微生物群集構造測定方法及び微生物群集構造測定装置
【課題】検出率や信頼性が高く、労力が小さくて熟練が不要であり、測定対象となる微生物の種類が多い微生物群集構造測定方法を提供する。
【解決手段】微生物群集構造を測定したい試料Ｘに、電子供与体ｄと電子受容体ａを添加し、電子供与体ｄの消費から試料Ｘの微生物群集構造を測定する方法において、少なくとも６本の密閉した容器１ａ〜１ｆに試料Ｘを入れ、各容器１ａ〜１ｆごとに、酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体ａのうち１種をそれぞれ添加し、全ての容器１ａ〜１ｆにおける電子供与体ｄの消費から試料Ｘの微生物群集構造を測定する方法である。
【解決手段】微生物群集構造を測定したい試料Ｘに、電子供与体ｄと電子受容体ａを添加し、電子供与体ｄの消費から試料Ｘの微生物群集構造を測定する方法において、少なくとも６本の密閉した容器１ａ〜１ｆに試料Ｘを入れ、各容器１ａ〜１ｆごとに、酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体ａのうち１種をそれぞれ添加し、全ての容器１ａ〜１ｆにおける電子供与体ｄの消費から試料Ｘの微生物群集構造を測定する方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の群集構造を測定する技術に係り、特に、微生物の量と汚染物質の浄化との関係などのシミュレーションモデルに入力する各電子受容体利用微生物の存在割合を決めるための微生物群集構造測定方法及び微生物群集構造測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
排水処理設備などの排水処理系や、土壌に代表される地下圏、水圏などの自然環境において、微生物が汚染物質の挙動や移行に及ぼす影響を予測する手段としてシミュレーションモデル（数値モデル）が広く用いられている。このシミュレーションモデルは、例えば、地層汚染などの長期間（数年ないし数十年から数万年）にわたる自然環境や生態系の状況を、微生物を含めて考察する場合に、特に有効である。シミュレーションモデルの影響の大きさ（予測可能性や精度など）は微生物の量に依存するので、微生物量をモデルに入力して解析が行われることが多い。
【０００３】
しかし、微生物は多種多様であって、それらを一括して扱うことには問題がある。そこで、いくつかのモデルでは、微生物群集を、活動する際に利用する電子受容体（酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、または炭酸イオン）によって６群に分けて解析する方法を採っている（非特許文献１，２）。
【０００４】
微生物の全量は顕微鏡を用いるなどして測定可能であるが、６群の微生物の存在割合を決めるのは容易ではない。たしかに６群の微生物を培養法で測定することは一応可能である（非特許文献３）。しかし、これは全微生物の１割以下といわれる、培養できる微生物しか測定することはできないし、培養に数日ないし数十日もかかるという問題があった。
【０００５】
この労力を軽減するため、微生物の酸化還元反応（微生物の活動状態をよく反映する）を電極で測定する方法（特許文献１）や、蛍光色素で検知する方法（特許文献２）が提案されているが、微生物代謝反応が特定されないと難しいようで、排水処理装置など複合微生物系の群集構造把握にはそのまま適用はできそうもない。
【０００６】
メタン生成菌については、その特有の色素で定量する方法（特許文献３，４，５）が、また脱窒菌についてはその活性をＯＲＰ（酸化還元電位）の変化で測定する方法（特許文献６）が提案されているが、これはメタン生成菌、あるいは脱窒菌にしか適用できない。
【０００７】
遺伝子の塩基配列の解析による測定も可能であるが、炭酸イオンを還元してメタンを生成する群を古細菌の遺伝子で、硫酸イオンを還元する群を硫酸還元菌の遺伝子で検出できるものの、６群すべてを測定することはできない。また、装置や測定方法の操作に熟練を要する。
【０００８】
一方、容易に測定できる方法として、微生物の代謝活性を酸素消費速度（非特許文献４）やメタンガス発生量（特許文献７，８）で測定する方法が提案されているが、これも、酸素を利用する群、あるいは炭酸イオンを還元してメタンを生成する群にしか適用できない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−１１６５９１号公報
【特許文献２】特許第３０９５８３３号公報
【特許文献３】特公昭６３−５０９９９号公報
【特許文献４】特公平４−１３６５５号公報
【特許文献５】特公平４−４０６５４号公報
【特許文献６】特開平９−８００１５号公報
【特許文献７】特許第３０７１４０５号公報
【特許文献８】特許第３６０８７３９号公報
【非特許文献１】Mayer,K.U. et al.(2001) Reactive transport modeling or processes controlling the distribution and natural attenuation of phonolic compounds n a deep sandstone aquifer Journal of Contaminant Hydrology.Vol.53,pp.341-368.,Elsevier
【非特許文献２】Wang,Y. & Papenguth, H.W.(2001) Kinetic modeling of microbially-driven redox chemistry of radionuclides in subsurface environments:coupling transport microbial metabolisum and geochemistry. Journal of Contaminant Hydrology.Vol.47,pp.297-309.,Elsevier
【非特許文献３】土壌微生物実験法研究会（１９９２）新編土壌微生物実験法，養賢堂，東京．
【非特許文献４】日本下水道協会（１９９７）下水試験方法（上巻）ｐｐ．２７４−２７５．，日本下水道協会，東京．
【非特許文献５】Musslewhite,C.L.,Mcinerney,M.J.,Dong,Onstott,T.C.,Green-Blum,M.,Swift,D. & Macnaughton,S.(2003) The factors controlling microbial distribution and activity in the shallow subsurface. Geomicrobiology J.20,pp.245-261.,Tayler & Francis
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上述べたように、微生物の群集構造を測定する技術としては過去、多くの方法が提案されてきたが、検出率が低い、熟練を要する、対象となる微生物が限定されるなどの問題点があって、よい方法がなかった。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、検出率や信頼性が高く、労力が小さくて熟練が不要であり、測定対象となる微生物の種類が多い微生物群集構造測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は上記目的を達成するために創案されたものであり、請求項１の発明は、微生物群集構造を測定したい試料に、電子供与体と電子受容体を添加し、電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する方法において、少なくとも６本の密閉した容器に上記試料を入れ、各容器ごとに、酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体のうち１種をそれぞれ添加し、上記全ての容器における電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する微生物群集構造測定方法である。
【００１３】
請求項２の発明は、上記容器を６本用意し、各容器に上記試料を入れ、
１番目の容器の気相を上記電子受容体としての空気または酸素含有ガスで置換し、
２番目の容器に上記電子受容体としての硝酸塩を入れ、
３番目の容器に上記電子受容体としてのマンガン（IV）塩を入れ、
４番目の容器に上記電子受容体としての鉄（III）塩を入れ、
５番目の容器に上記電子受容体としての硫酸塩を入れ、
２〜５番目の容器の気相をＡｒなどの不活性ガスで置換し、
６番目の容器に上記電子受容体としての炭酸塩を入れてその気相をＡｒなどの不活性ガスで置換し、あるいは６番目の容器の気相をＡｒなどの不活性ガスで置換して上記電子受容体としての二酸化炭素を加え、
１〜６番目の容器のすべての気相に、上記電子供与体としての水素ガスを添加して培養し、経時的に気相中のガス分析をして水素の減少速度を測定し、
これを上記電子受容体を利用する微生物の存在割合の指標とする請求項１記載の微生物群集構造測定方法である。
【００１４】
請求項３の発明は、上記６番目の容器に、硫化ナトリウムなどの還元剤をさらに添加する請求項２記載の微生物群集構造測定方法である。
【００１５】
請求項４の発明は、上記１〜６番目の容器を２本ずつ合計１２本用意し、２本１群で第１〜６群の容器とし、水素ガスを添加した後、各群の一方の容器はそのまま培養し、他方の容器は滅菌して培養する請求項２または３記載の微生物群集構造測定方法である。
【００１６】
請求項５の発明は、微生物群集構造を測定したい試料に、電子供与体と電子受容体を添加し、電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する装置において、上記試料を入れると共に酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体のうち１種をそれぞれ添加した少なくとも６本の密閉した容器と、これら容器を培養する培養手段と、培養後の各容器の気相をサンプリングするサンプリング手段とを備えた微生物群集構造測定装置である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、検出率や信頼性が高く、労力が小さくて熟練が不要であり、測定対象となる微生物の種類が多いという優れた効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者らは、特許文献１と同じく微生物の活性を酸化還元反応の量で把握しようという発想に立ち、鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態を添付図面にしたがって説明する。
【００２０】
図１（ａ）〜図１（ｆ）は、本発明の好適な実施形態である微生物群集構造測定装置と、これを用いた本発明の好適な実施形態を示す微生物群集構造測定方法の手順とを説明する概略図である。
【００２１】
図１（ａ）〜図１（ｆ）に示すように、本実施形態に係る微生物群集構造測定装置１０は、試料Ｘを入れると共に酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体ａのうち１種をそれぞれ添加した少なくとも６本の密閉した容器１と、これら容器１を回転培養する培養手段としての回転培養器５と、培養後の各容器１の気相ｇ３をサンプリングするサンプリング手段としてガスタイトシリンジ３ｓと、サンプリング手段でサンプリングした気相ｇ３のガス分析を行う図示しないガス分析手段としてのガスクロマトグラフ（ガスクロ）装置とを備える。
【００２２】
また、本実施形態に係る微生物群集構造測定方法は、微生物群集構造測定装置１０を用いて行い、微生物群集構造を測定したい試料Ｘに、微生物が活動する際に利用する電子供与体ｄと電子受容体（添加物）ａを添加し、電子供与体ｄの消費から試料Ｘの微生物群集構造を測定する方法である。
【００２３】
この微生物群集構造測定方法は、少なくとも６本の密閉した容器（密閉容器、培養容器、バイアル瓶）１に試料Ｘを入れ、各容器１ごとに、酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体ａのうち１種をそれぞれ添加し、全ての容器１における電子供与体ｄの消費から試料Ｘの微生物群集構造を測定する方法である。
【００２４】
試料Ｘとしては、排水処理設備などの排水処理系や、土壌に代表される地下圏、水圏などの自然環境のサンプルになるものであれば、液体に限らず、いかなるものでもよい。例えば、活性汚泥、活性汚泥処理水、メタン発酵処理水、地下水、河川水、海水などがある。
【００２５】
電子供与体ｄとしては、有機物を用いてもよいが、大部分の微生物にとって利用しやすい水素を用いるとよい。電子供与体ｄとして水素を使用すると、測定が簡単になる利点もある。
【００２６】
電子受容体ａを上記の６種類としたのは、これら６種類の電子受容体ａで試料Ｘ中に存在する微生物の存在割合の指標として必要十分だからである。また、６種類の電子受容体ａを用いる方法が、上述したシミュレーションモデルの有力あるいは代表的な方法だからである。
【００２７】
用いる電子受容体ａとして、酸素では好気性菌、硝酸イオンでは硝酸還元菌、マンガン（IV）塩ではマンガン還元菌、鉄（III）塩では鉄還元菌、硫酸イオンでは硫酸還元菌、炭酸イオンではメタン生成菌が、試料Ｘ中に存在していることがわかる。
【００２８】
より詳細には、図１（ａ）に示すように、容器１を６本用意し、各容器１に試料Ｘを入れ、
１番目の容器１ａの気相ｇ１を電子受容体ａとしての空気、または酸素含有ガス（例えば、空気＋Ａｒなどの不活性ガス）で置換する。後者は、酸素濃度が高いと、種によっては微生物の活動を阻害することがあるので、これを防止するためである。
【００２９】
他方、２番目の容器１ｂに電子受容体ａとしての硝酸塩を入れ、
３番目の容器１ｃに電子受容体ａとしてのマンガン（IV）塩を入れ、
４番目の容器１ｄに電子受容体ａとしての鉄（III）塩を入れ、
５番目の容器１ｅに電子受容体ａとしての硫酸塩を入れ、
図１（ｂ）に示すように、２〜５番目の容器１ｂ〜１ｅの気相ｇ１を、空気パージの目的でＡｒなどの不活性ガスｎで置換し、
６番目の容器１ｆに上記電子受容体ａとしての炭酸塩を入れてその気相をＡｒなどの不活性ガスｎで置換し、あるいは６番目の容器１ｆの気相ｇ１をＡｒなどの不活性ガスｎで置換して電子受容体ａとしての二酸化炭素を加える。
【００３０】
厳密に言うと１番目の容器１ａや、電子受容体ａとして二酸化炭素を加える場合の６番目の容器１ｆでは、電子受容体ａは気体であるが、説明の便宜上、図１では固体の例で示した。
【００３１】
図１（ｃ）に示すように、１〜６番目の容器１ａ〜１ｆのすべての気相ｇ２に、電子供与体ｄとしての水素ガスを添加（注入）する。
【００３２】
水素ガスの添加量は、微生物の酸化還元反応を促進するため、気相ｇ２に対し、１％以上にするとよい（自然環境では、非特許文献５の約０．０２６％より低い）。この際、気相ｇ２のｐＨを調整するために、水素ガスと共に二酸化炭素を水素ガスと同量程度添加するとよい。
【００３３】
気相ｇ２に水素ガスを添加するとき、各容器１ａ〜１ｆ内を微加圧するとよい。各容器１ａ〜１ｆ内を微加圧状態にすることで、各容器１ａ〜１ｆ内に空気が混入することを防止できる。
【００３４】
その後、図１（ｆ）に示すように培養し、経時的に気相ｇ３中のガス分析をして電子供与体ｄの消費の目安となる水素の減少速度を測定し、
これを電子受容体ａを利用する微生物の存在割合の指標とする。
【００３５】
各容器１ａ〜１ｆの密閉には、上部が開口した容器の開口部を、容器内の気密を保持するブチルゴム栓２でシールするとよい。不活性ガスｎによる気相ｇ１の置換、電子供与体ｄの添加、気相ｇ３中のガス分析には、それぞれ同様の構造を有するガスタイトシリンジ３ｎ，３ｄ，３ｓを用いるとよい。また、培養には、回転培養器５を用い、水素ガスの試料Ｘへの溶解を促進させるとよい。ガス分析は、上述したガスクロ装置を用いて行う。
【００３６】
６番目の容器１ｆには、硫化ナトリウムなどの還元剤をさらに添加してもよい。これは、酸化還元電位を確実に下げる場合に行う。例えば、酸化還元電位が高いと存在できないメタン生成菌などの微生物の群集構造も測定したいときに還元剤の添加が必要である。
【００３７】
また、容器１を６本ではなく、１〜６番目の容器１ａ〜１ｆを２本ずつ合計１２本用意し、２本１群で第１〜６群の容器１Ａ〜１Ｆとし、水素ガスを添加した後、図１（ｅ）に示すように、各群の一方の容器はそのまま培養し、図１（ｄ）に示すように、他方の容器は滅菌して培養（一部滅菌）してもよい。滅菌には、蒸気滅菌を行うオートクレーブ４を用いるとよいが、ガンマ線滅菌でもよい。
【００３８】
本実施形態の作用を説明する。
【００３９】
非特許文献５では、固体試料を密閉型の培養容器に入れ、気相には電子供与体として水素を添加して培養し、経時的にブチルゴム栓を通して気相のガスをサンプリングして水素の分析を行い、その消費量から微生物の活性を把握しようとしている。
【００４０】
本実施形態に係る微生物群集構造測定装置１０を用いた微生物群集構造測定方法では、少なくとも６本の密閉した容器１に試料Ｘを入れ、各容器１ごとに、上述した６種類の電子受容体ａのうち１種をそれぞれ添加し、全ての容器１における電子供与体ｄの消費から総合的に判断して試料Ｘの微生物群集構造を測定している。
【００４１】
より詳細には、容器１を１２本用意し、その２本ずつに試料Ｘのほか、６群の微生物の各々に特異的な６種類の電子受容体ａの１つを添加し、気相ｇ２には電子供与体ｄとして１％以上の水素を添加し（非特許文献５では０．０２６％しか添加していない）、微加圧状態として空気の混入を防ぎ、酸化還元電位も下げている。
【００４２】
これにより、本実施形態に係る方法は、炭酸イオンからメタンを生成する菌（メタン生成菌）も含めた多種類の微生物の培養を可能とし、さらに各容器１を回転培養して水素ガスの試料Ｘへの溶解を促進することによって、簡易かつ信頼できる微生物群集構造測定技術を提供するものである。
【００４３】
つまり、本実施形態に係る方法は、大部分の微生物にとって利用しやすい電子供与体ｄである水素の消費量を指標とし、図１（ｄ）および図１（ｅ）の一部滅菌により滅菌系とも比較するので、試料Ｘ中に存在する微生物群集構造の測定誤差が生じにくく、信頼性が高い。この測定結果を用いれば、上述したシミュレーションモデルの精度を従来よりも大幅に向上でき、現実や現場との整合性も高まる。
【００４４】
特に、一部滅菌すれば、各容器１ａ〜１ｆ内の反応を微生物反応と化学反応とに区別して測定できるため、一部滅菌しない場合と比べれば、誤差がより生じにくく、信頼性がより高い。
【００４５】
また、本実施形態に係る方法における操作は、試料Ｘへの電子受容体ａ、電子供与体ｄの添加が簡単であり、その後、回転培養器５に各容器１ａ〜１ｆをセッティングしてしまえば、あとは１日１回程度のガスクロ分析で済み、労力が小さく、また熟練も不要である。
【００４６】
さらに、本実施形態に係る方法は、特定の微生物のみでなく試料Ｘ中に存在する微生物全体の活性を測るので、測定対象となる微生物が限定されることはなく、測定できる微生物の種類も多い。すなわち、本実施形態に係る方法は、従来にないメリットを備えた測定方法である。
【００４７】
より詳細にいえば、本実施形態に係る方法は、特に６種類の電子受容体ａを利用する微生物群をすべて測定することによって、次のような効果を生む。
【００４８】
例えば、排水処理施設では、従来は排水と微生物の混合液を単に曝気して酸素を供給し、好気性菌により排水中の有機物等を分解するものであったが、最近では何らかの嫌気性工程を組み込む場合が増えてきた。しかも、好気性工程の液と嫌気性工程の液を循環する場合が多い（例えば、硝化脱窒法の循環変法、メタン発酵槽への硝化処理液の循環など）。こういう液中でどういう微生物群がどのくらい占めているかの情報は排水処理設備の管理上、大変重要である。
【００４９】
硝酸イオンを利用する硝酸還元菌が多ければ、窒素化合物除去のポテンシャルが高いことがわかる一方、温室効果ガスの亜酸化窒素の放出に配慮しなければならない。硫酸イオンを利用する硫酸還元菌が多ければ、悪臭や腐食の原因となる硫化水素の発生に注意しなければならない。炭酸イオンを利用するメタン生成菌が多ければ、温室効果ガスのメタンの放出への配慮が必要な一方、メタンを回収しエネルギー源として利用する可能性も出てくる。しかも、硝酸還元菌やマンガン還元菌など、よりエネルギー獲得効率のよい微生物群が働けば、よりエネルギー獲得効率の悪い硫酸還元菌は働かず、硫化水素の心配は軽減されるというような微生物群間の相互作用もある。
【００５０】
つまり、硫化水素発生可能性を調べるためには、硫酸還元菌の量だけ調べていればよいというものではない。６種の微生物群すべてを調査することによって、排水処理施設で何が起こりうるかを広い視野で予測することができる。
【００５１】
汚染土壌や汚染地下水においては別の意味で効果が期待される。汚染物質が流れている場で汚染物質の分解（自浄作用）が起きているとき、その場の微生物の群集構造（６つの群の存在割合）がわかり、ある電子受容体ａを利用する群が多いことがわかれば、自浄作用を高く保つような管理が可能になる。その電子受容体ａの供給が止まると浄化が遅れること、その電子受容体ａを添加してやれば浄化が進むことなどが推定できる。
【００５２】
例えば、本実施形態に係る方法により、排水処理装置から採取した処理水を試料Ｘとし、その微生物群集構造を測定すれば、排水処理装置の浄化槽や活性汚泥の状態（経時変化など）を正確に把握したり、種汚泥の良否、選別などを簡単に判断できる。
【００５３】
微生物挙動の長期予測のためのシミュレーションモデルにおいては、この本実施形態に係る測定方法はさらに決定的な役割を果たす。こういうモデルのいくつかでは、６群の微生物量と、各々の増殖に関するパラメータとを入力し、時空間的な環境変化に対応して６群の微生物量がどう変化していくかを予測するが、モデルは現場に適用する前に確証をする必要がある。
【００５４】
すなわち、現場や模擬実験装置に、例えばある水質の地下水を流入させて微生物挙動を調べ、一方それと同じ地下水質を境界条件として与えたシミュレーションモデルで解析を行って微生物挙動をアウトプットとして出し、両者がある程度一致することをもって確証とする。その際、本実施形態に係る方法のように、現場や模擬実験装置における６群の微生物量（存在割合）を測定する技術は必須となる。
【００５５】
また、本実施形態に係る微生物群集構造測定装置１０によれば、上述した微生物群集構造測定方法を簡単にかつ確実に実施できる。
【実施例】
【００５６】
本発明者らは、上述した効果を期待し、微生物群集構造測定装置１０を用いて実験を行った。
【００５７】
まず、１２本の容積６５ｍＬの培養容器を用意する。操作手順は、各培養容器１に主として排水処理装置から採取した試料Ｘを３０ｍＬ入れ、一部のものについては、電子受容体としての添加物を表１にしたがって入れる（あらかじめ入れておいてもよい）。
【００５８】
各容器１にブチルゴム栓２をして、試料Ｘおよび気相ｇ１にＡｒなどの不活性ガスｎを送り置換した後、密栓する。その後、表１の気相への注入にしたがって水素等を気相ｇ２に注入する。空気を入れる際は、ブチルゴム栓２を一端外して気相を完全に入れ替えてもよい。
【００５９】
より詳細には、第１群の培養容器１ＡにＯ2 を１０ｍＭ、第２群の培養容器１ＢにＫＮＯ3 を３ｍＭ、第３群の培養容器１ＣにＭｎＯ2 を７．５ｍＭ、第４群の培養容器１ＤにアモルファスＦｅ（III）を１０〜１５ｍＭ、第５群の培養容器１ＥにＫ2 ＳＯ4 を１．９ｍＭ、第６群の培養容器１ＦにＣＯ2 ：３．７５ｍＭ＋Ｎａ2 Ｓ・９Ｈ2 Ｏ：３００ｍｇ／Ｌ＋レサズリン１ｍｇ／Ｌ添加した。電子供与体ｄとしてＨ2 を３ｍＭ、またはアセテート−Ｃを９〜１０ｍＭとした。気相ｇ２にはｐＨ調整のため、すべてＣＯ2 を３．７５ｍＭ加えた。これにより、試験例１〜１２のサンプルを得た。
【００６０】
２本同じものができるので、そのうちの１本はオートクレーブ４で滅菌する。これらを回転培養器５にセットして、一定温度（例えば３０℃）で培養し、経時的に（例えば、毎日１回）気相ｇ３のガスをガスタイトシリンジ３で採取し、これを図示しないガスクロ装置に注入して水素濃度を分析し、気相ｇ３中のガス、水質の変化を測定した。
【００６１】
電子受容体ａとして酸素を用いる場合はただちに、それ以外の場合は気相ｇ３中に当初微量残存している可能性のある酸素がなくなった後、水素濃度の減少量から各電子受容体ａ存在下の微生物の水素消費速度を測定する。これから、試料Ｘ中の微生物群集の構成を推定する。
【００６２】
【表１】
【００６３】
メタン発酵処理水と活性汚泥処理水の試料Ｘについて、本実施形態に係る方法を適用し、２４ｈ後の結果を図２に示す。図２の横軸では、右に行くほど嫌気性菌が存在する割合が高く、左に行くほど酸化還元電位が高い。
【００６４】
図２に示すように、メタン発酵処理水（図２中の◆（滅菌なし））では、６種すべての電子受容体ａに対する水素消費活性がそれぞれ高く、一方滅菌系（図２中の◆（滅菌））ではほとんど活性がないことから、これら６種すべての電子受容体ａを利用する微生物群がこの試料Ｘにはそろっていることがわかる。
【００６５】
これにより、メタン発酵槽からは硫化水素が発生するおそれがあること、鉄（III）やマンガン（IV）を添加すれば有機物分解が促進される可能性があること、硝酸イオンを流入させれば脱窒で窒素化合物も除去される可能性があること、この処理水をさらに曝気すれば好気性菌を接種しなくても（もともと好気性菌が存在しているので）分解が進むことなどがわかる。
【００６６】
なお、■で示す滅菌系のデータでは、硝酸イオンにおける水素消費活性が０になっていないが、これは測定誤差だと思われる。
【００６７】
また、活性汚泥処理水（図２中の△）の試料Ｘでは、４種の電子受容体ａを利用する微生物群が存在することがわかるが、炭酸イオンを還元してメタンを発生する微生物群の活性はゼロであり、また総じて、嫌気的条件で利用されやすい硫酸イオン、マンガン（IV）塩などの利用性も悪く、好気的条件に適応した微生物群が育っていること、これをそのままメタン発酵槽の種汚泥には使えないことがわかる。
【００６８】
以上のように、本実施形態に係る方法は、様々な場での微生物挙動の予測に必要な微生物の群集構造測定方法として大変有効な方法である。
【００６９】
したがって、本実施形態に係る方法は、環境により、異なる電子受容体ａごとの活性の相対的関係が異なり、微生物群集の構成の違いを表す指標の１つとなるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１（ａ）〜図１（ｆ）は、本発明の好適な実施形態である微生物群集構造測定装置と、これを用いた本発明の好適な実施形態を示す微生物群集構造測定方法の手順とを説明する概略図である。
【図２】実施例の試料について本実施形態に係る微生物群集構造測定方法を実施した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７１】
１ 容器
１ａ〜１ｆ １〜６番目の容器
１Ａ〜１Ｆ 第１〜６群の容器
Ｘ 試料
ｄ 電子供与体
ａ 電子受容体
５ 回転培養器
１０ 微生物群集構造測定装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の群集構造を測定する技術に係り、特に、微生物の量と汚染物質の浄化との関係などのシミュレーションモデルに入力する各電子受容体利用微生物の存在割合を決めるための微生物群集構造測定方法及び微生物群集構造測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
排水処理設備などの排水処理系や、土壌に代表される地下圏、水圏などの自然環境において、微生物が汚染物質の挙動や移行に及ぼす影響を予測する手段としてシミュレーションモデル（数値モデル）が広く用いられている。このシミュレーションモデルは、例えば、地層汚染などの長期間（数年ないし数十年から数万年）にわたる自然環境や生態系の状況を、微生物を含めて考察する場合に、特に有効である。シミュレーションモデルの影響の大きさ（予測可能性や精度など）は微生物の量に依存するので、微生物量をモデルに入力して解析が行われることが多い。
【０００３】
しかし、微生物は多種多様であって、それらを一括して扱うことには問題がある。そこで、いくつかのモデルでは、微生物群集を、活動する際に利用する電子受容体（酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、または炭酸イオン）によって６群に分けて解析する方法を採っている（非特許文献１，２）。
【０００４】
微生物の全量は顕微鏡を用いるなどして測定可能であるが、６群の微生物の存在割合を決めるのは容易ではない。たしかに６群の微生物を培養法で測定することは一応可能である（非特許文献３）。しかし、これは全微生物の１割以下といわれる、培養できる微生物しか測定することはできないし、培養に数日ないし数十日もかかるという問題があった。
【０００５】
この労力を軽減するため、微生物の酸化還元反応（微生物の活動状態をよく反映する）を電極で測定する方法（特許文献１）や、蛍光色素で検知する方法（特許文献２）が提案されているが、微生物代謝反応が特定されないと難しいようで、排水処理装置など複合微生物系の群集構造把握にはそのまま適用はできそうもない。
【０００６】
メタン生成菌については、その特有の色素で定量する方法（特許文献３，４，５）が、また脱窒菌についてはその活性をＯＲＰ（酸化還元電位）の変化で測定する方法（特許文献６）が提案されているが、これはメタン生成菌、あるいは脱窒菌にしか適用できない。
【０００７】
遺伝子の塩基配列の解析による測定も可能であるが、炭酸イオンを還元してメタンを生成する群を古細菌の遺伝子で、硫酸イオンを還元する群を硫酸還元菌の遺伝子で検出できるものの、６群すべてを測定することはできない。また、装置や測定方法の操作に熟練を要する。
【０００８】
一方、容易に測定できる方法として、微生物の代謝活性を酸素消費速度（非特許文献４）やメタンガス発生量（特許文献７，８）で測定する方法が提案されているが、これも、酸素を利用する群、あるいは炭酸イオンを還元してメタンを生成する群にしか適用できない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−１１６５９１号公報
【特許文献２】特許第３０９５８３３号公報
【特許文献３】特公昭６３−５０９９９号公報
【特許文献４】特公平４−１３６５５号公報
【特許文献５】特公平４−４０６５４号公報
【特許文献６】特開平９−８００１５号公報
【特許文献７】特許第３０７１４０５号公報
【特許文献８】特許第３６０８７３９号公報
【非特許文献１】Mayer,K.U. et al.(2001) Reactive transport modeling or processes controlling the distribution and natural attenuation of phonolic compounds n a deep sandstone aquifer Journal of Contaminant Hydrology.Vol.53,pp.341-368.,Elsevier
【非特許文献２】Wang,Y. & Papenguth, H.W.(2001) Kinetic modeling of microbially-driven redox chemistry of radionuclides in subsurface environments:coupling transport microbial metabolisum and geochemistry. Journal of Contaminant Hydrology.Vol.47,pp.297-309.,Elsevier
【非特許文献３】土壌微生物実験法研究会（１９９２）新編土壌微生物実験法，養賢堂，東京．
【非特許文献４】日本下水道協会（１９９７）下水試験方法（上巻）ｐｐ．２７４−２７５．，日本下水道協会，東京．
【非特許文献５】Musslewhite,C.L.,Mcinerney,M.J.,Dong,Onstott,T.C.,Green-Blum,M.,Swift,D. & Macnaughton,S.(2003) The factors controlling microbial distribution and activity in the shallow subsurface. Geomicrobiology J.20,pp.245-261.,Tayler & Francis
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上述べたように、微生物の群集構造を測定する技術としては過去、多くの方法が提案されてきたが、検出率が低い、熟練を要する、対象となる微生物が限定されるなどの問題点があって、よい方法がなかった。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、検出率や信頼性が高く、労力が小さくて熟練が不要であり、測定対象となる微生物の種類が多い微生物群集構造測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は上記目的を達成するために創案されたものであり、請求項１の発明は、微生物群集構造を測定したい試料に、電子供与体と電子受容体を添加し、電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する方法において、少なくとも６本の密閉した容器に上記試料を入れ、各容器ごとに、酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体のうち１種をそれぞれ添加し、上記全ての容器における電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する微生物群集構造測定方法である。
【００１３】
請求項２の発明は、上記容器を６本用意し、各容器に上記試料を入れ、
１番目の容器の気相を上記電子受容体としての空気または酸素含有ガスで置換し、
２番目の容器に上記電子受容体としての硝酸塩を入れ、
３番目の容器に上記電子受容体としてのマンガン（IV）塩を入れ、
４番目の容器に上記電子受容体としての鉄（III）塩を入れ、
５番目の容器に上記電子受容体としての硫酸塩を入れ、
２〜５番目の容器の気相をＡｒなどの不活性ガスで置換し、
６番目の容器に上記電子受容体としての炭酸塩を入れてその気相をＡｒなどの不活性ガスで置換し、あるいは６番目の容器の気相をＡｒなどの不活性ガスで置換して上記電子受容体としての二酸化炭素を加え、
１〜６番目の容器のすべての気相に、上記電子供与体としての水素ガスを添加して培養し、経時的に気相中のガス分析をして水素の減少速度を測定し、
これを上記電子受容体を利用する微生物の存在割合の指標とする請求項１記載の微生物群集構造測定方法である。
【００１４】
請求項３の発明は、上記６番目の容器に、硫化ナトリウムなどの還元剤をさらに添加する請求項２記載の微生物群集構造測定方法である。
【００１５】
請求項４の発明は、上記１〜６番目の容器を２本ずつ合計１２本用意し、２本１群で第１〜６群の容器とし、水素ガスを添加した後、各群の一方の容器はそのまま培養し、他方の容器は滅菌して培養する請求項２または３記載の微生物群集構造測定方法である。
【００１６】
請求項５の発明は、微生物群集構造を測定したい試料に、電子供与体と電子受容体を添加し、電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する装置において、上記試料を入れると共に酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体のうち１種をそれぞれ添加した少なくとも６本の密閉した容器と、これら容器を培養する培養手段と、培養後の各容器の気相をサンプリングするサンプリング手段とを備えた微生物群集構造測定装置である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、検出率や信頼性が高く、労力が小さくて熟練が不要であり、測定対象となる微生物の種類が多いという優れた効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者らは、特許文献１と同じく微生物の活性を酸化還元反応の量で把握しようという発想に立ち、鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態を添付図面にしたがって説明する。
【００２０】
図１（ａ）〜図１（ｆ）は、本発明の好適な実施形態である微生物群集構造測定装置と、これを用いた本発明の好適な実施形態を示す微生物群集構造測定方法の手順とを説明する概略図である。
【００２１】
図１（ａ）〜図１（ｆ）に示すように、本実施形態に係る微生物群集構造測定装置１０は、試料Ｘを入れると共に酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体ａのうち１種をそれぞれ添加した少なくとも６本の密閉した容器１と、これら容器１を回転培養する培養手段としての回転培養器５と、培養後の各容器１の気相ｇ３をサンプリングするサンプリング手段としてガスタイトシリンジ３ｓと、サンプリング手段でサンプリングした気相ｇ３のガス分析を行う図示しないガス分析手段としてのガスクロマトグラフ（ガスクロ）装置とを備える。
【００２２】
また、本実施形態に係る微生物群集構造測定方法は、微生物群集構造測定装置１０を用いて行い、微生物群集構造を測定したい試料Ｘに、微生物が活動する際に利用する電子供与体ｄと電子受容体（添加物）ａを添加し、電子供与体ｄの消費から試料Ｘの微生物群集構造を測定する方法である。
【００２３】
この微生物群集構造測定方法は、少なくとも６本の密閉した容器（密閉容器、培養容器、バイアル瓶）１に試料Ｘを入れ、各容器１ごとに、酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体ａのうち１種をそれぞれ添加し、全ての容器１における電子供与体ｄの消費から試料Ｘの微生物群集構造を測定する方法である。
【００２４】
試料Ｘとしては、排水処理設備などの排水処理系や、土壌に代表される地下圏、水圏などの自然環境のサンプルになるものであれば、液体に限らず、いかなるものでもよい。例えば、活性汚泥、活性汚泥処理水、メタン発酵処理水、地下水、河川水、海水などがある。
【００２５】
電子供与体ｄとしては、有機物を用いてもよいが、大部分の微生物にとって利用しやすい水素を用いるとよい。電子供与体ｄとして水素を使用すると、測定が簡単になる利点もある。
【００２６】
電子受容体ａを上記の６種類としたのは、これら６種類の電子受容体ａで試料Ｘ中に存在する微生物の存在割合の指標として必要十分だからである。また、６種類の電子受容体ａを用いる方法が、上述したシミュレーションモデルの有力あるいは代表的な方法だからである。
【００２７】
用いる電子受容体ａとして、酸素では好気性菌、硝酸イオンでは硝酸還元菌、マンガン（IV）塩ではマンガン還元菌、鉄（III）塩では鉄還元菌、硫酸イオンでは硫酸還元菌、炭酸イオンではメタン生成菌が、試料Ｘ中に存在していることがわかる。
【００２８】
より詳細には、図１（ａ）に示すように、容器１を６本用意し、各容器１に試料Ｘを入れ、
１番目の容器１ａの気相ｇ１を電子受容体ａとしての空気、または酸素含有ガス（例えば、空気＋Ａｒなどの不活性ガス）で置換する。後者は、酸素濃度が高いと、種によっては微生物の活動を阻害することがあるので、これを防止するためである。
【００２９】
他方、２番目の容器１ｂに電子受容体ａとしての硝酸塩を入れ、
３番目の容器１ｃに電子受容体ａとしてのマンガン（IV）塩を入れ、
４番目の容器１ｄに電子受容体ａとしての鉄（III）塩を入れ、
５番目の容器１ｅに電子受容体ａとしての硫酸塩を入れ、
図１（ｂ）に示すように、２〜５番目の容器１ｂ〜１ｅの気相ｇ１を、空気パージの目的でＡｒなどの不活性ガスｎで置換し、
６番目の容器１ｆに上記電子受容体ａとしての炭酸塩を入れてその気相をＡｒなどの不活性ガスｎで置換し、あるいは６番目の容器１ｆの気相ｇ１をＡｒなどの不活性ガスｎで置換して電子受容体ａとしての二酸化炭素を加える。
【００３０】
厳密に言うと１番目の容器１ａや、電子受容体ａとして二酸化炭素を加える場合の６番目の容器１ｆでは、電子受容体ａは気体であるが、説明の便宜上、図１では固体の例で示した。
【００３１】
図１（ｃ）に示すように、１〜６番目の容器１ａ〜１ｆのすべての気相ｇ２に、電子供与体ｄとしての水素ガスを添加（注入）する。
【００３２】
水素ガスの添加量は、微生物の酸化還元反応を促進するため、気相ｇ２に対し、１％以上にするとよい（自然環境では、非特許文献５の約０．０２６％より低い）。この際、気相ｇ２のｐＨを調整するために、水素ガスと共に二酸化炭素を水素ガスと同量程度添加するとよい。
【００３３】
気相ｇ２に水素ガスを添加するとき、各容器１ａ〜１ｆ内を微加圧するとよい。各容器１ａ〜１ｆ内を微加圧状態にすることで、各容器１ａ〜１ｆ内に空気が混入することを防止できる。
【００３４】
その後、図１（ｆ）に示すように培養し、経時的に気相ｇ３中のガス分析をして電子供与体ｄの消費の目安となる水素の減少速度を測定し、
これを電子受容体ａを利用する微生物の存在割合の指標とする。
【００３５】
各容器１ａ〜１ｆの密閉には、上部が開口した容器の開口部を、容器内の気密を保持するブチルゴム栓２でシールするとよい。不活性ガスｎによる気相ｇ１の置換、電子供与体ｄの添加、気相ｇ３中のガス分析には、それぞれ同様の構造を有するガスタイトシリンジ３ｎ，３ｄ，３ｓを用いるとよい。また、培養には、回転培養器５を用い、水素ガスの試料Ｘへの溶解を促進させるとよい。ガス分析は、上述したガスクロ装置を用いて行う。
【００３６】
６番目の容器１ｆには、硫化ナトリウムなどの還元剤をさらに添加してもよい。これは、酸化還元電位を確実に下げる場合に行う。例えば、酸化還元電位が高いと存在できないメタン生成菌などの微生物の群集構造も測定したいときに還元剤の添加が必要である。
【００３７】
また、容器１を６本ではなく、１〜６番目の容器１ａ〜１ｆを２本ずつ合計１２本用意し、２本１群で第１〜６群の容器１Ａ〜１Ｆとし、水素ガスを添加した後、図１（ｅ）に示すように、各群の一方の容器はそのまま培養し、図１（ｄ）に示すように、他方の容器は滅菌して培養（一部滅菌）してもよい。滅菌には、蒸気滅菌を行うオートクレーブ４を用いるとよいが、ガンマ線滅菌でもよい。
【００３８】
本実施形態の作用を説明する。
【００３９】
非特許文献５では、固体試料を密閉型の培養容器に入れ、気相には電子供与体として水素を添加して培養し、経時的にブチルゴム栓を通して気相のガスをサンプリングして水素の分析を行い、その消費量から微生物の活性を把握しようとしている。
【００４０】
本実施形態に係る微生物群集構造測定装置１０を用いた微生物群集構造測定方法では、少なくとも６本の密閉した容器１に試料Ｘを入れ、各容器１ごとに、上述した６種類の電子受容体ａのうち１種をそれぞれ添加し、全ての容器１における電子供与体ｄの消費から総合的に判断して試料Ｘの微生物群集構造を測定している。
【００４１】
より詳細には、容器１を１２本用意し、その２本ずつに試料Ｘのほか、６群の微生物の各々に特異的な６種類の電子受容体ａの１つを添加し、気相ｇ２には電子供与体ｄとして１％以上の水素を添加し（非特許文献５では０．０２６％しか添加していない）、微加圧状態として空気の混入を防ぎ、酸化還元電位も下げている。
【００４２】
これにより、本実施形態に係る方法は、炭酸イオンからメタンを生成する菌（メタン生成菌）も含めた多種類の微生物の培養を可能とし、さらに各容器１を回転培養して水素ガスの試料Ｘへの溶解を促進することによって、簡易かつ信頼できる微生物群集構造測定技術を提供するものである。
【００４３】
つまり、本実施形態に係る方法は、大部分の微生物にとって利用しやすい電子供与体ｄである水素の消費量を指標とし、図１（ｄ）および図１（ｅ）の一部滅菌により滅菌系とも比較するので、試料Ｘ中に存在する微生物群集構造の測定誤差が生じにくく、信頼性が高い。この測定結果を用いれば、上述したシミュレーションモデルの精度を従来よりも大幅に向上でき、現実や現場との整合性も高まる。
【００４４】
特に、一部滅菌すれば、各容器１ａ〜１ｆ内の反応を微生物反応と化学反応とに区別して測定できるため、一部滅菌しない場合と比べれば、誤差がより生じにくく、信頼性がより高い。
【００４５】
また、本実施形態に係る方法における操作は、試料Ｘへの電子受容体ａ、電子供与体ｄの添加が簡単であり、その後、回転培養器５に各容器１ａ〜１ｆをセッティングしてしまえば、あとは１日１回程度のガスクロ分析で済み、労力が小さく、また熟練も不要である。
【００４６】
さらに、本実施形態に係る方法は、特定の微生物のみでなく試料Ｘ中に存在する微生物全体の活性を測るので、測定対象となる微生物が限定されることはなく、測定できる微生物の種類も多い。すなわち、本実施形態に係る方法は、従来にないメリットを備えた測定方法である。
【００４７】
より詳細にいえば、本実施形態に係る方法は、特に６種類の電子受容体ａを利用する微生物群をすべて測定することによって、次のような効果を生む。
【００４８】
例えば、排水処理施設では、従来は排水と微生物の混合液を単に曝気して酸素を供給し、好気性菌により排水中の有機物等を分解するものであったが、最近では何らかの嫌気性工程を組み込む場合が増えてきた。しかも、好気性工程の液と嫌気性工程の液を循環する場合が多い（例えば、硝化脱窒法の循環変法、メタン発酵槽への硝化処理液の循環など）。こういう液中でどういう微生物群がどのくらい占めているかの情報は排水処理設備の管理上、大変重要である。
【００４９】
硝酸イオンを利用する硝酸還元菌が多ければ、窒素化合物除去のポテンシャルが高いことがわかる一方、温室効果ガスの亜酸化窒素の放出に配慮しなければならない。硫酸イオンを利用する硫酸還元菌が多ければ、悪臭や腐食の原因となる硫化水素の発生に注意しなければならない。炭酸イオンを利用するメタン生成菌が多ければ、温室効果ガスのメタンの放出への配慮が必要な一方、メタンを回収しエネルギー源として利用する可能性も出てくる。しかも、硝酸還元菌やマンガン還元菌など、よりエネルギー獲得効率のよい微生物群が働けば、よりエネルギー獲得効率の悪い硫酸還元菌は働かず、硫化水素の心配は軽減されるというような微生物群間の相互作用もある。
【００５０】
つまり、硫化水素発生可能性を調べるためには、硫酸還元菌の量だけ調べていればよいというものではない。６種の微生物群すべてを調査することによって、排水処理施設で何が起こりうるかを広い視野で予測することができる。
【００５１】
汚染土壌や汚染地下水においては別の意味で効果が期待される。汚染物質が流れている場で汚染物質の分解（自浄作用）が起きているとき、その場の微生物の群集構造（６つの群の存在割合）がわかり、ある電子受容体ａを利用する群が多いことがわかれば、自浄作用を高く保つような管理が可能になる。その電子受容体ａの供給が止まると浄化が遅れること、その電子受容体ａを添加してやれば浄化が進むことなどが推定できる。
【００５２】
例えば、本実施形態に係る方法により、排水処理装置から採取した処理水を試料Ｘとし、その微生物群集構造を測定すれば、排水処理装置の浄化槽や活性汚泥の状態（経時変化など）を正確に把握したり、種汚泥の良否、選別などを簡単に判断できる。
【００５３】
微生物挙動の長期予測のためのシミュレーションモデルにおいては、この本実施形態に係る測定方法はさらに決定的な役割を果たす。こういうモデルのいくつかでは、６群の微生物量と、各々の増殖に関するパラメータとを入力し、時空間的な環境変化に対応して６群の微生物量がどう変化していくかを予測するが、モデルは現場に適用する前に確証をする必要がある。
【００５４】
すなわち、現場や模擬実験装置に、例えばある水質の地下水を流入させて微生物挙動を調べ、一方それと同じ地下水質を境界条件として与えたシミュレーションモデルで解析を行って微生物挙動をアウトプットとして出し、両者がある程度一致することをもって確証とする。その際、本実施形態に係る方法のように、現場や模擬実験装置における６群の微生物量（存在割合）を測定する技術は必須となる。
【００５５】
また、本実施形態に係る微生物群集構造測定装置１０によれば、上述した微生物群集構造測定方法を簡単にかつ確実に実施できる。
【実施例】
【００５６】
本発明者らは、上述した効果を期待し、微生物群集構造測定装置１０を用いて実験を行った。
【００５７】
まず、１２本の容積６５ｍＬの培養容器を用意する。操作手順は、各培養容器１に主として排水処理装置から採取した試料Ｘを３０ｍＬ入れ、一部のものについては、電子受容体としての添加物を表１にしたがって入れる（あらかじめ入れておいてもよい）。
【００５８】
各容器１にブチルゴム栓２をして、試料Ｘおよび気相ｇ１にＡｒなどの不活性ガスｎを送り置換した後、密栓する。その後、表１の気相への注入にしたがって水素等を気相ｇ２に注入する。空気を入れる際は、ブチルゴム栓２を一端外して気相を完全に入れ替えてもよい。
【００５９】
より詳細には、第１群の培養容器１ＡにＯ2 を１０ｍＭ、第２群の培養容器１ＢにＫＮＯ3 を３ｍＭ、第３群の培養容器１ＣにＭｎＯ2 を７．５ｍＭ、第４群の培養容器１ＤにアモルファスＦｅ（III）を１０〜１５ｍＭ、第５群の培養容器１ＥにＫ2 ＳＯ4 を１．９ｍＭ、第６群の培養容器１ＦにＣＯ2 ：３．７５ｍＭ＋Ｎａ2 Ｓ・９Ｈ2 Ｏ：３００ｍｇ／Ｌ＋レサズリン１ｍｇ／Ｌ添加した。電子供与体ｄとしてＨ2 を３ｍＭ、またはアセテート−Ｃを９〜１０ｍＭとした。気相ｇ２にはｐＨ調整のため、すべてＣＯ2 を３．７５ｍＭ加えた。これにより、試験例１〜１２のサンプルを得た。
【００６０】
２本同じものができるので、そのうちの１本はオートクレーブ４で滅菌する。これらを回転培養器５にセットして、一定温度（例えば３０℃）で培養し、経時的に（例えば、毎日１回）気相ｇ３のガスをガスタイトシリンジ３で採取し、これを図示しないガスクロ装置に注入して水素濃度を分析し、気相ｇ３中のガス、水質の変化を測定した。
【００６１】
電子受容体ａとして酸素を用いる場合はただちに、それ以外の場合は気相ｇ３中に当初微量残存している可能性のある酸素がなくなった後、水素濃度の減少量から各電子受容体ａ存在下の微生物の水素消費速度を測定する。これから、試料Ｘ中の微生物群集の構成を推定する。
【００６２】
【表１】
【００６３】
メタン発酵処理水と活性汚泥処理水の試料Ｘについて、本実施形態に係る方法を適用し、２４ｈ後の結果を図２に示す。図２の横軸では、右に行くほど嫌気性菌が存在する割合が高く、左に行くほど酸化還元電位が高い。
【００６４】
図２に示すように、メタン発酵処理水（図２中の◆（滅菌なし））では、６種すべての電子受容体ａに対する水素消費活性がそれぞれ高く、一方滅菌系（図２中の◆（滅菌））ではほとんど活性がないことから、これら６種すべての電子受容体ａを利用する微生物群がこの試料Ｘにはそろっていることがわかる。
【００６５】
これにより、メタン発酵槽からは硫化水素が発生するおそれがあること、鉄（III）やマンガン（IV）を添加すれば有機物分解が促進される可能性があること、硝酸イオンを流入させれば脱窒で窒素化合物も除去される可能性があること、この処理水をさらに曝気すれば好気性菌を接種しなくても（もともと好気性菌が存在しているので）分解が進むことなどがわかる。
【００６６】
なお、■で示す滅菌系のデータでは、硝酸イオンにおける水素消費活性が０になっていないが、これは測定誤差だと思われる。
【００６７】
また、活性汚泥処理水（図２中の△）の試料Ｘでは、４種の電子受容体ａを利用する微生物群が存在することがわかるが、炭酸イオンを還元してメタンを発生する微生物群の活性はゼロであり、また総じて、嫌気的条件で利用されやすい硫酸イオン、マンガン（IV）塩などの利用性も悪く、好気的条件に適応した微生物群が育っていること、これをそのままメタン発酵槽の種汚泥には使えないことがわかる。
【００６８】
以上のように、本実施形態に係る方法は、様々な場での微生物挙動の予測に必要な微生物の群集構造測定方法として大変有効な方法である。
【００６９】
したがって、本実施形態に係る方法は、環境により、異なる電子受容体ａごとの活性の相対的関係が異なり、微生物群集の構成の違いを表す指標の１つとなるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１（ａ）〜図１（ｆ）は、本発明の好適な実施形態である微生物群集構造測定装置と、これを用いた本発明の好適な実施形態を示す微生物群集構造測定方法の手順とを説明する概略図である。
【図２】実施例の試料について本実施形態に係る微生物群集構造測定方法を実施した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７１】
１ 容器
１ａ〜１ｆ １〜６番目の容器
１Ａ〜１Ｆ 第１〜６群の容器
Ｘ 試料
ｄ 電子供与体
ａ 電子受容体
５ 回転培養器
１０ 微生物群集構造測定装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物群集構造を測定したい試料に、電子供与体と電子受容体を添加し、電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する方法において、少なくとも６本の密閉した容器に上記試料を入れ、各容器ごとに、酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体のうち１種をそれぞれ添加し、上記全ての容器における電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定することを特徴とする微生物群集構造測定方法。
【請求項２】
上記容器を６本用意し、各容器に上記試料を入れ、
１番目の容器の気相を上記電子受容体としての空気または酸素含有ガスで置換し、
２番目の容器に上記電子受容体としての硝酸塩を入れ、
３番目の容器に上記電子受容体としてのマンガン（IV）塩を入れ、
４番目の容器に上記電子受容体としての鉄（III）塩を入れ、
５番目の容器に上記電子受容体としての硫酸塩を入れ、
２〜５番目の容器の気相をＡｒなどの不活性ガスで置換し、
６番目の容器に上記電子受容体としての炭酸塩を入れてその気相をＡｒなどの不活性ガスで置換し、あるいは６番目の容器の気相をＡｒなどの不活性ガスで置換して上記電子受容体としての二酸化炭素を加え、
１〜６番目の容器のすべての気相に、上記電子供与体としての水素ガスを添加して培養し、経時的に気相中のガス分析をして水素の減少速度を測定し、
これを上記電子受容体を利用する微生物の存在割合の指標とする請求項１記載の微生物群集構造測定方法。
【請求項３】
上記６番目の容器に、硫化ナトリウムなどの還元剤をさらに添加する請求項２記載の微生物群集構造測定方法。
【請求項４】
上記１〜６番目の容器を２本ずつ合計１２本用意し、２本１群で第１〜６群の容器とし、水素ガスを添加した後、各群の一方の容器はそのまま培養し、他方の容器は滅菌して培養する請求項２または３記載の微生物群集構造測定方法。
【請求項５】
微生物群集構造を測定したい試料に、電子供与体と電子受容体を添加し、電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する装置において、上記試料を入れると共に酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体のうち１種をそれぞれ添加した少なくとも６本の密閉した容器と、これら容器を培養する培養手段と、培養後の各容器の気相をサンプリングするサンプリング手段とを備えたことを特徴とする微生物群集構造測定装置。
【請求項１】
微生物群集構造を測定したい試料に、電子供与体と電子受容体を添加し、電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する方法において、少なくとも６本の密閉した容器に上記試料を入れ、各容器ごとに、酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体のうち１種をそれぞれ添加し、上記全ての容器における電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定することを特徴とする微生物群集構造測定方法。
【請求項２】
上記容器を６本用意し、各容器に上記試料を入れ、
１番目の容器の気相を上記電子受容体としての空気または酸素含有ガスで置換し、
２番目の容器に上記電子受容体としての硝酸塩を入れ、
３番目の容器に上記電子受容体としてのマンガン（IV）塩を入れ、
４番目の容器に上記電子受容体としての鉄（III）塩を入れ、
５番目の容器に上記電子受容体としての硫酸塩を入れ、
２〜５番目の容器の気相をＡｒなどの不活性ガスで置換し、
６番目の容器に上記電子受容体としての炭酸塩を入れてその気相をＡｒなどの不活性ガスで置換し、あるいは６番目の容器の気相をＡｒなどの不活性ガスで置換して上記電子受容体としての二酸化炭素を加え、
１〜６番目の容器のすべての気相に、上記電子供与体としての水素ガスを添加して培養し、経時的に気相中のガス分析をして水素の減少速度を測定し、
これを上記電子受容体を利用する微生物の存在割合の指標とする請求項１記載の微生物群集構造測定方法。
【請求項３】
上記６番目の容器に、硫化ナトリウムなどの還元剤をさらに添加する請求項２記載の微生物群集構造測定方法。
【請求項４】
上記１〜６番目の容器を２本ずつ合計１２本用意し、２本１群で第１〜６群の容器とし、水素ガスを添加した後、各群の一方の容器はそのまま培養し、他方の容器は滅菌して培養する請求項２または３記載の微生物群集構造測定方法。
【請求項５】
微生物群集構造を測定したい試料に、電子供与体と電子受容体を添加し、電子供与体の消費から上記試料の微生物群集構造を測定する装置において、上記試料を入れると共に酸素、硝酸イオン、マンガン（IV）塩、鉄（III）塩、硫酸イオン、炭酸イオンからなる６種類の電子受容体のうち１種をそれぞれ添加した少なくとも６本の密閉した容器と、これら容器を培養する培養手段と、培養後の各容器の気相をサンプリングするサンプリング手段とを備えたことを特徴とする微生物群集構造測定装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１０４４１９（Ｐ２００８−１０４４１９Ａ）
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２９１４８０（Ｐ２００６−２９１４８０）
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（０００００００９９）株式会社ＩＨＩ (5,014)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（０００００００９９）株式会社ＩＨＩ (5,014)
【Ｆターム（参考）】
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