急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用
【課題】本発明は、急性脳炎または急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用を提供する。
【解決手段】生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出する。これにより、急性脳炎または急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。
【解決手段】生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出する。これにより、急性脳炎または急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用に関するものであり、特に、急性脳炎および急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
急性脳炎および急性脳症は乳幼児期に多く、様々なウイルス感染や薬剤が引き金になって起きる。
【０００３】
急性脳炎および急性脳症は、ウイルス感染を発症してから数時間〜数日後に、意識障害、痙攣、異常行動(奇声をあげる、意味のわからない発言や行動など)、異常なおびえや怒り、幻覚などの精神症状などで発症する。重症の場合は突然の痙攣や意識障害が出現することが多い。重症の急性脳炎および急性脳症では、播種性血管内凝固、肝機能障害、腎機能障害、横紋筋融解症など、他の重篤な合併症を伴う。軽症では、後遺症を残すことなく回復するが、重症の場合、後遺症としては、てんかん、知能障害、四肢麻痺などが認められる。さらに経過中に様々な合併症を伴う最重症例は、最終的に多臓器不全の状態に陥り死亡する。
【０００４】
髄液にウイルスを検出できた場合を急性脳炎、ウイルスを検出できない場合を急性脳症として区別することが多いが、髄液から原因ウイルスを検出できなくても中枢神経系への感染を否定することは現状では困難であること、および、臨床症状が非常に類似していることより、実際の医療現場では急性脳炎と急性脳症とを区別して扱うよりも「急性脳炎・脳症」として総括して報告することが多い。
【０００５】
日本では、インフルエンザウイルス感染に伴って急性脳炎または急性脳症を引き起こすことも多く、インフルエンザウイルスによって引き起こされる急性脳炎および急性脳症はインフルエンザ脳症とも呼ばれる。急性脳炎および急性脳症の原因には、インフルエンザのほか、種々のウイルス感染やアスピリン（解熱剤）、テオフィリン（気管支拡張剤）などの薬剤等がある。しかし、原因が同定できない場合も少なからず認められる。
【０００６】
急性脳炎および急性脳症の中でも、日本人で頻度の高いインフルエンザ脳症は、主に６歳以下の子供がかかり、日本では毎年１００〜３００人前後の患者が発症している。脳症でよく見られる症状は、意識障害、けいれん、異常行動である。脳症発症後１〜２日で死亡に至ることもあり、死亡率は３０％、後遺症も２５％の患者に認められる重篤な疾患で、小児の死亡原因の第６位になっている。
【０００７】
インフルエンザ脳症は、日本を含む東アジアに多く欧米には少ないため、遺伝的要因の関連が考えられている。また、インフルエンザ脳症は発症すると死に至ることもあることから、できるだけ早く診断し治療を始めることが望まれている。しかし、インフルエンザ脳症の治療法として、抗インフルエンザ剤の投与、ステロイド療法、ガンマグロブリン療法、血漿交換、低体温療法などが行われているが、いまだ効果は不十分である。また、インフルエンザ感染に伴ってインフルエンザ脳症に進行する患者をインフルエンザ脳症発症前に特定することも現時点では不可能である。
【０００８】
このように、インフルエンザ感染などを契機とした急性脳炎および急性脳症は発症すると最悪の場合には、患者を死に至らしめる危険性があるため、急性脳炎および急性脳症の予防、診断、治療にかかる技術の開発が進められている。
【０００９】
例えば、小児インフルエンザ脳症の診断方法として、特許文献１に開示される技術を挙げることができる。
【００１０】
特許文献１には、小児髄液中に含まれる１４−３−３タンパク質のアイソフォームにおいて、β、θ、γ、ζ、εの順に強く検出された場合に、小児インフルエンザ脳症であると判断できることが記載されている。
【００１１】
また、解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤を投与したときにインフルエンザ脳症を発症するリスクを判定する方法として、例えば、特許文献２の技術が知られている。
【００１２】
特許文献２に開示されるインフルエンザ脳症の発症リスクの判定方法では、まず、血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、あるいは、非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与する。次に、（１）血管内皮細胞内のウイルス増殖の程度、（２）血管内皮細胞における血管の透過性亢進の程度、又は、（３）血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定する。これらの結果を、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較することにより、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与したときに、インフルエンザ脳症を発症するリスクを判定する。
【００１３】
また、最近、インフルエンザ脳症への罹患を左右する遺伝子多型解析が行われており、染色体１０ｑ２２に位置する特定の遺伝子の遺伝子多型がインフルエンザ脳症の発症と関連していることが報告されている。
【特許文献１】特開２００５−２９２１０８号公報（平成１７（２００５）年１０月２０日公開）
【特許文献２】特開２００７−５３９４２号公報（平成１９（２００７）年３月８日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上説したように、急性脳炎または急性脳症を診断したり、発症リスクを判定したりする方法が開発されているが、これらの方法は、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定する技術としては不十分である。
【００１５】
具体的には、特許文献１の技術は、急性脳炎または急性脳症を発症していることを診断するものであり、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定することはできない。
【００１６】
また、特許文献２の技術は、解熱鎮痛剤の中には、血管内皮細胞でウイルス増殖を引き起こすものがあるとの知見に基づくインフルエンザ脳症の発症リスクの判定方法である。つまり、特許文献２の技術は、投与した薬剤が患者に対してインフルエンザ脳症を発症させるか否かを判定するものである。そのため、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定することはできない。
【００１７】
このように、特許文献１および特許文献２を含め、従来技術では、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定することができない。そのため、少なくとも一般の臨床の現場では、インフルエンザに罹患した場合、一般内科医や小児科医による抗インフルエンザ剤等の処方が行われるのみで、事前に脳症に対する予防を講じるには至っていない。
【００１８】
そのため、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定する技術が求められている。
【００１９】
これに関連する技術として、染色体１０ｑ２２に位置する特定の遺伝子の遺伝子多型とインフルエンザ脳症の発症との関連性が知られているが、インフルエンザ脳症の罹患リスクの判定法としての有効性は十分に立証されていない。
【００２０】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、急性脳炎または急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症罹患リスク判定データの取得方法およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群における変異が、急性脳炎または急性脳症の罹患に関連していることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。
【００２２】
（１）急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法であって、生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【００２３】
（２）上記変異は、上記カルシウムイオンチャネルの活性を変化させる変異であることを特徴とする（１）に記載の急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【００２４】
（３）上記カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群は、カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子を少なくとも含み、該カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を少なくとも検出することを特徴とする（１）または（２）に記載の急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【００２５】
（４）急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するための急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キットであって、（ａ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマー、（ｂ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型のエキソン、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部のみを特異的に検出できるように設計されたプローブ、および（ｃ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット。
【００２６】
（５）急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞であって、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有することを特徴とする細胞。
【００２７】
（６）急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞の製造方法であって、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含むことを特徴とする細胞の製造方法。
【００２８】
（７）（５）に記載の細胞に、候補薬剤を投与し、該細胞におけるカルシウムイオンチャネルの活性が変化したか否かを判定することを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【００２９】
（８）上記候補薬剤は、カルシウムイオンチャネルに対する阻害剤もしくは作動薬、またはカルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであることを特徴とする（７）に記載の急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法は、以上のように、生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含んでいる。
【００３１】
上記構成によれば、取得されたデータにおいて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群にアミノ酸変化を伴う変異の有無を検証することにより、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定することができる。
【００３２】
それゆえ、急性脳炎または急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
＜Ｉ．急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法（以下、「本発明の判定データ取得方法」ともいう）は、被験者から分離した試料を用いて、該被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得するための方法である。
【００３５】
なお、上記被験者は特に限定されるものではなく、急性脳炎または急性脳症に罹患している者（罹患している可能性のある者）であってもよいし、急性脳炎または急性脳症に罹患していない者（罹患している可能性がない者）であってもよい。
【００３６】
本明細書において、「急性脳炎」および「急性脳症」とは、様々なウイルス感染や薬剤が引き金になって起きる意識障害、痙攣、異常行動、異常なおびえや怒り、幻覚などの精神症状きたす疾患が意図される。具体的には、インフルエンザ脳症、ライ症候群、アスピリンやテオフィリンなどの薬剤でおきる脳症、および種々のウイルス感染に惹起された脳症などを包含する。これらの急性脳炎および急性脳症は、疾患を引き起こす原因はそれぞれ異なるが、疾患の基盤的な機序は同一ではあると考えられる。したがって、本発明にかかる判定データ取得方法は、これら急性脳炎および急性脳症の全てについて、罹患リスクを判定する対象とする。
【００３７】
本発明の判定データ取得方法は、具体的には、生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群（以下、「カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群」ともいう）に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出する工程を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されない。
【００３８】
なお、本明細書において、「アミノ酸変化を伴う変異」とは、ミスセンス変異（アミノ酸が置換する）、ナンセンス変異（アミノ酸合成が途中で止まる）、フレームシフト（塩基の挿入、欠失により、変異位置より下流のアミノ酸配列が変化し、本来の機能を有しない）、スプライシング異常（該当エキソン領域の欠失等）、少数塩基挿入・欠失（一部のアミノ酸が新生、脱落するが下流は正常アミノ酸のまま合成）、エキソン領域微小欠失（エキソンが１つもしくは複数欠損）などが意図される。
【００３９】
本発明の判定データ取得方法は、具体的には、例えば、上記変異を検出するために、上記生体から分離した試料を前処理する工程等を含んでいてもよい。
【００４０】
上記カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群とは、カルシウムイオンチャネルを構成する各サブユニットをそれぞれコードする遺伝子からなる群が意図される。カルシウムイオンチャネルとは、電位依存性カルシウムチャネルが意図される。電位依存性カルシウムチャネルは、その電気生理学的性質の相違によって、Ｌ型、Ｔ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、およびＲ型の５つに分類される。
【００４１】
Ｌ型、Ｎ型、およびＰ／Ｑ型のカルシウムイオンチャネルは大きな脱分極によって活性化される。また、Ｒ型は中程度の脱分極によって活性化される。ここでは、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、およびＲ型のカルシウムイオンチャネルを総称して、高閾値活性化型カルシウムイオンチャネルともいう。一方、Ｔ型カルシウムイオンチャネルは小さな脱分極によって活性化される。ここでは、Ｔ型カルシウムイオンチャネルを、低閾値活性化型カルシウムイオンチャネルともいう。
【００４２】
高閾値活性化型カルシウムイオンチャネルは、α1サブユニット、α2／δサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットからなる５量体で構成されている。このうち、α2／δサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットは、修飾サブユニットである。
【００４３】
高閾値活性化型カルシウムイオンチャネルを構成するα1サブユニットは、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、およびＲ型のカルシウムイオンチャネルにおいて、それぞれ異なる。Ｌ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットとしては、α1S（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００００６０、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｓ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００００６９））、α1C（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１０、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｃ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７１９））、α1D（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１１、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｄ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２０））、およびα1F（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００５１７４、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｆ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００５１８３））の４種類が存在する。
【００４４】
Ｎ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットとしては、α1B（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７０９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｂ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７１８））の１種類が存在する。Ｐ／Ｑ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットしては、α1A（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００００５９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ａ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００００６８））の１種類が存在する。また、Ｒ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットとしては、α1E（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１２、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｅ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２１））の１種類が存在する。
【００４５】
βサブユニットには、β1（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１４、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＢ１（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２３））、β2（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１５、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＢ２（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２４））、β3（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１６、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＢ３（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２５））およびβ4（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１７、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＢ４（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２６））の４種類のサブタイプが存在する。
【００４６】
α2／δサブユニットは、同一の遺伝子から翻訳された後に修飾を受けてα2サブユニットとδサブユニットとに分かれ、ジスルフィド結合により再会合する。
【００４７】
α2／δサブユニットには、α2／δ1（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１３、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ２Ｄ１（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２２））、α2／δ2（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１００５５０５、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ２Ｄ２（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１００５５０５））、α2／δ3（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６０８６８、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ２Ｄ３（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１８３９８））およびα2／δ4（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿７５８９５２、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ２Ｄ４（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿１７２３６４））の４種類のサブタイプが存在する。
【００４８】
γサブユニットには、γ1（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１８、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ１（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２７））、γ2（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００６０６９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ２（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００６０７８））、γ3（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００６５３０、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ３（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００６５３９））、γ4（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０５５２２０、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ４（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１４４０５））、γ5（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０５５２１９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ５（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１４４０４））、γ6（ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＫ２００２９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ６（ＮＣＢＩアクセション番号ＡＦ２８８３８６））、γ7（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿１１４１０２、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ７（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０３１８９６））、およびγ8（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿１１４１０１、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ８（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０３１８９５））の８種類のサブタイプが存在する。
【００４９】
これに対して、低閾値活性化型カルシウムイオンチャネルであるＴ型カルシウムイオンチャネルは、α1サブユニット単独で構成されている。Ｔ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットとしては、α1G（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６１４９６、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｇ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１８８９６））、α1H（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６６９２１、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｈ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０２１０９８））、およびα1I（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６６９１９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｉ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０２１０９６））の３種類が存在する。
【００５０】
本発明の判定データ取得方法では、上記例示したようなカルシウムイオンチャネルを構成する各サブユニットをそれぞれコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出すればよい。
【００５１】
中でも、高閾値活性化カルシウムイオンチャネルを構成する各サブユニットをそれぞれコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することが好ましい。
【００５２】
また、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出する対象となる遺伝子は、高閾値活性化カルシウムイオンチャネルのαサブユニットまたはβサブユニットをコードする遺伝子のいずれかを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
【００５３】
β4サブユニットは、Ｎ型カルシウムイオンチャネルのβサブユニットの２４％を、Ｐ／Ｑ型カルシウムイオンチャネルのβサブユニットの５６％を占める(Liu et al., JBC 271 13804-13810 (1996), Scott et al., ＪＢＣ 271 3207-3212 (1996)を参照)。
【００５４】
Ｌ型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットは主にβ3サブユニットと結合するがβ2サブユニットとも結合する可能性が示唆されており、Ｌ型カルシウムチャネルのα1Dサブユニットは主にβ1サブユニットと結合するがβ2サブユニットとも結合する可能性が示唆されている（Tanaka et al, Molecular Brain Research 30, 1-16, 1995）。
【００５５】
Ｎ型カルシウムチャネルのα1Bサブユニットとの結合は５６％をβ3サブユニットが、２４％をβ4サブユニットが、１０％をβ1サブユニットが占めている（Scott et al, JBC 271, 3207-3212, 1996）。
【００５６】
Ｐ／Ｑ型カルシウムチャネルのα1Aサブユニットとの結合は４８％をβ4サブユニットが、３６％をβ3サブユニットが、８％をβ1サブユニットが、７％をβ2サブユニットが占めている（Liu et al, JBC 271, 13804-13810, 1996）。
【００５７】
骨格筋で発現しているα1Sサブユニットは主にβ1サブユニットと結合すると考えられている（Scott et al, JBC 271, 3207-3212, 1996）。
【００５８】
ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースによると、β4サブユニットはヒトの骨髄、脳、腎臓、筋肉、胸腺、気管に発現していることが報告されている（２００７年９月現在；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ESTProfileViewer.cgi?uglist=Hs.614033）。
【００５９】
したがって、β4サブユニットは、αサブユニットα1C、α1D、α1Eと結合する可能性も示唆される。また、β4サブユニットは主にα1Aサブユニットと結合するが、低い割合で他のαサブユニットα1B、α1C、α1Dとも結合する可能性が示唆されている（Tanaka et al, Molecular Brain Research 30, 1-16, 1995）。
【００６０】
Ｔ型カルシウムチャネルのα1Gサブユニットは、不完全ながらαサブユニット結合コンセンサス配列（α interaction domain）を持っており、β1サブユニットとだけ相互作用することにより、細胞膜への移動を円滑に行っていると考えられている（Dolphin et al, J. Physiol 519, 35-45, 1999）。
【００６１】
本発明の判定データ取得方法では、上記例示したカルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、少なくとも１つについて、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出すればよいが、複数の遺伝子について変異の有無を検出することが好ましい。
【００６２】
上記構成によれば、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクをより高精度に判定することが可能なデータを取得することができる。
【００６３】
上記カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる遺伝子において検出する変異は、アミノ酸変化を伴うものであればよく、その具体的な変異は特に限定されるものではない。具体的には、変異には、ミスセンス変異（アミノ酸が置換する）、ナンセンス変異（アミノ酸合成が途中で止まる）、フレームシフト（塩基の挿入、欠失によりアミノ酸コドンのフレームがずれ、変異位置より下流のアミノ酸配列が変化し、本来の機能を有しない）、スプライシング異常（該当エキソン領域の欠失等）、少数塩基挿入・欠失（一部のアミノ酸が新生、脱落するが下流は正常アミノ酸のまま合成）、エキソン領域微小欠失（エキソンが１つもしくは複数欠損）が含まれる。また、変異は、遺伝子多型であってもよい。
【００６４】
上記遺伝子における変異の位置は特に限定されるものではないが、カルシウムイオンチャネルの機能（換言すれば、活性）を変化させる位置における変異であることが好ましい。さらに、上記カルシウムイオンチャネルの機能の変化は、特に限定されるものではないが、カルシウムイオンチャネルの機能亢進であることが好ましい。
【００６５】
このような変異としては、具体的には、例えば、上記ＣＡＣＮＢ４遺伝子（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２６）の塩基配列における開始コドンＡＴＧのＡを第１位としたとき、第１４０３位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第１４０３位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換を挙げることができる。つまり、β4サブユニット（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１７）のアミノ酸配列における第４６８位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第４６８位のアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）への置換を挙げることができる。
【００６６】
また、これ以外にも、β4サブユニット（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１７）のアミノ酸配列における第１０４位のシステイン（Ｃ）がフェニルアラニン（Ｆ）への変異、第４８２位のアルギニン（Ｒ）が停止コドンへの変異等を挙げることができる。なお、これらの変異がカルシウムイオンチャネルの機能を亢進させることは、Escayg A, et al.Am.J.Hum. Genet. 66:1531-1539,2000等に記載されている。
【００６７】
カルシウムイオンチャネルの機能亢進にかかる変異は、上記例示的に示した変異に限定されないことはいうまでもない。
【００６８】
なお、本発明の判定データ取得方法において、変異の有無を検出する対象となる遺伝子は、上記のアクセション番号に登録されている塩基配列に限定されるものではない。つまり、上記例示した遺伝子がコードするタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子について、変異の有無を検出する構成も本発明に含まれる。このような遺伝子としては、具体的には、例えば、上記のアクセション番号に登録されている塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（遺伝子）であり、該ポリヌクレオチドの翻訳産物がカルシウムイオンチャネルのサブユニットとしての機能を有する遺伝子を挙げることができる。
【００６９】
また、本発明にかかる判定データ取得方法においては、同じ遺伝子から生じるアイソフォームｍＲＮＡやタンパク質を変異の有無を検出する対象としてもよい。
【００７０】
本明細書において、「遺伝子」とは、「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用されるものである。さらに、本明細書において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。
【００７２】
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
【００７３】
本発明の判定データ取得方法において、遺伝子の変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知のあらゆる方法を用いることができる。
【００７４】
具体的には、例えば、ＰＣＲを利用したシークエンシング、ＳＳＣＰ（Single strand conformation polymorphism）などの変異検出法、リアルタイムＰＣＲやＤＮＡチップを用いた多型検出方法、遺伝子の各エキソンのmicro−deletionを検出する方法、ｍＲＮＡの増減を検出するNorthern blot法、ＲＴ−ＰＣＲ法, Real-time PCR法、およびｃＤＮＡアレイ法、並びに、タンパク質の増減を検出するウエスタンブロット法、免疫染色法、およびタンパクアレイ法等を挙げることができる。
【００７５】
ここでは、（Ａ）生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出する実施形態、（Ｂ）生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて変異を検出する実施形態、（Ｃ）生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態に分けて、より具体的に説明する。
（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる実施形態
生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出する。
【００７６】
被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、ゲノムＤＮＡを抽出可能なものであればよい。具体的には、例えば、血液、骨髄液、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞を挙げることができる。また、被験者から分離した細胞を培養し、増殖したものからゲノムＤＮＡを抽出してもよい。
【００７７】
また、抽出したゲノムＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、およびＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いてもよい。
【００７８】
こうして調製されたゲノムＤＮＡを含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法等を挙げることができる。
【００７９】
より具体的には、例えば、ゲノムＤＮＡから、変異の有無を検出する対象となる遺伝子のエキソンを含む領域、好ましくは変異位置を含むエキソン領域、または、エキソンとイントロンとの境界領域、好ましくは変異位置を含むエキソンとイントロンとの境界領域を増幅後、得られたＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスすることによって該遺伝子における変異の有無を検出することができる。
【００８０】
また、ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、切断されたゲノムＤＮＡ断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても、遺伝子における変異の有無を検出することができる。
【００８１】
また、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる複数の遺伝子について、変異の有無を検出する場合、マルチプレートを用いるなど、従来公知の多サンプルの処理方法を上記方法と組み合わせて用いてもよい。
【００８２】
また、蛍光標識したプライマーを用いて各エキソンを増幅後、ゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動法にて各シグナルの強さを検討する方法により、エキソンの欠失を検出することも可能である。
【００８３】
このように、生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に変異が見出された場合には、該被験者は急性脳炎または急性脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
【００８４】
なお、変異の検出方法において使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる場合
生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出する。
【００８５】
上記被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、ｍＲＮＡを抽出可能であり、変異を検出する対象となる遺伝子を発現している、または発現している可能性があるものであればよい。
【００８６】
具体的には、例えば、患者の末梢血白血球細胞や皮膚線維芽細胞、口腔粘膜細胞、筋細胞が好ましい。
【００８７】
続いて、その抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製する。さらに、得られたｃＤＮＡを必要に応じて、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、およびＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅してもよい。
【００８８】
こうして調製されたｃＤＮＡを含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子の変異を検出する場合と同様の方法を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子の変異の有無を検出することができる。
【００８９】
このように、生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に変異が見出された場合には、該被験者は急性脳炎または急性脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
（Ｃ）タンパク質を用いる場合
生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、タンパク質を抽出する。
【００９０】
上記被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、タンパク質を抽出可能であり、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（換言すれば、カルシウムイオンチャネル）を発現している、または発現している可能性があるものであればよい。
【００９１】
こうして調製されたタンパク質を含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）について、特定の変異をもつポリペプチドのみを特異的に認識する抗体を作製し、該抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法により変異を検出することができる。なお、本明細書において、用語「タンパク質」は、「ポリペプチド」又は「ペプチド」と交換可能に使用される。
【００９２】
また、上記タンパク質を含有する試料から、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーや、質量分析装置を利用して変異を検出することができる。
【００９３】
さらに、上記タンパク質を含有する試料から、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）を単離し、該ポリペプチドの等電点に基づいて、変異を検出することもできる。
【００９４】
このように、生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）に変異が見出された場合には、該被験者は急性脳炎または急性脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
【００９５】
本発明の判定データ取得方法は、上説した構成を備えているため、該判定データ取得方法により取得したデータによれば、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクの可能性を事前に診断することができる。そのため、例えば、本発明の判定データ取得方法により取得したデータに基づいて急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクが高いから診断された被験者がインフルエンザに罹患した際には、該被験者の急性脳炎または急性脳症の罹患リスクが分かっているため、担当医との連携によりすばやい治療を施すことができる。
【００９６】
つまり、本発明の判定データ取得方法によれば、急性脳炎または急性脳症による死亡率や後遺症の成績を向上させることができる。また、家族の精神的負担や経済的負担を軽減し、さらには適切な治療を施すことによって医療費を削減することができる。
【００９７】
インフルエンザは数年毎に流行するため社会的関心が高い。本発明の判定データ取得方法によれば、インフルエンザ脳症の罹患リスクを判定することが可能であるため、インフルエンザ脳症の予防に好適に用いることができる。
【００９８】
さらに、近年、インフルエンザ患者にタミフルを投与したときに見られる異常行動が問題となっている。本発明にかかる判定データ取得方法は、インフルエンザ患者にタミフルを投与したときに異常行動を起こすリスク判定にも応用することができる。
【００９９】
＜ＩＩ．急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット＞
本発明には、本発明の判定データ取得方法を用いて、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得するために用いる急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット（以下、単に「本発明の判定キット」ともいう）も含まれる。
【０１００】
本発明の判定キットは、具体的には、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子における変異の有無を検出するための試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
【０１０１】
カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するための試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬以外のその他の試薬を含んでいてもよい。
【０１０２】
具体的には、ゲノムＤＮＡを用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域もしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマーや、変異型または野生型の一方のエキソン領域もしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部（換言すれば、特定の遺伝子型のエキソンもしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部）のみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。
【０１０３】
さらに、このような判定キットでは、上記プライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬など、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１０４】
なお、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【０１０５】
また、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）または全ＲＮＡを用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、上記遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡまたはその一部の領域を増幅できるように設計されたプライマーや、変異型または野生型の一方のｍＲＮＡもしくはその一部（換言すれば、特定の遺伝子型のｍＲＮＡまたはその一部）のみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。
【０１０６】
さらに、このような判定キットでは、上記プライマーやプローブに加えて、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬など、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１０７】
なお、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【０１０８】
また、タンパク質レベルでカルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、例えば、該遺伝子群の翻訳産物であるポリペプチド（タンパク質）のうち、野生型または変異型のポリペプチドもしくはその一部の一方のみに特異的に結合する抗体（換言すれば、特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体）を含むキット等が挙げられる。
【０１０９】
さらに、このような判定キットでは、上記抗体に加えて、ＥＬＩＳＡ法や、ウエスタンブロット法、カルシウムイオンチャネルの活性測定に用いられる試薬など、上記遺伝子における変異（換言すれば、カルシウムイオンチャネルにおける変異）の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１１０】
また、本発明の判定キットは、上記例示した構成物をどのように組み合わせて含んでいてもよい。
【０１１１】
上説したような本発明の判定キットを用いることにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを、急性脳炎または急性脳症の罹患前に判定するためのデータを取得することができる。
【０１１２】
本発明の判定キットが適用される被験者は、特に限定されるものではない。
【０１１３】
＜ＩＩＩ．急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞およびその製造方法＞
本発明によれば、培養細胞において、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入することにより、カルシウムイオンチャネルの活性が変化した細胞を製造することができる。
【０１１４】
換言すれば、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入された形で、カルシウムイオンチャネルのサブユニット遺伝子群が発現する培養細胞を製造することができる。
【０１１５】
このような細胞は、急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニングに好適に用いることができる。つまり、このような細胞は、治療薬剤のスクリーニング細胞ということができる。
【０１１６】
したがって、本発明には、このような急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞（以下、単に「スクリーニング細胞」ともいう）およびその製造方法も含まれる。
【０１１７】
本発明にかかるスクリーニング細胞は、具体的には、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有する細胞である。
【０１１８】
例えば、変異型のカルシウムイオンチャネルを発現するように、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されている細胞が挙げられる。
【０１１９】
このような細胞では、変異型のカルシウムイオンチャネルが発現しており、カルシウムイオンチャネルの機能が変化している。この機能変化は特に限定されるものではないが異常亢進であることが好ましい。
【０１２０】
上記遺伝子群におけるこのような変異および変異を導入する遺伝子については、＜Ｉ．急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞で説明した通りであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
【０１２１】
本明細書において、「治療薬剤のスクリーニング細胞」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験用培養細胞をいい、具体的には、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サルなどの哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
【０１２２】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞の製造方法は、上記の特性を有する細胞を製造する方法であり、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含んでいればよい。
【０１２３】
より具体的には、以下の３つの実施形態を挙げることができる。ここでは、以下の３つの実施形態について具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１２４】
（１）発現ベクター等を用いる方法
この方法では、まず、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群（α1サブユニット、α2／δサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニット）のうち、少なくとも１つの遺伝子にはアミノ酸変化を伴う変異を含んでいる遺伝子群を、発現ベクター等を用いて、宿主となる培養細胞内において発現させる。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
【０１２５】
このとき、宿主となる培養細胞はカルシウムイオンチャネルが発現していない細胞であることが好ましい。このような細胞によれば、内在のカルシウムイオンチャネルの影響を受けることがない。
【０１２６】
なお、本方法において、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
【０１２７】
（２）人為的な変異導入を用いる方法
この方法では、カルシウムイオンチャネルを発現している培養細胞に、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
【０１２８】
上記培養細胞に変異を導入する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の遺伝子操作技術を適宜組み合わせて用いればよい。
【０１２９】
（３）モデル動物を用いる方法
この方法では、まず、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有するモデル動物を作製する。次に、該モデル動物から組織を摘出し、その組織から培養細胞を作製する。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
【０１３０】
上記モデル動物は、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子に変異が導入されているため、急性脳炎または急性脳症を発症する。すなわち、上記モデル動物は、急性脳炎または急性脳症を人為的に発症させた急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物ということができる。
【０１３１】
本発明には、このようなモデル動物、すなわち、急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物、およびその製造方法も含まれる。
【０１３２】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物は、具体的には、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有する。該急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物は、カルシウムイオンチャネルの機能に異常があることが好ましく、その異常が異常亢進であることがより好ましい。
【０１３３】
上記遺伝子群におけるこのような変異および変異を導入する遺伝子については、＜Ｉ．急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞で説明した通りであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
【０１３４】
本明細書において、「モデル動物」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物をいい、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
【０１３５】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物の製造方法は、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されるように、モデル動物の上記遺伝子群を操作する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
【０１３６】
本明細書において、「モデル動物の遺伝子を操作する」とは、従来公知の遺伝子操作技術を用いて、モデル動物の遺伝子を操作することが意図される。具体的には、モデル動物の遺伝子を破壊したり、当該遺伝子に変異を導入したり、当該遺伝子を変異型遺伝子で置換したり、さらには、当該モデル動物に外来遺伝子を導入したり、モデル動物を交雑したりすることをすべて包含する意味である。
【０１３７】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物の製造方法によれば、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されるように、モデル動物の上記遺伝子群を操作することにより、急性脳炎または急性脳症を発症したモデル動物を製造することができる。
【０１３８】
＜ＩＶ．急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法＞
本発明にかかるスクリーニング細胞、および急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物は、新たな急性脳炎または急性脳症の治療方法や治療薬剤の開発に用いることができる。したがって、本発明には、急性脳炎または急性脳症の治療薬の治療薬剤をスクリーニングする急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法（以下、単に「スクリーニング方法」ともいう）が含まれる。
【０１３９】
ここでは、本発明にかかるスクリーニング方法の一実施形態として、本発明にかかるスクリーニング細胞を用いる実施形態と、本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物を用いる実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１４０】
すなわち、例えば、本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物に代えて、他の急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物を用いる実施形態とすることもできる。
【０１４１】
（１）本発明にかかるスクリーング細胞を用いる場合
本発明にかかるスクリーニング細胞に候補薬剤を投与する工程と、該候補薬剤が投与された急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞において、カルシウムイオンチャネルの活性が変化したかを判定する工程とを少なくとも含む。
【０１４２】
つまり、本実施形態にかかるスクリーニング方法によれば、本発明にかかるスクリーニング細胞に候補薬剤を投与し、当該候補薬剤を投与されたスクリーニング細胞におけるカルシウムイオンチャネルの活性が変化していることを指標として、上記候補薬剤が急性脳炎または急性脳症の治療薬剤となりうるかを判定することができる。
【０１４３】
上記候補薬剤は、特に限定されるものではないが、カルシウムイオンチャネルの発現に影響を及ぼすことが期待される化合物、またはカルシウムイオンチャネルの活性に影響を及ぼすことが期待される化合物（例えば、カルシウムイオンチャネルに対する阻害剤や阻害剤の候補物質、または作動薬や作動薬の候補物質）であることが好ましい。
【０１４４】
また、上記候補薬剤は、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであってもよい。
【０１４５】
このような候補薬剤を本発明にかかるスクリーニング細胞に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その候補薬剤の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
【０１４６】
また、該候補薬剤が投与されたスクリーニング細胞におけるカルシウムイオンチャネルの活性が変化したか否かを判定する方法は特に限定されるものではなく、電気生理学的測定機器や蛍光色素観察機器などを用いて判定すればよい。
【０１４７】
（２）本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物を用いる場合
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物に候補薬剤を投与する工程と、該候補薬剤が投与された急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物の急性脳炎または急性脳症が治癒または改善されたか否かを判定する工程とを含んでいればよい。つまり、本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法によれば、急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物に候補薬剤を投与し、当該候補薬剤を投与された急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物において、急性脳炎または急性脳症が治癒または改善していることを指標として、上記候補薬剤が急性脳炎または急性脳症の治療薬剤となりうるかを判定することができる。
【０１４８】
上記候補薬剤は、特に限定されるものではなく、（１）本発明にかかるスクリーング細胞を用いる場合と同様の物質を挙げることができる。
【０１４９】
このような候補薬剤を本発明にかかる急性脳炎または急性脳症発症モデル動物に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その候補薬剤の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
【０１５０】
また、該候補薬剤が投与された急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物の急性脳炎または急性脳症が治癒または改善されたか否かを判定する方法は特に限定されるものではなく、急性脳炎または急性脳症に特徴的症状を指標に判定すればよい。
【０１５１】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１５２】
本発明について、実施例および図１〜図４に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１５３】
〔実施例１：インフルエンザ脳症に罹患した患者の遺伝子解析〕
インフルエンザ脳症に罹患した患者について、脳波測定、聴性脳幹反応測定および遺伝子解析を行った。
【０１５４】
まず、インフルエンザ脳症に罹患した患者についての脳波測定の結果について、図１（ａ）〜（ｄ）に基づいて説明する。
【０１５５】
脳波は１０−２０法という電極配置法で記録した。電極配置記号は頭部の部位を示すもので、一般にＦｐ１，Ｆｐ２は前部極、Ｆ３，Ｆ４は前頭部、Ｃ３，Ｃ４は中心部、Ｐ３，Ｐ４は頭頂部、Ｏ１，Ｏ２は後頭部、Ｆ７，Ｆ８は前側頭部、Ｔ３，Ｔ４は中側頭部、Ｔ５，Ｔ６は後側頭部、Ｆｚは正中前頭部、Ｃｚは正中中心部、Ｐｚは正中頭頂部を意味する。
【０１５６】
図１（ａ）は、インフルエンザ脳症を発症して１３時間後の痙攣重積時の脳波を示す図である。全ての電極配置記号から、棘徐波複合が連続的に認められ、脳全体の広汎な領域から痙攣発射が出現していることを示している。
【０１５７】
その後、図１（ｂ）に示すように、インフルエンザ発症３８時間後には、痙攣は収まっているが、すでに、脳波の低電位化が始まっていた。さらに、図１（Ｃ）に示すように、インフルエンザ発症６２時間後の脳波では、さらに、低電位化が進行した。そして、図１（ｄ）に示すように、７日目には、脳波が平坦になって、急速な病状の進行で脳の全般的な活動停止に近い状態に至った。
【０１５８】
また、上記患者について、インフルエンザ脳症を発症して８日目の聴性脳幹反応を調べた。図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、右側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、左側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、および左右両側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果を示す。
【０１５９】
図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、いずれの刺激に対しても無反応であった。脳波所見、聴性脳幹反応所見、そして自発呼吸の消失や臨床的脳幹反応の消失など総合的に判断して、脳死状態になったと診断された。患者は、多臓器不全も合併し、インフルエンザ脳症を発症して２７日目に死亡した。
【０１６０】
次に、インフルエンザ脳症に罹患した上記患者について、カルシウムイオンチャネルをコードする遺伝子群の遺伝子解析の結果について説明する。
【０１６１】
末梢血ゲノムＤＮＡより、カルシウムイオンチャネルをコードする遺伝子群の各エキソンをＰＣＲにより増幅し、塩基配列の決定を行った。その結果、図３（ｂ）に示すように、カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子ＣＡＣＮＢ４に変異があることが分かった。その変異は、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２６に塩基配列が登録されているＣＡＣＮＢ４遺伝子の第１４０３位のＤＮＡ塩基であるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換された変異（Ｇ１４０３Ａ）であった。
【０１６２】
この変異により、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１７にアミノ酸配列が登録されているカルシウムイオンチャネルのβ4サブユニットの第４６８位のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）に置換（Ｒ４６８Ｑ）される。つまり、該変異は、ミスセンス変異であった。
【０１６３】
また、このＣＡＣＮＢ４遺伝子における変異を、熱性痙攣の既往をもつ父親（図３（ａ）を参照）を含め、両親についても調べたところ、同様の変異が熱性痙攣の既往をもつ父親にも存在した。なお、図３（ａ）中、インフルエンザ脳症を発症した患者は矢印で示している。また、ＦＳは熱性痙攣（Febrile seizure）を表す。
【０１６４】
さらに、健常者２００人について、ＣＡＣＮＢ４遺伝子における変異の有無を調べたところ、その変異を見出すことはできなかった。
【０１６５】
これらの結果から、インフルエンザ脳症に罹患した患者におけるＣＡＣＮＢ４遺伝子の変異は、遺伝子多型ではないことが分かった。
【０１６６】
次に、これらの変異型遺伝子ｃＤＮＡ発現系を作成し機能解析を行った。具体的には、変異型ＣＡＣＮＢ４遺伝子（Ｇ１４０３Ａ）および野生型（正常型）ＣＡＣＮＢ４遺伝子をそれぞれ発現させることによって、変異型カルシウムチャネル（Ｒ４６８Ｑ）および野生型（正常型）カルシウムチャネルを作製した。
【０１６７】
より具体的には、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１０８２２７６に塩基配列が登録されている骨格筋型カルシウムイオンチャネルα2／δ1サブユニット遺伝子（遺伝子名；ＣＡＣＮＡ２Ｄ１）のｃＤＮＡが事前に導入された培養細胞株（ＢＨＫ細胞）に、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１１０１６９３に塩基配列が登録されているα1AサブユニットＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のｃＤＮＡと、変異型ＣＡＣＮＢ４遺伝子（Ｇ１４０３Ａ）または野生型ＣＡＣＮＢ４遺伝子とを導入し、変異型カルシウムチャネル（Ｒ４６８Ｑ）および野生型カルシウムチャネルを作製した。
【０１６８】
そして、該変異型カルシウムイオンチャネルおよび野生型カルシウムイオンチャネルについて、電気生理学的機能解析を行った。
【０１６９】
その結果、図４（ａ）は、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの代表的なバリウム電流曲線を示している。図４（ｂ）は、電流−電圧曲線で、カルシウムチャネルが、膜電位の変化に伴って、電流量が変化していくことを示している。（b）では、膜電位を−４０ｍＶから５０ｍＶまで変化させたときに流れるバリウム電流を測定しており、０ｍＶから４０ｍＶの間の膜電位で、変異型カルシウムチャネルでは、野生型カルシウムチャネルよりも有意にバリウム電流が増加していた。このことは変異型カルシウムチャネルの機能亢進を示す結果である。
【０１７０】
また、図４（ｃ）に示すように、バリウム電流、細胞の電気容量および電流密度は、野生型カルシウムチャネルと比較して、変異型カルシウムチャネルで増加していた。
【０１７１】
また、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルについて、活性化曲線を比較したところ、図４（ｄ）に示すように、両者に有意な差は見られなかった。
【０１７２】
一方、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルについて、図４（ｅ）は、活性化の時定数タウを比較したものである。−１０ｍＶの膜電位の時、野生型カルシウムチャネルよりも、変異型カルシウムチャネルのほうが活性化する時間がわずかだが有意に遅かった。これは、−１０ｍＶの膜電位の時、変異型カルシウムチャネルが活性化するまでにより時間がかかることを示している。
【０１７３】
さらに、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルについて、不活性曲線を比較したところ、図４（ｆ）に示すように、両者に有意な差は見られなかった。また、変異型カルシウムイオンチャネルおよび野生型カルシウムイオンチャネルについて、不活性化の時定数タウを比較したところ、図４（ｇ）に示すように、両者に有意な差は見られなかった。
【０１７４】
これらの結果から、上記変異型カルシウムチャネルは、チャネルを流れる電流量が大きくなるという変化と−１０ｍＶの膜電位の時、活性化するが遅いという特性を持っていた。電流量が大きくなるという変化の方がより顕著なので、総合的に判断し、変異型カルシウムチャネルの機能は亢進していることが明らかになった。
【０１７５】
以上の結果、カルシウムイオンチャネルの機能異常が急性脳炎または急性脳症の発症と関連していることが示唆された。すなわち、カルシウムイオンチャネルの変異の有無を検出することにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することが可能になった。
【０１７６】
さらに、本実施例から、カルシウムイオンチャネルについて、カルシウムイオンを透過するポアを形成し主に働くのはα1サブユニットであると考えられているが、βサブユニットの変異によっても、そのチャネル機能に異常が生じることが明らかとなった。
【０１７７】
つまり、カルシウムイオンチャネルにおいて、βサブユニット、α2／δサブユニット、およびγサブユニットはα1サブユニットの機能を補佐するものであると従来考えられてきたが、これらのサブユニットに異常が生じても、カルシウムイオンチャネルとしてのチャネル機能に変化が生じることが示唆された。
【０１７８】
したがって、本実施例では、β4サブユニットにおける変異の有無により、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得できることを実証したが、カルシウムイオンチャネルを構成するいずれのサブユニットにおける変異の有無を指標としても、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得できることが分かった。
【０１７９】
また、本実施例の結果によれば、カルシウムイオンチャネルにおける上記変異は、急性脳炎または急性脳症でよく見られる症状（意識障害、けいれん、異常行動）や、多臓器不全をうまく解釈することができる。この点について、以下具体的に説明する。
【０１８０】
カルシウムイオンチャネルについては、α1サブユニットには１０種類の遺伝子が存在し、それら１０種類の遺伝子は、組織特異的に発現している。さらに、βサブユニットにも４種類、α2／δサブユニットにも４種類の遺伝子が存在する。これらサブユニットは、それぞれ、特定の組み合わせで主に結合しているが、メイン以外の組み合わせで結合することも知られている。
【０１８１】
β4サブユニットは、１０種類のα1サブユニットのうち、５種類のα1サブユニット（α1B、α1A、α1C、α1D、α1E）と結合する可能性がある。α1BはＮ型カルシウムイオンチャネルを構成するαサブユニットである。α1Aは、Ｐ／Ｑ型カルシウムイオンチャネルを構成するαサブユニットである。α1Cおよびα1Dは、Ｌ型カルシウムイオンチャネルを構成するαサブユニットである。さらに、α1EはＲ型カルシウムイオンチャネルを構成するαサブユニとである。
【０１８２】
このように、β4サブユニットは、多くのタイプの高閾値活性化型カルシウムイオンチャネルに結合している。したがって、β4サブユニットをコードするＣＡＣＮＢ４遺伝子の変異（異常）は、多くのタイプのカルシウムイオンチャネルの機能異常を引き起こすと考えられる。
【０１８３】
つまり、β4サブユニットに変異のある場合、様々なタイプのカルシウムイオンチャネルに異常が生じるため、さまざまな組織に異常が発生し、多臓器細胞の細胞死を誘導したり、意識障害、けいれん、異常行動といった症状を呈したりするものと考えられる。
【０１８４】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１８５】
以上のように、本発明では、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子におけるアミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することにより、急性脳炎または急性脳症に罹患していない被験者についても、該被験者が急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得することができる。
【０１８６】
そのため、本発明は、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するために用いる判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。
【０１８７】
また、本発明では、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入することにより、急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物を製造することができる。このような急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物は、急性脳炎または急性脳症の治療薬剤や治療方法の開発に用いることができる。それゆえ、本発明は、製薬分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１（ａ）〜（ｄ）は、脳症発症後の脳波の経過を示す図であり、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、インフルエンザ脳症による痙攣重積時の脳波、インフルエンザ発症３８時間後で痙攣が収まっている状態の脳波、インフルエンザ発症６２時間後の脳波、およびインフルエンザ発症７日目の脳波を示す図である。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、右側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、左側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、および左右両側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果を示す。
【図３】図３は遺伝子解析結果を示す図であり、（ａ）はインフルエンザ脳症を発症した患者の家系図を示す図であり、（ｂ）は該患者およびその両親のＣＡＣＮＢ４遺伝子の解析結果を示す図である。
【図４】図４は、変異型ＣＡＣＮＢ４遺伝子および野生型ＣＡＣＮＢ４遺伝子の機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの代表的なバリウム電流曲線を、（ｂ）は膜電位を−４０ｍＶから５０ｍＶまで変化させたときの、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルを流れるバリウム電流を、（ｃ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルのバリウム電流、細胞の電気容量、および電流密度を、（ｄ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの活性化曲線を、（ｅ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの活性化の時定数タウを、（ｆ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの不活性化曲線を、（ｇ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの不活性化の時定数タウをそれぞれ示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用に関するものであり、特に、急性脳炎および急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
急性脳炎および急性脳症は乳幼児期に多く、様々なウイルス感染や薬剤が引き金になって起きる。
【０００３】
急性脳炎および急性脳症は、ウイルス感染を発症してから数時間〜数日後に、意識障害、痙攣、異常行動(奇声をあげる、意味のわからない発言や行動など)、異常なおびえや怒り、幻覚などの精神症状などで発症する。重症の場合は突然の痙攣や意識障害が出現することが多い。重症の急性脳炎および急性脳症では、播種性血管内凝固、肝機能障害、腎機能障害、横紋筋融解症など、他の重篤な合併症を伴う。軽症では、後遺症を残すことなく回復するが、重症の場合、後遺症としては、てんかん、知能障害、四肢麻痺などが認められる。さらに経過中に様々な合併症を伴う最重症例は、最終的に多臓器不全の状態に陥り死亡する。
【０００４】
髄液にウイルスを検出できた場合を急性脳炎、ウイルスを検出できない場合を急性脳症として区別することが多いが、髄液から原因ウイルスを検出できなくても中枢神経系への感染を否定することは現状では困難であること、および、臨床症状が非常に類似していることより、実際の医療現場では急性脳炎と急性脳症とを区別して扱うよりも「急性脳炎・脳症」として総括して報告することが多い。
【０００５】
日本では、インフルエンザウイルス感染に伴って急性脳炎または急性脳症を引き起こすことも多く、インフルエンザウイルスによって引き起こされる急性脳炎および急性脳症はインフルエンザ脳症とも呼ばれる。急性脳炎および急性脳症の原因には、インフルエンザのほか、種々のウイルス感染やアスピリン（解熱剤）、テオフィリン（気管支拡張剤）などの薬剤等がある。しかし、原因が同定できない場合も少なからず認められる。
【０００６】
急性脳炎および急性脳症の中でも、日本人で頻度の高いインフルエンザ脳症は、主に６歳以下の子供がかかり、日本では毎年１００〜３００人前後の患者が発症している。脳症でよく見られる症状は、意識障害、けいれん、異常行動である。脳症発症後１〜２日で死亡に至ることもあり、死亡率は３０％、後遺症も２５％の患者に認められる重篤な疾患で、小児の死亡原因の第６位になっている。
【０００７】
インフルエンザ脳症は、日本を含む東アジアに多く欧米には少ないため、遺伝的要因の関連が考えられている。また、インフルエンザ脳症は発症すると死に至ることもあることから、できるだけ早く診断し治療を始めることが望まれている。しかし、インフルエンザ脳症の治療法として、抗インフルエンザ剤の投与、ステロイド療法、ガンマグロブリン療法、血漿交換、低体温療法などが行われているが、いまだ効果は不十分である。また、インフルエンザ感染に伴ってインフルエンザ脳症に進行する患者をインフルエンザ脳症発症前に特定することも現時点では不可能である。
【０００８】
このように、インフルエンザ感染などを契機とした急性脳炎および急性脳症は発症すると最悪の場合には、患者を死に至らしめる危険性があるため、急性脳炎および急性脳症の予防、診断、治療にかかる技術の開発が進められている。
【０００９】
例えば、小児インフルエンザ脳症の診断方法として、特許文献１に開示される技術を挙げることができる。
【００１０】
特許文献１には、小児髄液中に含まれる１４−３−３タンパク質のアイソフォームにおいて、β、θ、γ、ζ、εの順に強く検出された場合に、小児インフルエンザ脳症であると判断できることが記載されている。
【００１１】
また、解熱鎮痛剤及びこれに関連する薬剤を投与したときにインフルエンザ脳症を発症するリスクを判定する方法として、例えば、特許文献２の技術が知られている。
【００１２】
特許文献２に開示されるインフルエンザ脳症の発症リスクの判定方法では、まず、血管内皮細胞に、インビトロでウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を接触させ、あるいは、非ヒト動物に、ウイルスを感染させる前後又は同時に、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与する。次に、（１）血管内皮細胞内のウイルス増殖の程度、（２）血管内皮細胞における血管の透過性亢進の程度、又は、（３）血液脳関門における血管内皮細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質の発現量を測定する。これらの結果を、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤無添加の場合と比較することにより、解熱鎮痛剤又はその候補薬剤を投与したときに、インフルエンザ脳症を発症するリスクを判定する。
【００１３】
また、最近、インフルエンザ脳症への罹患を左右する遺伝子多型解析が行われており、染色体１０ｑ２２に位置する特定の遺伝子の遺伝子多型がインフルエンザ脳症の発症と関連していることが報告されている。
【特許文献１】特開２００５−２９２１０８号公報（平成１７（２００５）年１０月２０日公開）
【特許文献２】特開２００７−５３９４２号公報（平成１９（２００７）年３月８日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上説したように、急性脳炎または急性脳症を診断したり、発症リスクを判定したりする方法が開発されているが、これらの方法は、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定する技術としては不十分である。
【００１５】
具体的には、特許文献１の技術は、急性脳炎または急性脳症を発症していることを診断するものであり、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定することはできない。
【００１６】
また、特許文献２の技術は、解熱鎮痛剤の中には、血管内皮細胞でウイルス増殖を引き起こすものがあるとの知見に基づくインフルエンザ脳症の発症リスクの判定方法である。つまり、特許文献２の技術は、投与した薬剤が患者に対してインフルエンザ脳症を発症させるか否かを判定するものである。そのため、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定することはできない。
【００１７】
このように、特許文献１および特許文献２を含め、従来技術では、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定することができない。そのため、少なくとも一般の臨床の現場では、インフルエンザに罹患した場合、一般内科医や小児科医による抗インフルエンザ剤等の処方が行われるのみで、事前に脳症に対する予防を講じるには至っていない。
【００１８】
そのため、急性脳炎または急性脳症を発症していない患者における急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定する技術が求められている。
【００１９】
これに関連する技術として、染色体１０ｑ２２に位置する特定の遺伝子の遺伝子多型とインフルエンザ脳症の発症との関連性が知られているが、インフルエンザ脳症の罹患リスクの判定法としての有効性は十分に立証されていない。
【００２０】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、急性脳炎または急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症罹患リスク判定データの取得方法およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群における変異が、急性脳炎または急性脳症の罹患に関連していることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。
【００２２】
（１）急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法であって、生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【００２３】
（２）上記変異は、上記カルシウムイオンチャネルの活性を変化させる変異であることを特徴とする（１）に記載の急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【００２４】
（３）上記カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群は、カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子を少なくとも含み、該カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を少なくとも検出することを特徴とする（１）または（２）に記載の急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【００２５】
（４）急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するための急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キットであって、（ａ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマー、（ｂ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型のエキソン、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部のみを特異的に検出できるように設計されたプローブ、および（ｃ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット。
【００２６】
（５）急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞であって、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有することを特徴とする細胞。
【００２７】
（６）急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞の製造方法であって、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含むことを特徴とする細胞の製造方法。
【００２８】
（７）（５）に記載の細胞に、候補薬剤を投与し、該細胞におけるカルシウムイオンチャネルの活性が変化したか否かを判定することを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【００２９】
（８）上記候補薬剤は、カルシウムイオンチャネルに対する阻害剤もしくは作動薬、またはカルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであることを特徴とする（７）に記載の急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法は、以上のように、生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含んでいる。
【００３１】
上記構成によれば、取得されたデータにおいて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群にアミノ酸変化を伴う変異の有無を検証することにより、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定することができる。
【００３２】
それゆえ、急性脳炎または急性脳症を発症していない者について、急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
＜Ｉ．急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法（以下、「本発明の判定データ取得方法」ともいう）は、被験者から分離した試料を用いて、該被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得するための方法である。
【００３５】
なお、上記被験者は特に限定されるものではなく、急性脳炎または急性脳症に罹患している者（罹患している可能性のある者）であってもよいし、急性脳炎または急性脳症に罹患していない者（罹患している可能性がない者）であってもよい。
【００３６】
本明細書において、「急性脳炎」および「急性脳症」とは、様々なウイルス感染や薬剤が引き金になって起きる意識障害、痙攣、異常行動、異常なおびえや怒り、幻覚などの精神症状きたす疾患が意図される。具体的には、インフルエンザ脳症、ライ症候群、アスピリンやテオフィリンなどの薬剤でおきる脳症、および種々のウイルス感染に惹起された脳症などを包含する。これらの急性脳炎および急性脳症は、疾患を引き起こす原因はそれぞれ異なるが、疾患の基盤的な機序は同一ではあると考えられる。したがって、本発明にかかる判定データ取得方法は、これら急性脳炎および急性脳症の全てについて、罹患リスクを判定する対象とする。
【００３７】
本発明の判定データ取得方法は、具体的には、生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群（以下、「カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群」ともいう）に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出する工程を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されない。
【００３８】
なお、本明細書において、「アミノ酸変化を伴う変異」とは、ミスセンス変異（アミノ酸が置換する）、ナンセンス変異（アミノ酸合成が途中で止まる）、フレームシフト（塩基の挿入、欠失により、変異位置より下流のアミノ酸配列が変化し、本来の機能を有しない）、スプライシング異常（該当エキソン領域の欠失等）、少数塩基挿入・欠失（一部のアミノ酸が新生、脱落するが下流は正常アミノ酸のまま合成）、エキソン領域微小欠失（エキソンが１つもしくは複数欠損）などが意図される。
【００３９】
本発明の判定データ取得方法は、具体的には、例えば、上記変異を検出するために、上記生体から分離した試料を前処理する工程等を含んでいてもよい。
【００４０】
上記カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群とは、カルシウムイオンチャネルを構成する各サブユニットをそれぞれコードする遺伝子からなる群が意図される。カルシウムイオンチャネルとは、電位依存性カルシウムチャネルが意図される。電位依存性カルシウムチャネルは、その電気生理学的性質の相違によって、Ｌ型、Ｔ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、およびＲ型の５つに分類される。
【００４１】
Ｌ型、Ｎ型、およびＰ／Ｑ型のカルシウムイオンチャネルは大きな脱分極によって活性化される。また、Ｒ型は中程度の脱分極によって活性化される。ここでは、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、およびＲ型のカルシウムイオンチャネルを総称して、高閾値活性化型カルシウムイオンチャネルともいう。一方、Ｔ型カルシウムイオンチャネルは小さな脱分極によって活性化される。ここでは、Ｔ型カルシウムイオンチャネルを、低閾値活性化型カルシウムイオンチャネルともいう。
【００４２】
高閾値活性化型カルシウムイオンチャネルは、α1サブユニット、α2／δサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットからなる５量体で構成されている。このうち、α2／δサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニットは、修飾サブユニットである。
【００４３】
高閾値活性化型カルシウムイオンチャネルを構成するα1サブユニットは、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型、およびＲ型のカルシウムイオンチャネルにおいて、それぞれ異なる。Ｌ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットとしては、α1S（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００００６０、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｓ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００００６９））、α1C（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１０、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｃ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７１９））、α1D（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１１、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｄ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２０））、およびα1F（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００５１７４、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｆ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００５１８３））の４種類が存在する。
【００４４】
Ｎ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットとしては、α1B（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７０９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｂ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７１８））の１種類が存在する。Ｐ／Ｑ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットしては、α1A（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００００５９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ａ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００００６８））の１種類が存在する。また、Ｒ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットとしては、α1E（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１２、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｅ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２１））の１種類が存在する。
【００４５】
βサブユニットには、β1（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１４、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＢ１（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２３））、β2（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１５、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＢ２（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２４））、β3（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１６、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＢ３（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２５））およびβ4（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１７、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＢ４（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２６））の４種類のサブタイプが存在する。
【００４６】
α2／δサブユニットは、同一の遺伝子から翻訳された後に修飾を受けてα2サブユニットとδサブユニットとに分かれ、ジスルフィド結合により再会合する。
【００４７】
α2／δサブユニットには、α2／δ1（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１３、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ２Ｄ１（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２２））、α2／δ2（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１００５５０５、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ２Ｄ２（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１００５５０５））、α2／δ3（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６０８６８、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ２Ｄ３（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１８３９８））およびα2／δ4（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿７５８９５２、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ２Ｄ４（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿１７２３６４））の４種類のサブタイプが存在する。
【００４８】
γサブユニットには、γ1（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１８、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ１（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２７））、γ2（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００６０６９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ２（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００６０７８））、γ3（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００６５３０、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ３（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００６５３９））、γ4（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０５５２２０、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ４（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１４４０５））、γ5（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０５５２１９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ５（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１４４０４））、γ6（ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＫ２００２９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ６（ＮＣＢＩアクセション番号ＡＦ２８８３８６））、γ7（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿１１４１０２、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ７（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０３１８９６））、およびγ8（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿１１４１０１、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＧ８（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０３１８９５））の８種類のサブタイプが存在する。
【００４９】
これに対して、低閾値活性化型カルシウムイオンチャネルであるＴ型カルシウムイオンチャネルは、α1サブユニット単独で構成されている。Ｔ型カルシウムイオンチャネルのα1サブユニットとしては、α1G（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６１４９６、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｇ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１８８９６））、α1H（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６６９２１、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｈ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０２１０９８））、およびα1I（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６６９１９、コードする遺伝子：ＣＡＣＮＡ１Ｉ（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０２１０９６））の３種類が存在する。
【００５０】
本発明の判定データ取得方法では、上記例示したようなカルシウムイオンチャネルを構成する各サブユニットをそれぞれコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出すればよい。
【００５１】
中でも、高閾値活性化カルシウムイオンチャネルを構成する各サブユニットをそれぞれコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することが好ましい。
【００５２】
また、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出する対象となる遺伝子は、高閾値活性化カルシウムイオンチャネルのαサブユニットまたはβサブユニットをコードする遺伝子のいずれかを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
【００５３】
β4サブユニットは、Ｎ型カルシウムイオンチャネルのβサブユニットの２４％を、Ｐ／Ｑ型カルシウムイオンチャネルのβサブユニットの５６％を占める(Liu et al., JBC 271 13804-13810 (1996), Scott et al., ＪＢＣ 271 3207-3212 (1996)を参照)。
【００５４】
Ｌ型カルシウムチャネルのα1Cサブユニットは主にβ3サブユニットと結合するがβ2サブユニットとも結合する可能性が示唆されており、Ｌ型カルシウムチャネルのα1Dサブユニットは主にβ1サブユニットと結合するがβ2サブユニットとも結合する可能性が示唆されている（Tanaka et al, Molecular Brain Research 30, 1-16, 1995）。
【００５５】
Ｎ型カルシウムチャネルのα1Bサブユニットとの結合は５６％をβ3サブユニットが、２４％をβ4サブユニットが、１０％をβ1サブユニットが占めている（Scott et al, JBC 271, 3207-3212, 1996）。
【００５６】
Ｐ／Ｑ型カルシウムチャネルのα1Aサブユニットとの結合は４８％をβ4サブユニットが、３６％をβ3サブユニットが、８％をβ1サブユニットが、７％をβ2サブユニットが占めている（Liu et al, JBC 271, 13804-13810, 1996）。
【００５７】
骨格筋で発現しているα1Sサブユニットは主にβ1サブユニットと結合すると考えられている（Scott et al, JBC 271, 3207-3212, 1996）。
【００５８】
ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースによると、β4サブユニットはヒトの骨髄、脳、腎臓、筋肉、胸腺、気管に発現していることが報告されている（２００７年９月現在；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ESTProfileViewer.cgi?uglist=Hs.614033）。
【００５９】
したがって、β4サブユニットは、αサブユニットα1C、α1D、α1Eと結合する可能性も示唆される。また、β4サブユニットは主にα1Aサブユニットと結合するが、低い割合で他のαサブユニットα1B、α1C、α1Dとも結合する可能性が示唆されている（Tanaka et al, Molecular Brain Research 30, 1-16, 1995）。
【００６０】
Ｔ型カルシウムチャネルのα1Gサブユニットは、不完全ながらαサブユニット結合コンセンサス配列（α interaction domain）を持っており、β1サブユニットとだけ相互作用することにより、細胞膜への移動を円滑に行っていると考えられている（Dolphin et al, J. Physiol 519, 35-45, 1999）。
【００６１】
本発明の判定データ取得方法では、上記例示したカルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、少なくとも１つについて、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出すればよいが、複数の遺伝子について変異の有無を検出することが好ましい。
【００６２】
上記構成によれば、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクをより高精度に判定することが可能なデータを取得することができる。
【００６３】
上記カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる遺伝子において検出する変異は、アミノ酸変化を伴うものであればよく、その具体的な変異は特に限定されるものではない。具体的には、変異には、ミスセンス変異（アミノ酸が置換する）、ナンセンス変異（アミノ酸合成が途中で止まる）、フレームシフト（塩基の挿入、欠失によりアミノ酸コドンのフレームがずれ、変異位置より下流のアミノ酸配列が変化し、本来の機能を有しない）、スプライシング異常（該当エキソン領域の欠失等）、少数塩基挿入・欠失（一部のアミノ酸が新生、脱落するが下流は正常アミノ酸のまま合成）、エキソン領域微小欠失（エキソンが１つもしくは複数欠損）が含まれる。また、変異は、遺伝子多型であってもよい。
【００６４】
上記遺伝子における変異の位置は特に限定されるものではないが、カルシウムイオンチャネルの機能（換言すれば、活性）を変化させる位置における変異であることが好ましい。さらに、上記カルシウムイオンチャネルの機能の変化は、特に限定されるものではないが、カルシウムイオンチャネルの機能亢進であることが好ましい。
【００６５】
このような変異としては、具体的には、例えば、上記ＣＡＣＮＢ４遺伝子（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２６）の塩基配列における開始コドンＡＴＧのＡを第１位としたとき、第１４０３位のグアニン（Ｇ）の変異、好ましくは第１４０３位のグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換を挙げることができる。つまり、β4サブユニット（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１７）のアミノ酸配列における第４６８位のアルギニン（Ｒ）の変異、好ましくは第４６８位のアルギニン（Ｒ）のグルタミン（Ｑ）への置換を挙げることができる。
【００６６】
また、これ以外にも、β4サブユニット（ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１７）のアミノ酸配列における第１０４位のシステイン（Ｃ）がフェニルアラニン（Ｆ）への変異、第４８２位のアルギニン（Ｒ）が停止コドンへの変異等を挙げることができる。なお、これらの変異がカルシウムイオンチャネルの機能を亢進させることは、Escayg A, et al.Am.J.Hum. Genet. 66:1531-1539,2000等に記載されている。
【００６７】
カルシウムイオンチャネルの機能亢進にかかる変異は、上記例示的に示した変異に限定されないことはいうまでもない。
【００６８】
なお、本発明の判定データ取得方法において、変異の有無を検出する対象となる遺伝子は、上記のアクセション番号に登録されている塩基配列に限定されるものではない。つまり、上記例示した遺伝子がコードするタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子について、変異の有無を検出する構成も本発明に含まれる。このような遺伝子としては、具体的には、例えば、上記のアクセション番号に登録されている塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（遺伝子）であり、該ポリヌクレオチドの翻訳産物がカルシウムイオンチャネルのサブユニットとしての機能を有する遺伝子を挙げることができる。
【００６９】
また、本発明にかかる判定データ取得方法においては、同じ遺伝子から生じるアイソフォームｍＲＮＡやタンパク質を変異の有無を検出する対象としてもよい。
【００７０】
本明細書において、「遺伝子」とは、「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用されるものである。さらに、本明細書において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。
【００７２】
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
【００７３】
本発明の判定データ取得方法において、遺伝子の変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知のあらゆる方法を用いることができる。
【００７４】
具体的には、例えば、ＰＣＲを利用したシークエンシング、ＳＳＣＰ（Single strand conformation polymorphism）などの変異検出法、リアルタイムＰＣＲやＤＮＡチップを用いた多型検出方法、遺伝子の各エキソンのmicro−deletionを検出する方法、ｍＲＮＡの増減を検出するNorthern blot法、ＲＴ−ＰＣＲ法, Real-time PCR法、およびｃＤＮＡアレイ法、並びに、タンパク質の増減を検出するウエスタンブロット法、免疫染色法、およびタンパクアレイ法等を挙げることができる。
【００７５】
ここでは、（Ａ）生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出する実施形態、（Ｂ）生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いて変異を検出する実施形態、（Ｃ）生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態に分けて、より具体的に説明する。
（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる実施形態
生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出する。
【００７６】
被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、ゲノムＤＮＡを抽出可能なものであればよい。具体的には、例えば、血液、骨髄液、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞を挙げることができる。また、被験者から分離した細胞を培養し、増殖したものからゲノムＤＮＡを抽出してもよい。
【００７７】
また、抽出したゲノムＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、およびＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いてもよい。
【００７８】
こうして調製されたゲノムＤＮＡを含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法等を挙げることができる。
【００７９】
より具体的には、例えば、ゲノムＤＮＡから、変異の有無を検出する対象となる遺伝子のエキソンを含む領域、好ましくは変異位置を含むエキソン領域、または、エキソンとイントロンとの境界領域、好ましくは変異位置を含むエキソンとイントロンとの境界領域を増幅後、得られたＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスすることによって該遺伝子における変異の有無を検出することができる。
【００８０】
また、ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、切断されたゲノムＤＮＡ断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても、遺伝子における変異の有無を検出することができる。
【００８１】
また、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に含まれる複数の遺伝子について、変異の有無を検出する場合、マルチプレートを用いるなど、従来公知の多サンプルの処理方法を上記方法と組み合わせて用いてもよい。
【００８２】
また、蛍光標識したプライマーを用いて各エキソンを増幅後、ゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動法にて各シグナルの強さを検討する方法により、エキソンの欠失を検出することも可能である。
【００８３】
このように、生体から分離された試料に含有されるゲノムＤＮＡを用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に変異が見出された場合には、該被験者は急性脳炎または急性脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
【００８４】
なお、変異の検出方法において使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる場合
生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出する。
【００８５】
上記被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、ｍＲＮＡを抽出可能であり、変異を検出する対象となる遺伝子を発現している、または発現している可能性があるものであればよい。
【００８６】
具体的には、例えば、患者の末梢血白血球細胞や皮膚線維芽細胞、口腔粘膜細胞、筋細胞が好ましい。
【００８７】
続いて、その抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製する。さらに、得られたｃＤＮＡを必要に応じて、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、およびＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅してもよい。
【００８８】
こうして調製されたｃＤＮＡを含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子の変異を検出する場合と同様の方法を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子の変異の有無を検出することができる。
【００８９】
このように、生体から分離された試料に含有されるｍＲＮＡを用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群に変異が見出された場合には、該被験者は急性脳炎または急性脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
（Ｃ）タンパク質を用いる場合
生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて変異を検出する実施形態では、まず、被験者から分離された試料から、従来公知の方法を用いて、タンパク質を抽出する。
【００９０】
上記被験者から分離された試料は、特に限定されるものではなく、タンパク質を抽出可能であり、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（換言すれば、カルシウムイオンチャネル）を発現している、または発現している可能性があるものであればよい。
【００９１】
こうして調製されたタンパク質を含有する試料を用いて、変異を検出する対象となる遺伝子における変異の有無を検出する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）について、特定の変異をもつポリペプチドのみを特異的に認識する抗体を作製し、該抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法により変異を検出することができる。なお、本明細書において、用語「タンパク質」は、「ポリペプチド」又は「ペプチド」と交換可能に使用される。
【００９２】
また、上記タンパク質を含有する試料から、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーや、質量分析装置を利用して変異を検出することができる。
【００９３】
さらに、上記タンパク質を含有する試料から、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）を単離し、該ポリペプチドの等電点に基づいて、変異を検出することもできる。
【００９４】
このように、生体から分離された試料に含有されるタンパク質を用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異を検出することにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することができる。具体的には、取得されたデータにおいて、変異を検出する対象となる遺伝子の翻訳産物（タンパク質）に変異が見出された場合には、該被験者は急性脳炎または急性脳症に罹患する可能性が高いと判定することができる。
【００９５】
本発明の判定データ取得方法は、上説した構成を備えているため、該判定データ取得方法により取得したデータによれば、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクの可能性を事前に診断することができる。そのため、例えば、本発明の判定データ取得方法により取得したデータに基づいて急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクが高いから診断された被験者がインフルエンザに罹患した際には、該被験者の急性脳炎または急性脳症の罹患リスクが分かっているため、担当医との連携によりすばやい治療を施すことができる。
【００９６】
つまり、本発明の判定データ取得方法によれば、急性脳炎または急性脳症による死亡率や後遺症の成績を向上させることができる。また、家族の精神的負担や経済的負担を軽減し、さらには適切な治療を施すことによって医療費を削減することができる。
【００９７】
インフルエンザは数年毎に流行するため社会的関心が高い。本発明の判定データ取得方法によれば、インフルエンザ脳症の罹患リスクを判定することが可能であるため、インフルエンザ脳症の予防に好適に用いることができる。
【００９８】
さらに、近年、インフルエンザ患者にタミフルを投与したときに見られる異常行動が問題となっている。本発明にかかる判定データ取得方法は、インフルエンザ患者にタミフルを投与したときに異常行動を起こすリスク判定にも応用することができる。
【００９９】
＜ＩＩ．急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット＞
本発明には、本発明の判定データ取得方法を用いて、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得するために用いる急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット（以下、単に「本発明の判定キット」ともいう）も含まれる。
【０１００】
本発明の判定キットは、具体的には、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子における変異の有無を検出するための試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。
【０１０１】
カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するための試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬以外のその他の試薬を含んでいてもよい。
【０１０２】
具体的には、ゲノムＤＮＡを用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域もしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマーや、変異型または野生型の一方のエキソン領域もしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部（換言すれば、特定の遺伝子型のエキソンもしくはエキソンとイントロンとの境界領域、またはそれらの一部）のみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。
【０１０３】
さらに、このような判定キットでは、上記プライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬など、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１０４】
なお、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、ＰＣＲ法やサザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【０１０５】
また、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）または全ＲＮＡを用いて、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、上記遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡまたはその一部の領域を増幅できるように設計されたプライマーや、変異型または野生型の一方のｍＲＮＡもしくはその一部（換言すれば、特定の遺伝子型のｍＲＮＡまたはその一部）のみを特異的に検出できるように設計されたプローブを含む構成を挙げることができる。
【０１０６】
さらに、このような判定キットでは、上記プライマーやプローブに加えて、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いられる試薬など、上記遺伝子における変異の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１０７】
なお、上記試薬は、本発明の検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法、核酸シークエンシングに用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【０１０８】
また、タンパク質レベルでカルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群における変異の有無を検出するキットとしては、例えば、該遺伝子群の翻訳産物であるポリペプチド（タンパク質）のうち、野生型または変異型のポリペプチドもしくはその一部の一方のみに特異的に結合する抗体（換言すれば、特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体）を含むキット等が挙げられる。
【０１０９】
さらに、このような判定キットでは、上記抗体に加えて、ＥＬＩＳＡ法や、ウエスタンブロット法、カルシウムイオンチャネルの活性測定に用いられる試薬など、上記遺伝子における変異（換言すれば、カルシウムイオンチャネルにおける変異）の有無を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせて含む構成とすることもできる。
【０１１０】
また、本発明の判定キットは、上記例示した構成物をどのように組み合わせて含んでいてもよい。
【０１１１】
上説したような本発明の判定キットを用いることにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを、急性脳炎または急性脳症の罹患前に判定するためのデータを取得することができる。
【０１１２】
本発明の判定キットが適用される被験者は、特に限定されるものではない。
【０１１３】
＜ＩＩＩ．急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞およびその製造方法＞
本発明によれば、培養細胞において、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入することにより、カルシウムイオンチャネルの活性が変化した細胞を製造することができる。
【０１１４】
換言すれば、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入された形で、カルシウムイオンチャネルのサブユニット遺伝子群が発現する培養細胞を製造することができる。
【０１１５】
このような細胞は、急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニングに好適に用いることができる。つまり、このような細胞は、治療薬剤のスクリーニング細胞ということができる。
【０１１６】
したがって、本発明には、このような急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞（以下、単に「スクリーニング細胞」ともいう）およびその製造方法も含まれる。
【０１１７】
本発明にかかるスクリーニング細胞は、具体的には、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有する細胞である。
【０１１８】
例えば、変異型のカルシウムイオンチャネルを発現するように、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されている細胞が挙げられる。
【０１１９】
このような細胞では、変異型のカルシウムイオンチャネルが発現しており、カルシウムイオンチャネルの機能が変化している。この機能変化は特に限定されるものではないが異常亢進であることが好ましい。
【０１２０】
上記遺伝子群におけるこのような変異および変異を導入する遺伝子については、＜Ｉ．急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞で説明した通りであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
【０１２１】
本明細書において、「治療薬剤のスクリーニング細胞」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験用培養細胞をいい、具体的には、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サルなどの哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
【０１２２】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞の製造方法は、上記の特性を有する細胞を製造する方法であり、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含んでいればよい。
【０１２３】
より具体的には、以下の３つの実施形態を挙げることができる。ここでは、以下の３つの実施形態について具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１２４】
（１）発現ベクター等を用いる方法
この方法では、まず、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群（α1サブユニット、α2／δサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニット）のうち、少なくとも１つの遺伝子にはアミノ酸変化を伴う変異を含んでいる遺伝子群を、発現ベクター等を用いて、宿主となる培養細胞内において発現させる。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
【０１２５】
このとき、宿主となる培養細胞はカルシウムイオンチャネルが発現していない細胞であることが好ましい。このような細胞によれば、内在のカルシウムイオンチャネルの影響を受けることがない。
【０１２６】
なお、本方法において、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
【０１２７】
（２）人為的な変異導入を用いる方法
この方法では、カルシウムイオンチャネルを発現している培養細胞に、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
【０１２８】
上記培養細胞に変異を導入する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の遺伝子操作技術を適宜組み合わせて用いればよい。
【０１２９】
（３）モデル動物を用いる方法
この方法では、まず、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有するモデル動物を作製する。次に、該モデル動物から組織を摘出し、その組織から培養細胞を作製する。これにより、本発明にかかるスクリーニング細胞を製造することができる。
【０１３０】
上記モデル動物は、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち、少なくとも１つの遺伝子に変異が導入されているため、急性脳炎または急性脳症を発症する。すなわち、上記モデル動物は、急性脳炎または急性脳症を人為的に発症させた急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物ということができる。
【０１３１】
本発明には、このようなモデル動物、すなわち、急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物、およびその製造方法も含まれる。
【０１３２】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物は、具体的には、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有する。該急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物は、カルシウムイオンチャネルの機能に異常があることが好ましく、その異常が異常亢進であることがより好ましい。
【０１３３】
上記遺伝子群におけるこのような変異および変異を導入する遺伝子については、＜Ｉ．急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法＞で説明した通りであるので、ここでは、詳細な説明は省略する。
【０１３４】
本明細書において、「モデル動物」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物をいい、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
【０１３５】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物の製造方法は、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されるように、モデル動物の上記遺伝子群を操作する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
【０１３６】
本明細書において、「モデル動物の遺伝子を操作する」とは、従来公知の遺伝子操作技術を用いて、モデル動物の遺伝子を操作することが意図される。具体的には、モデル動物の遺伝子を破壊したり、当該遺伝子に変異を導入したり、当該遺伝子を変異型遺伝子で置換したり、さらには、当該モデル動物に外来遺伝子を導入したり、モデル動物を交雑したりすることをすべて包含する意味である。
【０１３７】
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物の製造方法によれば、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異が導入されるように、モデル動物の上記遺伝子群を操作することにより、急性脳炎または急性脳症を発症したモデル動物を製造することができる。
【０１３８】
＜ＩＶ．急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法＞
本発明にかかるスクリーニング細胞、および急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物は、新たな急性脳炎または急性脳症の治療方法や治療薬剤の開発に用いることができる。したがって、本発明には、急性脳炎または急性脳症の治療薬の治療薬剤をスクリーニングする急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法（以下、単に「スクリーニング方法」ともいう）が含まれる。
【０１３９】
ここでは、本発明にかかるスクリーニング方法の一実施形態として、本発明にかかるスクリーニング細胞を用いる実施形態と、本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物を用いる実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１４０】
すなわち、例えば、本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物に代えて、他の急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物を用いる実施形態とすることもできる。
【０１４１】
（１）本発明にかかるスクリーング細胞を用いる場合
本発明にかかるスクリーニング細胞に候補薬剤を投与する工程と、該候補薬剤が投与された急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング細胞において、カルシウムイオンチャネルの活性が変化したかを判定する工程とを少なくとも含む。
【０１４２】
つまり、本実施形態にかかるスクリーニング方法によれば、本発明にかかるスクリーニング細胞に候補薬剤を投与し、当該候補薬剤を投与されたスクリーニング細胞におけるカルシウムイオンチャネルの活性が変化していることを指標として、上記候補薬剤が急性脳炎または急性脳症の治療薬剤となりうるかを判定することができる。
【０１４３】
上記候補薬剤は、特に限定されるものではないが、カルシウムイオンチャネルの発現に影響を及ぼすことが期待される化合物、またはカルシウムイオンチャネルの活性に影響を及ぼすことが期待される化合物（例えば、カルシウムイオンチャネルに対する阻害剤や阻害剤の候補物質、または作動薬や作動薬の候補物質）であることが好ましい。
【０１４４】
また、上記候補薬剤は、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであってもよい。
【０１４５】
このような候補薬剤を本発明にかかるスクリーニング細胞に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その候補薬剤の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
【０１４６】
また、該候補薬剤が投与されたスクリーニング細胞におけるカルシウムイオンチャネルの活性が変化したか否かを判定する方法は特に限定されるものではなく、電気生理学的測定機器や蛍光色素観察機器などを用いて判定すればよい。
【０１４７】
（２）本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物を用いる場合
本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物に候補薬剤を投与する工程と、該候補薬剤が投与された急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物の急性脳炎または急性脳症が治癒または改善されたか否かを判定する工程とを含んでいればよい。つまり、本発明にかかる急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法によれば、急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物に候補薬剤を投与し、当該候補薬剤を投与された急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物において、急性脳炎または急性脳症が治癒または改善していることを指標として、上記候補薬剤が急性脳炎または急性脳症の治療薬剤となりうるかを判定することができる。
【０１４８】
上記候補薬剤は、特に限定されるものではなく、（１）本発明にかかるスクリーング細胞を用いる場合と同様の物質を挙げることができる。
【０１４９】
このような候補薬剤を本発明にかかる急性脳炎または急性脳症発症モデル動物に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その候補薬剤の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
【０１５０】
また、該候補薬剤が投与された急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物の急性脳炎または急性脳症が治癒または改善されたか否かを判定する方法は特に限定されるものではなく、急性脳炎または急性脳症に特徴的症状を指標に判定すればよい。
【０１５１】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１５２】
本発明について、実施例および図１〜図４に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１５３】
〔実施例１：インフルエンザ脳症に罹患した患者の遺伝子解析〕
インフルエンザ脳症に罹患した患者について、脳波測定、聴性脳幹反応測定および遺伝子解析を行った。
【０１５４】
まず、インフルエンザ脳症に罹患した患者についての脳波測定の結果について、図１（ａ）〜（ｄ）に基づいて説明する。
【０１５５】
脳波は１０−２０法という電極配置法で記録した。電極配置記号は頭部の部位を示すもので、一般にＦｐ１，Ｆｐ２は前部極、Ｆ３，Ｆ４は前頭部、Ｃ３，Ｃ４は中心部、Ｐ３，Ｐ４は頭頂部、Ｏ１，Ｏ２は後頭部、Ｆ７，Ｆ８は前側頭部、Ｔ３，Ｔ４は中側頭部、Ｔ５，Ｔ６は後側頭部、Ｆｚは正中前頭部、Ｃｚは正中中心部、Ｐｚは正中頭頂部を意味する。
【０１５６】
図１（ａ）は、インフルエンザ脳症を発症して１３時間後の痙攣重積時の脳波を示す図である。全ての電極配置記号から、棘徐波複合が連続的に認められ、脳全体の広汎な領域から痙攣発射が出現していることを示している。
【０１５７】
その後、図１（ｂ）に示すように、インフルエンザ発症３８時間後には、痙攣は収まっているが、すでに、脳波の低電位化が始まっていた。さらに、図１（Ｃ）に示すように、インフルエンザ発症６２時間後の脳波では、さらに、低電位化が進行した。そして、図１（ｄ）に示すように、７日目には、脳波が平坦になって、急速な病状の進行で脳の全般的な活動停止に近い状態に至った。
【０１５８】
また、上記患者について、インフルエンザ脳症を発症して８日目の聴性脳幹反応を調べた。図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、右側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、左側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、および左右両側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果を示す。
【０１５９】
図２（ａ）〜（ｃ）に示すように、いずれの刺激に対しても無反応であった。脳波所見、聴性脳幹反応所見、そして自発呼吸の消失や臨床的脳幹反応の消失など総合的に判断して、脳死状態になったと診断された。患者は、多臓器不全も合併し、インフルエンザ脳症を発症して２７日目に死亡した。
【０１６０】
次に、インフルエンザ脳症に罹患した上記患者について、カルシウムイオンチャネルをコードする遺伝子群の遺伝子解析の結果について説明する。
【０１６１】
末梢血ゲノムＤＮＡより、カルシウムイオンチャネルをコードする遺伝子群の各エキソンをＰＣＲにより増幅し、塩基配列の決定を行った。その結果、図３（ｂ）に示すように、カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子ＣＡＣＮＢ４に変異があることが分かった。その変異は、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００７２６に塩基配列が登録されているＣＡＣＮＢ４遺伝子の第１４０３位のＤＮＡ塩基であるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換された変異（Ｇ１４０３Ａ）であった。
【０１６２】
この変異により、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００７１７にアミノ酸配列が登録されているカルシウムイオンチャネルのβ4サブユニットの第４６８位のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）に置換（Ｒ４６８Ｑ）される。つまり、該変異は、ミスセンス変異であった。
【０１６３】
また、このＣＡＣＮＢ４遺伝子における変異を、熱性痙攣の既往をもつ父親（図３（ａ）を参照）を含め、両親についても調べたところ、同様の変異が熱性痙攣の既往をもつ父親にも存在した。なお、図３（ａ）中、インフルエンザ脳症を発症した患者は矢印で示している。また、ＦＳは熱性痙攣（Febrile seizure）を表す。
【０１６４】
さらに、健常者２００人について、ＣＡＣＮＢ４遺伝子における変異の有無を調べたところ、その変異を見出すことはできなかった。
【０１６５】
これらの結果から、インフルエンザ脳症に罹患した患者におけるＣＡＣＮＢ４遺伝子の変異は、遺伝子多型ではないことが分かった。
【０１６６】
次に、これらの変異型遺伝子ｃＤＮＡ発現系を作成し機能解析を行った。具体的には、変異型ＣＡＣＮＢ４遺伝子（Ｇ１４０３Ａ）および野生型（正常型）ＣＡＣＮＢ４遺伝子をそれぞれ発現させることによって、変異型カルシウムチャネル（Ｒ４６８Ｑ）および野生型（正常型）カルシウムチャネルを作製した。
【０１６７】
より具体的には、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１０８２２７６に塩基配列が登録されている骨格筋型カルシウムイオンチャネルα2／δ1サブユニット遺伝子（遺伝子名；ＣＡＣＮＡ２Ｄ１）のｃＤＮＡが事前に導入された培養細胞株（ＢＨＫ細胞）に、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１１０１６９３に塩基配列が登録されているα1AサブユニットＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のｃＤＮＡと、変異型ＣＡＣＮＢ４遺伝子（Ｇ１４０３Ａ）または野生型ＣＡＣＮＢ４遺伝子とを導入し、変異型カルシウムチャネル（Ｒ４６８Ｑ）および野生型カルシウムチャネルを作製した。
【０１６８】
そして、該変異型カルシウムイオンチャネルおよび野生型カルシウムイオンチャネルについて、電気生理学的機能解析を行った。
【０１６９】
その結果、図４（ａ）は、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの代表的なバリウム電流曲線を示している。図４（ｂ）は、電流−電圧曲線で、カルシウムチャネルが、膜電位の変化に伴って、電流量が変化していくことを示している。（b）では、膜電位を−４０ｍＶから５０ｍＶまで変化させたときに流れるバリウム電流を測定しており、０ｍＶから４０ｍＶの間の膜電位で、変異型カルシウムチャネルでは、野生型カルシウムチャネルよりも有意にバリウム電流が増加していた。このことは変異型カルシウムチャネルの機能亢進を示す結果である。
【０１７０】
また、図４（ｃ）に示すように、バリウム電流、細胞の電気容量および電流密度は、野生型カルシウムチャネルと比較して、変異型カルシウムチャネルで増加していた。
【０１７１】
また、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルについて、活性化曲線を比較したところ、図４（ｄ）に示すように、両者に有意な差は見られなかった。
【０１７２】
一方、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルについて、図４（ｅ）は、活性化の時定数タウを比較したものである。−１０ｍＶの膜電位の時、野生型カルシウムチャネルよりも、変異型カルシウムチャネルのほうが活性化する時間がわずかだが有意に遅かった。これは、−１０ｍＶの膜電位の時、変異型カルシウムチャネルが活性化するまでにより時間がかかることを示している。
【０１７３】
さらに、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルについて、不活性曲線を比較したところ、図４（ｆ）に示すように、両者に有意な差は見られなかった。また、変異型カルシウムイオンチャネルおよび野生型カルシウムイオンチャネルについて、不活性化の時定数タウを比較したところ、図４（ｇ）に示すように、両者に有意な差は見られなかった。
【０１７４】
これらの結果から、上記変異型カルシウムチャネルは、チャネルを流れる電流量が大きくなるという変化と−１０ｍＶの膜電位の時、活性化するが遅いという特性を持っていた。電流量が大きくなるという変化の方がより顕著なので、総合的に判断し、変異型カルシウムチャネルの機能は亢進していることが明らかになった。
【０１７５】
以上の結果、カルシウムイオンチャネルの機能異常が急性脳炎または急性脳症の発症と関連していることが示唆された。すなわち、カルシウムイオンチャネルの変異の有無を検出することにより、被験者が急性脳炎または急性脳症に罹患するリスクを判定するためのデータを取得することが可能になった。
【０１７６】
さらに、本実施例から、カルシウムイオンチャネルについて、カルシウムイオンを透過するポアを形成し主に働くのはα1サブユニットであると考えられているが、βサブユニットの変異によっても、そのチャネル機能に異常が生じることが明らかとなった。
【０１７７】
つまり、カルシウムイオンチャネルにおいて、βサブユニット、α2／δサブユニット、およびγサブユニットはα1サブユニットの機能を補佐するものであると従来考えられてきたが、これらのサブユニットに異常が生じても、カルシウムイオンチャネルとしてのチャネル機能に変化が生じることが示唆された。
【０１７８】
したがって、本実施例では、β4サブユニットにおける変異の有無により、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得できることを実証したが、カルシウムイオンチャネルを構成するいずれのサブユニットにおける変異の有無を指標としても、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得できることが分かった。
【０１７９】
また、本実施例の結果によれば、カルシウムイオンチャネルにおける上記変異は、急性脳炎または急性脳症でよく見られる症状（意識障害、けいれん、異常行動）や、多臓器不全をうまく解釈することができる。この点について、以下具体的に説明する。
【０１８０】
カルシウムイオンチャネルについては、α1サブユニットには１０種類の遺伝子が存在し、それら１０種類の遺伝子は、組織特異的に発現している。さらに、βサブユニットにも４種類、α2／δサブユニットにも４種類の遺伝子が存在する。これらサブユニットは、それぞれ、特定の組み合わせで主に結合しているが、メイン以外の組み合わせで結合することも知られている。
【０１８１】
β4サブユニットは、１０種類のα1サブユニットのうち、５種類のα1サブユニット（α1B、α1A、α1C、α1D、α1E）と結合する可能性がある。α1BはＮ型カルシウムイオンチャネルを構成するαサブユニットである。α1Aは、Ｐ／Ｑ型カルシウムイオンチャネルを構成するαサブユニットである。α1Cおよびα1Dは、Ｌ型カルシウムイオンチャネルを構成するαサブユニットである。さらに、α1EはＲ型カルシウムイオンチャネルを構成するαサブユニとである。
【０１８２】
このように、β4サブユニットは、多くのタイプの高閾値活性化型カルシウムイオンチャネルに結合している。したがって、β4サブユニットをコードするＣＡＣＮＢ４遺伝子の変異（異常）は、多くのタイプのカルシウムイオンチャネルの機能異常を引き起こすと考えられる。
【０１８３】
つまり、β4サブユニットに変異のある場合、様々なタイプのカルシウムイオンチャネルに異常が生じるため、さまざまな組織に異常が発生し、多臓器細胞の細胞死を誘導したり、意識障害、けいれん、異常行動といった症状を呈したりするものと考えられる。
【０１８４】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１８５】
以上のように、本発明では、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子におけるアミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することにより、急性脳炎または急性脳症に罹患していない被験者についても、該被験者が急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得することができる。
【０１８６】
そのため、本発明は、急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するために用いる判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。
【０１８７】
また、本発明では、カルシウムイオンチャネルサブユニット遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入することにより、急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物を製造することができる。このような急性脳炎または急性脳症の発症モデル動物は、急性脳炎または急性脳症の治療薬剤や治療方法の開発に用いることができる。それゆえ、本発明は、製薬分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１（ａ）〜（ｄ）は、脳症発症後の脳波の経過を示す図であり、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、インフルエンザ脳症による痙攣重積時の脳波、インフルエンザ発症３８時間後で痙攣が収まっている状態の脳波、インフルエンザ発症６２時間後の脳波、およびインフルエンザ発症７日目の脳波を示す図である。
【図２】図２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ、右側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、左側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果、および左右両側を刺激したときの聴性脳幹反応の結果を示す。
【図３】図３は遺伝子解析結果を示す図であり、（ａ）はインフルエンザ脳症を発症した患者の家系図を示す図であり、（ｂ）は該患者およびその両親のＣＡＣＮＢ４遺伝子の解析結果を示す図である。
【図４】図４は、変異型ＣＡＣＮＢ４遺伝子および野生型ＣＡＣＮＢ４遺伝子の機能解析の結果を示す図であり、（ａ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの代表的なバリウム電流曲線を、（ｂ）は膜電位を−４０ｍＶから５０ｍＶまで変化させたときの、変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルを流れるバリウム電流を、（ｃ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルのバリウム電流、細胞の電気容量、および電流密度を、（ｄ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの活性化曲線を、（ｅ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの活性化の時定数タウを、（ｆ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの不活性化曲線を、（ｇ）は変異型カルシウムチャネルおよび野生型カルシウムチャネルの不活性化の時定数タウをそれぞれ示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法であって、
生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【請求項２】
上記変異は、上記カルシウムイオンチャネルの活性を変化させる変異であることを特徴とする請求項１に記載の急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【請求項３】
上記カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群は、カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子を少なくとも含み、
該カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を少なくとも検出することを特徴とする請求項１または２に記載の急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【請求項４】
急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するための急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キットであって、
（ａ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマー、
（ｂ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型のエキソン、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部のみを特異的に検出できるように設計されたプローブ、および
（ｃ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット。
【請求項５】
急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞であって、
カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有することを特徴とする細胞。
【請求項６】
急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞の製造方法であって、
カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含むことを特徴とする細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞に、候補薬剤を投与し、
該細胞におけるカルシウムイオンチャネルの活性が変化したか否かを判定することを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記候補薬剤は、カルシウムイオンチャネルに対する阻害剤もしくは作動薬、またはカルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであることを特徴とする請求項７に記載の急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するためのデータを取得する急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法であって、
生体から分離した試料を用いて、カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を検出することを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【請求項２】
上記変異は、上記カルシウムイオンチャネルの活性を変化させる変異であることを特徴とする請求項１に記載の急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【請求項３】
上記カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群は、カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子を少なくとも含み、
該カルシウムイオンチャネルβ4サブユニットをコードする遺伝子について、アミノ酸変化を伴う変異の有無を少なくとも検出することを特徴とする請求項１または２に記載の急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定データの取得方法。
【請求項４】
急性脳炎または急性脳症の罹患リスクを判定するための急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キットであって、
（ａ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部を増幅できるように設計されたプライマー、
（ｂ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型のエキソン、エキソンとイントロンとの境界領域、もしくはｍＲＮＡ、またはそれらの一部のみを特異的に検出できるように設計されたプローブ、および
（ｃ）カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子の特定の遺伝子型の翻訳産物であるポリペプチドまたはその一部のみに特異的に結合する抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の罹患リスク判定キット。
【請求項５】
急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞であって、
カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を有することを特徴とする細胞。
【請求項６】
急性脳炎または急性脳症の治療薬剤をスクリーニングするための細胞の製造方法であって、
カルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群に含まれる少なくとも１つの遺伝子にアミノ酸変化を伴う変異を導入する工程を含むことを特徴とする細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞に、候補薬剤を投与し、
該細胞におけるカルシウムイオンチャネルの活性が変化したか否かを判定することを含むことを特徴とする急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記候補薬剤は、カルシウムイオンチャネルに対する阻害剤もしくは作動薬、またはカルシウムイオンチャネルのサブユニットをコードする遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子もしくはその核酸配列の一部からなるポリヌクレオチドを含む発現プラスミドベクターもしくはウイルスベクターであることを特徴とする請求項７に記載の急性脳炎または急性脳症の治療薬剤のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１１２２５１（Ｐ２００９−１１２２５１Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８８９７８（Ｐ２００７−２８８９７８）
【出願日】平成１９年１１月６日（２００７．１１．６）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月６日（２００７．１１．６）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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