は、例えば、Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2001に記載されている。
【００５４】
本発明において「ターゲット領域」とは、染色体ＤＮＡのうち、本発明に用いるプライマーを用いたＰＣＲにより増幅され得る領域であり、検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。検出対象の微生物に特異的なターゲット領域に対応するプライマーセットと、広汎な微生物の染色体ＤＮＡに対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生菌量と、多数種の微生物の生菌量を、同時に測定することができる。ターゲット領域の長さとしては、通常８０〜３０００塩基、好ましくは９００〜３０００塩基、特に好ましくは２０００〜３０００塩基が挙げられる。具体的には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が挙げられる。これらの中では、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が好ましい。
【００５５】
ＰＣＲに用いるプライマーは、上記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。具体的には、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットが挙げられる。また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号５及び６に示すプライマーセットが挙げられる。
【００５６】
また、検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、ターゲット領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のエンテロトキシン遺伝子やｉｎｖＡ遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属細菌のＭＭＳ遺伝子（エンテロバクター・サカザキ菌）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。また、同遺伝子に対応するプライマーとしては、配列番号７及び８に示すプライマーセットが挙げられる。
【００５７】
複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生菌を検出することができる。また、特定の細菌に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生菌を検出することができる。
【００５８】
ＰＣＲの条件は、ＰＣＲの原理に則った特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【００５９】
本発明の各態様のうち、ＥＭＡ処理及び可視光処理を行う態様においては、ターゲット領域が長い場合、例えば２０００以上の場合は、ＥＭＡ処理及び可視光照射処理のみでも効果的に生菌を検出することができる。一方、ターゲット領域が短い場合、例えば２００以下の場合は、ＥＭＡ処理及び可視光処理と、ＥＭＡ以外のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理を併用することが好ましい。
【００６０】
（３）ステップｃ）
続いて、ＰＣＲ増幅産物を解析する。解析法は、ＰＣＲ増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法（Nogva et al./ Application of 5'-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk. Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al./ Application of the 5'-nuclease PCR assay in evaluation and development of methods for quantitative detection of campylobacter jejuni. Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036）等が挙げられる。電気泳動法によれば、ＰＣＲ増幅産物の量、及びその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出しその１０を乗じた蛍光値をスレッショード値とし、そのスレッショード値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショード値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【００６１】
また、増幅産物の有無は、増幅産物の融解温度（ＴＭ）パターンを解析することによっても行うことができる。
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
【００６２】
本発明の方法によって生菌を検出する場合、ＰＣＲ増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生菌の有無又は定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各ステップを行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＤＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡを標準試料として用いることもできる。
【００６３】
（４）ステップｄ）
前記のとおり、死菌では、細胞内のトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースの活性が失われることがあり、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理しても、染色体ＤＮＡの切断が起らないことがある。このような場合であっても、ステップａ）に先立って、被検試料をトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースで処理すると、死菌に選択的なＤＮＡの切断が起るため、ＰＣＲによるターゲット領域の増幅を阻害することができる。
【００６４】
トポイソメラーゼ及びＤＮＡジャイレースは、両方を用いてもよく、一方のみを用いてもよい。また、各々一種を単独で用いてもよく、２種又はそれ以上を併用してもよい。
トポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレースによる反応条件としては、具体的には後記する参考例に示される条件が例示されるが、一般的には、食品や血液等の臨床検体から回収された微生物を含む上清に対し、４℃にて１４，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離を行って上清を除去した後、ＤＮＡ切断用緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．９、５０ｍＭ塩化カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２．５％グリセロール）１ｍｌを添加し、終濃度１〜５０ｍＭとなるようにトポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレースを添加し、さらに終濃度１〜５０ｍＭとなるようにＡＴＰを加えて、３０〜３７℃で、５〜３０分反応させる。尚、トポイソメラーゼ及
びＤＮＡジャイレースの活性にはＡＴＰが必要であるため、これらの酵素で被検試料を処理する際には、ＡＴＰ又はＡＴＰ合成系を添加することが好ましい。
【００６５】
＜２＞本発明のキット
本発明のキットは、被検試料中の微生物の生菌をＰＣＲにより検出するためのキットであって、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤、並びに検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅するためのプライマーを含む。
【００６６】
上記キットにおいて、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤は、本発明の方法で説明したものと同様である。
【００６７】
本発明のキットの好ましい態様は、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤として、ＥＭＡ及びＥＭＡ以外の他のトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤を含む。
【００６８】
また、本発明のキットは、上記の各要素に加えて、トポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースを含む。
【００６９】
本発明のキットは、さらに、希釈液、トポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレース反応用の反応液、本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。
【実施例】
【００７０】
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７１】
〔実施例１〕
微生物の生菌と損傷菌をそれぞれトポイソメラーゼ阻害剤で処理し、各染色体ＤＮＡにおける切断の度合いを検討した。
【００７２】
１．試料の調製
１−１）生菌及び損傷菌の懸濁液の調製
グラム陽性細菌であるリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes JCM 2873；以下、「リステリア」と略記することがある）を、ＢＨＩブロスを用いて３０℃で培養し、対数増殖期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に生理食塩水４０ｍｌを加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数を標準寒天平板培地により測定したところ、１．２×１０9ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００７３】
また、上記生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。尚、この懸濁液中の細胞には少数の生菌及び死菌も一部含まれると考えられるが、主に損傷菌であるため、単に「損傷菌」と記載する。尚、本発明の方法は本来生菌を検出する方法であり、生菌と区別される微生物は、損傷菌であるか死菌であるかは問わない。以下に示す他の細菌についても同様である。
【００７４】
１−２）トポイソメラーゼ阻害剤処理
前記で調製したリステリアの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液（それぞれ１．２×１０9ｃｆｕ／ｍｌ）１ｍｌずつを、新しく調製した９ ｍｌのＢＨＩブロスに加え（培地中の生菌及び損傷菌の菌数はともに１．２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ）、ＤＭＳＯに溶解した５ｍｇ
／ｍｌのアムサクリン溶液１００μｌを添加した。アムサクリンの終濃度は５０μｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯの終濃度は１％であった。その後、それぞれ３０℃で２４時間、４８時間、又は７２時間インキュベーションした。
【００７５】
損傷菌については、損傷菌体内に残存している活性を有するＤＮａｓｅが損傷菌の染色体ＤＮＡに与える影響を調べるため、損傷菌懸濁液１ｍｌを新しく調製した９ｍｌのＢＨＩブロスに加えた後、上記アムサクリン溶液の代りに１００μｌのＤＭＳＯを加え（ＤＭＳＯ終濃度１％）、３０℃で７２時間インキュベーションした。なお、生菌懸濁液１ｍｌ、及び損傷菌懸濁液１ｍｌをコントロールとした。
【００７６】
１−３）ＤＮＡの抽出
各懸濁液を、４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を完全に除去した。ペレットに０．５ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加え、予め１０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液により５ｍｇ／ｍｌに調製されたアクロモペプチダーゼ溶液（和光純薬社製、カタログ番号： 014-09661）２０μｌを加え、５０℃で３０分間放置した。その後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．５ｍｌ加え、さらに１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（シグマ社製、E.C.3.4.21.64）を２０μｌ加え、予め滅菌水により１０％（ｗ／ｖ）に調製されたＳＤＳ溶液を４００μｌ加えて、５０℃で一夜処理した。
【００７７】
前記各処理液を２ｍｌ用マイクロチューブ２本に半量ずつ分けて入れ、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／飽和フェノール０．５ｍｌを加え、１５分間穏やかに混合した後、０．５ｍｌのクロロホルムを加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を、新しく用意した２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を７０μｌ、９９．５％冷エタノールを１．２１ｍｌそれぞれ加えて穏やかに混合した。４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄した。ペレットに０．５ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を加え、４℃で一夜放置してＤＮＡを溶解した。
【００７８】
予め滅菌水により１０ｍｇ／ｍｌに調製したＲＮａｓｅ（シグマ社製：EC.3.1.27.5）溶液を５μｌ加え、３７℃で１時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルム（１／１）溶液を０．２５ｍｌ加え、１０分間穏やかに混合し、クロロホルム０．２５ｍｌを更に加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を新しい２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を５０μｌ、９９．５％冷エタノールを１ｍｌそれぞれ加えて穏やかに混合した。４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄してペレットを乾燥させた。
【００７９】
乾燥させたペレットに１２５μｌのＴＥバッファーを加え４℃で一夜放置することによりＤＮＡを溶解させ、抽出ＤＮＡとした。精製ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光値（ＯＤ260、ＯＤ280：ＤＮＡ溶液５０μｇ／ｍｌにおいてＯＤ260＝１．０、セル長１ｃｍ）を測定し、ＤＮＡ濃度をＯＤ260から算出し、精製ＤＮＡの純度をＯＤ260/ＯＤ280により評価した。
【００８０】
２．試験結果
１−３）により抽出した染色体ＤＮＡを０．８ ％アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動完了後、アガロースゲルを１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド水溶液に２０分間浸積し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長２５４ｎｍ）により染色体ＤＮＡの切断の度合いを観察した。
【００８１】
上記各抽出ＤＮＡを電気泳動により解析した。結果を図１に示す。図１は、リステリア（損傷菌）の染色体ＤＮＡに与える損傷菌体内に保持されているＤＮａｓｅの影響、及びリステリア（生菌及び損傷菌）の染色体ＤＮＡに与えるアムサクリンの影響を表す。
【００８２】
その結果、リステリアの損傷菌懸濁液にアムサクリンを添加せずに、７２時間までインキュベーションしても、ウェルに滞留した極めて長いＤＮＡ断片、及び19,329 bp付近に位置する長いＤＮＡ断片に関して、有意な差は見受けられず、損傷菌体内に活性が残存しているＤＮａｓｅにより、リステリア損傷菌の染色体ＤＮＡはほとんど切断を受けていなかった。しかし、同損傷菌にアムサクリンを添加して７２時間までインキュベーションすると、特にウェルに滞留した極めて長いＤＮＡ断片が明らかに減少し、リステリアの損傷菌体内に残存している活性のあるＤＮＡジャイレース又はトポイソメラーゼを介して、アムサクリンが染色体ＤＮＡを至る所で切断状態とすることが示唆された。
【００８３】
また、リステリアの生菌懸濁液にアムサクリンを添加し、７２時間までインキュベーションすると、２４時間でウェルに滞留した極めて長いＤＮＡ断片、及び19,329 bp付近に位置する長いＤＮＡ断片が一時的に減少し、その後、インキュベーションを続けると、双方のＤＮＡ断片はインキュベーション時間に比例して増加した。これにより、アムサクリンは２４時間経過時点で生菌の細胞壁を透過し、生菌内のＤＮＡジャイレース又はトポイソメラーゼを介して染色体ＤＮＡを切断状態にするが、その中で、アムサクリンの作用を僅かしか受けていない、もしくはほとんど受けていないリステリアの残存した生菌が、再度インキュベーションすることにより増殖することが示唆された。
【００８４】
また、アムサクリンは黄色着色物質であり疎水性の極めて高い物質なので、１〜３０分という短時間作用の場合、細胞壁の損傷のない親水性の高い生菌の細胞壁はほとんど透過せず生菌のペレットは白色であるが、損傷菌は細胞壁の損傷があり疎水性も増していることから、損傷菌の細胞壁は透過し、損傷菌のペレットは黄色を呈している。本実施例により、生菌又は損傷菌であっても、アムサクリンが細胞壁を透過すれば、菌体内のＤＮＡジャイレース及び／又はトポイソメラーゼを介して染色体ＤＮＡを至るところで切断状態にすることが確認されたが、短時間作用なら損傷菌の染色体が穏和であるが選択的にランダムに切断されることになり、アムサクリン等の短時間のトポイソメラーゼ阻害剤による追加処理（例えば、ＥＭＡ等のトポイソメラーゼ阻害剤で処理した後、さらに追加で処理）を行えば、ＰＣＲ法を用いて生菌と損傷菌又は死菌を高感度に判別することが可能である。
【００８５】
〔実施例２〕
ＤＮＡジャイレース阻害剤で処理した微生物の生菌と損傷菌の染色体ＤＮＡを用い、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ法による解析を行った。
【００８６】
１．試料の調製
１−１）生菌及び損傷菌の懸濁液の調製
グラム陰性細菌であるエンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii ATCC 51329株；以下、「エンテロバクター」と略記することがある）をＢＨＩブロスを用いて３７℃で培養し、対数増殖後期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に生理食塩水４０ｍｌを加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数を標準寒天平板培地により測定したところ、４．４×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００８７】
また、上記生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。
リステリア・モノサイトゲネスJCM 2873の生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液を、実施例１と同様にして調製した。尚、生菌懸濁液中の生菌数は４．０×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００８８】
１−２）ＤＮＡジャイレース阻害剤（シプロフロキサシン）処理
エンテロバクター（生菌及び損傷菌）懸濁液、及びリステリア（生菌及び損傷菌）懸濁液のそれぞれ各１ｍｌづつを分取し、９ｍｌの新しく調製したＢＨＩブロスに加え（培地中のエンテロバクターの生菌及び損傷菌の菌数は、それぞれ４．４×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、４．４×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、リステリアの生菌及び損傷菌の菌数は、４．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、４．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ）、シプロフロキサシン溶液（１３０μｇ／ｍｌ；生理食塩水で溶解）２ｍｌをそれぞれに添加した。
【００８９】
損傷菌については、損傷菌体内に残存している活性を有するＤＮａｓｅが損傷菌の染色体ＤＮＡに与える影響を調べるため、エンテロバクター及びリステリアの各損傷菌懸濁液１ｍｌを新しく調製した９ｍｌのＢＨＩブロスにそれぞれ加えた後、上記シプロフロキサシン溶液の代わりに生理食塩水２ ｍｌを加えたものを用意した。
その後、エンテロバクター（生菌及び損傷菌）は３７℃で１時間３０分、３時間３０分、５時間又は７２時間培養した懸濁液をそれぞれ調製した。また、リステリア（生菌及び損傷菌）は３０℃で１時間３０分、３時間３０分、５時間又は７２時間培養した懸濁液をそれぞれ調製した。さらに、０時間培養に相当するコントロールとして、エンテロバクター、リステリアの各々の生菌及び損傷菌懸濁液を、シプロフロキサシン未添加生菌懸濁液、シプロフロキサシン未添加損傷菌懸濁液とした。
【００９０】
各懸濁液を、４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を完全に除去してペレットを回収した。エンテロバクター、及びリステリアそれぞれについて、以下の方法でＤＮＡを抽出した。
【００９１】
１−３）ＤＮＡの抽出
エンテロバクターのＤＮＡの抽出は、下記の方法により行った。
０．５ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を前記ペレットに加え、１０μｌの１２５０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（シグマ社製：EC.3.4.21.64）を加え、予め滅菌水により１０％（ｗ／ｖ）に調製されたＳＤＳ溶液２００μｌを加え、５０℃で一夜処理した。この処理液に、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／飽和フェノール０．５ｍｌを加え、１５分間穏やかに混合した後、０．５ｍｌのクロロホルムを加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を、新しく用意した２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を７０μｌ、９９．５％冷エタノール１．２９ ｍｌ加え、穏やかに混合した。４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄した。ペレットに０．５ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を入れ、４℃で一夜放置してＤＮＡを溶解した。
【００９２】
予め滅菌水により１０ｍｇ／ｍｌに調製したＲＮａｓｅ（シグマ社製：EC.3.1.27.5）溶液５μｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルム（１／１）溶液を０．２５ｍｌ加え、１０分間穏やかに混合し、クロロホルム０．２５ｍｌを更に加え、５分間穏やかに混合した。４℃で６，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上層の水層を新しい２ｍｌ容マイクロチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を５０μｌ、９９．５％冷エタノール１ｍｌそれぞれを加え、穏やかに混合した。４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、０．４ｍｌの７０％冷エタノールで洗浄しペレットを乾燥させた。
【００９３】
乾燥させたペレットに１２５μｌのＴＥバッファーを加え４℃で一夜放置することによりＤＮＡを溶解させ、抽出ＤＮＡとした。精製ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光値（ＯＤ260、ＯＤ280：ＤＮＡ溶液５０μｇ／ｍｌにおいてＯＤ260＝１．０、セル長１ｃｍ）を測定し、ＤＮＡ濃度をＯＤ260から算出し、精製ＤＮＡの純度をＯＤ260/ＯＤ280により評価した。
【００９４】
なお、リステリアのＤＮＡの抽出は、実施例１の「１−３）ＤＮＡの抽出」の方法に準じて行った。
【００９５】
１−４）ＰＣＲ増幅産物の電気泳動
１−３）により抽出した染色体ＤＮＡを０．８ ％アガロースゲルを用いて電気泳動した。電気泳動完了後、アガロースゲルを１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド水溶液に２０分間浸積し、次いでイオン交換水で２回洗浄した後、ＵＶトランスイルミネーター（波長２５４ｎｍ）により染色体ＤＮＡの切断の度合いを観察した。
【００９６】
２．試験方法（２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ、及び電気泳動）
２−１）ＰＣＲマスターミックスの調製
下記の組成によりマスターミックス（全量５０μｌ）を調製した。
・Ex-Taq（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：０．２５μｌ
・10×Ex-Taq Buffer（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：５μｌ
・dNTP mixture（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：４μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号１（２３Ｓ−Ｆ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号２（２３Ｓ−Ｒ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号３（２３Ｓ−ＭＦ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号４（２３Ｓ−ＭＲ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・２×ＳＹＢＡ Ｇｒｅｅｎ （ＢＭＡ社製、カタログ番号：５０５１３）：１０μｌ
・滅菌水：１５．７５μｌ
・鋳型ＤＮＡ（１５ｎｇ／μｌ）：１０μｌ
尚、配列番号１、２のプライマーは、２３Ｓ ｒＲＮＡのほぼ全領域を増幅するためのプライマーであり、およそ2840bpの増幅断片がグラム陰性細菌を中心に得られる。配列番号３、４のプライマーは２３Ｓ ｒＲＮＡの中央領域に相当し、約900bpの増幅断片がグラム陽性細菌（グラム陰性細菌も増幅する）から得られる。
【００９７】
２−２）２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
エンテロバクターの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイルは表１に示すとおりである。
【００９８】
【表１】
【００９９】
リステリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイルは表２に示すとおりである。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
２−３）ＰＣＲ反応
前記１−３）で調製した各ＤＮＡ溶液を、ＴＥバッファーで１５ｎｇ／μｌに希釈し、その１０μｌを前記２−１）の鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応液中に１５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む。ネガティブコントロールとしてはＴＥバッファー１０μｌを用いた。
【０１０２】
前記２−２）で示したＰＣＲサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムＰＣＲ装置i Cycler（バイオラッド社製、機種番号：ｉＱ）を用いて、ＰＣＲ反応、及び増幅産物のＴＭ解析（融解温度解析）を行った。リアルタイムＰＣＲのスレッシュホールド値（境界値）は、０サイクル〜１０サイクルまでのSYBA Greenによる蛍光量の標準偏差ＳＤに１０を乗じた値とした。また、各リアルタイムＰＣＲ増幅曲線において、スレッシュホールド値を超えるサイクル数を、以下「Ｃｔ値」と略記する。
【０１０３】
３．試験結果
本実施例における試験結果を図２〜図１１に示す。図２は、エンテロバクター（損傷菌）の染色体ＤＮＡに与える菌体内保持ＤＮａｓｅの影響を示している。図３は、同菌（生菌及び損傷菌）の染色体ＤＮＡに与えるシプロフロキサシンの影響を示している。図４は、リステリア（損傷菌）の染色体ＤＮＡに与える損傷菌体内保持ＤＮａｓｅの影響を示している。図５は、及び同菌（生菌及び損傷菌）の染色体ＤＮＡに与える同薬剤の影響を示している。
【０１０４】
また、図６は、シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター生菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたリアルタイムＰＣＲ曲線を示している。図７は、図６における増幅産物のＴＭパターン解析を示している。同様に、同薬剤で処理された同菌損傷菌のリアルタイムＰＣＲ曲線及び増幅産物のＴＭパターン解析結果を図８、及び図９にそれぞれ示す。さらに、同薬剤で処理されたリステリア生菌及び損傷菌のリアルタイムＰＣＲ曲線を図１０、及び図１１にそれぞれ示す。
【０１０５】
図２より、エンテロバクター損傷菌体内に保持されているＤＮａｓｅにより、損傷菌染色体ＤＮＡは７２時間かけてわずかに切断されていることが確認された。しかしながら、図３より、損傷菌にシプロフロキサシンを１．５〜５時間作用させても上記ＤＮａｓｅより遥かに強いＤＮＡ切断現象が見受けられた。生菌の場合、19329 bp付近の長い染色体Ｄ
ＮＡ断片が逆に増加し、シプロフロキサシンを短時間作用させることにより、バクテリアＤＮＡジャイレースを介して生菌より損傷菌の染色体ＤＮＡをより切断していることが確認された。
図４が示すように、損傷菌染色体ＤＮＡは、19329bp付近の染色体ＤＮＡ由来の長い断片では、７２時間かけてもリステリア損傷菌体内に保持されているＤＮａｓｅによるＤＮＡ切断現象はほとんど見受けられなかった。しかしながら、図５が示すように、損傷菌にシプロフロキサシンを７２時間作用させると、上記ＤＮａｓｅにより、はるかに強いＤＮＡ切断現象が見受けられた。生菌へのシプロフロキサシンの作用効果も同様と解釈される。
【０１０６】
また、エンテロバクターの生菌、損傷菌ともに、７２時間シプロフロキサシンを作用させると、ＰＣＲが大幅に抑制されたが、Ｃｔ（生菌；Ｃｉｐ７２時間）−Ｃｔ（生菌；Ｃｉｐ未）＝１３、及びＣｔ（損傷菌；Ｃｉｐ７２時間）−Ｃｔ（損傷菌；Ｃｉｐ未）＝１７に示されるように、損傷菌の方がよりＰＣＲが抑制された。すなわち、２７サイクルでＰＣＲを打ち切った場合、生菌由来のＰＣＲは陽性、損傷菌由来のＰＣＲは陰性と判断されるため、シプロフロキサシンにより生菌と損傷菌を識別できることが確認された。リステリアについても、同様に、図１０、図１１にそれぞれ示すように、２０サイクルでＰＣＲを打ち切った場合、生菌由来のＰＣＲは陽性、損傷菌由来のＰＣＲは陰性と判断されるため、同薬剤によりリステリアに関しても生菌と損傷菌が識別できることが確認された。
【０１０７】
図７及び図９に示されるように、シプロフロキサシンを７２時間作用させたエンテロバクター・サカザキ生菌と損傷菌の染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物のＴＭパターン解析により、生菌のＰＣＲ増幅産物は、ターゲットである２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当するが、損傷菌のＰＣＲ増幅産物はターゲットとしている増幅産物ではないと推定される。損傷菌のＰＣＲ増幅産物は、鋳型ＤＮＡの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の内部に複数の切断が生じたため、結果として２３Ｓ ｒＲＮＡの一部の領域が増幅されたと考えられる。以上のように、シプロフロキサシン処理により、ＰＣＲによる生菌と損傷菌の識別が可能であることが示された。
【０１０８】
〔実施例３〕
ＥＭＡで処理した微生物の生菌と損傷菌の染色体ＤＮＡを用い、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子又は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ法による解析を行った。
【０１０９】
１．試料の調製
１−１)グラム陰性細菌（生菌及び損傷菌）懸濁液の調製
大腸菌ＤＨ５α（以下、「大腸菌」と略記することがある）、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri JCM 1658；以下、「シトロバクター」と略記することがある）、サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis IID 604；以下、「サルモネラ」と略記することがある）、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca JCM 1665；以下、「クレブシェラ」と略記することがある）を、ＢＨＩブロスを用いて３７℃で培養し、対数増殖後期の培養液４０ｍｌを４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、生理食塩水４０ｍｌを入れよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。これらの生菌懸濁液の生菌数は、大腸菌：３．２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ、シトロバクター：６．７×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、サルモネラ：１．９×１０8ｃｆｕ／ｍｌ、クレブシェラ：４．８×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった。
【０１１０】
また、各生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。
【０１１１】
１−２)グラム陽性細菌（生菌及び損傷菌）懸濁液の調製
バチルス・セレウス（Bacillus cereus JCM 2152；以下、「バチルス」と略記することがある）、及びスタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis KD；以下、「スタフィロコッカス」と略記することがある）を３７℃で、また、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes JCM 2873；以下、「リステリア」と略記することがある）を３０℃で、それぞれＢＨＩブロスで培養した。対数増殖期の各培養液４０ｍｌ（バチルスに関しては栄養型細胞）を４℃で８，０００×ｇ、１５分間冷却遠心分離し、上清を除去した後、生理食塩水４０ｍｌを入れてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離し、上清を除去した後、菌体に１０ｍｌの生理食塩水を加え、生菌懸濁液とした。この生菌懸濁液の生菌数は、バチラス：３．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ、リステリア：１．３×１０8ｃｆｕ／ｍｌ、スタフィロコッカス：１．１×１０6ｃｆｕ／ｍｌであった。
また、各生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、沸騰水に５０秒浸積後、氷水により急冷して損傷菌懸濁液を調製した。
【０１１２】
２．試験方法
２−１）ＥＭＡ処理及び可視光照射工程
１０００μｇ／ｍｌとなるようにＥＭＡ（シグマ社製、カタログ番号：E 2028）を滅菌水に溶解し、０．４５ μｍのマイクロフィルターによりろ過したＥＭＡ水溶液を、前記グラム陰性細菌（生菌及び損傷菌）、及びグラム陽性細菌（生菌及び損傷菌）の各懸濁液１ｍｌに１０μｌずつ添加し、遮光下で、４℃、３０分間放置した。その後、各懸濁液を氷上に置き、懸濁液から２０ｃｍの距離に設置した５００Ｗの可視光線（FLOOD PRF：100V、500W、岩崎電気社製）を１０分間照射した。以上のＥＭＡ溶液を添加し、可視光線を照射する工程を、「ＥＭＡ処理」と略記することがある。別途、前記グラム陰性細菌（生菌及び損傷菌）及び前記グラム陽性細菌（生菌及び損傷菌）の懸濁液各１ｍｌにＥＭＡ溶液の代りに１０μｌの滅菌水を加え、以下ＥＭＡ処理と同様に処理した。
【０１１３】
２−２）ＤＮＡ抽出
前記グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌の生菌、損傷菌（それぞれＥＭＡ未処理及びＥＭＡ処理）の入ったマイクロチューブを４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離した。各マイクロチューブに９９０μｌの生理食塩水を加えよく攪拌した後、２ｍｌマイクロチューブに全量移し、４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した。以下、実施例１、「１−３）ＤＮＡの抽出」と同様にしてＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ濃度の測定及び純度の評価を行った。
【０１１４】
３．１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、又は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ
３−１）ＰＣＲマスターミックスの調製
【０１１５】
下記の組成によりマスターミックス（全量５０μｌ）を調製した。
・Ex-Taq（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：０．２５μｌ
・10×Ex-Taq Buffer（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：５μｌ
・dNTP mixture（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：４μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号１（２３Ｓ−Ｆ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号２（２３Ｓ−Ｒ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号３（２３Ｓ−ＭＦ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号４（２３Ｓ−ＭＲ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号５（１６Ｓ−Ｆ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号６（１６Ｓ−Ｒ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・２×ＳＹＢＡ Ｇｒｅｅｎ （ＢＭＡ社製、カタログ番号：５０５１３）：１０μｌ
・滅菌水：１５．７５μｌ
・鋳型ＤＮＡ（１５ｎｇ／μｌ）：１０μｌ
【０１１６】
３−２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイルは表３に示すとおりである。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
３−３）２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
各細菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイルは表４（グラム陰性細菌）、表５（グラム陽性細菌）に示すとおりである。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
【表５】
【０１２１】
３−４）ＰＣＲ反応
前記２−２）で調製した各ＤＮＡ溶液を、ＴＥバッファーにより１５ｎｇ／μｌに希釈し、その１０μｌを前記３−１）の鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応液中に１５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む。ネガティブコントロールとしてはＴＥバッファー１０μｌを用いた。
【０１２２】
前記３−２）、又は３−３）で示したＰＣＲサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムＰＣＲ装置i Cycler（バイオラッド社製、機種番号：ｉＱ）を用いて、ＰＣＲ反応、及び増幅産物のＴＭ解析（融解温度解析）を行った。リアルタイムＰＣＲのスレッシュホールド値（境界値）及びＣｔ値の算出は、実施例２、２−３）と同様である。
３−５）ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動
【０１２３】
Seakem GTG アガロース（ＦＭＣ社製、カタログ番号：50070）とＴＡＥバッファー（Ｔｒｉｓ４．８４ｇ／ｌ、酢酸１．１４２ｍｌ／ｌ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ０．１４９ｇ／ｌ）により０．８％アガロースゲルを作製し、マーカーとしてλ-EcoT14 I digest（宝酒造社製、Code：3401）及び100bp DNA Ladder（宝酒造社製、Code：3407A）を用い、グラム陰性細菌、及びグラム陽性細菌に関してそれぞれ、各ＰＣＲ反応溶液１０μｌをウェルに注入し、電気泳動を行い、ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）がゲルを９割程度泳動した時点で電気泳動を終了させた。
【０１２４】
１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液に、電気泳動後のゲルを２０分間浸積し、イオン交換水で２回洗浄し後、ＵＶトランスイルミネーター（２５４ｎｍ）によりＰＣＲ増幅産物を観察した。
【０１２５】
４．試験結果
細菌懸濁液１ｍｌを入れた１．５ｍｌマイクロチューブを沸騰水に浸漬したときの温度の経時変化を図１２に示す。図１２から、損傷菌懸濁液の調製における沸騰水５０秒浸積は、７２〜７５℃、１５〜１６秒の高温短時間殺菌（ＨＴＳＴ殺菌）より、やや激しく加熱処理した方法であり、従って、超高温瞬間殺菌（ＵＨＴ殺菌）と同等の加熱処理に相当することがわかる。
【０１２６】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにした生菌、損傷菌の識別結果を図１３に、及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットにした生菌、損傷菌の識別結果を図１４、図１５にそれぞれ示す。図１３〜１５において、各細菌のＰＣＲ反応溶液は、生菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、生菌懸濁液・ＥＭＡ処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ処理の順番でゲルにロードされている。
【０１２７】
図１３より、ターゲットが１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の場合には、シトロバクター及びクレブシェラでは、ＥＭＡ処理した損傷菌ではＰＣＲ増幅産物が見られず、生菌と損傷菌の明確な識別が可能であった。その他の細菌については、ＥＭＡ処理した損傷菌で増幅産物が認められ、生菌と損傷菌との識別が不明確であった。
【０１２８】
一方、図１４及び図１５より、ターゲットが２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の場合は、グラム陰性細菌及び陽性細菌のいずれの細菌においても、ＥＭＡ処理により、生菌と損傷菌の識別を明瞭に行なえることが示された。サンプルバックグラウンドとして１０8ｃｆｕ／ｍｌレベルの細菌の損傷菌を含む被検試料を用いて、１５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを５０μｌのＰＣＲに供しても、損傷菌のＰＣＲ反応は完全に抑制され、生菌のＰＣＲはほぼ完全に抑制されなかった。また、１０5〜１０7ｃｆｕ／ｍｌの損傷菌を含む牛乳においても、損傷菌のＰＣＲは完全に抑制され、生菌を低濃度で検出することが可能であると考えられることから、食品衛生検査の一般細菌のスクリーニング検査として適用することが可能である
。さらに、敗血症で肝機能障害を持つ患者の場合、血液中に生菌及び損傷菌が１０4ｃｆｕ／ｍｌ以上の高濃度で存在する可能性もあり、そのような場合にも本発明により生菌のみを迅速に検出できる。
【０１２９】
〔実施例４〕
病原性細菌をＥＭＡ、及びトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理し、病原遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ法による細菌の生菌・損傷菌の識別を行った。
【０１３０】
１．細菌(生菌)培養液の調製
実施例１と同様にして、リステリア（リステリア・モノサイトゲネス：Listeria monocytogenes JCM 2873）の生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液を調製した。生菌懸濁液の生菌数は、１．３×１０8ｃｆｕ／ｍｌであった
【０１３１】
２．試験方法
２−１）ＥＭＡ処理及び可視光照射工程
前記で調製したリステリアの生菌懸濁液及び損傷菌懸濁液に対し、実施例３と同様にして、ＥＭＡ処理及び可視光照射を行った。なお、ＥＭＡは細胞壁に外膜を有さないグラム陽性細菌の場合、細胞壁損傷のない生菌であっても、透過しやすい傾向があるので、ＥＭＡ添加後の遮光下４℃での放置時間を５分に短縮し、可視光照射時間も５分に短縮した。また、生菌及び損傷菌懸濁液に対してＥＭＡを添加する代わりに滅菌水１０μｌを添加し、同様の処理を行ったものも用意した。
【０１３２】
２−２）トポイソメラーゼ阻害剤、又はＤＮＡジャイレース阻害剤処理工程
前記のＥＭＡ処理及び可視光照射工程を終えた後、各処理液が入ったマイクロチューブを４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した。菌体に１ｍｌの生理食塩水を加えてよく攪拌し、同様に冷却遠心分離した、上清を除去した後、菌体に生理食塩水１ｍｌを加えてよく攪拌した。こうして、生菌のＥＭＡ未処理１ｍｌ×１本、生菌のＥＭＡ処理１ｍｌ×７本、損傷菌のＥＭＡ未処理１ｍｌ×１本、損傷菌のＥＭＡ処理１ｍｌ×７本作製した。
【０１３３】
ＥＭＡ処理した生菌及び損傷菌の１本づつを１セットとして、６つのセットに分けた。第１セットにＤＮＡジャイレース阻害剤であるシプロフロキサシン（０．５ｍｇ／ｍｌ；生理食塩水により溶解）を８μｌ、第２セットにトポイソメラーゼ阻害剤であるカンプトセシン（１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を１０μｌ、第３セットに対しトポイソメラーゼ阻害剤であるエトポシド（１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を１０μｌ、第４セットにトポイソメラーゼ阻害剤であるエリプチシン（０．１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を５μｌ、第５セットにトポイソメラーゼ阻害剤であるミトキサントロン（０．１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を１０μｌ、第６セットにトポイソメラーゼ阻害剤であるアムサクリン（１ｍｇ／ｍｌ；ジメチルスルフォキシドに溶解）を１０μｌそれぞれ添加した。各試料を、３０℃で３０分間インキュベーションした後、２ｍｌマイクロチューブに全量移し、４℃で１５，０００×ｇ、１０分間冷却遠心分離し、上清を除去した。
【０１３４】
２−３）ＤＮＡ抽出工程
上記のようにして調製した各試料から、実施例１、「１−３）ＤＮＡの抽出」と同様にしてＤＮＡを抽出した。
【０１３５】
３．リステリア菌の各種遺伝子をターゲットにしたＰＣＲ
３−１）病原遺伝子リステリア・リステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子増幅
３−１−１）ＰＣＲマスターミックスの調製
【０１３６】
下記の組成によりマスターミックス（全量５０μｌ）を調製した。
・Ex-Taq（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：０．２５μｌ
・10×Ex-Taq Buffer（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：５μｌ
・dNTP mixture（宝酒造社製、カタログ番号：RR001B）：４μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号７（ｈｌｙＡ−Ｆ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・５ｐｍｏｌ／μｌ、配列番号８（ｈｌｙＡ−Ｒ）ＤＮＡ：２．５μｌ
・２×SYBA Green（ＢＭＡ社製、カタログ番号：50513）：１０μｌ
・滅菌水：１５．７５μｌ
・鋳型ＤＮＡ（１５ｎｇ／μｌ）：１０μｌ
３−１−２）ｈｌｙＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
【０１３７】
【表６】
【０１３８】
３−１−３）ＰＣＲ反応
前記２−３）で調製した各ＤＮＡ溶液をＴＥバッファーにより１５ｎｇ／μｌに希釈し、その１０μｌについて前記３−１−１）における鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応液中に１５０ｎｇのＤＮＡを含む。ネガテイブコントロールとしてはＴＥバッファー１０μｌを用いた。
【０１３９】
前記３−１−２）で示したＰＣＲサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムＰＣＲ装置i Cycler（バイオラッド社製、機種番号：ｉＱ）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１４０】
３−２）１６ＳｒＲＮＡ、及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅
３−２−１）ＰＣＲマスターミックスの調製
実施例３、３−１）「ＰＣＲマスターミックスの調製」と同様にしてマスターミックス（全量５０μｌ）を調製した。
３−２−２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
実施例３、３−２）「１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル」（表３）にしたがった。
【０１４１】
３−２−３）グラム陽性細菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル
実施例３、３−３）「グラム陽性細菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用ＰＣＲサーマルサイクルプロファイル」（表５）にしたがって行った。
３−２−４）ＰＣＲ反応
前記２−３）で調製した各ＤＮＡ溶液を、ＴＥバッファーにより１５ｎｇ／μｌに希釈
し、その１０μｌを前記３−１−１）又は３−２−１）の鋳型ＤＮＡとして用いた。すなわち、５０μｌのＰＣＲ反応液中に１５０ｎｇのＤＮＡを鋳型を含む。ネガテイブコントロールとしては、ＴＥバッファー１０μｌを用いた。
【０１４２】
前記３−２−２）又は３−２−３）で示したＰＣＲサーマルサイクルプロファイルに従い、リアルタイムＰＣＲ装置i Cycler（バイオラッド社製、機種番号：ｉＱ）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１４３】
３−３）ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動
電気泳動は、実施例２、１−４）「ＰＣＲ増幅産物の電気泳動」と同様にして行った。なお、ｈｌｙＡ遺伝子増幅産物の検出は、３％アガロースゲルを使用した。
【０１４４】
４．試験結果
ｈｌｙＡ遺伝子がターゲットのときの結果を図１６に、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子がターゲットのときの結果を図１７及び図１８にそれぞれ示す。
【０１４５】
図１６及び図１７より、ｈｌｙＡ及び１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした場合、ＥＭＡ処理により、損傷菌のＤＮＡ増幅がわずかに阻害される程度であった。しかし、ＥＭＡとともに、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理した場合、損傷菌のＤＮＡ増幅はさらに阻害された。特に、ｈｌｙＡ遺伝子をターゲットにした場合は、エトポシド、ミトキサントロン、又はアムサクリン、及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした場合は、カンプトセシン、エトポシド、エリプチシン、又はアムサクリンを、それぞれＥＭＡと併用することにより、損傷菌のＤＮＡ増幅が著しく阻害された。
また、図１８により、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした生菌の場合、ＥＭＡとその他のトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤を併用することにより、ＰＣＲが同様に著しく阻害された。
【０１４６】
特定病原細菌に焦点を当て生菌と死菌又は損傷菌との識別を迅速に行なう場合、病原遺伝子の特異性を高めるためには１００〜２００ｂｐという短い遺伝子領域をターゲット領域とする傾向がある。ターゲット領域がこのように短い場合は、ＥＭＡが損傷菌の細胞壁を透過してＤＮＡの切断が生じても、ターゲット領域が切断されずに増幅される結果、ＰＣＲは完全に抑制されないと考えられる。一方、ＥＭＡとトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤とを併用することにより、１１３ｂｐの極めて短いｈｌｙＡ遺伝子をターゲットにした場合であっても、１０8ｃｆｕ／ｍｌレベルのリステリア損傷菌のＰＣＲをほぼ完全に抑制し、生菌のＰＣＲはほとんど抑制されなかった。
これは、トポイソメラーゼ阻害剤がＥＭＡと異なった位置にＤＮＡクロスリンクをランダムに行い、損傷菌体内の活性を残存したＤＮＡジャイレース、バクテリア・トポイソメラーゼＩ、III、及びIVの切断−再結合の中でも、再結合を阻害することにより、ＥＭＡ単独によるＤＮＡ切断状態より、さらに激しくあらゆる箇所でＤＮＡ切断状態に至らしめ、100bp〜200bpの短いターゲット遺伝子の中にも切断が生じた結果等と考えられる。
したがって、高濃度の特定病原細菌の損傷菌バックグラウンドを含む食品や各種臨床検体において、特定病原細菌の生菌と損傷菌又は死菌との識別を明瞭に行うことが可能である。ただし、死菌のＰＣＲ増幅産物抑制のためには、損傷菌とは異なり、トポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレースが失活していることもあるので、予めＡＴＰ及びＭｇ2+と、トポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレース（酵素）を添加しておいた方がより好ましい。
例えば、抗結核剤を投与されている結核症の患者においては、治療中後期における検査材料の喀痰において、抗結核剤により結核菌損傷菌が１０8〜１０9ｃｆｕ／ｍｌの濃度で存在しているが、そのような場合であっても、本発明に方法により、生菌のみを検出することが可能である。
【０１４７】
［参考例１］食品からの被検試料の調製
本発明の被検試料の１つである食品として、牛乳中に微生物が混入していた場合を想定した被検試料の調製法を以下に例示する。
【０１４８】
牛乳に、終濃度が１〜５ｍＭ、特に２ｍＭとなるようにＥＤＴＡ溶液、及び終濃度が０．１〜０．５％、特に０．１％となるようにＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ添加し、１０，０００×ｇにて、１０分間、４℃により冷却遠心分離した。なお、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌのリパーゼ（シグマ社製E.C.3.1.1.3）を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理した後、終濃度が２０Ｕ／ｍｌとなるようにプロテイナーゼＫを（シグマ社製E.C.3.4.21.64）添加して３０分〜１時間放置することが好ましい。液表面の脂肪層及び中間部の水層を除去し、沈渣を回収した。この沈渣には、細菌、乳腺上皮細胞、ウシ白血球等の体細胞が含まれており、１０，０００×ｇ以上で遠心分離した場合は、プロテイナーゼＫにより不完全に分解したミセルタンパク質分解物（カゼインミセル不完全分解物）も含まれる。ここで、カゼインミセル不完全分解物は疎水性の高いα、β−カゼインのサブミセルと考えられる。
【０１４９】
前記沈渣に当初と同容量の生理食塩水を添加して懸濁した後、１００×ｇにて、５分間、４℃で冷却遠心分離し、微生物等が存在する上清を回収した。
【０１５０】
［参考例２］血液からの被検試料の調製（１）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加え、１０，０００×ｇにて、５分間、４℃で遠心分離し、上清は除去し、沈渣を回収した。この沈渣には、細菌、血小板、単球やリンパ球等の単核球、顆粒球、及び赤血球が含まれていた。
【０１５１】
［参考例３］血液からの被検試料の調製（２）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加え、１００×ｇにて、５分、４℃で冷却遠心分離し、血漿と血球成分（単球やリンパ球等の単核球、並びに顆粒球及び赤血球）に分離し、微生物が存在する血漿を回収した。
【０１５２】
［参考例４］血液からの被検試料の調製（３）
ヘパリン加血液に同容量の生理食塩水を加えた。滅菌試験管に、まず２倍希釈されたヘパリン加血液と同容量のFicoll-Paque［アマシャムバイオサイエンス社製；Ficoll 400 （フィコール４００）は５．７ｇ／１００ｍｌ、ジアトリゾエートナトリウムは９ｇ／１００ｍｌである。比重１．０７７ｇ／ｍｌ］を充填し、その後、前記の２倍希釈されたヘパリン加血液を、試験管を斜めに傾けながらゆっくりと重層した。続いて、１００×ｇ、５分間、４℃で冷却遠心分離し、微生物が存在する上清を回収した。なお、Ficoll-Paqueに２倍希釈されたヘパリン加血液を重層するする前に、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌのリパーゼ（シグマ社製E.C.3.1.1.3）溶液を添加した後、１０〜５０Ｕ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼI（シグマ社製、EC 3.1.21.1）溶液を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理後、終濃度１０〜２０Ｕ／ｍｌとなるようにプロテイナーゼＫ（シグマ社製E.C.3.4.21.64）を添加し、３０〜３７℃により３０分〜１時間処理することが好ましい。
【０１５３】
［参考例５］血液からの被検試料の調製（４）
滅菌試験管に、予めヘパリン加血液の１／２容量となるようにMonopolyTM［アマシャムバイオサイエンス社製； Ficoll（フィコール）とMetrizoate（メトリゾエート）の混合液、比重１．１１５ｇ／ｍｌ］添加しておき、試験管を傾けながらゆっくりとヘパリン加血液を重層した。その後、１００×ｇ、５分、４℃で冷却遠心分離し、細菌が存在する上清を回収した。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明により、培養法の特性をそのまま引き継いだ迅速代替法として、食品や臨床試料中に含まれる微生物の生菌（Viable-and-Culturable）を死菌（Dead）や損傷菌（Injured
or Viable-but-Non Culturable state）に比べて選択的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】リステリア（損傷菌）の染色体DNAに与える損傷菌体内DNaseの影響、リステリア（損傷菌）の染色体DNAに与えるアムサクリンの影響、及び、リステリア（生菌）の染色体DNAに与えるアムサクリンの影響を示す電気泳動写真。未： 未処理；アムサクリン(-): アムサクリン未添加；アムサクリン(+): アムサクリン添加；1: 30 ℃ 24時間インキュベーション；2: 30 ℃ 48時間インキュベーション；3: 30 ℃ 72時間インキュベーション；
【図２】エンテロバクター（損傷菌）の染色体DNAに与える損傷菌体内DNaseの影響を示す電気泳動写真。未： 未処理；1: 37 ℃、24時間インキュベーション；2: 37 ℃、48時間インキュベーション；3: 37 ℃、72時間インキュベーション；
【図３】エンテロバクター（生菌・損傷菌）の染色体DNAに与えるシプロフロキサシンの影響を示す電気泳動写真。未： 未処理；1: 37 ℃、1.5時間インキュベーション；2: 37 ℃、3.5時間インキュベーション；3: 37 ℃、 5時間インキュベーション；4: 37 ℃、72時間インキュベーション；
【図４】リステリア（損傷菌）の染色体DNAに与える損傷菌体内DNaseの影響を示す電気泳動図。未： 未処理；1: 30 ℃、24時間インキュベーション；2: 30 ℃、48時間インキュベーション；3: 30 ℃、72時間インキュベーション；
【図５】リステリア（生菌、損傷菌）の染色体DNAに与えるシプロフロキサシンの影響を示す電気泳動写真。未： 未処理；1: 30 ℃、1.5時間インキュベーション；2: 30 ℃、3.5時間インキュベーション；3: 30 ℃、 5時間インキュベーション；4: 30 ℃、72時間インキュベーション；
【図６】シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター（生菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅曲線（中間調画像の写真）。
【図７】シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター（生菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅産物のTMパターン（中間調画像の写真）。
【図８】シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター（損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅曲線（中間調画像の写真）。
【図９】シプロフロキサシン処理されたエンテロバクター（損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅産物のTMパターン（中間調画像の写真）。
【図１０】シプロフロキサシン処理されたリステリア（生菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅曲線（中間調画像の写真）。
【図１１】シプロフロキサシン処理されたリステリア（損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたリアルタイムPCR増幅曲線（中間調画像の写真）。
【図１２】細菌懸濁液を入れたマイクロチューブの沸騰水への浸積時間と液温の関係を示す図。
【図１３】EMA未処理又はEMA処理された７種の細菌(生菌・損傷菌)の16S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。各細菌毎に、それぞれ、生菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、生菌懸濁液・ＥＭＡ処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ未処理、損傷菌懸濁液・ＥＭＡ処理の順序である。図１４及び図１５においても同様である。
【図１４】EMA未処理又はEMA処理された4種の細菌（生菌・損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。
【図１５】EMA未処理又はEMA処理されたリステリア（生菌・損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。
【図１６】EMA未処理又はEMA処理後、DNAジャイレース阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤で処理したリステリア（生菌・損傷菌）のhlyA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。未: 未処理；E: EMA；1: EMA-シプロフロキサシン；2: EMA-カンプトセシン；3: EMA-エトポシド；4: EMA-エリプチシン；5: EMA-ミトキサントロン；6: EMA-アムサクリン
【図１７】EMA未処理又はEMA処理後、DNAジャイレース阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤で処理したリステリア（生菌・損傷菌）の16S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。未: 未処理；E: EMA；1: EMA-シプロフロキサシン；2: EMA-カンプトセシン；3: EMA-エトポシド；4: EMA-エリプチシン；5: EMA-ミトキサントロン；6: EMA-アムサクリン
【図１８】EMA未処理又はEMA処理後、DNAジャイレース阻害剤又はトポイソメラーゼ阻害剤で処理したリステリア（生菌・損傷菌）の23S rRNA遺伝子をターゲットにしたPCR遺伝子増幅の結果を示す電気泳動写真。未: 未処理；E: EMA；1: EMA-シプロフロキサシン；2: EMA-カンプトセシン；3: EMA-エトポシド；4: EMA-エリプチシン；5: EMA-ミトキサントロン；6: EMA-アムサクリン；
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料をエチジウムモノアザイドで処理し、可視光を照射する工程と、アムサクリン、カンプトセシン、エリプチシン、エトポシド、ミトキサントロン、及び／又はシプロフロキサシンから選択されるトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で被検試料を処理する工程からなる工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記増幅産物の解析を、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲ法により行い、ＰＣＲと増幅産物の解析を同時に行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲット領域が２３ＳｒＲＮＡ遺伝子である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＣＲを、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットを用いて行うことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ａ）の工程の前に、下記工程を行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法：
ｄ）前記被検試料をトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースで処理する工程。
【請求項９】
被検試料中の微生物の生菌をＰＣＲにより検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
エチジウムモノアザイド、並びに
アムサクリン、カンプトセシン、エリプチシン、エトポシド、ミトキサントロン、及びシプロフロキサシンから選択される少なくとも一つ、並びに
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅するためのプライマー。
【請求項１０】
さらに、トポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記プライマーが、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットである請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１】
被検試料中の微生物の生菌を検出するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料をエチジウムモノアザイドで処理し、可視光を照射する工程と、アムサクリン、カンプトセシン、エリプチシン、エトポシド、ミトキサントロン、及び／又はシプロフロキサシンから選択されるトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で被検試料を処理する工程からなる工程、
ｂ）前記被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅する工程、並びに
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記増幅産物の解析を、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲ法により行い、ＰＣＲと増幅産物の解析を同時に行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被検試料が、乳、乳製品、乳若しくは乳製品を原料とする食品、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料のいずれかである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲット領域が２３ＳｒＲＮＡ遺伝子である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＣＲを、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットを用いて行うことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ａ）の工程の前に、下記工程を行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法：
ｄ）前記被検試料をトポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースで処理する工程。
【請求項９】
被検試料中の微生物の生菌をＰＣＲにより検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
エチジウムモノアザイド、並びに
アムサクリン、カンプトセシン、エリプチシン、エトポシド、ミトキサントロン、及びシプロフロキサシンから選択される少なくとも一つ、並びに
検出対象の微生物ＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅するためのプライマー。
【請求項１０】
さらに、トポイソメラーゼ及び／又はＤＮＡジャイレースを含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記プライマーが、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び４に示すプライマーセットである請求項９又は１０に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００８−７９６１７（Ｐ２００８−７９６１７Ａ）
【公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１０２０６（Ｐ２００７−３１０２０６）
【出願日】平成１９年１１月３０日（２００７．１１．３０）
【分割の表示】特願２００７−５３１４９９（Ｐ２００７−５３１４９９）の分割
【原出願日】平成１８年２月１７日（２００６．２．１７）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月３０日（２００７．１１．３０）
【分割の表示】特願２００７−５３１４９９（Ｐ２００７−５３１４９９）の分割
【原出願日】平成１８年２月１７日（２００６．２．１７）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
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