抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキット
【課題】 サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株を提供する。
【解決手段】 サリバリウスで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合して、融合細胞を得る。サリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株を融合細胞の中からクローニングする工程において、該融合細胞から産生される抗体を、サリバリウスおよびその他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能について免疫測定法により検定することにより、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株を得ることができる。
【解決手段】 サリバリウスで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合して、融合細胞を得る。サリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株を融合細胞の中からクローニングする工程において、該融合細胞から産生される抗体を、サリバリウスおよびその他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能について免疫測定法により検定することにより、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株を得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サリバリウス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、以下単にサリバリウスと記す）に特異的なモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、う蝕あるいは歯周病を調べる際には、その原因菌と思われる細菌を培養することにより、原因菌の存在を半定量的に調べ、診断している。しかしながら、う蝕や歯周病等の感染症の原因となる菌の種類が多いため、感染症への罹患の有無を効率よく調べることは困難である。
【０００３】
口腔内の感染症の有無を検査するために、口腔内に常在する細菌の存在量を測定する方法がある。人の口腔内に常在する細菌として、例えばサリバリウスがある。サリバリウスは、通常、口腔内に無害な状態で常在している。口腔内が正常な状態にある場合、歯肉間にはサリバリウス菌しか存在していない。しかし、例えば、歯周病に感染し、歯周病原因菌が増殖すると、歯周病原因菌が増殖した部位におけるサリバリウス菌の存在量が著しく減少する。したがって、口腔内におけるサリバリウス菌の存在量を測定することにより、間接的な感染症への罹患の有無を判定することができる。
【０００４】
サリバリウスの存在量を測定するために、一般的には、培養法を利用してサリバリウスの存在量を測定する方法が用いられている。同方法では、サリバリウスを他のミュータンスグループの細菌（例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）やストレプトコッカス・クリセツス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ）など）と共に生育し、生育したミュータンスグループの細菌集団の中に存在するサリバリウスを同定および検出する。
【０００５】
非特許文献１は、培養法を利用したサリバリウスの存在量の測定方法について記載している。非特許文献１に記載の測定法によりサリバリウスの存在量を測定するために、例えば、アピテスト（アピストレップ２０；日本ビオメリューバイテック社製）を利用することができる。酵素活性や糖発酵能をテストするための基質が入っている２０個のカップそれぞれに菌を接種し、４時間または２４時間培養した後に、添加した試薬や指示薬により呈色した色を判定表に従って読み取り、陽性率表または７桁のアピプロフアイルインデックスによって同定する。
【０００６】
このように、非特許文献１に記載の従来の検出方法によれば、サリバリウスを検出することができる。
【非特許文献１】武笠英彦ら、「う蝕細菌の分子生物学一研究の成果と展望」、クインテッセンス、１９９７年４月、ｐ．７１−７２
【非特許文献２】ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「アンティボディーズ：ア ラボラトリー マニュアル（ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」、コールド・スプリング・アバー・ラボラトリー（ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ）、米国、１９８８年
【非特許文献３】コーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）およびミルシュテイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、「カルチャーズ オブ フューズド セルズ シクリーティング アンチボディー オブ プレディファインド スペシフィシティ（ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、英国、１９７５年、ｐ．２５６−４９５
【非特許文献４】コズボール（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、「ザ プロダクション オブ モノクローナル アンチボディーズ フロム ヒューマン リンフォサイツ（Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）」、イミュノロジー トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ）、１９８３年、ｐ．４−７２
【非特許文献５】コート（Ｃｏｔｅ）ら、「ジェネレーション オブ ヒューマン モノクローナル アンチボディーズ リアクティブ ウィズ セルラー アンチジェンズ（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）」、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイティド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、米国、１９８３年、ｐ．８０−２０２６
【非特許文献６】コール（Ｃｏｌｅ）ら、「モノクローナル アンティボディーズ アンド キャンサー セラピー（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ）」、アラン・アール・リス（Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．）、米国、１９８５年、ｐ．７７？９６
【非特許文献７】ポール（Ｐａｕｌ）・Ｗ編、「ファンダメンタル イミュノロジー（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」、第２版、レイバン プレス（Ｒａｖａｎ Ｐｒｅｓｓ）、米国、１９８９年、第７章
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に記載の従来の検出方法では、培養法を用いるため、菌の検出に時間がかかり、また、操作が煩雑であるという問題がある。また、同検出方法では、サリバリウスを検出することはできるものの、定量することが容易ではないという問題がある。したがって、サリバリウスの定量をより正確かつ簡便に行うことが望まれているが、現在のところそのような方法は提案されていない。
【０００８】
サリバリウスを容易に検出することができ、かつ定量的に分析することができる方法として、サリバリウスに対して特異的に結合する抗体を用い、サンドイッチ法によりサリバリウスを定量することが考えられる。サンドイッチ法は、目標とする細菌に特異的に結合する抗体を用い、固相に結合させた抗体と標的の細菌とを反応させ、さらに、標的の細菌に標識した抗体を反応させることにより、標的の細菌を定量することができる方法である。
【０００９】
サリバリウスを介してサンドイッチ状に結合できる抗体のペアを得ることは比較的容易である。しかし、モノクローナル抗体を用いる場合、抗体が均一であるため、このモノクローナル抗体の交叉反応性が非常に重要となる。サリバリウスに対するモノクローナル抗体の中には、サリバリウスだけでなく、他のストレプトコッカス属細菌に対しても高い結合能を有する抗体が存在し得る。ここで、他のストレプトコッカス属細菌とは、上記のミュータンスグループの他に、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）や、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓ．ｇｏｒｄｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．Ｓｏｂｒｉｎｕｓ）などを含む。これらの他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が高い抗体をサンドイッチ法に用いた場合、他のサリバリウスの正確な定量に支障をきたす恐れがある。従って、他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を用いる必要があるが、従来、サリバリウスに対して特異的に結合し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗体は得られていない。
【００１０】
それゆえに、本発明の目的は、サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、サリバリウスに特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株の作製方法であって、サリバリウスで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合して、融合細胞を得る工程；およびサリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株を該融合細胞の中からクローニングする工程であって、該融合細胞から産生される抗体を、サリバリウスおよびその他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能について免疫測定法により検定する工程を包含する。
【００１２】
好ましくは、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞は、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３株の細胞であるとよい。
【００１３】
好ましくは、免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）であるとよい。
【００１４】
また、免疫した哺乳動物が、マウスまたはラットであってもよい。一例として、免疫した哺乳動物は、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである。
【００１５】
また、本発明は、抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株であって、上記の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株の作製方法により作製される。
【００１６】
好ましくは、細胞株は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号であるとよい。また、好ましくは、細胞株は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号であるとよい。
【００１７】
また、本発明は、上記のモノクローナル抗体産出細胞株により産出され、その他のストレプトコッカス属細菌と比べてサリバリウスに対して高い結合能を有する、抗サリバリウスモノクローナル抗体である。
【００１８】
好ましくは、抗サリバリウスモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号のモノクローナル抗体産出細胞株により産出されるとよい。また、好ましくは、抗サリバリウスモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号のモノクローナル抗体産出細胞株により産出されるとよい。
【００１９】
また、本発明は、サリバリウスを検出するためのキットである。キットは、固相に結合された第１の抗体、および第２の抗体を含み、第１の抗体および第２の抗体のうち少なくとも一方は、本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出された抗サリバリウスモノクローナル抗体であり、第２の抗体は標識されている。好ましくは、上記本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出された抗サリバリウスモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号のモノクローナル抗体産出細胞株により産出された抗サリバリウスモノクローナル抗体、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号のモノクローナル抗体産出細胞株により産出された抗サリバリウスモノクローナル抗体であるとよい。
【００２０】
また、第１の抗体はポリクローナル抗体であってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明について、より具体的に説明する。本発明においては、特に指示のない限り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの手法は、市販の酵素、キット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。
【００２３】
本発明に係る抗サリバリウスモノクローナル抗体産生細胞株の作製を、以下作製手順に沿って説明する。
【００２４】
（免疫）
まず、哺乳動物をサリバリウスで免疫することによって、動物体内で抗体産生細胞を調製する。
【００２５】
「哺乳動物」の例として、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモットが挙げられる。哺乳動物は、好ましくはマウスおよびラットであり、より好ましくはマウスである。マウスの例として、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統のマウスが挙げられる。特に、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、免疫後に血清中に高い抗体力価を示すので、サリバリウスとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能である。血中抗体力価が、特異的なハイブリドーマの出来易さと関係していることは公知である。また、細胞株の確立後の腹水による抗体大量作製においては、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが一般によく使用される。以上により、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、サリバリウスの免疫に好ましい例である。実験動物の齢は、特に限定されないが、代表的には約４週齢〜約１２週齢であり、好ましくは約６〜約１０週齢、より好ましくは約７週齢のマウスまたはラットである。
【００２６】
免疫に用いられるサリバリウスは、人の口腔内から単離してもよいし、市販（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション、アメリカ合衆国 メリーランド ２０８５２、ロックビル、パークローン ドライブ １２３０１から入手し得る）のものを用いてもよい。人の口腔内からは、定法に従い、ＭＳ寒天培地上でムコイド型のコロニーとして単離され得る。
【００２７】
免疫の前に、サリバリウスは、免疫応答を増強させるためにアジュバントと混合され得る。アジュバントの例としては、油中水型乳剤（例えば、不完全フロイントアジュバント）、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバント、粉末ベントナイト、およびタピオカアジュバントの他に、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓなどの菌体、細胞壁およびトレハロースダイコレート（ＴＤＭ）などの菌体成分；グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖体（ＬＰＳ）およびリピドＡ画分；β グルカン（多糖体）；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ベスタチン；レバミゾールなどの合成化合物；胸腺ホルモン、胸腺ホルモン液性因子およびタフトシンなどの生体成分由来のタンパク質またはペプチド性物質；ならびにそれらの混合物（例えば、完全フロイントアジュバント）などが挙げられる。
【００２８】
これらのアジュバントは、投与経路、投与量、投与時期などに依存して免疫応答の増強または抑制に効果を示す。さらにアジュバントの種類によって、抗原に対する血中抗体産生、細胞性免疫の誘導、免疫グロブリンのクラスなどに差が認められる。それゆえ、目的とする免疫応答に応じて、アジュバントを適切に選択することが好ましい。選択されたアジュバントの取扱い、例えばサリバリウスとの混合方法などは当該分野で公知である。
【００２９】
哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法に従って行われる。例えば、抗原であるサリバリウスは、哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射され得る。免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類および系統によって異なるので、免疫スケジュールは、使用される動物に合わせて適切に変更され得る。抗原投与は、最初の免疫の後に、何回か繰り返される。追加免疫は、例えば、最初の免疫から４週間後、６週間後、および半年後に行われ得る。
【００３０】
（抗体産生の確認）
免疫後、哺乳動物から採血し、得られた血液をサリバリウス結合活性の存在についてアッセイすることにより、哺乳動物の体内でサリバリウスに対する抗体が産生されていること、および免疫末期にはＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチが起こっていることを確認する（例えば、非特許文献２を参照のこと）。適切なアッセイ方法の例として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法が挙げられる。本発明では、サリバリウスに対して高親和性を有する抗サリバリウスモノクローナル抗体を得ることが望ましい。高親和性のモノクローナル抗体産生細胞を得るためには、抗血清の時点で高い抗体価を示している必要がある。
【００３１】
（ブースト）
サリバリウス結合性抗体の産生を確認した後、脾臓を肥大させるために、ブースト（免疫原の追加注射）を行い得る。ブーストで投与されるサリバリウスの量は特に限定されないが、好ましくは、最初に免疫されるサリバリウスの量の約４〜５倍の量である。
【００３２】
ブーストは、代表的には、サリバリウスと不完全フロイントアジュバントとのエマルジョンを用いて行われる。ただし、最終免疫（細胞融合数日前の免疫原の追加注射）で投与されるサリバリウスとしては、アジュバントを加えず純粋品を用いることが好ましい。投与経路は、皮下、皮内、静脈、または腹腔内それぞれの投与によって、サリバリウスの異なった部位を認識する抗体が得られる可能性があることを考慮して、適宜決定される。
【００３３】
（細胞融合）
最終免疫後、免疫した哺乳動物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞株の細胞と細胞融合する。
【００３４】
融合細胞の増殖能力は、細胞融合時に用いられる骨髄腫由来の細胞株の種類に依存するので、細胞融合には、増殖能力の優れた細胞株を用いることが好ましい。また、骨髄腫由来の細胞株は、融合する脾臓細胞の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。骨髄腫由来の細胞株は、新たに調製してもよいし、市販のものを使用してもよい。マウスの骨髄腫由来の細胞株としては、Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０ ＢＵ．ｌ、Ｐ３／ＮＳ１／１ Ａｇ４ １などが挙げられる。抗体の断片を産生せず、かつ融合細胞の増殖能力が優れたものとなるため、Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３の使用が好ましい。ラット骨髄腫由来の細胞株としては、２１０、ＲＣＹ３．Ａｇ．１．２．３、ＹＢ２／０などが挙げられる。
【００３５】
細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行われる（非特許文献３〜６などを参照のこと）。細胞融合法の例として、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などが挙げられる。細胞毒性も比較的少なく、融合操作も容易で再現性が高いため、ポリエチレングリコール法が好ましい。
【００３６】
得られた融合細胞は、当該分野で公知の条件に従って増殖させ得る。産生される抗体の結合能に基づいて、所望の融合細胞を選択し得る。
【００３７】
（細胞選別およびクローニング）
融合細胞から産生される抗体の結合能は、当該分野で公知の方法に基づいてアッセイされ得る。本発明においては、サリバリウスに高い結合能を有し、他のストレプトコッカス属細菌に対して有意な結合能を有さないか、もしくは低い結合能を有する抗体を産生する融合細胞を得るために、他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能に基づく選別を利用して、目的の細胞株をクローニングする。従って、本明細書中で用語「サリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体」とは、サリバリウスに高い結合能を有し、他のストレプトコッカス属細菌に対して結合能を有さないか、もしくは低い結合能を有する抗体を意味する。サリバリウスに高い結合能を有し、他のストレプトコッカス属細菌に対して「結合能を有さない」抗体は、交叉反応性がない。なお、他のストレプトコッカス属細菌は、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）やストレプトコッカス・クリセツス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ）などのミュータンスグループの細菌、およびストレプトコッカス・サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）や、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓ．ｇｏｒｄｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．Ｓｏｂｒｉｎｕｓ）などを含む。
【００３８】
本明細書において、細菌検査における用語「高い結合能を有する」とは、測定対象とする細菌とその他の細菌とが同濃度で存在する場合に、測定対象とする細菌が、その他の細菌と比較して、有意義な結合能の差異を有する場合である。本明細書では、例えば、ＥＬＩＳＡ測定において吸光度０．５以上の差異があれば、高い結合能を有していると定義する。
【００３９】
抗体の結合能は、抗体産生の確認に関して上述したのと同様に、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイされる。簡便に感度よく抗体を検出し得ることから、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００４０】
融合細胞のクローニングには、当該分野で公知の方法が用いられ得る。クローニングの方法の例としては、限界希釈法、軟寒天法などが挙げられる。操作も容易で数多くの実績があり、再現性が高いため、限界希釈法が好ましい。細胞融合により得られた多くの融合細胞の中から、効率よく有用な細胞を選択するために、細胞選別は、クローニングの初期の段階から行うことが好ましい。
【００４１】
このようにして、望ましい結合能を有する抗体を産生する融合細胞株が最終的に選別される。選別された細胞株は、液体窒素中で半永久的に保存され得る。
【００４２】
（抗体の精製）
上記のようにして選別されたモノクローナル抗体産生細胞株を大量培養することにより、サリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体を大量に産生し得る。モノクローナル抗体産生細胞株の大量培養方法として、インビボおよびインビトロでの培養が挙げられる。インビボでの大量培養の例としては、哺乳動物の腹腔内に融合細胞を注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法が挙げられる。インビトロでの培養では、融合細胞が培地中で培養され、抗体が培地中に産生される。
【００４３】
大量培養により得られた腹水または培養上清から、当該分野で公知の方法を用いて、本発明のモノクローナル抗体を精製し得る。精製のためには、例えば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などが適宜組み合わせて用いられる。本発明の抗体は、通常、約９０％の純度、好ましくは約９５％の純度、より好ましくは約９８％の純度となるように精製される。
【００４４】
（抗体の評価）
任意の２種の抗体の組合せは、サンドイッチ法のために有用である。一方、細菌表面上には、同一のタンパク質が多く存在するため、一種類のモノクローナル抗体を使用してサンドイッチ法をすることも可能である。
【００４５】
本発明においては、サリバリウスを検出するためのサリバリウス検出用キットが提供される。サリバリウス検出用キットは、例えば、抗原抗体結合反応に基づいて水性試料中の抗原を検出する免疫クロマトグラフィーを実施するために提供され得る。サリバリウス検出用キットは、固相に結合された第１の抗体と、移動相に含められて用いられる第２の抗体とを含む。
【００４６】
固相に結合される第１の抗体としては、サリバリウスに高い結合能を有する限り任意の抗体を使用し得、これは、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株作製方法によって産出されるモノクローナル抗体が用いられる。第２の抗体として受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号、あるいは受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号の細胞株により産生されるモノクローナル抗体が好適に用いられる。なお、ポリクローナルは、当該分野で公知の方法により作製され得る。
【００４７】
移動相として用いられる第２の抗体としては、本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株作製方法によって産出されるモノクローナル抗体が用いられる。好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号、あるいは受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号の細胞株により産生されるモノクローナル抗体が使用され得る。第２の抗体は、当該分野で公知の方法によって、任意の標識で標識され得る。標識の例としては、酵素標識、色素標識、磁性標識、放射性標識、色の付いた粒子（金コロイド、ラテックスなど）による標識などが挙げられる。
【００４８】
サリバリウス検出用キットは、１つまたはそれ以上の容器中に上記第１の抗体および上記第の抗体を含み得る。サリバリウス検出用キットはまた、サリバリウスのサンドイッチアッセイにおける、抗体の使用を教示する説明教材を含み得る。サリバリウス検出用キットは、標識の検出のため、または陽性コントロールおよび陰性コントロールを検出するための適切な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液などを含み得る。
【００４９】
上記のように、第１の抗体は、通常、固相に固定化されており、そして第２の抗体は標識されている。サリバリウスの測定にあたっては、まず、第２の抗体を液相でサリバリウスと反応させ、標識−抗体−サリバリウス複合体を形成させる。そして、この複合体を含む反応液を移動相として、固体化された第１の抗体と反応させる。その結果、第１の抗体および第２の抗体は、サリバリウスを介してサンドイッチ状に結合する。従って、サリバリウスが存在する場合にのみ、サリバリウスを介して固相上に標識が固定化される。
【００５０】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号および受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号の細胞株により産生される抗サリバリウスモノクローナル抗体は、サリバリウスに高い結合能を有し、他のストレプトコッカス属細菌には結合能を有しない。
【００５１】
本発明による「抗サリバリウスモノクローナル抗体」には、その結合特性を保持した機能性の断片もまた含まれる。抗体の断片は、免疫グロブリンの重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含み得る。抗体の断片は、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的分離によって生じ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、非特許文献２に記載されたような標準的な方法を用い、ｐＨ３．０〜３．５においてペプシンでタンパク質消化することによってＩｇＧ分子から得ることができる。Ｆａｂ断片は、限定的還元によってＦ（ａｂ’）２断片から、あるいは還元剤の存在下パパイン消化によって全抗体から得ることができる（非特許文献７を参照のこと）。
【００５２】
以上のように、本実施形態に係る抗サリバリウスモノクローナル抗体産生細胞株の作製方法によれば、細胞株のクローニングにおいて、融合細胞から産生される抗体のサリバリウス、他のストレプトコッカス種に対する結合能を検定し、目的の細胞を選別する。そのため、細胞融合の後、初期に存在する多くの細胞から、効率よく有用な細胞を選択し得る。そして、サリバリウスに対する高い親和性を達成しながら、特異性の高い抗体を産生する細胞株を作製し得る。
【００５３】
また、免疫測定法が酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）である場合、抗体の結合能を簡便に感度よく検定し得る。哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３である場合、抗体の断片を産生せず、さらに得られる融合細胞の増殖能力が特に優れているため、短時間に多くの細胞を検定し得る。
【００５４】
免疫する哺乳動物がマウスまたはラットである場合、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよい。免疫する哺乳動物がＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである場合、サリバリウスとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能となる。
本発明のモノクローナル抗体産生細胞株によれば、それを培養することによりサリバリウスに対する高い親和性を有し特異性の高い抗サリバリウスモノクローナル抗体を半永久的に提供し得る。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体である、ＳＳａ−１抗体とＳＳａ−２抗体とを組み合わせてサンドイッチ法に使用すれば、高特異的なサリバリウス検出キットを提供し得る。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞株の作製についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００５７】
＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞
以下の実施例においては、得られた抗血清、培養上清およびモノクローナル抗体の評価は、ＥＬＩＳＡ法により行なった。その操作法を以下に記載する。
【００５８】
（Ａ）抗原（サリバリウス）のコーティング
サリバリウスを、１０8 細胞／ｍＬの濃度に調製した。マイクロプレート（ポリスチレン製高結合型平底＃２５８０、コスター社製）に抗原溶液を１００μＬ／ウェル注入し、室温で飽和水蒸気中に一晩保存した。実験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。
（Ｂ）ブロッキング
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ（Ａｚ：アザイドナトリウム塩）を２００μＬ／ウェル注入し、３０分間室温で放置した。その後、アスピレータで１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを除去した。以降の実験を即日に行わないときは、この状態で、飽和水蒸気中に４℃で保存した。
（Ｃ）抗体の反応
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで種々の濃度に希釈した抗体溶液（抗血清、培養上清、精製抗体等）を５０μＬ／ウェル、および１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを５０μＬ／ウェルで注入した。常温で１時間半放置した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
（Ｄ）第２抗体の反応
０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＭ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したものを５０μＬ／ウェル注入し、常温で３０分放置した。ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
（Ｅ）基質の反応と停止
Ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを１０ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（基質溶液）を１００μＬ／ウェル注入し、室温放置した。約３分後、４Ｎ硫酸を２５μＬ／ウェル注入して反応を停止した。
（Ｆ）測定
マイクロプレートリーダ（東洋ソーダ社製）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
なお、本実施例では免疫測定法として酵素免疫測定法を用いたが、他にＲＩＡ法、蛍光抗体法等を用いてもよい。
【００５９】
（実施例１）
抗サリバリウスポリクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法による結合能、および免疫クロマトグラフィーによる測定感度について評価した。
【００６０】
（免疫）
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【００６１】
免疫原であるサリバリウスを、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて１０8 細胞／ｍＬに調製した。このサリバリウスのＰＢＳ溶液に、同体積のアジュバント（ヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント、和光純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【００６２】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）３匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μＬずつ腹腔内、あるいは皮下に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて１０8 細胞／ｍＬに調製したサリバリウス溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに前回と同じ部位に１００μＬずつ注射した。
【００６３】
その後、免疫開始より４週間後、６週間後、および半年後に、２週間後の免疫と同じ組成、濃度のサリバリウスを含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μＬずつ前回と同じ部位に注射した。２回目の注射の１週間後と５回目の注射の１週間後にそれぞれ採血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【００６４】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相としてＰＢＳ−Ａｚで調製した１０8 細胞／ｍＬ・サリバリウスを、１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第２抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にサリバリウスに結合する抗体が存在することが確認される。
【００６５】
その結果、３匹すべてのマウスにおいて抗サリバリウス抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に、抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、５回目の注射後には、ＩｇＧ／Ｉｇ比が３００以上でありクラススイッチが充分起こっていることが確認された。
【００６６】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった２匹を選び、脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から６ヶ月後、免疫原のサリバリウスを、ＰＢＳを用いて１０8 細胞／ｍＬの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μＬずつ注射した。
【００６７】
最終免疫後３日を経過したマウスのうち１匹の脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【００６８】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート１枚にまいた（２００μＬ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ2インキュベータ（ＣＯ2濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【００６９】
（細胞選別およびクローニング）
１週間後、融合細胞の培養上清を１００μＬ採取した後、融合細胞を含む残りの培養液を４枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍＬの１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。
【００７０】
融合細胞を２４ウェルプレートに継代した４日後、細胞培養上清を１５０μＬ／ウェルずつ採取した。この培養上清と、培養開始後１週間目に採取した培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、サリバリウスに対する結合能を測定した。
【００７１】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したサリバリウスを、１００μＬ／ウェルずつ使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。第２の抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
【００７２】
２回採取した培養上清のＥＬＩＳＡ法結果を合わせて、サリバリウスに対して高い結合能を有する、増殖状態の良い２０ウェルを確認した。第１段階の選択として、これらのウェルの細胞を、すべて４枚の６ウェルプレートに継代し、各ウェルに４ｍＬの１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地を加えた。
【００７３】
第１段階の細胞選別の２日後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法によりサリバリウスに対する結合能を測定した。
【００７４】
固相として、ＰＢＳ−Ａｚで１０8 細胞／ｍＬの濃度に調製したサリバリウスを、１００μＬ／ウェルずつ使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。第２抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
【００７５】
この結果、サリバリウスに対して高い結合能を有したウェルを、１０ウェル選別した。これらのウェルの細胞を、それぞれ、中フラスコ（容量５０ｍＬ）に継代した。培地は１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を４５ｍＬずつ加えた。
【００７６】
第２段階の選択を受けた細胞の継代３日後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法によりサリバリウス、他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能を測定した。
【００７７】
固相として、ＰＢＳ−Ａｚで１０8 細胞／ｍＬの濃度に調製したミュータンスを、１００μＬ／ウェルずつ使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。第２抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ミュータンスに結合する抗体が存在すると、ウェル上に発色する。
【００７８】
同様に、ミュータンス以外の他のストレプトコッカス属細菌（ストレプトコッカス・クリセツス、ストレプトコッカス・ラッタス、ストレプトコッカス・サングイス、ストレプトコッカス・ゴルドニー、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ソブリヌス）に対する結合能を、上記培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００７９】
サリバリウスに対してのみ結合能を示し、ミュータンスを含む上記の他のストレプトコッカス属細菌に対して結合能を示さないウェルを、２ウェル選別した。
【００８０】
上記２ウェルの細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各２枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸腺細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時細胞培養上清について上記のＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。サリバリウスに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍＬの培地中で５×１０5 細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。最終的に、サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対して交叉反応を起こさない株を２株選定した。
【００８１】
サリバリウスに対して高い結合能を示した中の１株を細胞株名：ＳＳＡ−１と命名し、もう１株を細胞株名：ＳＳＡ−２と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１６年２月９日に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号）。
【００８２】
ＳＳＡ−１株の産生する抗体を、ＳＳａ―１抗体と称し、ＳＳＡ−２株の産生する抗体を、ＳＳａ―２抗体と称する。
【００８３】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０7 細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、？８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【００８４】
（抗体の精製）
選択した２株を、それぞれ、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、その上清を遠心分離した。また、選択した２株を、それぞれ、雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して増殖させ、腹水を蓄積させた。蓄積した腹水を採取した。各株の培養上清あるいは腹水を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＳＳａ−１抗体、ＳＳａ−２抗体）を精製した。
【００８５】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／時間）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定した吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【００８６】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＳＳａ−１、ＳＳａ−２）の精製分画は、分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【００８７】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製した２種類のモノクローナル抗体（ＳＳａ−１、ＳＳａ−２）について、サリバリウスの希釈系列を用いて、ＥＬＩＳＡ法と同一条件で抗体評価を行った。
【００８８】
図１は、ＳＳａ−１抗体について、（ａ）サリバリウス（黒丸）、（ｂ）ミュータンス（白丸）に対する結合能をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。図２は、ＳＳａ−２抗体について、（ａ）サリバリウス（黒丸）、（ｂ）ミュータンス（白丸）に対する結合能をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。図１および図２において、縦軸は、波長４９２ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は、各抗体の希釈倍率を表す。
【００８９】
図１および図２に示すように、ＳＳａ−１抗体およびＳＳａ−２抗体では、×１〜×１／１０4 希釈液でサリバリウスに対する結合が観察されたのに対し、ミュータンスに対してはいずれの希釈液についても結合は観察されず、ＳＳａ−１抗体およびＳＳａ−２抗体によって特異的にサリバリウスを検出し得ることが示された。
【００９０】
したがって、本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作成方法によって、サリバリウスに対して結合能を有し、かつ他のミュータンスに対して交叉反応を示さない細胞株を確実に作成し得ることが示された。
【００９１】
（サンドイッチ反応）
ＥＬＩＳＡ法において、ＳＳａ−１抗体をプレートにコートし、サリバリウスを結合させ、酵素ラベルしたＳＳａ−２抗体を反応させた後に余分な抗体を除去し、発色基質を添加してインキュベートしたところ、充分な発色が得られた。つまり、ＳＳａ−１抗体と、ＳＳａ−２抗体との組合せは、免疫クロマトグラフィーなどのサンドイッチ反応を利用した検査方法に有用であることが確認できた。
【００９２】
（免疫クロマトグラフィーにおける検出感度）
常法に従ってＳＳａ−１抗体を濾紙上に固定化し、金コロイド標識したＳＳａ−２抗体を移動相に置いて、免疫クロマトグラフィー装置を作製した。種々の濃度でサリバリウスを含むサンプルをアプライしたところ、この免疫クロマトグラフィー装置の感度は、約１０6 細胞／ｍＬであった。
【００９３】
一般に、健常人の口腔内中のサリバリウスレベルは、約１０8 〜１０10細胞／ｍＬであることが知られている。従って、本発明の抗体を用いて作製された免疫クロマトグラフィー装置は、口腔内中のサリバリウスを検出することが十分に可能である。
【００９４】
一方、ＳＳａ−２抗体を濾紙上に固定化し、金コロイド標識したＳＳａ−１抗体を移動相に置いた場合についても免疫クロマトグラフィー装置を作製した。その結果、上記の場合と比較してより強い呈色が見られた。
【００９５】
（実施例２）
抗サリバリウスポリクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法による結合能、および免疫クロマトグラフィーによる測定感度について評価した。
【００９６】
（免疫）
免疫原であるサリバリウスを、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて１０8 細胞／ｍＬに調製した。このサリバリウスのＰＢＳ溶液に、同体積のアジュバント（ヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント、和光純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。作製したエマルジョンが完全に乳化したことを確認するために、蒸留水に滴下した。エマルジョンが広がらないことを確認し。免疫原の作製を終了した。
【００９７】
２匹のウサギ（種：ＪＷ）に、約１０8 細菌／回・匹の免疫原を含むアジュバントエマルジョンを、ウサギ皮内約２０箇所に注射（注射針サイズ：２６Ｇ）した。針を皮内に刺す際、針を皮膚に平行な方向に進め、針の位置が深すぎないよう注意して実施した。
【００９８】
１回の免疫注射だけでは抗体産生が十分でないため、２週間ごとにさらに３回免疫した。２回目以降の免疫注射は、１回目の免疫注射と同様に、約１０8 細菌／回・匹の免疫原を含むアジュバントエマルジョンをウサギ皮内約２０箇所に注射（注射針サイズ：２６Ｇ）した。さらに、合計４回の免疫後、３回の追加免疫を行った。
【００９９】
（抗体価の測定）
追加免疫の約１週間後、抗体の産生状況を確認するために部分採血を実施した。部分採血は、免役したウサギの外線耳静脈から注射器（テルモ社製、２７Ｇ）を用いて行った。まず、免役したウサギの全身を電灯などで予め温めておき、耳静脈が怒張しているのを見きわめた後、免役したウサギを固定箱に入れ、頭および後部を固定後、耳を親指と小指の間に残りの３本の指を台として押え、怒張した外線静脆に注射器を刺して約５ｍＬ採血した。これを小試験管に受け、切口を指で軽く抑えて止血した。
【０１００】
次に、全採血するために、免役したウサギを採血用固定台に仰向けにして，口輪で頭部を、ひもで四肢を台に固定した。まず、ネンブタール約１ｍＬを、ウサギが眠るまでゆっくり耳朶静脈注射した。麻酔がかかったら前頸部の皮膚をつまんで窓をあけ胸鎖乳頭筋を切断し、気管に沿って無鈎ピンセットで分けた。銀赤色の頸動脈が見えた後、これに沿って走っている迷走神経をピンセットで剥がしてから、約２ｃｍあけて２本のクレンメで頸動脈を挟んだ。クレンメとクレンメの問で頭部側の頸動脈の直径に対して約３分の１をはさみで切った。そして、細いカテーテルを心臓側の頸動脈に挿入し、動脈からカテーテルが抜けないように糸で結んだ。その後、カテーテルの他端を試験管内に入れ、心臓側のクレンメを緩めて血液を逆流させることにより、血液を採取した。
【０１０１】
その後、採取した血液を３７℃の恒温槽に３０分間放置した。血液が凝固したところで無菌棒（たとえばガスバーナーの火炎を数回通したガラス棒）で血餅を管壁から剥がし、４℃で一晩放置後、血清を採取した。採取した血清は、フィルター（ミリポア社製、０．２２μｍ）で無菌的に炉過した。そして、血清の最終濃度が０．０２％になるようにＮａＮ3を添加した後分注し、４℃で保存した。
【０１０２】
（サンドイッチ反応）
ＥＬＩＳＡ法において、抗サリバリウスポリクローナル抗体をプレートにコートしてサリバリウスを結合させ、酵素ラベルしたＳＳＡ−１抗体またはＳＳＡ−２抗体を反応させた後に余分な抗体を除去し、発色基質を添加してインキュベートしたところ、充分な発色が得られた。つまり、抗サリバリウスポリクローナル抗体と、ＳＳａ−１抗体またはＳＳａ−２抗体との組合せは、免疫クロマトグラフィーなどのサンドイッチ反応を利用した検査方法に有用であることが確認できた。
【０１０３】
（免疫クロマトグラフィーにおける検出感度）
抗サリバリウスポリクローナル抗体を定法に従って濾紙上に固定化し、金コロイド標識したＳＳａ−１抗体、あるいはＳＳａ−２抗体を移動相に置いて、免疫クロマトグラフィー装置を作製した。その結果、抗サリバリウスポリクローナル抗体を第１の抗体として用いた場合においても、実施例１と同様に呈色が認められた。したがって、抗サリバリウスポリクローナル抗体を第１の抗体とし、抗サリバリウスポリクローナル抗体を第２の抗体とした組み合わせにおいてもサリバリウスを検出可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキット等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ＥＬＩＳＡ法により測定された、抗サリバリウスモノクローナル抗体（ＳＳａ−１抗体）のサリバリウスおよびミュータンスに対する結合能を示すグラフ
【図２】ＥＬＩＳＡ法により測定された、抗サリバリウスモノクローナル抗体（ＳＳａ−２抗体）のサリバリウスおよびミュータンスに対する結合能を示すグラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サリバリウス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、以下単にサリバリウスと記す）に特異的なモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、う蝕あるいは歯周病を調べる際には、その原因菌と思われる細菌を培養することにより、原因菌の存在を半定量的に調べ、診断している。しかしながら、う蝕や歯周病等の感染症の原因となる菌の種類が多いため、感染症への罹患の有無を効率よく調べることは困難である。
【０００３】
口腔内の感染症の有無を検査するために、口腔内に常在する細菌の存在量を測定する方法がある。人の口腔内に常在する細菌として、例えばサリバリウスがある。サリバリウスは、通常、口腔内に無害な状態で常在している。口腔内が正常な状態にある場合、歯肉間にはサリバリウス菌しか存在していない。しかし、例えば、歯周病に感染し、歯周病原因菌が増殖すると、歯周病原因菌が増殖した部位におけるサリバリウス菌の存在量が著しく減少する。したがって、口腔内におけるサリバリウス菌の存在量を測定することにより、間接的な感染症への罹患の有無を判定することができる。
【０００４】
サリバリウスの存在量を測定するために、一般的には、培養法を利用してサリバリウスの存在量を測定する方法が用いられている。同方法では、サリバリウスを他のミュータンスグループの細菌（例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）やストレプトコッカス・クリセツス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ）など）と共に生育し、生育したミュータンスグループの細菌集団の中に存在するサリバリウスを同定および検出する。
【０００５】
非特許文献１は、培養法を利用したサリバリウスの存在量の測定方法について記載している。非特許文献１に記載の測定法によりサリバリウスの存在量を測定するために、例えば、アピテスト（アピストレップ２０；日本ビオメリューバイテック社製）を利用することができる。酵素活性や糖発酵能をテストするための基質が入っている２０個のカップそれぞれに菌を接種し、４時間または２４時間培養した後に、添加した試薬や指示薬により呈色した色を判定表に従って読み取り、陽性率表または７桁のアピプロフアイルインデックスによって同定する。
【０００６】
このように、非特許文献１に記載の従来の検出方法によれば、サリバリウスを検出することができる。
【非特許文献１】武笠英彦ら、「う蝕細菌の分子生物学一研究の成果と展望」、クインテッセンス、１９９７年４月、ｐ．７１−７２
【非特許文献２】ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「アンティボディーズ：ア ラボラトリー マニュアル（ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」、コールド・スプリング・アバー・ラボラトリー（ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ）、米国、１９８８年
【非特許文献３】コーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）およびミルシュテイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、「カルチャーズ オブ フューズド セルズ シクリーティング アンチボディー オブ プレディファインド スペシフィシティ（ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、英国、１９７５年、ｐ．２５６−４９５
【非特許文献４】コズボール（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、「ザ プロダクション オブ モノクローナル アンチボディーズ フロム ヒューマン リンフォサイツ（Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）」、イミュノロジー トゥデイ（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ）、１９８３年、ｐ．４−７２
【非特許文献５】コート（Ｃｏｔｅ）ら、「ジェネレーション オブ ヒューマン モノクローナル アンチボディーズ リアクティブ ウィズ セルラー アンチジェンズ（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）」、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイティド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、米国、１９８３年、ｐ．８０−２０２６
【非特許文献６】コール（Ｃｏｌｅ）ら、「モノクローナル アンティボディーズ アンド キャンサー セラピー（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ）」、アラン・アール・リス（Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．）、米国、１９８５年、ｐ．７７？９６
【非特許文献７】ポール（Ｐａｕｌ）・Ｗ編、「ファンダメンタル イミュノロジー（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」、第２版、レイバン プレス（Ｒａｖａｎ Ｐｒｅｓｓ）、米国、１９８９年、第７章
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に記載の従来の検出方法では、培養法を用いるため、菌の検出に時間がかかり、また、操作が煩雑であるという問題がある。また、同検出方法では、サリバリウスを検出することはできるものの、定量することが容易ではないという問題がある。したがって、サリバリウスの定量をより正確かつ簡便に行うことが望まれているが、現在のところそのような方法は提案されていない。
【０００８】
サリバリウスを容易に検出することができ、かつ定量的に分析することができる方法として、サリバリウスに対して特異的に結合する抗体を用い、サンドイッチ法によりサリバリウスを定量することが考えられる。サンドイッチ法は、目標とする細菌に特異的に結合する抗体を用い、固相に結合させた抗体と標的の細菌とを反応させ、さらに、標的の細菌に標識した抗体を反応させることにより、標的の細菌を定量することができる方法である。
【０００９】
サリバリウスを介してサンドイッチ状に結合できる抗体のペアを得ることは比較的容易である。しかし、モノクローナル抗体を用いる場合、抗体が均一であるため、このモノクローナル抗体の交叉反応性が非常に重要となる。サリバリウスに対するモノクローナル抗体の中には、サリバリウスだけでなく、他のストレプトコッカス属細菌に対しても高い結合能を有する抗体が存在し得る。ここで、他のストレプトコッカス属細菌とは、上記のミュータンスグループの他に、ストレプトコッカス・サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）や、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓ．ｇｏｒｄｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．Ｓｏｂｒｉｎｕｓ）などを含む。これらの他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が高い抗体をサンドイッチ法に用いた場合、他のサリバリウスの正確な定量に支障をきたす恐れがある。従って、他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を用いる必要があるが、従来、サリバリウスに対して特異的に結合し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗体は得られていない。
【００１０】
それゆえに、本発明の目的は、サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、サリバリウスに特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株の作製方法であって、サリバリウスで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合して、融合細胞を得る工程；およびサリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株を該融合細胞の中からクローニングする工程であって、該融合細胞から産生される抗体を、サリバリウスおよびその他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能について免疫測定法により検定する工程を包含する。
【００１２】
好ましくは、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞は、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３株の細胞であるとよい。
【００１３】
好ましくは、免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）であるとよい。
【００１４】
また、免疫した哺乳動物が、マウスまたはラットであってもよい。一例として、免疫した哺乳動物は、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである。
【００１５】
また、本発明は、抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株であって、上記の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株の作製方法により作製される。
【００１６】
好ましくは、細胞株は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号であるとよい。また、好ましくは、細胞株は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号であるとよい。
【００１７】
また、本発明は、上記のモノクローナル抗体産出細胞株により産出され、その他のストレプトコッカス属細菌と比べてサリバリウスに対して高い結合能を有する、抗サリバリウスモノクローナル抗体である。
【００１８】
好ましくは、抗サリバリウスモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号のモノクローナル抗体産出細胞株により産出されるとよい。また、好ましくは、抗サリバリウスモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号のモノクローナル抗体産出細胞株により産出されるとよい。
【００１９】
また、本発明は、サリバリウスを検出するためのキットである。キットは、固相に結合された第１の抗体、および第２の抗体を含み、第１の抗体および第２の抗体のうち少なくとも一方は、本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出された抗サリバリウスモノクローナル抗体であり、第２の抗体は標識されている。好ましくは、上記本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出された抗サリバリウスモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号のモノクローナル抗体産出細胞株により産出された抗サリバリウスモノクローナル抗体、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号のモノクローナル抗体産出細胞株により産出された抗サリバリウスモノクローナル抗体であるとよい。
【００２０】
また、第１の抗体はポリクローナル抗体であってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明について、より具体的に説明する。本発明においては、特に指示のない限り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの手法は、市販の酵素、キット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。
【００２３】
本発明に係る抗サリバリウスモノクローナル抗体産生細胞株の作製を、以下作製手順に沿って説明する。
【００２４】
（免疫）
まず、哺乳動物をサリバリウスで免疫することによって、動物体内で抗体産生細胞を調製する。
【００２５】
「哺乳動物」の例として、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモットが挙げられる。哺乳動物は、好ましくはマウスおよびラットであり、より好ましくはマウスである。マウスの例として、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統のマウスが挙げられる。特に、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、免疫後に血清中に高い抗体力価を示すので、サリバリウスとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能である。血中抗体力価が、特異的なハイブリドーマの出来易さと関係していることは公知である。また、細胞株の確立後の腹水による抗体大量作製においては、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが一般によく使用される。以上により、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、サリバリウスの免疫に好ましい例である。実験動物の齢は、特に限定されないが、代表的には約４週齢〜約１２週齢であり、好ましくは約６〜約１０週齢、より好ましくは約７週齢のマウスまたはラットである。
【００２６】
免疫に用いられるサリバリウスは、人の口腔内から単離してもよいし、市販（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション、アメリカ合衆国 メリーランド ２０８５２、ロックビル、パークローン ドライブ １２３０１から入手し得る）のものを用いてもよい。人の口腔内からは、定法に従い、ＭＳ寒天培地上でムコイド型のコロニーとして単離され得る。
【００２７】
免疫の前に、サリバリウスは、免疫応答を増強させるためにアジュバントと混合され得る。アジュバントの例としては、油中水型乳剤（例えば、不完全フロイントアジュバント）、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバント、粉末ベントナイト、およびタピオカアジュバントの他に、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓなどの菌体、細胞壁およびトレハロースダイコレート（ＴＤＭ）などの菌体成分；グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖体（ＬＰＳ）およびリピドＡ画分；β グルカン（多糖体）；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；ベスタチン；レバミゾールなどの合成化合物；胸腺ホルモン、胸腺ホルモン液性因子およびタフトシンなどの生体成分由来のタンパク質またはペプチド性物質；ならびにそれらの混合物（例えば、完全フロイントアジュバント）などが挙げられる。
【００２８】
これらのアジュバントは、投与経路、投与量、投与時期などに依存して免疫応答の増強または抑制に効果を示す。さらにアジュバントの種類によって、抗原に対する血中抗体産生、細胞性免疫の誘導、免疫グロブリンのクラスなどに差が認められる。それゆえ、目的とする免疫応答に応じて、アジュバントを適切に選択することが好ましい。選択されたアジュバントの取扱い、例えばサリバリウスとの混合方法などは当該分野で公知である。
【００２９】
哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法に従って行われる。例えば、抗原であるサリバリウスは、哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射され得る。免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類および系統によって異なるので、免疫スケジュールは、使用される動物に合わせて適切に変更され得る。抗原投与は、最初の免疫の後に、何回か繰り返される。追加免疫は、例えば、最初の免疫から４週間後、６週間後、および半年後に行われ得る。
【００３０】
（抗体産生の確認）
免疫後、哺乳動物から採血し、得られた血液をサリバリウス結合活性の存在についてアッセイすることにより、哺乳動物の体内でサリバリウスに対する抗体が産生されていること、および免疫末期にはＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチが起こっていることを確認する（例えば、非特許文献２を参照のこと）。適切なアッセイ方法の例として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法が挙げられる。本発明では、サリバリウスに対して高親和性を有する抗サリバリウスモノクローナル抗体を得ることが望ましい。高親和性のモノクローナル抗体産生細胞を得るためには、抗血清の時点で高い抗体価を示している必要がある。
【００３１】
（ブースト）
サリバリウス結合性抗体の産生を確認した後、脾臓を肥大させるために、ブースト（免疫原の追加注射）を行い得る。ブーストで投与されるサリバリウスの量は特に限定されないが、好ましくは、最初に免疫されるサリバリウスの量の約４〜５倍の量である。
【００３２】
ブーストは、代表的には、サリバリウスと不完全フロイントアジュバントとのエマルジョンを用いて行われる。ただし、最終免疫（細胞融合数日前の免疫原の追加注射）で投与されるサリバリウスとしては、アジュバントを加えず純粋品を用いることが好ましい。投与経路は、皮下、皮内、静脈、または腹腔内それぞれの投与によって、サリバリウスの異なった部位を認識する抗体が得られる可能性があることを考慮して、適宜決定される。
【００３３】
（細胞融合）
最終免疫後、免疫した哺乳動物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞株の細胞と細胞融合する。
【００３４】
融合細胞の増殖能力は、細胞融合時に用いられる骨髄腫由来の細胞株の種類に依存するので、細胞融合には、増殖能力の優れた細胞株を用いることが好ましい。また、骨髄腫由来の細胞株は、融合する脾臓細胞の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。骨髄腫由来の細胞株は、新たに調製してもよいし、市販のものを使用してもよい。マウスの骨髄腫由来の細胞株としては、Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０ ＢＵ．ｌ、Ｐ３／ＮＳ１／１ Ａｇ４ １などが挙げられる。抗体の断片を産生せず、かつ融合細胞の増殖能力が優れたものとなるため、Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３の使用が好ましい。ラット骨髄腫由来の細胞株としては、２１０、ＲＣＹ３．Ａｇ．１．２．３、ＹＢ２／０などが挙げられる。
【００３５】
細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行われる（非特許文献３〜６などを参照のこと）。細胞融合法の例として、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などが挙げられる。細胞毒性も比較的少なく、融合操作も容易で再現性が高いため、ポリエチレングリコール法が好ましい。
【００３６】
得られた融合細胞は、当該分野で公知の条件に従って増殖させ得る。産生される抗体の結合能に基づいて、所望の融合細胞を選択し得る。
【００３７】
（細胞選別およびクローニング）
融合細胞から産生される抗体の結合能は、当該分野で公知の方法に基づいてアッセイされ得る。本発明においては、サリバリウスに高い結合能を有し、他のストレプトコッカス属細菌に対して有意な結合能を有さないか、もしくは低い結合能を有する抗体を産生する融合細胞を得るために、他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能に基づく選別を利用して、目的の細胞株をクローニングする。従って、本明細書中で用語「サリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体」とは、サリバリウスに高い結合能を有し、他のストレプトコッカス属細菌に対して結合能を有さないか、もしくは低い結合能を有する抗体を意味する。サリバリウスに高い結合能を有し、他のストレプトコッカス属細菌に対して「結合能を有さない」抗体は、交叉反応性がない。なお、他のストレプトコッカス属細菌は、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）やストレプトコッカス・クリセツス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ）などのミュータンスグループの細菌、およびストレプトコッカス・サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）や、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓ．ｇｏｒｄｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．Ｓｏｂｒｉｎｕｓ）などを含む。
【００３８】
本明細書において、細菌検査における用語「高い結合能を有する」とは、測定対象とする細菌とその他の細菌とが同濃度で存在する場合に、測定対象とする細菌が、その他の細菌と比較して、有意義な結合能の差異を有する場合である。本明細書では、例えば、ＥＬＩＳＡ測定において吸光度０．５以上の差異があれば、高い結合能を有していると定義する。
【００３９】
抗体の結合能は、抗体産生の確認に関して上述したのと同様に、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイされる。簡便に感度よく抗体を検出し得ることから、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００４０】
融合細胞のクローニングには、当該分野で公知の方法が用いられ得る。クローニングの方法の例としては、限界希釈法、軟寒天法などが挙げられる。操作も容易で数多くの実績があり、再現性が高いため、限界希釈法が好ましい。細胞融合により得られた多くの融合細胞の中から、効率よく有用な細胞を選択するために、細胞選別は、クローニングの初期の段階から行うことが好ましい。
【００４１】
このようにして、望ましい結合能を有する抗体を産生する融合細胞株が最終的に選別される。選別された細胞株は、液体窒素中で半永久的に保存され得る。
【００４２】
（抗体の精製）
上記のようにして選別されたモノクローナル抗体産生細胞株を大量培養することにより、サリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体を大量に産生し得る。モノクローナル抗体産生細胞株の大量培養方法として、インビボおよびインビトロでの培養が挙げられる。インビボでの大量培養の例としては、哺乳動物の腹腔内に融合細胞を注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法が挙げられる。インビトロでの培養では、融合細胞が培地中で培養され、抗体が培地中に産生される。
【００４３】
大量培養により得られた腹水または培養上清から、当該分野で公知の方法を用いて、本発明のモノクローナル抗体を精製し得る。精製のためには、例えば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などが適宜組み合わせて用いられる。本発明の抗体は、通常、約９０％の純度、好ましくは約９５％の純度、より好ましくは約９８％の純度となるように精製される。
【００４４】
（抗体の評価）
任意の２種の抗体の組合せは、サンドイッチ法のために有用である。一方、細菌表面上には、同一のタンパク質が多く存在するため、一種類のモノクローナル抗体を使用してサンドイッチ法をすることも可能である。
【００４５】
本発明においては、サリバリウスを検出するためのサリバリウス検出用キットが提供される。サリバリウス検出用キットは、例えば、抗原抗体結合反応に基づいて水性試料中の抗原を検出する免疫クロマトグラフィーを実施するために提供され得る。サリバリウス検出用キットは、固相に結合された第１の抗体と、移動相に含められて用いられる第２の抗体とを含む。
【００４６】
固相に結合される第１の抗体としては、サリバリウスに高い結合能を有する限り任意の抗体を使用し得、これは、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株作製方法によって産出されるモノクローナル抗体が用いられる。第２の抗体として受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号、あるいは受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号の細胞株により産生されるモノクローナル抗体が好適に用いられる。なお、ポリクローナルは、当該分野で公知の方法により作製され得る。
【００４７】
移動相として用いられる第２の抗体としては、本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株作製方法によって産出されるモノクローナル抗体が用いられる。好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号、あるいは受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号の細胞株により産生されるモノクローナル抗体が使用され得る。第２の抗体は、当該分野で公知の方法によって、任意の標識で標識され得る。標識の例としては、酵素標識、色素標識、磁性標識、放射性標識、色の付いた粒子（金コロイド、ラテックスなど）による標識などが挙げられる。
【００４８】
サリバリウス検出用キットは、１つまたはそれ以上の容器中に上記第１の抗体および上記第の抗体を含み得る。サリバリウス検出用キットはまた、サリバリウスのサンドイッチアッセイにおける、抗体の使用を教示する説明教材を含み得る。サリバリウス検出用キットは、標識の検出のため、または陽性コントロールおよび陰性コントロールを検出するための適切な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液などを含み得る。
【００４９】
上記のように、第１の抗体は、通常、固相に固定化されており、そして第２の抗体は標識されている。サリバリウスの測定にあたっては、まず、第２の抗体を液相でサリバリウスと反応させ、標識−抗体−サリバリウス複合体を形成させる。そして、この複合体を含む反応液を移動相として、固体化された第１の抗体と反応させる。その結果、第１の抗体および第２の抗体は、サリバリウスを介してサンドイッチ状に結合する。従って、サリバリウスが存在する場合にのみ、サリバリウスを介して固相上に標識が固定化される。
【００５０】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号および受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号の細胞株により産生される抗サリバリウスモノクローナル抗体は、サリバリウスに高い結合能を有し、他のストレプトコッカス属細菌には結合能を有しない。
【００５１】
本発明による「抗サリバリウスモノクローナル抗体」には、その結合特性を保持した機能性の断片もまた含まれる。抗体の断片は、免疫グロブリンの重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含み得る。抗体の断片は、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的分離によって生じ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、非特許文献２に記載されたような標準的な方法を用い、ｐＨ３．０〜３．５においてペプシンでタンパク質消化することによってＩｇＧ分子から得ることができる。Ｆａｂ断片は、限定的還元によってＦ（ａｂ’）２断片から、あるいは還元剤の存在下パパイン消化によって全抗体から得ることができる（非特許文献７を参照のこと）。
【００５２】
以上のように、本実施形態に係る抗サリバリウスモノクローナル抗体産生細胞株の作製方法によれば、細胞株のクローニングにおいて、融合細胞から産生される抗体のサリバリウス、他のストレプトコッカス種に対する結合能を検定し、目的の細胞を選別する。そのため、細胞融合の後、初期に存在する多くの細胞から、効率よく有用な細胞を選択し得る。そして、サリバリウスに対する高い親和性を達成しながら、特異性の高い抗体を産生する細胞株を作製し得る。
【００５３】
また、免疫測定法が酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）である場合、抗体の結合能を簡便に感度よく検定し得る。哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３である場合、抗体の断片を産生せず、さらに得られる融合細胞の増殖能力が特に優れているため、短時間に多くの細胞を検定し得る。
【００５４】
免疫する哺乳動物がマウスまたはラットである場合、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよい。免疫する哺乳動物がＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである場合、サリバリウスとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体を得ることが可能となる。
本発明のモノクローナル抗体産生細胞株によれば、それを培養することによりサリバリウスに対する高い親和性を有し特異性の高い抗サリバリウスモノクローナル抗体を半永久的に提供し得る。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体である、ＳＳａ−１抗体とＳＳａ−２抗体とを組み合わせてサンドイッチ法に使用すれば、高特異的なサリバリウス検出キットを提供し得る。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞株の作製についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００５７】
＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞
以下の実施例においては、得られた抗血清、培養上清およびモノクローナル抗体の評価は、ＥＬＩＳＡ法により行なった。その操作法を以下に記載する。
【００５８】
（Ａ）抗原（サリバリウス）のコーティング
サリバリウスを、１０8 細胞／ｍＬの濃度に調製した。マイクロプレート（ポリスチレン製高結合型平底＃２５８０、コスター社製）に抗原溶液を１００μＬ／ウェル注入し、室温で飽和水蒸気中に一晩保存した。実験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。
（Ｂ）ブロッキング
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ（Ａｚ：アザイドナトリウム塩）を２００μＬ／ウェル注入し、３０分間室温で放置した。その後、アスピレータで１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを除去した。以降の実験を即日に行わないときは、この状態で、飽和水蒸気中に４℃で保存した。
（Ｃ）抗体の反応
１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで種々の濃度に希釈した抗体溶液（抗血清、培養上清、精製抗体等）を５０μＬ／ウェル、および１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを５０μＬ／ウェルで注入した。常温で１時間半放置した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
（Ｄ）第２抗体の反応
０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＭ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解したものを５０μＬ／ウェル注入し、常温で３０分放置した。ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
（Ｅ）基質の反応と停止
Ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを１０ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（基質溶液）を１００μＬ／ウェル注入し、室温放置した。約３分後、４Ｎ硫酸を２５μＬ／ウェル注入して反応を停止した。
（Ｆ）測定
マイクロプレートリーダ（東洋ソーダ社製）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
なお、本実施例では免疫測定法として酵素免疫測定法を用いたが、他にＲＩＡ法、蛍光抗体法等を用いてもよい。
【００５９】
（実施例１）
抗サリバリウスポリクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法による結合能、および免疫クロマトグラフィーによる測定感度について評価した。
【００６０】
（免疫）
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養においてはＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用した。
【００６１】
免疫原であるサリバリウスを、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて１０8 細胞／ｍＬに調製した。このサリバリウスのＰＢＳ溶液に、同体積のアジュバント（ヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント、和光純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【００６２】
生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）３匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μＬずつ腹腔内、あるいは皮下に注射した。２週間後、ＰＢＳを用いて１０8 細胞／ｍＬに調製したサリバリウス溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ／Ｃマウスに前回と同じ部位に１００μＬずつ注射した。
【００６３】
その後、免疫開始より４週間後、６週間後、および半年後に、２週間後の免疫と同じ組成、濃度のサリバリウスを含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μＬずつ前回と同じ部位に注射した。２回目の注射の１週間後と５回目の注射の１週間後にそれぞれ採血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【００６４】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相としてＰＢＳ−Ａｚで調製した１０8 細胞／ｍＬ・サリバリウスを、１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第２抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にサリバリウスに結合する抗体が存在することが確認される。
【００６５】
その結果、３匹すべてのマウスにおいて抗サリバリウス抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に、抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、５回目の注射後には、ＩｇＧ／Ｉｇ比が３００以上でありクラススイッチが充分起こっていることが確認された。
【００６６】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった２匹を選び、脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から６ヶ月後、免疫原のサリバリウスを、ＰＢＳを用いて１０8 細胞／ｍＬの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μＬずつ注射した。
【００６７】
最終免疫後３日を経過したマウスのうち１匹の脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【００６８】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート１枚にまいた（２００μＬ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ2インキュベータ（ＣＯ2濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【００６９】
（細胞選別およびクローニング）
１週間後、融合細胞の培養上清を１００μＬ採取した後、融合細胞を含む残りの培養液を４枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍＬの１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。
【００７０】
融合細胞を２４ウェルプレートに継代した４日後、細胞培養上清を１５０μＬ／ウェルずつ採取した。この培養上清と、培養開始後１週間目に採取した培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、サリバリウスに対する結合能を測定した。
【００７１】
固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで５μｇ／ｍＬの濃度に調製したサリバリウスを、１００μＬ／ウェルずつ使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。第２の抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
【００７２】
２回採取した培養上清のＥＬＩＳＡ法結果を合わせて、サリバリウスに対して高い結合能を有する、増殖状態の良い２０ウェルを確認した。第１段階の選択として、これらのウェルの細胞を、すべて４枚の６ウェルプレートに継代し、各ウェルに４ｍＬの１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地を加えた。
【００７３】
第１段階の細胞選別の２日後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法によりサリバリウスに対する結合能を測定した。
【００７４】
固相として、ＰＢＳ−Ａｚで１０8 細胞／ｍＬの濃度に調製したサリバリウスを、１００μＬ／ウェルずつ使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。第２抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
【００７５】
この結果、サリバリウスに対して高い結合能を有したウェルを、１０ウェル選別した。これらのウェルの細胞を、それぞれ、中フラスコ（容量５０ｍＬ）に継代した。培地は１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を４５ｍＬずつ加えた。
【００７６】
第２段階の選択を受けた細胞の継代３日後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法によりサリバリウス、他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能を測定した。
【００７７】
固相として、ＰＢＳ−Ａｚで１０8 細胞／ｍＬの濃度に調製したミュータンスを、１００μＬ／ウェルずつ使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。第２抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ミュータンスに結合する抗体が存在すると、ウェル上に発色する。
【００７８】
同様に、ミュータンス以外の他のストレプトコッカス属細菌（ストレプトコッカス・クリセツス、ストレプトコッカス・ラッタス、ストレプトコッカス・サングイス、ストレプトコッカス・ゴルドニー、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ソブリヌス）に対する結合能を、上記培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００７９】
サリバリウスに対してのみ結合能を示し、ミュータンスを含む上記の他のストレプトコッカス属細菌に対して結合能を示さないウェルを、２ウェル選別した。
【００８０】
上記２ウェルの細胞について、１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各２枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸腺細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時細胞培養上清について上記のＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。サリバリウスに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍＬの培地中で５×１０5 細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。最終的に、サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対して交叉反応を起こさない株を２株選定した。
【００８１】
サリバリウスに対して高い結合能を示した中の１株を細胞株名：ＳＳＡ−１と命名し、もう１株を細胞株名：ＳＳＡ−２と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１６年２月９日に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号）。
【００８２】
ＳＳＡ−１株の産生する抗体を、ＳＳａ―１抗体と称し、ＳＳＡ−２株の産生する抗体を、ＳＳａ―２抗体と称する。
【００８３】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０7 細胞／ｍＬの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、？８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【００８４】
（抗体の精製）
選択した２株を、それぞれ、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、その上清を遠心分離した。また、選択した２株を、それぞれ、雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して増殖させ、腹水を蓄積させた。蓄積した腹水を採取した。各株の培養上清あるいは腹水を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（ＳＳａ−１抗体、ＳＳａ−２抗体）を精製した。
【００８５】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ グリシン・３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／時間）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定した吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【００８６】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による標準タンパク質との比較から、これらのモノクローナル抗体（ＳＳａ−１、ＳＳａ−２）の精製分画は、分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動上で、不純物の混入は検出限界以下であった。
【００８７】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製した２種類のモノクローナル抗体（ＳＳａ−１、ＳＳａ−２）について、サリバリウスの希釈系列を用いて、ＥＬＩＳＡ法と同一条件で抗体評価を行った。
【００８８】
図１は、ＳＳａ−１抗体について、（ａ）サリバリウス（黒丸）、（ｂ）ミュータンス（白丸）に対する結合能をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。図２は、ＳＳａ−２抗体について、（ａ）サリバリウス（黒丸）、（ｂ）ミュータンス（白丸）に対する結合能をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。図１および図２において、縦軸は、波長４９２ｎｍにおける吸光度を表し、横軸は、各抗体の希釈倍率を表す。
【００８９】
図１および図２に示すように、ＳＳａ−１抗体およびＳＳａ−２抗体では、×１〜×１／１０4 希釈液でサリバリウスに対する結合が観察されたのに対し、ミュータンスに対してはいずれの希釈液についても結合は観察されず、ＳＳａ−１抗体およびＳＳａ−２抗体によって特異的にサリバリウスを検出し得ることが示された。
【００９０】
したがって、本発明の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作成方法によって、サリバリウスに対して結合能を有し、かつ他のミュータンスに対して交叉反応を示さない細胞株を確実に作成し得ることが示された。
【００９１】
（サンドイッチ反応）
ＥＬＩＳＡ法において、ＳＳａ−１抗体をプレートにコートし、サリバリウスを結合させ、酵素ラベルしたＳＳａ−２抗体を反応させた後に余分な抗体を除去し、発色基質を添加してインキュベートしたところ、充分な発色が得られた。つまり、ＳＳａ−１抗体と、ＳＳａ−２抗体との組合せは、免疫クロマトグラフィーなどのサンドイッチ反応を利用した検査方法に有用であることが確認できた。
【００９２】
（免疫クロマトグラフィーにおける検出感度）
常法に従ってＳＳａ−１抗体を濾紙上に固定化し、金コロイド標識したＳＳａ−２抗体を移動相に置いて、免疫クロマトグラフィー装置を作製した。種々の濃度でサリバリウスを含むサンプルをアプライしたところ、この免疫クロマトグラフィー装置の感度は、約１０6 細胞／ｍＬであった。
【００９３】
一般に、健常人の口腔内中のサリバリウスレベルは、約１０8 〜１０10細胞／ｍＬであることが知られている。従って、本発明の抗体を用いて作製された免疫クロマトグラフィー装置は、口腔内中のサリバリウスを検出することが十分に可能である。
【００９４】
一方、ＳＳａ−２抗体を濾紙上に固定化し、金コロイド標識したＳＳａ−１抗体を移動相に置いた場合についても免疫クロマトグラフィー装置を作製した。その結果、上記の場合と比較してより強い呈色が見られた。
【００９５】
（実施例２）
抗サリバリウスポリクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法による結合能、および免疫クロマトグラフィーによる測定感度について評価した。
【００９６】
（免疫）
免疫原であるサリバリウスを、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて１０8 細胞／ｍＬに調製した。このサリバリウスのＰＢＳ溶液に、同体積のアジュバント（ヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント、和光純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。作製したエマルジョンが完全に乳化したことを確認するために、蒸留水に滴下した。エマルジョンが広がらないことを確認し。免疫原の作製を終了した。
【００９７】
２匹のウサギ（種：ＪＷ）に、約１０8 細菌／回・匹の免疫原を含むアジュバントエマルジョンを、ウサギ皮内約２０箇所に注射（注射針サイズ：２６Ｇ）した。針を皮内に刺す際、針を皮膚に平行な方向に進め、針の位置が深すぎないよう注意して実施した。
【００９８】
１回の免疫注射だけでは抗体産生が十分でないため、２週間ごとにさらに３回免疫した。２回目以降の免疫注射は、１回目の免疫注射と同様に、約１０8 細菌／回・匹の免疫原を含むアジュバントエマルジョンをウサギ皮内約２０箇所に注射（注射針サイズ：２６Ｇ）した。さらに、合計４回の免疫後、３回の追加免疫を行った。
【００９９】
（抗体価の測定）
追加免疫の約１週間後、抗体の産生状況を確認するために部分採血を実施した。部分採血は、免役したウサギの外線耳静脈から注射器（テルモ社製、２７Ｇ）を用いて行った。まず、免役したウサギの全身を電灯などで予め温めておき、耳静脈が怒張しているのを見きわめた後、免役したウサギを固定箱に入れ、頭および後部を固定後、耳を親指と小指の間に残りの３本の指を台として押え、怒張した外線静脆に注射器を刺して約５ｍＬ採血した。これを小試験管に受け、切口を指で軽く抑えて止血した。
【０１００】
次に、全採血するために、免役したウサギを採血用固定台に仰向けにして，口輪で頭部を、ひもで四肢を台に固定した。まず、ネンブタール約１ｍＬを、ウサギが眠るまでゆっくり耳朶静脈注射した。麻酔がかかったら前頸部の皮膚をつまんで窓をあけ胸鎖乳頭筋を切断し、気管に沿って無鈎ピンセットで分けた。銀赤色の頸動脈が見えた後、これに沿って走っている迷走神経をピンセットで剥がしてから、約２ｃｍあけて２本のクレンメで頸動脈を挟んだ。クレンメとクレンメの問で頭部側の頸動脈の直径に対して約３分の１をはさみで切った。そして、細いカテーテルを心臓側の頸動脈に挿入し、動脈からカテーテルが抜けないように糸で結んだ。その後、カテーテルの他端を試験管内に入れ、心臓側のクレンメを緩めて血液を逆流させることにより、血液を採取した。
【０１０１】
その後、採取した血液を３７℃の恒温槽に３０分間放置した。血液が凝固したところで無菌棒（たとえばガスバーナーの火炎を数回通したガラス棒）で血餅を管壁から剥がし、４℃で一晩放置後、血清を採取した。採取した血清は、フィルター（ミリポア社製、０．２２μｍ）で無菌的に炉過した。そして、血清の最終濃度が０．０２％になるようにＮａＮ3を添加した後分注し、４℃で保存した。
【０１０２】
（サンドイッチ反応）
ＥＬＩＳＡ法において、抗サリバリウスポリクローナル抗体をプレートにコートしてサリバリウスを結合させ、酵素ラベルしたＳＳＡ−１抗体またはＳＳＡ−２抗体を反応させた後に余分な抗体を除去し、発色基質を添加してインキュベートしたところ、充分な発色が得られた。つまり、抗サリバリウスポリクローナル抗体と、ＳＳａ−１抗体またはＳＳａ−２抗体との組合せは、免疫クロマトグラフィーなどのサンドイッチ反応を利用した検査方法に有用であることが確認できた。
【０１０３】
（免疫クロマトグラフィーにおける検出感度）
抗サリバリウスポリクローナル抗体を定法に従って濾紙上に固定化し、金コロイド標識したＳＳａ−１抗体、あるいはＳＳａ−２抗体を移動相に置いて、免疫クロマトグラフィー装置を作製した。その結果、抗サリバリウスポリクローナル抗体を第１の抗体として用いた場合においても、実施例１と同様に呈色が認められた。したがって、抗サリバリウスポリクローナル抗体を第１の抗体とし、抗サリバリウスポリクローナル抗体を第２の抗体とした組み合わせにおいてもサリバリウスを検出可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、サリバリウスに対して高い結合能を有し、かつ他のストレプトコッカス属細菌に対する交叉反応性が低い抗サリバリウスモノクローナル抗体を産出する細胞株、その製造方法、それにより産出されたモノクローナル抗体、およびそれにより産出されたモノクローナル抗体を含むキット等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ＥＬＩＳＡ法により測定された、抗サリバリウスモノクローナル抗体（ＳＳａ−１抗体）のサリバリウスおよびミュータンスに対する結合能を示すグラフ
【図２】ＥＬＩＳＡ法により測定された、抗サリバリウスモノクローナル抗体（ＳＳａ−２抗体）のサリバリウスおよびミュータンスに対する結合能を示すグラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリバリウスに特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株の作製方法であって、
サリバリウスで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合して、融合細胞を得る工程；および
サリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株を前記融合細胞の中からクローニングする工程であって、該融合細胞から産生される抗体を、サリバリウスおよびその他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能について免疫測定法により検定する工程を包含する、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項２】
前記哺乳動物の骨髄腫由来の細胞が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３株の細胞である、請求項１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項３】
前記免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）である、請求項１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項４】
前記免疫した哺乳動物が、マウスまたはラットである、請求項１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項５】
前記免疫した哺乳動物が、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである、請求項１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法により作製された、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号である、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号である、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株。
【請求項９】
請求項６に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出され、その他のストレプトコッカス属細菌と比べてサリバリウスに対して高い結合能を有する、抗サリバリウスモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項７に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出された、抗サリバリウスモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出された、抗サリバリウスモノクローナル抗体。
【請求項１２】
サリバリウスを検出するためのキットであって、
固相に結合された第１の抗体、および第２の抗体を含み、
前記第１の抗体および前記第２の抗体のうち少なくとも一方は、請求項９、請求項１０または請求項１１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体であり、
前記第２の抗体は標識されている、キット。
【請求項１３】
前記第１の抗体はポリクローナル抗体である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１】
サリバリウスに特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株の作製方法であって、
サリバリウスで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合して、融合細胞を得る工程；および
サリバリウスに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞株を前記融合細胞の中からクローニングする工程であって、該融合細胞から産生される抗体を、サリバリウスおよびその他のストレプトコッカス属細菌に対する結合能について免疫測定法により検定する工程を包含する、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項２】
前記哺乳動物の骨髄腫由来の細胞が、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３株の細胞である、請求項１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項３】
前記免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）である、請求項１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項４】
前記免疫した哺乳動物が、マウスまたはラットである、請求項１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項５】
前記免疫した哺乳動物が、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである、請求項１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株作製方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法により作製された、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株。
【請求項７】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１３号である、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１４号である、抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株。
【請求項９】
請求項６に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出され、その他のストレプトコッカス属細菌と比べてサリバリウスに対して高い結合能を有する、抗サリバリウスモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項７に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出された、抗サリバリウスモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項８に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体産出細胞株により産出された、抗サリバリウスモノクローナル抗体。
【請求項１２】
サリバリウスを検出するためのキットであって、
固相に結合された第１の抗体、および第２の抗体を含み、
前記第１の抗体および前記第２の抗体のうち少なくとも一方は、請求項９、請求項１０または請求項１１に記載の抗サリバリウスモノクローナル抗体であり、
前記第２の抗体は標識されている、キット。
【請求項１３】
前記第１の抗体はポリクローナル抗体である、請求項１２に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２３８７４７（Ｐ２００６−２３８７４７Ａ）
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５６５２４（Ｐ２００５−５６５２４）
【出願日】平成１７年３月１日（２００５．３．１）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１日（２００５．３．１）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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