抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法
【課題】抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法を提供する。
【解決手段】血液試料中の他の細胞から目標細胞を識別できるように、血液試料を１または複数の標識剤と合成する工程を含む。血液試料および容量占有セパレータフロートは、透明または半透明な可撓試料管に挿入される。セパレータフロートは、規定の比重と拡張時の試料管の内径よりも小さい断面径を有する。セパレータフロートは、硬質の本体部と管支持部材とを備える。セパレータフロートは、側壁とともに１または複数の分析領域を形成する。血液試料およびセパレータフロートは、試料管内で遠心力が付与され、血液試料中に存在するあらゆる目標細胞が遠心力により分析領域に局在化される。その後、分析領域に存在する血液試料は検査され、目標細胞が存在するかどうか識別される。
【解決手段】血液試料中の他の細胞から目標細胞を識別できるように、血液試料を１または複数の標識剤と合成する工程を含む。血液試料および容量占有セパレータフロートは、透明または半透明な可撓試料管に挿入される。セパレータフロートは、規定の比重と拡張時の試料管の内径よりも小さい断面径を有する。セパレータフロートは、硬質の本体部と管支持部材とを備える。セパレータフロートは、側壁とともに１または複数の分析領域を形成する。血液試料およびセパレータフロートは、試料管内で遠心力が付与され、血液試料中に存在するあらゆる目標細胞が遠心力により分析領域に局在化される。その後、分析領域に存在する血液試料は検査され、目標細胞が存在するかどうか識別される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、密度に基づく流体分離に関し、詳細には、遠心分離によって層状化された流体構成成分の分離および軸方向拡張のための改良型試料管およびフロートを採用した抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
定量バフィーコート（ＱＢＣ：Quantitative Buffy Coat）分析は、全血を評価するために、臨床試験室において日常的に実施されている。バフィーコートは、非凝固血液を遠心分離または静置したときに赤血球と血漿の層の間に形成される、白血球細胞の一連の薄い明色層である。
【０００３】
ＱＢＣ分析技術では、一般に、抗凝固処理全血を含む微小毛細管の遠心分離を利用して、血液を基本的に６つの層、すなわち（１）濃縮赤血球、（２）網状赤血球、（３）顆粒球、（４）リンパ球／単球、（５）血小板、（６）血漿に分離する。バフィーコートは、上から順番に、血小板、リンパ球、顆粒球および網状赤血球の層よりなる。
【０００４】
毛細管の検査に基づいて、ＱＢＣ分析時に各層の長さまたは高さを求め、細胞計測値に変換することで、各層の定量測定が可能になる。各層の長さまたは高さは、手動読取り装置、すなわち拡大接眼鏡および手動ポインティングデバイスを使用して、または管の長さ方向に沿って光透過率および蛍光発光を測定することにより層を確認する自動光学式走査装置によって光学的に測定することが可能である。広く使用されている一連のＱＢＣ計測器が、ニュージャージ州フランクリン・レークスのベクトン−ディッキンソン・アンド・カンパニー（Becton-Dickinson and Company）によって製造されている。
【０００５】
バフィーコート層は非常に薄いので、多くの場合、正確な視覚的または光学的測定を行うために、毛細管内にプラスチックシリンダまたはフロートが挿入されて、バフィーコートが毛細管内で拡張される。フロートは、赤血球の密度（１．０９０ｇ／ｍｌ）より小さく、血漿の密度（約１．０２８ｇ／ｍｌ）より大きい密度を有し、管の断面積のほぼすべてを占める。したがって、この容量占有フロートは、通常、濃縮赤血球層上に静止して、より容易かつ正確な測定に向けて、管内のバフィーコート層の軸方向長さを拡張させる。
【０００６】
当該技術分野では、血液を分離したり、あるいは血液試料中のバフィーコート層や他の層内の流血中癌や他の希少細胞、生体、粒子または物体（すなわち幹細胞、細胞断片、ウイルス感染細胞、トリパノソーマ等）を識別したりするための改良型試料管、フロートシステムおよび方法が必要とされている。しかしながら、バフィーコートに一般的に存在すると想定される細胞の数は、血液の量に比べて極めて小さく、例えば血液１ミリメートル当たり１から１００個の範囲であるため、特に従来のＱＢＣ毛細管およびフロートに採用される微小試料サイズでは、測定が困難である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の例示的な実施形態による、全体的にスプール状のセパレータフロートを有する試料管の断面図である。
【図２】本発明の他の例示的な実施形態による、全体的に円錐形の端部を有するセパレータフロートの立面図である。
【図３】本発明の他の例示的な実施形態による、全体的に円錐台形の端部を有するセパレータフロートの立面図である。
【図４】端部が全体的に凸形または円蓋形のさらに他の例示的な実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図５】端部から離間した位置に密封隆起を有するさらに他の例示的な実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図６】本発明のさらに別の例示的な実施形態によるリブ付きセパレータフロートの立面図である。
【図７】本発明のさらに別の例示的な実施形態によるリブ付きセパレータフロートの立面図である。
【図８】本発明のさらに別の例示的な実施形態によるリブ付きセパレータフロートの立面図である。
【図９】全体的に螺旋状の管支持隆起を有する、本発明の他の例示的な実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１０】半径方向に先細りする支持リブを有する本発明のさらに別の実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１１】全体的に先細になった螺旋状の管支持隆起を有する本発明のさらに他の例示的な実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１２】断面径状が丸みを帯びた支持リブを有する本発明の他の実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１３】断面径状が丸みを帯びた、螺旋状の支持隆起を有する本発明の他の実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１４】本発明の他の例示的な実施形態によるスプライン加工セパレータフロートの立面図である。
【図１５】図１４の線１５−１５に沿った拡大断面図である。
【図１６】本発明のさらに別のスプライン加工セパレータフロートの実施形態の立面図である。
【図１７】本発明によるさらに別のスプライン加工フロートの実施形態の立面図である。
【図１８】本発明によるさらに別のスプライン加工フロートの実施形態の立面図である。
【図１９】本発明のさらに他のスプライン加工フロートの実施形態の斜視図である。
【図２０】支持隆起が、交差する環状リブおよびスプラインを含むさらに他の例示的な実施形態のフロートの斜視図である。
【図２１】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２２】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２３】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２４】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２５】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２６】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２７】本発明のさらに別の例示的な実施形態による小面状凸部を有するスパイク付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２８】本発明のさらに別の例示的な実施形態による小面状凸部を有するスパイク付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、図面に基づいて説明する。なお、各図面の記載は、本発明の好ましい実施形態を例示することのみを目的とし、それを制限することを目的とはしていない。図１は、血液分離管およびフロート・アセンブリ１００を示す図で、このアセンブリは、本発明のセパレータフロートまたはボバー（Bobber）１１０を内部に有する試料管１３０を備えている。
【００１７】
試料管１３０は、描かれた実施形態では全体的に円筒形であるが、多角形および他の幾何学断面形状を有する管も考えられる。試料管１３０は、第１の閉鎖端１３２と、ストッパまたはキャップ１４０を受ける第２の開放端１３４とを含む。他の密封手段として、例えばパラフィルム（Parafilm）なども考えられる。代替的な実施形態（不図示）では、試料管を各端部で開放し、各端部が適切な密封装置を受けるようにすることができる。
【００１８】
管は、全体的に円筒形として描かれているが、特に射出成形法によって製造する場合は、開放端１３４に向けて僅かに拡大するように、管１３０に最小限のテーパーを付けることができる。このテーパまたは抜き勾配は、管を射出成形具から容易に取り除くのに一般に必要なものである。
【００１９】
管１３０は、透明または半透明の材料で形成されている。管１３０の側壁１３６は、十分にフレキシブルにまたは変形可能に構成され、遠心分離時には、例えば遠心荷重下での試料の静水圧により、半径方向に拡張する。そして、遠心力が取り除かれると、管側壁１３６は、実質的に本来のサイズおよび形状に戻る。
【００２０】
管は、任意の透明または半透明の可撓性材料（有機および無機）、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、スチレン−ブタジエン−スチレン（ＳＢＳ）、スチレン／ブタジエン共重合体（例えば、オクラホマ州バートルズビルのフィリップス６６社から入手可能なＫ−Ｒｅｓｉｎ（登録商標））などで形成することが可能である。管は透明であることが好ましいが、試料検体中の対象となる細胞または物体を探す受信計が、管内のこれらの物体を「確認」または検出できるのであれば、管は必ずしも透明でなくてもよい。例えば、バルク試料内で検出できない極めて低放射活性レベルの物体を、以下により詳細に説明するように、本発明の方法により分離して、フロート１１０により壁付近にトラップした後で、不透明または半透明の壁を通じて検出することが可能である。
【００２１】
好ましい実施形態において、管１３０は、少なくとも約５ミリリットルの血液または試料流体、より好ましくは少なくとも約８ミリリットルの血液または流体、最も好ましくは少なくとも約１０ミリリットルの血液または流体を、フロート１１０と共に収容できるようにサイズ設定される。特に好ましい実施形態において、管１３０は、約１．５ｃｍの内径１３８を有し、少なくとも約１０ミリリットルの血液をフロート１１０と共に収容する。
【００２２】
フロート１１０は、本体部１１２と、フロート１１０の軸方向の両端にそれぞれ配置された２つの密封リングまたはフランジ１１４とを含む。フロート１１０は、１つまたは複数の全体的に硬質の有機または無機材料、好ましくは硬質プラスチック材料、例えば、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）共重合体、芳香族ポリカーボネート、芳香族ポリエステル、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリアクリロニトリルおよび他のニトリル樹脂、ポリアクリロニトリル−塩化ビニル共重合体、ポリアミド、芳香族ポリアミド（アラミド）、ポリアミド−イミド、ポリアリレート、ポリアリレン酸化物、ポリアリレン硫化物、ポリアリルスルホン、ポリベンズイミダゾール、ポリブチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルイミド、ポリエーテルスルホン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリメタクリレート、ポリオレフィン（例えばポリエチレン、ポリプロピレン）、ポリアロマー、ポリオキサジアゾール、ポリパラキシレン、ポリフェニレン酸化物（ＰＰＯ）、改質ＰＰＯ、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオリエチレンの如きフッ素含有重合体、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニルの如きポリハロゲン化ビニル、ポリ塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニリデン、特殊重合体等で形成され、最も好ましくはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン−スチレン共重合体（ＡＢＳ）等で形成される。
【００２３】
この点において、本発明の目的の１つは、検出または走査法に干渉する材料および／または添加剤の使用を避けることである。例えば、検出を目的として蛍光を利用する場合は、フロート１１０を構成するのに利用される材料は、対象となる波長に干渉またはバックグラウンド（Background）蛍光を有するものであってはならない。
【００２４】
フロート１１０の本体部１１２および密封リングまたは支持部材１１４は、加圧下または遠心力下で、試料管１３０の内径１３８より小さい外径１１８を有するようにサイズ設定される。フロート１１０の本体部１１２も密封または支持リング１１４より小さく設定され、これにより、フロート１１０と管１３０の側壁１３６との間に環状溝１５０が形成されるようになっている。本体部は、管の断面積の多くを占め、環状の間隙１５０は、管が曲がってない状態のときにバフィーコート層の細胞成分および関連する目標細胞を収容するのに十分な大きさを有する。寸法１１８および１３８は、環状の間隙１５０が好ましくは約２５から２５０ミクロン、最も好ましくは約５０ミクロンの半径方向厚さを有するように、設定される。
【００２５】
場合によっては、フロート１１０の本体部１１２の外径１１８は、管１３０の内径１３８より小さくてもよいが、この関係は必須ではない。なぜなら管１３０に遠心力が付与（加圧）されると、管１３０が拡張して、フロート１１０が自由に移動できるようになるからである。遠心分離（加圧）工程が終了すると、管１３０は収縮して、再び密封リングまたは支持隆起（Support Ridges）１１４を押し付ける。その結果、環状間隙または溝１５０が形成され、そのサイズが支持隆起または密封リング１１４の高さによって設定される（すなわち、貯留部（Pool）の深さは、管径に関係なく、支持隆起１１４の高さと等しくなる）。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、フロート寸法は、高さ３．５ｃｍ、直径１．５ｃｍで、本体部は、血液のバフィーコート層を捕捉するために５０ミクロンの間隙を提供するようにサイズ設定される。したがって、バフィーコート層の捕捉に利用可能な体積は約０．０８ミリリットルである。バフィーコート層全体は、一般には全血試料の約０．５％より小さいため、好ましいフロートは、８〜１０ミリリットルの血液試料において分離されるバフィーコート層の全量を収容する。
【００２７】
密封または支持フランジ端部１１４は、管の内径１３８にほぼ等しいか、それよりわずかに大きくなるようにサイズ設定される。フロート１１０は、全体的に硬質で、可撓管壁１３６を支持することもできる。また、大径部１１４は、血液構成層の分離を維持するシール機能を提供する。フロートの大径領域１１４と管の壁１３６との間に形成されたシールは、流体密封シールを構成する。本明細書に用いられている「シール」という用語は、多くの場合は本発明の目的に適した実質的なシールを提供するもの、すなわちフランジ１１４と管壁１３６の間のほぼゼロの隙間またはわずかな干渉を包含することを意図したものである。
【００２８】
密封リング１１４は、最も好ましくは連続隆起で、この場合は、試料をより低速度で遠心分離することができ、分離層のスランピング（Slumping）が抑制される。しかし、代替的な実施形態において、密封隆起は、環状間隙１５０の内外に流路を提供する１つまたは複数の開口部を有する不連続または分割帯でありうる。密封隆起１１４は、個別に形成して、本体部１１２に取り付けるようにしてもよい。しかし、密封隆起１１４および本体部１１２は、単一または一体構造を形成するのが好ましい。
【００２９】
セパレータフロート１１０の全体比重は、赤血球の比重（約１．０９０）と血漿の比重（１．０２８）との間に設定する必要がある。好ましい実施形態において、上記比重は、約１．０８９〜１．０２９の範囲、より好ましくは約１．０７０〜約１．０４０の範囲、最も好ましくは約１．０５である。
【００３０】
フロートの全比重が所望の範囲内にあれば、異なる比重を有する複数の材料でフロートを形成できる。フロート１１０の全体比重および環状間隙１５０の体積を、バフィーコート層と共にある程度の赤血球および／または血漿が環状間隙内に保持されるように選択することができる。遠心分離すると、フロート１１０は、バフィーコート層および目標細胞と同じ軸方向位置を占め、濃縮赤血球層上に浮遊する。バフィーコートは、フロート１１０と管１３０の内壁１３６との間の狭い環状間隙１５０に保持される。その際に、拡張されたバフィーコート領域を例えば照明および拡大下で検査して、流血中上皮癌もしくは腫瘍細胞または他の目標分析物を識別することができる。
【００３１】
１つの好ましい実施形態において、フロート１１０の密度は、血液試料の顆粒球層に定在するように選択される。顆粒球は、濃縮赤血球層上または真上に存在し、約１．０８〜１．０９の比重を有する。この好ましい実施形態において、フロートの比重はこの約１．０８〜約１．０９の範囲にあり、遠心分離するとフロートが顆粒球層内に留まることとなる。顆粒球の量は、患者によって約２０倍も変動しうる。したがって、フロートが顆粒球層内に留まるようにフロート密度を選択することは、顆粒球の真上に存在するリンパ球／単球層のいずれかの損失が回避されるため、特に有利である。遠心分離時には、顆粒球層が増加するにつれて、フロートは顆粒球内のより高い位置に留まるようになり、リンパ球と単球をフロートと実質的に同じ位置に維持する。
【００３２】
米国特許第６，１９７，５２３号に開示されている被験者の血流中の循環上皮癌を検出するための方法は、本件発明の試料管およびフロートシステムを採用するようにモディファイすることが可能である。上記米国特許第６，１９７，５２３号は、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれている。
【００３３】
本発明の管／フロートシステム１００を使用する好ましい例示的な方法においては、抗凝固処理血液の試料が提供される。例えば、標準バキュティナー（Vacutainer：登録商標）、または抗凝固剤が予め仕込まれたタイプの他の同様の血液採取装置を使用して、分析すべき血液を引き込むことができる。
【００３４】
目標上皮細胞または他の対象分析物に特有の蛍光標識抗体（Fluorescently Labeled Antibody）を血液試料に添加し、培養することが可能である。例示的な実施形態において、上皮細胞は、蛍光標識が付されたＡｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ抗体で標識される。Ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ抗体は、血流中に通常見いだされる他の細胞に存在しないと想定される上皮細胞特有部位に結合する。アクリジン・オレンジの如き染色剤または着色剤を試料に添加して、それぞれの細胞型に異なる色を帯びさせることにより、照明下でのバフィーコート層の識別を容易にすることができ、また試料の検査時に上皮細胞の形態を強調または明確化することができる。
【００３５】
その後、血液は、遠心分離を行うためにアセンブリ１００に移送される。フロート１１０は、血液試料が試料管１３０内に導入された後に試料管１３０内に嵌入するようにしても、あるいは試料管１３０内に予め配置しておくようにしてもよい。その後、試料を含んだ管およびフロートアセンブリ１００は、遠心分離にかけられる。この管／フロートシステム１００によって血液を遠心分離するのに必要な動作は、従来の場合と顕著に違わないが、上述したように、遠心速度を減速させることが可能で、スランピングの問題を緩和することができる。場合によってはロータにアダプタを利用して、応力による可撓管の破壊を防止することができる。
【００３６】
遠心分離が開始されると、生じた水圧が、管の径を拡大するように壁１３６を変形または屈曲させる。このため、血液成分およびフロート１１０は、遠心力の下で管１３０内を自由に移動する。血液試料は、密度に応じて、下から順に濃縮赤血球、網状赤血球、顆粒球、リンパ球／単球、血小板および血漿の６つの異なる層に分離する。画像化の対象とする上皮細胞は、密度により、バフィーコート層、すなわち顆粒球、リンパ球／単球および血小板層に集まる。フロートは、その密度に基づいて、バフィーコート層と同じ軸方向位置を占める。バフィーコート層は、場合によっては少量の赤血球および／または血漿と共に、狭い環状間隙１５０を占める。
【００３７】
遠心分離が終了して遠心力が除かれると、管１３０は本来の径に戻って、環状間隙１５０内のバフィーコート層および目標分析物を捕捉または保持する。その後、管／フロートシステム１００は顕微鏡または光学式リーダに移送されて、血液試料中の各目標分析物の識別が行われる。
【００３８】
図２〜図２８は、本発明によるフロートの幾つかの典型的な変形例を示す図である。図２は、図１を参照して示し説明したフロート１１０と同様のフロート２１０を示す図である。このフロート２１０は、本体部２１２と密封リング２１４を備えるとともに、その両端部に、先細または円錐形のエンドキャップ部材２１６を備えている。先細状のエンドキャップ２１６は、遠心分離時に、フロート２１０および密封隆起２１４を通る細胞の流れを促進・誘導するために設けられている。
【００３９】
図３は、図２を参照して示し説明したフロート２１０と同様のフロート３１０を示す図である。このフロート３１０は、本体部３１２と密封隆起３１４を備え、その両端部に、円錐台形のエンドキャップ部材３１６を備えている。円錐台形エンドキャップ３１６は、遠心分離時の細胞流およびフロートの移動を促進するために設けられている。
【００４０】
図４は、図２および図３をそれぞれ参照して示し説明したフロート２１０および３１０と実質的に同様のフロート４１０を示す図である。このフロート４１０においては、全体的に凸形または円蓋形の部材４１６が密封隆起４１４を覆う構成となっている。エンドキャップ４１６は、半球形、半楕円形、または同様に傾斜した形状となっている。ここでも、傾斜端部４１６は、遠心分離時における密度に応じた細胞およびフロート移動を促進するために設けられている。
【００４１】
図２〜図４にそれぞれ示されるエンドキャップ・ユニット２１６，３１６，４１６の幾何学的形状は、例示のみを目的としており、これ以外にも、湾曲面、勾配面および／またはテーパー面を与える他の多くの幾何学的形状（凹形または凸形構成を含む）があり、遠心分離時には、その周囲を血液試料が流れることとなる。考えられるさらなる例示的な形状としては、屋根形（tectiform）およびその切頭形、三面、四面またはそれ以上の面を有する角錐形および切頭角錐形、オジバル（ogival）形およびその切頭形、ならびにジオデシック（Geodesic）形状等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４２】
図５は、図１に描かれている実施形態と同様のフロート５１０を示す図である。このフロート５１０においては、端部から軸方向に移動した位置に密封隆起５１４が配置されている。例示された実施形態では、随意のエンドキャップ部材５１６が円錐形として表示されている。しかし、エンドキャップ５１６は、設ける場合には、上述したように、勾配またはテーパ面を与える任意の他の幾何学的形状を用いてもよいことが認識されるであろう。
【００４３】
残りの図６〜図２８には、全体的に平坦な端部を有するもの、すなわち先細状端部を有していないものが示されているが、例示されている実施形態の各々は、図２〜図５に示される上述のエンドキャップ型のいずれか、または傾斜またはテーパー面を与える他の幾何学的構成を含むように、場合によっては変更できることが認識されるであろう。
【００４４】
図６〜図１３は、全体的に環状の管支持部材を有する本発明の実施形態を示す図である。図６はリブ付きフロート６１０を示す図で、このフロート６１０は、中心本体部６１２に沿って軸方向に間隔をおいて配置された複数の環状リブまたは隆起６２０を備えている。このフロートの両端には、随意の端部密封隆起６１４がそれぞれ配置されている。リブ６２０および随意の端部密封隆起６１４は、遠心力が取り除かれたときに管１３０（図１）との密封係合を提供するようにサイズ設定されている。可撓管は遠心分離時に拡張して、密度に基づく遠心分離処理時に、それらの周囲における流れを可能にする。本体部６１２は、遠心分離時とリブ６１４に支持されている間は、管の内径より小さい径を有する。そして、遠心分離処理が終了すると、本体部６１２と管内壁の間に多数の環状溝６５０が形成される。
【００４５】
図６に例示の実施形態は、連続的なリブを示しているが、支持リブを同様に分断またはセグメント化することにより、隣り合う環状溝６５０間の流路を拡大できることが認識されるであろう。さらに、変形し得る管を支持し、かつ／または管壁が内方向に崩れるのを防ぐために、多数のリブおよび／または密封隆起が存在していてもよい。
【００４６】
図７は、さらなる実施形態に係るフロート７１０を示す図である。フロート７１０は、図６に示されるフロート６１０と同様で、中心本体部７１２に沿って軸方向に間隔を設けて配置された複数のリブ７２０を有し、それらリブ７２０の間には、複数の環状溝７５０が形成されている。管支持リブ７２０は、図６の実施形態よりも密集度が低く離れて配置されている。フロートの両端には、随意の密封隆起７１４が配置されている。ここでも、例示の実施形態は、連続的なリブを示しているが、支持リブを同様に分断または分割して、隣り合う環状溝７５０間の流路を拡大できることが認識されるであろう。
【００４７】
図８は、図６および図７の実施形態と同様のさらなるフロートの実施形態８１０を示す図であり、上述した図６および図７についての説明は、この図８に対しても同等に適用可能である。しかし、フロート８１０は、随意的に設けることが可能な密封隆起をその両端に有していないという点において異なっており、リブ８２０の間隔は、図６および図７に示されるリブ間隔の中間である。
【００４８】
図９はさらに別のフロートの実施形態９１０を示す図で、このフロートは螺旋状支持部材または隆起９２０を備えている。すなわち、互いに分離した環状帯の代わりに、螺旋状隆起９２０の複数のターンによって、本体部９１２上に互いに離間した一連の隆起が形成され、その隆起によって、対応する螺旋溝９５０が画成されている。螺旋状隆起９２０は、連続的なものとして示されているが、その代わりに螺旋帯を２つまたはそれ以上の区画に分割または分断して、螺旋状バフィーコート保持溝９５０の互いに隣り合うターンの間に、流体の流れる流路を設けることができる。フロート９１０の軸方向の両端部には、必要に応じて密封隆起９１４が設けられる。
【００４９】
図１０および図１１は、リブ付きおよび螺旋状フロートのさらに別の実施形態１０１０および１１１０をそれぞれ示す図である。図１０において、本体部１０１２上の環状支持リブ１０２０は、半径方向に沿って先細になっている。図１１において、本体部１１１２上に形成された先細の螺旋状支持体１１２０が存在する。その他の点では、フロート１０１０および１１１０は、それぞれ図６および図９を参照しながら説明したものと同様である。支持部材１０２０および１１２０は、連続的なものとして示されているが、その代わりに、軸方向の流れを促進するために不連続になっていてもよいし、分割されていてもよい。また、フロート１０１０および１１１０の両端の上記密封隆起は、例示の実施形態において省略するようにしても、あるいは必要に応じて設けるようにしてもよい。
【００５０】
図１２および図１３は、リブ付きおよび螺旋状フロートのさらに別の実施形態１２１０および１３１０をそれぞれ示す図である。図示のように、支持部材１２２０および１３２０が、それぞれの本体部１２１２および１３１２上に形成されている。管支持部材１２２０および１３２０は、それぞれ全体的に湾曲したまたは円形の断面輪郭を有する。その他の点では、フロート１２１０および１３１０は、それぞれ図６および図９を参照して上述したものと同様である。ここでも、支持部材１２２０および１３２０は連続的なものとして示されるが、代替的な実施形態では、不連続または分割されたものであってもよい。図１３には、随意の端部密封隆起１３１４が存在する。また、図１２には端部密封隆起が示されていないが、場合によって設けることができる。
【００５１】
次に図１４および１５を参照すると、スプライン加工されたセパレータフロート１４１０が示されている。このフロート１４１０は、中心本体部１４１２の周囲に、放射状（Radially）に間隔を設けて配置された軸方向を向く複数のスプラインまたは隆起１４２４を有する。フロートの両端には、随意の端部密封隆起１４１４が配置されている。スプライン１４２４および随意の端部密封隆起１４１４は、本体部１４１２から突出して、可変管（変形可能な管）に係合し、それに対する支持を提供する。端部密封隆起１４１４を設けた場合には、上述した密封機能が与えられる。管内壁と本体部１４１２の間には、軸方向凸部１４２４によって流体保持溝１４５０が形成されている。例えば本体部が円筒形の場合、凸部１４２４間における本体部の表面１４１３を曲面とすることができるが、平坦な表面１４１３も考えられる。例示の実施形態は、フロートの全軸方向長さに沿って連続したスプライン１４２４を示しているが、分割したスプラインまたは不連続なスプラインも考えられる。
【００５２】
図１６は、図１４および図１５を参照して示し説明したフロート１４１０と類似のスプライン加工フロートの他の実施形態１６１０を示す図である。このフロートにおいては、随意の端部密封隆起が設けられていない。
【００５３】
図１７および図１８は、それぞれ代替的なスプライン加工フロート１７１０，１８１０の立面図で、それぞれの図１４および図１６を参照して上記に示し、説明したそれぞれの実施形態と類似しているが、それぞれの本体部１７１２，１８１２からそれぞれ突出する軸方向スプライン１７２４，１８２４が放射状により散在的に間隔を設けて配置されている。フロート１７１０は、図１８のフロート１８１０には存在しない随意の端部密封隆起１７１４を含む。上述のように、それぞれの表面１７１３，１８１３は平坦または曲面とすることができる。
【００５４】
次に図１９を参照すると、本発明のさらなる実施形態によるスプライン加工セパレータフロート１９１０の斜視図が示されている。軸方向を向く多数のスプライン１９２４が放射状に間隔を設けて配置され、中心本体部１９１２から突出して、可撓管に対する支持を提供する。随意の密封端部隆起１９１４が、フロート１９１０の両端に配置されている。隣り合うスプライン１９２４と、本体部１９１２上の表面１９１３によって、隣り合うスプライン１９２４の間に形成された流体保持溝１９５０が定められる。表面１９１３は、全体的に平坦なものとして描かれているが、曲面も考えられる。軸方向スプライン１９２４は、管の長さに沿って連続的なものとして描かれているが、分割されたスプラインまたは不連続なスプラインも考えられる。
【００５５】
次に図２０を参照すると、本体部２０１２に対して突出した管支持部材２０２６を含むさらに他の実施形態２０１０が示されている。支持手段２０２６は、環状リングまたはリブ２０２０と軸方向スプライン２０２４との交差ネットワークとすることができる。フロートの両端には、随意の端部密封隆起２０１４が配置されている。支持部材２０２６および随意の密封隆起２０１４は、フロートの両端において本体部２０１２から半径方向に突出して、可変管に係合し、それに対する支持を提供する。端部密封隆起２０１４を設けた場合には、上述した密封機能が与えられる。隆起状の支持部材２０２６は、管内壁と本体部２０１２の間に複数の流体保持窓２０５０を形成する。本体部が円筒形のときは、窓２０５０に対応する本体部２０１２の表面２０１３を曲面とすることができるが、平坦な表面２０１３も考えられる。例示されている実施形態は、支持部材２０２６を連続的な環状リブと軸方向スプラインのネットワークとして示しているが、例えば２つまたはそれ以上の窓２０５０の間に流路を提供するために、ネットワーク２０２６の環状および／または軸状部に分断部を含めることもできる。
【００５６】
図２１〜図２６は、試料管の可変壁に対する支持を提供するための複数の凸部を表面に有するいくつかのフロートを示す図である。図２１および図２２を参照すると、フロート２１１０および２２１０は、それぞれ中心本体部２１１２の表面に間隔を設けて配置された多数の円形突起またはノブ２１２８を有する。随意の端部密封隆起２１１４（図２１）は、フロート２１１０の両端に配置されているが、図２２のフロート２２１０には設けられていない。ノブ２１２８および随意の端部密封隆起２１１４は、本体２１１２から半径方向に突出し、環状間隙２１５０を横切って、可変管壁に係合し、それに対する支持を提供する。端部密封隆起２１１４が設けた場合には、上述した密封機能が与えられる。凸部間の本体部表面は、例えば本体部が円筒形のときは曲面であってもよく、あるいは平坦部または小面を有していてもよい。
【００５７】
図２３および図２４には、図２１および図２２を参照して上述したものと実質的に同様であるが、凸部２３２８が、本体部２３１２の表面に、千鳥状のパターンではなく整列パターンを形成するフロートの実施形態２３１０および２４１０が示されている。図２３の実施形態には、随意の端部密封隆起２３１４が設けられている。
【００５８】
次に図２５および図２６を参照すると、それぞれ図２１および図２２を参照して上述したものと実質的に同様であるが、凸部２５２８が、より低い密集度で本体部２５１２の表面に間隔を設けて配置されているフロートの実施形態２５１０および２６１０が示されている。図２５の実施形態には随意の端部密封隆起２５１４が設けられている。
【００５９】
図２７および図２８は、それぞれ中心本体部２７１２の表面に間隔を設けて配置された多数の隆起小面２７２８を含むフロートの実施形態２７１０および２８１０を示す図である。随意の端部密封隆起２７１４（図２７）は、フロート２７１０の両端に配置されているが、図２８の実施形態には設けられていない。小面２７２８および随意の端部密封隆起２７１４は、本体２７１２から半径方向に突出し、環状間隙を横切って、可変管壁に係合し、それに対する支持を提供し、複数の流体保持窓２７５０を定める。端部密封隆起２７１４を設けた場合には、上述した密封機能が与えられる。本体部の表面２７１３は、凸部２７２８の間に配置されて、流体保持窓２７５０を区画する表面を構成するものであるが、この表面２７１３は、例えば本体部が円筒形のときには、曲面であってもよい。あるいは、表面２７１３は平坦であってもよい。代替的な実施形態においては、小面２７１８のサイズ、間隔密度および整列パターンを大きく変更することができる。
【００６０】
可撓試料管を支持するものとして円形ノブまたは方形小面を参照しながら図２１〜図２８の例示的な実施形態を説明したが、任意の幾何学的形状の凸部を利用することができる。凸部の他の幾何学的形状としては、例えば円錐形または円錐台形スパイク、屋根形およびその切頭形凸部、円筒形凸部、角錐形または切頭角錐形凸部、半楕円形凸部や、それらの任意の組合せなども考えられる。同様に、凸部のサイズ、間隔およびパターンを変更することが可能である。試料を画像化する場合は、画像化視野および他の要因に従ってサイズおよび間隔を選択することが可能である。
【００６１】
以上、好ましい実施形態を参照しながら本発明を説明した。当然のことながら、上述した詳細な説明を読み、これを理解すれば、幾つかの修正や変更が思い付くことであろう。本発明は、添付の請求項またはその同等物の範囲内にある限り、それら全ての修正および変更を包含するものであると見なされる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、密度に基づく流体分離に関し、詳細には、遠心分離によって層状化された流体構成成分の分離および軸方向拡張のための改良型試料管およびフロートを採用した抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
定量バフィーコート（ＱＢＣ：Quantitative Buffy Coat）分析は、全血を評価するために、臨床試験室において日常的に実施されている。バフィーコートは、非凝固血液を遠心分離または静置したときに赤血球と血漿の層の間に形成される、白血球細胞の一連の薄い明色層である。
【０００３】
ＱＢＣ分析技術では、一般に、抗凝固処理全血を含む微小毛細管の遠心分離を利用して、血液を基本的に６つの層、すなわち（１）濃縮赤血球、（２）網状赤血球、（３）顆粒球、（４）リンパ球／単球、（５）血小板、（６）血漿に分離する。バフィーコートは、上から順番に、血小板、リンパ球、顆粒球および網状赤血球の層よりなる。
【０００４】
毛細管の検査に基づいて、ＱＢＣ分析時に各層の長さまたは高さを求め、細胞計測値に変換することで、各層の定量測定が可能になる。各層の長さまたは高さは、手動読取り装置、すなわち拡大接眼鏡および手動ポインティングデバイスを使用して、または管の長さ方向に沿って光透過率および蛍光発光を測定することにより層を確認する自動光学式走査装置によって光学的に測定することが可能である。広く使用されている一連のＱＢＣ計測器が、ニュージャージ州フランクリン・レークスのベクトン−ディッキンソン・アンド・カンパニー（Becton-Dickinson and Company）によって製造されている。
【０００５】
バフィーコート層は非常に薄いので、多くの場合、正確な視覚的または光学的測定を行うために、毛細管内にプラスチックシリンダまたはフロートが挿入されて、バフィーコートが毛細管内で拡張される。フロートは、赤血球の密度（１．０９０ｇ／ｍｌ）より小さく、血漿の密度（約１．０２８ｇ／ｍｌ）より大きい密度を有し、管の断面積のほぼすべてを占める。したがって、この容量占有フロートは、通常、濃縮赤血球層上に静止して、より容易かつ正確な測定に向けて、管内のバフィーコート層の軸方向長さを拡張させる。
【０００６】
当該技術分野では、血液を分離したり、あるいは血液試料中のバフィーコート層や他の層内の流血中癌や他の希少細胞、生体、粒子または物体（すなわち幹細胞、細胞断片、ウイルス感染細胞、トリパノソーマ等）を識別したりするための改良型試料管、フロートシステムおよび方法が必要とされている。しかしながら、バフィーコートに一般的に存在すると想定される細胞の数は、血液の量に比べて極めて小さく、例えば血液１ミリメートル当たり１から１００個の範囲であるため、特に従来のＱＢＣ毛細管およびフロートに採用される微小試料サイズでは、測定が困難である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の例示的な実施形態による、全体的にスプール状のセパレータフロートを有する試料管の断面図である。
【図２】本発明の他の例示的な実施形態による、全体的に円錐形の端部を有するセパレータフロートの立面図である。
【図３】本発明の他の例示的な実施形態による、全体的に円錐台形の端部を有するセパレータフロートの立面図である。
【図４】端部が全体的に凸形または円蓋形のさらに他の例示的な実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図５】端部から離間した位置に密封隆起を有するさらに他の例示的な実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図６】本発明のさらに別の例示的な実施形態によるリブ付きセパレータフロートの立面図である。
【図７】本発明のさらに別の例示的な実施形態によるリブ付きセパレータフロートの立面図である。
【図８】本発明のさらに別の例示的な実施形態によるリブ付きセパレータフロートの立面図である。
【図９】全体的に螺旋状の管支持隆起を有する、本発明の他の例示的な実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１０】半径方向に先細りする支持リブを有する本発明のさらに別の実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１１】全体的に先細になった螺旋状の管支持隆起を有する本発明のさらに他の例示的な実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１２】断面径状が丸みを帯びた支持リブを有する本発明の他の実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１３】断面径状が丸みを帯びた、螺旋状の支持隆起を有する本発明の他の実施形態によるセパレータフロートの立面図である。
【図１４】本発明の他の例示的な実施形態によるスプライン加工セパレータフロートの立面図である。
【図１５】図１４の線１５−１５に沿った拡大断面図である。
【図１６】本発明のさらに別のスプライン加工セパレータフロートの実施形態の立面図である。
【図１７】本発明によるさらに別のスプライン加工フロートの実施形態の立面図である。
【図１８】本発明によるさらに別のスプライン加工フロートの実施形態の立面図である。
【図１９】本発明のさらに他のスプライン加工フロートの実施形態の斜視図である。
【図２０】支持隆起が、交差する環状リブおよびスプラインを含むさらに他の例示的な実施形態のフロートの斜視図である。
【図２１】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２２】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２３】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２４】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２５】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２６】本発明のさらに別の例示的な実施形態による、全体的に丸形の凸部を有するノブ付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２７】本発明のさらに別の例示的な実施形態による小面状凸部を有するスパイク付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【図２８】本発明のさらに別の例示的な実施形態による小面状凸部を有するスパイク付きまたはスタッド付きセパレータフロートの立面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、図面に基づいて説明する。なお、各図面の記載は、本発明の好ましい実施形態を例示することのみを目的とし、それを制限することを目的とはしていない。図１は、血液分離管およびフロート・アセンブリ１００を示す図で、このアセンブリは、本発明のセパレータフロートまたはボバー（Bobber）１１０を内部に有する試料管１３０を備えている。
【００１７】
試料管１３０は、描かれた実施形態では全体的に円筒形であるが、多角形および他の幾何学断面形状を有する管も考えられる。試料管１３０は、第１の閉鎖端１３２と、ストッパまたはキャップ１４０を受ける第２の開放端１３４とを含む。他の密封手段として、例えばパラフィルム（Parafilm）なども考えられる。代替的な実施形態（不図示）では、試料管を各端部で開放し、各端部が適切な密封装置を受けるようにすることができる。
【００１８】
管は、全体的に円筒形として描かれているが、特に射出成形法によって製造する場合は、開放端１３４に向けて僅かに拡大するように、管１３０に最小限のテーパーを付けることができる。このテーパまたは抜き勾配は、管を射出成形具から容易に取り除くのに一般に必要なものである。
【００１９】
管１３０は、透明または半透明の材料で形成されている。管１３０の側壁１３６は、十分にフレキシブルにまたは変形可能に構成され、遠心分離時には、例えば遠心荷重下での試料の静水圧により、半径方向に拡張する。そして、遠心力が取り除かれると、管側壁１３６は、実質的に本来のサイズおよび形状に戻る。
【００２０】
管は、任意の透明または半透明の可撓性材料（有機および無機）、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、スチレン−ブタジエン−スチレン（ＳＢＳ）、スチレン／ブタジエン共重合体（例えば、オクラホマ州バートルズビルのフィリップス６６社から入手可能なＫ−Ｒｅｓｉｎ（登録商標））などで形成することが可能である。管は透明であることが好ましいが、試料検体中の対象となる細胞または物体を探す受信計が、管内のこれらの物体を「確認」または検出できるのであれば、管は必ずしも透明でなくてもよい。例えば、バルク試料内で検出できない極めて低放射活性レベルの物体を、以下により詳細に説明するように、本発明の方法により分離して、フロート１１０により壁付近にトラップした後で、不透明または半透明の壁を通じて検出することが可能である。
【００２１】
好ましい実施形態において、管１３０は、少なくとも約５ミリリットルの血液または試料流体、より好ましくは少なくとも約８ミリリットルの血液または流体、最も好ましくは少なくとも約１０ミリリットルの血液または流体を、フロート１１０と共に収容できるようにサイズ設定される。特に好ましい実施形態において、管１３０は、約１．５ｃｍの内径１３８を有し、少なくとも約１０ミリリットルの血液をフロート１１０と共に収容する。
【００２２】
フロート１１０は、本体部１１２と、フロート１１０の軸方向の両端にそれぞれ配置された２つの密封リングまたはフランジ１１４とを含む。フロート１１０は、１つまたは複数の全体的に硬質の有機または無機材料、好ましくは硬質プラスチック材料、例えば、ポリスチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）共重合体、芳香族ポリカーボネート、芳香族ポリエステル、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、ポリアセタール、ポリアセテート、ポリアクリロニトリルおよび他のニトリル樹脂、ポリアクリロニトリル−塩化ビニル共重合体、ポリアミド、芳香族ポリアミド（アラミド）、ポリアミド−イミド、ポリアリレート、ポリアリレン酸化物、ポリアリレン硫化物、ポリアリルスルホン、ポリベンズイミダゾール、ポリブチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルイミド、ポリエーテルスルホン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリメタクリレート、ポリオレフィン（例えばポリエチレン、ポリプロピレン）、ポリアロマー、ポリオキサジアゾール、ポリパラキシレン、ポリフェニレン酸化物（ＰＰＯ）、改質ＰＰＯ、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオリエチレンの如きフッ素含有重合体、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニルの如きポリハロゲン化ビニル、ポリ塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニリデン、特殊重合体等で形成され、最も好ましくはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン−スチレン共重合体（ＡＢＳ）等で形成される。
【００２３】
この点において、本発明の目的の１つは、検出または走査法に干渉する材料および／または添加剤の使用を避けることである。例えば、検出を目的として蛍光を利用する場合は、フロート１１０を構成するのに利用される材料は、対象となる波長に干渉またはバックグラウンド（Background）蛍光を有するものであってはならない。
【００２４】
フロート１１０の本体部１１２および密封リングまたは支持部材１１４は、加圧下または遠心力下で、試料管１３０の内径１３８より小さい外径１１８を有するようにサイズ設定される。フロート１１０の本体部１１２も密封または支持リング１１４より小さく設定され、これにより、フロート１１０と管１３０の側壁１３６との間に環状溝１５０が形成されるようになっている。本体部は、管の断面積の多くを占め、環状の間隙１５０は、管が曲がってない状態のときにバフィーコート層の細胞成分および関連する目標細胞を収容するのに十分な大きさを有する。寸法１１８および１３８は、環状の間隙１５０が好ましくは約２５から２５０ミクロン、最も好ましくは約５０ミクロンの半径方向厚さを有するように、設定される。
【００２５】
場合によっては、フロート１１０の本体部１１２の外径１１８は、管１３０の内径１３８より小さくてもよいが、この関係は必須ではない。なぜなら管１３０に遠心力が付与（加圧）されると、管１３０が拡張して、フロート１１０が自由に移動できるようになるからである。遠心分離（加圧）工程が終了すると、管１３０は収縮して、再び密封リングまたは支持隆起（Support Ridges）１１４を押し付ける。その結果、環状間隙または溝１５０が形成され、そのサイズが支持隆起または密封リング１１４の高さによって設定される（すなわち、貯留部（Pool）の深さは、管径に関係なく、支持隆起１１４の高さと等しくなる）。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、フロート寸法は、高さ３．５ｃｍ、直径１．５ｃｍで、本体部は、血液のバフィーコート層を捕捉するために５０ミクロンの間隙を提供するようにサイズ設定される。したがって、バフィーコート層の捕捉に利用可能な体積は約０．０８ミリリットルである。バフィーコート層全体は、一般には全血試料の約０．５％より小さいため、好ましいフロートは、８〜１０ミリリットルの血液試料において分離されるバフィーコート層の全量を収容する。
【００２７】
密封または支持フランジ端部１１４は、管の内径１３８にほぼ等しいか、それよりわずかに大きくなるようにサイズ設定される。フロート１１０は、全体的に硬質で、可撓管壁１３６を支持することもできる。また、大径部１１４は、血液構成層の分離を維持するシール機能を提供する。フロートの大径領域１１４と管の壁１３６との間に形成されたシールは、流体密封シールを構成する。本明細書に用いられている「シール」という用語は、多くの場合は本発明の目的に適した実質的なシールを提供するもの、すなわちフランジ１１４と管壁１３６の間のほぼゼロの隙間またはわずかな干渉を包含することを意図したものである。
【００２８】
密封リング１１４は、最も好ましくは連続隆起で、この場合は、試料をより低速度で遠心分離することができ、分離層のスランピング（Slumping）が抑制される。しかし、代替的な実施形態において、密封隆起は、環状間隙１５０の内外に流路を提供する１つまたは複数の開口部を有する不連続または分割帯でありうる。密封隆起１１４は、個別に形成して、本体部１１２に取り付けるようにしてもよい。しかし、密封隆起１１４および本体部１１２は、単一または一体構造を形成するのが好ましい。
【００２９】
セパレータフロート１１０の全体比重は、赤血球の比重（約１．０９０）と血漿の比重（１．０２８）との間に設定する必要がある。好ましい実施形態において、上記比重は、約１．０８９〜１．０２９の範囲、より好ましくは約１．０７０〜約１．０４０の範囲、最も好ましくは約１．０５である。
【００３０】
フロートの全比重が所望の範囲内にあれば、異なる比重を有する複数の材料でフロートを形成できる。フロート１１０の全体比重および環状間隙１５０の体積を、バフィーコート層と共にある程度の赤血球および／または血漿が環状間隙内に保持されるように選択することができる。遠心分離すると、フロート１１０は、バフィーコート層および目標細胞と同じ軸方向位置を占め、濃縮赤血球層上に浮遊する。バフィーコートは、フロート１１０と管１３０の内壁１３６との間の狭い環状間隙１５０に保持される。その際に、拡張されたバフィーコート領域を例えば照明および拡大下で検査して、流血中上皮癌もしくは腫瘍細胞または他の目標分析物を識別することができる。
【００３１】
１つの好ましい実施形態において、フロート１１０の密度は、血液試料の顆粒球層に定在するように選択される。顆粒球は、濃縮赤血球層上または真上に存在し、約１．０８〜１．０９の比重を有する。この好ましい実施形態において、フロートの比重はこの約１．０８〜約１．０９の範囲にあり、遠心分離するとフロートが顆粒球層内に留まることとなる。顆粒球の量は、患者によって約２０倍も変動しうる。したがって、フロートが顆粒球層内に留まるようにフロート密度を選択することは、顆粒球の真上に存在するリンパ球／単球層のいずれかの損失が回避されるため、特に有利である。遠心分離時には、顆粒球層が増加するにつれて、フロートは顆粒球内のより高い位置に留まるようになり、リンパ球と単球をフロートと実質的に同じ位置に維持する。
【００３２】
米国特許第６，１９７，５２３号に開示されている被験者の血流中の循環上皮癌を検出するための方法は、本件発明の試料管およびフロートシステムを採用するようにモディファイすることが可能である。上記米国特許第６，１９７，５２３号は、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれている。
【００３３】
本発明の管／フロートシステム１００を使用する好ましい例示的な方法においては、抗凝固処理血液の試料が提供される。例えば、標準バキュティナー（Vacutainer：登録商標）、または抗凝固剤が予め仕込まれたタイプの他の同様の血液採取装置を使用して、分析すべき血液を引き込むことができる。
【００３４】
目標上皮細胞または他の対象分析物に特有の蛍光標識抗体（Fluorescently Labeled Antibody）を血液試料に添加し、培養することが可能である。例示的な実施形態において、上皮細胞は、蛍光標識が付されたＡｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ抗体で標識される。Ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ抗体は、血流中に通常見いだされる他の細胞に存在しないと想定される上皮細胞特有部位に結合する。アクリジン・オレンジの如き染色剤または着色剤を試料に添加して、それぞれの細胞型に異なる色を帯びさせることにより、照明下でのバフィーコート層の識別を容易にすることができ、また試料の検査時に上皮細胞の形態を強調または明確化することができる。
【００３５】
その後、血液は、遠心分離を行うためにアセンブリ１００に移送される。フロート１１０は、血液試料が試料管１３０内に導入された後に試料管１３０内に嵌入するようにしても、あるいは試料管１３０内に予め配置しておくようにしてもよい。その後、試料を含んだ管およびフロートアセンブリ１００は、遠心分離にかけられる。この管／フロートシステム１００によって血液を遠心分離するのに必要な動作は、従来の場合と顕著に違わないが、上述したように、遠心速度を減速させることが可能で、スランピングの問題を緩和することができる。場合によってはロータにアダプタを利用して、応力による可撓管の破壊を防止することができる。
【００３６】
遠心分離が開始されると、生じた水圧が、管の径を拡大するように壁１３６を変形または屈曲させる。このため、血液成分およびフロート１１０は、遠心力の下で管１３０内を自由に移動する。血液試料は、密度に応じて、下から順に濃縮赤血球、網状赤血球、顆粒球、リンパ球／単球、血小板および血漿の６つの異なる層に分離する。画像化の対象とする上皮細胞は、密度により、バフィーコート層、すなわち顆粒球、リンパ球／単球および血小板層に集まる。フロートは、その密度に基づいて、バフィーコート層と同じ軸方向位置を占める。バフィーコート層は、場合によっては少量の赤血球および／または血漿と共に、狭い環状間隙１５０を占める。
【００３７】
遠心分離が終了して遠心力が除かれると、管１３０は本来の径に戻って、環状間隙１５０内のバフィーコート層および目標分析物を捕捉または保持する。その後、管／フロートシステム１００は顕微鏡または光学式リーダに移送されて、血液試料中の各目標分析物の識別が行われる。
【００３８】
図２〜図２８は、本発明によるフロートの幾つかの典型的な変形例を示す図である。図２は、図１を参照して示し説明したフロート１１０と同様のフロート２１０を示す図である。このフロート２１０は、本体部２１２と密封リング２１４を備えるとともに、その両端部に、先細または円錐形のエンドキャップ部材２１６を備えている。先細状のエンドキャップ２１６は、遠心分離時に、フロート２１０および密封隆起２１４を通る細胞の流れを促進・誘導するために設けられている。
【００３９】
図３は、図２を参照して示し説明したフロート２１０と同様のフロート３１０を示す図である。このフロート３１０は、本体部３１２と密封隆起３１４を備え、その両端部に、円錐台形のエンドキャップ部材３１６を備えている。円錐台形エンドキャップ３１６は、遠心分離時の細胞流およびフロートの移動を促進するために設けられている。
【００４０】
図４は、図２および図３をそれぞれ参照して示し説明したフロート２１０および３１０と実質的に同様のフロート４１０を示す図である。このフロート４１０においては、全体的に凸形または円蓋形の部材４１６が密封隆起４１４を覆う構成となっている。エンドキャップ４１６は、半球形、半楕円形、または同様に傾斜した形状となっている。ここでも、傾斜端部４１６は、遠心分離時における密度に応じた細胞およびフロート移動を促進するために設けられている。
【００４１】
図２〜図４にそれぞれ示されるエンドキャップ・ユニット２１６，３１６，４１６の幾何学的形状は、例示のみを目的としており、これ以外にも、湾曲面、勾配面および／またはテーパー面を与える他の多くの幾何学的形状（凹形または凸形構成を含む）があり、遠心分離時には、その周囲を血液試料が流れることとなる。考えられるさらなる例示的な形状としては、屋根形（tectiform）およびその切頭形、三面、四面またはそれ以上の面を有する角錐形および切頭角錐形、オジバル（ogival）形およびその切頭形、ならびにジオデシック（Geodesic）形状等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４２】
図５は、図１に描かれている実施形態と同様のフロート５１０を示す図である。このフロート５１０においては、端部から軸方向に移動した位置に密封隆起５１４が配置されている。例示された実施形態では、随意のエンドキャップ部材５１６が円錐形として表示されている。しかし、エンドキャップ５１６は、設ける場合には、上述したように、勾配またはテーパ面を与える任意の他の幾何学的形状を用いてもよいことが認識されるであろう。
【００４３】
残りの図６〜図２８には、全体的に平坦な端部を有するもの、すなわち先細状端部を有していないものが示されているが、例示されている実施形態の各々は、図２〜図５に示される上述のエンドキャップ型のいずれか、または傾斜またはテーパー面を与える他の幾何学的構成を含むように、場合によっては変更できることが認識されるであろう。
【００４４】
図６〜図１３は、全体的に環状の管支持部材を有する本発明の実施形態を示す図である。図６はリブ付きフロート６１０を示す図で、このフロート６１０は、中心本体部６１２に沿って軸方向に間隔をおいて配置された複数の環状リブまたは隆起６２０を備えている。このフロートの両端には、随意の端部密封隆起６１４がそれぞれ配置されている。リブ６２０および随意の端部密封隆起６１４は、遠心力が取り除かれたときに管１３０（図１）との密封係合を提供するようにサイズ設定されている。可撓管は遠心分離時に拡張して、密度に基づく遠心分離処理時に、それらの周囲における流れを可能にする。本体部６１２は、遠心分離時とリブ６１４に支持されている間は、管の内径より小さい径を有する。そして、遠心分離処理が終了すると、本体部６１２と管内壁の間に多数の環状溝６５０が形成される。
【００４５】
図６に例示の実施形態は、連続的なリブを示しているが、支持リブを同様に分断またはセグメント化することにより、隣り合う環状溝６５０間の流路を拡大できることが認識されるであろう。さらに、変形し得る管を支持し、かつ／または管壁が内方向に崩れるのを防ぐために、多数のリブおよび／または密封隆起が存在していてもよい。
【００４６】
図７は、さらなる実施形態に係るフロート７１０を示す図である。フロート７１０は、図６に示されるフロート６１０と同様で、中心本体部７１２に沿って軸方向に間隔を設けて配置された複数のリブ７２０を有し、それらリブ７２０の間には、複数の環状溝７５０が形成されている。管支持リブ７２０は、図６の実施形態よりも密集度が低く離れて配置されている。フロートの両端には、随意の密封隆起７１４が配置されている。ここでも、例示の実施形態は、連続的なリブを示しているが、支持リブを同様に分断または分割して、隣り合う環状溝７５０間の流路を拡大できることが認識されるであろう。
【００４７】
図８は、図６および図７の実施形態と同様のさらなるフロートの実施形態８１０を示す図であり、上述した図６および図７についての説明は、この図８に対しても同等に適用可能である。しかし、フロート８１０は、随意的に設けることが可能な密封隆起をその両端に有していないという点において異なっており、リブ８２０の間隔は、図６および図７に示されるリブ間隔の中間である。
【００４８】
図９はさらに別のフロートの実施形態９１０を示す図で、このフロートは螺旋状支持部材または隆起９２０を備えている。すなわち、互いに分離した環状帯の代わりに、螺旋状隆起９２０の複数のターンによって、本体部９１２上に互いに離間した一連の隆起が形成され、その隆起によって、対応する螺旋溝９５０が画成されている。螺旋状隆起９２０は、連続的なものとして示されているが、その代わりに螺旋帯を２つまたはそれ以上の区画に分割または分断して、螺旋状バフィーコート保持溝９５０の互いに隣り合うターンの間に、流体の流れる流路を設けることができる。フロート９１０の軸方向の両端部には、必要に応じて密封隆起９１４が設けられる。
【００４９】
図１０および図１１は、リブ付きおよび螺旋状フロートのさらに別の実施形態１０１０および１１１０をそれぞれ示す図である。図１０において、本体部１０１２上の環状支持リブ１０２０は、半径方向に沿って先細になっている。図１１において、本体部１１１２上に形成された先細の螺旋状支持体１１２０が存在する。その他の点では、フロート１０１０および１１１０は、それぞれ図６および図９を参照しながら説明したものと同様である。支持部材１０２０および１１２０は、連続的なものとして示されているが、その代わりに、軸方向の流れを促進するために不連続になっていてもよいし、分割されていてもよい。また、フロート１０１０および１１１０の両端の上記密封隆起は、例示の実施形態において省略するようにしても、あるいは必要に応じて設けるようにしてもよい。
【００５０】
図１２および図１３は、リブ付きおよび螺旋状フロートのさらに別の実施形態１２１０および１３１０をそれぞれ示す図である。図示のように、支持部材１２２０および１３２０が、それぞれの本体部１２１２および１３１２上に形成されている。管支持部材１２２０および１３２０は、それぞれ全体的に湾曲したまたは円形の断面輪郭を有する。その他の点では、フロート１２１０および１３１０は、それぞれ図６および図９を参照して上述したものと同様である。ここでも、支持部材１２２０および１３２０は連続的なものとして示されるが、代替的な実施形態では、不連続または分割されたものであってもよい。図１３には、随意の端部密封隆起１３１４が存在する。また、図１２には端部密封隆起が示されていないが、場合によって設けることができる。
【００５１】
次に図１４および１５を参照すると、スプライン加工されたセパレータフロート１４１０が示されている。このフロート１４１０は、中心本体部１４１２の周囲に、放射状（Radially）に間隔を設けて配置された軸方向を向く複数のスプラインまたは隆起１４２４を有する。フロートの両端には、随意の端部密封隆起１４１４が配置されている。スプライン１４２４および随意の端部密封隆起１４１４は、本体部１４１２から突出して、可変管（変形可能な管）に係合し、それに対する支持を提供する。端部密封隆起１４１４を設けた場合には、上述した密封機能が与えられる。管内壁と本体部１４１２の間には、軸方向凸部１４２４によって流体保持溝１４５０が形成されている。例えば本体部が円筒形の場合、凸部１４２４間における本体部の表面１４１３を曲面とすることができるが、平坦な表面１４１３も考えられる。例示の実施形態は、フロートの全軸方向長さに沿って連続したスプライン１４２４を示しているが、分割したスプラインまたは不連続なスプラインも考えられる。
【００５２】
図１６は、図１４および図１５を参照して示し説明したフロート１４１０と類似のスプライン加工フロートの他の実施形態１６１０を示す図である。このフロートにおいては、随意の端部密封隆起が設けられていない。
【００５３】
図１７および図１８は、それぞれ代替的なスプライン加工フロート１７１０，１８１０の立面図で、それぞれの図１４および図１６を参照して上記に示し、説明したそれぞれの実施形態と類似しているが、それぞれの本体部１７１２，１８１２からそれぞれ突出する軸方向スプライン１７２４，１８２４が放射状により散在的に間隔を設けて配置されている。フロート１７１０は、図１８のフロート１８１０には存在しない随意の端部密封隆起１７１４を含む。上述のように、それぞれの表面１７１３，１８１３は平坦または曲面とすることができる。
【００５４】
次に図１９を参照すると、本発明のさらなる実施形態によるスプライン加工セパレータフロート１９１０の斜視図が示されている。軸方向を向く多数のスプライン１９２４が放射状に間隔を設けて配置され、中心本体部１９１２から突出して、可撓管に対する支持を提供する。随意の密封端部隆起１９１４が、フロート１９１０の両端に配置されている。隣り合うスプライン１９２４と、本体部１９１２上の表面１９１３によって、隣り合うスプライン１９２４の間に形成された流体保持溝１９５０が定められる。表面１９１３は、全体的に平坦なものとして描かれているが、曲面も考えられる。軸方向スプライン１９２４は、管の長さに沿って連続的なものとして描かれているが、分割されたスプラインまたは不連続なスプラインも考えられる。
【００５５】
次に図２０を参照すると、本体部２０１２に対して突出した管支持部材２０２６を含むさらに他の実施形態２０１０が示されている。支持手段２０２６は、環状リングまたはリブ２０２０と軸方向スプライン２０２４との交差ネットワークとすることができる。フロートの両端には、随意の端部密封隆起２０１４が配置されている。支持部材２０２６および随意の密封隆起２０１４は、フロートの両端において本体部２０１２から半径方向に突出して、可変管に係合し、それに対する支持を提供する。端部密封隆起２０１４を設けた場合には、上述した密封機能が与えられる。隆起状の支持部材２０２６は、管内壁と本体部２０１２の間に複数の流体保持窓２０５０を形成する。本体部が円筒形のときは、窓２０５０に対応する本体部２０１２の表面２０１３を曲面とすることができるが、平坦な表面２０１３も考えられる。例示されている実施形態は、支持部材２０２６を連続的な環状リブと軸方向スプラインのネットワークとして示しているが、例えば２つまたはそれ以上の窓２０５０の間に流路を提供するために、ネットワーク２０２６の環状および／または軸状部に分断部を含めることもできる。
【００５６】
図２１〜図２６は、試料管の可変壁に対する支持を提供するための複数の凸部を表面に有するいくつかのフロートを示す図である。図２１および図２２を参照すると、フロート２１１０および２２１０は、それぞれ中心本体部２１１２の表面に間隔を設けて配置された多数の円形突起またはノブ２１２８を有する。随意の端部密封隆起２１１４（図２１）は、フロート２１１０の両端に配置されているが、図２２のフロート２２１０には設けられていない。ノブ２１２８および随意の端部密封隆起２１１４は、本体２１１２から半径方向に突出し、環状間隙２１５０を横切って、可変管壁に係合し、それに対する支持を提供する。端部密封隆起２１１４が設けた場合には、上述した密封機能が与えられる。凸部間の本体部表面は、例えば本体部が円筒形のときは曲面であってもよく、あるいは平坦部または小面を有していてもよい。
【００５７】
図２３および図２４には、図２１および図２２を参照して上述したものと実質的に同様であるが、凸部２３２８が、本体部２３１２の表面に、千鳥状のパターンではなく整列パターンを形成するフロートの実施形態２３１０および２４１０が示されている。図２３の実施形態には、随意の端部密封隆起２３１４が設けられている。
【００５８】
次に図２５および図２６を参照すると、それぞれ図２１および図２２を参照して上述したものと実質的に同様であるが、凸部２５２８が、より低い密集度で本体部２５１２の表面に間隔を設けて配置されているフロートの実施形態２５１０および２６１０が示されている。図２５の実施形態には随意の端部密封隆起２５１４が設けられている。
【００５９】
図２７および図２８は、それぞれ中心本体部２７１２の表面に間隔を設けて配置された多数の隆起小面２７２８を含むフロートの実施形態２７１０および２８１０を示す図である。随意の端部密封隆起２７１４（図２７）は、フロート２７１０の両端に配置されているが、図２８の実施形態には設けられていない。小面２７２８および随意の端部密封隆起２７１４は、本体２７１２から半径方向に突出し、環状間隙を横切って、可変管壁に係合し、それに対する支持を提供し、複数の流体保持窓２７５０を定める。端部密封隆起２７１４を設けた場合には、上述した密封機能が与えられる。本体部の表面２７１３は、凸部２７２８の間に配置されて、流体保持窓２７５０を区画する表面を構成するものであるが、この表面２７１３は、例えば本体部が円筒形のときには、曲面であってもよい。あるいは、表面２７１３は平坦であってもよい。代替的な実施形態においては、小面２７１８のサイズ、間隔密度および整列パターンを大きく変更することができる。
【００６０】
可撓試料管を支持するものとして円形ノブまたは方形小面を参照しながら図２１〜図２８の例示的な実施形態を説明したが、任意の幾何学的形状の凸部を利用することができる。凸部の他の幾何学的形状としては、例えば円錐形または円錐台形スパイク、屋根形およびその切頭形凸部、円筒形凸部、角錐形または切頭角錐形凸部、半楕円形凸部や、それらの任意の組合せなども考えられる。同様に、凸部のサイズ、間隔およびパターンを変更することが可能である。試料を画像化する場合は、画像化視野および他の要因に従ってサイズおよび間隔を選択することが可能である。
【００６１】
以上、好ましい実施形態を参照しながら本発明を説明した。当然のことながら、上述した詳細な説明を読み、これを理解すれば、幾つかの修正や変更が思い付くことであろう。本発明は、添付の請求項またはその同等物の範囲内にある限り、それら全ての修正および変更を包含するものであると見なされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法であって、
前記血液試料中の他の細胞から目標細胞を識別できるように、前記血液試料を１または複数の標識剤と組み合わせる工程と、
第１の径を内径とする細長い側壁を有する少なくとも半透明の可撓試料管に、前記血液試料を導入する工程と、
赤血球と血漿の中間の比重を有する容量占有セパレータフロートを、前記試料管に挿入する工程とを有し、
前記セパレータフロートは、硬質の本体部と、前記本体部から突出して前記試料管の前記側壁に係合するとともに前記側壁を支持する１または複数の支持部材とを備え、前記本体部および前記支持部材は、前記試料管が拡張されるときの当該管の第１の内径より小さい外径を有し、前記本体部は、前記側壁の軸方向に沿う部分と共に、その間に環状空間を形成し、前記支持部材は、前記環状空間を横切って、１または複数の分析領域を生成するように構成されており、
当該方法はさらに、
前記試料管内の前記血液試料およびセパレータフロートに遠心力を作用させて、前記分析領域内の前記血液試料中に存在する各目標細胞を遠心力によって局在化させる工程と、
遠心分離後に、前記試料管が前記セパレータフロートを圧迫することを可能にして、前記分析領域内に存在する前記血液試料を検査することにより、そこに含まれる各目標細胞を識別する工程と、を有することを特徴とする抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法。
【請求項２】
前記１または複数の標識剤は蛍光標識リガンドを含み、
前記血液試料を検査する工程では、照明および拡大下で、前記分析領域に存在する前記血液試料を画像化する処理をさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法。
【請求項３】
前記血液試料を染色剤と合成する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法。
【請求項１】
抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法であって、
前記血液試料中の他の細胞から目標細胞を識別できるように、前記血液試料を１または複数の標識剤と組み合わせる工程と、
第１の径を内径とする細長い側壁を有する少なくとも半透明の可撓試料管に、前記血液試料を導入する工程と、
赤血球と血漿の中間の比重を有する容量占有セパレータフロートを、前記試料管に挿入する工程とを有し、
前記セパレータフロートは、硬質の本体部と、前記本体部から突出して前記試料管の前記側壁に係合するとともに前記側壁を支持する１または複数の支持部材とを備え、前記本体部および前記支持部材は、前記試料管が拡張されるときの当該管の第１の内径より小さい外径を有し、前記本体部は、前記側壁の軸方向に沿う部分と共に、その間に環状空間を形成し、前記支持部材は、前記環状空間を横切って、１または複数の分析領域を生成するように構成されており、
当該方法はさらに、
前記試料管内の前記血液試料およびセパレータフロートに遠心力を作用させて、前記分析領域内の前記血液試料中に存在する各目標細胞を遠心力によって局在化させる工程と、
遠心分離後に、前記試料管が前記セパレータフロートを圧迫することを可能にして、前記分析領域内に存在する前記血液試料を検査することにより、そこに含まれる各目標細胞を識別する工程と、を有することを特徴とする抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法。
【請求項２】
前記１または複数の標識剤は蛍光標識リガンドを含み、
前記血液試料を検査する工程では、照明および拡大下で、前記分析領域に存在する前記血液試料を画像化する処理をさらに行うことを特徴とする請求項１に記載の抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法。
【請求項３】
前記血液試料を染色剤と合成する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗凝固処理全血試料中の循環目標細胞を検出するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公開番号】特開２００９−２８８２５４（Ｐ２００９−２８８２５４Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０８３７７（Ｐ２００９−２０８３７７）
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【分割の表示】特願２００４−５４２０３９（Ｐ２００４−５４２０３９）の分割
【原出願日】平成１５年１０月２日（２００３．１０．２）
【出願人】（５０１２８４２１７）バッテル メモリアル インスティチュート (6)
【出願人】（５０５４１１４７９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【分割の表示】特願２００４−５４２０３９（Ｐ２００４−５４２０３９）の分割
【原出願日】平成１５年１０月２日（２００３．１０．２）
【出願人】（５０１２８４２１７）バッテル メモリアル インスティチュート (6)
【出願人】（５０５４１１４７９）
【Ｆターム（参考）】
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