心筋の小胞体ストレス抑制剤
【課題】 小胞体ストレスを抑制して心筋の細胞死及び心機能の低下を効果的に抑制することにより、小胞体ストレスに誘導される心不全を予防及び／又は治療することができる心筋の小胞体ストレス抑制剤を提供する。
【解決手段】 有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤。
【解決手段】 有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体（以下、ＥＲともいう）ストレスによって引き起こされる心不全の予防及び／又は治療に有効な、心筋の小胞体ストレス抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗ガン剤の副作用やその他の原因による心不全による突然死が増加し、生活の質（ＱＯL）の低下が問題となっている。特に、抗ガン剤の副作用によって心不全が引き起こされるような場合には、抗ガン剤の効果と副作用とのバランスを考えて、副作用を抑えるために標準的投与量よりも低量を投与することもあり、抗ガン作用を十分に発揮させることができなくなる。従って、心不全を予防及び／又は治療することができる薬剤が望まれているが、心不全を効果的に抑制することができる薬剤は未だ開発されていない。
【０００３】
例えば、抗ガン剤のアドリアマイシン（一般名：塩酸ドキソルビシン；以下、単にＤｏｘともいう）は、心不全を誘導する副作用を示すことが知られている。アドリアマイシンの心不全誘導メカニズムは明らかではないが、要因の１つとして酸化ストレスが示唆されており、アドリアマイシンと共に抗酸化剤であるプロブコール（ｐｒｏｂｕｃｏｌ）を用いると、酸化ストレスを減少させることによって心不全が抑制されたことが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００４】
フェニル酪酸やフェニル酪酸ナトリウム等のＨＤＡＣ阻害剤については、放射線や抗ガン剤等の化学療法に誘導される損傷を減少させる作用を示したことも開示されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００５】
ガン治療薬であるメシル酸イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｇｌｅｅｖｅｃ（グリベック））も心毒性を示すことが知られている。培養心筋細胞をメシル酸イマチニブで処理すると、小胞体ストレス応答の活性化、ミトコンドリア膜のポテンシャルの崩壊等が起こり、細胞死が引き起こされることが報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。小胞体ストレスとは、小胞体にアンフォールド（ｕｎｆｏｌｄ）した異常タンパク質が蓄積する現象である。小胞体ストレスが継続すると、細胞死（アポトーシス）に至ることが知られており、心筋細胞や神経細胞の細胞死は、心不全や神経変性疾患、脳卒中等の原因となる。例えば、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）によって小胞体ストレスを誘導した実験によって、小胞体ストレスによって培養心筋細胞で細胞死が誘導されることが報告されており、このことから、継続する小胞体ストレスが、心臓肥大から心不全への進行過程に寄与していることが示唆されている（例えば、非特許文献３）。
【０００６】
４−フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢＡ）は、前述したＨＤＡＣ阻害剤としての作用と共に、小胞体シャペロンとして機能することにより小胞体ストレスを軽減する作用を有することが知られている。例えば、ＰＢＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでシャペロンとして作用すること及びヒトの神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において、小胞体ストレスを軽減させたことが開示されている（例えば、非特許文献４を参照）。小胞体ストレス抑制作用については、４−フェニル酢酸をＩＩ型糖尿病のモデルマウスに経口投与すると、肝細胞や脂肪細胞等の小胞体ストレスが軽減し、これによって高血糖の正常化、全身のインスリン感受性の回復、脂肪肝疾患の回復及び肝臓におけるインスリン作用の増加が起こり、グルコースホメオスタシスが回復したことが報告されている（例えば、非特許文献５及び非特許文献６を参照）。
【０００７】
ＰＢＡは上述したような作用を有することから、小胞体ストレスによって引き起こされる疾患の予防薬や治療薬に適用することができる可能性が示唆される。例えば、ＰＢＡの小胞体ストレス抑制作用は、小胞体ストレスによる心不全の予防や治療に有効であると考えられる。しかしながら、ＰＢＡを有効成分とする小胞体ストレス抑制剤は未だ開発されておらず、心筋細胞の小胞体ストレス抑制に有効なＰＢＡの用量の検討が必要とされる。小胞体ストレスを抑制するＰＢＡの用量については、上述した非特許文献６で、マウスのＦａｏ肝細胞や脂肪組織において小胞体ストレスを抑制するＰＢＡの用量が検討されている。しかしながら、心不全の治療や予防に有効な用量については一切検討されていない。
【特許文献１】特開２００５−２８１１５０号公報
【非特許文献１】Molecular and Cellular Biochemistry, 2000, 207, 77-85
【非特許文献２】Nature Medicine vol. 12 (8), 2006, 908-916
【非特許文献３】Circulation, 2004 110:705-712
【非特許文献４】Journal of Neurochemistry, 2006, 97, 1259-1268
【非特許文献５】Science vol. 313, 25 August, 2006, 1137-1140
【非特許文献６】Science vol. 313, 25 August, 2006, 1137 (Supporting Online Material : www.sciencemag.org/cgi/content/full/313/5790/1137/DC1)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、小胞体ストレスを抑制して心筋の細胞死及び心機能の低下を効果的に抑制することにより、小胞体ストレスに誘導される心不全を予防及び／又は治療することができる心筋の小胞体ストレス抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、心不全を効果的に抑制することができる薬剤を開発するため、４−フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢＡ）が、小胞体ストレス抑制作用を有することに注目して鋭意研究した。その結果、ＰＢＡは、その投与量や投与濃度によって心筋細胞において異なる作用を示すことを見出した。驚くべきことに、ＰＢＡという同じ物質であっても、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏの系において（１）１日の体重あたりの投与量（腹腔内投与）が、４−フェニル酪酸ナトリウムとして約５０〜１５０ｍｇ／ｋｇであると、ＩＣＲマウスの心筋細胞において小胞体ストレス抑制作用が発揮されて心機能低下が抑制されること、（２）余りに高用量、例えば、１日の体重あたりの投与量（腹腔内投与）が、４−フェニル酪酸ナトリウムとして約５００ｍｇ／ｋｇであると、ＩＣＲマウス心筋細胞において小胞体ストレス抑制作用は発現しないことを見出した。更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系において（３）４−フェニル酪酸ナトリウムを約０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌの低濃度でラット心筋細胞に投与すると、心筋細胞においてヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害作用は発現せず、小胞体ストレス抑制作用のみが発揮されること、（４）４−フェニル酪酸ナトリウムを余りに高濃度、例えば、５ｍｍｏｌ／Ｌでラット心筋細胞に投与すると、心筋細胞において逆にＨＤＡＣ阻害作用が発現し、小胞体ストレス抑制作用は発現しないことを見出した。ＰＢＡがＨＤＡＣ阻害剤としての作用及び小胞体ストレス抑制作用の２つの作用を有することは知られていたが、投与濃度又は投与量により心筋細胞において異なる作用が発現することは知られておらず、全く新しい知見である。また、１日の体重あたりの投与量をＰＢＡとして５０〜１５０ｍｇ／ｋｇの量にてＩＣＲマウスに非経口（腹腔内）投与するか、又は、低濃度のＰＢＡをラットの心筋細胞に投与することにより、抗がん剤等による心筋細胞の小胞体ストレスを抑制することができ、これによって心機能の低下及び心筋の細胞死を効果的に抑制して心不全を効果的に予防及び／又は治療することができることを見出した。更に、これらの動物実験によって得られた結果から、哺乳類、特にヒトの心筋において小胞体ストレスを抑制するのに効果的なＰＢＡの投与量を外挿することができるため、特定量のＰＢＡを経口又は非経口投与することによってヒトの心不全を効果的に予防及び／又は治療することができることに想到し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、
（１）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤、
（２）注射剤として用いられる上記（１）に記載の小胞体ストレス抑制剤、
（３）静脈内投与により投与される上記（１）又は（２）に記載の小胞体ストレス抑制剤、及び、
（４）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤、
に関する。
【００１１】
本発明はまた、
（５）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤の製造のための使用、
（６）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤の製造のための使用、
（７）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤としての使用、及び、
（８）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤としての使用、
に関する。
【００１２】
本発明はまた、
（９）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬を、ヒトに１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与して、心筋の小胞体ストレスを抑制する方法、及び、
（１０）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬を、ヒトに１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与して、心筋の小胞体ストレスを抑制する方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の小胞体ストレス抑制剤は、抗ガン剤の副作用等によって誘導される心筋の小胞体ストレスを効果的に抑制することができるため、小胞体ストレスが原因となる心筋の細胞死及び心機能の低下を抑制することができ、心不全の予防及び／又は治療に有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書中において、「小胞体ストレス」とは、膜タンパク質又は分泌タンパク質の翻訳の場である小胞体における機能異常により、異常構造を持ったタンパク質等が蓄積することにより起こるストレスをいう。心筋細胞において小胞体ストレスが継続すると、心筋細胞は細胞死（アポトーシス）に至り、心不全を引き起こす原因となる。「小胞体ストレス抑制作用」とは、上述した小胞体ストレスを低減又は解消する作用をいう。本発明の小胞体ストレス抑制剤は、（１）１日に体重あたり４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される４−フェニル酪酸ナトリウム若しくは（２）１日に体重あたり約１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される４−フェニル酪酸ナトリウムが心筋細胞において小胞体ストレスを効果的に抑制し（ｉｎ ｖｉｖｏ）、又は、（３）有効成分として全体に対して約０．５〜２ｍｍｏｌ含有される４−フェニル酪酸ナトリウムが心筋細胞において小胞体ストレスを効果的に抑制し（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、その結果小胞体ストレスにより引き起こされる心筋の細胞死を抑制すると共に、心筋の機能低下を抑制することができるものである。従って、本発明の小胞体ストレス抑制剤を用いると、抗ガン剤の副作用等による小胞体ストレスによって引き起こされる心不全を効果的に予防及び／又は治療することができる。
なお、上記（１）及び（２）のＰＢＡの投与量は、ＩＣＲマウスを用いたＩｎ ｖｉｖｏ実験において、効果的にＩＣＲマウスの心筋の小胞体ストレスを抑制することができたＰＢＡの投与量（腹腔内投与）５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙから、「“動物種差と外挿” 監修 松岡 理／小林定喜、ソフトサイエンス社、１９８３年」及び「Edward J. Calabrese著 “Principles of Animal Extrapolation”」に従ってヒトへのＰＢＡの非経口又は経口投与量を外挿した値である。
上記（３）のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて心筋の小胞体ストレス抑制に効果的なＰＢＡ濃度（０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌ）は、ラット心筋細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、効果的に小胞体ストレスを抑制することができたＰＢＡ濃度である。
【００１５】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤に用いられる４−フェニル酪酸ナトリウムは、尿酸サイクル異常症の治療薬として臨床応用されている化合物である。本発明で用いられる４−フェニル酪酸ナトリウムとしては、医薬上使用できる程度に精製されたものであればよく、市販品を用いることができる。市販品としては、例えば、Ｂｉｏｍｏｌ社のもの等が挙げられる。
【００１６】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤は、有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有するものであり、（１）１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される、又は、（２）１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与されるものである。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系では、（３）４−フェニル酪酸ナトリウムを全体に対して０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌ含有する小胞体ストレス抑制剤を心筋細胞に用いると、効果的に心筋の小胞体ストレスを抑制することができる。
【００１７】
上記（１）及び（２）の心筋の小胞体ストレス抑制剤において、該４−フェニル酪酸ナトリウムの１日の体重あたりの投与量が余りに少ないと、心筋細胞において小胞体ストレスを抑制する効果が十分発現しない場合がある。逆に４−フェニル酪酸ナトリウムの１日の体重あたりの投与量が余りに多いと、心筋細胞において４−フェニル酪酸ナトリウムのＨＤＡＣ阻害作用は発現するが、小胞体ストレス抑制作用が発現しない。本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤は、（１）の非経口投与される場合は、１日の体重あたりの投与量が４−フェニル酪酸ナトリウムとして約５〜１０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、約７〜９ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。上記（２）の経口投与される場合は、１日の体重あたりの投与量が４−フェニル酪酸ナトリウムとして約２０〜４０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、約２５〜３５ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。
【００１８】
上記（３）の心筋の小胞体ストレス抑制剤において、４−フェニル酪酸ナトリウム濃度が余りに低いと、心筋細胞において小胞体ストレスを抑制する効果が十分発現しない場合がある。逆に４−フェニル酪酸ナトリウム濃度が余りに高いと、４−フェニル酪酸ナトリウムのＨＤＡＣ阻害作用は発現するが、小胞体ストレス抑制作用が発現しない。心筋の小胞体ストレス抑制剤における４−フェニル酪酸ナトリウム濃度は、好ましくは全体に対して約０．５〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、約０．５〜１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
投与は、上記投与量を１日１回〜数回に分けて投与するのが好ましく、より好ましくは１日１回〜約４回、さらに好ましくは１日１回〜約２回に分けて投与する。
本発明の心筋のストレス抑制剤を非経口投与する場合の投与方法としては、例えば、静脈内投与、皮下投与等が挙げられるが、静脈内投与が好ましい。
【００２０】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤は、種々の製剤形態、例えば、固形製剤、液状製剤等をとりうる。例えば、経口投与のための内服用固形剤もしくは内服用液剤、又は非経口投与のための注射剤等とすることができる。非経口投与する場合の好ましい剤型は、液状製剤であり、より好ましくは、注射剤である。例えば、４−フェニル酪酸ナトリウムのみ又は４−フェニル酪酸ナトリウムと慣用の担体と共に注射剤とされることが好ましい。
【００２１】
経口投与のための内服用固形剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が挙げられる。
内服用固形剤においては、４−フェニル酪酸ナトリウムはそのままか、添加剤と混合又は造粒（例えば、攪拌造粒法、流動層造粒法、乾式造粒法、転動攪拌流動層造粒法等）され、常法に従って製造される。例えば、カプセル剤であれば、カプセル充填等によって、錠剤であれば、打錠剤等によって製造することができる。添加剤は、１種又は２種以上を適宜配合してもよい。添加剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の結合剤；トウモロコシデンプン等の分散剤；繊維素グリコール酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤；安定剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子類等の水溶性高分子；白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、還元麦芽糖水アメ、粉末還元麦芽糖水アメ、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、アスパルテーム、サッカリン、サッカリンナトリウム等の甘味剤等が挙げられる。
【００２２】
顆粒剤又は錠剤は、必要によりコーティング剤等で被覆されていてもよいし、また該コーティングは２以上の層であってもよい。コーティング剤としては、例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等が挙げられる。カプセル剤として製造する場合には、上記賦形剤を適宜選択し、プランルカスト水和物と均等に混和又は粒状、もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものをカプセルに充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチン等）にグリセリン又はソルビトール等を加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形してもよい。これらカプセル基剤には必要に応じて、着色剤又は保存剤（二酸化イオウ；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のパラベン類）等を加えることができる。カプセル剤には、ハードカプセル又はソフトカプセルが含まれる。
また、錠剤又はカプセル剤は、一回当たり、１〜数個投与されるのが好ましく、１〜約２個投与されるのがより好ましい。このため、錠剤又はカプセル剤には、４−フェニル酪酸ナトリウムが、１錠又は１カプセル当たり、約２〜５０ｍｇ、好ましくは約５〜３０ｍｇ、より好ましくは、約７〜２５ｍｇ含まれるよう製造されるのが好ましい。
【００２３】
経口投与のための内服用液剤としては、水剤、懸濁剤・乳剤、シロップ剤、ドライシロップ剤等の用時溶解型製剤、エリキシル剤等が挙げられる。このような内服用液剤においては、４−フェニル酪酸ナトリウムは、内服用液剤で一般的に用いられる希釈剤に溶解、懸濁又は乳化される。希釈剤としては、例えば、精製水、エタノール又はそれらの混液等が挙げられる。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤又は緩衝剤等を含有していてもよい。また、ドライシロップ剤は、例えばプランルカスト水和物と、例えば、白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖又は乳糖等とを混合等して製造することができる。また、ドライシロップ剤は、常法に従って顆粒としてもよい。
【００２４】
非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、４−フェニル酪酸ナトリウムを溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。上記（１）の小胞体ストレス抑制剤を注射剤とする場合の４−フェニル酪酸ナトリウムの濃度としては、例えば、約１０〜５０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましく、約１０〜３０ｍｇ／ｍＬとすることがより好ましい。このような濃度の注射液を１日に体重あたり、約０．２〜１ｍＬ投与するのが好ましい。
【００２５】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤は、ヒトの他、ヒト以外の哺乳動物にも投与することができる。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、牛等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２６】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤剤は、適宜他の医薬と併せて用いることができる。他の医薬としては、本発明の効果を奏することになる限り特に限定されない。例えば、本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤を、抗ガン剤等の心不全を引き起こす副作用を有する他の薬剤と併用することによって、抗ガン剤等による心不全を効果的に予防及び／又は治療することができる。本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤と、心不全を引き起こす副作用を有する抗癌剤等とを併用することは、本発明の好ましい実施形態の１つである。
【００２７】
有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤の製造のための使用；有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤の製造のための使用；有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤としての使用；及び、有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤としての使用も、本発明の１つである。有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する組成物やその好ましい形態としては、上述した心筋の小胞体ストレス抑制剤と同様である。
【００２８】
有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬を、ヒトに１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与して、心筋の小胞体ストレスを抑制する方法；及び、有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬を、ヒトに１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与して、心筋の小胞体ストレスを抑制する方法も、本発明の１つである。４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬やその好ましい態様としては、上述した心筋の小胞体ストレス抑制剤と同様である。
【実施例】
【００２９】
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
（Ｉ）材料
塩酸ドキソルビシン（Ｄｏｘ）及び４−フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢＡ）は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（St. Luis, MO）及びＢｉｏｍｏｌ社（BIOMOL International L.P.）（Plymouth Meetin PA）から購入した。ＣＨＯＰ、ＸＢＰ１、ＡＴＦ６、リン酸ＰＥＲＫ及びアクチンに対する抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）（Santa Cruz, CA）から入手した。リン酸ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ及びリン酸ｅＩＦ２αに対する抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Cell Signaling Technology, Inc.）（ Danvers, MA）から入手した。カスパーゼ１２に対する抗体は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（St. Luis, MO）から入手し、ＫＤＥＬは、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎｅ社（Assay Designs, Inc.）（Ann Arbor, MI）から入手した。ＧＡＰＤＨ抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ社（CHEMICON International, Inc.）（Temecula, CA）から購入した。
【００３１】
（ＩＩ）実験方法
（１）新生仔ラットの心筋細胞の調製
心筋細胞の初代培養は、新生仔ラットの心臓を用いて実験を行った。取り出した心臓をピンセットで細かく切断し、４℃にてトリプシン（trypsin）に一晩浸した。次の日に、トリプシンと同量の培養培地を添加し、３７℃にて５分インキュベートした後、トリプシンと培地を除いた。次に、１０ｍＬのコラーゲナーゼ（collagenase）（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、残留したトリプシンを洗浄し、心臓組織をコラーゲナーゼによって、１５分３回スタラーで回しながら、心筋細胞を分離させた。分離された心筋細胞を５０００ｒｐｍ、５分遠心した後、細胞ペレットを培養培地に再度懸濁し、Ｐ１０のシャーレに蒔いた。インキュベーター内で７０分細胞を静止し、混在する繊維芽細胞（fibroblast）を付着させた。ピペットで培養シャーレを軽く洗い、上澄に浮遊している心筋細胞を回収し、実験に用いた。全ての手順は、動物ケアに関する大阪大学医学部の指針及び“Position of the American Heart Association on Research Animal Use”に従って行った。
【００３２】
（２）ＰＥＲＫ及びｅＩｆ２αのリン酸化の検出
心筋細胞に各濃度のＤｏｘ添加６時間後、全タンパク質を回収し、ＰＥＲＫ及びｅＩｆ２αのリン酸化抗体を用いたウェスタンブロット法にて目的タンパク質のリン酸化を検討した。
【００３３】
（３）ＡＴＦ６の切断及びＸＢＰ１のスプライシング
心筋細胞に各濃度のＤｏｘを添加し、６時間に後細胞質及び核タンパク質を回収し、特異抗体を用いたウェスタンブロット法にて細胞質及び核内に存在するＡＴＦ６とＸＢＰ１を検討した
【００３４】
（４）ＲＮＡレベルでのＸＢＰ１スプライシング
ラットの心筋細胞をＤｏｘで６時間処理した後、ＸＢＰ１スプライシングをリバーストランスクリプショナル（reverse-transcriptional）ＰＣＲ法を用いて評価した。スプライスサイトにかかるプライマーは、以下のようにデザインした。
フォワードプライマー：ACGAGAGAAAACTCATGG （配列番号１）
リバースプライマー：ACAGGGTCCAACTTGTCC (配列番号２)
ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上で分離させ、ＵＶ照射によって観察した。
【００３５】
（５）ＣＨＯＰの誘導
心筋細胞に各濃度のＤｏｘ添加６時間後、又はＤｏｘ（１．０μｍｏｌ／Ｌ）添加１、３、６、１２、２４時間後、全タンパク質を回収し、ＣＨＯＰ抗体を用いたウェスタンブロット法にてＣＨＯＰの発現を検討した。
【００３６】
（６）カスパーゼ１２の活性化
心筋細胞に各濃度のＤｏｘ添加６時間後、又はＤｏｘ（１．０μｍｏｌ／Ｌ）添加１、３、６、１２、２４時間後、全タンパク質を回収し、カスパーゼ１２（Caspase-12）抗体を用いたウェスタンブロット法にてカスパーゼ１２の切断を検討した。
【００３７】
（７）ＪＮＫのリン酸化
ＰＢＡ又はＢＳに一晩プレインキュベートした心筋細胞に各濃度のＤｏｘ添加６時間後、又はＤｏｘ（１．０μｍｏｌ／Ｌ）添加１、３、６、１２、２４時間後、全タンパク質を回収し、ＪＮＫのリン酸化抗体を用いたウェスタンブロット法にてＪＮＫのリン酸化を検討した。
【００３８】
（８）細胞死の測定
ＰＢＡ又は酪酸ナトリウム（以下、ＢＳともいう）に一晩プレインキュベートした心筋細胞にＤｏｘ（１．０μｍｏｌ／Ｌ）、Ｄｏｘ及びＰＢＡ（０．５又は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）、又は、ＢＳ（０．５又は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加２４時間後、生存した細胞をＭＴＴアッセイにて検討した。
【００３９】
（９）免疫ブロッティング
心筋細胞を、プロテアーゼ阻害剤混合物（ナカライテスク）を含むバッファー（０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ）に溶解した。電気泳動、免疫ブロッティング及び検出は、Tsukamoto O. et al., Biochem Biophys Res Commun 2006 24: 1125-1133に記載された方法に従って行った。具体的には細胞可溶化物のタンパク質濃度を測定し、同じタンパク質量を含有するようにサンプルを調製した。電気泳動にはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い、Bio-Rad mini protean 3 cellにて、ブロッティングにはBio-Rad semidry transfer cellを用いて行った。
【００４０】
（１０）Ｄｏｘ投与マウスモデルの作製
雄ＩＣＲマウス（１０週齢、体重３５〜４０ｇ）をランダムに４群に分けた。コントロール群（ｎ＝６）には、試験期間中毎日１０ｍＬ／ｋｇの生理食塩水を与えた。Ｄｏｘ投与の１日前（−１日）、Ｄｏｘ（ｎ＝１０）群には生理食塩水を、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（ｎ＝１２）群にはＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）を、Ｄｏｘ＋ＢＳ（ｎ＝７）群にはＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ腹腔内（ＩＰ）に投与した。次いで、これらの３グループにＤｏｘを１ドーズ投与した（１５ｍｇ／ｋｇ）（０日目）。次の６日間（１日目から６日目）、Ｄｏｘ群には生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇ、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ群にはＰＢＡを１００ｍｇ／ｋｇ、Ｄｏｘ＋ＢＳ群にはＢＳを１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回腹腔内投与した。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。
【００４１】
（１１）血行動態指標の計測（Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）
ミラーカテーテルを右頸動脈から挿入し、左心室（ＬＶ）に慎重に導入した。その後、心拍、収縮期圧（ＬＶＳＰ）、拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）、圧波のアップストローク又はダウンストロークの間の最大勾配（ｍａｘ ｄＰ／ｄｔ：左心室内圧最大上昇速度及びｍｉｎ ｄＰ／ｄｔ：左心室内圧最大下降速度）、ｍａｘ ｄＰ／ｄｔをｍａｘ ｄＰ／ｄｔ時の圧力で割った値（収縮性指数）及び指数関数弛緩時間定数（Ｔａｕ）を、アプリケーションプログラムＢｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｍｏｄｅｌを用いて分析した。
【００４２】
（１２）統計学的分析
データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表わされる。統計的有意差の有無は、ｏｎｅ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡに続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを行い、求めた。全ての分析に関して、ｐ＜０．０５は、統計学的に有意差であると認められた。
【００４３】
（ＩＩＩ）結果
（１）Ｄｏｘの作用
（ｉ）ＰＥＲＫ（二本鎖ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ様のＥＲキナーゼ）は、小胞体ストレスを感知し、ｅＩｆ２α（真核生物の開始因子２α）のリン酸化を通して全体的なタンパク質合成の抑制を引き起こすと思われるので、Ｄｏｘ投与後のＰＥＲＫ及びｅＩｆ２αのリン酸化を検出した。培養新生仔の心筋細胞において、ＰＥＲＫ及びｅＩｆ２αのリン酸化はＤｏｘの投与によって用量依存的に誘導された。図１−１ＡにＤｏｘによって誘導されたＰＥＲＫのリン酸化を、図１−１ＢにＤｏｘによって誘導されたｅＩｆ２αのリン酸化を、それぞれ示す。アクチンは、各サンプル間タンパク質量の差がないことを示す内因性コントロールとして用いた。しかしながら、ＥＲにおけるタンパク質の適切なフォールディングと会合を助けることによって小胞体ストレスを軽減し、小胞体機能を保つために必要な小胞体シャペロン（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４）の誘導は、Ｄｏｘ投与後に観察されなかった（図１−１Ｃ）。従って、Ｄｏｘは培養新生仔の心筋細胞で小胞体ストレスを誘導したが、小胞体シャペロンの発現を誘導しなかった。
【００４４】
小胞体ストレスにおいて、ＧＲＰ７８の発現は、転写因子である切断されたＡＴＦ６とスプライスされたＸＢＰ１によって主に調節される（Jill A. et al.,Anat Embryol (Berl). 2000 Jul 202(1): 67-74、Yoshida H. et al., Cell 107 2001: 881-891）。従って、ＡＴＦ６の切断とＸＢＰ１のスプライシングへのＤｏｘの効果を調べた。図１−２Ｅ(下図)及びＦに示すように、Ｄｏｘを投与するとスプライスされていないＸＢＰ１の発現が阻害され、その結果ＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方でスプライスされたＸＢＰ１が存在しなかった。更に、薬理学的なＥＲストレッサーであるツニカマイシンによって誘導されたＧＲＰ７８の発現の増加は、Ｄｏｘによって阻害された（図１−２Ｇ）。このことから、ＡＴＦ６の切断はある程度増加するものの（図１−１Ｄ）、ＤｏｘはＸＢＰ１スプライシングを減少させることを通してＧＲＰ７８の発現を抑制することが示唆された。
【００４５】
（ｉｉ）Ｄｏｘは、小胞体に惹起されるアポトーシス経路を活性化した。
カスパーゼ１２は、細胞にアポトーシスを起こさせるシグナル伝達経路を構成する、一群のシステインプロテアーゼの１つである。小胞体ストレスが起こると、カスパーゼ１２が切断されて活性化が起こることが知られている。培養新生仔心筋細胞において、Ｄｏｘの投与はカスパーゼ１２の活性化（図２Ａ）及びＪＮＫのリン酸化（図２Ｂ）を、いずれも用量−及び時間−依存的に誘導した。しかしながら、Ｄｏｘ投与後、アポトーシスに関わることが知られているＣＨＯＰの誘導は、観察されなかった（図２Ｃ）。
【００４６】
（２）ＰＢＡの効果
（ｉ）ケミカルシャペロンであるＰＢＡで前処理すると、カスパーゼ１２の活性がＰＢＡ０．５又は１．０ｍｍｏｌ／Ｌの添加下で減少したが、０．１又は５．０ｍｍｏｌ／Ｌの添加ではカスパーゼ１２活性の抑制は見られなかった（図３−１Ａ）。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の１つとして、ＰＢＡはヒストンのアセチル化を誘導して遺伝子発現をリモデリングすることができる。従って、ＰＢＡが関与するヒストンのアセチル化がカスパーゼ１２活性の阻害に関与するかどうかについて調べた。図３−１Ｂに示すように、ＰＢＡは０．５ｍｍｏｌ／Ｌでカスパーゼ１２の切断をブロックしたが、５．０ｍｍｏｌ／Ｌではブロックしなかった。一方、ヒストン３のアセチル化は、ＰＢＡが５．０ｍｍｏｌ／Ｌのときのみ検出された。更に、フェニル基を有しない酪酸ナトリウム（ＢＳ）は、ＰＢＡと同様にヒストンをアセチル化する機能を有するが、ヒストン３のアセチル化を誘導したがカスパーゼ１２の活性を阻害しなかった。更に、Ｄｏｘによって誘導される心筋細胞死は、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＡによって抑制されたが、５．０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＡによっては抑制されなかった。Ｄｏｘからの心筋の保護作用は、ＢＳとＤｏｘとを用いて処理した場合には観察されなかった（図３−２Ｃ）。従って、ＰＢＡは、低濃度（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）で投与した場合に、心筋においてＤｏｘに誘導されるカスパーゼ１２活性を阻害し、細胞死を妨げることが分かった。また、マウスの心臓においても、ＰＢＡがＤｏｘによって誘導されるカスパーゼ１２の活性化を阻害するかどうかを調べるために、コントロール群（生理食塩水を投与）、Ｄｏｘ群（Ｄｏｘのみ投与）、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ群（Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＰＢＡを投与）及びＤｏｘ＋ＢＳ群（Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＢＳを投与）の心臓の組織のホモジネートを用いて、ウェスタンブロット分析によってカスパーゼ１２の切断をチェックした。図４に示すように、Ｄｏｘに誘導されたカスパーゼ１２活性は、１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＡの投与によって、コントロール又はＤｏｘ＋ＢＳ群に比べて抑制された。従って、１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＡは、Ｄｏｘに誘導される心臓損傷に対して保護作用を有することが示された。一方、ＰＢＡ１００ｍｇ／ｋｇまたはＢＳ１００ｍｇ／ｋｇいずれもヒストンアセチル化を誘導していなかったことは下段の図で明らかとなった。
【００４７】
（ｉｉ）コントロール群（生理食塩水を投与）、Ｄｏｘ群（Ｄｏｘのみ投与）、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ群（Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＰＢＡを投与）及びＤｏｘ＋ＢＳ群（Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＢＳを投与）の心機能を調べた。６日目、エコー検査の結果、各群左心室拡張末期径（ＬＶＥＤｄ）の差はなかったが（図５Ｂ）、左室駆出率（ＬＶＥＦ）が、Ｄｏｘ群と比較し、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ群では有意に改善された（図５Ｃ）。心臓カテーテル検査の結果、ｍａｘ ｄＰ／ｄｔ（左心室内圧最大上昇速度）及び収縮性指数（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）は、Ｄｏｘ群と比較してＤｏｘ＋ＰＢＡ群で高かった（図６−１Ｃ及び図６−２Ｅ）。１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＡ投与マウスにおいては、Ｄｏｘ群と比べてＬＶＳＰ（左室収縮末期圧）はわずかに低く、ｍｉｎ ｄＰ／ｄｔ（左心室内圧最大下降速度）、ＬＶＥＤＰ（左室拡張末期圧）及びＴａｕは非常に低い（図６−１Ａ、Ｄ、Ｂ及び図６−２Ｆ）。上記のパラメータにおいては、Ｄｏｘ群とＤｏｘ＋ＢＳ群との間に有意差はなかった。これらの結果は、ＢＳでなく１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＡが、Ｄｏｘ投与による心臓機能障害を改善したことを示している。
【００４８】
図１−１、図１−２及び図２に示されるように、Ｄｏｘ投与によって、心筋細胞において用量及び時間依存的に小胞体ストレスが誘導される。驚くべきことに、Ｄｏｘと共に低濃度（０．５ｍｍｏｌ／ｍＬ又は１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）ＰＢＡを投与すると、ＰＢＡのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害作用は発現しないが、小胞体ストレスが抑制されて心筋の細胞死を効果的に抑制することができた（図３−１及び図３−２）。更に、Ｄｏｘに誘導される心機能の低下を効果的に抑制することができた（図５、図６−１及び図６−２）。しかしながら、高濃度（５．０ｍｍｏｌ／ｍＬ）のＰＢＡを投与すると、ＰＢＡのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害作用は発現するが、小胞体ストレス抑制作用や心機能保護作用は発現しなかった（図３−１及び図３−２）。また、１日に体重当たりＰＢＡを１００ｍｇ／ｋｇ投与すると、小胞体ストレスが抑制されたが、高用量（５００ｍｇ／ｋｇ）ＰＢＡを投与すると、小胞体ストレス抑制作用や心機能保護作用は認められなかった（図４及び図７）。ＨＤＡＣ阻害剤であるＢＳを投与しても、小胞体ストレス抑制作用や心機能保護作用は観察されなかった（図５、図６−１及び図６−２）。
【００４９】
（ＩＶ）考察
これらの結果から、心筋細胞におけるＰＢＡの小胞体ストレス抑制作用及び心機能改善作用は、ＨＤＡＣ阻害作用が発現しない低濃度、低用量でのみ特異的に発現されることが初めて示された。低濃度又は低用量のＰＢＡをＤｏｘ等の小胞体ストレスを起こす薬剤と共に投与することによって、薬剤の副作用を軽減することができるため、心不全を効果的に防ぐことができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の小胞体ストレス抑制剤は、抗ガン剤の副作用等によって誘導される心筋の小胞体ストレスを効果的に抑制することができるため、小胞体ストレスが原因となる心筋の細胞死及び心機能の低下を抑制することができ、心不全の予防及び／又は治療に有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１−１】Ｄｏｘの心筋細胞への作用を調べた免疫ブロッティングの結果を示す図である。図１−１中、ＭＧは、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）を示し、Ｔｕは、ツニカマイシンを示す。Ａは、Ｄｏｘによって用量依存的にＰＥＲＫのリン酸化が誘導されたことを示す免疫ブロッティングの結果である。Ｂは、Ｄｏｘによって用量依存的にｅＩＦ２αのリン酸化が誘導されたことを示す免疫ブロッティングの結果である。Ｃは、Ｄｏｘを添加しても、分子シャペロンであるＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４の発現が誘導されなかったことを示す免疫ブロッティングの結果である。Ｄは、ＡＴＦ６の切断に対するＤｏｘの影響を示す免疫ブロッティングの結果である。
【図１−２】Ｄｏｘの心筋細胞への作用を調べた免疫ブロッティングの結果を示す図である。図１−２中、ＭＧは、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）を示し、Ｔｕは、ツニカマイシンを示す。Ｅは、スプライスされていないＸＢＰ１ ＲＮＡ及びスプライスされたＸＢＰ１ ＲＮＡを示す模式図（上）、及び、Ｄｏｘの投与によってスプライスされていないＸＢＰ１ ＲＮＡの発現が阻害されたこと（下）を示す免疫ブロッティングの結果である。Ｆはツニカマイシンによって誘導されるスプライスされたＸＢＰ１が核内移行する結果である。Ｇは、ツニカマイシンによって誘導されるＧＰＲ７８の発現量の増加が、Ｄｏｘによって阻害されたことを示す免疫ブロッティングの結果である。
【図２】Ｄｏｘの心筋細胞への作用を調べた免疫ブロッティングの結果を示す図である。図２中、ＭＧは、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）を示し、Ｔｕはツニカマイシンを示す。Ａ及びＢは、Ｄｏｘ投与によるカスパーゼ１２の活性化（Ａ）及びＪＮＫリン酸化（Ｂ）の、用量依存性（Ａ及びＢの上図）及び時間依存性（Ａ及びＢの下図）について調べた免疫ブロッティングの結果である。Ｃは、Ｄｏｘ投与によるＣＨＯＰの誘導を調べた免疫ブロッティングの結果である。Ｃの上図は、用量依存性を調べた結果であり、下図は、時間依存性を調べた結果である。
【図３−１】Ｄｏｘに誘導される心筋の小胞体ストレスに対するＰＢＡの効果を示す図である。ＡはＰＢＡの投与がカスパーゼ１２活性抑制及びヒストン３のアセチル化に対する影響を示している。下段のグラフはそれぞれの発現量を内因性コントロールであるＧＡＰＤＨによって定量化した図である。Ｂは、カスパーゼ１２の活性化及びヒストンのアセチル化に対するＰＢＡ及びＢＳの効果を調べた免疫ブロッティングの結果である。下段のグラフはプロ−カスパーゼ１２（カスパーゼ１２前駆体）のタンパク質量をＧＡＰＤＨによって定量化した図である。Ｄｏｘ：Ｄｏｘ投与群（Ｄｏｘのみ投与）；Ｄｏｘ＋ＰＢＡ０．５：Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＰＢＡ５．０：Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳ０．５：Ｄｏｘ＋ＢＳ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳ５．０：Ｄｏｘ＋ＢＳ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群。
【図３−２】Ｄｏｘに誘導される心筋の小胞体ストレスに対するＰＢＡの効果を示す図である。Ｃは、ＭＴＴアッセイによって細胞死を調べた結果であり、縦軸は、吸光度を示す。Ｄｏｘ：Ｄｏｘ投与群（Ｄｏｘのみ投与）；Ｄｏｘ＋ＰＢＡ０．５：Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＰＢＡ５．０：Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳ０．５：Ｄｏｘ＋ＢＳ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳ５．０：Ｄｏｘ＋ＢＳ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５、＃：Ｄｏｘ投与群に対してｐ＜０．０５
【図４】マウス心臓を用いて、カスパーゼ１２の活性（上段）及びヒストン３のアセチル化（中段）を調べた結果を示す図である。ヒストン３アセチル化のポジティブコントロールとして、心筋細胞のサンプルを使用した。コントロールは、生理食塩水を投与した群；Ｄｏｘは、Ｄｏｘのみ投与した群；Ｄｏｘ＋ＰＢＡは、Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＰＢＡを投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳは、Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＢＳを投与した群である。ＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤｏｘ（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＳ、ＰＢＡをそれぞれ１日に体重あたり１００ｍｇ、Ｄｏｘを０ｄａｙのみ１５ｍｇ投与したことを意味する。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。
【図５】エコー検査により、心機能に対するＤｏｘ、ＰＢＡ及びＢＳの作用を調べた結果を示す図である。Ａは４群のエコーの図を示している。Ｂは左室拡張末期径を、Ｃは左室駆出率を示している。ＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤｏｘ（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＳ、ＰＢＡをそれぞれ１日に体重あたり１００ｍｇ、Ｄｏｘを０ｄａｙのみ１５ｍｇ投与したことを意味する。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５；＃：Ｄｏｘに対してｐ＜０．０５
【図６−１】心臓カテーテル検査により、心機能に対するＤｏｘ、ＰＢＡ及びＢＳの作用を調べた結果を示す図である。Ａは、最大圧力（収縮期圧）、Ｂは、左室拡張末期圧、及びＣは、ｍａｘ ｄＰ／ｄｔ（左心室内圧最大上昇速度）、Ｄは、ｍｉｎ ｄＰ／ｄｔ（左心室内圧最大下降速度）の測定結果である。ＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤｏｘ（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＳ、ＰＢＡをそれぞれ１日に体重あたり１００ｍｇ、Ｄｏｘを０ｄａｙのみ１５ｍｇ投与したことを意味する。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５；＃：Ｄｏｘに対してｐ＜０．０５
【図６−２】心臓カテーテル検査により、心機能に対するＤｏｘ、ＰＢＡ及びＢＳの作用を調べた結果を示す図である。Ｅは、収縮性指数、及びＦは、Ｔａｕ（指数関数弛緩時間定数）の測定結果である。ＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤｏｘ（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＳ、ＰＢＡをそれぞれ１日に体重あたり１００ｍｇ、Ｄｏｘを０ｄａｙのみ１５ｍｇ投与したことを意味する。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５；＃：Ｄｏｘに対してｐ＜０．０５
【図７】ＰＢＡ５００ｍｇ／ｋｇの投与が心臓小胞体ストレス及び心機能に対する影響を調べた結果を示す図である。Ａは心臓細胞におけるカスパーゼ１２の活性、Ｂはエコーの結果を示している。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５；＃：Ｄｏｘに対してｐ＜０．０５
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体（以下、ＥＲともいう）ストレスによって引き起こされる心不全の予防及び／又は治療に有効な、心筋の小胞体ストレス抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗ガン剤の副作用やその他の原因による心不全による突然死が増加し、生活の質（ＱＯL）の低下が問題となっている。特に、抗ガン剤の副作用によって心不全が引き起こされるような場合には、抗ガン剤の効果と副作用とのバランスを考えて、副作用を抑えるために標準的投与量よりも低量を投与することもあり、抗ガン作用を十分に発揮させることができなくなる。従って、心不全を予防及び／又は治療することができる薬剤が望まれているが、心不全を効果的に抑制することができる薬剤は未だ開発されていない。
【０００３】
例えば、抗ガン剤のアドリアマイシン（一般名：塩酸ドキソルビシン；以下、単にＤｏｘともいう）は、心不全を誘導する副作用を示すことが知られている。アドリアマイシンの心不全誘導メカニズムは明らかではないが、要因の１つとして酸化ストレスが示唆されており、アドリアマイシンと共に抗酸化剤であるプロブコール（ｐｒｏｂｕｃｏｌ）を用いると、酸化ストレスを減少させることによって心不全が抑制されたことが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００４】
フェニル酪酸やフェニル酪酸ナトリウム等のＨＤＡＣ阻害剤については、放射線や抗ガン剤等の化学療法に誘導される損傷を減少させる作用を示したことも開示されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００５】
ガン治療薬であるメシル酸イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｇｌｅｅｖｅｃ（グリベック））も心毒性を示すことが知られている。培養心筋細胞をメシル酸イマチニブで処理すると、小胞体ストレス応答の活性化、ミトコンドリア膜のポテンシャルの崩壊等が起こり、細胞死が引き起こされることが報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。小胞体ストレスとは、小胞体にアンフォールド（ｕｎｆｏｌｄ）した異常タンパク質が蓄積する現象である。小胞体ストレスが継続すると、細胞死（アポトーシス）に至ることが知られており、心筋細胞や神経細胞の細胞死は、心不全や神経変性疾患、脳卒中等の原因となる。例えば、横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）によって小胞体ストレスを誘導した実験によって、小胞体ストレスによって培養心筋細胞で細胞死が誘導されることが報告されており、このことから、継続する小胞体ストレスが、心臓肥大から心不全への進行過程に寄与していることが示唆されている（例えば、非特許文献３）。
【０００６】
４−フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢＡ）は、前述したＨＤＡＣ阻害剤としての作用と共に、小胞体シャペロンとして機能することにより小胞体ストレスを軽減する作用を有することが知られている。例えば、ＰＢＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでシャペロンとして作用すること及びヒトの神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において、小胞体ストレスを軽減させたことが開示されている（例えば、非特許文献４を参照）。小胞体ストレス抑制作用については、４−フェニル酢酸をＩＩ型糖尿病のモデルマウスに経口投与すると、肝細胞や脂肪細胞等の小胞体ストレスが軽減し、これによって高血糖の正常化、全身のインスリン感受性の回復、脂肪肝疾患の回復及び肝臓におけるインスリン作用の増加が起こり、グルコースホメオスタシスが回復したことが報告されている（例えば、非特許文献５及び非特許文献６を参照）。
【０００７】
ＰＢＡは上述したような作用を有することから、小胞体ストレスによって引き起こされる疾患の予防薬や治療薬に適用することができる可能性が示唆される。例えば、ＰＢＡの小胞体ストレス抑制作用は、小胞体ストレスによる心不全の予防や治療に有効であると考えられる。しかしながら、ＰＢＡを有効成分とする小胞体ストレス抑制剤は未だ開発されておらず、心筋細胞の小胞体ストレス抑制に有効なＰＢＡの用量の検討が必要とされる。小胞体ストレスを抑制するＰＢＡの用量については、上述した非特許文献６で、マウスのＦａｏ肝細胞や脂肪組織において小胞体ストレスを抑制するＰＢＡの用量が検討されている。しかしながら、心不全の治療や予防に有効な用量については一切検討されていない。
【特許文献１】特開２００５−２８１１５０号公報
【非特許文献１】Molecular and Cellular Biochemistry, 2000, 207, 77-85
【非特許文献２】Nature Medicine vol. 12 (8), 2006, 908-916
【非特許文献３】Circulation, 2004 110:705-712
【非特許文献４】Journal of Neurochemistry, 2006, 97, 1259-1268
【非特許文献５】Science vol. 313, 25 August, 2006, 1137-1140
【非特許文献６】Science vol. 313, 25 August, 2006, 1137 (Supporting Online Material : www.sciencemag.org/cgi/content/full/313/5790/1137/DC1)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、小胞体ストレスを抑制して心筋の細胞死及び心機能の低下を効果的に抑制することにより、小胞体ストレスに誘導される心不全を予防及び／又は治療することができる心筋の小胞体ストレス抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、心不全を効果的に抑制することができる薬剤を開発するため、４−フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢＡ）が、小胞体ストレス抑制作用を有することに注目して鋭意研究した。その結果、ＰＢＡは、その投与量や投与濃度によって心筋細胞において異なる作用を示すことを見出した。驚くべきことに、ＰＢＡという同じ物質であっても、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏの系において（１）１日の体重あたりの投与量（腹腔内投与）が、４−フェニル酪酸ナトリウムとして約５０〜１５０ｍｇ／ｋｇであると、ＩＣＲマウスの心筋細胞において小胞体ストレス抑制作用が発揮されて心機能低下が抑制されること、（２）余りに高用量、例えば、１日の体重あたりの投与量（腹腔内投与）が、４−フェニル酪酸ナトリウムとして約５００ｍｇ／ｋｇであると、ＩＣＲマウス心筋細胞において小胞体ストレス抑制作用は発現しないことを見出した。更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系において（３）４−フェニル酪酸ナトリウムを約０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌの低濃度でラット心筋細胞に投与すると、心筋細胞においてヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害作用は発現せず、小胞体ストレス抑制作用のみが発揮されること、（４）４−フェニル酪酸ナトリウムを余りに高濃度、例えば、５ｍｍｏｌ／Ｌでラット心筋細胞に投与すると、心筋細胞において逆にＨＤＡＣ阻害作用が発現し、小胞体ストレス抑制作用は発現しないことを見出した。ＰＢＡがＨＤＡＣ阻害剤としての作用及び小胞体ストレス抑制作用の２つの作用を有することは知られていたが、投与濃度又は投与量により心筋細胞において異なる作用が発現することは知られておらず、全く新しい知見である。また、１日の体重あたりの投与量をＰＢＡとして５０〜１５０ｍｇ／ｋｇの量にてＩＣＲマウスに非経口（腹腔内）投与するか、又は、低濃度のＰＢＡをラットの心筋細胞に投与することにより、抗がん剤等による心筋細胞の小胞体ストレスを抑制することができ、これによって心機能の低下及び心筋の細胞死を効果的に抑制して心不全を効果的に予防及び／又は治療することができることを見出した。更に、これらの動物実験によって得られた結果から、哺乳類、特にヒトの心筋において小胞体ストレスを抑制するのに効果的なＰＢＡの投与量を外挿することができるため、特定量のＰＢＡを経口又は非経口投与することによってヒトの心不全を効果的に予防及び／又は治療することができることに想到し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、
（１）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤、
（２）注射剤として用いられる上記（１）に記載の小胞体ストレス抑制剤、
（３）静脈内投与により投与される上記（１）又は（２）に記載の小胞体ストレス抑制剤、及び、
（４）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤、
に関する。
【００１１】
本発明はまた、
（５）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤の製造のための使用、
（６）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤の製造のための使用、
（７）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤としての使用、及び、
（８）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤としての使用、
に関する。
【００１２】
本発明はまた、
（９）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬を、ヒトに１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与して、心筋の小胞体ストレスを抑制する方法、及び、
（１０）有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬を、ヒトに１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与して、心筋の小胞体ストレスを抑制する方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の小胞体ストレス抑制剤は、抗ガン剤の副作用等によって誘導される心筋の小胞体ストレスを効果的に抑制することができるため、小胞体ストレスが原因となる心筋の細胞死及び心機能の低下を抑制することができ、心不全の予防及び／又は治療に有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書中において、「小胞体ストレス」とは、膜タンパク質又は分泌タンパク質の翻訳の場である小胞体における機能異常により、異常構造を持ったタンパク質等が蓄積することにより起こるストレスをいう。心筋細胞において小胞体ストレスが継続すると、心筋細胞は細胞死（アポトーシス）に至り、心不全を引き起こす原因となる。「小胞体ストレス抑制作用」とは、上述した小胞体ストレスを低減又は解消する作用をいう。本発明の小胞体ストレス抑制剤は、（１）１日に体重あたり４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される４−フェニル酪酸ナトリウム若しくは（２）１日に体重あたり約１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される４−フェニル酪酸ナトリウムが心筋細胞において小胞体ストレスを効果的に抑制し（ｉｎ ｖｉｖｏ）、又は、（３）有効成分として全体に対して約０．５〜２ｍｍｏｌ含有される４−フェニル酪酸ナトリウムが心筋細胞において小胞体ストレスを効果的に抑制し（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、その結果小胞体ストレスにより引き起こされる心筋の細胞死を抑制すると共に、心筋の機能低下を抑制することができるものである。従って、本発明の小胞体ストレス抑制剤を用いると、抗ガン剤の副作用等による小胞体ストレスによって引き起こされる心不全を効果的に予防及び／又は治療することができる。
なお、上記（１）及び（２）のＰＢＡの投与量は、ＩＣＲマウスを用いたＩｎ ｖｉｖｏ実験において、効果的にＩＣＲマウスの心筋の小胞体ストレスを抑制することができたＰＢＡの投与量（腹腔内投与）５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙから、「“動物種差と外挿” 監修 松岡 理／小林定喜、ソフトサイエンス社、１９８３年」及び「Edward J. Calabrese著 “Principles of Animal Extrapolation”」に従ってヒトへのＰＢＡの非経口又は経口投与量を外挿した値である。
上記（３）のｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて心筋の小胞体ストレス抑制に効果的なＰＢＡ濃度（０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌ）は、ラット心筋細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、効果的に小胞体ストレスを抑制することができたＰＢＡ濃度である。
【００１５】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤に用いられる４−フェニル酪酸ナトリウムは、尿酸サイクル異常症の治療薬として臨床応用されている化合物である。本発明で用いられる４−フェニル酪酸ナトリウムとしては、医薬上使用できる程度に精製されたものであればよく、市販品を用いることができる。市販品としては、例えば、Ｂｉｏｍｏｌ社のもの等が挙げられる。
【００１６】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤は、有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有するものであり、（１）１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される、又は、（２）１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与されるものである。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系では、（３）４−フェニル酪酸ナトリウムを全体に対して０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌ含有する小胞体ストレス抑制剤を心筋細胞に用いると、効果的に心筋の小胞体ストレスを抑制することができる。
【００１７】
上記（１）及び（２）の心筋の小胞体ストレス抑制剤において、該４−フェニル酪酸ナトリウムの１日の体重あたりの投与量が余りに少ないと、心筋細胞において小胞体ストレスを抑制する効果が十分発現しない場合がある。逆に４−フェニル酪酸ナトリウムの１日の体重あたりの投与量が余りに多いと、心筋細胞において４−フェニル酪酸ナトリウムのＨＤＡＣ阻害作用は発現するが、小胞体ストレス抑制作用が発現しない。本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤は、（１）の非経口投与される場合は、１日の体重あたりの投与量が４−フェニル酪酸ナトリウムとして約５〜１０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、約７〜９ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。上記（２）の経口投与される場合は、１日の体重あたりの投与量が４−フェニル酪酸ナトリウムとして約２０〜４０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、約２５〜３５ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。
【００１８】
上記（３）の心筋の小胞体ストレス抑制剤において、４−フェニル酪酸ナトリウム濃度が余りに低いと、心筋細胞において小胞体ストレスを抑制する効果が十分発現しない場合がある。逆に４−フェニル酪酸ナトリウム濃度が余りに高いと、４−フェニル酪酸ナトリウムのＨＤＡＣ阻害作用は発現するが、小胞体ストレス抑制作用が発現しない。心筋の小胞体ストレス抑制剤における４−フェニル酪酸ナトリウム濃度は、好ましくは全体に対して約０．５〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、約０．５〜１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
投与は、上記投与量を１日１回〜数回に分けて投与するのが好ましく、より好ましくは１日１回〜約４回、さらに好ましくは１日１回〜約２回に分けて投与する。
本発明の心筋のストレス抑制剤を非経口投与する場合の投与方法としては、例えば、静脈内投与、皮下投与等が挙げられるが、静脈内投与が好ましい。
【００２０】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤は、種々の製剤形態、例えば、固形製剤、液状製剤等をとりうる。例えば、経口投与のための内服用固形剤もしくは内服用液剤、又は非経口投与のための注射剤等とすることができる。非経口投与する場合の好ましい剤型は、液状製剤であり、より好ましくは、注射剤である。例えば、４−フェニル酪酸ナトリウムのみ又は４−フェニル酪酸ナトリウムと慣用の担体と共に注射剤とされることが好ましい。
【００２１】
経口投与のための内服用固形剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が挙げられる。
内服用固形剤においては、４−フェニル酪酸ナトリウムはそのままか、添加剤と混合又は造粒（例えば、攪拌造粒法、流動層造粒法、乾式造粒法、転動攪拌流動層造粒法等）され、常法に従って製造される。例えば、カプセル剤であれば、カプセル充填等によって、錠剤であれば、打錠剤等によって製造することができる。添加剤は、１種又は２種以上を適宜配合してもよい。添加剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の結合剤；トウモロコシデンプン等の分散剤；繊維素グリコール酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤；安定剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子類等の水溶性高分子；白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、還元麦芽糖水アメ、粉末還元麦芽糖水アメ、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、アスパルテーム、サッカリン、サッカリンナトリウム等の甘味剤等が挙げられる。
【００２２】
顆粒剤又は錠剤は、必要によりコーティング剤等で被覆されていてもよいし、また該コーティングは２以上の層であってもよい。コーティング剤としては、例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等が挙げられる。カプセル剤として製造する場合には、上記賦形剤を適宜選択し、プランルカスト水和物と均等に混和又は粒状、もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものをカプセルに充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチン等）にグリセリン又はソルビトール等を加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形してもよい。これらカプセル基剤には必要に応じて、着色剤又は保存剤（二酸化イオウ；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のパラベン類）等を加えることができる。カプセル剤には、ハードカプセル又はソフトカプセルが含まれる。
また、錠剤又はカプセル剤は、一回当たり、１〜数個投与されるのが好ましく、１〜約２個投与されるのがより好ましい。このため、錠剤又はカプセル剤には、４−フェニル酪酸ナトリウムが、１錠又は１カプセル当たり、約２〜５０ｍｇ、好ましくは約５〜３０ｍｇ、より好ましくは、約７〜２５ｍｇ含まれるよう製造されるのが好ましい。
【００２３】
経口投与のための内服用液剤としては、水剤、懸濁剤・乳剤、シロップ剤、ドライシロップ剤等の用時溶解型製剤、エリキシル剤等が挙げられる。このような内服用液剤においては、４−フェニル酪酸ナトリウムは、内服用液剤で一般的に用いられる希釈剤に溶解、懸濁又は乳化される。希釈剤としては、例えば、精製水、エタノール又はそれらの混液等が挙げられる。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤又は緩衝剤等を含有していてもよい。また、ドライシロップ剤は、例えばプランルカスト水和物と、例えば、白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖又は乳糖等とを混合等して製造することができる。また、ドライシロップ剤は、常法に従って顆粒としてもよい。
【００２４】
非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、４−フェニル酪酸ナトリウムを溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。上記（１）の小胞体ストレス抑制剤を注射剤とする場合の４−フェニル酪酸ナトリウムの濃度としては、例えば、約１０〜５０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましく、約１０〜３０ｍｇ／ｍＬとすることがより好ましい。このような濃度の注射液を１日に体重あたり、約０．２〜１ｍＬ投与するのが好ましい。
【００２５】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤は、ヒトの他、ヒト以外の哺乳動物にも投与することができる。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ブタ、牛等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２６】
本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤剤は、適宜他の医薬と併せて用いることができる。他の医薬としては、本発明の効果を奏することになる限り特に限定されない。例えば、本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤を、抗ガン剤等の心不全を引き起こす副作用を有する他の薬剤と併用することによって、抗ガン剤等による心不全を効果的に予防及び／又は治療することができる。本発明の心筋の小胞体ストレス抑制剤と、心不全を引き起こす副作用を有する抗癌剤等とを併用することは、本発明の好ましい実施形態の１つである。
【００２７】
有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤の製造のための使用；有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤の製造のための使用；有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤としての使用；及び、有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与される組成物の、心筋の小胞体ストレス抑制剤としての使用も、本発明の１つである。有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する組成物やその好ましい形態としては、上述した心筋の小胞体ストレス抑制剤と同様である。
【００２８】
有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬を、ヒトに１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与して、心筋の小胞体ストレスを抑制する方法；及び、有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬を、ヒトに１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与して、心筋の小胞体ストレスを抑制する方法も、本発明の１つである。４−フェニル酪酸ナトリウムを含有する医薬やその好ましい態様としては、上述した心筋の小胞体ストレス抑制剤と同様である。
【実施例】
【００２９】
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
（Ｉ）材料
塩酸ドキソルビシン（Ｄｏｘ）及び４−フェニル酪酸ナトリウム（ＰＢＡ）は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（St. Luis, MO）及びＢｉｏｍｏｌ社（BIOMOL International L.P.）（Plymouth Meetin PA）から購入した。ＣＨＯＰ、ＸＢＰ１、ＡＴＦ６、リン酸ＰＥＲＫ及びアクチンに対する抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）（Santa Cruz, CA）から入手した。リン酸ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ及びリン酸ｅＩＦ２αに対する抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Cell Signaling Technology, Inc.）（ Danvers, MA）から入手した。カスパーゼ１２に対する抗体は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（St. Luis, MO）から入手し、ＫＤＥＬは、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎｅ社（Assay Designs, Inc.）（Ann Arbor, MI）から入手した。ＧＡＰＤＨ抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ社（CHEMICON International, Inc.）（Temecula, CA）から購入した。
【００３１】
（ＩＩ）実験方法
（１）新生仔ラットの心筋細胞の調製
心筋細胞の初代培養は、新生仔ラットの心臓を用いて実験を行った。取り出した心臓をピンセットで細かく切断し、４℃にてトリプシン（trypsin）に一晩浸した。次の日に、トリプシンと同量の培養培地を添加し、３７℃にて５分インキュベートした後、トリプシンと培地を除いた。次に、１０ｍＬのコラーゲナーゼ（collagenase）（１ｍｇ／ｍＬ）を加え、残留したトリプシンを洗浄し、心臓組織をコラーゲナーゼによって、１５分３回スタラーで回しながら、心筋細胞を分離させた。分離された心筋細胞を５０００ｒｐｍ、５分遠心した後、細胞ペレットを培養培地に再度懸濁し、Ｐ１０のシャーレに蒔いた。インキュベーター内で７０分細胞を静止し、混在する繊維芽細胞（fibroblast）を付着させた。ピペットで培養シャーレを軽く洗い、上澄に浮遊している心筋細胞を回収し、実験に用いた。全ての手順は、動物ケアに関する大阪大学医学部の指針及び“Position of the American Heart Association on Research Animal Use”に従って行った。
【００３２】
（２）ＰＥＲＫ及びｅＩｆ２αのリン酸化の検出
心筋細胞に各濃度のＤｏｘ添加６時間後、全タンパク質を回収し、ＰＥＲＫ及びｅＩｆ２αのリン酸化抗体を用いたウェスタンブロット法にて目的タンパク質のリン酸化を検討した。
【００３３】
（３）ＡＴＦ６の切断及びＸＢＰ１のスプライシング
心筋細胞に各濃度のＤｏｘを添加し、６時間に後細胞質及び核タンパク質を回収し、特異抗体を用いたウェスタンブロット法にて細胞質及び核内に存在するＡＴＦ６とＸＢＰ１を検討した
【００３４】
（４）ＲＮＡレベルでのＸＢＰ１スプライシング
ラットの心筋細胞をＤｏｘで６時間処理した後、ＸＢＰ１スプライシングをリバーストランスクリプショナル（reverse-transcriptional）ＰＣＲ法を用いて評価した。スプライスサイトにかかるプライマーは、以下のようにデザインした。
フォワードプライマー：ACGAGAGAAAACTCATGG （配列番号１）
リバースプライマー：ACAGGGTCCAACTTGTCC (配列番号２)
ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上で分離させ、ＵＶ照射によって観察した。
【００３５】
（５）ＣＨＯＰの誘導
心筋細胞に各濃度のＤｏｘ添加６時間後、又はＤｏｘ（１．０μｍｏｌ／Ｌ）添加１、３、６、１２、２４時間後、全タンパク質を回収し、ＣＨＯＰ抗体を用いたウェスタンブロット法にてＣＨＯＰの発現を検討した。
【００３６】
（６）カスパーゼ１２の活性化
心筋細胞に各濃度のＤｏｘ添加６時間後、又はＤｏｘ（１．０μｍｏｌ／Ｌ）添加１、３、６、１２、２４時間後、全タンパク質を回収し、カスパーゼ１２（Caspase-12）抗体を用いたウェスタンブロット法にてカスパーゼ１２の切断を検討した。
【００３７】
（７）ＪＮＫのリン酸化
ＰＢＡ又はＢＳに一晩プレインキュベートした心筋細胞に各濃度のＤｏｘ添加６時間後、又はＤｏｘ（１．０μｍｏｌ／Ｌ）添加１、３、６、１２、２４時間後、全タンパク質を回収し、ＪＮＫのリン酸化抗体を用いたウェスタンブロット法にてＪＮＫのリン酸化を検討した。
【００３８】
（８）細胞死の測定
ＰＢＡ又は酪酸ナトリウム（以下、ＢＳともいう）に一晩プレインキュベートした心筋細胞にＤｏｘ（１．０μｍｏｌ／Ｌ）、Ｄｏｘ及びＰＢＡ（０．５又は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）、又は、ＢＳ（０．５又は５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加２４時間後、生存した細胞をＭＴＴアッセイにて検討した。
【００３９】
（９）免疫ブロッティング
心筋細胞を、プロテアーゼ阻害剤混合物（ナカライテスク）を含むバッファー（０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ）に溶解した。電気泳動、免疫ブロッティング及び検出は、Tsukamoto O. et al., Biochem Biophys Res Commun 2006 24: 1125-1133に記載された方法に従って行った。具体的には細胞可溶化物のタンパク質濃度を測定し、同じタンパク質量を含有するようにサンプルを調製した。電気泳動にはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い、Bio-Rad mini protean 3 cellにて、ブロッティングにはBio-Rad semidry transfer cellを用いて行った。
【００４０】
（１０）Ｄｏｘ投与マウスモデルの作製
雄ＩＣＲマウス（１０週齢、体重３５〜４０ｇ）をランダムに４群に分けた。コントロール群（ｎ＝６）には、試験期間中毎日１０ｍＬ／ｋｇの生理食塩水を与えた。Ｄｏｘ投与の１日前（−１日）、Ｄｏｘ（ｎ＝１０）群には生理食塩水を、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（ｎ＝１２）群にはＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）を、Ｄｏｘ＋ＢＳ（ｎ＝７）群にはＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ腹腔内（ＩＰ）に投与した。次いで、これらの３グループにＤｏｘを１ドーズ投与した（１５ｍｇ／ｋｇ）（０日目）。次の６日間（１日目から６日目）、Ｄｏｘ群には生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇ、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ群にはＰＢＡを１００ｍｇ／ｋｇ、Ｄｏｘ＋ＢＳ群にはＢＳを１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回腹腔内投与した。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。
【００４１】
（１１）血行動態指標の計測（Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）
ミラーカテーテルを右頸動脈から挿入し、左心室（ＬＶ）に慎重に導入した。その後、心拍、収縮期圧（ＬＶＳＰ）、拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）、圧波のアップストローク又はダウンストロークの間の最大勾配（ｍａｘ ｄＰ／ｄｔ：左心室内圧最大上昇速度及びｍｉｎ ｄＰ／ｄｔ：左心室内圧最大下降速度）、ｍａｘ ｄＰ／ｄｔをｍａｘ ｄＰ／ｄｔ時の圧力で割った値（収縮性指数）及び指数関数弛緩時間定数（Ｔａｕ）を、アプリケーションプログラムＢｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｍｏｄｅｌを用いて分析した。
【００４２】
（１２）統計学的分析
データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表わされる。統計的有意差の有無は、ｏｎｅ−ｗａｙ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡに続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを行い、求めた。全ての分析に関して、ｐ＜０．０５は、統計学的に有意差であると認められた。
【００４３】
（ＩＩＩ）結果
（１）Ｄｏｘの作用
（ｉ）ＰＥＲＫ（二本鎖ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼ様のＥＲキナーゼ）は、小胞体ストレスを感知し、ｅＩｆ２α（真核生物の開始因子２α）のリン酸化を通して全体的なタンパク質合成の抑制を引き起こすと思われるので、Ｄｏｘ投与後のＰＥＲＫ及びｅＩｆ２αのリン酸化を検出した。培養新生仔の心筋細胞において、ＰＥＲＫ及びｅＩｆ２αのリン酸化はＤｏｘの投与によって用量依存的に誘導された。図１−１ＡにＤｏｘによって誘導されたＰＥＲＫのリン酸化を、図１−１ＢにＤｏｘによって誘導されたｅＩｆ２αのリン酸化を、それぞれ示す。アクチンは、各サンプル間タンパク質量の差がないことを示す内因性コントロールとして用いた。しかしながら、ＥＲにおけるタンパク質の適切なフォールディングと会合を助けることによって小胞体ストレスを軽減し、小胞体機能を保つために必要な小胞体シャペロン（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４）の誘導は、Ｄｏｘ投与後に観察されなかった（図１−１Ｃ）。従って、Ｄｏｘは培養新生仔の心筋細胞で小胞体ストレスを誘導したが、小胞体シャペロンの発現を誘導しなかった。
【００４４】
小胞体ストレスにおいて、ＧＲＰ７８の発現は、転写因子である切断されたＡＴＦ６とスプライスされたＸＢＰ１によって主に調節される（Jill A. et al.,Anat Embryol (Berl). 2000 Jul 202(1): 67-74、Yoshida H. et al., Cell 107 2001: 881-891）。従って、ＡＴＦ６の切断とＸＢＰ１のスプライシングへのＤｏｘの効果を調べた。図１−２Ｅ(下図)及びＦに示すように、Ｄｏｘを投与するとスプライスされていないＸＢＰ１の発現が阻害され、その結果ＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方でスプライスされたＸＢＰ１が存在しなかった。更に、薬理学的なＥＲストレッサーであるツニカマイシンによって誘導されたＧＲＰ７８の発現の増加は、Ｄｏｘによって阻害された（図１−２Ｇ）。このことから、ＡＴＦ６の切断はある程度増加するものの（図１−１Ｄ）、ＤｏｘはＸＢＰ１スプライシングを減少させることを通してＧＲＰ７８の発現を抑制することが示唆された。
【００４５】
（ｉｉ）Ｄｏｘは、小胞体に惹起されるアポトーシス経路を活性化した。
カスパーゼ１２は、細胞にアポトーシスを起こさせるシグナル伝達経路を構成する、一群のシステインプロテアーゼの１つである。小胞体ストレスが起こると、カスパーゼ１２が切断されて活性化が起こることが知られている。培養新生仔心筋細胞において、Ｄｏｘの投与はカスパーゼ１２の活性化（図２Ａ）及びＪＮＫのリン酸化（図２Ｂ）を、いずれも用量−及び時間−依存的に誘導した。しかしながら、Ｄｏｘ投与後、アポトーシスに関わることが知られているＣＨＯＰの誘導は、観察されなかった（図２Ｃ）。
【００４６】
（２）ＰＢＡの効果
（ｉ）ケミカルシャペロンであるＰＢＡで前処理すると、カスパーゼ１２の活性がＰＢＡ０．５又は１．０ｍｍｏｌ／Ｌの添加下で減少したが、０．１又は５．０ｍｍｏｌ／Ｌの添加ではカスパーゼ１２活性の抑制は見られなかった（図３−１Ａ）。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の１つとして、ＰＢＡはヒストンのアセチル化を誘導して遺伝子発現をリモデリングすることができる。従って、ＰＢＡが関与するヒストンのアセチル化がカスパーゼ１２活性の阻害に関与するかどうかについて調べた。図３−１Ｂに示すように、ＰＢＡは０．５ｍｍｏｌ／Ｌでカスパーゼ１２の切断をブロックしたが、５．０ｍｍｏｌ／Ｌではブロックしなかった。一方、ヒストン３のアセチル化は、ＰＢＡが５．０ｍｍｏｌ／Ｌのときのみ検出された。更に、フェニル基を有しない酪酸ナトリウム（ＢＳ）は、ＰＢＡと同様にヒストンをアセチル化する機能を有するが、ヒストン３のアセチル化を誘導したがカスパーゼ１２の活性を阻害しなかった。更に、Ｄｏｘによって誘導される心筋細胞死は、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＡによって抑制されたが、５．０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＡによっては抑制されなかった。Ｄｏｘからの心筋の保護作用は、ＢＳとＤｏｘとを用いて処理した場合には観察されなかった（図３−２Ｃ）。従って、ＰＢＡは、低濃度（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）で投与した場合に、心筋においてＤｏｘに誘導されるカスパーゼ１２活性を阻害し、細胞死を妨げることが分かった。また、マウスの心臓においても、ＰＢＡがＤｏｘによって誘導されるカスパーゼ１２の活性化を阻害するかどうかを調べるために、コントロール群（生理食塩水を投与）、Ｄｏｘ群（Ｄｏｘのみ投与）、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ群（Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＰＢＡを投与）及びＤｏｘ＋ＢＳ群（Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＢＳを投与）の心臓の組織のホモジネートを用いて、ウェスタンブロット分析によってカスパーゼ１２の切断をチェックした。図４に示すように、Ｄｏｘに誘導されたカスパーゼ１２活性は、１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＡの投与によって、コントロール又はＤｏｘ＋ＢＳ群に比べて抑制された。従って、１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＡは、Ｄｏｘに誘導される心臓損傷に対して保護作用を有することが示された。一方、ＰＢＡ１００ｍｇ／ｋｇまたはＢＳ１００ｍｇ／ｋｇいずれもヒストンアセチル化を誘導していなかったことは下段の図で明らかとなった。
【００４７】
（ｉｉ）コントロール群（生理食塩水を投与）、Ｄｏｘ群（Ｄｏｘのみ投与）、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ群（Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＰＢＡを投与）及びＤｏｘ＋ＢＳ群（Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＢＳを投与）の心機能を調べた。６日目、エコー検査の結果、各群左心室拡張末期径（ＬＶＥＤｄ）の差はなかったが（図５Ｂ）、左室駆出率（ＬＶＥＦ）が、Ｄｏｘ群と比較し、Ｄｏｘ＋ＰＢＡ群では有意に改善された（図５Ｃ）。心臓カテーテル検査の結果、ｍａｘ ｄＰ／ｄｔ（左心室内圧最大上昇速度）及び収縮性指数（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）は、Ｄｏｘ群と比較してＤｏｘ＋ＰＢＡ群で高かった（図６−１Ｃ及び図６−２Ｅ）。１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＡ投与マウスにおいては、Ｄｏｘ群と比べてＬＶＳＰ（左室収縮末期圧）はわずかに低く、ｍｉｎ ｄＰ／ｄｔ（左心室内圧最大下降速度）、ＬＶＥＤＰ（左室拡張末期圧）及びＴａｕは非常に低い（図６−１Ａ、Ｄ、Ｂ及び図６−２Ｆ）。上記のパラメータにおいては、Ｄｏｘ群とＤｏｘ＋ＢＳ群との間に有意差はなかった。これらの結果は、ＢＳでなく１００ｍｇ／ｋｇのＰＢＡが、Ｄｏｘ投与による心臓機能障害を改善したことを示している。
【００４８】
図１−１、図１−２及び図２に示されるように、Ｄｏｘ投与によって、心筋細胞において用量及び時間依存的に小胞体ストレスが誘導される。驚くべきことに、Ｄｏｘと共に低濃度（０．５ｍｍｏｌ／ｍＬ又は１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）ＰＢＡを投与すると、ＰＢＡのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害作用は発現しないが、小胞体ストレスが抑制されて心筋の細胞死を効果的に抑制することができた（図３−１及び図３−２）。更に、Ｄｏｘに誘導される心機能の低下を効果的に抑制することができた（図５、図６−１及び図６−２）。しかしながら、高濃度（５．０ｍｍｏｌ／ｍＬ）のＰＢＡを投与すると、ＰＢＡのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害作用は発現するが、小胞体ストレス抑制作用や心機能保護作用は発現しなかった（図３−１及び図３−２）。また、１日に体重当たりＰＢＡを１００ｍｇ／ｋｇ投与すると、小胞体ストレスが抑制されたが、高用量（５００ｍｇ／ｋｇ）ＰＢＡを投与すると、小胞体ストレス抑制作用や心機能保護作用は認められなかった（図４及び図７）。ＨＤＡＣ阻害剤であるＢＳを投与しても、小胞体ストレス抑制作用や心機能保護作用は観察されなかった（図５、図６−１及び図６−２）。
【００４９】
（ＩＶ）考察
これらの結果から、心筋細胞におけるＰＢＡの小胞体ストレス抑制作用及び心機能改善作用は、ＨＤＡＣ阻害作用が発現しない低濃度、低用量でのみ特異的に発現されることが初めて示された。低濃度又は低用量のＰＢＡをＤｏｘ等の小胞体ストレスを起こす薬剤と共に投与することによって、薬剤の副作用を軽減することができるため、心不全を効果的に防ぐことができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の小胞体ストレス抑制剤は、抗ガン剤の副作用等によって誘導される心筋の小胞体ストレスを効果的に抑制することができるため、小胞体ストレスが原因となる心筋の細胞死及び心機能の低下を抑制することができ、心不全の予防及び／又は治療に有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１−１】Ｄｏｘの心筋細胞への作用を調べた免疫ブロッティングの結果を示す図である。図１−１中、ＭＧは、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）を示し、Ｔｕは、ツニカマイシンを示す。Ａは、Ｄｏｘによって用量依存的にＰＥＲＫのリン酸化が誘導されたことを示す免疫ブロッティングの結果である。Ｂは、Ｄｏｘによって用量依存的にｅＩＦ２αのリン酸化が誘導されたことを示す免疫ブロッティングの結果である。Ｃは、Ｄｏｘを添加しても、分子シャペロンであるＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４の発現が誘導されなかったことを示す免疫ブロッティングの結果である。Ｄは、ＡＴＦ６の切断に対するＤｏｘの影響を示す免疫ブロッティングの結果である。
【図１−２】Ｄｏｘの心筋細胞への作用を調べた免疫ブロッティングの結果を示す図である。図１−２中、ＭＧは、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）を示し、Ｔｕは、ツニカマイシンを示す。Ｅは、スプライスされていないＸＢＰ１ ＲＮＡ及びスプライスされたＸＢＰ１ ＲＮＡを示す模式図（上）、及び、Ｄｏｘの投与によってスプライスされていないＸＢＰ１ ＲＮＡの発現が阻害されたこと（下）を示す免疫ブロッティングの結果である。Ｆはツニカマイシンによって誘導されるスプライスされたＸＢＰ１が核内移行する結果である。Ｇは、ツニカマイシンによって誘導されるＧＰＲ７８の発現量の増加が、Ｄｏｘによって阻害されたことを示す免疫ブロッティングの結果である。
【図２】Ｄｏｘの心筋細胞への作用を調べた免疫ブロッティングの結果を示す図である。図２中、ＭＧは、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）を示し、Ｔｕはツニカマイシンを示す。Ａ及びＢは、Ｄｏｘ投与によるカスパーゼ１２の活性化（Ａ）及びＪＮＫリン酸化（Ｂ）の、用量依存性（Ａ及びＢの上図）及び時間依存性（Ａ及びＢの下図）について調べた免疫ブロッティングの結果である。Ｃは、Ｄｏｘ投与によるＣＨＯＰの誘導を調べた免疫ブロッティングの結果である。Ｃの上図は、用量依存性を調べた結果であり、下図は、時間依存性を調べた結果である。
【図３−１】Ｄｏｘに誘導される心筋の小胞体ストレスに対するＰＢＡの効果を示す図である。ＡはＰＢＡの投与がカスパーゼ１２活性抑制及びヒストン３のアセチル化に対する影響を示している。下段のグラフはそれぞれの発現量を内因性コントロールであるＧＡＰＤＨによって定量化した図である。Ｂは、カスパーゼ１２の活性化及びヒストンのアセチル化に対するＰＢＡ及びＢＳの効果を調べた免疫ブロッティングの結果である。下段のグラフはプロ−カスパーゼ１２（カスパーゼ１２前駆体）のタンパク質量をＧＡＰＤＨによって定量化した図である。Ｄｏｘ：Ｄｏｘ投与群（Ｄｏｘのみ投与）；Ｄｏｘ＋ＰＢＡ０．５：Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＰＢＡ５．０：Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳ０．５：Ｄｏｘ＋ＢＳ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳ５．０：Ｄｏｘ＋ＢＳ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群。
【図３−２】Ｄｏｘに誘導される心筋の小胞体ストレスに対するＰＢＡの効果を示す図である。Ｃは、ＭＴＴアッセイによって細胞死を調べた結果であり、縦軸は、吸光度を示す。Ｄｏｘ：Ｄｏｘ投与群（Ｄｏｘのみ投与）；Ｄｏｘ＋ＰＢＡ０．５：Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＰＢＡ５．０：Ｄｏｘ＋ＰＢＡ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳ０．５：Ｄｏｘ＋ＢＳ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳ５．０：Ｄｏｘ＋ＢＳ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）を投与した群。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５、＃：Ｄｏｘ投与群に対してｐ＜０．０５
【図４】マウス心臓を用いて、カスパーゼ１２の活性（上段）及びヒストン３のアセチル化（中段）を調べた結果を示す図である。ヒストン３アセチル化のポジティブコントロールとして、心筋細胞のサンプルを使用した。コントロールは、生理食塩水を投与した群；Ｄｏｘは、Ｄｏｘのみ投与した群；Ｄｏｘ＋ＰＢＡは、Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＰＢＡを投与した群；Ｄｏｘ＋ＢＳは、Ｄｏｘ＋１００ｍｇ／ｋｇ ＢＳを投与した群である。ＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤｏｘ（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＳ、ＰＢＡをそれぞれ１日に体重あたり１００ｍｇ、Ｄｏｘを０ｄａｙのみ１５ｍｇ投与したことを意味する。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。
【図５】エコー検査により、心機能に対するＤｏｘ、ＰＢＡ及びＢＳの作用を調べた結果を示す図である。Ａは４群のエコーの図を示している。Ｂは左室拡張末期径を、Ｃは左室駆出率を示している。ＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤｏｘ（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＳ、ＰＢＡをそれぞれ１日に体重あたり１００ｍｇ、Ｄｏｘを０ｄａｙのみ１５ｍｇ投与したことを意味する。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５；＃：Ｄｏｘに対してｐ＜０．０５
【図６−１】心臓カテーテル検査により、心機能に対するＤｏｘ、ＰＢＡ及びＢＳの作用を調べた結果を示す図である。Ａは、最大圧力（収縮期圧）、Ｂは、左室拡張末期圧、及びＣは、ｍａｘ ｄＰ／ｄｔ（左心室内圧最大上昇速度）、Ｄは、ｍｉｎ ｄＰ／ｄｔ（左心室内圧最大下降速度）の測定結果である。ＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤｏｘ（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＳ、ＰＢＡをそれぞれ１日に体重あたり１００ｍｇ、Ｄｏｘを０ｄａｙのみ１５ｍｇ投与したことを意味する。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５；＃：Ｄｏｘに対してｐ＜０．０５
【図６−２】心臓カテーテル検査により、心機能に対するＤｏｘ、ＰＢＡ及びＢＳの作用を調べた結果を示す図である。Ｅは、収縮性指数、及びＦは、Ｔａｕ（指数関数弛緩時間定数）の測定結果である。ＢＳ（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＤｏｘ（１５ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＳ、ＰＢＡをそれぞれ１日に体重あたり１００ｍｇ、Ｄｏｘを０ｄａｙのみ１５ｍｇ投与したことを意味する。ＰＢＡとしては、生理食塩水に溶解させたＰＢＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。ＢＳとしては、生理食塩水に溶解させたＢＳ濃度１０ｍｇ／ｍＬの溶液を投与した。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５；＃：Ｄｏｘに対してｐ＜０．０５
【図７】ＰＢＡ５００ｍｇ／ｋｇの投与が心臓小胞体ストレス及び心機能に対する影響を調べた結果を示す図である。Ａは心臓細胞におけるカスパーゼ１２の活性、Ｂはエコーの結果を示している。＊：コントロールに対してｐ＜０．０５；＃：Ｄｏｘに対してｐ＜０．０５
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤。
【請求項２】
注射剤として用いられる請求項１に記載の小胞体ストレス抑制剤。
【請求項３】
静脈内投与により投与される請求項１又は２に記載の小胞体ストレス抑制剤。
【請求項４】
有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤。
【請求項１】
有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして４〜１２．５ｍｇ／ｋｇの量にて非経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤。
【請求項２】
注射剤として用いられる請求項１に記載の小胞体ストレス抑制剤。
【請求項３】
静脈内投与により投与される請求項１又は２に記載の小胞体ストレス抑制剤。
【請求項４】
有効成分として４−フェニル酪酸ナトリウムを含有し、１日に体重あたり該４−フェニル酪酸ナトリウムとして１５〜５０ｍｇ／ｋｇの量にて経口投与されることを特徴とする心筋の小胞体ストレス抑制剤。
【図３−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図３−１】
【図４】
【図５】
【図７】
【図６−１】
【図６−２】
【図１−１】
【図１−２】
【図２】
【図３−１】
【図４】
【図５】
【図７】
【公開番号】特開２００９−７８９７７（Ｐ２００９−７８９７７Ａ）
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４７２２７（Ｐ２００７−２４７２２７）
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２５日（２００７．９．２５）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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