抗ウイルス療法の応答の予測
本出願は、抗ウイルス療法が有効であるかどうかを決定するための方法に関する。特に本出願は、肝臓のウイルス感染がある対象が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に応答する可能性を決定するための、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐを使用する方法、および前記決定の実施のためのキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス療法を改善するための治療、および抗ウイルス療法が有効であり得るかどうかを決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染は健康に対する深刻な脅威となり、動物および人間の病的状態の主な原因であることが知られている。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は世界中で慢性肝疾患の主な原因である。Ｃ型肝炎の重要および顕著な特徴は、慢性化へのその傾向である。７０％を超える感染個体において、ＨＣＶは、肝硬変および肝細胞癌をもたらす可能性がある、数十年にわたる持続的感染を確定する。
【０００３】
ＨＣＶ生物学における興味深い仮説は、ウイルスＮＳ３−４Ａプロテアーゼはウイルスタンパク質を処理するだけでなく、ウイルス感染を検出しＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の転写活性化を誘導する細胞内感覚経路の構成要素を切断および不活性化もすることを提案する。ＮＳ３−４Ａの標的の１つは、ＴＲＩＦ（ＩＦＮβを誘導するＴＩＲドメイン含有アダプター）、ＴＬＲ３（トール様受容体３）によるエンドソーム中のｄｓＤＮＡ検出とＩＦＮβ誘導の間の本質的関連である。さらに近年、レチノイン酸誘導性遺伝子−Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）およびＭＤＡ５（ｈｅｌｉｃａｒｄ）がｄｓＲＮＡの細胞内センサーとして同定された。両方のセンサーはＣａｒｄｉｆ（ＩＰＳ−１、ＭＡＶＳ、ＶＩＳＡとしても知られる）を介してシグナル伝達してＩＦＮβ産生を誘導する。ＣａｒｄｉｆはＨＣＶＮＳ３−４Ａによって切断および不活性化することができる。ｄｓＲＮＡの細胞内センサーとして同定された２つのＲＮＡヘリカーゼ、ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５はＣａｒｄｉｆを介して作用し、ＩＦＮβ産生を誘導する。
【０００４】
Ｉ型ＩＦＮは、先天性免疫系の重要な構成要素であるだけでなく、ＣＨＣに対する現在の療法の最も重要な構成要素でもある。現在の標準的な療法は、週に１回皮下注射されるペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）および経口抗ウイルス薬リバビリンの毎日摂取からなる。このレジメンは、約５５％の患者において全体的な持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）、および遺伝子型間の有意な差を得る。ＳＶＲは、治療中の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの消失、および療法停止後少なくとも６カ月間のその継続的不在として定義される。ＳＶＲを得る患者の長期フォローアップのいくつかの試験は、この著効は９５％を超える患者において永続的であることを実証する。ＳＶＲの確率は治療に対する初期応答に強く依存する。治療第１２週後の少なくとも２ｌｏｇ１０のウイルス負荷の低下として定義される初期ウイルス学的著効（ＥＶＲ）を示さない患者は、ＳＶＲを示さない可能性が高く、これらの患者において治療を停止することができる。他方で、ＥＶＲを有する患者には治癒される十分な機会があり、その６５％はＳＶＲを得る。治療第４週後の検出不能な血清中のＨＣＶ ＲＮＡとして定義される迅速なウイルス学的著効（ＲＶＲ）を有する患者に関して、予後はさらに良い。８５％を超える患者がＳＶＲを得る。残念ながら、ＲＶＲを示すのは、遺伝子型１を有する患者の２０％未満、および遺伝子型２または３を有する患者の約６０％である。療法に対する初期応答に重要である宿主因子は現在知られていない。
【０００５】
Ｉ型ＩＦＮは、数百の遺伝子（ＩＳＧ、インターフェロン刺激遺伝子）の制御によって、それらの強い抗ウイルス効果を発揮する。ＩＳＧの転写活性化は、静止細胞中では通常合成されず細胞内で非ウイルス特異的抗ウイルス状態を確立するタンパク質を誘導する。インターフェロンは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化することによって、それらの合成を誘導し、これは、多くのサイトカインおよび増殖因子によって使用される細胞シグナル伝達の典型である。全てのＩ型ＩＦＮは同じ細胞表面受容体（ＩＦＮＡＲ）と結合し、受容体関連ＪａｎｕｓキナーゼファミリーのメンバーＪａｋ１およびＴｙｋ２を活性化する。次いでキナーゼは、シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）およびＳＴＡＴ２をリン酸化および活性化する。活性化したＳＴＡＴは核へ移行し、そこでそれらは、ＩＳＧのプロモーター中の特異的ＤＮＡエレメントと結合する。多くのＩＳＧは抗ウイルス活性を有するが、他のＩＳＧは脂質代謝、アポトーシス、タンパク質分解および炎症細胞応答に関与する。多くのウイルスの場合と同様に、ＨＣＶはおそらく複数レベルでＩＦＮ系に干渉する。ＩＦＮ誘導型Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達は、ＨＣＶタンパク質を発現する細胞およびトランスジェニックマウス中、およびＣＨＣを有する患者の肝生検中で阻害される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＡおよびＥ２は、重要な非特異的抗ウイルスタンパク質であるタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）と結合しそれを不活性化させる。しかしながら、ＣＨＣを有する患者において治療に適用するＩＦＮに対する応答に重要である分子機構は現在知られていない（Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚら、２００８、ＰＮＡＳ、１０５（１９）：７０３４〜７０３９）。
【０００６】
多くの異なるレベルでＩＦＮ経路に干渉するＨＣＶの能力は、慢性感染を確定するＨＣＶの成功が根底にある機構である可能性がある（Ｇａｌｅ、Ｍ．、Ｊｒ．＆ Ｆｏｙ、Ｅ．Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ４３６、９３９〜９４５（２００５）。しかしながら、非常に逆説的に、ＨＣＶに急性または慢性的に感染したチンパンジーでは、数百のＩＳＧが肝臓中で誘導される（７Ｂｉｇｇｅｒ、Ｃ．Ｂら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ７８、１３７７９〜１３７９２（２００４））。しかるに、内因性ＩＦＮ系の活性化にもかかわらず、ウイルスは慢性的に感染した動物から除去されない。チンパンジーで得た結果をヒトに当てはめるのは難しい。これらの種間ではＨＣＶ感染のいくつかの重要な病理生物学上の差が存在するからである。ＨＣＶに急性感染した大部分のチンパンジーはウイルスを自然に除去する一方で、人間における感染は大抵慢性化状態になる。他方で、慢性的に感染したチンパンジーをＩＦＮで治療することができるのは稀であり、一方で半数を超えるＣＨＣを有する患者が首尾よく治療される。
【０００７】
ＩＳＧの誘導はＣＨＣを有する多くの患者の前治療肝生検においても見られ、ＨＣＶ感染は内因性ＩＦＮ系の活性化をもたらす可能性があることが再度実証された（Ｃｈｅｎ、Ｌら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２８、１４３７〜１４４４（２００５））。特に、ＩＳＧの発現が予め高い患者は、低い初期発現を有する患者と比較したとき、療法にあまり応答しない傾向があった（Ｃｈｅｎ、Ｌら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２８、１４３７〜１４４４（２００５））。療法に対するこの示差的応答の原因は理解されていない。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、その中で本発明者らが、ペグＩＦＮαを用いた療法前および最中に慢性肝炎を有する患者の肝生検および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の対サンプル中の、ＩＦＮ誘導型シグナル伝達およびＩＳＧ誘導を調べた試験に基づく。本発明者らは、生化学的および分子学的データと治療に対する応答をさらに関連付けた。本発明者らの作業は、添付の実施例中により詳細に述べる。
【０００９】
以前の試験において、本発明者らは、肝臓のウイルス感染がある何人かの対象は、ＩＦＮシグナル伝達経路が活性化ＩＳＧによる刺激状態であるように、「事前活性化」の状態であることを確定した（Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚら、２００８、ＰＮＡＳ、１０５（１９）：７０３４〜７０３９）。本発明者らは、このような個体は、ＩＦＮおよび抗ウイルス薬で後に治療すると、抗ウイルス治療に対してほとんど、全く応答がなかったことを発見している。対照的に、別群の感染対象にはＩＦＮ受容体の事前刺激（およびＩＳＧの刺激）がなかったようであり、この群は抗ウイルス療法に十分応答した（すなわち、それらは迅速なウイルス学的著効（ＲＶＲ）を有していた）。さらに、その一部はＩＳＧ遺伝子であるいくつかの特異的遺伝子の発現レベルに従い、対象が治療に対して低応答者でありＲＶＲを有するかどうか決定することが可能である。言い換えると、本発明者らは、対象が抗ウイルス治療に応答するかどうかをその発現レベルが予想する予後判定遺伝子マーカーである１セットの遺伝子を同定した。
【００１０】
ペグＩＦＮαを用いた療法前および最中に慢性肝炎を有する患者の肝生検および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の対サンプルを使用するさらなる試験において、本発明者らは患者のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を調べた。
【００１１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、その最終産物が約２２ｎｔの機能的ＲＮＡ分子である非コードＲＮＡ遺伝子の１クラスである。それらは一本鎖ＲＮＡとして内因的にコードされた不完全なヘアピン前駆体からプロセシングされる。それらは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との塩基対形成を介した翻訳抑制によって働くようである（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．３４、Ｄ１４０〜Ｄ１４４）。
【００１２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生合成は、複雑な、多ステップのプロセスである。一次ｍｉＲＮＡ転写産物はＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され、かつ数百〜数千ヌクレオチド長（プリｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ‐ｍＲＮＡ））の大きさの範囲であってよい。ＭｉＲＮＡは２つのゲノム源に端を発する可能性がある。一部のｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子のイントロン領域内に位置する。他のｍｉＲＮＡは、非コードＲＮＡのイントロンまたはエクソン内に位置する。興味深いことに、プリｍｉＲＮＡは１つのｍｉＲＮＡをコードすることができるが、数個のｍｉＲＮＡの群も含有することができる。プリｍｉＲＮＡは、核リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）エンドヌクレアーゼ、Ｄｒｏｓｈａによって後に約７０ｎｔのヘアピン（プレ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ‐ｍＲＮＡ））にプロセシングされる。次いでプレ−ｍｉＲＮＡは、エクスポリン５／ＲａｎＧＴＰによって核から細胞質に輸送される。細胞質中では、第二のＲＮａｓｅＩＩＩ、ＤｉｃｅｒがそのｄｓＲＢＤタンパク質パートナーと一緒に、ヘアピンのステム領域中のプレ−ｍｉＲＮＡを切断し、それによって約２１ヌクレオチドのＲＮＡ−二本鎖を遊離させる。ｍｉＲＮＡ二本鎖から、一本の鎖が標的遺伝子の発現を抑制するタンパク質複合体、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に入り、一方他の鎖は分解される。鎖の選択は、ｍｉＲＮＡ二本鎖の局所熱力学的安定性に頼るものである。その５’末端が低い安定性で対形成する鎖がＲＩＳＣ複合体に充填される。ＲＩＳＣ複合体に充填されるｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との塩基対形成を介した翻訳抑制によって働くようである（Ｄｕ、Ｔ．ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ、Ｐ．Ｄら、ｍｉｃｒｏ−Ｐｒｉｍｅｒ：ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００５）１３２、４６４５〜４６５２）。現在４６２のヒトｍｉＲＮＡ配列がｍｉＲＢａｓｅに寄託されており（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）、この一覧は８００台に達することが示唆される。これまでに同定された多数のｍｉＲＮＡは、それらが生物学的プロセスの制御および微調整において複雑な役割を果たす可能性があることを示唆する。実際、いくつかのｍｉＲＮＡが、細胞増殖の調節（ｍｉｒ−１２５ｂおよびｌｅｔ−７）、造血Ｂ細胞系の運命（ｍｉｒ−１８１）、Ｂ細胞生存（ｍｉｒ−１５ａおよびｍｉｒ−１６−１）、脳のパターン形成（ｍｉｒ−４３０）、膵臓細胞のインシュリン分泌（ｍｉｒ−３５７）、脂肪細胞の発生（ｍｉｒ−３７５）ならびに筋肉の増殖および分化（ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３）に関与している。多くのｍｉＲＮＡは癌と関係があるゲノム領域中に位置する。例えば、ｍｉｒ−１６−１およびｍｉｒ−１５を含有する群は、大部分のＢ細胞慢性リンパ性白血病において欠失および下方制御される（Ｂ−ＣＬＬ；Ｃａｌｉｎ、Ｇ．Ａら、ＭｉｃｒｏＲＮＡ−ｃａｎｃｅｒ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｔａｌｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００６）６６、７３９０〜７３９４）。
【００１３】
ｍｉＲＮＡは遺伝子制御と関係があるようである。ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７を含めたいくつかのｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの部分的に相補的である３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と結合することによって、タンパク質合成を阻害する。植物中で見られるＳｃａｒｅｃｒｏｗのｍｉＲＮＡを含めた他のｍｉＲＮＡはｓｉＲＮＡと同様に働き、完全に相補的なｍＲＮＡ配列と結合して標的転写産物を破壊する（Ｇｒｉｓｈｏｋら、２００１）。
【００１４】
科学者達が、これらの分子が真核生物遺伝子の発現の制御において果たす広範囲の役割を理解し始めているので、マイクロＲＮＡに関する研究は増えている。２つの最も理解されているｍｉＲＮＡ、ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７は、重要なｍＲＮＡのファミリーの翻訳を制御することによってＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける発生時期を制御する（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ、２００２中に総説）。数百のｍｉＲＮＡがＣ．ｅｌｅｇａｎｓ、ショウジョウバエ、マウス、およびヒトにおいて同定されている。遺伝子発現を制御する分子に関して予想されるように、ｍｉＲＮＡレベルは組織相互および発生段階相互で異なることが示されており、さらに、１つの試験は、２つのｍｉＲＮＡの低い発現と慢性リンパ球性白血病の間の強い相関関係を示し、ｍｉＲＮＡと癌の間に存在し得る関連性を示す（Ｃａｌｉｎ、２００２）。この分野は歴史が浅いが、ｍｉＲＮＡは高等真核生物中の遺伝子発現を制御する際に、転写因子と同程度重要である可能性があると推測される。
【００１５】
細胞分化、初期発生、およびアポトーシスのような細胞プロセスおよび脂肪代謝において重要な役割を果たすｍｉＲＮＡの数例が存在し、ｌｉｎ−４とｌｅｔ−７の両方がＣ．ｅｌｅｇａｎｓの発生中１つの幼虫段階から他の段階への移行を制御する（Ａｍｂｒｏｓ、２００３）。ｍｉｒ−１４およびｂａｎｔａｍは、明らかなところ、アポトーシスと関係がある遺伝子の発現を制御することによって細胞死を制御するショウジョウバエのｍｉＲＮＡである（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、２００３、Ｘｕら、２００３）。Ｍｉｒ−１４は脂肪代謝にも関与している（Ｘｕら、２００３）。Ｌｓｙ−６およびｍｉＲ−２７３は、化学感覚ニューロンの非対称性を制御するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｍｉＲＮＡである（Ｃｈａｎｇら、２００４）。細胞分化を制御する別の動物ｍｉＲＮＡは、造血細胞の分化を支援するｍｉＲ−１８１である（Ｃｈｅｎら、２００４）。これらの分子は、知られている機能を有する全範囲の動物ｍｉＲＮＡを表す。ｍｉＲＮＡの機能の高い理解は、正常発生、分化、細胞間および細胞内伝達、細胞周期、血管新生、アポトーシス、および多くの他の細胞プロセスに貢献する制御ネットワークを間違いなく明らかにするはずである。多くの生物学的機能におけるそれらの重要な役割を考慮すると、ｍｉＲＮＡは治療介入または診断分析に関して重要な観点を提供する可能性がある。
【００１６】
多量に存在する肝臓特異的ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２が、ＨＣＶレプリコンを安定して発現する培養ヒト肝癌Ｈｕｈ７細胞中のＨＣＶ ＲＮＡの有効な複製に重要である（Ｊｏｐｌｉｎｇ ＣＬ、Ｙｉ Ｍ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＡＭ、Ｌｅｍｏｎ ＳＭ、Ｓａｒｎｏｗ Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００５；３０９：１５７７〜１５８１）。この観察によって、ＨＣＶ感染における、および考えられる治療標的としてのｍｉＲ−１２２の役割に対して一層関心が高まった。本明細書で説明するように、現在のＣＨＣの療法はリバビリンと組み合わせてもよいペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）からなるが、この治療は約５５％の患者のみで持続的ウイルス学的著効を得る（Ｍａｎｎｓ ＭＰら、Ｌａｎｃｅｔ２００１；３５８：９５８〜９６５；Ｆｒｉｅｄ ＭＷら、Ｎ ＥｎｇＩ Ｊ Ｍｅｄ２００２；３４７：９７５〜９８２）。ｍｉＲ−１２２およびいくつか他のｍｉＲＮＡのレベルはＨｕｈ７肝癌細胞および初代マウス肝細胞中ではＩＦＮによって制御されること、およびｍｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＣＶ ＲＮＡ複製に対するＩＦＮの少なくともある程度の影響を仲介する可能性があることが近年報告された（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＩＭら、Ｎａｔｕｒｅ２００７；４４９：９１９〜９２２）。今日までに実施された全ての実験は、培養細胞中でのＨＣＶ複製におけるｍｉＲ−１２２の役割を評価した。慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）を有する患者中でのｍｉＲ−１２２の状態を決定するために、本発明者らは、ペグＩＦＮαおよびリバビリンによる治療を施した４２人のＣＨＣ患者から回収した肝生検におけるｍｉＲ−１２２と他のｍｉＲＮＡのレベルを比較した。標準として化学的に合成したｍｉＲＮＡを使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定を実施した。本発明者らは、一次非応答者（ＰＮＲ）として分類した、第１２週で２ｌｏｇ１０を超えるウイルス負荷の低下があり療法に応答しなかった患者は、第１２週でＩＦＮαに対する強い応答性および検出不能なＨＣＶ ＲＮＡを有する患者より、有意に低いレベルのｍｉＲ−１２２を有していたことを発見した（完全初期ウイルス学的著効；ｃＥＶＲ）。ＰＮＲ患者とｃＥＶＲ患者の間の差は肝線維症の段階と無関係であり、ＰＮＲ患者中のｍｉＲ−１２２の低下は、生検材料中の肝細胞の低い割合によるものではないことを示した。さらに、群間のｍｉＲ−１２２発現の差はｍｉＲ−１２２レベルを肝細胞特異的アルブミンｍＲＮＡに標準化したとき一層明らかであり、ｍｉＲ−１２２レベルと治療に対する応答の間の直接的な相関関係をさらに支持した。
【００１７】
臨床試験は、高いＨＣＶウイルス負荷を有する患者は療法にそれほど応答しないことを示している（Ｍａｎｎｓ ＭＰら、Ｌａｎｃｅｔ２００１；３５８：９５８〜９６５；Ｆｒｉｅｄ ＭＷら、Ｎ ＥｎｇＩ Ｊ Ｍｅｄ２００２；３４７：９７５〜９８２）。ｍｉＲ−１２２はＨｕｈ７肝癌細胞中でのＨＣＶの複製に重要であるので、本発明者らによる非応答者中の少ないｍｉＲ−１２２の発見は驚くべきであった。本発明者らは、患者の肝臓および血清中のＨＣＶ ＲＮＡを測定した。ｍｉＲ−１２２のレベルとＨＣＶウイルス負荷の間の相関関係は観察しなかった。これらの結果はｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた結果とは反対で、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＶの複製におけるｍｉＲ−１２２の有意な役割を支持しない（例えば、ＨＣＶの治療に関するｍｉＲ−１２２の阻害を提案するＷＯ−Ａ−２００７／１１２７５４を参照）。非応答者における低いｍｉＲ−１２２のレベルは、ｍｉＲ−１２２が負の制御を受けるＩＦＮ標的遺伝子である可能性を提起する。実際、ＣＨＣ患者の生検におけるｍｉＲ−１２２の発現は、知られているＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現と負の相関関係を示す。
【００１８】
要約すると、本発明の驚くべき結果は、（ｉ）ＩＦＮ療法に応答しない患者は一般に応答者より数倍低いレベルのｍｉＲ−１２２を有すること、（ｉｉ）ペグＩＦＮαの投与は患者の肝臓中のｍｉＲ−１２２レベルに対して有意な影響がないこと、および（ｉｉｉ）肝内ｍｉＲ−１２２とＨＣＶ ＲＮＡレベルの間に相関関係が存在しないことを実証する。これは予想外である。Ｈｕｈ７細胞におけるＨＣＶレプリコンの試験に基づくと、低レベルのｍｉＲ−１２２はウイルス量を低下させ療法に利点を与えるに違いないからである。それにもかかわらず、ｍｉＲ−１２２のレベルがｃＥＶＲ患者よりＰＮＲ中で有意に低いという発見によって、ｍｉＲ−１２２は、例えば予め活性化したＩＳＧと一緒に（Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ Ｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ２００８、１０５（１９）：７０３４〜７０３９；Ｃｈｅｎ Ｌら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２００５；１２８：１４３７〜１４４４；Ａｓｓｅｌａｈ Ｔら、Ｇｕｔ２００８；５７：５１６〜５２４）、ＣＨＣ患者におけるＩＦＮ療法の結果を予想するのに適した便利なマーカーとなる。さらに、本発明の結果は驚くことに、（ｉ）ＩＦＮ療法に応答しない患者は一般に応答者より数倍高いレベルのｍｉＲ−２９６−５ｐを有することも実証する。これは、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、およびより一般的にｍｉＲＮＡを、ＣＨＣ患者におけるＩＦＮ療法の結果を予想するために使用することができることを実証する。
【００１９】
これによって本発明者らは、ｍｉＲＮＡに基づく方法を開発して、肝臓のウイルス感染に罹患した対象に関する治療レジメンを臨床医が決定するのを、助けることができる可能性があることを理解する。感染個体由来のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルは、対照（すなわち、ウイルス感染がない対象）からの遺伝子発現と比較することができる。
【００２０】
（対照と比較して）低レベルのｍｉＲ−１２２および／または高レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐを有する感染対象は、治療レジメン中のＩＦＮの使用から恩恵を被る可能性はないが（すなわち、これらの個体がＲＶＲを有するとは予想されない）、一方でそのｍｉＲ−１２２および／またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルが、対照の発現と比較して大部分は不変であるかまたは高い感染対象は、ＩＦＮ療法から恩恵を被る可能性がありＲＶＲを有する。当技術分野で知られているｉｎ ｖｉｔｒｏの結果は反対のことを予想したので、本発明者らはこれらの相関関係を得て驚いた。
【００２１】
肝臓のウイルス感染がある「応答者」および「非応答者」対象における遺伝子発現レベルの以前の試験が存在しており、例えば、本発明の一部としてその研究を実施した、Ｃｈｅｎら（２００５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２８、１４３７〜１４４４は、非常に広範囲の遺伝子セットを試験して、どれが予後診断マーカーとして働き得るか決定した。さらに本発明者らは、異なるｍｉＲＮＡを予後診断マーカーとして使用することができるかどうかも評価した。さらに本発明者らは、抗ウイルス治療の前後に得たサンプル中の遺伝子発現およびｍｉＲＮＡレベルも分析し、この情報を使用して予後診断遺伝子マーカーを同定したが、一方で以前の試験は、治療結果と治療前に得たサンプル中に存在した遺伝子の発現レベルの関連付けのみを試みた。したがって、以下に述べる予後診断遺伝子マーカーの同定をもたらしたデータセットは、以前の試験中のそれより一層完全で確かであると考えられる。
【００２２】
したがって、本発明の第一の態様において、肝臓のウイルス感染がある対象が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に応答する可能性を決定するための方法であって、ｍｉＲＮＡの発現のレベルに関して対象由来のサンプルを分析すること、および対象由来のサンプル中の前記ｍｉＲＮＡの発現のレベルと対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを比較することを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ１２２であり、対照サンプル中のｍｉＲ−１２２のレベルと比較した対象由来のサンプル中の低レベルのｍｉＲ−１２２は、対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答しないことを示す。
【００２４】
前に記載した実施形態と組み合わせることができる、本発明のいくつかの他の実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２９６−５ｐであり、対照サンプル中のｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと比較した対象由来のサンプル中の高レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐは、対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答しないことを示す。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態では、対照サンプル中のそれぞれｍｉＲ−１２２、またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと比較した、対象由来のサンプル中の不変もしくは高レベルのｍｉＲ−１２２および／または不変もしくは低レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐは、それぞれ対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答することを示すことができる。
【００２６】
本発明の方法は１つのｍｉＲＮＡの使用のみに限られず、任意のｍｉＲＮＡの発現レベルとｍｉＲ−１２２および／またはｍｉＲ−２９６−５ｐのそれの任意の組合せ、または任意の関連ｍｉＲＮＡ、特に肝臓のウイルス感染がある対象が抗ウイルス療法に応答する可能性に関する予測力を有する任意のｍｉＲＮＡの組合せも、包含することを理解するべきである。
【００２７】
本発明の方法中、抗ウイルス療法は、リバビリンと場合によっては組み合わせたペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）であってよい。
【００２８】
さらに、本発明のいくつかの実施形態では、ウイルス感染は、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス感染である。
【００２９】
さらに、本発明の方法中で、肝臓組織をサンプルとして使用することができる。
【００３０】
有利なことに、療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る遺伝子、例えば以前の試験（Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚら、２００８、ＰＮＡＳ、１０５（１９）：７０３４〜７０３９）に対して何人かの本発明者らによって公開されたいくつかの遺伝子の発現を、本発明の方法中で分析して、予測力を増大することもできる。前記遺伝子の発現は、サンプル中のｍＲＮＡ遺伝子転写産物の量、または前記ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの量を測定することによって、または例えば特異的結合分子を使用して、サンプル中の前記遺伝子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの量を測定することによって決定することができる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態では、対象は哺乳動物、例えば人間である。
【００３２】
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットであって、前記キットが、対象由来のサンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルを分析するための手段、および場合によっては、対象由来のサンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルと、対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを比較するための手段を含むキットも包含する。キットは、療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る少なくとも１つの遺伝子の発現を分析するための手段であって、療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る前記少なくとも１つの遺伝子を代表する分子をターゲティングすることができる１つまたは複数の特異的結合分子を最終的に含み、前記特異的結合分子がオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、またはアプタマーである手段、および場合によっては、サンプル中の遺伝子の発現と対照サンプル中の同じ遺伝子の発現を比較するための手段をさらに含むことができる。
【００３３】
本発明の方法は、臨床医に非常に有益であろうことは理解されよう。ＩＦＮはタンパク質増殖因子であり、ＩＦＮを含有する医薬調製物は製造するのに費用がかかる。したがって、適切かつコスト効率の良い方法でＩＦＮが使用されることが確実であることが、臨床医にとって非常に重要である。さらに、コストと無関係に、可能な限り早く肝臓のウイルス感染を除去することが望ましいことが多い。したがって、臨床医がＩＦＮを投与し、およびその後それに有益な効果がないことを発見する場合、それは時間の浪費である（それは別の療法を利用して費やされる可能性はある）。したがって、本発明の方法は臨床医にとって大きな力添えとなる。臨床医は、２つの対象の集団を同定することができるからである。１つの集団は対照と比較して低レベルのｍｉＲ−１２２および／または高レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐを示し、したがっておそらくＩＦＮを用いた治療から恩恵を被らない。対照と比較して正常または高レベルのｍｉＲ−１２２および／または正常または低い発現レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐを有する、もう１つの集団は、ＩＦＮを用いた治療から恩恵を被り得る。
【００３４】
さらに別の実施形態では、本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に対する、肝臓のウイルス感染がある対象の応答に影響を与える方法を提供し、この方法はｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを調節することを含む。
【００３５】
ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルは、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって制御することができる。このような方法の例は、例えばＷＯ−Ａ−２００６／１３７９４１、ＷＯ−Ａ−２００７／０２１８９６またはＷＯ−Ａ−２００７／０９００７３中で見ることができる。
【００３６】
「抗ウイルス療法」によって、本発明者らは、ＩＦＮ活性の刺激を含むウイルス感染を減らすための任意の治療レジメンを意味する。このようなレジメンは、Ｉ型ＩＦＮ活性を刺激するおよび／またはＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）を誘導する化合物の使用を含むことができる。この療法はＩＦＮ自体または他のＩＦＮ受容体アゴニストを用いた治療を含むことができる。例えば、この療法はペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）を利用することができる。
【００３７】
療法はＩＦＮ活性のみの刺激を含むことができる。しかしながら本発明者らは、本発明による方法は、知られている抗ウイルス薬と併せたＩＦＮ活性の刺激剤を含む併用療法の使用を含む抗ウイルス療法の、有効性を予想するのに特に有用であることを発見している。多くの抗ウイルス薬が当業者に知られており、本発明の方法を使用して、いくつかの異なる併用療法の有効性を評価することができる。しかしながら本発明者らは、本発明の方法は、抗ウイルス薬リバビリンと併せて使用するＩＦＮ活性の刺激剤を用いた療法の、有効性を予想するのに特に有益であることを発見している。
【００３８】
一実施形態では、本発明の方法を使用して、抗ウイルス療法剤としてのペグＩＦＮαおよびリバビリンの有用性を予想する。
【００３９】
本発明の方法を利用して、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス感染を含めた、いくつかの異なる肝臓のウイルス感染のための治療の有効性を評価することができる。一実施形態では、本発明の方法を利用して、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染のための療法の有効性を評価する。本発明者らは、本発明の方法は、迅速なウイルス学的著効（ＲＶＲ）を有すると予想される対象とそうではない対象（非ＲＶＲ）を区別するのに特に有用であることを発見している。
【００４０】
本発明に従い使用することができる対象中のｍｉＲ−１２２のレベルを表すサンプルは、前記対象中のｍｉＲ−１２２のレベルに関する情報を与えることができる任意のサンプルを包含する。
【００４１】
適切なサンプルの例には、生検、外科手術中に切除したサンプル、血液サンプル、尿サンプル、痰サンプル、脳脊髄液サンプル、およびスワブサンプル（唾液スワブサンプルなど）がある。サンプル源は、どのタイプのウイルス感染を対象が有するかに依存し得ることは理解されるであろう。
【００４２】
一実施形態では、サンプルは肝臓組織に由来する。肝臓サンプルは、ＨＣＶ感染がある対象の評価に方法を適用するとき、特に有益であることが分かっている。本発明者らは、ｍｉＲ−１２２のレベルを分析することによって、ＲＶＲを非ＲＶＲ対象と区別することができたことを発見して驚いた。
【００４３】
適切なサンプルは、組織学的または凍結切片などの組織切片を含むことができる。切片が由来する対象中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現のレベルを表す情報を与えることができるような形式で、このような切片を調製することができる方法は当業者によく知られており、遺伝子発現の調査時に使用することを目的とする技法を参照して選択されなければならない。
【００４４】
対象由来の組織の一部分を含むサンプルの使用は企図されるが、一般に、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを表すサンプルはこのような組織から得た適切な抽出物を含み、前記抽出物を調べて対象中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの前記レベルに関する情報を与えることができることは好ましい可能性がある。対象中の遺伝子発現に関する情報を与えることができる組織抽出物の生成用に、使用することができる適切なプロトコルは、当業者によく知られている。好ましいプロトコルは、遺伝子発現を調査する方法を参照して選択することができる。
【００４５】
肝臓に由来するサンプルの場合、適切な調製ステップは実施例中に開示する。
【００４６】
「対照サンプル」によって、本発明者らは、肝臓のウイルス感染に罹患していない個体に由来している対象由来のそれと、同等のサンプルを意味する。対照サンプルを構成する同等の組織または臓器サンプル、またはこのようなサンプル由来の抽出物は、対照サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルに関する情報源として直接使用することはできるが、「理想的な」対照サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルに関する情報は参照データの形で与えられ、かつそれが一般に好ましいことは理解されるであろう。このような参照データは、選択した対照組織中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを示す表の形で与えることができる。あるいは参照データは、選択した対照組織中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを示す読み出し可能な情報を含有するコンピュータソフトウェアの形で供給することができる。例えば参照データは、対照組織サンプル中でこのｍｉＲＮＡの発現がある対象中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルを少なくとも比較することができるアルゴリズムの形で与えることができる。
【００４７】
対照サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを、対照サンプルを構成する組織または臓器サンプルの処理によって調べる場合、対象由来のサンプルを処理するために使用した同じ方法を使用してこのような処理を行うことが有益である。対象サンプルと対照サンプルのこのような並行処理は、これらの組織中の遺伝子発現の比較を互いに対して標準化する高い信頼度を与える（組織を処理し遺伝子発現を調べた選択方法と関係がある任意の人工物は、対象サンプルと対照サンプルの両方に適用されるからである）。
【００４８】
本発明による方法は、少なくともｍｉＲ−１２２のレベルの分析を含むことができる。ｍｉＲ−１２２のレベルの変化を、抗ウイルス療法の有効性を決定する際に使用することができるという発見は驚くべきである。従来技術中で公開された結果を鑑みると、低レベルのｍｉＲ−１２２が、後のＩＦＮ治療に対する乏しい応答と関連し得ることは全く予想外であった。
【００４９】
以前の試験中で、本発明者らは、その発現レベルが抗ウイルス療法の結果に関する予後診断マーカーであり得る、異なる遺伝子を同定している。ｍｉＲ−１２２に関する本発明を前記遺伝子と組み合わせて、さらに一層確かな予想を与えることができる。
【００５０】
調べることができるｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの存在、不在および／またはレベルは、一般に適切なプローブ分子を使用して検出される。このような検出は、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの存在、不在および／またはレベルに関する情報を提供し、それによって対象中に存在するｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと、対照サンプル中に存在するレベルの間の比較を可能にする。プローブは一般に、直接的または間接的に、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐと特異的に結合することができる。このようなプローブの結合を次いで評価し、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと関連付けて、対象と対照の間の有効な予後比較を可能にすることができる。
【００５１】
「変化した発現」によって、本発明者らは、前に論じたように、対照と比較したとき、遺伝子発現がサンプル中でいずれも上昇または低下している場合を含める。
【００５２】
逆に「不変の発現」によって、本発明者らは、前に論じたように、対照と比較したとき、遺伝子発現がサンプル中で上昇も低下もしていない場合を含める。
【００５３】
ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベル、および遺伝子発現が変化した状態または不変であるかどうかの評価は、通常の統計解析法を使用して行うことができる。
【００５４】
標的分子はペプチドまたはポリペプチドであってよい。ペプチドまたはポリペプチドの量は、特異的結合分子、例えば抗体を使用して決定することができる。好ましい場合、サンプル中に存在する特定の標的タンパク質の量は、サンプル中の標的タンパク質の生物活性を参照して評価することができる。この形式での発現の評価および比較は、タンパク質標的が酵素活性を有する場合非常に適切である。サンプル中に存在するタンパク質標的の量の測定に適した技法には、アプタマーおよび抗体系技法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびウエスタンブロッティングなどがあるが、これらだけには限られない。
【００５５】
本発明の目的での「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指すことは理解されるであろう。さらに、文脈が他に必要としない限り、これらの用語は、天然に存在するヌクレオチドと類似した形式で働くことができる、天然ヌクレオチドの知られているアナログを包含すると考えるべきである。
【００５６】
さらに、本発明に従い使用するのに適した標的核酸は、「完全長」核酸（例えば、完全長遺伝子転写産物）を含む必要はないが、プローブ分子の特異的結合を可能にするのに十分な長さを時折含む必要があることは理解されるであろう。
【００５７】
本発明の方法の一実施形態では、適切なサンプルから得た細胞を溶解し（これはＱｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．により製造されたバッファーなどの市販の溶解バッファーを使用して実施することができる）、次に（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．により製造されたＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉスピンカラムなど）市販の核酸分離カラムを使用して溶解物を遠心分離にかけるプロセスによって、サンプルを処理してＲＮＡ標的分子を単離することができる。ＲＮＡ抽出のための他の方法は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１６２、１５６．「Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」のフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法の変形を含む。この方法で得たＲＮＡはそれ自体が適切な標的分子になる可能性があり、またはｍｉＲ−１２２のレベルを表す標的分子を生成するための鋳型として働くことができる。
【００５８】
選択した遺伝子の発現を評価して一層確かな予想値を得る場合、対象または対照サンプル由来のＲＮＡを、例えばＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して、ｃＤＮＡ合成の基質として使用することができることが好ましい可能性がある。生成したｃＤＮＡは次いでＢｉｏＡｒｒａｙ ＲＮＡ転写産物標識キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してビオチニル化ｃＲＮＡに転換することができ、このｃＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ）を使用して反応混合物から精製することができる。遺伝子発現を表すｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの抽出または精製を必要とせずに、対象または対照サンプル由来の組織において直接測定することができる。例えば、対象とする対象または対照サンプル中に存在しその遺伝子発現を表すｍＲＮＡは、このような組織の適切に固定された切片または生検を使用して調べることができる。この種のサンプルの使用は、発現の比較を行うことができる迅速性、ならびにサンプルを生成するために使用することができる比較的安価で簡潔な組織処理の点で利点をもたらすことができる。ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション技法は、この種の組織サンプル中での遺伝子発現を調査および比較することができる好ましい方法となる。対象とする組織を処理するための技法であって、対象または対照サンプル中の遺伝子発現を表すＲＮＡの有用性を維持する技法は、当業者によく知られている。しかしながら、対象または対照サンプル中の遺伝子発現を表すｍＲＮＡを抽出および回収することができる技法も当業者によく知られており、本発明者らは、このような技法は本発明に従い有利に利用することができることを発見している。対象または対照サンプルから抽出したｍＲＮＡを含むサンプルは、本発明の第三の態様の方法中で使用するのに好ましい可能性がある。このような抽出物には、元の組織を含むサンプルの場合より簡単に調べられる傾向があるからである。例えば、遺伝子発現の比較を可能にするのに適した標的分子は、対象由来の組織のサンプル、または対照組織のサンプルから単離した全ＲＮＡを含むことができる。さらに、抽出したＲＮＡは容易に増幅して、対象または対照サンプル中の遺伝子発現に関する多大な情報を与えることができる拡大ｍＲＮＡサンプルを生成することができる。ｍＲＮＡ集団の抽出および増幅に適した技法の例はよく知られており、以下でより詳細に考える。
【００５９】
例えば、本発明による使用に適した核酸標的を生成するための核酸の単離および精製法は、Ｃｈａｐｔｅｒ３ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、ＰａｒｔＩ．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）中に詳細に記載される。
【００６０】
遺伝子発現の調査および比較前に核酸標的を増幅することが望ましい場合、サンプルが由来する対象または対照組織中の増幅核酸の相対頻度を、維持または調節する方法を使用することが好ましい可能性がある。
【００６１】
「定量的」増幅の適切な方法は当業者によく知られている。１つのよく知られている例、定量的ＰＣＲは、その量が対照と対象サンプルの間で不変であることが知られている対照配列をいっせいに同時に増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を測定するために使用することができる内標準を与える。
【００６２】
前述の方法以外に、当業者は、遺伝子転写産物特異的生成物の増幅とシグナル生成を結び付けた任意の技法も、定量化に適している可能性があることを理解しているであろう。好ましい例は、ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの初期逆転写を組み込むことによりそれを特異的ｍＲＮＡ転写産物の正確な定量化に適したものにしている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＵＳ４６８３１９５および４６８３２０２）の好都合な改良点を利用する。さらなる重要な改良点が、反応進行時にリアルタイムで蓄積するＰＣＲ産物の測定を可能にする。
【００６３】
多くの場合、関連サンプル中の標的分子の存在を示すことができるプローブ分子を使用して、対象または対照サンプル中の遺伝子発現の程度を評価することは好ましい可能性がある。
【００６４】
調査する遺伝子発現の（直接または間接）産物を参照して、プローブを選択することができる。適切なプローブの例には、適切な特異性を有するオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、アプタマー、および結合タンパク質または小分子がある。
【００６５】
オリゴヌクレオチドプローブはプローブとして使用することができる。適切なオリゴヌクレオチドプローブの作製は当業者によく知られている（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｅｔ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（ｅｄ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４））。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、多くの会社から市販されている。
【００６６】
本記載の目的で、オリゴヌクレオチドプローブは、１つまたは複数の型の化学結合を介して相補的配列の核酸標的分子と特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチドを含むと考えることができる。このような結合は通常は相補的塩基対形成によって、および通常は水素結合形成によって生じる可能性がある。適切なオリゴヌクレオチドプローブは、天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含むことができる。さらに、この変異がオリゴヌクレオチドプローブとその標的のハイブリダイゼーションに干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合を使用して（１つまたは複数の）オリゴヌクレオチドプローブ中の塩基を接合することができる。したがって、適切なオリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって構成塩基が接合するペプチド核酸であってよい。
【００６７】
本明細書で説明するように、マイクロＲＮＡ分子（「ｍｉＲＮＡ」）は一般に２１〜２２ヌクレオチド長であるが、１７および最大２５ヌクレオチド長が報告されている。ｍｉＲＮＡはそれぞれ長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされる。前駆体ｍｉＲＮＡは非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体ｍｉＲＮＡは、動物中でダイサーと呼ばれる酵素によって切断されるステム−ループまたは折返し様構造を、それらが形成するのを可能にする２つの相補領域を有する。ダイサーはリボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼである。プロセシングされるｍｉＲＮＡは典型的にはステムの一部分である。
【００６８】
プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）は大きな複合体の一部となり、特定の標的遺伝子を下方制御する。動物のｍｉＲＮＡの例には、標的と不完全に塩基対を形成し、それによって翻訳を停止させる（Ｏｌｓｅｎら、１９９９；Ｓｅｇｇｅｒｓｏｎら、２００２）ｍｉＲＮＡがある。ＳｉＲＮＡ分子もダイサーによってプロセシングされるが、ただし長鎖の、二本鎖ＲＮＡ分子からである。ＳｉＲＮＡは動物細胞において本来見られないが、それらはこのような細胞においてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）で働いて、ｍＲＮＡ標的の配列特異的切断を誘導することができる（Ｄｅｎｌｉら、２００３）。
【００６９】
内因性ｍｉＲＮＡ分子の試験は例えば米国特許出願６０／５７５，７４３中に記載されている。合成ｍｉＲＮＡｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡの翻訳を制御するタンパク質複合体によって、成熟、一本鎖ＲＮＡが結合するとき、細胞中で外見上活性がある。内因的に発現されるｍｉＲＮＡと同じ形式で細胞に影響を与える外因性ＲＮＡ分子の導入は、内因性成熟ｍｉＲＮＡと同じ配列の一本鎖ＲＮＡ分子が、翻訳制御を容易にするタンパク質複合体によって取り込まれることを必要とする。様々なＲＮＡ分子の設計が評価されている。ｍｉＲＮＡ経路による望ましい一本鎖ｍｉＲＮＡの取り込みを最大にする、３つの一般的な設計が同定されている。この３つの設計の少なくとも１つを有しｍｉＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子を、合成ｍｉＲＮＡと呼ぶ。
【００７０】
本発明の合成ｍｉＲＮＡは、いくつかの実施形態で、１つのＲＮＡが天然に存在する、成熟ｍｉＲＮＡと同一である２つのＲＮＡ分子を含む。成熟ｍｉＲＮＡと同一であるＲＮＡ分子は活性鎖と呼ぶ。相補鎖と呼ぶ第二のＲＮＡ分子は、活性鎖と少なくとも部分的に相補的である。活性鎖と相補鎖はハイブリダイズして、細胞中でのｍｉＲＮＡ活性化の直前にタンパク質複合体によって結合した、天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体と類似した合成ｍｉＲＮＡと呼ばれる、二本鎖ＲＮＡを生成する。合成ｍｉＲＮＡの最大活性は、翻訳レベルでの遺伝子発現を制御するｍｉＲＮＡタンパク質複合体による、活性鎖の最大の取り込みおよび相補鎖の最大の取り込みを必要とする。最適ｍｉＲＮＡ活性をもたらす分子設計は、相補鎖に対する修飾を含む。
【００７１】
２つの設計は相補鎖中の化学修飾を組み込む。第一の修飾は、その５’末端にリン酸またはヒドロキシル以外の化学基を有する相補的ＲＮＡの作製を含む。５’の修飾の存在によって相補鎖の取り込みが外見上なくなり、ｍｉＲＮＡタンパク質複合体による活性鎖の取り込みを後に助長する。５’の修飾は、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、ビオチン、およびその他を含めた様々な分子のいずれかであってよい。
【００７２】
ｍｉＲＮＡ経路によって相補鎖の取り込みを有意に低下させる第二の化学修飾戦略は、相補鎖の最初の２〜６ヌクレオチド中に糖修飾を有するヌクレオチドを組み込むことである。第二の設計戦略と一致した糖修飾を第一の設計戦略と一致した５’末端修飾と関連付けて、合成ｍｉＲＮＡ活性をさらに高めることができることを記さなければならない。
【００７３】
第三の合成ｍｉＲＮＡ設計は、活性鎖と相補的ではない相補鎖の３’末端にヌクレオチドを組み込むことを含む。
【００７４】
生成した活性ＲＮＡと相補的ＲＮＡのハイブリッドは活性鎖の３’末端で非常に安定しているが、活性鎖の５’末端では比較的不安定である。ｓｉＲＮＡを用いた試験は、５’ハイブリッドの安定性は、細胞中のｍｉＲＮＡ経路と少なくとも関連があるＲＮＡ干渉を促進する、タンパク質複合体によるＲＮＡ取り込みの重要な指標であることを示す。相補的ＲＮＡ鎖中のミスマッチの賢明な使用は、合成ｍｉＲＮＡの活性を有意に高める。
【００７５】
本明細書で説明する用語「ｍｉＲＮＡ」は一本鎖分子を一般に指すが、特定の実施形態では、本発明の条件を満たす分子は、部分的（鎖の長さ中１０〜５０％相補的）、実質的（鎖の長さ中５０％を超えてただし１００％未満で相補的）、または同じ一本鎖分子の別の領域もしくは別の核酸と完全に相補的である領域または別の鎖も包含する。したがって核酸は、１つまたは複数の相補的または（１つまたは複数の）自己相補的鎖または分子を含む特定配列の「（１つまたは複数の）補体」を含む分子を包含することができる。例えば前駆体ｍｉＲＮＡは、最大１００％相補的である自己相補的領域を有することができる。
【００７６】
合成ｍｉＲＮＡは典型的に、二本の鎖、試験中の成熟ｍｉＲＮＡと配列が同一である活性鎖、および活性鎖と少なくとも部分的に相補的である相補鎖を含む。活性鎖は生物学的関係がある分子であり、細胞中でｍＲＮＡ分解または翻訳制御のいずれかによって翻訳を調節する複合体によって優先的に取り込まれるはずである。活性鎖の優先的取り込みには２つの核心を突く結果がある。（１）観察する合成ｍｉＲＮＡの活性は劇的に増大する、および（２）相補鎖の取り込みおよび活性化によって誘導される意図しない効果がほぼ消失する。本発明によれば、いくつかの合成ｍｉＲＮＡ設計を使用して、活性鎖の優先的取り込みを確実にすることができる。
【００７７】
相補鎖の５’末端におけるリン酸またはヒドロキシル以外の安定部分の導入は、ｍｉＲＮＡ経路中のその活性を害する。これは、合成ｍｉＲＮＡの活性鎖のみが、細胞中の翻訳を制御するために使用されることを確かにする。５’修飾には、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２Ｏ−Ｍｅ、ＤＭＴＯ、フルオロセイン、チオール、またはアクリジン、またはこの型の官能性を有する任意の他の基があるが、これらだけには限られない。
【００７８】
他のセンス鎖修飾。２’−０Ｍｅ、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、ＤＭＴＯ、フルオロセイン、チオール、またはアクリジン、または合成ｍｉＲＮＡの相補鎖中にこの型の官能性を有する、任意の他の基のようなヌクレオチド修飾の導入は、相補鎖の活性を除去し、ｍｉＲＮＡの活性鎖の取り込みを高めることができる。
【００７９】
ｓｉＲＮＡと同様に（Ｓｃｈｗａｒｚ、２００３）、合成ｍｉＲＮＡの活性鎖の５’末端と３’末端の相対的安定性は、ｍｉＲＮＡ経路による活性鎖の取り込みおよび活性化を外見上決定する。合成ｍｉＲＮＡの相補鎖の３’末端中の塩基ミスマッチの戦略的配置による、合成ｍｉＲＮＡの活性鎖の５’末端の不安定化は、活性鎖の活性を高め、相補鎖の活性をほぼ除去する。
【００８０】
ｍｉＲＮＡ−１２２２とも呼ばれるｍｉＲ−１２２、２２ヌクレオチドのマイクロＲＮＡは、遺伝子ｈｃｒから転写される肝臓特異的非コードポリアデニル化ＲＮＡに由来する。ｈｃｒのｍＲＮＡ内のｍｉＲ−１２２の正確な配列、および隣接する二次構造は、哺乳動物種から魚類に遡り保存されている。マウス肝臓中のｍｉＲ−１２２のレベルは胚発生の第１７日ごろに半最大値まで増大し、出生前に平均細胞当たり５０，０００コピーのほぼ最大レベルに達する（それは全ｍｉＲＮＡの７０％を構成する）（Ｃｈａｎｇら、２００４；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２）。それは、組織の分化状態の維持を担う可能性がある遺伝子発現のパターンを確定するのに重要であると考えられる、多くの組織特異的マイクロＲＮＡの１つである（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２；Ｌｉｍら、２００５）。
【００８１】
本明細書で使用する語句「〜と特異的にハイブリダイズする」は、複合体混合物（全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡなど）中にその配列が存在するときストリンジェントな条件下で、特定の標的ヌクレオチド配列と優先的にオリゴヌクレオチドプローブが結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。一実施形態では、プローブは特定の標的分子のみと結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることができる。
【００８２】
用語「ストリンジェントな条件」は、その下でプローブがその標的部分列と、ただし他の配列とは最小限でハイブリダイズする条件を指す。いくつかの実施形態では、プローブはストリンジェントな条件下でその標的以外の配列とハイブリダイズすることができない。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況で異なり得る。長い配列は高温で特異的にハイブリダイズする。
【００８３】
一般に、定義したイオン強度およびｐＨでの特定配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低い、ストリンジェントな条件を選択することができる。Ｔｍは、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプローブの５０％が平衡状態で標的核酸とハイブリダイズする、（定義したイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下での）温度である。標的核酸は一般に過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、平衡状態では５０％のプローブが占有される。例えばストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で少なくとも約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関する温度が少なくとも約３０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によって得ることもできる。
【００８４】
オリゴヌクレオチドプローブを使用して、適切な代表サンプル中の相補的核酸配列（すなわち、核酸標的）を検出することができる。このような相補的結合は、オリゴヌクレオチドを使用して検出し、それによって特定遺伝子の発現を比較することができる大部分の技法の基礎を形成する。いくつかの適切な技術は多数の遺伝子発現の平行定量化を可能にし、定量的逆転写ＰＣＲ技術などの種の増幅と定量化をリアルタイムで結び付けた技術、およびアレイ技術などの増幅種の定量化を増幅後に行う技術を含む。
【００８５】
アレイ技術は、それぞれのプローブが開示する１つまたは複数の遺伝子、またはｍｉＲＮＡと優先的にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いる、対象または対照サンプルを表すサンプルのハイブリダイゼーションを含む。アレイ技術は、例えばそれらの物理的位置（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．によって市販された二次元アレイ中の格子）によって、または別の特徴（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＩｎｃまたはＬｕｍｉｎｅｘ Ｉｎｃによって市販された標識ビーズ）との関連によって、特異的オリゴヌクレオチド配列の独自の同定をもたらす。オリゴヌクレオチドアレイは、（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃによって市販された光誘導型合成により）ｉｎ ｓｉｔｕで合成する、または（ＡｇｉｌｅｎｔまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって市販された）接触もしくはインクジェット技術によって事前形成およびスポットすることができる。完全または部分的ｃＤＮＡ配列は、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって市販された）アレイ技術用のプローブとして働くこともできることは、当業者には明らかであろう。
【００８６】
オリゴヌクレオチドプローブを、サザンブロッティングまたはノーザンブロッティングなどのブロッティング技法中で使用して、（例えば、遺伝子発現を表すｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ標的分子によって）遺伝子発現を検出および比較することができる。サザンまたはノーザンブロッティング技法中で使用するのに適した技法および試薬は、当業者にはよく知られているであろう。簡単に言うと、ＤＮＡ（サザンブロッティングの場合）またはＲＮＡ（ノーザンブロッティングの場合）標的分子を含むサンプルを、アクリルアミドまたはアガロースなどのゲル材料を貫通するそれらの能力に従って分離する。ゲルの貫通は毛細管現象によって、または電場の活性によって誘導することができる。標的分子の分離を実施した後、これらの分子を、（例えばベーキングによってまたは紫外線照射によって）膜に固定する前に、薄膜（典型的にはナイロンまたはニトロセルロース）に移す。したがって遺伝子発現は、膜に結合した標的分子とオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって、検出および比較することができる。
【００８７】
特定の状況では、遺伝子発現を比較するための伝統的なハイブリダイゼーションプロトコルの使用が問題となる可能性がある。例えばブロッティング技法には、ほぼ同じ分子量の２つ以上の遺伝子産物またはｍｉＲＮＡを区別する、難点がある可能性がある。このような同様に大きい産物は、ゲルを使用して分離するのが難しいからである。したがって、このような状況では、以下に記載する技法などの別の技法を使用して、遺伝子発現を比較することは好ましい可能性がある。
【００８８】
対象中の遺伝子発現および／またはｍｉＲＮＡのレベルを表すサンプル中の遺伝子発現は、高密度オリゴヌクレオチドアレイ技術によって、適切な核酸サンプル内の全体の転写産物レベルを参照して評価することができる。このような技術は、オリゴヌクレオチドプローブが、例えば共有結合によって固形支持体と結合したアレイを利用する。固形支持体に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのこれらのアレイは、遺伝子発現を比較するための本発明の方法およびキット中で使用するのに好ましい要素となる。多数のこのようなプローブをこの形式で結合させて、多数の遺伝子またはｍｉＲＮＡの発現を比較するのに適したアレイを提供することが可能である。したがって、このようなオリゴヌクレオチドアレイは、２つ以上のｍｉＲＮＡおよび／または遺伝子の発現を比較することが望ましい実施形態中で、特に好ましい可能性があることは理解されよう。
【００８９】
遺伝子発現を表す核酸標的の比較において使用することができる他の適切な方法には、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）；またはローリングサークル型ＤＮＡ増幅（ＲＣＡ）があるが、これらだけには限られない。
【００９０】
それらを容易に検出することができるように、プローブを標識することは通常望ましい。本発明に従い使用するのに適したプローブまたは標的の標識において使用することができる検出可能成分の例には、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能である任意の組成物がある。適切な検出可能成分には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質および比色分析用物質がある。これらの検出可能成分は、相反することを示さない限り、本発明の方法中で使用することができる全タイプのプローブまたは標的における取り込みに適している。
【００９１】
適切な酵素の例にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがあり、適切な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがあり、適切な蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン イソシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリスリン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質などがあり、発光物質の例にはルミノールがあり、生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンがあり、適切な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、または３２Ｐがあり、適切な比色分析用物質の例にはコロイド金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズがある。
【００９２】
このような標識を検出する手段は当業者によく知られている。例えば、放射性標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、発光を検出するための光検出器を使用して検出することができる。典型的には酵素標識は、酵素および基質を与えること、および基質に対する酵素の作用によって生成した反応産物を検出することによって検出され、比色標識は着色標識を単に視覚化することによって検出される。
【００９３】
本発明の一実施形態では、蛍光標識プローブまたは標的をスキャンすることができ、蛍光はレーザー共焦点スキャナーを使用して検出することができる。
【００９４】
標識核酸プローブまたは標的の場合、適切な標識はハイブリダイゼーションの前、最中、または後に実施することができる。一実施形態では、核酸プローブまたは標的はハイブリダイゼーションの前に標識する。蛍光標識も適切であり、および使用時に、それらの核酸標的と核酸プローブのハイブリダイゼーションの定量化は、ハイブリダイズした蛍光標識核酸からの蛍光の定量化による。定量化は、核酸に取り込まれるハプテンと結合する蛍光標識試薬からであってよい。
【００９５】
本発明の一実施形態では、ハイブリダイゼーションの分析は、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）などの適切な分析用ソフトウェアを使用して実施することができる。
【００９６】
有効な定量化は、アレイ自動走査を可能にする自動ステージを備えることができ、かつ蛍光強度情報の自動測定、記録およびその後の処理用のデータ収集システムを備えることができる、蛍光顕微鏡を使用して実施することができる。このような自動化の適切な配置は従来通りであり、当業者によく知られている。
【００９７】
一実施形態では、ハイブリダイズした核酸は、核酸と結合した１つまたは複数の検出可能成分を検出することによって検出する。検出可能成分は、当業者によく知られているいくつかの手段のいずれかによって取り込ませることが可能である。しかしながら、一実施形態では、このような成分は、サンプル核酸（プローブまたは標的）の調製における増幅ステップ中に同時に取り込ませる。したがって、例えば、検出可能成分で標識したプライマーまたはヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、前記成分で標識した増幅産物を提供し得る。別の実施形態では、蛍光標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する転写増幅は、転写される核酸に標識を取り込ませる。
【００９８】
あるいは、適切な検出可能成分は、元の核酸サンプル（例えば、対象とする組織由来のｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に直接、または元の核酸の増幅が終了した後に増幅産物に加えることができる。蛍光標識などの標識と核酸を結合させる手段は当業者によく知られており、例えば核酸のキナーゼ処理、およびサンプルと接合した核酸リンカーと標識（適切なフルオロフォアなど）の後の結合（連結）による、ニックトランスレーションまたは末端標識（例えば、標識ＲＮＡを用いる）を含む。
【００９９】
本発明の方法はヒト対象に関して使用するのに最適であるが、本発明の方法は、非ヒト動物（例えば、ウマ、イヌ、ウシ、ラクダ）におけるウイルス感染の治療過程を決定する際にも有用であり得ることは理解されよう。
【０１００】
以前の試験において、本発明者らは、内因性ＩＦＮ系は多くの感染患者中で絶えず活性化されることを確定した。さらに、本発明者らは驚くことに、予め活性化されたＩＦＮ系がある患者とＩＦＮ療法に対する乏しい応答を関連付けた。この発見は直感に反する。活性化した先天性免疫系は、ＩＦＮα療法中にウイルスの除去を手助けすると予想されるからである。
【０１０１】
本発明者らは肝生検中のＩＳＧ発現を分析し、ＨＣＶが驚くことに内因性ＩＦＮ系を誘導する（阻害しない）患者が存在し、かつ（おそらくＴＲＩＦおよび／またはＣａｒｄｉｆの切断によって）ＨＣＶが内因性ＩＦＮ系を誘導しない患者が存在するが、この違いは慢性感染を維持するＨＣＶの能力に対して全く影響がないとさらに結論付けた。
【０１０２】
ＩＦＮ系の事前活性化がない患者において、本発明者らは、ペグＩＦＮα２ｂが４時間以内に肝臓中で多くのＩＳＧの確かな（準）最大上方制御を誘導したことを発見した。驚くことに、このような高いＩＳＧ発現レベルは、第４週で迅速なウイルス学的著効を後に示さなかった患者の前処理生検において既に存在した。
【０１０３】
内因性ＩＦＮ系の事前活性化が、遺伝子型２または３よりＨＣＶ遺伝子型１（および４）に感染した患者の肝生検中で一層頻繁に見られたことも発見した。遺伝子型２および３の感染は、遺伝子型１を有する患者の５０％未満と比較して、８０％を超える患者で治癒することができることはよく知られているので、これは興味深い。内因性ＩＦＮ系の事前活性化の頻度および程度はＨＣＶの遺伝子型に依存するという本発明者らの発見は、ＨＣＶの遺伝子型の異なる治療感受性に関する説明を与える。
【０１０４】
本発明者らは、これらのデータは、ＨＣＶはＩＦＮシグナル伝達に干渉し、それによって療法に対する応答を損なうことを確かにしたことに気付いた。さらに、ＨＣＶによるＩＦＮαシグナル伝達の阻害は、内因性ＩＦＮ系の強い事前活性化が、ＨＣＶの自然な除去をもたらさない理由を説明する。本発明者らは、何らかの仮説によって縛られることは望まないが、これは、ＨＣＶに感染した肝細胞中で、ＩＦＮαが抗ウイルス状態を誘導する可能性はないことを意味すると考える。多くの患者の肝臓中で観察したＩＳＧの上方制御は、したがって非感染肝細胞中のみで起こり得る。
【０１０５】
肝生検中で見られるＩＳＧの強い誘導はこのようなモデルと適合性がある。感染肝細胞より多くの非感染肝細胞が存在するからである。ＩＦＮβ産生は、Ｃａｒｄｉｆおよび／またはＴＲＩＦ切断が成功しないウイルスに感染した肝細胞中で起こり得る。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路のＨＣＶ誘導型阻害のため、分泌されるＩＦＮβは、これらの感染肝細胞中で抗ウイルス状態を誘導しないが、非感染状態の近隣細胞中でのみ誘導し得る。
【０１０６】
「を低減する」によって、本発明者らは、作用物質がＩＳＧの発現レベルが対照組織中での発現レベルと著しく異ならないように、ＩＳＧの刺激を低減するのに有効であることを意味する。
【０１０７】
Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス感染を含めたいくつかの肝臓の異なるウイルス感染の治療において、作用物質を使用することができる。一実施形態では、作用物質を使用してＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防または低減する。
【０１０８】
本発明に従い使用することができる作用物質の例には、作用物質がＩＦＮαポリペプチドと結合してＩＦＮの機能活性を妨げることができる場合、例えば、抗体および断片およびそれらの誘導体（例えば、ドメイン抗体またはＦａｂ）がある。あるいは作用物質は、ＩＦＮα受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２ａ、ｂ、またはｃ）でアンタゴニストとして作用することによって、ＩＦＮ系に対する競合阻害剤として作用することができる。あるいは作用物質は、ＩＦＮ経路中の酵素または他の分子を阻害することができる。あるいは作用物質は、そのｍＲＮＡの低減、したがってＩＦＮαポリペプチドの低減をもたらすような形式で、ＩＦＮαポリペプチドをコードするｍＲＮＡと結合することができる。あるいは作用物質は、それがＩＦＮαポリペプチドをコードする転写ｍＲＮＡの量の低減をもたらすような形式で、ＩＦＮαをコードする核酸配列と結合することができる。例えば作用物質は、ＩＦＮα遺伝子のコードまたは非コード領域、またはＩＦＮのＤＮＡの５’または３’と結合して、それによってタンパク質の発現を低減することができる。
【０１０９】
いくつかの異なるヒトインターフェロンαポリペプチド配列が存在する。コンセンサス配列が決定されている。当業者によって、この情報を使用してＩＦＮαポリペプチドに対する結合作用物質を開発することができる。
【０１１０】
作用物質がＩＦＮαポリペプチドと結合するとき、その作用物質は、その天然型に正確にフォールディングされたタンパク質によって定義されるエピトープと結合することが好ましい。種間およびさらに遺伝子型間に、ある程度の配列変動性があり得ることは理解されよう。したがって、他の好ましいエピトープは、遺伝子変異体由来の同等の領域を含み得る。さらなるＩＦＮポリペプチド由来の同等の領域は、前述の配列類似性および同一性ツール、およびデータベース検索法を使用して同定することができる。
【０１１１】
動物に抗原を注射することによって、ポリクローナル血清として抗体を産生することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、当業者に知られている技法を使用して、抗原（例えば、ＩＦＮαポリペプチドの全体または断片）を動物（例えば、ウサギ）に接種することによって産生することができる。
【０１１２】
あるいは抗体はモノクローナルであってよい。従来のハイブリドーマ技法を使用してこのような抗体を産生することができる。本発明中で使用するためのモノクローナル抗体を作製するために使用する抗原は、ポリクローナル血清を作製するために使用するのと同一であってよい。
【０１１３】
その最も簡潔な型で、抗体または免疫グロブリンタンパク質は、γ−免疫グロブリン（ＩｇＧ）クラスの抗体によって通常例示されるＹ形状分子である。この分子は、４本のポリペプチド鎖、それぞれ各々約５０ｋＤおよび２５ｋＤの２本の同一な重鎖（Ｈ）および２本の同一な軽鎖（Ｌ）からなる。それぞれの軽鎖は、ジスルフィドおよび非共有結合によって重鎖と結合する（Ｈ−Ｌ）。２本の同一なＨ−Ｌ鎖の組合せは、２本のＨ鎖間で同様の非共有結合およびジスルフィド結合により互いに結合して、基本の４本の鎖免疫グロブリン構造（Ｈ−Ｌ）２を形成する。
【０１１４】
軽鎖免疫グロブリンは１つのＶ−ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）で構成され、一方で重鎖は１つのＶ−ドメイン、およびＨ鎖のアイソタイプに応じて、３つまたは４つのＣ−ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）からなる。
【０１１５】
Ｎ末端において、それぞれの軽鎖または重鎖の領域は、配列が大きく異なり、抗原との特異的結合を担う可変（Ｖ）ドメインである。抗原に対する抗体特異性は実際、超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られるＶ領域内のアミノ酸配列によって決定される。それぞれＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域は３つのこのようなＣＤＲを有し、それは抗体の抗原結合部位を形成する全６個の組合せである。わずかな変異を示し超可変ループを支持する残りのＶ領域アミノ酸は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
【０１１６】
可変ドメイン（Ｃ−ドメイン）を超える領域は比較的配列が一定である。本発明による抗体の特徴とする特徴は、ＶＨおよびＶＬドメインであることは理解されよう。ＣＨおよびＣＬドメインの正確な性質は概して本発明には重要ではないことが、さらに理解されよう。実際、本発明中で使用するのに好ましい抗体は、非常に異なるＣＨおよびＣＬドメインを有する可能性がある。さらに、以下でより完全に論じるように、好ましい抗体機能誘導体は、Ｃドメインがない可変ドメインを含むことができる（例えば、ｓｃＦＶ抗体）。
【０１１７】
一種で作製される抗体、および特にｍＡｂは、異なる種を治療するために使用するとき、いくつかの重大な欠点を有することが知られている。例えばマウス抗体をヒト中で使用するとき、それらは短い血清中循環半減期を有する傾向があり、治療される患者の免疫系により外来タンパク質として認識される可能性がある。これは望ましくないヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の発生をもたらす可能性がある。抗体の頻繁な投与が必要とされるとき、これは特に問題がある。それはそのクリアランスを高め、その治療効果を阻害し、かつ過敏反応を誘導する可能性があるからである。これらの要因がヒト療法におけるマウスモノクローナル抗体の使用を制限し、ヒト化抗体を作製するための抗体操作技術の開発を促す。
【０１１８】
したがって、ＩＦＮ活性を低減することができる抗体を、ヒト対象中のＨＣＶ感染を治療するための治療剤として使用する場合、したがって、非ヒト起源の抗体およびその断片はヒト化することが好ましい。
【０１１９】
（例えば、非ヒトハイブリドーマにおいて作製したモノクローナル抗体由来の）Ｖ領域配列と、ヒト抗体由来のＣ領域（および理想的にはＶ領域由来のＦＲ）配列を接合することによって、ヒト化を実施することができる。生成する「操作」抗体は、それらが由来した非ヒト抗体よりヒト中で免疫原性が低く、したがって臨床用途により適している。
【０１２０】
ヒト化抗体はキメラモノクローナル抗体であってよく、その中で、組換えＤＮＡ技術を使用して、げっ歯類免疫グロブリン定常領域はヒト抗体の定常領域と置換される。次いでキメラＨ鎖およびＬ鎖遺伝子を、適切な制御エレメントを含有する発現ベクターにクローニングすることができ、哺乳動物細胞に誘導して完全グリコシル化抗体を産生することができる。この目的に適したヒトＨ鎖Ｃ領域遺伝子を選択することによって、抗体の生物活性を予め決定することができる。このようなキメラ分子を使用して、本発明に従い癌を治療または予防することができる。
【０１２１】
抗体のさらなるヒト化は、抗体のＣＤＲ移植または再形成を含むことができる。このような抗体は、（抗体の抗原結合部位を形成する）非ヒト抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲを、ヒト抗体の対応するフレームワーク領域に移植することによって産生される。
【０１２２】
ヒト化抗体断片は、本発明に従い使用するのに好ましい作用物質となる。ＩＦＮαポリペプチドまたはＩＦＮ受容体上のエピトープを認識するヒトＦＡｂは、可変鎖ヒト抗体のファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。（例えば、ＭｏｒｐｈｏｓｙｓまたはＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発された）当技術分野で知られている技法を利用して、本発明に従い作用物質として使用することができるＦａｂを作製することができる。簡単に言うと、ヒトコンビナトリアルＦａｂ抗体ライブラリーを、単鎖Ｆｖライブラリー由来の重鎖および軽鎖可変領域を、Ｆａｂディスプレイベクターに移植することによって作製することができる。このライブラリーは２．１×１０１０の異なる抗体断片を生成することができる。次いでペプチドを「おとり」として使用して、望ましい結合性を有するそのライブラリーから抗体断片を同定することができる。
【０１２３】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、本発明のこの実施形態に従い使用することができる別の好ましい作用物質となる。ｄＡｂは抗体の最小の機能的結合単位であり、ヒト抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変領域に相当する。このようなｄＡｂは、約１３ｋＤａの分子量（完全抗体の大きさの約１／１０（またはそれ未満）に相当）を有することができる。
【０１２４】
アプタマーは、本発明の第三または第四の態様の別の好ましい作用物質となる。アプタマーは、特異的、配列依存的な形状をとる核酸分子であり、アプタマーとリガンドの間の鍵と鍵穴の適合に基づいて特異的標的リガンドと結合する。典型的には、アプタマーは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡ）のいずれか、または一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ）を含むことができる。アプタマーを使用して、核酸および非核酸標的の両方と結合することができる。したがって、ＩＦＮαを認識しそれによってＩＦＮαの活性または発現を低減する、アプタマーを作製することができる。適切なアプタマーはランダムな配列プールから選択することができ、そこから高親和性で選択した標的分子と結合する特異的アプタマーを同定することができる。望ましい特異性を有するアプタマーを生成および選択するための方法は当業者によく知られており、ＳＥＬＥＸ（指数関数的増大によるリガンドの系統的進化）法を含む。簡単に言うと、オリゴヌクレオチドの巨大ライブラリーを生成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択およびポリメラーゼ連鎖反応による後の増幅の反復プロセスによる、多量の機能的核酸の単離を可能にする。
【０１２５】
アンチセンス分子は、患者の治療に使用するための別の好ましい作用物質となる。典型的にはアンチセンス分子は、遺伝子によって生成される相補的核酸配列と特異的に結合することができ、それを不活性化する、その遺伝子を効率よく「オフ」にする一本鎖核酸である。当業者によって理解されるように、それが「センス」配列と呼ばれる遺伝子のｍＲＮＡと相補的であるので、この分子は「アンチセンス」と呼ぶ。典型的にはアンチセンス分子は、１５〜３５塩基長のＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的類似体である。アンチセンス核酸を実験的に使用してｍＲＮＡと結合させ、特異的遺伝子の発現を妨げている。これは、癌、糖尿病および炎症疾患の治療用の薬剤としての「アンチセンス療法剤」の開発につながっている。アンチセンス薬剤は、ヒト治療用途に関してＵＳＦＤＡによって近年承認されている。したがって、ＩＦＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子を設計することによって、細胞中のＩＦＮαポリペプチドの発現を低減し、それによってＩＦＮα活性を低減し、ＨＣＶ感染において見られる事前活性化を低減することができる可能性がある。ＩＦＮαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は図８中に与える。
【０１２６】
短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られることもある、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、本発明の第三または第四の態様に従い使用するのに好ましい、さらなる作用物質となる。前述のように、本発明者らは、ＩＦＮ系の事前活性化は抗ウイルス療法に対する耐性と関係があることを理解した。したがって、ＩＦＮα発現を低減することができるｓｉＲＮＡ分子には、ＨＣＶ感染を治療するための医薬品の調製において多大な有用性があることは明らかである。ｓｉＲＮＡは、それによってｓｉＲＮＡが特異的遺伝子の発現の低減をもたらし、またはこのようなｍＲＮＡの翻訳に特異的に干渉し、それによってｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現を阻害することができるＲＮＡ干渉経路（ＲＮＡｉ）に関与する、２０〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子の１クラスである。ｓｉＲＮＡは十分に定義された構造、いずれかの末端に２ｎｔの３’突出部分がある短い（通常２１ｎｔ）二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を有する。それぞれの鎖は、５’リン酸基および３’ヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する。ｉｎ ｖｉｖｏでのこの構造は、ダイサー、長いｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに転換する酵素によるプロセシングの結果である。ｓｉＲＮＡを様々なトランスフェクション法により外から（人為的に）細胞に導入して、対象とする遺伝子の特異的ノックダウンをもたらすこともできる。したがって、その配列が知られているほぼ任意の遺伝子を、適切に調節されたｓｉＲＮＡとの配列相補性に基づいてターゲティングすることができる。対象とするほぼ任意の遺伝子をノックダウンする能力を考慮すると、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉは、基礎生物学と応用生物学の両方において大きな関心を引き起こしている。様々な生物学的経路中で重要な遺伝子を同定するために設計された、多数の大規模なＲＮＡｉスクリーニングが存在する。疾患プロセスは多数の遺伝子の活性にも依存するので、いくつかの状況では、ｓｉＲＮＡによる遺伝子の活性の抑制は、治療効果をもたらす可能性があると予想される。したがってその発見は、生物医学研究および薬剤開発のための、ＲＮＡｉの抑制の関心の上昇をもたらしている。近年の治療用ＲＮＡｉの第Ｉ相臨床試験の結果は、ｓｉＲＮＡは十分耐性があり適切な薬物動態性を有すること実証する。したがってｓｉＲＮＡおよび関連ＲＮＡｉ誘導法は、近い将来重要な新クラスの薬剤となる。ＩＦＮαポリペプチドをコードする核酸に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を使用してＩＦＮαの発現を低減し、したがってＩＦＮ系の事前活性化の低減をもたらすことができる。したがって、本発明のこの態様の一実施形態は、作用物質がＩＦＮαポリヌクレオチドに対する相補配列を有するｓｉＲＮＡ分子である実施形態である。
【０１２７】
このような情報を使用すると、ＩＦＮαポリヌクレオチドに対する相補配列を有するｓｉＲＮＡ分子を設計することは簡単であり、十分当業者の能力の範囲内にある。例えば、簡単なインターネット検索によって、ｓｉＲＮＡ分子を設計するために使用することができる多くのウエブサイトを得る。
【０１２８】
「ｓｉＲＮＡ分子」によって、本発明者らは、二本鎖２０〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子、およびｓｉＲＮＡ分子を構成する２つの一本ＲＮＡ鎖のそれぞれを含める。
【０１２９】
例えば、ｓｉＲＮＡはヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形で使用される。このようなｓｈＲＮＡは、（例えば、約９ヌクレオチドの）スペーサー配列によって連結した２つの相補的ｓｉＲＮＡ分子を含むことができる。相補的ｓｉＲＮＡ分子は、それらが一緒に結合するようにフォールディングすることができる。
【０１３０】
ＩＦＮαポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡを切断することができるリボザイムは、本発明の第三または第四の態様の別の好ましい作用物質となる。
【０１３１】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、飼育動物または人間であってよい。治療する対象はヒトであることが好ましい。これが該当するとき、それらがヒト治療（例えば、前に論じたような抗体のヒト化）に最適であるように、作用物質を設計することができる。しかしながら、獣医学の対象となる他の動物（例えば、ウマ、ラクダ、ウシ、イヌまたはネコ）を治療するために、作用物質を使用することも可能であることも理解されよう。
【０１３２】
本明細書で言及する「薬剤として許容されるビヒクル」は、医薬組成物を配合する際に有用であるとして当業者に知られている任意の生理的ビヒクルである。
【０１３３】
技術者が本発明の第一の態様の方法を実施するのに必要とする様々な要素を、キットに組み込むことができる。
【０１３４】
したがって、本発明の態様によれば、肝臓のウイルス感染がある対象が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に応答する可能性を決定するためのキットであって、
（ｉ）対象由来のサンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを分析するための手段、および場合によっては、
（ｉｉ）サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと、対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを比較するための手段を含むキットを提供する。
【０１３５】
「対象由来のサンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを分析するための手段」によって、本発明者らは、サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを示す分子をターゲティングすることができる特異的結合分子を含める。いくつかの実施形態では、特異的結合分子はオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、アプタマー、または前述の結合タンパク質もしくは小分子である。
【０１３６】
「サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと、対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを比較するための手段」によって、本発明者らは、本発明の第一の態様中の前述の対照サンプルを含める。本発明者らは、前述の対照の参照データも含める。
【０１３７】
本発明のキットは、
（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルを分析するための関連バッファーおよび試薬も含むことができる。
【０１３８】
キットと共に与えられるバッファーおよび試薬は液体形であってよく、およびいくつかの実施形態では、予め測定したアリコートとして与えることができる。あるいは、バッファーおよび試薬は、希釈用に濃縮（またはさらに粉末形）であってよい。
【０１３９】
（任意の添付の特許請求の範囲、要約および図面を含めた）本明細書に記載する全ての特徴、および／またはこのように開示する任意の方法またはプロセスの全てのステップは、このような特徴および／またはステップの少なくともいくつかが互いに矛盾する組合せ以外、任意の組合せで前述の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【０１４０】
ここで本発明を、以下の実施例および図面を参照しながらさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）を有する患者の肝臓におけるｍｉＲ−１２２発現の図である。（Ａ）ｍｉＲ−１２２レベルが、完全初期ウイルス学的著効（ｃＥＶＲ）を有する患者中より、ペグＩＦＮα療法に対する一次非応答者（ＰＮＲ）において有意に低い図である。４２人のＣＨＣ患者および肝臓疾患がない６人の対照患者の肝臓中のｍｉＲ−１２２の量はＲＴ−ｑＰＣＲにより測定し、「コピー数／１０ｐｇの全ＲＮＡ」として示す。１６人のＰＮＲ患者と２６人のｃＥＶＲ患者の間の差は、両側マンホイットニーｔ検定により測定して統計学的に有意である（ｐ＜０．０００１）。ｃＥＶＲ患者と対照の間に有意な差は存在しない。 （Ｂ）ＲＮａｓｅ保護アッセイが、ＰＮＲ患者とｃＥＶＲ患者の間のｍｉＲ−１２２レベルの差を確認する図である。４人の対照患者および８人のＣＨＣ患者（４ＰＮＲおよび４ｃＥＶＲ；患者番号、図の上部に示す）由来のＲＮＡを、ｍｉＲ−１２２（上図）およびｌｅｔ−７ｂ（中央図）に特異的なプローブを用いて分析した。下図中の棒線は、それぞれの患者に関して定量的ホスファーイメージング（ＰｈｏｓｐｏｒＩｍａｇｉｎｇ）によって測定した、ｍｉＲ−１２２のＲＮＡとｌｅｔ−７ｂのＲＮＡの間の相対比（上図および下図中に示した実験と同様の２つの実験からの平均）を表す。ＰＮＲ患者は、ｃＥＶＲおよび対照患者より３〜４倍低いｍｉＲ−１２２レベルを示す。 （Ｃ）血清中のＨＣＶのＲＮＡレベルは、肝内ｍｉＲ−１２２発現と相関関係がない図である。血清中ウイルス負荷（１ｍｌ当たりの国際単位）は対数目盛でプロットする（ｙ軸）。相関関係は有意ではなく（ｐ＝０．３５）、相関係数ｒ＝０．１５である。 （Ｄ）肝内ＨＣＶのＲＮＡレベルは、ｍｉＲ−１２２発現と相関関係がない図である。肝内ＨＣＶのＲＮＡ（全肝臓ＲＮＡ１μｇ当たりのコピー数）は対数目盛でプロットする（ｙ軸）。相関関係は有意ではない（ｐ＝０．０６、相関係数ｒ＝−０．２９）。 （Ｅ）ペグＩＦＮαの投与は、ヒト肝臓中のｍｉＲ−１２２レベルに対して有意な影響がない図である。ＣＨＣを有する６ｃＥＶＲ患者および５ＰＮＲ患者由来の対のヒト肝生検中のＭｉＲ−１２２レベル（コピー数／１０ｐｇの全ＲＮＡ）は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。第一の肝生検は治療開始前に実施した（−ペグＩＦＮα）。第二の生検（＋ペグＩＦＮα）は第一のペグＩＦＮα注射後４時間で実施した。ダイアグラムは、それぞれの患者の（線によって結んだ）対の肝臓サンプル中のｍｉＲ−１２２のレベルを示す。
【図２】慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）を有する患者の肝臓におけるｍｉＲ−２９６−５ｐ発現の図である。ｍｉＲ−２９６−５ｐレベルは、完全初期ウイルス学的著効（ｃＥＶＲ）を有する患者中より、ペグＩＦＮα療法に対する一次非応答者（ＰＮＲ）において有意に高い。４２人のＣＨＣ患者および肝臓疾患がない６人の対照患者の肝臓中のｍｉＲ−２９６−５ｐの量はＲＴ−ｑＰＣＲにより測定し、「コピー／１０ｐｇの全ＲＮＡ」として示す。１６人のＰＮＲ患者と２６人のｃＥＶＲ患者の間の差は、両側マンホイットニーｔ検定により測定して統計学的に有意である（ｐ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１４２】
患者のサンプルおよびＣ型肝炎治療
２００６年１０月から２００８年３月まで、バーゼル大学病院の外来患者肝臓クリニック参照のＣＨＣを有する患者に、研究目的で彼らの診断用肝生検の一部を使用する許可を求めた。ペグ化ＩＦＮα２ｂ（ペグＩＦＮα；Ｐｅｇｌｎｔｒｏｎ、Ｅｓｓｅｘ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、スイス）およびリバビリン（Ｒｅｂｅｔｏｌ、Ｅｓｓｅｘ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、スイス；体重に基づいた投与：６５ｋｇ未満、８００ｍｇ／ｄ；６５〜８５ｋｇ、１ｇ／ｄ；８５ｋｇ超、１．２ｇ／ｄ）で治療した４２人の患者は、繰り返しのＲＮＡ抽出に利用可能な十分な肝生検材料を有していた。彼らは全員白色人種であった。この４２人の患者の１１人は、ペグ化ＩＦＮαの最初の注射後４時間で２回目の肝生検を受けることも承諾した。プロトコルはバーゼル大学病院の倫理委員会によって承認され、文書化されたインフォームドコンセントを全患者から得た。血清中のＨＣＶ ＲＮＡは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｙｓｔｅｍｓからのＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＨＣＶ−Ｔｅｓｔを使用して、治療開始前ならびに治療第４週および第１２週に定量化した。Ｍｅｔａｖｉｒの分類体系によるＨＣＶ肝生検の組織学的グレーディングおよびステージングは、バーゼル大学病院の病理学研究所で実施された。非ＣＨＣ健常対照の組織は局所性病変の超音波ガイド下肝生検を受けた６人の患者から得て、局所性病変外の正常肝臓組織由来の生検に関するインフォームドコンセントを得た。これらの患者は正常肝臓値を有しており、肝臓病変の不在は全対照サンプルに関して組織学的に確認した。
【０１４３】
肝臓組織およびＨｕｈ７細胞における定量化用のｍｉＲＮＡの選択
ｍｉＲ−１２２以外に、Ｈｕｈ−７細胞ならびにヒトおよびマウス肝臓サンプルにおけるＩＦＮの影響の定量化および分析用に選択したｍｉＲＮＡは、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＩＭら、Ｎａｔｕｒｅ２００７；４４９：９１９〜９２２）によっていずれもＩＮＦ誘導性として報告された、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３５１、およびｍｉＲ−４４８であった。ｍｉＲ−１を除いたこれらのそれぞれのトランスフェクションは、Ｈｕｈ７細胞中のＨＣＶレプリコンＲＮＡの量を低下させることも報告された（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＩＭら、Ｎａｔｕｒｅ２００７；４４９：９１９〜９２２）。ＨＣＶレプリコンＲＮＡの収率の低下をもたらすとして報告された別のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−４３１であるが、しかしながら、本発明者らはこのｍｉＲＮＡを分析しなかった。その定量化のためのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのアッセイが利用可能ではなく、かつ今日までこのｍｉＲＮＡは、肝臓または肝癌細胞中で発現されるとして同定されていないからである。同様に、ｍｉＲ−３０を分析しなかった。それは多数の形（ｍｉＲ−３０ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）で存在するが、分析する形がＰｅｄｅｒｓｅｎらによって特定されなかったからである。さらに、このｍｉＲＮＡの過剰発現はＨＣＶ ＲＮＡの収率に対して全く影響がなかった（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＩＭら、Ｎａｔｕｒｅ２００７；４４９：９１９〜９２２）。Ｐｅｄｅｒｓｅｎらによって分析された具体的なｍｉＲ−１９６およびｍｉＲ−２９６の形は示されていないが、本発明者らは定量化用に、ｍｉＲ−１９６ｂ（ヒト肝癌細胞中で同定した２つのｍｉＲ−１９６特異的クローンはｍｉＲ−１９６ａではなくｍｉＲ−１９６ｂを表す）、およびｍｉＲ−２９６−５ｐ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎらによっても利用されたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイは、ｍｉＲ−２９６−３ｐに関してではなくｍｉＲ−２９６−５ｐに関して利用可能である）を選択した。ｍｉＲ−１９６ｂ以外、他の分析したｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３５１、およびｍｉＲ−４４８）を表すクローンは、ヒト肝臓または肝癌細胞から単離しなかった（参照３）。
【０１４４】
Ｌｅｔ−７ｂおよびｍｉＲ−１５ａを、そのレベルがＣＨＣ中でまたはＩＦＮ治療によって影響を受けると予想されなかった、対照ｍｉＲＮＡとして選択した。
【０１４５】
ＲＮＡの抽出、逆転写、および低分子ＲＮＡのリアルタイムｑＰＣＲ定量化
Ｈｕｈ７およびＨｕｈ７．５細胞由来の全および低分子ＲＮＡ分画を、それぞれトリゾールおよびｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して、かつ製造者のプロトコルに従い抽出した。ヒトまたはマウス肝臓由来の全ＲＮＡは、トリゾール試薬中に１０〜３０ｍｇの凍結組織を均質化することによって単離した。ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して定量化した。
【０１４６】
ヒトおよびマウス材料中でのｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３５１、およびｍｉＲ−４４８発現の分析用に（マウスおよびヒト中でのこれらのｍｉＲＮＡの配列は同一である）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した。７．５μｌの最終体積中、１×ＲＴバッファー、５ｎｇのＲＮＡ、５０ｎＭのｍｉＲＮＡ特異的ＲＴプライマー、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２５Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．３３Ｕ／μｌのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ ＲＴを含有した逆転写酵素（ＲＴ）反応混合物を、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃に保った。鋳型対照を含まない全てのＲＴ反応は三連で実施した。リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出システムを使用して実施した。１０μｌのＰＣＲは、０．６７μｌのＲＴ産物、１×Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスター混合物、および１μｌのプライマー、ならびにＴａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイのプローブ混合物を含んでいた。反応混合物は、９６ウエルの光学プレートにおいて９５℃で５分間インキュベートし、次に９５℃で１５秒および６０℃で６０秒の４０サイクルでインキュベートした。Ｃｔ値はデフォルト閾値設定を使用して決定した。閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光が一定の閾値を超える分別サイクル数として定義する。
【０１４７】
標準化およびｍｉＲＮＡのコピー数の推定。
それぞれのサンプルに関して決定したＣｔ値を、三連反応から計算したＵ６ＲＮＡに関して得た平均Ｃｔに標準化した。ｍｉＲＮＡのコピー数を決定するために、ポリアクリルアミド−ゲル−電気泳動（ＰＡＧＥ）−ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３５１、およびｍｉＲ−４４８ｍｉＲＮＡに対応する精製オリゴヌクレオチド（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、スイス）を使用して、標準曲線を作製した。１．３ａＭ（反応当たり７コピーに相当）から１３ｐＭ（反応当たり７×１０７コピー）までの範囲の合成ＲＮＡインプットおよび反応混合物を、前に記載したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７０００を使用して、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイによって二連で分析した。単離合成ｍｉＲＮＡを用いて実施した標準化をさらに検証するために、ＨｅＬａ細胞またはマウス網膜のいずれかに由来する５ｎｇの全ＲＮＡを含有する反応混合物に高濃度（１．３ａＭ〜１３ｐＭ）の合成ｍｉＲ−１２２を加え、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイによって分析した。合成ｍｉＲ−１２２ＲＮＡの添加がない対照反応により測定したところ、ＭｉＲ−１２２はＨｅＬａおよびマウス網膜細胞中で発現されない。「担体」ＲＮＡの有無の下で得た標準曲線間で、差は観察しなかった（データ示さず）。
【０１４８】
異なる反応から得たＣｔ値を、適切な標準曲線を使用して、肝臓組織由来の１０ｐｇの全ＲＮＡ当たりまたは１つのＨｕｈ７細胞当たりの特異的ｍｉＲＮＡの絶対コピー数に変換した。適応があれば、ｍｉＲＮＡの回収を肝細胞特異的アルブミンｍＲＮＡのレベルにさらに標準化した。ヒトアルブミンＲＴ−ｑＰＣＲに使用したプライマーはＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴ（配列番号１）およびＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＣ（配列番号２）であった。ＳＹＢＲ−ＰＣＲ反応はＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。
【０１４９】
Ｈｕｈ７細胞当たりの個々のｍｉＲＮＡのコピー数を決定するために、細胞当たりの全ＲＮＡの回収を３つの異なる手順によって計算した。最初の２つの手順に関して、製造者（Ｓｃｈａｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ、ドイツ）のプロトコルに従いＣＡＳＹ１細胞計数器を使用して細胞を計数し、知られている数の細胞由来のＲＮＡは、トリゾールまたはｍｉｒＶａｎａキットのいずれかを使用して抽出した。第三の手順では、細胞は顕微鏡下で計数し、ＲＮＡはトリゾールによって抽出した。３つの全ての手順は、ＲＮＡ抽出用の異なる数の細胞を使用して三連で実施した。サンプルに３２Ｐ標識ＲＮＡを加えてＲＮＡの回収を測定した。３つの手順は以下の量の細胞当たりの全ＲＮＡ：１３．８＋／−３．５ｐｇ、１４．５２＋／−２．６５ｐｇ、および１３，９８＋／−２．３７ｐｇをもたらした。１４．１ｐｇ／細胞の平均値をさらなる計算に使用した。この値は、肝細胞または肝癌細胞中のｍｉＲ−１２２含有量の計算用にＣｈａｎｇらにより以前に使用された、細胞当たり２５ｐｇのＲＮＡより低い。しかしながらそれは、異なる発生段階のマウスＴリンパ球（０．６７〜６．８２ｐｇ／細胞）またはマウスＥＳ細胞（２０ｐｇ／細胞）に関して計算した値の範囲内にある。
【０１５０】
細胞当たりの低分子ＲＮＡ（２００ｎｔ未満）の含有量を決定するために、異なる手順によって得た全Ｈｕｈ７細胞ＲＮＡに、ｍｉｒＶａｎａ（商標）キットによる分別を施す。１つのＨｕｈ７細胞は、１．１２５ｐｇの低分子ＲＮＡ（細胞当たり１．０５〜１．２ｐｇの範囲の測定値の平均）を含有すると計算した。Ｂｒｏｗｎらにより測定した値と類似したこの値を使用して、細胞当たりのｍｉＲＮＡコピー数に対する、低分子ＲＮＡ１０ｐｇ当たりのｍｉＲＮＡのコピー数（Ｂｒｏｗｎらにおいて測定したように、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイをさらに使用した）を再度計算した。本発明者らは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイによって測定した細胞当たりのｍｉＲＮＡコピー数の値は、ＲＮａｓｅ保護アッセイによって測定した値より低い傾向があることを記す（本発明者らの非公開の結果）。これは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）システムが、同一の有効性で特異的ｍｉＲＮＡの個々の３’末端配列変異体を検出しない事実による（非公開の結果）。
【０１５１】
ＲＮａｓｅ保護アッセイによるｍｉＲＮＡの検出
ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）を、製造者の説明書に従いｍｉｒＶａｎａｍｉＲＮＡプローブ構築および検出キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して実施した。ＲＰＡプローブの調製に使用したプライマーは、ｌｅｔ−７ｂ、ＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３）およびｍｉＲ−１２２、ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４）であった。簡単に言うと、ＲＰＡ反応混合物は、５ｆｍｏｌ（１００，０００ｃｐｍ）の内部標識およびＰＡＧＥ精製ＲＰＡプローブおよび１μｇの全肝臓ＲＮＡを含有していた。ハイブリダイゼーションは４２℃で一晩実施し、ＲＮａｓｅＡ／Ｔ１の消化は３７℃において２０分であった。保護断片は変性条件下で１２％ＰＡＧＥによって分析し、次にＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量化した。
【０１５２】
ＩＳＧｍＲＮＡレベルの測定
ヒトまたはマウス肝臓組織から抽出した全ＲＮＡを、ＩＦＮ作用の指標としての「古典的な」ＩＳＧｍＲＮＡ（ＰＫＲ、ＯＡＳ１、ＳＴＡＴ１およびＳＯＣＳ１）の定量化に使用した。ランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｌｉｓｅｌｌｅｎ、スイス）によってＲＮＡを逆転写した。反応混合物は、７０℃で５分間、次いで３７℃で１時間インキュベートし、９５℃で５分間加熱することによって停止した。ＳＹＢＲ−ＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびゲノムＤＮＡの増幅を避けるためのエクソン−イントロン接合部に広がるプライマーを使用して実施した。以下のプライマーをマウス（ｍ）遺伝子：リボソームタンパク質Ｌ−１９（ｍＲＰＬ−１９）に使用した。ＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴ（配列番号５）およびＴＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴ（配列番号６）；ｍＰＫＲ、ＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＧ（配列番号７）およびＡＣＡＡＧＧＣＣＴＡＴＧＴＡＧＴＴＡＣＣＡＡＣＧＡ（配列番号８）；ｍＯＡＳ１、ＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＡ（配列番号９）およびＣＣＣＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＴ（配列番号１０）；ｍＳＴＡＴ１、ＣＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴＴＴＧＣ（配列番号１１）およびＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡ（配列番号１２）。ヒト（ｈ）遺伝子のプライマーは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼであった（ｈＧＡＰＤＨ）；ＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＣＡ（配列番号１３）およびＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡ（配列番号１４）、ｈＰＫＲ、ＴＧＡＴＴＡＴＣＴＧＣＧＴＧＣＡＴＴＴＴＧＧ（配列番号１５）およびＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＴＴＴ（配列番号１６）；ｈＯＡＳ１、ＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＴＧ（配列番号１７）およびＴＣＧＧＴＧＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＴＧＡ（配列番号１８）；ｈＳＯＣＳ１、ＣＣＣＣＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＴＧＧＴＡＧＣＡ（配列番号１９）およびＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＣＡＴＴＧＴＣ（配列番号２０）；ｈＳＴＡＴ１、ＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＧ（配列番号２１）およびＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣＡ（配列番号２２）；ｈＩＰ１０、ＣＧＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴＡＴ（配列番号２３）およびＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＴＣＴ（配列番号２４）；ｈＵＳＰ１８、ＣＴＣＡＧＴＣＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴ（配列番号２５）およびＡＴＣＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣＡ（配列番号２６）；ｈＩＦｌ２７、ＣＣＴＣＧＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＴＧ（配列番号２７）およびＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＴ（配列番号２８）。サイクル閾値（ΔＣｔ）値の差は、対象とする転写産物に関するＣｔ値から、内部対照として働いたｈＧＡＰＤＨまたはｍＲＰＬ−１９に関するＣｔ値を差し引くことによって導いた。全ての反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出システムを使用して二連で実施した。ｍＲＮＡの発現レベルは、式２―ΔＣｔを使用して、ΔＣｔ値からのｈＧＡＰＤＨまたはｍＲＰＬ−１９に対して計算した。対の肝生検サンプル中の発現の変化は、式２”（ΔＣｔＢ−１−ΔＣｔＢ−２）に従い倍数変化として計算した。
【０１５３】
肝内ＨＣＶ ＲＮＡの定量化
４２人のＣＨＣおよび６人の対照患者の生検から単離した１μｇの全ＲＮＡを、全てのＨＣＶ亜型のｉｎ ｖｉｔｒｏ定量化用に設計された病原体特異的ＲＴプライマー混合物（ＨＣＶ用定量化キット、ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）を使用して、製造者の説明書に従い逆転写した。ＨＣＶ ＲＮＡは、病原体特異的プライマー／プローブ混合物（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ）およびＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡにより製造された）を使用して、製造者の説明書に従い定量化した。蛍光はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７０００配列検出システムのＦＡＭチャンネルによって検出し、１μｇの全ＲＮＡ当たりのＨＣＶ ＲＮＡのコピー数は、病原体陽性対照鋳型（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ）を使用して得た標準曲線に従い計算した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス療法を改善するための治療、および抗ウイルス療法が有効であり得るかどうかを決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染は健康に対する深刻な脅威となり、動物および人間の病的状態の主な原因であることが知られている。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は世界中で慢性肝疾患の主な原因である。Ｃ型肝炎の重要および顕著な特徴は、慢性化へのその傾向である。７０％を超える感染個体において、ＨＣＶは、肝硬変および肝細胞癌をもたらす可能性がある、数十年にわたる持続的感染を確定する。
【０００３】
ＨＣＶ生物学における興味深い仮説は、ウイルスＮＳ３−４Ａプロテアーゼはウイルスタンパク質を処理するだけでなく、ウイルス感染を検出しＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の転写活性化を誘導する細胞内感覚経路の構成要素を切断および不活性化もすることを提案する。ＮＳ３−４Ａの標的の１つは、ＴＲＩＦ（ＩＦＮβを誘導するＴＩＲドメイン含有アダプター）、ＴＬＲ３（トール様受容体３）によるエンドソーム中のｄｓＤＮＡ検出とＩＦＮβ誘導の間の本質的関連である。さらに近年、レチノイン酸誘導性遺伝子−Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）およびＭＤＡ５（ｈｅｌｉｃａｒｄ）がｄｓＲＮＡの細胞内センサーとして同定された。両方のセンサーはＣａｒｄｉｆ（ＩＰＳ−１、ＭＡＶＳ、ＶＩＳＡとしても知られる）を介してシグナル伝達してＩＦＮβ産生を誘導する。ＣａｒｄｉｆはＨＣＶＮＳ３−４Ａによって切断および不活性化することができる。ｄｓＲＮＡの細胞内センサーとして同定された２つのＲＮＡヘリカーゼ、ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５はＣａｒｄｉｆを介して作用し、ＩＦＮβ産生を誘導する。
【０００４】
Ｉ型ＩＦＮは、先天性免疫系の重要な構成要素であるだけでなく、ＣＨＣに対する現在の療法の最も重要な構成要素でもある。現在の標準的な療法は、週に１回皮下注射されるペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）および経口抗ウイルス薬リバビリンの毎日摂取からなる。このレジメンは、約５５％の患者において全体的な持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）、および遺伝子型間の有意な差を得る。ＳＶＲは、治療中の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの消失、および療法停止後少なくとも６カ月間のその継続的不在として定義される。ＳＶＲを得る患者の長期フォローアップのいくつかの試験は、この著効は９５％を超える患者において永続的であることを実証する。ＳＶＲの確率は治療に対する初期応答に強く依存する。治療第１２週後の少なくとも２ｌｏｇ１０のウイルス負荷の低下として定義される初期ウイルス学的著効（ＥＶＲ）を示さない患者は、ＳＶＲを示さない可能性が高く、これらの患者において治療を停止することができる。他方で、ＥＶＲを有する患者には治癒される十分な機会があり、その６５％はＳＶＲを得る。治療第４週後の検出不能な血清中のＨＣＶ ＲＮＡとして定義される迅速なウイルス学的著効（ＲＶＲ）を有する患者に関して、予後はさらに良い。８５％を超える患者がＳＶＲを得る。残念ながら、ＲＶＲを示すのは、遺伝子型１を有する患者の２０％未満、および遺伝子型２または３を有する患者の約６０％である。療法に対する初期応答に重要である宿主因子は現在知られていない。
【０００５】
Ｉ型ＩＦＮは、数百の遺伝子（ＩＳＧ、インターフェロン刺激遺伝子）の制御によって、それらの強い抗ウイルス効果を発揮する。ＩＳＧの転写活性化は、静止細胞中では通常合成されず細胞内で非ウイルス特異的抗ウイルス状態を確立するタンパク質を誘導する。インターフェロンは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化することによって、それらの合成を誘導し、これは、多くのサイトカインおよび増殖因子によって使用される細胞シグナル伝達の典型である。全てのＩ型ＩＦＮは同じ細胞表面受容体（ＩＦＮＡＲ）と結合し、受容体関連ＪａｎｕｓキナーゼファミリーのメンバーＪａｋ１およびＴｙｋ２を活性化する。次いでキナーゼは、シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）およびＳＴＡＴ２をリン酸化および活性化する。活性化したＳＴＡＴは核へ移行し、そこでそれらは、ＩＳＧのプロモーター中の特異的ＤＮＡエレメントと結合する。多くのＩＳＧは抗ウイルス活性を有するが、他のＩＳＧは脂質代謝、アポトーシス、タンパク質分解および炎症細胞応答に関与する。多くのウイルスの場合と同様に、ＨＣＶはおそらく複数レベルでＩＦＮ系に干渉する。ＩＦＮ誘導型Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達は、ＨＣＶタンパク質を発現する細胞およびトランスジェニックマウス中、およびＣＨＣを有する患者の肝生検中で阻害される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＡおよびＥ２は、重要な非特異的抗ウイルスタンパク質であるタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）と結合しそれを不活性化させる。しかしながら、ＣＨＣを有する患者において治療に適用するＩＦＮに対する応答に重要である分子機構は現在知られていない（Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚら、２００８、ＰＮＡＳ、１０５（１９）：７０３４〜７０３９）。
【０００６】
多くの異なるレベルでＩＦＮ経路に干渉するＨＣＶの能力は、慢性感染を確定するＨＣＶの成功が根底にある機構である可能性がある（Ｇａｌｅ、Ｍ．、Ｊｒ．＆ Ｆｏｙ、Ｅ．Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ４３６、９３９〜９４５（２００５）。しかしながら、非常に逆説的に、ＨＣＶに急性または慢性的に感染したチンパンジーでは、数百のＩＳＧが肝臓中で誘導される（７Ｂｉｇｇｅｒ、Ｃ．Ｂら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ７８、１３７７９〜１３７９２（２００４））。しかるに、内因性ＩＦＮ系の活性化にもかかわらず、ウイルスは慢性的に感染した動物から除去されない。チンパンジーで得た結果をヒトに当てはめるのは難しい。これらの種間ではＨＣＶ感染のいくつかの重要な病理生物学上の差が存在するからである。ＨＣＶに急性感染した大部分のチンパンジーはウイルスを自然に除去する一方で、人間における感染は大抵慢性化状態になる。他方で、慢性的に感染したチンパンジーをＩＦＮで治療することができるのは稀であり、一方で半数を超えるＣＨＣを有する患者が首尾よく治療される。
【０００７】
ＩＳＧの誘導はＣＨＣを有する多くの患者の前治療肝生検においても見られ、ＨＣＶ感染は内因性ＩＦＮ系の活性化をもたらす可能性があることが再度実証された（Ｃｈｅｎ、Ｌら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２８、１４３７〜１４４４（２００５））。特に、ＩＳＧの発現が予め高い患者は、低い初期発現を有する患者と比較したとき、療法にあまり応答しない傾向があった（Ｃｈｅｎ、Ｌら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２８、１４３７〜１４４４（２００５））。療法に対するこの示差的応答の原因は理解されていない。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、その中で本発明者らが、ペグＩＦＮαを用いた療法前および最中に慢性肝炎を有する患者の肝生検および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の対サンプル中の、ＩＦＮ誘導型シグナル伝達およびＩＳＧ誘導を調べた試験に基づく。本発明者らは、生化学的および分子学的データと治療に対する応答をさらに関連付けた。本発明者らの作業は、添付の実施例中により詳細に述べる。
【０００９】
以前の試験において、本発明者らは、肝臓のウイルス感染がある何人かの対象は、ＩＦＮシグナル伝達経路が活性化ＩＳＧによる刺激状態であるように、「事前活性化」の状態であることを確定した（Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚら、２００８、ＰＮＡＳ、１０５（１９）：７０３４〜７０３９）。本発明者らは、このような個体は、ＩＦＮおよび抗ウイルス薬で後に治療すると、抗ウイルス治療に対してほとんど、全く応答がなかったことを発見している。対照的に、別群の感染対象にはＩＦＮ受容体の事前刺激（およびＩＳＧの刺激）がなかったようであり、この群は抗ウイルス療法に十分応答した（すなわち、それらは迅速なウイルス学的著効（ＲＶＲ）を有していた）。さらに、その一部はＩＳＧ遺伝子であるいくつかの特異的遺伝子の発現レベルに従い、対象が治療に対して低応答者でありＲＶＲを有するかどうか決定することが可能である。言い換えると、本発明者らは、対象が抗ウイルス治療に応答するかどうかをその発現レベルが予想する予後判定遺伝子マーカーである１セットの遺伝子を同定した。
【００１０】
ペグＩＦＮαを用いた療法前および最中に慢性肝炎を有する患者の肝生検および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の対サンプルを使用するさらなる試験において、本発明者らは患者のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を調べた。
【００１１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、その最終産物が約２２ｎｔの機能的ＲＮＡ分子である非コードＲＮＡ遺伝子の１クラスである。それらは一本鎖ＲＮＡとして内因的にコードされた不完全なヘアピン前駆体からプロセシングされる。それらは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との塩基対形成を介した翻訳抑制によって働くようである（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．３４、Ｄ１４０〜Ｄ１４４）。
【００１２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生合成は、複雑な、多ステップのプロセスである。一次ｍｉＲＮＡ転写産物はＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され、かつ数百〜数千ヌクレオチド長（プリｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ‐ｍＲＮＡ））の大きさの範囲であってよい。ＭｉＲＮＡは２つのゲノム源に端を発する可能性がある。一部のｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子のイントロン領域内に位置する。他のｍｉＲＮＡは、非コードＲＮＡのイントロンまたはエクソン内に位置する。興味深いことに、プリｍｉＲＮＡは１つのｍｉＲＮＡをコードすることができるが、数個のｍｉＲＮＡの群も含有することができる。プリｍｉＲＮＡは、核リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）エンドヌクレアーゼ、Ｄｒｏｓｈａによって後に約７０ｎｔのヘアピン（プレ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ‐ｍＲＮＡ））にプロセシングされる。次いでプレ−ｍｉＲＮＡは、エクスポリン５／ＲａｎＧＴＰによって核から細胞質に輸送される。細胞質中では、第二のＲＮａｓｅＩＩＩ、ＤｉｃｅｒがそのｄｓＲＢＤタンパク質パートナーと一緒に、ヘアピンのステム領域中のプレ−ｍｉＲＮＡを切断し、それによって約２１ヌクレオチドのＲＮＡ−二本鎖を遊離させる。ｍｉＲＮＡ二本鎖から、一本の鎖が標的遺伝子の発現を抑制するタンパク質複合体、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に入り、一方他の鎖は分解される。鎖の選択は、ｍｉＲＮＡ二本鎖の局所熱力学的安定性に頼るものである。その５’末端が低い安定性で対形成する鎖がＲＩＳＣ複合体に充填される。ＲＩＳＣ複合体に充填されるｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との塩基対形成を介した翻訳抑制によって働くようである（Ｄｕ、Ｔ．ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ、Ｐ．Ｄら、ｍｉｃｒｏ−Ｐｒｉｍｅｒ：ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００５）１３２、４６４５〜４６５２）。現在４６２のヒトｍｉＲＮＡ配列がｍｉＲＢａｓｅに寄託されており（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）、この一覧は８００台に達することが示唆される。これまでに同定された多数のｍｉＲＮＡは、それらが生物学的プロセスの制御および微調整において複雑な役割を果たす可能性があることを示唆する。実際、いくつかのｍｉＲＮＡが、細胞増殖の調節（ｍｉｒ−１２５ｂおよびｌｅｔ−７）、造血Ｂ細胞系の運命（ｍｉｒ−１８１）、Ｂ細胞生存（ｍｉｒ−１５ａおよびｍｉｒ−１６−１）、脳のパターン形成（ｍｉｒ−４３０）、膵臓細胞のインシュリン分泌（ｍｉｒ−３５７）、脂肪細胞の発生（ｍｉｒ−３７５）ならびに筋肉の増殖および分化（ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１３３）に関与している。多くのｍｉＲＮＡは癌と関係があるゲノム領域中に位置する。例えば、ｍｉｒ−１６−１およびｍｉｒ−１５を含有する群は、大部分のＢ細胞慢性リンパ性白血病において欠失および下方制御される（Ｂ−ＣＬＬ；Ｃａｌｉｎ、Ｇ．Ａら、ＭｉｃｒｏＲＮＡ−ｃａｎｃｅｒ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｔａｌｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００６）６６、７３９０〜７３９４）。
【００１３】
ｍｉＲＮＡは遺伝子制御と関係があるようである。ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７を含めたいくつかのｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの部分的に相補的である３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と結合することによって、タンパク質合成を阻害する。植物中で見られるＳｃａｒｅｃｒｏｗのｍｉＲＮＡを含めた他のｍｉＲＮＡはｓｉＲＮＡと同様に働き、完全に相補的なｍＲＮＡ配列と結合して標的転写産物を破壊する（Ｇｒｉｓｈｏｋら、２００１）。
【００１４】
科学者達が、これらの分子が真核生物遺伝子の発現の制御において果たす広範囲の役割を理解し始めているので、マイクロＲＮＡに関する研究は増えている。２つの最も理解されているｍｉＲＮＡ、ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７は、重要なｍＲＮＡのファミリーの翻訳を制御することによってＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける発生時期を制御する（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ、２００２中に総説）。数百のｍｉＲＮＡがＣ．ｅｌｅｇａｎｓ、ショウジョウバエ、マウス、およびヒトにおいて同定されている。遺伝子発現を制御する分子に関して予想されるように、ｍｉＲＮＡレベルは組織相互および発生段階相互で異なることが示されており、さらに、１つの試験は、２つのｍｉＲＮＡの低い発現と慢性リンパ球性白血病の間の強い相関関係を示し、ｍｉＲＮＡと癌の間に存在し得る関連性を示す（Ｃａｌｉｎ、２００２）。この分野は歴史が浅いが、ｍｉＲＮＡは高等真核生物中の遺伝子発現を制御する際に、転写因子と同程度重要である可能性があると推測される。
【００１５】
細胞分化、初期発生、およびアポトーシスのような細胞プロセスおよび脂肪代謝において重要な役割を果たすｍｉＲＮＡの数例が存在し、ｌｉｎ−４とｌｅｔ−７の両方がＣ．ｅｌｅｇａｎｓの発生中１つの幼虫段階から他の段階への移行を制御する（Ａｍｂｒｏｓ、２００３）。ｍｉｒ−１４およびｂａｎｔａｍは、明らかなところ、アポトーシスと関係がある遺伝子の発現を制御することによって細胞死を制御するショウジョウバエのｍｉＲＮＡである（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、２００３、Ｘｕら、２００３）。Ｍｉｒ−１４は脂肪代謝にも関与している（Ｘｕら、２００３）。Ｌｓｙ−６およびｍｉＲ−２７３は、化学感覚ニューロンの非対称性を制御するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｍｉＲＮＡである（Ｃｈａｎｇら、２００４）。細胞分化を制御する別の動物ｍｉＲＮＡは、造血細胞の分化を支援するｍｉＲ−１８１である（Ｃｈｅｎら、２００４）。これらの分子は、知られている機能を有する全範囲の動物ｍｉＲＮＡを表す。ｍｉＲＮＡの機能の高い理解は、正常発生、分化、細胞間および細胞内伝達、細胞周期、血管新生、アポトーシス、および多くの他の細胞プロセスに貢献する制御ネットワークを間違いなく明らかにするはずである。多くの生物学的機能におけるそれらの重要な役割を考慮すると、ｍｉＲＮＡは治療介入または診断分析に関して重要な観点を提供する可能性がある。
【００１６】
多量に存在する肝臓特異的ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２が、ＨＣＶレプリコンを安定して発現する培養ヒト肝癌Ｈｕｈ７細胞中のＨＣＶ ＲＮＡの有効な複製に重要である（Ｊｏｐｌｉｎｇ ＣＬ、Ｙｉ Ｍ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ＡＭ、Ｌｅｍｏｎ ＳＭ、Ｓａｒｎｏｗ Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００５；３０９：１５７７〜１５８１）。この観察によって、ＨＣＶ感染における、および考えられる治療標的としてのｍｉＲ−１２２の役割に対して一層関心が高まった。本明細書で説明するように、現在のＣＨＣの療法はリバビリンと組み合わせてもよいペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）からなるが、この治療は約５５％の患者のみで持続的ウイルス学的著効を得る（Ｍａｎｎｓ ＭＰら、Ｌａｎｃｅｔ２００１；３５８：９５８〜９６５；Ｆｒｉｅｄ ＭＷら、Ｎ ＥｎｇＩ Ｊ Ｍｅｄ２００２；３４７：９７５〜９８２）。ｍｉＲ−１２２およびいくつか他のｍｉＲＮＡのレベルはＨｕｈ７肝癌細胞および初代マウス肝細胞中ではＩＦＮによって制御されること、およびｍｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＣＶ ＲＮＡ複製に対するＩＦＮの少なくともある程度の影響を仲介する可能性があることが近年報告された（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＩＭら、Ｎａｔｕｒｅ２００７；４４９：９１９〜９２２）。今日までに実施された全ての実験は、培養細胞中でのＨＣＶ複製におけるｍｉＲ−１２２の役割を評価した。慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）を有する患者中でのｍｉＲ−１２２の状態を決定するために、本発明者らは、ペグＩＦＮαおよびリバビリンによる治療を施した４２人のＣＨＣ患者から回収した肝生検におけるｍｉＲ−１２２と他のｍｉＲＮＡのレベルを比較した。標準として化学的に合成したｍｉＲＮＡを使用して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定を実施した。本発明者らは、一次非応答者（ＰＮＲ）として分類した、第１２週で２ｌｏｇ１０を超えるウイルス負荷の低下があり療法に応答しなかった患者は、第１２週でＩＦＮαに対する強い応答性および検出不能なＨＣＶ ＲＮＡを有する患者より、有意に低いレベルのｍｉＲ−１２２を有していたことを発見した（完全初期ウイルス学的著効；ｃＥＶＲ）。ＰＮＲ患者とｃＥＶＲ患者の間の差は肝線維症の段階と無関係であり、ＰＮＲ患者中のｍｉＲ−１２２の低下は、生検材料中の肝細胞の低い割合によるものではないことを示した。さらに、群間のｍｉＲ−１２２発現の差はｍｉＲ−１２２レベルを肝細胞特異的アルブミンｍＲＮＡに標準化したとき一層明らかであり、ｍｉＲ−１２２レベルと治療に対する応答の間の直接的な相関関係をさらに支持した。
【００１７】
臨床試験は、高いＨＣＶウイルス負荷を有する患者は療法にそれほど応答しないことを示している（Ｍａｎｎｓ ＭＰら、Ｌａｎｃｅｔ２００１；３５８：９５８〜９６５；Ｆｒｉｅｄ ＭＷら、Ｎ ＥｎｇＩ Ｊ Ｍｅｄ２００２；３４７：９７５〜９８２）。ｍｉＲ−１２２はＨｕｈ７肝癌細胞中でのＨＣＶの複製に重要であるので、本発明者らによる非応答者中の少ないｍｉＲ−１２２の発見は驚くべきであった。本発明者らは、患者の肝臓および血清中のＨＣＶ ＲＮＡを測定した。ｍｉＲ−１２２のレベルとＨＣＶウイルス負荷の間の相関関係は観察しなかった。これらの結果はｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた結果とは反対で、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＶの複製におけるｍｉＲ−１２２の有意な役割を支持しない（例えば、ＨＣＶの治療に関するｍｉＲ−１２２の阻害を提案するＷＯ−Ａ−２００７／１１２７５４を参照）。非応答者における低いｍｉＲ−１２２のレベルは、ｍｉＲ−１２２が負の制御を受けるＩＦＮ標的遺伝子である可能性を提起する。実際、ＣＨＣ患者の生検におけるｍｉＲ−１２２の発現は、知られているＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現と負の相関関係を示す。
【００１８】
要約すると、本発明の驚くべき結果は、（ｉ）ＩＦＮ療法に応答しない患者は一般に応答者より数倍低いレベルのｍｉＲ−１２２を有すること、（ｉｉ）ペグＩＦＮαの投与は患者の肝臓中のｍｉＲ−１２２レベルに対して有意な影響がないこと、および（ｉｉｉ）肝内ｍｉＲ−１２２とＨＣＶ ＲＮＡレベルの間に相関関係が存在しないことを実証する。これは予想外である。Ｈｕｈ７細胞におけるＨＣＶレプリコンの試験に基づくと、低レベルのｍｉＲ−１２２はウイルス量を低下させ療法に利点を与えるに違いないからである。それにもかかわらず、ｍｉＲ−１２２のレベルがｃＥＶＲ患者よりＰＮＲ中で有意に低いという発見によって、ｍｉＲ−１２２は、例えば予め活性化したＩＳＧと一緒に（Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ Ｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ２００８、１０５（１９）：７０３４〜７０３９；Ｃｈｅｎ Ｌら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２００５；１２８：１４３７〜１４４４；Ａｓｓｅｌａｈ Ｔら、Ｇｕｔ２００８；５７：５１６〜５２４）、ＣＨＣ患者におけるＩＦＮ療法の結果を予想するのに適した便利なマーカーとなる。さらに、本発明の結果は驚くことに、（ｉ）ＩＦＮ療法に応答しない患者は一般に応答者より数倍高いレベルのｍｉＲ−２９６−５ｐを有することも実証する。これは、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、およびより一般的にｍｉＲＮＡを、ＣＨＣ患者におけるＩＦＮ療法の結果を予想するために使用することができることを実証する。
【００１９】
これによって本発明者らは、ｍｉＲＮＡに基づく方法を開発して、肝臓のウイルス感染に罹患した対象に関する治療レジメンを臨床医が決定するのを、助けることができる可能性があることを理解する。感染個体由来のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルは、対照（すなわち、ウイルス感染がない対象）からの遺伝子発現と比較することができる。
【００２０】
（対照と比較して）低レベルのｍｉＲ−１２２および／または高レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐを有する感染対象は、治療レジメン中のＩＦＮの使用から恩恵を被る可能性はないが（すなわち、これらの個体がＲＶＲを有するとは予想されない）、一方でそのｍｉＲ−１２２および／またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルが、対照の発現と比較して大部分は不変であるかまたは高い感染対象は、ＩＦＮ療法から恩恵を被る可能性がありＲＶＲを有する。当技術分野で知られているｉｎ ｖｉｔｒｏの結果は反対のことを予想したので、本発明者らはこれらの相関関係を得て驚いた。
【００２１】
肝臓のウイルス感染がある「応答者」および「非応答者」対象における遺伝子発現レベルの以前の試験が存在しており、例えば、本発明の一部としてその研究を実施した、Ｃｈｅｎら（２００５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１２８、１４３７〜１４４４は、非常に広範囲の遺伝子セットを試験して、どれが予後診断マーカーとして働き得るか決定した。さらに本発明者らは、異なるｍｉＲＮＡを予後診断マーカーとして使用することができるかどうかも評価した。さらに本発明者らは、抗ウイルス治療の前後に得たサンプル中の遺伝子発現およびｍｉＲＮＡレベルも分析し、この情報を使用して予後診断遺伝子マーカーを同定したが、一方で以前の試験は、治療結果と治療前に得たサンプル中に存在した遺伝子の発現レベルの関連付けのみを試みた。したがって、以下に述べる予後診断遺伝子マーカーの同定をもたらしたデータセットは、以前の試験中のそれより一層完全で確かであると考えられる。
【００２２】
したがって、本発明の第一の態様において、肝臓のウイルス感染がある対象が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に応答する可能性を決定するための方法であって、ｍｉＲＮＡの発現のレベルに関して対象由来のサンプルを分析すること、および対象由来のサンプル中の前記ｍｉＲＮＡの発現のレベルと対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを比較することを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ１２２であり、対照サンプル中のｍｉＲ−１２２のレベルと比較した対象由来のサンプル中の低レベルのｍｉＲ−１２２は、対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答しないことを示す。
【００２４】
前に記載した実施形態と組み合わせることができる、本発明のいくつかの他の実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２９６−５ｐであり、対照サンプル中のｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと比較した対象由来のサンプル中の高レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐは、対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答しないことを示す。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態では、対照サンプル中のそれぞれｍｉＲ−１２２、またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと比較した、対象由来のサンプル中の不変もしくは高レベルのｍｉＲ−１２２および／または不変もしくは低レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐは、それぞれ対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答することを示すことができる。
【００２６】
本発明の方法は１つのｍｉＲＮＡの使用のみに限られず、任意のｍｉＲＮＡの発現レベルとｍｉＲ−１２２および／またはｍｉＲ−２９６−５ｐのそれの任意の組合せ、または任意の関連ｍｉＲＮＡ、特に肝臓のウイルス感染がある対象が抗ウイルス療法に応答する可能性に関する予測力を有する任意のｍｉＲＮＡの組合せも、包含することを理解するべきである。
【００２７】
本発明の方法中、抗ウイルス療法は、リバビリンと場合によっては組み合わせたペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）であってよい。
【００２８】
さらに、本発明のいくつかの実施形態では、ウイルス感染は、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス感染である。
【００２９】
さらに、本発明の方法中で、肝臓組織をサンプルとして使用することができる。
【００３０】
有利なことに、療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る遺伝子、例えば以前の試験（Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚら、２００８、ＰＮＡＳ、１０５（１９）：７０３４〜７０３９）に対して何人かの本発明者らによって公開されたいくつかの遺伝子の発現を、本発明の方法中で分析して、予測力を増大することもできる。前記遺伝子の発現は、サンプル中のｍＲＮＡ遺伝子転写産物の量、または前記ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの量を測定することによって、または例えば特異的結合分子を使用して、サンプル中の前記遺伝子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの量を測定することによって決定することができる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態では、対象は哺乳動物、例えば人間である。
【００３２】
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットであって、前記キットが、対象由来のサンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルを分析するための手段、および場合によっては、対象由来のサンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルと、対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを比較するための手段を含むキットも包含する。キットは、療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る少なくとも１つの遺伝子の発現を分析するための手段であって、療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る前記少なくとも１つの遺伝子を代表する分子をターゲティングすることができる１つまたは複数の特異的結合分子を最終的に含み、前記特異的結合分子がオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、またはアプタマーである手段、および場合によっては、サンプル中の遺伝子の発現と対照サンプル中の同じ遺伝子の発現を比較するための手段をさらに含むことができる。
【００３３】
本発明の方法は、臨床医に非常に有益であろうことは理解されよう。ＩＦＮはタンパク質増殖因子であり、ＩＦＮを含有する医薬調製物は製造するのに費用がかかる。したがって、適切かつコスト効率の良い方法でＩＦＮが使用されることが確実であることが、臨床医にとって非常に重要である。さらに、コストと無関係に、可能な限り早く肝臓のウイルス感染を除去することが望ましいことが多い。したがって、臨床医がＩＦＮを投与し、およびその後それに有益な効果がないことを発見する場合、それは時間の浪費である（それは別の療法を利用して費やされる可能性はある）。したがって、本発明の方法は臨床医にとって大きな力添えとなる。臨床医は、２つの対象の集団を同定することができるからである。１つの集団は対照と比較して低レベルのｍｉＲ−１２２および／または高レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐを示し、したがっておそらくＩＦＮを用いた治療から恩恵を被らない。対照と比較して正常または高レベルのｍｉＲ−１２２および／または正常または低い発現レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐを有する、もう１つの集団は、ＩＦＮを用いた治療から恩恵を被り得る。
【００３４】
さらに別の実施形態では、本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に対する、肝臓のウイルス感染がある対象の応答に影響を与える方法を提供し、この方法はｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを調節することを含む。
【００３５】
ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルは、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって制御することができる。このような方法の例は、例えばＷＯ−Ａ−２００６／１３７９４１、ＷＯ−Ａ−２００７／０２１８９６またはＷＯ−Ａ−２００７／０９００７３中で見ることができる。
【００３６】
「抗ウイルス療法」によって、本発明者らは、ＩＦＮ活性の刺激を含むウイルス感染を減らすための任意の治療レジメンを意味する。このようなレジメンは、Ｉ型ＩＦＮ活性を刺激するおよび／またはＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）を誘導する化合物の使用を含むことができる。この療法はＩＦＮ自体または他のＩＦＮ受容体アゴニストを用いた治療を含むことができる。例えば、この療法はペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）を利用することができる。
【００３７】
療法はＩＦＮ活性のみの刺激を含むことができる。しかしながら本発明者らは、本発明による方法は、知られている抗ウイルス薬と併せたＩＦＮ活性の刺激剤を含む併用療法の使用を含む抗ウイルス療法の、有効性を予想するのに特に有用であることを発見している。多くの抗ウイルス薬が当業者に知られており、本発明の方法を使用して、いくつかの異なる併用療法の有効性を評価することができる。しかしながら本発明者らは、本発明の方法は、抗ウイルス薬リバビリンと併せて使用するＩＦＮ活性の刺激剤を用いた療法の、有効性を予想するのに特に有益であることを発見している。
【００３８】
一実施形態では、本発明の方法を使用して、抗ウイルス療法剤としてのペグＩＦＮαおよびリバビリンの有用性を予想する。
【００３９】
本発明の方法を利用して、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス感染を含めた、いくつかの異なる肝臓のウイルス感染のための治療の有効性を評価することができる。一実施形態では、本発明の方法を利用して、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染のための療法の有効性を評価する。本発明者らは、本発明の方法は、迅速なウイルス学的著効（ＲＶＲ）を有すると予想される対象とそうではない対象（非ＲＶＲ）を区別するのに特に有用であることを発見している。
【００４０】
本発明に従い使用することができる対象中のｍｉＲ−１２２のレベルを表すサンプルは、前記対象中のｍｉＲ−１２２のレベルに関する情報を与えることができる任意のサンプルを包含する。
【００４１】
適切なサンプルの例には、生検、外科手術中に切除したサンプル、血液サンプル、尿サンプル、痰サンプル、脳脊髄液サンプル、およびスワブサンプル（唾液スワブサンプルなど）がある。サンプル源は、どのタイプのウイルス感染を対象が有するかに依存し得ることは理解されるであろう。
【００４２】
一実施形態では、サンプルは肝臓組織に由来する。肝臓サンプルは、ＨＣＶ感染がある対象の評価に方法を適用するとき、特に有益であることが分かっている。本発明者らは、ｍｉＲ−１２２のレベルを分析することによって、ＲＶＲを非ＲＶＲ対象と区別することができたことを発見して驚いた。
【００４３】
適切なサンプルは、組織学的または凍結切片などの組織切片を含むことができる。切片が由来する対象中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現のレベルを表す情報を与えることができるような形式で、このような切片を調製することができる方法は当業者によく知られており、遺伝子発現の調査時に使用することを目的とする技法を参照して選択されなければならない。
【００４４】
対象由来の組織の一部分を含むサンプルの使用は企図されるが、一般に、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを表すサンプルはこのような組織から得た適切な抽出物を含み、前記抽出物を調べて対象中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの前記レベルに関する情報を与えることができることは好ましい可能性がある。対象中の遺伝子発現に関する情報を与えることができる組織抽出物の生成用に、使用することができる適切なプロトコルは、当業者によく知られている。好ましいプロトコルは、遺伝子発現を調査する方法を参照して選択することができる。
【００４５】
肝臓に由来するサンプルの場合、適切な調製ステップは実施例中に開示する。
【００４６】
「対照サンプル」によって、本発明者らは、肝臓のウイルス感染に罹患していない個体に由来している対象由来のそれと、同等のサンプルを意味する。対照サンプルを構成する同等の組織または臓器サンプル、またはこのようなサンプル由来の抽出物は、対照サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルに関する情報源として直接使用することはできるが、「理想的な」対照サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルに関する情報は参照データの形で与えられ、かつそれが一般に好ましいことは理解されるであろう。このような参照データは、選択した対照組織中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを示す表の形で与えることができる。あるいは参照データは、選択した対照組織中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを示す読み出し可能な情報を含有するコンピュータソフトウェアの形で供給することができる。例えば参照データは、対照組織サンプル中でこのｍｉＲＮＡの発現がある対象中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルを少なくとも比較することができるアルゴリズムの形で与えることができる。
【００４７】
対照サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを、対照サンプルを構成する組織または臓器サンプルの処理によって調べる場合、対象由来のサンプルを処理するために使用した同じ方法を使用してこのような処理を行うことが有益である。対象サンプルと対照サンプルのこのような並行処理は、これらの組織中の遺伝子発現の比較を互いに対して標準化する高い信頼度を与える（組織を処理し遺伝子発現を調べた選択方法と関係がある任意の人工物は、対象サンプルと対照サンプルの両方に適用されるからである）。
【００４８】
本発明による方法は、少なくともｍｉＲ−１２２のレベルの分析を含むことができる。ｍｉＲ−１２２のレベルの変化を、抗ウイルス療法の有効性を決定する際に使用することができるという発見は驚くべきである。従来技術中で公開された結果を鑑みると、低レベルのｍｉＲ−１２２が、後のＩＦＮ治療に対する乏しい応答と関連し得ることは全く予想外であった。
【００４９】
以前の試験中で、本発明者らは、その発現レベルが抗ウイルス療法の結果に関する予後診断マーカーであり得る、異なる遺伝子を同定している。ｍｉＲ−１２２に関する本発明を前記遺伝子と組み合わせて、さらに一層確かな予想を与えることができる。
【００５０】
調べることができるｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの存在、不在および／またはレベルは、一般に適切なプローブ分子を使用して検出される。このような検出は、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの存在、不在および／またはレベルに関する情報を提供し、それによって対象中に存在するｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと、対照サンプル中に存在するレベルの間の比較を可能にする。プローブは一般に、直接的または間接的に、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐと特異的に結合することができる。このようなプローブの結合を次いで評価し、ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと関連付けて、対象と対照の間の有効な予後比較を可能にすることができる。
【００５１】
「変化した発現」によって、本発明者らは、前に論じたように、対照と比較したとき、遺伝子発現がサンプル中でいずれも上昇または低下している場合を含める。
【００５２】
逆に「不変の発現」によって、本発明者らは、前に論じたように、対照と比較したとき、遺伝子発現がサンプル中で上昇も低下もしていない場合を含める。
【００５３】
ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベル、および遺伝子発現が変化した状態または不変であるかどうかの評価は、通常の統計解析法を使用して行うことができる。
【００５４】
標的分子はペプチドまたはポリペプチドであってよい。ペプチドまたはポリペプチドの量は、特異的結合分子、例えば抗体を使用して決定することができる。好ましい場合、サンプル中に存在する特定の標的タンパク質の量は、サンプル中の標的タンパク質の生物活性を参照して評価することができる。この形式での発現の評価および比較は、タンパク質標的が酵素活性を有する場合非常に適切である。サンプル中に存在するタンパク質標的の量の測定に適した技法には、アプタマーおよび抗体系技法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびウエスタンブロッティングなどがあるが、これらだけには限られない。
【００５５】
本発明の目的での「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指すことは理解されるであろう。さらに、文脈が他に必要としない限り、これらの用語は、天然に存在するヌクレオチドと類似した形式で働くことができる、天然ヌクレオチドの知られているアナログを包含すると考えるべきである。
【００５６】
さらに、本発明に従い使用するのに適した標的核酸は、「完全長」核酸（例えば、完全長遺伝子転写産物）を含む必要はないが、プローブ分子の特異的結合を可能にするのに十分な長さを時折含む必要があることは理解されるであろう。
【００５７】
本発明の方法の一実施形態では、適切なサンプルから得た細胞を溶解し（これはＱｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．により製造されたバッファーなどの市販の溶解バッファーを使用して実施することができる）、次に（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．により製造されたＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉスピンカラムなど）市販の核酸分離カラムを使用して溶解物を遠心分離にかけるプロセスによって、サンプルを処理してＲＮＡ標的分子を単離することができる。ＲＮＡ抽出のための他の方法は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１６２、１５６．「Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」のフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法の変形を含む。この方法で得たＲＮＡはそれ自体が適切な標的分子になる可能性があり、またはｍｉＲ−１２２のレベルを表す標的分子を生成するための鋳型として働くことができる。
【００５８】
選択した遺伝子の発現を評価して一層確かな予想値を得る場合、対象または対照サンプル由来のＲＮＡを、例えばＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用して、ｃＤＮＡ合成の基質として使用することができることが好ましい可能性がある。生成したｃＤＮＡは次いでＢｉｏＡｒｒａｙ ＲＮＡ転写産物標識キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用してビオチニル化ｃＲＮＡに転換することができ、このｃＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ）を使用して反応混合物から精製することができる。遺伝子発現を表すｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの抽出または精製を必要とせずに、対象または対照サンプル由来の組織において直接測定することができる。例えば、対象とする対象または対照サンプル中に存在しその遺伝子発現を表すｍＲＮＡは、このような組織の適切に固定された切片または生検を使用して調べることができる。この種のサンプルの使用は、発現の比較を行うことができる迅速性、ならびにサンプルを生成するために使用することができる比較的安価で簡潔な組織処理の点で利点をもたらすことができる。ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション技法は、この種の組織サンプル中での遺伝子発現を調査および比較することができる好ましい方法となる。対象とする組織を処理するための技法であって、対象または対照サンプル中の遺伝子発現を表すＲＮＡの有用性を維持する技法は、当業者によく知られている。しかしながら、対象または対照サンプル中の遺伝子発現を表すｍＲＮＡを抽出および回収することができる技法も当業者によく知られており、本発明者らは、このような技法は本発明に従い有利に利用することができることを発見している。対象または対照サンプルから抽出したｍＲＮＡを含むサンプルは、本発明の第三の態様の方法中で使用するのに好ましい可能性がある。このような抽出物には、元の組織を含むサンプルの場合より簡単に調べられる傾向があるからである。例えば、遺伝子発現の比較を可能にするのに適した標的分子は、対象由来の組織のサンプル、または対照組織のサンプルから単離した全ＲＮＡを含むことができる。さらに、抽出したＲＮＡは容易に増幅して、対象または対照サンプル中の遺伝子発現に関する多大な情報を与えることができる拡大ｍＲＮＡサンプルを生成することができる。ｍＲＮＡ集団の抽出および増幅に適した技法の例はよく知られており、以下でより詳細に考える。
【００５９】
例えば、本発明による使用に適した核酸標的を生成するための核酸の単離および精製法は、Ｃｈａｐｔｅｒ３ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ、ＰａｒｔＩ．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）中に詳細に記載される。
【００６０】
遺伝子発現の調査および比較前に核酸標的を増幅することが望ましい場合、サンプルが由来する対象または対照組織中の増幅核酸の相対頻度を、維持または調節する方法を使用することが好ましい可能性がある。
【００６１】
「定量的」増幅の適切な方法は当業者によく知られている。１つのよく知られている例、定量的ＰＣＲは、その量が対照と対象サンプルの間で不変であることが知られている対照配列をいっせいに同時に増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を測定するために使用することができる内標準を与える。
【００６２】
前述の方法以外に、当業者は、遺伝子転写産物特異的生成物の増幅とシグナル生成を結び付けた任意の技法も、定量化に適している可能性があることを理解しているであろう。好ましい例は、ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの初期逆転写を組み込むことによりそれを特異的ｍＲＮＡ転写産物の正確な定量化に適したものにしている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＵＳ４６８３１９５および４６８３２０２）の好都合な改良点を利用する。さらなる重要な改良点が、反応進行時にリアルタイムで蓄積するＰＣＲ産物の測定を可能にする。
【００６３】
多くの場合、関連サンプル中の標的分子の存在を示すことができるプローブ分子を使用して、対象または対照サンプル中の遺伝子発現の程度を評価することは好ましい可能性がある。
【００６４】
調査する遺伝子発現の（直接または間接）産物を参照して、プローブを選択することができる。適切なプローブの例には、適切な特異性を有するオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、アプタマー、および結合タンパク質または小分子がある。
【００６５】
オリゴヌクレオチドプローブはプローブとして使用することができる。適切なオリゴヌクレオチドプローブの作製は当業者によく知られている（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｅｔ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（ｅｄ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４））。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、多くの会社から市販されている。
【００６６】
本記載の目的で、オリゴヌクレオチドプローブは、１つまたは複数の型の化学結合を介して相補的配列の核酸標的分子と特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチドを含むと考えることができる。このような結合は通常は相補的塩基対形成によって、および通常は水素結合形成によって生じる可能性がある。適切なオリゴヌクレオチドプローブは、天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含むことができる。さらに、この変異がオリゴヌクレオチドプローブとその標的のハイブリダイゼーションに干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合を使用して（１つまたは複数の）オリゴヌクレオチドプローブ中の塩基を接合することができる。したがって、適切なオリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって構成塩基が接合するペプチド核酸であってよい。
【００６７】
本明細書で説明するように、マイクロＲＮＡ分子（「ｍｉＲＮＡ」）は一般に２１〜２２ヌクレオチド長であるが、１７および最大２５ヌクレオチド長が報告されている。ｍｉＲＮＡはそれぞれ長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされる。前駆体ｍｉＲＮＡは非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体ｍｉＲＮＡは、動物中でダイサーと呼ばれる酵素によって切断されるステム−ループまたは折返し様構造を、それらが形成するのを可能にする２つの相補領域を有する。ダイサーはリボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼである。プロセシングされるｍｉＲＮＡは典型的にはステムの一部分である。
【００６８】
プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）は大きな複合体の一部となり、特定の標的遺伝子を下方制御する。動物のｍｉＲＮＡの例には、標的と不完全に塩基対を形成し、それによって翻訳を停止させる（Ｏｌｓｅｎら、１９９９；Ｓｅｇｇｅｒｓｏｎら、２００２）ｍｉＲＮＡがある。ＳｉＲＮＡ分子もダイサーによってプロセシングされるが、ただし長鎖の、二本鎖ＲＮＡ分子からである。ＳｉＲＮＡは動物細胞において本来見られないが、それらはこのような細胞においてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）で働いて、ｍＲＮＡ標的の配列特異的切断を誘導することができる（Ｄｅｎｌｉら、２００３）。
【００６９】
内因性ｍｉＲＮＡ分子の試験は例えば米国特許出願６０／５７５，７４３中に記載されている。合成ｍｉＲＮＡｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡの翻訳を制御するタンパク質複合体によって、成熟、一本鎖ＲＮＡが結合するとき、細胞中で外見上活性がある。内因的に発現されるｍｉＲＮＡと同じ形式で細胞に影響を与える外因性ＲＮＡ分子の導入は、内因性成熟ｍｉＲＮＡと同じ配列の一本鎖ＲＮＡ分子が、翻訳制御を容易にするタンパク質複合体によって取り込まれることを必要とする。様々なＲＮＡ分子の設計が評価されている。ｍｉＲＮＡ経路による望ましい一本鎖ｍｉＲＮＡの取り込みを最大にする、３つの一般的な設計が同定されている。この３つの設計の少なくとも１つを有しｍｉＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子を、合成ｍｉＲＮＡと呼ぶ。
【００７０】
本発明の合成ｍｉＲＮＡは、いくつかの実施形態で、１つのＲＮＡが天然に存在する、成熟ｍｉＲＮＡと同一である２つのＲＮＡ分子を含む。成熟ｍｉＲＮＡと同一であるＲＮＡ分子は活性鎖と呼ぶ。相補鎖と呼ぶ第二のＲＮＡ分子は、活性鎖と少なくとも部分的に相補的である。活性鎖と相補鎖はハイブリダイズして、細胞中でのｍｉＲＮＡ活性化の直前にタンパク質複合体によって結合した、天然に存在するｍｉＲＮＡ前駆体と類似した合成ｍｉＲＮＡと呼ばれる、二本鎖ＲＮＡを生成する。合成ｍｉＲＮＡの最大活性は、翻訳レベルでの遺伝子発現を制御するｍｉＲＮＡタンパク質複合体による、活性鎖の最大の取り込みおよび相補鎖の最大の取り込みを必要とする。最適ｍｉＲＮＡ活性をもたらす分子設計は、相補鎖に対する修飾を含む。
【００７１】
２つの設計は相補鎖中の化学修飾を組み込む。第一の修飾は、その５’末端にリン酸またはヒドロキシル以外の化学基を有する相補的ＲＮＡの作製を含む。５’の修飾の存在によって相補鎖の取り込みが外見上なくなり、ｍｉＲＮＡタンパク質複合体による活性鎖の取り込みを後に助長する。５’の修飾は、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、ビオチン、およびその他を含めた様々な分子のいずれかであってよい。
【００７２】
ｍｉＲＮＡ経路によって相補鎖の取り込みを有意に低下させる第二の化学修飾戦略は、相補鎖の最初の２〜６ヌクレオチド中に糖修飾を有するヌクレオチドを組み込むことである。第二の設計戦略と一致した糖修飾を第一の設計戦略と一致した５’末端修飾と関連付けて、合成ｍｉＲＮＡ活性をさらに高めることができることを記さなければならない。
【００７３】
第三の合成ｍｉＲＮＡ設計は、活性鎖と相補的ではない相補鎖の３’末端にヌクレオチドを組み込むことを含む。
【００７４】
生成した活性ＲＮＡと相補的ＲＮＡのハイブリッドは活性鎖の３’末端で非常に安定しているが、活性鎖の５’末端では比較的不安定である。ｓｉＲＮＡを用いた試験は、５’ハイブリッドの安定性は、細胞中のｍｉＲＮＡ経路と少なくとも関連があるＲＮＡ干渉を促進する、タンパク質複合体によるＲＮＡ取り込みの重要な指標であることを示す。相補的ＲＮＡ鎖中のミスマッチの賢明な使用は、合成ｍｉＲＮＡの活性を有意に高める。
【００７５】
本明細書で説明する用語「ｍｉＲＮＡ」は一本鎖分子を一般に指すが、特定の実施形態では、本発明の条件を満たす分子は、部分的（鎖の長さ中１０〜５０％相補的）、実質的（鎖の長さ中５０％を超えてただし１００％未満で相補的）、または同じ一本鎖分子の別の領域もしくは別の核酸と完全に相補的である領域または別の鎖も包含する。したがって核酸は、１つまたは複数の相補的または（１つまたは複数の）自己相補的鎖または分子を含む特定配列の「（１つまたは複数の）補体」を含む分子を包含することができる。例えば前駆体ｍｉＲＮＡは、最大１００％相補的である自己相補的領域を有することができる。
【００７６】
合成ｍｉＲＮＡは典型的に、二本の鎖、試験中の成熟ｍｉＲＮＡと配列が同一である活性鎖、および活性鎖と少なくとも部分的に相補的である相補鎖を含む。活性鎖は生物学的関係がある分子であり、細胞中でｍＲＮＡ分解または翻訳制御のいずれかによって翻訳を調節する複合体によって優先的に取り込まれるはずである。活性鎖の優先的取り込みには２つの核心を突く結果がある。（１）観察する合成ｍｉＲＮＡの活性は劇的に増大する、および（２）相補鎖の取り込みおよび活性化によって誘導される意図しない効果がほぼ消失する。本発明によれば、いくつかの合成ｍｉＲＮＡ設計を使用して、活性鎖の優先的取り込みを確実にすることができる。
【００７７】
相補鎖の５’末端におけるリン酸またはヒドロキシル以外の安定部分の導入は、ｍｉＲＮＡ経路中のその活性を害する。これは、合成ｍｉＲＮＡの活性鎖のみが、細胞中の翻訳を制御するために使用されることを確かにする。５’修飾には、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、２Ｏ−Ｍｅ、ＤＭＴＯ、フルオロセイン、チオール、またはアクリジン、またはこの型の官能性を有する任意の他の基があるが、これらだけには限られない。
【００７８】
他のセンス鎖修飾。２’−０Ｍｅ、ＮＨ２、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、ＤＭＴＯ、フルオロセイン、チオール、またはアクリジン、または合成ｍｉＲＮＡの相補鎖中にこの型の官能性を有する、任意の他の基のようなヌクレオチド修飾の導入は、相補鎖の活性を除去し、ｍｉＲＮＡの活性鎖の取り込みを高めることができる。
【００７９】
ｓｉＲＮＡと同様に（Ｓｃｈｗａｒｚ、２００３）、合成ｍｉＲＮＡの活性鎖の５’末端と３’末端の相対的安定性は、ｍｉＲＮＡ経路による活性鎖の取り込みおよび活性化を外見上決定する。合成ｍｉＲＮＡの相補鎖の３’末端中の塩基ミスマッチの戦略的配置による、合成ｍｉＲＮＡの活性鎖の５’末端の不安定化は、活性鎖の活性を高め、相補鎖の活性をほぼ除去する。
【００８０】
ｍｉＲＮＡ−１２２２とも呼ばれるｍｉＲ−１２２、２２ヌクレオチドのマイクロＲＮＡは、遺伝子ｈｃｒから転写される肝臓特異的非コードポリアデニル化ＲＮＡに由来する。ｈｃｒのｍＲＮＡ内のｍｉＲ−１２２の正確な配列、および隣接する二次構造は、哺乳動物種から魚類に遡り保存されている。マウス肝臓中のｍｉＲ−１２２のレベルは胚発生の第１７日ごろに半最大値まで増大し、出生前に平均細胞当たり５０，０００コピーのほぼ最大レベルに達する（それは全ｍｉＲＮＡの７０％を構成する）（Ｃｈａｎｇら、２００４；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２）。それは、組織の分化状態の維持を担う可能性がある遺伝子発現のパターンを確定するのに重要であると考えられる、多くの組織特異的マイクロＲＮＡの１つである（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２；Ｌｉｍら、２００５）。
【００８１】
本明細書で使用する語句「〜と特異的にハイブリダイズする」は、複合体混合物（全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡなど）中にその配列が存在するときストリンジェントな条件下で、特定の標的ヌクレオチド配列と優先的にオリゴヌクレオチドプローブが結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。一実施形態では、プローブは特定の標的分子のみと結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることができる。
【００８２】
用語「ストリンジェントな条件」は、その下でプローブがその標的部分列と、ただし他の配列とは最小限でハイブリダイズする条件を指す。いくつかの実施形態では、プローブはストリンジェントな条件下でその標的以外の配列とハイブリダイズすることができない。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況で異なり得る。長い配列は高温で特異的にハイブリダイズする。
【００８３】
一般に、定義したイオン強度およびｐＨでの特定配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低い、ストリンジェントな条件を選択することができる。Ｔｍは、標的核酸と相補的なオリゴヌクレオチドプローブの５０％が平衡状態で標的核酸とハイブリダイズする、（定義したイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下での）温度である。標的核酸は一般に過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、平衡状態では５０％のプローブが占有される。例えばストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で少なくとも約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関する温度が少なくとも約３０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によって得ることもできる。
【００８４】
オリゴヌクレオチドプローブを使用して、適切な代表サンプル中の相補的核酸配列（すなわち、核酸標的）を検出することができる。このような相補的結合は、オリゴヌクレオチドを使用して検出し、それによって特定遺伝子の発現を比較することができる大部分の技法の基礎を形成する。いくつかの適切な技術は多数の遺伝子発現の平行定量化を可能にし、定量的逆転写ＰＣＲ技術などの種の増幅と定量化をリアルタイムで結び付けた技術、およびアレイ技術などの増幅種の定量化を増幅後に行う技術を含む。
【００８５】
アレイ技術は、それぞれのプローブが開示する１つまたは複数の遺伝子、またはｍｉＲＮＡと優先的にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いる、対象または対照サンプルを表すサンプルのハイブリダイゼーションを含む。アレイ技術は、例えばそれらの物理的位置（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．によって市販された二次元アレイ中の格子）によって、または別の特徴（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＩｎｃまたはＬｕｍｉｎｅｘ Ｉｎｃによって市販された標識ビーズ）との関連によって、特異的オリゴヌクレオチド配列の独自の同定をもたらす。オリゴヌクレオチドアレイは、（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃによって市販された光誘導型合成により）ｉｎ ｓｉｔｕで合成する、または（ＡｇｉｌｅｎｔまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって市販された）接触もしくはインクジェット技術によって事前形成およびスポットすることができる。完全または部分的ｃＤＮＡ配列は、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって市販された）アレイ技術用のプローブとして働くこともできることは、当業者には明らかであろう。
【００８６】
オリゴヌクレオチドプローブを、サザンブロッティングまたはノーザンブロッティングなどのブロッティング技法中で使用して、（例えば、遺伝子発現を表すｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ標的分子によって）遺伝子発現を検出および比較することができる。サザンまたはノーザンブロッティング技法中で使用するのに適した技法および試薬は、当業者にはよく知られているであろう。簡単に言うと、ＤＮＡ（サザンブロッティングの場合）またはＲＮＡ（ノーザンブロッティングの場合）標的分子を含むサンプルを、アクリルアミドまたはアガロースなどのゲル材料を貫通するそれらの能力に従って分離する。ゲルの貫通は毛細管現象によって、または電場の活性によって誘導することができる。標的分子の分離を実施した後、これらの分子を、（例えばベーキングによってまたは紫外線照射によって）膜に固定する前に、薄膜（典型的にはナイロンまたはニトロセルロース）に移す。したがって遺伝子発現は、膜に結合した標的分子とオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって、検出および比較することができる。
【００８７】
特定の状況では、遺伝子発現を比較するための伝統的なハイブリダイゼーションプロトコルの使用が問題となる可能性がある。例えばブロッティング技法には、ほぼ同じ分子量の２つ以上の遺伝子産物またはｍｉＲＮＡを区別する、難点がある可能性がある。このような同様に大きい産物は、ゲルを使用して分離するのが難しいからである。したがって、このような状況では、以下に記載する技法などの別の技法を使用して、遺伝子発現を比較することは好ましい可能性がある。
【００８８】
対象中の遺伝子発現および／またはｍｉＲＮＡのレベルを表すサンプル中の遺伝子発現は、高密度オリゴヌクレオチドアレイ技術によって、適切な核酸サンプル内の全体の転写産物レベルを参照して評価することができる。このような技術は、オリゴヌクレオチドプローブが、例えば共有結合によって固形支持体と結合したアレイを利用する。固形支持体に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのこれらのアレイは、遺伝子発現を比較するための本発明の方法およびキット中で使用するのに好ましい要素となる。多数のこのようなプローブをこの形式で結合させて、多数の遺伝子またはｍｉＲＮＡの発現を比較するのに適したアレイを提供することが可能である。したがって、このようなオリゴヌクレオチドアレイは、２つ以上のｍｉＲＮＡおよび／または遺伝子の発現を比較することが望ましい実施形態中で、特に好ましい可能性があることは理解されよう。
【００８９】
遺伝子発現を表す核酸標的の比較において使用することができる他の適切な方法には、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）；またはローリングサークル型ＤＮＡ増幅（ＲＣＡ）があるが、これらだけには限られない。
【００９０】
それらを容易に検出することができるように、プローブを標識することは通常望ましい。本発明に従い使用するのに適したプローブまたは標的の標識において使用することができる検出可能成分の例には、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能である任意の組成物がある。適切な検出可能成分には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質および比色分析用物質がある。これらの検出可能成分は、相反することを示さない限り、本発明の方法中で使用することができる全タイプのプローブまたは標的における取り込みに適している。
【００９１】
適切な酵素の例にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがあり、適切な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがあり、適切な蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン イソシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリスリン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質などがあり、発光物質の例にはルミノールがあり、生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンがあり、適切な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、または３２Ｐがあり、適切な比色分析用物質の例にはコロイド金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズがある。
【００９２】
このような標識を検出する手段は当業者によく知られている。例えば、放射性標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、発光を検出するための光検出器を使用して検出することができる。典型的には酵素標識は、酵素および基質を与えること、および基質に対する酵素の作用によって生成した反応産物を検出することによって検出され、比色標識は着色標識を単に視覚化することによって検出される。
【００９３】
本発明の一実施形態では、蛍光標識プローブまたは標的をスキャンすることができ、蛍光はレーザー共焦点スキャナーを使用して検出することができる。
【００９４】
標識核酸プローブまたは標的の場合、適切な標識はハイブリダイゼーションの前、最中、または後に実施することができる。一実施形態では、核酸プローブまたは標的はハイブリダイゼーションの前に標識する。蛍光標識も適切であり、および使用時に、それらの核酸標的と核酸プローブのハイブリダイゼーションの定量化は、ハイブリダイズした蛍光標識核酸からの蛍光の定量化による。定量化は、核酸に取り込まれるハプテンと結合する蛍光標識試薬からであってよい。
【００９５】
本発明の一実施形態では、ハイブリダイゼーションの分析は、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）などの適切な分析用ソフトウェアを使用して実施することができる。
【００９６】
有効な定量化は、アレイ自動走査を可能にする自動ステージを備えることができ、かつ蛍光強度情報の自動測定、記録およびその後の処理用のデータ収集システムを備えることができる、蛍光顕微鏡を使用して実施することができる。このような自動化の適切な配置は従来通りであり、当業者によく知られている。
【００９７】
一実施形態では、ハイブリダイズした核酸は、核酸と結合した１つまたは複数の検出可能成分を検出することによって検出する。検出可能成分は、当業者によく知られているいくつかの手段のいずれかによって取り込ませることが可能である。しかしながら、一実施形態では、このような成分は、サンプル核酸（プローブまたは標的）の調製における増幅ステップ中に同時に取り込ませる。したがって、例えば、検出可能成分で標識したプライマーまたはヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、前記成分で標識した増幅産物を提供し得る。別の実施形態では、蛍光標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する転写増幅は、転写される核酸に標識を取り込ませる。
【００９８】
あるいは、適切な検出可能成分は、元の核酸サンプル（例えば、対象とする組織由来のｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に直接、または元の核酸の増幅が終了した後に増幅産物に加えることができる。蛍光標識などの標識と核酸を結合させる手段は当業者によく知られており、例えば核酸のキナーゼ処理、およびサンプルと接合した核酸リンカーと標識（適切なフルオロフォアなど）の後の結合（連結）による、ニックトランスレーションまたは末端標識（例えば、標識ＲＮＡを用いる）を含む。
【００９９】
本発明の方法はヒト対象に関して使用するのに最適であるが、本発明の方法は、非ヒト動物（例えば、ウマ、イヌ、ウシ、ラクダ）におけるウイルス感染の治療過程を決定する際にも有用であり得ることは理解されよう。
【０１００】
以前の試験において、本発明者らは、内因性ＩＦＮ系は多くの感染患者中で絶えず活性化されることを確定した。さらに、本発明者らは驚くことに、予め活性化されたＩＦＮ系がある患者とＩＦＮ療法に対する乏しい応答を関連付けた。この発見は直感に反する。活性化した先天性免疫系は、ＩＦＮα療法中にウイルスの除去を手助けすると予想されるからである。
【０１０１】
本発明者らは肝生検中のＩＳＧ発現を分析し、ＨＣＶが驚くことに内因性ＩＦＮ系を誘導する（阻害しない）患者が存在し、かつ（おそらくＴＲＩＦおよび／またはＣａｒｄｉｆの切断によって）ＨＣＶが内因性ＩＦＮ系を誘導しない患者が存在するが、この違いは慢性感染を維持するＨＣＶの能力に対して全く影響がないとさらに結論付けた。
【０１０２】
ＩＦＮ系の事前活性化がない患者において、本発明者らは、ペグＩＦＮα２ｂが４時間以内に肝臓中で多くのＩＳＧの確かな（準）最大上方制御を誘導したことを発見した。驚くことに、このような高いＩＳＧ発現レベルは、第４週で迅速なウイルス学的著効を後に示さなかった患者の前処理生検において既に存在した。
【０１０３】
内因性ＩＦＮ系の事前活性化が、遺伝子型２または３よりＨＣＶ遺伝子型１（および４）に感染した患者の肝生検中で一層頻繁に見られたことも発見した。遺伝子型２および３の感染は、遺伝子型１を有する患者の５０％未満と比較して、８０％を超える患者で治癒することができることはよく知られているので、これは興味深い。内因性ＩＦＮ系の事前活性化の頻度および程度はＨＣＶの遺伝子型に依存するという本発明者らの発見は、ＨＣＶの遺伝子型の異なる治療感受性に関する説明を与える。
【０１０４】
本発明者らは、これらのデータは、ＨＣＶはＩＦＮシグナル伝達に干渉し、それによって療法に対する応答を損なうことを確かにしたことに気付いた。さらに、ＨＣＶによるＩＦＮαシグナル伝達の阻害は、内因性ＩＦＮ系の強い事前活性化が、ＨＣＶの自然な除去をもたらさない理由を説明する。本発明者らは、何らかの仮説によって縛られることは望まないが、これは、ＨＣＶに感染した肝細胞中で、ＩＦＮαが抗ウイルス状態を誘導する可能性はないことを意味すると考える。多くの患者の肝臓中で観察したＩＳＧの上方制御は、したがって非感染肝細胞中のみで起こり得る。
【０１０５】
肝生検中で見られるＩＳＧの強い誘導はこのようなモデルと適合性がある。感染肝細胞より多くの非感染肝細胞が存在するからである。ＩＦＮβ産生は、Ｃａｒｄｉｆおよび／またはＴＲＩＦ切断が成功しないウイルスに感染した肝細胞中で起こり得る。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路のＨＣＶ誘導型阻害のため、分泌されるＩＦＮβは、これらの感染肝細胞中で抗ウイルス状態を誘導しないが、非感染状態の近隣細胞中でのみ誘導し得る。
【０１０６】
「を低減する」によって、本発明者らは、作用物質がＩＳＧの発現レベルが対照組織中での発現レベルと著しく異ならないように、ＩＳＧの刺激を低減するのに有効であることを意味する。
【０１０７】
Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス感染を含めたいくつかの肝臓の異なるウイルス感染の治療において、作用物質を使用することができる。一実施形態では、作用物質を使用してＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防または低減する。
【０１０８】
本発明に従い使用することができる作用物質の例には、作用物質がＩＦＮαポリペプチドと結合してＩＦＮの機能活性を妨げることができる場合、例えば、抗体および断片およびそれらの誘導体（例えば、ドメイン抗体またはＦａｂ）がある。あるいは作用物質は、ＩＦＮα受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２ａ、ｂ、またはｃ）でアンタゴニストとして作用することによって、ＩＦＮ系に対する競合阻害剤として作用することができる。あるいは作用物質は、ＩＦＮ経路中の酵素または他の分子を阻害することができる。あるいは作用物質は、そのｍＲＮＡの低減、したがってＩＦＮαポリペプチドの低減をもたらすような形式で、ＩＦＮαポリペプチドをコードするｍＲＮＡと結合することができる。あるいは作用物質は、それがＩＦＮαポリペプチドをコードする転写ｍＲＮＡの量の低減をもたらすような形式で、ＩＦＮαをコードする核酸配列と結合することができる。例えば作用物質は、ＩＦＮα遺伝子のコードまたは非コード領域、またはＩＦＮのＤＮＡの５’または３’と結合して、それによってタンパク質の発現を低減することができる。
【０１０９】
いくつかの異なるヒトインターフェロンαポリペプチド配列が存在する。コンセンサス配列が決定されている。当業者によって、この情報を使用してＩＦＮαポリペプチドに対する結合作用物質を開発することができる。
【０１１０】
作用物質がＩＦＮαポリペプチドと結合するとき、その作用物質は、その天然型に正確にフォールディングされたタンパク質によって定義されるエピトープと結合することが好ましい。種間およびさらに遺伝子型間に、ある程度の配列変動性があり得ることは理解されよう。したがって、他の好ましいエピトープは、遺伝子変異体由来の同等の領域を含み得る。さらなるＩＦＮポリペプチド由来の同等の領域は、前述の配列類似性および同一性ツール、およびデータベース検索法を使用して同定することができる。
【０１１１】
動物に抗原を注射することによって、ポリクローナル血清として抗体を産生することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、当業者に知られている技法を使用して、抗原（例えば、ＩＦＮαポリペプチドの全体または断片）を動物（例えば、ウサギ）に接種することによって産生することができる。
【０１１２】
あるいは抗体はモノクローナルであってよい。従来のハイブリドーマ技法を使用してこのような抗体を産生することができる。本発明中で使用するためのモノクローナル抗体を作製するために使用する抗原は、ポリクローナル血清を作製するために使用するのと同一であってよい。
【０１１３】
その最も簡潔な型で、抗体または免疫グロブリンタンパク質は、γ−免疫グロブリン（ＩｇＧ）クラスの抗体によって通常例示されるＹ形状分子である。この分子は、４本のポリペプチド鎖、それぞれ各々約５０ｋＤおよび２５ｋＤの２本の同一な重鎖（Ｈ）および２本の同一な軽鎖（Ｌ）からなる。それぞれの軽鎖は、ジスルフィドおよび非共有結合によって重鎖と結合する（Ｈ−Ｌ）。２本の同一なＨ−Ｌ鎖の組合せは、２本のＨ鎖間で同様の非共有結合およびジスルフィド結合により互いに結合して、基本の４本の鎖免疫グロブリン構造（Ｈ−Ｌ）２を形成する。
【０１１４】
軽鎖免疫グロブリンは１つのＶ−ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）で構成され、一方で重鎖は１つのＶ−ドメイン、およびＨ鎖のアイソタイプに応じて、３つまたは４つのＣ−ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）からなる。
【０１１５】
Ｎ末端において、それぞれの軽鎖または重鎖の領域は、配列が大きく異なり、抗原との特異的結合を担う可変（Ｖ）ドメインである。抗原に対する抗体特異性は実際、超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られるＶ領域内のアミノ酸配列によって決定される。それぞれＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域は３つのこのようなＣＤＲを有し、それは抗体の抗原結合部位を形成する全６個の組合せである。わずかな変異を示し超可変ループを支持する残りのＶ領域アミノ酸は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
【０１１６】
可変ドメイン（Ｃ−ドメイン）を超える領域は比較的配列が一定である。本発明による抗体の特徴とする特徴は、ＶＨおよびＶＬドメインであることは理解されよう。ＣＨおよびＣＬドメインの正確な性質は概して本発明には重要ではないことが、さらに理解されよう。実際、本発明中で使用するのに好ましい抗体は、非常に異なるＣＨおよびＣＬドメインを有する可能性がある。さらに、以下でより完全に論じるように、好ましい抗体機能誘導体は、Ｃドメインがない可変ドメインを含むことができる（例えば、ｓｃＦＶ抗体）。
【０１１７】
一種で作製される抗体、および特にｍＡｂは、異なる種を治療するために使用するとき、いくつかの重大な欠点を有することが知られている。例えばマウス抗体をヒト中で使用するとき、それらは短い血清中循環半減期を有する傾向があり、治療される患者の免疫系により外来タンパク質として認識される可能性がある。これは望ましくないヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の発生をもたらす可能性がある。抗体の頻繁な投与が必要とされるとき、これは特に問題がある。それはそのクリアランスを高め、その治療効果を阻害し、かつ過敏反応を誘導する可能性があるからである。これらの要因がヒト療法におけるマウスモノクローナル抗体の使用を制限し、ヒト化抗体を作製するための抗体操作技術の開発を促す。
【０１１８】
したがって、ＩＦＮ活性を低減することができる抗体を、ヒト対象中のＨＣＶ感染を治療するための治療剤として使用する場合、したがって、非ヒト起源の抗体およびその断片はヒト化することが好ましい。
【０１１９】
（例えば、非ヒトハイブリドーマにおいて作製したモノクローナル抗体由来の）Ｖ領域配列と、ヒト抗体由来のＣ領域（および理想的にはＶ領域由来のＦＲ）配列を接合することによって、ヒト化を実施することができる。生成する「操作」抗体は、それらが由来した非ヒト抗体よりヒト中で免疫原性が低く、したがって臨床用途により適している。
【０１２０】
ヒト化抗体はキメラモノクローナル抗体であってよく、その中で、組換えＤＮＡ技術を使用して、げっ歯類免疫グロブリン定常領域はヒト抗体の定常領域と置換される。次いでキメラＨ鎖およびＬ鎖遺伝子を、適切な制御エレメントを含有する発現ベクターにクローニングすることができ、哺乳動物細胞に誘導して完全グリコシル化抗体を産生することができる。この目的に適したヒトＨ鎖Ｃ領域遺伝子を選択することによって、抗体の生物活性を予め決定することができる。このようなキメラ分子を使用して、本発明に従い癌を治療または予防することができる。
【０１２１】
抗体のさらなるヒト化は、抗体のＣＤＲ移植または再形成を含むことができる。このような抗体は、（抗体の抗原結合部位を形成する）非ヒト抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲを、ヒト抗体の対応するフレームワーク領域に移植することによって産生される。
【０１２２】
ヒト化抗体断片は、本発明に従い使用するのに好ましい作用物質となる。ＩＦＮαポリペプチドまたはＩＦＮ受容体上のエピトープを認識するヒトＦＡｂは、可変鎖ヒト抗体のファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。（例えば、ＭｏｒｐｈｏｓｙｓまたはＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発された）当技術分野で知られている技法を利用して、本発明に従い作用物質として使用することができるＦａｂを作製することができる。簡単に言うと、ヒトコンビナトリアルＦａｂ抗体ライブラリーを、単鎖Ｆｖライブラリー由来の重鎖および軽鎖可変領域を、Ｆａｂディスプレイベクターに移植することによって作製することができる。このライブラリーは２．１×１０１０の異なる抗体断片を生成することができる。次いでペプチドを「おとり」として使用して、望ましい結合性を有するそのライブラリーから抗体断片を同定することができる。
【０１２３】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、本発明のこの実施形態に従い使用することができる別の好ましい作用物質となる。ｄＡｂは抗体の最小の機能的結合単位であり、ヒト抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変領域に相当する。このようなｄＡｂは、約１３ｋＤａの分子量（完全抗体の大きさの約１／１０（またはそれ未満）に相当）を有することができる。
【０１２４】
アプタマーは、本発明の第三または第四の態様の別の好ましい作用物質となる。アプタマーは、特異的、配列依存的な形状をとる核酸分子であり、アプタマーとリガンドの間の鍵と鍵穴の適合に基づいて特異的標的リガンドと結合する。典型的には、アプタマーは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡ）のいずれか、または一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ）を含むことができる。アプタマーを使用して、核酸および非核酸標的の両方と結合することができる。したがって、ＩＦＮαを認識しそれによってＩＦＮαの活性または発現を低減する、アプタマーを作製することができる。適切なアプタマーはランダムな配列プールから選択することができ、そこから高親和性で選択した標的分子と結合する特異的アプタマーを同定することができる。望ましい特異性を有するアプタマーを生成および選択するための方法は当業者によく知られており、ＳＥＬＥＸ（指数関数的増大によるリガンドの系統的進化）法を含む。簡単に言うと、オリゴヌクレオチドの巨大ライブラリーを生成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択およびポリメラーゼ連鎖反応による後の増幅の反復プロセスによる、多量の機能的核酸の単離を可能にする。
【０１２５】
アンチセンス分子は、患者の治療に使用するための別の好ましい作用物質となる。典型的にはアンチセンス分子は、遺伝子によって生成される相補的核酸配列と特異的に結合することができ、それを不活性化する、その遺伝子を効率よく「オフ」にする一本鎖核酸である。当業者によって理解されるように、それが「センス」配列と呼ばれる遺伝子のｍＲＮＡと相補的であるので、この分子は「アンチセンス」と呼ぶ。典型的にはアンチセンス分子は、１５〜３５塩基長のＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的類似体である。アンチセンス核酸を実験的に使用してｍＲＮＡと結合させ、特異的遺伝子の発現を妨げている。これは、癌、糖尿病および炎症疾患の治療用の薬剤としての「アンチセンス療法剤」の開発につながっている。アンチセンス薬剤は、ヒト治療用途に関してＵＳＦＤＡによって近年承認されている。したがって、ＩＦＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子を設計することによって、細胞中のＩＦＮαポリペプチドの発現を低減し、それによってＩＦＮα活性を低減し、ＨＣＶ感染において見られる事前活性化を低減することができる可能性がある。ＩＦＮαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は図８中に与える。
【０１２６】
短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られることもある、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、本発明の第三または第四の態様に従い使用するのに好ましい、さらなる作用物質となる。前述のように、本発明者らは、ＩＦＮ系の事前活性化は抗ウイルス療法に対する耐性と関係があることを理解した。したがって、ＩＦＮα発現を低減することができるｓｉＲＮＡ分子には、ＨＣＶ感染を治療するための医薬品の調製において多大な有用性があることは明らかである。ｓｉＲＮＡは、それによってｓｉＲＮＡが特異的遺伝子の発現の低減をもたらし、またはこのようなｍＲＮＡの翻訳に特異的に干渉し、それによってｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現を阻害することができるＲＮＡ干渉経路（ＲＮＡｉ）に関与する、２０〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子の１クラスである。ｓｉＲＮＡは十分に定義された構造、いずれかの末端に２ｎｔの３’突出部分がある短い（通常２１ｎｔ）二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を有する。それぞれの鎖は、５’リン酸基および３’ヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する。ｉｎ ｖｉｖｏでのこの構造は、ダイサー、長いｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに転換する酵素によるプロセシングの結果である。ｓｉＲＮＡを様々なトランスフェクション法により外から（人為的に）細胞に導入して、対象とする遺伝子の特異的ノックダウンをもたらすこともできる。したがって、その配列が知られているほぼ任意の遺伝子を、適切に調節されたｓｉＲＮＡとの配列相補性に基づいてターゲティングすることができる。対象とするほぼ任意の遺伝子をノックダウンする能力を考慮すると、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉは、基礎生物学と応用生物学の両方において大きな関心を引き起こしている。様々な生物学的経路中で重要な遺伝子を同定するために設計された、多数の大規模なＲＮＡｉスクリーニングが存在する。疾患プロセスは多数の遺伝子の活性にも依存するので、いくつかの状況では、ｓｉＲＮＡによる遺伝子の活性の抑制は、治療効果をもたらす可能性があると予想される。したがってその発見は、生物医学研究および薬剤開発のための、ＲＮＡｉの抑制の関心の上昇をもたらしている。近年の治療用ＲＮＡｉの第Ｉ相臨床試験の結果は、ｓｉＲＮＡは十分耐性があり適切な薬物動態性を有すること実証する。したがってｓｉＲＮＡおよび関連ＲＮＡｉ誘導法は、近い将来重要な新クラスの薬剤となる。ＩＦＮαポリペプチドをコードする核酸に対して設計したｓｉＲＮＡ分子を使用してＩＦＮαの発現を低減し、したがってＩＦＮ系の事前活性化の低減をもたらすことができる。したがって、本発明のこの態様の一実施形態は、作用物質がＩＦＮαポリヌクレオチドに対する相補配列を有するｓｉＲＮＡ分子である実施形態である。
【０１２７】
このような情報を使用すると、ＩＦＮαポリヌクレオチドに対する相補配列を有するｓｉＲＮＡ分子を設計することは簡単であり、十分当業者の能力の範囲内にある。例えば、簡単なインターネット検索によって、ｓｉＲＮＡ分子を設計するために使用することができる多くのウエブサイトを得る。
【０１２８】
「ｓｉＲＮＡ分子」によって、本発明者らは、二本鎖２０〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子、およびｓｉＲＮＡ分子を構成する２つの一本ＲＮＡ鎖のそれぞれを含める。
【０１２９】
例えば、ｓｉＲＮＡはヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形で使用される。このようなｓｈＲＮＡは、（例えば、約９ヌクレオチドの）スペーサー配列によって連結した２つの相補的ｓｉＲＮＡ分子を含むことができる。相補的ｓｉＲＮＡ分子は、それらが一緒に結合するようにフォールディングすることができる。
【０１３０】
ＩＦＮαポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡを切断することができるリボザイムは、本発明の第三または第四の態様の別の好ましい作用物質となる。
【０１３１】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、飼育動物または人間であってよい。治療する対象はヒトであることが好ましい。これが該当するとき、それらがヒト治療（例えば、前に論じたような抗体のヒト化）に最適であるように、作用物質を設計することができる。しかしながら、獣医学の対象となる他の動物（例えば、ウマ、ラクダ、ウシ、イヌまたはネコ）を治療するために、作用物質を使用することも可能であることも理解されよう。
【０１３２】
本明細書で言及する「薬剤として許容されるビヒクル」は、医薬組成物を配合する際に有用であるとして当業者に知られている任意の生理的ビヒクルである。
【０１３３】
技術者が本発明の第一の態様の方法を実施するのに必要とする様々な要素を、キットに組み込むことができる。
【０１３４】
したがって、本発明の態様によれば、肝臓のウイルス感染がある対象が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に応答する可能性を決定するためのキットであって、
（ｉ）対象由来のサンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを分析するための手段、および場合によっては、
（ｉｉ）サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと、対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを比較するための手段を含むキットを提供する。
【０１３５】
「対象由来のサンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを分析するための手段」によって、本発明者らは、サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを示す分子をターゲティングすることができる特異的結合分子を含める。いくつかの実施形態では、特異的結合分子はオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、アプタマー、または前述の結合タンパク質もしくは小分子である。
【０１３６】
「サンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと、対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを比較するための手段」によって、本発明者らは、本発明の第一の態様中の前述の対照サンプルを含める。本発明者らは、前述の対照の参照データも含める。
【０１３７】
本発明のキットは、
（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルを分析するための関連バッファーおよび試薬も含むことができる。
【０１３８】
キットと共に与えられるバッファーおよび試薬は液体形であってよく、およびいくつかの実施形態では、予め測定したアリコートとして与えることができる。あるいは、バッファーおよび試薬は、希釈用に濃縮（またはさらに粉末形）であってよい。
【０１３９】
（任意の添付の特許請求の範囲、要約および図面を含めた）本明細書に記載する全ての特徴、および／またはこのように開示する任意の方法またはプロセスの全てのステップは、このような特徴および／またはステップの少なくともいくつかが互いに矛盾する組合せ以外、任意の組合せで前述の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【０１４０】
ここで本発明を、以下の実施例および図面を参照しながらさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）を有する患者の肝臓におけるｍｉＲ−１２２発現の図である。（Ａ）ｍｉＲ−１２２レベルが、完全初期ウイルス学的著効（ｃＥＶＲ）を有する患者中より、ペグＩＦＮα療法に対する一次非応答者（ＰＮＲ）において有意に低い図である。４２人のＣＨＣ患者および肝臓疾患がない６人の対照患者の肝臓中のｍｉＲ−１２２の量はＲＴ−ｑＰＣＲにより測定し、「コピー数／１０ｐｇの全ＲＮＡ」として示す。１６人のＰＮＲ患者と２６人のｃＥＶＲ患者の間の差は、両側マンホイットニーｔ検定により測定して統計学的に有意である（ｐ＜０．０００１）。ｃＥＶＲ患者と対照の間に有意な差は存在しない。 （Ｂ）ＲＮａｓｅ保護アッセイが、ＰＮＲ患者とｃＥＶＲ患者の間のｍｉＲ−１２２レベルの差を確認する図である。４人の対照患者および８人のＣＨＣ患者（４ＰＮＲおよび４ｃＥＶＲ；患者番号、図の上部に示す）由来のＲＮＡを、ｍｉＲ−１２２（上図）およびｌｅｔ−７ｂ（中央図）に特異的なプローブを用いて分析した。下図中の棒線は、それぞれの患者に関して定量的ホスファーイメージング（ＰｈｏｓｐｏｒＩｍａｇｉｎｇ）によって測定した、ｍｉＲ−１２２のＲＮＡとｌｅｔ−７ｂのＲＮＡの間の相対比（上図および下図中に示した実験と同様の２つの実験からの平均）を表す。ＰＮＲ患者は、ｃＥＶＲおよび対照患者より３〜４倍低いｍｉＲ−１２２レベルを示す。 （Ｃ）血清中のＨＣＶのＲＮＡレベルは、肝内ｍｉＲ−１２２発現と相関関係がない図である。血清中ウイルス負荷（１ｍｌ当たりの国際単位）は対数目盛でプロットする（ｙ軸）。相関関係は有意ではなく（ｐ＝０．３５）、相関係数ｒ＝０．１５である。 （Ｄ）肝内ＨＣＶのＲＮＡレベルは、ｍｉＲ−１２２発現と相関関係がない図である。肝内ＨＣＶのＲＮＡ（全肝臓ＲＮＡ１μｇ当たりのコピー数）は対数目盛でプロットする（ｙ軸）。相関関係は有意ではない（ｐ＝０．０６、相関係数ｒ＝−０．２９）。 （Ｅ）ペグＩＦＮαの投与は、ヒト肝臓中のｍｉＲ−１２２レベルに対して有意な影響がない図である。ＣＨＣを有する６ｃＥＶＲ患者および５ＰＮＲ患者由来の対のヒト肝生検中のＭｉＲ−１２２レベル（コピー数／１０ｐｇの全ＲＮＡ）は、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。第一の肝生検は治療開始前に実施した（−ペグＩＦＮα）。第二の生検（＋ペグＩＦＮα）は第一のペグＩＦＮα注射後４時間で実施した。ダイアグラムは、それぞれの患者の（線によって結んだ）対の肝臓サンプル中のｍｉＲ−１２２のレベルを示す。
【図２】慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）を有する患者の肝臓におけるｍｉＲ−２９６−５ｐ発現の図である。ｍｉＲ−２９６−５ｐレベルは、完全初期ウイルス学的著効（ｃＥＶＲ）を有する患者中より、ペグＩＦＮα療法に対する一次非応答者（ＰＮＲ）において有意に高い。４２人のＣＨＣ患者および肝臓疾患がない６人の対照患者の肝臓中のｍｉＲ−２９６−５ｐの量はＲＴ−ｑＰＣＲにより測定し、「コピー／１０ｐｇの全ＲＮＡ」として示す。１６人のＰＮＲ患者と２６人のｃＥＶＲ患者の間の差は、両側マンホイットニーｔ検定により測定して統計学的に有意である（ｐ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１４２】
患者のサンプルおよびＣ型肝炎治療
２００６年１０月から２００８年３月まで、バーゼル大学病院の外来患者肝臓クリニック参照のＣＨＣを有する患者に、研究目的で彼らの診断用肝生検の一部を使用する許可を求めた。ペグ化ＩＦＮα２ｂ（ペグＩＦＮα；Ｐｅｇｌｎｔｒｏｎ、Ｅｓｓｅｘ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、スイス）およびリバビリン（Ｒｅｂｅｔｏｌ、Ｅｓｓｅｘ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、スイス；体重に基づいた投与：６５ｋｇ未満、８００ｍｇ／ｄ；６５〜８５ｋｇ、１ｇ／ｄ；８５ｋｇ超、１．２ｇ／ｄ）で治療した４２人の患者は、繰り返しのＲＮＡ抽出に利用可能な十分な肝生検材料を有していた。彼らは全員白色人種であった。この４２人の患者の１１人は、ペグ化ＩＦＮαの最初の注射後４時間で２回目の肝生検を受けることも承諾した。プロトコルはバーゼル大学病院の倫理委員会によって承認され、文書化されたインフォームドコンセントを全患者から得た。血清中のＨＣＶ ＲＮＡは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｙｓｔｅｍｓからのＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＨＣＶ−Ｔｅｓｔを使用して、治療開始前ならびに治療第４週および第１２週に定量化した。Ｍｅｔａｖｉｒの分類体系によるＨＣＶ肝生検の組織学的グレーディングおよびステージングは、バーゼル大学病院の病理学研究所で実施された。非ＣＨＣ健常対照の組織は局所性病変の超音波ガイド下肝生検を受けた６人の患者から得て、局所性病変外の正常肝臓組織由来の生検に関するインフォームドコンセントを得た。これらの患者は正常肝臓値を有しており、肝臓病変の不在は全対照サンプルに関して組織学的に確認した。
【０１４３】
肝臓組織およびＨｕｈ７細胞における定量化用のｍｉＲＮＡの選択
ｍｉＲ−１２２以外に、Ｈｕｈ−７細胞ならびにヒトおよびマウス肝臓サンプルにおけるＩＦＮの影響の定量化および分析用に選択したｍｉＲＮＡは、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＩＭら、Ｎａｔｕｒｅ２００７；４４９：９１９〜９２２）によっていずれもＩＮＦ誘導性として報告された、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３５１、およびｍｉＲ−４４８であった。ｍｉＲ−１を除いたこれらのそれぞれのトランスフェクションは、Ｈｕｈ７細胞中のＨＣＶレプリコンＲＮＡの量を低下させることも報告された（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＩＭら、Ｎａｔｕｒｅ２００７；４４９：９１９〜９２２）。ＨＣＶレプリコンＲＮＡの収率の低下をもたらすとして報告された別のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−４３１であるが、しかしながら、本発明者らはこのｍｉＲＮＡを分析しなかった。その定量化のためのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのアッセイが利用可能ではなく、かつ今日までこのｍｉＲＮＡは、肝臓または肝癌細胞中で発現されるとして同定されていないからである。同様に、ｍｉＲ−３０を分析しなかった。それは多数の形（ｍｉＲ−３０ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）で存在するが、分析する形がＰｅｄｅｒｓｅｎらによって特定されなかったからである。さらに、このｍｉＲＮＡの過剰発現はＨＣＶ ＲＮＡの収率に対して全く影響がなかった（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＩＭら、Ｎａｔｕｒｅ２００７；４４９：９１９〜９２２）。Ｐｅｄｅｒｓｅｎらによって分析された具体的なｍｉＲ−１９６およびｍｉＲ−２９６の形は示されていないが、本発明者らは定量化用に、ｍｉＲ−１９６ｂ（ヒト肝癌細胞中で同定した２つのｍｉＲ−１９６特異的クローンはｍｉＲ−１９６ａではなくｍｉＲ−１９６ｂを表す）、およびｍｉＲ−２９６−５ｐ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎらによっても利用されたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイは、ｍｉＲ−２９６−３ｐに関してではなくｍｉＲ−２９６−５ｐに関して利用可能である）を選択した。ｍｉＲ−１９６ｂ以外、他の分析したｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３５１、およびｍｉＲ−４４８）を表すクローンは、ヒト肝臓または肝癌細胞から単離しなかった（参照３）。
【０１４４】
Ｌｅｔ−７ｂおよびｍｉＲ−１５ａを、そのレベルがＣＨＣ中でまたはＩＦＮ治療によって影響を受けると予想されなかった、対照ｍｉＲＮＡとして選択した。
【０１４５】
ＲＮＡの抽出、逆転写、および低分子ＲＮＡのリアルタイムｑＰＣＲ定量化
Ｈｕｈ７およびＨｕｈ７．５細胞由来の全および低分子ＲＮＡ分画を、それぞれトリゾールおよびｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して、かつ製造者のプロトコルに従い抽出した。ヒトまたはマウス肝臓由来の全ＲＮＡは、トリゾール試薬中に１０〜３０ｍｇの凍結組織を均質化することによって単離した。ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して定量化した。
【０１４６】
ヒトおよびマウス材料中でのｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３５１、およびｍｉＲ−４４８発現の分析用に（マウスおよびヒト中でのこれらのｍｉＲＮＡの配列は同一である）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した。７．５μｌの最終体積中、１×ＲＴバッファー、５ｎｇのＲＮＡ、５０ｎＭのｍｉＲＮＡ特異的ＲＴプライマー、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２５Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．３３Ｕ／μｌのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ ＲＴを含有した逆転写酵素（ＲＴ）反応混合物を、１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次いで４℃に保った。鋳型対照を含まない全てのＲＴ反応は三連で実施した。リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出システムを使用して実施した。１０μｌのＰＣＲは、０．６７μｌのＲＴ産物、１×Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスター混合物、および１μｌのプライマー、ならびにＴａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイのプローブ混合物を含んでいた。反応混合物は、９６ウエルの光学プレートにおいて９５℃で５分間インキュベートし、次に９５℃で１５秒および６０℃で６０秒の４０サイクルでインキュベートした。Ｃｔ値はデフォルト閾値設定を使用して決定した。閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光が一定の閾値を超える分別サイクル数として定義する。
【０１４７】
標準化およびｍｉＲＮＡのコピー数の推定。
それぞれのサンプルに関して決定したＣｔ値を、三連反応から計算したＵ６ＲＮＡに関して得た平均Ｃｔに標準化した。ｍｉＲＮＡのコピー数を決定するために、ポリアクリルアミド−ゲル−電気泳動（ＰＡＧＥ）−ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３５１、およびｍｉＲ−４４８ｍｉＲＮＡに対応する精製オリゴヌクレオチド（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ、スイス）を使用して、標準曲線を作製した。１．３ａＭ（反応当たり７コピーに相当）から１３ｐＭ（反応当たり７×１０７コピー）までの範囲の合成ＲＮＡインプットおよび反応混合物を、前に記載したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７０００を使用して、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイによって二連で分析した。単離合成ｍｉＲＮＡを用いて実施した標準化をさらに検証するために、ＨｅＬａ細胞またはマウス網膜のいずれかに由来する５ｎｇの全ＲＮＡを含有する反応混合物に高濃度（１．３ａＭ〜１３ｐＭ）の合成ｍｉＲ−１２２を加え、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイによって分析した。合成ｍｉＲ−１２２ＲＮＡの添加がない対照反応により測定したところ、ＭｉＲ−１２２はＨｅＬａおよびマウス網膜細胞中で発現されない。「担体」ＲＮＡの有無の下で得た標準曲線間で、差は観察しなかった（データ示さず）。
【０１４８】
異なる反応から得たＣｔ値を、適切な標準曲線を使用して、肝臓組織由来の１０ｐｇの全ＲＮＡ当たりまたは１つのＨｕｈ７細胞当たりの特異的ｍｉＲＮＡの絶対コピー数に変換した。適応があれば、ｍｉＲＮＡの回収を肝細胞特異的アルブミンｍＲＮＡのレベルにさらに標準化した。ヒトアルブミンＲＴ−ｑＰＣＲに使用したプライマーはＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴ（配列番号１）およびＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＣ（配列番号２）であった。ＳＹＢＲ−ＰＣＲ反応はＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。
【０１４９】
Ｈｕｈ７細胞当たりの個々のｍｉＲＮＡのコピー数を決定するために、細胞当たりの全ＲＮＡの回収を３つの異なる手順によって計算した。最初の２つの手順に関して、製造者（Ｓｃｈａｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ、ドイツ）のプロトコルに従いＣＡＳＹ１細胞計数器を使用して細胞を計数し、知られている数の細胞由来のＲＮＡは、トリゾールまたはｍｉｒＶａｎａキットのいずれかを使用して抽出した。第三の手順では、細胞は顕微鏡下で計数し、ＲＮＡはトリゾールによって抽出した。３つの全ての手順は、ＲＮＡ抽出用の異なる数の細胞を使用して三連で実施した。サンプルに３２Ｐ標識ＲＮＡを加えてＲＮＡの回収を測定した。３つの手順は以下の量の細胞当たりの全ＲＮＡ：１３．８＋／−３．５ｐｇ、１４．５２＋／−２．６５ｐｇ、および１３，９８＋／−２．３７ｐｇをもたらした。１４．１ｐｇ／細胞の平均値をさらなる計算に使用した。この値は、肝細胞または肝癌細胞中のｍｉＲ−１２２含有量の計算用にＣｈａｎｇらにより以前に使用された、細胞当たり２５ｐｇのＲＮＡより低い。しかしながらそれは、異なる発生段階のマウスＴリンパ球（０．６７〜６．８２ｐｇ／細胞）またはマウスＥＳ細胞（２０ｐｇ／細胞）に関して計算した値の範囲内にある。
【０１５０】
細胞当たりの低分子ＲＮＡ（２００ｎｔ未満）の含有量を決定するために、異なる手順によって得た全Ｈｕｈ７細胞ＲＮＡに、ｍｉｒＶａｎａ（商標）キットによる分別を施す。１つのＨｕｈ７細胞は、１．１２５ｐｇの低分子ＲＮＡ（細胞当たり１．０５〜１．２ｐｇの範囲の測定値の平均）を含有すると計算した。Ｂｒｏｗｎらにより測定した値と類似したこの値を使用して、細胞当たりのｍｉＲＮＡコピー数に対する、低分子ＲＮＡ１０ｐｇ当たりのｍｉＲＮＡのコピー数（Ｂｒｏｗｎらにおいて測定したように、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイをさらに使用した）を再度計算した。本発明者らは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイによって測定した細胞当たりのｍｉＲＮＡコピー数の値は、ＲＮａｓｅ保護アッセイによって測定した値より低い傾向があることを記す（本発明者らの非公開の結果）。これは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）システムが、同一の有効性で特異的ｍｉＲＮＡの個々の３’末端配列変異体を検出しない事実による（非公開の結果）。
【０１５１】
ＲＮａｓｅ保護アッセイによるｍｉＲＮＡの検出
ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）を、製造者の説明書に従いｍｉｒＶａｎａｍｉＲＮＡプローブ構築および検出キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して実施した。ＲＰＡプローブの調製に使用したプライマーは、ｌｅｔ−７ｂ、ＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号３）およびｍｉＲ−１２２、ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＣＴＣ（配列番号４）であった。簡単に言うと、ＲＰＡ反応混合物は、５ｆｍｏｌ（１００，０００ｃｐｍ）の内部標識およびＰＡＧＥ精製ＲＰＡプローブおよび１μｇの全肝臓ＲＮＡを含有していた。ハイブリダイゼーションは４２℃で一晩実施し、ＲＮａｓｅＡ／Ｔ１の消化は３７℃において２０分であった。保護断片は変性条件下で１２％ＰＡＧＥによって分析し、次にＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量化した。
【０１５２】
ＩＳＧｍＲＮＡレベルの測定
ヒトまたはマウス肝臓組織から抽出した全ＲＮＡを、ＩＦＮ作用の指標としての「古典的な」ＩＳＧｍＲＮＡ（ＰＫＲ、ＯＡＳ１、ＳＴＡＴ１およびＳＯＣＳ１）の定量化に使用した。ランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｌｉｓｅｌｌｅｎ、スイス）によってＲＮＡを逆転写した。反応混合物は、７０℃で５分間、次いで３７℃で１時間インキュベートし、９５℃で５分間加熱することによって停止した。ＳＹＢＲ−ＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびゲノムＤＮＡの増幅を避けるためのエクソン−イントロン接合部に広がるプライマーを使用して実施した。以下のプライマーをマウス（ｍ）遺伝子：リボソームタンパク質Ｌ−１９（ｍＲＰＬ−１９）に使用した。ＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴ（配列番号５）およびＴＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴ（配列番号６）；ｍＰＫＲ、ＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＧ（配列番号７）およびＡＣＡＡＧＧＣＣＴＡＴＧＴＡＧＴＴＡＣＣＡＡＣＧＡ（配列番号８）；ｍＯＡＳ１、ＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＡ（配列番号９）およびＣＣＣＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＴ（配列番号１０）；ｍＳＴＡＴ１、ＣＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＡＴＴＴＧＣ（配列番号１１）およびＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡ（配列番号１２）。ヒト（ｈ）遺伝子のプライマーは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼであった（ｈＧＡＰＤＨ）；ＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＣＡ（配列番号１３）およびＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡ（配列番号１４）、ｈＰＫＲ、ＴＧＡＴＴＡＴＣＴＧＣＧＴＧＣＡＴＴＴＴＧＧ（配列番号１５）およびＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＴＴＴ（配列番号１６）；ｈＯＡＳ１、ＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＴＧ（配列番号１７）およびＴＣＧＧＴＧＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＴＧＡ（配列番号１８）；ｈＳＯＣＳ１、ＣＣＣＣＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＴＧＧＴＡＧＣＡ（配列番号１９）およびＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＣＡＴＴＧＴＣ（配列番号２０）；ｈＳＴＡＴ１、ＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＴＧＴＴＧ（配列番号２１）およびＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＡＣＣＡ（配列番号２２）；ｈＩＰ１０、ＣＧＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴＡＴ（配列番号２３）およびＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＴＣＴ（配列番号２４）；ｈＵＳＰ１８、ＣＴＣＡＧＴＣＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴ（配列番号２５）およびＡＴＣＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＣＡＴＧＣＡ（配列番号２６）；ｈＩＦｌ２７、ＣＣＴＣＧＧＧＣＡＧＣＣＴＴＧＴＧ（配列番号２７）およびＡＡＴＣＣＧＧＡＧＡＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＴ（配列番号２８）。サイクル閾値（ΔＣｔ）値の差は、対象とする転写産物に関するＣｔ値から、内部対照として働いたｈＧＡＰＤＨまたはｍＲＰＬ−１９に関するＣｔ値を差し引くことによって導いた。全ての反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出システムを使用して二連で実施した。ｍＲＮＡの発現レベルは、式２―ΔＣｔを使用して、ΔＣｔ値からのｈＧＡＰＤＨまたはｍＲＰＬ−１９に対して計算した。対の肝生検サンプル中の発現の変化は、式２”（ΔＣｔＢ−１−ΔＣｔＢ−２）に従い倍数変化として計算した。
【０１５３】
肝内ＨＣＶ ＲＮＡの定量化
４２人のＣＨＣおよび６人の対照患者の生検から単離した１μｇの全ＲＮＡを、全てのＨＣＶ亜型のｉｎ ｖｉｔｒｏ定量化用に設計された病原体特異的ＲＴプライマー混合物（ＨＣＶ用定量化キット、ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）を使用して、製造者の説明書に従い逆転写した。ＨＣＶ ＲＮＡは、病原体特異的プライマー／プローブ混合物（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ）およびＴａｑｍａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡにより製造された）を使用して、製造者の説明書に従い定量化した。蛍光はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７０００配列検出システムのＦＡＭチャンネルによって検出し、１μｇの全ＲＮＡ当たりのＨＣＶ ＲＮＡのコピー数は、病原体陽性対照鋳型（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ）を使用して得た標準曲線に従い計算した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓のウイルス感染がある対象が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に応答する可能性を決定するための方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡの発現のレベルに関して対象由来のサンプルを分析すること、および
（ｂ）対象由来のサンプル中の前記ｍｉＲＮＡの発現のレベルと対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを比較することを含む方法。
【請求項２】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲ１２２であり、対照サンプル中のｍｉＲ−１２２のレベルと比較した対象由来のサンプル中の低レベルのｍｉＲ−１２２が、対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答しないことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−２９６−５ｐであり、対照サンプル中のｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと比較した対象由来のサンプル中の高レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐが、対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答しないことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対照サンプル中のそれぞれｍｉＲ−１２２および／またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと比較した、対象由来のサンプル中の不変もしくは高レベルのｍｉＲ−１２２および／または不変もしくは低レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐが、それぞれ対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答することを示す、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗ウイルス療法が、リバビリンと場合によっては組み合わせてもよいペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ウイルス感染がＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス感染である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが肝臓組織を含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る遺伝子の発現も分析する、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中のｍＲＮＡ遺伝子転写産物の量、または前記ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの量を測定することによって遺伝子の発現を決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中の前記遺伝子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの量を測定することによって遺伝子の発現を決定する、請求項９または１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドまたはポリペプチドの量を、特異的結合分子を使用して決定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象がヒトである、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
（ｉ）対象由来のサンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルを分析するための手段、および場合によっては、
（ｉｉ）対象由来のサンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと、対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを比較するための手段を含むキット。
【請求項１５】
療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る少なくとも１つの遺伝子の発現を分析するための手段であって、療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る前記少なくとも１つの遺伝子を代表する分子をターゲティングすることができる１つまたは複数の特異的結合分子を最終的に含み、前記特異的結合分子がオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、またはアプタマーである手段、および場合によっては、サンプル中の遺伝子の発現と対照サンプル中の同じ遺伝子の発現を比較するための手段をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１】
肝臓のウイルス感染がある対象が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス療法に応答する可能性を決定するための方法であって、
（ａ）ｍｉＲＮＡの発現のレベルに関して対象由来のサンプルを分析すること、および
（ｂ）対象由来のサンプル中の前記ｍｉＲＮＡの発現のレベルと対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡのレベルを比較することを含む方法。
【請求項２】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲ１２２であり、対照サンプル中のｍｉＲ−１２２のレベルと比較した対象由来のサンプル中の低レベルのｍｉＲ−１２２が、対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答しないことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−２９６−５ｐであり、対照サンプル中のｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと比較した対象由来のサンプル中の高レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐが、対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答しないことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対照サンプル中のそれぞれｍｉＲ−１２２および／またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと比較した、対象由来のサンプル中の不変もしくは高レベルのｍｉＲ−１２２および／または不変もしくは低レベルのｍｉＲ−２９６−５ｐが、それぞれ対象が前記抗ウイルス療法におそらく応答することを示す、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗ウイルス療法が、リバビリンと場合によっては組み合わせてもよいペグ化ＩＦＮα（ペグＩＦＮα）を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ウイルス感染がＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス感染である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが肝臓組織を含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る遺伝子の発現も分析する、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中のｍＲＮＡ遺伝子転写産物の量、または前記ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの量を測定することによって遺伝子の発現を決定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中の前記遺伝子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの量を測定することによって遺伝子の発現を決定する、請求項９または１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドまたはポリペプチドの量を、特異的結合分子を使用して決定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象がヒトである、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
（ｉ）対象由来のサンプル中のｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐの発現レベルを分析するための手段、および場合によっては、
（ｉｉ）対象由来のサンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルと、対照サンプル中の前記ｍｉＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−２９６−５ｐのレベルを比較するための手段を含むキット。
【請求項１５】
療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る少なくとも１つの遺伝子の発現を分析するための手段であって、療法に対する対象の応答性を予測するものであり得る前記少なくとも１つの遺伝子を代表する分子をターゲティングすることができる１つまたは複数の特異的結合分子を最終的に含み、前記特異的結合分子がオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、またはアプタマーである手段、および場合によっては、サンプル中の遺伝子の発現と対照サンプル中の同じ遺伝子の発現を比較するための手段をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５２５７９９（Ｐ２０１１−５２５７９９Ａ）
【公表日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１５４００（Ｐ２０１１−５１５４００）
【出願日】平成２１年６月２６日（２００９．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８０４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５６５０７
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５０２４０７３３６）ノバルティス・フォルシュングスシュティフトゥング・ツヴァイクニーダーラッスング・フリードリッヒ・ミーシェー・インスティトゥート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｗｅｉｇｎｉｅｄｅｒｌａｓｓｕｎｇ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【出願人】（５０４０５１９２８）ユニバーシティ ホスピタル バーゼル (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２６日（２００９．６．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８０４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５６５０７
【国際公開日】平成２１年１２月３０日（２００９．１２．３０）
【出願人】（５０２４０７３３６）ノバルティス・フォルシュングスシュティフトゥング・ツヴァイクニーダーラッスング・フリードリッヒ・ミーシェー・インスティトゥート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｗｅｉｇｎｉｅｄｅｒｌａｓｓｕｎｇ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【出願人】（５０４０５１９２８）ユニバーシティ ホスピタル バーゼル (2)
【Ｆターム（参考）】
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