抗がん製剤
【課題】ｎ−ブチリデンフタリドをがんの部位に選択的および持続的に長い期間を通じて放出する製剤の提供。
【解決手段】ｚ−ブチリデンフタリドと乳酸・グリコール酸共重合体、キトサン、コラーゲン、ハイドロゲル、及びビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の混合物から調製されるポリ無水物などから選ばれる重合体を含む、腫瘍を治療するための製剤。
【解決手段】ｚ−ブチリデンフタリドと乳酸・グリコール酸共重合体、キトサン、コラーゲン、ハイドロゲル、及びビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の混合物から調製されるポリ無水物などから選ばれる重合体を含む、腫瘍を治療するための製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本特許出願は、２０１０年１月５日出願の、米国仮特許出願６１／２９２，３１１号の優先権を主張し、これらの出願の内容は参照により本明細書に引用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ｎ−ブチリデンフタリド（n-Butylidenephthalide）（Ｂｄｐｈ）は、アンゼリカ・シネンシス（Angelica sinensis）から分離された化学化合物である。当該化合物は、たとえば、多形性膠芽腫（gliobastoma multiforme）および乳がん（breast cancer）のようなさまざまな腫瘍を治療するのに用いられうる。たとえば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５， １１（９）：３４７５−３４８４、およびＴｓａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２００６， ９９（４）：１２５１−６２を参照。しかしながら、その使用において、効果的ながん治療のためには、ｎ−ブチリデンフタリドをがんの部位に選択的および持続的に運搬することが重要な意味を有する。このことは、血液脳関門（blood brain barrier）のために薬剤が疾患部位に到達するのが困難な脳腫瘍を治療するのに特に重要なことである。薬剤の運搬に効果的な方法を開発する必要があった。
【発明の概要】
【０００３】
要約
本発明は、ｎ−ブチリデンフタリド、特に、Ｚ型ｎ−ブチリデンフタリド（すなわち、（Ｚ）−ｎ−ブチリデンフタリド、ｚ−ブチリデンフタリドおよびｚ−Ｂｄｐｈ）が、Ｅ型ｎ−ブチリデンフタリド（すなわち、（Ｅ）−ｎ−ブチリデンフタリド、ｅ−ブチリデンフタリドおよびｅ−Ｂｄｐｈ）よりも、３０日以上の長い期間を通じて放出され、抗腫瘍効果を有する製剤の発見に基づいている。
【０００４】
本発明は、ひとつの態様において、（ｉ）ｚ−ブチリデンフタリドおよび（ｉｉ）重合体を含み、それらが共に混合されている製剤に関する。
【０００５】
重合体としては、乳酸・グリコール酸共重合体、キトサン、コラーゲン、ハイドロゲル、または、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ブタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ペンタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘプタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）オクタン、イソフタル酸、１，４−フェニレンジプロピオン酸、ドデカンジオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、またはこれらの混合物から調製されるポリ無水物（polyanhydride）が挙げられる。
【０００６】
製剤の例としては、ｚ−ブチリデンフタリドと、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン（ＣＰＰ）およびセバシン酸（ＳＡ）から調製されるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）ポリ無水物と、の混合物が挙げられる。ポリ無水物において、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンとセバシン酸の比は、好ましくは、１：２〜１：１０（たとえば、１：４）である。ｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントは、製剤中、３％〜５０％（たとえば、３％〜２０％、１０％、および１５％）である。製剤は、粉体、ウエハ、シート、棒、マイクロスフィア、ナノスフィア、ペースト、または糊の形態でありうる。
【０００７】
本発明は、他の態様において、腫瘍の治療のための上記製剤の使用に関する。治療される腫瘍の例としては、これに制限されないが、多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）、肺がん, 肝細胞がん（hepatocellular carcinoma）、結腸がん（colon cancer）、黒色腫（melanoma）、乳がん（breast cancer）、神経芽細胞腫（neuroblastoma）、奇形腫（teratoma）およびヒト白血病（human leukemia）が挙げられる。
【０００８】
また、本発明の範囲には、腫瘍を治療するための薬剤を製造するときの上記製剤の使用も含まれる。
【０００９】
本発明のひとつ以上の形態は、添付された図面および明細書に詳細に記載されている。本発明の他の特徴、目的および有利な点は明細書および図面、ならびに請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。ＣＰＰの芳香族プロトンに特徴的なシグナルが６．９〜８．２ｐｐｍに観測された。ＳＡのメチレンプロトンに特徴的なシグナルが１．３ｐｐｍに観測された。
【図２】図２は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体のＦＴＩＲスペクトルである。ＣＰＰとＳＡ間の無水物結合に特徴的なシグナルが１８１２．７６ｃｍ−１に観測された。
【図３】図３は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−２％ＢＣＮＵウエハ、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％Ｂｄｐｈ、およびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％Ｂｄｐｈの放出速度（Release kinetics）を示す図である。すべての製剤において、ＢｄｐｈまたはＢＣＮＵが放出を維持することが観測された。
【図４】図４は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％Ｂｄｐｈに誘導されるラット悪性神経膠腫（malignant glioma）細胞の成長抑制を示す図である。（Ａ）のラット悪性神経膠腫細胞ＲＧ２系列（line RG2）を２４時間１０％Ｂｄｐｈ−ウエハで処理した。細胞生存率は、ＭＴＴ分析により決定した。このデータは３回の独立した実験からの平均値と標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）ウエハ処理を行ったＲＧ２悪性神経膠腫細胞の細胞形態。（Ｃ）２４時間ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％Ｂｄｐｈ処理を行ったＲＧ２悪性神経膠腫細胞の細胞形態。（Ｄ）２４時間ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％Ｂｄｐｈ処理を行ったＲＧ２悪性神経膠腫細胞の細胞形態。
【図５】図５は、Ｂｄｐｈに誘導されるＮｕｒ７７転写産物（transcript）を示す図である。ラットＧＢＭ細胞（ＲＧ２）を、ＢｄｐｈのＩＣ５０濃度で記載された時間で処理した。薬剤のインキュベート後、細胞を回収し、トータルＲＮＡ（total RNA）を分離した。ＧＡＤＰＨを内部コントロールとして用いた。
【図６】図６は、Ｂｄｐｈに誘導されるＮｕｒ７７の核から細胞質（cytoplasm）への転移を示す図である。（ａ）ＤＢＴＲＧ−０５ＮＧ細胞を、２４時間Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で処理して、その後、対応するローダミン−共役抗ＩｇＧ二次抗体（Rhodamine-conjugated anti-IgG secondary antibody）により、抗Ｎｕｒ７７抗体（anti-Nur77 antibody）で免疫染色して、Ｎｕｒ７７タンパク質を表示した。同時に、細胞をＤＡＰＩで染色し、核を表示した。蛍光顕微鏡で蛍光像を可視化した。
【図７】図７は、ＲＧ２細胞におけるＢｄｐｈに誘導されるＮｕｒ７７核細胞質間転移（nucleo-cytoplasmic translocation）を示す図である。ＲＧ２細胞を、１０ｃｍ皿上に固定化し、９０％コンフルエンス（confluence）までインキュベートした。細胞を、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で、異なる期間（０、６、１２、２４、および４８時間）で処理した。細胞を採取し、核および細胞質フラクションを分離した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により、Ｎｕｒ７７の核および細胞質を観測し定量した。
【図８】図８は、Ｂｄｐｈに誘導される成長抑制のシグナル経路を示す図である。示されているように、ＲＧ２細胞を、０〜１８０分のさまざまな継続時間において、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で処理した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を、ｐＪＮＫ、ｐＰＫＣ、ｐＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐＥＲＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐｐ３８およびｐ３８抗体に対して実施した。β−アクチンを内部コントロールとして用いた。
【図９Ａ】図９は、同種ラットＧＢＭモデルにおけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）による腫瘍成長の抑制を示す図である。ＲＧ２細胞（５×１０６）をＦ３４４ラットの皮下背中に移植した。ＲＧ細胞の移植の５日後、ＲＧ２細胞のみを移植された７匹のラットをコントロール群（●）とし、他のラットは、それぞれ、ウエハ（□）、３％Ｂｄｐｈ−ウエハ（▲）、１０％Ｂｄｐｈ−ウエハ（■）、および３％ＢＣＮＵ−ウエハ（×）で処理した。図９（Ａ）は、腫瘍サイズは、平均値と標準偏差を示した。
【図９Ｂ】図９（Ｂ）体重もまた、平均値と標準偏差を示した。
【図９Ｃ】図９（Ｃ）は、ＧＢＭ組織における免疫組織化学染色を分析した（ＲＧ２細胞の移植後の３０日目）ものを示す。ウエハ群、３％Ｂｄｐｈ−ウエハ群、１０％Ｂｄｐｈ−ウエハ群および３％ＢＣＮＵ−ウエハ群の切片（sections）の代表的な画像である。ｋｉ−６７、開裂されたカスパーゼ３、およびＮｕｒ７７の免疫組織化学染色されたＧＢＭ腫瘍である。Ｋｉ−６７−、開裂されたカスパーゼ３−、またはＮｕｒ７７−陽性細胞を茶色に染色した（４００×）。
【図１０】図１０は、異種移植のヒトＧＢＭヌードマウスモデルにおいてＢｄｐｈウエハが腫瘍成長を抑制したことを示す図である（２×１０６）。Ｆｏｘｎ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞を皮下に移植した。ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞移植の５日後、マウスはウエハ（◆）、３％Ｂｄｐｈ−ウエハ（■）および１０％Ｂｄｐｈウエハ（▲）でそれぞれ処理した。（Ａ）腫瘍サイズは、平均値と標準偏差を示した。（Ｂ）体重もまた、平均値と標準偏差を示した。（Ｃ）、（Ｄ）画像は、ヌードマウスにおいて腫瘍をウエハ、３％Ｂｄｐｈ−ウエハまたは１０％Ｂｄｐｈ−ウエハで処理したものを示す。Ｐ＜０．０１。
【図１１】図１１は、ＢｄｐｈがＡｘｌタンパク質発現を制御することを実証したＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を示す図である。
【図１２】図１２は、腫瘍細胞転移および浸潤分析を評価するための１２−ウエルインサートシステム（12-well insert system）を示す図である。
【図１３】図１３は、２４ウエルインサートシステムを用いることにより、Ｂｄｐｈが用量依存的に腫瘍細胞転移を抑制することを示す図である。
【図１４】図１４は、２４ウエルインサートシステムを用いることにより、Ｂｄｐｈが用量依存的に腫瘍細胞浸潤を抑制することを示す図である。
【図１５】図１５は、腫瘍細胞増殖（tumor cell proliferation）を抑制するＢｄｐｈが用量依存的にＤＢＴＲＧ脳腫瘍細胞のＡｘｌ発現により逆転されうることを示す図である。
【図１６】図１６は、細胞転移および湿潤を検出するためのＯｒｉｓＴＭシステムを示す図である。
【図１７】図１７は、ＯｒｉｓＴＭシステムを用いることにより、Ｂｄｐｈによる細胞転移の抑制が、用量依存的にＤＢＴＲＧ脳腫瘍細胞のＡｘｌ発現により逆転されうることを示す図である。
【図１８】図１８は、ＢＰによる細胞湿潤の抑制が、ＤＢＴＲＧ脳腫瘍細胞のＡｘｌ発現により逆転されうることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の詳細な説明
本発明のひとつの態様は、ｎ−ブチリデンフタリド、特にそのｚ型、ｚ−ブチリデンフタリド、および重合体を含む製剤に関する。該製剤は、多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）のような腫瘍の成長を抑制するのに用いることができる。
【００１２】
本発明の実施のために用いられるｚ−ブチリデンフタリドは、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｌｔｄ．（ＵＫ）から入手できるような市販のものを用いることができる。該化合物は、アンゼリカ・シネンシスのクロロホルム抽出によっても分離することができる。Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５，１１（９）：３４７５−３４８４を参照。購入または分離したｚ−ブチリデンフタリドを、フラッシュカラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、結晶化、またはその他の好適な方法によってさらに精製することができる。
【００１３】
本発明の実施のために用いられる重合体は、市販のものまたは公知の方法で調製されたものを用いることができる。たとえば、無水酢酸中で二酸の化合物（diacid compound）を還流してポリ無水物が得られる。
【００１４】
重合体は共重合体でありうる。たとえば、共重合体としては、溶融重合（melt polycondensation）を用いて、２つの相違するポリ無水物部分から調製されうる。Ｄｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２５：３３７３−３３８６を参照。
【００１５】
得られた重合体を、適当な方法で精製し、ＮＭＲ、ＭＳ、またはＦＴ−ＩＲにより確認する。
【００１６】
本発明の製剤を調製するには、ｚ−ブチリデンフタリドと、ポリ無水物などの重合体とを、 所望の比率で（たとえば、ｚ−ブチリデンフタリド１０重量部およびポリ無水物９０重量部）混合する。他の例としては、ブチリデンフタリドおよびポリ無水物を溶媒中（たとえば、塩化メチレン）に溶解し、その後溶媒を除去して、乾燥パウダーを得る。
【００１７】
そのようにして得られた混合物は、さらに、ウエハ（wafers）、シート（sheets）、棒（rods）、マイクロスフィア（microspheres）、ナノスフィア（nanospheres）、ペースト（paste）、または糊（glue）などのさまざまな形態に処理されうる。たとえば、鋳型（mold）を用いて、当該混合物を圧搾（compress）してウエハにすることができる。
【００１８】
本明細書中、「製剤（pharmaceutical formulation）」という言葉は、（ｉ）たとえば、投与に適するように滅菌されているなどの、人あるいは他の哺乳類または治療されうるものに投与するのに適した組成物、ならびに（ｉｉ）少なくともひとつの薬剤（すなわち、ｚ−ブチリデンフタリド）および少なくともひとつの上述した重合体を含む組成物を意味する。前記製剤は、ピル、カプセル剤、ゲル、デポー剤（depots）、移植医療デバイス（自己拡張ステント、バルーン拡張ステント、薬剤溶出ステントおよびステントグラフトを含むステント、グラフト（大動脈グラフト）、人口心臓バルブ、髄液短絡術（cerebrospinal fluid shunts）、ペースメーカー電極、心内膜リード（endocardial leads）、生体浸食性移植（bioerodable implants）など）、および外部からのマニュピュレートデバイス（externally manipulated devices）（たとえば、カテーテルの先端を加熱することにより薬剤を放出するカテーテルを含む薬剤デバイスおよびカテーテル）などの薬剤を運搬しうるいかなるデバイスの一部またはすべてでありうる。製剤は、また、１または１以上の他の添加剤、たとえば製薬上許容しうる賦形剤、担体、浸透促進剤、安定化剤、緩衝液または投薬形態の運搬量（the deliverability of the dosage form）および／あるいは薬剤の有効性を増加させるための薬剤ならびに／もしくは重合体に関連した他の材料を含みうる。製剤は、たとえば、液体、縣濁液、固体（たとえば、錠剤、ピル、およびマイクロカプセルを含むカプセル）、乳濁液、ミセル、軟膏、ゲル、乳液、デポー（depot）（皮下に移植されたデポー（subcutaneously implanted depot））、またはステントのような移植されたデバイス上の被覆（coating）でありうる。製剤は、たとえば、パッチのように外部に適用されたり、または部分的に外部に適用され部分的に移植されたデバイスであったり、または完全に移植されたり、または皮下に注射されうる。
【００１９】
「薬剤（drug）」という言葉は、人または他の哺乳類に、局所的に（locally）および／または組織的に（systemically）、生体的に活性な物質を意味する。薬剤の例としては、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、および米国特許第６，２９７，３３７号明細書 カラム１１，１６行〜カラム１２，５８行、および米国特許出願公開第２００３／０２２４９７４号明細書の段落００４５、本明細書中にあらゆる目的で参照によって組み込まれたすべての開示に、開示されている。薬剤は、たとえば、疾患や病気を治療（treatment）、予防（prevention）、診断（diagnosis）、治癒（cure）、または緩和（mitigation）するために用いる物質で、ビタミンおよび鉱物（mineral）栄養補助食品（supplements）；哺乳類の構造または機能に影響する物質；生体的に活性または生理環境（physiological environment）に置かれた後により活性になる物質であるプロドラック；および薬剤の代謝物（metabolites of drugs）を含む。診断薬の例としては、ラジオアイソトープ（radioisotopes）を含む造影剤（imaging agents）、ヨウ素、酵素、蛍光物質などを含む対照薬（contrasting agents）などが挙げられる。
【００２０】
本発明の製剤は、また、適当な添加剤を含みうる。これらの添加剤としては、製剤を調製する際のどの段階においても、製剤中に含みうる。目的とする効果を付与するための製剤中の添加剤の所望濃度は、当業者であればわかるように、公知の方法を用いて評価しうる。
【００２１】
本発明の製剤は、液体（fluid）に接触すると、抗腫瘍薬であるｚ−ブチリデンフタリドを放出する。それゆえに、本発明はまた、製剤を必要とする患者に、その有効量を投与することによる、腫瘍を治療する方法に関する。製剤中のブチリデンフタリドは、２０、３０、３５、４０、５０、６０日のように、ある期間の時間を経て、ゆっくり、持続的に、隣接した組織中へ放出される。
【００２２】
本明細書中、「治療する（treating）」または「治療（treatment）」という言葉は、腫瘍を有する、腫瘍の兆候、腫瘍に伴う疾患もしくは病気、または腫瘍の傾向を有する患者に対して、腫瘍、腫瘍の兆候、腫瘍に伴う疾患もしくは病気、または腫瘍の傾向を、治癒する（cure）、緩和する（alleviate）、軽減する（relieve）、治療する（remedy）、または改善する（ameliorate）目的での、製剤の有効量の投与として定義される。
【００２３】
「患者（subject）」とは、人および人以外の動物を意味する。人以外の動物としては、すべての脊髄動物（vertebrates）を含み、たとえば、人以外の霊長類（特に高等霊長類）、犬、齧歯動物（rodent）（たとえば、ねずみまたはラット）、モルモット（guinea pig）、猫のような哺乳類、および鳥類、両生類、爬虫類のような非哺乳類などが挙げられる。好ましい形態としては、患者は人である。他の形態では、患者は、実験動物または疾患モデルとして適した動物である。腫瘍、がん、または他の細胞増殖性の疾患（cellular proliferative disorder）を治療される患者は、疾患のための標準的な診断技術により確認されうる。
【００２４】
腫瘍は、増大（swelling）または細胞の異常増殖（an abnormal growth of cells）によって形成された病変（lesion）である。それは、良性の腫瘍または悪性の腫瘍（すなわち、がん）でありうる。がんは、細胞が制御されていない増殖（growth）、浸潤（invasion）、ときには転移（metastasis）をする郡の疾患の部類を意味する。治療されるがんの例としては、これに制限されないが、多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）、肺がん、肝細胞がん（hepatocellular carcinoma）、結腸がん（colon cancer）、黒色腫（melanoma）、乳がん（breast cancer）、神経芽細胞腫（neuroblastoma）、奇形腫（teratoma）、およびヒト白血病（human leukemia）が挙げられる。
【００２５】
「有効量」という言葉は、治療される患者に治療効果を付与する製剤または化合物の量を意味する。治療方法は、単独または他の薬剤もしくは治療とともに、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施されうる。ｉｎ ｖｉｖｏの場合、化合物または製剤は患者に投与される。一般的に、化合物または製剤は、製薬上許容される担体（たとえば、生理食塩水）中で調製され、経口もしくは静脈内注射により投与され、または皮下に（subcutaneously）、筋肉注射で（intramuscularly）、髄腔内に（intrathecally）、腹腔内に（intraperitoneally）、直腸内に（intrarectally）、膣内に（intravaginally）、鼻腔内に（intranasally）、胃内に（intragastrically）、気管内に（intratracheally）、肺内に（intrapulmonarily）、注入もしくは移植される。
【００２６】
好ましくは、製剤は、がん患者の皮下に（subcutaneously）、筋肉注射で（intramuscularly）、静脈内に（intravenously）、間質に（interstitially）または頭蓋内に移植されうる。ひとつの形態において、製剤は、さまざまな形態であり、腫瘍組織の除去の有無にかかわらず、がんの部位またはその近傍に、移植されうる。
【００２７】
必要な用量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の疾患の性質；患者の大きさ、重量、表面積、年齢、および性別；投与される他の薬剤；および主治医の判断に依存する。これは、栄養士（nutritionist）、食事療法士（dietician）、または治療する医者などの当業者であれば、患者の応答とともに、調整しうる。好適な用量は、０．０１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要な用量は、利用できるさまざまな化合物と、さまざまな投与経路の有効性の相違点の観点から予測されうる。
【００２８】
製剤は、外科（surgery）または放射線治療（radiotherapy）とともに用いられうる。当該製剤は、また、ひとつ以上の他の化学療法剤（chemotherapeutic agents）とともに用いられうる。化学療法剤としては、たとえば、トポテカン（topotecan）のようなカンプトテシン（camptothecins）、ドキソルビシン（doxorubicin）のようなアントラサイクリン系抗生物質（anthracycline anthracycline）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）のようなアルキル化剤、またはカルムスチン（carmustin）などが挙げられる。
【００２９】
本発明は、さらなる検討がなくとも、上述の記載から十分に実施されうる。そのために、以下の例示は、単なる例示であり、残りの開示にいかなることがあろうとも制限されない。本明細書中、引用されたすべての刊行物は、参照により全体に組み込まれる。
【実施例】
【００３０】
実施例１：重合体の合成
ＳＡ単量体を、２回アルコールから結晶化させた。２．７ｇのＳＡ単量体を６０ｍＬの無水酢酸中で、３０分間１３５〜１４０℃、真空下（１０−４トール（torr））で還流した。未反応の無水酢酸を除去した。ＳＡプレポリマー（SA prepolymer）を、真空下６０℃で乾燥し、その後乾燥トルエン（dry toluene）に溶解した。乾燥エチルエーテルおよび石油エーテルの１：１（ｖ／ｖ）混合物に、この溶液を体積比１：１０で加え、一晩静置し、ＳＡプレポリマー（１０：１ ｖ／ｖ）を析出させた。乾燥エチルエーテルおよび石油エーテルを除去した後、ＳＡプレポリマーを真空下で乾燥させた。
【００３１】
３ｇのＣＰＰ単量体を５０ｍＬの無水酢酸と３０分間１５０℃、真空下（１０−４トール（torr））で還流した。冷却後、反応混合物をろ過した。ろ液から、いくぶんかの未反応の無水酢酸を除去して、濃縮し、ＣＰＰプレポリマーを０℃で結晶化した。残った未反応の無水酢酸は除去した。ＣＰＰプレポリマーをエーテルで洗浄し、真空下で乾燥した。続いて、ＣＰＰプレポリマーにＤＭＦおよび乾燥エーテル（ＤＭＦ：乾燥エーテル＝１：９）を加えた。約１２時間後、ＤＭＦおよびエーテルを除去し、ＣＰＰプレポリマーの結晶を真空下で、再度乾燥した。
【００３２】
２０：８０の比のＣＰＰプレポリマーおよびＳＡプレポリマーを、ガラスチューブ（２×２０ｃｍ）にチャージし、オイルバス中、１分間１８０℃で加熱した。圧力は、１０−４ｍｍＨｇまで減圧された。重合の間、真空を１５分ごとに解除（eliminated）した。チューブをジクロロメタンで洗浄した後、石油エーテルを加え、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体を析出させ、無水エーテルで洗浄して真空下で乾燥した。
【００３３】
このｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体を、ＩＲおよび１Ｈ ＮＭＲで測定した。ＩＲ測定では、無水物結合の特徴的なシグナルが１８１２．７６ｃｍ−１に観測された。１Ｈ ＮＭＲ測定では、ＣＰＰの芳香族プロトンの特徴的なシグナルが、６．９−８．２ｐｐｍに観測され、メチレンのプロトンの特徴的なシグナルが１．３ｐｐｍに観測された。さらに、共重合体中のＣＰＰおよびＳＡの比は、１Ｈ ＮＭＲのＣＰＰおよびＳＡのピーク強度によれば、１：４〜１：５に同定された。
【００３４】
ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）重合体を、ｚ−Ｂｄｐｈを混合し、ｚ−Ｂｄｐｈの重量に対して３％または１０％を含む混合物を得た。９７％ ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）および３％ １，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea）（ＢＣＮＵ）を含む混合物を調製した。それぞれの混合物を、１０％（ｗ／ｖ）の濃度で塩化メチレンに溶解した。溶液を真空下で７２時間乾燥した。このようにして得られた乾燥粉末をステンレススティール鋳型（a stainless steel mold）を（内部径、１３ｍｍ）用いて、Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４，５４（８）：２２０７−１２；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ． １９８５，１９（８）：９４１−５５；およびＳｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ． ２００２，５６（３）：２０９−１７に記載されているように、Ｃａｒｖｅｒ Ｐｒｅｓｓの２００ｐｓｉの軽い圧力下、圧縮（compressed）し、ｚ−Ｂｄｐｈ ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）ディスクを形成した（１００ｍｇ／ｄｉｓｃ）。同サイズのＢＣＮＵ ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）ディスクを圧縮成形（compression molding）により調製した。
【００３５】
実施例２：放出速度（Release kinetics）
ｚ−Ｂｄｐｈ−ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）ディスクを、０．１ｍＬの０．１Ｍリン酸−緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）および１．０ｍＬのｎ−オクタノールの入ったシンチレーションバイアル中に置き、３７℃でインキュベーションした。溶液は、さまざまな時間において、新しい緩衝液に置き換えた。３１０ｎｍの波長での吸収を、Ｗｅｉｎｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． １９９５，６２（５）：６０５−９に記載のように、分光光度計を用いて測定し、緩衝液中のｚ−Ｂｄｐｈの濃度を決定した。ｚ−Ｂｄｐｈの持続的な放出が確認された。
【００３６】
実施例３：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏでの放出制御および細胞毒性
ＲＧ２ラット多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）（ＧＢＭ）細胞におけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈの成長抑制効果（the growth inhibitory effects）の分析測定を行った。ＲＧ２細胞を、１０％Ｂｄｐｈ−ウエハ（wafer）で２４時間処理した。細胞生存率（Cell viability）を、ＭＴＴ分析により測定した。ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈの成長抑制効果は、コントロールと比較すると、５０％であることがわかった。さらに、ＧＢＭ細胞の形態は徐々に変化し、そして処理後には培養皿の下部から細胞の分離が観測された。未処理の細胞と比較すると、分離したＧＢＭ細胞のほとんどは、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理後にアポトーシス（apoptotic）した。
【００３７】
データは、３つの独立した実験から、平均±ＳＤまたはＳＥ（それぞれ、標準偏差および標準エラー（standard error））として表されている。統計的有意性は、スチューデントｔ−検定（Student's t-test）およびＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定より分析した。生存率分析（survival analysis）は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法を用いて行った。Ｐ値０．０５以下は有意性があるとみなされる。
【００３８】
実施例４：ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−ｚ−Ｂｄｐｈによって引き起こされるアポトーシス経路およびＮｕｒｒ転移（Nurr translocattion）
オリゴデオキシヌクレオチドのマクロアレイ分析（oligodeoxynucleotide-based microarray analysis）の結果を確認するために、ｚ−Ｂｄｐｈ処理したＲＧ２細胞中のオーファン受容体（orphan receptors）ＮＯＲ−１、Ｎｕｒｒ１、およびＮｕｒ７７の発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。
【００３９】
ＲＧ２細胞を、さまざまな期間（０、０．５、１、３、および６ｈ）のｚ−ＢｄｐｈのＩＣ５０濃度でインキュベートした。インキュベート後、細胞を回収し、トータルＲＮＡ（total RNA）を分離した。ＧＡＤＰＨの発現を、内部コントロール（internal control）として用いた。
【００４０】
ｚ−Ｂｄｐｈ処理後、Ｎｕｒｒ７７のｍＲＮＡ発現は、時間依存方式（a time-dependent manner）で、細胞内で誘導された。Ｎｕｒｒ７ ｍＲＮＡ発現が、ｚ−Ｂｄｐｈ処理後の半時間から処理後の６時間、有意に誘導された。ｚ−Ｂｄｐｈ処理後に大きく誘導されたＮｕｒ７７は、成長抑制およびアポトーシスに関係しており、Ｎｕｒ７７誘導（Nur77 induction）が、ＧＢＭ細胞内のｚ−Ｂｄｐｈに誘導されるアポトーシス（z-Bdph -induced apoptosis）の初期段階（early event）になりうることを示している。
【００４１】
ｚ−Ｂｄｐｈに応答して生じるＮｕｒ７７の転移（translocation）について調べた。ＤＢＴＲＧ−０５ＮＧ細胞（ヒトＧＢＭ細胞）を、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で２４時間処理し、その後、対応するローダミン−共役抗ＩｇＧ二次抗体（Rhodamine-conjugated anti-IgG secondary antibody）により、抗Ｎｕｒ７７抗体（anti-Nur77 antibody）で免疫染色した（immunostained）。同時に、細胞をＤＡＰＩで染色し、核を表示した。蛍光顕微鏡で蛍光像を可視化した。結果は、Ｎｕｒ７７は、細胞質ゾル内よりも核内において、より豊富であることを示した。ｚ−Ｂｄｐｈ処理後の２４時間、Ｎｕｒ７７は核から細胞質まで転移（translocated）した。
【００４２】
さらに確認するために、細胞の細胞質ゾルおよび核フラクションを、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により調べた。ＲＧ２細胞を、１０ｃｍ皿上に固定化し、９０％コンフルエンス（confluence）までインキュベートした。細胞を、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で、異なる期間（０、６、１２、２４、および４８時間）で処理した。細胞を採取し、核および細胞質フラクションを分離した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により、ｚ−Ｂｄｐｈ処理がない場合、Ｎｕｒ７７は、核内に圧倒的に多く存在することが示された。
【００４３】
最後に、ｚ−Ｂｄｐｈに誘導されるＮｕｒ７７遺伝子発現に伴うシグナル経路を調べた。ＲＧ２細胞を、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で、さまざまな期間（０、１５、３０、６０、および１８０分）で処理した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により、ＪＮＫ、ＡＫＴ、ＥＲＫは、ｚ−Ｂｄｐｈ処理後の１時間、有意にリン酸化されたことが示された。さらに、ＭＴＴ分析結果により、細胞を５−２０ｎＭのｐＪＮＫ抑制剤で前処理し、ｚ−Ｂｄｐｈで処理した後の細胞生存率が増加したことを示された。
【００４４】
実施例５：動物実験（Animal studies）
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（台北、台湾）から、オスのＦ３４４ラット（２３０−２６０ｇ）およびオスのＦｏｘｎ１ ｎｕ／ｎｕマウス（１０−１２週）を入手した。すべての手順を、ナショナルＴａｕ Ｈｗａユニバーシティ（ホァーリュン（Hualien）、台湾）およびチャイナメディカルユニバーシティホスピタル（台中（Taichung）、台湾）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒの標準作業手順に従って行った。ＲＧ２細胞およびＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞を動物実験に用いて、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％または１０％ｚ−Ｂｄｐｈ製剤およびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵの抗腫瘍活性（anti-tumor activities）を測定した。
【００４５】
同系のＦ３４４ラットに皮下背中にＲＧ２細胞の移植をした。動物に、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ製剤、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ、またはポリマーのみを移植した。腫瘍細胞移植後、もとの注射部位から少なくとも１．５ｃｍを除去した。
【００４６】
さらに、Ｆｏｘｎ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞の皮下移植、およびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ製剤、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ、またはポリマーのみの皮下移植をして、腫瘍細胞移植後、
もとの注射部位から少なくとも１．５ｃｍを除去した。
【００４７】
腫瘍サイズをキャリパー（caliper）を用いて測定し、容積は、Ｌ×Ｈ×Ｗ×０．５２３６として計算した。腫瘍の容積がラットは２５ｃｍ３を超え、マウスは１０００ｍｍ３を超えた場合、動物は処分した。ラットおよびマウスの最終生存日を日付として計算に用いた。
【００４８】
実施例６：動物モデルのｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−ｚ−Ｂｄｐｈ治療効果
Ｆ３４４ラットの後部脇腹領域に、ＲＧ２細胞（５×１０６）を皮下移植した。ＲＧ２細胞移植の５日後、ラットに、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ｚ−Ｂｄｐｈ、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）のみ、またはｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵを皮下に処理した。ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ処理群、およびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）処理群に比べて、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群において、大きな腫瘍成長抑制が観測された（ｐ＜０．００５）。
【００４９】
３０日の平均的な腫瘍サイズはコントロール（未処理）群が２０７０．７９±７８４．９０ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）処理群が１５８６．３０±２４３．６９ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群が３４６．７１±５２１．６８ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群が８７．８９±１６７．４４ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ処理群が３５７．４８±２７．３０ｍｍ３だった。
【００５０】
細胞増殖を示すｋｉ−６７の免疫組織化学的染色により、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群における細胞増殖の著しい減少が示された。さらに、アポトーシスを示すカスパーゼの免疫組織化学的染色により、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群における細胞のアポトーシスの著しい増加が示された。
【００５１】
最終的に、体重およびさまざまな器官の組織学的分析により評価されたように、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群における動物には、毒性に関与する薬剤は観測されなかった。対照的に、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ処理群においては、著しい体重の減少が観測された。
【００５２】
実施例７：異種移植された腫瘍の成長におけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−ｚ−Ｂｄｐｈ処理群の治療効果
Ｆｏｘｎｌヌードマウスに、ヒトＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞（２×１０６）を接種させ、５日目にｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−ｚ−Ｂｄｐｈ（０％、３％、１０％）を移植した。３％および１０％のｚ−Ｂｄｐｈ−ウエハ処理群の腫瘍成長の著しい抑制が観測された。３９日目の腫瘍サイズの平均値は、コントロール群 １０９８．４６±１７０．１１、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群 ６０５．８±９８．８ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群 ５０４．４±３８．９ｍｍ３であった（ｐ＜０．０５）。
【００５３】
実施例８：ｚ−Ｂｄｐｈのヒト多形膠芽細胞腫（human glioblastoma multiformis）の転移（migration）および浸潤（invasion）の抑制
ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞の浸潤を、バイオコート腫瘍浸潤チャンバーシステム（BioCoat matrigel invasion chamber system）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて測定した。ＢＤマトリゲルマトリックス（BD matrigel Matrix）は、８μｍの孔径を有するポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）メンブレン上、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ニドジェン／エンタクチン（nidogen/entrctin）、およびプロテオグリカンから構成される。Ｉｎ Ｖｉｔｒｏの転移分析では、ファルコンカルチャーインサート（Falcon culture insert）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上の低い細孔密度（pore density）のＰＥＴトラックエッチドメンブレン（track-etched membrane）が適用された。メンブレンを、マトリゲルチャンバーまたはファルコンカルチャーインサートの上部と下部ウエルの間に置いた。まず最初に、１０％ウシ胎仔血清（fetal bovine serum）を含むＰＲＭＩ１６４０中に細胞を再懸濁し、チャンバーの上部ウエル中にシードした（１ウエルにつき細胞５０，０００）。２４時間３７℃でインキュベートした後、メンブレンを浸潤または転移した細胞を、Ｌｉｕ染色（Ｈａｎｄｓｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，台北、台湾）で染色し、顕微鏡下でカウントした。それぞれの実験は、３回繰り返した。
【００５４】
上述の組織（system）を、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞（ヒトＧＢＭ）の転移および浸潤におけるｚ−Ｂｄｐｈの効果を調べるために用いた。ｚ−Ｂｄｐｈが、用量依存的に、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞の転移および浸潤を抑制することがわかった。
【００５５】
実施例９：ｚ−ＢｄｐｈのＡｘｌ抑制を経由する腫瘍の転移および浸潤の抑制
悪性の脳腫瘍をｚ−Ｂｄｐｈが抑制するメカニズムを解明するため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＧＢＭ細胞の遺伝子発現プロファイル上のｚ−Ｂｄｐｈの効果を調べた。Ａｘｌレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のｍＲＮＡ発現が、ｚ−Ｂｄｐｈの存在下で下方制御されたことがわかった。
【００５６】
さらに、Ａｘｌの過剰発現（over-expression）（すなわち、ＧＢＭ細胞へのｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌプラスミドを導入することによるもの）が、Ａｘｌが媒介するＧＢＭ細胞の増殖、転移および湿潤におけるｚ−Ｂｄｐｈの抑制効果を逆転させることができる。
【００５７】
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析も実施して、ｚ−Ｂｄｐｈの存在下でのＧＢＭ細胞のＡｘｌタンパク質レベルを調べた。Ａｘｌタンパク質レベルが減少した結果となった。
【００５８】
タンパク質チロシンキナーゼが細胞増殖および分化（differentiation）の制御ならびにヒト神経膠腫を含む多くの新生組織形成の発生に重要な役割を担っていることは、これまでによく知られていることである。Ａｘｌは腫瘍転移および浸潤を伴うことが報告されていた。上記結果は、ｚ−ＢｄｐｈがＡｘｌレセプターチロシンキナーゼのタンパク質発現を抑制し、それによりＧＢＭ細胞の転移および湿潤を抑制したことを示している
他の実施形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせられうる。本明細書に開示のそれぞれの特徴は、同一の、均等な、または類似の目的を達成する他の特徴により置換されうる。よって、特記しない限り、開示されたそれぞれの特徴は、広範な一連の均等なまたは類似の特徴の一例に過ぎない。
【００５９】
当業者であれば、上述した記載から本発明の本質的な特徴を容易に認識することができ、本発明の思想および範囲から逸脱することがなく、発明に種々の変更および修飾を施し、種々の用途および条件に適合させることができる。よって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲に包含される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本特許出願は、２０１０年１月５日出願の、米国仮特許出願６１／２９２，３１１号の優先権を主張し、これらの出願の内容は参照により本明細書に引用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ｎ−ブチリデンフタリド（n-Butylidenephthalide）（Ｂｄｐｈ）は、アンゼリカ・シネンシス（Angelica sinensis）から分離された化学化合物である。当該化合物は、たとえば、多形性膠芽腫（gliobastoma multiforme）および乳がん（breast cancer）のようなさまざまな腫瘍を治療するのに用いられうる。たとえば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５， １１（９）：３４７５−３４８４、およびＴｓａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２００６， ９９（４）：１２５１−６２を参照。しかしながら、その使用において、効果的ながん治療のためには、ｎ−ブチリデンフタリドをがんの部位に選択的および持続的に運搬することが重要な意味を有する。このことは、血液脳関門（blood brain barrier）のために薬剤が疾患部位に到達するのが困難な脳腫瘍を治療するのに特に重要なことである。薬剤の運搬に効果的な方法を開発する必要があった。
【発明の概要】
【０００３】
要約
本発明は、ｎ−ブチリデンフタリド、特に、Ｚ型ｎ−ブチリデンフタリド（すなわち、（Ｚ）−ｎ−ブチリデンフタリド、ｚ−ブチリデンフタリドおよびｚ−Ｂｄｐｈ）が、Ｅ型ｎ−ブチリデンフタリド（すなわち、（Ｅ）−ｎ−ブチリデンフタリド、ｅ−ブチリデンフタリドおよびｅ−Ｂｄｐｈ）よりも、３０日以上の長い期間を通じて放出され、抗腫瘍効果を有する製剤の発見に基づいている。
【０００４】
本発明は、ひとつの態様において、（ｉ）ｚ−ブチリデンフタリドおよび（ｉｉ）重合体を含み、それらが共に混合されている製剤に関する。
【０００５】
重合体としては、乳酸・グリコール酸共重合体、キトサン、コラーゲン、ハイドロゲル、または、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ブタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ペンタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘプタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）オクタン、イソフタル酸、１，４−フェニレンジプロピオン酸、ドデカンジオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、またはこれらの混合物から調製されるポリ無水物（polyanhydride）が挙げられる。
【０００６】
製剤の例としては、ｚ−ブチリデンフタリドと、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン（ＣＰＰ）およびセバシン酸（ＳＡ）から調製されるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）ポリ無水物と、の混合物が挙げられる。ポリ無水物において、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンとセバシン酸の比は、好ましくは、１：２〜１：１０（たとえば、１：４）である。ｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントは、製剤中、３％〜５０％（たとえば、３％〜２０％、１０％、および１５％）である。製剤は、粉体、ウエハ、シート、棒、マイクロスフィア、ナノスフィア、ペースト、または糊の形態でありうる。
【０００７】
本発明は、他の態様において、腫瘍の治療のための上記製剤の使用に関する。治療される腫瘍の例としては、これに制限されないが、多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）、肺がん, 肝細胞がん（hepatocellular carcinoma）、結腸がん（colon cancer）、黒色腫（melanoma）、乳がん（breast cancer）、神経芽細胞腫（neuroblastoma）、奇形腫（teratoma）およびヒト白血病（human leukemia）が挙げられる。
【０００８】
また、本発明の範囲には、腫瘍を治療するための薬剤を製造するときの上記製剤の使用も含まれる。
【０００９】
本発明のひとつ以上の形態は、添付された図面および明細書に詳細に記載されている。本発明の他の特徴、目的および有利な点は明細書および図面、ならびに請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。ＣＰＰの芳香族プロトンに特徴的なシグナルが６．９〜８．２ｐｐｍに観測された。ＳＡのメチレンプロトンに特徴的なシグナルが１．３ｐｐｍに観測された。
【図２】図２は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体のＦＴＩＲスペクトルである。ＣＰＰとＳＡ間の無水物結合に特徴的なシグナルが１８１２．７６ｃｍ−１に観測された。
【図３】図３は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−２％ＢＣＮＵウエハ、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％Ｂｄｐｈ、およびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％Ｂｄｐｈの放出速度（Release kinetics）を示す図である。すべての製剤において、ＢｄｐｈまたはＢＣＮＵが放出を維持することが観測された。
【図４】図４は、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％Ｂｄｐｈに誘導されるラット悪性神経膠腫（malignant glioma）細胞の成長抑制を示す図である。（Ａ）のラット悪性神経膠腫細胞ＲＧ２系列（line RG2）を２４時間１０％Ｂｄｐｈ−ウエハで処理した。細胞生存率は、ＭＴＴ分析により決定した。このデータは３回の独立した実験からの平均値と標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）ウエハ処理を行ったＲＧ２悪性神経膠腫細胞の細胞形態。（Ｃ）２４時間ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％Ｂｄｐｈ処理を行ったＲＧ２悪性神経膠腫細胞の細胞形態。（Ｄ）２４時間ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％Ｂｄｐｈ処理を行ったＲＧ２悪性神経膠腫細胞の細胞形態。
【図５】図５は、Ｂｄｐｈに誘導されるＮｕｒ７７転写産物（transcript）を示す図である。ラットＧＢＭ細胞（ＲＧ２）を、ＢｄｐｈのＩＣ５０濃度で記載された時間で処理した。薬剤のインキュベート後、細胞を回収し、トータルＲＮＡ（total RNA）を分離した。ＧＡＤＰＨを内部コントロールとして用いた。
【図６】図６は、Ｂｄｐｈに誘導されるＮｕｒ７７の核から細胞質（cytoplasm）への転移を示す図である。（ａ）ＤＢＴＲＧ−０５ＮＧ細胞を、２４時間Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で処理して、その後、対応するローダミン−共役抗ＩｇＧ二次抗体（Rhodamine-conjugated anti-IgG secondary antibody）により、抗Ｎｕｒ７７抗体（anti-Nur77 antibody）で免疫染色して、Ｎｕｒ７７タンパク質を表示した。同時に、細胞をＤＡＰＩで染色し、核を表示した。蛍光顕微鏡で蛍光像を可視化した。
【図７】図７は、ＲＧ２細胞におけるＢｄｐｈに誘導されるＮｕｒ７７核細胞質間転移（nucleo-cytoplasmic translocation）を示す図である。ＲＧ２細胞を、１０ｃｍ皿上に固定化し、９０％コンフルエンス（confluence）までインキュベートした。細胞を、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で、異なる期間（０、６、１２、２４、および４８時間）で処理した。細胞を採取し、核および細胞質フラクションを分離した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により、Ｎｕｒ７７の核および細胞質を観測し定量した。
【図８】図８は、Ｂｄｐｈに誘導される成長抑制のシグナル経路を示す図である。示されているように、ＲＧ２細胞を、０〜１８０分のさまざまな継続時間において、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で処理した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を、ｐＪＮＫ、ｐＰＫＣ、ｐＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐＥＲＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐｐ３８およびｐ３８抗体に対して実施した。β−アクチンを内部コントロールとして用いた。
【図９Ａ】図９は、同種ラットＧＢＭモデルにおけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）による腫瘍成長の抑制を示す図である。ＲＧ２細胞（５×１０６）をＦ３４４ラットの皮下背中に移植した。ＲＧ細胞の移植の５日後、ＲＧ２細胞のみを移植された７匹のラットをコントロール群（●）とし、他のラットは、それぞれ、ウエハ（□）、３％Ｂｄｐｈ−ウエハ（▲）、１０％Ｂｄｐｈ−ウエハ（■）、および３％ＢＣＮＵ−ウエハ（×）で処理した。図９（Ａ）は、腫瘍サイズは、平均値と標準偏差を示した。
【図９Ｂ】図９（Ｂ）体重もまた、平均値と標準偏差を示した。
【図９Ｃ】図９（Ｃ）は、ＧＢＭ組織における免疫組織化学染色を分析した（ＲＧ２細胞の移植後の３０日目）ものを示す。ウエハ群、３％Ｂｄｐｈ−ウエハ群、１０％Ｂｄｐｈ−ウエハ群および３％ＢＣＮＵ−ウエハ群の切片（sections）の代表的な画像である。ｋｉ−６７、開裂されたカスパーゼ３、およびＮｕｒ７７の免疫組織化学染色されたＧＢＭ腫瘍である。Ｋｉ−６７−、開裂されたカスパーゼ３−、またはＮｕｒ７７−陽性細胞を茶色に染色した（４００×）。
【図１０】図１０は、異種移植のヒトＧＢＭヌードマウスモデルにおいてＢｄｐｈウエハが腫瘍成長を抑制したことを示す図である（２×１０６）。Ｆｏｘｎ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞を皮下に移植した。ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞移植の５日後、マウスはウエハ（◆）、３％Ｂｄｐｈ−ウエハ（■）および１０％Ｂｄｐｈウエハ（▲）でそれぞれ処理した。（Ａ）腫瘍サイズは、平均値と標準偏差を示した。（Ｂ）体重もまた、平均値と標準偏差を示した。（Ｃ）、（Ｄ）画像は、ヌードマウスにおいて腫瘍をウエハ、３％Ｂｄｐｈ−ウエハまたは１０％Ｂｄｐｈ−ウエハで処理したものを示す。Ｐ＜０．０１。
【図１１】図１１は、ＢｄｐｈがＡｘｌタンパク質発現を制御することを実証したＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を示す図である。
【図１２】図１２は、腫瘍細胞転移および浸潤分析を評価するための１２−ウエルインサートシステム（12-well insert system）を示す図である。
【図１３】図１３は、２４ウエルインサートシステムを用いることにより、Ｂｄｐｈが用量依存的に腫瘍細胞転移を抑制することを示す図である。
【図１４】図１４は、２４ウエルインサートシステムを用いることにより、Ｂｄｐｈが用量依存的に腫瘍細胞浸潤を抑制することを示す図である。
【図１５】図１５は、腫瘍細胞増殖（tumor cell proliferation）を抑制するＢｄｐｈが用量依存的にＤＢＴＲＧ脳腫瘍細胞のＡｘｌ発現により逆転されうることを示す図である。
【図１６】図１６は、細胞転移および湿潤を検出するためのＯｒｉｓＴＭシステムを示す図である。
【図１７】図１７は、ＯｒｉｓＴＭシステムを用いることにより、Ｂｄｐｈによる細胞転移の抑制が、用量依存的にＤＢＴＲＧ脳腫瘍細胞のＡｘｌ発現により逆転されうることを示す図である。
【図１８】図１８は、ＢＰによる細胞湿潤の抑制が、ＤＢＴＲＧ脳腫瘍細胞のＡｘｌ発現により逆転されうることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の詳細な説明
本発明のひとつの態様は、ｎ−ブチリデンフタリド、特にそのｚ型、ｚ−ブチリデンフタリド、および重合体を含む製剤に関する。該製剤は、多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）のような腫瘍の成長を抑制するのに用いることができる。
【００１２】
本発明の実施のために用いられるｚ−ブチリデンフタリドは、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｌｔｄ．（ＵＫ）から入手できるような市販のものを用いることができる。該化合物は、アンゼリカ・シネンシスのクロロホルム抽出によっても分離することができる。Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５，１１（９）：３４７５−３４８４を参照。購入または分離したｚ−ブチリデンフタリドを、フラッシュカラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、結晶化、またはその他の好適な方法によってさらに精製することができる。
【００１３】
本発明の実施のために用いられる重合体は、市販のものまたは公知の方法で調製されたものを用いることができる。たとえば、無水酢酸中で二酸の化合物（diacid compound）を還流してポリ無水物が得られる。
【００１４】
重合体は共重合体でありうる。たとえば、共重合体としては、溶融重合（melt polycondensation）を用いて、２つの相違するポリ無水物部分から調製されうる。Ｄｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２５：３３７３−３３８６を参照。
【００１５】
得られた重合体を、適当な方法で精製し、ＮＭＲ、ＭＳ、またはＦＴ−ＩＲにより確認する。
【００１６】
本発明の製剤を調製するには、ｚ−ブチリデンフタリドと、ポリ無水物などの重合体とを、 所望の比率で（たとえば、ｚ−ブチリデンフタリド１０重量部およびポリ無水物９０重量部）混合する。他の例としては、ブチリデンフタリドおよびポリ無水物を溶媒中（たとえば、塩化メチレン）に溶解し、その後溶媒を除去して、乾燥パウダーを得る。
【００１７】
そのようにして得られた混合物は、さらに、ウエハ（wafers）、シート（sheets）、棒（rods）、マイクロスフィア（microspheres）、ナノスフィア（nanospheres）、ペースト（paste）、または糊（glue）などのさまざまな形態に処理されうる。たとえば、鋳型（mold）を用いて、当該混合物を圧搾（compress）してウエハにすることができる。
【００１８】
本明細書中、「製剤（pharmaceutical formulation）」という言葉は、（ｉ）たとえば、投与に適するように滅菌されているなどの、人あるいは他の哺乳類または治療されうるものに投与するのに適した組成物、ならびに（ｉｉ）少なくともひとつの薬剤（すなわち、ｚ−ブチリデンフタリド）および少なくともひとつの上述した重合体を含む組成物を意味する。前記製剤は、ピル、カプセル剤、ゲル、デポー剤（depots）、移植医療デバイス（自己拡張ステント、バルーン拡張ステント、薬剤溶出ステントおよびステントグラフトを含むステント、グラフト（大動脈グラフト）、人口心臓バルブ、髄液短絡術（cerebrospinal fluid shunts）、ペースメーカー電極、心内膜リード（endocardial leads）、生体浸食性移植（bioerodable implants）など）、および外部からのマニュピュレートデバイス（externally manipulated devices）（たとえば、カテーテルの先端を加熱することにより薬剤を放出するカテーテルを含む薬剤デバイスおよびカテーテル）などの薬剤を運搬しうるいかなるデバイスの一部またはすべてでありうる。製剤は、また、１または１以上の他の添加剤、たとえば製薬上許容しうる賦形剤、担体、浸透促進剤、安定化剤、緩衝液または投薬形態の運搬量（the deliverability of the dosage form）および／あるいは薬剤の有効性を増加させるための薬剤ならびに／もしくは重合体に関連した他の材料を含みうる。製剤は、たとえば、液体、縣濁液、固体（たとえば、錠剤、ピル、およびマイクロカプセルを含むカプセル）、乳濁液、ミセル、軟膏、ゲル、乳液、デポー（depot）（皮下に移植されたデポー（subcutaneously implanted depot））、またはステントのような移植されたデバイス上の被覆（coating）でありうる。製剤は、たとえば、パッチのように外部に適用されたり、または部分的に外部に適用され部分的に移植されたデバイスであったり、または完全に移植されたり、または皮下に注射されうる。
【００１９】
「薬剤（drug）」という言葉は、人または他の哺乳類に、局所的に（locally）および／または組織的に（systemically）、生体的に活性な物質を意味する。薬剤の例としては、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、および米国特許第６，２９７，３３７号明細書 カラム１１，１６行〜カラム１２，５８行、および米国特許出願公開第２００３／０２２４９７４号明細書の段落００４５、本明細書中にあらゆる目的で参照によって組み込まれたすべての開示に、開示されている。薬剤は、たとえば、疾患や病気を治療（treatment）、予防（prevention）、診断（diagnosis）、治癒（cure）、または緩和（mitigation）するために用いる物質で、ビタミンおよび鉱物（mineral）栄養補助食品（supplements）；哺乳類の構造または機能に影響する物質；生体的に活性または生理環境（physiological environment）に置かれた後により活性になる物質であるプロドラック；および薬剤の代謝物（metabolites of drugs）を含む。診断薬の例としては、ラジオアイソトープ（radioisotopes）を含む造影剤（imaging agents）、ヨウ素、酵素、蛍光物質などを含む対照薬（contrasting agents）などが挙げられる。
【００２０】
本発明の製剤は、また、適当な添加剤を含みうる。これらの添加剤としては、製剤を調製する際のどの段階においても、製剤中に含みうる。目的とする効果を付与するための製剤中の添加剤の所望濃度は、当業者であればわかるように、公知の方法を用いて評価しうる。
【００２１】
本発明の製剤は、液体（fluid）に接触すると、抗腫瘍薬であるｚ−ブチリデンフタリドを放出する。それゆえに、本発明はまた、製剤を必要とする患者に、その有効量を投与することによる、腫瘍を治療する方法に関する。製剤中のブチリデンフタリドは、２０、３０、３５、４０、５０、６０日のように、ある期間の時間を経て、ゆっくり、持続的に、隣接した組織中へ放出される。
【００２２】
本明細書中、「治療する（treating）」または「治療（treatment）」という言葉は、腫瘍を有する、腫瘍の兆候、腫瘍に伴う疾患もしくは病気、または腫瘍の傾向を有する患者に対して、腫瘍、腫瘍の兆候、腫瘍に伴う疾患もしくは病気、または腫瘍の傾向を、治癒する（cure）、緩和する（alleviate）、軽減する（relieve）、治療する（remedy）、または改善する（ameliorate）目的での、製剤の有効量の投与として定義される。
【００２３】
「患者（subject）」とは、人および人以外の動物を意味する。人以外の動物としては、すべての脊髄動物（vertebrates）を含み、たとえば、人以外の霊長類（特に高等霊長類）、犬、齧歯動物（rodent）（たとえば、ねずみまたはラット）、モルモット（guinea pig）、猫のような哺乳類、および鳥類、両生類、爬虫類のような非哺乳類などが挙げられる。好ましい形態としては、患者は人である。他の形態では、患者は、実験動物または疾患モデルとして適した動物である。腫瘍、がん、または他の細胞増殖性の疾患（cellular proliferative disorder）を治療される患者は、疾患のための標準的な診断技術により確認されうる。
【００２４】
腫瘍は、増大（swelling）または細胞の異常増殖（an abnormal growth of cells）によって形成された病変（lesion）である。それは、良性の腫瘍または悪性の腫瘍（すなわち、がん）でありうる。がんは、細胞が制御されていない増殖（growth）、浸潤（invasion）、ときには転移（metastasis）をする郡の疾患の部類を意味する。治療されるがんの例としては、これに制限されないが、多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）、肺がん、肝細胞がん（hepatocellular carcinoma）、結腸がん（colon cancer）、黒色腫（melanoma）、乳がん（breast cancer）、神経芽細胞腫（neuroblastoma）、奇形腫（teratoma）、およびヒト白血病（human leukemia）が挙げられる。
【００２５】
「有効量」という言葉は、治療される患者に治療効果を付与する製剤または化合物の量を意味する。治療方法は、単独または他の薬剤もしくは治療とともに、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施されうる。ｉｎ ｖｉｖｏの場合、化合物または製剤は患者に投与される。一般的に、化合物または製剤は、製薬上許容される担体（たとえば、生理食塩水）中で調製され、経口もしくは静脈内注射により投与され、または皮下に（subcutaneously）、筋肉注射で（intramuscularly）、髄腔内に（intrathecally）、腹腔内に（intraperitoneally）、直腸内に（intrarectally）、膣内に（intravaginally）、鼻腔内に（intranasally）、胃内に（intragastrically）、気管内に（intratracheally）、肺内に（intrapulmonarily）、注入もしくは移植される。
【００２６】
好ましくは、製剤は、がん患者の皮下に（subcutaneously）、筋肉注射で（intramuscularly）、静脈内に（intravenously）、間質に（interstitially）または頭蓋内に移植されうる。ひとつの形態において、製剤は、さまざまな形態であり、腫瘍組織の除去の有無にかかわらず、がんの部位またはその近傍に、移植されうる。
【００２７】
必要な用量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の疾患の性質；患者の大きさ、重量、表面積、年齢、および性別；投与される他の薬剤；および主治医の判断に依存する。これは、栄養士（nutritionist）、食事療法士（dietician）、または治療する医者などの当業者であれば、患者の応答とともに、調整しうる。好適な用量は、０．０１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要な用量は、利用できるさまざまな化合物と、さまざまな投与経路の有効性の相違点の観点から予測されうる。
【００２８】
製剤は、外科（surgery）または放射線治療（radiotherapy）とともに用いられうる。当該製剤は、また、ひとつ以上の他の化学療法剤（chemotherapeutic agents）とともに用いられうる。化学療法剤としては、たとえば、トポテカン（topotecan）のようなカンプトテシン（camptothecins）、ドキソルビシン（doxorubicin）のようなアントラサイクリン系抗生物質（anthracycline anthracycline）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）のようなアルキル化剤、またはカルムスチン（carmustin）などが挙げられる。
【００２９】
本発明は、さらなる検討がなくとも、上述の記載から十分に実施されうる。そのために、以下の例示は、単なる例示であり、残りの開示にいかなることがあろうとも制限されない。本明細書中、引用されたすべての刊行物は、参照により全体に組み込まれる。
【実施例】
【００３０】
実施例１：重合体の合成
ＳＡ単量体を、２回アルコールから結晶化させた。２．７ｇのＳＡ単量体を６０ｍＬの無水酢酸中で、３０分間１３５〜１４０℃、真空下（１０−４トール（torr））で還流した。未反応の無水酢酸を除去した。ＳＡプレポリマー（SA prepolymer）を、真空下６０℃で乾燥し、その後乾燥トルエン（dry toluene）に溶解した。乾燥エチルエーテルおよび石油エーテルの１：１（ｖ／ｖ）混合物に、この溶液を体積比１：１０で加え、一晩静置し、ＳＡプレポリマー（１０：１ ｖ／ｖ）を析出させた。乾燥エチルエーテルおよび石油エーテルを除去した後、ＳＡプレポリマーを真空下で乾燥させた。
【００３１】
３ｇのＣＰＰ単量体を５０ｍＬの無水酢酸と３０分間１５０℃、真空下（１０−４トール（torr））で還流した。冷却後、反応混合物をろ過した。ろ液から、いくぶんかの未反応の無水酢酸を除去して、濃縮し、ＣＰＰプレポリマーを０℃で結晶化した。残った未反応の無水酢酸は除去した。ＣＰＰプレポリマーをエーテルで洗浄し、真空下で乾燥した。続いて、ＣＰＰプレポリマーにＤＭＦおよび乾燥エーテル（ＤＭＦ：乾燥エーテル＝１：９）を加えた。約１２時間後、ＤＭＦおよびエーテルを除去し、ＣＰＰプレポリマーの結晶を真空下で、再度乾燥した。
【００３２】
２０：８０の比のＣＰＰプレポリマーおよびＳＡプレポリマーを、ガラスチューブ（２×２０ｃｍ）にチャージし、オイルバス中、１分間１８０℃で加熱した。圧力は、１０−４ｍｍＨｇまで減圧された。重合の間、真空を１５分ごとに解除（eliminated）した。チューブをジクロロメタンで洗浄した後、石油エーテルを加え、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体を析出させ、無水エーテルで洗浄して真空下で乾燥した。
【００３３】
このｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体を、ＩＲおよび１Ｈ ＮＭＲで測定した。ＩＲ測定では、無水物結合の特徴的なシグナルが１８１２．７６ｃｍ−１に観測された。１Ｈ ＮＭＲ測定では、ＣＰＰの芳香族プロトンの特徴的なシグナルが、６．９−８．２ｐｐｍに観測され、メチレンのプロトンの特徴的なシグナルが１．３ｐｐｍに観測された。さらに、共重合体中のＣＰＰおよびＳＡの比は、１Ｈ ＮＭＲのＣＰＰおよびＳＡのピーク強度によれば、１：４〜１：５に同定された。
【００３４】
ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）重合体を、ｚ−Ｂｄｐｈを混合し、ｚ−Ｂｄｐｈの重量に対して３％または１０％を含む混合物を得た。９７％ ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）および３％ １，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea）（ＢＣＮＵ）を含む混合物を調製した。それぞれの混合物を、１０％（ｗ／ｖ）の濃度で塩化メチレンに溶解した。溶液を真空下で７２時間乾燥した。このようにして得られた乾燥粉末をステンレススティール鋳型（a stainless steel mold）を（内部径、１３ｍｍ）用いて、Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４，５４（８）：２２０７−１２；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ． １９８５，１９（８）：９４１−５５；およびＳｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ． ２００２，５６（３）：２０９−１７に記載されているように、Ｃａｒｖｅｒ Ｐｒｅｓｓの２００ｐｓｉの軽い圧力下、圧縮（compressed）し、ｚ−Ｂｄｐｈ ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）ディスクを形成した（１００ｍｇ／ｄｉｓｃ）。同サイズのＢＣＮＵ ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）ディスクを圧縮成形（compression molding）により調製した。
【００３５】
実施例２：放出速度（Release kinetics）
ｚ−Ｂｄｐｈ−ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）ディスクを、０．１ｍＬの０．１Ｍリン酸−緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）および１．０ｍＬのｎ−オクタノールの入ったシンチレーションバイアル中に置き、３７℃でインキュベーションした。溶液は、さまざまな時間において、新しい緩衝液に置き換えた。３１０ｎｍの波長での吸収を、Ｗｅｉｎｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． １９９５，６２（５）：６０５−９に記載のように、分光光度計を用いて測定し、緩衝液中のｚ−Ｂｄｐｈの濃度を決定した。ｚ−Ｂｄｐｈの持続的な放出が確認された。
【００３６】
実施例３：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏでの放出制御および細胞毒性
ＲＧ２ラット多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme）（ＧＢＭ）細胞におけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈの成長抑制効果（the growth inhibitory effects）の分析測定を行った。ＲＧ２細胞を、１０％Ｂｄｐｈ−ウエハ（wafer）で２４時間処理した。細胞生存率（Cell viability）を、ＭＴＴ分析により測定した。ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈの成長抑制効果は、コントロールと比較すると、５０％であることがわかった。さらに、ＧＢＭ細胞の形態は徐々に変化し、そして処理後には培養皿の下部から細胞の分離が観測された。未処理の細胞と比較すると、分離したＧＢＭ細胞のほとんどは、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理後にアポトーシス（apoptotic）した。
【００３７】
データは、３つの独立した実験から、平均±ＳＤまたはＳＥ（それぞれ、標準偏差および標準エラー（standard error））として表されている。統計的有意性は、スチューデントｔ−検定（Student's t-test）およびＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定より分析した。生存率分析（survival analysis）は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法を用いて行った。Ｐ値０．０５以下は有意性があるとみなされる。
【００３８】
実施例４：ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−ｚ−Ｂｄｐｈによって引き起こされるアポトーシス経路およびＮｕｒｒ転移（Nurr translocattion）
オリゴデオキシヌクレオチドのマクロアレイ分析（oligodeoxynucleotide-based microarray analysis）の結果を確認するために、ｚ−Ｂｄｐｈ処理したＲＧ２細胞中のオーファン受容体（orphan receptors）ＮＯＲ−１、Ｎｕｒｒ１、およびＮｕｒ７７の発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。
【００３９】
ＲＧ２細胞を、さまざまな期間（０、０．５、１、３、および６ｈ）のｚ−ＢｄｐｈのＩＣ５０濃度でインキュベートした。インキュベート後、細胞を回収し、トータルＲＮＡ（total RNA）を分離した。ＧＡＤＰＨの発現を、内部コントロール（internal control）として用いた。
【００４０】
ｚ−Ｂｄｐｈ処理後、Ｎｕｒｒ７７のｍＲＮＡ発現は、時間依存方式（a time-dependent manner）で、細胞内で誘導された。Ｎｕｒｒ７ ｍＲＮＡ発現が、ｚ−Ｂｄｐｈ処理後の半時間から処理後の６時間、有意に誘導された。ｚ−Ｂｄｐｈ処理後に大きく誘導されたＮｕｒ７７は、成長抑制およびアポトーシスに関係しており、Ｎｕｒ７７誘導（Nur77 induction）が、ＧＢＭ細胞内のｚ−Ｂｄｐｈに誘導されるアポトーシス（z-Bdph -induced apoptosis）の初期段階（early event）になりうることを示している。
【００４１】
ｚ−Ｂｄｐｈに応答して生じるＮｕｒ７７の転移（translocation）について調べた。ＤＢＴＲＧ−０５ＮＧ細胞（ヒトＧＢＭ細胞）を、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で２４時間処理し、その後、対応するローダミン−共役抗ＩｇＧ二次抗体（Rhodamine-conjugated anti-IgG secondary antibody）により、抗Ｎｕｒ７７抗体（anti-Nur77 antibody）で免疫染色した（immunostained）。同時に、細胞をＤＡＰＩで染色し、核を表示した。蛍光顕微鏡で蛍光像を可視化した。結果は、Ｎｕｒ７７は、細胞質ゾル内よりも核内において、より豊富であることを示した。ｚ−Ｂｄｐｈ処理後の２４時間、Ｎｕｒ７７は核から細胞質まで転移（translocated）した。
【００４２】
さらに確認するために、細胞の細胞質ゾルおよび核フラクションを、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により調べた。ＲＧ２細胞を、１０ｃｍ皿上に固定化し、９０％コンフルエンス（confluence）までインキュベートした。細胞を、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で、異なる期間（０、６、１２、２４、および４８時間）で処理した。細胞を採取し、核および細胞質フラクションを分離した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により、ｚ−Ｂｄｐｈ処理がない場合、Ｎｕｒ７７は、核内に圧倒的に多く存在することが示された。
【００４３】
最後に、ｚ−Ｂｄｐｈに誘導されるＮｕｒ７７遺伝子発現に伴うシグナル経路を調べた。ＲＧ２細胞を、Ｂｄｐｈ（１００μｇ／ｍＬ）で、さまざまな期間（０、１５、３０、６０、および１８０分）で処理した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析により、ＪＮＫ、ＡＫＴ、ＥＲＫは、ｚ−Ｂｄｐｈ処理後の１時間、有意にリン酸化されたことが示された。さらに、ＭＴＴ分析結果により、細胞を５−２０ｎＭのｐＪＮＫ抑制剤で前処理し、ｚ−Ｂｄｐｈで処理した後の細胞生存率が増加したことを示された。
【００４４】
実施例５：動物実験（Animal studies）
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（台北、台湾）から、オスのＦ３４４ラット（２３０−２６０ｇ）およびオスのＦｏｘｎ１ ｎｕ／ｎｕマウス（１０−１２週）を入手した。すべての手順を、ナショナルＴａｕ Ｈｗａユニバーシティ（ホァーリュン（Hualien）、台湾）およびチャイナメディカルユニバーシティホスピタル（台中（Taichung）、台湾）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒの標準作業手順に従って行った。ＲＧ２細胞およびＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞を動物実験に用いて、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％または１０％ｚ−Ｂｄｐｈ製剤およびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵの抗腫瘍活性（anti-tumor activities）を測定した。
【００４５】
同系のＦ３４４ラットに皮下背中にＲＧ２細胞の移植をした。動物に、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ製剤、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ、またはポリマーのみを移植した。腫瘍細胞移植後、もとの注射部位から少なくとも１．５ｃｍを除去した。
【００４６】
さらに、Ｆｏｘｎ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞の皮下移植、およびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ製剤、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ、またはポリマーのみの皮下移植をして、腫瘍細胞移植後、
もとの注射部位から少なくとも１．５ｃｍを除去した。
【００４７】
腫瘍サイズをキャリパー（caliper）を用いて測定し、容積は、Ｌ×Ｈ×Ｗ×０．５２３６として計算した。腫瘍の容積がラットは２５ｃｍ３を超え、マウスは１０００ｍｍ３を超えた場合、動物は処分した。ラットおよびマウスの最終生存日を日付として計算に用いた。
【００４８】
実施例６：動物モデルのｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−ｚ−Ｂｄｐｈ治療効果
Ｆ３４４ラットの後部脇腹領域に、ＲＧ２細胞（５×１０６）を皮下移植した。ＲＧ２細胞移植の５日後、ラットに、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ｚ−Ｂｄｐｈ、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）のみ、またはｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵを皮下に処理した。ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ処理群、およびｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）処理群に比べて、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群において、大きな腫瘍成長抑制が観測された（ｐ＜０．００５）。
【００４９】
３０日の平均的な腫瘍サイズはコントロール（未処理）群が２０７０．７９±７８４．９０ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）処理群が１５８６．３０±２４３．６９ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群が３４６．７１±５２１．６８ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群が８７．８９±１６７．４４ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ処理群が３５７．４８±２７．３０ｍｍ３だった。
【００５０】
細胞増殖を示すｋｉ−６７の免疫組織化学的染色により、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群における細胞増殖の著しい減少が示された。さらに、アポトーシスを示すカスパーゼの免疫組織化学的染色により、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群における細胞のアポトーシスの著しい増加が示された。
【００５１】
最終的に、体重およびさまざまな器官の組織学的分析により評価されたように、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群における動物には、毒性に関与する薬剤は観測されなかった。対照的に、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ＢＣＮＵ処理群においては、著しい体重の減少が観測された。
【００５２】
実施例７：異種移植された腫瘍の成長におけるｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−ｚ−Ｂｄｐｈ処理群の治療効果
Ｆｏｘｎｌヌードマウスに、ヒトＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞（２×１０６）を接種させ、５日目にｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−ｚ−Ｂｄｐｈ（０％、３％、１０％）を移植した。３％および１０％のｚ−Ｂｄｐｈ−ウエハ処理群の腫瘍成長の著しい抑制が観測された。３９日目の腫瘍サイズの平均値は、コントロール群 １０９８．４６±１７０．１１、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−３％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群 ６０５．８±９８．８ｍｍ３、ｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）−１０％ｚ−Ｂｄｐｈ処理群 ５０４．４±３８．９ｍｍ３であった（ｐ＜０．０５）。
【００５３】
実施例８：ｚ−Ｂｄｐｈのヒト多形膠芽細胞腫（human glioblastoma multiformis）の転移（migration）および浸潤（invasion）の抑制
ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞の浸潤を、バイオコート腫瘍浸潤チャンバーシステム（BioCoat matrigel invasion chamber system）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて測定した。ＢＤマトリゲルマトリックス（BD matrigel Matrix）は、８μｍの孔径を有するポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）メンブレン上、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ニドジェン／エンタクチン（nidogen/entrctin）、およびプロテオグリカンから構成される。Ｉｎ Ｖｉｔｒｏの転移分析では、ファルコンカルチャーインサート（Falcon culture insert）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上の低い細孔密度（pore density）のＰＥＴトラックエッチドメンブレン（track-etched membrane）が適用された。メンブレンを、マトリゲルチャンバーまたはファルコンカルチャーインサートの上部と下部ウエルの間に置いた。まず最初に、１０％ウシ胎仔血清（fetal bovine serum）を含むＰＲＭＩ１６４０中に細胞を再懸濁し、チャンバーの上部ウエル中にシードした（１ウエルにつき細胞５０，０００）。２４時間３７℃でインキュベートした後、メンブレンを浸潤または転移した細胞を、Ｌｉｕ染色（Ｈａｎｄｓｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，台北、台湾）で染色し、顕微鏡下でカウントした。それぞれの実験は、３回繰り返した。
【００５４】
上述の組織（system）を、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞（ヒトＧＢＭ）の転移および浸潤におけるｚ−Ｂｄｐｈの効果を調べるために用いた。ｚ−Ｂｄｐｈが、用量依存的に、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ細胞の転移および浸潤を抑制することがわかった。
【００５５】
実施例９：ｚ−ＢｄｐｈのＡｘｌ抑制を経由する腫瘍の転移および浸潤の抑制
悪性の脳腫瘍をｚ−Ｂｄｐｈが抑制するメカニズムを解明するため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＧＢＭ細胞の遺伝子発現プロファイル上のｚ−Ｂｄｐｈの効果を調べた。Ａｘｌレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のｍＲＮＡ発現が、ｚ−Ｂｄｐｈの存在下で下方制御されたことがわかった。
【００５６】
さらに、Ａｘｌの過剰発現（over-expression）（すなわち、ＧＢＭ細胞へのｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌプラスミドを導入することによるもの）が、Ａｘｌが媒介するＧＢＭ細胞の増殖、転移および湿潤におけるｚ−Ｂｄｐｈの抑制効果を逆転させることができる。
【００５７】
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析も実施して、ｚ−Ｂｄｐｈの存在下でのＧＢＭ細胞のＡｘｌタンパク質レベルを調べた。Ａｘｌタンパク質レベルが減少した結果となった。
【００５８】
タンパク質チロシンキナーゼが細胞増殖および分化（differentiation）の制御ならびにヒト神経膠腫を含む多くの新生組織形成の発生に重要な役割を担っていることは、これまでによく知られていることである。Ａｘｌは腫瘍転移および浸潤を伴うことが報告されていた。上記結果は、ｚ−ＢｄｐｈがＡｘｌレセプターチロシンキナーゼのタンパク質発現を抑制し、それによりＧＢＭ細胞の転移および湿潤を抑制したことを示している
他の実施形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせられうる。本明細書に開示のそれぞれの特徴は、同一の、均等な、または類似の目的を達成する他の特徴により置換されうる。よって、特記しない限り、開示されたそれぞれの特徴は、広範な一連の均等なまたは類似の特徴の一例に過ぎない。
【００５９】
当業者であれば、上述した記載から本発明の本質的な特徴を容易に認識することができ、本発明の思想および範囲から逸脱することがなく、発明に種々の変更および修飾を施し、種々の用途および条件に適合させることができる。よって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲に包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｚ−ブチリデンフタリド、およびｚ−ブチリデンフタリドと混合された重合体を含む製剤。
【請求項２】
前記重合体が、乳酸・グリコール酸共重合体、キトサン、コラーゲン、ハイドロゲル、ポリ無水物、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ブタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ペンタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘプタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）オクタン、イソフタル酸、１，４−フェニレンジプロピオン酸、ドデカンジオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、またはこれらの混合物から調製される、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン、イソフタル酸、１，４−フェニレンジプロピオン酸、ドデカンジオン酸、セバシン酸、またはこれらの混合物から調製される、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の混合物から調製される、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の比が、１：２〜１：１０である、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の比が、１：４〜１：５である、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが３％〜２０％である、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが約１０％である、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
粉体、ウエハ、シート、棒、マイクロスフィア、ナノスフィア、ペースト、または糊の形態である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが３％〜２０％である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
ｚ−ブチリデンフタリド、およびｚ−ブチリデンフタリドと混合された重合体を含む製剤の有効量を、必要とする患者に投与することを含む腫瘍の治療方法。
【請求項１３】
前記重合体が、乳酸・グリコール酸共重合体、キトサン、コラーゲン、ハイドロゲル、ポリ無水物、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が、多形性膠芽腫、肺がん、肝細胞がん、結腸がん、黒色腫、乳がん、神経芽細胞腫、奇形腫またはヒト白血病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン、イソフタル酸、１，４−フェニレンジプロピオン酸、ドデカンジオン酸、セバシン酸、またはこれらの混合物から調製される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の混合物から調製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の比が、１：２〜１：１０である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の比が、約１：４〜１：５である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが３％〜２０％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが約１０％である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記製剤が、患者の皮下に移植され、間質に移植され、または頭蓋内に移植される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、多形性膠芽腫である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
ｚ−ブチリデンフタリドが、Ａｘｌが媒介する腫瘍細胞の増殖、転移または浸潤を抑制する、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
ｚ−ブチリデンフタリド、およびｚ−ブチリデンフタリドと混合された重合体を含む製剤。
【請求項２】
前記重合体が、乳酸・グリコール酸共重合体、キトサン、コラーゲン、ハイドロゲル、ポリ無水物、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ブタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ペンタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘプタン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）オクタン、イソフタル酸、１，４−フェニレンジプロピオン酸、ドデカンジオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、またはこれらの混合物から調製される、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン、イソフタル酸、１，４−フェニレンジプロピオン酸、ドデカンジオン酸、セバシン酸、またはこれらの混合物から調製される、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の混合物から調製される、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の比が、１：２〜１：１０である、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の比が、１：４〜１：５である、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが３％〜２０％である、請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが約１０％である、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
粉体、ウエハ、シート、棒、マイクロスフィア、ナノスフィア、ペースト、または糊の形態である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが３％〜２０％である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
ｚ−ブチリデンフタリド、およびｚ−ブチリデンフタリドと混合された重合体を含む製剤の有効量を、必要とする患者に投与することを含む腫瘍の治療方法。
【請求項１３】
前記重合体が、乳酸・グリコール酸共重合体、キトサン、コラーゲン、ハイドロゲル、ポリ無水物、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が、多形性膠芽腫、肺がん、肝細胞がん、結腸がん、黒色腫、乳がん、神経芽細胞腫、奇形腫またはヒト白血病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサン、イソフタル酸、１，４−フェニレンジプロピオン酸、ドデカンジオン酸、セバシン酸、またはこれらの混合物から調製される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリ無水物が、ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の混合物から調製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の比が、１：２〜１：１０である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンおよびセバシン酸の比が、約１：４〜１：５である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが３％〜２０％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
製剤中のｚ−ブチリデンフタリドの重量パーセントが約１０％である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記製剤が、患者の皮下に移植され、間質に移植され、または頭蓋内に移植される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、多形性膠芽腫である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
ｚ−ブチリデンフタリドが、Ａｘｌが媒介する腫瘍細胞の増殖、転移または浸潤を抑制する、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１１−１７３８６６（Ｐ２０１１−１７３８６６Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−７２０（Ｐ２０１１−７２０）
【出願日】平成２３年１月５日（２０１１．１．５）
【出願人】（５１１００５５５０）ナショナル ドン ファ ユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｏｎｇ Ｈｗａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １， Ｓｅｃ． ２， Ｄａ−Ｈｓｕｅｈ Ｒｏａｄ， Ｓｈｏｕｆｅｎｇ， Ｈｕａｌｉｅｎ， Ｔａｉｗａｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７２０（Ｐ２０１１−７２０）
【出願日】平成２３年１月５日（２０１１．１．５）
【出願人】（５１１００５５５０）ナショナル ドン ファ ユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｏｎｇ Ｈｗａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １， Ｓｅｃ． ２， Ｄａ−Ｈｓｕｅｈ Ｒｏａｄ， Ｓｈｏｕｆｅｎｇ， Ｈｕａｌｉｅｎ， Ｔａｉｗａｎ
【Ｆターム（参考）】
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