抗炎症剤
本発明は、ヒトおよび動物における炎症の治療または予防の分野に関し、様々な炎症状態を、治療または予防するための、医薬組成物および方法に関する。特に、本発明は、シトルリン関連疾患、好ましくは炎症性疾患のような炎症状態を、予防または治療するための、組成物および方法に関する。本発明は、炎症状態の治療および予防に使用するための、シトルリン含有エピトープに対する特異的結合分子を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび動物における炎症の治療または予防の分野に属し、様々な炎症状態を、治療または予防するための、医薬組成物および方法に関する。特に、本発明は、シトルリン関連疾患、好ましくは炎症性疾患のような炎症状態を、予防または治療するための、組成物および方法に関する。本発明は、炎症状態の治療および予防に使用するための、シトルリン含有エピトープに対する特異的結合分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
炎症状態は、慢性であろうと急性であろうと、医療業界における相当な問題を突き付ける。簡潔に述べるならば、慢性的な炎症は、活動性炎症、組織破壊、および治癒の試行は同時に進行する、持続時間の長い（数週間または数ヶ月の）炎症であると考えられる（Robbins Pathological Basis of Disease by R.S. Cortran, V.Kumar and S.L.Robbins, W.B.Saunders Co., p.75, 1989）。慢性炎症は、急性炎症の発症後に続き得るが、例えば、持続感染（例えば、結核、梅毒、真菌症）の結果として、内因性（例えば、血漿脂質）もしくは外因性（例えば、シリカ、アスベスト、タバコのタール、手術用縫合糸）の毒素への遷延性の曝露、または体自身の組織に対する自己免疫反応（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬）のような、時間経過とともに進行する潜行性のプロセスとしても生じ得る。
【０００３】
炎症性関節炎は、特に高齢者の増加した先進国において深刻な健康問題である。例えば、炎症性関節炎の一種である慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、世界の人口の１〜２％が侵されている多系統慢性の再発性炎症性疾患である。
【０００４】
多くの器官が侵され得るが、ＲＡは、基本的に、侵された関節の破壊および強直を導くこともある慢性滑膜炎症の重度の形態である（Rob bins Pathological Basis of Disease, by R.S. Cotran, V.Kumar, and S.L. Robbins, W.B.Saunders Co., 1989）。疾患は、関節隙に拡張する様々な投射を形成する滑膜の顕著な厚化、滑膜ライニング（滑膜細胞増殖）の多層化、白血球細胞（「炎症性滑膜炎」と称される、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、およびリンパ濾胞）による滑膜の炎症、ならびに滑膜内の細胞壊死によるフィブリンの沈着により病理学的に特徴付けられる。この過程の結果として形成された組織はパンヌスと称され、パンヌスは最終的に関節隙を埋めるまで増殖する。パンヌスは、滑膜炎の進展に不可欠である血管新生の過程を通じて、新しい血管の広範なネットワークを発達させる。パンヌス組織の細胞に由来する、消化酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ、ストロメリシン））および炎症性プロセスの他の修飾因子（例えば、過酸化水素、スーパーオキサイド、リソソーム酵素、およびアラキドン酸代謝の生産物）の放出は、軟骨組織において進行性の破壊を導く。パンヌスは、関節軟骨に侵潤し、びらん（erosion）および軟骨組織の断片化を導く。結果的に、関与する関節について、線維性強直を有する肋軟骨下のびらんを生じ、最終的に骨性強直を生じる。
【０００５】
一般的には、ＲＡは自己免疫疾患であり、その多くの異なる関節刺激が免疫遺伝学的に感受性である宿主における免疫応答を活性化すると考えられている。外因性感染性病原体（Epstein-Barrウイルス、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、マイコプラズマなど）と、コラーゲン、プロテオグリカン、変更された免疫グロブリン、およびシトルリン化タンパク質のような翻訳後修飾されたタンパク質などの内因性タンパク質との両者は、不適切な宿主の免疫応答を引き起こす病原体として関与している。刺激する病原体に関係なく、自己免疫は疾患の進行に影響を与える。特に、関連する抗原は、抗原提示細胞（滑膜における、マクロファージまたは樹状細胞）により摂取され、処理され、Ｔリンパ球に提示される。Ｔ細胞は、細胞性免疫応答をイニシエートし、形質細胞の増殖およびＢリンパ球の形質細胞への分化を刺激する。最終的には、宿主組織に対する不適切な過剰の免疫応答（例えば、ＩＩ型コラーゲンに対する抗体、自己由来のＩｇＧのＦｃ部分に対する抗体（「リウマチ因子」と称する））、および異なるシトルリン化エピトープに対する抗体（抗ＣＣＰ）が生じる。このことは、さらに免疫応答を増幅し、軟骨組織の破壊を早める。一度このカスケードがイニシエートされれば、軟骨破壊の多数の修飾因子が関節リウマチの進行に関与する。
【０００６】
上述の抗ＣＣＰ抗体は、ＲＡに特異性が高いことが示された。最近の証拠は、これらの抗体についての血清反応陽性である各個人が既にＲＡを有しているか、または将来この疾患が進展することを示す。抗ＣＣＰ抗体の存在（特に、高力価が存在している場合）は、びらん性疾患の転帰の前兆である（Nijenhuis et al., Clin. Chim. Acta, vol 350, 17-34, 2004）。さらに抗ＣＣＰ抗体は、炎症の局所的な部位において産生されることが示された。ＲＡ患者に由来する滑膜材料において見出される総ＩｇＧに対する抗ＣＣＰ抗体の割合は、同じ患者の血清における当該割合よりも顕著に高いことが明らかである（Masson-Bessi鑽e et al., Clin Exp Immunol, vol 119, 544-552, 2000）（Reparon-Schuijt et al., Arthritis Rheum, vol 44、41-47、2001）。
【０００７】
滑膜において形質細胞を産生する抗ＣＣＰの存在は、炎症部位におけるＣＣＰ特異的なＢ細胞の抗原駆動型の成熟を示す。一度抗ＣＣＰ抗体が産生されれば、滑膜におけるシトルリン化タンパク質を有する免疫複合体の形成は、炎症過程の進行を引き起こし得る。これらのデータおよびその他のデータは、抗ＣＣＰ抗体がＲＡの疾患症状の少なくとも一部を実際に引き起こすという仮説を支持する。ＲＡの病因における抗ＣＣＰ抗体の役割は、ＲＡ患者におけるＢリンパ球減少実験の結果により支持される（Cambridge et al., Arthritis Rheum, vol48, 2146-2154, 2003）。
【０００８】
進行した関節リウマチを持つ人々の死亡率は、数種のがんの死亡率を超えている。このため、治療法は、不可逆的な関節破壊の可能性を減少させるために設計される積極的な早期の薬物療法に移行している。米国リウマチ学会（Arthritis and Rheumatism 39（5): 713-722, 1996）の最近の推奨事項は、診断が確定し、症状が進行中の全ての患者のための疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）治療の早期開始を含む。抗がん剤は、リウマチの６０〜７０％の第１選択薬である化学療法薬のメトトレキサートとともに、大半の患者のための第１選択療法となった。重度疾患では、多くの場合、無期限のこの薬剤による毎週の治療を必要とし、メトトレキサート療法にも関わらず症状が進行する患者（患者の５０％以上）には、シクロスポリンおよびアザチオプリンのような第２化学療法薬（単独または組み合わせ）が頻繁に採用される。
【０００９】
特に、前記滑膜が関与している疾患およびシトルリン関連炎症性疾患などの、炎症性疾患の病理発生を抑制することが可能な炎症性疾患の治療または予防のための化合物が依然として必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、炎症性疾患の治療または予防における使用のためのｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を提供する。
【００１１】
また、本発明は、炎症性疾患を治療または予防するための方法であって、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を含む、治療に有効な量の抗炎症組成物をそれが必要とされる患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の組成物および方法は、シトルリン残基に反応する特異的結合分子の薬学的に受容可能な形態を含む。特に、上記結合分子は、本明細書においてｐ１５およびｐ１７と称したような２つのポリペプチドにおけるシトルリン化されたエピトープに特異的に反応する。
【００１３】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明、図面、および実施例を参照すれば明らかになるであろう。加えて、より詳細な具体的手順、装置、または組成物が記載された様々な参考文献が本明細書に明記されており、したがってその全体が参照により組み込まれる。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、炎症性疾患の治療または予防に使用するための、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を提供する。
【００１５】
用語「特異的結合分子」は、特異的結合をすることができる分子、好ましくは小分子を示すために本明細書において使用される。この点において、特異的な結合は、分子が選択された標的分子に結合することができるが、同一の条件下において標的分子に関連しない他のものには結合しないことを意味する。例えば、結合分子が、血清アルブミンに結合するが、その他、好ましくは血清中に見出される他の全てのタンパク質に、ほとんどまたは全く結合しないときに血清アルブミンに特異的に結合すると表現する。
【００１６】
この文章において、用語「シトルリンに特異的に反応する」または「シトルリン化エピトープに反応する」または「シトルリンエピトープに反応する」は、抗体が、シトルリン残基を含む、ペプチドまたはペプチド様分子のような構造に反応するが、前記抗体が、シトルリン残基の換わりにアルギニン残基を含む同一の構造にほとんど反応しないか、または好ましくは全く反応しないことを意味する。用語、ペプチドまたはペプチド様分子は、好ましくはヒトまたは動物の体に現れるような同一の構成（context）、好ましくは天然ポリペプチドの構成において、本明細書に記載されているような特異的な結合分子との免疫反応性のための正確な構成内にシトルリン残基が存在することができる構造として解釈されるべきである。
【００１７】
「特異的結合分子」は分子であってもよく、好ましくは標的化合物に特異的に結合することができる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質全体、またはそれらの組み合わせ、もしくはその部分であってもよい。特異的結合分子の好ましい例としては、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、フラグメント抗原結合領域（Ｆａｂｓ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂｓ）、または、ＶＨＨ抗体としても知られるナノボディ（ラクダ由来の単一ドメイン抗体）もしくはＶＮＡＲと呼ばれるサメＩｇＮＡＲ由来単一ドメイン抗体フラグメント、もしくはそれらの他の活性成分、またはアンチカリン、またはアプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のようなペプチドもしくは抗体またはその部分である。好ましい実施形態では、特異的結合分子は、抗体またはＤＮＡもしくはＲＮＡ形態であるアプタマーのようなアプタマーの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。さらに好ましい実施形態では、特異的結合分子は、抗体フラグメント、ナノボディ、単一ドメイン抗体、またはそれらの活性部分を含むような、抗体またはそれらの誘導体を含む。したがって、本発明は、特に上述したような特異的結合分子に関し、前記特異的結合分子はペプチドまたは抗体である。
【００１８】
用語「抗体（Antibodies）」または「抗体（antibody）」は、多くの場合「抗原」として表される標的分子に特異的に結合することができる、タンパク質またはポリペプチドを表す。抗体（免疫グロブリンとしても知られる）は、脊椎動物の血液または他の体液に見出され、細菌およびウイルスのような外来の異物を特定および中和する免疫系によって使用されるガンマグロブリンタンパク質である。
【００１９】
抗体は、通常、基本的な構造ユニット（それぞれ、２つの大きな重鎖および２つの小さな軽鎖）によって、例えば、１ユニットを有するモノマー、２ユニットを有するダイマー、または５ユニットを有するペンタマーを形成するために作製される。抗体は、Ｂ細胞と称される種類の白血球によって生産される。抗体重鎖のいくつかの異なる種類およびいくつかの異なる種類の抗体が存在し、それらの有する重鎖に基づく異なるアイソタイプに分類される。異なる役割を有する５種の異なる抗体アイソタイプが哺乳類で知られており、それらが遭遇した外来の異物の異なる種類のそれぞれについて適切な免疫応答を直接に補助する。ラクダ（例えば、ラマ）およびサメのような数種の動物種は異常な抗体構造を有し得る。
【００２０】
全ての抗体の一般的な構造は非常によく似ているが、タンパク質の先端にある小さな領域は、非常に変化に富んでおり、わずかに異なる先端構造を有する数百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は可変領域として知られている。これらの変異体のそれぞれは、抗原として知られる異なる標的に結合することができる。抗体のこの豊かな多様性により、免疫系は等しく広い抗原の多様性を認識することが可能となる。抗体によって認識される抗原の独特の部分は、エピトープと称される。これらのエピトープは、生物を構成する異なる数百万の分子中の独特な抗原のみを識別して結合することができる、特異性の高い相互作用によってそれらの抗体に結合する。抗体タグによる抗原の認識は、免疫系の他の部分による攻撃のためである。また、抗体は、例えば、感染症を引き起こす病原体の一部に結合することによって、直接に標的を中和することができる。
【００２１】
抗体の多種多様な集団は、異なる抗原結合部位（またはパラトープ）をコードする遺伝子セグメントのセットのランダムな組み合わせによって生成され、その後に抗体遺伝子のこの領域におけるランダムな突然変異が続く。また、抗体遺伝子は、重鎖の基礎を他の重鎖に変更し、抗原特異的可変領域が保持された抗体の異なるアイソタイプを作製する、クラススイッチングと称される過程において再認識される。このことは、単一抗体が、免疫系のいくつかの異なる部分によって、いくつかの異なるアイソタイプで使用されることを可能にする。
【００２２】
本明細書において使用される、用語「抗体」は、一本鎖抗体、フラグメント抗原結合領域、組換え産生される抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体などが含まれる。
【００２３】
抗体または他の特異的結合分子との関連で、用語「またはそれらの一部」は、抗体または特異的結合分子の特異的な結合部位を構成する、抗体または特異的結合分子の一部を表し、抗体全体または特異的な結合分子のような同一のエピトープにでも反応することができる、抗体または特異的結合分子の一部と解釈し得る。
【００２４】
抗体、抗体の特異的結合ドメインを含む融合タンパク質、アプタマー、抗体フラグメント、単一ドメイン抗体フラグメント、アンチカリンような他のタンパク質様結合ドメイン、およびシトルリン化エピトープに特異的に結合する小分子のような、全種類の特異的結合分子およびそれらの誘導体が本発明において使用することができる。しかし、ヒト抗体またはそれらのフラグメントが、本発明の好ましい実施形態である。好ましくは、ＩｇＧ１重鎖とラムダ軽鎖とを有するＩｇＧ１（例えば、ＩｇＧ１λ）抗体が使用される。しかし、カッパまたはラムダ軽鎖に組み合わせたＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、他のヒト抗体アイソタイプも本発明に包含される。また、動物に由来する抗体の多様なアイソタイプの全てが本発明において使用することができる。抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖフラグメント、または単一ドメインＶＨＨ、ＶＨ、もしくはＶＬを含む、全長サイズ抗体または抗体の抗原結合フラグメントとすることができる。
【００２５】
「特異的結合分子はシトルリン化エピトープに反応する」は、ペプチドもしくはペプチド核酸またはアプタマーもしくは疑似ペプチド構造のような大きな構造に関連して、シトルリン残基に特異的に反応する特異的結合分子として解釈される。
【００２６】
シトルリンは、翻訳の間にタンパク質に組み込まれないアミノ酸である。しかし、それはペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるアルギニン残基の翻訳後修飾によって生成され得る。
【００２７】
シトルリン化は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって触媒され、アルギニン残基をシトルリン残基に翻訳後変換することである。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）酵素は、タンパク質においてアルギニン残基をシトルリン残基に変換することを触媒する。シトルリンについてのtＲＮＡは存在せず、タンパク質中におけるシトルリン残基の存在は、全て翻訳後修飾の結果である。哺乳類（ヒト、マウス、およびラット）における５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１〜ＰＡＤ６、「ＰＡＤ４」および「ＰＡＤ５」は同一のアイソタイプに使用される）は、それぞれ同定された別個の遺伝子にコードされている（Vossenaar, et al., Bioessays 25, 1106-1118, 2003）。全てのこれらの酵素は、活性についてＣａ２＋の存在に強く依存しており、遊離のＬ−アルギニンを遊離のＬ−シトルリンに変換することはできない。遊離のＬ−アルギニンは、細菌真核生物においては一酸化窒素合成酵素（ＥＣ１．１４．１３．３９）によって、または細菌においてはアルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．３．６）によって、遊離のＬ−シトルリンに変換することができる。これらの酵素はＣａ２＋に依存していない。
【００２８】
相同性の高いＰＡＤの酵素の間の最も顕著な違いは、それらの組織特異的な発現である。表皮におけるＰＡＤ１（同義語として、ＰＡＤＩ、ＰＡＤタイプＩ）は、角化エンベロープの再組織化のために重要である、ケラチノサイト分化の最終段階の間におけるケラチン繊維のシトルリン化に関与している。表皮におけるシトルリン化の他の部位は、ＰＡＤ３（同義語として、ＰＡＤＩＩＩ、ＰＡＤタイプＩＩＩ）およびその天然基質であるトリコヒアリンを（ＴＨＨ）を含む毛包である。ＴＨＨは、毛包内毛根鞘細胞および毛包髄質層、ならびにより少なくは他の特殊な上皮の髄質層の主要な構造タンパク質である。ごく最近同定されたＰＡＤアイソタイプ、ＰＡＤ６（同義語としてｅＰＡＤ）は、初期胚発生に重要な役割を果たすマウス卵母細胞の細胞シートにおいて見出された。そのヒトオーソログの発現は、卵巣、精巣、末梢血白血球に制限されることが見出された（Chavanas et al., Gene vol 330; 19-27, 2004）。当初、このＰＡＤアイソタイプは、ｅＰＡＤと称されたが、他のパッドの系統番号に基づいて、このアイソタイプはＰＡＤ６（Vossenaar et al., Bioessays vol 25 1106-1118, 2003）に名称が変更された。最も広く発現するアイソタイプであるＰＡＤ２（同義語として、ＰＡＤＩＩ、ＰＡＤタイプＩＩ、ＰＡＤ−Ｈ１９）は、骨格筋、脳、脾臓、分泌腺、およびマクロファージのような多くの異なる組織に存在する。この広範な発現パターンにも関わらず、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびビメンチンを除いては天然基質として同定されていない。多発性硬化症（ＭＳ）の患者では、ＭＢＰに対する自己免疫応答が発生している。ＭＢＰは、ミエリン鞘に豊富なタンパク質であり、そのシトルリン化は中枢神経系の発生中に起こる。ビメンチンのシトルリン化は、カルシウムイオノフォアに誘導される、ヒトおよびマウスにおけるマクロファージのアポトーシス間に観察され、上述したように、シトルリン化されたビメンチンは、ＲＡ特異的な抗Ｓａ自己抗体の標的であることが示された。全て主に細胞質に局在する上述したＰＡＤｓとは対照的に、ＰＡＤ４アイソタイプ（同義語として、ＰＡＤＩＶ、ＰＡＤタイプＩＶ、ＨＬ−６０ＰＡＤ、ＰＡＤ Ｖ、ＰＡＤタイプＶ、ＰＡＤＩ４）は核内に存在する。ＰＡＤ４の核局在化シグナルは、タンパク質のＮ末端領域で見出された。ＰＡＤ４は、主に末梢血の顆粒球および単球に発現する。核内におけるＰＡＤ４の基質は、ヒストンコアタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ３、およびＨ４）、ならびにリボソームアセンブリ、核細胞質間輸送、中心体の複製に機能する核小体タンパク質であるヌクレオホスミン／Ｂ２３である。
【００２９】
本発明に係る特異的結合分子は、それぞれ１５ｋＤａおよび１７ｋＤａであるそれらの分子量によって特徴付けられる２つのポリペプチドである、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープに対する。
【００３０】
このような特異的結合分子は、特に炎症性疾患の治療または予防に適していることが見出された。
【００３１】
本明細書において使用される、「炎症性条件」または「炎症性疾患」は、血管病変、好中球の浮腫および浸潤（例えば、急性炎症反応）、単核球による組織の浮腫、炎症細胞、結合組織細胞、およびそれらの細胞性産物による組織破壊、ならびに結合性組織による修復の試行（例えば、慢性的な炎症反応）により特徴付けられる任意の数の、条件または疾患を表す。
【００３２】
このような条件の代表的な例には、シトルリンに関連する炎症性疾患および自己免疫疾患が含まれる。シトルリン関連炎症性疾患は、シトルリンが病気の発症において影響を与える疾患として本明細書において定義される。シトルリンが病気の発症に影響を与えるか否かは、当該分野において利用可能な常用試験を用いて当業者により容易に決定され得る。例えば、これらの疾患は、罹患した、または病気に関連する組織におけるシトルリン化タンパク質の異常なレベルの存在によって特徴付けられ得る。このような特徴付けは、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡのような免疫学的検査により達成することができ、上記罹患した組織は抗原として使用され、その抗原のシトルリン化は本明細書に記載されたような抗シトルリン抗体を用いて検出し得る。
【００３３】
また、当業者は、罹患患者由来の患部組織と健康な組織とにおける、シトルリンのレベルおよび種類を比較するためのマススペック分析のようなプロテオミクスアプリケーションを使用することができる。
【００３４】
また、疾患は、ペプチドまたはタンパク質を含むシトルリンに対する免疫応答の存在によって特徴付けられ得る。これは、Ｔ細胞またはＢ細胞によって媒介される、体液性または細胞性免疫応答であり得る。検査のための抗シトルリン抗体は、当該技術分野で記述され、市販されている。
【００３５】
したがって、本発明は、シトルリンに関連する炎症性疾患の、治療または予防に使用するための特異的結合分子に関する。
【００３６】
このような疾患は、例えば、関節リウマチおよび変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、ならびにレビー小体型認知症を含む炎症性関節炎である。したがって、本発明は、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される疾患の、治療または予防における使用のための特異的結合分子に関する。
【００３７】
特に、本発明は、自己免疫疾患、より具体的には関節リウマチまたは変形性関節症の、治療または予防のための特異的結合分子に関する。
【００３８】
多発性硬化症またはＭＳは、ミエリン鞘の自己免疫性破壊により特徴付けられる中枢神経系の慢性炎症性疾患である。ミエリン鞘の細胞は、約３：１の割合で脂質タンパク質複合体からなる軸索周囲の多重二分子層構造を形成する。２つの主要なタンパク質であるＭＢＰおよびプロテオリピドタンパク質でタンパク質画分の８５％を占める。ＭＢＰは、高カチオン性タンパク質であり、ホスファチジルセリンのような負に帯電したリン脂質と強い相互作用を形成することができる。健康な成人におけるＭＢＰ分子の約１８％では、６個（１９個中）のアルギニンがシトルリン化される（Wood et al., J Biol Chem, vol264, 5121-5127, 1989, Wood et al., Ann Neurol, vol40, 18 -24, 1996）。残りのＭＢＰ分子はシトルリンを含んでいない。ＭＳ患者においてＭＢＰ−ｃｉｔ６の割合は全ＭＢＰの４５％に増加する。ＭＢＰ−ｃｉｔ６における正の実効電荷（net positive charge）の減少は、ＭＢＰ分子の部分的なアンフォールディングを引き起こし、リン脂質とのそれらの相互作用を弱める（Boggs et al., J Neurosci Res, vol57, 529-535, 1999, Pritzker et al., Biochemistry, vol39, 5374-5381, 2000）。ＭＢＰ−ｃｉｔ６は、非シトルリン化ＭＢＰより迅速に脂質複合体を形成することができるが、形成された複合体は、非シトルリン化ＭＢＰにより形成された複合体の充填された密度ほどではなく形成される（Boggs et al., J Neurosci Res, vol57, 529-535, 1999, Beniac et al., J Struct Biol, vol129, 80-95,2000）。ＭＢＰ−ｃｉｔ６は、非シトルリン化ＭＢＰよりも４倍の速さでカテプシンＤによって分解される（Cao et al., Biochemistry, vol38, 6157-6163, 1999）。急性劇症のＭＳ（マールブルグ型）のまれなケースでは、ＭＢＰの分子の８０％が重度にシトルリン化されるＭＢＰｃｉｔ１８）（Wood et al., Ann Neurol, vol40, 18-24, 1996）。重度にアンフォールドされたＭＢＰ−ｃｉｔ１８は、通常のＭＢＰよりも４５倍の速度でカテプシンＤにより分解される（Cao et al., Biochemistry, vol38, 6157-6163, 1999）。抗がん剤タキソールの有効成分であるパクリタキセルの臨床試験が進行中である（O'Connor et al., Ann Neurol, vol46, 470, 1999）。低用量のパクリタキセルは、in vitroにおいてＰＡＤ２によるＭＢＰのシトルリン化を抑制することができる（Pritzker et al., Biochim Biophys Acta, vol1388, 154-160, 1998）。パクリタキセルによる治療は、臨床的な症状を和らげ、損傷した鞘の再ミエリン化を誘導し（Moscarello et al., Mult Scler, vol8, 130138, 2002）、脱ミエリン化疾患における候補因子としてＰＡＤの潜在的重要性を際立たせた（Moscarello et al., J Neurochem, vol81, 335-343, 2002）。
【００３９】
乾癬では、ケラチノサイトは非常に急速に増殖し、約４日間で基底層から表面に移動する。これらの細胞は、厚く、乾燥したパッチまたはプラークに蓄積されるので、皮膚はそれらを充分に迅速に脱落させることができない。通常のケラチノサイトでは、ケラチンＫ１は、末端の分化の間にＰＡＤ１によってシトルリン化される。この過程は、表皮における通常の角化のプロセスに不可欠である、ケラチンフィラメントをコンパクト化する原因となる。乾癬性高増殖性プラークにおけるケラチノサイトは、シトルリン化ケラチンＫ１を含まない（Ishida-Yamamoto et al., J Invest Dermatol, vol114, 701-705, 2000）。細胞増殖の増大がＰＡＤによる適切なシトルリン化を予防するか、またはＰＡＤの不活性化がケラチノサイトの過剰増殖および蓄積を可能にするのかは明らかではない。メカニズムは不明であるが、乾癬表皮における異常なシトルリン化は明らかにＰＡＤ１に関する。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、水溶液、ゲル、ヒドロゲル、フィルム、ペースト、クリーム、スプレー、軟膏、またはラップからなる群から選択される形態である。さらなる実施形態において、上述の方法は、関節内、腹膜内、腹腔内、局所、直腸、静脈内、経口、眼、または腫瘍の周辺部の切除から選択される経路によって、本明細書に記載された組成物の投与のために使用される。
【００４１】
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、共溶媒溶液、リポソーム、ミセル、液晶、ナノ結晶、ナノ粒子、エマルジョン、微粒子、微小球、ナノスフェア、ナノカプセル、ポリマーまたはポリマー担体、界面活性剤、懸濁化剤、シクロデキストリンまたはアルブミンのような吸着分子などの錯化剤、表面活性粒子、およびキレート剤からなる群から選択される少なくとも１つの担体を含む。さらなる実施形態では、多糖類は、ヒアルロン酸およびその誘導体、デキストランおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、コハク酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、キトサンおよびその誘導体、[ベータ]−グルカン、アラビノキシラン、カラギーナン、ペクチン、グリコーゲン、フコイダン、コンドロイチン、デルマタン、ヘパラン、ヘパリン、ペントサン、ケラタン、アルギン酸塩、シクロデキストリン、ならびにそれらのエステルおよび硫酸塩を含む塩および誘導体を含む。
【００４２】
さらに別の態様において、本発明の方法は、本発明の組成物を標的部位、特に滑膜関節に導くことを含む。
【００４３】
本発明のある特定の実施例では、特異的結合分子は、ｐ１５および／またはｐ１７に結合するモノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107に競合する。
【００４４】
モノクローナル抗体RhmAb2.101、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104、RmmAb1.101、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104の可変領域の一次ｍＲＮＡ配列が公開され、表１に示すような受入番号でＥＭＢＬデータベースに供託した。モノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107の可変領域の一次配列は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２として本明細書において開示されている。
【００４５】
したがって、本発明は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２にかかる、可変重鎖または軽鎖を含むポリペプチドに関する。また、本発明は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２にかかるポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、特異的結合分子は、モノクローナル抗体RhmAb2.102、R mmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体である。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、特異的結合分子は、モノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体に由来するＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。
【００４８】
本発明の特異的結合分子は、２つの方法で本質的に生成され得る。第１に、それらは本明細書に示されたような、抗体およびその配列に由来し得る。抗体の反応性は、部位特異的突然変異誘発、chainシャフリング、sexual PCR法、または、当業者に知られている抗体の導出および最適化のための他の手段によって改良することもできる。代替的に、特異的結合分子、特に抗体は、本明細書において記載されたような任意の特異的反応性エピトープにパニングすることによって、特に、ＰＡＤ４をヒストン２Ａ、ペプチド１（配列番号２１）、および他の特異的反応性ペプチドで処理することによって得ることができる。
【００４９】
本明細書における、用語「由来する」は、特定の抗体における、ＶＨおよび／またはＶＬドメインの特異的結合特性のために最も重要な残基が識別され、これらの最も重要な残基は、他のペプチドの構成に移行されることを意味する。
【００５０】
当業者は本明細書に記載された配列を、例えば、以下の実施例に記載したように、ｃＤＮＡまたはゲノム配列をクローニングまたは生成するために使用し得る。ｐｃＤＮＡ３（In Vitrogen）またはそれらの誘導体のような適切な真核生物の発現ベクターにおけるこれらの配列のクローニング、およびその後のベクターを含む適切な軽鎖と重鎖との組合せを用いた哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のダブルトランスフェクションは、挙げられた抗体である、RhmAb2.101、2.102、2.103、2.104、2.105、および／または2.107、ならびにRmmAb1.101、1.102、1.103、1.104の発現および分泌をもたらすであろう。
【００５１】
また、当業者は、抗体配列の特異的結合ドメインを使用することにより本明細書に記載されたような特異的結合分子の類似体を作製し、融合タンパク質のようなポリペプチドなどの異なる構成においてそれらを発現させることができる。このことは、当技術分野でよく知られている。
【００５２】
ヒトおよびマウスのリコンビナント抗シトルリン化モノクローナル抗体は、実施例１および１５に記載したようにして得た。モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、RhmAb2.104、RhmAb2.105とRhmAb2.107）ならびにマウスＩｇＧ２ａＦｃ領域（RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104）を用いて得られた。ヒトおよびマウスのリコンビナント抗体ペア（RhmAb2.101およびRmmAb1.102、RhmAb2.102およびRmmAb1.102、RhmAb2.103およびRmmAb1.103、ならびにRhmAb2.104およびRmmAb1.104）は、同一のＶＨおよびＶＬドメインを含むが、それぞれヒトＩｇＧ１（配列番号１４）またはマウスＩｇＧ２ａのＦｃドメイン（配列番号２０）を含む。これらの３つのマウスおよびヒトモノクローナル抗体ペアは、ウエスタンブロットを用いて分析され、各ペアは、それぞれの抗原について同様の特異性を有することが分かった。
【００５３】
マウス抗シトルリン化ペプチドモノクローナル抗体であるRmmAb13.101、RmmAb13.102、およびRmmAb13.103は、商業ソースから得られた（ModiQuest Research BV Nijmegen、The Netherlands、カタログ番号、MQ13.101、MQ13.102、およびMQ13.103）。
【００５４】
抗シトルリン化抗体は、実験モデルにおいて試験され、炎症はマウスに抗コラーゲン抗体を注入することによって誘導した。このモデルは、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）として知られている（Nandakumar and Holmdahl, J Immunol Methods, vol304, 126-136, 2005）。抗コラーゲン抗体は、商業ソース（ModiQuest Research BV Nijmegen、The Netherlands、カタログ番号、MQ18.101）から入手した。
【００５５】
マウス抗シトルリン化モノクローナル抗体である、Rm mAb13.101、RmmAb13.102、およびRmmAb13.103は、Kuhnら（J.Clin. Invest, vol116, 961-871, 2006）、およびHillら（J Exp Med, vol 205, 967-979, 2008）によっても記載されたようにコラーゲン抗体に誘導される関節炎の重症度を増すことが確認された。このことは、図１ａおよび１ｂに示す。
【００５６】
さらに、ヒト患者におけるいくつかの研究では、シトルリン化エピトープに対する抗体をＲＡの発生機序に追加することが示される（Masson- Bessi鑽e et al., J.immunol, vol166, 4177-4184, 2001、Vossenaar and van Venrooij, Arthritis Res Ther, vol6, 107-111, 2004）。このことは、同じ実験の「平均関節炎スコア」および「関節炎の発症率」をそれぞれ示す、図１ａおよびｂに示す。
【００５７】
しかし、驚くべきことに、ヒトモノクローナル抗体であるRhmAb2.104およびRhmAb2.105は、ＣＡＩＡモデル実験における関節炎の臨床症状を軽減するが、一方、RhmAb2.103、RhmAb2.102、およびRhmAb2.107は、ＣＡＩＡモデル実験における関節炎の臨床症状を消失させた。
【００５８】
RhmAb2.103およびRhmAb2.102は同一に実行し、RhmAb2.102を用いて得られた結果のみ図１ｃおよび１ｄに示す。RhmAb2.105およびRhmAb2.107を用いて得られた結果は、図１０に示される。
【００５９】
ヒトモノクローナル抗体であるRhmAb2.101は、適用した用量において、全く関節炎の臨床症状に効果を有しなかった。市販の抗体であるRhmAb2.201（ModiQuest Research B.V., カタログ番号、MQR2.201）は、本実験において不適切な抗体のコントロールとして使用される。この抗体は、シトルリン化エピトープを認識しない。
【００６０】
同一の実験が、同等のマウスＦｃＩｇＧ２ａモノクローナル抗体である、RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104を用いて実行され、当該抗体は、それらのヒト対応物と比較して同一のＶＨおよびＶＬドメインを含み、それらのヒト対応物として同一のエピトープを認識する。同一の結果が、それらのヒト対応物と同様に得られた。 RmmAb1.102、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104は、関節炎の臨床症状を消失（RmmAb1.102、RmmAb1.103）または軽減（RmmAb1.104）したが、一方RmmAb1.101は全く影響を与えなかった。
【００６１】
図１ｅおよび１ｆは、RhmAb2.102のための臨床用量を評価した独立のＣＡＩＡ実験を示す。最大の抑制をもたらした最低用量は、０．５ｍｇＡｂ／マウスであり、これは腹腔内注入における２８ｍｇ／ｋｇに相当する。
【００６２】
これらの実験から、RhmAb2.102、RhmAb2.103、RhmAb2.104、RmmAb1.102、RmmAb1.103、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択されたモノクローナル抗体によって認識される特異的エピトープは、炎症性疾患の治療または予防に影響を与えるという結論に達する。
【００６３】
これらのモノクローナル抗体によって認識される抗原（antigen）または抗原（antigens）をさらにを解析するために、実施例３において記載されたように、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ酵素）を用いて脱イミノ化した細胞抽出物に対するそれらの反応性について試験した。翻訳後に脱イミノ化された、ｈＰＡＤ２またはｈＰＡＤ４をトランスフェクトしたＣＯＳ−１ライセートを含むウエスタンブロットは、モノクローナル抗体であるRhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104とともにインキュベートされた。RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104とともにインキュベートしたストリップ（strip）のみが、約１５および１７キロダルトンの分子量を有するタンパク質の二量体との反応性を示した。
【００６４】
ＷＯ２００４／０７８０９８は、Ｔ細胞の活性化を阻害するための、シトルリン化ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体に対する特異的な抗体を開示している。これらの抗体は、分離されたペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しないが、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体にのみに結合する。本明細書において開示された抗体は、本明細書に記載されたように個々のペプチドおよびタンパク質を認識するので、ＷＯ２００４／０７８０９８に記載された抗体とは異なる。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子とシトルリン化されたペプチドとの間の複合体はイムノブロットの手順において使用されるＳＤＳゲルの還元条件において全く残存することができないので、抗体は、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間で複合体を形成することができないウエスタンブロットにおいてポリペプチドを認識する。本明細書中で開示されたような結合分子により認識されるエピトープは、したがって、ＷＯ２００４／０７８０９８に開示された抗体と異なる。さらに、本明細書に記載されたような抗体は、具体的にペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体に反応しない。
【００６５】
上記の実験および考察は、我々を、炎症性疾患の臨床症状を防ぐための能力と、ｐ１５およびｐ１７におけるシトルリン化エピトープの反応性との間に明確な相関関係があるという結論に導いた。
【００６６】
実施例５に詳述したように、ヒトモノクローナル抗体RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104と、マウスモノクローナル抗体RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103およびRmmAb1.104とを免疫沈降実験において使用した場合も同じ結果が得られた。
【００６７】
ヒトＰＡＤ２およびＰＡＤ４の両者による脱イミノ化ＣＯＳ−１ライセートにおける、RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、およびRmmAb1.103を用いた免疫沈降は、顕著なｐ１５およびｐ１７タンパク質のバンドを示した。これらのバンドは、RhmAb2.104およびRmmAb1.104を用いて免疫沈降を実行した場合には、いくぶん顕著さに欠けるものだった。
【００６８】
したがって、ｐ１５およびｐ１７タンパク質の認識強度は、これらの抗体の治療特性に相関すると思われる（図１ａ−ｄ）。
【００６９】
抗体が、ｐ１５またはｐ１７に反応性であるか否かは、実施例４および５で詳述するように、免疫沈降またはウエスタンブロット分析を行うことにより容易に確立し得る。また、RhmAb2.102、RhmAb2.103、またはRhmAb2.104との競合実験は、実施例６において記載したように脱イミノ化ＣＯＳ−１ライセート、またはウエスタンブロットにおいて精製された脱イミノ化ｐ１５および／またはｐ１７タンパク質を含むウエスタンブロット、またはＥＬＩＳＡのいずれかを用いて実行することができる。
【００７０】
タンパク質ｐ１５およびｐ１７は、実施例７に詳述したように、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化時間飛行質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）によってさらに特徴付けられる。アフリカミドリザルのゲノムは完全に配列決定されていないので、我々は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて見出されたペプチドと相同である他の全ての哺乳類ゲノムデータベースをスクリーニングした。高い相同性を有するタンパク質は、ヒストンであることが判明した。このことは、表３（実施例７）に示す。
【００７１】
したがって、本発明は、炎症性疾患の治療または予防における使用のための、ヒストンにおけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する結合分子にも関する。
【００７２】
ＰＡＤの酵素作用によるヒストンのシトルリン化は十分に実証されているので、シトルリン化ヒストンはin vitroにおいて非常に容易に製造することができる。このため、これらのシトルリン化ヒストンは、シトルリン化ｐ１５およびｐ１７、すなわちヒストンにおけるエピトープに反応する、ペプチドおよび抗体のようなその他の特異的結合分子をスクリーニングおよび選択するための酵素結合アッセイにおける基質としても使用し得る。好ましくは、特異的結合分子は、ｐ１５および／またはｐ１７への結合について、抗体であるRhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、およびRhmAb2.105、およびRhmAb2.107 に競合するものから選択される。
【００７３】
この文書およびその特許請求の範囲において、動詞「含む」およびその語形変化は、以下に続く語が含まれる項目を意味するための非限定的な意味で使用されるが、具体的に記載されていない項目が除外されるものではない。また、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素表現は、文脈上明確に１つおよび１つの要素のみが存在することが要求される場合を除き、１つ以上の要素が存在している可能性を除外するものではない。このため、不定冠詞は、「ａ」または「ａｎ」は通常「少なくとも１つの」を意味する。
【００７４】
脱イミノ化ヒストン（histone）またはヒストン（histones）のいずれがRhmAb2.102およびRhmAb2.104の治療効果に関与するかをさらに解析するために、市販のヒストン（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４）をヒトペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）酵素（ｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４）を用いて脱イミノ化した。脱イミノ化だけではなく、脱イミノ化されていないヒストンを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに塗布し、RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびRhmAb2.104の連続希釈液とともにインキュベートした。結果は、表６および図２に示す。
【００７５】
図２に示す結果から、ｈｕＰＡＤ４脱イミノ化したヒストン２Ａ（Ｈ２Ａ／ｐ４）は、抗体医薬であるRhmAb2.102およびRh mAb2.104によって最も認識されるが、RhmAb2.101によっては最も認識されるわけではなかった（図２ａ、２ｂ、および２ｃ）。さらに、RhmAb2.102は、RhmAb2.104に比較するとＨ２Ａ／ｐ４への高い親和性を有している（図２ｂおよび２ｃ）。これらのデータは、関節炎の臨床症状について、RhmAb2.102は完全に消滅させ、RhmAb2.104は低減させ、RhmAb2.101は全く効果がない、ＣＡＩＡモデル実験における関節炎の臨床症状におけるこれらの抗体の効果とよく相関する（図１ｃおよび図１ｄ）。
【００７６】
したがって、我々は、Ｈ２Ａ／ｐ４またはその構造的模擬体における脱イミノ化エピトープは、ＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしていることを示した。RhmAb2.102は、RhmAb2.104およびRhmAb2.101よりもこれらのヒストンに対する高い親和性を示すので、Ｈ３／ｐ２、Ｈ４／ｐ２、およびＨ４／ｐ４における脱イミノ化エピトープについても同様である（図２ａ、２ｂおよび２ｃ）。
【００７７】
模擬体は、例えば、等価な活性の許容程度を有する分子であり、この場合、RhmAb2.104およびRhmAb2.101よりもRhmAb2.102によって高い親和性で認識されるものを含む。
【００７８】
したがって、本発明は上述したように、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａもしくはヒストン４、またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４もしくはＨ３におけるシトルリン化エピトープに反応する特異的結合分子に関する。
【００７９】
RhmAb2.102およびRhmAb2.104によって認識される、Ｈ２Ａにおける正確なシトルリン化エピトープをさらに特定するために、ヒストン２Ａにおける全１３の潜在的な脱イミノ化部位を含むビオチン標識化ペプチドを合成した（表４）。これらのペプチドを、９６ウェルニュートラアビジンＥＬＩＳＡプレートに塗布し、RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびRhmAb2.104の連続希釈液とともにインキュベートした。結果を図３に示す。
【００８０】
【表６Ａ】
【００８１】
【表６Ｂ】
【００８２】
【表６Ｃ】
【００８３】
【表７】
【００８４】
【表８】
【００８５】
ペプチド1（AAASGXGKQGGK）は、抗体医薬であるRhmAb2.102およびRhmAb2.104によって認識されるが、RhmAb2.101によっては認識されないことが観察された（表４ならびに図３ａ、３ｂ、および３ｃ）。RhmAb2.102は、RhmAb2.104と比較した場合にも高い親和性を示した（図３ｂおよび３ｃ）。
【００８６】
RhmAb2.102は、RhmAb2.104およびRhmAb2.101よりも、これらのペプチドに対する高い親和性を示す（図２ａ、２ｂ、および２ｃ）ので、ペプチド４および６における脱イミノ化エピトープについても同じことが当てはまる（表４）。我々は、それとともに、ペプチド１、４、および６における、脱イミノ化エピトープまたは構造的等価物もしくはそれらの模擬体がＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしていることを示した。この抗体の認識パターンは、Ｈ２Ａ／ｐ４の認識パターンに非常に似ている。したがって、我々は、本発明の特異的結合分子は、ペプチド１、４、および６（それぞれ、配列番号２１、配列番号２４、および配列番号２６）に対するそれらの反応性によって定義することもできると結論付けた。これらの各ペプチドは、本発明の抗体のような特異的結合分子を生成するために個々に使用することができる。そのうえ、そのような抗体は、適した反応性について本明細書に開示されたような、任意の他の抗原に対して選択することができる。
【００８７】
【表４】
【００８８】
ビオチン標識され、シトルリンを含む、フィブリノゲンおよびビメンチンペプチド（表５）についても、抗体医薬との反応性について調べた。ペプチドを９６ウェルニュートラアビジン−ＥＬＩＳＡプレート上に塗布した。続いて、RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびRhmAb2.104の連続希釈液を塗布されたプレートに添加した。結果を表８および図４に示す。
【００８９】
【表５】
【００９０】
マウスフィブリノゲンβペプチド（配列番号３７）が、RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびRhmAb2.104によって認識されることが観察された（図４ａ、４ｂおよび４ｃ）。RhmAb2.102は、RhmAb2.104と比較した場合にも高い親和性を示し、RhmAb2.104は、RhmAb2.101よりも若干良い結果であった（図４ａ、４ｂおよび４ｃ）。この抗体の認識パターンは、ｈｕＰＡＤ２およびＨｕＰＡＤ４脱イミノ化ヒトフィブリノゲンをロードしたウエスタンブロットで観察されるパターンに類似している。さらに、RhmAb2.102のみが、マウスビメンチンペプチドを認識した（実施例１０）。上述したペプチド以外でも、ｍｓＦｉｂβ（配列番号３７）およびｍｓＶｉｍ（配列番号３８）ペプチドにおける脱イミノ化エピトープがＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしている可能性が非常に高い。しかし、それととも、我々の抗体医薬の抗炎症作用における重要な役割を果たす上で、フィブリノゲンおよびビメンチンにおける他のエピトープも除外されない。
【００９１】
したがって、本発明は、ペプチドｍｓＦｉｂβまたはｍｓＶｉｍ（配列番号３７または配列番号３８）におけるエピトープに特異的に反応する、上述したような特異的結合分子、およびそれらの使用にも関する。
【００９２】
また、我々は、シトルリン化エピトープが炎症組織で新規に現れることを示した。関節リウマチの実験モデルマウスにおいて、我々は、ヒトモノクローナル抗体１０２（RhmAb2.102）を用いて、発症したマウスの炎症を起こした前足からシトルリン化ペプチドを免疫沈降可能であることを示すことができた。
【００９３】
したがって、典型的なＣＡＩＡ実験を、０日目に８つの抗コラーゲン抗体（２．８ｍｇ／マウス）の混合物を腹腔内注入したマウス（グループあたり３匹）において行った。３日後、マウスに２５μｇのＬＰＳを含む別の腹腔内注入を行った。スコア付けは上述したように行った。この実験の間、毎日１グループのマウスを犠牲し、足をウエスタンブロット解析および免疫組織化学的手法によってシトルリンの存在について分析した。
【００９４】
各グループのマウスについて前足を集めて抽出した。免疫沈降（ＩＰ）を、ＩＰ毎に２０マイクログラムのRhmAb2.102を用いてこれらの抽出を行った。沈殿物について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ウエスタンブロット法によりニトロセルロース膜に転写した。前記ブロットを第１に全タンパク質を検出するためにポンソーＳで染色した。ポンソーＳ染色は、各ＩＰについて同量の抗体が使用されたことを確かめるために行われる。明白な抗体の重鎖および軽鎖が同量で観察できた。
【００９５】
続いて、ブロット上に存在するシトルリン残基を、Senshuらにしたがって化学的に修飾した（Senshu et al, Anal Biochem 203, 94〜100, 1992）。化学的修飾は、その後、シトルリン残基の化学修飾を認識する抗体を用いて可視化することができる（Senshu et al, Anal Biochem 203, 94〜100, 1992）。
脱イミノ化フィブリノゲンは、この実験においてポジティブコントロールとして使用した。抽出物を含まない免疫沈降をこれらの実験のネガティブコントロールとして使用した。
【００９６】
４日目からは、５０、１５、および１７キロダルトンの分子量を有するタンパク質に対応する位置に顕著なバンドがブロット上に現れた。これらのバンドは、５日目においてより顕著になり、６日目において最も濃くなった。
【００９７】
通常の関節炎スコアを有するマウスにおける、実験での関節炎の発症率は１００％であり、６日目で５＋に達した（図５Ａおよび５Ｂ）。沈殿するタンパク質の量は、時間経過にともなって増加し、４日目〜６日目に可視化される。RhmAb2.102のシトルリン特異性および抗化学修飾化シトルリン抗体を用いて得られたブロットにおけるシグナルの存在に基づいて、我々は、ＣＡＩＡを受けたマウスは、それらの炎症化関節において検出可能なレベルのシトルリンを有すると結論付けた。
【００９８】
免疫組織化学的分析も同一のマウスの後足を用いて行った。スライドをRhAb2.104を用いてインキュベートした。その結果はウエスタンブロット分析に応じたものであった。修飾されたシトルリンは、４日目〜６日目のサンプルにおいて、約５０、１５、および１７キロダルトンの見かけ上の分子量を有するタンパク質において検出することができた。このことから、シトルリン化エピトープは、炎症性関節、この場合は実験的に誘導された関節炎マウスの後足において、新規に現れ、RhmAb2.102に反応し、免疫沈降することができると結論付けた。
【００９９】
上述したようなＣＡＩＡ実験において、マウスの足における炎症が、未だ存在しないか、非常に軽度のときに、抗シトルリン抗体を抗コラーゲン抗体注入後３日目に注入した。このことは、臨床症状の発生を予防した。したがって、特に予防処置における炎症の治療として有用である。
【０１００】
したがって、我々は、RhmAb2.102も一度発生した臨床症状を治すことができるのか研究を必要とした。このことは、全てのマウスの四足全ての平均関節炎スコアが約４の任意スコアに達した抗コラーゲン注射後７日目に動物を処置することにより行った。図６Ａおよび６Ｂに示すように、RhmAb2.102は、観察される腫脹を消滅させるのではなく、存在する炎症／腫脹を安定させた。動物を、プラセボおよびRhmAb2.102処置したマウスの間で炎症スコアが同程度であった後である３５日目までの間追跡調査した（図６Ｂおよび実施例１２）。図６Ａは、各群の四足の全ての平均炎症スコアを示し、一方図６Ｂは、３５日目において組織学的分析に使用した動物の右後足の平均炎症スコアを示す。
【０１０１】
７日目におけるRhmAb2.102処置が、永久的な関節の損傷からマウスを保護することができるか否かについて調べるために、全ての動物における右後足の組織学的検査を行った。図７Ａは、実験３５日目における実験群の間の右後足の肉眼で確認できる炎症が類似していたことを示す。しかし、最も驚くべきことに、関節のびらんについての既知パラメータが減少した。RhmAb2.102を用いて７日目に処置された実験群において、炎症細胞の流入（Ｄ）、軟骨の侵食（Ｂ）、軟骨ＰＧの枯渇（Ｅ）、軟骨細胞死（Ｆ）、および骨のびらん（Ｃ）のスコアの劇的な減少が観察された場合、RhmAb2.102は、炎症の間の関節損傷を予防することに関して強力な治療可能性を秘めている（実施例１２）。したがって、本発明は、そのような処置を必要とする患者に対して、本明細書に記載したような結合分子を投与することによって、関節の損傷を予防または治療するための方法に関する。
【０１０２】
さらに、ＣＡＩＡ実験を、それぞれ、５日目、６日目、および７日目におけるRhmAb2.102処置の各治療効果を調べるために行った（図８）。この実験において、RhmAb2.102は、炎症部位に迅速に抗体を提供するために静脈内に注入した。この実験には、３日目予防処置群およびコントロール群を含有した。実験手順は、実施例１２のように行った。唯一の違いとして、３日目、５日目、および６日目にマウスあたり１ｍｇのRhmAb2.102を注入した。予期したように、３日目のRhmAb2.102は炎症反応を抑制した。５日目、６日目、および７日目のRhmAb2.102の静脈内注入によるマウスの処置は、図６にも見られるように炎症を安定させた（図８）。炎症の徴候は減少しなかったが、関節びらんの全てのパラメータが減少したことは注目に値する。このことは、関節びらんおよび炎症が、別々に処理することができる２つの別の実体であることを示す。
【０１０３】
次の一連のＣＡＩＡ実験では、我々は、デキサメタゾンにより炎症レベルを低下させる可能性を調べ、デキサメタゾン処置後の炎症の再発予防は、５日目、６日目、および７日目にRhmAb2.102（図９）をデキサメタゾンと同時に注入することで止まった。
【０１０４】
デキサメタゾンは、日常的に投与する必要がある一般的な炎症性阻害剤である。一度治療が中断された場合は炎症が再発する。腹腔内へのデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）の注入と同時に抗コラーゲン抗体の注入後、５日目（図９Ａ）、６日目（図９Ｂ）、および７日目（図９Ｃ）において、１ｍｇのRhmAb2.102を静脈内に注入した点において実施例１２と異なる実験手順を実行した。デキサメタゾンは、足における腫脹が消失するまで２〜３日間連続的に投与した。動物のその他の群は、デキサメタゾンの腹腔内注入のみを受けた。図９に示されるように、RhmAb2.102を受けていないマウスにおいて炎症が再出現した。しかし、非常に対照的に、デキサメタゾンがRhmAb2.102と組み合わされた場合、炎症の再発は非常に穏やかであり、デキサメタゾンのみを処置されたマウスに比較して遅れて発生した。このことは、６日目または７日目に組み合わせたRhmAb2.102／デキサメタゾン処置を開始した場合に最も明らかであった（図９ＢおよびＣ）。図９に示される実験は、デキサメタゾンなどの炎症の阻害剤を炎症の再燃を治療するために使用することができ、RhmAb2.102は炎症の再発を予防するため、より重要には組織／関節損傷が生じることを予防するために使用できる、炎症性疾患における新規の治療方法を示す。したがって、本発明は、本明細書に記載したような結合分子とともに炎症の阻害剤の同時投与によって、炎症および関節損傷を治療するための方法に関する。
【０１０５】
他のＣＡＩＡ実験において、RhmAb2.101の差別化抗原であるRhmAb2.102との交差反応性が示された２つの新規抗シトルリン抗体（RhmAb2.105およびRhmAb2.107）について、それらの抗炎症効果を試験した。RhmAb2.105、RhmAb2.107、およびRhmAb2.102（ポジティブコントロール）を、別の実験群において抗コラーゲン抗体注入後３日目に静脈内に注入（１ｍｇ／マウス）した（図１０）。実験手順は実施例１２に記載されたように実行した。図１０は、各グループの全ての足の平均関節炎スコアを示す。
【０１０６】
RhmAb2.102が最も高い抗炎症作用を示すことが明らかとなった。RhmAb2.107は、ほとんどRhmAb2.102と同様であり、RhmAb2.105は、以前観察したRhmAb2.104と同様の中間の効果を示した（図１Ｃ）。
【０１０７】
RhmAb2.102に優先的に結合するその他の脱イミノ化タンパク質を質量分析により同定した。さらに、RhmAb2.102に優先的に結合するが、RhmAb2.101に結合しないか、またはあまり結合しない脱イミノ化タンパク質は、追加の質量分析によって同定した。ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）ライセートを、RhmAb2.101またはRhmAb2.102（実施例１３）で免疫沈降し、high throughput nano-LC system coupled to an advanced, high-performance LTQ Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass spectrometer （nLC LTQ FTMS ULTRA）を行った（実施例１４）。Exponentially Modified Protein Abundace Index (emPAI)と組み合わせたその超高質量分解能、質量精度、および感度の算出は、RhmAb2.102に（優先的に）結合する脱イミノ化タンパク質を同定することを可能にする。このことは、表７（実施例１３および１４）に示す。
【０１０８】
このため、本発明は、表７に示すような任意のタンパク質またはポリペプチドに特異的に反応する、炎症性疾患の予防または治療における使用のための結合分子にも関する。
【０１０９】
要約すると、我々は、本明細書において、ｐ１５、ｐ１７、特に、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、または表７のタンパク質からなる群から選択されたタンパク質、より具体的には、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８のペプチドからなる群から選択された分子におけるエピトープに特異的に反応する、本明細書に明記されたような炎症性疾患の治療または予防において使用できる結合分子を示した。所定の結合分子が、上記の分子に特異的に反応しているか否かは、RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体と競合する結合分子の、ｐ１５もしくはｐ１７、または上述した任意のシトルリン化エピトープに結合する能力を分析することによって簡単に決定することができる。
【０１１０】
本発明の結合組成物の効果を示したことで、炎症性疾患は免疫応答を誘発することによっても治療または予防することができ、本発明に係る特異的結合分子は患者自身の体において生成される（in vivo）ことが当業者に明らかである。このような免疫応答は、炎症性疾患の発症を防ぐため（予防、予防ワクチン）、または炎症性疾患の転帰を改善もしくは軽減、すなわち治療するために生じ得る。
【０１１１】
したがって、本発明は、in vivoにおける免疫応答を誘発することにより炎症性疾患を予防または治療するための方法にも関し、ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択されるエピトープに反応する特異的結合分子が生成される。
【０１１２】
本発明のワクチンまたは治療は、本発明に係る結合分子に特異的に反応するシトルリン化エピトープを効果的に含み得る。より詳細には、シトルリン化エピトープアは、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａもしくはヒストン４、またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトヒストンＨ３、もしくは配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されたペプチドにおけるシトルリン化エピトープであり得る。
【０１１３】
したがって、多くのシトルリンに関連する炎症性疾患は、治療または予防することができる。このため、本発明は、上述したような方法にも関し、前記炎症性疾患は、自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される。関節リウマチなどの自己免疫疾患の予防または治療が特に好ましい。
【０１１４】
本発明の実施形態は、in vivoにおける免疫応答に関するので、好ましい特異的結合分子は抗体である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを関節炎症状の重症度について８つのモノクローナル抗体の効果を検査するために使用した。平均関節炎スコア（図１ａ、１ｃ、および１ｅ）および関節炎の発生率は（図１ｂ、１ｄ、および１ｆ）を示した。５〜６匹のマウス群について抗コラーゲン抗体を腹腔内注入することにより０日目に処置した。図１ａおよび図１ｂに示される実験において使用されるマウスは、１．６ｍｇの抗コラーゲン抗体混合物の投与を受け、一方、図１ｃ−ｆに示される実験において使用されるマウスは、２．４ｍｇの投与を受けた。抗シトルリン抗体またはコントロール抗体（RhmAb2.201）とともにＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を腹腔内投与によって３日目に投与した。グラフに記載されている場合を除いて、全ての抗体を１ｍｇ／マウスで投与した。動物は１３日目まで毎日スコアを評価した。抗体RhmAb2.102およびRhmAb2.103は同様に好成績を収め、RhmAb2.102のみ示した。抗体RmmAb1.102およびRmmAb1.103についても同様であり、それらは好成績を収め、RmmAb1.102のみ示した。
【０１１６】
【図２】酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）をｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４を用いて脱イミノ化したヒトリコンビナントヒストン（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４）についてａ）RhmAb2.101、ｂ）RhmAb2.102、およびｃ）RhmAb2.104の親和性について検査するために使用した。脱イミノ化されたヒストンと同様に脱イミノ化されていないヒストンを９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μｇ／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを抗体の特異的結合について試験するために使用した。コートされたウェルを、１０ｕｇ／ウェルから０．０００１２８μｇ／ウェルに至るまでの範囲の連続抗体希釈液を用いて室温で１時間（Ｚ軸）インキュベートした。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温での１時間のインキュベートに続いて、ＴＭＢ基質とともにするインキュベーションにより行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。Ｈ１＝リコンビナントヒストン１、Ｈ１／ｐ２＝ｈｕＰＡＤ２リコンビナントヒストン１、Ｈ１／ｐ４＝ｈｕＰＡＤ４リコンビナントヒストン１など（ｘ軸）。
【０１１７】
【図３】酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、ヒトヒストンＨ２Ａに由来するペプチドを含むシトルリンに対する、ａ）RhmAb2.101、ｂ）RhmAb2.102、およびｃ）RhmAb2.104の親和性の試験に用いた。ヒストン２Ａに由来するペプチドを含む、ビオチンおよびシトルリンは、ニュートラアビジンでコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μg／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を、同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを、各抗体の結合について試験するために使用した。コートされたウェルを、１０ｕｇ／ウェルから０．０００１２８μｇ／ウェルに至るまでの範囲の連続抗体希釈液を用いて室温で１時間（Ｚ軸）インキュベートした。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温での１時間のインキュベートに続いて、ＴＭＢ基質とともにするインキュベーションにより行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。
【０１１８】
【図４】酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、フィブリノゲンおよびビメンチンに由来するペプチドを含むシトルリンに対する、ａ）RhmAb2.101、ｂ）RhmAb2.102、およびｃ）RhmAb2.104の親和性の試験に用いた。フィブリノゲンおよびビメンチンに由来するペプチドを含む、ビオチンおよびシトルリンは、ニュートラアビジンでコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μg／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを、各抗体の結合について試験するために使用した。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温での１時間のインキュベートに続いて、ＴＭＢ基質とともにするインキュベーションにより行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。
【０１１９】
【図５】コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを、足におけるシトルリンの出現を調べるために使用した。３匹のマウスの群について、０日目に腹腔内投与によって２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を用いて処置し、続いて３日目にＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を追加で腹腔内に注入した。平均関節炎スコアおよび関節炎の発症率は、図５Ａおよび５Ｂにそれぞれ示した。
【０１２０】
【図６】抗コラーゲン抗体注入後７日目にRhmAb2.102を投与した場合のRhmAb2.102の治療効果を試験テストするために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。全ての足の平均関節炎スコア（図６Ａ）および右後足の平均関節炎スコア（図６Ｂ）を示す。５匹のマウスの群について、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を用いて腹腔内注入よって処置した。ＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を、３日目に腹腔内注入によって投与し、RhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）またはプラセボを７日目に同一の経路によって注入した。動物について３５日目まで毎日スコアを評価した。RhmAb2.102は存在する炎症を少なくとも安定化することが観察された。
【０１２１】
【図７】組織学的分析を、ヘマトキシリン／エオシン染色およびサフラニンＯ染色された、RhmAb2.102またはプラセボを用いて７日目に処置した全てのＣＡＩＡ動物の右後足の組織スライドで行った（図７）。軟骨の侵食（Ｂ）、骨侵食（Ｃ）、炎症細胞の流入（Ｄ）、軟骨ＰＧの枯渇（Ｅ）、および軟骨細胞死（Ｆ）のパラメータは、染色された組織スライドにおいてスコアを評価された（０〜３の任意の尺度）。図７Ａは、実験最終日（３５日目）における実験群の間における右後足の肉眼で確認できる炎症を示す。各点は単一の動物を表す。水平な線は実験群内での平均スコアを示す。RhmAb2.102の注入は、永続的な関節の損傷からマウスを保護すると結論付けることができる。
【０１２２】
【図８】抗コラーゲン抗体の注入後、３日後、５日後、６日後、および７日後にRhmAb2.102を与えた場合のRhmAb2.102の治療効果を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを用いた。５匹のマウスの群は、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内に注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）を腹腔内注入によって３日目に投与した。RhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）について、３日目、５日目、６日目、または７日目に静脈内投与した。動物について１９日目まで毎日スコアを評価した。グラフは、各実験群の平均関節炎スコアを示す。RhmAb2.102は、治療開始時のレベルに比較して炎症レベルを少なくとも安定化すると再度結論付けることができる。 菱形：コントロール、丸：７日目、白丸：６日目、四角：５日目、および三角：３日目
【０１２３】
【図９】デキサメタゾン処理と同時に抗コラーゲン抗体を注入した後、５日目、６日目、および７日目（それぞれ、パネルＡ、Ｂ、およびＣ）にRhmAb2.102を与えた場合におけるRhmAb2.102の治療効果を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。５匹のマウスの群は、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）腹腔内注入によって３日目に投与した。RhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）を５日目、６日目、または７日目に第１用量のデキサメタゾンと同時に静脈内に注入し、一方デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）を肉眼で確認できる腫れが消えるまで２日または３日連続して与えた（腹腔内投与）。その他の動物群は、デキサメタゾンのみの腹腔内注入を受けた。 動物について２１日目まで毎日スコアを評価した。グラフは各実験群の平均関節炎スコアを示す。 デキサメタゾンと組み合わせたRhmAb2.102治療は、腫れを劇的に減少させ、RhmAb2.102の投与を受けていないマウスと比較してゆっくりした穏やかな炎症の再発のみをもたらすことを見出した。非常に対照的に、デキサメタゾンのみを動物に投与した場合、炎症性再発は、デキサメタゾン／RhmAb2.102の組み合わせを投与したマウスと比較してはるかに強く迅速であった。 菱形：コントロール、三角：５日目から毎日デキサメタゾンのみ投与、四角：５日目から毎日デキサメタゾンに加えてRhmAb2.102を投与。
【０１２４】
【図１０】抗コラーゲン抗体注入後３日目にRhmAb2.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107を投与した場合のRhmAb2.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107の抗炎症作用を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。全ての足の平均関節炎スコア（図１０Ａ）および後足のみの平均関節炎スコア（図１０Ｂ）を示す。５匹のマウスの群は、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内に注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）を腹腔内注入によって３日目に投与した。RhmAb2.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107（１ｍｇ／マウス）またはプラセボを同日に静脈内投与した。動物について１４日目まで毎日スコアを評価した。 RhmAb2.102は、最も高い抗炎症作用をもたらした。後足のみの平均関節炎スコアを調べたとき、RhmAb2.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107全ての抗炎症作用に関して同様であった。 菱形：コントロール、三角：RhmAb2.102、四角：RhmAb2.105、丸：RhmAb2.107
【実施例】
【０１２５】
実施例１：ヒトおよびマウスのリコンビナントモノクローナル抗体。
ＲＡ患者のシトルリン化抗原に対するモノクローナル抗体は、記載されたようにファージディスプレイ法によって最初に選択した（Raats et al., J Reumatology, vol30, 1696-711,2003）。簡潔には、３人のＲＡ患者の自己抗体レパートリを、Ｂ細胞レパートリから分離し、抗体フラグメントライブラリを生成するために使用した。これらのライブラリについて、ＷＯ９８／２２５０３に記載されたように、シトルリン化環状ペプチドＣＦＣ１−ｃｙｃに対する４段階の親和性選択を行った。抗体のクローンは、ＣＦＣ１−ｃｙｃへの強い反応性およびシトルリン化されていないＣＦＣ０−ｃｙｃへの反応性の欠如に基づいて選択した（ＷＯ９８/２２５０３）。
【０１２６】
Raatsらによって記載された配列をコードする抗体（J Reumatology, vol30、1696-711, 2003）を、Stemmerら（Gene, vol164, 49-53, 1995）に従って合成し、続いてヒトおよびマウスの抗体アイソタイプをコードする哺乳類発現ベクターにクローニングした。ヒト抗体は、アイソタイプＩｇＧ１ラムダであり、RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104と命名した。マウス抗体は、アイソタイプＩｇＧ２ａカッパであり、RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104と命名した。
【０１２７】
RhmAb2.101をStemmerらのプロトコル（Gene, vol164, 49-53, 1995）に応じて、クローンＲａ３の配列（Raats et al., J Reumatology, vol30, 1696-711, 2003）に基づいて合成した。RhmAb2.101は、生殖系列ファミリーλ１ｂに由来するＶＬに組み合わせた生殖系列ファミリー３〜２１に由来するＶＨからなる。RhmAb2.103をStemmerらに従って（Gene, vol164, 49-53, 1995）、クローンＡ２−２の配列（Raats et al., J Reumatology, vol30, 1696-711, 2003）に基づいて合成した。RhmAb2.103は、生殖系列ファミリーλ１ａに由来するＶＬに結合した生殖系列ファミリー３−２３に由来するＶＨからなる。RhmAb2.104は、Stemmerら（Gene, vol164, 49-53, 1995）に従って合成した。RhmAb2.104は、生殖系列λ１ｃに由来するＶＬに結合した生殖系列４−ｂに由来するＶＨからなる。
【０１２８】
RhmAb2.102は、Stemmerら（Gene, vol164, 49-53, 1995）に応じて合成した。RhmAb2.102は、配列番号９によりコードされた免疫グロブリン軽鎖に結合した配列番号８によりコードされた免疫グロブリン重鎖を含む。配列番号８によってコードされる免疫グロブリン重鎖は、配列番号１２に対応するマウスリーダグロブリン、続いて配列番号１３に対応する多様な抗体の重鎖、続いて配列番号１４に対応する免疫グロブリン定常ドメインヒトＩｇＧ１を含む。配列番号９によってコードされる免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１２に対応するマウスリーダグロブリン、続いて配列番号１５に対応する可変抗体軽鎖、続いて配列番号１６に対応する免疫グロブリンヒトラムダ定常ドメインを含む。
【０１２９】
RmmAb1.102は、Stemmerらに従って（Gene, vol164, 49-53, 1995）合成した。RmmAb1.102は、配列番号１１によりコードされた免疫グロブリン軽鎖と結合した、配列番号１０によりコードされた免疫グロブリン重鎖を含む。配列番号１０によってコードされる免疫グロブリン重鎖は、配列番号１２に対応するマウスリーダグロブリン、続いて配列番号１９に対応する可変抗体の重鎖、続いて配列番号２０に対応する免疫グロブリン定常ドメインマウスＩｇＧ２ａを含む。配列番号１１によってコードされる免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１２に対応するマウスリーダグロブリン、続いて配列番号１７に対応する可変抗体軽鎖、続いて配列番号１８に対応する免疫グロブリンマウスカッパ定常ドメインを含む。
【０１３０】
モノクローナル抗体RhmAb2.101、RhmAb2.103およびRhmAb2.104、RmmAb1.101 RmmAb1.103、およびRmmAb1.104の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の一次ｍＲＮＡ配列を公開し、表１に示したような受入番号でＥＭＢＬデータベースに供託した。全長ヒトおよびマウス抗体配列を、抗体RhmAb2.102およびRmmAb1.102について記載されたように、同一のリーダおよび定常ヒトドメインまたは定常マウスドメインを使用して生成した。
【０１３１】
【表１】
【０１３２】
シトルリン化フィブリノゲンに対するコントロール抗体であるRmmAb13.101、R mmAb13.102、およびRmmAb13.103、ならびにヒトＵ１−７０ｋタンパク質のアポトーシス性の４０ｋＤ切断産物に対するRhmAb2.201は、Modiquest Research BV, Schoutstraat 58, 6525 XV Nijmegen, The Netherlands から市販されている(Cat no, MQ13.101、MQ13.102、MQ13.103、およびMQR2.201）。
【０１３３】
実施例２：炎症の実験モデル
ModiQuest Research B.V. から市販されているコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）マウスモデル(cat no: MQ18.101）をマウスに関節炎を誘導するため製造規格に従って使用した（http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG%20_2007.08.22.pdf）。その目的のために、０日目に８つの抗コラーゲン抗体の混合物を８週齢のＤＢＪ／Ｊ１マウス（５〜６マウス／群）に腹腔内投与した。（図１ａおよび１ｂにおいて使用されるマウスは、１．６ｍｇの抗コラーゲン抗体混合物の投与を受け、一方、図１ｃにおいて使用されたマウスは２．４ｍｇの投与を受けた）。３日目において、マウスは、１ｍｇの抗シトルリン抗体を混合した２５μｇＬＰＳを含む、他の腹腔内注入を受けた（特に記載のない限り）。ＬＰＳは炎症を引き起こす。実験の１３日目まで、マウスはそれらの足における炎症の兆候について毎日スコアを評価された。スコアは表２にしたがって実施した。動物あたりの最大関節炎スコアは８である。
【０１３４】
マウスモノクローナル抗シトルリン抗体である、RmmAb13.101、RmmAb13.102、およびRmmAb13.103について、コラーゲン抗体が誘発する関節炎の重症度を促進することができることを確認した。これらの抗体の混合物はさらに顕著に応答した。このことは、本質的に抗シトルリン抗体が関節炎を強化／誘導することができる早期の結果を確立する（Kuhn et al,. J. Clin. Invest, vol116, 961-871, 2006; Hill et al., J Exp Med, vol205, 967-979, 2008）。これらの結果は、同じ実験でそれぞれ「平均関節炎スコア」および「関節炎の発症率」を示す、図１ａおよびｂに示される。
【０１３５】
しかし驚くべきことに、ヒト型モノクローナル抗体RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104は、実験的なＣＡＩＡモデルにおける関節炎の臨床症状を軽減または欠失させた（図１ｃおよび１ｄ）。RhmAb2.102およびRhmAb2.103は関節炎の最高の症状を軽減したが、一方RhmAb2.104は炎症を約５０％軽減した。RhmAb2.101は用量試験において全く効果が無かった。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
抗コラーゲン抗体注入後３日目における、抗シトルリン抗体を投与するための決定は、約４日目に実験的に誘導される関節炎を有するマウスの足にシトルリン化エピトープが現れることを示す上記された実験データに基づく。
【０１３８】
実施例３：脱イミノ化細胞抽出物の調製、ＳＤＳページ電気泳動、およびウエスタンブロッティング。
ＣＯＳ−１細胞（８・１０５）を、Ｖ−ｋｉｔとともにAMAXA nucleofection装置（プログラムＤ−００５）を用いて、２μｇのｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトし、細胞をＴ７５の２０ｍｌ培地中に播種した。
【０１３９】
７２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、スピンダウンし、１５μｌの氷冷溶解バッファ（ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、１０ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁した。
【０１４０】
細胞サンプルを氷上で１５秒間に４回音波処理した（sonified）。ライセートを５分間３．０００ｒｐｍで遠心し、上清を清浄なチューブに移した。細胞ライセートを、それぞれ１０ｍＭおよび５ｍＭの最終濃度で、ＣａＣｌ２およびＤＴＥを追加して３７℃で３０分から２時間脱イミノ化した。脱イミノ化された細胞ライセートは、−２０℃で保存した。
【０１４１】
１０倍のサンプルバッファ（ｐＨ６．８の０．２５Ｍトリス、８％ＳＤＳ、３５％グリセロール、２．５％β-メルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー）を脱イミノ化された細胞ライセートに添加し、５分間ボイルした。約５・１０５細胞に対応するライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）の各レーンにロードして分離し、続いてHybond C extraニトロセルロース膜（Amersham Biosciences）エレクトロブロッティングした。ブロッティングおよびローディングをポンソーＳ染色によって確認した。
【０１４２】
実施例４：治療用抗シトルリン抗体はｐ１５およびｐ１７を認識する。
実施例３において作製されたようなブロットについて、細長い形に切断し（cut in strips）、全ての非特異的部位をブロックするために、２時間室温で、５％（w/v）低脂肪粉ミルクのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（洗浄液）を用いてブロックした。それから、ブロットを、洗浄バッファを用いて５回５分間洗浄し、ストリップ（strip）をさらに２０μｇの抗シトルリン抗体を含む４ｍｌの洗浄バッファを用いて室温で１時間インキュベートした。その後、ストリップを、洗浄バッファを用いて１０分間５回洗浄し、洗浄バッファ中のペルオキシダーゼ共役化ウサギ抗ヒトＩｇＧ（DAKO）（室温で1時間）（１：２０００）とともにインキュベートした。その後、洗浄バッファで１０分間３回洗浄し、続いて全ての未結合抗体を洗浄するためにＰＢＳで洗浄した。
【０１４３】
免疫反応性バンドは、化学発光基質（PIERCE）を用いて可視化し、Kodak BioMax XARオートラジオグラフィーフィルム（Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA）に感光させた。
【０１４４】
RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104を用いてインキュベートされたストリップは、約１５および１７キロダルトンの分子量を有する２量体タンパク質への反応性を示した。
【０１４５】
実施例５：抗原の免疫沈降
免疫沈降のために、３０μＬのプロテインＡ−セファロースファストフロー（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）を、３３０μＬの細胞ライセートに添加し、２時間４℃で回転させながらインキュベートした。セファロースビーズに免疫結合したタンパク質を、その後ＩＰＰ１５０（ｐＨ８の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ４０、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。２倍のサンプルバッファ（１００ｍｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８の２００ｍｍジチオスレイトール、４％ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）をビーズに添加し、タンパク質について１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。ゲルを、室温で一晩、染色溶液（１０％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム、２％ｗ／ｖのリン酸（８５％）、０．１％ｗ／ｖのＣＢＢ Ｇ−２５０、２０％ｖ／ｖのメタノール）中で穏やかに揺らしながら染色した。全ての染色トレイをメタノールの蒸発を防ぐためにパラフィルムで密封した。翌日、ゲルをミリＱ水（milli-Q water）中で所望の染色が見えるまでインキュベートすることにより、染色されていないバックグラウンドを脱染色した。ゲルの画像を撮影後に脱染色液（ミリＱ水）を２〜３回置換した。
【０１４６】
ヒトＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ＣＯＳ-１ライセートの両者における、R hmAb2.102、RhmAb2.103、RmmAb1.102、およびRmmAb1.103を用いた免疫沈降は、ｐ１５およびｐ１７タンパク質の顕著なバンドを表す。これらのバンドは、免疫沈降がRhmAb2.104およびRmmAb1.104を用いて行ったときにいくらか顕著さが低下した。したがって、ｐ１５およびｐ１７タンパク質の認識率は、これらの抗体の治療特性とよく相関している（図１ａ−ｄ）。
【０１４７】
実施例６：ｐ１５およびｐ１７に対する抗体の競合アッセイ。
ｐ１５およびｐ１７に結合するための競合アッセイを、実施例３に記載されたように免疫ブロットにおいて行った。マウスモノクローナル抗体である、RmmAb1.102およびRmmAb1.103を、それぞれ、RhmAb2.102およびRhmAb2.103の存在下および非存在下においてｐ１５およびｐ１７を含むイムノブロットストリップに結合させた。結合は抗マウス共役物を使用して検出した。適切なコントロール実験を共役物がヒト抗体に反応しないことを確認するために行った。RmmAb1.102およびRmmAb1.103のｐ１５およびｐ１７への結合は、それぞれRhmAb2.102およびRhmAb2.103が競合する抗体として使用された場合に減少させることができる。コントロール抗体である、RmmAb13.101、RmmAb13.102、およびRmmAb13.103は、ｐ１５またはｐ１７への結合について、RmmAb1.102またはRmmAb1.103と競合しない。
【０１４８】
これらの知見は、このアッセイを炎症性疾患の臨床症状を抑制することができる抗体の選択のための優れた試験にする。
【０１４９】
実施例７：ｐ１５およびＰ１７の質量分析。
実施例３のＳＤＳ−ｐａｇｅゲルのｐ１５およびｐ１７のバンドをゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。簡潔には、切り出したゲルの一部を、５０μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで２回洗浄し、各洗浄工程について３０分間インキュベートする。上記したように、３０％ｖ／ｖアセトニトリルを添加して１５分間の洗浄を繰り返す。全ての液体を取り除き、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム＋２５μｌのアセトニトリルを添加し、１５分間インキュベートした。再度、全ての液体を除去し、ゲルを５０μｌのアセトニトリルとともに３０分間インキュベートした。全ての液体を取り除き、一部を３７℃で２時間インキュベートした。脱水後、ゲル片を再度膨潤させるために、５μｌのトリプシン溶液（２５ｍＭ重炭酸アンモニウム／５ｍＭのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド中において、〜１５ｎｇのトリプシン／μｌ）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。余分なトリプシン溶液を除去し、ゲル片を５μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム／５ｍＭのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとともに３７℃で１４時間インキュベートした。ペプチドを４μｌの５０％アセトニトリル／０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ｎオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとともに室温で１時間インキュベートすることにより抽出した。サンプルを、超音波水槽中において２分間超音波処理し、液体を新しいチューブに移し、抽出工程を繰り返した。サンプルを真空遠心機で乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを行った。
【０１５０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析で特定される全ての断片は、ヒストンタンパク質（表３）に起因した。
【０１５１】
【表３】
【０１５２】
実施例８：治療用の抗シトルリン抗体はＨ２Ａ／ｐ４を認識する。
ヒトリコンビナントヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４（１００μｇ）を５３．４ｍＵのｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４とともに、またはこれらを含まずに３７℃で３時間インキュベートした。脱イミノ化されたヒストンだけではなく、脱イミノ化されていないヒストンを４℃で一晩インキュベートすることにより、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（０．３μｇ／ウェル）上にコートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄し、室温（ＲＴ）でＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに１時間インキュベートすることによりブロックした。ＰＢＳ−Ｔでさらに５回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡのRhmAb2.101、RhmAb2.102、またはRhmAb2.104の１０μｇ／ウェルの濃度から開始する連続希釈液とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ウサギ抗ヒト抗体ＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳで３回の洗浄工程を行った。RhmAb2.101およびRhmAb 2.104とともにインキュベートしたウェルを１５分間インキュベートし、RhmAb2.102とともにインキュベートしたウェルを、２ＭのＨ２ＳＯ４との反応を停止する前にＴＭＢ基質とともに１０分間インキュベートした。光学密度を４５０ｎｍで測定し、使用される抗体の親和性の尺度とした。
【０１５３】
実施例９：治療用の抗シトルリン抗体はペプチド１を認識する。
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩インキュベートすることによりニュートラアビジンでコートした（０．１μｇ／ウェル）。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）とともに５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。ＰＢＳ−Ｔを用いてさらに５回洗浄した後、ウェルを、ヒストン由来シトルリンおよびビオチン含有ペプチド（０．３μｇ／ウェル）とともに室温で1時間インキュベートした。さらにＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中の１０μｇ／ウェルの濃度から開始するRhmAb2.101、RhmAb2.102、またはRhmAb2.104の連続希釈液で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔを用いた５回の洗浄およびＰＢＳを用いた３回の洗浄工程に続いて、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルを、２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止する前にＴＭＢ基質とともに５分間インキュベートした。光学密度を４５０ｎｍで測定し、使用される抗体の親和性の尺度とした。
【０１５４】
実施例１０：脱イミノ化されたヒト血漿フィブリノゲンの調製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロッティング、ならびに抗シトルリン抗体による検出。
【０１５５】
１００ｕｇのヒト血漿フィブリノゲンを、１００μｌの脱イミノ化バッファ（ｐＨ７．６のＰＢＳ、１０ｍＭの塩化カルシウム、５ｍＭのジチオスレイトール）に溶解し、５３．４ｍＵのｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４とともに３７℃で３時間脱イミノ化した。１０倍のサンプルバッファ（ｐＨ６．８の０．２５Ｍトリス、８％ＳＤＳ、３５％グリセロール、２．５％β−メルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー）を添加し、７．５μｇの、脱イミノ化されたフィブリノゲンまたは脱イミノ化されていないフィブリノゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）の各レーンにロードして分離し、Hybond C extraニトロセルロース膜（Amersham Biosciences）にエレクトロブロッティングした。ブロッティングおよびローディングはポンソーＳ染色により確認した。
【０１５６】
ブロットを、全ての非結合部位をブロックするために、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（洗浄バッファ）中の５％（ｗ／ｖ）低脂肪粉ミルクを用いて室温で２時間ブロックした。続いてブロットを、洗浄バッファを用いて５回５分間洗浄し、ストリップを２０μｇの抗シトルリン抗体を含む４ｍｌの洗浄バッファを用いて室温で１時間インキュベートした。その後、ストリップを、洗浄バッファで１０分間５回洗浄し、洗浄バッファ（１：２０００）中でペルオキシダーゼ共役化ウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ）（室温で1時間）とともにインキュベートした。ストリップをＰＢＳによって２回洗浄後、全ての未結合抗体を洗浄するために、洗浄バッファを用いて１０分間３回洗浄した。
【０１５７】
免疫反応性バンドは、化学発光基質（PIERCE）を用いて可視化し、Kodak BioMaxオートラジオグラフィーフィルム（Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA）に感光させた。
【０１５８】
RhmAb2.102およびRhmAb2.104を用いてインキュベートしたブロットは、RhmAb2.101を用いたものよりも脱イミノ化ヒト血漿フィブリノゲンとの高い反応性を示した。また、RhmAb2.102は、RhmAb2.104と比較した場合に高い反応性を示した。
【０１５９】
実施例１１：治療用抗シトルリン抗体は、フィブリノゲンおよびビメンチン由来シトルリンペプチドを認識する。
【０１６０】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩インキュベートすることによりニュートラアビジン（０．１μｇ／ウェル）でコートした。ウェルをＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。ＰＢＳ−Ｔを用いてさらに５回洗浄した後、ウェルをフィブリノゲンおよびビメンチン由来シトルリンおよびビオチン含有ペプチド（０．３μｇ／ウェル）とともに室温で1時間インキュベートした。さらにＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中の１０μｇ／ウェルの濃度から開始するRhmAb2.101、RhmAb2.102、またはRhmAb2.104の連続希釈液で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔを用いた５回の洗浄およびＰＢＳを用いた３回の洗浄工程に続いて、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルを、２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止する前にＴＭＢ基質で５分間インキュベートした。光学密度を４５０ｎｍで測定し、使用される抗体の親和性の尺度とした。
【０１６１】
実施例１２：RhmAb2.102の治療可能性
ModiQuest Research B.V. から市販されているコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）マウスモデル(cat no: MQ18.101）をマウスにおいて関節炎を誘導するため製造規格に従って使用した（http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG%20_2007.08.22.pdf）。その目的のために、０日目に８つの抗コラーゲン抗体の混合物（２．８ｍｇ／マウス）を８週齢のＤＢＪ／Ｊ１マウス（５マウス／群）の腹腔内に投与した。３日目、マウスは２５μｇＬＰＳを含む、他の腹腔内投与を受けた。ＬＰＳは炎症を引き起こす。平均関節炎スコアが約４になった７日目において（図６Ａ）、１群について１ｍｇのRhmAb2.102を含む静脈内注入を行った。一方、他の群は、プラセボを含む静脈内注入を受けた。
【０１６２】
動物の足における炎症症状について毎日スコアを評価した。スコアの評価は表２に従って行った。動物あたりの最大関節炎スコアは８である。RhmAb2.102は炎症を安定させた（図６Ａ）。
【０１６３】
全ての右後足を組織学的分析のために使用した。組織を４％ホルムアルデヒドで４日間固定し、５％ギ酸で脱灰し、続いて脱水し、パラフィン包埋した。７μｍの標準正面セクションを、SuperFrostスライド（Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany）にマウントした。ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を関節の炎症を調べるために行った（細胞の流入、図７Ｄ）。関節における炎症の程度について、０〜３のスケール（０＝細胞なし、１＝軽度の細胞充実性、２＝中程度の細胞充実性、３＝最大細胞充実性）でスコアを評価した。図７Ａは３５日目における肉眼で確認できる炎症を示す。軟骨基質からのプロテオグリカン（ＰＧ）の枯渇を検討するために（図７Ｅ）、ファストグリーンを用いた対比染色に続いてサフラニンＯ（ＳＯ）染色した。完全に軟骨が染色された（通常）から軟骨が染色されない（完全なＰＧｓ枯渇）までの範囲である０〜３の任意のスケールを用いてＰＧの枯渇を測定した。軟骨細胞死（図７Ｆ）を、軟骨細胞核の損失無しから完全に軟骨表面が空洞であるまでの０〜３の範囲のスケールでスコアを評価した。軟骨および骨侵食（図７ＢおよびＣ）を、損傷無しから軟骨または骨の構造の完全な損失までの、スケール０〜３の範囲で類別した。関節における病理組織学的変化を７０μｍ離れた関節の５つの準連続切片においてスコアを評価した。スコアの評価は実験条件について既知の知識なしにブラインドで行った。
【０１６４】
群間における右後足の肉眼で観察できる炎症は３５日目において同じであったが（図６Ａおよび７Ａ）、炎症性細胞流入（図７Ｄ）、軟骨の浸食（図７Ｂ）、軟骨ＰＧの枯渇（図７Ｅ）、軟骨細胞死（図７Ｆ）、および骨の浸食（図７Ｃ）の関節炎についての任意のパラメータを調べた場合、コントロール群と比較してRhmAb2.102の投与を受けた実験群において劇的な減少が観察された。この結果は、RhmAb2.102の治療可能性を強く支持する。
【０１６５】
実施例１３：ｈｕＰＡＤ４脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞抽出物の調製、ならびにRhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いた免疫沈降。
【０１６６】
ＨＥＫ２９３細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、スピンダウンし、５．１０５細胞を１５μｌの氷冷溶解バッファ（ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、１０ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁した。
【０１６７】
細胞サンプルを氷上で１５秒間に４回音波処理した。ライセートを３．０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を清浄なチューブに移した。細胞ライセートをタンパク質２ｍｇあたり１ＵのヒトＰＡＤ４（ModiQuestResearch B.V.; cat no: MQ16.203）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、および５ｍＭのＤＴＴを添加することにより３７℃で２時間脱イミノ化した。
【０１６８】
脱イミノ化ＨＥＫ２９３ライセートにＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２．５％ゲル）電気泳動、それに続くウエスタンブロッティングを実行することにより、ライセートの脱イミノ化を検証した。ウエスタンブロッティングは、抗体RhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いて免疫染色し、陽性であった。無関係な抗体を用いて処理したブロットは全く染色は認められなかった。
【０１６９】
その後、免疫沈降（ＩＰ）を抗体RhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いて脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞ライセートについて行った。簡潔には、３０μｌのプロテインＡセファロースファストフローを、１ｍｌのＩＰＰ５００（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ４０、および０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、２０μｇのRhmAb2.101または２０μｇのRhmAb2.102に結合させ、結合させないものをネガティブコントロールとした。プロテインＡセファロースビーズ／抗体混合物を一定の回転のもと１時間室温でインキュベートした。１ｍｌのＩＰＰ５００を用いてビーズを３回洗浄し、１回１ｍｌのＩＰＰ１５０（ｐＨ８．０の１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ４０、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、続いて３００μｌ脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞ライセートとともに室温で２時間、一定の回転のもとでインキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞のＩＰ手順が成功したか否か決定するために、少量のビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に使用し、その後ビーズを１ｍｌのＩＰＰ１５０を用いて３回洗浄した。RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびコントロールビーズにおける免疫沈降タンパク質を、５０μｌの抽出バッファ（ｐＨ３．０の１００ｍＭナトリウムクエン酸）を用いて抽出し、ｐＨ９．０４の１０μｌ１Ｍトリス／ＨＣｌを用いて中和し、nLC LTQ FTMS ULTRA質量分析法（実施例１４）まで−２０℃で保存した。
【０１７０】
実施例１４：RhmAb2.101およびRhmAb2.102により免疫沈降させたｈｕＰＡＤ４脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞タンパク質の質量分析
免疫沈降されたタンパク質からＰＥＧ形態を取り除くために、それらを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、短時間泳動した。実施例７において記載したように、タンパク質についてゲルの切り出し、およびゲル内トリプシン消化を行った。サンプルについてnLC LTQ FTMS ULTRA質量分析を実行する前にそれらを５０倍に希釈した。
【０１７１】
ペプチドおよびタンパク質の同定は、ホモサピエンス分類のNCBInr_20081022データベースを使用して検索プログラムMascotによってデータから抽出した。以下の修飾を検索において許可した。システイン（Ｃ）（固定）のカルバミドメチル化（carbamidomethylation）、メチオニン（Ｍ）（可変）の酸化、ならにびアスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、およびグルタミン（Ｑ）（可変）の脱アミノ化。脱イミノ化は検索ツールとして使用することができなかった。脱アミノ化および脱イミノ化は、修飾されていないアルギニンと比較した場合に、両者は１ダルトンの質量差をもたらすのでこの問題は除去できる。
【０１７２】
タンパク質の特性の検証を社内で開発したスクリプトによって行った。簡潔には、ソフトウェアは、独特に同定されたペプチド配列、ペプチドの同一のセットを共有するクラスタタンパク質、および以下の条件を有するタンパク質の検証に基づいてタンパク質の特性を分類する。
【０１７３】
１本のペプチドを有するタンパク質は、＞４９のペプチドスコアを有していなければならない。
【０１７４】
１本以上のペプチドを有するタンパク質は、＞２９のペプチドスコアを有していなければならない。
【０１７５】
検証基準の使用について、ペプチドは３つの全てのサンプルで同定された（サンプル１：RhmAb2.101を用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞、サンプル２：Rhm2.102を用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞、サンプル３：空ビーズを用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞）。
【０１７６】
emPAI（Exponentially Modified Protein Abundance Index）を全ての検証タンパク質について算出した。emPAIは、データベースの検索結果に一致するペプチドによるタンパク質範囲に基づいて、混合物中の、おおよその、標識のない、タンパク質の相対的定量を提供する。この手法は、（選択的に）RhmAb2.102に結合する脱イミノ化タンパク質を同定することを可能にする。このことを表７に示す。
【０１７７】
【表７−１】
【０１７８】
【表７−２】
【０１７９】
実施例１５：抗炎症抗体のファミリー生成／選択
ヒト由来のｓｃＦｖライブラリを、Raatsら（２００３）に記載された方法と同様に、ヒトヒストン２Ａ、ヒストン４、ペプチド１（AAASGXGKQGGK：配列番号２１）、およびＣＦＣ−１ペプチドのＰＡＤ２−またはＰＡＤ４−脱イミノ化形態に対してパニングした（Raats, J.M.H., Wijnen, E.W, Pruijin, G.J.M., Van den Hoogen, F.H.M., and W.J. van Verooij. 2003. J.Rheum. 30, 1696-1711）。
【０１８０】
ＣＦＣ−１および／またはペプチド１（AAASGXGKQGGK：配列番号２１）および／またはＰＡＤ脱イミノ化ヒストン２ａおよび／またはヒストン４とのシトルリン非依存の反応性を示す、選択された抗体は、シトルリン化タンパク質および／またはそれらに由来するペプチドのアレイに対する反応性（実施例１４、表７）、ならびにＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストンアイソフォーム、および脱イミノ化ヒトヒストン由来ペプチドに対する反応性についてスクリーニングした。付随して、ＲＡ患者に由来するＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒト細胞抽出物および関節液に免疫沈降を行った。
【０１８１】
続いて、ｐ１５および／またはｐ１７のバンドとして免疫沈降された抗体、および／またはシトルリン化エピトープ（ＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストンアイソフォーム、および／またはＣＦＣ−１、および／またはペプチド１（AAASGXGKQGGK、配列番号２１）、および／または表７に挙げられたタンパク質に由来するシトルリン化エピトープ）に対するＥＬＩＳＡ反応性プロファイルを有する抗体を、ヒトＩｇＧ１フォーマットにクローン化した。本明細書において記載したように、ＣＡＩＡマウスモデルにおける、それらの予防的および治療的抗炎症可能性について全長のヒトＩｇＧ抗体を試験した。
【０１８２】
このスクリーニングの手順では、高頻度でＣＡＩＡマウスモデルにおける、予防的および／または治療的抗炎症可能性を有する抗体を得た。
【０１８３】
上述した方法に従って選択される新規抗体の例は、RhmAb2.105（配列番号３９および４０）およびRhmAb2.107（配列番号４１および４２）である。これらの抗体をコードする核酸配列は、配列番号４３〜４６に挙げる。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび動物における炎症の治療または予防の分野に属し、様々な炎症状態を、治療または予防するための、医薬組成物および方法に関する。特に、本発明は、シトルリン関連疾患、好ましくは炎症性疾患のような炎症状態を、予防または治療するための、組成物および方法に関する。本発明は、炎症状態の治療および予防に使用するための、シトルリン含有エピトープに対する特異的結合分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
炎症状態は、慢性であろうと急性であろうと、医療業界における相当な問題を突き付ける。簡潔に述べるならば、慢性的な炎症は、活動性炎症、組織破壊、および治癒の試行は同時に進行する、持続時間の長い（数週間または数ヶ月の）炎症であると考えられる（Robbins Pathological Basis of Disease by R.S. Cortran, V.Kumar and S.L.Robbins, W.B.Saunders Co., p.75, 1989）。慢性炎症は、急性炎症の発症後に続き得るが、例えば、持続感染（例えば、結核、梅毒、真菌症）の結果として、内因性（例えば、血漿脂質）もしくは外因性（例えば、シリカ、アスベスト、タバコのタール、手術用縫合糸）の毒素への遷延性の曝露、または体自身の組織に対する自己免疫反応（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬）のような、時間経過とともに進行する潜行性のプロセスとしても生じ得る。
【０００３】
炎症性関節炎は、特に高齢者の増加した先進国において深刻な健康問題である。例えば、炎症性関節炎の一種である慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、世界の人口の１〜２％が侵されている多系統慢性の再発性炎症性疾患である。
【０００４】
多くの器官が侵され得るが、ＲＡは、基本的に、侵された関節の破壊および強直を導くこともある慢性滑膜炎症の重度の形態である（Rob bins Pathological Basis of Disease, by R.S. Cotran, V.Kumar, and S.L. Robbins, W.B.Saunders Co., 1989）。疾患は、関節隙に拡張する様々な投射を形成する滑膜の顕著な厚化、滑膜ライニング（滑膜細胞増殖）の多層化、白血球細胞（「炎症性滑膜炎」と称される、マクロファージ、リンパ球、形質細胞、およびリンパ濾胞）による滑膜の炎症、ならびに滑膜内の細胞壊死によるフィブリンの沈着により病理学的に特徴付けられる。この過程の結果として形成された組織はパンヌスと称され、パンヌスは最終的に関節隙を埋めるまで増殖する。パンヌスは、滑膜炎の進展に不可欠である血管新生の過程を通じて、新しい血管の広範なネットワークを発達させる。パンヌス組織の細胞に由来する、消化酵素（マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ、ストロメリシン））および炎症性プロセスの他の修飾因子（例えば、過酸化水素、スーパーオキサイド、リソソーム酵素、およびアラキドン酸代謝の生産物）の放出は、軟骨組織において進行性の破壊を導く。パンヌスは、関節軟骨に侵潤し、びらん（erosion）および軟骨組織の断片化を導く。結果的に、関与する関節について、線維性強直を有する肋軟骨下のびらんを生じ、最終的に骨性強直を生じる。
【０００５】
一般的には、ＲＡは自己免疫疾患であり、その多くの異なる関節刺激が免疫遺伝学的に感受性である宿主における免疫応答を活性化すると考えられている。外因性感染性病原体（Epstein-Barrウイルス、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、マイコプラズマなど）と、コラーゲン、プロテオグリカン、変更された免疫グロブリン、およびシトルリン化タンパク質のような翻訳後修飾されたタンパク質などの内因性タンパク質との両者は、不適切な宿主の免疫応答を引き起こす病原体として関与している。刺激する病原体に関係なく、自己免疫は疾患の進行に影響を与える。特に、関連する抗原は、抗原提示細胞（滑膜における、マクロファージまたは樹状細胞）により摂取され、処理され、Ｔリンパ球に提示される。Ｔ細胞は、細胞性免疫応答をイニシエートし、形質細胞の増殖およびＢリンパ球の形質細胞への分化を刺激する。最終的には、宿主組織に対する不適切な過剰の免疫応答（例えば、ＩＩ型コラーゲンに対する抗体、自己由来のＩｇＧのＦｃ部分に対する抗体（「リウマチ因子」と称する））、および異なるシトルリン化エピトープに対する抗体（抗ＣＣＰ）が生じる。このことは、さらに免疫応答を増幅し、軟骨組織の破壊を早める。一度このカスケードがイニシエートされれば、軟骨破壊の多数の修飾因子が関節リウマチの進行に関与する。
【０００６】
上述の抗ＣＣＰ抗体は、ＲＡに特異性が高いことが示された。最近の証拠は、これらの抗体についての血清反応陽性である各個人が既にＲＡを有しているか、または将来この疾患が進展することを示す。抗ＣＣＰ抗体の存在（特に、高力価が存在している場合）は、びらん性疾患の転帰の前兆である（Nijenhuis et al., Clin. Chim. Acta, vol 350, 17-34, 2004）。さらに抗ＣＣＰ抗体は、炎症の局所的な部位において産生されることが示された。ＲＡ患者に由来する滑膜材料において見出される総ＩｇＧに対する抗ＣＣＰ抗体の割合は、同じ患者の血清における当該割合よりも顕著に高いことが明らかである（Masson-Bessi鑽e et al., Clin Exp Immunol, vol 119, 544-552, 2000）（Reparon-Schuijt et al., Arthritis Rheum, vol 44、41-47、2001）。
【０００７】
滑膜において形質細胞を産生する抗ＣＣＰの存在は、炎症部位におけるＣＣＰ特異的なＢ細胞の抗原駆動型の成熟を示す。一度抗ＣＣＰ抗体が産生されれば、滑膜におけるシトルリン化タンパク質を有する免疫複合体の形成は、炎症過程の進行を引き起こし得る。これらのデータおよびその他のデータは、抗ＣＣＰ抗体がＲＡの疾患症状の少なくとも一部を実際に引き起こすという仮説を支持する。ＲＡの病因における抗ＣＣＰ抗体の役割は、ＲＡ患者におけるＢリンパ球減少実験の結果により支持される（Cambridge et al., Arthritis Rheum, vol48, 2146-2154, 2003）。
【０００８】
進行した関節リウマチを持つ人々の死亡率は、数種のがんの死亡率を超えている。このため、治療法は、不可逆的な関節破壊の可能性を減少させるために設計される積極的な早期の薬物療法に移行している。米国リウマチ学会（Arthritis and Rheumatism 39（5): 713-722, 1996）の最近の推奨事項は、診断が確定し、症状が進行中の全ての患者のための疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）治療の早期開始を含む。抗がん剤は、リウマチの６０〜７０％の第１選択薬である化学療法薬のメトトレキサートとともに、大半の患者のための第１選択療法となった。重度疾患では、多くの場合、無期限のこの薬剤による毎週の治療を必要とし、メトトレキサート療法にも関わらず症状が進行する患者（患者の５０％以上）には、シクロスポリンおよびアザチオプリンのような第２化学療法薬（単独または組み合わせ）が頻繁に採用される。
【０００９】
特に、前記滑膜が関与している疾患およびシトルリン関連炎症性疾患などの、炎症性疾患の病理発生を抑制することが可能な炎症性疾患の治療または予防のための化合物が依然として必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、炎症性疾患の治療または予防における使用のためのｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を提供する。
【００１１】
また、本発明は、炎症性疾患を治療または予防するための方法であって、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を含む、治療に有効な量の抗炎症組成物をそれが必要とされる患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の組成物および方法は、シトルリン残基に反応する特異的結合分子の薬学的に受容可能な形態を含む。特に、上記結合分子は、本明細書においてｐ１５およびｐ１７と称したような２つのポリペプチドにおけるシトルリン化されたエピトープに特異的に反応する。
【００１３】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明、図面、および実施例を参照すれば明らかになるであろう。加えて、より詳細な具体的手順、装置、または組成物が記載された様々な参考文献が本明細書に明記されており、したがってその全体が参照により組み込まれる。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、炎症性疾患の治療または予防に使用するための、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープと特異的に反応する結合分子を提供する。
【００１５】
用語「特異的結合分子」は、特異的結合をすることができる分子、好ましくは小分子を示すために本明細書において使用される。この点において、特異的な結合は、分子が選択された標的分子に結合することができるが、同一の条件下において標的分子に関連しない他のものには結合しないことを意味する。例えば、結合分子が、血清アルブミンに結合するが、その他、好ましくは血清中に見出される他の全てのタンパク質に、ほとんどまたは全く結合しないときに血清アルブミンに特異的に結合すると表現する。
【００１６】
この文章において、用語「シトルリンに特異的に反応する」または「シトルリン化エピトープに反応する」または「シトルリンエピトープに反応する」は、抗体が、シトルリン残基を含む、ペプチドまたはペプチド様分子のような構造に反応するが、前記抗体が、シトルリン残基の換わりにアルギニン残基を含む同一の構造にほとんど反応しないか、または好ましくは全く反応しないことを意味する。用語、ペプチドまたはペプチド様分子は、好ましくはヒトまたは動物の体に現れるような同一の構成（context）、好ましくは天然ポリペプチドの構成において、本明細書に記載されているような特異的な結合分子との免疫反応性のための正確な構成内にシトルリン残基が存在することができる構造として解釈されるべきである。
【００１７】
「特異的結合分子」は分子であってもよく、好ましくは標的化合物に特異的に結合することができる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質全体、またはそれらの組み合わせ、もしくはその部分であってもよい。特異的結合分子の好ましい例としては、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、フラグメント抗原結合領域（Ｆａｂｓ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂｓ）、または、ＶＨＨ抗体としても知られるナノボディ（ラクダ由来の単一ドメイン抗体）もしくはＶＮＡＲと呼ばれるサメＩｇＮＡＲ由来単一ドメイン抗体フラグメント、もしくはそれらの他の活性成分、またはアンチカリン、またはアプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のようなペプチドもしくは抗体またはその部分である。好ましい実施形態では、特異的結合分子は、抗体またはＤＮＡもしくはＲＮＡ形態であるアプタマーのようなアプタマーの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。さらに好ましい実施形態では、特異的結合分子は、抗体フラグメント、ナノボディ、単一ドメイン抗体、またはそれらの活性部分を含むような、抗体またはそれらの誘導体を含む。したがって、本発明は、特に上述したような特異的結合分子に関し、前記特異的結合分子はペプチドまたは抗体である。
【００１８】
用語「抗体（Antibodies）」または「抗体（antibody）」は、多くの場合「抗原」として表される標的分子に特異的に結合することができる、タンパク質またはポリペプチドを表す。抗体（免疫グロブリンとしても知られる）は、脊椎動物の血液または他の体液に見出され、細菌およびウイルスのような外来の異物を特定および中和する免疫系によって使用されるガンマグロブリンタンパク質である。
【００１９】
抗体は、通常、基本的な構造ユニット（それぞれ、２つの大きな重鎖および２つの小さな軽鎖）によって、例えば、１ユニットを有するモノマー、２ユニットを有するダイマー、または５ユニットを有するペンタマーを形成するために作製される。抗体は、Ｂ細胞と称される種類の白血球によって生産される。抗体重鎖のいくつかの異なる種類およびいくつかの異なる種類の抗体が存在し、それらの有する重鎖に基づく異なるアイソタイプに分類される。異なる役割を有する５種の異なる抗体アイソタイプが哺乳類で知られており、それらが遭遇した外来の異物の異なる種類のそれぞれについて適切な免疫応答を直接に補助する。ラクダ（例えば、ラマ）およびサメのような数種の動物種は異常な抗体構造を有し得る。
【００２０】
全ての抗体の一般的な構造は非常によく似ているが、タンパク質の先端にある小さな領域は、非常に変化に富んでおり、わずかに異なる先端構造を有する数百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は可変領域として知られている。これらの変異体のそれぞれは、抗原として知られる異なる標的に結合することができる。抗体のこの豊かな多様性により、免疫系は等しく広い抗原の多様性を認識することが可能となる。抗体によって認識される抗原の独特の部分は、エピトープと称される。これらのエピトープは、生物を構成する異なる数百万の分子中の独特な抗原のみを識別して結合することができる、特異性の高い相互作用によってそれらの抗体に結合する。抗体タグによる抗原の認識は、免疫系の他の部分による攻撃のためである。また、抗体は、例えば、感染症を引き起こす病原体の一部に結合することによって、直接に標的を中和することができる。
【００２１】
抗体の多種多様な集団は、異なる抗原結合部位（またはパラトープ）をコードする遺伝子セグメントのセットのランダムな組み合わせによって生成され、その後に抗体遺伝子のこの領域におけるランダムな突然変異が続く。また、抗体遺伝子は、重鎖の基礎を他の重鎖に変更し、抗原特異的可変領域が保持された抗体の異なるアイソタイプを作製する、クラススイッチングと称される過程において再認識される。このことは、単一抗体が、免疫系のいくつかの異なる部分によって、いくつかの異なるアイソタイプで使用されることを可能にする。
【００２２】
本明細書において使用される、用語「抗体」は、一本鎖抗体、フラグメント抗原結合領域、組換え産生される抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体などが含まれる。
【００２３】
抗体または他の特異的結合分子との関連で、用語「またはそれらの一部」は、抗体または特異的結合分子の特異的な結合部位を構成する、抗体または特異的結合分子の一部を表し、抗体全体または特異的な結合分子のような同一のエピトープにでも反応することができる、抗体または特異的結合分子の一部と解釈し得る。
【００２４】
抗体、抗体の特異的結合ドメインを含む融合タンパク質、アプタマー、抗体フラグメント、単一ドメイン抗体フラグメント、アンチカリンような他のタンパク質様結合ドメイン、およびシトルリン化エピトープに特異的に結合する小分子のような、全種類の特異的結合分子およびそれらの誘導体が本発明において使用することができる。しかし、ヒト抗体またはそれらのフラグメントが、本発明の好ましい実施形態である。好ましくは、ＩｇＧ１重鎖とラムダ軽鎖とを有するＩｇＧ１（例えば、ＩｇＧ１λ）抗体が使用される。しかし、カッパまたはラムダ軽鎖に組み合わせたＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、他のヒト抗体アイソタイプも本発明に包含される。また、動物に由来する抗体の多様なアイソタイプの全てが本発明において使用することができる。抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖフラグメント、または単一ドメインＶＨＨ、ＶＨ、もしくはＶＬを含む、全長サイズ抗体または抗体の抗原結合フラグメントとすることができる。
【００２５】
「特異的結合分子はシトルリン化エピトープに反応する」は、ペプチドもしくはペプチド核酸またはアプタマーもしくは疑似ペプチド構造のような大きな構造に関連して、シトルリン残基に特異的に反応する特異的結合分子として解釈される。
【００２６】
シトルリンは、翻訳の間にタンパク質に組み込まれないアミノ酸である。しかし、それはペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるアルギニン残基の翻訳後修飾によって生成され得る。
【００２７】
シトルリン化は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって触媒され、アルギニン残基をシトルリン残基に翻訳後変換することである。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）酵素は、タンパク質においてアルギニン残基をシトルリン残基に変換することを触媒する。シトルリンについてのtＲＮＡは存在せず、タンパク質中におけるシトルリン残基の存在は、全て翻訳後修飾の結果である。哺乳類（ヒト、マウス、およびラット）における５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１〜ＰＡＤ６、「ＰＡＤ４」および「ＰＡＤ５」は同一のアイソタイプに使用される）は、それぞれ同定された別個の遺伝子にコードされている（Vossenaar, et al., Bioessays 25, 1106-1118, 2003）。全てのこれらの酵素は、活性についてＣａ２＋の存在に強く依存しており、遊離のＬ−アルギニンを遊離のＬ−シトルリンに変換することはできない。遊離のＬ−アルギニンは、細菌真核生物においては一酸化窒素合成酵素（ＥＣ１．１４．１３．３９）によって、または細菌においてはアルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．３．６）によって、遊離のＬ−シトルリンに変換することができる。これらの酵素はＣａ２＋に依存していない。
【００２８】
相同性の高いＰＡＤの酵素の間の最も顕著な違いは、それらの組織特異的な発現である。表皮におけるＰＡＤ１（同義語として、ＰＡＤＩ、ＰＡＤタイプＩ）は、角化エンベロープの再組織化のために重要である、ケラチノサイト分化の最終段階の間におけるケラチン繊維のシトルリン化に関与している。表皮におけるシトルリン化の他の部位は、ＰＡＤ３（同義語として、ＰＡＤＩＩＩ、ＰＡＤタイプＩＩＩ）およびその天然基質であるトリコヒアリンを（ＴＨＨ）を含む毛包である。ＴＨＨは、毛包内毛根鞘細胞および毛包髄質層、ならびにより少なくは他の特殊な上皮の髄質層の主要な構造タンパク質である。ごく最近同定されたＰＡＤアイソタイプ、ＰＡＤ６（同義語としてｅＰＡＤ）は、初期胚発生に重要な役割を果たすマウス卵母細胞の細胞シートにおいて見出された。そのヒトオーソログの発現は、卵巣、精巣、末梢血白血球に制限されることが見出された（Chavanas et al., Gene vol 330; 19-27, 2004）。当初、このＰＡＤアイソタイプは、ｅＰＡＤと称されたが、他のパッドの系統番号に基づいて、このアイソタイプはＰＡＤ６（Vossenaar et al., Bioessays vol 25 1106-1118, 2003）に名称が変更された。最も広く発現するアイソタイプであるＰＡＤ２（同義語として、ＰＡＤＩＩ、ＰＡＤタイプＩＩ、ＰＡＤ−Ｈ１９）は、骨格筋、脳、脾臓、分泌腺、およびマクロファージのような多くの異なる組織に存在する。この広範な発現パターンにも関わらず、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびビメンチンを除いては天然基質として同定されていない。多発性硬化症（ＭＳ）の患者では、ＭＢＰに対する自己免疫応答が発生している。ＭＢＰは、ミエリン鞘に豊富なタンパク質であり、そのシトルリン化は中枢神経系の発生中に起こる。ビメンチンのシトルリン化は、カルシウムイオノフォアに誘導される、ヒトおよびマウスにおけるマクロファージのアポトーシス間に観察され、上述したように、シトルリン化されたビメンチンは、ＲＡ特異的な抗Ｓａ自己抗体の標的であることが示された。全て主に細胞質に局在する上述したＰＡＤｓとは対照的に、ＰＡＤ４アイソタイプ（同義語として、ＰＡＤＩＶ、ＰＡＤタイプＩＶ、ＨＬ−６０ＰＡＤ、ＰＡＤ Ｖ、ＰＡＤタイプＶ、ＰＡＤＩ４）は核内に存在する。ＰＡＤ４の核局在化シグナルは、タンパク質のＮ末端領域で見出された。ＰＡＤ４は、主に末梢血の顆粒球および単球に発現する。核内におけるＰＡＤ４の基質は、ヒストンコアタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ３、およびＨ４）、ならびにリボソームアセンブリ、核細胞質間輸送、中心体の複製に機能する核小体タンパク質であるヌクレオホスミン／Ｂ２３である。
【００２９】
本発明に係る特異的結合分子は、それぞれ１５ｋＤａおよび１７ｋＤａであるそれらの分子量によって特徴付けられる２つのポリペプチドである、ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープに対する。
【００３０】
このような特異的結合分子は、特に炎症性疾患の治療または予防に適していることが見出された。
【００３１】
本明細書において使用される、「炎症性条件」または「炎症性疾患」は、血管病変、好中球の浮腫および浸潤（例えば、急性炎症反応）、単核球による組織の浮腫、炎症細胞、結合組織細胞、およびそれらの細胞性産物による組織破壊、ならびに結合性組織による修復の試行（例えば、慢性的な炎症反応）により特徴付けられる任意の数の、条件または疾患を表す。
【００３２】
このような条件の代表的な例には、シトルリンに関連する炎症性疾患および自己免疫疾患が含まれる。シトルリン関連炎症性疾患は、シトルリンが病気の発症において影響を与える疾患として本明細書において定義される。シトルリンが病気の発症に影響を与えるか否かは、当該分野において利用可能な常用試験を用いて当業者により容易に決定され得る。例えば、これらの疾患は、罹患した、または病気に関連する組織におけるシトルリン化タンパク質の異常なレベルの存在によって特徴付けられ得る。このような特徴付けは、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡのような免疫学的検査により達成することができ、上記罹患した組織は抗原として使用され、その抗原のシトルリン化は本明細書に記載されたような抗シトルリン抗体を用いて検出し得る。
【００３３】
また、当業者は、罹患患者由来の患部組織と健康な組織とにおける、シトルリンのレベルおよび種類を比較するためのマススペック分析のようなプロテオミクスアプリケーションを使用することができる。
【００３４】
また、疾患は、ペプチドまたはタンパク質を含むシトルリンに対する免疫応答の存在によって特徴付けられ得る。これは、Ｔ細胞またはＢ細胞によって媒介される、体液性または細胞性免疫応答であり得る。検査のための抗シトルリン抗体は、当該技術分野で記述され、市販されている。
【００３５】
したがって、本発明は、シトルリンに関連する炎症性疾患の、治療または予防に使用するための特異的結合分子に関する。
【００３６】
このような疾患は、例えば、関節リウマチおよび変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、ならびにレビー小体型認知症を含む炎症性関節炎である。したがって、本発明は、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される疾患の、治療または予防における使用のための特異的結合分子に関する。
【００３７】
特に、本発明は、自己免疫疾患、より具体的には関節リウマチまたは変形性関節症の、治療または予防のための特異的結合分子に関する。
【００３８】
多発性硬化症またはＭＳは、ミエリン鞘の自己免疫性破壊により特徴付けられる中枢神経系の慢性炎症性疾患である。ミエリン鞘の細胞は、約３：１の割合で脂質タンパク質複合体からなる軸索周囲の多重二分子層構造を形成する。２つの主要なタンパク質であるＭＢＰおよびプロテオリピドタンパク質でタンパク質画分の８５％を占める。ＭＢＰは、高カチオン性タンパク質であり、ホスファチジルセリンのような負に帯電したリン脂質と強い相互作用を形成することができる。健康な成人におけるＭＢＰ分子の約１８％では、６個（１９個中）のアルギニンがシトルリン化される（Wood et al., J Biol Chem, vol264, 5121-5127, 1989, Wood et al., Ann Neurol, vol40, 18 -24, 1996）。残りのＭＢＰ分子はシトルリンを含んでいない。ＭＳ患者においてＭＢＰ−ｃｉｔ６の割合は全ＭＢＰの４５％に増加する。ＭＢＰ−ｃｉｔ６における正の実効電荷（net positive charge）の減少は、ＭＢＰ分子の部分的なアンフォールディングを引き起こし、リン脂質とのそれらの相互作用を弱める（Boggs et al., J Neurosci Res, vol57, 529-535, 1999, Pritzker et al., Biochemistry, vol39, 5374-5381, 2000）。ＭＢＰ−ｃｉｔ６は、非シトルリン化ＭＢＰより迅速に脂質複合体を形成することができるが、形成された複合体は、非シトルリン化ＭＢＰにより形成された複合体の充填された密度ほどではなく形成される（Boggs et al., J Neurosci Res, vol57, 529-535, 1999, Beniac et al., J Struct Biol, vol129, 80-95,2000）。ＭＢＰ−ｃｉｔ６は、非シトルリン化ＭＢＰよりも４倍の速さでカテプシンＤによって分解される（Cao et al., Biochemistry, vol38, 6157-6163, 1999）。急性劇症のＭＳ（マールブルグ型）のまれなケースでは、ＭＢＰの分子の８０％が重度にシトルリン化されるＭＢＰｃｉｔ１８）（Wood et al., Ann Neurol, vol40, 18-24, 1996）。重度にアンフォールドされたＭＢＰ−ｃｉｔ１８は、通常のＭＢＰよりも４５倍の速度でカテプシンＤにより分解される（Cao et al., Biochemistry, vol38, 6157-6163, 1999）。抗がん剤タキソールの有効成分であるパクリタキセルの臨床試験が進行中である（O'Connor et al., Ann Neurol, vol46, 470, 1999）。低用量のパクリタキセルは、in vitroにおいてＰＡＤ２によるＭＢＰのシトルリン化を抑制することができる（Pritzker et al., Biochim Biophys Acta, vol1388, 154-160, 1998）。パクリタキセルによる治療は、臨床的な症状を和らげ、損傷した鞘の再ミエリン化を誘導し（Moscarello et al., Mult Scler, vol8, 130138, 2002）、脱ミエリン化疾患における候補因子としてＰＡＤの潜在的重要性を際立たせた（Moscarello et al., J Neurochem, vol81, 335-343, 2002）。
【００３９】
乾癬では、ケラチノサイトは非常に急速に増殖し、約４日間で基底層から表面に移動する。これらの細胞は、厚く、乾燥したパッチまたはプラークに蓄積されるので、皮膚はそれらを充分に迅速に脱落させることができない。通常のケラチノサイトでは、ケラチンＫ１は、末端の分化の間にＰＡＤ１によってシトルリン化される。この過程は、表皮における通常の角化のプロセスに不可欠である、ケラチンフィラメントをコンパクト化する原因となる。乾癬性高増殖性プラークにおけるケラチノサイトは、シトルリン化ケラチンＫ１を含まない（Ishida-Yamamoto et al., J Invest Dermatol, vol114, 701-705, 2000）。細胞増殖の増大がＰＡＤによる適切なシトルリン化を予防するか、またはＰＡＤの不活性化がケラチノサイトの過剰増殖および蓄積を可能にするのかは明らかではない。メカニズムは不明であるが、乾癬表皮における異常なシトルリン化は明らかにＰＡＤ１に関する。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、水溶液、ゲル、ヒドロゲル、フィルム、ペースト、クリーム、スプレー、軟膏、またはラップからなる群から選択される形態である。さらなる実施形態において、上述の方法は、関節内、腹膜内、腹腔内、局所、直腸、静脈内、経口、眼、または腫瘍の周辺部の切除から選択される経路によって、本明細書に記載された組成物の投与のために使用される。
【００４１】
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、共溶媒溶液、リポソーム、ミセル、液晶、ナノ結晶、ナノ粒子、エマルジョン、微粒子、微小球、ナノスフェア、ナノカプセル、ポリマーまたはポリマー担体、界面活性剤、懸濁化剤、シクロデキストリンまたはアルブミンのような吸着分子などの錯化剤、表面活性粒子、およびキレート剤からなる群から選択される少なくとも１つの担体を含む。さらなる実施形態では、多糖類は、ヒアルロン酸およびその誘導体、デキストランおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、コハク酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、キトサンおよびその誘導体、[ベータ]−グルカン、アラビノキシラン、カラギーナン、ペクチン、グリコーゲン、フコイダン、コンドロイチン、デルマタン、ヘパラン、ヘパリン、ペントサン、ケラタン、アルギン酸塩、シクロデキストリン、ならびにそれらのエステルおよび硫酸塩を含む塩および誘導体を含む。
【００４２】
さらに別の態様において、本発明の方法は、本発明の組成物を標的部位、特に滑膜関節に導くことを含む。
【００４３】
本発明のある特定の実施例では、特異的結合分子は、ｐ１５および／またはｐ１７に結合するモノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107に競合する。
【００４４】
モノクローナル抗体RhmAb2.101、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104、RmmAb1.101、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104の可変領域の一次ｍＲＮＡ配列が公開され、表１に示すような受入番号でＥＭＢＬデータベースに供託した。モノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107の可変領域の一次配列は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２として本明細書において開示されている。
【００４５】
したがって、本発明は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２にかかる、可変重鎖または軽鎖を含むポリペプチドに関する。また、本発明は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２にかかるポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、特異的結合分子は、モノクローナル抗体RhmAb2.102、R mmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体である。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、特異的結合分子は、モノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体に由来するＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む。
【００４８】
本発明の特異的結合分子は、２つの方法で本質的に生成され得る。第１に、それらは本明細書に示されたような、抗体およびその配列に由来し得る。抗体の反応性は、部位特異的突然変異誘発、chainシャフリング、sexual PCR法、または、当業者に知られている抗体の導出および最適化のための他の手段によって改良することもできる。代替的に、特異的結合分子、特に抗体は、本明細書において記載されたような任意の特異的反応性エピトープにパニングすることによって、特に、ＰＡＤ４をヒストン２Ａ、ペプチド１（配列番号２１）、および他の特異的反応性ペプチドで処理することによって得ることができる。
【００４９】
本明細書における、用語「由来する」は、特定の抗体における、ＶＨおよび／またはＶＬドメインの特異的結合特性のために最も重要な残基が識別され、これらの最も重要な残基は、他のペプチドの構成に移行されることを意味する。
【００５０】
当業者は本明細書に記載された配列を、例えば、以下の実施例に記載したように、ｃＤＮＡまたはゲノム配列をクローニングまたは生成するために使用し得る。ｐｃＤＮＡ３（In Vitrogen）またはそれらの誘導体のような適切な真核生物の発現ベクターにおけるこれらの配列のクローニング、およびその後のベクターを含む適切な軽鎖と重鎖との組合せを用いた哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のダブルトランスフェクションは、挙げられた抗体である、RhmAb2.101、2.102、2.103、2.104、2.105、および／または2.107、ならびにRmmAb1.101、1.102、1.103、1.104の発現および分泌をもたらすであろう。
【００５１】
また、当業者は、抗体配列の特異的結合ドメインを使用することにより本明細書に記載されたような特異的結合分子の類似体を作製し、融合タンパク質のようなポリペプチドなどの異なる構成においてそれらを発現させることができる。このことは、当技術分野でよく知られている。
【００５２】
ヒトおよびマウスのリコンビナント抗シトルリン化モノクローナル抗体は、実施例１および１５に記載したようにして得た。モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、RhmAb2.104、RhmAb2.105とRhmAb2.107）ならびにマウスＩｇＧ２ａＦｃ領域（RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104）を用いて得られた。ヒトおよびマウスのリコンビナント抗体ペア（RhmAb2.101およびRmmAb1.102、RhmAb2.102およびRmmAb1.102、RhmAb2.103およびRmmAb1.103、ならびにRhmAb2.104およびRmmAb1.104）は、同一のＶＨおよびＶＬドメインを含むが、それぞれヒトＩｇＧ１（配列番号１４）またはマウスＩｇＧ２ａのＦｃドメイン（配列番号２０）を含む。これらの３つのマウスおよびヒトモノクローナル抗体ペアは、ウエスタンブロットを用いて分析され、各ペアは、それぞれの抗原について同様の特異性を有することが分かった。
【００５３】
マウス抗シトルリン化ペプチドモノクローナル抗体であるRmmAb13.101、RmmAb13.102、およびRmmAb13.103は、商業ソースから得られた（ModiQuest Research BV Nijmegen、The Netherlands、カタログ番号、MQ13.101、MQ13.102、およびMQ13.103）。
【００５４】
抗シトルリン化抗体は、実験モデルにおいて試験され、炎症はマウスに抗コラーゲン抗体を注入することによって誘導した。このモデルは、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）として知られている（Nandakumar and Holmdahl, J Immunol Methods, vol304, 126-136, 2005）。抗コラーゲン抗体は、商業ソース（ModiQuest Research BV Nijmegen、The Netherlands、カタログ番号、MQ18.101）から入手した。
【００５５】
マウス抗シトルリン化モノクローナル抗体である、Rm mAb13.101、RmmAb13.102、およびRmmAb13.103は、Kuhnら（J.Clin. Invest, vol116, 961-871, 2006）、およびHillら（J Exp Med, vol 205, 967-979, 2008）によっても記載されたようにコラーゲン抗体に誘導される関節炎の重症度を増すことが確認された。このことは、図１ａおよび１ｂに示す。
【００５６】
さらに、ヒト患者におけるいくつかの研究では、シトルリン化エピトープに対する抗体をＲＡの発生機序に追加することが示される（Masson- Bessi鑽e et al., J.immunol, vol166, 4177-4184, 2001、Vossenaar and van Venrooij, Arthritis Res Ther, vol6, 107-111, 2004）。このことは、同じ実験の「平均関節炎スコア」および「関節炎の発症率」をそれぞれ示す、図１ａおよびｂに示す。
【００５７】
しかし、驚くべきことに、ヒトモノクローナル抗体であるRhmAb2.104およびRhmAb2.105は、ＣＡＩＡモデル実験における関節炎の臨床症状を軽減するが、一方、RhmAb2.103、RhmAb2.102、およびRhmAb2.107は、ＣＡＩＡモデル実験における関節炎の臨床症状を消失させた。
【００５８】
RhmAb2.103およびRhmAb2.102は同一に実行し、RhmAb2.102を用いて得られた結果のみ図１ｃおよび１ｄに示す。RhmAb2.105およびRhmAb2.107を用いて得られた結果は、図１０に示される。
【００５９】
ヒトモノクローナル抗体であるRhmAb2.101は、適用した用量において、全く関節炎の臨床症状に効果を有しなかった。市販の抗体であるRhmAb2.201（ModiQuest Research B.V., カタログ番号、MQR2.201）は、本実験において不適切な抗体のコントロールとして使用される。この抗体は、シトルリン化エピトープを認識しない。
【００６０】
同一の実験が、同等のマウスＦｃＩｇＧ２ａモノクローナル抗体である、RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104を用いて実行され、当該抗体は、それらのヒト対応物と比較して同一のＶＨおよびＶＬドメインを含み、それらのヒト対応物として同一のエピトープを認識する。同一の結果が、それらのヒト対応物と同様に得られた。 RmmAb1.102、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104は、関節炎の臨床症状を消失（RmmAb1.102、RmmAb1.103）または軽減（RmmAb1.104）したが、一方RmmAb1.101は全く影響を与えなかった。
【００６１】
図１ｅおよび１ｆは、RhmAb2.102のための臨床用量を評価した独立のＣＡＩＡ実験を示す。最大の抑制をもたらした最低用量は、０．５ｍｇＡｂ／マウスであり、これは腹腔内注入における２８ｍｇ／ｋｇに相当する。
【００６２】
これらの実験から、RhmAb2.102、RhmAb2.103、RhmAb2.104、RmmAb1.102、RmmAb1.103、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択されたモノクローナル抗体によって認識される特異的エピトープは、炎症性疾患の治療または予防に影響を与えるという結論に達する。
【００６３】
これらのモノクローナル抗体によって認識される抗原（antigen）または抗原（antigens）をさらにを解析するために、実施例３において記載されたように、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ酵素）を用いて脱イミノ化した細胞抽出物に対するそれらの反応性について試験した。翻訳後に脱イミノ化された、ｈＰＡＤ２またはｈＰＡＤ４をトランスフェクトしたＣＯＳ−１ライセートを含むウエスタンブロットは、モノクローナル抗体であるRhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104とともにインキュベートされた。RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104とともにインキュベートしたストリップ（strip）のみが、約１５および１７キロダルトンの分子量を有するタンパク質の二量体との反応性を示した。
【００６４】
ＷＯ２００４／０７８０９８は、Ｔ細胞の活性化を阻害するための、シトルリン化ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体に対する特異的な抗体を開示している。これらの抗体は、分離されたペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しないが、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体にのみに結合する。本明細書において開示された抗体は、本明細書に記載されたように個々のペプチドおよびタンパク質を認識するので、ＷＯ２００４／０７８０９８に記載された抗体とは異なる。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子とシトルリン化されたペプチドとの間の複合体はイムノブロットの手順において使用されるＳＤＳゲルの還元条件において全く残存することができないので、抗体は、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との間で複合体を形成することができないウエスタンブロットにおいてポリペプチドを認識する。本明細書中で開示されたような結合分子により認識されるエピトープは、したがって、ＷＯ２００４／０７８０９８に開示された抗体と異なる。さらに、本明細書に記載されたような抗体は、具体的にペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体に反応しない。
【００６５】
上記の実験および考察は、我々を、炎症性疾患の臨床症状を防ぐための能力と、ｐ１５およびｐ１７におけるシトルリン化エピトープの反応性との間に明確な相関関係があるという結論に導いた。
【００６６】
実施例５に詳述したように、ヒトモノクローナル抗体RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104と、マウスモノクローナル抗体RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103およびRmmAb1.104とを免疫沈降実験において使用した場合も同じ結果が得られた。
【００６７】
ヒトＰＡＤ２およびＰＡＤ４の両者による脱イミノ化ＣＯＳ−１ライセートにおける、RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、およびRmmAb1.103を用いた免疫沈降は、顕著なｐ１５およびｐ１７タンパク質のバンドを示した。これらのバンドは、RhmAb2.104およびRmmAb1.104を用いて免疫沈降を実行した場合には、いくぶん顕著さに欠けるものだった。
【００６８】
したがって、ｐ１５およびｐ１７タンパク質の認識強度は、これらの抗体の治療特性に相関すると思われる（図１ａ−ｄ）。
【００６９】
抗体が、ｐ１５またはｐ１７に反応性であるか否かは、実施例４および５で詳述するように、免疫沈降またはウエスタンブロット分析を行うことにより容易に確立し得る。また、RhmAb2.102、RhmAb2.103、またはRhmAb2.104との競合実験は、実施例６において記載したように脱イミノ化ＣＯＳ−１ライセート、またはウエスタンブロットにおいて精製された脱イミノ化ｐ１５および／またはｐ１７タンパク質を含むウエスタンブロット、またはＥＬＩＳＡのいずれかを用いて実行することができる。
【００７０】
タンパク質ｐ１５およびｐ１７は、実施例７に詳述したように、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化時間飛行質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）によってさらに特徴付けられる。アフリカミドリザルのゲノムは完全に配列決定されていないので、我々は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて見出されたペプチドと相同である他の全ての哺乳類ゲノムデータベースをスクリーニングした。高い相同性を有するタンパク質は、ヒストンであることが判明した。このことは、表３（実施例７）に示す。
【００７１】
したがって、本発明は、炎症性疾患の治療または予防における使用のための、ヒストンにおけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する結合分子にも関する。
【００７２】
ＰＡＤの酵素作用によるヒストンのシトルリン化は十分に実証されているので、シトルリン化ヒストンはin vitroにおいて非常に容易に製造することができる。このため、これらのシトルリン化ヒストンは、シトルリン化ｐ１５およびｐ１７、すなわちヒストンにおけるエピトープに反応する、ペプチドおよび抗体のようなその他の特異的結合分子をスクリーニングおよび選択するための酵素結合アッセイにおける基質としても使用し得る。好ましくは、特異的結合分子は、ｐ１５および／またはｐ１７への結合について、抗体であるRhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、およびRhmAb2.105、およびRhmAb2.107 に競合するものから選択される。
【００７３】
この文書およびその特許請求の範囲において、動詞「含む」およびその語形変化は、以下に続く語が含まれる項目を意味するための非限定的な意味で使用されるが、具体的に記載されていない項目が除外されるものではない。また、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素表現は、文脈上明確に１つおよび１つの要素のみが存在することが要求される場合を除き、１つ以上の要素が存在している可能性を除外するものではない。このため、不定冠詞は、「ａ」または「ａｎ」は通常「少なくとも１つの」を意味する。
【００７４】
脱イミノ化ヒストン（histone）またはヒストン（histones）のいずれがRhmAb2.102およびRhmAb2.104の治療効果に関与するかをさらに解析するために、市販のヒストン（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４）をヒトペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）酵素（ｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４）を用いて脱イミノ化した。脱イミノ化だけではなく、脱イミノ化されていないヒストンを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに塗布し、RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびRhmAb2.104の連続希釈液とともにインキュベートした。結果は、表６および図２に示す。
【００７５】
図２に示す結果から、ｈｕＰＡＤ４脱イミノ化したヒストン２Ａ（Ｈ２Ａ／ｐ４）は、抗体医薬であるRhmAb2.102およびRh mAb2.104によって最も認識されるが、RhmAb2.101によっては最も認識されるわけではなかった（図２ａ、２ｂ、および２ｃ）。さらに、RhmAb2.102は、RhmAb2.104に比較するとＨ２Ａ／ｐ４への高い親和性を有している（図２ｂおよび２ｃ）。これらのデータは、関節炎の臨床症状について、RhmAb2.102は完全に消滅させ、RhmAb2.104は低減させ、RhmAb2.101は全く効果がない、ＣＡＩＡモデル実験における関節炎の臨床症状におけるこれらの抗体の効果とよく相関する（図１ｃおよび図１ｄ）。
【００７６】
したがって、我々は、Ｈ２Ａ／ｐ４またはその構造的模擬体における脱イミノ化エピトープは、ＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしていることを示した。RhmAb2.102は、RhmAb2.104およびRhmAb2.101よりもこれらのヒストンに対する高い親和性を示すので、Ｈ３／ｐ２、Ｈ４／ｐ２、およびＨ４／ｐ４における脱イミノ化エピトープについても同様である（図２ａ、２ｂおよび２ｃ）。
【００７７】
模擬体は、例えば、等価な活性の許容程度を有する分子であり、この場合、RhmAb2.104およびRhmAb2.101よりもRhmAb2.102によって高い親和性で認識されるものを含む。
【００７８】
したがって、本発明は上述したように、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａもしくはヒストン４、またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４もしくはＨ３におけるシトルリン化エピトープに反応する特異的結合分子に関する。
【００７９】
RhmAb2.102およびRhmAb2.104によって認識される、Ｈ２Ａにおける正確なシトルリン化エピトープをさらに特定するために、ヒストン２Ａにおける全１３の潜在的な脱イミノ化部位を含むビオチン標識化ペプチドを合成した（表４）。これらのペプチドを、９６ウェルニュートラアビジンＥＬＩＳＡプレートに塗布し、RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびRhmAb2.104の連続希釈液とともにインキュベートした。結果を図３に示す。
【００８０】
【表６Ａ】
【００８１】
【表６Ｂ】
【００８２】
【表６Ｃ】
【００８３】
【表７】
【００８４】
【表８】
【００８５】
ペプチド1（AAASGXGKQGGK）は、抗体医薬であるRhmAb2.102およびRhmAb2.104によって認識されるが、RhmAb2.101によっては認識されないことが観察された（表４ならびに図３ａ、３ｂ、および３ｃ）。RhmAb2.102は、RhmAb2.104と比較した場合にも高い親和性を示した（図３ｂおよび３ｃ）。
【００８６】
RhmAb2.102は、RhmAb2.104およびRhmAb2.101よりも、これらのペプチドに対する高い親和性を示す（図２ａ、２ｂ、および２ｃ）ので、ペプチド４および６における脱イミノ化エピトープについても同じことが当てはまる（表４）。我々は、それとともに、ペプチド１、４、および６における、脱イミノ化エピトープまたは構造的等価物もしくはそれらの模擬体がＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしていることを示した。この抗体の認識パターンは、Ｈ２Ａ／ｐ４の認識パターンに非常に似ている。したがって、我々は、本発明の特異的結合分子は、ペプチド１、４、および６（それぞれ、配列番号２１、配列番号２４、および配列番号２６）に対するそれらの反応性によって定義することもできると結論付けた。これらの各ペプチドは、本発明の抗体のような特異的結合分子を生成するために個々に使用することができる。そのうえ、そのような抗体は、適した反応性について本明細書に開示されたような、任意の他の抗原に対して選択することができる。
【００８７】
【表４】
【００８８】
ビオチン標識され、シトルリンを含む、フィブリノゲンおよびビメンチンペプチド（表５）についても、抗体医薬との反応性について調べた。ペプチドを９６ウェルニュートラアビジン−ＥＬＩＳＡプレート上に塗布した。続いて、RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびRhmAb2.104の連続希釈液を塗布されたプレートに添加した。結果を表８および図４に示す。
【００８９】
【表５】
【００９０】
マウスフィブリノゲンβペプチド（配列番号３７）が、RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびRhmAb2.104によって認識されることが観察された（図４ａ、４ｂおよび４ｃ）。RhmAb2.102は、RhmAb2.104と比較した場合にも高い親和性を示し、RhmAb2.104は、RhmAb2.101よりも若干良い結果であった（図４ａ、４ｂおよび４ｃ）。この抗体の認識パターンは、ｈｕＰＡＤ２およびＨｕＰＡＤ４脱イミノ化ヒトフィブリノゲンをロードしたウエスタンブロットで観察されるパターンに類似している。さらに、RhmAb2.102のみが、マウスビメンチンペプチドを認識した（実施例１０）。上述したペプチド以外でも、ｍｓＦｉｂβ（配列番号３７）およびｍｓＶｉｍ（配列番号３８）ペプチドにおける脱イミノ化エピトープがＲＡの炎症カスケードに重要な役割を果たしている可能性が非常に高い。しかし、それととも、我々の抗体医薬の抗炎症作用における重要な役割を果たす上で、フィブリノゲンおよびビメンチンにおける他のエピトープも除外されない。
【００９１】
したがって、本発明は、ペプチドｍｓＦｉｂβまたはｍｓＶｉｍ（配列番号３７または配列番号３８）におけるエピトープに特異的に反応する、上述したような特異的結合分子、およびそれらの使用にも関する。
【００９２】
また、我々は、シトルリン化エピトープが炎症組織で新規に現れることを示した。関節リウマチの実験モデルマウスにおいて、我々は、ヒトモノクローナル抗体１０２（RhmAb2.102）を用いて、発症したマウスの炎症を起こした前足からシトルリン化ペプチドを免疫沈降可能であることを示すことができた。
【００９３】
したがって、典型的なＣＡＩＡ実験を、０日目に８つの抗コラーゲン抗体（２．８ｍｇ／マウス）の混合物を腹腔内注入したマウス（グループあたり３匹）において行った。３日後、マウスに２５μｇのＬＰＳを含む別の腹腔内注入を行った。スコア付けは上述したように行った。この実験の間、毎日１グループのマウスを犠牲し、足をウエスタンブロット解析および免疫組織化学的手法によってシトルリンの存在について分析した。
【００９４】
各グループのマウスについて前足を集めて抽出した。免疫沈降（ＩＰ）を、ＩＰ毎に２０マイクログラムのRhmAb2.102を用いてこれらの抽出を行った。沈殿物について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ウエスタンブロット法によりニトロセルロース膜に転写した。前記ブロットを第１に全タンパク質を検出するためにポンソーＳで染色した。ポンソーＳ染色は、各ＩＰについて同量の抗体が使用されたことを確かめるために行われる。明白な抗体の重鎖および軽鎖が同量で観察できた。
【００９５】
続いて、ブロット上に存在するシトルリン残基を、Senshuらにしたがって化学的に修飾した（Senshu et al, Anal Biochem 203, 94〜100, 1992）。化学的修飾は、その後、シトルリン残基の化学修飾を認識する抗体を用いて可視化することができる（Senshu et al, Anal Biochem 203, 94〜100, 1992）。
脱イミノ化フィブリノゲンは、この実験においてポジティブコントロールとして使用した。抽出物を含まない免疫沈降をこれらの実験のネガティブコントロールとして使用した。
【００９６】
４日目からは、５０、１５、および１７キロダルトンの分子量を有するタンパク質に対応する位置に顕著なバンドがブロット上に現れた。これらのバンドは、５日目においてより顕著になり、６日目において最も濃くなった。
【００９７】
通常の関節炎スコアを有するマウスにおける、実験での関節炎の発症率は１００％であり、６日目で５＋に達した（図５Ａおよび５Ｂ）。沈殿するタンパク質の量は、時間経過にともなって増加し、４日目〜６日目に可視化される。RhmAb2.102のシトルリン特異性および抗化学修飾化シトルリン抗体を用いて得られたブロットにおけるシグナルの存在に基づいて、我々は、ＣＡＩＡを受けたマウスは、それらの炎症化関節において検出可能なレベルのシトルリンを有すると結論付けた。
【００９８】
免疫組織化学的分析も同一のマウスの後足を用いて行った。スライドをRhAb2.104を用いてインキュベートした。その結果はウエスタンブロット分析に応じたものであった。修飾されたシトルリンは、４日目〜６日目のサンプルにおいて、約５０、１５、および１７キロダルトンの見かけ上の分子量を有するタンパク質において検出することができた。このことから、シトルリン化エピトープは、炎症性関節、この場合は実験的に誘導された関節炎マウスの後足において、新規に現れ、RhmAb2.102に反応し、免疫沈降することができると結論付けた。
【００９９】
上述したようなＣＡＩＡ実験において、マウスの足における炎症が、未だ存在しないか、非常に軽度のときに、抗シトルリン抗体を抗コラーゲン抗体注入後３日目に注入した。このことは、臨床症状の発生を予防した。したがって、特に予防処置における炎症の治療として有用である。
【０１００】
したがって、我々は、RhmAb2.102も一度発生した臨床症状を治すことができるのか研究を必要とした。このことは、全てのマウスの四足全ての平均関節炎スコアが約４の任意スコアに達した抗コラーゲン注射後７日目に動物を処置することにより行った。図６Ａおよび６Ｂに示すように、RhmAb2.102は、観察される腫脹を消滅させるのではなく、存在する炎症／腫脹を安定させた。動物を、プラセボおよびRhmAb2.102処置したマウスの間で炎症スコアが同程度であった後である３５日目までの間追跡調査した（図６Ｂおよび実施例１２）。図６Ａは、各群の四足の全ての平均炎症スコアを示し、一方図６Ｂは、３５日目において組織学的分析に使用した動物の右後足の平均炎症スコアを示す。
【０１０１】
７日目におけるRhmAb2.102処置が、永久的な関節の損傷からマウスを保護することができるか否かについて調べるために、全ての動物における右後足の組織学的検査を行った。図７Ａは、実験３５日目における実験群の間の右後足の肉眼で確認できる炎症が類似していたことを示す。しかし、最も驚くべきことに、関節のびらんについての既知パラメータが減少した。RhmAb2.102を用いて７日目に処置された実験群において、炎症細胞の流入（Ｄ）、軟骨の侵食（Ｂ）、軟骨ＰＧの枯渇（Ｅ）、軟骨細胞死（Ｆ）、および骨のびらん（Ｃ）のスコアの劇的な減少が観察された場合、RhmAb2.102は、炎症の間の関節損傷を予防することに関して強力な治療可能性を秘めている（実施例１２）。したがって、本発明は、そのような処置を必要とする患者に対して、本明細書に記載したような結合分子を投与することによって、関節の損傷を予防または治療するための方法に関する。
【０１０２】
さらに、ＣＡＩＡ実験を、それぞれ、５日目、６日目、および７日目におけるRhmAb2.102処置の各治療効果を調べるために行った（図８）。この実験において、RhmAb2.102は、炎症部位に迅速に抗体を提供するために静脈内に注入した。この実験には、３日目予防処置群およびコントロール群を含有した。実験手順は、実施例１２のように行った。唯一の違いとして、３日目、５日目、および６日目にマウスあたり１ｍｇのRhmAb2.102を注入した。予期したように、３日目のRhmAb2.102は炎症反応を抑制した。５日目、６日目、および７日目のRhmAb2.102の静脈内注入によるマウスの処置は、図６にも見られるように炎症を安定させた（図８）。炎症の徴候は減少しなかったが、関節びらんの全てのパラメータが減少したことは注目に値する。このことは、関節びらんおよび炎症が、別々に処理することができる２つの別の実体であることを示す。
【０１０３】
次の一連のＣＡＩＡ実験では、我々は、デキサメタゾンにより炎症レベルを低下させる可能性を調べ、デキサメタゾン処置後の炎症の再発予防は、５日目、６日目、および７日目にRhmAb2.102（図９）をデキサメタゾンと同時に注入することで止まった。
【０１０４】
デキサメタゾンは、日常的に投与する必要がある一般的な炎症性阻害剤である。一度治療が中断された場合は炎症が再発する。腹腔内へのデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）の注入と同時に抗コラーゲン抗体の注入後、５日目（図９Ａ）、６日目（図９Ｂ）、および７日目（図９Ｃ）において、１ｍｇのRhmAb2.102を静脈内に注入した点において実施例１２と異なる実験手順を実行した。デキサメタゾンは、足における腫脹が消失するまで２〜３日間連続的に投与した。動物のその他の群は、デキサメタゾンの腹腔内注入のみを受けた。図９に示されるように、RhmAb2.102を受けていないマウスにおいて炎症が再出現した。しかし、非常に対照的に、デキサメタゾンがRhmAb2.102と組み合わされた場合、炎症の再発は非常に穏やかであり、デキサメタゾンのみを処置されたマウスに比較して遅れて発生した。このことは、６日目または７日目に組み合わせたRhmAb2.102／デキサメタゾン処置を開始した場合に最も明らかであった（図９ＢおよびＣ）。図９に示される実験は、デキサメタゾンなどの炎症の阻害剤を炎症の再燃を治療するために使用することができ、RhmAb2.102は炎症の再発を予防するため、より重要には組織／関節損傷が生じることを予防するために使用できる、炎症性疾患における新規の治療方法を示す。したがって、本発明は、本明細書に記載したような結合分子とともに炎症の阻害剤の同時投与によって、炎症および関節損傷を治療するための方法に関する。
【０１０５】
他のＣＡＩＡ実験において、RhmAb2.101の差別化抗原であるRhmAb2.102との交差反応性が示された２つの新規抗シトルリン抗体（RhmAb2.105およびRhmAb2.107）について、それらの抗炎症効果を試験した。RhmAb2.105、RhmAb2.107、およびRhmAb2.102（ポジティブコントロール）を、別の実験群において抗コラーゲン抗体注入後３日目に静脈内に注入（１ｍｇ／マウス）した（図１０）。実験手順は実施例１２に記載されたように実行した。図１０は、各グループの全ての足の平均関節炎スコアを示す。
【０１０６】
RhmAb2.102が最も高い抗炎症作用を示すことが明らかとなった。RhmAb2.107は、ほとんどRhmAb2.102と同様であり、RhmAb2.105は、以前観察したRhmAb2.104と同様の中間の効果を示した（図１Ｃ）。
【０１０７】
RhmAb2.102に優先的に結合するその他の脱イミノ化タンパク質を質量分析により同定した。さらに、RhmAb2.102に優先的に結合するが、RhmAb2.101に結合しないか、またはあまり結合しない脱イミノ化タンパク質は、追加の質量分析によって同定した。ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）ライセートを、RhmAb2.101またはRhmAb2.102（実施例１３）で免疫沈降し、high throughput nano-LC system coupled to an advanced, high-performance LTQ Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass spectrometer （nLC LTQ FTMS ULTRA）を行った（実施例１４）。Exponentially Modified Protein Abundace Index (emPAI)と組み合わせたその超高質量分解能、質量精度、および感度の算出は、RhmAb2.102に（優先的に）結合する脱イミノ化タンパク質を同定することを可能にする。このことは、表７（実施例１３および１４）に示す。
【０１０８】
このため、本発明は、表７に示すような任意のタンパク質またはポリペプチドに特異的に反応する、炎症性疾患の予防または治療における使用のための結合分子にも関する。
【０１０９】
要約すると、我々は、本明細書において、ｐ１５、ｐ１７、特に、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、または表７のタンパク質からなる群から選択されたタンパク質、より具体的には、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８のペプチドからなる群から選択された分子におけるエピトープに特異的に反応する、本明細書に明記されたような炎症性疾患の治療または予防において使用できる結合分子を示した。所定の結合分子が、上記の分子に特異的に反応しているか否かは、RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体と競合する結合分子の、ｐ１５もしくはｐ１７、または上述した任意のシトルリン化エピトープに結合する能力を分析することによって簡単に決定することができる。
【０１１０】
本発明の結合組成物の効果を示したことで、炎症性疾患は免疫応答を誘発することによっても治療または予防することができ、本発明に係る特異的結合分子は患者自身の体において生成される（in vivo）ことが当業者に明らかである。このような免疫応答は、炎症性疾患の発症を防ぐため（予防、予防ワクチン）、または炎症性疾患の転帰を改善もしくは軽減、すなわち治療するために生じ得る。
【０１１１】
したがって、本発明は、in vivoにおける免疫応答を誘発することにより炎症性疾患を予防または治療するための方法にも関し、ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択されるエピトープに反応する特異的結合分子が生成される。
【０１１２】
本発明のワクチンまたは治療は、本発明に係る結合分子に特異的に反応するシトルリン化エピトープを効果的に含み得る。より詳細には、シトルリン化エピトープアは、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａもしくはヒストン４、またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトヒストンＨ３、もしくは配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されたペプチドにおけるシトルリン化エピトープであり得る。
【０１１３】
したがって、多くのシトルリンに関連する炎症性疾患は、治療または予防することができる。このため、本発明は、上述したような方法にも関し、前記炎症性疾患は、自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される。関節リウマチなどの自己免疫疾患の予防または治療が特に好ましい。
【０１１４】
本発明の実施形態は、in vivoにおける免疫応答に関するので、好ましい特異的結合分子は抗体である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを関節炎症状の重症度について８つのモノクローナル抗体の効果を検査するために使用した。平均関節炎スコア（図１ａ、１ｃ、および１ｅ）および関節炎の発生率は（図１ｂ、１ｄ、および１ｆ）を示した。５〜６匹のマウス群について抗コラーゲン抗体を腹腔内注入することにより０日目に処置した。図１ａおよび図１ｂに示される実験において使用されるマウスは、１．６ｍｇの抗コラーゲン抗体混合物の投与を受け、一方、図１ｃ−ｆに示される実験において使用されるマウスは、２．４ｍｇの投与を受けた。抗シトルリン抗体またはコントロール抗体（RhmAb2.201）とともにＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を腹腔内投与によって３日目に投与した。グラフに記載されている場合を除いて、全ての抗体を１ｍｇ／マウスで投与した。動物は１３日目まで毎日スコアを評価した。抗体RhmAb2.102およびRhmAb2.103は同様に好成績を収め、RhmAb2.102のみ示した。抗体RmmAb1.102およびRmmAb1.103についても同様であり、それらは好成績を収め、RmmAb1.102のみ示した。
【０１１６】
【図２】酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）をｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４を用いて脱イミノ化したヒトリコンビナントヒストン（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４）についてａ）RhmAb2.101、ｂ）RhmAb2.102、およびｃ）RhmAb2.104の親和性について検査するために使用した。脱イミノ化されたヒストンと同様に脱イミノ化されていないヒストンを９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μｇ／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを抗体の特異的結合について試験するために使用した。コートされたウェルを、１０ｕｇ／ウェルから０．０００１２８μｇ／ウェルに至るまでの範囲の連続抗体希釈液を用いて室温で１時間（Ｚ軸）インキュベートした。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温での１時間のインキュベートに続いて、ＴＭＢ基質とともにするインキュベーションにより行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。Ｈ１＝リコンビナントヒストン１、Ｈ１／ｐ２＝ｈｕＰＡＤ２リコンビナントヒストン１、Ｈ１／ｐ４＝ｈｕＰＡＤ４リコンビナントヒストン１など（ｘ軸）。
【０１１７】
【図３】酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、ヒトヒストンＨ２Ａに由来するペプチドを含むシトルリンに対する、ａ）RhmAb2.101、ｂ）RhmAb2.102、およびｃ）RhmAb2.104の親和性の試験に用いた。ヒストン２Ａに由来するペプチドを含む、ビオチンおよびシトルリンは、ニュートラアビジンでコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μg／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を、同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを、各抗体の結合について試験するために使用した。コートされたウェルを、１０ｕｇ／ウェルから０．０００１２８μｇ／ウェルに至るまでの範囲の連続抗体希釈液を用いて室温で１時間（Ｚ軸）インキュベートした。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温での１時間のインキュベートに続いて、ＴＭＢ基質とともにするインキュベーションにより行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。
【０１１８】
【図４】酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、フィブリノゲンおよびビメンチンに由来するペプチドを含むシトルリンに対する、ａ）RhmAb2.101、ｂ）RhmAb2.102、およびｃ）RhmAb2.104の親和性の試験に用いた。フィブリノゲンおよびビメンチンに由来するペプチドを含む、ビオチンおよびシトルリンは、ニュートラアビジンでコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（０．３μg／ウェル）上に固定化した。ＣＦＣ−１およびＣＦＣ−０を同じ濃度でコートし、特異的な抗シトルリン抗体の反応性について、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとし、コーティングコントロールとした。コートされていないウェルを、各抗体の結合について試験するために使用した。結合した抗シトルリン抗体の検出は、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）を用いて室温での１時間のインキュベートに続いて、ＴＭＢ基質とともにするインキュベーションにより行った。得られたＯＤ（ｙ軸）は、抗体結合の尺度である。
【０１１９】
【図５】コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを、足におけるシトルリンの出現を調べるために使用した。３匹のマウスの群について、０日目に腹腔内投与によって２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を用いて処置し、続いて３日目にＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を追加で腹腔内に注入した。平均関節炎スコアおよび関節炎の発症率は、図５Ａおよび５Ｂにそれぞれ示した。
【０１２０】
【図６】抗コラーゲン抗体注入後７日目にRhmAb2.102を投与した場合のRhmAb2.102の治療効果を試験テストするために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。全ての足の平均関節炎スコア（図６Ａ）および右後足の平均関節炎スコア（図６Ｂ）を示す。５匹のマウスの群について、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を用いて腹腔内注入よって処置した。ＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を、３日目に腹腔内注入によって投与し、RhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）またはプラセボを７日目に同一の経路によって注入した。動物について３５日目まで毎日スコアを評価した。RhmAb2.102は存在する炎症を少なくとも安定化することが観察された。
【０１２１】
【図７】組織学的分析を、ヘマトキシリン／エオシン染色およびサフラニンＯ染色された、RhmAb2.102またはプラセボを用いて７日目に処置した全てのＣＡＩＡ動物の右後足の組織スライドで行った（図７）。軟骨の侵食（Ｂ）、骨侵食（Ｃ）、炎症細胞の流入（Ｄ）、軟骨ＰＧの枯渇（Ｅ）、および軟骨細胞死（Ｆ）のパラメータは、染色された組織スライドにおいてスコアを評価された（０〜３の任意の尺度）。図７Ａは、実験最終日（３５日目）における実験群の間における右後足の肉眼で確認できる炎症を示す。各点は単一の動物を表す。水平な線は実験群内での平均スコアを示す。RhmAb2.102の注入は、永続的な関節の損傷からマウスを保護すると結論付けることができる。
【０１２２】
【図８】抗コラーゲン抗体の注入後、３日後、５日後、６日後、および７日後にRhmAb2.102を与えた場合のRhmAb2.102の治療効果を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを用いた。５匹のマウスの群は、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内に注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）を腹腔内注入によって３日目に投与した。RhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）について、３日目、５日目、６日目、または７日目に静脈内投与した。動物について１９日目まで毎日スコアを評価した。グラフは、各実験群の平均関節炎スコアを示す。RhmAb2.102は、治療開始時のレベルに比較して炎症レベルを少なくとも安定化すると再度結論付けることができる。 菱形：コントロール、丸：７日目、白丸：６日目、四角：５日目、および三角：３日目
【０１２３】
【図９】デキサメタゾン処理と同時に抗コラーゲン抗体を注入した後、５日目、６日目、および７日目（それぞれ、パネルＡ、Ｂ、およびＣ）にRhmAb2.102を与えた場合におけるRhmAb2.102の治療効果を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。５匹のマウスの群は、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）腹腔内注入によって３日目に投与した。RhmAb2.102（１ｍｇ／マウス）を５日目、６日目、または７日目に第１用量のデキサメタゾンと同時に静脈内に注入し、一方デキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）を肉眼で確認できる腫れが消えるまで２日または３日連続して与えた（腹腔内投与）。その他の動物群は、デキサメタゾンのみの腹腔内注入を受けた。 動物について２１日目まで毎日スコアを評価した。グラフは各実験群の平均関節炎スコアを示す。 デキサメタゾンと組み合わせたRhmAb2.102治療は、腫れを劇的に減少させ、RhmAb2.102の投与を受けていないマウスと比較してゆっくりした穏やかな炎症の再発のみをもたらすことを見出した。非常に対照的に、デキサメタゾンのみを動物に投与した場合、炎症性再発は、デキサメタゾン／RhmAb2.102の組み合わせを投与したマウスと比較してはるかに強く迅速であった。 菱形：コントロール、三角：５日目から毎日デキサメタゾンのみ投与、四角：５日目から毎日デキサメタゾンに加えてRhmAb2.102を投与。
【０１２４】
【図１０】抗コラーゲン抗体注入後３日目にRhmAb2.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107を投与した場合のRhmAb2.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107の抗炎症作用を試験するために、コラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）モデルを使用した。全ての足の平均関節炎スコア（図１０Ａ）および後足のみの平均関節炎スコア（図１０Ｂ）を示す。５匹のマウスの群は、０日目に２．８ｍｇの抗コラーゲン抗体を腹腔内に注入することによって処置した。ＬＰＳ（２５μg／マウス）を腹腔内注入によって３日目に投与した。RhmAb2.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107（１ｍｇ／マウス）またはプラセボを同日に静脈内投与した。動物について１４日目まで毎日スコアを評価した。 RhmAb2.102は、最も高い抗炎症作用をもたらした。後足のみの平均関節炎スコアを調べたとき、RhmAb2.102、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107全ての抗炎症作用に関して同様であった。 菱形：コントロール、三角：RhmAb2.102、四角：RhmAb2.105、丸：RhmAb2.107
【実施例】
【０１２５】
実施例１：ヒトおよびマウスのリコンビナントモノクローナル抗体。
ＲＡ患者のシトルリン化抗原に対するモノクローナル抗体は、記載されたようにファージディスプレイ法によって最初に選択した（Raats et al., J Reumatology, vol30, 1696-711,2003）。簡潔には、３人のＲＡ患者の自己抗体レパートリを、Ｂ細胞レパートリから分離し、抗体フラグメントライブラリを生成するために使用した。これらのライブラリについて、ＷＯ９８／２２５０３に記載されたように、シトルリン化環状ペプチドＣＦＣ１−ｃｙｃに対する４段階の親和性選択を行った。抗体のクローンは、ＣＦＣ１−ｃｙｃへの強い反応性およびシトルリン化されていないＣＦＣ０−ｃｙｃへの反応性の欠如に基づいて選択した（ＷＯ９８/２２５０３）。
【０１２６】
Raatsらによって記載された配列をコードする抗体（J Reumatology, vol30、1696-711, 2003）を、Stemmerら（Gene, vol164, 49-53, 1995）に従って合成し、続いてヒトおよびマウスの抗体アイソタイプをコードする哺乳類発現ベクターにクローニングした。ヒト抗体は、アイソタイプＩｇＧ１ラムダであり、RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104と命名した。マウス抗体は、アイソタイプＩｇＧ２ａカッパであり、RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103、およびRmmAb1.104と命名した。
【０１２７】
RhmAb2.101をStemmerらのプロトコル（Gene, vol164, 49-53, 1995）に応じて、クローンＲａ３の配列（Raats et al., J Reumatology, vol30, 1696-711, 2003）に基づいて合成した。RhmAb2.101は、生殖系列ファミリーλ１ｂに由来するＶＬに組み合わせた生殖系列ファミリー３〜２１に由来するＶＨからなる。RhmAb2.103をStemmerらに従って（Gene, vol164, 49-53, 1995）、クローンＡ２−２の配列（Raats et al., J Reumatology, vol30, 1696-711, 2003）に基づいて合成した。RhmAb2.103は、生殖系列ファミリーλ１ａに由来するＶＬに結合した生殖系列ファミリー３−２３に由来するＶＨからなる。RhmAb2.104は、Stemmerら（Gene, vol164, 49-53, 1995）に従って合成した。RhmAb2.104は、生殖系列λ１ｃに由来するＶＬに結合した生殖系列４−ｂに由来するＶＨからなる。
【０１２８】
RhmAb2.102は、Stemmerら（Gene, vol164, 49-53, 1995）に応じて合成した。RhmAb2.102は、配列番号９によりコードされた免疫グロブリン軽鎖に結合した配列番号８によりコードされた免疫グロブリン重鎖を含む。配列番号８によってコードされる免疫グロブリン重鎖は、配列番号１２に対応するマウスリーダグロブリン、続いて配列番号１３に対応する多様な抗体の重鎖、続いて配列番号１４に対応する免疫グロブリン定常ドメインヒトＩｇＧ１を含む。配列番号９によってコードされる免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１２に対応するマウスリーダグロブリン、続いて配列番号１５に対応する可変抗体軽鎖、続いて配列番号１６に対応する免疫グロブリンヒトラムダ定常ドメインを含む。
【０１２９】
RmmAb1.102は、Stemmerらに従って（Gene, vol164, 49-53, 1995）合成した。RmmAb1.102は、配列番号１１によりコードされた免疫グロブリン軽鎖と結合した、配列番号１０によりコードされた免疫グロブリン重鎖を含む。配列番号１０によってコードされる免疫グロブリン重鎖は、配列番号１２に対応するマウスリーダグロブリン、続いて配列番号１９に対応する可変抗体の重鎖、続いて配列番号２０に対応する免疫グロブリン定常ドメインマウスＩｇＧ２ａを含む。配列番号１１によってコードされる免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１２に対応するマウスリーダグロブリン、続いて配列番号１７に対応する可変抗体軽鎖、続いて配列番号１８に対応する免疫グロブリンマウスカッパ定常ドメインを含む。
【０１３０】
モノクローナル抗体RhmAb2.101、RhmAb2.103およびRhmAb2.104、RmmAb1.101 RmmAb1.103、およびRmmAb1.104の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の一次ｍＲＮＡ配列を公開し、表１に示したような受入番号でＥＭＢＬデータベースに供託した。全長ヒトおよびマウス抗体配列を、抗体RhmAb2.102およびRmmAb1.102について記載されたように、同一のリーダおよび定常ヒトドメインまたは定常マウスドメインを使用して生成した。
【０１３１】
【表１】
【０１３２】
シトルリン化フィブリノゲンに対するコントロール抗体であるRmmAb13.101、R mmAb13.102、およびRmmAb13.103、ならびにヒトＵ１−７０ｋタンパク質のアポトーシス性の４０ｋＤ切断産物に対するRhmAb2.201は、Modiquest Research BV, Schoutstraat 58, 6525 XV Nijmegen, The Netherlands から市販されている(Cat no, MQ13.101、MQ13.102、MQ13.103、およびMQR2.201）。
【０１３３】
実施例２：炎症の実験モデル
ModiQuest Research B.V. から市販されているコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）マウスモデル(cat no: MQ18.101）をマウスに関節炎を誘導するため製造規格に従って使用した（http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG%20_2007.08.22.pdf）。その目的のために、０日目に８つの抗コラーゲン抗体の混合物を８週齢のＤＢＪ／Ｊ１マウス（５〜６マウス／群）に腹腔内投与した。（図１ａおよび１ｂにおいて使用されるマウスは、１．６ｍｇの抗コラーゲン抗体混合物の投与を受け、一方、図１ｃにおいて使用されたマウスは２．４ｍｇの投与を受けた）。３日目において、マウスは、１ｍｇの抗シトルリン抗体を混合した２５μｇＬＰＳを含む、他の腹腔内注入を受けた（特に記載のない限り）。ＬＰＳは炎症を引き起こす。実験の１３日目まで、マウスはそれらの足における炎症の兆候について毎日スコアを評価された。スコアは表２にしたがって実施した。動物あたりの最大関節炎スコアは８である。
【０１３４】
マウスモノクローナル抗シトルリン抗体である、RmmAb13.101、RmmAb13.102、およびRmmAb13.103について、コラーゲン抗体が誘発する関節炎の重症度を促進することができることを確認した。これらの抗体の混合物はさらに顕著に応答した。このことは、本質的に抗シトルリン抗体が関節炎を強化／誘導することができる早期の結果を確立する（Kuhn et al,. J. Clin. Invest, vol116, 961-871, 2006; Hill et al., J Exp Med, vol205, 967-979, 2008）。これらの結果は、同じ実験でそれぞれ「平均関節炎スコア」および「関節炎の発症率」を示す、図１ａおよびｂに示される。
【０１３５】
しかし驚くべきことに、ヒト型モノクローナル抗体RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104は、実験的なＣＡＩＡモデルにおける関節炎の臨床症状を軽減または欠失させた（図１ｃおよび１ｄ）。RhmAb2.102およびRhmAb2.103は関節炎の最高の症状を軽減したが、一方RhmAb2.104は炎症を約５０％軽減した。RhmAb2.101は用量試験において全く効果が無かった。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
抗コラーゲン抗体注入後３日目における、抗シトルリン抗体を投与するための決定は、約４日目に実験的に誘導される関節炎を有するマウスの足にシトルリン化エピトープが現れることを示す上記された実験データに基づく。
【０１３８】
実施例３：脱イミノ化細胞抽出物の調製、ＳＤＳページ電気泳動、およびウエスタンブロッティング。
ＣＯＳ−１細胞（８・１０５）を、Ｖ−ｋｉｔとともにAMAXA nucleofection装置（プログラムＤ−００５）を用いて、２μｇのｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトし、細胞をＴ７５の２０ｍｌ培地中に播種した。
【０１３９】
７２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、スピンダウンし、１５μｌの氷冷溶解バッファ（ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、１０ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁した。
【０１４０】
細胞サンプルを氷上で１５秒間に４回音波処理した（sonified）。ライセートを５分間３．０００ｒｐｍで遠心し、上清を清浄なチューブに移した。細胞ライセートを、それぞれ１０ｍＭおよび５ｍＭの最終濃度で、ＣａＣｌ２およびＤＴＥを追加して３７℃で３０分から２時間脱イミノ化した。脱イミノ化された細胞ライセートは、−２０℃で保存した。
【０１４１】
１０倍のサンプルバッファ（ｐＨ６．８の０．２５Ｍトリス、８％ＳＤＳ、３５％グリセロール、２．５％β-メルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー）を脱イミノ化された細胞ライセートに添加し、５分間ボイルした。約５・１０５細胞に対応するライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）の各レーンにロードして分離し、続いてHybond C extraニトロセルロース膜（Amersham Biosciences）エレクトロブロッティングした。ブロッティングおよびローディングをポンソーＳ染色によって確認した。
【０１４２】
実施例４：治療用抗シトルリン抗体はｐ１５およびｐ１７を認識する。
実施例３において作製されたようなブロットについて、細長い形に切断し（cut in strips）、全ての非特異的部位をブロックするために、２時間室温で、５％（w/v）低脂肪粉ミルクのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（洗浄液）を用いてブロックした。それから、ブロットを、洗浄バッファを用いて５回５分間洗浄し、ストリップ（strip）をさらに２０μｇの抗シトルリン抗体を含む４ｍｌの洗浄バッファを用いて室温で１時間インキュベートした。その後、ストリップを、洗浄バッファを用いて１０分間５回洗浄し、洗浄バッファ中のペルオキシダーゼ共役化ウサギ抗ヒトＩｇＧ（DAKO）（室温で1時間）（１：２０００）とともにインキュベートした。その後、洗浄バッファで１０分間３回洗浄し、続いて全ての未結合抗体を洗浄するためにＰＢＳで洗浄した。
【０１４３】
免疫反応性バンドは、化学発光基質（PIERCE）を用いて可視化し、Kodak BioMax XARオートラジオグラフィーフィルム（Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA）に感光させた。
【０１４４】
RhmAb2.102、RhmAb2.103、およびRhmAb2.104を用いてインキュベートされたストリップは、約１５および１７キロダルトンの分子量を有する２量体タンパク質への反応性を示した。
【０１４５】
実施例５：抗原の免疫沈降
免疫沈降のために、３０μＬのプロテインＡ−セファロースファストフロー（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）を、３３０μＬの細胞ライセートに添加し、２時間４℃で回転させながらインキュベートした。セファロースビーズに免疫結合したタンパク質を、その後ＩＰＰ１５０（ｐＨ８の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ４０、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で４回洗浄した。２倍のサンプルバッファ（１００ｍｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８の２００ｍｍジチオスレイトール、４％ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）をビーズに添加し、タンパク質について１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。ゲルを、室温で一晩、染色溶液（１０％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム、２％ｗ／ｖのリン酸（８５％）、０．１％ｗ／ｖのＣＢＢ Ｇ−２５０、２０％ｖ／ｖのメタノール）中で穏やかに揺らしながら染色した。全ての染色トレイをメタノールの蒸発を防ぐためにパラフィルムで密封した。翌日、ゲルをミリＱ水（milli-Q water）中で所望の染色が見えるまでインキュベートすることにより、染色されていないバックグラウンドを脱染色した。ゲルの画像を撮影後に脱染色液（ミリＱ水）を２〜３回置換した。
【０１４６】
ヒトＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ＣＯＳ-１ライセートの両者における、R hmAb2.102、RhmAb2.103、RmmAb1.102、およびRmmAb1.103を用いた免疫沈降は、ｐ１５およびｐ１７タンパク質の顕著なバンドを表す。これらのバンドは、免疫沈降がRhmAb2.104およびRmmAb1.104を用いて行ったときにいくらか顕著さが低下した。したがって、ｐ１５およびｐ１７タンパク質の認識率は、これらの抗体の治療特性とよく相関している（図１ａ−ｄ）。
【０１４７】
実施例６：ｐ１５およびｐ１７に対する抗体の競合アッセイ。
ｐ１５およびｐ１７に結合するための競合アッセイを、実施例３に記載されたように免疫ブロットにおいて行った。マウスモノクローナル抗体である、RmmAb1.102およびRmmAb1.103を、それぞれ、RhmAb2.102およびRhmAb2.103の存在下および非存在下においてｐ１５およびｐ１７を含むイムノブロットストリップに結合させた。結合は抗マウス共役物を使用して検出した。適切なコントロール実験を共役物がヒト抗体に反応しないことを確認するために行った。RmmAb1.102およびRmmAb1.103のｐ１５およびｐ１７への結合は、それぞれRhmAb2.102およびRhmAb2.103が競合する抗体として使用された場合に減少させることができる。コントロール抗体である、RmmAb13.101、RmmAb13.102、およびRmmAb13.103は、ｐ１５またはｐ１７への結合について、RmmAb1.102またはRmmAb1.103と競合しない。
【０１４８】
これらの知見は、このアッセイを炎症性疾患の臨床症状を抑制することができる抗体の選択のための優れた試験にする。
【０１４９】
実施例７：ｐ１５およびＰ１７の質量分析。
実施例３のＳＤＳ−ｐａｇｅゲルのｐ１５およびｐ１７のバンドをゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。簡潔には、切り出したゲルの一部を、５０μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで２回洗浄し、各洗浄工程について３０分間インキュベートする。上記したように、３０％ｖ／ｖアセトニトリルを添加して１５分間の洗浄を繰り返す。全ての液体を取り除き、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム＋２５μｌのアセトニトリルを添加し、１５分間インキュベートした。再度、全ての液体を除去し、ゲルを５０μｌのアセトニトリルとともに３０分間インキュベートした。全ての液体を取り除き、一部を３７℃で２時間インキュベートした。脱水後、ゲル片を再度膨潤させるために、５μｌのトリプシン溶液（２５ｍＭ重炭酸アンモニウム／５ｍＭのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド中において、〜１５ｎｇのトリプシン／μｌ）を添加し、氷上で１時間インキュベートした。余分なトリプシン溶液を除去し、ゲル片を５μｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム／５ｍＭのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとともに３７℃で１４時間インキュベートした。ペプチドを４μｌの５０％アセトニトリル／０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ｎオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとともに室温で１時間インキュベートすることにより抽出した。サンプルを、超音波水槽中において２分間超音波処理し、液体を新しいチューブに移し、抽出工程を繰り返した。サンプルを真空遠心機で乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを行った。
【０１５０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析で特定される全ての断片は、ヒストンタンパク質（表３）に起因した。
【０１５１】
【表３】
【０１５２】
実施例８：治療用の抗シトルリン抗体はＨ２Ａ／ｐ４を認識する。
ヒトリコンビナントヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４（１００μｇ）を５３．４ｍＵのｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４とともに、またはこれらを含まずに３７℃で３時間インキュベートした。脱イミノ化されたヒストンだけではなく、脱イミノ化されていないヒストンを４℃で一晩インキュベートすることにより、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（０．３μｇ／ウェル）上にコートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄し、室温（ＲＴ）でＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに１時間インキュベートすることによりブロックした。ＰＢＳ−Ｔでさらに５回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡのRhmAb2.101、RhmAb2.102、またはRhmAb2.104の１０μｇ／ウェルの濃度から開始する連続希釈液とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ウサギ抗ヒト抗体ＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳで３回の洗浄工程を行った。RhmAb2.101およびRhmAb 2.104とともにインキュベートしたウェルを１５分間インキュベートし、RhmAb2.102とともにインキュベートしたウェルを、２ＭのＨ２ＳＯ４との反応を停止する前にＴＭＢ基質とともに１０分間インキュベートした。光学密度を４５０ｎｍで測定し、使用される抗体の親和性の尺度とした。
【０１５３】
実施例９：治療用の抗シトルリン抗体はペプチド１を認識する。
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩インキュベートすることによりニュートラアビジンでコートした（０．１μｇ／ウェル）。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）とともに５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。ＰＢＳ−Ｔを用いてさらに５回洗浄した後、ウェルを、ヒストン由来シトルリンおよびビオチン含有ペプチド（０．３μｇ／ウェル）とともに室温で1時間インキュベートした。さらにＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中の１０μｇ／ウェルの濃度から開始するRhmAb2.101、RhmAb2.102、またはRhmAb2.104の連続希釈液で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔを用いた５回の洗浄およびＰＢＳを用いた３回の洗浄工程に続いて、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルを、２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止する前にＴＭＢ基質とともに５分間インキュベートした。光学密度を４５０ｎｍで測定し、使用される抗体の親和性の尺度とした。
【０１５４】
実施例１０：脱イミノ化されたヒト血漿フィブリノゲンの調製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロッティング、ならびに抗シトルリン抗体による検出。
【０１５５】
１００ｕｇのヒト血漿フィブリノゲンを、１００μｌの脱イミノ化バッファ（ｐＨ７．６のＰＢＳ、１０ｍＭの塩化カルシウム、５ｍＭのジチオスレイトール）に溶解し、５３．４ｍＵのｈｕＰＡＤ２またはｈｕＰＡＤ４とともに３７℃で３時間脱イミノ化した。１０倍のサンプルバッファ（ｐＨ６．８の０．２５Ｍトリス、８％ＳＤＳ、３５％グリセロール、２．５％β−メルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー）を添加し、７．５μｇの、脱イミノ化されたフィブリノゲンまたは脱イミノ化されていないフィブリノゲンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）の各レーンにロードして分離し、Hybond C extraニトロセルロース膜（Amersham Biosciences）にエレクトロブロッティングした。ブロッティングおよびローディングはポンソーＳ染色により確認した。
【０１５６】
ブロットを、全ての非結合部位をブロックするために、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（洗浄バッファ）中の５％（ｗ／ｖ）低脂肪粉ミルクを用いて室温で２時間ブロックした。続いてブロットを、洗浄バッファを用いて５回５分間洗浄し、ストリップを２０μｇの抗シトルリン抗体を含む４ｍｌの洗浄バッファを用いて室温で１時間インキュベートした。その後、ストリップを、洗浄バッファで１０分間５回洗浄し、洗浄バッファ（１：２０００）中でペルオキシダーゼ共役化ウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＡＫＯ）（室温で1時間）とともにインキュベートした。ストリップをＰＢＳによって２回洗浄後、全ての未結合抗体を洗浄するために、洗浄バッファを用いて１０分間３回洗浄した。
【０１５７】
免疫反応性バンドは、化学発光基質（PIERCE）を用いて可視化し、Kodak BioMaxオートラジオグラフィーフィルム（Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA）に感光させた。
【０１５８】
RhmAb2.102およびRhmAb2.104を用いてインキュベートしたブロットは、RhmAb2.101を用いたものよりも脱イミノ化ヒト血漿フィブリノゲンとの高い反応性を示した。また、RhmAb2.102は、RhmAb2.104と比較した場合に高い反応性を示した。
【０１５９】
実施例１１：治療用抗シトルリン抗体は、フィブリノゲンおよびビメンチン由来シトルリンペプチドを認識する。
【０１６０】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩インキュベートすることによりニュートラアビジン（０．１μｇ／ウェル）でコートした。ウェルをＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。ＰＢＳ−Ｔを用いてさらに５回洗浄した後、ウェルをフィブリノゲンおよびビメンチン由来シトルリンおよびビオチン含有ペプチド（０．３μｇ／ウェル）とともに室温で1時間インキュベートした。さらにＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄した後、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中の１０μｇ／ウェルの濃度から開始するRhmAb2.101、RhmAb2.102、またはRhmAb2.104の連続希釈液で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔを用いた５回の洗浄およびＰＢＳを用いた３回の洗浄工程に続いて、ウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともに室温で１時間インキュベートした。ウェルを、２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて反応を停止する前にＴＭＢ基質で５分間インキュベートした。光学密度を４５０ｎｍで測定し、使用される抗体の親和性の尺度とした。
【０１６１】
実施例１２：RhmAb2.102の治療可能性
ModiQuest Research B.V. から市販されているコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡＩＡ）マウスモデル(cat no: MQ18.101）をマウスにおいて関節炎を誘導するため製造規格に従って使用した（http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG%20_2007.08.22.pdf）。その目的のために、０日目に８つの抗コラーゲン抗体の混合物（２．８ｍｇ／マウス）を８週齢のＤＢＪ／Ｊ１マウス（５マウス／群）の腹腔内に投与した。３日目、マウスは２５μｇＬＰＳを含む、他の腹腔内投与を受けた。ＬＰＳは炎症を引き起こす。平均関節炎スコアが約４になった７日目において（図６Ａ）、１群について１ｍｇのRhmAb2.102を含む静脈内注入を行った。一方、他の群は、プラセボを含む静脈内注入を受けた。
【０１６２】
動物の足における炎症症状について毎日スコアを評価した。スコアの評価は表２に従って行った。動物あたりの最大関節炎スコアは８である。RhmAb2.102は炎症を安定させた（図６Ａ）。
【０１６３】
全ての右後足を組織学的分析のために使用した。組織を４％ホルムアルデヒドで４日間固定し、５％ギ酸で脱灰し、続いて脱水し、パラフィン包埋した。７μｍの標準正面セクションを、SuperFrostスライド（Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany）にマウントした。ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を関節の炎症を調べるために行った（細胞の流入、図７Ｄ）。関節における炎症の程度について、０〜３のスケール（０＝細胞なし、１＝軽度の細胞充実性、２＝中程度の細胞充実性、３＝最大細胞充実性）でスコアを評価した。図７Ａは３５日目における肉眼で確認できる炎症を示す。軟骨基質からのプロテオグリカン（ＰＧ）の枯渇を検討するために（図７Ｅ）、ファストグリーンを用いた対比染色に続いてサフラニンＯ（ＳＯ）染色した。完全に軟骨が染色された（通常）から軟骨が染色されない（完全なＰＧｓ枯渇）までの範囲である０〜３の任意のスケールを用いてＰＧの枯渇を測定した。軟骨細胞死（図７Ｆ）を、軟骨細胞核の損失無しから完全に軟骨表面が空洞であるまでの０〜３の範囲のスケールでスコアを評価した。軟骨および骨侵食（図７ＢおよびＣ）を、損傷無しから軟骨または骨の構造の完全な損失までの、スケール０〜３の範囲で類別した。関節における病理組織学的変化を７０μｍ離れた関節の５つの準連続切片においてスコアを評価した。スコアの評価は実験条件について既知の知識なしにブラインドで行った。
【０１６４】
群間における右後足の肉眼で観察できる炎症は３５日目において同じであったが（図６Ａおよび７Ａ）、炎症性細胞流入（図７Ｄ）、軟骨の浸食（図７Ｂ）、軟骨ＰＧの枯渇（図７Ｅ）、軟骨細胞死（図７Ｆ）、および骨の浸食（図７Ｃ）の関節炎についての任意のパラメータを調べた場合、コントロール群と比較してRhmAb2.102の投与を受けた実験群において劇的な減少が観察された。この結果は、RhmAb2.102の治療可能性を強く支持する。
【０１６５】
実施例１３：ｈｕＰＡＤ４脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞抽出物の調製、ならびにRhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いた免疫沈降。
【０１６６】
ＨＥＫ２９３細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、スピンダウンし、５．１０５細胞を１５μｌの氷冷溶解バッファ（ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス、１０ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁した。
【０１６７】
細胞サンプルを氷上で１５秒間に４回音波処理した。ライセートを３．０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を清浄なチューブに移した。細胞ライセートをタンパク質２ｍｇあたり１ＵのヒトＰＡＤ４（ModiQuestResearch B.V.; cat no: MQ16.203）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、および５ｍＭのＤＴＴを添加することにより３７℃で２時間脱イミノ化した。
【０１６８】
脱イミノ化ＨＥＫ２９３ライセートにＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１２．５％ゲル）電気泳動、それに続くウエスタンブロッティングを実行することにより、ライセートの脱イミノ化を検証した。ウエスタンブロッティングは、抗体RhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いて免疫染色し、陽性であった。無関係な抗体を用いて処理したブロットは全く染色は認められなかった。
【０１６９】
その後、免疫沈降（ＩＰ）を抗体RhmAb2.101またはRhmAb2.102を用いて脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞ライセートについて行った。簡潔には、３０μｌのプロテインＡセファロースファストフローを、１ｍｌのＩＰＰ５００（ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ４０、および０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、２０μｇのRhmAb2.101または２０μｇのRhmAb2.102に結合させ、結合させないものをネガティブコントロールとした。プロテインＡセファロースビーズ／抗体混合物を一定の回転のもと１時間室温でインキュベートした。１ｍｌのＩＰＰ５００を用いてビーズを３回洗浄し、１回１ｍｌのＩＰＰ１５０（ｐＨ８．０の１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ４０、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、続いて３００μｌ脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞ライセートとともに室温で２時間、一定の回転のもとでインキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞のＩＰ手順が成功したか否か決定するために、少量のビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に使用し、その後ビーズを１ｍｌのＩＰＰ１５０を用いて３回洗浄した。RhmAb2.101、RhmAb2.102、およびコントロールビーズにおける免疫沈降タンパク質を、５０μｌの抽出バッファ（ｐＨ３．０の１００ｍＭナトリウムクエン酸）を用いて抽出し、ｐＨ９．０４の１０μｌ１Ｍトリス／ＨＣｌを用いて中和し、nLC LTQ FTMS ULTRA質量分析法（実施例１４）まで−２０℃で保存した。
【０１７０】
実施例１４：RhmAb2.101およびRhmAb2.102により免疫沈降させたｈｕＰＡＤ４脱イミノ化ＨＥＫ２９３細胞タンパク質の質量分析
免疫沈降されたタンパク質からＰＥＧ形態を取り除くために、それらを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、短時間泳動した。実施例７において記載したように、タンパク質についてゲルの切り出し、およびゲル内トリプシン消化を行った。サンプルについてnLC LTQ FTMS ULTRA質量分析を実行する前にそれらを５０倍に希釈した。
【０１７１】
ペプチドおよびタンパク質の同定は、ホモサピエンス分類のNCBInr_20081022データベースを使用して検索プログラムMascotによってデータから抽出した。以下の修飾を検索において許可した。システイン（Ｃ）（固定）のカルバミドメチル化（carbamidomethylation）、メチオニン（Ｍ）（可変）の酸化、ならにびアスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、およびグルタミン（Ｑ）（可変）の脱アミノ化。脱イミノ化は検索ツールとして使用することができなかった。脱アミノ化および脱イミノ化は、修飾されていないアルギニンと比較した場合に、両者は１ダルトンの質量差をもたらすのでこの問題は除去できる。
【０１７２】
タンパク質の特性の検証を社内で開発したスクリプトによって行った。簡潔には、ソフトウェアは、独特に同定されたペプチド配列、ペプチドの同一のセットを共有するクラスタタンパク質、および以下の条件を有するタンパク質の検証に基づいてタンパク質の特性を分類する。
【０１７３】
１本のペプチドを有するタンパク質は、＞４９のペプチドスコアを有していなければならない。
【０１７４】
１本以上のペプチドを有するタンパク質は、＞２９のペプチドスコアを有していなければならない。
【０１７５】
検証基準の使用について、ペプチドは３つの全てのサンプルで同定された（サンプル１：RhmAb2.101を用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞、サンプル２：Rhm2.102を用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞、サンプル３：空ビーズを用いて沈殿させたＨＥＫ２９３細胞）。
【０１７６】
emPAI（Exponentially Modified Protein Abundance Index）を全ての検証タンパク質について算出した。emPAIは、データベースの検索結果に一致するペプチドによるタンパク質範囲に基づいて、混合物中の、おおよその、標識のない、タンパク質の相対的定量を提供する。この手法は、（選択的に）RhmAb2.102に結合する脱イミノ化タンパク質を同定することを可能にする。このことを表７に示す。
【０１７７】
【表７−１】
【０１７８】
【表７−２】
【０１７９】
実施例１５：抗炎症抗体のファミリー生成／選択
ヒト由来のｓｃＦｖライブラリを、Raatsら（２００３）に記載された方法と同様に、ヒトヒストン２Ａ、ヒストン４、ペプチド１（AAASGXGKQGGK：配列番号２１）、およびＣＦＣ−１ペプチドのＰＡＤ２−またはＰＡＤ４−脱イミノ化形態に対してパニングした（Raats, J.M.H., Wijnen, E.W, Pruijin, G.J.M., Van den Hoogen, F.H.M., and W.J. van Verooij. 2003. J.Rheum. 30, 1696-1711）。
【０１８０】
ＣＦＣ−１および／またはペプチド１（AAASGXGKQGGK：配列番号２１）および／またはＰＡＤ脱イミノ化ヒストン２ａおよび／またはヒストン４とのシトルリン非依存の反応性を示す、選択された抗体は、シトルリン化タンパク質および／またはそれらに由来するペプチドのアレイに対する反応性（実施例１４、表７）、ならびにＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストンアイソフォーム、および脱イミノ化ヒトヒストン由来ペプチドに対する反応性についてスクリーニングした。付随して、ＲＡ患者に由来するＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒト細胞抽出物および関節液に免疫沈降を行った。
【０１８１】
続いて、ｐ１５および／またはｐ１７のバンドとして免疫沈降された抗体、および／またはシトルリン化エピトープ（ＰＡＤ２およびＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストンアイソフォーム、および／またはＣＦＣ−１、および／またはペプチド１（AAASGXGKQGGK、配列番号２１）、および／または表７に挙げられたタンパク質に由来するシトルリン化エピトープ）に対するＥＬＩＳＡ反応性プロファイルを有する抗体を、ヒトＩｇＧ１フォーマットにクローン化した。本明細書において記載したように、ＣＡＩＡマウスモデルにおける、それらの予防的および治療的抗炎症可能性について全長のヒトＩｇＧ抗体を試験した。
【０１８２】
このスクリーニングの手順では、高頻度でＣＡＩＡマウスモデルにおける、予防的および／または治療的抗炎症可能性を有する抗体を得た。
【０１８３】
上述した方法に従って選択される新規抗体の例は、RhmAb2.105（配列番号３９および４０）およびRhmAb2.107（配列番号４１および４２）である。これらの抗体をコードする核酸配列は、配列番号４３〜４６に挙げる。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する、炎症性疾患の予防または治療に使用するための結合分子。
【請求項２】
ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａもしくはヒストン４、またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４もしくはＨ３におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されるペプチドに特異的に反応する、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項４】
シトルリンに関連する炎症性疾患の、治療または予防に使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項５】
自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、特発性若年関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、クローン病、およびギランバレー（Guillan Barre）からなる群から選択される疾患の、予防または治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項６】
関節リウマチのような自己免疫疾患の予防または治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項７】
抗体またはペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項８】
モノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体である、請求項７に記載の結合分子。
【請求項９】
ｐ１５、ｐ１７、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、表７のリストから選択されるタンパク質、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される分子への結合のための、RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択されるモノクローナル抗体に競合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１０】
モノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体に由来する特異的結合ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１】
抗体またはポリペプチドである、請求項１０に記載の結合分子。
【請求項１２】
リコンビナントペプチドまたは単鎖抗体である、請求項１１に記載の結合分子。
【請求項１３】
一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、フラグメント抗原結合領域（Ｆａｂｓ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂｓ）、または、ラクダ由来単一ドメイン抗体もしくはサメＩｇＮＡＲ由来単一ドメイン抗体フラグメント（ＶＮＡＲ）などのＶＨＨ抗体もしくはナノボディ、またはアンチカリン、またはアプタマーを含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１４】
炎症性疾患の予防または治療のための方法であって、ｐ１５、ｐ１７、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される分子におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する結合分子を含む抗炎症性組成物の、治療上有効な量をそれが必要とされる患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１５】
結合分子が、ｐ１５、ｐ１７、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、表７のリストから選択されるタンパク質、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される分子に結合するための、RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択されるモノクローナル抗体に競合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に対応する、可変重鎖または軽鎖を含むポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドをコードした核酸。
【請求項１８】
In vivoにおいて免疫応答を誘発することによる、炎症性疾患の予防または治療のための方法であって、ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択されるエピトープに反応する特異的結合分子が生成される、方法。
【請求項１９】
組成物がそれを必要とする患者に投与される方法であって、上記組成物は、ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される有効成分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性疾患が、自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、およびダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性疾患が、関節リウマチのような自己免疫疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
特異的結合分子が抗体である、請求項１８〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択されるシトルリン化エピトープに対して向けられた、i n vivoでの特異的免疫応答を高めることが可能な、炎症性疾患の治療または予防における使用のための組成物。
【請求項２４】
ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される有効成分を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
炎症性疾患は、自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
炎症性疾患は、関節リウマチのような自己免疫疾患である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
特異的結合分子が抗体である、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する、関節の損傷を予防または治療するための結合分子。
【請求項２９】
炎症の阻害剤とともに共同投与される、請求項２８に記載の結合分子。
【請求項１】
ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する、炎症性疾患の予防または治療に使用するための結合分子。
【請求項２】
ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａもしくはヒストン４、またはヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４もしくはＨ３におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８からなる群から選択されるペプチドに特異的に反応する、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項４】
シトルリンに関連する炎症性疾患の、治療または予防に使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項５】
自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、特発性若年関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、クローン病、およびギランバレー（Guillan Barre）からなる群から選択される疾患の、予防または治療に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項６】
関節リウマチのような自己免疫疾患の予防または治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項７】
抗体またはペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項８】
モノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体である、請求項７に記載の結合分子。
【請求項９】
ｐ１５、ｐ１７、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、表７のリストから選択されるタンパク質、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される分子への結合のための、RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択されるモノクローナル抗体に競合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１０】
モノクローナル抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択される抗体に由来する特異的結合ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１】
抗体またはポリペプチドである、請求項１０に記載の結合分子。
【請求項１２】
リコンビナントペプチドまたは単鎖抗体である、請求項１１に記載の結合分子。
【請求項１３】
一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、フラグメント抗原結合領域（Ｆａｂｓ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂｓ）、または、ラクダ由来単一ドメイン抗体もしくはサメＩｇＮＡＲ由来単一ドメイン抗体フラグメント（ＶＮＡＲ）などのＶＨＨ抗体もしくはナノボディ、またはアンチカリン、またはアプタマーを含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１４】
炎症性疾患の予防または治療のための方法であって、ｐ１５、ｐ１７、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される分子におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する結合分子を含む抗炎症性組成物の、治療上有効な量をそれが必要とされる患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１５】
結合分子が、ｐ１５、ｐ１７、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、表７のリストから選択されるタンパク質、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される分子に結合するための、RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105、およびRhmAb2.107からなる群から選択されるモノクローナル抗体に競合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２に対応する、可変重鎖または軽鎖を含むポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドをコードした核酸。
【請求項１８】
In vivoにおいて免疫応答を誘発することによる、炎症性疾患の予防または治療のための方法であって、ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択されるエピトープに反応する特異的結合分子が生成される、方法。
【請求項１９】
組成物がそれを必要とする患者に投与される方法であって、上記組成物は、ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される有効成分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性疾患が、自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、およびダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性疾患が、関節リウマチのような自己免疫疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
特異的結合分子が抗体である、請求項１８〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択されるシトルリン化エピトープに対して向けられた、i n vivoでの特異的免疫応答を高めることが可能な、炎症性疾患の治療または予防における使用のための組成物。
【請求項２４】
ｐ１５、ｐ１７におけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン２Ａにおけるシトルリン化エピトープ、ヒトＰＡＤ４脱イミノ化ヒトヒストン４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ４、ヒトＰＡＤ２脱イミノ化ヒトヒストンＨ３、ならびに配列番号２１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３７、および配列番号３８に対応するペプチドからなる群から選択される有効成分を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
炎症性疾患は、自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬性関節炎、乾癬、アルツハイマー病、自己免疫性肝炎、若年性特発性関節炎、脊椎関節症、ダウン症候群、多系統萎縮症、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症からなる群から選択される、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
炎症性疾患は、関節リウマチのような自己免疫疾患である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
特異的結合分子が抗体である、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
ｐ１５および／またはｐ１７におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する、関節の損傷を予防または治療するための結合分子。
【請求項２９】
炎症の阻害剤とともに共同投与される、請求項２８に記載の結合分子。
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５２３５５５（Ｐ２０１１−５２３５５５Ａ）
【公表日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２１２３（Ｐ２０１１−５１２１２３）
【出願日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６８６２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７２０１
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５１０３２０６８９）
【氏名又は名称原語表記】ＭＯＤＩＱＵＥＳＴ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｙｅｎｄａａｌｓｅｗｅｇ １３５ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６８６２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７２０１
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５１０３２０６８９）
【氏名又は名称原語表記】ＭＯＤＩＱＵＥＳＴ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｈｅｙｅｎｄａａｌｓｅｗｅｇ １３５ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
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