抗体精製用のメンブラン及び関連方法
本発明は、抗体含有生体試料から不要な化合物を分離するための装置に関する。この装置は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂とを含む。この装置は、ポリマー樹脂の上流又は下流にウィルス除去メンブランをさらに含んでもよい。使用方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体精製用のメンブラン及び関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
内在性不純物（宿主細胞ＤＮＡ又はタンパク質）又は外在性夾雑物（内毒素、ウイルス又は細菌）からの、抗体、プラスミドＤＮＡ、ワクチン又は血漿画分のような治療用又は診断用生体分子又は生物学的存在の精製は、バイオセパレーション及びバイオプロセスにおける成長分野である。大量の純粋な抗体が免疫学的及び治療用途に必要とされることが多い。この数年間で、モノクローナル又は組換え抗体及びそれらの構築物は、治療薬及び診断薬の臨床試験で検討されている分子の最大のクラスになっている。発現系及び生産戦略の補完として、簡単で安価に高純度抗体を得るための効率的な精製プロトコールが必要とされている。安価で拡大縮小可能で迅速な精製技術の開発が必要とされている。
【０００３】
塩に基づくタンパク質分画又は超遠心分離のような伝統的な精製方法は、経済的でなく時間がかかる。各々特異的分子相互作用に依拠するビーズ状クロマトグラフィー技術も抗体及びウイルスの精製に用いられており、アフィニティー、疎水性相互作用及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。主にビーズでのクロマトグラフィーが、抗体又はウイルスの精製に用いられている。慣用されるクロマトグラフィー技術は、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを始めとする、相互作用の原理に基づくものである。従前、個々の特定の分離目的に最適な固定相を設計するための努力がなされてきた。かかる固定相は、担体又はベースマトリックスに、結合基を含むリガンドを結合したものであることが多い。生体高分子を高い純度及び収率で経済的かつ効率的に精製するためのマルチモーダルクロマトグラフィー分離技術を開発するため、様々なクロマトグラフィー技術の組合せを用いることができる。
【０００４】
或いは、生体分子の高効率で高流量の分離を達成するために、メンブランクロマトグラフィーが用いられている。しかし、特定の目標分子の精製に関してプロセスを最適化するために、特有の操作条件が必要とされることが多い。さらに、抗体、内毒素又はウイルスのような種々の試料によって最良の分離マトリックスが変動することがある。例えば、バイオテック産業では、ペプチド及びタンパク質（例えば抗体）、核酸、又はウイルスを精製するために特異的なプロセスを設計する必要がある。さらに、抗体の精製では、抗体の種類が、分離マトリックスの選択に重要な意味をもつことがある。そのため、絶え間なく開発されている新規生成物を精製するための選択の幅を広げるために、代替分離マトリックスが必要とされている。
【０００５】
微量不純物が、メンブランの容量に影響することがある。ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質又はタンパク質凝集体のような微量不純物を除去するために、従前、様々なメンブラン及びクロマトグラフィー樹脂が用いられてきた。タンパク質は、凍結融解操作又は下流精製におけるプロセス保留工程で、凝集体を形成することがある。そのため、ウィルス除去工程及び目標タンパク質分子の最終処方へと進む前に、凝集タンパク質及び微量不純物を除去することが常に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第２００９／００３５５５２号
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、広義には、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂とを含む新規な分離装置、並びに該装置を抗体精製に用いる方法に関する。精製プロセスは、同じ単位操作で高度精製工程をウイルス除去工程と組合せることによって、より効率的にできる。このことは、多孔質担体とポリマー樹脂とを含む分離マトリックスを、ウィルス除去メンブランと、同じ装置中で並列させることにより達成できる。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、抗体含有生体試料から１種以上の不要な化合物を分離するための装置を提供する。本装置は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂であって、ビニル架橋剤並びに第４級アンモニウム基及び２つ以上の環構造を含む芳香族モノマーに由来する構造単位を含むポリマー樹脂とを含む。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、抗体含有生体試料から不要な化合物を分離するための装置を提供する。本装置は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂であって、ビニル架橋剤及び式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ又はそれらの組合せに由来する構造単位を有するモノマーに由来する構造単位を含むポリマー樹脂とを含む。
【００１０】
【化１】
式中、Ｒ1及びＲ2は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せであり、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数であり、Ｒ3及びＲ4は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、ベンジル又は置換ベンジルである。さらに、ポリマー樹脂は、生物学的溶液中に存在する１種以上の化合物を、マルチモーダル相互作用によって選択的に保持できる。
【００１１】
一実施形態では、本装置は、ウイルスを除去できるウィルス除去メンブランをさらに含んでいて、ポリマー樹脂を含有する多孔質担体は、ウィルス除去メンブランの上流又は下流に配置される。
【００１２】
一実施形態では、抗体含有生体試料中に存在する不要な化合物から抗体を分離する方法は、生体試料を上記装置に、試料がポリマー樹脂と接触するように添加する工程と、生体試料中に存在する１種以上の化合物を、マルチモーダル相互作用によって選択的に保持する工程と、未結合の抗体を含む通過（フロースルー）流出液を回収する工程とを含む。
【００１３】
別の実施形態では、本方法は、同じ装置中でウィルス除去メンブランの上流に、ポリマー樹脂を含有する多孔質担体を組み込んだ高度精製工程を用いることによって、生体試料とのウィルス除去メンブランの容量の改善をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗体精製のための伝統的なバイオプロセスと圧縮バイオプロセスとの比較を示す２つのフローチャートを示す。
【図２】装置中での流れの方向に対する、高度精製メンブランの位置及びウィルス除去メンブランの位置を示す構成を示す。
【図３】ウイルスメンブランが、自立型装置であるか又は分離マトリックスを有する装置に組み込まれている、ウイルスメンブラン濾過の容量を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のこれらの及びその他の特徴、態様並びに利点は、図面全体を通して同様の文字が同様の部分を示す添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読むことによって、よりよく理解されるようになる。
【００１６】
請求される発明の主題をより明確且つ簡潔に記載するために、以下の記載及び添付の特許請求の範囲で用いられる具体的な用語について、以下の定義を用いる。明細書全体を通して、具体的な用語の例示は、非限定的な例とみなされる。
【００１７】
そうでないと示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いる成分、分子量のような特性、反応条件などの量を表す全ての数字は、全ての場合で用語「約」で修飾されていると理解される。従って、別途記載しない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲で示す数値パラメータは、本発明により得ることを求める所望の特性に依存して変動できる近似値である。最低限でも、そして特許請求の範囲に均等論を適用することを制限することを試みることなく、各数値パラメータは、報告される有効数字の数に鑑みて、且つ通常の丸めの技法を用いることにより少なくとも解釈される。
定義
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、明細書で互換的に用いられる。
【００１８】
用語「分離マトリックス」又は「樹脂」は、担体に含まれる材料であって、該担体が、それに直接的若しくは間接的に結合したリガンドを有するか又は架橋ポリマーで被覆されており、官能基を含む１種以上のリガンドがポリマーと結合している材料のことをいう。より具体的には、本明細書で用いる分離マトリックスは、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂を有する多孔質担体のことをいう。
【００１９】
用語「マルチモーダル分離マトリックス」又は「混合モード分離マトリックス」とは、結合のために１種以上の化合物と相互作用する２つ以上の異なる、しかし協同的な部位を提供できる分離マトリックスのことをいう。例えば、これらの部位のうちの１つは、リガンドと対象の化合物との電荷−電荷相互作用をもたらすことができる。その他の部位（複数可）は、電子受容体−供与体相互作用並びに／又は疎水性及び／若しくは親水性相互作用をもたらすことがある。電子供与体−受容体相互作用は、それらに限定されないが、水素結合相互作用、π−π相互作用、カチオン−π相互作用、電荷移動相互作用、双極子間相互作用又は誘起双極子相互作用を含む。
【００２０】
用語「脂肪族基」とは、１以上の結合価を有し、環状でない直鎖状又は枝分れの原子の並びからなる有機基のことをいう。脂肪族基は、１つ以上の炭素原子を含む。脂肪族基を含む原子の並びは、窒素、硫黄、ケイ素、セレン若しくは酸素のような複素原子を有することがあるか、又は炭素及び水素だけで構成されることがある。脂肪族基は、環状でない直鎖状又は枝分れの原子の並びの一部として、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロアルキル基、共役ジエニル基、アルコール基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、カルボン酸基、アシル基（例えばエステル及びアミドのようなカルボン酸誘導体）、アミン基、ニトロ基などのような広範囲の官能基を包含する。例えば、４−メチルペンタ−１−イル基は、メチル基を含むＣ６脂肪族基であって、該メチル基が、アルキル基である官能基である。同様に、４−ニトロブタ−１−イル基は、ニトロ基を含むＣ４脂肪族基であって、該ニトロ基が官能基である。脂肪族基は、同じ又は異なっていてよい１種以上のハロゲン原子を含むハロアルキル基であってよい。ハロゲン原子は、例えば、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を含み得る。１種以上のハロゲン原子を含む脂肪族基は、アルキルハロゲン化物であるトリフルオロメチル、ブロモジフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、ヘキサフルオロイソプロピリデン、クロロメチル、ジフルオロビニリデン、トリクロロメチル、ブロモジクロロメチル、ブロモエチル、２−ブロモトリメチレン（例えば−ＣＨ２ＣＨＢｒＣＨ２−）などを含む。脂肪族基のさらなる例は、アリル、アミノカルボニル（すなわち−ＣＯＮＨ２）、カルボニル、２，２−ジシアノイソプロピリデン（すなわち−ＣＨ２Ｃ（ＣＮ）２ＣＨ２−）、メチル（すなわち−ＣＨ３）、メチレン（すなわち−ＣＨ２−）、エチル、エチレン、ホルミル（すなわち−ＣＨＯ）、ヘキシル、ヘキサメチレン、ヒドロキシメチル（すなわち−ＣＨ２ＯＨ）、メルカプトメチル（すなわち−ＣＨ２ＳＨ）、メチルチオ（すなわち−ＳＣＨ３）、メチルチオメチル（すなわち−ＣＨ２ＳＣＨ３）、メトキシ、メトキシカルボニル（すなわちＣＨ３ＯＣＯ−）、ニトロメチル（すなわち−ＣＨ２ＮＯ２）、チオカルボニル、トリメチルシリル（すなわち（ＣＨ３）３Ｓｉ−）、ｔ−ブチルジメチルシリル、３−トリメトキシシリルプロピル（すなわち（ＣＨ３Ｏ）３ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ビニル、ビニリデンなどを含む。さらなる例として、Ｃ１〜Ｃ１０脂肪族基は、１つ以上であるが１０個以下の炭素原子を含有する。メチル基（すなわちＣＨ３−）は、Ｃ１脂肪族基の例である。デシル基（すなわちＣＨ３（ＣＨ２）９−）は、Ｃ１０脂肪族基の別の例である。
【００２１】
用語「表面」は、全ての外部表面を意味し、多孔質担体の場合に細孔の外側の表面及び内側の表面を含む。
【００２２】
用語「通過画分」とは、移動相を分離マトリックスに投入した後に分離マトリックスから出てくる液体のことをいう。通過画分は、タンパク質又は分離マトリックスと結合しなかったその他の化合物を含み得る。
【００２３】
用語「溶離液」とは、１種以上の化合物を分離マトリックスから遊離させるために用いる適切なｐＨ及び／若しくはイオン強度の溶液又は緩衝液のことをいう。
【００２４】
用語「不要な化合物」とは、クロマトグラフィーリガンド又は分離マトリックスと結合できる物質のことをいう。不要な化合物は、タンパク質（これは、抗体のような目標化合物を除外し得る）、溶出プロテインＡ、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素、栄養素のような生体分子並びに細胞培養培地の成分、消泡剤及び抗生物質であり得る。不要な化合物は、典型的に「不純物」と呼ばれることがあるその他の生成物、例えば凝集体、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素、ミスフォールド種（例えばミスフォールドタンパク質）又は変性された種のことをいうこともある。
【００２５】
用語「捕捉工程」とは、液体クロマトグラフィーの関係で、分離手順の最初の工程のことをいう。最も一般的には、捕捉工程は、ある程度の清澄化を含むが、より一般的に、この工程の結果として、濃縮、安定化及び可溶性不純物からの著しい精製が得られる。捕捉工程の後に、中間精製を行うことがあるが、これは、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素、栄養素、細胞培養培地の成分、消泡剤、抗生物質、又は凝集体、ミスフォールド種及び凝集体のような生成物関連不純物のような残存量の不純物をさらに低減する。最後に、一連の高度精製工程を行って、残存宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、タンパク質凝集体及び内毒素のような微量不純物を除去してよい。
【００２６】
用語「高度精製工程」は、液体クロマトグラフィーの関係で、分離手順の最初の精製工程の後のことをいう。最も一般的には、高度精製工程は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素及びタンパク質凝集体のような微量不純物を低減するために採用される。これらの不純物は、より一般的に、この工程による。高度精製工程は、目標分子が分離マトリックスと結合せず、微量不純物が結合するフロースルーモード操作で行うことができる。別の単位操作として、高度精製工程の後には、最も一般的には、濾過によるウィルス除去が行われる。
【００２７】
用語「使い捨ての」とは、本明細書で、装置中のクロマトグラフィーチャンバ及び分離マトリックスの関係で、単回使用又は制限された回数の使用を意図するマトリックスを意味する。使い捨ての装置（例えばカラム、ビーズ若しくは分離マトリックス又は多孔質担体）は、非常に少量でも害を及ぼす夾雑物を除去するために有利に用いられる。使い捨ての装置は、夾雑物及び相互汚染を導入する可能性を低減するために、生体分子の滅菌処理のために望ましい。
【００２８】
１種以上の実施形態は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂とを含む、抗体含有生体試料から不要な化合物を分離するための装置を含む。装置自体は、クロマトグラフィーチャンバ、管状過カラム、モノリス、フィルター又はメンブラン、キャピラリー、マイクロフルイディックチップ、プリーツカートリッジ若しくはカプセル又はカセット、らせん体、中空繊維、シリンジフィルター、マニフォールド、或いはマルチウェルプレートの形態であってよい。全ての装置は、本発明のポリマー樹脂で被覆された多孔質担体を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ポリマー樹脂は、多孔質担体構造の細孔内に配置される。多孔質担体は、メンブラン、ウェブ、フィルター、繊維又はメッシュの形態で作製してよい。
【００３０】
多孔質担体は、複数の細孔を含む。細孔径は、約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲であってよい。いくつかの具体的な実施形態では、細孔径は、約２μｍ〜約５μｍの範囲である。細孔は、同一のサイズ／形状又は異なるサイズ／形状のものであってよい。細孔は、円形、楕円形、方形、正方形又は三角形の形状であってよい。
【００３１】
多孔質担体は、有機又は無機の材料を用いて作製してよい。いくつかの実施形態では、多孔質担体は、ポリマーを用いて作製される。多孔質担体は、天然高分子（例えばアガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ゲラン、アルギネート、ペクチン又はデンプン）を用いて、又は合成高分子（例えばポリフェニレンエーテル、ポリエーテルスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリフェニレンのようなポリアリールエーテル、ポリスチレン、ポリアクリレート若しくはポリメタクリレートのようなポリビニルポリマー、ポリビニルエステル、ポリアクリルアミド、ポリビニルエステル、ポリビニルアミド、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ポリエステル）から調製してよい。用いられるポリマーは、ホモポリマー、コポリマー、架橋ポリマー、ブロックコポリマー、ランダムポリマー又はポリマーブレンドであってよい。上記のポリマーと水溶性ポリマーとのブレンドが、薄膜凝固により頻繁に加工され、該水溶性ポリマーは、細孔の形態を制御するように作用する。多孔質担体を作製するために用いることができる適切なポリマーは、それらに限定されないが、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅ−ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリフェニレンオキシド、ポリカーボネート、ポリエステル、セルロース又はセルロース誘導体を含む。いくつかのその他の実施形態では、担体は、シリカのような無機ポリマーから調製される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、多孔質担体の細孔内に配置されるポリマー樹脂は、ビニル架橋剤と、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ又はそれらの組合せに由来する構造単位を有するモノマーとに由来する構造単位を含む。
【００３３】
【化２】
式Ｉにおいて、Ｒ1及びＲ2は独立に水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せである。式Ｉ及びＩＩにおいて、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数である。いくつかの実施形態では、モノマーは、２つ以上の環構造を含む。
【００３４】
式（Ｉ）に示すように、スチレン置換第４級アミンはＲ1基を含み、これはアミンの窒素に接続されるが、Ｒ2は、ベンゼン環のオルト、メタ又はパラ位に結合し得る置換基である。Ｒ1が水素である場合、式（Ｉ）は、第３級アミンを表す。Ｒ1は、１〜２０炭素原子含有アルキル、例えば置換を有するか若しくは有さない２〜１６又は３〜１８炭素原子含有アルキルを含み得る。置換基Ｒ2は、１〜２０炭素原子を含む。Ｒ2は、２〜１８炭素原子のような１〜２０炭素原子を含むことができ、これらは適宜置換される。Ｒ2が水素である場合、ベンゼン環は、ＣＨ２基を介して窒素に結合する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、アリール又は置換アリールであり得る。Ｒ1のアリール環系は、１種以上の置換又は非置換フェニル基を含んでよいが、但し、置換（複数可）が、結合特性を損なわないことを条件とする。よって、Ｒ1は、１種以上の芳香環、例えばフェニレン、ビフェニレン又はナフタレン構造及びその他の芳香環系を含み得る。芳香環は、１種以上の窒素、酸素又は硫黄原子を含有する複素環、例えばピリジン、ピリミジン、ピロール、イミダゾール、チオフェン又はピランであり得る。例示的な置換Ｒ1基は、ヒドロキシフェニル（２−、３−及び４−）、２−ベンズイミダゾリル、メチルチオキシフェニル（２−、３−及び４−）、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル（２−、３−及び４−）、４−（２−アミノエチル）フェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２，４，５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル、及び４−スルホンアミドフェニルからなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｒ1は、非置換フェニルである。代替の実施形態では、Ｒ1は、１つ以上のＯＨ基で置換されたフェニルである。
【００３６】
さらに、Ｒ1及びＲ2は、リガンドの結合特性が損なわれない限りは、任意の適切な置換基で置換されてよい。例えば、より親水性のリガンドが望ましいならば、これは、ＯＨ基のような１種以上の親水性基を含んでよい。代わりに、置換は、リガンドの疎水性を増進させてよく、この場合、リガンドは、アルキル基及び／又はフッ素含有基のような１種以上の疎水性基を含んでよい。最後に、置換は、１つ以上の追加の機能、例えばリガンドのマルチモーダル特徴を増進するための荷電された物体を導入するために用いてよい。さらに、Ｒ1及びＲ2は、直鎖状であっても、枝分れがリガンドの結合特性を損なわない限り、枝分れであってよい。
【００３７】
式ＩＩに示すように、ピペリジン環は、置換ベンゼン、より具体的にはビニルベンゼンに連結しているＣＨ２に結合している。ピペリジン環は、ビニルベンゼンに結合しているペンダント炭化水素鎖として存在する。ｍ及びｎは独立に１〜５の整数である。いくつかの実施形態では、生体試料中に存在する１種以上の化合物と結合するリガンドは、ビニルベンゼン又はスチレンを含む。
【００３８】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ3及びＲ4は各々独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル又はそれらの組合せである。ある実施形態では、式ＩＩＩは、窒素原子に結合した２つのビニル基を含み、Ｒ3及びＲ4は各々独立に水素原子である。別の実施形態では、Ｒ3及びＲ4は、２〜１８炭素原子を含んでよく、これらは適宜置換されている。さらに別の実施形態では、式ＩＩＩは、２つ以上の環構造を含む。
【００３９】
別の実施形態では、Ｒ3及びＲ4は各々独立に、アリール又は置換アリール基である。アリール環系Ｒ3又はＲ4は、１種以上の置換又は非置換フェニル基を含んでよいが、但し、置換（複数可）がリガンドの結合特性を損なわないことを条件とする。よって、Ｒ3又はＲ4は、１種以上の芳香環、例えばベンジル、フェニレン、ビフェニレン又はナフチレン構造及びその他の芳香環系（結合部分）を含み得る。芳香環は、複素環、すなわち１種以上の複素原子（例えば窒素、酸素又は硫黄原子）を含有するもの、例えばピリジン、ピリミジン、ピロール、イミダゾール、チオフェン又はピランであり得る。例示的な置換Ｒ3及びＲ4基は、ヒドロキシフェニル（２−、３−及び４−）、２−ベンズイミダゾリル、メチルチオキシフェニル（２−、３−及び４−）、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル（２−、３−及び４−）、４−（２−アミノエチル）フェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２，４，５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル、及び４−スルホンアミドフェニルからなる群から選択される。有利な実施形態では、Ｒ3又はＲ4は、非置換フェニルである。代替の実施形態では、Ｒ3又はＲ4は、１つ以上のＯＨ基で置換されたフェニルである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は、式ＩＶに由来する構造単位を含む。Ｒ5及びＲ6は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せであり、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数である。
【００４１】
【化３】
ある実施形態では、ポリマー樹脂は、式Ｖに由来する構造単位をさらに含んでよい。
【００４２】
【化４】
式中、ＺはＮＨ又はＯであり、Ｒ7は、水素若しくはメチル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、置換アルキル又はそれらの組合せであり、ｎは、１〜５の整数である。
【００４３】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩに示すように、本発明によるリガンドは、ビニル置換ベンゼン誘導体を含み、これは、多孔質担体に架橋して接着し、よって第４級アミン及びフェニル基を含む共役リガンドを創出するために適切である。その結果、固定化されると、リガンドは、マルチモーダルアニオン交換リガンドとして機能できる。なぜなら、正に荷電された第４級アミン基に加えて、これは、疎水性である芳香環構造も含むからである。
【００４４】
よって、ポリマー樹脂は、一般的に、複数のリガンドを含む。具体的な実施形態では、ポリマーマトリックスは、上記の式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに由来する第１リガンドを、第２の種類のリガンドと組合せて、又はリガンドの混合物を含み得る。第２リガンドも、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩから選択してよい。第１リガンドは、リガンドの合計量の約３０％以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、最も好ましくは約９０％以上で存在してよい。このような組合せリガンド分離装置は、１種以上の不要な化合物との相互作用を増進して、分離特性を改善するように設計できる。第２の種類のリガンドは、電荷反発により目標化合物を溶出するために用いられるカチオン交換体のような１種以上の荷電基、疎水性基、水素結合できる基、アフィニティー基などを含み得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ポリマー樹脂は、架橋剤を含み、該架橋剤は、ビニル架橋剤であってよい。ビニル架橋剤は、Ｎ’，Ｎ”−メチレンビスアクリルアミドを含む。ビニル架橋剤は、熱、光、放射線又はそれらの組合せでの処理により活性化され得る。いくつかのその他の実施形態では、架橋剤は、非ビニル架橋剤であってよい。
【００４６】
分離装置は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂とを含む。本明細書で用いる場合、多孔質担体とポリマー樹脂との組合せは、交換可能に、その作用の形態、分離工程及び／又は高度精製工程に関連して、分離マトリックス又は高度精製マトリックスということがある。
【００４７】
装置の分離マトリックスは、ポリエーテルスルホン多孔質担体と、表１に示すモノマー１、モノマー２及び架橋剤の１種以上に由来する構造単位を含むポリマー樹脂とを含む。プロトタイプ１について、モノマー１は、式ＩＶ（式中、Ｒ5は、メチル基であり、ｎは、１であり、１つのＨは、ＣＨ２のＣに結合し、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−ＯＨ部分は、ここではＮに結合している別のメチル基で置き換えられている）に部分的に由来する。プロトタイプＩは、表１に示すように、式ＩＩＩに由来する構造単位（構造２）をさらに含んでよい。プロトタイプ２について、構造単位（モノマー１）は、式ＩＩに由来する。プロトタイプ３及びプロトタイプ４は、式Ｉに由来する構造単位（モノマー１）を含む。プロトタイプ４は、式Ｖに由来する構造単位（モノマー２）をさらに含む。Ｎ’，Ｎ”−メチレンビスアクリルアミドを、各プロトタイプについてビニル架橋剤として用いた。水及びメタノールを、プロトタイプ２、３及び４について溶媒として用いた。水だけをプロトタイプ１について溶媒として用いた（表１に示すように）。全てのプロトタイプについて、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９を開始剤として用い、ポリマーを硬化するためにＥビームを用いた。「メンブランプロトタイプ」は、「分離マトリックス」と互換的に用いている。
【００４８】
【表１】
本発明による装置は、クロマトグラフィーチャンバ、モノリス、フィルター若しくはメンブラン、キャピラリー、マイクロフルイディックチップ、管状カラム、プリーツカートリッジ若しくはカプセル、カセット、らせん体、中空繊維、シリンジフィルター又はマニフォールドのような、分離において従来用いられる任意のその他の形状をとることができる。例えば、装置は、単層メンブラン又はフィルター装置を構成する複数層のメンブランのようなメンブラン状の構造を含み得る。
【００４９】
一実施形態では、分離マトリックスは、使用前又は使用後に乾燥させることができる。乾燥した構造を液体に浸漬して、使用前にその元の形を再生することができる。
【００５０】
ポリマー樹脂は、試料中に存在する１種以上の不要な化合物を保持できる。一実施形態では、１種以上の不要な化合物は、メンブラン上に、１種以上の不要な化合物がメンブランと結合することにより保持され得る。ポリマー樹脂は、試料中に存在する１種以上の不要な化合物と結合できる。試料は、抗体のような１種以上の目標化合物と、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素などのような１種以上の不要な化合物とを含むことがある。一実施形態では、ポリマー樹脂は、試料中の１種以上の不要な化合物を、結合により保持できる。不要な化合物は、ポリマー樹脂に、マルチモーダル相互作用によって結合することがある。非限定的な例としてのマルチモーダル相互作用は、イオン性相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用又は双極子間相互作用であってよい。マルチモーダル相互作用は、水素結合相互作用、疎水性相互作用又はイオン性相互作用の２つ以上を含んでよい。一実施形態では、マルチモーダル相互作用は、水素結合相互作用及び疎水性相互作用を含むことがある。別の実施形態では、マルチモーダル相互作用は、水素結合相互作用及びイオン性相互作用を含むことがある。さらに別の実施形態では、マルチモーダル相互作用は、疎水性相互作用及びイオン性相互作用を含むことがある。
【００５１】
いくつかの実施形態では、試料は、抗体を含有する生体試料であり、対象の分子とは別に１種以上の化合物を含んでよい。「対象の分子」又は「目標化合物」とは、本明細書で言及する場合、対象の分子とともに不要な化合物を含有する混合物から分離する必要がある分子である。例えば、対象の分子は、抗体と宿主細胞タンパク質とを含有する混合物から分離する必要がある抗体であり得る。対象の分子（目標化合物）は、それらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、内毒素、ウイルス及び抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、不要な化合物は、ＤＮＡ、内毒素、ウイルス、タンパク質凝集体又は宿主細胞タンパク質であり得る。ポリマー樹脂のリガンドは、試料中に存在する対象の分子が、ポリマー樹脂と結合せず、マトリックスを通過するような様式で選択できる。対象の分子は、次いで、後続の下流の操作で通過画分からさらに処理できる。生体試料中に存在する１種以上の不要な化合物は、ポリマー樹脂と結合することがある。ポリマー樹脂は、試料中に存在する１種以上の不要な化合物と、特異的結合部位により又は１種以上の化合物上に存在する荷電部位（例えば負電荷）を用いる静電相互作用を介して相互作用することがある。いくらかの不要な化合物が樹脂と結合せず、マトリックスを通過して通過画分流中に入ることが可能である。よって、これらの不要な化合物を対象の分子から除去するために、さらなる精製が必要になることがある。このことは、高度精製工程をさらに改善するために異なるリガンド部分を含む異なるポリマー樹脂を有する別の構造により達成できる。ポリマー樹脂と結合した不要な化合物は、１種以上の疎水性部位を含むことがある。不要な化合物は、ポリマー樹脂中に存在する正荷電基と相互作用し得るアニオン荷電基を含むことがある。
【００５２】
小規模精製のために、小面積の構成での言及した装置フォーマットのいずれも、高度精製単位操作として純度を改善するために用いることができる。不純物（又は不要な化合物）を抗体のような治療用又は診断用の生体分子から除去することによる高度精製の工程のために、小さい管状カラム又はシリンジフィルターが有用になり得る。１つ以上の入口及び出口をメンブラン装置に装着して、移動相の内向き流れ及び外向き流れを維持することができる。一実施形態では、装置は、単層又は多層フォーマットの分離マトリックスの形態であってよい。装置を、装置の入口に装着されたポンプ又は圧力容器と接続して、分離マトリックスを通して流速を維持できる。具体的な実施形態では、装置は、単層又は多層フォーマットの分離マトリックスであり、使用前に滅菌できる。
【００５３】
装置は、いくつかの実施形態では、追加の分離メンブランをさらに含むことがある。追加のメンブランは、目標分子を、フロースルーモード操作で、生体試料からある化合物を選択的に除去することにより高度精製できるものであってよい。この追加の高度精製工程は、図１の伝統的なプロセスに示すように、中間精製操作の後に配置できる。いくつかの実施形態では、追加の高度精製工程は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、内毒素、ウイルス及び／又は凝集抗体のような微量不純物を除去する能力を有する。図１は、ウィルス除去専用工程と組合せた高度精製工程の実施形態を組み込んだ圧縮プロセスを示す。
【００５４】
ある実施形態では、装置は、分離マトリックスと隣接して配置されるウィルス除去メンブランを含み得る。このことは、高度精製メンブラン２０１及びウィルス除去メンブラン２０３として機能する分離マトリックスを示す図２に示す。いくつかの実施形態では、一連の分離マトリックス（高度精製用）及びウィルス除去メンブランが、装置中に存在し得る。
【００５５】
図２は、装置中の流れ２０９の方向に対するメンブランの位置をさらに示す。多層の分離マトリックス２０５は、多層のウィルス除去メンブラン２０７と接触している。最後の高度精製メンブラン２０１の層と最初のウィルス除去メンブラン２０３の層との界面は、装置中の高度精製工程とウィルス除去工程との境界を構成する。
【００５６】
一実施形態では、装置は、不純物を高度精製するための分離マトリックスと、ウイルスを除去するためのウィルス除去メンブランとをともに含み、該分離マトリックスは、ウィルス除去メンブランと並列している。一実施形態では、分離マトリックス（又は複数のマトリックス）は、ウィルス除去メンブランの上流で並列してよい。別の実施形態では、分離マトリックス（複数のマトリックス）は、ウィルス除去メンブランの下流で並列してよい。
【００５７】
具体的な実施形態では、分離装置は、流速、時間、純度又は塩濃度の詳細を決定できる表示装置に接続できる。分離装置、より具体的にはポリマー樹脂を含有する多孔質担体は、ポリマー樹脂を含有する多孔質担体、コントローラ、コンピュータ、表示装置、液体（移動相）取扱システム、通過画分回収システムの１種以上を含む分離システムの一部であってよい。分離システムは、オペレータの介入あり又はなしでその機能の１種以上を行うように自動化されていてよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、分離装置は、滅菌状態で提供され、単回使用の後に処分できる。単回使用メンブラン装置は、使い捨てのメンブラン装置と記載することがある。抗体のような治療用化合物の精製のために使い捨てのメンブラン装置を用いる利点は、２つの異なるプロセス間の相互汚染を回避することが可能になることである。メンブラン装置は、使い捨てのモノリス、使い捨ての管状カラム、使い捨てのプリーツカートリッジ、使い捨てのカプセル、使い捨てのカセット、使い捨てのスパイラルフィルター、使い捨ての中空繊維フィルター、使い捨てのシリンジフィルター又は使い捨てのマニフォールドの形態であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、分離装置は、再利用可能であってよい。再利用可能な装置の場合では、マトリックスを通して移動相を通過させた後に、溶離液を用いてマトリックスを数回洗浄する。最後の溶離液の通過画分を試験して、溶離液中にタンパク質若しくはペプチド又はその他の化合物が存在しないことを確実にできる。マトリックスは、次いで、さらなる使用のために適切な緩衝液を用いて平衡化してよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、装置を、使用前に適切な方法によりさらに滅菌する。滅菌処理は、オートクレーブ処理すること若しくは内部マトリックスを飽和蒸気に曝露することのような熱処理により、４５ｋＧｒｙ以下の十分な線量での放射線照射により、又は滅菌のための任意のその他の従来の方法を用いることにより行うことができる。
【００６１】
一実施形態では、抗体含有生体試料から不要な化合物を分離するための装置を調製する方法が提供され、該方法は、装置中でウィルス除去メンブランと並列された分離マトリックスを用意する工程と、装置を適切な緩衝液で平衡化する工程とを含む。いくつかの実施形態では、本発明の分離マトリックスは、タンパク質精製のために用いることができる。タンパク質は、抗体、抗体断片、又は抗体を含む融合タンパク質であってよい。別の実施形態では、分離マトリックスは、任意のその他の化合物、例えばポリペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、プラスミド、ウイルス、プリオン、細胞（例えば原核又は真核細胞）、脂質、炭水化物、有機分子、目標薬物、又は診断用マーカー分子からなる群から選択されるものの分離のために用いることができる。当業者が気づくように、本出願では、分離との用語は、精製、単離、及び不要な化合物の除去について用いるが、これは、診断目的のための抗体のような目標化合物の同定も包含する。
【００６２】
一実施形態では、分離マトリックスとウィルス除去メンブランとを含む装置に試料を加えることを含む、試料中に存在するその他の不要な化合物から抗体を分離する方法が提供される。試料は、分離マトリックスと接触し、分離マトリックスを通過し、その後、ウィルス除去メンブランと接触し、最後にウィルス除去メンブランを通過する。代替の実施形態では、分離マトリックスに先だって、試料をウィルス除去メンブランと接触させ、且つ通過させてよい。結合しなかった抗体を、装置から、フロースルーモード操作で回収できる。上記の実施形態で、重力場、ポンプ、圧力容器又はそれらの組合せの支援を用いて、試料を装置に通過させてよい。
【００６３】
装置を通過する試料は、細胞抽出物から得られた上清であってよい。いくつかの実施形態では、試料を分離マトリックスと接触させる前に、１つ以上の予備精製工程を行ってよい。１つ以上の予備精製工程は、機械的濾過、遠心分離、超遠心分離、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は電気泳動を含み得る。
【００６４】
抗体のような対象の化合物（目標化合物）は、生体試料の１種以上のその他の不要な化合物から、生体試料を含む移動相を上記の分離マトリックスと接触させることにより分離できる。具体的な実施形態では、本方法は、液体クロマトグラフィーの原理を用いて、すなわち移動相を、本発明による分離マトリックスを含む装置に通すことにより行うことができる。代替の実施形態では、本方法は、液体クロマトグラフィーの原理を用いて、すなわち移動相を、本発明による高度精製メンブランとウィルス除去メンブランとを含む装置に通すことにより行うことができる。
【００６５】
本方法の一実施形態では、不要な化合物は、分離マトリックスに吸着されるが、抗体のような所望の化合物は、吸着されることなく移動相中に残る。別の実施形態では、凝集若しくはミスフォールドタンパク質又はペプチド或いはウイルスのような不要な化合物は、ウィルス除去メンブランに吸着されるが、抗体のような所望の化合物は、吸着されることなく移動相中に残る。当業者により理解されるように、吸着される化合物の性質及びアイデンティティーは、生体試料の起源に依存する。マトリックスに吸着される不要な化合物の非限定的な例は（所望の抗体が吸着されない場合）、細胞及び細胞細片、タンパク質（所望の抗体以外）及びペプチド、凝集形のタンパク質若しくはペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸、内毒素、ウイルス、培養培地からの残渣などである。具体的な実施形態では、本発明の分離マトリックス若しくはウィルス除去メンブラン又はそれらの両方は、メンブラン装置にもたらされ、移動相は、装置を、重力及び／又はポンプの使用若しくは圧力により通過し、抗体が通過画分中で回収される。具体的な実施形態では、メンブラン装置は、クロマトグラフィー装置であってよい。
【００６６】
一実施形態では、本方法は、フロースルーモード操作を用いる高度精製工程を構成する。具体的な実施形態では、生体試料は、粗製の供給原料であり、これは、本発明による高度精製メンブラン（分離マトリックス）及びウィルス除去メンブランと接触させる前に濾過される。その結果、この実施形態は、生体試料が機械的手段により予備精製されていても、高度精製工程を構成する。抗体を生成する宿主細胞は、宿主細胞タンパク質として一般的に知られるいくつかのその他のタンパク質も含むことがある。このような宿主細胞タンパク質は、酵素（例えばプロテアーゼ）及び宿主細胞により生成されるその他のタンパク質を含み得る。よって、一実施形態では、生体試料の宿主細胞タンパク質は、宿主細胞タンパク質を分離マトリックスに吸着させることによって、本発明の方法により実質的に除去される。
【００６７】
代替の実施形態では、本方法は、中間精製又は高度精製工程のような清澄化プロトコールにおける第２、第３又は第４のクロマトグラフィー工程としてさえ用いることができる。よって、一実施形態では、移動相は、本分離マトリックスにアプライされた抗体含有生体試料を含む。
【００６８】
本方法は、哺乳類宿主、例えばマウス、げっ歯類、霊長類及びヒトを起源とする抗体、若しくはハイブリドーマを起源とする抗体のような任意のモノクローナル又はポリクローナル抗体を分離するために有用である。一実施形態では、分離された抗体は、ヒト又はヒト化抗体から回収される。抗体は、任意のクラスのものであってよく、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭからなる群から選択できる。一実施形態では、抗体は、プロテインＡと結合できるか、又はＦｃ含有抗体断片若しくは融合タンパク質である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１のような免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。一実施形態では、本方法は、６〜９の範囲、特に７〜８の範囲内の等電点（ｐＩ）を有する抗体の精製に用いられる。具体的な実施形態では、精製された抗体のｐＩは、約９である。この関係で、用語「抗体」は、抗体断片及び抗体又は抗体断片を含む任意の融合タンパク質も含むことが理解される。よって、本発明は、上記の抗体のいずれか１つの断片及びこのような抗体を含む融合タンパク質の分離も包含する。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
【００６９】
本方法は、装置中の分離マトリックスからの抗体生成物のいずれの溶出も要求しないことがある。特定の溶出工程を回避することは、プロセスの観点から魅力的である。なぜなら、より少ない数の工程は、より迅速な精製プロトコールをもたらし、その結果、プロセスの経費を低減するからである。さらに、抗体は、それらのフォールディングパターンを損ない得るか又はペプチド結合を切断することによりそれらを分解し得るある条件に対して感受性である。よって、全般的にアニオン交換のための溶出条件はいずれの極端な化学物質も含まないが、塩及び／又はｐＨの変化は、感受性が高い抗体に影響することがあり、その影響は、ｐＩ、電荷分布などに依存して種ごとに変動する。さらに、いくつかの実施形態では、本方法は、溶離液を加え、所望の化合物に対して溶出条件を用いることを回避する。化合物の吸着のための最も適切な条件を得るために、生体試料は、適切な緩衝液又はその他の液体と組合せて、移動相とすることができる。
【００７０】
本発明の方法を、アニオン交換クロマトグラフィーのための従来の条件下で採用することも可能であり、これは、一般的に、比較的低い塩濃度での吸着を含む。よって、本方法の一実施形態では、移動相の導電率は、１〜２５ｍＳ／ｃｍの範囲にある。いくつかの実施形態では、移動相の導電率は、７〜１５ｍＳ／ｃｍの範囲にある。移動相のｐＨは、約５〜８であってよい。例えば分離マトリックスを再利用するために、吸着した化合物を後で遊離させることが望ましい場合、溶出は、より高い塩濃度で行ってよい（例えば漸増塩勾配を用いることにより）。ｐＨの値も又は代わりに、例えば漸減ｐＨ勾配でシフトさせて、吸着された化合物を溶出してよい。
【００７１】
方法は、ｐＨ及び／又は導電率を制御することにより有利に、特定の化合物を吸着するように適合できる。例えば、抗体の分離で、異なるクラスの抗体は、異なる電荷及び電荷分布パターンを有する。電荷分布パターンと分離の目的との組合せによって、抗体が吸着されることがより好ましいか、又は吸着されることなく装置を通過させるかが決定される。
【００７２】
不要なその他の化合物から分離されることが必要な抗体は、表面で培養された細胞のような任意の公知の供給源、或いは発酵タンク若しくは容器内の回分又は連続細胞培養を起源とすることができる。抗体を含有する試料は、液体、懸濁物又は半固体であってよい。具体的な実施形態では、試料は、液体試料である。試料は、粗細胞抽出物を含むか、又は部分的に精製された細胞抽出物であってよい。試料は、患者の体から回収されてよい。一実施形態では、生体試料は、細胞発酵から得られた上清であってよい。
【実施例】
【００７３】
実施例１．構造単位に由来するモノマーの合成
別途記載しない限り、化学物質は、Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国）から購入し、受領したまま用いた。溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ社（米国）から得た。
【００７４】
ビニルベンジルモノマーの合成：塩化ビニルベンジルに由来する第４級アンモニウム塩モノマーを作製するための全般的な合成アプローチを、本明細書に記載する。塩化ビニルベンジルを、第３級アミンと、ジクロロメタン又はメタノールを溶媒として用いて反応させた。反応時間は、嵩高い基を含む第３級アミン（例えばピペリジンエタノール及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン）について、室温にて３〜２４時間又は６５℃にて３．５〜６時間の範囲であった。反応の完了は、反応生成物についての1Ｈ ＮＭＲ分析により決定した。最終生成物を直接用いたか、又は溶媒蒸発により単離して、さらなる精製を行わずに用いた。反応生成物は、典型的に、９５％収率で単離され、1Ｈ ＮＭＲ分析により査定して９５％を超える純度であった。
【００７５】
１−（２−ヒドロキシエチル）−１−（４−ビニルベンジル）ピペリジニウムクロリド又はビニルベンジル［ピペリジン−エタノール］アンモニウムクロリドの合成：塩化ビニルベンジルを、塩基性アルミナを通して濾過し、濾過の直後に用いた。２５０ｍｌ丸底フラスコに、２４．８３ｇの塩化ビニルベンジル（１６２ｍｍｏｌ）及び５０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）を加え、その後、２０．９９ｇ（１６２ｍｍｏｌ）の２−ピペリジンエタノールを加えた。反応混合物を３．５時間、６５℃にて撹拌した。溶媒を真空の下で蒸発させ、さらなる精製を行わずに生成物を用いた。生成物は、1Ｈ−ＮＭＲにより査定して＞９５％の純度であった。
【００７６】
Ｎ−ベンジル−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ビニルベンジル）エタンアンモニウムクロリド又はビニルベンジル［Ｎ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル］アンモニウムクロリドの合成：塩化ビニルベンジルを、塩基性アルミナを通して濾過し、濾過の直後に用いた。２５０ｍｌの丸底フラスコに、３４．０ｇの塩化ビニルベンジル（２２０ｍｍｏｌ）及び６０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）を加え、その後、３６．８ｇ（２２０ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチルアミンを加えた。反応混合物を、３．５時間、６５℃にて撹拌した。溶媒を真空の下で蒸発させ、さらなる精製を行わずに生成物を用いた。生成物は、1Ｈ−ＮＭＲにより査定して＞９５％の純度であった。
【００７７】
Ｎ−ベンジル−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ビニルベンジル）エタンアンモニウムクロリド又はビニルベンジル［Ｎ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル］アンモニウムクロリドの合成：１Ｌのフラスコに、１０１ｇの塩化ビニルベンジル（６６１ｍｍｏｌ）及び１０９．３ｇ（６６１ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチルアミンを加え、その後、６０ｍｌのメタノールを加えた。反応混合物を５．５時間、６５℃にて撹拌した。さらなる精製を行わずに反応混合物を用いた。生成物は、1Ｈ−ＮＭＲにより査定して＞９５％の純度であった。
【００７８】
Ｎ−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジアリル−Ｎ−メチルアンモニウムクロリドの合成：５００ｍＬの１つの丸底フラスコに、３６．２ｇ（０．２８８ｍｏｌ）の塩化ベンジル、１６．０ｇのジアリルメチルアミン（０．１４４ｍｏｌ）及び１４０ｇのアセトニトリルをチャージした。溶液を２日間還流した。溶液を濃縮し、生成物をジエチルエーテル中で沈殿させた。粗製の粘性の油を水（４０ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテルで３回洗浄した（３×１００ｍＬ）。水性相を回収し、溶媒を蒸発させ、得られた油を真空の下で５０℃にて乾燥させた。３０．０ｇ（８８％）の粘性の油が、プロセスの後に得られた。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）は、７．６０−７．１０ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ）、６．０５−５．７５ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ）、５．７０−５．４０ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ）、４．７６ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）、４．２０−３．８０ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ）、及び２．９４ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ）にピークを示す。
【００７９】
実施例２．メンブランの組み立て及びｅビーム硬化方法
メンブラン組み立て材料：別途記載しない限り、化学物質は、Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国）から購入した。Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９は、ＣＩＢＡから得た。ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブランは、ＧＥ Ｗａｔｅｒ（５ミクロン孔径、１５０ミクロン厚さ）から得た。ＰＥシート（バッグ）は、Ｆｉｓｈｅｒ社（米国）（ｃａｔ＃１９０７５３８８Ａ）から得た。
【００８０】
メンブラン上のコーティングを作製するために用いた溶液は、本明細書でコーティング溶液と記載する。メンブランをコーティング溶液に１分間、又はいくつかの実施例では２０分間浸漬した。過剰のコーティング溶液を、メンブランを２枚のポリエチレン（ＰＥ）シートの間に置き、シリコーンの刃で過剰の溶液を搾り出し、その後、約４５〜７０分間風乾することにより除去した。メンブランをフレーム上に載せ、ｅビームチャンバ中に置いた。Ｎ２を、チャンバを通じて２分間パージし、メンブランを、５０フィート毎分の速度で電子ビームに曝露した。Ｏ２レベルが１５０ｐｐｍ（±５）に到達したときに、４０ＫＧｙの線量が送達された。メンブランを裏返し、メンブランの他方の面について曝露手順を反復した（ベンチトップ電子ビームユニット、ＥＢ Ｌａｂ−１５０、約４０平方ｃｍチャンバ、ＡＥＢ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）。
【００８１】
一例では（プロトタイプ１）、ポリエーテルスルホンメンブラン（５ミクロン、ＧＥ Ｗａｔｅｒから）を、１０ｇのビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド（０．０４７ｍｏｌ）、８ｇのジアリルジメチルアンモニウムクロリド（０．０５０ｍｏｌ）、３ｇのメチレンビスアクリルアミド（０．０２０ｍｏｌ）及び１．０ｇのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．００４５ｍｏｌ）を２００ｍｌの水の中に含む水性調合物（コーティング溶液）で被覆した。メンブランを、コーティング溶液に２０分間浸した。メンブランを、次いで、溶液から取り出し、２枚のポリエステルシートの間で穏やかに搾って空気の泡を除去した。コーティング溶液を、メンブランを通して流し、過剰の溶液をメンブランから除去した。メンブランを、その後、６０分間吊るして風乾した後に、両面をｅビーム照射（４０ＫＧｒａｙ）に曝露した（１５０ｐｐｍ酸素）。
【００８２】
別の例では（プロトタイプ２）、ポリエーテルスルホンメンブラン（５ミクロン、ＧＥ Ｗａｔｅｒから）を、２６．５ｇのビニルベンジル［ピペリジンエタノール］アンモニウムクロリド（０．０９４ｍｏｌ）、１．５ｇのメチレンビスアクリルアミド（０．０１０ｍｏｌ）及び０．８８ｇのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．００４ｍｏｌ）を１１７ｍｌの水とメタノールとの混液（３５：６５）中に含む（１５ｗｔ％モノマー）調合物（コーティング溶液）で被覆した。メンブランを、コーティング溶液に２０分間浸した。メンブランを、次いで、溶液から取り出し、２枚のポリエステルシートの間で穏やかに搾って空気の泡を除去した。コーティング溶液を、メンブランを通して流し、過剰の溶液を除去した。メンブランを、その後、４５〜６０分間吊るして風乾した後に、両面をｅビーム照射（４０ＫＧｒａｙ）に曝露した（１５０ｐｐｍ酸素）。
【００８３】
別の例では（プロトタイプ３）、ポリエーテルスルホンメンブラン（５ミクロン、ＧＥ Ｗａｔｅｒから）を、２７．６６ｇのビニルベンジル（Ｎ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル）アンモニウムクロリド（０．０８７ｍｏｌ）、１．８５ｇのメチレンビスアクリルアミド（０．０１０ｍｏｌ）及び０．８８ｇのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．００４ｍｏｌ）を２１８ｍｌの水とメタノールとの混液（３５：６５）中に含む（１３ｗｔ％モノマー）コーティング溶液で被覆した。メンブランコーティング溶液を、水とメタノールとの混液（３５：６５）で希釈した（８．５ｗｔ％モノマー）。メンブランを、希釈コーティング溶液に２０分間浸した。メンブランを、次いで、溶液から取り出し、２枚のポリエステルシートの間で穏やかに搾って空気の泡を除去した。コーティング溶液を、メンブランを通して流し、過剰の溶液を除去した。メンブランを、その後、４５〜６０分間吊るして風乾した後に、両面をｅビーム照射（４０ＫＧｒａｙ）に曝露した（１５０ｐｐｍ酸素）。
【００８４】
さらに別の例では（プロトタイプ４）、ポリエーテルスルホンメンブラン（５ミクロン、ＧＥ Ｗａｔｅｒから）を、３０．０ｇのビニルベンジル（Ｎ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル）アンモニウムクロリド（０．０９ｍｏｌ）、２．７２７ｇのＮ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（０．０２７Ｍ、水中の４８ｗｔ％溶液として、５．６８７ｇの溶液）、４．１４８７ｇのメチレンビスアクリルアミド（０．０２６９ｍｏｌ）及び２．０ｇのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．００９ｍｏｌ）を、２１５ｍｌの水と２０９ｍｌのメタノールとの混液中に含有する水性／メタノール調合物（約５０／５０水：メタノール中に７．６６ｗｔ％モノマー）で被覆した。メンブランを、コーティング溶液に１分間浸し、溶液を除去し、２枚のポリエステルシートの間で穏やかに搾って空気の泡を除去した。コーティング溶液を、次いで、メンブランを通して流し、過剰の溶液を除去した。メンブランを、その後、２分間水平にして風乾し、次いで、ポリエステルシート上で５８分間乾燥させた後に、両面をｅビーム照射（４０ＫＧｒａｙ）に曝露した（１５０ｐｐｍ酸素）。
【００８５】
実施例３．メンブラン流量及び透過性
単層のメンブランのメンブラン流量及び透過性を、２種の緩衝液及び脱イオン（ＤＩ）水を用いて決定した。１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ）が単層のメンブランを通って流れるのに要求される時間を、ある設定した圧力レベルにて決定した。単層のメンブランを、２５ｍｍガラスフィルターホルダ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に保持し、真空を、典型的に、２７”Ｈｇ又は５”ｍｍのＨｇに設定した。時間は、ｐＨ６．５での７０ｍＭリン酸緩衝液及びＤＩ水についても測定した。ニードルゲージを用いて、真空を調節した（ガラスフィルターホルダ、ステンレス鋼担体を有する２５ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ ＸＸ１０ ０２５ ３０、ニードルゲージ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ、Ｋ−０６３９３−６１、真空ゲージ、Ａｓｈｃｒｏｆｔ Ｃｏｒｐ、２３８Ａ ４６０−０２）。
【００８６】
実施例４．ＢＳＡアッセイ方法
全ての緩衝液は、室温にて貯蔵した。緩衝液を、真空の下で５分以上、連続的に混合しながら脱気した。
【００８７】
高導電率緩衝液Ａは、１００ｍＭのＮａＣｌを有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０である。緩衝液は、２５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、１５ｍｌの５Ｍ塩化ナトリウム、及び水（１Ｌの最終体積まで）を含む。緩衝液を濾過し、脱気し、使用前に導電率を測定した。この緩衝液Ａの導電率は、１２〜１３ｍＳ／ｃｍと記録された。低導電率緩衝液Ａは、１５ｍＭのＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ緩衝液、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０である。緩衝液は、２５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３ｍｌの５Ｍ塩化ナトリウム、及び水（１Ｌの最終体積まで）を含む。緩衝液を濾過し、脱気し、使用前に導電率を測定した。この緩衝液Ａの導電率は、３．１〜３．２ｍＳ／ｃｍと記録された。
【００８８】
緩衝液Ｂは、ストリップ緩衝液である（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）。緩衝液Ｂは、０．６９８ｍｌのリン酸、１２．３７１ｇのＮａＨ２ＰＯ４、及び水（１Ｌの最終体積まで）を含む。緩衝液を濾過し、使用前に脱気した。緩衝液Ｂの導電率は、７〜８ｍＳ／ｃｍと記録された。
【００８９】
リン酸緩衝液のストック溶液は、次のようにして調製した：０．５Ｍのリン酸一ナトリウム（ＦＷ＝１１９．９６）の溶液を、５９．９８ｇのリン酸一ナトリウムを１Ｌの最終体積の水に溶解することにより作製した。０．５Ｍのリン酸二ナトリウム（ＦＷ＝１４１．９６）の溶液を、７０．９８ｇのリン酸二ナトリウムを１Ｌの最終体積の水に溶解することにより調製した。０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液のストックを、０．５Ｍリン酸一ナトリウムと０．５Ｍリン酸二ナトリウムとを、撹拌し、且つ所望のｐＨに到達するまで監視しながら混合することにより調製した。ストック緩衝液を、適当であれば所望の濃度に到達するまで希釈し、塩を、必要に応じて所望の導電率に到達するまで加えた。リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５は、１００ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５と、水中の７ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌとを、１Ｌの最終体積まで混合することにより作製した、３５ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５である。緩衝液を濾過し、脱気し、使用前に導電率を測定した。緩衝液の導電率は、約８ｍＳ／ｃｍと記録された。リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４は、１００ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４と、水中の２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌとを、１Ｌの最終体積まで混合することにより作製した、１０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４である。緩衝液を濾過し、脱気し、使用前に導電率を測定した。緩衝液の導電率は、約７．２ｍＳ／ｃｍと記録された。
【００９０】
０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液を、４０ｍｌの水酸化ナトリウムの濃縮ストック（１２．５Ｎ）を９６０ｍｌの水に加えることにより作製した。溶液を濾過し、使用前に脱気した。
【００９１】
ＢＳＡのストックを、所望の緩衝液Ａ中で、約６ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製した。ストックを濾過し、脱気し、分光光度計を用いて２８０ｎｍにて吸光度を決定して、濾過後の実際のタンパク質濃度を確認した。この濃縮ストックを、暗所で４℃にて貯蔵した。濃縮ストックを、同じ緩衝液Ａで希釈して、０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の作業濃度を達成した。希釈した作業溶液を、暗所で４℃にて貯蔵した。溶液を室温まで温め（暗所で）、濃度を、使用前に分光光度計を用いて測定した。
【００９２】
ＢＳＡを用いるクロマトグラフィーアッセイは、次のようにして行った。クロマトグラフィー装置を、１５ｍｌの緩衝液Ａで平衡化した。１０ｍｌのＢＳＡ溶液（０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ濃度）を装置に注入した。１５ｍｌの緩衝液Ａを装置に通し、未結合の試料を洗い流した後に、１００％緩衝液Ｂ（１５ｍｌ）を通した。装置を、１０ｍｌの０．５Ｎ ＮａＯＨでさらに洗浄し、最後に、１５ｍｌの緩衝液Ａで再平衡化した。クロマトグラフィー装置中に存在するマトリックスの結合容量は、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１０％破過で（ＱＢ１０値ともいう）２８０ｎｍにて決定した（Bo-Lennart Johansson et al. J. Chromatogr. A 1016 (2003) 21-33）。
【００９３】
【表２】
表２は、本発明のマトリックスを用いることによる、ＢＳＡのより良好な結合容量を示す。セット５では、商業的に入手可能な第４級アンモニウム吸着材メンブラン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓにより製造されるＱ吸着材メンブラン）を用いた。表２に示すように、セット２、３及び４は、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液中で、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓにより製造される商業的なＱ吸着材メンブラン（セット５）よりも良好な結合容量を示す。これらの結果から、タンパク質と７〜８ｍＳ／ｃｍにて結合するリガンドの有効性が確認される。セット２及び３は、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液中で、商業的なＱ吸着材（セット５）よりも良好な結合容量を示す。この結果から、７〜８ｍＳ／ｃｍでのリガンドタンパク質相互作用の有効性が確認される。同様に、セット４でのイオン強度、導電率及びｐＨの変動のような３つの異なる条件のセットでの結合容量は、期待されたマルチモーダル効果を示す。ビニルベンジルトリメチルＱ（セット１で用いるような）は、異なるイオン強度、異なる導電率及び異なるｐＨにて、セット５と同様である。セット４で見られるようなマルチモーダル効果を観察するために、フェニル部分が、結合分子のための部位に向かって突出し得る。他の場合では、フェニル部分が結合部位に向かって突出していないならば、挙動は、セット５に記載される従来の第４級アンモニウムメンブラン吸着材のものと同様であり得る。
【００９４】
実施例５．宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）除去
ＨＣＰの除去は、７ｍＳ／ｃｍにて、表３に示すような比較的低いリガンド密度であっても、商業的なＱ吸着材メンブラン（セット６）よりも、本発明のマトリックス（セット７）についてより良好である。
【００９５】
【表３】
実施例６．凝集抗体（ｍＡｂ）の除去
ｍＡｂ供給原料（ｍＡｂ濃度＝６．４ｍｇ／ｍｌ）は、およそ２％のｍＡｂ凝集体を、プロテインＡクロマトグラフィーによる精製の後であるが高度精製の前に含有していた。セット８で用いたメンブランを用いるフロースルー（ＦＴ）モードでの高度精製（保持時間＝５秒）の後に（流速１．３ｍｌ／分）、ｍＡｂ供給原料中のＨＣＰ含量は、３０．９Ｅ３ｎｇ／ｍｌから９．０Ｅ３ｎｇ／ｍｌ（表４に示すように）メンブランまで（ＦＴ中に２９％）低下し、１．７０％ｍＡｂ凝集体であった。これと比較して、セット９で用いたメンブラン、すなわち商業的なＱ吸着材メンブランを用いるフロースルーモードでの精製の後に（１．６５ｍｌ／分流速）、ＨＣＰ含量は、３０．９Ｅ３ｎｇ／ｍｌから８．８Ｅ３ｎｇ／ｍｌメンブランまで（ＦＴ中に２８％）低下し、２％ｍＡｂ凝集体であった。これらの条件の下で（１０００ｍｇ ｍＡｂ／ｍｌメンブランのｍＡｂ投入量、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、７ｍＳ／ｃｍ）、両方のメンブランは、ＥＬＩＳＡアッセイにより査定して同じ量のＨＣＰを除去したが、マルチモーダル吸着材メンブラン（セット８に示すように）は、ｍＡｂ凝集体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより査定されるように、およそ１５％驚くほど減少させるが、商業的なＱ吸着材（セット９のように）は、ｍＡｂ凝集体レベルに対して影響しない。
【００９６】
【表４】
実施例７．ウイルスフィルターと組合せた吸着材メンブラン
本明細書で「高度精製メンブラン」というマルチモーダルメンブラン吸着材の高度精製の有効性を証明するために、高度精製フィルターの使用あり（図２に示すように）及びなしで、商業的なウイルス濾過メンブランの容量（Ｌ／ｍ2でのＶｍａｘ）を決定した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰ）。ポリクローナルＩｇＧ（Ｂａｘｔｅｒ：ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、１５５ｍＭ ＮａＣｌ中に５ｍｇ／ｍｌ）を装置に通過させて、ウイルスフィルター容量Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ2）を、漸進的細孔閉塞モデルを用いて決定した（参照Jonathan T. Royce, Practical Application of the Cake-Complete, Pore-Plugging Model for Sizing Normal Flow Filters PDA J Pharm Sci Technol September 2009 63:462-471）。
【００９７】
２つの実験を行った（表５）、実験１は、高度精製メンブランなしでの通常流れパルボウイルス（ＮＦＰ）だけについてであり、実験２は、約２４μｍｏｌのリガンド密度（約２２ｍｍの直径、及び約０．１６２ｍｌのメンブラン体積）を有する本発明のマルチモーダルマトリックスに基づくプロトタイプ装置（表２のセット４と同様）とともに、高度精製モード操作で用いるＮＦＰであった。マルチモーダル高度精製メンブランを用いるＮＦＰメンブランのＶｍａｘ容量（実験２）を、同一条件下で対照（実験１）のものと比較した。マルチモーダル高度精製メンブランは、ＮＦＰの容量（Ｖｍａｘ）の約２３倍の増加を示した。高度精製メンブランが、ウィルス除去メンブランの上流に並列される（図２に示すように）構成で、容量の増進が観察される。よって、上記の実験は、本発明の高度精製メンブランの使用が、ウィルス除去メンブランに入るポリクローナル供給原料の凝集体含量を有効に低減できることを明確に示す。この実施例は、高度精製及びウィルス除去の両方の単位操作を、図２に示すように単一の単位操作に組合せることができることをさらに証明する。
【００９８】
図３は、高度精製メンブランを用いないウィルス除去メンブランの容量と比較した、高度精製メンブランを用いながらのウィルス除去メンブランの容量の増加を示す。図３に示すように、高度精製メンブランを組み込まないウイルスフィルターの典型的な容量（２１０）は、２２リットル／平方メートル（Ｌ／ｍ2）であり、ウイルスメンブランフィルターの上流に並列された高度精製メンブランを有するウイルスメンブランの容量（２１２）の増加は、５０３Ｌ／ｍ2である。
【００９９】
この結果により、単一の単位操作を効率的に提供する、高度精製メンブランがウィルス除去フィルターの上流に並列されたプロセスを有することの利点が確認される。
【０１００】
【表５】
本発明のある特徴だけを本明細書で説明して記載したが、多くの改変及び変更が、当業者により見出される。よって、添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲内にある全てのそのような改変及び変更をカバーすることを意図することが理解される。
【符号の説明】
【０１０１】
２０１ 高度精製メンブラン
２０３ ウィルス除去メンブラン
２０５ 多層の分離マトリックス
２０７ 多層のウィルス除去メンブラン
２０９ 装置中の流れ
２１０ 高度精製メンブランを組み込まないウイルスフィルターの典型的な容量
２１２ ウイルスメンブランフィルターの上流に並列された高度精製メンブランを有するウイルスメンブランの容量
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体精製用のメンブラン及び関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
内在性不純物（宿主細胞ＤＮＡ又はタンパク質）又は外在性夾雑物（内毒素、ウイルス又は細菌）からの、抗体、プラスミドＤＮＡ、ワクチン又は血漿画分のような治療用又は診断用生体分子又は生物学的存在の精製は、バイオセパレーション及びバイオプロセスにおける成長分野である。大量の純粋な抗体が免疫学的及び治療用途に必要とされることが多い。この数年間で、モノクローナル又は組換え抗体及びそれらの構築物は、治療薬及び診断薬の臨床試験で検討されている分子の最大のクラスになっている。発現系及び生産戦略の補完として、簡単で安価に高純度抗体を得るための効率的な精製プロトコールが必要とされている。安価で拡大縮小可能で迅速な精製技術の開発が必要とされている。
【０００３】
塩に基づくタンパク質分画又は超遠心分離のような伝統的な精製方法は、経済的でなく時間がかかる。各々特異的分子相互作用に依拠するビーズ状クロマトグラフィー技術も抗体及びウイルスの精製に用いられており、アフィニティー、疎水性相互作用及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。主にビーズでのクロマトグラフィーが、抗体又はウイルスの精製に用いられている。慣用されるクロマトグラフィー技術は、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを始めとする、相互作用の原理に基づくものである。従前、個々の特定の分離目的に最適な固定相を設計するための努力がなされてきた。かかる固定相は、担体又はベースマトリックスに、結合基を含むリガンドを結合したものであることが多い。生体高分子を高い純度及び収率で経済的かつ効率的に精製するためのマルチモーダルクロマトグラフィー分離技術を開発するため、様々なクロマトグラフィー技術の組合せを用いることができる。
【０００４】
或いは、生体分子の高効率で高流量の分離を達成するために、メンブランクロマトグラフィーが用いられている。しかし、特定の目標分子の精製に関してプロセスを最適化するために、特有の操作条件が必要とされることが多い。さらに、抗体、内毒素又はウイルスのような種々の試料によって最良の分離マトリックスが変動することがある。例えば、バイオテック産業では、ペプチド及びタンパク質（例えば抗体）、核酸、又はウイルスを精製するために特異的なプロセスを設計する必要がある。さらに、抗体の精製では、抗体の種類が、分離マトリックスの選択に重要な意味をもつことがある。そのため、絶え間なく開発されている新規生成物を精製するための選択の幅を広げるために、代替分離マトリックスが必要とされている。
【０００５】
微量不純物が、メンブランの容量に影響することがある。ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質又はタンパク質凝集体のような微量不純物を除去するために、従前、様々なメンブラン及びクロマトグラフィー樹脂が用いられてきた。タンパク質は、凍結融解操作又は下流精製におけるプロセス保留工程で、凝集体を形成することがある。そのため、ウィルス除去工程及び目標タンパク質分子の最終処方へと進む前に、凝集タンパク質及び微量不純物を除去することが常に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第２００９／００３５５５２号
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、広義には、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂とを含む新規な分離装置、並びに該装置を抗体精製に用いる方法に関する。精製プロセスは、同じ単位操作で高度精製工程をウイルス除去工程と組合せることによって、より効率的にできる。このことは、多孔質担体とポリマー樹脂とを含む分離マトリックスを、ウィルス除去メンブランと、同じ装置中で並列させることにより達成できる。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、抗体含有生体試料から１種以上の不要な化合物を分離するための装置を提供する。本装置は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂であって、ビニル架橋剤並びに第４級アンモニウム基及び２つ以上の環構造を含む芳香族モノマーに由来する構造単位を含むポリマー樹脂とを含む。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、抗体含有生体試料から不要な化合物を分離するための装置を提供する。本装置は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂であって、ビニル架橋剤及び式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ又はそれらの組合せに由来する構造単位を有するモノマーに由来する構造単位を含むポリマー樹脂とを含む。
【００１０】
【化１】
式中、Ｒ1及びＲ2は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せであり、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数であり、Ｒ3及びＲ4は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、ベンジル又は置換ベンジルである。さらに、ポリマー樹脂は、生物学的溶液中に存在する１種以上の化合物を、マルチモーダル相互作用によって選択的に保持できる。
【００１１】
一実施形態では、本装置は、ウイルスを除去できるウィルス除去メンブランをさらに含んでいて、ポリマー樹脂を含有する多孔質担体は、ウィルス除去メンブランの上流又は下流に配置される。
【００１２】
一実施形態では、抗体含有生体試料中に存在する不要な化合物から抗体を分離する方法は、生体試料を上記装置に、試料がポリマー樹脂と接触するように添加する工程と、生体試料中に存在する１種以上の化合物を、マルチモーダル相互作用によって選択的に保持する工程と、未結合の抗体を含む通過（フロースルー）流出液を回収する工程とを含む。
【００１３】
別の実施形態では、本方法は、同じ装置中でウィルス除去メンブランの上流に、ポリマー樹脂を含有する多孔質担体を組み込んだ高度精製工程を用いることによって、生体試料とのウィルス除去メンブランの容量の改善をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗体精製のための伝統的なバイオプロセスと圧縮バイオプロセスとの比較を示す２つのフローチャートを示す。
【図２】装置中での流れの方向に対する、高度精製メンブランの位置及びウィルス除去メンブランの位置を示す構成を示す。
【図３】ウイルスメンブランが、自立型装置であるか又は分離マトリックスを有する装置に組み込まれている、ウイルスメンブラン濾過の容量を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のこれらの及びその他の特徴、態様並びに利点は、図面全体を通して同様の文字が同様の部分を示す添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読むことによって、よりよく理解されるようになる。
【００１６】
請求される発明の主題をより明確且つ簡潔に記載するために、以下の記載及び添付の特許請求の範囲で用いられる具体的な用語について、以下の定義を用いる。明細書全体を通して、具体的な用語の例示は、非限定的な例とみなされる。
【００１７】
そうでないと示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いる成分、分子量のような特性、反応条件などの量を表す全ての数字は、全ての場合で用語「約」で修飾されていると理解される。従って、別途記載しない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲で示す数値パラメータは、本発明により得ることを求める所望の特性に依存して変動できる近似値である。最低限でも、そして特許請求の範囲に均等論を適用することを制限することを試みることなく、各数値パラメータは、報告される有効数字の数に鑑みて、且つ通常の丸めの技法を用いることにより少なくとも解釈される。
定義
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、明細書で互換的に用いられる。
【００１８】
用語「分離マトリックス」又は「樹脂」は、担体に含まれる材料であって、該担体が、それに直接的若しくは間接的に結合したリガンドを有するか又は架橋ポリマーで被覆されており、官能基を含む１種以上のリガンドがポリマーと結合している材料のことをいう。より具体的には、本明細書で用いる分離マトリックスは、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂を有する多孔質担体のことをいう。
【００１９】
用語「マルチモーダル分離マトリックス」又は「混合モード分離マトリックス」とは、結合のために１種以上の化合物と相互作用する２つ以上の異なる、しかし協同的な部位を提供できる分離マトリックスのことをいう。例えば、これらの部位のうちの１つは、リガンドと対象の化合物との電荷−電荷相互作用をもたらすことができる。その他の部位（複数可）は、電子受容体−供与体相互作用並びに／又は疎水性及び／若しくは親水性相互作用をもたらすことがある。電子供与体−受容体相互作用は、それらに限定されないが、水素結合相互作用、π−π相互作用、カチオン−π相互作用、電荷移動相互作用、双極子間相互作用又は誘起双極子相互作用を含む。
【００２０】
用語「脂肪族基」とは、１以上の結合価を有し、環状でない直鎖状又は枝分れの原子の並びからなる有機基のことをいう。脂肪族基は、１つ以上の炭素原子を含む。脂肪族基を含む原子の並びは、窒素、硫黄、ケイ素、セレン若しくは酸素のような複素原子を有することがあるか、又は炭素及び水素だけで構成されることがある。脂肪族基は、環状でない直鎖状又は枝分れの原子の並びの一部として、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロアルキル基、共役ジエニル基、アルコール基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、カルボン酸基、アシル基（例えばエステル及びアミドのようなカルボン酸誘導体）、アミン基、ニトロ基などのような広範囲の官能基を包含する。例えば、４−メチルペンタ−１−イル基は、メチル基を含むＣ６脂肪族基であって、該メチル基が、アルキル基である官能基である。同様に、４−ニトロブタ−１−イル基は、ニトロ基を含むＣ４脂肪族基であって、該ニトロ基が官能基である。脂肪族基は、同じ又は異なっていてよい１種以上のハロゲン原子を含むハロアルキル基であってよい。ハロゲン原子は、例えば、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を含み得る。１種以上のハロゲン原子を含む脂肪族基は、アルキルハロゲン化物であるトリフルオロメチル、ブロモジフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、ヘキサフルオロイソプロピリデン、クロロメチル、ジフルオロビニリデン、トリクロロメチル、ブロモジクロロメチル、ブロモエチル、２−ブロモトリメチレン（例えば−ＣＨ２ＣＨＢｒＣＨ２−）などを含む。脂肪族基のさらなる例は、アリル、アミノカルボニル（すなわち−ＣＯＮＨ２）、カルボニル、２，２−ジシアノイソプロピリデン（すなわち−ＣＨ２Ｃ（ＣＮ）２ＣＨ２−）、メチル（すなわち−ＣＨ３）、メチレン（すなわち−ＣＨ２−）、エチル、エチレン、ホルミル（すなわち−ＣＨＯ）、ヘキシル、ヘキサメチレン、ヒドロキシメチル（すなわち−ＣＨ２ＯＨ）、メルカプトメチル（すなわち−ＣＨ２ＳＨ）、メチルチオ（すなわち−ＳＣＨ３）、メチルチオメチル（すなわち−ＣＨ２ＳＣＨ３）、メトキシ、メトキシカルボニル（すなわちＣＨ３ＯＣＯ−）、ニトロメチル（すなわち−ＣＨ２ＮＯ２）、チオカルボニル、トリメチルシリル（すなわち（ＣＨ３）３Ｓｉ−）、ｔ−ブチルジメチルシリル、３−トリメトキシシリルプロピル（すなわち（ＣＨ３Ｏ）３ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ビニル、ビニリデンなどを含む。さらなる例として、Ｃ１〜Ｃ１０脂肪族基は、１つ以上であるが１０個以下の炭素原子を含有する。メチル基（すなわちＣＨ３−）は、Ｃ１脂肪族基の例である。デシル基（すなわちＣＨ３（ＣＨ２）９−）は、Ｃ１０脂肪族基の別の例である。
【００２１】
用語「表面」は、全ての外部表面を意味し、多孔質担体の場合に細孔の外側の表面及び内側の表面を含む。
【００２２】
用語「通過画分」とは、移動相を分離マトリックスに投入した後に分離マトリックスから出てくる液体のことをいう。通過画分は、タンパク質又は分離マトリックスと結合しなかったその他の化合物を含み得る。
【００２３】
用語「溶離液」とは、１種以上の化合物を分離マトリックスから遊離させるために用いる適切なｐＨ及び／若しくはイオン強度の溶液又は緩衝液のことをいう。
【００２４】
用語「不要な化合物」とは、クロマトグラフィーリガンド又は分離マトリックスと結合できる物質のことをいう。不要な化合物は、タンパク質（これは、抗体のような目標化合物を除外し得る）、溶出プロテインＡ、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素、栄養素のような生体分子並びに細胞培養培地の成分、消泡剤及び抗生物質であり得る。不要な化合物は、典型的に「不純物」と呼ばれることがあるその他の生成物、例えば凝集体、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素、ミスフォールド種（例えばミスフォールドタンパク質）又は変性された種のことをいうこともある。
【００２５】
用語「捕捉工程」とは、液体クロマトグラフィーの関係で、分離手順の最初の工程のことをいう。最も一般的には、捕捉工程は、ある程度の清澄化を含むが、より一般的に、この工程の結果として、濃縮、安定化及び可溶性不純物からの著しい精製が得られる。捕捉工程の後に、中間精製を行うことがあるが、これは、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素、栄養素、細胞培養培地の成分、消泡剤、抗生物質、又は凝集体、ミスフォールド種及び凝集体のような生成物関連不純物のような残存量の不純物をさらに低減する。最後に、一連の高度精製工程を行って、残存宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、タンパク質凝集体及び内毒素のような微量不純物を除去してよい。
【００２６】
用語「高度精製工程」は、液体クロマトグラフィーの関係で、分離手順の最初の精製工程の後のことをいう。最も一般的には、高度精製工程は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素及びタンパク質凝集体のような微量不純物を低減するために採用される。これらの不純物は、より一般的に、この工程による。高度精製工程は、目標分子が分離マトリックスと結合せず、微量不純物が結合するフロースルーモード操作で行うことができる。別の単位操作として、高度精製工程の後には、最も一般的には、濾過によるウィルス除去が行われる。
【００２７】
用語「使い捨ての」とは、本明細書で、装置中のクロマトグラフィーチャンバ及び分離マトリックスの関係で、単回使用又は制限された回数の使用を意図するマトリックスを意味する。使い捨ての装置（例えばカラム、ビーズ若しくは分離マトリックス又は多孔質担体）は、非常に少量でも害を及ぼす夾雑物を除去するために有利に用いられる。使い捨ての装置は、夾雑物及び相互汚染を導入する可能性を低減するために、生体分子の滅菌処理のために望ましい。
【００２８】
１種以上の実施形態は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂とを含む、抗体含有生体試料から不要な化合物を分離するための装置を含む。装置自体は、クロマトグラフィーチャンバ、管状過カラム、モノリス、フィルター又はメンブラン、キャピラリー、マイクロフルイディックチップ、プリーツカートリッジ若しくはカプセル又はカセット、らせん体、中空繊維、シリンジフィルター、マニフォールド、或いはマルチウェルプレートの形態であってよい。全ての装置は、本発明のポリマー樹脂で被覆された多孔質担体を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ポリマー樹脂は、多孔質担体構造の細孔内に配置される。多孔質担体は、メンブラン、ウェブ、フィルター、繊維又はメッシュの形態で作製してよい。
【００３０】
多孔質担体は、複数の細孔を含む。細孔径は、約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲であってよい。いくつかの具体的な実施形態では、細孔径は、約２μｍ〜約５μｍの範囲である。細孔は、同一のサイズ／形状又は異なるサイズ／形状のものであってよい。細孔は、円形、楕円形、方形、正方形又は三角形の形状であってよい。
【００３１】
多孔質担体は、有機又は無機の材料を用いて作製してよい。いくつかの実施形態では、多孔質担体は、ポリマーを用いて作製される。多孔質担体は、天然高分子（例えばアガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラギーナン、ゲラン、アルギネート、ペクチン又はデンプン）を用いて、又は合成高分子（例えばポリフェニレンエーテル、ポリエーテルスルホン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリフェニレンのようなポリアリールエーテル、ポリスチレン、ポリアクリレート若しくはポリメタクリレートのようなポリビニルポリマー、ポリビニルエステル、ポリアクリルアミド、ポリビニルエステル、ポリビニルアミド、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ポリエステル）から調製してよい。用いられるポリマーは、ホモポリマー、コポリマー、架橋ポリマー、ブロックコポリマー、ランダムポリマー又はポリマーブレンドであってよい。上記のポリマーと水溶性ポリマーとのブレンドが、薄膜凝固により頻繁に加工され、該水溶性ポリマーは、細孔の形態を制御するように作用する。多孔質担体を作製するために用いることができる適切なポリマーは、それらに限定されないが、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅ−ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリフェニレンオキシド、ポリカーボネート、ポリエステル、セルロース又はセルロース誘導体を含む。いくつかのその他の実施形態では、担体は、シリカのような無機ポリマーから調製される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、多孔質担体の細孔内に配置されるポリマー樹脂は、ビニル架橋剤と、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ又はそれらの組合せに由来する構造単位を有するモノマーとに由来する構造単位を含む。
【００３３】
【化２】
式Ｉにおいて、Ｒ1及びＲ2は独立に水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せである。式Ｉ及びＩＩにおいて、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数である。いくつかの実施形態では、モノマーは、２つ以上の環構造を含む。
【００３４】
式（Ｉ）に示すように、スチレン置換第４級アミンはＲ1基を含み、これはアミンの窒素に接続されるが、Ｒ2は、ベンゼン環のオルト、メタ又はパラ位に結合し得る置換基である。Ｒ1が水素である場合、式（Ｉ）は、第３級アミンを表す。Ｒ1は、１〜２０炭素原子含有アルキル、例えば置換を有するか若しくは有さない２〜１６又は３〜１８炭素原子含有アルキルを含み得る。置換基Ｒ2は、１〜２０炭素原子を含む。Ｒ2は、２〜１８炭素原子のような１〜２０炭素原子を含むことができ、これらは適宜置換される。Ｒ2が水素である場合、ベンゼン環は、ＣＨ２基を介して窒素に結合する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、アリール又は置換アリールであり得る。Ｒ1のアリール環系は、１種以上の置換又は非置換フェニル基を含んでよいが、但し、置換（複数可）が、結合特性を損なわないことを条件とする。よって、Ｒ1は、１種以上の芳香環、例えばフェニレン、ビフェニレン又はナフタレン構造及びその他の芳香環系を含み得る。芳香環は、１種以上の窒素、酸素又は硫黄原子を含有する複素環、例えばピリジン、ピリミジン、ピロール、イミダゾール、チオフェン又はピランであり得る。例示的な置換Ｒ1基は、ヒドロキシフェニル（２−、３−及び４−）、２−ベンズイミダゾリル、メチルチオキシフェニル（２−、３−及び４−）、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル（２−、３−及び４−）、４−（２−アミノエチル）フェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２，４，５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル、及び４−スルホンアミドフェニルからなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｒ1は、非置換フェニルである。代替の実施形態では、Ｒ1は、１つ以上のＯＨ基で置換されたフェニルである。
【００３６】
さらに、Ｒ1及びＲ2は、リガンドの結合特性が損なわれない限りは、任意の適切な置換基で置換されてよい。例えば、より親水性のリガンドが望ましいならば、これは、ＯＨ基のような１種以上の親水性基を含んでよい。代わりに、置換は、リガンドの疎水性を増進させてよく、この場合、リガンドは、アルキル基及び／又はフッ素含有基のような１種以上の疎水性基を含んでよい。最後に、置換は、１つ以上の追加の機能、例えばリガンドのマルチモーダル特徴を増進するための荷電された物体を導入するために用いてよい。さらに、Ｒ1及びＲ2は、直鎖状であっても、枝分れがリガンドの結合特性を損なわない限り、枝分れであってよい。
【００３７】
式ＩＩに示すように、ピペリジン環は、置換ベンゼン、より具体的にはビニルベンゼンに連結しているＣＨ２に結合している。ピペリジン環は、ビニルベンゼンに結合しているペンダント炭化水素鎖として存在する。ｍ及びｎは独立に１〜５の整数である。いくつかの実施形態では、生体試料中に存在する１種以上の化合物と結合するリガンドは、ビニルベンゼン又はスチレンを含む。
【００３８】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ3及びＲ4は各々独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル又はそれらの組合せである。ある実施形態では、式ＩＩＩは、窒素原子に結合した２つのビニル基を含み、Ｒ3及びＲ4は各々独立に水素原子である。別の実施形態では、Ｒ3及びＲ4は、２〜１８炭素原子を含んでよく、これらは適宜置換されている。さらに別の実施形態では、式ＩＩＩは、２つ以上の環構造を含む。
【００３９】
別の実施形態では、Ｒ3及びＲ4は各々独立に、アリール又は置換アリール基である。アリール環系Ｒ3又はＲ4は、１種以上の置換又は非置換フェニル基を含んでよいが、但し、置換（複数可）がリガンドの結合特性を損なわないことを条件とする。よって、Ｒ3又はＲ4は、１種以上の芳香環、例えばベンジル、フェニレン、ビフェニレン又はナフチレン構造及びその他の芳香環系（結合部分）を含み得る。芳香環は、複素環、すなわち１種以上の複素原子（例えば窒素、酸素又は硫黄原子）を含有するもの、例えばピリジン、ピリミジン、ピロール、イミダゾール、チオフェン又はピランであり得る。例示的な置換Ｒ3及びＲ4基は、ヒドロキシフェニル（２−、３−及び４−）、２−ベンズイミダゾリル、メチルチオキシフェニル（２−、３−及び４−）、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル（２−、３−及び４−）、４−（２−アミノエチル）フェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２，４，５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル、及び４−スルホンアミドフェニルからなる群から選択される。有利な実施形態では、Ｒ3又はＲ4は、非置換フェニルである。代替の実施形態では、Ｒ3又はＲ4は、１つ以上のＯＨ基で置換されたフェニルである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は、式ＩＶに由来する構造単位を含む。Ｒ5及びＲ6は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せであり、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数である。
【００４１】
【化３】
ある実施形態では、ポリマー樹脂は、式Ｖに由来する構造単位をさらに含んでよい。
【００４２】
【化４】
式中、ＺはＮＨ又はＯであり、Ｒ7は、水素若しくはメチル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、置換アルキル又はそれらの組合せであり、ｎは、１〜５の整数である。
【００４３】
式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩに示すように、本発明によるリガンドは、ビニル置換ベンゼン誘導体を含み、これは、多孔質担体に架橋して接着し、よって第４級アミン及びフェニル基を含む共役リガンドを創出するために適切である。その結果、固定化されると、リガンドは、マルチモーダルアニオン交換リガンドとして機能できる。なぜなら、正に荷電された第４級アミン基に加えて、これは、疎水性である芳香環構造も含むからである。
【００４４】
よって、ポリマー樹脂は、一般的に、複数のリガンドを含む。具体的な実施形態では、ポリマーマトリックスは、上記の式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに由来する第１リガンドを、第２の種類のリガンドと組合せて、又はリガンドの混合物を含み得る。第２リガンドも、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩから選択してよい。第１リガンドは、リガンドの合計量の約３０％以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、最も好ましくは約９０％以上で存在してよい。このような組合せリガンド分離装置は、１種以上の不要な化合物との相互作用を増進して、分離特性を改善するように設計できる。第２の種類のリガンドは、電荷反発により目標化合物を溶出するために用いられるカチオン交換体のような１種以上の荷電基、疎水性基、水素結合できる基、アフィニティー基などを含み得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ポリマー樹脂は、架橋剤を含み、該架橋剤は、ビニル架橋剤であってよい。ビニル架橋剤は、Ｎ’，Ｎ”−メチレンビスアクリルアミドを含む。ビニル架橋剤は、熱、光、放射線又はそれらの組合せでの処理により活性化され得る。いくつかのその他の実施形態では、架橋剤は、非ビニル架橋剤であってよい。
【００４６】
分離装置は、多孔質担体と、多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂とを含む。本明細書で用いる場合、多孔質担体とポリマー樹脂との組合せは、交換可能に、その作用の形態、分離工程及び／又は高度精製工程に関連して、分離マトリックス又は高度精製マトリックスということがある。
【００４７】
装置の分離マトリックスは、ポリエーテルスルホン多孔質担体と、表１に示すモノマー１、モノマー２及び架橋剤の１種以上に由来する構造単位を含むポリマー樹脂とを含む。プロトタイプ１について、モノマー１は、式ＩＶ（式中、Ｒ5は、メチル基であり、ｎは、１であり、１つのＨは、ＣＨ２のＣに結合し、（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−ＯＨ部分は、ここではＮに結合している別のメチル基で置き換えられている）に部分的に由来する。プロトタイプＩは、表１に示すように、式ＩＩＩに由来する構造単位（構造２）をさらに含んでよい。プロトタイプ２について、構造単位（モノマー１）は、式ＩＩに由来する。プロトタイプ３及びプロトタイプ４は、式Ｉに由来する構造単位（モノマー１）を含む。プロトタイプ４は、式Ｖに由来する構造単位（モノマー２）をさらに含む。Ｎ’，Ｎ”−メチレンビスアクリルアミドを、各プロトタイプについてビニル架橋剤として用いた。水及びメタノールを、プロトタイプ２、３及び４について溶媒として用いた。水だけをプロトタイプ１について溶媒として用いた（表１に示すように）。全てのプロトタイプについて、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９を開始剤として用い、ポリマーを硬化するためにＥビームを用いた。「メンブランプロトタイプ」は、「分離マトリックス」と互換的に用いている。
【００４８】
【表１】
本発明による装置は、クロマトグラフィーチャンバ、モノリス、フィルター若しくはメンブラン、キャピラリー、マイクロフルイディックチップ、管状カラム、プリーツカートリッジ若しくはカプセル、カセット、らせん体、中空繊維、シリンジフィルター又はマニフォールドのような、分離において従来用いられる任意のその他の形状をとることができる。例えば、装置は、単層メンブラン又はフィルター装置を構成する複数層のメンブランのようなメンブラン状の構造を含み得る。
【００４９】
一実施形態では、分離マトリックスは、使用前又は使用後に乾燥させることができる。乾燥した構造を液体に浸漬して、使用前にその元の形を再生することができる。
【００５０】
ポリマー樹脂は、試料中に存在する１種以上の不要な化合物を保持できる。一実施形態では、１種以上の不要な化合物は、メンブラン上に、１種以上の不要な化合物がメンブランと結合することにより保持され得る。ポリマー樹脂は、試料中に存在する１種以上の不要な化合物と結合できる。試料は、抗体のような１種以上の目標化合物と、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、内毒素などのような１種以上の不要な化合物とを含むことがある。一実施形態では、ポリマー樹脂は、試料中の１種以上の不要な化合物を、結合により保持できる。不要な化合物は、ポリマー樹脂に、マルチモーダル相互作用によって結合することがある。非限定的な例としてのマルチモーダル相互作用は、イオン性相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用又は双極子間相互作用であってよい。マルチモーダル相互作用は、水素結合相互作用、疎水性相互作用又はイオン性相互作用の２つ以上を含んでよい。一実施形態では、マルチモーダル相互作用は、水素結合相互作用及び疎水性相互作用を含むことがある。別の実施形態では、マルチモーダル相互作用は、水素結合相互作用及びイオン性相互作用を含むことがある。さらに別の実施形態では、マルチモーダル相互作用は、疎水性相互作用及びイオン性相互作用を含むことがある。
【００５１】
いくつかの実施形態では、試料は、抗体を含有する生体試料であり、対象の分子とは別に１種以上の化合物を含んでよい。「対象の分子」又は「目標化合物」とは、本明細書で言及する場合、対象の分子とともに不要な化合物を含有する混合物から分離する必要がある分子である。例えば、対象の分子は、抗体と宿主細胞タンパク質とを含有する混合物から分離する必要がある抗体であり得る。対象の分子（目標化合物）は、それらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、内毒素、ウイルス及び抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、不要な化合物は、ＤＮＡ、内毒素、ウイルス、タンパク質凝集体又は宿主細胞タンパク質であり得る。ポリマー樹脂のリガンドは、試料中に存在する対象の分子が、ポリマー樹脂と結合せず、マトリックスを通過するような様式で選択できる。対象の分子は、次いで、後続の下流の操作で通過画分からさらに処理できる。生体試料中に存在する１種以上の不要な化合物は、ポリマー樹脂と結合することがある。ポリマー樹脂は、試料中に存在する１種以上の不要な化合物と、特異的結合部位により又は１種以上の化合物上に存在する荷電部位（例えば負電荷）を用いる静電相互作用を介して相互作用することがある。いくらかの不要な化合物が樹脂と結合せず、マトリックスを通過して通過画分流中に入ることが可能である。よって、これらの不要な化合物を対象の分子から除去するために、さらなる精製が必要になることがある。このことは、高度精製工程をさらに改善するために異なるリガンド部分を含む異なるポリマー樹脂を有する別の構造により達成できる。ポリマー樹脂と結合した不要な化合物は、１種以上の疎水性部位を含むことがある。不要な化合物は、ポリマー樹脂中に存在する正荷電基と相互作用し得るアニオン荷電基を含むことがある。
【００５２】
小規模精製のために、小面積の構成での言及した装置フォーマットのいずれも、高度精製単位操作として純度を改善するために用いることができる。不純物（又は不要な化合物）を抗体のような治療用又は診断用の生体分子から除去することによる高度精製の工程のために、小さい管状カラム又はシリンジフィルターが有用になり得る。１つ以上の入口及び出口をメンブラン装置に装着して、移動相の内向き流れ及び外向き流れを維持することができる。一実施形態では、装置は、単層又は多層フォーマットの分離マトリックスの形態であってよい。装置を、装置の入口に装着されたポンプ又は圧力容器と接続して、分離マトリックスを通して流速を維持できる。具体的な実施形態では、装置は、単層又は多層フォーマットの分離マトリックスであり、使用前に滅菌できる。
【００５３】
装置は、いくつかの実施形態では、追加の分離メンブランをさらに含むことがある。追加のメンブランは、目標分子を、フロースルーモード操作で、生体試料からある化合物を選択的に除去することにより高度精製できるものであってよい。この追加の高度精製工程は、図１の伝統的なプロセスに示すように、中間精製操作の後に配置できる。いくつかの実施形態では、追加の高度精製工程は、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、内毒素、ウイルス及び／又は凝集抗体のような微量不純物を除去する能力を有する。図１は、ウィルス除去専用工程と組合せた高度精製工程の実施形態を組み込んだ圧縮プロセスを示す。
【００５４】
ある実施形態では、装置は、分離マトリックスと隣接して配置されるウィルス除去メンブランを含み得る。このことは、高度精製メンブラン２０１及びウィルス除去メンブラン２０３として機能する分離マトリックスを示す図２に示す。いくつかの実施形態では、一連の分離マトリックス（高度精製用）及びウィルス除去メンブランが、装置中に存在し得る。
【００５５】
図２は、装置中の流れ２０９の方向に対するメンブランの位置をさらに示す。多層の分離マトリックス２０５は、多層のウィルス除去メンブラン２０７と接触している。最後の高度精製メンブラン２０１の層と最初のウィルス除去メンブラン２０３の層との界面は、装置中の高度精製工程とウィルス除去工程との境界を構成する。
【００５６】
一実施形態では、装置は、不純物を高度精製するための分離マトリックスと、ウイルスを除去するためのウィルス除去メンブランとをともに含み、該分離マトリックスは、ウィルス除去メンブランと並列している。一実施形態では、分離マトリックス（又は複数のマトリックス）は、ウィルス除去メンブランの上流で並列してよい。別の実施形態では、分離マトリックス（複数のマトリックス）は、ウィルス除去メンブランの下流で並列してよい。
【００５７】
具体的な実施形態では、分離装置は、流速、時間、純度又は塩濃度の詳細を決定できる表示装置に接続できる。分離装置、より具体的にはポリマー樹脂を含有する多孔質担体は、ポリマー樹脂を含有する多孔質担体、コントローラ、コンピュータ、表示装置、液体（移動相）取扱システム、通過画分回収システムの１種以上を含む分離システムの一部であってよい。分離システムは、オペレータの介入あり又はなしでその機能の１種以上を行うように自動化されていてよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、分離装置は、滅菌状態で提供され、単回使用の後に処分できる。単回使用メンブラン装置は、使い捨てのメンブラン装置と記載することがある。抗体のような治療用化合物の精製のために使い捨てのメンブラン装置を用いる利点は、２つの異なるプロセス間の相互汚染を回避することが可能になることである。メンブラン装置は、使い捨てのモノリス、使い捨ての管状カラム、使い捨てのプリーツカートリッジ、使い捨てのカプセル、使い捨てのカセット、使い捨てのスパイラルフィルター、使い捨ての中空繊維フィルター、使い捨てのシリンジフィルター又は使い捨てのマニフォールドの形態であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、分離装置は、再利用可能であってよい。再利用可能な装置の場合では、マトリックスを通して移動相を通過させた後に、溶離液を用いてマトリックスを数回洗浄する。最後の溶離液の通過画分を試験して、溶離液中にタンパク質若しくはペプチド又はその他の化合物が存在しないことを確実にできる。マトリックスは、次いで、さらなる使用のために適切な緩衝液を用いて平衡化してよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、装置を、使用前に適切な方法によりさらに滅菌する。滅菌処理は、オートクレーブ処理すること若しくは内部マトリックスを飽和蒸気に曝露することのような熱処理により、４５ｋＧｒｙ以下の十分な線量での放射線照射により、又は滅菌のための任意のその他の従来の方法を用いることにより行うことができる。
【００６１】
一実施形態では、抗体含有生体試料から不要な化合物を分離するための装置を調製する方法が提供され、該方法は、装置中でウィルス除去メンブランと並列された分離マトリックスを用意する工程と、装置を適切な緩衝液で平衡化する工程とを含む。いくつかの実施形態では、本発明の分離マトリックスは、タンパク質精製のために用いることができる。タンパク質は、抗体、抗体断片、又は抗体を含む融合タンパク質であってよい。別の実施形態では、分離マトリックスは、任意のその他の化合物、例えばポリペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、プラスミド、ウイルス、プリオン、細胞（例えば原核又は真核細胞）、脂質、炭水化物、有機分子、目標薬物、又は診断用マーカー分子からなる群から選択されるものの分離のために用いることができる。当業者が気づくように、本出願では、分離との用語は、精製、単離、及び不要な化合物の除去について用いるが、これは、診断目的のための抗体のような目標化合物の同定も包含する。
【００６２】
一実施形態では、分離マトリックスとウィルス除去メンブランとを含む装置に試料を加えることを含む、試料中に存在するその他の不要な化合物から抗体を分離する方法が提供される。試料は、分離マトリックスと接触し、分離マトリックスを通過し、その後、ウィルス除去メンブランと接触し、最後にウィルス除去メンブランを通過する。代替の実施形態では、分離マトリックスに先だって、試料をウィルス除去メンブランと接触させ、且つ通過させてよい。結合しなかった抗体を、装置から、フロースルーモード操作で回収できる。上記の実施形態で、重力場、ポンプ、圧力容器又はそれらの組合せの支援を用いて、試料を装置に通過させてよい。
【００６３】
装置を通過する試料は、細胞抽出物から得られた上清であってよい。いくつかの実施形態では、試料を分離マトリックスと接触させる前に、１つ以上の予備精製工程を行ってよい。１つ以上の予備精製工程は、機械的濾過、遠心分離、超遠心分離、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は電気泳動を含み得る。
【００６４】
抗体のような対象の化合物（目標化合物）は、生体試料の１種以上のその他の不要な化合物から、生体試料を含む移動相を上記の分離マトリックスと接触させることにより分離できる。具体的な実施形態では、本方法は、液体クロマトグラフィーの原理を用いて、すなわち移動相を、本発明による分離マトリックスを含む装置に通すことにより行うことができる。代替の実施形態では、本方法は、液体クロマトグラフィーの原理を用いて、すなわち移動相を、本発明による高度精製メンブランとウィルス除去メンブランとを含む装置に通すことにより行うことができる。
【００６５】
本方法の一実施形態では、不要な化合物は、分離マトリックスに吸着されるが、抗体のような所望の化合物は、吸着されることなく移動相中に残る。別の実施形態では、凝集若しくはミスフォールドタンパク質又はペプチド或いはウイルスのような不要な化合物は、ウィルス除去メンブランに吸着されるが、抗体のような所望の化合物は、吸着されることなく移動相中に残る。当業者により理解されるように、吸着される化合物の性質及びアイデンティティーは、生体試料の起源に依存する。マトリックスに吸着される不要な化合物の非限定的な例は（所望の抗体が吸着されない場合）、細胞及び細胞細片、タンパク質（所望の抗体以外）及びペプチド、凝集形のタンパク質若しくはペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸、内毒素、ウイルス、培養培地からの残渣などである。具体的な実施形態では、本発明の分離マトリックス若しくはウィルス除去メンブラン又はそれらの両方は、メンブラン装置にもたらされ、移動相は、装置を、重力及び／又はポンプの使用若しくは圧力により通過し、抗体が通過画分中で回収される。具体的な実施形態では、メンブラン装置は、クロマトグラフィー装置であってよい。
【００６６】
一実施形態では、本方法は、フロースルーモード操作を用いる高度精製工程を構成する。具体的な実施形態では、生体試料は、粗製の供給原料であり、これは、本発明による高度精製メンブラン（分離マトリックス）及びウィルス除去メンブランと接触させる前に濾過される。その結果、この実施形態は、生体試料が機械的手段により予備精製されていても、高度精製工程を構成する。抗体を生成する宿主細胞は、宿主細胞タンパク質として一般的に知られるいくつかのその他のタンパク質も含むことがある。このような宿主細胞タンパク質は、酵素（例えばプロテアーゼ）及び宿主細胞により生成されるその他のタンパク質を含み得る。よって、一実施形態では、生体試料の宿主細胞タンパク質は、宿主細胞タンパク質を分離マトリックスに吸着させることによって、本発明の方法により実質的に除去される。
【００６７】
代替の実施形態では、本方法は、中間精製又は高度精製工程のような清澄化プロトコールにおける第２、第３又は第４のクロマトグラフィー工程としてさえ用いることができる。よって、一実施形態では、移動相は、本分離マトリックスにアプライされた抗体含有生体試料を含む。
【００６８】
本方法は、哺乳類宿主、例えばマウス、げっ歯類、霊長類及びヒトを起源とする抗体、若しくはハイブリドーマを起源とする抗体のような任意のモノクローナル又はポリクローナル抗体を分離するために有用である。一実施形態では、分離された抗体は、ヒト又はヒト化抗体から回収される。抗体は、任意のクラスのものであってよく、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭからなる群から選択できる。一実施形態では、抗体は、プロテインＡと結合できるか、又はＦｃ含有抗体断片若しくは融合タンパク質である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１のような免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。一実施形態では、本方法は、６〜９の範囲、特に７〜８の範囲内の等電点（ｐＩ）を有する抗体の精製に用いられる。具体的な実施形態では、精製された抗体のｐＩは、約９である。この関係で、用語「抗体」は、抗体断片及び抗体又は抗体断片を含む任意の融合タンパク質も含むことが理解される。よって、本発明は、上記の抗体のいずれか１つの断片及びこのような抗体を含む融合タンパク質の分離も包含する。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
【００６９】
本方法は、装置中の分離マトリックスからの抗体生成物のいずれの溶出も要求しないことがある。特定の溶出工程を回避することは、プロセスの観点から魅力的である。なぜなら、より少ない数の工程は、より迅速な精製プロトコールをもたらし、その結果、プロセスの経費を低減するからである。さらに、抗体は、それらのフォールディングパターンを損ない得るか又はペプチド結合を切断することによりそれらを分解し得るある条件に対して感受性である。よって、全般的にアニオン交換のための溶出条件はいずれの極端な化学物質も含まないが、塩及び／又はｐＨの変化は、感受性が高い抗体に影響することがあり、その影響は、ｐＩ、電荷分布などに依存して種ごとに変動する。さらに、いくつかの実施形態では、本方法は、溶離液を加え、所望の化合物に対して溶出条件を用いることを回避する。化合物の吸着のための最も適切な条件を得るために、生体試料は、適切な緩衝液又はその他の液体と組合せて、移動相とすることができる。
【００７０】
本発明の方法を、アニオン交換クロマトグラフィーのための従来の条件下で採用することも可能であり、これは、一般的に、比較的低い塩濃度での吸着を含む。よって、本方法の一実施形態では、移動相の導電率は、１〜２５ｍＳ／ｃｍの範囲にある。いくつかの実施形態では、移動相の導電率は、７〜１５ｍＳ／ｃｍの範囲にある。移動相のｐＨは、約５〜８であってよい。例えば分離マトリックスを再利用するために、吸着した化合物を後で遊離させることが望ましい場合、溶出は、より高い塩濃度で行ってよい（例えば漸増塩勾配を用いることにより）。ｐＨの値も又は代わりに、例えば漸減ｐＨ勾配でシフトさせて、吸着された化合物を溶出してよい。
【００７１】
方法は、ｐＨ及び／又は導電率を制御することにより有利に、特定の化合物を吸着するように適合できる。例えば、抗体の分離で、異なるクラスの抗体は、異なる電荷及び電荷分布パターンを有する。電荷分布パターンと分離の目的との組合せによって、抗体が吸着されることがより好ましいか、又は吸着されることなく装置を通過させるかが決定される。
【００７２】
不要なその他の化合物から分離されることが必要な抗体は、表面で培養された細胞のような任意の公知の供給源、或いは発酵タンク若しくは容器内の回分又は連続細胞培養を起源とすることができる。抗体を含有する試料は、液体、懸濁物又は半固体であってよい。具体的な実施形態では、試料は、液体試料である。試料は、粗細胞抽出物を含むか、又は部分的に精製された細胞抽出物であってよい。試料は、患者の体から回収されてよい。一実施形態では、生体試料は、細胞発酵から得られた上清であってよい。
【実施例】
【００７３】
実施例１．構造単位に由来するモノマーの合成
別途記載しない限り、化学物質は、Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国）から購入し、受領したまま用いた。溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ社（米国）から得た。
【００７４】
ビニルベンジルモノマーの合成：塩化ビニルベンジルに由来する第４級アンモニウム塩モノマーを作製するための全般的な合成アプローチを、本明細書に記載する。塩化ビニルベンジルを、第３級アミンと、ジクロロメタン又はメタノールを溶媒として用いて反応させた。反応時間は、嵩高い基を含む第３級アミン（例えばピペリジンエタノール及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン）について、室温にて３〜２４時間又は６５℃にて３．５〜６時間の範囲であった。反応の完了は、反応生成物についての1Ｈ ＮＭＲ分析により決定した。最終生成物を直接用いたか、又は溶媒蒸発により単離して、さらなる精製を行わずに用いた。反応生成物は、典型的に、９５％収率で単離され、1Ｈ ＮＭＲ分析により査定して９５％を超える純度であった。
【００７５】
１−（２−ヒドロキシエチル）−１−（４−ビニルベンジル）ピペリジニウムクロリド又はビニルベンジル［ピペリジン−エタノール］アンモニウムクロリドの合成：塩化ビニルベンジルを、塩基性アルミナを通して濾過し、濾過の直後に用いた。２５０ｍｌ丸底フラスコに、２４．８３ｇの塩化ビニルベンジル（１６２ｍｍｏｌ）及び５０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）を加え、その後、２０．９９ｇ（１６２ｍｍｏｌ）の２−ピペリジンエタノールを加えた。反応混合物を３．５時間、６５℃にて撹拌した。溶媒を真空の下で蒸発させ、さらなる精製を行わずに生成物を用いた。生成物は、1Ｈ−ＮＭＲにより査定して＞９５％の純度であった。
【００７６】
Ｎ−ベンジル−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ビニルベンジル）エタンアンモニウムクロリド又はビニルベンジル［Ｎ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル］アンモニウムクロリドの合成：塩化ビニルベンジルを、塩基性アルミナを通して濾過し、濾過の直後に用いた。２５０ｍｌの丸底フラスコに、３４．０ｇの塩化ビニルベンジル（２２０ｍｍｏｌ）及び６０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）を加え、その後、３６．８ｇ（２２０ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチルアミンを加えた。反応混合物を、３．５時間、６５℃にて撹拌した。溶媒を真空の下で蒸発させ、さらなる精製を行わずに生成物を用いた。生成物は、1Ｈ−ＮＭＲにより査定して＞９５％の純度であった。
【００７７】
Ｎ−ベンジル−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ビニルベンジル）エタンアンモニウムクロリド又はビニルベンジル［Ｎ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル］アンモニウムクロリドの合成：１Ｌのフラスコに、１０１ｇの塩化ビニルベンジル（６６１ｍｍｏｌ）及び１０９．３ｇ（６６１ｍｍｏｌ）のＮ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチルアミンを加え、その後、６０ｍｌのメタノールを加えた。反応混合物を５．５時間、６５℃にて撹拌した。さらなる精製を行わずに反応混合物を用いた。生成物は、1Ｈ−ＮＭＲにより査定して＞９５％の純度であった。
【００７８】
Ｎ−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジアリル−Ｎ−メチルアンモニウムクロリドの合成：５００ｍＬの１つの丸底フラスコに、３６．２ｇ（０．２８８ｍｏｌ）の塩化ベンジル、１６．０ｇのジアリルメチルアミン（０．１４４ｍｏｌ）及び１４０ｇのアセトニトリルをチャージした。溶液を２日間還流した。溶液を濃縮し、生成物をジエチルエーテル中で沈殿させた。粗製の粘性の油を水（４０ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテルで３回洗浄した（３×１００ｍＬ）。水性相を回収し、溶媒を蒸発させ、得られた油を真空の下で５０℃にて乾燥させた。３０．０ｇ（８８％）の粘性の油が、プロセスの後に得られた。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ）は、７．６０−７．１０ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ）、６．０５−５．７５ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ）、５．７０−５．４０ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ）、４．７６ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）、４．２０−３．８０ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ）、及び２．９４ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ）にピークを示す。
【００７９】
実施例２．メンブランの組み立て及びｅビーム硬化方法
メンブラン組み立て材料：別途記載しない限り、化学物質は、Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国）から購入した。Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９は、ＣＩＢＡから得た。ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブランは、ＧＥ Ｗａｔｅｒ（５ミクロン孔径、１５０ミクロン厚さ）から得た。ＰＥシート（バッグ）は、Ｆｉｓｈｅｒ社（米国）（ｃａｔ＃１９０７５３８８Ａ）から得た。
【００８０】
メンブラン上のコーティングを作製するために用いた溶液は、本明細書でコーティング溶液と記載する。メンブランをコーティング溶液に１分間、又はいくつかの実施例では２０分間浸漬した。過剰のコーティング溶液を、メンブランを２枚のポリエチレン（ＰＥ）シートの間に置き、シリコーンの刃で過剰の溶液を搾り出し、その後、約４５〜７０分間風乾することにより除去した。メンブランをフレーム上に載せ、ｅビームチャンバ中に置いた。Ｎ２を、チャンバを通じて２分間パージし、メンブランを、５０フィート毎分の速度で電子ビームに曝露した。Ｏ２レベルが１５０ｐｐｍ（±５）に到達したときに、４０ＫＧｙの線量が送達された。メンブランを裏返し、メンブランの他方の面について曝露手順を反復した（ベンチトップ電子ビームユニット、ＥＢ Ｌａｂ−１５０、約４０平方ｃｍチャンバ、ＡＥＢ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）。
【００８１】
一例では（プロトタイプ１）、ポリエーテルスルホンメンブラン（５ミクロン、ＧＥ Ｗａｔｅｒから）を、１０ｇのビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド（０．０４７ｍｏｌ）、８ｇのジアリルジメチルアンモニウムクロリド（０．０５０ｍｏｌ）、３ｇのメチレンビスアクリルアミド（０．０２０ｍｏｌ）及び１．０ｇのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．００４５ｍｏｌ）を２００ｍｌの水の中に含む水性調合物（コーティング溶液）で被覆した。メンブランを、コーティング溶液に２０分間浸した。メンブランを、次いで、溶液から取り出し、２枚のポリエステルシートの間で穏やかに搾って空気の泡を除去した。コーティング溶液を、メンブランを通して流し、過剰の溶液をメンブランから除去した。メンブランを、その後、６０分間吊るして風乾した後に、両面をｅビーム照射（４０ＫＧｒａｙ）に曝露した（１５０ｐｐｍ酸素）。
【００８２】
別の例では（プロトタイプ２）、ポリエーテルスルホンメンブラン（５ミクロン、ＧＥ Ｗａｔｅｒから）を、２６．５ｇのビニルベンジル［ピペリジンエタノール］アンモニウムクロリド（０．０９４ｍｏｌ）、１．５ｇのメチレンビスアクリルアミド（０．０１０ｍｏｌ）及び０．８８ｇのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．００４ｍｏｌ）を１１７ｍｌの水とメタノールとの混液（３５：６５）中に含む（１５ｗｔ％モノマー）調合物（コーティング溶液）で被覆した。メンブランを、コーティング溶液に２０分間浸した。メンブランを、次いで、溶液から取り出し、２枚のポリエステルシートの間で穏やかに搾って空気の泡を除去した。コーティング溶液を、メンブランを通して流し、過剰の溶液を除去した。メンブランを、その後、４５〜６０分間吊るして風乾した後に、両面をｅビーム照射（４０ＫＧｒａｙ）に曝露した（１５０ｐｐｍ酸素）。
【００８３】
別の例では（プロトタイプ３）、ポリエーテルスルホンメンブラン（５ミクロン、ＧＥ Ｗａｔｅｒから）を、２７．６６ｇのビニルベンジル（Ｎ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル）アンモニウムクロリド（０．０８７ｍｏｌ）、１．８５ｇのメチレンビスアクリルアミド（０．０１０ｍｏｌ）及び０．８８ｇのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．００４ｍｏｌ）を２１８ｍｌの水とメタノールとの混液（３５：６５）中に含む（１３ｗｔ％モノマー）コーティング溶液で被覆した。メンブランコーティング溶液を、水とメタノールとの混液（３５：６５）で希釈した（８．５ｗｔ％モノマー）。メンブランを、希釈コーティング溶液に２０分間浸した。メンブランを、次いで、溶液から取り出し、２枚のポリエステルシートの間で穏やかに搾って空気の泡を除去した。コーティング溶液を、メンブランを通して流し、過剰の溶液を除去した。メンブランを、その後、４５〜６０分間吊るして風乾した後に、両面をｅビーム照射（４０ＫＧｒａｙ）に曝露した（１５０ｐｐｍ酸素）。
【００８４】
さらに別の例では（プロトタイプ４）、ポリエーテルスルホンメンブラン（５ミクロン、ＧＥ Ｗａｔｅｒから）を、３０．０ｇのビニルベンジル（Ｎ−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル）アンモニウムクロリド（０．０９ｍｏｌ）、２．７２７ｇのＮ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド（０．０２７Ｍ、水中の４８ｗｔ％溶液として、５．６８７ｇの溶液）、４．１４８７ｇのメチレンビスアクリルアミド（０．０２６９ｍｏｌ）及び２．０ｇのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９（０．００９ｍｏｌ）を、２１５ｍｌの水と２０９ｍｌのメタノールとの混液中に含有する水性／メタノール調合物（約５０／５０水：メタノール中に７．６６ｗｔ％モノマー）で被覆した。メンブランを、コーティング溶液に１分間浸し、溶液を除去し、２枚のポリエステルシートの間で穏やかに搾って空気の泡を除去した。コーティング溶液を、次いで、メンブランを通して流し、過剰の溶液を除去した。メンブランを、その後、２分間水平にして風乾し、次いで、ポリエステルシート上で５８分間乾燥させた後に、両面をｅビーム照射（４０ＫＧｒａｙ）に曝露した（１５０ｐｐｍ酸素）。
【００８５】
実施例３．メンブラン流量及び透過性
単層のメンブランのメンブラン流量及び透過性を、２種の緩衝液及び脱イオン（ＤＩ）水を用いて決定した。１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ）が単層のメンブランを通って流れるのに要求される時間を、ある設定した圧力レベルにて決定した。単層のメンブランを、２５ｍｍガラスフィルターホルダ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に保持し、真空を、典型的に、２７”Ｈｇ又は５”ｍｍのＨｇに設定した。時間は、ｐＨ６．５での７０ｍＭリン酸緩衝液及びＤＩ水についても測定した。ニードルゲージを用いて、真空を調節した（ガラスフィルターホルダ、ステンレス鋼担体を有する２５ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ ＸＸ１０ ０２５ ３０、ニードルゲージ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ、Ｋ−０６３９３−６１、真空ゲージ、Ａｓｈｃｒｏｆｔ Ｃｏｒｐ、２３８Ａ ４６０−０２）。
【００８６】
実施例４．ＢＳＡアッセイ方法
全ての緩衝液は、室温にて貯蔵した。緩衝液を、真空の下で５分以上、連続的に混合しながら脱気した。
【００８７】
高導電率緩衝液Ａは、１００ｍＭのＮａＣｌを有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０である。緩衝液は、２５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、１５ｍｌの５Ｍ塩化ナトリウム、及び水（１Ｌの最終体積まで）を含む。緩衝液を濾過し、脱気し、使用前に導電率を測定した。この緩衝液Ａの導電率は、１２〜１３ｍＳ／ｃｍと記録された。低導電率緩衝液Ａは、１５ｍＭのＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ緩衝液、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０である。緩衝液は、２５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、３ｍｌの５Ｍ塩化ナトリウム、及び水（１Ｌの最終体積まで）を含む。緩衝液を濾過し、脱気し、使用前に導電率を測定した。この緩衝液Ａの導電率は、３．１〜３．２ｍＳ／ｃｍと記録された。
【００８８】
緩衝液Ｂは、ストリップ緩衝液である（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）。緩衝液Ｂは、０．６９８ｍｌのリン酸、１２．３７１ｇのＮａＨ２ＰＯ４、及び水（１Ｌの最終体積まで）を含む。緩衝液を濾過し、使用前に脱気した。緩衝液Ｂの導電率は、７〜８ｍＳ／ｃｍと記録された。
【００８９】
リン酸緩衝液のストック溶液は、次のようにして調製した：０．５Ｍのリン酸一ナトリウム（ＦＷ＝１１９．９６）の溶液を、５９．９８ｇのリン酸一ナトリウムを１Ｌの最終体積の水に溶解することにより作製した。０．５Ｍのリン酸二ナトリウム（ＦＷ＝１４１．９６）の溶液を、７０．９８ｇのリン酸二ナトリウムを１Ｌの最終体積の水に溶解することにより調製した。０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液のストックを、０．５Ｍリン酸一ナトリウムと０．５Ｍリン酸二ナトリウムとを、撹拌し、且つ所望のｐＨに到達するまで監視しながら混合することにより調製した。ストック緩衝液を、適当であれば所望の濃度に到達するまで希釈し、塩を、必要に応じて所望の導電率に到達するまで加えた。リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５は、１００ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５と、水中の７ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌとを、１Ｌの最終体積まで混合することにより作製した、３５ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５である。緩衝液を濾過し、脱気し、使用前に導電率を測定した。緩衝液の導電率は、約８ｍＳ／ｃｍと記録された。リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４は、１００ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４と、水中の２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌとを、１Ｌの最終体積まで混合することにより作製した、１０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４である。緩衝液を濾過し、脱気し、使用前に導電率を測定した。緩衝液の導電率は、約７．２ｍＳ／ｃｍと記録された。
【００９０】
０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液を、４０ｍｌの水酸化ナトリウムの濃縮ストック（１２．５Ｎ）を９６０ｍｌの水に加えることにより作製した。溶液を濾過し、使用前に脱気した。
【００９１】
ＢＳＡのストックを、所望の緩衝液Ａ中で、約６ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製した。ストックを濾過し、脱気し、分光光度計を用いて２８０ｎｍにて吸光度を決定して、濾過後の実際のタンパク質濃度を確認した。この濃縮ストックを、暗所で４℃にて貯蔵した。濃縮ストックを、同じ緩衝液Ａで希釈して、０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の作業濃度を達成した。希釈した作業溶液を、暗所で４℃にて貯蔵した。溶液を室温まで温め（暗所で）、濃度を、使用前に分光光度計を用いて測定した。
【００９２】
ＢＳＡを用いるクロマトグラフィーアッセイは、次のようにして行った。クロマトグラフィー装置を、１５ｍｌの緩衝液Ａで平衡化した。１０ｍｌのＢＳＡ溶液（０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ濃度）を装置に注入した。１５ｍｌの緩衝液Ａを装置に通し、未結合の試料を洗い流した後に、１００％緩衝液Ｂ（１５ｍｌ）を通した。装置を、１０ｍｌの０．５Ｎ ＮａＯＨでさらに洗浄し、最後に、１５ｍｌの緩衝液Ａで再平衡化した。クロマトグラフィー装置中に存在するマトリックスの結合容量は、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１０％破過で（ＱＢ１０値ともいう）２８０ｎｍにて決定した（Bo-Lennart Johansson et al. J. Chromatogr. A 1016 (2003) 21-33）。
【００９３】
【表２】
表２は、本発明のマトリックスを用いることによる、ＢＳＡのより良好な結合容量を示す。セット５では、商業的に入手可能な第４級アンモニウム吸着材メンブラン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓにより製造されるＱ吸着材メンブラン）を用いた。表２に示すように、セット２、３及び４は、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液中で、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓにより製造される商業的なＱ吸着材メンブラン（セット５）よりも良好な結合容量を示す。これらの結果から、タンパク質と７〜８ｍＳ／ｃｍにて結合するリガンドの有効性が確認される。セット２及び３は、ｐＨ６．５のリン酸緩衝液中で、商業的なＱ吸着材（セット５）よりも良好な結合容量を示す。この結果から、７〜８ｍＳ／ｃｍでのリガンドタンパク質相互作用の有効性が確認される。同様に、セット４でのイオン強度、導電率及びｐＨの変動のような３つの異なる条件のセットでの結合容量は、期待されたマルチモーダル効果を示す。ビニルベンジルトリメチルＱ（セット１で用いるような）は、異なるイオン強度、異なる導電率及び異なるｐＨにて、セット５と同様である。セット４で見られるようなマルチモーダル効果を観察するために、フェニル部分が、結合分子のための部位に向かって突出し得る。他の場合では、フェニル部分が結合部位に向かって突出していないならば、挙動は、セット５に記載される従来の第４級アンモニウムメンブラン吸着材のものと同様であり得る。
【００９４】
実施例５．宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）除去
ＨＣＰの除去は、７ｍＳ／ｃｍにて、表３に示すような比較的低いリガンド密度であっても、商業的なＱ吸着材メンブラン（セット６）よりも、本発明のマトリックス（セット７）についてより良好である。
【００９５】
【表３】
実施例６．凝集抗体（ｍＡｂ）の除去
ｍＡｂ供給原料（ｍＡｂ濃度＝６．４ｍｇ／ｍｌ）は、およそ２％のｍＡｂ凝集体を、プロテインＡクロマトグラフィーによる精製の後であるが高度精製の前に含有していた。セット８で用いたメンブランを用いるフロースルー（ＦＴ）モードでの高度精製（保持時間＝５秒）の後に（流速１．３ｍｌ／分）、ｍＡｂ供給原料中のＨＣＰ含量は、３０．９Ｅ３ｎｇ／ｍｌから９．０Ｅ３ｎｇ／ｍｌ（表４に示すように）メンブランまで（ＦＴ中に２９％）低下し、１．７０％ｍＡｂ凝集体であった。これと比較して、セット９で用いたメンブラン、すなわち商業的なＱ吸着材メンブランを用いるフロースルーモードでの精製の後に（１．６５ｍｌ／分流速）、ＨＣＰ含量は、３０．９Ｅ３ｎｇ／ｍｌから８．８Ｅ３ｎｇ／ｍｌメンブランまで（ＦＴ中に２８％）低下し、２％ｍＡｂ凝集体であった。これらの条件の下で（１０００ｍｇ ｍＡｂ／ｍｌメンブランのｍＡｂ投入量、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、７ｍＳ／ｃｍ）、両方のメンブランは、ＥＬＩＳＡアッセイにより査定して同じ量のＨＣＰを除去したが、マルチモーダル吸着材メンブラン（セット８に示すように）は、ｍＡｂ凝集体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより査定されるように、およそ１５％驚くほど減少させるが、商業的なＱ吸着材（セット９のように）は、ｍＡｂ凝集体レベルに対して影響しない。
【００９６】
【表４】
実施例７．ウイルスフィルターと組合せた吸着材メンブラン
本明細書で「高度精製メンブラン」というマルチモーダルメンブラン吸着材の高度精製の有効性を証明するために、高度精製フィルターの使用あり（図２に示すように）及びなしで、商業的なウイルス濾過メンブランの容量（Ｌ／ｍ2でのＶｍａｘ）を決定した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰ）。ポリクローナルＩｇＧ（Ｂａｘｔｅｒ：ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、１５５ｍＭ ＮａＣｌ中に５ｍｇ／ｍｌ）を装置に通過させて、ウイルスフィルター容量Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ2）を、漸進的細孔閉塞モデルを用いて決定した（参照Jonathan T. Royce, Practical Application of the Cake-Complete, Pore-Plugging Model for Sizing Normal Flow Filters PDA J Pharm Sci Technol September 2009 63:462-471）。
【００９７】
２つの実験を行った（表５）、実験１は、高度精製メンブランなしでの通常流れパルボウイルス（ＮＦＰ）だけについてであり、実験２は、約２４μｍｏｌのリガンド密度（約２２ｍｍの直径、及び約０．１６２ｍｌのメンブラン体積）を有する本発明のマルチモーダルマトリックスに基づくプロトタイプ装置（表２のセット４と同様）とともに、高度精製モード操作で用いるＮＦＰであった。マルチモーダル高度精製メンブランを用いるＮＦＰメンブランのＶｍａｘ容量（実験２）を、同一条件下で対照（実験１）のものと比較した。マルチモーダル高度精製メンブランは、ＮＦＰの容量（Ｖｍａｘ）の約２３倍の増加を示した。高度精製メンブランが、ウィルス除去メンブランの上流に並列される（図２に示すように）構成で、容量の増進が観察される。よって、上記の実験は、本発明の高度精製メンブランの使用が、ウィルス除去メンブランに入るポリクローナル供給原料の凝集体含量を有効に低減できることを明確に示す。この実施例は、高度精製及びウィルス除去の両方の単位操作を、図２に示すように単一の単位操作に組合せることができることをさらに証明する。
【００９８】
図３は、高度精製メンブランを用いないウィルス除去メンブランの容量と比較した、高度精製メンブランを用いながらのウィルス除去メンブランの容量の増加を示す。図３に示すように、高度精製メンブランを組み込まないウイルスフィルターの典型的な容量（２１０）は、２２リットル／平方メートル（Ｌ／ｍ2）であり、ウイルスメンブランフィルターの上流に並列された高度精製メンブランを有するウイルスメンブランの容量（２１２）の増加は、５０３Ｌ／ｍ2である。
【００９９】
この結果により、単一の単位操作を効率的に提供する、高度精製メンブランがウィルス除去フィルターの上流に並列されたプロセスを有することの利点が確認される。
【０１００】
【表５】
本発明のある特徴だけを本明細書で説明して記載したが、多くの改変及び変更が、当業者により見出される。よって、添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲内にある全てのそのような改変及び変更をカバーすることを意図することが理解される。
【符号の説明】
【０１０１】
２０１ 高度精製メンブラン
２０３ ウィルス除去メンブラン
２０５ 多層の分離マトリックス
２０７ 多層のウィルス除去メンブラン
２０９ 装置中の流れ
２１０ 高度精製メンブランを組み込まないウイルスフィルターの典型的な容量
２１２ ウイルスメンブランフィルターの上流に並列された高度精製メンブランを有するウイルスメンブランの容量
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体含有生体試料から１種以上の不要な化合物を分離するための装置であって、
多孔質担体と、
多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂であって、
ビニル架橋剤、並びに
第４級アンモニウム基及び２つ以上の環構造を含む芳香族モノマー
に由来する構造単位を含むポリマー樹脂と
を含む装置。
【請求項２】
前記芳香族モノマーが、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ又はそれらの組合せに由来する構造単位を有し、前記ポリマー樹脂が、生体試料中に存在する１種以上の不要な化合物を、マルチモーダル相互作用によって選択的に保持できる、請求項１記載の装置。
【化１】
式中、Ｒ1及びＲ2は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せであり、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数であり、
Ｒ3及びＲ4は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、ベンジル又はそれらの組合せである。
【請求項３】
Ｒ3が式ＩＶに由来する構造単位を含む、請求項２記載の装置。
【化２】
式中、Ｒ5及びＲ6は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せであり、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数である。
【請求項４】
前記ポリマー樹脂が、式Ｖに由来する構造単位をさらに含む、請求項２記載の装置。
【化３】
式中、Ｚは、ＮＨ又はＯであり、
Ｒ7は、水素若しくはメチル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、置換アルキル又はそれらの組合せであり、
ｎは１〜５の整数である。
【請求項５】
前記ビニル架橋剤が、Ｎ’，Ｎ”−メチレンビスアクリルアミドを含む、請求項２記載の装置。
【請求項６】
前記マルチモーダル相互作用が、水素結合相互作用、イオン性相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用又は双極子間相互作用の２以上を含む、請求項２記載の装置。
【請求項７】
前記多孔質担体が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅ−ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリフェニレンオキシド、ポリカーボネート、ポリエステル、セルロース又はセルロース誘導体から選択される、請求項２記載の装置。
【請求項８】
前記多孔質担体が約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲の細孔径を有する、請求項２記載の装置。
【請求項９】
前記多孔質担体が約２μｍ〜約５μｍの範囲の細孔径を有する、請求項２記載の装置。
【請求項１０】
前記多孔質担体が、メンブラン、ウェブ、フィルター、繊維又はメッシュである、請求項２記載の装置。
【請求項１１】
前記不要な化合物が、凝集タンパク質若しくはペプチド、ミスフォールドタンパク質若しくはペプチド、宿主細胞タンパク質、核酸、内毒素又はそれらの組合せを含む、請求項２記載の装置。
【請求項１２】
前記凝集タンパク質が凝集抗体を含む、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
前記多孔質担体の上流又は下流に配置された、ウィルスを除去することができるウィルス除去メンブランをさらに備える、請求項２記載の装置。
【請求項１４】
前記ウィルス除去メンブランが、前記多孔質担体の下流に配置され、当該装置が、同等の自立型ウィルス除去メンブランと比較してウィルス除去メンブランの容量を１０Ｌ／ｍ2以上改善できる、請求項１３記載の装置。
【請求項１５】
前記ポリマー樹脂が、式Ｖに由来する構造単位をさらに含む、請求項１４記載の装置。
【化４】
式中、Ｚは、ＮＨ又はＯであり、
Ｒ7は、水素若しくはメチル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、置換アルキル又はそれらの組合せであり、
ｎは１〜５の整数である。
【請求項１６】
クロマトグラフィーチャンバ、管状カラム、カートリッジ、シリンジフィルター、マニフォールド、マルチウェルプレート、モノリス、フィルター、メンブラン、キャピラリー、マイクロフルイディックチップ、プリーツカートリッジ若しくはカプセル、カセット、スパイラルフィルター又は中空繊維の形態である、請求項２記載の装置。
【請求項１７】
滅菌可能である、請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
１種以上の不要な化合物と抗体とを含む抗体含有生体試料中に存在する抗体から１種以上の不要な化合物を分離する方法であって、
生体試料を請求項２記載の装置に、試料がポリマー樹脂と接触するように添加する工程と、
生体試料中に存在する１種以上の化合物を、マルチモーダル相互作用によって保持する工程と、
未結合の抗体を含む通過画分流出液を回収する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
１種以上の不要な化合物が、凝集タンパク質若しくはペプチド、ミスフォールドタンパク質若しくはペプチド、核酸、内毒素又はそれらの組合せを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
生体試料を、メンブラン装置に、重力流れ、ポンプ、圧力容器又はそれらの組合せにより通過させる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記接触工程に先だって、生体試料の機械的濾過、遠心分離又はクロマトグラフィー分離を含む１以上の分離工程を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
抗体含有生体試料から１種以上の不要な化合物を分離する方法であって、
生体試料を請求項１３記載の装置に、試料がポリマー樹脂及びウィルス除去メンブランと接触するように添加する工程と、
生体試料中に存在する１種以上の化合物を、マルチモーダル相互作用によってポリマー樹脂上に保持する工程と、
試料中に存在するウイルスを、ウィルス除去メンブランによって除去する工程と、
未結合の抗体を含む通過画分流出液を回収する工程と
を含む方法。
【請求項２３】
１種以上の不要な化合物が、凝集タンパク質若しくはペプチド、ミスフォールドタンパク質若しくはペプチド、宿主細胞タンパク質、核酸、内毒素又はそれらの組合せを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
生体試料を、メンブラン装置に、重力流れ、ポンプ、圧力容器又はそれらの組合せにより通過させる、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記接触工程に先だって、生体試料の機械的濾過、遠心分離又はクロマトグラフィー分離を含む１以上の分離工程を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項１】
抗体含有生体試料から１種以上の不要な化合物を分離するための装置であって、
多孔質担体と、
多孔質担体の細孔内に配置されたポリマー樹脂であって、
ビニル架橋剤、並びに
第４級アンモニウム基及び２つ以上の環構造を含む芳香族モノマー
に由来する構造単位を含むポリマー樹脂と
を含む装置。
【請求項２】
前記芳香族モノマーが、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ又はそれらの組合せに由来する構造単位を有し、前記ポリマー樹脂が、生体試料中に存在する１種以上の不要な化合物を、マルチモーダル相互作用によって選択的に保持できる、請求項１記載の装置。
【化１】
式中、Ｒ1及びＲ2は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せであり、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数であり、
Ｒ3及びＲ4は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、ベンジル又はそれらの組合せである。
【請求項３】
Ｒ3が式ＩＶに由来する構造単位を含む、請求項２記載の装置。
【化２】
式中、Ｒ5及びＲ6は独立に水素、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、Ｃ1〜Ｃ20置換アルキル、アリール、置換アリール又はそれらの組合せであり、ｍ及びｎは独立に１〜５の整数である。
【請求項４】
前記ポリマー樹脂が、式Ｖに由来する構造単位をさらに含む、請求項２記載の装置。
【化３】
式中、Ｚは、ＮＨ又はＯであり、
Ｒ7は、水素若しくはメチル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、置換アルキル又はそれらの組合せであり、
ｎは１〜５の整数である。
【請求項５】
前記ビニル架橋剤が、Ｎ’，Ｎ”−メチレンビスアクリルアミドを含む、請求項２記載の装置。
【請求項６】
前記マルチモーダル相互作用が、水素結合相互作用、イオン性相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用又は双極子間相互作用の２以上を含む、請求項２記載の装置。
【請求項７】
前記多孔質担体が、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅ−ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリフェニレンオキシド、ポリカーボネート、ポリエステル、セルロース又はセルロース誘導体から選択される、請求項２記載の装置。
【請求項８】
前記多孔質担体が約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲の細孔径を有する、請求項２記載の装置。
【請求項９】
前記多孔質担体が約２μｍ〜約５μｍの範囲の細孔径を有する、請求項２記載の装置。
【請求項１０】
前記多孔質担体が、メンブラン、ウェブ、フィルター、繊維又はメッシュである、請求項２記載の装置。
【請求項１１】
前記不要な化合物が、凝集タンパク質若しくはペプチド、ミスフォールドタンパク質若しくはペプチド、宿主細胞タンパク質、核酸、内毒素又はそれらの組合せを含む、請求項２記載の装置。
【請求項１２】
前記凝集タンパク質が凝集抗体を含む、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
前記多孔質担体の上流又は下流に配置された、ウィルスを除去することができるウィルス除去メンブランをさらに備える、請求項２記載の装置。
【請求項１４】
前記ウィルス除去メンブランが、前記多孔質担体の下流に配置され、当該装置が、同等の自立型ウィルス除去メンブランと比較してウィルス除去メンブランの容量を１０Ｌ／ｍ2以上改善できる、請求項１３記載の装置。
【請求項１５】
前記ポリマー樹脂が、式Ｖに由来する構造単位をさらに含む、請求項１４記載の装置。
【化４】
式中、Ｚは、ＮＨ又はＯであり、
Ｒ7は、水素若しくはメチル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、置換アルキル又はそれらの組合せであり、
ｎは１〜５の整数である。
【請求項１６】
クロマトグラフィーチャンバ、管状カラム、カートリッジ、シリンジフィルター、マニフォールド、マルチウェルプレート、モノリス、フィルター、メンブラン、キャピラリー、マイクロフルイディックチップ、プリーツカートリッジ若しくはカプセル、カセット、スパイラルフィルター又は中空繊維の形態である、請求項２記載の装置。
【請求項１７】
滅菌可能である、請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
１種以上の不要な化合物と抗体とを含む抗体含有生体試料中に存在する抗体から１種以上の不要な化合物を分離する方法であって、
生体試料を請求項２記載の装置に、試料がポリマー樹脂と接触するように添加する工程と、
生体試料中に存在する１種以上の化合物を、マルチモーダル相互作用によって保持する工程と、
未結合の抗体を含む通過画分流出液を回収する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
１種以上の不要な化合物が、凝集タンパク質若しくはペプチド、ミスフォールドタンパク質若しくはペプチド、核酸、内毒素又はそれらの組合せを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
生体試料を、メンブラン装置に、重力流れ、ポンプ、圧力容器又はそれらの組合せにより通過させる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記接触工程に先だって、生体試料の機械的濾過、遠心分離又はクロマトグラフィー分離を含む１以上の分離工程を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
抗体含有生体試料から１種以上の不要な化合物を分離する方法であって、
生体試料を請求項１３記載の装置に、試料がポリマー樹脂及びウィルス除去メンブランと接触するように添加する工程と、
生体試料中に存在する１種以上の化合物を、マルチモーダル相互作用によってポリマー樹脂上に保持する工程と、
試料中に存在するウイルスを、ウィルス除去メンブランによって除去する工程と、
未結合の抗体を含む通過画分流出液を回収する工程と
を含む方法。
【請求項２３】
１種以上の不要な化合物が、凝集タンパク質若しくはペプチド、ミスフォールドタンパク質若しくはペプチド、宿主細胞タンパク質、核酸、内毒素又はそれらの組合せを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
生体試料を、メンブラン装置に、重力流れ、ポンプ、圧力容器又はそれらの組合せにより通過させる、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記接触工程に先だって、生体試料の機械的濾過、遠心分離又はクロマトグラフィー分離を含む１以上の分離工程を含む、請求項２２記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５１３６２３（Ｐ２０１３−５１３６２３Ａ）
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４３３４０（Ｐ２０１２−５４３３４０）
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０１７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８１８９８
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０１７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８１８９８
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【Ｆターム（参考）】
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