成熟樹状細胞の生産方法
【課題】共通に単球を起源とするＤＣ１およびＤＣ２を効率よく生産する方法を提供すること、創薬標的となるＤＣ由来のＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子の同定方法を提供すること、また、該同定方法により同定された遺伝子を用いたＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導阻害剤の同定方法を提供すること。
細胞内の化合物量を簡便かつ精度良く測定できる方法を提供すること。
【解決手段】単球由来の未成熟ＤＣをリポポリサッカライドおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で培養することにより、共通に単球を由来とする、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性を有する細胞またはＴｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞を生産できることを見出した。さらには、得られた細胞の発現遺伝子解析を行い、それぞれの細胞において優位に発現している遺伝子を明らかにするとともに、該遺伝子を用いたＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子阻害剤の同定方法を確立した。
細胞内の化合物量を簡便かつ精度良く測定できる方法を提供すること。
【解決手段】単球由来の未成熟ＤＣをリポポリサッカライドおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で培養することにより、共通に単球を由来とする、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性を有する細胞またはＴｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞を生産できることを見出した。さらには、得られた細胞の発現遺伝子解析を行い、それぞれの細胞において優位に発現している遺伝子を明らかにするとともに、該遺伝子を用いたＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子阻害剤の同定方法を確立した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成熟樹状細胞を生産する方法に関する。より詳細には、単球を用いた、Ｔヘルパー１応答への偏向を誘導する活性を有する樹状細胞およびＴヘルパー２応答への偏向を誘導する活性を有する樹状細胞の生産方法に関する。さらには、前記樹状細胞を用いるＴヘルパー１またはＴヘルパー２応答への偏向誘導に関与する因子の同定方法、および該同定方法により同定された因子、また、該因子を阻害することを特徴とするＴヘルパー１またはＴヘルパー２応答偏向への誘導阻害剤の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる抗原受容体を発現する細胞として定義され、獲得免疫系において中心的な役割を果たす。Ｔ細胞は、主に、ヘルパーＴ細胞とキラーＴ細胞の２種類の機能集団に分類され、さらに、ヘルパーＴ細胞は、産生するサイトカインの種類によって、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞とＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の２種類の亜群に分類される。Ｔｈ１細胞はインターフェロンγを産生することを特徴として、主に細胞性免疫に関与し、Ｔｈ２細胞はインターロイキン（ＩＬ）−４を産生することを特徴として、主に液性免疫に関与する。
【０００３】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞は共通して、胸腺から移出したナイーブＴ細胞を起源とし、抗原提示細胞からの刺激により分化誘導される。このようなＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のそれぞれへの分化において重要な役割を果たす抗原提示細胞としては、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ：ＤＣ）が知られている。ＤＣは、リンパ系器官だけでなく生体内の種々の組織や器官に広く分布する最も強力な抗原提示細胞である。
【０００４】
ＤＣにはその分化経路の相違により、マクロファージなどの食細胞に近い細胞群であるミエロイド系と、Ｔ、Ｂ、ＮＫ細胞などリンパ球と同一の前駆細胞から分化してくるリンパ球系が存在することが知られている。従来、ミエロイド系ＤＣは種々の刺激により多量のＩＬ−１２を産生し、Ｔｈ１細胞を誘導することが知られてきた。これに対し、リンパ球系ＤＣはＩＬ−１２産生能が低いことが知られてきた。近年、Ｒｉｓｓｏａｎらは、リンパ球系細胞であるｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｃｅｌｌ由来のＤＣがＴｈ２細胞への分化誘導能を有することを明らかにし、ミエロイド系ＤＣをＴｈ１細胞を誘導するＤＣ亜群としてＤＣ１、リンパ球系ＤＣをＴｈ２細胞を誘導するＤＣ亜群としてＤＣ２と定義した（非特許文献１）。
【０００５】
しかし、単球由来樹状細胞においても、プロスタグランジンＥ２処理したものではＩＬ−１２の産生は抑制され、Ｔｈ２細胞を誘導することが示されており（非特許文献２）、また、Ｅｂｎｅｒらは、ＩＬ−３存在下で培養した単球からＤＣ２作用を有する細胞を誘導できることを報告した（非特許文献３）。これらの報告から、生体内におけるＤＣ亜群への分化は、細胞の起源のみに依存するのではなく、ＤＣが成熟化していく過程における環境も深く関与していると考えられるようになった。
【０００６】
前述のとおり、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞は共通してナイーブＴ細胞を起源としている。そのため、Ｔｈ１細胞あるいはＴｈ２細胞のいずれかが優位に誘導されてＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランスが崩れると、様々な病態が生じると考えられている。例えば、Ｔｈ１細胞優位の場合はリンパ球やマクロファージなど単核細胞中心の炎症反応が起こりやすいため、リウマチなどの自己免疫疾患が生じやすく、Ｔｈ２細胞優位の場合は、ＩｇＥの過剰産生によるアレルギー疾患が生じやすいと考えられている。
【０００７】
Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞をそれぞれ効果的に誘導する細胞は、前述の通り、それぞれＤＣ１とＤＣ２であると考えられているため、ＤＣ１とＤＣ２によるＴｈ１細胞あるいはＴｈ２細胞誘導のメカニズムを解明することは、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向に起因する病態の予防や治療に結びつくと考えられている。そのため、ＤＣ１またはＤＣ２由来の、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子を見出だす目的で、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子を比較する試みがこれまでにも行われてきた（非特許文献４）。しかし、多くが単球由来の成熟ＤＣとリンパ球系成熟ＤＣとの比較という形で行われたため、ミエロイド系とリンパ球系という系統差に由来すると考えられる遺伝子が発現相違遺伝子として見出だされるなどしてＤＣ由来のＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子、さらには、有用なＤＣ１およびＤＣ２の発現遺伝子プロファイルが得られるには到っていない。
【０００８】
【非特許文献１】Rissoan M-L et al. Science, 283, 1183-1186 (1999)
【非特許文献２】Kalinski P. et al. J. Immun., 159, 28-35 (1997)
【非特許文献３】Ebner S. et al. J. Immun., 168, 6199-6207 (2002)
【非特許文献４】Rissoan M-L et al. Blood, 100, 3295-3303 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、共通に単球を起源とするＤＣ１およびＤＣ２を効率よく生産する方法を提供するものである。さらには、創薬標的となるＤＣ由来のＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子の同定方法を提供するものである。また、該同定方法により同定された遺伝子を用いたＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導阻害剤の同定方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、単球由来の未成熟ＤＣをリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養することにより、共通に単球を由来とする、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性を有する細胞（以下、ＤＣ１作用を有する細胞と称することがある。）またはＴｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞（以下、ＤＣ２作用を有する細胞と称することがある。）を生産できることを見出した。さらには、得られたＤＣ１作用を有する細胞とＤＣ２作用を有する細胞の発現遺伝子の比較を行い、それぞれの細胞において優位に発現している遺伝子を明らかにするとともに、該遺伝子を用いたＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子阻害剤の同定方法を確立し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む単球由来の未成熟樹状細胞の成熟化方法に関する。
また、単球由来の未成熟樹状細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む成熟樹状細胞の生産方法に関する。
さらに、単球由来の未成熟樹状細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法に関する。
また、抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである上記方法に関する。
さらに、次の工程を含む成熟樹状細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
【００１２】
また、次の工程を含むインターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生能を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
さらに、次の工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向を誘導する活性を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、次の工程を含むＣＤ１ａ陽性細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
さらに、次の工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１ａおよびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
【００１３】
また、次の工程を含む、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）においてナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
さらに、次の工程を含むＤＣ１の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである上記方法に関する。
さらに、次の工程を含む成熟樹状細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、次の工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向を誘導する活性を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
【００１４】
さらに、次の工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、次の工程を含む、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）においてナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
さらに、次の工程を含むＤＣ２の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである上記方法に関する。
さらに、上記方法を用いて得られた細胞に関する。
また、上記細胞を用いることを特徴とするヘルパーＴ細胞の生産方法に関する。
さらに、ナイーブＴ細胞を、上記細胞の存在下で培養する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の生産方法に関する。
また、ナイーブＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含むインターフェロンγ産生能を有する細胞の生産方法に関する。
さらに、ナイーブＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞の生産方法に関する。
また、ナイーブＴ細胞を上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、ＩＬ−４産生能を有する細胞の生産方法に関する。
【００１５】
さらに、ナイーブＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の生産方法に関する。
また、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、インターフェロンγ産生能を有する細胞の生産方法に関する。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞の生産方法に関する。
また、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、ＩＬ−４産生能を有する細胞の生産方法に関する。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の生産方法に関する。
また、上記方法を用いることにより得られた細胞に関する。
さらに、次の工程を含む、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子を比較する方法に関する。（１）単球を得る工程、（２）（１）で得られた単球を２つの細胞群に分け、一方の細胞群をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で、他方の細胞群をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、（３）（２）で得られた２つの細胞群それぞれを、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程、（４）（３）で得られた２つの細胞群のうち、（２）の工程でＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した細胞群をＤＣ１群とし、ＩＬ−３存在下で培養した細胞群をＤＣ２群とする工程、（５）（４）で得られたＤＣ１群とＤＣ２群の発現遺伝子を差異解析により比較する工程。
また、差異解析がサブトラクション法、ＤＮＡチップを用いた解析法または蛋白質二次元電気泳動法である上記方法に関する。
また、上記方法を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向誘導因子の同定方法に関する。
【００１６】
さらに、被検者から得られた試料における次の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向の診断方法に関する。ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １。
また、被検者から得られた試料における次の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向の診断方法に関する。ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、ｓｔａｂｉｌｉｎ １、ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＲＡＢ７Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ｃａｓｐａｓｅ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４。
さらに、次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物を選択する工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向誘導阻害剤の同定方法に関する。ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １。
【００１７】
また、次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能促進作用を有する化合物を選択する工程を含むＤＣ移植免疫療法の効果増強剤の同定方法に関する。ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １。
さらに、次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物を選択する工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向誘導阻害剤の同定方法に関する。ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、ｓｔａｂｉｌｉｎ １、ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＲＡＢ７Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ｃａｓｐａｓｅ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４。
【発明の効果】
【００１８】
本発明を用いることにより、創薬標的となるＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子を同定することができる。さらには、同定された遺伝子を用いることにより、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導の阻害剤、ひいては、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向に起因する疾患の治療剤および／または予防剤の同定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は単球由来の未成熟樹状細胞の成熟化方法に関する。また、単球を起源とする成熟樹状細胞の生産方法に関する。
本発明の成熟化方法または成熟樹状細胞の生産方法においては、単球由来の未成熟樹状細胞をＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む。ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体以外の成分をさらに添加してもよいが、本発明では、通常の細胞培養に用いられる培地（例えば、牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等）中にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体の２成分を添加して、共存させて作用させることで、効率よくＤＣ１およびＤＣ２に成熟化させることができる。また、培地中に添加する牛胎児血清はエンドトキシン保証のものを用いるとよい。
【００２０】
本発明に用いる単球は、起源となる生物種を問わず、また、いかなる手段によって得られたものでもよいが、密度勾配遠心分離法を利用して動物の末梢血から採取する方法が一般に用いられる。例えば、まず、単球を得ようとする動物に対してヘパリンコートしたシリンジ等を用いて採血を行い、末梢血を得る。次に、密度勾配遠心分離法により、単核球細胞を得る。密度勾配遠心分離法には、例えば、市販のフィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）などの密度勾配遠心用媒体を用いると良い。さらに血球分離用に調製が施されたＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）、Ｍｏｎｏ−ｐｏｌｙ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）などを利用してもよい。密度勾配遠心分離法における媒体の量、温度設定等は用いる媒体により、適宜、設定されるが、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ（登録商標）およびパーコールを用いる場合は、まず、得られた末梢血をＰＢＳ（−）で４〜５倍程度希釈し、遠心用チューブに予め入れておいたＦｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ液層に重層する。次に、４００×ｇで２０分程度遠心処理し、中間層を単核球細胞フラクションとして得る。さらにＰＢＳ（−）で数回洗浄後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などの培地中に該細胞を浮遊させる。次に、４６％パーコール溶液層に前記細胞浮遊液を重層する。４００×ｇで２０分程度遠心処理後、中間層を粗単球フラクションとして得る。該粗単球フラクションをＰＢＳで３回程度遠心洗浄することにより、単球を得ることができる。
【００２１】
単核球細胞フラクションからの単球の分離は、プラスティック付着法によっても行うことができる。プラスティック付着法は、例えば、まず通常の培養用のプラスティックフラスコにＦＢＳを注入し底面に十分いきわたらせた後、ＰＢＳ（−）で３回程度洗浄する。１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地などに浮遊させた単核球細胞フラクションを上記フラスコ内に注入し、３７℃で１時間程度培養する。上清を吸引後、培地により３回程度洗浄し、非付着細胞を除去する。さらに冷却した０．５％ＥＤＴＡ、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳを添加し４℃で３０分程度放置する。その後、ピペット等で付着細胞を回収することにより、単球を得ることができる。
【００２２】
さらに、別法としては、後述する実施例で示すように、抗ＣＤ１４ＭＡＣＳビーズ（登録商標：Ｍｉｌｔｅｎｕｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）を用いてＭａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｕｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）でＣＤ１４陽性細胞として単球を回収する方法も挙げられる。
【００２３】
本発明における「単球由来の未成熟樹状細胞」とは、単球由来であって、抗原提示細胞としてナイーブＴ細胞からヘルパーＴ細胞を有意に誘導し得る細胞へと分化する能力を持つ細胞を意味する。該細胞は、いかなる方法によって得られたものでもよく、由来等も問わないが、例えば、単球を、未成熟樹状細胞の分化に必要とされるサイトカイン存在下で培養することにより得ることができる。
ＤＣ１作用を有する細胞へ分化する活性を有する未成熟樹状細胞を生産する場合は、単球をＩＬ−４および顆粒球・マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養し、ＤＣ２作用を有する細胞へ分化する活性を有する未成熟樹状細胞を生産する場合は、単球をＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養するとよい（Ｅｂｎｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．，１６８，６１９９−６２０７（２００２））。用いるサイトカインは生体成分から分離されたものでも遺伝子工学的手法により生産したものでもよく、市販品を入手することもできる。また、本発明における各サイトカインには、そのサイトカインの作用を示し得る各サイトカインの変異体および部分構造をも含む。添加する各サイトカインの濃度は限定されることはなく、適宜設定すればよいが、最終濃度が１Ｕ／ｍｌ〜２０００Ｕ／ｍｌであることが好ましく、１００Ｕ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌ程度であることがより好ましい。各培養期間は、数時間から数週間程度が好ましく、より好ましくは数日間から数十日間であり、６〜９日間程度がさらに好ましい。培養に用いる培養液は、通常の細胞培養に用いる培地（例えば、牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等）を用いることが好ましい。
【００２４】
本発明では、単球由来の未成熟樹状細胞は、さらにＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程により成熟化され、成熟樹状細胞へと分化する。
成熟樹状細胞とは、ナイーブＴ細胞からヘルパーＴ細胞を誘導する活性を有する細胞である。さらに詳細には、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性またはＴｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞である。別の観点からは、ＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性の細胞である。また、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）において、ナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞である。
【００２５】
上記成熟樹状細胞のうちでも、Ｔｈ１応答への偏向を誘導することができる細胞は、ＩＬ−１２を有意に産生する細胞であり、また、表面抗原として、ＣＤ１ａを有意に発現する細胞である。また、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する樹状細胞として、ＤＣ１と定義されることもある。これに対し、上記Ｔｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞はＤＣ２と定義されることもある。ＤＣ２はＤＣ１に比べ、有意にＣＤ１ａの発現が低下している。
【００２６】
未成熟樹状細胞が成熟化したことは、表面抗原ＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現をフローサイトメトリー法等により調べることにより確認できる。また、ＢＤＣＡ４、ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃまたはＣＤ１４の発現が、成熟樹状細胞では、未成熟樹状細胞と比較して低下する傾向が見られる。さらに、ＩＬ−１２の分泌活性をＥＬＩＳＡ法などにより調べることにより、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性を有する成熟樹状細胞であることが確認できる。これらの確認試験に用いる抗体、蛍光標識抗体等は、ＢＤファーミンジェン社等から入手できる。
本発明において用いられるＬＰＳはシグマ社等から入手でき、Ｏ抗原の種類は特に限定されない。
本発明において用いられる抗ＣＤ４０抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、由来も問わない。用いる単球由来の生物種のＣＤ４０を認識する抗体を適宜選択すればよい。ヒト由来の単球を用いる場合は、好ましいものとして、Ｍａｂｔｅｃ社の抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体が挙げられる。また、抗ＣＤ４０抗体は、細胞培養液中に液体として加えてもよいが、細胞培養に供するプラスティックプレート等に予め固相化して作用させることがより好ましい。
【００２７】
ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下での未成熟樹状細胞の培養は、数時間から数週間程度でよいが、好ましくは数日間程度、２日間程度行うことがより好ましい。添加するＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体の量は、用いる試薬やロット等により適宜設定すればよいが、ＬＰＳは最終濃度が１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜２００ｎｇ／ｍｌ程度になるように、抗ＣＤ４０抗体は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌ程度になるように、添加するとよい。抗ＣＤ４０抗体は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌ程度の濃度で、予めプレートに添加して２４時間程度穏やかに振とうすることにより、固相化させることが好ましい。
【００２８】
上記のとおり、単球を用いて、ＤＣ１の場合は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で、ＤＣ２の場合は、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で、好ましくは６〜９日間程度培養した後に、ＬＰＳを含む培地に交換して抗ＣＤ４０抗体を固相化したプレートにてさらに培養を行うことにより、それぞれ、ＤＣ１作用を有する成熟樹状細胞またはＤＣ２作用を有する成熟樹状細胞を生産することができる。ＤＣ１およびＤＣ２それぞれへの分化は、後述するＴｈ１およびＴｈ２の誘導能を調べることにより確認できる。
【００２９】
本発明の上記方法により生産された、単球由来の、成熟樹状細胞、ＩＬ−１２産生能を有する細胞、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性を有する細胞、Ｔｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞、ＣＤ１ａ陽性細胞、ＤＣ１またはＤＣ２（以下、成熟樹状細胞と総称することもある。）を用いると、ヘルパーＴ細胞を生産することができる。具体的には、本発明の上記方法により生産された成熟樹状細胞の存在下で、ナイーブＴ細胞を培養することにより、ヘルパーＴ細胞を生産することができる。また、ナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導することができる。
【００３０】
ヘルパーＴ細胞の生産に用いるナイーブＴ細胞は、起源となる生物種を問わず、また、いかなる手段によって得られたものでもよいが、作用させる成熟樹状細胞と同一の生物種由来であることが好ましい。ナイーブＴ細胞は、一般に、胸腺から移出した抗原刺激を受けていないＴ細胞とされ、表面抗原は、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性である。
【００３１】
ナイーブＴ細胞は、例えば、末梢血からネガティブセレクションによって採取することができる。具体的には、上記の単球の採取時と同様にして、まず、末梢血から単核球細胞フラクションを得る。該単核球細胞フラクションに、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δおよびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡのそれぞれに対するビオチン化抗体を含むカクテル液を添加し反応させる。これらのビオチン化抗体はＭｉｌｔｅｎｕｉ Ｂｉｏｔｅｃ.社等から入手できる。次に、抗ビオチンミクロビーズ、抗ＣＤ４５ＲＯミクロビーズを添加、反応させ、Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを用いて、ネガティブフラクションを回収することにより、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を回収でき、ナイーブＴ細胞として用いることができる。
【００３２】
本発明の方法により得た成熟樹状細胞とアロジェニックなナイーブＴ細胞との共培養は、共培養時の細胞混合比が、ナイーブＴ細胞数が成熟樹状細胞数の４００倍以下、好ましくは１００倍以下、より好ましくは２０倍以下、さらに好ましくは１０倍以下になるように調製して行うとよい。培養期間は１日間〜数ヶ月間、好ましくは1日間〜数週間、より好ましくは１〜１０日間程度で設定するとよい。
【００３３】
ヘルパーＴ細胞への分化は上記共培養により得られたＴ細胞の分泌サイトカインまたは、産生サイトカインを調べることにより確認できる。一般的に、インターフェロンγを有意に産生するヘルパーＴ細胞をＴｈ１細胞、ＩＬ−４を有意に産生するヘルパーＴ細胞をＴｈ２細胞という。
【００３４】
ナイーブＴ細胞と共培養する成熟樹状細胞が、ＤＣ１作用を有する成熟樹状細胞である場合、インターフェロンγ産生能を有する細胞、すなわち、Ｔｈ１細胞を効果的に生産することができる。これに対して、ナイーブＴ細胞と培養する成熟樹状細胞がＤＣ２作用を有する成熟樹状細胞である場合、ＩＬ−４産生能を有する細胞、すなわち、Ｔｈ２細胞を効果的に生産することができる。
【００３５】
上記共培養により得られたＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞のインターフェロンγまたはＩＬ−４の産生は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体存在下で再活性化することにより誘導できることが知られている（Ｅｂｎｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．，１６８，６１９９−６２０７（２００２））。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞の培養液中に液体で添加してもよいが、予め培養に用いるプラスティックプレートに固相化して作用させることが好ましい。抗ＣＤ３抗体のみを固相化することがさらに好ましい。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、用いるＴ細胞の生物種に応じて、適宜選択すればよい。ＢＤファーミジェン社等から入手できる。添加する抗体の濃度は用いる抗体によって適宜設定すればよい。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体をＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞に作用させる期間は、特に限定されないが、数時間〜数十時間が好ましく、２０〜３０時間程度が特に好ましい。
【００３６】
再活性化されたＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞から分泌されるインターフェロンγまたはＩＬ−４は、ＥＬＩＳＡ法などによって定量すればよい。Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）システムを用いたＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン測定キット（ＢＤファーミジェン）を利用することもできる。
【００３７】
また、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞が産生するサイトカインを、細胞外へ分泌させないで細胞内にとどめ、フローサイトメトリーを利用して確認することもできる。上記共培養により得られたＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞をＰＭＡなどのホルボールエステルとイオノマイシンにより活性化処理した後、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡを添加し、分泌因子を細胞内に蓄積させる。その後、ホルマリン固定およびサポニンによる脱脂を行った後、抗インターフェロンγ抗体、抗ＩＬ−４抗体を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメトリーにより定量を行う。
【００３８】
本発明は別の観点からは、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子の比較方法に関する。該方法は、（１）単球を得る工程、（２）（１）で得られた単球を２つの細胞群に分け、一方の細胞群をＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で、他方の細胞群をＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養する工程、（３）（２）で得られた２つの細胞群それぞれを、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程、（４）（３）で得られた２つの細胞群のうち、（２）の工程でＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した細胞群をＤＣ１群とし、ＩＬ−３存在下で培養した細胞群をＤＣ２群とする工程を含む。
【００３９】
上述のように、ＤＣ１およびＤＣ２は、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答への偏向に深く関与していると考えられていることから、ＤＣ１およびＤＣ２における発現遺伝子を比較することは、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答への偏向誘導因子の同定を可能とし、ひいては、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答への偏向に基づく疾患の予防および／または治療につながるため有用である。
本発明の方法により生産されたＤＣ１およびＤＣ２は、共通に単球を起源としているので、該ＤＣ１とＤＣ２の発現遺伝子を比較することは、細胞の起源に基づく相違ではなく、ＤＣ１およびＤＣ２のそれぞれの機能を特徴づける発現遺伝子の相違を見出だすことが可能であると考えられ、非常に有用である。さらに、本発明では、単球から成熟ＤＣ１および成熟ＤＣ２を得る過程中に単球に作用させる物質としては、未成熟ＤＣ１および未成熟ＤＣ２を得る工程における、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３が相違するのみであるため、作用させる物質の副次的な作用も最小に抑えられると考えられ、ＤＣ１とＤＣ２の比較に適している。
【００４０】
ＤＣ１とＤＣ２の発現遺伝子の比較は、差異解析により行う。差異解析としては、サブトラクション法、ＤＮＡチップを用いた解析法、蛋白質二次元電気泳動法などが挙げられる。
【００４１】
ＤＣ１およびＤＣ２の発現遺伝子は通常用いられるＲＮＡの採取法により採取できる。以降の解析において、発現遺伝子は、ｍＲＮＡのままで用いてもｃＤＮＡ化して用いてもよい。ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は逆転写酵素等を用いた方法が適用できる。全ＲＮＡの採取には例えば、酸性グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法（ＡＧＰＣ法；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，ｐｐ１５６−１５９（１９８６））が適用でき、全ＲＮＡからのｍＲＮＡの採取にはオリゴｄＴカラム等を用いたｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡの精製等が挙げられる。ＲＮＡサンプルは複数回採取したものを混合して用いてもよい。採取ロットの品質を解析する目的では、いくつかの遺伝子の発現をモニターするとよい。例えば、ＤＣ１においてはＣＤ１ａ、ＤＣ２においてはＣＤ１２３などをモニター遺伝子として用い、これらの発現が同等であるサンプルを使用するとよい。
【００４２】
サブトラクション法では差し引かれる側の遺伝子群（テスター）と差し引く側の遺伝子群（ドライバー）の二組の遺伝子群を用いる。例えば、ＤＣ１において優位に発現する遺伝子を獲得するためには、テスターとしてＤＣ１から得られた遺伝子、ドライバーとしてＤＣ２から得られた遺伝子を用いたサブトラクションを行うとよい。ＤＣ２において優位に発現する遺伝子を獲得するためには、テスターとしてＤＣ２から得られた遺伝子、ドライバーとしてＤＣ１から得られた遺伝子を用いたサブトラクションを行うとよい。サブトラクション処理の方法としては、既知の各種手段を利用可能であり（特開平３−１１７４８８号）、好ましくはｃＤＮＡサブトラクション法が挙げられる。ｃＤＮＡサブトラクション法としては、ＲＤＡ法、ＰＣＲ−選択（ｓｅｌｅｃｔ）ｃＤＮＡサブトラクション法などが特に好ましい。
【００４３】
サブトラクション処理においては、サブトラクションの陽性対照として、テスター側に適当なＤＮＡフラグメントを加え、その濃縮を確認することにより、サブトラクション処理の効率を確認できる。また、ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現することが知られている遺伝子をプローブとして、サブトラクション前およびサブトラクション後のＰＣＲ産物についてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行うと、同様にサブトラクション処理の成否を確認できる。ＤＣ１で優位に発現している遺伝子としてはＣＤ１a、ＤＣ２で優位に発現している遺伝子としては、ＣＤ１２３が挙げられる。
【００４４】
サブトラクション処理後のＰＣＲ産物を適当なベクターへ挿入し、プラスミドライブラリーなどを作成する。ベクター挿入部分をＰＣＲにより増幅し、それらの遺伝子をメンブレンにドットブロットしたものを２セット作製する。このドットメンブレンに対して、テスターとしてＤＣ１由来遺伝子、ドライバーとしてＤＣ２由来遺伝子を用いたサブトラクション処理後のＰＣＲ産物（以下、サブトラクション処理を（テスター）−（ドライバー）の式で表す。）プローブと（ＤＣ２）−（ＤＣ１）のサブトラクション後のＰＣＲ産物プローブでそれぞれハイブリダイゼーションを実施する。例えば、（ＤＣ２）−（ＤＣ１）のサブトラクション後のＰＣＲ産物と比較して、（ＤＣ１）−（ＤＣ２）のサブトラクション後のＰＣＲ産物において特異的に濃縮が認められるクローンは、ＤＣ１で優位に発現する遺伝子として判断することができる。ＤＣ２で優位に発現する遺伝子を得るためには、上記のテスターにＤＣ２由来遺伝子、ドライバーにＤＣ１由来遺伝子を用いればよい。ベクター挿入部分は自体公知のＤＮＡシークエンス法によりその配列を決定することができる。
【００４５】
ＤＮＡチップを用いた解析では、ＤＣ１およびＤＣ２からＲＮＡを精製した後、用いるＤＮＡチップに適した方法によりそれぞれｃＤＮＡ化、ｃＲＮＡ化等を行う。差異解析が可能なＤＮＡチップとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ、アマシャムバイオサイエンス社のＣｏｄｅＬｉｎｋ、タカラバイオ社のＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅなどが挙げられる。それぞれのＤＮＡチップおよび解析ソフトを用いて、各細胞における発現遺伝子を測定後、両者の比較解析により、発現に差がある遺伝子を見出だすことができる。
【００４６】
蛋白質二次元電気泳動法では、ＤＣ１、ＤＣ２をそれぞれ可溶化液にてホモジナイズした後に、２−Ｄ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などにて二次元電気泳動に影響を与える不純物を除去後、膨潤液と混合し、その遠心上清をＢｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質を定量した後に、二次元電気泳動サンプルとすることができる。１次元目の等電点電気泳動、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、泳動後のゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）等で染色し、画像解析により各サンプル間のスポットパターンの比較解析を行うとよい。ＤＣ１とＤＣ２とで１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上の発現変動のあるスポットを切り出しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、もしくはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により蛋白質を同定すれば、発現相違因子を同定することができる。
【００４７】
本発明者は、本発明の、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子を比較する方法を用いて、実際に、ヒト由来ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現する遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導に関与する因子であると考えられる。
【００４８】
ＤＣ１において優位に発現する遺伝子としては、ａｎｎｅｘｉｎＡ８、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １ （ＰＡＫ１）、ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３およびｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １が得られた。
【００４９】
各遺伝子は表１に示されるアクセッション番号（＃）でＧｅｎＢａｎｋに登録されている遺伝子である。各遺伝子の配列や機能等に関する情報は該データベースから入手できる。
【００５０】
【表１】
【００５１】
ＤＣ２において優位に発現する遺伝子としては、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、ｓｔａｂｉｌｉｎ １、ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＲＡＢ７Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ｃａｓｐａｓｅ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４が得られた。
【００５２】
各遺伝子は表２および表３に示されるアクセッション番号（＃）でＧｅｎＢａｎｋに登録されている遺伝子である。各遺伝子の配列や機能等に関する情報は該データベースから入手できる。
【００５３】
【表２】
【００５４】
【表３】
【００５５】
ＤＣ２での発現上昇遺伝子として同定された遺伝子群の中でも、ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １に関しては本酵素阻害剤ならびにその産物であるＴＸＡ２のアンタゴニストの計３剤が喘息治療剤として既に国内上市・発売済であり、また、ＣＣＲ５阻害剤に関しては抗ＨＩＶ剤としてのほかに喘息治療剤として２社で前臨床開発中である。
一方、ＤＣ１での発現上昇遺伝子には、関節リウマチ患者（Ｔｈ１偏向病態）の自己抗原探索解析で見出されたｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ファミリー内他分子が同じく関節リウマチの自己抗原として見出されているａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、動脈硬化症（Ｔｈ１偏向病態）への関与が報告されているｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）などが含まれていた。また、動脈硬化危険因子のコレステロール合成系の２因子も含まれた。
これらの結果から、本研究戦略で抽出されたＤＣサブタイプ発現上昇遺伝子群は、実際に生体内で生じるＴｈ２偏向病態（アレルギー等）、Ｔｈ１偏向病態（リウマチ等）への関与因子を反映する遺伝子発現プロファイルとして有用である可能性が高いことが示唆された。
【００５６】
上記ＤＣ１において優位に発現する遺伝子は、Ｔｈ１応答への偏向誘導に関与する遺伝子と考えられるので、被験者から得られた試料における該遺伝子の発現量を測定することにより、被験者のＴｈ１応答への偏向を診断できる。診断は、上記ＤＣ１において優位に発現する遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することにより行う。本発明において、「遺伝子の発現量を測定する」とは、該遺伝子およびその断片、該遺伝子の転写物およびその断片、該遺伝子の産物である蛋白質およびその一部分の量を測定することを意味する。
診断に供される試料としては、血液、ずい液、脳生検サンプル等が好適であり、特に血液が好ましい。診断に用いる測定法は、自体公知の抗原抗体反応、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。
【００５７】
同様に、上記ＤＣ２において優位に発現する遺伝子は、Ｔｈ２応答への偏向誘導に関与する遺伝子と考えられるので、被験者から得られた試料における該遺伝子の発現量を測定することにより、被験者のＴｈ２応答への偏向を診断できる。
【００５８】
Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向を診断することは、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向に起因する疾患の診断、予防、治療等につながると考えられる。Ｔｈ１応答への偏向に起因する疾患としては、慢性関節リウマチ、膠原病等の自己免疫疾患ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が挙げられる。Ｔｈ２応答への偏向に起因する疾患としては、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症等のアレルギー疾患が挙げられる。また、逆に、Ｔｈ１を誘導することは、細胞性免疫の強化につながり、例えば、抗腫瘍ＤＣ免疫療法（ＤＣ移植免疫療法）の効果増強が期待できる。
【００５９】
一方で、上記のように、ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現する上記の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物は、それぞれ、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導の阻害剤となり得る。Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導の阻害剤は、ひいては、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向が関与する疾患の治療剤および／または予防剤になり得る。
本発明において、「遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物」とは、蛋白質そのものに何らかの作用をして機能を阻害する化合物のみならず、該蛋白質がコードする遺伝子に作用したり、遺伝子から蛋白質が発現してくる過程において何らか作用することにより蛋白質の発現を阻害等することによって該蛋白質の機能を阻害する化合物をも含む。
【００６０】
ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現する上記の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物の同定には、公知のいかなる手法を適用してもよい。阻害剤の同定には、ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現する上記の遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子、該遺伝子がコードする蛋白質、およびそれらの由来物、それらを認識する抗体、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体などを用いることができる。例えば、天然の上記遺伝子産物は一般的酵素精製手段により精製して得たり、あるいは、遺伝子工学的手法により生産したりなどして得ればよい。また、阻害剤の同定に供する上記遺伝子が、酵素をコードするものである場合は、該酵素と基質との酵素反応系を確立し、酵素反応を阻害する物質を阻害剤とすればよい。阻害剤の同定に供する上記遺伝子が、リガンドである場合は、該リガンドとそのレセプターとの結合試験系をセルフリー、または、細胞にレセプターを発現させた系などで確立し、結合阻害試験を行えばよい。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。フローサイトメトリーに用いた抗体を表４に示す。
【００６２】
【表４】
【００６３】
（実施例１）単球の調製
ヒト新鮮末梢血を、ヘパリン（ノボ・ノルディクス）コートしたシリンジで採血後穏やかに転倒混和した。Ｍｏｎｏ−Ｐｏｌｙ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（大日本製薬）を予め２０ｍｌ分注した５０ｍｌチューブ（イワキ）に新鮮末梢血２５ｍｌを重層し、遠心分離（８００×ｇ、２０分、室温）を行った。単核球細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）を回収し、ＰＢＳ（−）への再懸濁と遠心分離による細胞回収を繰り返して洗浄操作を実施し、その際に遠心回転数を徐々に下げることで血小板を除去した。検鏡により血小板が少なくなったことを確認し、単核球細胞（リンパ球、単球）を再度遠心回収し、末梢血１００ｍｌ由来分量に対しＭＡＣＳ洗浄用緩衝液５００μｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）を用いてＭａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）により、ＣＤ１４陽性細胞（単球）を回収した。方法は添付プロトコールに従った。フローサイトメーター（Ａｒｉａ；ＢＤ）にてＣＤ１４陽性率として単球純度が９５％以上であることを確認した。
【００６４】
（実施例２）樹状細胞への分化
得られた単球を６ウエルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に２×１０６ｃｅｌｌｓ／ウエル、１ウエルあたり３ｍｌの培養溶液（ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）に、１０％非働化エンドトキシン保証牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）とペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を加えて調製）となるように播種した。ＤＣ１サブタイプ分化誘導のためには、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）、ＤＣ２サブタイプ分化誘導のためには、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＬ−３（１００Ｕ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を添加し、７日間培養した。その際、２、４、６日目に培養溶液を交換した。
【００６５】
（実施例３）樹状細胞の成熟化操作
単球を上記の分化条件で７日間培養して得られた細胞を遠心回収（２８０×ｇ、１０分、４℃）し、分化培養１ウエルから派生した細胞が２ウエルに等分されるように６ウエルプレート播種した（１ウエルあたり３ｍｌ培養液）。成熟化方法の開発検討のため、次の６条件でＤＣの成熟化培養（３７℃、５％ＣＯ２、４８ｈ）後成績を比較した。ｉ）Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＭＣ）；ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）＋ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）＋ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）＋プロスタグランジンＥ２（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ｉｉ）ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ｉｉｉ）ＴＮＦ−α（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、ｉｖ）ＴＮＦ−α（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）＋ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、ｖ）プレート固相化抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ，ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ；Ｍａｂｔｅｃｈ）、ｖｉ）プレート固相化抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ，ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ；Ｍａｂｔｅｃｈ）＋ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）。ｉ）〜ｖｉ）の成熟化操作を加えずに２日間培養した細胞を未成熟ＤＣ、成熟化操作を施した細胞を成熟化ＤＣと称した。
【００６６】
（実施例４）樹状細胞培養上清サイトカインの定量
未成熟ＤＣに対する実施例３に示した成熟化操作２日後の培養上清をそれぞれ回収し、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ）を用いたＣＢＡ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄｓ Ａｒｒａｙ；ＢＤ）法にて分泌サイトカインを定量した。成熟化ＤＣの培養上清に含まれるＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１０分泌量を定量することにより、ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプそれぞれへの分化度合いを評価した。方法は添付プロトコールに従った。ｖｉ）ＬＰＳ＋固相化抗ＣＤ４０抗体により成熟化させた場合、ＧＭ−ＣＳＦ前処理ＤＣでＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ前処理ＤＣならびにＩＬ−３前処理ＤＣでＩＬ−１０の分泌が他の方法に比べてよく認められた（図１）。得られた成熟化ＤＣを光学顕微鏡下で観察したところ、成熟化ＤＣは、樹状突起を延ばし、単球と比較して細胞大も高まった。
【００６７】
（実施例５）ナイーブＴ細胞の精製
新鮮末梢血を実施例１に記した単球精製同様に処理し、単核球細胞を回収した。末梢血１００ｍｌ由来分量に対しＭＡＣＳ洗浄用緩衝液１ｍｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）を加えて懸濁し、ビオチン化抗体カクテル（ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δ、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａ抗体、抗ビオチンＭｉｃｒｏｂｅａｄｓ、ＣＤ４５ＲＯ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＭａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍにより、ネガティブフラクションを回収した。方法は添付プロトコールに従った。フローサイトメーター（Ａｒｉａ；ＢＤ）にてＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞）としての純度が９８％以上であることを確認した。
【００６８】
（実施例６）ＤＣとの共培養とＴ細胞分泌サイトカインの定量
得られたナイーブＴ細胞とアロジェニック成熟化ＤＣを２４ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）で細胞混合比４：１（１×１０６Ｔ細胞：０．２５×１０６ＤＣ）で６日間共培養した。
ＤＣと６日間共培養した後に、２４ウェルプレート固相化抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍｌでｏｖｅｒｎｉｇｈｔ固相化；ＢＤ、ｃａｔ．Ｎｏ．５５５３２９）ならびに抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ；ＢＤ、ｃａｔ．Ｎｏ．５５５７２５）存在下にて１×１０６Ｔ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再活性化（２２ｈ）し、その培養上清を回収し、Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｔ （ＢＤ）を用いたＣＢＡ法にて分泌サイトカインを定量した。方法は添付プロトコールに従った。
ヘルパーＴ細胞のＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）の分泌量を指標とし、Ｔｈ１／Ｔｈ２への分化度合いを比較解析評価した。その結果、ＩＦＮ−γ分泌量では、ｉ）〜ｖｉ）のほぼ全ての成熟化法において、ＤＣ２サブタイプに比し、ＤＣ１サブタイプによるＴｈ１への有意な誘導傾向が認められた。その中でも、ｖ）抗ＣＤ４０抗体、および、ｖｉ）ＬＰＳ＋抗ＣＤ４０抗体の２方法が特に効果的なＴｈ１への誘導を示した。一方、ＩＬ−４分泌量に関しては、ｉｉ）ＬＰＳにおいてもＤＣ１サブタイプに比し、ＤＣ２サブタイプによるＴｈ２への誘導が認められるものの、ｖｉ）ＬＰＳ＋抗ＣＤ４０抗体が最も効果的なＴｈ２誘導を示した。ｖ）抗ＣＤ４０抗体は、ＩＬ−４分泌量は高いものの、ＤＣ１に比べたＤＣ２サブタイプによるＴｈ２への効果的誘導傾向は認められなかった。以上の結果より、ｖｉ）ＬＰＳ＋抗ＣＤ４０抗体の成熟化方法により、最も有効にＴｈ１／Ｔｈ２それぞれを誘導するＤＣ１／ＤＣ２サブタイプが得られることが明らかになった（図２）。
【００６９】
細胞の形態変化を合わせて、光学顕微鏡を用いて観察した。成熟化ＤＣとの共培養により、ナイーブＴ細胞は細胞大を高め、ＤＣを中心とするクラスターを構成しながら増殖した。
【００７０】
（実施例７）多数検体を用いたＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ分化・成熟化方法の確認
実施例６で見出だされたＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ分化・成熟化方法の有効性と再現性を確認するため、ＬＰＳ存在下での抗ＣＤ４０抗体による成熟化方法で得られるＤＣ１／ＤＣ２サブタイプのフェノタイプに関して、成熟化ＤＣ分泌サイトカイン、ならびに成熟化ＤＣとの共培養で得られるヘルパーＴ細胞が分泌するサイトカインを指標とし、試験検体数（採血ドナー数）を増やして解析した。 ＤＣ分泌サイトカインでは、ＩＬ−１２ｐ７０については１１全ドナーのＤＣ１サブタイプがＤＣ２サブタイプに比べて優位に分泌し、ＩＬ−１０に関しては両サブタイプで同等に分泌されるという傾向が再現された（図３）。一方、成熟化ＤＣと共培養して得られるヘルパーＴ細胞の分泌サイトカインに関しても、再現性良く、ＤＣ１サブタイプと共培養したナイーブＴ細胞がＩＦＮ−γを優位に分泌するＴｈ１へ、対して、ＤＣ２サブタイプと共培養したナイーブＴ細胞はＩＬ−４を優位に分泌するＴｈ２へ効果的に誘導されていることが示された（図４）。ＴＮＦ−αとＩＬ−２（いずれもＴｈ１サイトカインとされている）に関してはＤＣ１サブタイプと共培養して得られるヘルパーＴ細胞で優位に、対してＩＬ−５（Ｔｈ２サイトカイン）とＩＬ−１０（Ｔｈ２サイトカインとされている）に関してはＤＣ２と共培養して得られるヘルパーＴ細胞で優位に分泌されることが明らかとなった。これらの結果からも、本研究で開発したＤＣ１／ＤＣ２サブタイプがＴｈ１／Ｔｈ２のそれぞれを効果的に誘導していることが支持された。
【００７１】
（実施例８）Ｔ細胞産生サイトカインの細胞内染色定量
ＤＣと６日間共培養したＴ細胞をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）とＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）により２時間活性化処理した後、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、分泌因子を細胞内に６時間蓄積処理した。細胞を遠心回収後、１．９％ Ｆｏｒｍａｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）固定（１０分、室温）、１％Ｓａｐｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ）脱脂（１０分、室温）を行い、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＩＬ−４抗体にて細胞内染色を実施し、フローサイトメトリーにて解析した。
ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプのそれぞれと共培養することで分化誘導されたヘルパーＴ細胞プレパレ−ションをドナー毎に比較すると、ＤＣ１サブタイプとの共培養ではＤＣ２サブタイプとの共培養で得られるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）プレパレ−ションに比較して、Ｔｈ１含有率（Ｔｈ１への分化誘導率）が高く、Ｔｈ２含有率（Ｔｈ２への分化誘導率）が低かった。逆に、ＤＣ２サブタイプとの共培養ではＤＣ１サブタイプとの共培養で得られるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）プレパレ―ションに比較して、Ｔｈ１含有率が低く、Ｔｈ２含有率が高いという傾向が認められた（図５）。このことはＤＣ１／ＤＣ２サブタイプがＴｈ１／Ｔｈ２それぞれへの分化を効果的に誘導していることを示している。
【００７２】
（実施例９）リンパ球混合反応（ＭＬＲ：Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ナイーブＴ細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、９６ウエルプレート：ＢＤファルコン）とＤＣ（３０Ｇｙ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）を細胞数比１：６、１：２４、１：９６、１：３８４（ＤＣ：ナイーブＴ細胞）となるように加え、６日間共培養した。培養終了の１６時間前に最終濃度が１μＣｉになるように［３Ｈ］ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（２８０ＧＢｑ／ｍｍｏｌ＝６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、グラスフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に細胞を付着させ３７℃で一晩風乾した。液体シンチレーション（Ａｑａｚｏｌ２；ＤｕＰｏｎｔ）にて細胞を溶解した後、増殖したＴ細胞数を［３Ｈ］Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込み量としてシンチレーションカウンター（トップカウント）で測定した。
【００７３】
ＤＣ１／ＤＣ２両サブタイプとも成熟化ＤＣの混合比に依存したナイーブＴ細胞に対する増殖能の誘導を同程度に示した（図６）。このことは、作製した両ＤＣサブタイプ間ではナイーブＴ細胞に対する増殖誘導能には違いが無く、Ｔｈ１／Ｔｈ２のそれぞれを効果的に分化誘導する能力を有していることを示す。一方、未成熟ＤＣにおいては両サブタイプとも増殖誘導能が認められなかったことから、確立した成熟化方法が両ＤＣサブタイプ間での相違ない成熟化に有効に機能していることも明らかとなった。
【００７４】
（実施例１０）ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプからのｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出、ｐｏｌｙ Ａ （＋）ＲＮＡの精製、ｃＤＮＡサブトラクション、ディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニング、ならびにＲＴ−ＰＣＲによる発現変動遺伝子の同定
延べ２２ドナーから得た末梢血由来、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体による処理後２４時間のＤＣ１／ＤＣ２サブタイプよりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡをプ−ル（ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプそれぞれ２５０μｇ）し、その一部（５μｇ）を用いてＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）解析を実施した。残るｔｏｔａｌ ＲＮＡよりＯｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用い添付プロトコールに従いｐｏｌｙ Ａ（＋）ＲＮＡを精製（ＤＣ１：４．８μｇ、ＤＣ２：３．８μｇを取得）し、ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプそれぞれのｐｏｌｙ Ａ（＋）ＲＮＡ（８００ｎｇ）を出発材料に、（ＤＣ１−ＤＣ２）／（ＤＣ２−ＤＣ１）の双方向のｃＤＮＡサブトラクションを実施した。ｃＤＮＡサブトラクション効果の検証実験として、ＤＣ１またはＤＣ２サブタイプで優位に発現することを事前に明らかにしたＣＤ１ａならびにＣＤ１２３、また、両サブタイプで同等に発現しているハウスキーピング遺伝子としてＧ３ＰＤＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）遺伝子断片をプローブにサザンブロッティング解析した。ＣＤ１ａ、ＣＤ１２３プローブはＲＴ−ＰＣＲ法（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にてＤＣ由来ｐｏｌｙ Ａ（＋） ＲＮＡを鋳型に得たＰＣＲ産物を使用した。サブトラクティッドプラスミドライブラリーよりディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングにて選択された遺伝子の塩基配列を決定した。得られた塩基配列情報をもとにＢＬＡＳＴ解析を実施し、選択クローン中の重複クローンを除去した。ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ間での発現変動評価は、個々の遺伝子についてプライマーを設計し（シグマジェノシス製造）、ｃＤＮＡサブトラクションに供したｐｏｌｙ Ａ（＋）ＲＮＡが由来するｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法にて実施した。エチジウムブロマイド染色後の増幅遺伝子量をＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ（Ｂｉｏ Ｉｍａｇｅ）にて定量した。内部標準として、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子を用いてｃＤＮＡ化効率を標準化した。
【００７５】
ｃＤＮＡサブトラクション実施後、その効果の検証実験として、ＤＣ１サブタイプで優位に発現するＣＤ１ａならびにＤＣ２サブタイプで優位に発現するＣＤ１２３が、それぞれの方向のサブトラクション操作後ＰＣＲ産物において有意に濃縮されているか否か、また、両サブタイプで同等に発現しているハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）がサブトラクション操作により相殺されているか否かをサザンブロッティングにて解析した。その結果、濃縮並びに相殺効果が有意に認められ、ｃＤＮＡサブトラクションが系として機能していることが確認できた。以上から、発現変動遺伝子抽出作業を実施するに値する、ｃＤＮＡサブトラクティッドライブラリーの構築材料の獲得に成功したと判断した。
【００７６】
作製した（ＤＣ１−ＤＣ２）、（ＤＣ２−ＤＣ１）それぞれの方向のｃＤＮＡサブトラクティッドプラスミドライブラリーより（ＤＣ１−ＤＣ２）方向：７６８クローン、（ＤＣ２−ＤＣ１）方向：１１５２クローンをディファレンシャルハイブリダーゼーションに供し、（ＤＣ２−ＤＣ１）側で２４１クローン、（ＤＣ１−ＤＣ２）側で１６３クローンを選出した。これら発現変動候補遺伝子の塩基配列を決定し、重複遺伝子を除去した後に、次の解析優先順位を設けてＲＴ−ＰＣＲ法による発現変動遺伝子の同定を実施した。本研究において目的とするＤＣ由来のヘルパーＴ細胞分化制御因子としては、直接的にヘルパーＴ細胞に働きかける因子を想定していることから、クロマチン結合蛋白質、転写因子等の核内蛋白質、機能未知蛋白質については解析優先順位を下げ、逆に、細胞膜表面分子、分泌因子、免疫系シグナルカスケード関連因子の解析優先順位を上げた。（ＤＣ２−ＤＣ１）側で１１４クローン（ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析で有力な２１クローンも含む）、（ＤＣ１−ＤＣ２）側２７クローンをＲＴ−ＰＣＲ法にて解析し、ＤＣサブタイプ間で１．９倍以上の発現変動を示すものを発現変動遺伝子とした。（ＤＣ２−ＤＣ１）側で３２、（ＤＣ１−ＤＣ２）側で１１遺伝子を獲得した。
【００７７】
【表５】
【００７８】
【表６】
【００７９】
【表７】
【００８０】
（実施例１１）ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプの表面抗原発現解析
確立した分化・成熟化方法で得られるＤＣ１／ＤＣ２サブタイプの特性解析として、細胞表面抗原の発現解析をフローサイトメトリーにて解析した。
まず、ＤＣ成熟化マーカー分子であるＣＤ８６、ＣＤ８３、ＨＬ−ＤＲ、ＣＤ２５分子は、ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプに関らず、未成熟ＤＣに比べ成熟化ＤＣでの発現亢進が認められた（図７）。この結果は、確立したＤＣ調製方法が、両サブタイプ間で相違なく十分なＤＣ成熟化をもたらしていることを示す。一方、ＢＤＣＡ４、ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４については、未成熟ＤＣに比べ成熟化ＤＣでの発現低下が認められた（図８）。隣接リンパ節でＴ細胞と接触するために、ＤＣは抗原を取り込んだ後成熟化する際にはＴＬＲなどの抗原認識分子を内在化させることが明らかになっている。次に、この解析の主たる目的であるＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ間で発現に差異が認められた分子群については、ＤＣ１優位な分子としてＣＤ１ａとＢＤＣＡ１、ＤＣ２優位な分子としてはＨＬＡ−ＤＲが見出せた（図９）。ＣＤ１ａに関してはＥｂｎｅｒらの報告（Ｅｂｎｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．，１６８，６１９９−６２０７（２００２））と一致する。他の分子のＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ間での発現差異に関しては本研究で初めて見出されたものである。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図中ｉ）〜ｖｉ）の各刺激条件下で成熟化させたＤＣの分泌サイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−１０）量を示す図である。ＤＣ１は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後に図中ｉ）〜ｖｉ）に示す各条件下で成熟化させた細胞、ＤＣ２は、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後に図中ｉ）〜ｖｉ）に示す各条件下で成熟化させた細胞を示す。ＭＣはＭａｔｕｒａｒｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌを意味する。
【図２】図中ｉ）〜ｖｉ）の各刺激条件下で成熟化させたＤＣをナイーブＴ細胞と共培養することで分化誘導されるヘルパーＴ細胞のＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）の分泌量を示す図である。ＤＣ１―Ｔｈは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後に図中ｉ）〜ｖｉ）に示す各条件下で成熟化させた細胞と共培養して得られたヘルパーＴ細胞、ＤＣ２―Ｔｈは、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後に図中ｉ）〜ｖｉ）に示す各条件下で成熟化させた細胞と共培養して得られたヘルパーＴ細胞を示す。ＭＣはＭａｔｕｒａｒｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌを意味する。
【図３】多数検体を用いて、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体で成熟化させた際のＤＣの分泌サイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−１０）量を測定した結果を示す図である。ＤＣ１は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後に、ＤＣ２は、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体刺激で成熟化させた細胞を示す。
【図４】多数検体を用いて、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体で成熟化させたＤＣをナイーブＴ細胞と共培養することで分化誘導されるヘルパーＴ細胞のＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）の分泌量測定した結果を示す図である。ＤＣ１−Ｔｈは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体で成熟化させた細胞と共培養して得られたヘルパーＴ細胞、ＤＣ２−Ｔｈは、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体で成熟化させた細胞と共培養して得られたヘルパーＴ細胞を示す。
【図５】成熟化ＤＣによって誘導されたヘルパーＴ細胞のうちの、Ｔｈ１／Ｔｈ２比率を、ヘルパーＴ細胞が産生するＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を細胞内で染色、定量解析することで算出した図である。図中の丸で囲まれた数値は、Ｔ細胞全体に占めるＴｈ１、Ｔｈ２それぞれの含有率を示す。
【図６】未成熟および成熟ＤＣの、ナイーブＴ細胞に対する増殖能の誘導をリンパ球混合反応（ＭＬＲ）により測定した結果を示す図である。
【図７】未成熟および成熟ＤＣの表面抗原ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ２５の発現量をＤＣ１（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）およびＤＣ２（ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）で比較した図である。
【図８】未成熟および成熟ＤＣの表面抗原ＢＤＣＡ４、ＴＬＲ−２、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１４の発現量をＤＣ１（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）およびＤＣ２（ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）で比較した図である。
【図９】未成熟および成熟ＤＣの表面抗原ＣＤ１ａ、ＢＤＣＡ１およびＨＬＡ−ＤＲの発現量をＤＣ１（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）およびＤＣ２（ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）で比較した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成熟樹状細胞を生産する方法に関する。より詳細には、単球を用いた、Ｔヘルパー１応答への偏向を誘導する活性を有する樹状細胞およびＴヘルパー２応答への偏向を誘導する活性を有する樹状細胞の生産方法に関する。さらには、前記樹状細胞を用いるＴヘルパー１またはＴヘルパー２応答への偏向誘導に関与する因子の同定方法、および該同定方法により同定された因子、また、該因子を阻害することを特徴とするＴヘルパー１またはＴヘルパー２応答偏向への誘導阻害剤の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる抗原受容体を発現する細胞として定義され、獲得免疫系において中心的な役割を果たす。Ｔ細胞は、主に、ヘルパーＴ細胞とキラーＴ細胞の２種類の機能集団に分類され、さらに、ヘルパーＴ細胞は、産生するサイトカインの種類によって、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞とＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の２種類の亜群に分類される。Ｔｈ１細胞はインターフェロンγを産生することを特徴として、主に細胞性免疫に関与し、Ｔｈ２細胞はインターロイキン（ＩＬ）−４を産生することを特徴として、主に液性免疫に関与する。
【０００３】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞は共通して、胸腺から移出したナイーブＴ細胞を起源とし、抗原提示細胞からの刺激により分化誘導される。このようなＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のそれぞれへの分化において重要な役割を果たす抗原提示細胞としては、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ：ＤＣ）が知られている。ＤＣは、リンパ系器官だけでなく生体内の種々の組織や器官に広く分布する最も強力な抗原提示細胞である。
【０００４】
ＤＣにはその分化経路の相違により、マクロファージなどの食細胞に近い細胞群であるミエロイド系と、Ｔ、Ｂ、ＮＫ細胞などリンパ球と同一の前駆細胞から分化してくるリンパ球系が存在することが知られている。従来、ミエロイド系ＤＣは種々の刺激により多量のＩＬ−１２を産生し、Ｔｈ１細胞を誘導することが知られてきた。これに対し、リンパ球系ＤＣはＩＬ−１２産生能が低いことが知られてきた。近年、Ｒｉｓｓｏａｎらは、リンパ球系細胞であるｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｃｅｌｌ由来のＤＣがＴｈ２細胞への分化誘導能を有することを明らかにし、ミエロイド系ＤＣをＴｈ１細胞を誘導するＤＣ亜群としてＤＣ１、リンパ球系ＤＣをＴｈ２細胞を誘導するＤＣ亜群としてＤＣ２と定義した（非特許文献１）。
【０００５】
しかし、単球由来樹状細胞においても、プロスタグランジンＥ２処理したものではＩＬ−１２の産生は抑制され、Ｔｈ２細胞を誘導することが示されており（非特許文献２）、また、Ｅｂｎｅｒらは、ＩＬ−３存在下で培養した単球からＤＣ２作用を有する細胞を誘導できることを報告した（非特許文献３）。これらの報告から、生体内におけるＤＣ亜群への分化は、細胞の起源のみに依存するのではなく、ＤＣが成熟化していく過程における環境も深く関与していると考えられるようになった。
【０００６】
前述のとおり、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞は共通してナイーブＴ細胞を起源としている。そのため、Ｔｈ１細胞あるいはＴｈ２細胞のいずれかが優位に誘導されてＴｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランスが崩れると、様々な病態が生じると考えられている。例えば、Ｔｈ１細胞優位の場合はリンパ球やマクロファージなど単核細胞中心の炎症反応が起こりやすいため、リウマチなどの自己免疫疾患が生じやすく、Ｔｈ２細胞優位の場合は、ＩｇＥの過剰産生によるアレルギー疾患が生じやすいと考えられている。
【０００７】
Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞をそれぞれ効果的に誘導する細胞は、前述の通り、それぞれＤＣ１とＤＣ２であると考えられているため、ＤＣ１とＤＣ２によるＴｈ１細胞あるいはＴｈ２細胞誘導のメカニズムを解明することは、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向に起因する病態の予防や治療に結びつくと考えられている。そのため、ＤＣ１またはＤＣ２由来の、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子を見出だす目的で、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子を比較する試みがこれまでにも行われてきた（非特許文献４）。しかし、多くが単球由来の成熟ＤＣとリンパ球系成熟ＤＣとの比較という形で行われたため、ミエロイド系とリンパ球系という系統差に由来すると考えられる遺伝子が発現相違遺伝子として見出だされるなどしてＤＣ由来のＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子、さらには、有用なＤＣ１およびＤＣ２の発現遺伝子プロファイルが得られるには到っていない。
【０００８】
【非特許文献１】Rissoan M-L et al. Science, 283, 1183-1186 (1999)
【非特許文献２】Kalinski P. et al. J. Immun., 159, 28-35 (1997)
【非特許文献３】Ebner S. et al. J. Immun., 168, 6199-6207 (2002)
【非特許文献４】Rissoan M-L et al. Blood, 100, 3295-3303 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、共通に単球を起源とするＤＣ１およびＤＣ２を効率よく生産する方法を提供するものである。さらには、創薬標的となるＤＣ由来のＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子の同定方法を提供するものである。また、該同定方法により同定された遺伝子を用いたＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導阻害剤の同定方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、単球由来の未成熟ＤＣをリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養することにより、共通に単球を由来とする、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性を有する細胞（以下、ＤＣ１作用を有する細胞と称することがある。）またはＴｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞（以下、ＤＣ２作用を有する細胞と称することがある。）を生産できることを見出した。さらには、得られたＤＣ１作用を有する細胞とＤＣ２作用を有する細胞の発現遺伝子の比較を行い、それぞれの細胞において優位に発現している遺伝子を明らかにするとともに、該遺伝子を用いたＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子阻害剤の同定方法を確立し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む単球由来の未成熟樹状細胞の成熟化方法に関する。
また、単球由来の未成熟樹状細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む成熟樹状細胞の生産方法に関する。
さらに、単球由来の未成熟樹状細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法に関する。
また、抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである上記方法に関する。
さらに、次の工程を含む成熟樹状細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
【００１２】
また、次の工程を含むインターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生能を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
さらに、次の工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向を誘導する活性を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、次の工程を含むＣＤ１ａ陽性細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
さらに、次の工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１ａおよびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
【００１３】
また、次の工程を含む、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）においてナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
さらに、次の工程を含むＤＣ１の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程、
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである上記方法に関する。
さらに、次の工程を含む成熟樹状細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、次の工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向を誘導する活性を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
【００１４】
さらに、次の工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、次の工程を含む、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）においてナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
さらに、次の工程を含むＤＣ２の生産方法に関する。１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程。
また、抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである上記方法に関する。
さらに、上記方法を用いて得られた細胞に関する。
また、上記細胞を用いることを特徴とするヘルパーＴ細胞の生産方法に関する。
さらに、ナイーブＴ細胞を、上記細胞の存在下で培養する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の生産方法に関する。
また、ナイーブＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含むインターフェロンγ産生能を有する細胞の生産方法に関する。
さらに、ナイーブＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞の生産方法に関する。
また、ナイーブＴ細胞を上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、ＩＬ−４産生能を有する細胞の生産方法に関する。
【００１５】
さらに、ナイーブＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の生産方法に関する。
また、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、インターフェロンγ産生能を有する細胞の生産方法に関する。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞の生産方法に関する。
また、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、ＩＬ−４産生能を有する細胞の生産方法に関する。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、上記方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の生産方法に関する。
また、上記方法を用いることにより得られた細胞に関する。
さらに、次の工程を含む、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子を比較する方法に関する。（１）単球を得る工程、（２）（１）で得られた単球を２つの細胞群に分け、一方の細胞群をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で、他方の細胞群をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程、（３）（２）で得られた２つの細胞群それぞれを、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程、（４）（３）で得られた２つの細胞群のうち、（２）の工程でＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した細胞群をＤＣ１群とし、ＩＬ−３存在下で培養した細胞群をＤＣ２群とする工程、（５）（４）で得られたＤＣ１群とＤＣ２群の発現遺伝子を差異解析により比較する工程。
また、差異解析がサブトラクション法、ＤＮＡチップを用いた解析法または蛋白質二次元電気泳動法である上記方法に関する。
また、上記方法を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向誘導因子の同定方法に関する。
【００１６】
さらに、被検者から得られた試料における次の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向の診断方法に関する。ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １。
また、被検者から得られた試料における次の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向の診断方法に関する。ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、ｓｔａｂｉｌｉｎ １、ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＲＡＢ７Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ｃａｓｐａｓｅ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４。
さらに、次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物を選択する工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向誘導阻害剤の同定方法に関する。ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １。
【００１７】
また、次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能促進作用を有する化合物を選択する工程を含むＤＣ移植免疫療法の効果増強剤の同定方法に関する。ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １。
さらに、次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物を選択する工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向誘導阻害剤の同定方法に関する。ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、ｓｔａｂｉｌｉｎ １、ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＲＡＢ７Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ｃａｓｐａｓｅ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４。
【発明の効果】
【００１８】
本発明を用いることにより、創薬標的となるＴｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導因子を同定することができる。さらには、同定された遺伝子を用いることにより、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導の阻害剤、ひいては、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向に起因する疾患の治療剤および／または予防剤の同定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は単球由来の未成熟樹状細胞の成熟化方法に関する。また、単球を起源とする成熟樹状細胞の生産方法に関する。
本発明の成熟化方法または成熟樹状細胞の生産方法においては、単球由来の未成熟樹状細胞をＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む。ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体以外の成分をさらに添加してもよいが、本発明では、通常の細胞培養に用いられる培地（例えば、牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等）中にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体の２成分を添加して、共存させて作用させることで、効率よくＤＣ１およびＤＣ２に成熟化させることができる。また、培地中に添加する牛胎児血清はエンドトキシン保証のものを用いるとよい。
【００２０】
本発明に用いる単球は、起源となる生物種を問わず、また、いかなる手段によって得られたものでもよいが、密度勾配遠心分離法を利用して動物の末梢血から採取する方法が一般に用いられる。例えば、まず、単球を得ようとする動物に対してヘパリンコートしたシリンジ等を用いて採血を行い、末梢血を得る。次に、密度勾配遠心分離法により、単核球細胞を得る。密度勾配遠心分離法には、例えば、市販のフィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）などの密度勾配遠心用媒体を用いると良い。さらに血球分離用に調製が施されたＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）、Ｍｏｎｏ−ｐｏｌｙ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）などを利用してもよい。密度勾配遠心分離法における媒体の量、温度設定等は用いる媒体により、適宜、設定されるが、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ（登録商標）およびパーコールを用いる場合は、まず、得られた末梢血をＰＢＳ（−）で４〜５倍程度希釈し、遠心用チューブに予め入れておいたＦｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ液層に重層する。次に、４００×ｇで２０分程度遠心処理し、中間層を単核球細胞フラクションとして得る。さらにＰＢＳ（−）で数回洗浄後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などの培地中に該細胞を浮遊させる。次に、４６％パーコール溶液層に前記細胞浮遊液を重層する。４００×ｇで２０分程度遠心処理後、中間層を粗単球フラクションとして得る。該粗単球フラクションをＰＢＳで３回程度遠心洗浄することにより、単球を得ることができる。
【００２１】
単核球細胞フラクションからの単球の分離は、プラスティック付着法によっても行うことができる。プラスティック付着法は、例えば、まず通常の培養用のプラスティックフラスコにＦＢＳを注入し底面に十分いきわたらせた後、ＰＢＳ（−）で３回程度洗浄する。１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地などに浮遊させた単核球細胞フラクションを上記フラスコ内に注入し、３７℃で１時間程度培養する。上清を吸引後、培地により３回程度洗浄し、非付着細胞を除去する。さらに冷却した０．５％ＥＤＴＡ、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳを添加し４℃で３０分程度放置する。その後、ピペット等で付着細胞を回収することにより、単球を得ることができる。
【００２２】
さらに、別法としては、後述する実施例で示すように、抗ＣＤ１４ＭＡＣＳビーズ（登録商標：Ｍｉｌｔｅｎｕｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）を用いてＭａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｕｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）でＣＤ１４陽性細胞として単球を回収する方法も挙げられる。
【００２３】
本発明における「単球由来の未成熟樹状細胞」とは、単球由来であって、抗原提示細胞としてナイーブＴ細胞からヘルパーＴ細胞を有意に誘導し得る細胞へと分化する能力を持つ細胞を意味する。該細胞は、いかなる方法によって得られたものでもよく、由来等も問わないが、例えば、単球を、未成熟樹状細胞の分化に必要とされるサイトカイン存在下で培養することにより得ることができる。
ＤＣ１作用を有する細胞へ分化する活性を有する未成熟樹状細胞を生産する場合は、単球をＩＬ−４および顆粒球・マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養し、ＤＣ２作用を有する細胞へ分化する活性を有する未成熟樹状細胞を生産する場合は、単球をＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養するとよい（Ｅｂｎｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．，１６８，６１９９−６２０７（２００２））。用いるサイトカインは生体成分から分離されたものでも遺伝子工学的手法により生産したものでもよく、市販品を入手することもできる。また、本発明における各サイトカインには、そのサイトカインの作用を示し得る各サイトカインの変異体および部分構造をも含む。添加する各サイトカインの濃度は限定されることはなく、適宜設定すればよいが、最終濃度が１Ｕ／ｍｌ〜２０００Ｕ／ｍｌであることが好ましく、１００Ｕ／ｍｌ〜１０００Ｕ／ｍｌ程度であることがより好ましい。各培養期間は、数時間から数週間程度が好ましく、より好ましくは数日間から数十日間であり、６〜９日間程度がさらに好ましい。培養に用いる培養液は、通常の細胞培養に用いる培地（例えば、牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等）を用いることが好ましい。
【００２４】
本発明では、単球由来の未成熟樹状細胞は、さらにＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程により成熟化され、成熟樹状細胞へと分化する。
成熟樹状細胞とは、ナイーブＴ細胞からヘルパーＴ細胞を誘導する活性を有する細胞である。さらに詳細には、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性またはＴｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞である。別の観点からは、ＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性の細胞である。また、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）において、ナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞である。
【００２５】
上記成熟樹状細胞のうちでも、Ｔｈ１応答への偏向を誘導することができる細胞は、ＩＬ−１２を有意に産生する細胞であり、また、表面抗原として、ＣＤ１ａを有意に発現する細胞である。また、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する樹状細胞として、ＤＣ１と定義されることもある。これに対し、上記Ｔｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞はＤＣ２と定義されることもある。ＤＣ２はＤＣ１に比べ、有意にＣＤ１ａの発現が低下している。
【００２６】
未成熟樹状細胞が成熟化したことは、表面抗原ＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現をフローサイトメトリー法等により調べることにより確認できる。また、ＢＤＣＡ４、ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃまたはＣＤ１４の発現が、成熟樹状細胞では、未成熟樹状細胞と比較して低下する傾向が見られる。さらに、ＩＬ−１２の分泌活性をＥＬＩＳＡ法などにより調べることにより、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性を有する成熟樹状細胞であることが確認できる。これらの確認試験に用いる抗体、蛍光標識抗体等は、ＢＤファーミンジェン社等から入手できる。
本発明において用いられるＬＰＳはシグマ社等から入手でき、Ｏ抗原の種類は特に限定されない。
本発明において用いられる抗ＣＤ４０抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、由来も問わない。用いる単球由来の生物種のＣＤ４０を認識する抗体を適宜選択すればよい。ヒト由来の単球を用いる場合は、好ましいものとして、Ｍａｂｔｅｃ社の抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体が挙げられる。また、抗ＣＤ４０抗体は、細胞培養液中に液体として加えてもよいが、細胞培養に供するプラスティックプレート等に予め固相化して作用させることがより好ましい。
【００２７】
ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下での未成熟樹状細胞の培養は、数時間から数週間程度でよいが、好ましくは数日間程度、２日間程度行うことがより好ましい。添加するＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体の量は、用いる試薬やロット等により適宜設定すればよいが、ＬＰＳは最終濃度が１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜２００ｎｇ／ｍｌ程度になるように、抗ＣＤ４０抗体は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌ程度になるように、添加するとよい。抗ＣＤ４０抗体は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌ程度の濃度で、予めプレートに添加して２４時間程度穏やかに振とうすることにより、固相化させることが好ましい。
【００２８】
上記のとおり、単球を用いて、ＤＣ１の場合は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で、ＤＣ２の場合は、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で、好ましくは６〜９日間程度培養した後に、ＬＰＳを含む培地に交換して抗ＣＤ４０抗体を固相化したプレートにてさらに培養を行うことにより、それぞれ、ＤＣ１作用を有する成熟樹状細胞またはＤＣ２作用を有する成熟樹状細胞を生産することができる。ＤＣ１およびＤＣ２それぞれへの分化は、後述するＴｈ１およびＴｈ２の誘導能を調べることにより確認できる。
【００２９】
本発明の上記方法により生産された、単球由来の、成熟樹状細胞、ＩＬ−１２産生能を有する細胞、Ｔｈ１応答への偏向を誘導する活性を有する細胞、Ｔｈ２応答への偏向を誘導する活性を有する細胞、ＣＤ１ａ陽性細胞、ＤＣ１またはＤＣ２（以下、成熟樹状細胞と総称することもある。）を用いると、ヘルパーＴ細胞を生産することができる。具体的には、本発明の上記方法により生産された成熟樹状細胞の存在下で、ナイーブＴ細胞を培養することにより、ヘルパーＴ細胞を生産することができる。また、ナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導することができる。
【００３０】
ヘルパーＴ細胞の生産に用いるナイーブＴ細胞は、起源となる生物種を問わず、また、いかなる手段によって得られたものでもよいが、作用させる成熟樹状細胞と同一の生物種由来であることが好ましい。ナイーブＴ細胞は、一般に、胸腺から移出した抗原刺激を受けていないＴ細胞とされ、表面抗原は、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性である。
【００３１】
ナイーブＴ細胞は、例えば、末梢血からネガティブセレクションによって採取することができる。具体的には、上記の単球の採取時と同様にして、まず、末梢血から単核球細胞フラクションを得る。該単核球細胞フラクションに、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δおよびＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡのそれぞれに対するビオチン化抗体を含むカクテル液を添加し反応させる。これらのビオチン化抗体はＭｉｌｔｅｎｕｉ Ｂｉｏｔｅｃ.社等から入手できる。次に、抗ビオチンミクロビーズ、抗ＣＤ４５ＲＯミクロビーズを添加、反応させ、Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを用いて、ネガティブフラクションを回収することにより、ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を回収でき、ナイーブＴ細胞として用いることができる。
【００３２】
本発明の方法により得た成熟樹状細胞とアロジェニックなナイーブＴ細胞との共培養は、共培養時の細胞混合比が、ナイーブＴ細胞数が成熟樹状細胞数の４００倍以下、好ましくは１００倍以下、より好ましくは２０倍以下、さらに好ましくは１０倍以下になるように調製して行うとよい。培養期間は１日間〜数ヶ月間、好ましくは1日間〜数週間、より好ましくは１〜１０日間程度で設定するとよい。
【００３３】
ヘルパーＴ細胞への分化は上記共培養により得られたＴ細胞の分泌サイトカインまたは、産生サイトカインを調べることにより確認できる。一般的に、インターフェロンγを有意に産生するヘルパーＴ細胞をＴｈ１細胞、ＩＬ−４を有意に産生するヘルパーＴ細胞をＴｈ２細胞という。
【００３４】
ナイーブＴ細胞と共培養する成熟樹状細胞が、ＤＣ１作用を有する成熟樹状細胞である場合、インターフェロンγ産生能を有する細胞、すなわち、Ｔｈ１細胞を効果的に生産することができる。これに対して、ナイーブＴ細胞と培養する成熟樹状細胞がＤＣ２作用を有する成熟樹状細胞である場合、ＩＬ−４産生能を有する細胞、すなわち、Ｔｈ２細胞を効果的に生産することができる。
【００３５】
上記共培養により得られたＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞のインターフェロンγまたはＩＬ−４の産生は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体存在下で再活性化することにより誘導できることが知られている（Ｅｂｎｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．，１６８，６１９９−６２０７（２００２））。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞の培養液中に液体で添加してもよいが、予め培養に用いるプラスティックプレートに固相化して作用させることが好ましい。抗ＣＤ３抗体のみを固相化することがさらに好ましい。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、用いるＴ細胞の生物種に応じて、適宜選択すればよい。ＢＤファーミジェン社等から入手できる。添加する抗体の濃度は用いる抗体によって適宜設定すればよい。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体をＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞に作用させる期間は、特に限定されないが、数時間〜数十時間が好ましく、２０〜３０時間程度が特に好ましい。
【００３６】
再活性化されたＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞から分泌されるインターフェロンγまたはＩＬ−４は、ＥＬＩＳＡ法などによって定量すればよい。Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）システムを用いたＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン測定キット（ＢＤファーミジェン）を利用することもできる。
【００３７】
また、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞が産生するサイトカインを、細胞外へ分泌させないで細胞内にとどめ、フローサイトメトリーを利用して確認することもできる。上記共培養により得られたＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞をＰＭＡなどのホルボールエステルとイオノマイシンにより活性化処理した後、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡを添加し、分泌因子を細胞内に蓄積させる。その後、ホルマリン固定およびサポニンによる脱脂を行った後、抗インターフェロンγ抗体、抗ＩＬ−４抗体を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメトリーにより定量を行う。
【００３８】
本発明は別の観点からは、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子の比較方法に関する。該方法は、（１）単球を得る工程、（２）（１）で得られた単球を２つの細胞群に分け、一方の細胞群をＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で、他方の細胞群をＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養する工程、（３）（２）で得られた２つの細胞群それぞれを、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程、（４）（３）で得られた２つの細胞群のうち、（２）の工程でＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した細胞群をＤＣ１群とし、ＩＬ−３存在下で培養した細胞群をＤＣ２群とする工程を含む。
【００３９】
上述のように、ＤＣ１およびＤＣ２は、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答への偏向に深く関与していると考えられていることから、ＤＣ１およびＤＣ２における発現遺伝子を比較することは、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答への偏向誘導因子の同定を可能とし、ひいては、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答への偏向に基づく疾患の予防および／または治療につながるため有用である。
本発明の方法により生産されたＤＣ１およびＤＣ２は、共通に単球を起源としているので、該ＤＣ１とＤＣ２の発現遺伝子を比較することは、細胞の起源に基づく相違ではなく、ＤＣ１およびＤＣ２のそれぞれの機能を特徴づける発現遺伝子の相違を見出だすことが可能であると考えられ、非常に有用である。さらに、本発明では、単球から成熟ＤＣ１および成熟ＤＣ２を得る過程中に単球に作用させる物質としては、未成熟ＤＣ１および未成熟ＤＣ２を得る工程における、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３が相違するのみであるため、作用させる物質の副次的な作用も最小に抑えられると考えられ、ＤＣ１とＤＣ２の比較に適している。
【００４０】
ＤＣ１とＤＣ２の発現遺伝子の比較は、差異解析により行う。差異解析としては、サブトラクション法、ＤＮＡチップを用いた解析法、蛋白質二次元電気泳動法などが挙げられる。
【００４１】
ＤＣ１およびＤＣ２の発現遺伝子は通常用いられるＲＮＡの採取法により採取できる。以降の解析において、発現遺伝子は、ｍＲＮＡのままで用いてもｃＤＮＡ化して用いてもよい。ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は逆転写酵素等を用いた方法が適用できる。全ＲＮＡの採取には例えば、酸性グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法（ＡＧＰＣ法；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，ｐｐ１５６−１５９（１９８６））が適用でき、全ＲＮＡからのｍＲＮＡの採取にはオリゴｄＴカラム等を用いたｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡの精製等が挙げられる。ＲＮＡサンプルは複数回採取したものを混合して用いてもよい。採取ロットの品質を解析する目的では、いくつかの遺伝子の発現をモニターするとよい。例えば、ＤＣ１においてはＣＤ１ａ、ＤＣ２においてはＣＤ１２３などをモニター遺伝子として用い、これらの発現が同等であるサンプルを使用するとよい。
【００４２】
サブトラクション法では差し引かれる側の遺伝子群（テスター）と差し引く側の遺伝子群（ドライバー）の二組の遺伝子群を用いる。例えば、ＤＣ１において優位に発現する遺伝子を獲得するためには、テスターとしてＤＣ１から得られた遺伝子、ドライバーとしてＤＣ２から得られた遺伝子を用いたサブトラクションを行うとよい。ＤＣ２において優位に発現する遺伝子を獲得するためには、テスターとしてＤＣ２から得られた遺伝子、ドライバーとしてＤＣ１から得られた遺伝子を用いたサブトラクションを行うとよい。サブトラクション処理の方法としては、既知の各種手段を利用可能であり（特開平３−１１７４８８号）、好ましくはｃＤＮＡサブトラクション法が挙げられる。ｃＤＮＡサブトラクション法としては、ＲＤＡ法、ＰＣＲ−選択（ｓｅｌｅｃｔ）ｃＤＮＡサブトラクション法などが特に好ましい。
【００４３】
サブトラクション処理においては、サブトラクションの陽性対照として、テスター側に適当なＤＮＡフラグメントを加え、その濃縮を確認することにより、サブトラクション処理の効率を確認できる。また、ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現することが知られている遺伝子をプローブとして、サブトラクション前およびサブトラクション後のＰＣＲ産物についてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行うと、同様にサブトラクション処理の成否を確認できる。ＤＣ１で優位に発現している遺伝子としてはＣＤ１a、ＤＣ２で優位に発現している遺伝子としては、ＣＤ１２３が挙げられる。
【００４４】
サブトラクション処理後のＰＣＲ産物を適当なベクターへ挿入し、プラスミドライブラリーなどを作成する。ベクター挿入部分をＰＣＲにより増幅し、それらの遺伝子をメンブレンにドットブロットしたものを２セット作製する。このドットメンブレンに対して、テスターとしてＤＣ１由来遺伝子、ドライバーとしてＤＣ２由来遺伝子を用いたサブトラクション処理後のＰＣＲ産物（以下、サブトラクション処理を（テスター）−（ドライバー）の式で表す。）プローブと（ＤＣ２）−（ＤＣ１）のサブトラクション後のＰＣＲ産物プローブでそれぞれハイブリダイゼーションを実施する。例えば、（ＤＣ２）−（ＤＣ１）のサブトラクション後のＰＣＲ産物と比較して、（ＤＣ１）−（ＤＣ２）のサブトラクション後のＰＣＲ産物において特異的に濃縮が認められるクローンは、ＤＣ１で優位に発現する遺伝子として判断することができる。ＤＣ２で優位に発現する遺伝子を得るためには、上記のテスターにＤＣ２由来遺伝子、ドライバーにＤＣ１由来遺伝子を用いればよい。ベクター挿入部分は自体公知のＤＮＡシークエンス法によりその配列を決定することができる。
【００４５】
ＤＮＡチップを用いた解析では、ＤＣ１およびＤＣ２からＲＮＡを精製した後、用いるＤＮＡチップに適した方法によりそれぞれｃＤＮＡ化、ｃＲＮＡ化等を行う。差異解析が可能なＤＮＡチップとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ、アマシャムバイオサイエンス社のＣｏｄｅＬｉｎｋ、タカラバイオ社のＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅなどが挙げられる。それぞれのＤＮＡチップおよび解析ソフトを用いて、各細胞における発現遺伝子を測定後、両者の比較解析により、発現に差がある遺伝子を見出だすことができる。
【００４６】
蛋白質二次元電気泳動法では、ＤＣ１、ＤＣ２をそれぞれ可溶化液にてホモジナイズした後に、２−Ｄ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などにて二次元電気泳動に影響を与える不純物を除去後、膨潤液と混合し、その遠心上清をＢｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質を定量した後に、二次元電気泳動サンプルとすることができる。１次元目の等電点電気泳動、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、泳動後のゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）等で染色し、画像解析により各サンプル間のスポットパターンの比較解析を行うとよい。ＤＣ１とＤＣ２とで１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上の発現変動のあるスポットを切り出しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、もしくはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により蛋白質を同定すれば、発現相違因子を同定することができる。
【００４７】
本発明者は、本発明の、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子を比較する方法を用いて、実際に、ヒト由来ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現する遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導に関与する因子であると考えられる。
【００４８】
ＤＣ１において優位に発現する遺伝子としては、ａｎｎｅｘｉｎＡ８、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １ （ＰＡＫ１）、ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３およびｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １が得られた。
【００４９】
各遺伝子は表１に示されるアクセッション番号（＃）でＧｅｎＢａｎｋに登録されている遺伝子である。各遺伝子の配列や機能等に関する情報は該データベースから入手できる。
【００５０】
【表１】
【００５１】
ＤＣ２において優位に発現する遺伝子としては、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、ｓｔａｂｉｌｉｎ １、ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、ＳＥＲＰＩＮＢ２、ＲＡＢ７Ｂ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ｃａｓｐａｓｅ １、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４が得られた。
【００５２】
各遺伝子は表２および表３に示されるアクセッション番号（＃）でＧｅｎＢａｎｋに登録されている遺伝子である。各遺伝子の配列や機能等に関する情報は該データベースから入手できる。
【００５３】
【表２】
【００５４】
【表３】
【００５５】
ＤＣ２での発現上昇遺伝子として同定された遺伝子群の中でも、ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １に関しては本酵素阻害剤ならびにその産物であるＴＸＡ２のアンタゴニストの計３剤が喘息治療剤として既に国内上市・発売済であり、また、ＣＣＲ５阻害剤に関しては抗ＨＩＶ剤としてのほかに喘息治療剤として２社で前臨床開発中である。
一方、ＤＣ１での発現上昇遺伝子には、関節リウマチ患者（Ｔｈ１偏向病態）の自己抗原探索解析で見出されたｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、ファミリー内他分子が同じく関節リウマチの自己抗原として見出されているａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、動脈硬化症（Ｔｈ１偏向病態）への関与が報告されているｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）などが含まれていた。また、動脈硬化危険因子のコレステロール合成系の２因子も含まれた。
これらの結果から、本研究戦略で抽出されたＤＣサブタイプ発現上昇遺伝子群は、実際に生体内で生じるＴｈ２偏向病態（アレルギー等）、Ｔｈ１偏向病態（リウマチ等）への関与因子を反映する遺伝子発現プロファイルとして有用である可能性が高いことが示唆された。
【００５６】
上記ＤＣ１において優位に発現する遺伝子は、Ｔｈ１応答への偏向誘導に関与する遺伝子と考えられるので、被験者から得られた試料における該遺伝子の発現量を測定することにより、被験者のＴｈ１応答への偏向を診断できる。診断は、上記ＤＣ１において優位に発現する遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定することにより行う。本発明において、「遺伝子の発現量を測定する」とは、該遺伝子およびその断片、該遺伝子の転写物およびその断片、該遺伝子の産物である蛋白質およびその一部分の量を測定することを意味する。
診断に供される試料としては、血液、ずい液、脳生検サンプル等が好適であり、特に血液が好ましい。診断に用いる測定法は、自体公知の抗原抗体反応、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。
【００５７】
同様に、上記ＤＣ２において優位に発現する遺伝子は、Ｔｈ２応答への偏向誘導に関与する遺伝子と考えられるので、被験者から得られた試料における該遺伝子の発現量を測定することにより、被験者のＴｈ２応答への偏向を診断できる。
【００５８】
Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向を診断することは、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向に起因する疾患の診断、予防、治療等につながると考えられる。Ｔｈ１応答への偏向に起因する疾患としては、慢性関節リウマチ、膠原病等の自己免疫疾患ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が挙げられる。Ｔｈ２応答への偏向に起因する疾患としては、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症等のアレルギー疾患が挙げられる。また、逆に、Ｔｈ１を誘導することは、細胞性免疫の強化につながり、例えば、抗腫瘍ＤＣ免疫療法（ＤＣ移植免疫療法）の効果増強が期待できる。
【００５９】
一方で、上記のように、ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現する上記の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物は、それぞれ、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導の阻害剤となり得る。Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向誘導の阻害剤は、ひいては、Ｔｈ１またはＴｈ２応答への偏向が関与する疾患の治療剤および／または予防剤になり得る。
本発明において、「遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物」とは、蛋白質そのものに何らかの作用をして機能を阻害する化合物のみならず、該蛋白質がコードする遺伝子に作用したり、遺伝子から蛋白質が発現してくる過程において何らか作用することにより蛋白質の発現を阻害等することによって該蛋白質の機能を阻害する化合物をも含む。
【００６０】
ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現する上記の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物の同定には、公知のいかなる手法を適用してもよい。阻害剤の同定には、ＤＣ１またはＤＣ２において優位に発現する上記の遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子、該遺伝子がコードする蛋白質、およびそれらの由来物、それらを認識する抗体、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体などを用いることができる。例えば、天然の上記遺伝子産物は一般的酵素精製手段により精製して得たり、あるいは、遺伝子工学的手法により生産したりなどして得ればよい。また、阻害剤の同定に供する上記遺伝子が、酵素をコードするものである場合は、該酵素と基質との酵素反応系を確立し、酵素反応を阻害する物質を阻害剤とすればよい。阻害剤の同定に供する上記遺伝子が、リガンドである場合は、該リガンドとそのレセプターとの結合試験系をセルフリー、または、細胞にレセプターを発現させた系などで確立し、結合阻害試験を行えばよい。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。フローサイトメトリーに用いた抗体を表４に示す。
【００６２】
【表４】
【００６３】
（実施例１）単球の調製
ヒト新鮮末梢血を、ヘパリン（ノボ・ノルディクス）コートしたシリンジで採血後穏やかに転倒混和した。Ｍｏｎｏ−Ｐｏｌｙ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（大日本製薬）を予め２０ｍｌ分注した５０ｍｌチューブ（イワキ）に新鮮末梢血２５ｍｌを重層し、遠心分離（８００×ｇ、２０分、室温）を行った。単核球細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）を回収し、ＰＢＳ（−）への再懸濁と遠心分離による細胞回収を繰り返して洗浄操作を実施し、その際に遠心回転数を徐々に下げることで血小板を除去した。検鏡により血小板が少なくなったことを確認し、単核球細胞（リンパ球、単球）を再度遠心回収し、末梢血１００ｍｌ由来分量に対しＭＡＣＳ洗浄用緩衝液５００μｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）を用いてＭａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）により、ＣＤ１４陽性細胞（単球）を回収した。方法は添付プロトコールに従った。フローサイトメーター（Ａｒｉａ；ＢＤ）にてＣＤ１４陽性率として単球純度が９５％以上であることを確認した。
【００６４】
（実施例２）樹状細胞への分化
得られた単球を６ウエルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に２×１０６ｃｅｌｌｓ／ウエル、１ウエルあたり３ｍｌの培養溶液（ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ）に、１０％非働化エンドトキシン保証牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）とペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を加えて調製）となるように播種した。ＤＣ１サブタイプ分化誘導のためには、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）、ＤＣ２サブタイプ分化誘導のためには、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＬ−３（１００Ｕ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を添加し、７日間培養した。その際、２、４、６日目に培養溶液を交換した。
【００６５】
（実施例３）樹状細胞の成熟化操作
単球を上記の分化条件で７日間培養して得られた細胞を遠心回収（２８０×ｇ、１０分、４℃）し、分化培養１ウエルから派生した細胞が２ウエルに等分されるように６ウエルプレート播種した（１ウエルあたり３ｍｌ培養液）。成熟化方法の開発検討のため、次の６条件でＤＣの成熟化培養（３７℃、５％ＣＯ２、４８ｈ）後成績を比較した。ｉ）Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＭＣ）；ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）＋ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）＋ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）＋プロスタグランジンＥ２（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ｉｉ）ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ｉｉｉ）ＴＮＦ−α（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、ｉｖ）ＴＮＦ−α（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）＋ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、ｖ）プレート固相化抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ，ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ；Ｍａｂｔｅｃｈ）、ｖｉ）プレート固相化抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ，ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ；Ｍａｂｔｅｃｈ）＋ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）。ｉ）〜ｖｉ）の成熟化操作を加えずに２日間培養した細胞を未成熟ＤＣ、成熟化操作を施した細胞を成熟化ＤＣと称した。
【００６６】
（実施例４）樹状細胞培養上清サイトカインの定量
未成熟ＤＣに対する実施例３に示した成熟化操作２日後の培養上清をそれぞれ回収し、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ）を用いたＣＢＡ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄｓ Ａｒｒａｙ；ＢＤ）法にて分泌サイトカインを定量した。成熟化ＤＣの培養上清に含まれるＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１０分泌量を定量することにより、ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプそれぞれへの分化度合いを評価した。方法は添付プロトコールに従った。ｖｉ）ＬＰＳ＋固相化抗ＣＤ４０抗体により成熟化させた場合、ＧＭ−ＣＳＦ前処理ＤＣでＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ前処理ＤＣならびにＩＬ−３前処理ＤＣでＩＬ−１０の分泌が他の方法に比べてよく認められた（図１）。得られた成熟化ＤＣを光学顕微鏡下で観察したところ、成熟化ＤＣは、樹状突起を延ばし、単球と比較して細胞大も高まった。
【００６７】
（実施例５）ナイーブＴ細胞の精製
新鮮末梢血を実施例１に記した単球精製同様に処理し、単核球細胞を回収した。末梢血１００ｍｌ由来分量に対しＭＡＣＳ洗浄用緩衝液１ｍｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．）を加えて懸濁し、ビオチン化抗体カクテル（ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲγ／δ、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ Ａ抗体、抗ビオチンＭｉｃｒｏｂｅａｄｓ、ＣＤ４５ＲＯ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＭａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍにより、ネガティブフラクションを回収した。方法は添付プロトコールに従った。フローサイトメーター（Ａｒｉａ；ＢＤ）にてＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞）としての純度が９８％以上であることを確認した。
【００６８】
（実施例６）ＤＣとの共培養とＴ細胞分泌サイトカインの定量
得られたナイーブＴ細胞とアロジェニック成熟化ＤＣを２４ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）で細胞混合比４：１（１×１０６Ｔ細胞：０．２５×１０６ＤＣ）で６日間共培養した。
ＤＣと６日間共培養した後に、２４ウェルプレート固相化抗ＣＤ３抗体（５μｇ／ｍｌでｏｖｅｒｎｉｇｈｔ固相化；ＢＤ、ｃａｔ．Ｎｏ．５５５３２９）ならびに抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ；ＢＤ、ｃａｔ．Ｎｏ．５５５７２５）存在下にて１×１０６Ｔ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再活性化（２２ｈ）し、その培養上清を回収し、Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｔ （ＢＤ）を用いたＣＢＡ法にて分泌サイトカインを定量した。方法は添付プロトコールに従った。
ヘルパーＴ細胞のＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）の分泌量を指標とし、Ｔｈ１／Ｔｈ２への分化度合いを比較解析評価した。その結果、ＩＦＮ−γ分泌量では、ｉ）〜ｖｉ）のほぼ全ての成熟化法において、ＤＣ２サブタイプに比し、ＤＣ１サブタイプによるＴｈ１への有意な誘導傾向が認められた。その中でも、ｖ）抗ＣＤ４０抗体、および、ｖｉ）ＬＰＳ＋抗ＣＤ４０抗体の２方法が特に効果的なＴｈ１への誘導を示した。一方、ＩＬ−４分泌量に関しては、ｉｉ）ＬＰＳにおいてもＤＣ１サブタイプに比し、ＤＣ２サブタイプによるＴｈ２への誘導が認められるものの、ｖｉ）ＬＰＳ＋抗ＣＤ４０抗体が最も効果的なＴｈ２誘導を示した。ｖ）抗ＣＤ４０抗体は、ＩＬ−４分泌量は高いものの、ＤＣ１に比べたＤＣ２サブタイプによるＴｈ２への効果的誘導傾向は認められなかった。以上の結果より、ｖｉ）ＬＰＳ＋抗ＣＤ４０抗体の成熟化方法により、最も有効にＴｈ１／Ｔｈ２それぞれを誘導するＤＣ１／ＤＣ２サブタイプが得られることが明らかになった（図２）。
【００６９】
細胞の形態変化を合わせて、光学顕微鏡を用いて観察した。成熟化ＤＣとの共培養により、ナイーブＴ細胞は細胞大を高め、ＤＣを中心とするクラスターを構成しながら増殖した。
【００７０】
（実施例７）多数検体を用いたＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ分化・成熟化方法の確認
実施例６で見出だされたＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ分化・成熟化方法の有効性と再現性を確認するため、ＬＰＳ存在下での抗ＣＤ４０抗体による成熟化方法で得られるＤＣ１／ＤＣ２サブタイプのフェノタイプに関して、成熟化ＤＣ分泌サイトカイン、ならびに成熟化ＤＣとの共培養で得られるヘルパーＴ細胞が分泌するサイトカインを指標とし、試験検体数（採血ドナー数）を増やして解析した。 ＤＣ分泌サイトカインでは、ＩＬ−１２ｐ７０については１１全ドナーのＤＣ１サブタイプがＤＣ２サブタイプに比べて優位に分泌し、ＩＬ−１０に関しては両サブタイプで同等に分泌されるという傾向が再現された（図３）。一方、成熟化ＤＣと共培養して得られるヘルパーＴ細胞の分泌サイトカインに関しても、再現性良く、ＤＣ１サブタイプと共培養したナイーブＴ細胞がＩＦＮ−γを優位に分泌するＴｈ１へ、対して、ＤＣ２サブタイプと共培養したナイーブＴ細胞はＩＬ−４を優位に分泌するＴｈ２へ効果的に誘導されていることが示された（図４）。ＴＮＦ−αとＩＬ−２（いずれもＴｈ１サイトカインとされている）に関してはＤＣ１サブタイプと共培養して得られるヘルパーＴ細胞で優位に、対してＩＬ−５（Ｔｈ２サイトカイン）とＩＬ−１０（Ｔｈ２サイトカインとされている）に関してはＤＣ２と共培養して得られるヘルパーＴ細胞で優位に分泌されることが明らかとなった。これらの結果からも、本研究で開発したＤＣ１／ＤＣ２サブタイプがＴｈ１／Ｔｈ２のそれぞれを効果的に誘導していることが支持された。
【００７１】
（実施例８）Ｔ細胞産生サイトカインの細胞内染色定量
ＤＣと６日間共培養したＴ細胞をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）とＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）により２時間活性化処理した後、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、分泌因子を細胞内に６時間蓄積処理した。細胞を遠心回収後、１．９％ Ｆｏｒｍａｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）固定（１０分、室温）、１％Ｓａｐｏｎｉｎ（Ｓｉｇｍａ）脱脂（１０分、室温）を行い、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＩＬ−４抗体にて細胞内染色を実施し、フローサイトメトリーにて解析した。
ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプのそれぞれと共培養することで分化誘導されたヘルパーＴ細胞プレパレ−ションをドナー毎に比較すると、ＤＣ１サブタイプとの共培養ではＤＣ２サブタイプとの共培養で得られるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）プレパレ−ションに比較して、Ｔｈ１含有率（Ｔｈ１への分化誘導率）が高く、Ｔｈ２含有率（Ｔｈ２への分化誘導率）が低かった。逆に、ＤＣ２サブタイプとの共培養ではＤＣ１サブタイプとの共培養で得られるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）プレパレ―ションに比較して、Ｔｈ１含有率が低く、Ｔｈ２含有率が高いという傾向が認められた（図５）。このことはＤＣ１／ＤＣ２サブタイプがＴｈ１／Ｔｈ２それぞれへの分化を効果的に誘導していることを示している。
【００７２】
（実施例９）リンパ球混合反応（ＭＬＲ：Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ナイーブＴ細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、９６ウエルプレート：ＢＤファルコン）とＤＣ（３０Ｇｙ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）を細胞数比１：６、１：２４、１：９６、１：３８４（ＤＣ：ナイーブＴ細胞）となるように加え、６日間共培養した。培養終了の１６時間前に最終濃度が１μＣｉになるように［３Ｈ］ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（２８０ＧＢｑ／ｍｍｏｌ＝６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、グラスフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に細胞を付着させ３７℃で一晩風乾した。液体シンチレーション（Ａｑａｚｏｌ２；ＤｕＰｏｎｔ）にて細胞を溶解した後、増殖したＴ細胞数を［３Ｈ］Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込み量としてシンチレーションカウンター（トップカウント）で測定した。
【００７３】
ＤＣ１／ＤＣ２両サブタイプとも成熟化ＤＣの混合比に依存したナイーブＴ細胞に対する増殖能の誘導を同程度に示した（図６）。このことは、作製した両ＤＣサブタイプ間ではナイーブＴ細胞に対する増殖誘導能には違いが無く、Ｔｈ１／Ｔｈ２のそれぞれを効果的に分化誘導する能力を有していることを示す。一方、未成熟ＤＣにおいては両サブタイプとも増殖誘導能が認められなかったことから、確立した成熟化方法が両ＤＣサブタイプ間での相違ない成熟化に有効に機能していることも明らかとなった。
【００７４】
（実施例１０）ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプからのｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出、ｐｏｌｙ Ａ （＋）ＲＮＡの精製、ｃＤＮＡサブトラクション、ディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニング、ならびにＲＴ−ＰＣＲによる発現変動遺伝子の同定
延べ２２ドナーから得た末梢血由来、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体による処理後２４時間のＤＣ１／ＤＣ２サブタイプよりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡをプ−ル（ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプそれぞれ２５０μｇ）し、その一部（５μｇ）を用いてＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）解析を実施した。残るｔｏｔａｌ ＲＮＡよりＯｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用い添付プロトコールに従いｐｏｌｙ Ａ（＋）ＲＮＡを精製（ＤＣ１：４．８μｇ、ＤＣ２：３．８μｇを取得）し、ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプそれぞれのｐｏｌｙ Ａ（＋）ＲＮＡ（８００ｎｇ）を出発材料に、（ＤＣ１−ＤＣ２）／（ＤＣ２−ＤＣ１）の双方向のｃＤＮＡサブトラクションを実施した。ｃＤＮＡサブトラクション効果の検証実験として、ＤＣ１またはＤＣ２サブタイプで優位に発現することを事前に明らかにしたＣＤ１ａならびにＣＤ１２３、また、両サブタイプで同等に発現しているハウスキーピング遺伝子としてＧ３ＰＤＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）遺伝子断片をプローブにサザンブロッティング解析した。ＣＤ１ａ、ＣＤ１２３プローブはＲＴ−ＰＣＲ法（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にてＤＣ由来ｐｏｌｙ Ａ（＋） ＲＮＡを鋳型に得たＰＣＲ産物を使用した。サブトラクティッドプラスミドライブラリーよりディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングにて選択された遺伝子の塩基配列を決定した。得られた塩基配列情報をもとにＢＬＡＳＴ解析を実施し、選択クローン中の重複クローンを除去した。ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ間での発現変動評価は、個々の遺伝子についてプライマーを設計し（シグマジェノシス製造）、ｃＤＮＡサブトラクションに供したｐｏｌｙ Ａ（＋）ＲＮＡが由来するｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法にて実施した。エチジウムブロマイド染色後の増幅遺伝子量をＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ（Ｂｉｏ Ｉｍａｇｅ）にて定量した。内部標準として、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子を用いてｃＤＮＡ化効率を標準化した。
【００７５】
ｃＤＮＡサブトラクション実施後、その効果の検証実験として、ＤＣ１サブタイプで優位に発現するＣＤ１ａならびにＤＣ２サブタイプで優位に発現するＣＤ１２３が、それぞれの方向のサブトラクション操作後ＰＣＲ産物において有意に濃縮されているか否か、また、両サブタイプで同等に発現しているハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）がサブトラクション操作により相殺されているか否かをサザンブロッティングにて解析した。その結果、濃縮並びに相殺効果が有意に認められ、ｃＤＮＡサブトラクションが系として機能していることが確認できた。以上から、発現変動遺伝子抽出作業を実施するに値する、ｃＤＮＡサブトラクティッドライブラリーの構築材料の獲得に成功したと判断した。
【００７６】
作製した（ＤＣ１−ＤＣ２）、（ＤＣ２−ＤＣ１）それぞれの方向のｃＤＮＡサブトラクティッドプラスミドライブラリーより（ＤＣ１−ＤＣ２）方向：７６８クローン、（ＤＣ２−ＤＣ１）方向：１１５２クローンをディファレンシャルハイブリダーゼーションに供し、（ＤＣ２−ＤＣ１）側で２４１クローン、（ＤＣ１−ＤＣ２）側で１６３クローンを選出した。これら発現変動候補遺伝子の塩基配列を決定し、重複遺伝子を除去した後に、次の解析優先順位を設けてＲＴ−ＰＣＲ法による発現変動遺伝子の同定を実施した。本研究において目的とするＤＣ由来のヘルパーＴ細胞分化制御因子としては、直接的にヘルパーＴ細胞に働きかける因子を想定していることから、クロマチン結合蛋白質、転写因子等の核内蛋白質、機能未知蛋白質については解析優先順位を下げ、逆に、細胞膜表面分子、分泌因子、免疫系シグナルカスケード関連因子の解析優先順位を上げた。（ＤＣ２−ＤＣ１）側で１１４クローン（ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析で有力な２１クローンも含む）、（ＤＣ１−ＤＣ２）側２７クローンをＲＴ−ＰＣＲ法にて解析し、ＤＣサブタイプ間で１．９倍以上の発現変動を示すものを発現変動遺伝子とした。（ＤＣ２−ＤＣ１）側で３２、（ＤＣ１−ＤＣ２）側で１１遺伝子を獲得した。
【００７７】
【表５】
【００７８】
【表６】
【００７９】
【表７】
【００８０】
（実施例１１）ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプの表面抗原発現解析
確立した分化・成熟化方法で得られるＤＣ１／ＤＣ２サブタイプの特性解析として、細胞表面抗原の発現解析をフローサイトメトリーにて解析した。
まず、ＤＣ成熟化マーカー分子であるＣＤ８６、ＣＤ８３、ＨＬ−ＤＲ、ＣＤ２５分子は、ＤＣ１／ＤＣ２サブタイプに関らず、未成熟ＤＣに比べ成熟化ＤＣでの発現亢進が認められた（図７）。この結果は、確立したＤＣ調製方法が、両サブタイプ間で相違なく十分なＤＣ成熟化をもたらしていることを示す。一方、ＢＤＣＡ４、ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４については、未成熟ＤＣに比べ成熟化ＤＣでの発現低下が認められた（図８）。隣接リンパ節でＴ細胞と接触するために、ＤＣは抗原を取り込んだ後成熟化する際にはＴＬＲなどの抗原認識分子を内在化させることが明らかになっている。次に、この解析の主たる目的であるＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ間で発現に差異が認められた分子群については、ＤＣ１優位な分子としてＣＤ１ａとＢＤＣＡ１、ＤＣ２優位な分子としてはＨＬＡ−ＤＲが見出せた（図９）。ＣＤ１ａに関してはＥｂｎｅｒらの報告（Ｅｂｎｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．，１６８，６１９９−６２０７（２００２））と一致する。他の分子のＤＣ１／ＤＣ２サブタイプ間での発現差異に関しては本研究で初めて見出されたものである。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図中ｉ）〜ｖｉ）の各刺激条件下で成熟化させたＤＣの分泌サイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−１０）量を示す図である。ＤＣ１は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後に図中ｉ）〜ｖｉ）に示す各条件下で成熟化させた細胞、ＤＣ２は、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後に図中ｉ）〜ｖｉ）に示す各条件下で成熟化させた細胞を示す。ＭＣはＭａｔｕｒａｒｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌを意味する。
【図２】図中ｉ）〜ｖｉ）の各刺激条件下で成熟化させたＤＣをナイーブＴ細胞と共培養することで分化誘導されるヘルパーＴ細胞のＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）の分泌量を示す図である。ＤＣ１―Ｔｈは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後に図中ｉ）〜ｖｉ）に示す各条件下で成熟化させた細胞と共培養して得られたヘルパーＴ細胞、ＤＣ２―Ｔｈは、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後に図中ｉ）〜ｖｉ）に示す各条件下で成熟化させた細胞と共培養して得られたヘルパーＴ細胞を示す。ＭＣはＭａｔｕｒａｒｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌを意味する。
【図３】多数検体を用いて、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体で成熟化させた際のＤＣの分泌サイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−１０）量を測定した結果を示す図である。ＤＣ１は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後に、ＤＣ２は、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体刺激で成熟化させた細胞を示す。
【図４】多数検体を用いて、ＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体で成熟化させたＤＣをナイーブＴ細胞と共培養することで分化誘導されるヘルパーＴ細胞のＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）の分泌量測定した結果を示す図である。ＤＣ１−Ｔｈは、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体で成熟化させた細胞と共培養して得られたヘルパーＴ細胞、ＤＣ２−Ｔｈは、ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体で成熟化させた細胞と共培養して得られたヘルパーＴ細胞を示す。
【図５】成熟化ＤＣによって誘導されたヘルパーＴ細胞のうちの、Ｔｈ１／Ｔｈ２比率を、ヘルパーＴ細胞が産生するＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を細胞内で染色、定量解析することで算出した図である。図中の丸で囲まれた数値は、Ｔ細胞全体に占めるＴｈ１、Ｔｈ２それぞれの含有率を示す。
【図６】未成熟および成熟ＤＣの、ナイーブＴ細胞に対する増殖能の誘導をリンパ球混合反応（ＭＬＲ）により測定した結果を示す図である。
【図７】未成熟および成熟ＤＣの表面抗原ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ２５の発現量をＤＣ１（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）およびＤＣ２（ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）で比較した図である。
【図８】未成熟および成熟ＤＣの表面抗原ＢＤＣＡ４、ＴＬＲ−２、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１４の発現量をＤＣ１（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）およびＤＣ２（ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）で比較した図である。
【図９】未成熟および成熟ＤＣの表面抗原ＣＤ１ａ、ＢＤＣＡ１およびＨＬＡ−ＤＲの発現量をＤＣ１（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）およびＤＣ２（ＩＬ−４およびＩＬ−３存在下で培養した後にＬＰＳおよび抗ＣＤ４０抗体存在下で成熟化させて得たＤＣ）で比較した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む単球由来の未成熟樹状細胞の成熟化方法。
【請求項２】
単球由来の未成熟樹状細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む成熟樹状細胞の生産方法。
【請求項３】
単球由来の未成熟樹状細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法。
【請求項４】
抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
次の工程を含む成熟樹状細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項６】
次の工程を含むインターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生能を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項７】
次の工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向を誘導する活性を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項８】
次の工程を含むＣＤ１ａ陽性細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項９】
次の工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１ａおよびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１０】
次の工程を含む、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）においてナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１１】
次の工程を含むＤＣ１の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１２】
抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
次の工程を含む成熟樹状細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１４】
次の工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向を誘導する活性を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１５】
次の工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１６】
次の工程を含む、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）においてナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１７】
次の工程を含むＤＣ２の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１８】
抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞を用いることを特徴とするヘルパーＴ細胞の生産方法。
【請求項２１】
ナイーブＴ細胞を、請求項１９に記載の細胞の存在下で培養する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の生産方法。
【請求項２２】
ナイーブＴ細胞を、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含むインターフェロンγ産生能を有する細胞の生産方法。
【請求項２３】
ナイーブＴ細胞を、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞の生産方法。
【請求項２４】
ナイーブＴ細胞を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、ＩＬ−４産生能を有する細胞の生産方法。
【請求項２５】
ナイーブＴ細胞を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の生産方法。
【請求項２６】
ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、インターフェロンγ産生能を有する細胞の生産方法。
【請求項２７】
ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞の生産方法。
【請求項２８】
ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、ＩＬ−４産生能を有する細胞の生産方法。
【請求項２９】
ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の生産方法。
【請求項３０】
請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法を用いることにより得られた細胞。
【請求項３１】
次の工程を含む、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子を比較する方法。
（１）単球を得る工程
（２）（１）で得られた単球を２つの細胞群に分け、一方の細胞群をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で、他方の細胞群をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
（３）（２）で得られた２つの細胞群それぞれを、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
（４）（３）で得られた２つの細胞群のうち、（２）の工程でＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した細胞群をＤＣ１群とし、ＩＬ−３存在下で培養した細胞群をＤＣ２群とする工程
（５）（４）で得られたＤＣ１群とＤＣ２群の発現遺伝子を差異解析により比較する工程
【請求項３２】
差異解析がサブトラクション法、ＤＮＡチップを用いた解析法または蛋白質二次元電気泳動法である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の方法を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向誘導因子の同定方法。
【請求項３４】
被検者から得られた試料における次の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向の診断方法。
ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、
ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、
ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、
ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、
ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、
Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、
ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １
【請求項３５】
被検者から得られた試料における次の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向の診断方法。
ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、
ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、
ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、
ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、
ｓｔａｂｉｌｉｎ １、
ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、
ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、
ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、
ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、
ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、
ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、
ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、
ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、
ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、
ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、
ＳＥＲＰＩＮＢ２、
ＲＡＢ７Ｂ、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、
ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、
ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、
ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、
ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、
ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、
ｃａｓｐａｓｅ １、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４
【請求項３６】
次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物を選択する工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向誘導阻害剤の同定方法。
ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、
ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、
ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、
ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、
ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、
Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、
ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １
【請求項３７】
次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能促進作用を有する化合物を選択する工程を含むＤＣ移植免疫療法の効果増強剤の同定方法。
ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、
ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、
ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、
ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、
ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、
Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、
ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １
【請求項３８】
次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物を選択する工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向誘導阻害剤の同定方法。
ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、
ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、
ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、
ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、
ｓｔａｂｉｌｉｎ １、
ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、
ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、
ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、
ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、
ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、
ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、
ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、
ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、
ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、
ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、
ＳＥＲＰＩＮＢ２、
ＲＡＢ７Ｂ、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、
ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、
ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、
ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、
ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、
ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、
ｃａｓｐａｓｅ １、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４
【請求項１】
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む単球由来の未成熟樹状細胞の成熟化方法。
【請求項２】
単球由来の未成熟樹状細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含む成熟樹状細胞の生産方法。
【請求項３】
単球由来の未成熟樹状細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法。
【請求項４】
抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
次の工程を含む成熟樹状細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項６】
次の工程を含むインターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生能を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項７】
次の工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向を誘導する活性を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項８】
次の工程を含むＣＤ１ａ陽性細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項９】
次の工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１ａおよびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１０】
次の工程を含む、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）においてナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１１】
次の工程を含むＤＣ１の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１２】
抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
次の工程を含む成熟樹状細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１４】
次の工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向を誘導する活性を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１５】
次の工程を含むＣＤ２５、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１６】
次の工程を含む、リンパ球混合反応（ＭＬＲ）においてナイーブＴ細胞に対して増殖能を誘導する活性を有する細胞の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１７】
次の工程を含むＤＣ２の生産方法。
１）単球をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
２）１）で得られた細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
【請求項１８】
抗ＣＤ４０抗体が固相化されたものである請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞を用いることを特徴とするヘルパーＴ細胞の生産方法。
【請求項２１】
ナイーブＴ細胞を、請求項１９に記載の細胞の存在下で培養する工程を含む、ヘルパーＴ細胞の生産方法。
【請求項２２】
ナイーブＴ細胞を、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含むインターフェロンγ産生能を有する細胞の生産方法。
【請求項２３】
ナイーブＴ細胞を、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞の生産方法。
【請求項２４】
ナイーブＴ細胞を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、ＩＬ−４産生能を有する細胞の生産方法。
【請求項２５】
ナイーブＴ細胞を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の生産方法。
【請求項２６】
ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、インターフェロンγ産生能を有する細胞の生産方法。
【請求項２７】
ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞の生産方法。
【請求項２８】
ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、ＩＬ−４産生能を有する細胞の生産方法。
【請求項２９】
ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陰性のＴ細胞を、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて得られた細胞の存在下で培養する工程を含む、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の生産方法。
【請求項３０】
請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法を用いることにより得られた細胞。
【請求項３１】
次の工程を含む、ＤＣ１とＤＣ２における発現遺伝子を比較する方法。
（１）単球を得る工程
（２）（１）で得られた単球を２つの細胞群に分け、一方の細胞群をインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）存在下で、他方の細胞群をインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン３（ＩＬ−３）存在下で培養する工程
（３）（２）で得られた２つの細胞群それぞれを、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および抗ＣＤ４０抗体存在下で培養する工程
（４）（３）で得られた２つの細胞群のうち、（２）の工程でＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養した細胞群をＤＣ１群とし、ＩＬ−３存在下で培養した細胞群をＤＣ２群とする工程
（５）（４）で得られたＤＣ１群とＤＣ２群の発現遺伝子を差異解析により比較する工程
【請求項３２】
差異解析がサブトラクション法、ＤＮＡチップを用いた解析法または蛋白質二次元電気泳動法である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の方法を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向誘導因子の同定方法。
【請求項３４】
被検者から得られた試料における次の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向の診断方法。
ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、
ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、
ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、
ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、
ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、
Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、
ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １
【請求項３５】
被検者から得られた試料における次の群から選ばれる１以上の遺伝子の発現量を測定する工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向の診断方法。
ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、
ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、
ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、
ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、
ｓｔａｂｉｌｉｎ １、
ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、
ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、
ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、
ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、
ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、
ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、
ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、
ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、
ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、
ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、
ＳＥＲＰＩＮＢ２、
ＲＡＢ７Ｂ、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、
ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、
ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、
ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、
ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、
ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、
ｃａｓｐａｓｅ １、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４
【請求項３６】
次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物を選択する工程を含むＴヘルパー１（Ｔｈ１）応答への偏向誘導阻害剤の同定方法。
ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、
ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、
ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、
ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、
ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、
Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、
ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １
【請求項３７】
次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能促進作用を有する化合物を選択する工程を含むＤＣ移植免疫療法の効果増強剤の同定方法。
ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８、
ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ＡＤＡＭ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄｏｍａｉｎ １２（ＡＤＡＭ１２）、
ｐ２１／Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ１−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＡＫ１）、
ｓｔｅｒｏｌ−Ｃ４−ｍｅｔｈｙｌ ｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｋｅ、
ｃｏａｃｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ １、
ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ９（ＧＭ３ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｆａｒｎｅｓｙｌ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、
ｃｏｐｉｎｅ ＩＶ、
Ａ ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １３、
ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １
【請求項３８】
次の群から選ばれるいずれか１の遺伝子がコードする蛋白質の機能阻害作用を有する化合物を選択する工程を含むＴヘルパー２（Ｔｈ２）応答への偏向誘導阻害剤の同定方法。
ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ） ｌｉｇａｎｄ ３、
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ２７ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、
ｓｅｒｐｉｎ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｌａｄｅ Ｅ ｍｅｍｂｅｒ １、
ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ Ｅ、
ｒａｄｉｃａｌ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２、
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、
ｓｔａｂｉｌｉｎ １、
ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ， ａｃｉｄｉｃ， ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ、
ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ｂ、
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｎｍｂ、
ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ４、
ｆｏｒｍｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ２、
ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、
ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ １５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ （１５−ＬＯ）、
ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆａｃｔｏｒ ２、
ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ ｓｙｎｔｈａｓｅ １、
ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｃ ｍｅｍｂｅｒ ３、
ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １５、
ＳＥＲＰＩＮＢ２、
ＲＡＢ７Ｂ、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １、
ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、
ｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、
ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ９、
ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ３、
ｅｇｆ ｍｕｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、
ｃａｓｐａｓｅ １、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５、
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ４
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−３１２６８３（Ｐ２００７−３１２６８３Ａ）
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４６０９７（Ｐ２００６−１４６０９７）
【出願日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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