成長因子／両親媒性ポリマー複合体、可溶性のカチオン塩及び有機支持体を含有する骨形成組成物
【課題】成長因子／両親媒性アニオン性多糖類複合体、可溶性のカチオン塩及び有機支持体を含む骨形成組成物を提供する。
【解決手段】本発明は、少なくとも１種の骨形成成長因子／両親媒性アニオン性多糖類複合体、１種の可溶性の少なくとも２価のカチオン塩、及び１種の有機支持体
を含む骨形成組成物から構成されるオープンインプラントであって、前記有機支持体は脱塩された骨マトリックスを含んでいない、オープンインプラントに関する。一の態様において、前記インプラントは凍結乾燥物の形態にある。本発明はまた、その製造方法にも関する。
【解決手段】本発明は、少なくとも１種の骨形成成長因子／両親媒性アニオン性多糖類複合体、１種の可溶性の少なくとも２価のカチオン塩、及び１種の有機支持体
を含む骨形成組成物から構成されるオープンインプラントであって、前記有機支持体は脱塩された骨マトリックスを含んでいない、オープンインプラントに関する。一の態様において、前記インプラントは凍結乾燥物の形態にある。本発明はまた、その製造方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成製剤の分野に、より特に、骨形成タンパク質であるＢＭＰファミリーに属する骨形成タンパク質の製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成誘発の機構に伴う成長因子である。ＢＭＰは骨形成タンパク質（ＯＰ）としても知られており、１９６５年にＵｒｉｓｔにより最初に特定された（非特許文献１）。皮質骨から単離されるこれらタンパク質は、多種の動物の骨形成を誘発し得る（非特許文献１）。
【０００３】
ＢＭＰは、翻訳後成熟の後に１０４ないし１３９残基の長さを有するプロペプチドの形態で発現する。それらは互いに非常に相同性の配列を有しており、且つ類似の三次元構造を有している。特に、それらは、所謂“システイン集団（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｋｎｏｔ）”を形成する分子内ジスルフィド架橋に包含される６個のシステイン残基を有している（非特許文献２及び３）。ＢＭＰのうちの数種は、ダイマーの形成に関与する分子間ジスルフィド架橋に包含される７番目のシステインを有している（非特許文献２）。
【０００４】
それらの活性形態において、ＢＭＰは、Ｉｓｒａｅｌ等により記載されるように、ホモダイマーとして及びヘテロダイマーとしてさえ会合する（非特許文献４）。ダイマー状ＢＭＰは、ＢＭＰＲ型の膜透過受容体と相互作用する（非特許文献５）。この認識は、特にＳｍａｄタンパク質を含有する一連の細胞内シグナル伝達を引き起こし、このことが標的遺伝子の活性化又は抑制化を誘発する。
【０００５】
ＢＭＰ１及び３を除いて、ＢＭＰは、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）を分化させるのに直接的な且つ間接的な役割を果しており、このことが骨芽細胞へのその分化を誘発する（非特許文献６）。それらはまた、走化性の特性を有し、且つ増殖及び分化を誘発する。
【０００６】
幾種かのヒト組換体ＢＭＰ、特にｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＢＭＰ−７は、ヒトの生体内での骨形成を誘発する能力を明らかに示しており、そして幾つかの医療用途のため承認されている。このように、ヒト組換体ＢＭＰ−２、即ち国際的な一般名に従うとジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ ａｌｆａ）は、米国ではインフーズ（ＩｎＦｕｓｅ）（登録商標）、そして欧州ではインダクトＯｓ（ＩｎｄｕｃｔＯｓ）（登録商標）の名称で販売される製品中に配合されている。この製品は、腰椎融合に対して、及び“非結合”骨折に対する脛骨の骨再生に対して処方される。腰椎の融合のためのインフーズの場合、外科的処置はまず第一に、ｒｈＢＭＰ−２溶液中にコラーゲンスポンジを浸し、その後、腰椎間に前もって移植された中空ケージ（ＬＴケージ）にそのスポンジを置くことからなる。
【０００７】
ヒト組換体ＢＭＰ−７、即ち国際的な一般名に従うとエプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ ａｌｆａ）は、ＢＭＰ−２と同じ治療指標を有し、２つの製品、即ち脛骨の開裂骨折に対するＯＰ−１インプラント（ＯＰ−１Ｉｍｐｌａｎｔ）及び腰椎融合に対するＯＰ−１パテ（ＯＰ−１Ｐｕｔｔｙ）の基盤を形成している。ＯＰ−１インプラントは、ｒｈＢＭＰ−７及び０．９％生理的食塩水が吸収されるコラーゲンを含有する粉末からなる。得られたペーストはその後、外科的処置中に骨折部に適用される。ＯＰ−１パテは、一方がｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンを含み、他方がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む、２種類の粉末の形態にある。外科的処置中に、ＣＭＣの溶液は０．９％生理的食塩水によって再構成され、そしてｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンと混合される。得られたペーストは、治療部位に適用される。
【０００８】
特許文献１は、無機セラミックを含有する支持体（骨格）、該支持体に一体的に結合された固形メンブラン及び骨形成剤から成る骨形成誘発インプラントを記載している。前記支持体は、好ましくはコラーゲンスポンジである。前記無機セラミックは、カルシウム誘導体、好ましくは二相性のリン酸カルシウムのような水不溶性の無機マトリックスである（ｐ．２，[００２４]）。インプラントに一体的に結合された固形メンブランは、周囲の軟部組織からの細胞の進入を制限するために、そしてまた、炎症細胞の侵入を防止するために、不透過性でなければならない（ｐ．３，[００３０]）。インプラントへのこれら細胞の進入が骨成長の低下及び治療の失敗を引き起こすおそれがある、と記載されている（ｐ．１，[０００７]）。
この発明は、骨形成を改善するために、インプラントへのメンブランの添加を中心としている。
【０００９】
特許文献２は、脱塩された骨マトリックス（即ちＤＢＭ）、コラーゲン微粒子及び物理的に架橋された多糖類マトリックスを含有するシート形態の発明品を記載している。さらには、このインプラントは、成長因子のような骨形成物質を含有し得る。前記物理的に架橋された多糖類は、脱塩された骨の粒子に対する安定化剤として作用し（ｐ．３，[００２６]）、前記アルギネートを基剤とした多糖類は、塩化カルシウムの添加によって架橋される。
【００１０】
特許文献３は、物理的強度を有する生体適合性の骨形成複合体材料を記載している。著者等によれば、この骨形成誘発材料は脱塩された骨から成り、そのことが、脱塩された骨の存在、或いは脱塩された骨のタンパク質抽出物の存在、或いはこれら２つの成分の存在においてのみ骨形成誘発が生じることを可能にしている（ｐ．２，第２行ないし第５行）。カルシウム塩又は無機塩がこの材料に添加されている。無機塩は、場合により水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム又は水酸化マグネシウムであることが記載されている（ｐ．１７，第４行ないし第９行）。カルシウム塩は、可溶性塩であっても、又はそうでなくともよく（ｐ．１７，第２１行ないし第２１行）、好ましくは水酸化カルシウムである。添加される種々のカチオン、特にカルシウムの水酸化物の選択が、この環境におけるコラーゲン合成の向上に有利となるマトリックスのｐＨを上昇させる効果により、正当化される（ｐ．１５，第７行ないし第１１行）。
この発明は、インプラントの物理学的及び骨形成特性がインプラントのｐＨの上昇によって改良された、新規の脱塩された骨を基剤としたインプラントの形成を包含している。
【００１１】
さらには、複合体を安定化させる目的で、及び／又はその可溶性を高める目的で、及び／又はその活性を高める目的で、成長因子とポリマーとの間で複合体を形成させることが特に有利であることが示されている。
こうして、本出願人の名における特許出願である特許文献４において、ＢＭＰ−２と両親媒性ポリマーとの間の複合体の形成が、生理学的ｐＨにおいて比較的不溶性であるこの非常に疎水性のタンパク質の溶解性を高めることを特に可能としたことを示すことができた。
特許出願である特許文献４において、出願人はまた、疎水性置換基によって官能化されたデキストラン誘導体の存在下において、ＢＭＰ−２の生理学的活性の増加を示した。生体外において、このＢＭＰ−２複合体は、ＢＭＰ−２単独と比べて全て優れていることが判る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第２００８／０１４１９７号明細書
【特許文献２】米国特許第２００７／０２５４０４１号明細書
【特許文献３】国際公開第９６／３９２０３号明細書
【特許文献４】仏国特許第０７０５５３６号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｕｒｉｓｔ ＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６５；１５０，８９３
【非特許文献２】Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ Ｃ．２００４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；２８７，１０３
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒ ＭＰ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３；２３１，４４５
【非特許文献４】Ｉｓｒａｅｌ ＤＩ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６，１３（３−４），２９１
【非特許文献５】Ｍｕｎｄｙ他 Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ２００４，２２（４），２３３
【非特許文献６】Ｃｈｅｎｇ Ｈ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００３，８５Ａ １５４４−１５５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、例えば、投与量を低減し得るために、これらＢＭＰ成長因子の有効性を改良し得る製剤を見出すことをが不可欠である。
これらタンパク質は一般に、数桁の大きさだけ生理学的投与量を超える投与量で使用されるために、この課題は多くの成長因子製剤で共通である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
成長因子含有のヒドロゲルへの可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液の添加により、前記成長因子の活性を改良することを可能にする成長因子製剤であって、前記可溶性の少なくとも２価のカチオン塩が前記成長因子の効果を高める成長因子製剤を見出したことは、出願人の功績である。
驚くことに、この新規製剤は、より少量の成長因子で同様の骨形成効果を生じ得る。
本発明は、少なくとも
・１種の骨形成成長因子／両親媒性アニオン性多糖類複合体、
・１種の可溶性の少なくとも２価のカチオン塩、及び
・１種の有機支持体
を含有する骨形成組成物から構成されるオープンインプラント（ｏｐｅｎ ｉｍｐｌａｎｔ）であって、前記有機支持体は脱塩された骨マトリックスを含んでいない、オープンインプラント、に関する。
【００１６】
用語“オープンインプラント”とは、インプラント周囲の組織との交換を制限又は規制し得るメンブランもシェルも含有していない、且つ、その構成について実質的に均質であるインプラントを意味する。
用語“脱塩された骨マトリックス”（即ちＤＢＭ）とは、脱塩された成分の大部分が無いが、成長因子を含有するコラーゲンタンパク質又はコラーゲンでないタンパク質を保持する自家骨の酸抽出によって得られるマトリックスを意味する。そのような脱塩された骨マトリックスはまた、カオトロピック剤を用いた抽出後に不活性形態で製造され得る。
用語“有機支持体”とは、有機マトリックス及び／又はヒドロゲルから成る支持体を意味する。
用語“有機マトリックス”とは、架橋されたヒドロゲル及び／又はコラーゲンから成るマトリックスを意味する。
【００１７】
有機マトリックスは、ポリマー鎖の化学的架橋によって得られるヒドロゲルである。鎖間共有結合が有機マトリックスを定義する。有機マトリックスを構成するのに使用され得るポリマーは、Ｈｙｄｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ，２００２，４３，３−１２）なる表題の、Ｈｏｆｆｍａｎによる概説に記載されている。
【００１８】
一の態様において、マトリックスは、滅菌され、架橋され、精製された天然コラーゲンを基剤としたマトリックスより選択される。
コラーゲンのような天然ポリマーは、細胞付着、移動及び分化を促進する細胞外マトリックス成分である。それらは、顕著に生体適合性であるという利点を有し、そして酵素消化機構によって分解される。コラーゲンを基剤としたマトリックスは、ウシ又はブタの腱又は骨から抽出される繊維状コラーゲンＩ型又はＩＶ型から得られる。これらコラーゲンはまず精製され、その後架橋され、そしてその後殺菌される。
【００１９】
本発明に従う有機支持体は、造形され、又は成形されるに十分な機械的特性を有する材料の形態に、或いは“パテ”の形態にあり得る材料を得るために、混合物として使用され得るか、或いは、コラーゲン又はヒドロゲルは結合剤の役割を果たす。
【００２０】
混合材料、例えば、コラーゲンと無機粒子とを組み合わせた、且つ強化された機械的特性を有する複合材料の形態に、或いは“パテ”の形態にあり得るマトリックスが使用され得るか、或いは、コラーゲンは結合剤の役割を果たす。
使用され得る無機材料は、主要な利点が骨の化学組成に非常に近い化学組成である、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ)、二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ)又は非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）のような、リン酸カルシウムを基剤としたセラミックを実質的に含有する。これら材料は、良好な機械的特性を有し、そして免疫学的に不活性である。これら材料は、粉末、顆粒又はブロックのような種々の形態であり得る。これらの材料は、それらの組成に応じて非常に種々の分解速度を有し；即ち、ヒドロキシアパタイトは非常にゆっくりと分解するが（数ヶ月）、リン酸三カルシウムはより迅速に分解する（数週間）。二相性のリン酸カルシウムは中間の吸収速度を有するために、この目的のために開発された。これらの無機材料は、主として骨誘導性として既知である。
【００２１】
用語“ヒドロゲル”とは、大量の水又は生理学的流動体を吸着し得るポリマーの親水性三次元網目構造を意味する（Ｐｅｐｐａｓ他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６）。そのようなヒドロゲルは、物理的相互作用から構成され、そしてそれ故、ポリマー鎖の化学的架橋によっては得られない。
【００２２】
これらのポリマーのうち、合成ポリマー及び天然ポリマーが見出され得る。ヒドロゲル形成多糖類は、例えば、Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｃｏｖｉｅｌｌｏ他，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２００７，１１９，５−２４）なる表題の文献に記載されている。
【００２３】
一の態様において、架橋されていても、又は架橋されていなくてもよいヒドロゲル形成ポリマーは、エチレングリコール／乳酸コポリマー、エチレングリコール／グリコール酸コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸である合成ポリマー群より選択される。
【００２４】
一の態様において、ヒドロゲル形成ポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、プルラン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン及びフィブリン、及び生物学的に許容され得るそれらの塩である天然ポリマー群より選択される。
【００２５】
一の態様において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、プルラン、キサンタン、カラギーナン、キトサン及びコンドロイチン、及び生物学的に許容され得るそれらの塩であるヒドロゲル形成多糖類群より選択される。
【００２６】
一の態様において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸及びアルギン酸、及び生物学的に許容され得るそれらの塩であるヒドロゲル形成多糖類群より選択される。
【００２７】
用語“両親媒性多糖類”とは、疎水性誘導体によって官能化された多糖類群より選択される多糖類を意味する。
【００２８】
これら多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から構成されている。それらは中性であり得る、即ち、酸官能基を保有していないか、或いはアニオン性であって且つ酸官能基を保有し得る。
それらは、少なくとも１つのトリプトファン誘導体（Ｔｒｐ）によって官能化されている。
・前記トリプトファン誘導体は、酸官能基によるカップリングによって多糖類にグラフトされているか又は結合されており、前記酸官能基が、アニオン性多糖類の酸官能基及び／又は官能基Ｆにより多糖類に結合しているリンカーアームＲによって保有されている酸官能基となることを可能にしており、前記官能基Ｆは、リンカーアームＲと、天然の又はアニオン性多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリングの結果であり、
Ｆは、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カルボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基であり、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ及び／又はＮのようなヘテロ原子を１つ以上含有し、且つ少なくとも１つの酸官能基を有する、所望により枝分れ状の及び／又は不飽和鎖であり、
・Ｔｒｐは、トリプトファンのアミンと、Ｒ基により保有されている少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有されている１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基である。
【００２９】
本発明に従うと、主として（１，４）、（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合を含有し、少なくとも１つのトリプトファン誘導体により官能化された多糖類は、下記の一般式Ｉ：
［式中、
多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合からなり、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性又はアニオン性多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１個以上のヘテロ原子を含有し、そして少なくとも１つの酸官能基を有する、所望により枝分れ状及び／又は不飽和鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファン誘導体のアミンと、Ｒ基により保有される少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有される少なくとも１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基を表し、
ｎは、Ｔｒｐ置換されたＲのモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｏは、Ｔｒｐ置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｉは、糖単位当りのＲ基により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし２であり、
ｊは、糖単位当りのアニオン性多糖類により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
（ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ＲがＴｒｐにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン（群）であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属のカチオンであり、
前記多糖類がアニオン性多糖類である場合、多糖類の１つ以上の酸官能基（群）がＴｒｐにより置換されておらず、その場合にそれ（それら）はカチオンにより塩化されており、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
に対応し得る。
【００３０】
一の態様において、Ｆは、エステル、カーボネート、カルバメート又はエーテル官能基を表す。
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）型のグリコシド結合からなる。
一の態様において、大部分が（１，４）型のグリコシド結合からなる多糖類は、プルラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キシラン、ガラクツロン酸及び水溶性セルロースからなる群より選択される。
一の態様において、多糖類はプルランである。
一の態様において、多糖類はアルギン酸である。
一の態様において、多糖類はヒアルロン酸である。
一の態様において、多糖類はキシランである。
一の態様において、多糖類はガラクツロン酸である。
一の態様において、多糖類は水溶性セルロースである。
【００３１】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、カードランである。
【００３２】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、イヌリンである。
【００３３】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、グルカンである。
【００３４】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、マンナンである。
【００３５】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、Ｒ基が下記の基：
又はそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【００３６】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、トリプトファン誘導体が、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミン及びそれらのアルカリ金属カチオン塩からなる群より選択されることを特徴とする。
一の態様において、本発明に係る多糖類は、トリプトファン誘導体が式ＩＩ：
[式中、
Ｅは、直鎖状の又は枝分れ状の（Ｃ１ないしＣ８）アルキル基；直鎖状の又は枝分れ状の（Ｃ６ないしＣ２０）アルキルアリール基又はアリールアルキル基であり得る基である。]
で表されるトリプトファンエステルより選択されることを特徴とする。
【００３７】
多糖類は、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、多糖類は、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【００３８】
一の態様において、多糖類は、仏国特許第０７／０２３１６号明細書に記載される、トリプトファン及びトリプトファン誘導体のような疎水性アミノ酸によって官能化されたデキストラン群より選択される。
【００３９】
本発明によれば、官能化されたデキストランは、下記の一般式ＩＩＩ
［式中、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有し、少なくとも１つの酸官能基を有する、所望により枝分れ状及び／又は不飽和鎖を表し、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性の又はアニオン性の多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
ＡＡは、アミノ酸のアミンと、Ｒ基により保有される酸との間のカップリングから生じる疎水性のＬ−又はＤ−アミノ酸残基を表し、
ｔは、グリコシド単位当りのＦ−Ｒ−［ＡＡ］ｎ置換基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ｐは、ＡＡにより置換されたＲ基のモル分率であって、０．０５ないし１である。]
に対応し得る。
ＲがＡＡにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン群であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記デキストランは、中性ｐＨにて両親媒性である。
一の態様において、アルカリ金属カチオンはＮａ＋である。
一の態様において、Ｆは、エステル、カーボネート、カルバメート又はエーテルのいずれかである。
【００４０】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、式ＩＶ：
で表されるカルボキシメチレートデキストラン又は対応する酸である。
一の態様において、本発明に係る多糖類は、式Ｖ：
で表されるデキストランのモノコハク酸エステル又は対応する酸である。
【００４１】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、Ｒ基が下記の基：
又はそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【００４２】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、疎水性アミノ酸が、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミン、及びそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【００４３】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、トリプトファン誘導体が、上記定義された式ＩＩで表されるトリプトファンエステルより選択されることを特徴とする。
【００４４】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、式ＶＩ：
で表されるトリプトファン変性されたカルボキシメチレートデキストランである。
【００４５】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、式ＶＩＩ：
で表されるトリプトファン変性されたモノコハク酸エステルである。
【００４６】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、疎水性アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン、及びそれらのアルコール、アミド又は脱カルボキシル誘導体より選択されることを特徴とする。
【００４７】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン誘導体が、式ＶＩＩＩ：
（式中、Ｅは、上記定義されたとおりである。）
で表されるこれらアミノ酸のエステルより選択されることを特徴とする。
【００４８】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、疎水性アミノ酸が、フェニルアラニン、又はそのアルコール、アミド又は脱カルボキシル誘導体であることを特徴とする。
【００４９】
デキストランは、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、デキストランは、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、デキストランは、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【００５０】
一の態様において、多糖類は、仏国特許出願第０８／０５５０６号明細書に記載されるもののような、少なくとも１つがＡｈで表される疎水性アルコール誘導体により置換されたカルボキシル官能基を含む多糖類群より選択され：
前記疎水性アルコール（Ａｈ）は、カップリングアームＲによりアニオン性多糖類にグラフトされているか又は結合されており、前記カップリングアームは、官能基Ｆ’によりアニオン性多糖類に結合しており、前記官能基Ｆ’はリンカーアームＲのアミン官能基と、アニオン性多糖類のカルボキシル官能基との間のカップリング由来のものであり、前記カップリングアームは、カップリングアームのカルボキシル官能基、イソシアネート官能基、チオ酸又はアルコール官能基と、疎水性アルコールの官能基との間のカップリング由来の官能基Ｇによって疎水性アルコールに結合しており、アニオン性多糖類の未置換のカルボキシル官能基は、カルボン酸カチオンの形態にあり、該カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
Ｆ’は、アミド官能基を表し、
Ｇは、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基又はカルバメート官能基のいずれかを表し、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、所望によりＯ、Ｎ及び／又はＳのようなヘテロ原子を１つ以上含有し、且つ少なくとも１つの酸官能基を有する所望により枝分れ状の及び／又は不飽和鎖を表し、
Ａｈは、疎水性アルコールのヒドロキシル官能基と、Ｒ基により保有される少なくとも１つの求電子性官能基との間のカップリングから生じる、疎水性アルコールの残基を表し、
カルボキシル官能基を含有する前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。
【００５１】
疎水性アルコールによって部分的に置換されたカルボキシル官能基を含有する多糖類は、一般式ＩＸ：
［式中、
ｑは、多糖類のＦ−Ｒ−Ｇ−Ａｈで置換されたカルボキシル官能基のモル分率であって、０．０１ないし０．７であり、
Ｆ’、Ｒ、Ｇ及びＡｈは上記定義に対応し、そして多糖類のカルボキシル官能基がＦ’−Ｒ−Ｇ−Ａｈによって置換されていない場合、多糖類のカルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン群であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンを表す。］
で表されるカルボキシル官能基を含有する多糖類より選択される。
一の態様において、カルボキシル官能基を含有する多糖類は、カルボキシル官能基を本来保有する多糖類であって、アルギン酸、ヒアルロナン及びガラクツロナンより選択される。
【００５２】
一の態様において、一般式Ｘ：
［式中、
天然多糖類は、大部分が（１，６）及び／又は（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合によって成る多糖類群より選択され、
Ｌは、リンカーアームＱと、多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来の結合部であって、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基又はエーテル官能基のいずれかを表し、
ｒは、多糖類の糖単位当りの置換基Ｌ−Ｑのモル分率を表し、
Ｑは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのようなヘテロ原子を１つ以上含有し、且つ少なくとも１つのカルボキシル官能基−ＣＯ２Ｈを有する所望により枝分れ状及び／又は不飽和鎖を表す。］
で表されるカルボキシル官能基を含有する多糖類は、カルボキシル官能基を本来含有する多糖類から、又は１００の糖単位当り少なくとも１５のカルボキシル官能基がグラフトされた中性多糖類から得られる合成多糖類である。
【００５３】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成る多糖類は、デキストランである。
【００５４】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成る多糖類は、プルラン、アルギン酸、ヒアルロナン、キシラン、ガラクツロナン及び水溶性セルロースからなる群より選択される。
一の態様において、多糖類はプルランである。
一の態様において、多糖類はアルギン酸である。
一の態様において、多糖類はヒアルロナンである。
一の態様において、多糖類はキシランである。
一の態様において、多糖類はガラクツロナンである。
一の態様において、多糖類は水溶性セルロースである。
【００５５】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、カードランである。
【００５６】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、イヌリンである。
【００５７】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、グルカンである。
【００５８】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、マンナンである。
【００５９】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、Ｑ基が以下の基：
より選択されることを特徴とする。
【００６０】
一の態様において、ｒは０．１ないし２である。
一の態様において、ｒは０．２ないし１．５である。
【００６１】
一の態様において、本発明に係るＲ基は、アミノ酸より選択されることを特徴とする。
一の態様において、アミノ酸は、α−アミノ酸より選択される。
一の態様において、α−アミノ酸は、天然のα−アミノ酸より選択される。
一の態様において、天然のα−アミノ酸は、ロイシン、アラニン、イソロイシン、グリシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンより選択される。
【００６２】
一の態様において、疎水性アルコールは、脂肪アルコールより選択される。
一の態様において、疎水性アルコールは、４ないし１８の炭素原子を含有する不飽和又は飽和アルキル鎖から成るアルコールより選択される。
一の態様において、脂肪アルコールは、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ブチルアルコール、オレイルアルコール及びラノリンより選択される。
一の態様において、疎水性アルコールは、コレステロール誘導体より選択される。
一の態様において、コレステロール誘導体は、コレステロールである。
一の態様において、疎水性アルコールＡｈは、トコフェロールより選択される。
一の態様において、トコフェロールは、α−トコフェロールである。
一の態様において、α−トコフェロールは、α−トコフェロールのラセミ混合物である。
一の態様において、疎水性アルコールは、アリール基を有するアルコールより選択される。
一の態様において、アリール基を有するアルコールは、ベンジルアルコール及びフェネチルアルコールより選択される。
【００６３】
多糖類は、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、多糖類は、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、多糖類は、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【００６４】
一の態様において、前記組成物は、凍結乾燥物の形態にある。
【００６５】
一の態様において、可溶性の少なくとも２価のカチオン塩は、カルシウム、マグネシウム又は亜鉛カチオンより選択される可溶性の２価のカチオン塩である。
一の態様において、可溶性の少なくとも２価のカチオン塩は、可溶性のカルシウム塩である。
用語“可溶性の少なくとも２価のカチオン塩”とは、溶解度が、５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上である塩を意味する。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩はカルシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩はマグネシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩は亜鉛塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩は、塩化カルシウムである。
一の態様において、可溶性のカチオン塩は、可溶性の多価カチオン塩である。
用語“多価カチオン”とは、鉄、アルミニウムのような２以上の正電荷を保有する種、ポリリシン、スペルミン、プロタミン又はフィブリンのようなカチオン性ポリマーを意味する。
【００６６】
用語“骨形成成長因子”、又は“ＢＭＰ”は、単独で、又は組み合せて、治療効果のあるＢＭＰ群より選択されるＢＭＰ（骨形成タンパク質）を意味する。
より特に、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択される。
一の態様において、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）である。
一の態様において、骨形成タンパク質は、ＧＤＦ−５である。
使用されるＢＭＰは、当業者に既知の技術に従い得られるか、或いは、例えば、リサーチ ダイアグノスチック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．）（ＵＳＡ）のような供給者から購入される、組換え体ヒトＢＭＰである。
【００６７】
一の態様において、ヒドロゲルは、移植直前に製造され得る。
一の態様において、ヒドロゲルは、予備充填されたシリンジ中で製造され且つ保管されて、その後に移植され得る。
一の態様において、ヒドロゲルは、移植直前に凍結乾燥物の再水和によって製造され得るか、又は脱水形態で移植され得る。
凍結乾燥は組成物を脱水させ得る水昇華技術であり、この技術はタンパク質の貯蔵及び安定化に普通使用される。
凍結乾燥物の再水和は非常に迅速であり、すぐ使用できる製剤をたやすく得ることができるので、移植前に前記製剤を再水和することを可能にし、或いは、体液と接触することによって移植後に再水和が生じるその脱水形態で移植される。
【００６８】
さらには、他のタンパク質、特に、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ又はＦＧＦのような血管形成成長因子を、骨形成成長因子に添加することが可能である。
本発明はそれ故、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦからなる群より選択される血管形成成長因子をさらに含有することを特徴とする、本発明に係る組成物に関する。
【００６９】
本発明に係る骨形成組成物は、例えば、骨欠損を充填するために、脊椎融合又は顎顔面の復元を行うために、或いは、骨折連結（偽関節）の欠損を治療するために、移植により使用される。
【００７０】
これら種々の治療用途において、マトリックスの寸法及び骨形成成長因子の量は、充填される部位の容量に依存する。
一の態様において、アニオン性多糖類の溶液は、０．１ｍｇ／ｍＬないし１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬないし７５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５ないし５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
一の態様において、脊椎用インプラントについては、骨形成成長因子の投与量は、０．０５ｍｇないし８ｍｇであり、好ましくは０．１ｍｇないし４ｍｇであり、より好ましくは０．１ｍｇないし２ｍｇであるが、文献において通常許容される投与量は、８ないし１２ｍｇである。
一の態様において、脊椎用インプラントについては、血管形成成長因子の投与量は、０．０５ｍｇないし８ｍｇであり、好ましくは０．１ｍｇないし４ｍｇであり、より好ましくは０．１ｍｇないし２ｍｇである。
顎顔面の復元における、又は偽関節治療における用途に関し、例えば、投与量は１ｍｇ未満である。
【００７１】
一の態様において、２価カチオンの溶液は、０．０１ないし１Ｍ、好ましくは０．０５ないし０．２Ｍの濃度を有する。
【００７２】
一の態様において、アニオン性多糖類の溶液は、０．１ｍｇ／ｍＬないし１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬないし７５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５ないし５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
【００７３】
本発明はまた、少なくとも、下記の段階：
ａ）骨形成成長因子／アニオン性多糖類複合体を含有する溶液、並びに有機マトリックス及び／又はヒドロゲルを生成する段階、
ｂ）前記複合体を含有する溶液を、前記有機マトリックス及び／又はヒドロゲルに添加し、所望により該混合物を均質化する段階、
ｃ）可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液を、ｂ）において得られたインプラントに添加する段階、
ｄ）所望により、ｃ）段階において得られたインプラントの凍結乾燥を行う段階
を含有する、本発明のインプラントの製造方法にも関する。
【００７４】
本発明はまた、少なくとも下記の段階：
ａ）骨形成成長因子／両親媒性アニオン性多糖類複合体を含有する溶液、並びに有機マトリックス及び／又はヒドロゲルを生成する段階、
ｂ）可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液を、ａ）の前記有機マトリックス及び／又はヒドロゲルに添加する段階、
ｃ）前記成長因子を含有する溶液を、ｂ）で得られた前記有機マトリックス及び／又はヒドロゲルに添加し、そして所望により該混合物を均質化する段階、
ｄ）所望により、ｃ）段階において得られたインプラントの凍結乾燥を行う段階
を含む、本発明のインプラントの製造方法にも関する。
【００７５】
一の態様において、有機マトリックスは、架橋されたヒドロゲル及び／又はコラーゲンからなるマトリックスである。
一の態様において、前記マトリックスは、滅菌された、好ましくは架橋された、精製された天然コラーゲンを基剤としたマトリックスより選択される。
一の態様において、ａ）段階において架橋されていても又は架橋されていなくとも良いヒドロゲル形成ポリマーは、エチレングリコール／乳酸コポリマー、エチレングリコール／グリコール酸コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸からなる合成ポリマー群より選択される。
一の態様において、ａ）段階において架橋されていても又は架橋されていなくとも良いヒドロゲル形成ポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン及びフィブリン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなる天然ポリマー群より選択される。
一の態様において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、プルラン、キサンタン、カラギーナン、キトサン及びコンドロイチン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択される。
一の態様において、ａ）段階において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸及びアルギン酸、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択される。
【００７６】
一の態様において、ｂ）又はｃ）段階における可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液は、２価のカチオン溶液である。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩はカルシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩は、塩化カルシウムである。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩はマグネシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩は亜鉛塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択され。
一の態様において、ｂ）又はｃ）段階において、可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液は、多価カチオン溶液である。
一の態様において、多価カチオンは、鉄、アルミニウム、及びポリリシン、スペルミン、プロタミン又はフィブリンのようなカチオン性ポリマーより選択される多価カチオンである。
一の態様において、ａ）段階において、骨形成成長因子以外の溶液がさらに提供される。
【００７７】
本発明はまた、骨インプラントとしての本発明の組成物の使用にも関する。
一の態様において、前記組成物は、脊椎補綴又はケージ型の脊椎融合の人工器官と組み合せて使用され得る。
本発明はまた、骨の復元における前記組成物を用いた治療方法及び外科的方法にも関する。
【００７８】
本発明は、以下の実施例により例示される。
【実施例】
【００７９】
実施例１：Ｌ−トリプトファンのナトリウム塩により変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランの製造
ポリマー１は、仏国特許出願第０７．０２３１６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの重量平均分子量、即ち、１５４の重合度を有するデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）から得られたＬ−トリプトファンのナトリウム塩により変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランである。トリプトファンにより変性されていても、又はいなくともよいナトリウムカルボキシメチレート誘導体のモル分率、即ち、式Ｉ中のｔは、１．０３である。トリプトファンにより変性されたナトリウムカルボキシメチレート誘導体のモル分率、即ち式ＩＩＩ中のｐは、０．３６である。
【００８０】
実施例２：Ｌ−トリプトファンのエチルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランの製造
ポリマー２は、仏国特許出願第０７．０２３１６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの重量平均分子量、即ち、１５４の重合度を有するデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）から得られたＬ−トリプトファンのエチルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランである。トリプトファンのエチルエステルにより変性されていても、又はいなくともよいナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち、式ＩＩＩ中のｔは、１．０７である。トリプトファンのエチルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち式ＩＩＩ中のｐは、０．４９である。
【００８１】
実施例３：Ｌ−グリシンのデシルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランの製造
ポリマー３は、仏国特許出願第０８．０５５０６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの重量平均分子量、即ち、１５４の重合度を有するデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）から得られたＬ−グリシンのデシルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランである。Ｌ−グリシンのデシルエステルにより変性されていても、又はいなくともよいナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち、式Ｘ中のｒは、１．０４である。Ｌ−グリシンのデシルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち式ＩＸ中のｑは、０．０９である。
【００８２】
実施例４：Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランの製造
ポリマー４は、特許出願仏国第０８．０５５０６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの重量平均分子量、即ち、１５４の重合度を有するデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）から得られたＬ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランである。Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されていても、又はいなくともよいナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち、式Ｘ中のｒは、１．０７である。Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち式ＩＸ中のｑは、０．０８である。
【００８３】
実施例５：ｒｈＧＤＦ−５／ポリマー３複合体の製造
製剤１：５ｍＭ ＨＣｌ中の２．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液５０μＬを、６１．１ｍｇ／ｍＬのポリマー３溶液５０μＬと混合した。ポリマー溶液を、２０ｍＭホスフェート（ｐＨ７．２）により緩衝した。ＧＤＦ−５／ポリマー３複合体の溶液は、ｐＨ６．４であり、そして、１０ｍＭホスフェートを含有していた。ＧＤＦ−５／ポリマー３のモル比は１／２０であった。この溶液を、最終的に０．２２μｍで濾過した。最終溶液は清澄であり、動的光散乱により特徴付けた。対象物の大部分は、１０ｎｍ未満の寸法を示した。
【００８４】
実施例６：ｒｈＧＤＦ−５／ポリマー４複合体の製造
製剤２：１０ｍＭ ＨＣｌ中の３．７ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液６７９μＬを、４２．３ｍｇ／ｍＬのポリマー４溶液１８２１μＬ（ｐＨ７．３）と混合した。ＧＤＦ−５／ポリマー４複合体の溶液は、ｐＨ６．５であり、そして、１ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５及び３０．８ｍｇ／ｍＬのポリマー４を含有していた。ＧＤＦ−５／ポリマー４のモル比は１／２０であった。この溶液を、最終的に０．２２μｍで濾過した。最終溶液は清澄であり、動的光散乱により特徴付けた。対象物の大部分は、１０ｎｍ未満の寸法を示した。
【００８５】
実施例７：
コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２インプラントの製造
インプラント１：０．０５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液４０μＬを、ヘリシュタット（Ｈｅｌｉｓｔａｔ）型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ニュージャージー）中に無菌的に導入した。コラーゲンスポンジ中で溶液を３０分間インキュベートした後に使用した。ＢＭＰ−２の投与量は２μｇであった。
インプラント２：０．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液４０μＬを用いて、インプラント１と同様に製造した。ＢＭＰ−２の投与量は２０μｇであった。
【００８６】
実施例８：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体の製造
製剤３：０．１５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液５０μＬを、３７．５ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液１００μＬと混合した。ｒｈＢＭＰ−２とポリマー１の溶液を、ｐＨ７．４にて緩衝した。該溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍで無菌的に濾過した。
製剤４：１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液５０μＬを、３７．５ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液１００μＬと混合することにより、製剤３と同様に製造した。
【００８７】
実施例９：凍結乾燥された、塩化カルシウムの存在中のコラーゲンスポンジ／ＢＭＰ−２／ポリマー１複合体のインプラントの製造
インプラント３：４０μＬの製剤４を、ヘリシュタット型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ニュージャージー）中に導入した。溶液をコラーゲンスポンジ中で３０分間インキュベートした後、１８．３ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウム溶液１００μＬを添加した。１５分後に、スポンジは使用できる状態となった。ＢＭＰ−２の投与量は、２０μｇであった。
【００８８】
実施例１０：凍結乾燥された、塩化カルシウムの存在中のコラーゲンスポンジ／ＢＭＰ−２／ポリマー１複合体のインプラントの製造
インプラント４：４０μＬの製剤３を、ヘリシュタット型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ニュージャージー）中に導入した。溶液をコラーゲンスポンジ中で３０分間インキュベートした後、１８．３ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウム溶液１００μＬを添加した。スポンジをその後、凍結し、且つ無菌的に凍結乾燥した。ＢＭＰ−２の投与量は２μｇであった。
インプラント５：４０μＬの製剤４を用いて、インプラント４と同様に製造した。ＢＭＰ−２の投与量は２０μｇであった。
【００８９】
実施例１１：種々の製剤の骨誘導性能の評価
本実験の目的は、ラットにおける異所性の骨形成モデルにおける種々の製剤の骨誘導性能を示すことである。体重１５０ないし２５０ｇの雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ＯＦＡ−ＳＤ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｆｒａｎｃｅ，Ｂ．ｐ．１０９，６９５９２ Ｉ‘Ａｒｂｒｅｓｌｅ）をこの実験のために使用した。
鎮痛剤処理を施した後にブプレノルフィン（テムゲシック（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ）（登録商標），ファイザー株式会社，フランス国）、外科的手段を行った。Ｏ２−イソフルラン混合物（１−４％）の吸入により、ラットを麻酔した。広い背中部を刈ることによって毛皮を除去した。この背面部の皮膚を、ポビドン−ヨウ素溶液（ベテジン（Ｖｅｔｅｄｉｎｅ）（登録商標）溶液，Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ，フランス）を用いて消毒した。
右及び左の背面部の傍脊椎筋を剥き出しにするために、およそ１ｃｍの傍脊椎切開を行った。トランス筋膜切開（ｔｒａｎｓｆａｓｃｉａｌ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）によって筋肉に到達した。各々のインプラントを、圧迫がそこに生じ得ないような方法で、窪みに置いた。ラット１匹当り４つのインプラントを移植した（１部位当り２つのインプラント）。その後、ポリプロピレン糸（プロレン４／０（Ｐｒｏｌｅｎｅ４／０），Ｅｔｈｉｃｏｎ，フランス）を用いてインプラントの開口を縫合した。非吸収性縫合糸を用いて皮膚を再び閉じた。その後、ラットをそれぞれのケージに戻し、それらの回復の間、観察し続けた。
２１日目に、チレタミン−ゾラゼパム（ゾレチル（ＺＯＬＥＴＩＬ）（登録商標）２５−５０ｍｇ／ｋｇ，ＩＭ，ＶＩＲＢＡＣ，フランス）の注射によって、ラットを麻酔した。
その後、ペントバルビタール（ドレタール（ＤＯＬＥＴＨＡＬ）（登録商標），ベトキノール（ＶＥＴＯＱＵＩＮＯＬ），フランス）の投与量を注射することによって、ラットを安楽死させた。その後、各々の部位の肉眼観察を行い、；局所的な過敏症（炎症、壊死、出血）のいずれかの兆候、及び、骨及び／又は軟骨組織の存在をも記録し、そして以下のスケールに従い、等級分けした。 ０：なし，１：微弱，２：並み ３：著しい，４：相当。
各々インプラントをその移植部位から除去し、肉眼写真を撮った。その後、インプラントの寸法及び質量を決定した。その後、各々のインプラントを、緩衝した１０％ホルモル溶液中に保存した。
【００９０】
結果：
この生体内実験は、ラット背面部の筋肉にインプラントを置いたことにより、ＢＭＰ−２の骨誘導効果を測定することを可能にしている。
移植片の肉眼観察によって、骨組織の存在及びインプラントの質量を評価することが可能である。
【００９１】
コラーゲンスポンジ中のＢＭＰ−２の２μｇの投与量（インプラント１）は、２１日後にコラーゲンインプラントを見出すことができるほどの十分な骨誘導性能を有していなかった。
コラーゲンスポンジ中のＢＭＰ−２の２０μｇの投与量（インプラント２）によって、２１日後に３８ｍｇの平均質量を有する骨化されたインプラントが得られた。
ＢＭＰ−２の同様の２０μｇの投与量について、コラーゲンスポンジ中のＣａＣｌ２溶液の存在中のＢＭＰ−２／ポリマー１複合体（インプラント３）は、ＢＭＰ−２の骨形成活性を向上させることができた。インプラント３の平均質量は、インプラント２のそれよりもおよそ３倍大きかった。
コラーゲンスポンジ中で凍結乾燥された、ＣａＣｌ２の存在中のポリマー１との複合体の形態における２０μｇのＢＭＰ−２を含有するインプラント（インプラント５）の平均質量は、ＣａＣｌ２の存在中のＢＭＰ−２／ポリマー１複合体が溶液中であるインプラントのそれの２倍であったので、凍結乾燥は、骨形成活性の上記の向上を増幅することができた。
１０倍低いＢＭＰ−２の投与量については、コラーゲンスポンジ中で凍結乾燥された、ＣａＣｌ２の存在中のＢＭＰ−２複合体（インプラント４）によって、２倍の質量を有し、ＢＭＰ−２単独のものに等しい骨スコアを有する骨化されたインプラントを生じさせることができた。この新規製剤は、ＢＭＰ−２投与量を大きく低減させると同時に、かかるタンパク質の骨形成活性を維持することを可能にした。
【００９２】
実施例１２：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有する製剤の製造
製剤５：１．３５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液５５２μＬを、６０．０ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液６１９μＬと混合した。製剤５の容量を、滅菌水を添加することにより１３００μＬとした。この溶液を、４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍで無菌的に濾過した。製剤５中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．５７１ｍｇ／ｍＬであり、そしてポリマー１のそれは２８．６ｍｇ／ｍＬであった。
製剤６：１．４７ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液１７５μＬと、６０．０ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液１２２４μＬとを混合することにより、製剤５と同様に製造した。滅菌水を添加することにより、製剤６の容量を１８００μＬとした。製剤６中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．１４ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは４０．８ｍｇ／ｍＬであった。
製剤７：１．４６ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液２６．５μＬを、６０．０ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液３２１．７μＬと混合することにより、製剤５と同様に製造した。製剤の容量を、滅菌水を添加することにより７７２μＬとした。製剤７中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．０５ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは２５ｍｇ／ｍＬであった。
【００９３】
実施例１３：塩化カルシウムを含有するヒアルロン酸ナトリウムゲルの製造
ゲル１：滅菌水１０．６２ｍＬを、５０ｍＬファルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅ）に入れた。０．４４ｇのヒアルロン酸ナトリウム（ファルマ グレード８０（Ｐｈａｒｍａ ｇｒａｄｅ），紀文フードケミファ社）を、ボルテックスにて激しく攪拌しながら添加した。その後、さらに攪拌しながら、０．１４ｇの塩化カルシウムをヒアルロン酸ナトリウムゲルに添加した。ゲル中の塩化カルシウムの濃度は１３．１ｍｇ／ｍＬであった。
【００９４】
実施例１４：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するヒアルロン酸ナトリウムゲルの製造
ゲル２：１２３０μＬの製剤５を、１０ｍＬ滅菌シリンジ中に移した。１３．１ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウムを含有する４％ヒアルロン酸ナトリウムゲル１の５．８ｍＬを、１０ｍＬ滅菌シリンジに移した。２つのシリンジを併せることによって、製剤５の溶液を、ゲル１に添加し、そして、一方のシリンジから他方へと数回通すことによって、得られたゲルを均質化した。得られた不透明色のゲルを、５０ｍＬファルコンチューブに移した。ゲル２中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．１０ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは５．０ｍｇ／ｍＬであった。
２００μＬのゲル２を、移植部位に注入した。移植されたｒｈＢＭＰ−２の投与量は、２０μｇであった。
【００９５】
実施例１５：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するヒアルロン酸ナトリウムゲルの製造
ゲル３：このゲルは、製剤６の１６９７μＬ及び１５．８ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウムを含有する４％ヒアルロン酸ナトリウムゲルの８ｍＬを用いて、実施例１３に記載されるとおりに製造された。ゲル３中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．０２５ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは７．１４ｍｇ／ｍＬであった。
２００μＬのゲル３を、移植部位に注入した。移植されたｒｈＢＭＰ−２の投与量は、５μｇであった。
【００９６】
実施例１６：
ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するアルギン酸ナトリウムゲルの製造
ゲル４：このゲルは、製剤７の７７２μＬ及び４０ｍｇ／ｍＬのアルギン酸ナトリウムゲルの３８６μＬを用いて製造された。４５．５ｍｇ／ｍＬの塩化カルシウム溶液の４０μＬを、ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有するアルギン酸ナトリウムゲルの６０μＬに添加した。ゲル４中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．０２ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは１０．０ｍｇ／ｍＬであった。
１００μＬのゲル４を移植部位に注入した。移植されたｒｈＢＭＰ−２の投与量は２μｇであった。
【００９７】
実施例１７：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するアルギン酸ナトリウムゲルを含有するコラーゲンインプラントの製造
インプラント６：ゲル５を、製剤７の６４５μＬ及び４０ｍｇ／ｍＬのアルギン酸ナトリウムゲルの３２３μＬを用いて製造した。ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有するアルギン酸ナトリウムゲルの６０μＬを、ヘリシュタット型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ニュージャージー）中に添加した。４５．５ｍｇ／ｍＬの塩化カルシウム溶液の４０μＬをも、このスポンジに添加した。３０分間の接触時間の後、スポンジを凍結し、そして凍結乾燥した。このスポンジを、ラットに直接に移植した。
インプラント１中のｒｈＢＭＰ−２の投与量は２μｇであり、ポリマー１のそれは１ｍｇであった。
【００９８】
実施例１８：種々の製剤の骨誘導性能の評価
骨誘導性能を、実施例１１に記載のプロトコルに従い評価した。
結果：
この生体外実験は、ラット背面部の筋肉に置いたｒｈＢＭＰ−２の骨形成効果を測定することを可能にしている。この骨でない部位を、異所性であるという。種々の実験結果を以下の表に概略する。
【００９９】
コラーゲンスポンジ中のｒｈＢＭＰ−２の２μｇの投与量（インプラント１）は、２１日後に外植片を見出すことができるほどの十分な骨誘導性能を有していなかった。
コラーゲンスポンジ中のＢＭＰ−２の２０μｇの投与量（インプラント２）によって、２１日後に３８ｍｇの平均質量を有する骨化された外植片が得られた。
２０μｇの同じＢＭＰ−２投与量について、塩化カルシウムの存在下でｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有するヒアルロン酸ナトリウムゲル（ゲル２）は、ｒｈＢＭＰ−２の骨形成活性を高めることができた。ゲル２を用いて得られた外植片の平均質量は、ｒｈＢＭＰ−２を単独で２０μｇ含有するコラーゲンインプラント（インプラント８）を用いて得られた外植片のそれよりも、およそ６倍大きかった、
４倍低いｒｈＢＭＰ−２、即ち５μｇのｒｈＢＭＰ−２投与量については、ヒアルロン酸ナトリウムゲル（ゲル３）中のＣａＣｌ２の存在下のｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体は、９倍大きい質量を有し、ｒｈＢＭＰ−２を単独で２０μｇ含有するコラーゲンインプラント（インプラント８）を用いて得られた外植片と同等の骨スコアを有する骨化外植片を生じさせることができた。この新規製剤は、ＢＭＰ−２投与量を大きく低減させると同時に、かかるタンパク質の骨形成活性を維持することを可能にした。
１０倍低いｒｈＢＭＰ−２投与量については、塩化カルシウムを含有するアルギン酸ナトリウムゲル（ゲル４）中のｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体は、ｒｈＢＭＰ−２を単独で２０μｇ含有するコラーゲンインプラント（インプラント８）を用いて得られたものよりも、僅かに大きい質量を有する外植片を生じることを可能にした。この新規製剤は、ｒｈＢＭＰ−２投与量を大きく低減させると同時に、かかるタンパク質の骨形成活性を維持することを可能にした。
ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有するアルギン酸ゲルはまた、骨細胞の成長の支持体として補助するコラーゲンスポンジに配置し得る。この場合にまた、２μｇのｒｈＢＭＰ−２（インプラント６）が、ｒｈＢＭＰ−２を単独で２０μｇ含有するコラーゲンインプラント（インプラント８）を用いて得られたものよりも大きい質量を有する骨化外植片を得ることを可能にした。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成製剤の分野に、より特に、骨形成タンパク質であるＢＭＰファミリーに属する骨形成タンパク質の製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形成誘発の機構に伴う成長因子である。ＢＭＰは骨形成タンパク質（ＯＰ）としても知られており、１９６５年にＵｒｉｓｔにより最初に特定された（非特許文献１）。皮質骨から単離されるこれらタンパク質は、多種の動物の骨形成を誘発し得る（非特許文献１）。
【０００３】
ＢＭＰは、翻訳後成熟の後に１０４ないし１３９残基の長さを有するプロペプチドの形態で発現する。それらは互いに非常に相同性の配列を有しており、且つ類似の三次元構造を有している。特に、それらは、所謂“システイン集団（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｋｎｏｔ）”を形成する分子内ジスルフィド架橋に包含される６個のシステイン残基を有している（非特許文献２及び３）。ＢＭＰのうちの数種は、ダイマーの形成に関与する分子間ジスルフィド架橋に包含される７番目のシステインを有している（非特許文献２）。
【０００４】
それらの活性形態において、ＢＭＰは、Ｉｓｒａｅｌ等により記載されるように、ホモダイマーとして及びヘテロダイマーとしてさえ会合する（非特許文献４）。ダイマー状ＢＭＰは、ＢＭＰＲ型の膜透過受容体と相互作用する（非特許文献５）。この認識は、特にＳｍａｄタンパク質を含有する一連の細胞内シグナル伝達を引き起こし、このことが標的遺伝子の活性化又は抑制化を誘発する。
【０００５】
ＢＭＰ１及び３を除いて、ＢＭＰは、間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）を分化させるのに直接的な且つ間接的な役割を果しており、このことが骨芽細胞へのその分化を誘発する（非特許文献６）。それらはまた、走化性の特性を有し、且つ増殖及び分化を誘発する。
【０００６】
幾種かのヒト組換体ＢＭＰ、特にｒｈＢＭＰ−２及びｒｈＢＭＰ−７は、ヒトの生体内での骨形成を誘発する能力を明らかに示しており、そして幾つかの医療用途のため承認されている。このように、ヒト組換体ＢＭＰ−２、即ち国際的な一般名に従うとジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ ａｌｆａ）は、米国ではインフーズ（ＩｎＦｕｓｅ）（登録商標）、そして欧州ではインダクトＯｓ（ＩｎｄｕｃｔＯｓ）（登録商標）の名称で販売される製品中に配合されている。この製品は、腰椎融合に対して、及び“非結合”骨折に対する脛骨の骨再生に対して処方される。腰椎の融合のためのインフーズの場合、外科的処置はまず第一に、ｒｈＢＭＰ−２溶液中にコラーゲンスポンジを浸し、その後、腰椎間に前もって移植された中空ケージ（ＬＴケージ）にそのスポンジを置くことからなる。
【０００７】
ヒト組換体ＢＭＰ−７、即ち国際的な一般名に従うとエプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ ａｌｆａ）は、ＢＭＰ−２と同じ治療指標を有し、２つの製品、即ち脛骨の開裂骨折に対するＯＰ−１インプラント（ＯＰ−１Ｉｍｐｌａｎｔ）及び腰椎融合に対するＯＰ−１パテ（ＯＰ−１Ｐｕｔｔｙ）の基盤を形成している。ＯＰ−１インプラントは、ｒｈＢＭＰ−７及び０．９％生理的食塩水が吸収されるコラーゲンを含有する粉末からなる。得られたペーストはその後、外科的処置中に骨折部に適用される。ＯＰ−１パテは、一方がｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンを含み、他方がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む、２種類の粉末の形態にある。外科的処置中に、ＣＭＣの溶液は０．９％生理的食塩水によって再構成され、そしてｒｈＢＭＰ−７及びコラーゲンと混合される。得られたペーストは、治療部位に適用される。
【０００８】
特許文献１は、無機セラミックを含有する支持体（骨格）、該支持体に一体的に結合された固形メンブラン及び骨形成剤から成る骨形成誘発インプラントを記載している。前記支持体は、好ましくはコラーゲンスポンジである。前記無機セラミックは、カルシウム誘導体、好ましくは二相性のリン酸カルシウムのような水不溶性の無機マトリックスである（ｐ．２，[００２４]）。インプラントに一体的に結合された固形メンブランは、周囲の軟部組織からの細胞の進入を制限するために、そしてまた、炎症細胞の侵入を防止するために、不透過性でなければならない（ｐ．３，[００３０]）。インプラントへのこれら細胞の進入が骨成長の低下及び治療の失敗を引き起こすおそれがある、と記載されている（ｐ．１，[０００７]）。
この発明は、骨形成を改善するために、インプラントへのメンブランの添加を中心としている。
【０００９】
特許文献２は、脱塩された骨マトリックス（即ちＤＢＭ）、コラーゲン微粒子及び物理的に架橋された多糖類マトリックスを含有するシート形態の発明品を記載している。さらには、このインプラントは、成長因子のような骨形成物質を含有し得る。前記物理的に架橋された多糖類は、脱塩された骨の粒子に対する安定化剤として作用し（ｐ．３，[００２６]）、前記アルギネートを基剤とした多糖類は、塩化カルシウムの添加によって架橋される。
【００１０】
特許文献３は、物理的強度を有する生体適合性の骨形成複合体材料を記載している。著者等によれば、この骨形成誘発材料は脱塩された骨から成り、そのことが、脱塩された骨の存在、或いは脱塩された骨のタンパク質抽出物の存在、或いはこれら２つの成分の存在においてのみ骨形成誘発が生じることを可能にしている（ｐ．２，第２行ないし第５行）。カルシウム塩又は無機塩がこの材料に添加されている。無機塩は、場合により水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム又は水酸化マグネシウムであることが記載されている（ｐ．１７，第４行ないし第９行）。カルシウム塩は、可溶性塩であっても、又はそうでなくともよく（ｐ．１７，第２１行ないし第２１行）、好ましくは水酸化カルシウムである。添加される種々のカチオン、特にカルシウムの水酸化物の選択が、この環境におけるコラーゲン合成の向上に有利となるマトリックスのｐＨを上昇させる効果により、正当化される（ｐ．１５，第７行ないし第１１行）。
この発明は、インプラントの物理学的及び骨形成特性がインプラントのｐＨの上昇によって改良された、新規の脱塩された骨を基剤としたインプラントの形成を包含している。
【００１１】
さらには、複合体を安定化させる目的で、及び／又はその可溶性を高める目的で、及び／又はその活性を高める目的で、成長因子とポリマーとの間で複合体を形成させることが特に有利であることが示されている。
こうして、本出願人の名における特許出願である特許文献４において、ＢＭＰ−２と両親媒性ポリマーとの間の複合体の形成が、生理学的ｐＨにおいて比較的不溶性であるこの非常に疎水性のタンパク質の溶解性を高めることを特に可能としたことを示すことができた。
特許出願である特許文献４において、出願人はまた、疎水性置換基によって官能化されたデキストラン誘導体の存在下において、ＢＭＰ−２の生理学的活性の増加を示した。生体外において、このＢＭＰ−２複合体は、ＢＭＰ−２単独と比べて全て優れていることが判る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第２００８／０１４１９７号明細書
【特許文献２】米国特許第２００７／０２５４０４１号明細書
【特許文献３】国際公開第９６／３９２０３号明細書
【特許文献４】仏国特許第０７０５５３６号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｕｒｉｓｔ ＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６５；１５０，８９３
【非特許文献２】Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ Ｃ．２００４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；２８７，１０３
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｕｎｅｇｇｅｒ ＭＰ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３；２３１，４４５
【非特許文献４】Ｉｓｒａｅｌ ＤＩ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６，１３（３−４），２９１
【非特許文献５】Ｍｕｎｄｙ他 Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ２００４，２２（４），２３３
【非特許文献６】Ｃｈｅｎｇ Ｈ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００３，８５Ａ １５４４−１５５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、例えば、投与量を低減し得るために、これらＢＭＰ成長因子の有効性を改良し得る製剤を見出すことをが不可欠である。
これらタンパク質は一般に、数桁の大きさだけ生理学的投与量を超える投与量で使用されるために、この課題は多くの成長因子製剤で共通である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
成長因子含有のヒドロゲルへの可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液の添加により、前記成長因子の活性を改良することを可能にする成長因子製剤であって、前記可溶性の少なくとも２価のカチオン塩が前記成長因子の効果を高める成長因子製剤を見出したことは、出願人の功績である。
驚くことに、この新規製剤は、より少量の成長因子で同様の骨形成効果を生じ得る。
本発明は、少なくとも
・１種の骨形成成長因子／両親媒性アニオン性多糖類複合体、
・１種の可溶性の少なくとも２価のカチオン塩、及び
・１種の有機支持体
を含有する骨形成組成物から構成されるオープンインプラント（ｏｐｅｎ ｉｍｐｌａｎｔ）であって、前記有機支持体は脱塩された骨マトリックスを含んでいない、オープンインプラント、に関する。
【００１６】
用語“オープンインプラント”とは、インプラント周囲の組織との交換を制限又は規制し得るメンブランもシェルも含有していない、且つ、その構成について実質的に均質であるインプラントを意味する。
用語“脱塩された骨マトリックス”（即ちＤＢＭ）とは、脱塩された成分の大部分が無いが、成長因子を含有するコラーゲンタンパク質又はコラーゲンでないタンパク質を保持する自家骨の酸抽出によって得られるマトリックスを意味する。そのような脱塩された骨マトリックスはまた、カオトロピック剤を用いた抽出後に不活性形態で製造され得る。
用語“有機支持体”とは、有機マトリックス及び／又はヒドロゲルから成る支持体を意味する。
用語“有機マトリックス”とは、架橋されたヒドロゲル及び／又はコラーゲンから成るマトリックスを意味する。
【００１７】
有機マトリックスは、ポリマー鎖の化学的架橋によって得られるヒドロゲルである。鎖間共有結合が有機マトリックスを定義する。有機マトリックスを構成するのに使用され得るポリマーは、Ｈｙｄｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ，２００２，４３，３−１２）なる表題の、Ｈｏｆｆｍａｎによる概説に記載されている。
【００１８】
一の態様において、マトリックスは、滅菌され、架橋され、精製された天然コラーゲンを基剤としたマトリックスより選択される。
コラーゲンのような天然ポリマーは、細胞付着、移動及び分化を促進する細胞外マトリックス成分である。それらは、顕著に生体適合性であるという利点を有し、そして酵素消化機構によって分解される。コラーゲンを基剤としたマトリックスは、ウシ又はブタの腱又は骨から抽出される繊維状コラーゲンＩ型又はＩＶ型から得られる。これらコラーゲンはまず精製され、その後架橋され、そしてその後殺菌される。
【００１９】
本発明に従う有機支持体は、造形され、又は成形されるに十分な機械的特性を有する材料の形態に、或いは“パテ”の形態にあり得る材料を得るために、混合物として使用され得るか、或いは、コラーゲン又はヒドロゲルは結合剤の役割を果たす。
【００２０】
混合材料、例えば、コラーゲンと無機粒子とを組み合わせた、且つ強化された機械的特性を有する複合材料の形態に、或いは“パテ”の形態にあり得るマトリックスが使用され得るか、或いは、コラーゲンは結合剤の役割を果たす。
使用され得る無機材料は、主要な利点が骨の化学組成に非常に近い化学組成である、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ)、二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ)又は非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）のような、リン酸カルシウムを基剤としたセラミックを実質的に含有する。これら材料は、良好な機械的特性を有し、そして免疫学的に不活性である。これら材料は、粉末、顆粒又はブロックのような種々の形態であり得る。これらの材料は、それらの組成に応じて非常に種々の分解速度を有し；即ち、ヒドロキシアパタイトは非常にゆっくりと分解するが（数ヶ月）、リン酸三カルシウムはより迅速に分解する（数週間）。二相性のリン酸カルシウムは中間の吸収速度を有するために、この目的のために開発された。これらの無機材料は、主として骨誘導性として既知である。
【００２１】
用語“ヒドロゲル”とは、大量の水又は生理学的流動体を吸着し得るポリマーの親水性三次元網目構造を意味する（Ｐｅｐｐａｓ他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６）。そのようなヒドロゲルは、物理的相互作用から構成され、そしてそれ故、ポリマー鎖の化学的架橋によっては得られない。
【００２２】
これらのポリマーのうち、合成ポリマー及び天然ポリマーが見出され得る。ヒドロゲル形成多糖類は、例えば、Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｃｏｖｉｅｌｌｏ他，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２００７，１１９，５−２４）なる表題の文献に記載されている。
【００２３】
一の態様において、架橋されていても、又は架橋されていなくてもよいヒドロゲル形成ポリマーは、エチレングリコール／乳酸コポリマー、エチレングリコール／グリコール酸コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸である合成ポリマー群より選択される。
【００２４】
一の態様において、ヒドロゲル形成ポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、プルラン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン及びフィブリン、及び生物学的に許容され得るそれらの塩である天然ポリマー群より選択される。
【００２５】
一の態様において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、プルラン、キサンタン、カラギーナン、キトサン及びコンドロイチン、及び生物学的に許容され得るそれらの塩であるヒドロゲル形成多糖類群より選択される。
【００２６】
一の態様において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸及びアルギン酸、及び生物学的に許容され得るそれらの塩であるヒドロゲル形成多糖類群より選択される。
【００２７】
用語“両親媒性多糖類”とは、疎水性誘導体によって官能化された多糖類群より選択される多糖類を意味する。
【００２８】
これら多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から構成されている。それらは中性であり得る、即ち、酸官能基を保有していないか、或いはアニオン性であって且つ酸官能基を保有し得る。
それらは、少なくとも１つのトリプトファン誘導体（Ｔｒｐ）によって官能化されている。
・前記トリプトファン誘導体は、酸官能基によるカップリングによって多糖類にグラフトされているか又は結合されており、前記酸官能基が、アニオン性多糖類の酸官能基及び／又は官能基Ｆにより多糖類に結合しているリンカーアームＲによって保有されている酸官能基となることを可能にしており、前記官能基Ｆは、リンカーアームＲと、天然の又はアニオン性多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリングの結果であり、
Ｆは、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カルボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基であり、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ及び／又はＮのようなヘテロ原子を１つ以上含有し、且つ少なくとも１つの酸官能基を有する、所望により枝分れ状の及び／又は不飽和鎖であり、
・Ｔｒｐは、トリプトファンのアミンと、Ｒ基により保有されている少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有されている１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基である。
【００２９】
本発明に従うと、主として（１，４）、（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合を含有し、少なくとも１つのトリプトファン誘導体により官能化された多糖類は、下記の一般式Ｉ：
［式中、
多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合からなり、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性又はアニオン性多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１個以上のヘテロ原子を含有し、そして少なくとも１つの酸官能基を有する、所望により枝分れ状及び／又は不飽和鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファン誘導体のアミンと、Ｒ基により保有される少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有される少なくとも１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基を表し、
ｎは、Ｔｒｐ置換されたＲのモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｏは、Ｔｒｐ置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｉは、糖単位当りのＲ基により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし２であり、
ｊは、糖単位当りのアニオン性多糖類により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
（ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ＲがＴｒｐにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン（群）であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属のカチオンであり、
前記多糖類がアニオン性多糖類である場合、多糖類の１つ以上の酸官能基（群）がＴｒｐにより置換されておらず、その場合にそれ（それら）はカチオンにより塩化されており、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
に対応し得る。
【００３０】
一の態様において、Ｆは、エステル、カーボネート、カルバメート又はエーテル官能基を表す。
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）型のグリコシド結合からなる。
一の態様において、大部分が（１，４）型のグリコシド結合からなる多糖類は、プルラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キシラン、ガラクツロン酸及び水溶性セルロースからなる群より選択される。
一の態様において、多糖類はプルランである。
一の態様において、多糖類はアルギン酸である。
一の態様において、多糖類はヒアルロン酸である。
一の態様において、多糖類はキシランである。
一の態様において、多糖類はガラクツロン酸である。
一の態様において、多糖類は水溶性セルロースである。
【００３１】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、カードランである。
【００３２】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、イヌリンである。
【００３３】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、グルカンである。
【００３４】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、マンナンである。
【００３５】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、Ｒ基が下記の基：
又はそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【００３６】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、トリプトファン誘導体が、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミン及びそれらのアルカリ金属カチオン塩からなる群より選択されることを特徴とする。
一の態様において、本発明に係る多糖類は、トリプトファン誘導体が式ＩＩ：
[式中、
Ｅは、直鎖状の又は枝分れ状の（Ｃ１ないしＣ８）アルキル基；直鎖状の又は枝分れ状の（Ｃ６ないしＣ２０）アルキルアリール基又はアリールアルキル基であり得る基である。]
で表されるトリプトファンエステルより選択されることを特徴とする。
【００３７】
多糖類は、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、多糖類は、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【００３８】
一の態様において、多糖類は、仏国特許第０７／０２３１６号明細書に記載される、トリプトファン及びトリプトファン誘導体のような疎水性アミノ酸によって官能化されたデキストラン群より選択される。
【００３９】
本発明によれば、官能化されたデキストランは、下記の一般式ＩＩＩ
［式中、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有し、少なくとも１つの酸官能基を有する、所望により枝分れ状及び／又は不飽和鎖を表し、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性の又はアニオン性の多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
ＡＡは、アミノ酸のアミンと、Ｒ基により保有される酸との間のカップリングから生じる疎水性のＬ−又はＤ−アミノ酸残基を表し、
ｔは、グリコシド単位当りのＦ−Ｒ−［ＡＡ］ｎ置換基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ｐは、ＡＡにより置換されたＲ基のモル分率であって、０．０５ないし１である。]
に対応し得る。
ＲがＡＡにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン群であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記デキストランは、中性ｐＨにて両親媒性である。
一の態様において、アルカリ金属カチオンはＮａ＋である。
一の態様において、Ｆは、エステル、カーボネート、カルバメート又はエーテルのいずれかである。
【００４０】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、式ＩＶ：
で表されるカルボキシメチレートデキストラン又は対応する酸である。
一の態様において、本発明に係る多糖類は、式Ｖ：
で表されるデキストランのモノコハク酸エステル又は対応する酸である。
【００４１】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、Ｒ基が下記の基：
又はそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【００４２】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、疎水性アミノ酸が、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミン、及びそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
【００４３】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、トリプトファン誘導体が、上記定義された式ＩＩで表されるトリプトファンエステルより選択されることを特徴とする。
【００４４】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、式ＶＩ：
で表されるトリプトファン変性されたカルボキシメチレートデキストランである。
【００４５】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、式ＶＩＩ：
で表されるトリプトファン変性されたモノコハク酸エステルである。
【００４６】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、疎水性アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン、及びそれらのアルコール、アミド又は脱カルボキシル誘導体より選択されることを特徴とする。
【００４７】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン誘導体が、式ＶＩＩＩ：
（式中、Ｅは、上記定義されたとおりである。）
で表されるこれらアミノ酸のエステルより選択されることを特徴とする。
【００４８】
一の態様において、本発明に係るデキストランは、疎水性アミノ酸が、フェニルアラニン、又はそのアルコール、アミド又は脱カルボキシル誘導体であることを特徴とする。
【００４９】
デキストランは、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、デキストランは、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、デキストランは、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【００５０】
一の態様において、多糖類は、仏国特許出願第０８／０５５０６号明細書に記載されるもののような、少なくとも１つがＡｈで表される疎水性アルコール誘導体により置換されたカルボキシル官能基を含む多糖類群より選択され：
前記疎水性アルコール（Ａｈ）は、カップリングアームＲによりアニオン性多糖類にグラフトされているか又は結合されており、前記カップリングアームは、官能基Ｆ’によりアニオン性多糖類に結合しており、前記官能基Ｆ’はリンカーアームＲのアミン官能基と、アニオン性多糖類のカルボキシル官能基との間のカップリング由来のものであり、前記カップリングアームは、カップリングアームのカルボキシル官能基、イソシアネート官能基、チオ酸又はアルコール官能基と、疎水性アルコールの官能基との間のカップリング由来の官能基Ｇによって疎水性アルコールに結合しており、アニオン性多糖類の未置換のカルボキシル官能基は、カルボン酸カチオンの形態にあり、該カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
Ｆ’は、アミド官能基を表し、
Ｇは、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基又はカルバメート官能基のいずれかを表し、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、所望によりＯ、Ｎ及び／又はＳのようなヘテロ原子を１つ以上含有し、且つ少なくとも１つの酸官能基を有する所望により枝分れ状の及び／又は不飽和鎖を表し、
Ａｈは、疎水性アルコールのヒドロキシル官能基と、Ｒ基により保有される少なくとも１つの求電子性官能基との間のカップリングから生じる、疎水性アルコールの残基を表し、
カルボキシル官能基を含有する前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。
【００５１】
疎水性アルコールによって部分的に置換されたカルボキシル官能基を含有する多糖類は、一般式ＩＸ：
［式中、
ｑは、多糖類のＦ−Ｒ−Ｇ−Ａｈで置換されたカルボキシル官能基のモル分率であって、０．０１ないし０．７であり、
Ｆ’、Ｒ、Ｇ及びＡｈは上記定義に対応し、そして多糖類のカルボキシル官能基がＦ’−Ｒ−Ｇ−Ａｈによって置換されていない場合、多糖類のカルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン群であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンを表す。］
で表されるカルボキシル官能基を含有する多糖類より選択される。
一の態様において、カルボキシル官能基を含有する多糖類は、カルボキシル官能基を本来保有する多糖類であって、アルギン酸、ヒアルロナン及びガラクツロナンより選択される。
【００５２】
一の態様において、一般式Ｘ：
［式中、
天然多糖類は、大部分が（１，６）及び／又は（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合によって成る多糖類群より選択され、
Ｌは、リンカーアームＱと、多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来の結合部であって、エステル官能基、チオエステル官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基又はエーテル官能基のいずれかを表し、
ｒは、多糖類の糖単位当りの置換基Ｌ−Ｑのモル分率を表し、
Ｑは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのようなヘテロ原子を１つ以上含有し、且つ少なくとも１つのカルボキシル官能基−ＣＯ２Ｈを有する所望により枝分れ状及び／又は不飽和鎖を表す。］
で表されるカルボキシル官能基を含有する多糖類は、カルボキシル官能基を本来含有する多糖類から、又は１００の糖単位当り少なくとも１５のカルボキシル官能基がグラフトされた中性多糖類から得られる合成多糖類である。
【００５３】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成る多糖類は、デキストランである。
【００５４】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成る多糖類は、プルラン、アルギン酸、ヒアルロナン、キシラン、ガラクツロナン及び水溶性セルロースからなる群より選択される。
一の態様において、多糖類はプルランである。
一の態様において、多糖類はアルギン酸である。
一の態様において、多糖類はヒアルロナンである。
一の態様において、多糖類はキシランである。
一の態様において、多糖類はガラクツロナンである。
一の態様において、多糖類は水溶性セルロースである。
【００５５】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、カードランである。
【００５６】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、イヌリンである。
【００５７】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、グルカンである。
【００５８】
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る。
一の態様において、大部分が（１，４）及び（１，３）及び（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、マンナンである。
【００５９】
一の態様において、本発明に係る多糖類は、Ｑ基が以下の基：
より選択されることを特徴とする。
【００６０】
一の態様において、ｒは０．１ないし２である。
一の態様において、ｒは０．２ないし１．５である。
【００６１】
一の態様において、本発明に係るＲ基は、アミノ酸より選択されることを特徴とする。
一の態様において、アミノ酸は、α−アミノ酸より選択される。
一の態様において、α−アミノ酸は、天然のα−アミノ酸より選択される。
一の態様において、天然のα−アミノ酸は、ロイシン、アラニン、イソロイシン、グリシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンより選択される。
【００６２】
一の態様において、疎水性アルコールは、脂肪アルコールより選択される。
一の態様において、疎水性アルコールは、４ないし１８の炭素原子を含有する不飽和又は飽和アルキル鎖から成るアルコールより選択される。
一の態様において、脂肪アルコールは、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ブチルアルコール、オレイルアルコール及びラノリンより選択される。
一の態様において、疎水性アルコールは、コレステロール誘導体より選択される。
一の態様において、コレステロール誘導体は、コレステロールである。
一の態様において、疎水性アルコールＡｈは、トコフェロールより選択される。
一の態様において、トコフェロールは、α−トコフェロールである。
一の態様において、α−トコフェロールは、α−トコフェロールのラセミ混合物である。
一の態様において、疎水性アルコールは、アリール基を有するアルコールより選択される。
一の態様において、アリール基を有するアルコールは、ベンジルアルコール及びフェネチルアルコールより選択される。
【００６３】
多糖類は、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、多糖類は、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、多糖類は、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
【００６４】
一の態様において、前記組成物は、凍結乾燥物の形態にある。
【００６５】
一の態様において、可溶性の少なくとも２価のカチオン塩は、カルシウム、マグネシウム又は亜鉛カチオンより選択される可溶性の２価のカチオン塩である。
一の態様において、可溶性の少なくとも２価のカチオン塩は、可溶性のカルシウム塩である。
用語“可溶性の少なくとも２価のカチオン塩”とは、溶解度が、５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上である塩を意味する。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩はカルシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩はマグネシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩は亜鉛塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩は、塩化カルシウムである。
一の態様において、可溶性のカチオン塩は、可溶性の多価カチオン塩である。
用語“多価カチオン”とは、鉄、アルミニウムのような２以上の正電荷を保有する種、ポリリシン、スペルミン、プロタミン又はフィブリンのようなカチオン性ポリマーを意味する。
【００６６】
用語“骨形成成長因子”、又は“ＢＭＰ”は、単独で、又は組み合せて、治療効果のあるＢＭＰ群より選択されるＢＭＰ（骨形成タンパク質）を意味する。
より特に、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択される。
一の態様において、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）である。
一の態様において、骨形成タンパク質は、ＧＤＦ−５である。
使用されるＢＭＰは、当業者に既知の技術に従い得られるか、或いは、例えば、リサーチ ダイアグノスチック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．）（ＵＳＡ）のような供給者から購入される、組換え体ヒトＢＭＰである。
【００６７】
一の態様において、ヒドロゲルは、移植直前に製造され得る。
一の態様において、ヒドロゲルは、予備充填されたシリンジ中で製造され且つ保管されて、その後に移植され得る。
一の態様において、ヒドロゲルは、移植直前に凍結乾燥物の再水和によって製造され得るか、又は脱水形態で移植され得る。
凍結乾燥は組成物を脱水させ得る水昇華技術であり、この技術はタンパク質の貯蔵及び安定化に普通使用される。
凍結乾燥物の再水和は非常に迅速であり、すぐ使用できる製剤をたやすく得ることができるので、移植前に前記製剤を再水和することを可能にし、或いは、体液と接触することによって移植後に再水和が生じるその脱水形態で移植される。
【００６８】
さらには、他のタンパク質、特に、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ又はＦＧＦのような血管形成成長因子を、骨形成成長因子に添加することが可能である。
本発明はそれ故、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦからなる群より選択される血管形成成長因子をさらに含有することを特徴とする、本発明に係る組成物に関する。
【００６９】
本発明に係る骨形成組成物は、例えば、骨欠損を充填するために、脊椎融合又は顎顔面の復元を行うために、或いは、骨折連結（偽関節）の欠損を治療するために、移植により使用される。
【００７０】
これら種々の治療用途において、マトリックスの寸法及び骨形成成長因子の量は、充填される部位の容量に依存する。
一の態様において、アニオン性多糖類の溶液は、０．１ｍｇ／ｍＬないし１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬないし７５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５ないし５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
一の態様において、脊椎用インプラントについては、骨形成成長因子の投与量は、０．０５ｍｇないし８ｍｇであり、好ましくは０．１ｍｇないし４ｍｇであり、より好ましくは０．１ｍｇないし２ｍｇであるが、文献において通常許容される投与量は、８ないし１２ｍｇである。
一の態様において、脊椎用インプラントについては、血管形成成長因子の投与量は、０．０５ｍｇないし８ｍｇであり、好ましくは０．１ｍｇないし４ｍｇであり、より好ましくは０．１ｍｇないし２ｍｇである。
顎顔面の復元における、又は偽関節治療における用途に関し、例えば、投与量は１ｍｇ未満である。
【００７１】
一の態様において、２価カチオンの溶液は、０．０１ないし１Ｍ、好ましくは０．０５ないし０．２Ｍの濃度を有する。
【００７２】
一の態様において、アニオン性多糖類の溶液は、０．１ｍｇ／ｍＬないし１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬないし７５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５ないし５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
【００７３】
本発明はまた、少なくとも、下記の段階：
ａ）骨形成成長因子／アニオン性多糖類複合体を含有する溶液、並びに有機マトリックス及び／又はヒドロゲルを生成する段階、
ｂ）前記複合体を含有する溶液を、前記有機マトリックス及び／又はヒドロゲルに添加し、所望により該混合物を均質化する段階、
ｃ）可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液を、ｂ）において得られたインプラントに添加する段階、
ｄ）所望により、ｃ）段階において得られたインプラントの凍結乾燥を行う段階
を含有する、本発明のインプラントの製造方法にも関する。
【００７４】
本発明はまた、少なくとも下記の段階：
ａ）骨形成成長因子／両親媒性アニオン性多糖類複合体を含有する溶液、並びに有機マトリックス及び／又はヒドロゲルを生成する段階、
ｂ）可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液を、ａ）の前記有機マトリックス及び／又はヒドロゲルに添加する段階、
ｃ）前記成長因子を含有する溶液を、ｂ）で得られた前記有機マトリックス及び／又はヒドロゲルに添加し、そして所望により該混合物を均質化する段階、
ｄ）所望により、ｃ）段階において得られたインプラントの凍結乾燥を行う段階
を含む、本発明のインプラントの製造方法にも関する。
【００７５】
一の態様において、有機マトリックスは、架橋されたヒドロゲル及び／又はコラーゲンからなるマトリックスである。
一の態様において、前記マトリックスは、滅菌された、好ましくは架橋された、精製された天然コラーゲンを基剤としたマトリックスより選択される。
一の態様において、ａ）段階において架橋されていても又は架橋されていなくとも良いヒドロゲル形成ポリマーは、エチレングリコール／乳酸コポリマー、エチレングリコール／グリコール酸コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸からなる合成ポリマー群より選択される。
一の態様において、ａ）段階において架橋されていても又は架橋されていなくとも良いヒドロゲル形成ポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン及びフィブリン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなる天然ポリマー群より選択される。
一の態様において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、プルラン、キサンタン、カラギーナン、キトサン及びコンドロイチン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択される。
一の態様において、ａ）段階において、天然ポリマーは、ヒアルロン酸及びアルギン酸、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択される。
【００７６】
一の態様において、ｂ）又はｃ）段階における可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液は、２価のカチオン溶液である。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩はカルシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩は、塩化カルシウムである。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩はマグネシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択される。
一の態様において、可溶性の２価のカチオン塩は亜鉛塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択され。
一の態様において、ｂ）又はｃ）段階において、可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液は、多価カチオン溶液である。
一の態様において、多価カチオンは、鉄、アルミニウム、及びポリリシン、スペルミン、プロタミン又はフィブリンのようなカチオン性ポリマーより選択される多価カチオンである。
一の態様において、ａ）段階において、骨形成成長因子以外の溶液がさらに提供される。
【００７７】
本発明はまた、骨インプラントとしての本発明の組成物の使用にも関する。
一の態様において、前記組成物は、脊椎補綴又はケージ型の脊椎融合の人工器官と組み合せて使用され得る。
本発明はまた、骨の復元における前記組成物を用いた治療方法及び外科的方法にも関する。
【００７８】
本発明は、以下の実施例により例示される。
【実施例】
【００７９】
実施例１：Ｌ−トリプトファンのナトリウム塩により変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランの製造
ポリマー１は、仏国特許出願第０７．０２３１６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの重量平均分子量、即ち、１５４の重合度を有するデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）から得られたＬ−トリプトファンのナトリウム塩により変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランである。トリプトファンにより変性されていても、又はいなくともよいナトリウムカルボキシメチレート誘導体のモル分率、即ち、式Ｉ中のｔは、１．０３である。トリプトファンにより変性されたナトリウムカルボキシメチレート誘導体のモル分率、即ち式ＩＩＩ中のｐは、０．３６である。
【００８０】
実施例２：Ｌ−トリプトファンのエチルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランの製造
ポリマー２は、仏国特許出願第０７．０２３１６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの重量平均分子量、即ち、１５４の重合度を有するデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）から得られたＬ−トリプトファンのエチルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランである。トリプトファンのエチルエステルにより変性されていても、又はいなくともよいナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち、式ＩＩＩ中のｔは、１．０７である。トリプトファンのエチルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち式ＩＩＩ中のｐは、０．４９である。
【００８１】
実施例３：Ｌ−グリシンのデシルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランの製造
ポリマー３は、仏国特許出願第０８．０５５０６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの重量平均分子量、即ち、１５４の重合度を有するデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）から得られたＬ−グリシンのデシルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランである。Ｌ−グリシンのデシルエステルにより変性されていても、又はいなくともよいナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち、式Ｘ中のｒは、１．０４である。Ｌ−グリシンのデシルエステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち式ＩＸ中のｑは、０．０９である。
【００８２】
実施例４：Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランの製造
ポリマー４は、特許出願仏国第０８．０５５０６号明細書に記載の方法に従い、４０ｋｇ／モルの重量平均分子量、即ち、１５４の重合度を有するデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ）から得られたＬ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートデキストランである。Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されていても、又はいなくともよいナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち、式Ｘ中のｒは、１．０７である。Ｌ−フェニルアラニンのオクタン酸エステルにより変性されたナトリウムカルボキシメチレートのモル分率、即ち式ＩＸ中のｑは、０．０８である。
【００８３】
実施例５：ｒｈＧＤＦ−５／ポリマー３複合体の製造
製剤１：５ｍＭ ＨＣｌ中の２．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液５０μＬを、６１．１ｍｇ／ｍＬのポリマー３溶液５０μＬと混合した。ポリマー溶液を、２０ｍＭホスフェート（ｐＨ７．２）により緩衝した。ＧＤＦ−５／ポリマー３複合体の溶液は、ｐＨ６．４であり、そして、１０ｍＭホスフェートを含有していた。ＧＤＦ−５／ポリマー３のモル比は１／２０であった。この溶液を、最終的に０．２２μｍで濾過した。最終溶液は清澄であり、動的光散乱により特徴付けた。対象物の大部分は、１０ｎｍ未満の寸法を示した。
【００８４】
実施例６：ｒｈＧＤＦ−５／ポリマー４複合体の製造
製剤２：１０ｍＭ ＨＣｌ中の３．７ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＤＦ−５溶液６７９μＬを、４２．３ｍｇ／ｍＬのポリマー４溶液１８２１μＬ（ｐＨ７．３）と混合した。ＧＤＦ−５／ポリマー４複合体の溶液は、ｐＨ６．５であり、そして、１ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５及び３０．８ｍｇ／ｍＬのポリマー４を含有していた。ＧＤＦ−５／ポリマー４のモル比は１／２０であった。この溶液を、最終的に０．２２μｍで濾過した。最終溶液は清澄であり、動的光散乱により特徴付けた。対象物の大部分は、１０ｎｍ未満の寸法を示した。
【００８５】
実施例７：
コラーゲンスポンジ／ｒｈＢＭＰ−２インプラントの製造
インプラント１：０．０５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液４０μＬを、ヘリシュタット（Ｈｅｌｉｓｔａｔ）型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ニュージャージー）中に無菌的に導入した。コラーゲンスポンジ中で溶液を３０分間インキュベートした後に使用した。ＢＭＰ−２の投与量は２μｇであった。
インプラント２：０．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液４０μＬを用いて、インプラント１と同様に製造した。ＢＭＰ−２の投与量は２０μｇであった。
【００８６】
実施例８：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体の製造
製剤３：０．１５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液５０μＬを、３７．５ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液１００μＬと混合した。ｒｈＢＭＰ−２とポリマー１の溶液を、ｐＨ７．４にて緩衝した。該溶液を４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍで無菌的に濾過した。
製剤４：１．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液５０μＬを、３７．５ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液１００μＬと混合することにより、製剤３と同様に製造した。
【００８７】
実施例９：凍結乾燥された、塩化カルシウムの存在中のコラーゲンスポンジ／ＢＭＰ−２／ポリマー１複合体のインプラントの製造
インプラント３：４０μＬの製剤４を、ヘリシュタット型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ニュージャージー）中に導入した。溶液をコラーゲンスポンジ中で３０分間インキュベートした後、１８．３ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウム溶液１００μＬを添加した。１５分後に、スポンジは使用できる状態となった。ＢＭＰ−２の投与量は、２０μｇであった。
【００８８】
実施例１０：凍結乾燥された、塩化カルシウムの存在中のコラーゲンスポンジ／ＢＭＰ−２／ポリマー１複合体のインプラントの製造
インプラント４：４０μＬの製剤３を、ヘリシュタット型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ニュージャージー）中に導入した。溶液をコラーゲンスポンジ中で３０分間インキュベートした後、１８．３ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウム溶液１００μＬを添加した。スポンジをその後、凍結し、且つ無菌的に凍結乾燥した。ＢＭＰ−２の投与量は２μｇであった。
インプラント５：４０μＬの製剤４を用いて、インプラント４と同様に製造した。ＢＭＰ−２の投与量は２０μｇであった。
【００８９】
実施例１１：種々の製剤の骨誘導性能の評価
本実験の目的は、ラットにおける異所性の骨形成モデルにおける種々の製剤の骨誘導性能を示すことである。体重１５０ないし２５０ｇの雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ＯＦＡ−ＳＤ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｆｒａｎｃｅ，Ｂ．ｐ．１０９，６９５９２ Ｉ‘Ａｒｂｒｅｓｌｅ）をこの実験のために使用した。
鎮痛剤処理を施した後にブプレノルフィン（テムゲシック（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ）（登録商標），ファイザー株式会社，フランス国）、外科的手段を行った。Ｏ２−イソフルラン混合物（１−４％）の吸入により、ラットを麻酔した。広い背中部を刈ることによって毛皮を除去した。この背面部の皮膚を、ポビドン−ヨウ素溶液（ベテジン（Ｖｅｔｅｄｉｎｅ）（登録商標）溶液，Ｖｅｔｏｑｕｉｎｏｌ，フランス）を用いて消毒した。
右及び左の背面部の傍脊椎筋を剥き出しにするために、およそ１ｃｍの傍脊椎切開を行った。トランス筋膜切開（ｔｒａｎｓｆａｓｃｉａｌ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）によって筋肉に到達した。各々のインプラントを、圧迫がそこに生じ得ないような方法で、窪みに置いた。ラット１匹当り４つのインプラントを移植した（１部位当り２つのインプラント）。その後、ポリプロピレン糸（プロレン４／０（Ｐｒｏｌｅｎｅ４／０），Ｅｔｈｉｃｏｎ，フランス）を用いてインプラントの開口を縫合した。非吸収性縫合糸を用いて皮膚を再び閉じた。その後、ラットをそれぞれのケージに戻し、それらの回復の間、観察し続けた。
２１日目に、チレタミン−ゾラゼパム（ゾレチル（ＺＯＬＥＴＩＬ）（登録商標）２５−５０ｍｇ／ｋｇ，ＩＭ，ＶＩＲＢＡＣ，フランス）の注射によって、ラットを麻酔した。
その後、ペントバルビタール（ドレタール（ＤＯＬＥＴＨＡＬ）（登録商標），ベトキノール（ＶＥＴＯＱＵＩＮＯＬ），フランス）の投与量を注射することによって、ラットを安楽死させた。その後、各々の部位の肉眼観察を行い、；局所的な過敏症（炎症、壊死、出血）のいずれかの兆候、及び、骨及び／又は軟骨組織の存在をも記録し、そして以下のスケールに従い、等級分けした。 ０：なし，１：微弱，２：並み ３：著しい，４：相当。
各々インプラントをその移植部位から除去し、肉眼写真を撮った。その後、インプラントの寸法及び質量を決定した。その後、各々のインプラントを、緩衝した１０％ホルモル溶液中に保存した。
【００９０】
結果：
この生体内実験は、ラット背面部の筋肉にインプラントを置いたことにより、ＢＭＰ−２の骨誘導効果を測定することを可能にしている。
移植片の肉眼観察によって、骨組織の存在及びインプラントの質量を評価することが可能である。
【００９１】
コラーゲンスポンジ中のＢＭＰ−２の２μｇの投与量（インプラント１）は、２１日後にコラーゲンインプラントを見出すことができるほどの十分な骨誘導性能を有していなかった。
コラーゲンスポンジ中のＢＭＰ−２の２０μｇの投与量（インプラント２）によって、２１日後に３８ｍｇの平均質量を有する骨化されたインプラントが得られた。
ＢＭＰ−２の同様の２０μｇの投与量について、コラーゲンスポンジ中のＣａＣｌ２溶液の存在中のＢＭＰ−２／ポリマー１複合体（インプラント３）は、ＢＭＰ−２の骨形成活性を向上させることができた。インプラント３の平均質量は、インプラント２のそれよりもおよそ３倍大きかった。
コラーゲンスポンジ中で凍結乾燥された、ＣａＣｌ２の存在中のポリマー１との複合体の形態における２０μｇのＢＭＰ−２を含有するインプラント（インプラント５）の平均質量は、ＣａＣｌ２の存在中のＢＭＰ−２／ポリマー１複合体が溶液中であるインプラントのそれの２倍であったので、凍結乾燥は、骨形成活性の上記の向上を増幅することができた。
１０倍低いＢＭＰ−２の投与量については、コラーゲンスポンジ中で凍結乾燥された、ＣａＣｌ２の存在中のＢＭＰ−２複合体（インプラント４）によって、２倍の質量を有し、ＢＭＰ−２単独のものに等しい骨スコアを有する骨化されたインプラントを生じさせることができた。この新規製剤は、ＢＭＰ−２投与量を大きく低減させると同時に、かかるタンパク質の骨形成活性を維持することを可能にした。
【００９２】
実施例１２：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有する製剤の製造
製剤５：１．３５ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液５５２μＬを、６０．０ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液６１９μＬと混合した。製剤５の容量を、滅菌水を添加することにより１３００μＬとした。この溶液を、４℃にて２時間インキュベートし、そして０．２２μｍで無菌的に濾過した。製剤５中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．５７１ｍｇ／ｍＬであり、そしてポリマー１のそれは２８．６ｍｇ／ｍＬであった。
製剤６：１．４７ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液１７５μＬと、６０．０ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液１２２４μＬとを混合することにより、製剤５と同様に製造した。滅菌水を添加することにより、製剤６の容量を１８００μＬとした。製剤６中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．１４ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは４０．８ｍｇ／ｍＬであった。
製剤７：１．４６ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２溶液２６．５μＬを、６０．０ｍｇ／ｍＬのポリマー１溶液３２１．７μＬと混合することにより、製剤５と同様に製造した。製剤の容量を、滅菌水を添加することにより７７２μＬとした。製剤７中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．０５ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは２５ｍｇ／ｍＬであった。
【００９３】
実施例１３：塩化カルシウムを含有するヒアルロン酸ナトリウムゲルの製造
ゲル１：滅菌水１０．６２ｍＬを、５０ｍＬファルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅ）に入れた。０．４４ｇのヒアルロン酸ナトリウム（ファルマ グレード８０（Ｐｈａｒｍａ ｇｒａｄｅ），紀文フードケミファ社）を、ボルテックスにて激しく攪拌しながら添加した。その後、さらに攪拌しながら、０．１４ｇの塩化カルシウムをヒアルロン酸ナトリウムゲルに添加した。ゲル中の塩化カルシウムの濃度は１３．１ｍｇ／ｍＬであった。
【００９４】
実施例１４：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するヒアルロン酸ナトリウムゲルの製造
ゲル２：１２３０μＬの製剤５を、１０ｍＬ滅菌シリンジ中に移した。１３．１ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウムを含有する４％ヒアルロン酸ナトリウムゲル１の５．８ｍＬを、１０ｍＬ滅菌シリンジに移した。２つのシリンジを併せることによって、製剤５の溶液を、ゲル１に添加し、そして、一方のシリンジから他方へと数回通すことによって、得られたゲルを均質化した。得られた不透明色のゲルを、５０ｍＬファルコンチューブに移した。ゲル２中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．１０ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは５．０ｍｇ／ｍＬであった。
２００μＬのゲル２を、移植部位に注入した。移植されたｒｈＢＭＰ−２の投与量は、２０μｇであった。
【００９５】
実施例１５：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するヒアルロン酸ナトリウムゲルの製造
ゲル３：このゲルは、製剤６の１６９７μＬ及び１５．８ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化カルシウムを含有する４％ヒアルロン酸ナトリウムゲルの８ｍＬを用いて、実施例１３に記載されるとおりに製造された。ゲル３中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．０２５ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは７．１４ｍｇ／ｍＬであった。
２００μＬのゲル３を、移植部位に注入した。移植されたｒｈＢＭＰ−２の投与量は、５μｇであった。
【００９６】
実施例１６：
ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するアルギン酸ナトリウムゲルの製造
ゲル４：このゲルは、製剤７の７７２μＬ及び４０ｍｇ／ｍＬのアルギン酸ナトリウムゲルの３８６μＬを用いて製造された。４５．５ｍｇ／ｍＬの塩化カルシウム溶液の４０μＬを、ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有するアルギン酸ナトリウムゲルの６０μＬに添加した。ゲル４中のｒｈＢＭＰ−２の濃度は０．０２ｍｇ／ｍＬであり、ポリマー１のそれは１０．０ｍｇ／ｍＬであった。
１００μＬのゲル４を移植部位に注入した。移植されたｒｈＢＭＰ−２の投与量は２μｇであった。
【００９７】
実施例１７：ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体及び塩化カルシウムを含有するアルギン酸ナトリウムゲルを含有するコラーゲンインプラントの製造
インプラント６：ゲル５を、製剤７の６４５μＬ及び４０ｍｇ／ｍＬのアルギン酸ナトリウムゲルの３２３μＬを用いて製造した。ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有するアルギン酸ナトリウムゲルの６０μＬを、ヘリシュタット型の無菌の２００ｍｍ３架橋コラーゲンスポンジ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ニュージャージー）中に添加した。４５．５ｍｇ／ｍＬの塩化カルシウム溶液の４０μＬをも、このスポンジに添加した。３０分間の接触時間の後、スポンジを凍結し、そして凍結乾燥した。このスポンジを、ラットに直接に移植した。
インプラント１中のｒｈＢＭＰ−２の投与量は２μｇであり、ポリマー１のそれは１ｍｇであった。
【００９８】
実施例１８：種々の製剤の骨誘導性能の評価
骨誘導性能を、実施例１１に記載のプロトコルに従い評価した。
結果：
この生体外実験は、ラット背面部の筋肉に置いたｒｈＢＭＰ−２の骨形成効果を測定することを可能にしている。この骨でない部位を、異所性であるという。種々の実験結果を以下の表に概略する。
【００９９】
コラーゲンスポンジ中のｒｈＢＭＰ−２の２μｇの投与量（インプラント１）は、２１日後に外植片を見出すことができるほどの十分な骨誘導性能を有していなかった。
コラーゲンスポンジ中のＢＭＰ−２の２０μｇの投与量（インプラント２）によって、２１日後に３８ｍｇの平均質量を有する骨化された外植片が得られた。
２０μｇの同じＢＭＰ−２投与量について、塩化カルシウムの存在下でｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有するヒアルロン酸ナトリウムゲル（ゲル２）は、ｒｈＢＭＰ−２の骨形成活性を高めることができた。ゲル２を用いて得られた外植片の平均質量は、ｒｈＢＭＰ−２を単独で２０μｇ含有するコラーゲンインプラント（インプラント８）を用いて得られた外植片のそれよりも、およそ６倍大きかった、
４倍低いｒｈＢＭＰ−２、即ち５μｇのｒｈＢＭＰ−２投与量については、ヒアルロン酸ナトリウムゲル（ゲル３）中のＣａＣｌ２の存在下のｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体は、９倍大きい質量を有し、ｒｈＢＭＰ−２を単独で２０μｇ含有するコラーゲンインプラント（インプラント８）を用いて得られた外植片と同等の骨スコアを有する骨化外植片を生じさせることができた。この新規製剤は、ＢＭＰ−２投与量を大きく低減させると同時に、かかるタンパク質の骨形成活性を維持することを可能にした。
１０倍低いｒｈＢＭＰ−２投与量については、塩化カルシウムを含有するアルギン酸ナトリウムゲル（ゲル４）中のｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体は、ｒｈＢＭＰ−２を単独で２０μｇ含有するコラーゲンインプラント（インプラント８）を用いて得られたものよりも、僅かに大きい質量を有する外植片を生じることを可能にした。この新規製剤は、ｒｈＢＭＰ−２投与量を大きく低減させると同時に、かかるタンパク質の骨形成活性を維持することを可能にした。
ｒｈＢＭＰ−２／ポリマー１複合体を含有するアルギン酸ゲルはまた、骨細胞の成長の支持体として補助するコラーゲンスポンジに配置し得る。この場合にまた、２μｇのｒｈＢＭＰ−２（インプラント６）が、ｒｈＢＭＰ−２を単独で２０μｇ含有するコラーゲンインプラント（インプラント８）を用いて得られたものよりも大きい質量を有する骨化外植片を得ることを可能にした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の骨形成成長因子、１種の可溶性の少なくとも２価のカチオン塩、及び１種の有機支持体
を含有する骨形成組成物から構成されるオープンインプラントであって、前記有機支持体は脱塩された骨マトリックスを含んでいない、オープンインプラント。
【請求項２】
前記支持体は、有機マトリックス及び／又はヒドロゲル形成ポリマーから構成されることを特徴とする、請求項１に記載のインプラント。
【請求項３】
前記有機マトリックスは、架橋されたヒドロゲル及び／又はコラーゲンから構成されたマトリックスであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のインプラント。
【請求項４】
前記マトリックスは、滅菌された、好ましくは架橋された、精製された天然コラーゲンを基剤としたマトリックスより選択されることを特徴とする、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項５】
架橋されていても又は架橋されていなくとも良い前記ヒドロゲル形成ポリマーは、エチレングリコール／乳酸コポリマー、エチレングリコール／グリコール酸コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸からなる合成ポリマー群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項６】
架橋されいても又は架橋されていなくとも良い前記ヒドロゲル形成ポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、プルラン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン及びフィブリン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなる天然ポリマー群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項７】
前記天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、プルラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、キサンタン、カラギーナン、キトサン及びコンドロイチン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載のインプラント。
【請求項８】
前記天然ポリマーは、ヒアルロン酸及びアルギン酸、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載のインプラント。
【請求項９】
前記組成物は、凍結乾燥物の形態にあることを特徴とする、請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１０】
前記骨形成成長因子は、治療効果のあるＢＭＰ（骨形成タンパク質）群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし９のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１１】
前記骨形成成長因子は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１０のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１２】
前記骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）であることを特徴とする、請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１３】
前記骨形成タンパク質は、ＧＤＦ−５であることを特徴とする、請求項１ないし１２のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１４】
ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦからなる群より選択される血管形成成長因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１ないし１３のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１５】
少なくとも２価のカチオンは、カルシウム、マグネシウム又は亜鉛カチオンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１４のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１６】
可溶性の２価のカチオン塩はカルシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１７】
前記可溶性の２価のカチオン塩は、塩化カルシウムであることを特徴とする、請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１８】
前記少なくとも２価のカチオンは、鉄、アルミニウムのカチオンからなる群より選択される多価カチオン、或いは、ポリリシン、スペルミン及びフィブリンより選択されるカチオン性ポリマー、それら単独又は組み合わせであることを特徴とする、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１９】
両親媒性多糖類は、疎水性誘導体によって官能化された多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１８のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項２０】
両親媒性多糖類は、下記の一般式Ｉ：
［式中、
多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合からなり、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性又はアニオン性多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有し、そして少なくとも１つの酸官能基を有する、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であってもよい鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファン誘導体のアミンと、Ｒ基により保有される少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有される少なくとも１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基を表し、
ｎは、Ｔｒｐ置換されたＲのモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｏは、Ｔｒｐ置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｉは、糖単位当りのＲ基により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし２であり、
ｊは、糖単位当りのアニオン性多糖類により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
（ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ＲがＴｒｐにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン（群）であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属のカチオンであり、
前記多糖類がアニオン性多糖類である場合、多糖類の１つ以上の酸官能基（群）がＴｒｐにより置換されておらず、その場合にそれ（それら）はカチオンにより塩化されており、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
に対応する少なくとも１種のトリプトファン誘導体により官能化された、大部分が（１，４）、（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合を含有するアニオン性多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１９のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項２１】
前記両親媒性多糖類は、下記の一般式ＩＩＩ
［式中、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有し、そして少なくとも１つの酸官能基を有する、枝分れ状であってもよく、及び／又は不飽和であってもよい鎖を表し、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性の又はアニオン性の多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
ＡＡは、アミノ酸のアミンと、Ｒ基により保有される酸との間のカップリングから生じる疎水性のＬ−又はＤ−アミノ酸残基を表し、前記疎水性のアミノ酸は、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミンのようなトリプトファン誘導体、及びそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されるか、或いは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン、及びそのアルコール、アミド又は脱炭酸誘導体より選択され、
ｔは、グリコシド単位当りのＦ−Ｒ−［ＡＡ］ｎ置換基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ｐは、ＡＡにより置換されたＲ基のモル分率であって、０．０５ないし１であり、
ＲがＡＡにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン群であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記デキストランは、中性ｐＨにて両親媒性である。］
で表される官能化されたアニオン性多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし２０のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項２２】
前記両親媒性多糖類は、一般式ＩＸ：
［式中、
ｑは、Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ａｈで置換された多糖類のカルボキシル官能基のモル分率を表し、０．０１ないし０．７であり、
Ｆ’は、アミド官能基を表し、
Ｇは、エステル官能基、チオエステル官能基、カルボネート官能基又はカルバメート官能基のいずれかを表し、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する、枝分れ状であってもよく、及び／又は不飽和であってもよい鎖を表し、
Ａｈは、疎水性アルコールのヒドロキシル官能基と、Ｒ基により保有される少なくとも１つの求電子性官能基との間のカップリングから生じる、疎水性アルコールの残基を表し、
多糖類のカルボキシル官能基がＦ’−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換されていない場合、多糖類のカルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン（群）であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンを表し、
前記カルボキシル官能基を有する多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
で表される疎水性アルコールにより一部が置換されたカルボキシル官能基を含有する多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし２１のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項２３】
少なくとも、下記の段階：
ａ）骨形成成長因子を含有する溶液を生成する段階、
ｂ）有機マトリックス及び／又はヒドロゲル形成ポリマーを生成する段階、
ｃ）前記成長因子を含有する溶液を前記有機マトリックスに及び／又は前記ヒドロゲルに添加し、そして所望により混合物を均質化する段階、
ｄ）可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液を、ｃ）において得られたインプラントに添加する段階、
ｅ）所望により、ｄ）段階において得られたインプラントの凍結乾燥を行う段階
を含む、本発明のインプラントの製造方法。
【請求項２４】
前記有機マトリックスは、架橋されたヒドロゲル及び／又はコラーゲンからなるマトリックスであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記マトリックスは、滅菌された、好ましくは架橋された、精製された天然コラーゲンを基剤としたマトリックスより選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
架橋されていても又は架橋されていなくとも良い前記ヒドロゲル形成ポリマーは、エチレングリコール／乳酸コポリマー、エチレングリコール／グリコール酸コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸からなる合成ポリマー群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
架橋されていても又は架橋されていなくとも良い前記ヒドロゲル形成ポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン及びフィブリン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなる天然ポリマー群より選択されることを特徴とする、請求項２３ないし２６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、プルラン、キサンタン、カラギーナン、キトサン及びコンドロイチン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記天然ポリマーは、ヒアルロン酸及びアルギン酸、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液は、２価のカチオン溶液であることを特徴とする、請求項２３ないし２９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記可溶性の２価のカチオン塩はマグネシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記可溶性の２価のカチオン塩は、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択されることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｄ）段階において、前記可溶性の２価のカチオン塩は、塩化カルシウムであることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）段階において、骨形成成長因子以外の溶液がさらに提供されることを特徴とする、請求項２３ないし３５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも１種の骨形成成長因子、１種の可溶性の少なくとも２価のカチオン塩、及び１種の有機支持体
を含有する骨形成組成物から構成されるオープンインプラントであって、前記有機支持体は脱塩された骨マトリックスを含んでいない、オープンインプラント。
【請求項２】
前記支持体は、有機マトリックス及び／又はヒドロゲル形成ポリマーから構成されることを特徴とする、請求項１に記載のインプラント。
【請求項３】
前記有機マトリックスは、架橋されたヒドロゲル及び／又はコラーゲンから構成されたマトリックスであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のインプラント。
【請求項４】
前記マトリックスは、滅菌された、好ましくは架橋された、精製された天然コラーゲンを基剤としたマトリックスより選択されることを特徴とする、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項５】
架橋されていても又は架橋されていなくとも良い前記ヒドロゲル形成ポリマーは、エチレングリコール／乳酸コポリマー、エチレングリコール／グリコール酸コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸からなる合成ポリマー群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項６】
架橋されいても又は架橋されていなくとも良い前記ヒドロゲル形成ポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、プルラン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン及びフィブリン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなる天然ポリマー群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項７】
前記天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、プルラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、キサンタン、カラギーナン、キトサン及びコンドロイチン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載のインプラント。
【請求項８】
前記天然ポリマーは、ヒアルロン酸及びアルギン酸、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載のインプラント。
【請求項９】
前記組成物は、凍結乾燥物の形態にあることを特徴とする、請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１０】
前記骨形成成長因子は、治療効果のあるＢＭＰ（骨形成タンパク質）群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし９のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１１】
前記骨形成成長因子は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα（ｄｉｂｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７（エプトテルミンα（ｅｐｔｏｔｅｒｍｉｎ−ａｌｆａ））、ＢＭＰ−１４及びＧＤＦ−５からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１０のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１２】
前記骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２（ジボテルミンα）であることを特徴とする、請求項１ないし１１のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１３】
前記骨形成タンパク質は、ＧＤＦ−５であることを特徴とする、請求項１ないし１２のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１４】
ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦからなる群より選択される血管形成成長因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１ないし１３のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１５】
少なくとも２価のカチオンは、カルシウム、マグネシウム又は亜鉛カチオンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１４のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１６】
可溶性の２価のカチオン塩はカルシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１７】
前記可溶性の２価のカチオン塩は、塩化カルシウムであることを特徴とする、請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１８】
前記少なくとも２価のカチオンは、鉄、アルミニウムのカチオンからなる群より選択される多価カチオン、或いは、ポリリシン、スペルミン及びフィブリンより選択されるカチオン性ポリマー、それら単独又は組み合わせであることを特徴とする、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項１９】
両親媒性多糖類は、疎水性誘導体によって官能化された多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１８のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項２０】
両親媒性多糖類は、下記の一般式Ｉ：
［式中、
多糖類は、大部分が（１，４）及び／又は（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合からなり、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性又はアニオン性多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有し、そして少なくとも１つの酸官能基を有する、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であってもよい鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファン誘導体のアミンと、Ｒ基により保有される少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により保有される少なくとも１つの酸との間のカップリングから生じるＬ−又はＤ−トリプトファン誘導体の残基を表し、
ｎは、Ｔｒｐ置換されたＲのモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｏは、Ｔｒｐ置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．０５ないし０．７であり、
ｉは、糖単位当りのＲ基により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし２であり、
ｊは、糖単位当りのアニオン性多糖類により保有される酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
（ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ＲがＴｒｐにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン（群）であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属のカチオンであり、
前記多糖類がアニオン性多糖類である場合、多糖類の１つ以上の酸官能基（群）がＴｒｐにより置換されておらず、その場合にそれ（それら）はカチオンにより塩化されており、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
に対応する少なくとも１種のトリプトファン誘導体により官能化された、大部分が（１，４）、（１，３）及び／又は（１，２）型のグリコシド結合を含有するアニオン性多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし１９のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項２１】
前記両親媒性多糖類は、下記の一般式ＩＩＩ
［式中、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有し、そして少なくとも１つの酸官能基を有する、枝分れ状であってもよく、及び／又は不飽和であってもよい鎖を表し、
Ｆは、リンカーアームＲと、中性の又はアニオン性の多糖類の官能基−ＯＨとの間のカップリング由来のものであって、エステル官能基、チオエステル官能基、アミド官能基、カーボネート官能基、カルバメート官能基、エーテル官能基、チオエーテル官能基又はアミン官能基のいずれかを表し、
ＡＡは、アミノ酸のアミンと、Ｒ基により保有される酸との間のカップリングから生じる疎水性のＬ−又はＤ−アミノ酸残基を表し、前記疎水性のアミノ酸は、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミンのようなトリプトファン誘導体、及びそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されるか、或いは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン、及びそのアルコール、アミド又は脱炭酸誘導体より選択され、
ｔは、グリコシド単位当りのＦ−Ｒ−［ＡＡ］ｎ置換基のモル分率であって、０．１ないし２であり、
ｐは、ＡＡにより置換されたＲ基のモル分率であって、０．０５ないし１であり、
ＲがＡＡにより置換されていない場合、Ｒ基の酸（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン群であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンであり、
前記デキストランは、中性ｐＨにて両親媒性である。］
で表される官能化されたアニオン性多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし２０のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項２２】
前記両親媒性多糖類は、一般式ＩＸ：
［式中、
ｑは、Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ａｈで置換された多糖類のカルボキシル官能基のモル分率を表し、０．０１ないし０．７であり、
Ｆ’は、アミド官能基を表し、
Ｇは、エステル官能基、チオエステル官能基、カルボネート官能基又はカルバメート官能基のいずれかを表し、
Ｒは、１ないし１８個の炭素原子を含有し、Ｏ、Ｎ又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する、枝分れ状であってもよく、及び／又は不飽和であってもよい鎖を表し、
Ａｈは、疎水性アルコールのヒドロキシル官能基と、Ｒ基により保有される少なくとも１つの求電子性官能基との間のカップリングから生じる、疎水性アルコールの残基を表し、
多糖類のカルボキシル官能基がＦ’−Ｒ−Ｇ−Ａｈにより置換されていない場合、多糖類のカルボキシル官能基（群）は、カルボン酸カチオン又はカルボン酸カチオン（群）であって、前記カチオンは、好ましくはＮａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンを表し、
前記カルボキシル官能基を有する多糖類は、中性ｐＨにて両親媒性である。］
で表される疎水性アルコールにより一部が置換されたカルボキシル官能基を含有する多糖類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１ないし２１のうちいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項２３】
少なくとも、下記の段階：
ａ）骨形成成長因子を含有する溶液を生成する段階、
ｂ）有機マトリックス及び／又はヒドロゲル形成ポリマーを生成する段階、
ｃ）前記成長因子を含有する溶液を前記有機マトリックスに及び／又は前記ヒドロゲルに添加し、そして所望により混合物を均質化する段階、
ｄ）可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液を、ｃ）において得られたインプラントに添加する段階、
ｅ）所望により、ｄ）段階において得られたインプラントの凍結乾燥を行う段階
を含む、本発明のインプラントの製造方法。
【請求項２４】
前記有機マトリックスは、架橋されたヒドロゲル及び／又はコラーゲンからなるマトリックスであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記マトリックスは、滅菌された、好ましくは架橋された、精製された天然コラーゲンを基剤としたマトリックスより選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
架橋されていても又は架橋されていなくとも良い前記ヒドロゲル形成ポリマーは、エチレングリコール／乳酸コポリマー、エチレングリコール／グリコール酸コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド及びポリアクリル酸からなる合成ポリマー群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
架橋されていても又は架橋されていなくとも良い前記ヒドロゲル形成ポリマーは、ヒアルロン酸、ケラタン、ペクチン、デキストラン、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸、キサンタン、カラギーナン、キトサン、コンドロイチン、コラーゲン、ゼラチン、ポリリシン及びフィブリン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなる天然ポリマー群より選択されることを特徴とする、請求項２３ないし２６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記天然ポリマーは、ヒアルロン酸、アルギン酸、デキストラン、ペクチン、セルロース及びその誘導体、プルラン、キサンタン、カラギーナン、キトサン及びコンドロイチン、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記天然ポリマーは、ヒアルロン酸及びアルギン酸、並びに生物学的に許容され得るそれらの塩からなるヒドロゲル形成多糖類群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記可溶性の少なくとも２価のカチオン塩の溶液は、２価のカチオン溶液であることを特徴とする、請求項２３ないし２９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記可溶性の２価のカチオン塩はマグネシウム塩であり、その対イオンは、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記可溶性の２価のカチオン塩は、塩化物塩、Ｄ−グルコン酸塩、ギ酸塩、Ｄ−サッカラート、酢酸塩、Ｌ−乳酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、ソルビン酸塩、重炭酸塩、臭化物塩又はアスコルビン酸塩より選択されることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｄ）段階において、前記可溶性の２価のカチオン塩は、塩化カルシウムであることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）段階において、骨形成成長因子以外の溶液がさらに提供されることを特徴とする、請求項２３ないし３５のうちいずれか１項に記載の方法。
【公表番号】特表２０１１−５１９２９２（Ｐ２０１１−５１９２９２Ａ）
【公表日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０４５５４（Ｐ２０１１−５０４５５４）
【出願日】平成２１年４月１４日（２００９．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５２３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２７９４０
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（５０８０９００８８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１４日（２００９．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５２３５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２７９４０
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（５０８０９００８８）
【Ｆターム（参考）】
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