デングウイルスや日本脳炎ウイルスなどのフラビウイルスに感染したとき血漿タンパクの漏出及びその他悪影響を誘発する細胞受容体が同定される。ここで開示する融合タンパク質を使用して、フラビウイルスなどの病原体がグリカン結合を介して結合する受容体が決定される。受容体が決定されたら、特定の受容体に結合することの作用が解明可能となり、特定の症状を引き起こす受容体の標的化は、受容体への病原体の結合を阻害する物質によって標的化することができる。これに基づき、デングウイルスと日本脳炎ウイルスの場合、病原体がＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体に結合すると、ＴＮＦ−αが放出される。ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体をモノクロナール抗体で阻害することによって、ウイルスの排除を担うサイトカインの分泌に影響を与えることなくＴＮＦ−αの分泌を減少し、感染マウスの生存率をゼロから約５０％に高めることができる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年３月２７日出願の米国実用新案登録出願第１２／０７９５７６号及び２００５年８月３１日出願の米国仮特許出願番号第６０／７１３４６３号のパリ条約による優先権を主張する２００６年８月３１日出願の米国特許出願第１１／４６９２７０号のパリ条約による優先権を主張し、それら特許出願の全開示が参照として組み込まれる。
【０００２】
本研究は、台湾国家科学委員会助成金番号９４Ｆ００−８−５、ＮＳＣ ９５−２３２０−Ｂ−０１０−０１０、ＮＳＣ ９５−３１１２−Ｂ−０１０−０１７からの助成金によって支援された。また本研究は台湾中央研究院助成金番号９４Ｍ００２−１、および国立陽明大学助成金番号９５Ａ−ＣＴ８Ｇ０２からの助成金によっても支援された。
【０００３】
本発明は応答標的の同定及びフラビウイルス感染反応の治療に用いる組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、このような参考文献が任意の国の一般知識または先行技術の一部を形成するという容認または暗示を構成せず、そのように認識されるべきでない。ここに引用されるあらゆる参考文献は全開示が参照として組み込まれる。
【０００５】
免疫系は、宿主生物が非自己抗原から自身を区別し、かつ侵襲性病原体を認識してそれらを根絶することを可能にする。適応免疫系はＴ細胞とＢ細胞に抗原を提示し、それによって免疫系を活性化させるために、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ、major histocompatibility complex）のクラスＩ及びクラスＩＩ抗原、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体などの多形分子に大きく依存している。自然免疫系がこれらの多様な抗原を認識するメカニズムは、Ｊａｎｅｗａｙ（Ｊａｎｅｗａｙ、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ５４ Ｐｔ １、１〜１３）によって示された「パターン認識受容体（ＰＰＲ）」の概念が生まれるまで解明されていなかった。この仮説は後に、ＴＯＬＬ様受容体（Ａｄｅｒｅｍ ａｎｄ Ｕｌｅｖｉｔｃｈ、２０００ Ｎａｔｕｒｅ ４０６、７８２〜７；Ａｋｉｒａ ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ、２００４、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４、４９９〜５１１；Ａｔｈｍａｎ ａｎｄ Ｐｈｉｌｐｏｔｔ、２００４、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７、２５〜３２）、レクチン受容体（Ｃａｍｂｉ ａｎｄ Ｆｉｇｄｏｒ、２００３、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５、５３９〜４６）、免疫グロブリン様（Ｉｇ様）受容体（Ｄａｗｓ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１、５９４〜９）、ＮＯＤタンパク質（Ａｔｈｍａｎ ａｎｄ Ｐｈｉｌｐｏｔｔ、２００４、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７、２５〜３２）、その他（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６、３４６８６〜９４；ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．、２００５、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０、２０１７７〜８０）によって認識される病原体特異的分子パターン（ＰＡＭＰ）の識別によって正しいことが証明された。
【０００６】
ＴＯＬＬ様受容体（Ａｋｉｒａ ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ、２００４、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４、４９９〜５１１）によって認識され、しっかりと特徴付けられたＰＡＭＰに加えて、最近の研究では、宿主の免疫系は特定の糖鎖抗原を通して侵襲性病原体を認識できることが示されている。例えば、マンノース受容体は病原体の表面に発現された高マンノース型糖鎖を認識でき（Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ、１９９８、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０、５０〜５）、一方でＤｅｃｔｉｎ−１受容体は菌の細胞壁の多糖類の主要なバックボーンであるβ−グルカンに特異的に結合することができる（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４１３、３６〜７；Ｈｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０、８６９〜７６）。これらの結果は、病原体に関連付けられる糖鎖構造が、免疫細胞の自然免疫受容体によって認識される標的の１つであることを暗示している。
【０００７】
茸の一種であるマンネンタケとコルディセプスは中国で医療用途に服用される最も一般的な植物薬である。マンネンタケ（霊芝、レイシとも呼ばれる）から抽出される多糖は抗腫瘍剤及び免疫機能調節剤として伝統的な漢方薬で使用されている（Ｌｉｅｎ、１９９０、Ｐｒｏｇ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ ３４、３９５〜４２０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １０、１０５７〜６２；Ｓｈｉａｏ、２００３、Ｃｈｅｍ Ｒｅｃ ３、１７２〜８０）。コルディセプス（冬虫夏草、虫草菌）から抽出されたものは、アポトーシスホメオスタシスを変化させ、呼吸器、腎臓、心血管機能（Ｂｕｅｎｚ ｅｔ ａｌ．、２００５、Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ９６、１９〜２９；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊ Ａｌｔｅｒｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｅｄ ４、２８９〜３０３；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊ Ａｌｔｅｒｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｅｄ ４、４２９〜５７）、及び体全体のインスリン感性を向上することが示されている（Ｂａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ Ａｌｔｅｒｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｅｄ ８、３１５〜２３）。しかし、抽出物の多糖組成物は、多糖が異なるソースから、異なる菌株から、及び異なる成長条件下で抽出されたときさまざまである。
【０００８】
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、high-performance liquid chromatography）及びプロトン核磁気共鳴に依存した分析法を用いて霊芝と冬虫夏草から分離した多糖の組成物の調査が行われている（Ｈｅ ａｎｄ Ｓｅｌｅｅｎ、２００４、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ ６、２５３）。しかしながら、ＨＰＬＣクロマトグラムはガノデリン酸ＡとＣ（霊芝の２つの主要なトリテルペン）またはアデノシンの比較に基づいている。質量に基づいて抽出物が多糖の活性物質を含んでいるかを知ることは未だ困難である。
【０００９】
デングウイルスや日本脳炎ウイルスなどのフラビウイルスに感染したとき血漿タンパクの漏出及びその他悪影響を誘発する細胞受容体が同定される。ここで開示する融合タンパク質を使用して、フラビウイルスなどの病原体がグリカン結合を介して結合する受容体が決定される。受容体が決定されたら、特定の受容体に結合することの作用が解明可能となり、特定の症状を引き起こす受容体の標的化は、受容体への病原体の結合を阻害する物質によって標的化することができる。これに基づき、デングウイルスと日本脳炎ウイルスの場合、病原体がＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体に結合すると、ＴＮＦ−αが放出される。ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体をモノクロナール抗体で阻害することによって、ウイルスの排除を担うサイトカインの分泌に影響を与えることなくＴＮＦ−αの分泌を減少し、感染マウスの生存率をゼロから約５０％に高めることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙ、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ５４ Ｐｔ １、１〜１３
【非特許文献２】Ａｄｅｒｅｍ ａｎｄ Ｕｌｅｖｉｔｃｈ、２０００ Ｎａｔｕｒｅ ４０６、７８２〜７
【非特許文献３】Ａｋｉｒａ ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ、２００４、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４、４９９〜５１１
【非特許文献４】Ａｔｈｍａｎ ａｎｄ Ｐｈｉｌｐｏｔｔ、２００４、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７、２５〜３２
【非特許文献５】Ｃａｍｂｉ ａｎｄ Ｆｉｇｄｏｒ、２００３、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５、５３９〜４６
【非特許文献６】Ｄａｗｓ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１、５９４〜９
【非特許文献７】Ａｔｈｍａｎ ａｎｄ Ｐｈｉｌｐｏｔｔ、２００４、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７、２５〜３２
【非特許文献８】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６、３４６８６〜９４
【非特許文献９】ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．、２００５、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０、２０１７７〜８０
【非特許文献１０】Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ、１９９８、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０、５０〜５
【非特許文献１１】Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４１３、３６〜７
【非特許文献１２】Ｈｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０、８６９〜７６
【非特許文献１３】Ｌｉｅｎ、１９９０、Ｐｒｏｇ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ ３４、３９５〜４２０
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １０、１０５７〜６２；
【非特許文献１５】Ｓｈｉａｏ、２００３、Ｃｈｅｍ Ｒｅｃ ３、１７２〜８０
【非特許文献１６】Ｂｕｅｎｚ ｅｔ ａｌ．、２００５、Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ９６、１９〜２９
【非特許文献１７】Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊ Ａｌｔｅｒｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｅｄ ４、２８９〜３０３
【非特許文献１８】Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊ Ａｌｔｅｒｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｅｄ ４、４２９〜５７
【非特許文献１９】Ｂａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｊ Ａｌｔｅｒｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｅｄ ８、３１５〜２３
【非特許文献２０】Ｈｅ ａｎｄ Ｓｅｌｅｅｎ、２００４、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ ６、２５３
【発明の概要】
【００１１】
本発明の特徴に基づき、本発明は、受容体の結合領域と、基質に付着させるための領域を含む融合タンパク質の補体を取得する工程、病原体が融合タンパク質の補体の少なくとも１つの融合タンパク質の結合領域に結合するかを決定するため前記融合タンパク質と病原体を接触させる工程、前記病原体が前記融合タンパク質に結合されているかを検出する工程を含む方法を提供する。前記融合タンパク質の補体は、少なくとも１つの受容体の複数の異なる結合領域を表す。
【００１２】
本発明の特徴に基づき、本発明は、病原体に感受性のある細胞を取得する工程、少なくとも１つの細胞受容体遺伝子をノックダウンする工程、前記細胞と前記病原体を接触させる工程、前記細胞のサイトカイン分泌レベルを測定する工程を含むことを特徴とする方法を開示する。
【００１３】
本発明の特徴に基づき、本発明は、病原体によって示されるリガンドに結合する少なくとも１つの細胞受容体を同定する工程、前記病原体に感染した動物に対し、前記受容体への前記リガンドの結合を阻害して前記病原体の作用を修飾するため物質を投与する工程を含むことを特徴とする方法を開示する。
【００１４】
本発明の特徴に基づき、本発明は、病原体の動物における作用を修飾するため動物に感染している病原体の作用を修飾する物質の有効量を提供する工程を含ことを特徴とする方法を開示する。前記物質は、動物のネイティブ細胞の少なくとも１つの細胞受容体に誘導されて、前記受容体が病原体によって示されるリガンドに結合する。
【００１５】
本発明の特徴に基づき、本発明は、デングウイルスに感染した動物に有効量の抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体を提供する工程を含み、そのうち、前記抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体が、デングウイルス粒子によって示されるリガンドのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体への結合を阻止し、それによりＴＮＦ−αの分泌が阻害されることを特徴とする方法を開示する。
【００１６】
本発明の特徴に基づき、本発明は、日本脳炎ウイルスに感染した動物に有効量の抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体を提供する工程を含み、そのうち、前記抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体が、日本脳炎ウイルス粒子によって示されるリガンドのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体への結合を阻止し、それによりＴＮＦ−αの分泌が阻害されることを特徴とする方法を開示する。
【００１７】
本発明の特徴に基づき、本発明は、インターフェロンαの分泌に影響することなく、少なくとも１つの前炎症性サイトカインの分泌を少なくとも部分的に阻害する有効量の物質をデングウイルスに感染した動物に提供する工程を含むことを特徴とする方法を開示する。
【００１８】
本発明の特徴に基づき、本発明は、デングウイルス感染に感受性のあるマウスと、マウス体内のＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体をノックダウンするｓｈ−ＲＮＡ粒子を含むことを特徴とするマウスを開示する。
【００１９】
本発明の特徴に基づき、本発明は、動物の病原体感染の作用を修飾するため、動物の少なくとも１つの細胞受容体に対する有効量の抗体を含む医薬製剤を含む組成物を開示する。前記修飾は少なくとも動物細胞の前炎症性サイトカイン分泌の阻害を含み、かつウイルスの排除に作用するサイトカインの分泌に影響しない。
【００２０】
本発明の特徴に基づき、本発明は、動物のデングウイルス感染の作用を修飾するため、デングウイルスに感染した動物のＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体に対する有効量の抗体を含む医薬製剤を含む組成物を開示する。前記修飾が少なくとも動物細胞の前炎症性サイトカイン分泌の阻害を含み、かつウイルスの排除に作用するサイトカインの分泌に影響しない。
【００２１】
本特許もしくは出願書類は、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含んでいる。カラー図面を含めた本特許もしくは特許出願公報のコピーは、請求及び必要手数料の支払いにより、特許庁から提供される。本発明の前述の特徴及び目的は、以下の説明を添付図面と合わせて参照するとより完全に理解できる。図面中では、同一の符号は同一の部品を参照している。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ＲＴ−ＰＣＲで増幅され、さらに０．８％アガロース上で分画し、エチジウムブロミド染色によって可視化された自然免疫受容体のＤＮＡ断片を示す。
【図１Ｂ】発現した組み換え受容体を示す。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳動後のＦｃ融合タンパク質である。
【図２Ａ】ストレプトアビジン結合西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と接触した膜固定化したビオチン化ＧＬＰＳ Ｆ３のドットブロットを示す。
【図２Ｂ】Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ融合タンパク質と接触し、ヤギＨＲＰ標識抗ＩｇＧ１抗体でインキュベーションした、膜固定化非ビオチン化ＧＬＰＳ Ｆ３のドットブロットを示す。
【図２Ｃ】図２Ｂのブロットのドット密度分析を示す。
【図２Ｄ】Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃから膜固定化したＧＬＰＳ Ｆ３の結合上の競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）βグルカンのドット密度に対する影響を示す。
【図２Ｅ】Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ融合タンパク質と接触し、異なる量の競合多糖（βグルカン、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース）が存在する状況においてヤギＨＲＰ標識抗ＩｇＧ１抗体でインキュベーションした、固定化したＧＬＰＳ Ｆ３のドットブロットを示す。
【図３】それぞれがリストに記載のＩｇＧ１ Ｆｃにカップリングされた自然免疫受容体の細胞外ドメインを含む２７の異なる融合タンパク質と接触された、膜固定化したＧＬＰＳ Ｆ３及びＧＬＰＳ Ｆ３Ｃのドットブロットの半定量分析を示す。
【図４Ａ】図３のリストに記載された２７の融合タンパク質でプローブした、膜固定化したＧＬＰＳ Ｆ３及びＧＬＰＳ Ｆ３Ｃのドットブロットを示す。
【図４Ｂ】Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃ、ＫＣＲ．Ｆｃ、ＴＬＴ−２．Ｆｃの膜固定化したＧＬＰＳ Ｆ３への結合におけるＥＤＴＡの影響を示す。
【図４Ｃ】Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃ、ＫＣＲ．Ｆｃ、ＴＬＴ−２．Ｆｃ融合タンパク質でプローブした、膜固定化したβグルカンのドットブロットを示す。
【図５Ａ】Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃ、ＫＣＲ．Ｆｃ、ＴＬＴ−２．Ｆｃ融合タンパク質でプローブした多糖試料のドットブロットを示す。
【図５Ｂ】試料番号の識別情報と、半定量形式での図５Ａのドット密度を示す。
【図６Ａ】黄色反応性生物を検出するため、ペルオキシダーゼ標識アビジンアッセイを用い、ＯＤ４５０ｎｍで読み取った、マイクロタイタープレート上に塗布されたビオチン化ＧＬＰＳ−Ｆ３の量を示す。
【図６Ｂ】マイクロタイタープレート上に固定化されたＧＬＰＳ−Ｆ３に対する多様な受容体．Ｆｃ融合タンパク質の親和性をグラフ形式で示す。各受容体．Ｆｃ融合タンパク質の絶対結合（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）を左Ｙ軸に（ＯＤ４５０ｎｍ読み取りとして）表し、右Ｙ軸にＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃの結合と比較した相対結合を表す。
【図７】多糖マンナンとβグルカン、及び単糖Ｄ−マンノース（Ｍａｎ）、Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）、シアル酸の競合アッセイにおけるさまざまな受容体．Ｆｃ融合タンパク質のＧＬＰＳ−Ｆ３への結合率を示す。
【図８Ａ】ヒトＩｇＧ陰性対照と比較した受容体．Ｆｃ融合タンパク質のデングウイルスへの結合を示すグラフである。
【図８Ｂ】デングウイルスＥタンパク質に対する抗体でプローブした、３つの受容体．Ｆｃ融合タンパク質及びヒトＩｇＧ陰性対照でのデングウイルスの免疫複合体のウェスタンブロットを示す。
【図８Ｃ】ＥＤＴＡがデングウイルスのＤＣ−ＳＩＧＮ．Ｆｃ融合タンパク質への結合を阻害するが、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ融合タンパク質への結合は阻害しないことを示すグラフである。
【図８Ｄ】ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ融合タンパク質のＰＮＧａｓｅＦ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、熱（Ｈｅａｔ）、紫外線照射（ＵＶ）で処理されたデングウイルスへの結合、及び未処理デングウイルス（Ｎｏｎ）への結合を示す。
【図９Ａ】抗 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体を用いたフローサイトメトリーによる多様な免疫細胞タイプにおける ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を示す。 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現は、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのプロファイル（点線跡）が抗体アイソタイプコントロール（網掛け部分）に合致しないところに示される。
【図９Ｂ】抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を用いたフローサイトメトリーによる多様な免疫細胞タイプにおけるＤＣ−ＳＩＧＮの発現を示す。ＤＣ−ＳＩＧＮの発現は、ＤＣ−ＳＩＧＮのプロファイル（点線跡）が抗体アイソタイプコントロール（網掛け部分）に合致しないところに示される。
【図１０Ａ】対応する抗体アイソタイプコントロール（網掛け部分）と比較し、生（ｌｉｖｅ）またはＵＶ照射（ＵＶ−ＤＶ）デングウイルスと接触したＣＤ１４＋マクロファージにおける抗ＮＳ３抗体を用いたＮＳ３タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１０Ｂ】異なる感染多重度（ＭＯＩ）でデングウイルスに感染した、またはＵＶ照射デングウイルスに感染した、ＣＤ１４＋マクロファージの細胞外デングウイルスの力価を時間経過と共に示すグラフである。
【図１０Ｃ】異なるＭＯＩでデングウイルスに感染したＣＤ１４＋マクロファージにおけるトータルＤＡＰ１２及びリン酸化ＤＡＰ１２を示す免疫ブロットを示す。
【図１０Ｄ】ＭＯＩ＝５での生（ｌｉｖｅ）デングウイルスまたはＵＶ照射デングウイルスでの感染後の異なる時間における、デングウイルスに感染したＣＤ１４＋マクロファージにおけるトータルＤＡＰ１２及びリン酸化ＤＡＰ１２を示す免疫ブロットを示す。
【図１１】デングウイルス感染前にｐＬＬ３．７ベクター（コントロール）または ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ−ｓｈＲＮＡでエレクトロポレーションされたＣＤ１４＋マクロファージにおけるトータルＤＡＰ１２及びリン酸化ＤＡＰ１２を示す免疫ブロットを示す。
【図１２Ａ】特定のＭＯＩの生（ｌｉｖｅ）またはＵＶ照射デングウイルスにＣＤ１４＋マクロファージが感染した６時間後のＴＮＦ−α の分泌を示す。
【図１２Ｂ】特定のＭＯＩの生（ｌｉｖｅ）またはＵＶ照射デングウイルスにＣＤ１４＋マクロファージが感染した１２時間後のＴＮＦ−α の分泌を示す。
【図１２Ｃ】ＣＤ１４＋マクロファージの感染後のＴＮＦ−αの分泌の時間変化測定値を示す。
【図１３Ａ】ＤＣ−ＳＩＧＮｓｈ−ＲＮＡまたは ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａｓｈ−ＲＮＡ、あるいはベクターコントロール（ｐＷＴＳＩ及びｐＬＬ３．７）で形質転換されたＣＤ１４＋マクロファージにおける、ウェスタンブロットによるＤＣ−ＳＩＧＮ及び ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を示す。
【図１３Ｂ】デングウイルス感染前に、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈＲＮＡ、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ−ｓｈＲＮＡ、またはｐＬＬ３．７ベクターコントロールでエレクトロポレーションされたＣＤ１４＋マクロファージにおける、（抗ＮＳ３抗体を用いた）ＮＳ３発現のフローサイトメトリー分析を示す。網掛け部分はＮＳ３抗体のアイソタイプコントロールである。
【図１３Ｃ】ｔ＝０でデングウイルスに感染する前のＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈＲＮＡまたは ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ−ｓｈＲＮＡ、ベクターコントロールでエレクトロポレーションされたＣＤ１４＋マクロファージの上清中のウイルス力価の時間経過解析を示す。
【図１４Ａ】ｔ＝０でデングウイルスに感染する前のＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈＲＮＡまたは ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ−ｓｈＲＮＡ、ベクターコントロールでエレクトロポレーションされたＣＤ１４＋マクロファージの多様なサイトカインの分泌の時間経過解析を示す。
【図１４Ｂ】同一条件下でのサイトカインＩＦＮ−αの時間経過解析を示す。
【図１５】デングウイルスに感染し、特定のモノクロナール抗体で ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに対して特定の濃度で処理されたＣＤ１４＋マクロファージによって培養上清に分泌されたＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ測定値を示す。
【図１６ａ】多様な受容体．Ｆｃ融合タンパク質のデングウイルスへの結合を示すグラフである。
【図１６ｂ】デングウイルスＥタンパク質に対する抗体でプローブした、３つの受容体．Ｆｃ融合タンパク質とヒトＩｇＧ 陰性対照でのデングウイルスの免疫複合体のウェスタンブロットを示す。
【図１６ｃ】ＥＤＴＡがデングウイルスのＤＣ−ＳＩＧＮ．Ｆｃ融合タンパク質への結合を阻害するが、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ融合タンパク質への結合は阻害しないことを示すグラフである。
【図１６ｄ】デングウイルスのヒト２９３Ｔ細胞への結合の増加、及びＤＣ−ＳＩＧＮ．ＦｃとＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ融合タンパク質への結合を示すグラフである。
【図１６ｅ】多様な糖の添加がデングウイルスのＤＣ−ＳＩＧＮ．Ｆｃ融合タンパク質への結合を阻害することを示すグラフである。
【図１６ｆ】デングウイルスのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ融合タンパク質への結合におけるＰＮＧａｓｅＦの作用を示すグラフである。
【図１７ａ】ヒトＰＢＭＣにおけるＤＣ−ＳＩＧＮの発現パターンを示す。
【図１７ｂ】ヒトＰＢＭＣにおけるＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現パターンを示す。
【図１８ａ】リン酸化チロシンとＤＡＰ１２に対する抗体を用いた、ヒトマクロファージにおけるデングウイルス誘導ＤＡＰ１２リン酸化（感染２時間後）を示す免疫ブロットを示す。
【図１８ｂ】デングウイルス及び紫外線不活化デングウイルスによって誘導されたＤＡＰ１２リン酸化のキネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示す免疫ブロットを示す。
【図１８ｃ】ｓｈＲＮＡのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ及びＤＣ−ＳＩＧＮ．Ｆｃ融合タンパク質発現ノックダウン、及びデングウイルス（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）介在性ＤＡＰ１２リン酸化阻害の能力を示す免疫ブロットを示す。
【図１８ｄ】マクロファージにおけるデングウイルスの侵入と複製に対するｓｈＲＮＡの作用を示す。
【図１８ｅ】非構造タンパク質ＮＳ３の発現に対する抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂ、抗ＤＣＳＩＧＮ ｍＡｂ及びマウスＩｇＧの作用を示す。
【図１８ｆ】感染したマクロファージのデングウイルス力価に対するｓｈＲＮＡの作用の時間経過解析を示すグラフである。
【図１９ａ】マクロファージによるデングウイルス及び紫外線不活化デングウイルス誘導ＴＮＦ−α分泌の用量依存性を示すグラフである。
【図１９ｂ】デングウイルス感染（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）後のＴＮＦ−α発現のキネティクスを示すグラフである。
【図１９ｃ】デングウイルス感染（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）マクロファージからのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＭＩＰ１−α、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−αの分泌に対するＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ及びＤＣ−ＳＩＧＮ ｓｈ−ＲＮＡの作用を示すグラフである。
【図１９ｄ】デングウイルス誘導ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−α分泌の多様な分泌経路に対する特定のｓｈＲＮＡを用いたノックダウン実験の作用を示すグラフである。
【図１９ｅ】拮抗的抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂによるデングウイルス血清型１〜４に応答したＴＮＦ−α分泌の阻害を示すグラフである。Ｍ．Ｒ． ｍＡｂ（抗マンノース受容体ｍＡｂ、ｍＩｇＧ１）及びマウスＩｇＭ（ｍＩｇＭ）が陰性対照として用いられた。
【図２０ａ】デングウイルス、デングウイルス／抗Ｅ、デングウイルス／抗ｐｒＭ免疫複合体に感染したマクロファージのＮＳ３発現を示す。
【図２０ｂ】ＤＶ２に感染したマクロファージのＴＮＦ−α 及びＩＦＮ−α分泌のレベルを示す。
【図２０ｃ】抗ｐｒＭ／デングウイルス、抗Ｅ／デングウイルス免疫複合体に感染したマクロファージのＴＮＦ−α及びＩＦＮ−α分泌のレベルを示す。
【図２１ａ】上清のＨＭＥＣ−１単層の透過性及びＴＮＦ−αレベルの時間経過解析を示すグラフである。
【図２１ｂ】内皮単層の透過性に対するＴＮＦＲ２．Ｆｃ及び抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの阻害効果を示すグラフである。
【図２２ａ】デングウイルスのヒト及びマウスＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ融合タンパク質との結合親和性を示すグラフである。
【図２２ｂ】マウス脾細胞におけるｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を示す。
【図２２ｃ】マウス骨髄（ＢＭ）由来マクロファージ及びマウスのマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７におけるｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を表す。
【図２３ａ】デングウイルスのマウスのマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７との結合からのＴＮＦ−α分泌と、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを安定的に発現しているＲａｗ２６４．７細胞の比較を示すグラフである。
【図２３ｂ】ｍＡｂが存在する状況においてＤＶ２でインキュベーションされた、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを安定的に発現しているＲａｗ２６４.７細胞によるＴＮＦ−αの分泌を示すグラフである。
【図２３ｃ】抗ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂ（３Ｄ２Ｈ６及び１０Ｄ７Ｈ３）による用量依存的なＤＶ２誘導ＴＮＦ−α分泌の阻害を示すグラフである。
【図２４】ＤＶ２／ＰＬ０４６株及びＤＶ２／ＮＧＣ−Ｃ株でチャレンジしたＳＴＡＴ−／−マウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。
【図２５ａ】デングウイルスをチャレンジしたＳＴＡＴ１−／−マウスの皮下及び腸出血に向けて、マウスＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに対して作成した、ｍＡｂ ３Ｄ２Ｈ６及び１０Ｄ７Ｈ３の作用を示す。
【図２５ｂ】デングウイルスをチャレンジしたＳＴＡＴ１−／−マウスの重要臓器への血漿タンパク漏出に向けた、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（３Ｄ２Ｈ６及び１０Ｄ７Ｈ３）に対するｍＡｂの作用を示す。
【図２５ｃ】臓器からのエバンスブルー抽出による重要臓器の血管透過性を示すグラフである。
【図２５ｄ】抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂまたはＴＮＦＲ２．Ｆｃが存在する、または存在しない状況において、デングウイルスをチャレンジしたＳＴＡＴ１−／−マウスのＴＮＦ−αとＩＰ−１０の血漿レベル、及びウイルス力価を示す。
【図２５ｅ】拮抗的抗マウス ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂまたはＴＮＦＲ２．Ｆｃが存在する状況において、ＤＶ２をチャレンジしたＳＴＡＴ１欠損マウスの生存率を示すグラフである。
【図２６ａ】図２６はＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＪＥＶ介在性 ＤＡＰ１２リン酸化及びヒトマクロファージからのＴＮＦ−α分泌に関与していることを示す。ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ（１μｇ）とＪＥＶ及びデングウイルス（ＤＶ）（５×１０^６ＰＦＵ）の相互作用をＥＬＩＳＡでそれぞれ検出した。ＤＶはヒトＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（１８８アミノ酸長）と相互作用するが、選択的スプライシングされた形式ｓＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（ａａ４３〜６５が削除される）とはしない。対照的に、ＪＥＶはｓＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのみと相互作用し、全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａとはしない。
【図２６ｂ】デングウイルスはヒトマクロファージにＤＡＰ１２リン酸化（感染２時間後に）を誘導する。ＤＶ感染マクロファージ中のＤＡＰ１２は抗ＤＡＰ１２ｍＡｂによって沈降され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分画後にニトロセルロースペーパーにブロットされ、さらにリン酸化チロシン及びＤＡＰ１２に対する抗体とそれぞれ培養された。ＪＥＶ誘導ＤＡＰ１２リン酸化（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）はｐＬＬ３．７／ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａによって阻害される。
【図２６ｃ】ＪＥＶ感染（左）に応答したヒトマクロファージからのＴＮＦ−α分泌のキネティクスを示す。ＪＥＶ誘導ＴＮＦ−α分泌はｐＬＬ３.５／ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂ（右）によって阻害される。データは３回の独立実験の平均±標準偏差で表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の以下の詳細な説明では、本発明を実施することができる特定の実施形態を図によって示す添付の図面を参照し、以下の図面では同じ参照番号は同じ構成部品を指す。する。これらの実施形態は当業者 が本発明を実施できるように十分に詳細に説明され、他の実施形態を利用することができること、ならびに本発明の範囲を逸脱せずに論理的、機械的、生物学的、電気的、機能的、その他変更を加えることができることを理解されたい。したがって以下の説明は限定的なものととられるべきでなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。本明細書で使用される用語「または」（「ｏｒ」）は、論理和として定義され、排他的論理和をとることが明示されているか、「ｘまたは」（「ｘｏｒ」）と記載されていない限り、排他的論理和を示すものではないことを理解する必要がある。
【００２４】
一実施形態において、本発明は自然免疫受容体の糖鎖認識ドメインと異種ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。ここで言う自然免疫受容体とは次を意味する。
１）ＣＤ６６ファミリー（ＣＥＡＣＡＭ１及びＰＳＧ１）、ＳＩＧＬＥＣファミリー、ＮＧＫ７、ＦＣＧＲＴ、ＩＬＴ／ＬＩＬＲＡ／ＬＩＬＲＢ（ＣＤ８５）ファミリー、ＬＡＩＲファミリー、ＫＩＲ（ＣＤ１５８）ファミリー（ＫＩＲ２ＤＬサブファミリー、ＫＩＲ２ＤＳサブファミリー、ＫＩＲ３ＤＬサブファミリーを含む）、ＦＣＡＲ（ＣＤ８９）、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＧＰＶＩ（ＧＰ６）を含むが、これらに限定されない、ヒト第１９染色体上の白血球受容体複合体（ＬＲＣ）及びＬＲＣ関連遺伝子内の遺伝子によってコードされる受容体、及び
２）ＭＡＦＡ−Ｌ（ＫＬＲＧ１）、Ａ２Ｍ、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ（ＫＬＲＢ１）、ＬＬｔ１（ＣＬＥＣ２Ｄ）、ＣＤ６９（ＣＬＥＣ２Ｃ）、ＫＬＲＦ１、ＡＩＣＬ（ＣＬＥＣ２Ｂ）、ＣＬＥＣ−２（ＣＬＥＣＦＳ２）、Ｌｏｘ−１（ＯＬＲ１）、ＣＤ９４（ＫＬＲＤ１）、ＮＫＧ２−Ｄ（ＫＬＲＫ１）、ＮＫＧ２−Ｆ（ＫＬＲＣ４）、ＮＫＧ２−Ｅ（ＫＬＲＣ３）、ＮＫＧ２−Ｃ（ＫＬＲＣ２）、ＮＫＧ２−Ａ（ＫＬＲＣ１）、Ｌｙ４９Ｌ（ＫＬＲＡ１）、ＰＲＢ３を含むが、これらに限定されない、ヒト第１２染色体上のナチュラルキラー受容体複合体（ＮＫＣ）内の遺伝子によってコードされる受容体、及び
３）ヒト染色体上のヒト及びマウスＣ型レクチン（ＣＬＥＣ）ファミリー遺伝子すべて、ヒトシアル酸結合性Ｉｇ様（ＳＩＧＬＥＣ）遺伝子すべて、骨髄細胞上に発現するヒトトリガー受容体（ＴＲＥＭ）遺伝子すべて、ヒトＴＲＥＭ様（ＴＲＥＭＬ／ＴＬＴ）遺伝子すべて、ヒトＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）遺伝子すべて、ヒトＦｃ受容体様（ＦＣＲＬ１からＦＣＬＲ６、及びＦＣＬＲＭ１とＦＣＬＲＭ２を含む）遺伝子すべて。
【００２５】
ヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ、Human Genome Organization）検索エンジンウェブサイトを使って本発明の方法に用いることができる可能性のある、これらグループ内の別の遺伝子が見つかる場合がある。さらに、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００１ Ｖｏｌ． １８１：２０〜３８の遺伝子座の説明も全開示が参照としてここに組み込まれる。
【００２６】
非ヒト種由来の前述の遺伝子のいずれかのオルソログも本発明の方法において用いることができる。
【００２７】
本発明での使用が考えられるＣ型レクチン遺伝子は、次のヒト遺伝子を含むが、これらに限定されない：ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２（ＣＬＥＣ４Ｈ２）、ＣＤ２０７（ＣＬＥＣ４Ｋ／ランゲリン）、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ／ＣＬＥＣ４Ｌ）、ＣＤ３０２（ＣＬＥＣ１３Ａ）、ＣＬＥＣ１Ａ、ＣＬＥＣ１Ｂ（ＣＬＥＣ−２）、ＣＬＥＣ２Ａ、ＣＬＥＣ２Ｂ、ＣＤ６９、ＣＬＥＣ２Ｄ、ＣＬＥＣ２Ｌ、ＣＬＥＣ３Ａ、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＣＬＥＣ３Ｏ、ＣＬＥＣ３Ｑ、ＣＬＥＣ４Ａ、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＣＬＥＣ４Ｄ（ＣＬＥＣ−６）、ＣＬＥＣ４Ｅ、ＣＬＥＣ４Ｆ（ＫＣＬＲ）、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＣＬＥＣ４Ｍ（ＤＣ−ＳＩＧＮＲ）、ＣＤ２０９、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ、ＣＬＥＣ６Ａ（Ｄｅｃｔｉｎ−２）、ＣＬＥＣ７Ａ（Ｄｅｃｔｉｎ−１）、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＦＣＥＲ２、ＫＬＲＢ１、ＫＬＲＦ１、ＬＹ７５（ＤＥＣ２０５）、ＭＲＣ１、ＭＲＣ１Ｌ１、ＭＲＣ２（Ｅｎｄｏ１８０）、ＯＬＲ１、ＰＬＡ２Ｒ１、ＤＣＡＬ１、ＣＯＬＥＣ１０。これらいずれかの遺伝子の相同体、及びマウスやラットなどその他動物種由来のオルソログも考えられる。相同体及びオルソログは列挙されたＣ型レクチン遺伝子のいずれかと５０％、７０％、８０％、８０．６％、８３％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％同じとすることができる。具体的に考えられるオルソログはマウスのＫｕｐｆｆｅｒ細胞受容体（ｍＫＣＲ）遺伝子（ヒトＣＬＥＣ４Ｆに相同）である。
【００２８】
本発明での使用が考えられるＴＲＥＭ遺伝子及びＴＲＥＭＬ遺伝子は、次のヒト遺伝子を含むが、これらに限定されない：ＣＤ３００抗原様ファミリーメンバーＢ（ＣＤ３００ＬＢ）、ＣＤ３００抗原様ファミリーメンバーＧ（ＣＤ３００ＬＧ）、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＥＭＬ１（ＴＬＴ１）、ＴＲＥＭＬ２（ＴＬＴ２）、ＴＲＥＭＬ３（ＴＬＴ３）、ＴＲＥＭＬ４（ＴＬＴ４）。これらいずれかの遺伝子の相同体、及びマウスやラットなどその他動物種由来のオルソログも考えられる。相同体及びオルソログはこれら列挙された遺伝子のいずれかと５０％、７０％、８０％、８０．６％、８３％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％同じとすることができる。具体的に考えられるオルソログはマウス由来のｍＴＲＥＭ１、ｍＴＲＥＭ２、ｍＴＬＴ１、ｍＴＬＴ４を含む。
【００２９】
本発明での使用が考えられるＴＬＲ遺伝子は次のヒト遺伝子を含むが、これらに限定されない：ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、ＴＬＲ１３。これらいずれかの遺伝子の相同体、及びマウスやラットなどその他動物種由来のオルソログも考えられる。相同体及びオルソログは列挙されたＴＬＲ遺伝子のいずれかと５０％、７０％、８０％、８０．６％、８３％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％同じとすることができる。
【００３０】
本発明での使用が考えられるＳＩＧＬＥＣ遺伝子は次のヒト遺伝子を含むが、これらに限定されない：ＣＤ２２、ＣＤ３３、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ＳＩＧＬＥＣ５、ＳＩＧＬＥＣ６、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ８、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＧＬＥＣ１０、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＳＩＧＬＥＣ１２、ＳＩＧＬＥＣ１３、シアロアドヘシン（ＳＮ）。これらいずれかの遺伝子の相同体、及びマウスやラットなどその他動物種由来のオルソログも考えられる。相同体及びオルソログは列挙されたＳＩＧＬＥＣ遺伝子のいずれかと５０％、７０％、８０％、８０．６％、８３％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％同じとすることができる。
【００３１】
本発明での使用に適したその他自然免疫受容体は以下の実施形態において挙げるものを含む。
【００３２】
前記融合タンパク質は、糖鎖認識ドメインを含む、自然免疫受容体の全細胞外ドメイン、または糖鎖認識ドメインを含む、細胞外ドメインの一部、または糖鎖認識ドメインのみを含むことができる。
【００３３】
前記異種ポリペプチドは、体内または体外のいずれにおいても、糖鎖ドメインがそのコグネイトの特定の糖鎖に結合することを前記異種ポリペプチドが阻害しないように、自然免疫受容体の糖鎖認識ドメインが融合可能な任意のポリペプチドを含むことができる。好ましくは、前記異種ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２a、ＩｇＧ２b、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡａ、ＩｇＡ２などの免疫グロブリン、またはほかの動物種由来の免疫グロブリンとする。好ましくは、例えば、ＩｇＧのＦｃフラグメントなど免疫グロブリンのフラグメントを異種ポリペプチドとして用いる。好ましい実施形態において、異種ポリペプチドはヒトＦｃ受容体に結合しない免疫グロブリンの異型である。そのような異型は本技術分野で公知であり、例えばＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３３１Ｓといった変異体を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ異型を用いることができる。
【００３４】
前記異種ポリペプチドはさらに、前記融合ポリペプチドを固体支持体上に固定化する、または複雑な混合物から精製することができる１つ以上の機能性ドメインを含むことができる。具体例を挙げると、前記異種ポリペプチドはＨｉｓ６タグを含み、本技術分野で公知の方法で融合タンパク質のＮｉ−ＮＴＡ固体支持体への付着を可能にすることができる。さらに具体例を挙げると、前記異種ポリペプチドは、得られる融合タンパク質が、例えばグルタチオンビーズまたはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸収されるように、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼドメインを含むことができる。
【００３５】
前記異種ポリペプチドはまた、１つ以上のビオチン、またはビオチン誘導体を含むことができる。この方法で、融合タンパク質をストレプトアビジン結合固体支持体に固定化する、またはストレプトアビジン結合酵素を融合タンパク質に結合させることができる。
【００３６】
前記融合タンパク質は選択的に、さらに異種ポリペプチドと前記自然免疫受容体の糖鎖認識ドメイン間のリンカーを含むことができる。前記リンカーはペプチドリンカー、またはポリエチレングリコールなどの非ペプチド性リンカーとすることができる。
【００３７】
前記糖鎖認識ドメインは、融合タンパク質において前記異種ポリペプチドに対してＣ−末端、または前記異種ポリペプチドに対してＮ−末端とすることができる。
【００３８】
本発明の前記融合タンパク質は、本技術分野で公知の任意のタンパク質の生産方法で作製することができる。好ましくは、前記融合タンパク質は本技術分野で公知のＤＮＡ組み換え技術及びタンパク質発現技術を用いて作製する。例えば、自然免疫受容体の糖鎖認識ドメインをコードするＤＮＡは、その特定の自然免疫受容体の糖鎖認識ドメインに特異的なプライマーを用いたｍＲＮＡの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって取得することができる。得られるＤＮＡはその後異種ポリペプチド配列をコードするＤＮＡとインフレームで発現ベクターにクローニングすることができる。本発明において有用な発現ベクターは一般に、複製起点、５’（すなわち、上流）に位置するプロモーターとそれに続く融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、転写終結配列および残りのベクターからなる。前記発現ベクターはまた、本技術分野で公知の他のＤＮＡ配列、例えば、発現生成物に安定性を付与する安定化リーダー配列（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｌｅａｄｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、発現生成物を分泌させる分泌リーダー配列（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、融合タンパク質の発現の修飾または誘導を可能にする配列を含むことができる。 前記発現ベクターはまた、バキュロウイルス発現系など本技術分野で公知のウイルス発現系を用いて融合タンパク質を発現させることができるウイルス配列も含むことができる。前記発現ベクターは微生物細胞、イースト細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞などの宿主細胞に導入することができる。前記発現ベクターｎａｋｅｄ ＤＮＡとして、またはウイルス（バキュロウイルスなど）内に封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）して細胞に導入することができる。前記発現ベクターは宿主細胞内に保持するか、宿主細胞ゲノムに組み込むこともできる。
【００３９】
好ましくは、前記発現ベクターは、融合タンパク質に分泌リーダー配列を追加し、それにより前記融合タンパク質を宿主細胞周囲の培地（ｍｅｄｉｕｍ）に分泌させることに導くＤＮＡ配列を含む。融合タンパク質はその後本技術分野で公知の方法を用いて培地から精製することができる。具体例を挙げると、融合タンパク質が異種ポリペプチドとしてＩｇＧを含む場合、融合タンパク質に結合するためにプロテインＡカラムを用い、融合タンパク質を周囲の培地内のほかのタンパク質から分離することができる。
【００４０】
また、融合タンパク質は、アフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅ）発現系など、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を用いて、その融合タンパク質をコードするｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によって作製することもできる。
【００４１】
一実施形態において、前記融合タンパク質は個別に作製し、その後本技術分野で公知の化学技法を用いて相互に結合することもできる。例えば、前記糖鎖認識ドメインと前記異種ポリペプチドを個別に作製し、その後グルタルアルデヒドを用いて相互に結合することができる。
【００４２】
融合タンパク質の作製後、前記融合タンパク質は、蛍光色素、放射標識、酵素、酵素基質、色素、化学発光物質、磁性粒子、量子ドット、または直接的または間接的に、検出可能な信号を生成する任意のその他部分（ｍｏｉｅｔｙ）など、検出可能な標識で標識することができる。そのようなタンパク質に対する検出可能な標識の結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の多くの方法が本技術分野で公知である。具体例のみとして挙げると、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化色素、最も好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化蛍光色素を、融合タンパク質上での第一級アミンとの反応によって融合タンパク質に結合させることができる。
【００４３】
一部の実施形態において、前記融合タンパク質は本技術分野で公知の方法を用い、前記融合タンパク質が１つ以上のビオチンまたは１つ以上のビオチン誘導体を含むように、ビオチン化される。これにより、前記融合タンパク質は酵素−ストレプトアビジン結合などのストレプトアビジン検出可能部分結合（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｄｅｔｅｃａｂｌｅ ｍｏｉｅｔｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に付着させることができる。
【００４４】
ある一連の実施形態において、本発明の融合タンパク質は多糖類を含む組成物に特定の糖鎖成分が存在するか否かを判定するために用いられる。この方法は、多糖類を多糖類の特定の糖鎖成分に結合する融合タンパク質に接触させ、その後前記融合タンパク質が組成物において多糖類に結合しているか否かを判定する工程を含む。例えば、ＣＬＥＣ７Ａ（Ｄｅｃｔｉｎ−１とも呼ばれる）の糖鎖認識ドメインは、β-１、３−Ｄ−グリカンと相互作用できることが知られている （Ｂｒｏｗｎ、Ｇ．Ｄ．及びＧｏｒｄｏｎ，Ｓ．、２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４１３、３６〜７、全開示が参照によってここに組み込まれる）。したがって、ＣＬＥＣ７Ａの糖鎖認識ドメインを含む融合タンパク質の多糖組成物への結合は、多糖組成物がβ-１、３グルカンを含むことを示す。同様に、げっ歯類Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞受容体（ＫＣＲ、ヒトＣＬＥＣ４Ｆに相同）はＤ−ガラクトース及びＮ−アセチルガラクトサミンに高い親和性を有し、Ｄ−ガラクトースとＤ−フコース末端糖タンパク質を血漿から除去できるため（Ｆａｄｄｅｎ，Ａ．Ｊ．，Ｈｏｌｔ，Ｏ．Ｊ．ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｋ．（２００３）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １３、５２９〜３７を参照、全開示が参照によってここに組み込まれる）、ＫＣＲの糖鎖認識ドメインを含む融合タンパク質の多糖組成物への結合は、前記多糖組成物がＤ−ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンまたはＤ−ガラクトース末端糖タンパク質またはＤ−フコース末端糖タンパク質を含むことを示す。さらに、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＬＥＣ４Ｌとも呼ばれる）及びＣＬＥＣ４Ｍ（ＤＣ−ＳＩＧＮＲ及びＬ−ＳＩＧＮ）は共にＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２Ａｓｎ糖ペプチド,に結合できるが、ＣＤ２０９のみが末端フコース残基を有するグリカンに結合でき、ＣＬＥＣ４Ｍはできない（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１、５９１〜８参照）。したがって、ＣＤ２０９及びＣＬＥＣ４Ｍの融合タンパク質はこれら糖質成分を含む多糖組成物間を区別することができる。したがって、本発明の方法及び試薬は多糖組成物の糖質成分の同一性及びそれら糖質成分の相対量を判定する、つまり多糖組成物の「フィンガープリンティング」に用いることができる。例えば、本発明の方法及び試薬は、免疫調節作用を有する多糖組成物の糖質成分を判定するために用いることができる。
【００４５】
加えて、融合タンパク質の糖鎖認識ドメインが由来する自然免疫受容体を発現する細胞の同一性が分かっている場合、本発明の開示するアッセイは、調べている多糖類に結合する体内の細胞の同一性を明らかにする。そのような知識は、例えば、特定の多糖組成物（霊芝から分離された多糖など）がその多糖類に接触する生物に対して有益な、または有害な影響を及ぼすメカニズムを明らかにするために役立つ。この実施形態において、糖鎖認識ドメインによって結合される糖質成分の同一性を知る必要はない。
【００４６】
本発明の融合タンパク質のそのコグネイト糖質成分への結合は、多糖類を含む組成物を固体支持体に固定化した後、前記固体支持体を融合タンパク質と接触させることで実行することができる。融合タンパク質の結合は、固体支持体の表面上における融合タンパク質の有無、例えば、固体支持体の表面上の異種ポリペプチドの有無、または固体支持体の表面上の糖鎖認識ドメインの有無を検出することで検出できる。例えば、異種ポリペプチドが蛍光色素に結合され（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、その後洗浄後、固体支持体の表面上に前記蛍光色素が存在する場合、これは融合タンパク質の存在を示し、さらに融合タンパク質の糖鎖認識ドメインによって認識される特定の糖鎖成分を含む多糖類の存在を示す。
【００４７】
ここで言う「固体支持体」とは、共有結合または非共有結合のいずれかを通して分子が付着する任意の表面として定義される。これは、メンブレン（例えば、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）メンブレンなど）、プラスチック（例えば、マイクロタイタープレートなど）、常磁性ビーズ、荷電性紙（ｃｈａｒｇｅｄ ｐａｐｅｒ）、ナイロン、ラングミュア・ブロジェット膜、官能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴＦＥ、ポリスチレン、ガリウムヒ素、金、銀などを含むが、これらに限定されない。本技術分野で公知のその表面に組み込まれたアミノ、カルボキシル、チオール、ヒドロキシルなどの官能基を持つことができるその他あらゆる材料もまた検討可能である。これは、球面、溝付表面、円柱面（柱体など）の任意のトポロジの表面を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
多糖を含む組成物（ここでは「多糖組成物」とも言う）は、制限なく、例えば、糖タンパク質（プロテオグリカンを含む）、糖脂質、ペプチドグリカン、微生物細胞壁、ウイルス粒子、麹菌細胞壁を含む多糖類を含む任意の組成物とすることができる。別の実施形態において、多糖類を含む組成物は溶液中で自由な多糖類、例えば、タンパク質または脂質に結合していない多糖類である。ここで「多糖類」とは２つ以上の単糖類を含む糖質分子を指す。
【００４９】
多糖類を含む組成物の固体支持体上での固定化は、例えば、組成物中の多糖をビオチン化した後、ストレプトアビジン結合固体支持体上で固定化することにより、達成可能である。さらに、多糖は例えばメタノール活性化ＰＶＤＦメンブレンなどの上に固定化させることができる。本発明の方法はＰＶＤＦメンブレン上に固定化された多糖類のドットを用いた「ドットブロット」形式で実行できることを特に意図する。
【００５０】
一部の実施形態において、融合タンパク質の固定化された多糖類への結合は、第二試薬を融合タンパク質に、好ましくは異種ポリペプチドに結合した後、第二試薬の有無を検出することによって検出される。例えば、ビオチン化融合タンパク質はストレプトアビジン結合酵素に付着することができ、この酵素の存在は検出可能な生成物を生み出す基質を加えることで検出される。非ビオチン化融合タンパク質は、例えば、二次抗体が酵素に結合される、異種ポリペプチド（異種ポリペプチドがＩｇＧ、またはＩｇＧ Ｆｃの場合抗ＩｇＧ 抗体など）に結合する抗体を用いて検出することができる。例えば、酵素が西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である場合、融合タンパク質結合の検出は本技術分野で公知の技法であるＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いて実施することができる。また第二試薬は、あるいは選択的に、蛍光色素や放射性同位元素などの検出可能な標識に結合させることもできる。本発明の融合タンパク質の固体支持体への結合の検出に用いることができるその他多くの技法が本技術分野で公知である。
【００５１】
前述のアッセイは、多重アレイ形式で実施できることを特に考慮する。例えば、固体支持体は複数の異なる組成物を結合させることができる複数の空間的に不連続のアドレス（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ａｄｄｒｅｓｓ）に区分してもよい。その後固体支持体は融合タンパク質と接触され、融合タンパク質の結合が検出される。この方法で、融合タンパク質の糖鎖認識ドメインによって結合された特定の糖質成分を含む固定化された多糖組成物がある場合、それを判定することができる。
【００５２】
別の実施形態において、単一の組成物が複数の空間的に不連続のアドレスに区分された固体支持体上に固定化される。その後各アドレスが異なる融合タンパク質と接触され、各異なる融合タンパク質は異なる糖鎖認識ドメインを含む。非特異的に結合した物質を除去するための洗浄後、上述の方法で融合タンパク質の結合を検出することができる。検出された各結合反応の空間的アドレスは、結合した融合タンパク質のアイデンティティを表す。この方法で、組成物は同時に複数の異なる融合タンパク質でプローブすることができる。この実施形態において、各融合タンパク質は同一の異種ポリペプチドを含むことができ、それにより単一の第二試薬で同時に各アドレスで結合を検出することがえきる。例えば、各融合タンパク質がＩｇＧ Ｆｃを異種ポリペプチドとして含む場合、抗ＩｇＧ 抗体、またはタンパク質Ａ、またはタンパク質Ｇのいずれかを使用して融合タンパク質の結合を検出することができる。
【００５３】
本発明の融合タンパク質及び方法は、マンネンタケ（霊芝）、冬虫夏草、シイタケ、及び植物Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｈｕｏｓｈａｎｅｎｓｅから分離された多糖類含有フラクションなどの生薬から取得される多糖組成物を含むが、これに限定されない、多糖を含む任意の組成物の「フィンガープリンティング」に用いることができる。特に、ここで用いられる方法は、霊芝多糖類のＦ３多糖類フラクションの糖質成分を判定するために用いられることを意図する（Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １０、１０５７〜６２；Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ（２００４）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １２、５５９５〜６０１；Ｃｈｉｅｎ， ｅｔ ａｌ（２００４） Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １２、５６０３〜９;Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３、５９８９〜９９を参照、それぞれの全開示が参照によってここに組み込まれる）。
【００５４】
本発明の方法は、多数の異なる多糖組成物を含む複雑な混合物の「フィンガープリンティング」に用いることができ、また、例えば単一の糖タンパク質や単一の多糖類など、単一の多糖類の種のみを含む製剤に用いることができる。
【００５５】
糖鎖認識ドメインが由来する自然免疫受容体を発現する細胞のアイデンティティが分かっている場合、前述のアッセイは多糖組成物を体内に導入することで体内のどの細胞が多糖類に結合するかを示すことができる。その後、同定された自然免疫受容体の働きを修飾する薬剤（ａｇｅｎｔ）を取得することが可能となる。例えば、多糖類の構造を模擬する薬剤、または多糖類の自然免疫受容体との相互作用を促進する薬剤は、自然免疫受容体の多糖類との相互作用が体内において有益な効果をもたらす場合、遺伝子に関係している場合がある。以下の「修飾因子」と題されたセクションを参照のこと。
【００５６】
別の一連の実施形態において、本発明の方法及び融合タンパク質は、真菌細胞、細菌細胞、またはエンベロープウイルス及びフラビウイルスファミリーからのウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスなど、病原体表面上に現れる多糖の同一性の判定に用いることができる。本発明の方法での用途に適したフラビウイルス科ウイルスは、フラビウイルス属のメンバー（例えば、デングウイルス（ＤＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ、West Nile Virus）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ、Japanese encephamyelitis virus）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ、yellow fever virus）、ダニ媒介脳炎ウイルスなど）及びヘパシウイルス属のメンバー（例えば、Ｃ型肝炎ウイルスなど）を含むが、これらに限定されない。そのような一実施形態において、融合タンパク質が固体支持体上に固定化され（例えば、異種ポリペプチドがＩｇＧまたはそのフラグメントである場合、タンパク質Ａ誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）固体支持体を用いる）、その後前記固体支持体がその特定の病原体を含む組成物に接触される。洗浄後、例えば融合タンパク質の結合と競合せずに、その病原体に特異的に結合する第二試薬を用いて、病原体の結合が検出される。例えば、前記病原体に特異的な二次抗体を用いることができる。その後前記第二試薬の結合は上述したように（例えば、ＨＲＰ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）二次抗体を使用して）、または第二試薬に結合する第三試薬を用いて（例えば、前記第二試薬が抗病原体ＩｇＧである場合、ＨＲＰに結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗ＩｇＧ 抗体を用いて）検出することができる。第二試薬の結合が検出された場合、これは特定の糖鎖成分を含む多糖類を含む病原体が融合タンパク質の糖鎖認識ドメインに認識されたことを示す。
【００５７】
もう一つの方法として、前記アッセイは前記病原体に特異的に結合する試薬を固体支持体上に固定化することで実施できる。例えば、病原体に結合する抗体を固体支持体上に固定化し、その後病原体を含む組成物と接触させる。その後前記固体支持体を融合タンパク質と接触させ、融合タンパク質の結合が上述したように検出される（好ましくは、前記融合タンパク質が病原体と固定化された試薬との結合に競合しない）。例えば、融合タンパク質の異種ポリペプチドがＩｇＧ Ｆｃである場合、抗ＩｇＧ抗体が融合タンパク質の病原体への結合を検出することができる。または、融合タンパク質が検出可能な標識に結合される（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）場合、標識の検出を用いて結合を検出することができる。
【００５８】
前述の病原体アッセイは、例えば複数の異なる融合タンパク質を同時に用いて、多重形式で実施できることが明示的に意図される。例えば、病原体に結合する抗体は、固体支持体上の複数の不連続のアドレスで固定化することができる。その後、前記固体支持体が前記病原体を含む組成物と接触され、さらにその後各特定のアドレスが異なる融合タンパク質と接触され、各異なる融合タンパク質は異なる糖鎖認識ドメインを含む。各融合タンパク質が同一の異種ポリペプチドを含む場合、融合タンパク質の結合は前記異種ポリペプチドに結合する単一の試薬を用いて検出することができる。例えば、前記異種ポリペプチドがＩｇＧ Ｆｃである場合、抗ＩｇＧ抗体を用いて融合タンパク質の結合を検出することができる。各結合反応の空間的アドレスは、前記融合タンパク質のアイデンティティを示す。あるいは、固体支持体上の空間的に不連続のアドレスで固定化された複数の異なる融合タンパク質を用い、前記固体支持体と病原体を含む組成物を接触させた後、前記固体支持体と前記病原体に特異的に結合する第二試薬を接触させることで、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）アッセイを実行することができる。例えば、病原体がデングウイルスである場合、前記第二試薬はＥエンベロープタンパク質に対する抗体とすることができる。前述のすべてのアッセイと同様に、非特異的に結合した物質を固体支持体から除去するために洗浄を用いることができる。
【００５９】
本発明の方法を用いて、デングウイルスはＣＤ１４＋マクロファージの表面上で ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに結合することが発見されている。これに関しては実施例１１を参照する。さらに、デングウイルスに結合した ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＤＡＰ１２の活性化を生じ、これがさらにマクロファージからの前炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＩＦＮ−α、ＩＬ−８の放出をもたらすことが示されている。これに関しては実施例１２を参照する。これらサイトカインの放出はデング出血熱（ＤＨＦ、Dengue hemorrhagic fever）及びデングショック症候群（ＤＳＳ、Dengue shock syndrome）の形成に関与している。
【００６０】
本発明の方法の実施形態に従い、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａがデングウイルスと特異的に相互作用することが示されている。これに関しては実施例１６〜１８を参照する。さらに、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＤＡＰ１２リン酸化を修飾し、これがＴＮＦ−αなど前炎症性サイトカインの放出を少なくとも部分的に修飾すると考えられることが示されている。これに関しては実施例１８を参照する。ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ発現がデングウイルスに感染した細胞でノックダウンされると、ＤＡＰ１２のリン酸化が抑制され、かつインターフェロン−αなどのウイルス排除サイトカインの分泌に作用することなく、ＴＮＦ−αを含む前炎症性サイトカインの分泌が抑制される。これに関しては実施例１８〜１９を参照する。実施形態に基づき、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのノックダウンは、ｓｉ−ＲＮＡとｓｈ−ＲＮＡの両方の使用を含め、従来のＲＮＡ干渉法を用いて達成することができる。これに関しては実施例１８〜１９を参照する。
【００６１】
病原体と相互作用する自然免疫受容体のアイデンティティに関する知識は、自然免疫受容体の働きを修飾する薬剤の形成に用いることができる。例えば、特定の病原体に対する免疫反応を促進するために、同定された自然免疫受容体を活性化させる修飾因子を得ることができる。特定の多糖組成物に対する自然免疫受容体の相互作用が体に有害である場合（例えば、病原体が過剰炎症を引き起こすときなど）、自然免疫受容体の働きを抑制する修飾因子を取得することができる。例えば、病原体の自然免疫受容体への結合を遮断する薬剤（抗体など）は、前記病原体の感染に対する好ましくない炎症誘導反応の発生を防止するために用いることができる。同様に、本発明のスクリーニング法によって特定の病原体（ウイルスなど）が自然免疫受容体を使用して細胞に侵入することが明らかになった場合、その病原体の自然免疫受容体への結合を遮断する薬剤が病原体の細胞への侵入を防止する。
【００６２】
本発明の方法の実施形態に基づき、利用可能なＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ結合部位を減少する阻害剤の投与が、デングウイルス感染マウスの生存率を高めることが示されている。実施形態に基づき、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａリガンドへの結合を阻害するＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体の投与がマウスの生存率を向上することが示されている。これに関しては実施例２５を参照する。
【００６３】
別の一連の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、多糖類と細胞表面上の自然免疫受容体間の相互作用を妨害または阻止するために用いられる。この一連の実施形態において、前記融合タンパク質は細胞表面に発現した自然免疫受容体の糖鎖認識ドメインを含む。その後自然免疫受容体を発現する細胞は、体内または体外のいずれかで、前記融合タンパク質と接触され、それにより前記融合タンパク質が前記自然免疫受容体への結合のため多糖類と競合する。
【００６４】
多糖類と細胞表面の自然免疫受容体の相互作用が有機体に有害な影響をもたらす場合、その相互作用を防止または減少するため、医薬組成物内で有機体に対し治療的に有効な量の前記融合タンパク質を投与することができる。投与される融合タンパク質の異種ポリペプチドがいかなる細胞表面受容体にも結合しないことが好ましい。例えば、前記異種ポリペプチドは細胞表面上のＦｃ受容体に結合しないＩｇＧ Ｆｃの変異した異型を含むことができる。
【００６５】
精製
別の一連の実施形態において、融合タンパク質は、前記融合タンパク質の糖鎖認識ドメインによって認識される特定の糖鎖成分を含む多糖を少なくとも部分的に精製または単離するために用いられる。例えば、前記融合タンパク質は固体支持体上に固定化され、多糖組成物を含有することが考えられる、または分かっている組成物が前記固体支持体と接触される。前記組成物が前記融合タンパク質の糖鎖認識ドメインに結合できる多糖類を含む場合、その多糖類が前記融合タンパク質に結合する。その後前記固体支持体を洗浄し、前記組成物の非特異的に結合した成分を排除することができ、その後融合タンパク質との相互作用を絶つことにより、結合した前記多糖類が溶出され、収集される。例えば、前記融合タンパク質がレクチン受容体の糖鎖認識ドメインを含む場合、前記相互作用はＣａ^２＋をキレートするＥＤＴＡを用いて絶つことができる。この方法で、特定の多糖組成物を複雑な混合物から精製することができる。好ましい実施形態において、この方法は霊芝（レイシ）から分離された多糖を精製するために用いることができる。
【００６６】
前述の精製法に関し、固体支持体は、例えば、融合タンパク質が結合したカラムを含むことができる。適したカラムは、異種ポリペプチドとしてＩｇＧを含む融合タンパク質が、タンパク質Ａを持つ融合タンパク質のＩｇＧドメインとの相互作用を介して結合できる、セファロースタンパク質Ａカラムを含む。または、ＣＮＢｒ活性化カラム媒体に融合タンパク質を結合させることができる。
【００６７】
本発明はまた、上述のあらゆる方法で使用できるキットも提供する。一実施形態において、キットは本発明の融合タンパク質を１つ以上の容器内に含む。前記キットはさらに、融合タンパク質の異種ポリペプチドドメインに特異的に結合する抗体（例えば、前記異種ポリペプチドがＩｇＧ、またはそのフラグメントである場合、抗ＩｇＧ 抗体）など、第二試薬を含むことができる。前記キットはまた、融合タンパク質の多糖類への結合を検出するための試薬及びバッファーを含むことができる。例えば、ＨＲＰ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）二次抗体が融合タンパク質の多糖類への結合の検出に用いられる実施形態において、前記キットは増強化学発光反応を確立するために必要な試薬、例えば、ルミノール、ｐ−クマル酸、トリスバッファー、過酸化水素を含む１つ以上の容器を含む。前記キットはさらに、１つ以上の陽性対照多糖を含むことができる。前記キットはまた、前述の方法での使用向けの１つ以上の固体支持体、例えば、１つ以上のＰＶＤＦメンブレン、または１つ以上のマルチウェルマイクロタイタープレートなどを含むことができる。
【００６８】
修飾因子（Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）
上述したように、本発明の方法は特定の多糖類と相互作用する自然免疫受容体を同定する。この情報は同定された自然免疫受容体の修飾因子を取得することを可能にする。修飾因子は、自然免疫受容体のアゴニスト、アンタゴニスト（競合的及び非競合的拮抗薬を含む）、またはインバースアゴニストとすることができる。修飾因子は、多糖類の自然免疫受容体への結合を阻害する、多糖類の自然免疫受容体への結合を促進する、または、自然免疫受容体に結合する多糖類のミメティクスとして機能し、かつこれらに限定されず、それにより多糖類が存在しなくても自然免疫受容体を活性化させることができる。
【００６９】
自然免疫受容体の修飾因子は抗体を含む。例えば、自然免疫受容体に対する拮抗的抗体は、病原体の自然免疫受容体への結合を防止することができる。一部のケースで、そのような抗体は自然免疫受容体を発現する細胞への病原体の侵入を防止するため、中和抗体である。または、アゴニスト抗体は細胞に有益な効果を発揮する多糖組成物のミメティクスとして機能することができる。また、拮抗的抗体は、病原体の結合に際した受容体による下流シグナル伝達を阻害するように、自然免疫受容体に結合することもできる。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、単価、二重特異性、ヘテロ抱合、多重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーから産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上述のいずれかのエピトープ結合フラグメントとできるが、これらに限定されない。ここで言う「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。前記免疫グロブリン分子は任意のタイプ（例：ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ）、クラス（例：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）または免疫グロブリン分子のサブクラスとすることができる。さらに、「抗体」（Ａｂ）または「モノクロナール抗体」（Ｍａｂ）という語句は、タンパク質を特異的に結合する能力がある、完全分子、および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）を含むことが意図されている。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントはインタクト抗体のＦｃフラグメントが欠けており、動物または植物の循環からより迅速に消失し、非特異的組織結合がインタクト抗体よりも少ない場合がある（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４:３１６〜３２５（１９８３））。抗体アゴニストを産生する方法は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／４０２８１号、米国特許第５８１１０９７号、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１〜１９８８（１９９８）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８（１６）: ３６６８〜３６７８（１９９８）、Ｈａｒｒｏｐ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６〜１７９４（１９９８）、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５８ （１５）: ３２０９〜３２１４（１９９８）、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０（７）：３１７０〜３１７９（１９９８）、Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７〜２４７（１９９８）、Ｐｉｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７〜１９０（１９９７）、Ｌｉａｕｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３〜２４１（１９９７）、Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５〜１１３０１（１９９７）、Ｔａｒｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５〜７６２（１９９５）、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３〜１１６７（１９９８）、Ｂａｒｔｕｎｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４〜２０（１９９６）、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、 ｅｔ ａｌ．、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ ハイブリドーマ ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．、１９８１）に記載されている（これらはすべて全開示が参照としてここに組み込まれる）。
【００７０】
本発明は、ＤＶ感染後にマクロファージからのＴＮＦ−α放出を防止する抗 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａモノクロナール抗体の具体的な（制限しない）例を提供する。これについては実施例１５を参照する。これらの抗体は、ここで特定される医薬組成物および治療法、特に、人間のＤＶ感染の治療または予防向けの組成物および方法に用いることができる。
【００７１】
本発明はまた、ＤＶまたはＪＥＶ感染後のマクロファージからのＴＮＦ−α放出を防止するヒト化抗 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体を提供する。これに関しては実施例２０〜２６を参照する。特定の実施形態において、前記ヒト化抗体は、ヒト化抗体９Ｂ１２、３Ｅ１２Ａ２、３Ｅ１２Ｃ１、３Ｅ１２Ｇ９、８Ｈ８Ｆ５〜構成される群から選択される。これら抗体はここで特定される医薬組成物および治療法、特に、人間のＤＶ感染の治療または予防向けの組成物および方法に用いることができる。具体的な治療は、ＤＶ誘導血漿タンパクの漏出、および皮下と重要臓器の出血の抑制を含む。前記ヒト化抗体は、ＤＶ誘導出血性ショックおよび敗血症に対する治療法として用いることができる。ここで説明するウイルスによるサイトカイン刺激の減少に関連する原則は、刺激する細胞の受容体に結合し、それを修飾するすべてのウイルスに適用されることが明示的に意図されている。
【００７２】
さらに、ウイルスの発見と治療の原則は、同様に細胞侵入受容体、および細菌、真菌、寄生生物の作用にも拡大される。本発明の方法は、当業者が病原体の結合プロファイル（すなわち、どの受容体に結合するか）を判定する、受容体の結合の作用を判定する、および抗体などの阻害剤を提供し、病原体のターゲット受容体に結合する能力を阻害することを可能にする。
【００７３】
実施形態に基づき、マウス脾細胞とＮＳ１骨髄パートナー細胞の融合によって生成されるモノクロナール抗体（ｍＡｂ）、抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂは一本鎖ヒト抗ヒトＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂを生成するためのファージディスプレイ技術によって生成することができる。アゴニストｍＡｂおよび拮抗的ｍＡｂは実施例１９〜２５に開示されたスクリーニング法に基づいて選択することができる。
【００７４】
現在のマウス抗ヒトＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂの抗原性を減少するため、実施形態に基づき、野生型Ｆｃ部分はヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）で置換される。Ｆｃ受容体へのＦｃ結合をさらに消失させ、補体活性化を防ぐには、ヒトＩｇＧ１の変異型Ｆｃフラグメント（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３３１Ｓ）を使用して野生型Ｆｃを置換し、ヒト化ｍＡｂを生成することができる。抗原性をさらに減少するには、抗体Ｖドメインのフレームワーク領域をヒト配列で置換することができる。
【００７５】
自然免疫受容体の修飾因子は、高スループットスクリーニング法によって同定される小分子も含む。前記高スループットスクリーニング法は通常、多数の治療薬候補化合物（例えばリガンドまたはモジュレーター化合物）を含むコンビナトリアルケミカルまたはペプチドライブラリーの提供を含む。前記コンビナトリアルケミカルライブラリーまたはリガンドライブラリーは、１つ以上のアッセイでスクリーニングされ、その特定の自然免疫受容体に結合するライブラリーメンバー（例えば、特定の化学種またはサブクラス）が同定される。そのように同定された化合物は、従来のリード化合物として役立てるか、そのものを治療薬候補または実際の治療薬として用いることができる。
【００７６】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、複数の化学合成遮断（つまり、アミノ酸などの試薬）を組み合わせることによる化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成される多様な化合物のコレクションである。一例として、例えば、一連の化学合成遮断を特定の化合物長さ（すなわちポリペプチドまたはペプチド化合物中のアミノ酸の数）に対して可能なあらゆる方法で組み合わせることで、ポリペプチドまたはペプチドライブラリーなどの線状コンビナトリアルライブラリーが形成される。そのような化学合成遮断の組み合わせ混合を通して数百万の化合物を合成することができる。
【００７７】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製とスクリーニングは、関連技術でスキルを有する人物にはよく知られている。コンビナトリアルライブラリーは、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５０１０１７５号、Ｆｕｒｋａ、１９９１、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．、３７：４８７〜４９３、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８４〜８８など）を含むが、これに限定されない。その他化合物多様化ライブラリーを生成するための化学物質も使用できる。化合物多様化ライブラリーの化学物質の例には、ペプチド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０１９７３５）、コードされたペプチド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５２８８５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、ジペプチドなどの異性体（Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０：６９０９〜６９１３）、ビニルロゴアスポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１１４：６５６８）、グルコース骨格を備えた非ペプチド性ペプチドミメティクス（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１１４：９２１７〜９２１８）、小化合物ライブラリーの類似有機合成（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１１６：２６６１）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３）、またはペプチジルホスホン酸（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、５９：６５８）、核酸ライブラリー（例えば、「アプタマー」として知られる核酸リガンドの生成を説明する米国特許第５２７０１６３号を参照）、ペプチド核酸ライブラリー（米国特許第５５３９０８３号）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９〜３１４）およびＰＣＴ／米国第９６／１０２８７号）、糖鎖ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４〜１５２０〜１５２２）および米国特許第５５９３８５３号）、有機小分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ、１９９３年１月１８日、３３ページ、および米国特許第５２８８５１４号；イソプレノイド、米国特許第５５６９５８８号;チアゾリジノンおよびメタチアゾノン、米国特許第５５４９９７４号；ピロリジン、米国特許第５５２５７３５号および第５５１９１３４号；モルフォリノ化合物、米国特許第５５０６３３７号；等を参照のこと）を含むがこれに限らない。
【００７８】
コンビナトリアルライブラリーを調製するための装置が、市販で入手可能である（例えば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ；Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａｓｓ．；４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．；９０５０ Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．を参照のこと）。それに加えて、多数のコンビナトリアルライブラリーが、それ自身市販で入手可能である（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．；Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．；ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ．、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ；３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、Ｐａ．；Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｍｄ．；等を参照のこと）。
【００７９】
医薬組成物
本発明はまた、医薬組成物も提供する。一部の実施形態において、前記医薬組成物は本発明の融合タンパク質を含む。ほかの実施形態において、前記医薬組成物は自然免疫受容体の修飾因子（例えば、例１５で示す抗体を含め、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａなどの自然免疫受容体に対する抗体）を含む。そのような医薬組成物において、前記融合タンパク質または前記自然免疫受容体修飾因子は「活性化合物」を形成する。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、対象の細胞表面で多糖類が自然免疫受容体に結合することによって特徴付けられる疾病または疾患を治療または防止するため、対象に投与される。別の実施形態において、前記医薬組成物は、自然免疫受容体の働きを高めることが対象にとって有益である状況において、その自然免疫受容体を活性化させるため対象に投与される。さらに別の実施形態において、前記医薬組成物は、多糖組成物の自然免疫受容体への結合を促進するために対象に投与される。
【００８０】
前記医薬組成物は、活性化合物に加え、好ましくは、少なくとも１つの薬学上許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学上許容される担体」という語句は、医薬的投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。補助活性化合物も組成物に含めることができる。医薬組成物は特定の投与経路に適合するように調製される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、口腔（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、直腸投与が含まれる。非経口、皮内、皮下用途に用いられる溶媒または懸濁液は、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、その他合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液、塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの等張性を調整するための製剤を含むことができる。ｐＨは、例えば塩酸もしくは水酸化ナトリウムなどの酸もしくは塩基を用いて調整できる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジもしくは複数回投与バイアル内に封入できる。
【００８１】
本明細書で用いられる対象とは、人間および人間以外の霊長類（例えば、ゴリラ、マカク、マーモセット）、家畜動物（例えば、羊、牛、馬、ロバ、豚）、コンパニオンアニマル（例えば、犬、猫）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、鹿）およびその他任意の本発明の薬剤から恩恵を受ける有機体を指す。本発明で説明する薬剤から恩恵を受ける動物の種類について制限はない。本発明の最も好ましい対象は人間である。人間または人間以外の有機体を問わず、対象は患者、個人、動物、宿主、受容者と呼ぶこともある。
【００８２】
注射用途に適した医薬組成物は、無菌水溶液 （可溶性の場合）、又は、無菌の注射可能溶液又は分散体の即時調製用の分散体及び無菌粉末を含む。静脈内の投与に適した担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ．^ＴＭ（ＢＡＳＦ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いずれの場合も、組成物は無菌でなくてはならず、また、シリンジでの投与に十分な流動性を保持していなくてはならない。前記組成物は、調剤及び保存の条件下で安定的でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来の汚染を防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む、溶媒または分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。微生物の働きの防止に対しては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどのさまざまな抗菌剤及び抗真菌剤が使用可能である。また多くの場合、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムなどの等張剤が組成物中に含まれてもよい。注射可能な組成物の吸収を遅らせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を組成物に含めることで可能である。
【００８３】
無菌の注射可能溶液は、上に列挙した成分の必要なものを１つ以上組み合わせ、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加えた上で、フィルタ滅菌することにより調製される。一般に分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能溶液を調製するのための無菌粉末の調製方法には、活性成分及び先にフィルタ滅菌された溶液に由来するいずれかの所望な成分を含む粉末を調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
【００８４】
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤または可食担体が含まれる。経口的治療投与のために、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチまたは例えば、ゼラチンのカプセル剤などカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、洗口液として使用するために流動性担体を用いて調製することも可能である。さらに、薬剤的に適合する結合剤、またはアジュバント物質などが組成物に包含されてもよい。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチなどは、微結晶セルロース、トラガカントガム、ゼラチンなどの結合剤、デンプン、ラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅ）などの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバなどの香味料、あるいは同様の性質の成分または化合物のいずれかを含有してよい。
【００８５】
吸入による投与向けに、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素などのガス）を含有する圧縮容器またはディスペンサー、ネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００８６】
全身投与は、経粘膜手段または経皮手段でもあり得る。経粘膜投与または経皮投与向けに、浸透される障壁に適した浸透剤が、製剤中に使用される。このような浸透剤は、一般的に本技術分野で公知であり、そして例えば、経粘膜投与向けには、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐薬の使用を介して達成され得る。経皮投与向けに、活性化合物は、一般的に本技術分野で公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームで調製される。
【００８７】
化合物はまた、坐薬（例えば、従来のココアバターやその他グリセリド坐薬基剤などと共に）または直腸送達のための停留浣腸の形態で調製され得る。
【００８８】
一実施形態において、活性化合物は、移植片およびマイクロカプセル化送達系を含む、徐放製剤など、身体からの迅速な排除から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸など、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手できる。リポソーム懸濁液（細胞特異的抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染させた細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学上許容される担体として使用することができる。これらは例えば、米国特許第４５２２８１１号に記載される方法など、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【００８９】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、投薬単位形態で経口的組成物または非経口的組成物を調製することが特に有利である。本明細書中で使用される投薬単位形態とは、処置されるべき対象にとって単位投与量として適した物理的分散単位をいう。それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望される治療的効果を生じるように計算され、予め決定された量の活性化合物を含む。
【００９０】
それら化合物の毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（半数の個体が死に至る薬物量）及びＥＤ５０（半数の個体に有効な薬理効果が現れる量）の判定など、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順によって判定される。毒性と治療効果間の用量割合が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表される。高治療指数の化合物が好ましい。一方で、毒性のある副作用を持つ化合物は使用できるが、そのような化合物が影響を受けた組織の場所をターゲットとする送達システムの設計に注意し、未感染の細胞に対する潜在的な損傷を最小に抑え、それにより副作用を軽減する必要がある。
【００９１】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータを対象での使用向けの用量範囲の処方に使用できる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含み、毒性が少ないまたは毒性がない、血中濃度の範囲内とする。前記投与量は用いられる投与形態及び利用される投与経路によって、この範囲内で変化することができる。本発明の方法で使用されるあらゆる化合物について、治療的に有効な投与量は初めに細胞培養アッセイから見積もりが可能である。投与量は動物モデルで処方し、細胞培養において判定されたＩＣ５０（すなわち、半数の症状の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む血中血漿濃度範囲を達成することができる。そのような情報は、対象における有用な投与量のより正確な判定に用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィで測定することができる。
【００９２】
本明細書で定義されるように、治療的に有効量の本発明の活性化合物は、約０.００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０.０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０.１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。活性化合物は週に１回から1日３回またはそれ以上の頻度で、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、さらにより好ましくは約４、５、または６週間、投与することができるが、これに限定されない。当業者は、疾病または疾患の重篤度、前処置、対象の全般的健康状態または年齢、およびその他疾病の存在を含むが、これらに限定されない、特定の要因が対象を効果的に治療するために必要な投与量とタイミングに影響を与えることを認識する必要がある。さらに、治療的に有効量の本発明の医薬組成物での対象の治療は、単一の治療、または、好ましくは、一連の治療を含むことがある。
【００９３】
遺伝子治療とＲＮＡｉ
本発明の融合タンパク質をコードするコンストラクトは、受容体融合タンパク質の治療的に有効な投与量を対象に送達するための遺伝子治療プロトコルの一部として用いることができる。細胞への核酸の生体内導入に関しては、本発明の融合タンパク質をコードする、核酸を含むウイルスベクターの使用によるアプローチが好ましい。細胞のウイルスベクターへの感染は、標的細胞の大部分が核酸を受け取るという利点がある。加えて、例えばウイルスベクター中に含まれるｃＤＮＡによって、ウイルスベクター中でコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取得した細胞で効率的に発現される。
【００９４】
レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは、体内での融合タンパク質をコードする外来性核酸分子の転移向けの組み換え遺伝子送達システムとして用いることができる。これらベクターは細胞に核酸を効率的に送達し、転移された核酸は安定的に宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれる。複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊な細胞株（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの利用を増加し、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的の遺伝子導入での使用に特徴付けられる（概説はＭｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１を参照）。複製欠損レトロウイルスは、標準的な技法でヘルパーウイルスの使用を通して標的細胞に感染するために用いることができるウイルス粒子にパッケージすることができる。組み換えレトロウイルスの産生及び体外または体内でそのようなウイルスを細胞に感染させるプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．、（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、セクション９.１０〜９.１４及びその他の標準実験マニュアルに記載されている。
【００９５】
もう１つの有用なウイルス遺伝子送達システムはアデノウイルス由来ベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムは、特定の遺伝子産物をコードし、発現するが、正常の溶菌ウイルス生活環で複製する能力が不活性となるように、操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６（１９８８）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４（１９９１）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５５（１９９２）を参照できる。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ ｄ１３２４またはその他アデノウイルスの株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７、など）由来の適したアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。組み換えアデノウイルスは、非分裂細胞を感染させることができない特定の状況において利点がある場合があり、かつ上皮細胞（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、（１９９２）上記参照）を含む幅広い細胞の種類を感染させるために用いることができる。さらに、ウイルス粒子は精製および濃縮に対して比較的安定性があって適しており、かつ、上述のように、感染スペクトルに影響を与えるように修飾することができる。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及びそれに含まれる外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノムに組み込まれず、エピソームに留まるため、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれる状況（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）での挿入変異の結果として生じることがある潜在的な問題を回避することができる。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡに対する環境収容力は、ほかの遺伝子送達ベクターに比べて大きい（最大８キロベース）（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記参照；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７（１９８６））。
【００９６】
別の実施形態において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達システムは、標的化された細胞による対象の核酸分子取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依存する。このタイプの遺伝子送達システムの例は、リポソーム由来のシステム、ポリリシンコンジュゲート、人工ウイルスエンベロープを含む。代表的な実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子は、表面が正に荷電した（例えば、リポフェクチン）及び（選択的に）標的組織の細胞表面抗原に対して抗体でタグ付けされたリポソームに封入されることができる（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２）脳神経外科２０：５４７〜５５１、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０６３０９、日本特許出願第１０４７３８１号、欧州特許公報第ＥＰ−Ａ４３０７５号）。
【００９７】
本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子のための遺伝子送達システムは、任意の数の方法で対象に導入することができる。例えば、遺伝子送達システムの製剤は、例えば静脈内注射によって、全身に導入することができ、標的細胞内のタンパク質の特異的伝達は、遺伝子送達手段、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型または組織型発現、またはそれらの組み合わせによって提供されるトランスフェクションの特異度から主に発生する。ほかの実施形態において、組み換え遺伝子の最初の送達はかなり局所化されて動物への導入でより制限される。例えば、遺伝子送達手段はカテーテルによって（米国特許第５３２８４７０号参照）または定位的注入によって（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３０５４〜３０５７）導入され得る。遺伝子治療コンストラクトの製剤は、本質的に許容可能な希釈剤中の遺伝子送達システムから成るか、あるいは遺伝子送達手段が埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。融合タンパク質が、例えば、レトロウイルスベクターなど、組み換え細胞から完全に産生できる場合、製剤は融合タンパク質を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
【００９８】
別の実施形態において、本発明に基づき病因に関与しているとして同定される自然免疫受容体の発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて低減または完全に阻害される。ＲＮＡｉは本技術分野で公知であり、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いて達成できる。本発明に基づくｓｉＲＮＡは、最大２９ｂｐｓ、２５ｂｐｓ、２２ｂｐｓ、２１ｂｐｓ、２０ｂｐｓ、１５ｂｐｓ、１０ｂｐｓ、５ｂｐｓまたは同程度またはそれらの間の任意の整数とすることができる。そのようなｓｉＲＮＡは、例えば、ベクター（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターなど）によってコードされる形態またはリポソーム核酸複合体として投与することができる。免疫脂質複合体（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘ）などの標的化リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に公知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４〜４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２９１〜２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２〜３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７〜６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０〜７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７〜４８２０（１９９２）、米国特許第４１８６１８３号、第４２１７３４４号、第４２３５８７１号、第４２６１９７５号、第４４８５０５４号、第４５０１７２８号、第４７７４０８５号、第４８３７０２８号、第４９４６７８７号を参照）。したがって、本発明はまた、対象に投与されたときの自然免疫受容体のＲＮＡ干渉を媒介することができるＲＮＡ分子を含む医薬組成物も提供する。
【００９９】
実施形態に基づき、本発明はマクロファージ中の ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ遺伝子ＲＮＡｉ介在性「ノックダウン」の非限定的な例を提供する。この方法での ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの減衰はＤＶ感染マクロファージ中の前炎症性サイトカインの分泌を大幅に抑え、それにより ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡのＲＮＡｉ介在性減衰がＤＶの治療に有用であることを示す。
【０１００】
ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を減衰するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがデングウイルスに感染した対象のＲＮＡｉ介在性治療に用いられることが特に意図されている。特定の遺伝子の発現を減衰するためのｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを設計、合成、投与する方法は、本技術分野で公知であり、例えば、米国特許第７０２２８２８号で説明されている。本発明のｓｈＲＮＡコンストラクト及びｓｉＲＮＡ分子との調製に適した物質の非限定的な例には、ＰＥＧ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）核酸、リン脂質結合核酸、親油性成分を含む核酸、ホスホロチオアート、多様な組織への薬物の進入を強化できるＰ−糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５など）、例えば、ＣＮＳ（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ ａｎｄ Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ、１９９９、Ｆｕｎｄａｍ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１３、１６ ２６）、植え込み後の徐放送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）小球体などの生分解性ポリマー（Ｅｍｅｒｉｃｈ ＤＦ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、８、４７〜５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ， Ｉｎｃ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．；および血液脳関門を横切って薬物を送達することができ、及び神経細胞の取り込み機構を変化させることができるポリブチルシアノアクリラートから作製されたものな ど、搭載されたナノ粒子（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２３、９４１〜９４９、１９９９）が含まれる。本発明の核酸分子のＣＮＳ送達を含む、送達戦略のその他非限定的な例には、Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．、８７、１３０８〜１３１５；Ｔｙlｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４２１、２８０〜２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、１９９５、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．、９２、５５９２〜５５９６；Ｂｏａｄｏ、１９９５、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、１５、７３〜１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ ｅｔ ａｌ．、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６、４９１０〜４９１６；Ｔｙlｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９９、ＰＮＡＳ ＵＳＡ．、９６、７０５３〜７０５８で説明されている物質が含まれる。これらの参考文献はすべて参照によってここに組み込まれる。さらに、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾されたリポソーム（ＰＥＧ修飾された、若しくは長時間循環するリポソームまたはステルスリポソーム）を含む組成物も、本発明の核酸に使用され得る。本発明の核酸分子は、多様な分子量の共有結合化ＰＥＧ分子も含むことができる。これらの製剤は、標的組織中での薬物の蓄積を増加させる方法を提供する。薬物担体のこのクラスは、単核性食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニ ン化及び除去に耐えることにより、封入された薬物に対して、より長い血液循環時間及び強化された組織曝露を可能にする（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １９９５、９５、２６０１〜２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １９９５、４３、１００５〜１０１１）。そのようなリポソームは、おそらく、新血管新生が生じた標的組織中への血管外遊走と捕捉によって、腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５、２６７、１２７５〜１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１２３８、８６〜９０）。長時間循環するリポソームは、とりわけ、ＭＰＳの組織中に蓄積することが知られている従来の陽イオン性リポソームと比べて、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態学及び薬力学を強化する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９５、４２、２４８６４〜２４８７０；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．、国際ＰＣＴ公報第ＷＯ９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、国際ＰＣＴ公報第ＷＯ９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、国際ＰＣＴ公報第ＷＯ９６／１０３９２；これらすべては参照によって本明細書に組み込まれる）。長時間循環するリポソームは、肝臓及び脾臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織中への蓄積を回避する能力に基づいて、陽イオン性リポソームに比べてより大きな程度で、薬物をヌクレアーゼ分解から保護する可能性もある。
【実施例】
【０１０１】
実施例
本発明について、以下非限定的な実施例を挙げてさらに説明する。
【実施例１】
【０１０２】
自然免疫受容体の調製：Ｆｃ融合タンパク質
細胞培養
２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ７９０−０７）が、３７℃のＣＯ_２インキュベータ内のオービタルシェーカー（１２５ｒｐｍ）上の１２５ｍＬフラスク内無血清２９３フリースタイル２０３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２３３８−０１８）で培養された。
【０１０３】
受容体．Ｆｃ融合遺伝子のコンストラクション
レクチン受容体の細胞外ドメイン、ＴＲＥＭおよびＴＬＴが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってクローニングされ、その後ｙＴ＆Ａベクターに、さらにその後ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈＩｇＧ１．Ｆｃ発現ベクターにサブクローニングされた。得られた受容体．Ｆｃコンストラクトは、ヒトＦｃ受容体に結合しない、変異型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分と融合される、組み換えタンパク質をコードする。ＩｇＧ１ Ｆｃ部分の突然変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３３１Ｓである。細胞外ドメインをＲＴ−ＰＣＲ増幅するために用いられるプライマーの配列は次のとおりである（または、表２に記載された配列からプライマーを選択することも可能である）。
【０１０４】
ＣＬＥＣ１Ａ／ＣＬＥＣ−１
センスプライマー
５'-GAATCCTTTCAGTACTACCAGCTCTCC-３' 配列番号 l
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCTCAGTCACCTTCGCCTAATGT-３' 配列番号 ２
ＣＬＥＣ１Ｂ／ＣＬＥＣ−２
センスプライマー
５'-GGATCCCTGGGGATTTGGTCTGTC-３' 配列番号 ３
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCTTAAGGTAGTTGGTCCAC-３' 配列番号 ４
ＣＬＥＣ２Ｂ／ＡＩＣＬ
センスプライマー
５'-GGATCCTCTCAGAGTTTATGCCCC-３' 配列番号 ５
アンチセンスプライマー
５'-GGATCCCCCCATTATCTTAGACAT-３' 配列番号 ６
ＣＬＥＣ４Ａ／ＤＣＩＲ
センスプライマー
５' -GGATCCTTTCAAAAATATTCTCAGCTTCTT-３' 配列番号 ７
アンチセンスプライマー
５' -GAATTCTCATAAGTGGATCTTCATCATC-３' 配列番号 ８
ＣＬＥＣ４Ｃ／ＢＤＣＡ−２
センスプライマー
５'-GGATCCTTTATGTATAGCAAAACTGTCAAG-３' 配列番号 ９
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCTTATATGTAGATCTTCTTCATCTT-３' 配列番号 １０
ＣＬＥＣ４Ｄ／ＣＬＥＣ-６
センスプライマー
５'-GAATCCCATCACAACTTTTCACGCTGT-３' 配列番号 １１
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCCTAGTTCAATGTTGTTCCAGG-３' 配列番号 １２
ＣＬＥＣ４Ｅ／MINCLE
センスプライマー
５'-GAAGATCTACATTTCGCATCTTTCAAACC-３' 配列番号 １３
アンチセンスプライマー
５'-GCGGTTAAAGAGATTTTCCTTTGTTCA-３' 配列番号 １４
ＣＬＥＣ４Ｋ／ランゲリン
センスプライマー
５'-GGATCCCGGTTTATGGGCACCATA-３' 配列番号 １５
アンチセンスプライマー
５'-GGATCCTCACGGTTCTGATGGGAC-３' 配列番号 l６
ＣＬＥＣ４Ｌ／ＤＣ−ＳＩＧＮ
センスプライマー
５'-GGATCCAAGGTCCCCAGCTCCATAAG-３' 配列番号 １７
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCCTACGCAGGAGGGGGGT-３' 配列番号 １８
ＣＬＥＣ４Ｍ ／ＤＣ−ＳＩＧＮＲ／Ｌ−ＳＩＧＮ
センスプライマー
５'-GGATCCTCCAAGGTCCCCAGCTCC-３' 配列番号 １９
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCCTATTCGTCTCTGAAGCAGG-３' 配列番号 ２０
ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（ＭＤＬ−１）
センスプライマー
５'-AGATCTAGTAACGATGGTTTCACCAC-３' 配列番号 ２１
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCCTGTGATCATTTGGCATTCTT-３' 配列番号 ２２
ＣＬＥＣ６Ａ／Ｄｅｃｔｉｎ−２
センスプライマー
５'-GGATCCACATATGGTGAAACTGGC-３' 配列番号 ２３
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCCATCAGTCGATGGGC-３' 配列番号 ２４
ＣＬＥＣ７Ａ／Ｄｅｃｔｉｎ−１
センスプライマー
５'-GGATCCACCATGGCTATTTGGAGATCC-３' 配列番号 ２５
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCTTACATTGAAAACTTCTTCTCACA-３' 配列番号 ２６
ＣＬＥＣ１０Ａ／ＭＬ２
センスプライマー
５'-GGATCCTCCAAATTTCAGAGGGACCTG-３' 配列番号 ２７
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCTCAGTGACTCTCCTGGCTG-３' 配列番号 ２８
ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＬＬ−１
センスプライマー
５'-GGATCCGTAACTTTGAAGATAGAAATGAAA-３' 配列番号 ２９
アンチセンスプライマー
５'- GAATCCTCATGCCTCCCTAAAATATGTA -３' 配列番号 ３０
ＣＬＥＣ１３Ａ／ＢＩＭＬＥＣ
センスプライマー
５'-GGATCCTCATGCTCCGGGCCGCG -３' 配列番号 ３１
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCGCTAGCAATCACCAATGCTGA-３' 配列番号 ３２
ＣＯＬＥＣ１２／ＣＬ−Ｐ１
センスプライマー
５'-AGAGGTGACAGAGGATCCCA-３' 配列番号 ３３
アンチセンスプライマー
５'-GAATTCGTGATCCCATCACAGTCC-３' 配列番号 ３４
ＭＡＦＡ−Ｌ／ＫＬＲＧ−１
センスプライマー
５'-GGATCCTGCCAGGGCTCCAACT-３' 配列番号 ３５
アンチセンスプライマー
５'-ATGACAGATCTGAGGGTCA-３' 配列番号 ３６
【０１０５】
組み換え受容体．Ｆｃ融合タンパク質の発現及び精製
受容体．Ｆｃ タンパク質がＦＲＥＥＳＴＹＬＥ２９３遺伝子導入システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して過剰発現され、プロテインＡカラムで精製された。簡単に、３×１０^７個の２９３-Ｆ細胞が１５００ｒｐｍでスピンダウンされた後、２８ｍｌのＦＲＥＥＳＴＹＬＥ２９３培地で再懸濁された。その後、２９３ＦＥＣＴＩＮ４０μｌとＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０６２）１ｍｌを室温で５分間混合し、３０μｇのプラスミドＤＮＡと１ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５-０６２）でさらに20分間インキュベーションした後、２９３-Ｆ細胞を加えた。４８時間後、上清を取り出し、組み換え融合タンパク質をプロテインＡカラムで精製した。
【実施例２】
【０１０６】
多糖類抽出物の調製
霊芝生エキス
霊芝生エキス（アルカリ抽出、中和、エタノール沈殿で調製）をＰｈａｒｍａｎｅｘ Ｃｏ．（米国カリフォルニア州）より取得した。Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ（登録商標）透析用メンブレンチューブ分画分子量（ＭＷＣＯ）６０００〜８０００ダルトン、Ｔｈｅｒｍｏ ｂｉｏ−ｂａｓｉｃ ＳＥＣ−１０００カラム、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ Ｇ５０００ＰＷｘ１ ＳＥＣカラム、およびすべての薬品と試薬は、別途記載がない限り、Ｓｉｇｍａ、またはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．製である。
【０１０７】
霊芝抽出物の精製
生薬霊芝粉末（６ｇ）（Ｐｈａｒｍａｎｅｘ Ｃｏ．から取得）を１２０ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中に溶解させ、熱水（１００℃）で２時間攪拌し、１時間遠心分離（１０００ｒｐｍ）して不溶性物質を除去した。得られた溶液を約４０℃〜約５０℃で濃縮して少量を得た後、凍結乾燥して５g（８３％）の暗褐色粉末（霊芝多糖; ＧＬＰＳ）を生成した。この可溶性残渣物をさらなる精製までの間−２０℃で保存した。
【０１０８】
霊芝多糖類Ｆ３フラクションの標準分離
霊芝多糖類の可溶性残渣物の暗褐色粉末から霊芝多糖類フラクション３（以下、「ＧＬＰＳ Ｆ３」及び「Ｆ３」と呼ぶ）を分離した。クロマトグラフィ手順はすべて４℃の冷室で実行された。アジ化ナトリウム０.１Ｎを含む少量のトリスバッファー（ｐＨ７．０、０．１Ｎ）中に試料（２．１ｇ）を溶解し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００カラム（９５×２．６ｃｍ）と溶離液として０．１Ｎトリスバッファー（ｐＨ７.０）を使用して、ゲルろ過クロマトグラフィによって精製した。流量は０．６ｍｌ／分に設定され、１チューブにつき６．０ｍｌが収集された。クロマトグラフィ後、各フラクションについてフェノール硫酸法で各チューブ内の糖含有量を検出した。５つのフラクションが収集された（フラクション１〜５）。フラクション３（Ｆ３）を約４０〜５０℃で回転式気化器により濃縮し、少量を得て、その後６０００〜８０００ダルトンのＭＷＣＯメンブレンを使ってそれを透析し、過剰な塩とアジ化ナトリウムを除去した。透析後、Ｆ３を凍結乾燥し、５２０ｍｇの固体を得た。
【０１０９】
冬虫夏草由来の多糖の調製
冬虫夏草由来の多糖の精製のため、試料を０．２ｃｍ^３ 片に砕いた後、脱イオン化熱水（１００℃）で６０分間インキュベーションし、室温まで冷却してから、０．２μｍのフィルタを通過させ、等量のエタノールを加えて多糖を沈殿させた。凍結乾燥機を用いて沈殿物を乾燥させ、４℃で保管した。多糖の全糖量分析はフェノール硫酸法により４８５ｎｍでＯＤを測定することで判定され、多糖の純度はＴｈｅｒｍｏ Ｂｉｏ−Ｂａｓｉｃ ＳＥＣ−１０００カラムを使用し、２８０ｎｍのＵＶ測定で、かつＲＩ検出器を用いてＨＰＬＣにより判定された。
【０１１０】
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｈｕｏｓｈａｎｅｎｓｅ由来の多糖の調製
空気乾燥したＤ． ｈｕｏｓｈａｎｅｎｓｅを粉砕し、粉末に挽いて蒸留水中に均質化し、４℃で一晩攪拌した。不溶性物質を遠心沈殿法で収集した。上清を少量に濃縮した後、１分量のエタノールを加えて沈殿（０）と上清（Ｎ）を得た。定義済みの分子量を有する標準プルランフラクションを用いた多糖分析にはＴＳＫ Ｇ−５０００ＰＷサイズ排除カラムを高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、high performance liquid chromatography）で使用した。Ｎ中の多糖の分子量は１．２×１０^５〜４．１×１０^５ダルトンの間と見積もられ、Ｏ中の多糖の分子量は１．０×１０^６〜２．２×１０^５ダルトンの間と見積もられた。糖含量をフェノール硫酸法で測定した。Ｏ中の多糖は８３％、Ｎ中の多糖は７７％であった。ＯとＮの両方共ヨウ素反応で陽性であり（λｍａｘ４４０ｎｍ、紺色）、これらフラクション中の多糖は主にα−Ｄ−グルカンであることを示している。
【０１１１】
キノコ由来の多糖の調製
空気乾燥したシイタケを粉砕し、粉末に挽いて蒸留水中で均質化し、４℃で一晩攪拌した。残渣を遠心沈殿法で除去し、上清を少量に濃縮した後、凍結乾燥して粗多糖類Ｌを得た。その後、０.２５Ｎ ＮａＯＨ溶液を（遠心沈殿法によって分離された）不溶性残渣に加え、この混合物を室温で一晩攪拌した後、２分量のエタノールを添加して多糖を沈殿させた。その後沈降された多糖類に蒸留水を添加し、続いて酢酸を加えてｐＨを中和した。得られた溶液を遠心分離し、かつ凍結乾燥して多糖類Ｍを得た。その後ＴＳＫ Ｇ−５０００ＰＷサイズ排除カラムを使用したＨＰＬＣを実施して、多糖を分析した。糖含量をフェノール硫酸法で測定した結果、Ｌが７９％の糖を含有し、Ｍが９０％の糖を含有していた。シイタケ由来の多糖のフラクションのデータと比較すると、多糖ＬおよびＭは主にβ-１、３−Ｄ−グルカンであることが示されている。
【０１１２】
β−１，３−グルカン、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトースの調製
競合アッセイ用の試料を調整するため、β−１，３−グルカン（Ｆｌｕｋａ、日本）１００ｍｇを７．５ｍｌの水で懸濁し、４０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液５０μｌを加えた。この混合物を還流下で１．５時間加熱し、冷却した。その後、メタノールを加えてβ−１，３−グルカンを沈殿させた。β−１，３−グルカンの沈殿を水に溶解させ、４Ｌのｄｄ−Ｈ_２Ｏで４回透析し、減圧濃縮して可溶性β−１，３−グルカンを得た。Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）およびＤ−ガラクトース（Ｓｉｇｍａ）ｄｄ−Ｈ_２Ｏ（１００ｍｇ／ｍｌ）中で溶解させ、４℃で保管した。
【０１１３】
ビオチニル−Ｆ３の調製
霊芝多糖−Ｆ３にワンポット反応を使用してビオチン標識した。具体的には、０．２Ｎ ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３（１０ｍｌ）中の霊芝多糖類−Ｆ３（１００ｍｇ）とビオチンアミドヘキサノイル−６−アミノ−ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ビオチン−ＸＸ−ＮＨＳ）１．０ｍｇをＤＭＦ（１ｍｌ）中で反応させた。この混合物を室温で１２時間攪拌した。反応の完了後、ＭＷＣＯ６０００〜８０００ダルトン（５×５００ｍｌ）のメンブレンチュービングを使用し、４℃で得られた溶液を４８時間透析した。透析後、ビオチニル−Ｆ３を凍結乾燥して、褐色粉末９０ｍｇ（９０％）を得た。ビオチニル−Ｆ３の精製はＨＰＬＣによってモニタされ、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣを結合アッセイに使用した。
【実施例３】
【０１１４】
精製受容体：Ｆｃ融合タンパク質のウェスタンブロット分析
実施例１の精製受容体．Ｆｃ融合タンパク質が電気泳動を受け、ニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ ｅｘｔｒａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写され、（１:３０００）ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ、米国ペンシルベニア州）とＴＢＳＴ（０.０２％Ｔｗｅｅｎ ２０含有トリスバッファー塩中脱脂粉乳５％）バッファー中で反応された。ＴＢＳＴでの洗浄後、可視化するためブロットを増強化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でインキュベーションされた。
【実施例４】
【０１１５】
免疫吸着ドット結合アッセイ
５倍段階希釈後、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国カリフォルニア州）を用いてビオチン化Ｆ３をメタノール活性化ＰＶＤＦメンブレン（２μＬ／ドット）にブロットした。空気乾燥後、ブロットをＴＢＳＴでインキュベーションし、続いて１００μＬのストレプトアビジン結合西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１:２０００希釈）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国カリフォルニア州）でインキュベーションした。結合反応は増強化学発光（ＥＣＬ）試薬で可視化された（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【０１１６】
非ビオチン化多糖もメタノール活性化ＰＶＤＦメンブレン上に固定化され、続いて１００μＬの受容体．Ｆｃ融合タンパク質（１μｇ／ｍｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２／ＴＢＳＴ中）がＢｉｏ−Ｄｏｔ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国カリフォルニア州）上で室温で１時間インキュベーションされた後、（１:３０００）ＨＲＰ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、米国ペンシルベニア州）とＴＢＳＴ（０.０２％Ｔｗｅｅｎ ２０含有トリスバッファー塩中脱脂粉乳５％）バッファー中で反応された。ＢＳＴでの洗浄後、可視化するためブロットを増強化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でインキュベーションされた。
【実施例５】
【０１１７】
組み換え受容体．Ｆｃ融合タンパク質の発現
免疫細胞由来のいくつかの自然免疫受容体の細胞外ドメインが、実施例１の方法に従い、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってクローンされた。増幅されたＤＮＡ断片がｐｃＤＮＡ３／ｈＩｇＧ１−変異プラスミドに含有されるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合された。クローンされた融合遺伝子は２９３ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ哺乳類細胞に形質転換され、分泌されたタンパク質は実施例１の方法に従い、タンパク質ビーズによって精製された。図１に示すように、１６のＣ型レクチン遺伝子がクローンされた（図１Ａ）。具体的には、図１Ａに、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅された後、０．８％アガロース上で分画され、エチジウムブロミド染色により可視化された自然免疫受容体のＤＮＡ断片を示す。図１Ｂに、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動後、発現した組み換え受容体．Ｆｃ融合タンパク質を示す。図１Ａと図１Ｂの両方で、次のレーン指定が用いられている：レーン１：ＣＬＥＣ２Ｂ／ＡＩＣＬ、レーン２：ＣＬＥＣ４Ｃ／ＢＤＣＡ−２、レーン３：ＣＬＥＣ１３Ａ／ＢＩＭＬＥＣ、レーン４:ＣＬＥＣ１Ａ／ＣＬＥＣ−１、レーン５：ＣＬＥＣ４Ｄ／ＣＬＥＣ−６、レーン６：ＣＬＥＣ１２Ａ／ＣＬＬ−１、レーン７：ＣＬＥＣ４Ａ／ＤＣＩＲ、レーン８：ＣＬＥＣ４Ｌ／ＤＣ−ＳＩＧＮ、レーン９：ＣＬＥＣ４Ｍ／ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、レーン１０：ＣＬＥＣ７Ａ／Ｄｅｔｉｎ−１、レーン１１：ＣＬＥＣ６Ａ／Ｄｅｔｉｎ−２、レーン１２：ＣＬＥＣ４Ｈ２／ＨＢＶｘＡｇＢＰ、レーン１３：ＣＬＥＣ４Ｋ／Ｌａｎｇｅｒｉｎ、レーン１４:ＫＬＲＧ／ＭＡＦＡＬ、レーン１５：ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（ＭＤＬ−１）、レーン１６：ＣＬＥＣ４Ｅ／ＭＩＮＣＬＥ。さらに、ヒトＴＲＥＭ（骨髄細胞上に発現するトリガー受容体）−１、−２及びＴＲＥＭ様転写物（ＴＬＴ）−１、−２（Ｂｏｕｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４、４９９１〜５；Ｄａｗｓ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１、５９４〜９；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｂｌｏｏｄ １００、３８２２〜４）も類似の戦略でクローンされ、発現された。
【実施例６】
【０１１８】
固定化された多糖と受容体．Ｆｃ融合タンパク質間の用量依存的相互作用
多糖と受容体．Ｆｃ融合タンパク質間の相互作用は、実施例４の方法に従い、ドット結合アッセイを用いてテストされた。霊芝多糖の可溶性フラクション３（Ｆ３）（実施例３を参照）は、サイトカインを産生する細胞を刺激する活性成分を含む（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １０、１０５７〜６２; Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １２、５５９５〜６０１; Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １２、５６０３〜９；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３、５９８９〜９９）。霊芝サッカリドはβ−１，３型結合の多糖類バックボーン、またはα−１，４結合のポリマンノースバックボーンのいずれかを含むことが知られていた（Ｕｓｕｉ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．、２７３；Ｍｉｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｊｉｍｅ、１９８２、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． １０９、２９０；Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５９、１７５〜８１）。Ｃ型レクチンファミリーのメンバーであるＤｅｃｔｉｎ−１受容体は、β-１，３−Ｄ−グリカンと相互作用することが示されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４１３、３６〜７）。Ｄｅｃｔｉｎ−１受容体はβ−グルカンの生物学的作用を媒介することが知られている（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７、１１１９〜２４）。このため、霊芝のＦ３部分はＤｅｃｔｉｎ−１受容体と相互作用するか否かを判定するため、実施例４のドット結合アッセイを用いてテストされた。
【０１１９】
ビオチン化Ｆ３フラクション（図２Ａの「ビオチン−ＧＬＰＳ Ｆ３」）（実施例２に従い調製）は５倍段階希釈後にＰＶＤＦメンブレン上に固定化され、ストレプトアビジン結合ＨＲＰでインキュベーションされ、得られた結合反応が増強化学発光試薬を用いて検出された（実施例４参照）。図２Ａに示すように、このドット結合アッセイの感度は約０．０８μｇより良い。図２Ａはまた、非ビオチン化Ｆ３（図２Ａの「ＧＬＰＳ−Ｆ３」）がＰＶＤＦメンブレン上に固定化され、その後ストレプトアビジン結合ＨＲＰと接触されたとき、いかなるバックグラウンドも見えないことを示している。
【０１２０】
非ビオチン化Ｆ３フラクションも段階希釈後ＰＶＤＦメンブレン上に固定化され、１００μＬの１μｇ／ｍｌのＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ融合タンパク質またはヒトＩｇＧ１でインキュベーションされ（陰性対照として）、続いてヤギＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧでインキュベーションされた（実施例４を参照）。図２Ｂに示すように、Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃはドット結合アッセイで約１ｎｇ未満のＦ３の存在を検出できる。Ｄｅｃｔｉｎ−１．ＦｃではなくヒトＩｇＧ１に接触されたブロットの領域に見えるバックグラウンドはない。
【０１２１】
図２Ｂのブロットのドット密度はデンシトメータ （ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）で測定され、結果によると、Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ結合シグナルは用量依存的に増加したことを示している（図２Ｃ参照）。
【０１２２】
ほかの多糖がＦ３とＤｅｃｔｉｎ−１間の相互作用を阻害するか否かを判定するため、Ｆ３（１０μｇ／ドット）がＰＶＤＦメンブレン上で固定化され、β−グルカン、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース（０.１μｇ〜１０００μｇ）の段階希釈溶液の存在する中で１００μＬのＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）と接触され、その後ヤギＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧでインキュベーションされた。図２Ｄに競合βグルカンに関するブロットのドット密度分析を示す。図２Ｅに全競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒｓ）のブロット画像を示す。Ｄｅｃｔｉｎ−１．ＦｃとＦ３フラクション間の相互作用はβ−１,３−グルカンによって阻害されるが、Ｄ−グルコースまたはＤ−ガラクトースによっては阻害されないと見ることができる。これは、Ｄｅｃｔｉｎ−１．ＦｃとＦ３の相互作用は、β−１, ３−グルカンの認識を介していることを示す。
【実施例７】
【０１２３】
Ｆ３フラクションと相互作用する能力を持つ受容体の同定
Ｆ３とＣ型レクチンファミリーのほかのメンバーまたはＩｇ様受容体との相互作用を分析した。非ビオチン化Ｆ３と非ビオチン化Ｆ３Ｃ（１００ｋＤａＭＷＣＯ遠心チューブを通過した後のＦ３に由来する）（１０μｇ／ドット）がＰＶＤＦメンブレン上に固定化され（実施例４を参照）、２５の異なる組み換え受容体．Ｆｃ融合タンパク質（１９のレクチン受容体、及びＴＲＥＭとＴＬＴファミリーの８つのメンバーを含む）の１μｇ／ｍｌ溶液１００μＬと、対照としてヒトＩｇＧ１でインキュベーションされた。ヤギＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体とＥＣＬ試薬を用いて結合が検出された。結果を表形式で図３に示し（相対的ドット強度は「＋」のシンボルで、検出可能な結合なしは「−」のシンボルで表示）、ブロットの画像を図４Ａに示す。図３で用いられたプローブ番号のシステムが図４Ａで維持されている。
【０１２４】
結果によると、Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ（図３と図４Ａのプローブ番号１４）に加え、Ｆ３はＫＣＲ．Ｆｃ（図３と図４Ａのプローブ番号７）, ＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃ（図３と図４Ａのプローブ番号１１）、ＴＬＴ−２．Ｆｃ（図３と図４Ａのプローブ番号２１）とも相互作用したことが示されている。１００ｋＤａＭＷＣＯ遠心チューブを通過した後のＦ３に由来するＦ３ＣのＴＬＴ２に対する親和性が低くなっていることが興味深い。これは、ＴＬＴ２がＦ３とＦ３Ｃ間の微妙な違いを区別できることを示唆している。
【０１２５】
レクチン受容体ファミリーのメンバーは相互作用のためＣａ^＋＋に依存している。このため、 ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のＦ３への結合を阻害する能力を研究した。その結果、ＥＤＴＡ（ＴＢＳＴ中１０ｍＭ）はＦ３のＫＣＲ．Ｆｃ、及びＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃとの相互作用を完全に消滅させたが、Ｆ３のＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ、及びＴＬＴ２.Ｆｃとの相互作用は消滅させなかった。図４ＢにＣａ^＋＋が存在する状況と存在しない状況（左パネルはＴＢＳＴのみ、右パネルは１０ｍＭのＥＤＴＡ＋ＴＢＳＴ）で作成したブロットの画像を示す。ヤギＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体とＥＣＬ試薬を用いて結合が検出された。この結果は、リガンドとＫＣＲ間の相互作用（Ｈｏｙｌｅ ａｎｄ Ｈｉｌｌ、１９８８、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３、７４８７〜９２）及びＤＣ−ＳＩＧＮＲがＣａ^＋＋依存性であること（Ｓｏｉｌｌｅｕｘ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５、２９３７〜４２）、一方Ｃａ^＋＋がＤｅｃｔｉｎ−１とβ−１,３−グルカン間の相互作用に不可欠であること（Ｈｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０、８６９〜７６）といった先行研究と合致する。従って、Ｆ３は複数の受容体と免疫細胞上で同時に相互作用できる豊富なグリカンを含んでいるようである。
【０１２６】
図４Ｃにβグルカンを多糖類として（１０μｇ／ドット）、及び１μｇ／ｍｌのＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ、ＤＣ−ＳＩＧＮ．Ｆｃ、ｍＫＣＲ．Ｆｃ、ＴＬＴ２.Ｆｃ１００μＬを用いたドットブロットを示す。ヤギＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体とＥＣＬ試薬を用いて結合が検出された。テストした４つの受容体．Ｆｃ融合タンパク質のうち、Ｄｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃのみがβ−１,３−グルカンに結合した。これは、ほかの３つの受容体．Ｆｃ融合タンパク質はβ−１,３−グルカンではない糖成分に結合することを示している。
【実施例８】
【０１２７】
多様なソースに由来する多糖のフィンガープリント
冬虫夏草及び市場のその他ソースから分離された多糖のフィンガープリントを取得するため、Ｄｅｃｔｉｎ１．Ｆｃ、ｍＫＣＲ．Ｆｃ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃ、ＴＬＴ２.Ｆｃ融合タンパク質を用いて実施例４のドット結合アッセイを実施した。各多糖組成物は上述したようにＰＶＤＦメンブレン上に固定され、その後融合タンパク質の１μｇ／ｍｌ溶液１００μＬに接触された。ヤギＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体とＥＣＬ試薬を用いて結合が検出された。図５Ａに各融合タンパク質に関する個別のドットブロットを示し、図５Ｂに表形式で試料のキー番号と相対的なドット強度を示す。霊芝生薬抽出物（図５のスポット番号５）はＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃとのみ相互作用し、一方前記生薬抽出物由来の精製されたＦ３（スポット番号１）は４つすべての受容体と相互作用した。これは、Ｆ３精製工程が免疫受容体と相互作用する成分を豊富にしたことを示している。冬虫夏草由来の多糖類（スポット番号７）はＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃと強い相互作用があり、この多糖類はβ−１,３−グリカンを含むことを示しているが、ほかの３つの受容体との相互作用はＦ３よりずっと弱い。Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｎ ｈｕｏｓｈａｎｅｎｓｅから分離された多糖はヨウ素テスト反応が陽性であり（実施例２を参照）、これらフラクションが主にα−Ｄ−グルカンを含むことを示唆している。キノコ類から分離されたものとは対照的に、Ｄ． ｈｕｏｓｈａｎｅｎｓｅの多糖の混合（スポット番号６）は４つの受容体．Ｆｃ融合タンパク質のいずれとも反応しない。キノコ多糖からｄｄＨ_２Ｏ（フラクションＬ、スポット番号８）と０.２５Ｎ ＮａＯＨ（フラクションＭ、スポット番号９）によって分離された多糖（実施例２を参照）は、特異的にＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃと結合する。従って、このアプローチで異なるソース及び調製から分離された多糖から明確なフィンガープリントを産生することができる。
【０１２８】
実施例６〜８は、Ｆ３がＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ、ｍＫＣＲ．Ｆｃ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃ、ＴＬＴ２.Ｆｃと相互作用することを示している。Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞受容体（ＫＣＲ）はＤ−ガラクトースとＮ−アセチルガラクトサミンに高い親和性を持ち（Ｆａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １３、５２９〜３７）、血漿Ｄ−ガラクトースまたはＤ−フコース末端の糖タンパク質を除去することができる（Ｌｅｈｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１、７４２６〜３２）。Ｆ３の免疫調節機能はフコースの存在に依存しており、α１，２−フコシダーゼによる解糖系による切断がＦ３の作用を消滅させる。従って、これら４つの受容体が解糖系による切断後にＦ３と相互作用できるか否かという問題が興味深いものとなる。ＤＣ−ＳＩＧＮＲ／Ｌ−ＳＩＧＮは構造的にＤＣ−ＳＩＧＮに類似（７７％の同一性）しているが、肝類洞壁、リンパ節、胎盤の内皮細胞でのみ発現される（Ｖａｎ Ｌｉｅｍｐｔ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９、３３１６１〜７）。ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲの両方がＮ−結合高マンノース型糖鎖（Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２Ａｓｎ糖ペプチド）に結合できる。しかし、ＤＣ−ＳＩＧＮのみが末端フコース残基を持つグリカンに結合でき、ＤＣ−ＳＩＧＮＲはできない（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１、５９１〜８）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲはＤＣ−ＳＩＧＮよりも比較的限られたリガンドに結合できるが、ＤＣ−ＳＩＧＮＲのみがＦ３と相互作用できる。これは、Ｆ３がＦｕｃα１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｌｅｗｉｓ^ｘ、Ｌｅｗｉｓ^ａ及び血液型糖エピトープ（ＤＣ−ＳＩＧＮの既知のリガンド）とは異なる固有の構造を含む可能性を示唆している。
【０１２９】
ＴＬＴ-２はＴＲＥＭ様転写物ファミリーのメンバーであり、単一のＶ−ｓｅｔ免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインと、プロリンリッチ領域及び免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を持つ長い細胞質尾部の特徴を含み、後者はタンパク質チロシンホスファターゼとの相互作用に用いられることが知られている（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｂｌｏｏｄ １００、３８２２〜４；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｂｌｏｏｄ １０４、１０４２〜７）。Ｆ３は強力な免疫刺激機能を有し、ＴＬＴ２.Ｆｃ結合成分を親和性クロマトグラフィによりＦ３から除去することで、Ｆ３の刺激機能をさらに強化できるか否かが将来的に興味深い研究となる。また、Ｆ３はＤｅｃｔｉｎ−１．Ｆｃ、ＫＣＲ．Ｆｃ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃを用いて親和性クロマトグラフィによりＦ３中のほかの成分を除去することでさらに精製することができる。
【０１３０】
Ｆ３とＦ３Ｃ間、Ｆ３と霊芝１-３間、キノコ多糖フラクションＬとＭ間のディファレンシャルフィンガープリントは、精製手順を最適化し、異なるソースまたは異なる培養条件に由来するさまざまな多糖のモニタリングにここで例示したこれら４つの受容体．Ｆｃ融合タンパク質が使用できることを示唆している。
【実施例９】
【０１３１】
マイクロタイタープレート上での酵素結合免疫アッセイによるＧＬＰＳ−Ｆ３と相互作用するヒトレクチン受容体の同定
多糖と受容体．Ｆｃ融合タンパク質の相互作用について、親水性力と疎水性力の両方を通してマイクロタイタープレート（ポリスチレン）上にＧＬＰＳ−Ｆ３を固定化することに基づいた、酵素結合免疫アッセイを実施することによりさらに調査した。この形式では、プロファイリングするための異なる受容体．Ｆｃ融合体の数を実施例７よりも増加した。固定化のためのＧＬＰＳ−Ｆ３の量を最適化するため、多様な量（３〜１０００ｎｇ／ウェル、１０ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ９.５に希釈）のビオチン化ＧＬＰＳ−Ｆ３（Ｂｉｏｔｉｎ-ＧＬＰＳ−Ｆ３）をＭａｘｉＳｏｒｐ ＳｔａｒＷｅｌｌマイクロタイタープレート上に塗布した（５０μＬ／ウェル；ヌンク）。プレートを一晩４℃でインキュベーションした後、ウェルをＴＢＳＴで２回洗浄し、２００μＬのブロッキングバッファー（２％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ）で室温で１時間遮断した。その後、ペルオキシダーゼ標識アビジン（１:５０００希釈、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質を固定化されたビオチン化ＧＬＰＳ−Ｆ３の検出に用いた。図６Ａに示すように、プレート塗布のビオチン−ＧＬＰＳ−Ｆ３の量は１００ｎｇ／ウェルでプラトーに達し、このため、ＥＩＡでの非ビオチン化ＧＬＰＳ−Ｆ３の固定化に用いるために選択された。
【０１３２】
次にＧＬＰＳ−Ｆ３と受容体．Ｆｃ間の相互作用をテストした。非ビオチン化 ＧＬＰＳ−Ｆ３が上述のように１００ｎｇ／ウェルで固定化され、１００μＬの受容体．Ｆｃ融合タンパク質（２ｍＭ ＭｇＣＬ_２／２ｍＭ ＣａＣｌ_２／１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴに１μｇ／ｍｌ）が各ウェルに加えられ、室温で１時間インキュベーションされた。ＴＢＳＴでの洗浄後、ウェルはペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ（１:５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とブロッキングバッファー中で室温で３０分間インキュベーションされた。ウェルはＴＢＳＴ洗浄後１００μＬのＴＭＢ基質と１５分間インキュベーションされ、Ｆｕｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍで読み取られた。結果はＦｃ．Ｄｅｃｔｉｎ−１結合（Ｄｅｃｔｉｎ−１は、ＧＬＰＳ−Ｆ３中のバックボーンであるβ-１,３−グルカンに結合する既知のレクチン受容体である）に対して補正された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）。図６ＢにＤｅｃｔｉｎ−１に対するＧＬＰＳ−Ｆ３の各受容体の親和性を図の形式で示す。結果によると、ＧＬＰＳ−Ｆ３への高い結合親和性がＦｃ．Ｌａｎｇｅｒｉｎ、Ｆｃ．ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲ．Ｆｃ、ＴＬＲ２．Ｆｃ、ＴＬＲ４．Ｆｃ、Ｆｃ．ＣＬＥＣ-２（ＣＬＥＣ１Ｂ）、Ｆｃ．ＣＬＥＣ-６（ＣＬＥＣ４Ｄ）について認められたことが示されている（このアッセイにおいて高い結合とはＦｃ．Ｄｅｃｔｉｎ−１と比較して＞５０％の結合強度と定義する）。ＧＬＰＳ誘導細胞活性化の役割を果たすことを示しているＴＬＲ２とＴＬＲ４（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３：５９８９〜５９９９（２００４）；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３２３：１３３〜１４１（２００４））が、ＥＩＡ形式でもＧＬＰＳ−Ｆ３に結合することに注目すべきである。Ｆｃ．ＮＫＧ２Ｄ、Ｆｃ．ＭＩＮＣＬＥ、Ｆｃ．ｍＫＣＲ、ＤＣＡＬ１．Ｆｃ、ＤＥＣ２０５．Ｆｃ、Ｅｎｄｏ１８０．Ｆｃ、ＮＫｐ３０（ＮＣＲ３）．Ｆｃでも弱いながらも陽性のＧＬＰＳ−Ｆ３結合能力（Ｆｃ．dｅｃｔｉｎ−１と比較して２５〜５０％の結合強度）があった。Ｆｃ．ＡＩＣＬ、Ｆｃ．ＢＤＣＡ２、Ｆｃ．ＣＬＥＣ１、Ｆｃ．ＣＬＬ１、Ｆｃ．ＤＣＩＲ、Ｆｃ．ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、Ｆｃ．Ｄｅｃｔｉｎ−２、Ｆｃ．ＭＤＬ−１、Ｆｃ．ＭＬ２を含むほかのレクチン受容体は、対照のヒトＩｇＧ１と同様に、ＧＬＰＳ−Ｆ３に最小程度の結合能力があった。
【実施例１０】
【０１３３】
ＧＬＰＳ−Ｆ３と相互作用する自然免疫受容体の競合アッセイ
ＧＬＰＳ−Ｆ３と特定の自然免疫受容体の相互作用を理解するため、多糖マンナンとβ−グルカン及び単糖Ｄ−マンノース（Ｍａｎ）、Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）、シアル酸が競合アッセイで使用された。Ｆｃ.Ｄｅｃｔｉｎ−１、Ｆｃ.Ｌａｎｇｅｒｉｎ、Ｆｃ.ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＴＬＲ４．Ｆｃ、ＭＭＲ．Ｆｃ、Ｆｃ.ＣＬＥＣ-２（ＣＬＥＣ１Ｂ）、Ｆｃ.ＣＬＥＣ-６（ＣＬＥＣ４Ｄ）を含む、ＧＬＰＳ−Ｆ３に対してより高い結合能力を示した自然免疫受容体が検査された。アッセイは各多糖類または単糖類１ｍｇ／ｍｌを加えて実施例９の通りに実施された。
【０１３４】
図７（糖類の存在しない状況で見られる結合に対して各受容体／糖類の組み合わせの結合％をグラフで示す）及び表１（図７のデータを表形式で示す）に示すように、ＧＬＰＳ−Ｆ３とＦｃ．Ｄｅｃｔｉｎ−１間の相互作用は、公開されている結果に基づくと、阻害率５８％のβグルカンによって遮断され得る（Ｐａｌｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１:５７７１〜５７７９ （２００６）；Ｗｉｌｌｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６:４３８１８〜４３８２３ （２００１））。シアル酸（８３％の阻害率）の添加はＦｃ．Ｄｅｃｔｉｎ−１ のＧＬＰＳ−Ｆ３への結合を阻害した。Ｆｃ．ＬａｎｇｅｒｉｎとＧＬＰＳ−Ｆ３間の相互作用は、ランゲリンの糖リガンドとして報告されている（Ｓｔａｍｂａｃｈ ＆ Ｔａｙｌｏｒ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：４０１〜４１０（２００２））マンナン、Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃ（９５％、２６％、８４％の阻害率）によって分断された。シアル酸（９５％の阻害率）もＦｃ．ランゲリンのＧＬＰＳ−Ｆ３への結合を阻害することが観察された。Ｆｃ．ＤＣ−ＳＩＧＮのＧＬＰＳ−Ｆ３への結合については、マンナン、Ｍａｎ、Ｆｕｃ、シアル酸が強い遮断作用を示した（９８％、７２％、９２％、９０％の阻害率）一方で、ＧｌｃとＧｌｃＮＡｃは相互作用の遮断においてより弱い効果（それぞれ４５％と２７％の阻害率）しかなかった。マンナン、Ｍａｎ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、Ｆｕｃ、シアル酸は、ＧＬＰＳ−Ｆ３と、Ｍａｎ、Ｆｕｃ、ＧｌｃＮＡｃ、シアリルＬｅｗis ｘ（ｓＬｅｘ）に結合することが知られている重要なレクチン受容体である（Ｌｅｔｕｅｘ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１:１１１７〜１１２６（２０００）；Ｓｔａｈｌ、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２:３１７〜３１８（１９９０））ＭＭＲ．Ｆｃ間の相互作用を遮断した（９８％、８７％、４５％、７８％、３６％、８８％、９３％の阻害率）。Ｆｃ．ＣＬＥＣ-２のＧＬＰＳ−Ｆ３に対する相互作用は、シアル酸（５５％の阻害率）の添加によって遮断された。Ｆｃ．ＣＬＥＣ-６については、テストした糖の中で顕著なブロッキングは観察されなかった。とりわけ、マンナンとＦｕｃはＴＬＲ４．ＦｃとＧＬＰＳ−Ｆ３の相互作用に遮断作用（それぞれ７２％と４４％の阻害率）を示した。ここで得られた結果は、Ｄｅｃｔｉｎ−１、ランゲリン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲの糖リガンドに関する研究で報告されている結果に添うものであった。また、多くのレクチン受容体が異なる糖成分を通して多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）のＧＬＰＳ−Ｆ３に結合できることも示された。
【０１３５】
【表１】


表１は糖競合体（ｓｕｇａｒ ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）が不在時に見られる結合に相対する、糖競合体存在時の自然免疫受容体．Ｆｃ融合体のＧＬＰＳ−Ｆ３への結合率を示す。
【０１３６】
実施例７〜１０で提示したシステムはＧＬＰＳだけではなく、現在使用されている多くの漢方薬を含め、ほかの糖タンパク質混合物(ｍｉｘｔｕｒｅ）の高スループットプロファイリングにおいても有用なツールである。多糖の固定化に異なる表面（ＰＶＤＦ及びポリスチレン）を用いることにより、ＧＬＰＳ−Ｆ３について異なるプロファイルを取得することができた。これは、異なる表面に対する混合物中の特定の多糖の選択的結合による可能性がある。これら２つの相補的形式から得られた結果は、多糖類混合物の「フィンガープリント」を提供する。多糖類混合物のこれらフィンガープリント戦略は、例えば、異なる条件下での、異なるソースまたは異なるバッチに由来する、草本抽出物の成分を監視するために用いることができる。さらに、特定の多糖類混合物のプロファイルから集めた情報は、それらの体内における生物学的作用の根本的分子機序を理解する際に非常に重要となる。
【実施例１１】
【０１３７】
ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（ＭＤＬ−１）とデングウイルスの相互作用の検出
以下の実施例は、本発明の融合タンパク質および方法をどのように病原体と相互作用する自然免疫受容体を同定し、かつその後その情報をどのように用いてその自然免疫受容体に結合する病原体の下流の影響を判定し、そしてどのように病原体感染の治療用の治療薬を設計するかに用いることができるかを示す。
【０１３８】
デングは人に影響を与える最も重要な蚊媒介性ウイルス疾病の１つである。その世界的な分布はマラリアにも匹敵し、約２５億人の人々流行性伝播の危険がある地域に居住している。デングウイルス（ＤＶ）感染後の臨床的症候群には、 デング熱（ＤＦ）とデング出血熱（ＤＨＦ）／デングショック症候群（ＤＳＳ）が含まれる。しかし、ＤＨＦおよびＤＳＳを引き起こす根本的分子機序は未だよく解明されていない。
【０１３９】
ＤＣ−ＳＩＧＮは、ヒト樹枝状細胞のＤＶ感染を媒介することが知られている（Ｔａｓｓａｎｅｅｔｒｉｔｈｅｐ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２００３、１９７（７）：８２３〜９）。ＤＶの病因を理解するためには、ＤＶが樹枝状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のほかのメンブレン結合Ｃ型レクチン受容体およびＣ型様レクチン受容体と相互作用できるか否かを判定することが重要である。このため、ＤＶＬＲ１／ＣＬＥＣ４Ａ（ＭＤＬ−１）、Ｄｅｃｔｉｎ−１、ＫＣＲ、およびＤＣ−ＳＩＧＮ（陽性対照として）の細胞外ドメインがヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合された。具体的には、ＤＣ−ＳＩＧＮ（配列番号１７及び配列番号１８）、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（配列番号２１及び配列番号２２）、Ｄｅｃｔｉｎ−１（配列番号２５及び配列番号２６）、ＫＣＲ（フォワード：５'−ＣＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＴ−３' 配列番号３７、リバース：５'−ＴＡＧＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＣＧＣ−３'配列番号３８）のプライマーを使用して 、増幅されたcＤＮＡ断片を生成した。各フォワードプライマーは余分なＢａｍＨｉサイトを有し、各リバースプライマーは余分なＥｃｏＲＩサイトを有しており、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含む哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３.１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への増幅されたｃＤＮＡのサブクローニングが促進される。さらにその後、得られたベクターが可溶性組み換えタンパク質を産生するために２９３ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換された。すべての組み換え受容体．Ｆｃ融合タンパク質がタンパク質Ａセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製され、０．１Ｍ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ０．３）で溶出された。
【０１４０】
各受容体．Ｆｃ融合タンパク質１μｇでマイクロタイタープレート上をコートし、一晩４℃で置いた。その後、結合バッファー（１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中の１６６８１株（ＤＥＮ２株）のＤＶ（５×１０^６粒子）がプレートに添加され、プレートを２時間インキュベーションした。非結合ウイルスの洗浄後、ビオチン化抗ＤＥＮ2エンベロープタンパク質抗体（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｒｏｉ、２００２、７６（８）：３５９６〜６０４）がウイルスに結合させるため１時間適用された。その後希釈した西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ストレプトアビジンをプレートに添加し、続いて１時間インキュベーションした。さらにその後ＴＭＢ基質を加え、ＥＬＩＳＡリーダーを使用してＯＤ４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０１４１】
結果を図８Ａに示す（**はｐ＜０．０１、***はｐ＜０．００１を表す（スチューデントのｔ検定））。結果によると、ＤＣ−ＳＩＧＮ（陽性対照）に加え、ＤＶも ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに結合することが示された。この結果を確認するため、ヒトＩｇＧ１（陰性対照）、ＤＣ−ＳＩＧＮ．Ｆｃ、ＫＣＲ．Ｆｃ、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ. Ｆｃで免疫沈降を実施した。具体的には、５×１０^６のデングウイルス粒子を各タンパク質５μｇでインキュベーションした後、タンパク質Ａビーズを添加した。得られた免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ニトロセルロースメンブレン上に転写した。その後、メンブレンはビオチン化抗ＤＥＮ２エンベロープタンパク質抗体でプローブされ、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ストレプトアビジンで発現された。その結果を図８Ｂに示す。結果によると、ＤＣ−ＳＩＧＮ．Ｆｃと ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．ＦｃのみがＤＶを免疫沈降することができた。
【０１４２】
マイクロタイタープレートアッセイをＥＤＴＡ（１０ｍＭ）が存在する状態でキレートＣａ^＋＋ カチオンに対して繰り返した。結果（図８Ｃ）によると、デングウイルスに結合している ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＣａ^＋＋非依存的であり、一方ＤＣ−ＳＩＧＮ結合はＣａ^＋＋ 依存的であることが示された（***はｐ＜０．００１を表す、スチューデントのｔ検定）。
【０１４３】
マイクロタイタープレートアッセイを、１）５００ＵのグリコシダーゼＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）で一晩３７℃でプレインキュベートされた、または、２）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（０．１Ｍ）で処理された、または、３）９５℃で５分間インキュベートされた、あるいは、４）５分間ＵＶ照射した、ＤＶ粒子（５×１０^６）で ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ融合タンパク質に対しても繰り返した。その結果を図８Ｄに示す（アスタリスクは ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性が未処理のウイルスに対してウイルスの修飾によって変化されている場合を示す、**ｐ＜０．０１、*** ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）。結果は、ＤＶのＰＮＧａｓｅＦでの前処理が ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃの相互作用を大きく阻害し、かつ加熱またはジチオスレイトールのいずれかで前処理がほぼ完全に ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ結合を阻害したが、ＤＣ−ＳＩＧＮ．ＦｃのＤＶへの結合は阻害しないことを示した。これは、ＤＶの糖エピトープと立体構造の両方が ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａへの結合に重要であることを示唆している。
【０１４４】
免疫細胞上での ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を評価するため、フローサイトメトリー分析がヒト多形核（ＰＭＮ）細胞（好中球）、ＰＢＭＣ、マクロファージ、樹枝状細胞に実施された。ＰＭＮとＰＢＭＣは説明したとおりデキストラン沈降法（Ｋｕａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００５、１４５（４）：４６０〜４６８）、及びＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅでの標準密度勾配遠心沈殿法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で人の健常ドナーの全血からそれぞれ分離された。精製した好中球を赤血球の低張性溶解でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。続いてＰＢＭＣから抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ、ベルギッシュグラートバハ）でのＶＡＲＩＯＭＡＣＳ法を使用した高勾配磁気分離によってＣＤ１４＋細胞を精製した後、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を添加した完全なＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲイザースバーグ）で６日間培養した（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ、２００４、７５（３）：４８６〜４９４）。１０％ウシ胎仔血清、８００Ｕ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｃｏｍａｘ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、ニュージャージー州ケニルワース）と、５００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で６日間培養することにより、樹枝状細胞（ＤＣ）を接着（ａｄｈｅｒｅｎｔ）ＰＢＭＣから生成した（未成熟ＤＣ、ｉｍｍａｔｕｒｅ ＤＣ）。成熟した活性ＤＣを作製するため、未成熟ＤＣをさらにγ線照射済み（５５００ｒａｄ）ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）発現Ｌ細胞（ＤＮＡＸ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州パロアルト）と３:１の割合で３６時間インキュベーションした（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、１６８（１０）：４８４６〜４８５３）。
【０１４５】
フローサイトメトリーが、ＦＩＴＣ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａモノクロナール抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）、またはＦＩＴＣ結合抗ＤＣ−ＳＩＧＮモノクロナール抗体（ＥＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使って、二重染色のためＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）結合抗ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ６６抗体と組み合わせ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、上述の細胞型に実施された。背景情報を提供するため、対応するアイソタイプ対照（ＤＶＬＲ１ ｍＡｂに対してＩｇＧ２Ｂ、ＤＣ−ＳＩＧＮに対してＩｇＧ１；Ｓｉｇｍａ）もこの表面染色で実施された。蛍光色素がＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によってＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析された。ＣＤマーカー陽性細胞が ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡまたはＤＣ−ＳＩＧＮの発現を判定するためにゲートされた。その結果を図９Ａ（ ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ）と図９Ｂ（ＤＣ−ＳＩＧＮ）に示す（網掛け部分はアイソタイプ対照を表す）。結果は、ＤＣ−ＳＩＧＮが主に未成熟の樹枝状細胞で発現し、マクロファージでは弱く発現したことが示されている。また、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＣＤ１４＋由来マクロファージ（ＭΦ）、ＣＤ６６＋ＰＭＮ、ＣＤ１４＋新鮮分離ＰＢＭＣの表面上では検出されたが、ＣＤ１４＋由来未成熟及び成熟樹枝状細胞では検出されなかったことも示している。これは、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＲＮＡがヒト単球とマクロファージでは発現するが、樹枝状細胞ではしないという先行観察と合致している（Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９９、９６（１７）：９７９２〜９７９６）。
【０１４６】
この実施例で示された結果は、本発明が開示する受容体．Ｆｃ融合タンパク質に基づいた方法が、デングウイルスなど特定病原体に結合する自然免疫受容体の同一性の判定に利用可能であることを示している。そしてこれは、病原体と相互作用する細胞型を同定し、さらにその病原体による感染の治療または防止の新たなターゲットを提供することを可能にする。例えば、本発明の開示する結果は、ＤＶの ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａへの結合を防止する物質を予防目的または治療目的に利用できることを示唆している。例えば、ＤＶの ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａへの結合を防止する ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに対するモノクロナール抗体を当業者であれば生成することが可能である。さらに、ＤＶはフラビウイルスファミリーのメンバーであるため、この結果は ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａが、例えば、フラビウイルス属内のウイルス（ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、黄熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスなど）及びヘパシウイルス属内のウイルス（Ｃ型肝炎ウイルスなど）といった、同一ファミリー内のほかのウイルスと相互作用する可能性も示唆している。従って、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａはこれらウイルスに対する治療または予防ターゲットとしても作用する可能性がある。加えて、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａはパターン認識受容体であるため、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａはほかのエンベロープウイルスに対する治療または予防ターゲットとして作用する可能性がある。
【実施例１２】
【０１４７】
デングウイルス誘導ＤＡＰ１２リン酸化が ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａによって媒介される
ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（ＭＤＬ−１）は、長さ１８７ａａから成り、膜貫通領域に荷電性残基を含み、ＤＡＰ１２（１２ｋＤａのＤＮＡＸ活性化タンパク質）とペアを組むことが可能なII型膜貫通タンパク質である（Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９９、９６（１７）：９７９２〜９７９６）。ＤＡＰ１２は、最小の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン中に荷電性アスパラギン酸、及びその細胞質尾部にＩＴＡＭ（免疫受容活性化チロシンモチーフ）を含有するジスルフィド結合のホモ二量体状膜貫通タンパク質である。ＤＶはＣＤ１４＋マクロファージ上で ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに結合するため、またＤＡＰ１２はＩＴＡＭを有するため、ＤＶがＣＤ１４＋マクロファージにおいてＤＡＰ１２リン酸化を誘導できるか否かの判定が興味を引く。従って、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００２、７６（１９）：９８７７〜９８８７で開示された方法を若干変更した方法を用いてＣＤ１４＋マクロファージをＤＶに感染させた。簡単に、最終分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）マクロファージは培地中のウシ胎仔血清を除去するために不完全ＲＰＭＩ培地で洗浄された。その後異なる感染多重度（ＭＯＩ）で細胞をＤＶに感染させた。ウイルスは細胞と共に無血清ＲＰＭＩで３７℃で２．５時間インキュベーションされ、ウイルスを吸着させた。培養プレートは最適なウイルス−細胞接触を確約するため３０分ごとに静かに撹拌された。その後、細胞単層を無血清ＲＰＭＩで２回、その後インキュベーションで１回洗浄することにより未吸着のウイルスが除去され、無細胞上清が分離して採取され、かつ感染性ウイルス産生とサイトカイン分泌の分析までアリコートで−８０℃で保存された（実施例１３参照）。感染性ウイルス力価がＢＨＫ−２１細胞でのプラーク形成アッセイによって判定された。プラークはクリスタルバイオレットオーバーレイの７日後に目視検査でカウントされ、上清１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ、plaque-forming unit）数を判定した（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、１９９８、７２（１２）：９７２９〜９７３７）。細胞内のＤＶ抗原を検出するため、感染した細胞が１％のパラホルムアルデヒドで固定され、０.１％のサポニンで膜透過処理され、続いてＮＳ３ ｍＡｂ（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、１９９８、７２（１２）：９７２９〜９７３７）または対応するアイソタイプコントロール（ＩｇＧ１；Ｓｉｇｍａ）で染色された。１時間のインキュベーション後、蛍光検出のためＰＥ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギＦ（ａｂ）’抗マウスＩｇＧ二次抗体が加えられ、蛍光色素がＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーによってＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで分析された。
【０１４８】
結果を図１０Ａ〜Ｄに示す。感染の４８時間後、ＭＯＩ＝５で、ＤＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）がマクロファージの細胞質中にフローサイトメトリーによって検出された（図１０Ａ；灰色のヒストグラムは抗体アイソタイプ対照）。細胞外ウイルス力価が感染後のさまざまな時間に測定され、マクロファージが生（ｌｉｖｅ）ＤＶに感染したときはウイルス粒子が培養上清に放出されるが、ＵＶ照射ＤＶ（ＵＶ−ＤＶ；氷上で５〜１０ｃｍの距離で１５分間２５４ｎｍ照射）では放出されないことが明らかになった（図１０Ｂ）。
【０１４９】
ＤＡＰ１２リン酸化が感染の２時間後にさまざまなＭＯＩ（ＭＯＩ＝０.０５〜３０、感染２時間後）と、一定のＭＯＩ（ＭＯＩ＝５）での時間経過（感染の２〜４８時間後）で検査された。具体的には、リン酸化ＤＡＰ１２の検出のため、マクロファージが適切な時間、適切なＭＯＩでＤＶによって刺激され、その後溶解バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット[Ｒｏｃｈｅ]）中に溶解された。等量の全細胞抽出物（ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ）がＤＡＰ１２ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ. カリフォルニア州）とタンパク質Ａセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）で４時間４℃で免疫沈降された。インキュベーション後、免疫複合体は３回洗浄され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、続いてニトロセルロースメンブレンに転写され、さらに抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）でプローブされた。ＨＲＰ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）二次抗体と増強化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて免疫ブロット作製された。リプロービングのため、メンブレンが強いリプローブキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で剥離され、ＤＡＰ１２抗体でブロットされた。
【０１５０】
多様なＭＯＩで得られた結果を図１０Ｃに、時間経過実験の結果を図１０Ｄにそれぞれ示す。結果は、ＤＶ感染２時間後、ＭＯＩがＭＯＩ＝０.０５から上がるにつれてＤＡＰ１２リン酸化の強度が増加し、ＭＯＩ＝５でピークとなることを示している（図１０Ｃ）。ＤＡＰ１２リン酸化はＤＶ感染２時間後に検出され、１２時間でピークとなり、少なくとも４８時間継続した（図１０Ｄ）。ＵＶ−ＤＶはＣＤ１４＋マクロファージ中で複製できず、プラークアッセイ（図１０Ｂ）で活動がなくても、ＤＡＰ１２はやはり２時間でリン酸化され、強度は生（ｌｉｖｅ）ＤＶによって誘導されたものよりずっと弱いながらも、リン酸化ＤＡＰ１２が１２時間検出可能となった（図１０Ｄ；ＵＶ−ＤＶ）。これは、ＤＶ誘導ＤＡＰ１２リン酸化には２つのフェーズがあり、フェーズＩ（最初の６時間）が複製非依存性で、フェーズＩＩ（１２時間後）が複製依存性であることを示唆している。
【０１５１】
ＤＡＰ１２リン酸化が ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ経由であることを確認するため、ＣＤ１４＋マクロファージにおける ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を阻害するために低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）でのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用し、ＤＡＰ１２リン酸化が上述のようにアッセイされた。具体的には、ヒト ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのコード領域が次の ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｓｉＲＮＡで標的化された。
５'−TTGTTGGAATGACCTTAT-３' 配列番号３９
【０１５２】
このストレッチは、ｓｈＲＮＡを形成するため、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９６（５５６７）：５５０〜５５３からのループ配列（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ）に適応された。本発明で用いられたポリメラーゼＩＩＩターミネーターストレッチはＴＴＴＴＴＴであった。ｓｈＲＮＡは、ｌｏｘＰ部位、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、enhanced green fluorescent protein）の発現を促すＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、下流制限部位（ＨｐａＩ及びＸｈｏＩ）を持つＵ６プロモーターを含むｐＬＬ３．７遺伝子サイレンシングベクターにクローンされた（Ｒｕｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２００３、３３（３）：４０１〜４０６）。また、ＤＣ−ＳＩＧＮ ｓｈＲＮＡコンストラクトは、コンストラクトｐＳＵＰＥＲ−ｓｉＤＣ−ＳＩＧＮ（Ｔａｓｓａｎｅｅｔｒｉｔｈｅｐ ｅｔ ａｌ．、上記参照）に含まれるｓｈ−ＲＮＡをＨｐａＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＬＬ３．７ベクターにサブクローニングすることにより作製された。コンストラクトはＡｍａｘａキット（メリーランド州ゲイザースバーグ）を製造元の規格に従って用い、マクロファージにエレクトロポレーションされた。簡単に、マクロファージ（６x１０^６）が上述のように採取され、１００μＬのヌクレオフェクター溶液に再懸濁された。ｓｉＲＮＡ（５μｇ）またはベクターコントロールを加えた後、細胞はＡｍａｘａプログラムＹ−００１を用いてエレクトロポレーションされ、回復に１６時間与えられた。ＤＶＬＲ１及びＤＣ−ＳＩＧＮサイレンシングの効率が、抗 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ及びＤＣ−ＳＩＧＮモノクロナール抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれ使用した免疫ブロットにより、トランスフェクションの２４時間後に分析された。
【０１５３】
結果を図１１に示す。コントロールベクターｐＬＬ３．７、またはＤＣ−ＳＩＧＮ ｓｈＲＮＡでエレクトロポレーションされたＣＤ１４＋マクロファージは、ＤＶ感染後ＤＡＰ１２リン酸化において減少を示さなかった。対照的に、ＤＡＰ１２リン酸化はＤＶ感染に先立って ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ−ｓｈＲＮＡでエレクトロポレーションされたＣＤ１４＋マクロファージにおいて劇的に減少した。このため、ＤＶ誘導ＤＡＰ１２リン酸化は ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ経由で発生すると結論付けられた。
【実施例１３】
【０１５４】
ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＤＶ介在性ＴＮＦ−α放出に関与しているが、ＣＤ１４＋マクロファージへの侵入には関与していない
ＤＶ感染に際して、ＣＤ１４＋マクロファージは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、上記参照）を含む前炎症性サイトカインとケモカインを分泌する。市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＤＶ感染ＣＤ１４＋マクロファージの培養上清中のＴＮＦ−αのレベルを測定した。測定は異なるＭＯＩで、及び感染後の異なる時間に、生（ｌｉｖｅ）ＤＶとＵＶ−ＤＶについて実施された。結果を図１２Ａ〜Ｃに示す（エラーバーは３回（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均からの標準誤差を示し、アスタリスクはサイトカイン産生の統計的に異なるレベル、*＝ｐ＜０．０５；**＝ｐ＜０．０１；***＝ｐ＜０．００１を示す）。結果によると、感染６時間後、生ＤＶとＵＶ−ＤＶの両方が０.０５〜３０の範囲のＭＯＩでＴＮＦ−α分泌に対し類似の作用をすることが示された（図１２Ａ）。感染１２時間後、ＴＮＦ−αの分泌は生ＤＶのみに対して用量（ＭＯＩの増加）依存的に増加した。ＵＶ−ＤＶ感染細胞については感染１２時間後、ＴＮＦ−αレベルはすべてのＭＯＩで変わらなかった（図１２Ｂ）。図１２ＣにＴＮＦの時間変化測定結果を示す。結果によると、ＭＯＩ＝５で生ＤＶに感染させたとき、ＴＮＦ−αの分泌は６時間（８ｐｇ／ｍｌ）から１２時間（８５ｐｇ／ｍｌ）にかけて急速に増加し、４８時間（３５０ｐｇ／ｍｌ）でピークに達することが示されている。しかし、ＵＶ−ＤＶでインキュベーションしたとき、ＴＮＦ−αの分泌は ８ｐｇ／ｍｌ（６時間時点）から５ｐｇ／ｍｌ（１２時間時点）に減少した。これは初期反応（６時間時点）がウイルス複製に非依存的である一方、ＴＮＦ−α分泌のより後のフェーズ（１２時間後）はＤＶ複製と相関性があることを示唆している。
【０１５５】
ＤＣ−ＳＩＧＮは先に樹枝状細胞へのウイルス侵入を媒介するためＤＶと相互作用することが示されている。ＲＮＡｉ法と先の実施例の試薬を用い、ＤＶ感染ＣＤ１４＋マクロファージ中でのＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈ−ＲＮＡ及び ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ−ｓｈＲＮＡのＮＳ３発現における作用を調べた。図１３Ａは、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈＲＮＡ及び ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ−ｓｈＲＮＡがそれらそれぞれのタンパク質をノックダウンできることを示している（ｐＷＴＳＩ及びｐＬＬ３．７はインサート対照ではない）。図１３Ｂは、フローサイトメトリー分析の結果を示し、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈＲＮＡのみがＣＤ１４＋マクロファージにおけるＤＶ ＮＳ３の発現を弱める可能性があることを示している。この結果は、抗ＤＳ３抗体を用いた共焦点免疫蛍光顕微鏡法で確認された。図１３ＣはｓｈＲＮＡコンストラクトでエレクトロポレーションされた細胞の上清中のウイルス力価のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。結果は、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈＲＮＡのみがＤＶ感染細胞の上清中のウイルス力価を減弱させることができることを示している。
【実施例１４】
【０１５６】
ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＣＤ１４＋マクロファージからのＤＶ誘導性前炎症性サイトカイン放出に関与している
ＥＬＩＳＡを用い、前述の実施例の方法（２．５時間トランスフェクション）に従って ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ及びＤＣ−ＳＩＧＮのノックダウン後、ＤＶに感染した（ＭＯＩ＝５）ＣＤ１４＋マクロファージのサイトカイン放出プロファイルを評価した。最初の１２時間、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈＲＮＡはＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８の分泌に作用しなかった。図１４Ａ〜Ｂを参照する（エラーバーは３回の平均からの標準誤差を示し、アスタリスクは対照実験と比較した統計的に有意な差異を示す、*＝ｐ＜０．０５；**＝ｐ＜０．０１；***＝ｐ＜０．００１）。４８時間後、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ｓｈＲＮＡはＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６の分泌に 軽度の阻害作用（２０％未満）があり、ＩＬ−８の分泌は影響されなかった。ＤＣ−ＳＩＧＮがウイルスの侵入と複製に関与しているため、この観察は初期のサイトカイン分泌（最初の１２時間）がＤＶ複製に非依存的であることを示唆している。対照的に、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡのノックダウンはＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＩＦＮ−α、ＩＬ−８の分泌を大幅に抑制した（ｐ＜０．００５）が、ＩＬ−６は抑制されなかった。これは、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＣＤ１４＋マクロファージからのＤＶ誘導サイトカイン放出に関与していることを示唆している。従って、ＤＶの ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａへの結合を防止する治療薬がヒトにおけるＤＶ誘導サイトカイン放出の有害な影響を防止するために有効となる。例えば、 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡのＤＶとの相互作用を防止するモノクロナール抗体は、ＤＶ誘導デングショック症候群（ＤＳＳ）またはデング出血熱（ＤＨＦ）の防止または治療に有効となる。
【実施例１５】
【０１５７】
拮抗的抗 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａモノクロナール抗体（ｍＡｂ）がＤＶ血清型１、２、３、４による炎症性サイトカイン放出を消滅させる
標準の技法を用いて ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに対するモノクロナール抗体を生成した。簡単に、マウスがＤＶＬＲ−１．Ｆｃ融合タンパク質で免疫され、マウスからの脾細胞をＰ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１[ＮＳ−１]骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）と融合してハイブリドーマを形成した。生成されたｍＡｂのうち、クローン９Ｂ１２、３Ｅ１２のサブクローン（クローン３Ｅ１２Ａ２、３Ｅ１２Ｃ１、３Ｅ１２Ｇ９）、及びクローン８Ｈ８Ｆ５は、ＤＥＮ１（７６６７３３Ａ株）、ＤＥＮ２（PL046株）、ＤＥＮ３（Ｈ−８７株）、ＤＥＮ４（８６６１４６Ａ株）の感染後、用量依存的にマクロファージからのＴＮＦ−α放出を抑制した。図１５にＤＶに感染したＣＤ１４＋マクロファージによって培養上清に分泌されたＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ測定値を示す。標準の命名法に従い、各抗体はそれを分泌するハイブリドーマのクローン番号で呼ばれる。従って、本発明は上述のモノクロナール抗体を分泌するハイブリドーマも提供する。
【０１５８】
結果によると、抗 ＤＶＬＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体は、ヒトのＤＶ感染ＣＤ１４＋マクロファージからの前炎症性サイトカイン放出を防止する有効な治療薬として作用することが示されている。特に、ただし排他的でなく、本実施例のモノクロナール抗体、またはそのフラグメント、あるいは本実施例の抗体と同一のエピトープに結合する抗体（またはそのフラグメント）は、本発明の方法に従い、医薬組成物として作製し、ヒトにおけるＤＶ感染の治療または予防向けに投与することが可能である。
【実施例１６】
【０１５９】
デングウイルスによって活性かされる免疫細胞上のパターン認識受容体（ＰＲＲ）の判定
樹枝状細胞（ＤＣ）及びマクロファージはＤＶ感染の主な標的である（Ｈａｌｓｔｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９７７、１４６：２０１〜２１７；Ｐａｌｕｃｋａ、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２０００、６：７４８〜７４９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２０００、６：８１６〜８２０）。感染したＤＣがアポトーシスを起こす（バイスタンダーＤＣによる前炎症性サイトカインの分泌に関わらず）（Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００５、７９：２４３２〜２４３９）一方、感染したマクロファージは少なくとも４５日間生存し、感染６時間後から複数のサイトカインとケモカインを分泌する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２００２、７６:９８７７〜９８８７）。これは、マクロファージがＤＶ感染に伴う前炎症性サイトカインの主要なソースであり、そこでウイルス粒子がパターン認識受容体（ＰＲＲ）を活性化させることで炎症反応を引き起こす可能性があることを示唆している。このコンテクストで、ＴＯＬＬ様受容体（ＴＬＲ、Toll-like receptor）、Ｃ型レクチン、免疫グロブリン様（Ｉｇ様）受容体（例えば、ＴＲＥＭ及びＴＲＥＭ様受容体（ＴＬＴ））が潜在的ＰＲＲとされている（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４、５：９７５〜９７９；Ｋｌｅｓｎｅｙ−Ｔａｉｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６、７：１２６６〜１２７３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６、７：１２５８〜１２６５）。
【０１６０】
デングウイルスが免疫細胞の候補ＰＲＲに結合し、それらを活性化させるか否かを判定するため、２２の融合タンパク質が哺乳類細胞で発現され、かつＤＶ２とのそれらの相互作用についてスクリーニングされた（表２）。融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ1．Ｆｃフラグメントと、Ｃ型レクチンの細胞外ドメイン及びＩｇ様受容体を含有した。
【０１６１】
【表２−１】

【表２−２】

【０１６２】
表２に組み換え受容体．Ｆｃ融合タンパク質のコンストラクトを示す。
【０１６３】
図１６に示すように、ＤＶはＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａと相互作用する。具体的に、図１６ａはＥＬＩＳＡによって判定されたＤＶ（５×１０^６ ＰＦＵ）の受容体．Ｆｃ（１μｇ）との相互作用を示す。図１６ｂでは、ＤＶ（５×１０^６ ＰＦＵ）と受容体．Ｆｃ（５μｇ）の複合体が免疫沈降され、ＤＶエンベロープ（Ｅ）タンパク質に対するｍＡｂでウェスタンブロット検出された。図１６ｃは、ＥＬＩＳＡで判定された、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）によるＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ-ＤＶ相互作用の阻害を示す。図１６ｄ及び図１６ｅは、ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＬＥＣ４Ｌ）とＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの両方がヒト２９３Ｔ細胞へのＤＶ結合を増加する（図１６ｄ）一方で、糖の添加がＤＣ−ＳＩＧＮ（左パネル）またはＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（右パネル）形質転換２９３Ｔ細胞へのビオチン化ＤＶの結合を用量依存的に阻害する（図１６ｅ）ことをフローサイトメトリーによって判定した、糖競合アッセイを示す。 図１６eにおいて、ＭＦＩは平均蛍光強度を表す。単糖類（マンノース及びフコース）と多糖類（マンナン）の単位（Ｕ）はそれぞれ、ｍＭとｍｇ／ｍｌである。図１６ｆは、ＥＬＩＳＡで測定したＰＮＧａｓｅＦ（５００Ｕ）、ＤＴＴ（０.１Ｍ）、熱（９５℃、５分）、またはＵＶ（１０Ｊ／ｃｍ^２）のＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ-ＤＶ相互作用に対する影響を示す。データは３回の独立した実験の平均値±標準偏差として示されている。両側検定のスチューデントｔ検定を実施した。
【０１６４】
テストした受容体のうち、ＤＣ−ＳＩＧＮはＤＶのエンベロープ（Ｅ）タンパク質上に位置するグリカンと相互作用することがこれまでに示されている（Ｐｏｋｉｄｙｓｈｅｖａ， Ｅ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １２４:４８５〜９３ （２００６））。ＥＬＩＳＡを用い、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ（ＤＣ−ＳＩＧＮ．ＦｃとＤＣ−ＳＩＧＮＲ．Ｆｃに加え）がＤＶ２を捕獲できることが示された（図１６ａ）。ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶ間の相互作用の特異性を確認するため、複合体がタンパク質Ａセファロースビーズで免疫沈降され、その後抗ＤＶエンベロープ（抗Ｅ）モノクロナール抗体（ｍＡｂ）でプローブされた。Ｅタンパク質がＤＣ−ＳＩＧＮ．ＦｃとＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃの免疫沈降で検出され、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａがデングウイルス粒子と相互作用することが確認された（図１６ｂ）。しかしながら、ＤＣ−ＳＩＧＮのＤＶへの結合はＣａ^＋＋依存的である一方で、ＥＤＴＡ（Ｃａ^＋＋キレート剤）はＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用に一切作用しなかった（図１６ｃ）。さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮとＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａでの２９３Ｔ細胞のトランスフェクションはビオチン化ＤＶの細胞への結合増加につながった（図１６ｄ）。
【０１６５】
２つの保存されたＮ−結合糖鎖付加部位がＥタンパク質のＡｓｎ−６７とＡｓｎ−１５３にあり（Ｐｏｋｉｄｙｓｈｅｖａ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １２４:４８５〜９３（２００６））、付着したグリカン（末端フコースとマンノース含有）は細胞吸着とウイルス侵入に関与している（Ｍｏｄｉｓ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ. Ｖｉｒｏｌ． ７９:１２２３〜１２３１（２００５））.ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの会合におけるグリカンの参与を調べるため、ウイルス粒子がフコース、マンノース、またはマンナンとインキュベーションされた。このうちマンノースとマンナンはＤＣ−ＳＩＧＮ用のリガンドである（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６: ２８９３９〜２８９４５（２００６））。予想されたとおり、マンノースとマンナンはＤＣ−ＳＩＧＮとＤＶの相互作用の用量依存的な阻害を引き起こし（図１６ｅ）、一方ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡのＤＶへの結合はフコース（ｐ＜０．０００１）と、より少ない程度ながら、マンナン（ｐ＝０.０００５）の存在で大幅に減少された（図１６ｅ）。ＤＶのＰＮＧａｓｅＦでの前処理もＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用を大きく減少し（図１６ｆ）、ウイルスのＥタンパク質に存在するグリカンが結合に必須であることを示唆している。熱処理またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）もＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用を消滅させることが判明しており（図１６ｆ）、デングウイルス粒子上におけるグリカンの正しい局所的な分布が重要であることを示唆している。
【実施例１７】
【０１６６】
ＤＣ−ＳＩＧＮとＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのデングウイルスとの相互作用
図１７にヒトＰＢＭＣにおけるＤＣ−ＳＩＧＮ及びＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現パターンを示す。新鮮分離ＰＢＭＣがＰＥ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体で図１７ａに示す実施形態に基づいてＣＤマーカー（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）とＦＩＴＣ結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗ＤＣ−ＳＩＧＮ ｍＡｂに、または図１７ｂに示す実施形態に基づいてＦＩＴＣ結合抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に二重染色された。ＣＤマーカー陽性細胞がＤＣ−ＳＩＧＮとＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を判定するためにゲートされた（点線）。網掛け部分はアイソタイプ対照を示す。
【０１６７】
ＤＣとマクロファージ上で発現したＤＣ−ＳＩＧＮ（図１７a）は、その細胞質尾部にエンドサイトーシスまたは細胞内輸送のいずれかに関与すると考えられているモチーフを３つ含有する（Ｌｏｚａｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００５、２８０、２３６９８〜２３７０８）。対照的に、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａは本来単球とマクロファージ上で排他的に発現されるＤＡＰ１２会合分子として同定されているが（図１７ｂ）、そのリガンド及び生物学的機能は謎のままである（Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９、９６、９７９２〜９７９６）。
【実施例１８】
【０１６８】
ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＤＶ誘導ＤＡＰ１２リン酸化に必須であるが、デングウイルス複製には必須でない
図１８に示す実施形態に基づくと、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＤＶ誘導ＤＡＰ１２リン酸化に必須であるが、ＤＶ複製には必須でない。具体的には、図１８ａにおいて、リン酸化チロシン及びＤＡＰ１２に対する抗体を用いてウェスタンブロットでヒトマクロファージにおけるＤＶ誘導 ＤＡＰ１２リン酸化（感染２時間後）が判定された。図１８ｂはＤＶ及び紫外線不活化ＤＶ（ＵＶ−ＤＶ）によって誘導されたＤＡＰ１２リン酸化のキネティクスを示す。図１８ｃはｓｈＲＮＡのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ及びＤＣ−ＳＩＧＮの発現をノックダウンする能力と、ＤＶ介在性（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）ＤＡＰ１２リン酸化を阻害する能力を示す。図１８ｄはフローサイトメトリーで判定したマクロファージにおけるＤＶ侵入と複製に対するｓｈＲＮＡの作用を示す。図１８ｅは共焦点顕微鏡で検査した非構造タンパク質ＮＳ３（赤；Ｃｙ３標識）の発現に対する抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂ、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ ｍＡｂ、マウスＩｇＧ（５０ μｇ／ｍｌ）の作用を示す（Ｔａｓｓａｎｅｅｔｒｉｔｈｅｐ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７: ８２３〜２９（２００３））。細胞はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（青）でカウンター染色された。図１８ｄおよび図１８ｅの両方で、マクロファージをＤＶ（ｍ．ｏ．ｉ．＝ ５）に感染させ、感染４８時間後のＮＳ３発現を判定した。図１８ｆは感染マクロファージのＤＶ力価に対するｓｈＲＮＡの作用を示す。
【０１６９】
マクロファージのＤＶ感染は用量依存的にＤＡＰ１２リン酸化を誘導することが分かった（図１８ａ）。ＤＡＰ１２リン酸化は感染１２時間後（p.i.）にピークに達し、生（ｌｉｖｅ）ＤＶの存在する中では少なくとも４８時間持続した一方で、紫外線不活化デングウイルス（ＵＶ−ＤＶ）は限られたＤＡＰ１２リン酸化のみを生じ、１２時間だけ持続した（図１８ｂ）。これは、感染から最初の２〜６時間、ＤＡＰ１２リン酸化がＤＶ複製に非依存的であることを示している。ＤＣ−ＳＩＧＮのノックダウン（ｐＬＬ３．７／ＤＣ−ＳＩＧＮによる）ではなく、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのノックダウン（ｓｈＲＮＡ ｐＬＬ３．７／ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａを使用）が、ＤＡＰ１２リン酸化に大幅な減少を引き起こしており（図１８ｃ）、ＤＶでトリガされるＤＡＰ１２リン酸化はＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに媒介されることを示唆している。
【０１７０】
ＤＣ−ＳＩＧＮはＤＶによるＤＣの感染に関与していることが知られている（Ｎａｖａｒｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ． ４:７２３〜２８（２００３）；Ｔａｓｓａｎｅｅｔｒｉｔｈｅｐ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９７:８２３〜８２９（２００３））。このため、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＤＶのマクロファージへの侵入に関与しているか否かを知るために、ＤＶがマクロファージ中で複製されるときに発現されるＤＶ非構造タンパク質３（ＮＳ３）の発現を監視することにより、それをテストした。ＤＣ−ＳＩＧＮと対照的に、ｓｈＲＮＡによるＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのノックダウン（図１８ｄ）または抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ＡｂでのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用の遮断（図１８ｅ）は、マクロファージにおけるＮＳ３発現を阻害しなかった（それぞれフローサイトメトリーと共焦点顕微鏡で検査）。ｓｈＲＮＡ ｐＬＬ３．７／ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａも感染したマクロファージの上清へのデングウイルス粒子の放出を抑制できなかった（プラーク形成アッセイで判定）（図１８ｆ）。これらの結果は、ＤＣ−ＳＩＧＮがＤＶ感染と複製に介在する一方で、ＤＶとＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの相互作用が細胞シグナリングを引き起こすことを示唆している。
【実施例１９】
【０１７１】
ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａとデングウイルスの相互作用の阻害がウイルスの排除反応に影響せずに感染したマクロファージによる炎症反応を抑制する
ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＤＶ誘導性炎症に関与しているか否かを判定するため、ＤＶ感染後のマクロファージによる炎症性サイトカインの分泌を調べた。
【０１７２】
図１９に示す実施形態に基づくと、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＤＶ介在性ＴＮＦ−αの分泌に重要であるが、ＩＦＮ−αの分泌には重要でない。より具体的に、図１９ａはＥＬＩＳＡにより６時間及び感染１２時間後に測定されたマクロファージによるＤＶ及びＵＶ−ＤＶ誘導性ＴＮＦ−α分泌の用量依存性を示す。図１９ｂはＤＶ感染（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）後のＴＮＦ−α発現のキネティクスを示す。図１９ｃはＤＶ感染マクロファージ（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）からのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＭＩＰ１−α、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−αの分泌に対するＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＣ−ＳＩＧＮ ｓｈＲＮＡの作用を示す。図１９ｄでは、受容体特異的ｓｈＲＮＡでのノックダウン実験により、ＤＶ誘導ＩＦＮ−αの分泌がＴＬＲ７−ＭｙＤ８８経由であり、ＴＮＦ−αの分泌がＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ−ＴＬＲ７−ＭｙＤ８８経由であることを示す。図１９ｅは、ＤＶ血清型１〜４に応答したＴＮＦ−αの分泌を阻害する拮抗的抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂが阻害されていることを示す（表３参照）。
【０１７３】
【表３】

【０１７４】
表３に抗ヒトＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂの特性を示す。「*」−ｐ＜０．０５；「**」−ｐ＜０．０１；「***」−ｐ＜０．００１。ヒトマクロファージからのＤＶ誘導ＴＮＦ−α分泌を抑制することができる抗体（１０μｇ／試料）。両側検定のスチューデントｔ検定を実施してデータを適切な各アイソタイプ対照抗体と比較した。ヒトマクロファージからＴＮＦ−αの分泌を引き起こすことができる抗体は（アイソタイプ対照と比較して）アゴニスティックであると定義された。特異性はｐＬＬ３．７／ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｓｈＲＮＡ（ｐＬＬ３．７ ベクター及びｐＬＬ３．７／ＤＣ−ＳＩＧＮはＴＮＦ−α分泌を媒介する抗体に対していかなる作用もなかった）を使ったＴＮＦ−α分泌の消滅によって確認された。ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＷＢ、ウェスタンブロット；ＦＡＣＳ、蛍光標識細胞分取。抗体はアジ化ナトリウム不含有、濾過滅菌済み、エンドトキシンレベル１マイクログラム当たり０.１ＥＵ未満。
【０１７５】
Ｍ．Ｒ．ｍＡｂ（抗マンノース受容体ｍＡｂ；ｍＩｇＧ１）とマウスＩｇＭ（ｍＩｇＭ）を陰性対照として用いた。図１９ｄと図１９ｅの両方で、マクロファージがＤＶ（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）に感染され、サイトカインアッセイ用に感染３６時間後に採取された。データは３回の独立した実験の平均値±標準偏差として示されている（少なくとも３つの異なるドナーからのマテリアルを使用）。両側検定のスチューデントｔ検定を実施した。「ＮＤ」は未検出を表す。
【０１７６】
感染６時間後にＴＮＦ−αの用量依存的分泌が検出され、ＤＶまたはＵＶ−ＤＶのいずれかに感染されたマクロファージによって同程度のサイトカインが分泌された（図１９ａ、左パネル）。しかし、感染１２時間後では、ＤＶによるＴＮＦ−αの分泌がさらに増加したものの、ＵＶ−ＤＶでは増加しなかった（図１９a、右パネル）。４８時間の時間経過中、ＴＮＦ−αの分泌はＤＶに感染されたマクロファージで連続して増加した一方、ＵＶ−ＤＶの感染２４〜４８時間後、このサイトカインはほぼ検出できなかった（図１９ｂ）。これらのデータはＤＡＰ１２リン酸化のキネティクス（図１８ｂ）に準じており、ＤＶ介在性ＴＮＦ−αの分泌はＤＡＰ１２の活性化に関連があることを示唆している。また、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡのノックダウンがＤＶ感染マクロファージによるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ１−α、ＩＰ−１０の放出をＤＣ−ＳＩＧＮのノックダウンよりも大幅に抑制したことが観察された（図１９ｃ）。しかしながら、ｐＬＬ３．７／ＤＣ−ＳＩＧＮがＩＦＮ−αの分泌を軽度に抑制した（ｐ＝０.０４８）一方で、ｐＬＬ３．７／ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＩＦＮ−αにまったく作用しなかった（図１９ｃ）。
【０１７７】
サイトカインの分泌につながるＤＶ活性化シグナリング経路をより理解するために、ＤＶ感染に先立ってマクロファージがｓｈＲＮＡで形質転換され、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、またはＭｙＤ８８をノックダウンした。得られたデータによると、ＤＶ誘導ＩＦＮ−αの分泌はＴＬＲ７−ＭｙＤ８８経路で発生し（ｐ＝０.００１６）、一方ＴＮＦ−αの分泌はＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（ｐ＝０.００３）とＴＬＲ７−ＭｙＤ８８の両方を介して媒介される（ｐ＝０.０１３）（図１９ｄ）ことが示唆されている。ＤＶの４つの血清型（上の表３参照）に対してＤＶ感染マクロファージからのＴＮＦ−α分泌の阻害によって判断された特異的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）拮抗的作用を持つ抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂの一群が生成された（図３ｅ）。これらのデータは、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの異なるエピトープが個々の相互作用を媒介するようであるが、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用を阻害する抗体は関連のＤＶ血清型に感染したマクロファージによる炎症応答を抑制できることを示している。抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂの特異的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）拮抗的作用は、各ＤＶ血清型がＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの異なるエピトープに結合し、かつ抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂは抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂの結合部位と重なる結合部位を持つ特定のＤＶ血清型の結合を阻害することができるという事実に関連している可能性がある。
【実施例２０】
【０１７８】
抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）介在性ＩＦＮ−αの分泌はＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに非依存的である
非中和性抗ＤＶ ＡｂがＦｃＲ受容体を介してＤＶの標的細胞への侵入を助け、それによりサイトカイン放出を増強する、感染の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ、antibody-dependent enhancement）と呼ばれる現象がこれまでに示されている（Ｈａｌｓｔｅａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １４６:２０１〜２１７（１９７７）；Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４:９４２２〜９４２７（２００７））。例えば、抗ｐｒＭ及び抗Ｅ ｍＡｂは体外でこの作用を誘導することが示されている（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ １７６:２８２５〜２８３２（２００６））。ここでは、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用の遮断がＡＤＥを阻害できるか否かに関する調査を実施した。
【０１７９】
図２０に示す実施形態のとおり、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡはＡＤＥ介在性ＴＮＦ−α分泌に重要であるが、ＩＦＮ−αは重要でない。より具体的には、図２０ａでマクロファージがＤＶ（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）、ＤＶ／抗ＥまたはＤＶ／抗ｐｒＭ免疫複合体（ＡＤＥ）に３６時間感染され、続いて抗ＮＳ３ ｍＡｂによりＤＶ複製の検出を行った。拮抗的抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂ（１μｇ；クローン９Ｂ１２Ｈ４）またはアイソタイプ対照が存在する状況で、１０人からのマクロファージがＤＶ２（図２０ｂ）あるいはＤＶ／抗ｐｒＭまたはＤＶ／抗Ｅ複合体（図２０ｃ）に感染された。ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−αの分泌がＥＬＩＳＡで判定された。両側検定のスチューデントＴ検定を実施した。
【０１８０】
プライマリヒトマクロファージが、ＤＶ単独または抗ｐｒＭ／ＤＶまたは抗Ｅ／ＤＶ免疫複合体と共に、抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂ（またはアイソタイプ対照）が存在する状況で３６時間感染された。抗ｐｒＭ／ＤＶ及び抗Ｅ／ＤＶ免疫複合体（ＡＤＥ）は、ＤＶ単独と比較してＮＳ３の発現（図２０ａ）及びＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの分泌レベルを増加する（図２０ｂおよび図２０ｃ）ことが分かった。しかしながら、抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂがＤＶ、抗ｐｒＭ／ＤＶ及び抗Ｅ／ＤＶ免疫複合体（図２０ｃ）に感染したマクロファージからのＴＮＦ−α放出を大幅に阻害する一方で、ＩＦＮ−αの分泌は影響を受けず、ＡＤＥ介在性ＩＦＮ−αの分泌は、（ＤＶ誘導ＩＦＮ−α産生に関して上述したように）ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに非依存的であることを示唆している。
【実施例２１】
【０１８１】
デングウイルス誘導血管漏出におけるＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの関与
ＤＨＦとＤＳＳの特徴は、皮下及び重要臓器の出血を伴う血漿タンパクの漏出である。これらの症状は血管透過性を高める数々の可溶性因子と免疫細胞によって放出されるサイトカインにより引き起こされる（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９：４２９〜４３６（２００６））。ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＤＶ誘導血管漏出に関与しているか否かを判定するため、ヒト皮膚微小血管内皮細胞の単層（ＨＭＥＣ−１）が透過性アッセイで用いられた（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：５２１〜５２８（２００３））。
【０１８２】
図２１に示す実施形態に基づき、拮抗的抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂはＤＶ感染マクロファージの上清によって内皮細胞単層の透過性を回復（ｒｅｓｃｕｅ）する。より具体的に、図２１ａはＤＶまたはＤＶ／抗ｐｒＭ複合体（ＡＤＥ）に感染したマクロファージからの上清でのインキュベーション後にＨＲＰの透過を測定することによって判定されたＨＭＥＣ−１単層の透過性における時間経過上の変化を示す。上清中のＴＮＦ−αレベルがＥＬＩＳＡによって測定された。図２１ｂに示すように、ＴＮＦＲ２．Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）と抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（クローン９Ｂ１２Ｈ４、５μｇ／ｍｌ）内皮単層の透過性に対する阻害作用が判定された。データは３回の独立した実験の平均値±標準偏差として示されている。両側検定のスチューデントｔ検定を実施した。
【０１８３】
ＤＶまたは抗ｐｒＭ／ＤＶ免疫複合体に感染したマクロファージからの上清は、ＨＭＥＣ−１単層における透過性を誘導することが分かった。そのうち、免疫複合体（ＡＤＥ）は感染の最初の３６〜４８時間にわたりＤＶ単独よりも大きな作用を示した（図２１ａ、左）。興味深いことに、透過性における変化は上清中のＴＮＦ−αレベルと相関性がなかった（図２１ａ、右）。さらに、組み換えＴＮＦＲ２．ＦｃによるＴＮＦ−αの中和がＤＶまたは抗ｐｒＭ／ＤＶによって引き起こされる透過性の誘導を部分的に阻害することができた（ｐ＜０．０５）（図２１ｂ）一方で、抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂはこれに関してより効果的であった（図２１ｂ）。抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＴＮＦ−α（図１９ｃ）に加え、マクロファージによるほかの炎症性サイトカインの分泌を遮断したことが観察されており、これがこの現象を説明できるかもしれない。
【実施例２２】
【０１８４】
拮抗的ｍＡｂとデングウイルス誘導性ＴＮＦ−α分泌間の用量依存的相互作用
ＤＶとＣＬＥＣ５Ａの相互作用の遮断が体内でのＤＶ誘導致死性からマウスを回復させることができるか否かについてさらに調査を実施した。図２２に示す実施形態に基づき、ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用（図２２ａ）及びｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのマウス細胞における発現パターンを（図２２ｂ及び図２２ｃ）が示された。より具体的に、図２２ＡはＥＬＩＳＡによって判定されたＤＶ（５×１０^６ＰＦＵ）とヒト及びマウスのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ（１μｇ）の相互作用を示す。マウス脾細胞（図２２ｂ）、マウス骨髄（ＢＭ）由来マクロファージ及びマウスマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７（図２２ｃ）におけるｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａの発現を判定するため、Ｆ４／８０及びＣＤマーカー陽性細胞がゲートされた。
【０１８５】
マウスＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ）はヒトＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａと同様の親和性でＤＶと結合し（図２２ａ）、ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａは骨髄系（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋）、骨髄由来マクロファージ、及びマウスマクロファージ様Ｒａｗ２６４．７細胞で発現されることが分かった（図２２ｂ及び図２２ｃ）。
【実施例２３】
【０１８６】
ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用の遮断はＲａｗ２６４．７細胞からのＤＶ誘導ＴＮＦ−αの分泌を抑制する。
図２３に示す実施形態に基づくと、ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用の遮断はＲａｗ２６４．７細胞からのＤＶ誘導ＴＮＦ−αの分泌を抑制する。より具体的に、図２３ａはヒトＤＣ−ＳＩＧＮがマウスマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７へのＤＶ結合を増加し、ＤＶ感染の促進作用を増強したことを示す。ＴＮＦ−α放出がＥＬＩＳＡによって判定された。図２３ｂは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを安定的に発現しているマウスＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ. Ｒａｗ２６４．７細胞に対する拮抗的ｍＡｂの同定が、ｍＡｂの存在する状況でＤＶ２（PL046; ｍ．ｏ．ｉ．＝３０）とインキュベーションされたことを示す。上清中のＴＮＦ−αレベル（感染４８時間後）がＥＬＩＳＡで判定された。図２３ｃは抗ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂ（クローン：３Ｄ２Ｈ６及び１０Ｄ７Ｈ３）がＤＶ２（ＮＧＣ−Ｎ；ｍ．ｏ．ｉ．＝３０）誘導性ＴＮＦ−α放出を用量依存的に阻害することを示す。ｍＩｇＧ１はアイソタイプ対応の陰性対照として作用する。
【０１８７】
ＤＶはヒトＤＣ−ＳＩＧＮを安定的に発現しているＲａｗ２６４．７細胞（Ｒａｗ２６４．７／ＤＣ−ＳＩＧＮ）を刺激し、ＴＮＦ−αを分泌させ（図２３ａ）、拮抗的ｍＡｂ（表４）によるｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用の遮断はＲａｗ２６４．７／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞によるＤＶ誘導ＴＮＦ−αの分泌を用量依存的に消滅させた（図２３ｂ及び図２３ｃ）。
【０１８８】
【表４】

【０１８９】
表４に抗マウス ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂの特徴を示す。「*」−ｐ＜０．０５；「**」−ｐ＜０．０１；「ＮＤ」−未実施。マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７／ＤＣ−ＳＩＧＮからのＤＶ誘導ＴＮＦ−αの分泌を抑制する抗体。両側検定スチューデントＴ検定を実施し、データを適切な各アイソタイプコントロール抗体と比較した。ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＦＡＣＳ、蛍光標識細胞分取。抗体はアジ化ナトリウム不含有、濾過滅菌済み、エンドトキシンレベル１マイクログラム当たり０.１ＥＵ未満。
【実施例２４】
【０１９０】
デングウイルス（ＮＧＣ−Ｎ）はＳＴＡＴ１−／−マウスで致死性を誘導する
図２４に示す実施形態に基づき、ＳＴＡＴ１−／−マウス（ｎ＝５／グループ）が幅広い範囲の投与量（１０２〜１０５ＰＦＵ）のＤＶ２／PL046またはＤＶ２／ＮＧＣ−Ｎ株（ｉ．ｐ．及びｉ．ｃ．ルート）で４週間チャレンジされた。データをカプラン−マイヤー生存曲線で示す。
【０１９１】
ＩＦＮ−αはウイルス複製を感染細胞と未感染細胞の両方で阻害する作用を発揮し、ＤＶ感染に対するＩＦＮ介在性応答はＳＴＡＴ１依存的（ウイルス複製のコントロールに不可欠）及びＳＴＡＴ１非依存的（感染の消散に不可欠）経路の両方に関係がある（Ｓｈｒｅｓｔａ、ｅｔ ａｌ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：３９４６〜３９５４（２００５））。野生型マウスはＤＶ感染に耐性があったが、ＳＴＡＴ１欠損（ＳＴＡＴ１−／−）（Ｄｕｒｂｉｎ、 ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ．８４：４４３〜４５０（１９９６））マウスはＤＶ２〜９（Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａ Ｃ−Ｎ株）誘導致死性に感受性があった（図２４）。
【実施例２５】
【０１９２】
ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに対する拮抗的ｍＡｂの潜在的治療作用
ＳＴＡＴ１−／−マウスに対する拮抗的ｍＡｂの潜在的治療作用についてさらにテストを実施した。図２５に示す実施形態に基づき、抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂはＳＴＡＴ１欠損マウスにおいてＤＶ誘導血管漏出と致死性を防止する。より具体的に、図２５ａでは、ｍＡｂ ３Ｄ２Ｈ６に対して作成したマウスＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＤＶチャレンジＳＴＡＴ１−／−マウスの皮下及び腸出血を阻害している。図２５ｂでは、ＤＶチャレンジＳＴＡＴ１−／−マウスの重要臓器への血漿タンパクの漏出がＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａに対するｍＡｂ（３Ｄ２Ｈ６及び１０Ｄ７Ｈ３）によって減少されたことがエバンスブルーアッセイにより判定された。 図２５ｃは臓器からのエバンスブルーの抽出による血管透過性の定量化を示す。データは３回の独立した実験の平均値±標準偏差として示されている：*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。図２５ｄは抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂまたはＴＮＦＲ２．Ｆｃの存在するまたは存在しない状況における感染７日目のＤＶチャレンジＳＴＡＴ１−／−マウスに関するＴＮＦ−αとＩＰ−１０の血漿レベル（ｎ＝８；上と中央）及びウイルス力価（ｎ＝４；下）を示す。両側検定のスチューデントｔ検定を実施した。図２５ｅは拮抗的抗マウス ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂまたはＴＮＦＲ２．Ｆｃが存在する状態でＤＶ２（Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａ Ｃ−Ｎ株、１×１０^５ ＰＦＵ／マウスｉ．ｐ．＋ｉ．ｃ．ルート）でチャレンジされたＳＴＡＴ１欠損マウスの生存曲線を示す。データは４回の独立した実験（各グループ１７マウス）から収集され、ログランク検定でカプラン−マイヤー生存曲線として示した。ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂの治療とマウスＩｇＧ間の有意な差異のｐ値が示されている。
【０１９３】
ＤＶチャレンジＳＴＡＴ１−／−マウスは感染８日目に皮下と腸の出血に加えて被毛の乱れと弱い麻痺を示し（図２５ａ）、感染から７〜１４日以内にすべて死亡した（図２５ｅ）。５用量のＡｂ（１００μｇ／マウス、ｉ．ｐ．）またはＴＮＦＲ２．Ｆｃ（１００μｇ／マウス、ｉ．ｐ．）が感染０、１、３、５、７日目に投与された。感染９日目、ＤＶチャレンジマウスの腎臓、肝臓、胃、小腸、大腸、脾臓へのエバンスブルーの漏出が対照群と比較して抗ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂで治療したマウスで大幅に減少した（図２５ｂ及び図２５ｃ）。抗ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂも感染７日目に（図２５ｄ、下）ウイルス複製を抑制することなく、ＴＮＦ−αとＩＰ−１０の血漿レベルを効果的に低下させ（図２５ｄ、上と中央）、感染１４日目にマウスを致死性から保護した（７０％の保護率）。抗ｍＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａで治療されたマウスの全体生存率は感染２１日目の観察で４８％であり（図２５ｅ）、感染２３日目に存命マウスの血漿からＤＶが排除された（データは表示していない）。従って、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用を遮断することは、出血及び血漿タンパク漏出というＤＶ関連合併症を防止し、同時に適応的免疫反応によるウイルス排除を妨げることなく、マクロファージ炎症性応答を抑制した。対照的に、ＴＮＦＲ２．ＦｃはＴＮＦ−αの血漿レベルを効果的に低下させたものの（図２５ｄ）、血管透過性（図２５ｃ）を減少することも、致死性からマウスを保護することも（図２５ｅ）なかった。
【実施例２６】
【０１９４】
ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡがＪＥＶ介在性ＤＡＰ１２リン酸化とヒトマクロファージからのＴＮＦ−α分泌に関与している
ＤＶ同様に、ＪＥＶは類似のウイルス感染応答パターンに従い、これはすべてのフラビウイルスで同一または類似であると考えられる。図２６ａに示すように、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ．Ｆｃ（１μｇ）のＪＥＶ及びＤＶ（５×１０^６ＰＦＵ）それぞれとの相互作用がＥＬＩＳＡによって判定された。ＤＶはヒトＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（１８７アミノ酸長）配列番号７２と相互作用するが、選択的スプライシングされた形態のｓＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ（ａａ４３〜６５が削除されている）配列番号 ７３とはしない。対照的に、ＪＥＶはｓＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのみと相互作用するが、全長のＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａとはしない。図２６ｂに示すように、ＤＶはヒトマクロファージにおいてＤＡＰ１２リン酸化を（感染２時間後に）誘導する。ＤＶ感染マクロファージのＤＡＰ１２が抗ＤＡＰ１２ ｍＡｂによって沈降され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画後ニトロセルロースペーパーにブロットされ、続いてリン酸化チロシンとＤＡＰ１２に対する抗体でそれぞれインキュベーションされる。ＪＥＶ誘導ＤＡＰ１２リン酸化（ｍ．ｏ．ｉ．＝５）はｐＬＬ３．７／ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａによって阻害される。図２６ｃに、ＪＥＶ感染に反応したヒトマクロファージからのＴＮＦ−α分泌のキネティクス（左）が示されている。ＪＥＶ誘導ＴＮＦ−α分泌はｐＬＬ３.５／ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ ｍＡｂによって阻害される（右）。データは３回の独立した実験の平均値±標準偏差として示されている。
【実施例２７】
【０１９５】
ｍＡｂ ３Ｅ１２Ａ２の可変重鎖及び軽鎖配列
ｍＡｂ ３Ｅ１２Ａ２の可変重鎖配列を下に示す（配列番号 ６０）：
【表５】

ｍＡｂ ３Ｅ１２Ａ２の可変軽鎖配列を下に示す（配列番号 ６１）：
【表６】

【実施例２８】
【０１９６】
可変重鎖及び軽鎖配列 for ｍＡｂ ３Ｅ１２Ｇ９
ｍＡｂ ３Ｅ１２Ｇ９の可変重鎖配列を下に示す（配列番号 ６２）：
【表７】

ｍＡｂ ３Ｅ１２Ｇ９の可変軽鎖配列を下に示す（配列番号 ６３）：
【表８】

【実施例２９】
【０１９７】
ｍＡｂ ８Ｈ８Ｆ５の可変重鎖及び軽鎖配列
ｍＡｂ ８Ｈ８Ｆ５の可変重鎖配列を下に示す（配列番号 ６４）：
【表９】

ｍＡｂ ８Ｈ８Ｆ５の可変軽鎖配列を下に示す（配列番号 ６５）：
【表１０】

【実施例３０】
【０１９８】
ｍＡｂ ８Ｈ８Ｆ５、３Ｅ１２Ａ２、３Ｅ１２Ｇ９の可変重鎖及び軽鎖配列の比較
ｍＡｂ ８Ｈ８Ｆ５、３Ｅ１２Ａ２、３Ｅ１２Ｇ９の可変重鎖配列の比較を下に示す（それぞれ配列番号 ６６、６７、６８）：
【表１１】

ｍＡｂ ８Ｈ８Ｆ５、３Ｅ１２Ａ２、３Ｅ１２Ｇ９の可変軽鎖配列の比較を下に示す（それぞれ配列番号 ６９、７０、７１）：
【表１２】

【０１９９】
ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａはデングウイルス粒子徒食説相互作用し、かつ、それにより、ＤＡＰ１２リン酸化をもたらす。ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用を遮断することでインターフェロンαの放出に影響することなく、前炎症性サイトカインの分泌が抑制される。さらに、抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａモノクロナール抗体はＤＶ誘導血漿タンパクの漏出、及び皮下と重要臓器の出血を阻害し、かつＳＴＡＴ１欠損マウスでＤＶ感染の発生を最大５０％減少する。この結果は、ＤＶによって引き起こされるマクロファージからのサイトカイン放出にＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＴＬＲ７経路の両方が関与しており、一方ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５ＡとＤＶの相互作用の遮断がウイルスの排除を妨げることなく炎症を軽減することを示唆している。しかしながら、ＴＬＲ７（またはＭｙＤ８８）受容体の遮断は前炎症性サイトカインと、ウイルス排除性サイトカインの両方の分泌を阻害し、ウイルス及び炎症の排除を最終的に妨げる。このため、デングウイルス、及び日本脳炎ウイルスなどほかのフラビウイルスの効果的な治療には、ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａのウイルス結合の減衰を必要とするが、ＴＬＲ７またはＭｙＤ８８受容体については必要としない。従って、デングウイルスと抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体の結合遮断はＤＨＦ／ＤＳＳ患者における重度のデング疾病進行に対する治療を提供する。
【０２００】
前述に記載した本明細書は当業者が本発明を実施するために十分であると考えられる。寄託された実施例は本発明及び本発明の範囲内で機能的に同等な任意の抗体の特定の要素のみを示すことが意図されているため、本発明は寄託されたハイブリドーマによって範囲が限定されることはない。本発明における材料の寄託は、ここに記載された説明が、その最良の実施形態を含め、本発明の任意の要素の実施を可能にするために不十分であるということを認めることを構成せず、また請求項の範囲をそれらが表す特定の説明に限定すると見なされない。実際に、ここに示し、ここで説明されたものに加え、本発明の多様な変更が前述の説明から当業者にとって明らかとなり、それらは後付の特許請求の範囲内に含まれる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体の結合領域（ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に付着させるための領域を含む融合タンパク質の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を取得する工程、
病原体が融合タンパク質の補体の少なくとも１つの融合タンパク質の結合領域に結合するかを決定するため前記融合タンパク質と病原体を接触させる工程、
前記病原体が前記融合タンパク質に結合されているかを検出する工程、
を含み、そのうち、前記融合タンパク質の補体が少なくとも１つの受容体の複数の異なる結合領域を表すことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記融合タンパク質の補体の結合領域が、細胞膜受容体の細胞外部分のグリカン結合部位を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基質に付着させるための前記領域が免疫グロブリンの.Ｆｃ部分であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出の方法が酵素結合免疫吸着アッセイであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記病原体がフラビウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記フラビウイルスがデングウイルスであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記フラビウイルスが日本脳炎ウイルスであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
病原体に感受性のある細胞を取得する工程、
少なくとも１つの細胞受容体遺伝子をノックダウンする工程、
前記細胞と前記病原体を接触させる工程、
前記細胞のサイトカイン分泌レベルを測定する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項９】
さらにサイトカイン放出に作用する受容体を判定するために分泌量測定値の相関性を探る工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
測定される前記サイトカインの分泌が、ＴＮＦ−αの分泌であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記病原体がフラビウイルスであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記フラビウイルスがデングウイルスであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フラビウイルスが日本脳炎ウイルスであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
病原体によって示されるリガンドに結合する少なくとも１つの細胞受容体を同定する工程、
前記病原体に感染した動物に対し、前記受容体への前記リガンドの結合を阻害して前記病原体の作用を修飾するため物質を投与する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記病原体がフラビウイルスであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記フラビウイルスがデングウイルスであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記受容体がＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記作用が細胞からのＴＮＦ−αの放出であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記フラビウイルスが日本脳炎ウイルスであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記物質が、前記病原体に対する前記受容体の親和性を減少する前記受容体に対する抗体であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記作用が細胞からのサイトカインの放出であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記サイトカインがＴＮＦ−αであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記受容体がＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
病原体の動物における作用を修飾するため動物に感染している病原体の作用を修飾する物質の有効量を提供する工程を含み、そのうち前記物質が動物のネイティブ細胞の少なくとも１つの細胞受容体に誘導され、前記受容体が病原体によって示されるリガンドに結合することを阻止することを特徴とする、方法。
【請求項２５】
前記リガンドがグリカンであることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記物質が受容体に結合する抗体であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体であり、前記受容体がＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記病原体がフラビウイルスであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記フラビウイルスが、デングウイルスまたは日本脳炎ウイルスのいずれかであることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
デングウイルスに感染した動物に有効量の抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体を提供する工程を含み、そのうち、前記抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体が、デングウイルス粒子によって示されるリガンドのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体への結合を阻止し、それによりＴＮＦ−α の分泌が阻害されることを特徴とする、方法。
【請求項３１】
前記抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体が、配列番号 ６６、配列番号 ６７、配列番号 ６８から構成される群から選択されたアミノ酸配列を有する可変軽鎖を含むことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体が、配列番号 ６９、配列番号 ７０、配列番号 ７１から構成される群から選択されたアミノ酸配列を有する可変重鎖を含むことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
日本脳炎ウイルスに感染した動物に有効量の抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体を提供する工程を含み、そのうち、前記抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体が、日本脳炎ウイルス粒子によって示されるリガンドのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体への結合を阻止し、それによりＴＮＦ−αの分泌が阻害されることを特徴とする、方法。
【請求項３４】
前記抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体が、配列番号 ６６、配列番号 ６７、配列番号 ６８から構成される群から選択されたアミノ酸配列を有する可変軽鎖を含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体が、配列番号 ６９、配列番号 ７０、配列番号 ７１から構成される群から選択されたアミノ酸配列を有する可変重鎖を含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
インターフェロンαの分泌に影響することなく、少なくとも１つの前炎症性サイトカインの分泌を少なくとも部分的に阻害する有効量の物質をデングウイルスに感染した動物に提供する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３７】
前記前炎症性サイトカインがＴＮＦ−αを含むことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記物質が抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体であることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記物質が、グリカンリガンドのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａへの結合を阻害するが、グリカンリガンドのＴｏｌｌ様受容体７またはＭｙＤ８８受容体への結合を阻害しないことを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記物質が、グリカンリガンドのＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａへの結合に阻害する抗ＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ抗体であることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
デングウイルス感染に感受性のあるマウスと、マウス体内のＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体をノックダウンするｓｈ−ＲＮＡ粒子を含むことを特徴とする、マウス。
【請求項４２】
前記ｓｈ−ＲＮＡ粒子が配列番号３９を含むことを特徴とする、請求項４１に記載のマウス。
【請求項４３】
動物の病原体感染の作用を修飾するため、動物の少なくとも１つの細胞受容体に対する有効量の抗体を含む製剤を含み、
前記修飾が少なくとも動物細胞の前炎症性サイトカイン分泌の阻害を含み、かつウイルスの排除に作用するサイトカインの分泌に影響しないことを特徴とする、組成物。
【請求項４４】
前記ウイルスが肝炎ウイルスであることを特徴とする、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ウイルスがフラビウイルスであることを特徴とする、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記フラビウイルスがデングウイルスであることを特徴とする、ことを特徴とする、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの細胞受容体が、少なくともＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体を含むことを特徴とする、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記前炎症性サイトカインがＴＮＦ−αを含み、ウイルスの排除に作用する前記サイトカインが少なくともインターフェロンαを含むことを特徴とする、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記フラビウイルスが日本脳炎ウイルスであることを特徴とする、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５０】
前記前炎症性サイトカインが少なくともＴＮＦ−αを含むことを特徴とする、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５１】
ウイルスの排除に作用する前記サイトカインが、少なくともインターフェロンαを含むことを特徴とする、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５２】
動物のデングウイルス感染の作用を修飾するため、デングウイルスに感染した動物のＤＬＶＲ_１／ＣＬＥＣ_５Ａ受容体に対する有効量の抗体を含む製剤を含み、前記修飾が少なくとも動物細胞の前炎症性サイトカイン分泌の阻害を含み、かつウイルスの排除に作用するサイトカインの分泌に影響しないことを特徴とする、組成物。
【請求項５３】
少なくとも１つの前炎症性サイトカインがＴＮＦ−αであることを特徴とする、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
ウイルスの排除に作用する少なくとも１つのサイトカインがインターフェロンαであることを特徴とする、請求項５２に記載の組成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１３Ｃ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５】

【図１６ａ】

【図１６ｂ】

【図１６ｃ】

【図１６ｄ】

【図１６ｅ】

【図１６ｆ】

【図１７ａ】

【図１７ｂ】

【図１８ａ−１８ｂ】

【図１８ｃ】

【図１８ｄ】

【図１８ｅ】

【図１８ｆ】

【図１９ａ】

【図１９ｂ】

【図１９ｃ】

【図１９ｄ】

【図１９ｅ】

【図２０ａ】

【図２０ｂ】

【図２０ｃ】

【図２１ａ】

【図２１ｂ】

【図２２ａ】

【図２２ｂ】

【図２２ｃ】

【図２３ａ】

【図２３ｂ】

【図２３ｃ】

【図２４】

【図２５ａ】

【図２５ｂ】

【図２５ｃ】

【図２５ｄ】

【図２５ｅ】

【図２６ａ】

【図２６ｂ】

【図２６ｃ】

【公表番号】特表２０１１−５１９４１４（Ｐ２０１１−５１９４１４Ａ）
【公表日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０１７７７（Ｐ２０１１−５０１７７７）
【出願日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５１６６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０２２５
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（５９６１１８４９３）アカデミア　シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】