抗癌作用を有する組換えタンパク質、それをコードする遺伝子、及びそれらの使用
【課題】抗癌作用を持つ組換えタンパク質、そのコード遺伝子、およびそれらの用途を提供すること。
【解決手段】（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と、（２）配列番号２との配列相同性が９０％を超え、同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５個以下のアミノ酸残基の付加または欠失によって得られ、同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、（４）配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５個以下のアミノ酸残基の付加または欠失によって得られ、同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、（５）配列番号２のアミノ酸配列にある１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加によって得られ、同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質とからなる群から選択される組換えタンパク質である。
【解決手段】（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と、（２）配列番号２との配列相同性が９０％を超え、同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５個以下のアミノ酸残基の付加または欠失によって得られ、同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、（４）配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５個以下のアミノ酸残基の付加または欠失によって得られ、同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、（５）配列番号２のアミノ酸配列にある１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加によって得られ、同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質とからなる群から選択される組換えタンパク質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学及び薬理学の分野に関する。本発明は、組換えタンパク質、そのコード遺伝子、及び活性成分として上記組換えタンパク質を含む遺伝子組換え医薬品に関する。特に、本発明は抗癌作用を有する組換えタンパク質、それをコードする遺伝子、及び活性成分として上記組換えタンパク質を含む癌治療用遺伝子組換え医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
進化の過程で、哺乳類は、個々の細胞のプログラム細胞死を誘導することができるアポトーシスのための一連の情報伝達機構を徐々に確立した。根底をなす理論は、キラー細胞のリガンドが、細胞表面上にあるデスレセプターと相互作用し、細胞のアポトーシスを誘導するというものである。そのような有益なアポトーシスは、免疫応答の終わりにおける活性化されたリンパ球の排除や、ウイルス感染細胞及び腫瘍形成的にトランスフォーメーションした細胞の排除に、重要な生理学的役割を果たす。その例として、ＴＮＦ及び受容体であるＴＮＦＲの相互作用、ならびにＦａｓＬ及び受容体であるＦａｓ／Ａｐｏ１／ＣＤ９５の相互作用が挙げられる。
【０００３】
活性化されたデスレセプターは、細胞アポトーシスのカスケード反応に直接関与する。活性化されたデスレセプターは、種々の癌細胞のアポトーシスを誘導するものであり、潜在的な抗癌因子である。ＴＮＦ及びＦａｓＬは、癌細胞のアポトーシスを誘導することが可能ではあるけれども、それらは著しい毒性を有しており、抗癌療法で副作用を生じさせる。ＴＮＦの注射は、敗血症性ショックに類似の致命的な炎症反応をもたらす。この反応は、血管内皮細胞及びマクロファージ中に位置し、ＴＮＦによって活性化されるＮＦ−κＢ（プレ転写因子）によって、主に媒介される。抗Ｆａｓ抗体は、肝臓組織でのＦａｓ依存型細胞のアポトーシスを誘導し、致命的な肝障害を誘導する。
【０００４】
Ｗｉｌｅｙ他は、１９９５年に、ＴＮＦ及びＦａｓＬとの配列の同一性に基づいてＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を発見した。ＴＲＡＩＬは、デスレセプターＤＲ４又はＤＲ５と相互作用することで、アポトーシスを誘導する。ＴＮＦ及びＦａｓＬとは異なり、ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡは、多くの正常なヒト組織で構成的に発現している。このことは、ＴＲＡＩＬが正常細胞には影響を与えずに癌細胞のアポトーシスを誘導する生理学的機構を示唆する。これらのメカニズムとして、リガンドとの結合を巡ってＤＲ４及びＤＲ５と拮抗する抑制性受容体の発現、３種類の受容体ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及びＤＰＧとＴＲＡＩＬとの相互作用能が挙げられる。したがって、ＴＲＡＩＬの毒性は、ＴＮＦ及びＦａｓＬよりも低い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗癌作用を有する組換えタンパク質と、該組換えタンパク質を有効成分として含み、癌を効果的に治療する医薬品とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にもとづく抗癌作用を有する組換えタンパク質は、
（１）配列表に示される配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と、
（２）配列番号２との配列相同性が９０％を超え、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（３）配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（４）配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（５）配列番号２のアミノ酸配列にある１残基又は数残基のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
からなる群から選択されるものである。
【０００７】
配列表に示される配列番号２のタンパク質は、１６６残基のアミノ酸残基からなるヒト組換え環状置換ＴＲＡＩＬ（ＣＰＴ；ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔｅｄ ＴＲＡＩＬ）である。
【０００８】
本発明によって提供される癌治療用医薬品の有効成分（ＣＰＴ）は、上述したタンパク質の一つである。
【０００９】
必要に応じて、一種類以上の医薬的に許容される担体を上記医薬品に添加することが可能である。担体として、医薬の分野で一般に用いられる希釈剤、賦形剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸着剤担体、及び潤滑剤が挙げられる。必要に応じて、香料及び甘味料等も添加してもよい。
【００１０】
本発明にもとづく医薬品を種々の形態に製剤化することが可能であり、該形態として注射剤、錠剤、粉末、顆粒、カプセル、経口投与流体、軟膏、及びクリームが挙げられる。医薬品の上記調剤形態のいずれも製薬分野で通常用いられる方法によって調製可能である。
【００１１】
本発明によって提供される癌治療用医薬品の有効成分（タンパク質）（ＣＰＴ）のコード配列は、
（１）配列表に示す配列番号１と、
（２）配列表に示す配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、
（３）配列番号１によって定義されるＤＮＡ配列との配列相同性が９０％を超え、かつ配列番号１によってコードされるタンパク質の活性と同等の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、
（４）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、上記配列番号２に由来するタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質の活性と同等の活性を有するタンパク質である、ＤＮＡ配列と、
（５）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、上記配列番号２に由来するタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質の活性と同等の活性を有するタンパク質である、ＤＮＡ配列と、
（６）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、上記配列番号２に由来するタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列にある１残基又は数残基のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質の活性と同等の活性を有するタンパク質である、ＤＮＡ配列と、
からなる群から選択されるものである。
【００１２】
配列表にある配列番号１は、５０１塩基対からなる。そのリーディング・フレームは、５’末端側からヌクレオチド１〜４９８である。
【００１３】
本発明の遺伝子を含む発現ベクター及び細胞株（例えば、大腸菌及び酵母発現系）は、本発明の範囲内である。
【実施例１】
【００１４】
＜ヒト組換え環状置換ＴＲＡＩＬをコードする遺伝子の構築及び発現＞
ヒトＴＲＡＩＬの１２１残基から２８１残基にあるアミノ酸残基をコードする、遺伝子配列を、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーから得た。ヒトＴＲＡＩＬの１２１残基〜２８１残基のアミノ酸残基をコードする遺伝子を、ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をテンプレートとして用いて、通常行われるＰＣＲ法によって生成した。つぎに、ＴＲＡＩＬのアミノ酸残基１２２残基〜１３５残基をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲ法によってＴＲＩＬの１３５〜３８１位にあるアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列の３’末端と結合させた。アミノ酸残基１３５残基〜２８１残基をコードするＤＮＡ配列とＴＲＡＩＬのアミノ酸残基１２２〜１３５をコードするＤＮＡ配列との間に、５個のグリシン残基をコードするＤＮＡ配列を挿入した。グリシンの柔軟性により、タンパク質の折り畳みを容易にすることができる。このようにして得られるＣＰＴコード遺伝子を、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩを用いてベクタープラスミドｐｅｔ２８ｂ（又は他のベクター）に連結して、発現ベクターとした。そのＤＮＡ配列は、塩基配列決定によって正しいことが確認された。
【００１５】
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換された大腸菌を、２０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種した。細胞を３７℃で１２時間にわたり振とう機上でインキュベートした。つぎに、１Ｌの２０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢ液体培地に１０ｍｌの培地を接種して、さらに培養を続けた。ＯＤ６００が０．６に達した時に、０．２ｍｌの１Ｍ ＩＰＴＧを１Ｌの培地に加えてタンパク質発現を誘導した。発現誘導を３時間おこなった後、遠心により細胞を回収した。ペレットを、１００ｍＭトリス（ｐＨ７．９）及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍｌの緩衝液に、懸濁した。
【００１６】
細胞を４℃の超音波処理で溶菌させ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ２０ローターを用いて１５，０００ｒｐｍで遠心した。発現タンパク質が金属キレート樹脂と結合可能であることから、金属キレート・クロマトグラフィーを用いて発現タンパク質の精製をおこなうことができる。遠心後、上清を固定化Ｎｉ２＋キレート・クロマトグラフィー・カラムに投入した。このカラムを、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．９）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、及び２００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液によって洗浄し、このカラムに吸着した夾雑タンパク質を除去した。つぎに、結合タンパク質を、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．９）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液によって溶出させた。溶出タンパク質をＰＢＳ緩衝液で透析した。
【００１７】
最後に、タンパク質を、ＡＫＴＡ・ＨＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に設置されたイオン交換カラム及びゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）によって精製した。タンパク質の分析は、そのようにして得られたタンパク質が本発明の抗癌作用を有する医薬品である配列番号２のアミノ酸配列を有することを示した。最終産物は、白色粉末であり、また水溶性であった。
【実施例２】
【００１８】
＜テトラゾリウム還元法（ＭＴＴ）を用いた癌細胞に対する本発明の医薬品の細胞毒性効果の測定＞
試薬：ＲＰＭ１６４０は、ＧＩＢＣＯ社から入手。ＭＴＴはＢｅｎｃｏ社から入手。ウシ胎児血清は、杭州四季青生物工程材料有限公司（中華人民共和国）から購入。
【００１９】
細胞株：ＣＯＬＯ２０５（ヒト大腸癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ヒト肺癌細胞）、ＲＰＭＩ８２２６（ヒト多発性骨髄腫細胞）、及びＵ２５１（ヒト脳神経膠腫細胞）は、米国ＡＴＣＣ社から入手。ＨＬ−６０（ヒト前骨髄性白血病細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト乳癌細胞）、ＳＣＬＣ（ヒト小細胞肺癌細胞）、Ｈ１２５（ヒト肺癌細胞）、及びＰＣ−３（ヒト膵臓癌細胞）。
【００２０】
発育が良い腫瘍細胞を集め、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地による細胞懸濁液（１×１０４／ｍｌ）を調製した。細胞懸濁液を９６穴プレートに接種して、各穴あたり１００μｌ（１，０００個の腫瘍細胞を含む）とした。３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間にわたってプレートを培養した後、医薬品を添加した。
【００２１】
ブランクコントロールと５−フルオロウラシル又はアドリアマイシンを用いたポジティブコントロールとを実験で採用した。ＣＰＴ試料の濃度を５通りにして、各濃度に対して３穴を対応させた。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２であるインキュベータで４日間にわたって培養した。次に、培地を取り除き、１００μｌのＭＴＴ溶液（ＲＰＭＩ−１６４０中、０．４ｍｇ／ｍｌ）を各穴に添加した。プレートをさらに４時間にわたって３７℃でインキュベートした。
【００２２】
上清を捨てた。フォマザン（Ｆｏｍａｚａｎ）粒状物を可溶化するために、１５０μｌのＤＭＳＯを各穴に添加した。穏やかに振とう後、ＯＤ値をＢＩＯＲＡＤ ５５０ ｅｎｚｙｍｅ ａｎａｌｙｚｅｒによって、検出波長を５４０ｎｍ、また参照波長を４５０ｎｍとして測定した。
【００２３】
用量反応曲線は、医薬品の細胞阻害率及び異なる濃度をプロットすることで得られ、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。結果を図１に示した。ヒト腫瘍細胞Ｕ２５１、ＣＯＬＯ２０５、ＮＣＩ−Ｈ４６０、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５に対して、ＣＰＴが非常に強い致死効果を有することがわかった（ＩＣ５０＜０．０１μｇ／ｍｌ）。ＣＰＴはまた、ＨＬ−６０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ−３、及びＨＬ１２５細胞に対して相当に強い致死効果を有する（ＩＣ５０＜０．１μｇ／ｍｌ）。ＣＰＴは、ＲＰＭＩ８２２６細胞に対して良好な効果を有する（ＩＣ５０＜１μｇ／ｍｌ）。また、それはＳＣＬＣ細胞の成長に対するある程度の阻害効果も示す。癌細胞のアポトーシスを誘導するＣＰＴの活性は、野生型ＴＲＡＩＬのものよりも６から１１倍強い。
【００２４】
【表１】
【実施例３】
【００２５】
＜ヌードマウスへのヒト癌異種移植片の増殖に対する本発明の医薬品の阻害効果＞
この実施例では、使用した動物はＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス、６〜８週齢であった。各々の実験に対して、全ての動物の性を同一にした。
【００２６】
腫瘍細胞株：ヒト脳神経膠腫Ｕ２５１、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５を試験管内での培養からヌードマウスへ皮下接種し、腫瘍を二次培養して維持した。
【００２７】
実験手順：発育が良い腫瘍を担持する発育が良いヌードマウスを選択し、頚椎脱臼により安楽死させた。腫瘍を無菌的に取り出し、メスによって直径２〜３ｍｍの断片に切り刻んだ。この断片を、針を用いてヌードマウスの腋窩に皮下接種した。腫瘍を、約７〜１０日後、動物の腋窩に見出すことができた。腫瘍の長さ及び幅を副尺付きカリパスで測定した。つぎに、腫瘍サイズに基づいて動物のグループ分けをおこなった。各々の群は７から８匹の動物を含んだ。
【００２８】
腫瘍の長さ及び幅とマウスの体重とを週２回測定した。腫瘍体積（ＴＶ）及び相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を計算した。腫瘍サイズの変化を示すグラフをプロットした。この実験の最後に、マウスを安楽死させた後、腫瘍を取り出して重さを計り、腫瘍成長に対する医薬品の阻害率を計算した。
【００２９】
腫瘍体積（ＴＶ）を計算するための式は、
【数１】
である。
【００３０】
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を計算するための式は、
【数２】
（式中、Ｖｏは投与開始時に測定されたＴＶ値であり、Ｖｔはその後に測定されたＴＶ値である）である。
【００３１】
Ｔ検定を用いて、異なる動物群間の腫瘍重量、腫瘍体積、ＲＴＶ等の統計学的差を測定した。抗腫瘍活性を評価するために用いた指標は、相対腫瘍成長率Ｔ／Ｃ（％）であり、その式は：
【数３】
である。
【００３２】
効率に関する評価基準は、
Ｔ／Ｃ（％）＞６０は、効果がない。
統計分析後のＴ／Ｃ（％）≦６０及びＰ＜０．０５は、有効である。
【００３３】
＜１．ヒト脳神経膠腫Ｕ２５１に対する阻害効果＞
カルムスチン（Ｒｅｎｍｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｉｎｃ．、天津、中華人民共和国）をポジティブコントロールとして用い、腹腔内注射によって一度だけ４０ｍｇ／ｋｇ投与した。ＣＰＴを、０．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内注射により、４つの群に投与した。処置では１０回の注射を行った。
【００３４】
実験結果を表１及び表２ならびに図１及び図２に示す。ヌードマウスに移植された腫瘍（ヒト脳神経膠腫Ｕ２５１）の成長に対する著しい阻害効果をＣＰＴが示したことが分かる。４つの処置群について体重により計算した腫瘍阻害率は、それぞれ３０．５％、４４．５％、６４．８％、及び８７．５％であった。対照群と比較して、処置群の腫瘍重量は、有意又は相当有意な統計差を示した。ＣＰＴの抗腫瘍効果は、有意に用量依存的であった。５．０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの群についての相対腫瘍成長率Ｔ／Ｃ（％）の値は、＜６０であった。１５ｍｇ／ｋｇの群についての相対腫瘍用量（ＲＴＶ）は、対照群のものと比較して統計学的に有意な差があった。
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
＜２．ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０に対する阻害効果＞
シクロホスファミド（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｕａｌｉａｎ Ｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．、中華人民共和国）をポジティブコントロールとして用い、１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射により投与した。２週間後、８０ｍｇ／ｋｇでさらに１回注射をおこなった。ＣＰＴを、１．７ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、及び１５．０ｍｇ／ｋｇのそれぞれの用量で、３つの処置群に対して与え、１日１回、腹注により投与した。処置は、合計１０回の注射に及んだ。
【００３８】
実験結果を表４及び表５ならびに図３及び図５に示す。ヌードマウスに移植された腫瘍（ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０）の成長に対する著しい阻害効果をＣＰＴが示したことが分かる。３つの処置群について体重により計算した腫瘍阻害率は、それぞれ５２．２％、７４．５％、及び８７．０％であった。対照群と比較して、処置群の腫瘍重量は、有意又は相当有意な統計差を示した。５．０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの群についての相対腫瘍成長率（％）の値は、＜６０であった。相対腫瘍用量（ＲＴＶ）は、対照群のものと比較して統計学的に有意な差があった。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
組織病理学的試験の結果を図４−１から図４−６に示した。図４−１、図４−３、及び図４−５は、ネガティブコントロールのものであった。図４−１は、腫瘍組織が広がり、束のようになっていることを示した。大きな液化性のネクローシスが腫瘍の中心部分にあった。腫瘍は、薄い結合組織膜によって囲まれ、またリンパ球によってあまり浸潤されていなかった。図４−３は、腫瘍細胞が固まった束のような構造及び綱のような構造に配置されることを示した。腫瘍組織は、毛細血管が多く、リンパ球による浸透はおこらなかった。図４−５は、腫瘍細胞は円形又は多角であり、大きな核を有し、細胞質が少ししかないことを示した。クロマチンの凝縮状態はルーズであり、核小体が明瞭であって、２ないし３の核小体があるなど、細胞分裂を示す複数の兆候を示した。図４−２、図４−４、及び図４−６は、１５ｍｇ／ｋｇのＣＰＴにより処置された群に関するものであった。図４−２は、腫瘍組織が固まった束であり、シート状のネクローシスが中心部に現れたことを示した。腫瘍には非常に増殖した結合組織が存在し、又は腫瘍の周りに薄い結合組織包膜が存在した。腫瘍は、リンパ球による浸潤が不十分であった。図４−４では、腫瘍細胞が綱状構造に配置された。腫瘍組織は毛細血管が少なく、中央部分にネクローシスが現れていた。腫瘍組織は結合組織包膜によって囲まれ、わずかなリンパ球が浸透した。図４−６は、腫瘍細胞は円形又は多角であり、大きな核小体を有し、細胞質が少ししかないことを示した。クロマチンの凝縮状態はルーズであり、さらに細胞分裂の兆候を有した。腫瘍は、ほとんど毛細血管を持たず、多数の点状の小さなネクローシスの塊があった。
【００４２】
本発明の医薬品がヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に対して強い阻害効果を有していることが明らかである。
【００４３】
＜３．ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５の成長に対する阻害効果＞
注射用ヒドロキシカンプトセシン（商品名：喜素、Ｗｕｈａｎ Ｌｉｓｈｉｚｈｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、ならびにＨｕａｎｇｓｈｉ Ｌｉｓｈｉｚｈｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｇｒｏｕｐ、中華人民共和国）をポジティブコントロールとして用い、１日１回、１ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射により投与した。連続１５日間にわたる投与後に、投与を止めた。腫瘍の成長が著しいことが観察され、そのため、ヒドロキシカンプトセシンを８日後１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射によりさらに１週間投与した。２週間後、８０ｍｇ／ｋｇのヒドロキシカンプトセシンの１回投与をさらにおこなった。ＣＰＴを１日１回、腹腔内注射で、それぞれ１．７ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、及び１５．０ｍｇ／ｋｇの用量で３つの処置群に与えた。処置は、合計１５回の注射を含んだ。
【００４４】
実験結果を表６及び表７ならびに図６及び図７−１から図７−５に示した。ここで、図７−１はネガティブコントロール、図７−２は１５．０ｍｇ／ｋｇのＣＰＴによる処置群、図７−３は５．０ｍｇ／ｋｇのＣＰＴによる処置群、図７−４は１．７ｍｇ／ｋｇのＣＰＴによる処置群、さらに図７−５はヒドロキシカンプトセシンによるポジティブコントロールについてである。結果は、ヌードマウスでの移植された腫瘍（ヒト大腸菌ＣＯＬＯ２０５）の成長に対する有意な阻害をＣＰＴが表したことを示している。処置５日後に高用量のＣＰＴによって処置された群で、腫瘍のサイズが有意に減少した。いくつかの腫瘍は、投与回数が増すことで、さらに消失した。それらのマウスに対する観察を投与終了後４週間にわたっておこない、動物の１／３に何ら腫瘍は観られなかった。それらのマウスの全体的な解剖学的検査によって、皮膚下の接種のいくつかの徴候のみを見いだした。３つの処置群の重量による腫瘍の阻害率は、それぞれ７９．６％、９０．８％、及び９７．４％であった。対照群と比較して、処置群全ての腫瘍重量は、有意又は相当有意な統計学的差を示した。全ての処置群の相対腫瘍成長率Ｔ／Ｃ（％）値は、＜６０であった。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は、対照群のものと比較して統計学的に非常に有意な差があった。具体的には、高用量のＣＰＴで処置した群のＴ／Ｃ（％）値は＜１０であり、ＣＰＴがこの種の腫瘍に対して高い活性を有することを示している。
【００４５】
【表６】
【００４６】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００４７】
テトラゾリウム還元法（ＭＴＴ）アッセイを用いて、医薬品の抗癌作用を測定した。医薬品の細胞阻害率及び異なる濃度をプロットすることによって用量依存曲線を作り、さらに５０％の阻害率を示す濃度（ＩＣ５０）を計算した。多くのヒト腫瘍細胞株に対する観察は、ＣＰＴ製剤が腫瘍細胞の成長に対してかなり有意な阻害効果を持つことを証明する。ＣＰＴは、ヒト肺癌、大腸癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、神経膠腫、血液細胞癌、膀胱癌、精巣癌、直腸癌、子宮頸癌、及び脳腫瘍細胞を含む１０種類を越える腫瘍細胞に対して、かなり有意な試験管内での致死活性を生ずる。Ｕ２５１（ヒト脳神経膠腫細胞）、ＣＯＬＯ２０５（ヒト大腸癌細胞）、ＭＣＩ−Ｈ４６０（ヒト肺癌細胞）、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト乳癌細胞）に対するＣＰＴの５０％の阻害率を示す濃度（ＩＣ５０）は、＜０．０１μｇ／ｍｌである。ＨＬ−６０（ヒト前骨髄球性白血病細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌細胞）、ＰＣ−３（ヒト脾臓癌細胞）、及びＨ１２５（ヒト肺癌細胞）に対するＣＰＴのＩＣ５０は、＜０．１μｇ／ｍｌである。ＲＰＭＩ８２２６（ヒト多発性ミエローマ細胞）に対するＣＰＴのＩＣ５０は、＜１μｇ／ｍｌである。ＣＰＴはまた、ＳＣＬＣ（ヒト小細胞肺癌細胞）の成長に対してある程度の阻害効果を示す。
【００４８】
生体内実験結果は、１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でＣＰＴの腹腔内投与を１０〜１５日間連続しておこなうことで、ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５、ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０、ヒト神経膠腫Ｕ２５１等を含む腫瘍細胞の成長に対して、かなり有意な阻害効果を表したことを示す。
【００４９】
いずれの医薬品も投与されなかった陰性対照群と比較して、ＣＰＴは動物での腫瘍の成長を有意に遅くすることができ、移植腫瘍の成長初期段間での高用量投与は、腫瘍の容積を減少させるか、腫瘍を消し去ることさえも可能である。ＣＰＴの効果は、明らかに用量依存性である。また、その有効性は、ある程度、処置過程と関連している。ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５を移植されたヌードマウス・モデルでは、たとえ投与を止めてから４週間であっても投与前の腫瘍サイズよりも依然として腫瘍サイズが小さいことが観察された（マウスは１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でＣＰＴ注射を連続１５日間にわたって受けた）。腫瘍の存在は、１／３の動物で接種部位において確認することができず、接種によって生じた徴候のみが解剖学的分析の過程で観察された。
【００５０】
全てのデータは、ＣＰＴの投与がヌードマウスでの移植ヒト腫瘍の成長に対して有意な阻害効果を表したことを示した。対照群と比較して、Ｕ２５１に関しては、腫瘍重量に基づいた１５ｍｇ／ｋｇＣＰＴの阻害率がそれぞれ８７．５％及び８７．７％、ＮＣＩ−Ｈ４６０に関しては、阻害率がそれぞれ８７．０％及び８８．８％、ＣＯＬＯ２０５に関しては、阻害率がそれぞれ９７．４％及び９７．８％であり、統計学的に相当の有意差があることを示した。３つのモデルを用いて、この発明の実験をおこなった。結果は、３つの動物モデルの相対腫瘍体積（ＲＴＶ）がネガティブコントロールのものに対して統計学的な有意差を示し、ここでは動物に対してＣＰＴを１０〜１５日間にわたって５．０ｍｇ／ｋｇの用量で連続的に投与した。１５ｍｇ／ｋｇのＣＰＴによる処置を受けた群に関するデータは、ネガティブコントロールのものと比べて相当の有意差があり、ここでは全てのＴ／Ｃ（％）値が２５未満であり、しばしば１０未満であることもあり、このことはＣＰＴが高い抗腫瘍活性を有すること、また実験が良好な再現性を有することを示した。
【００５１】
ＣＰＴは、動物に対して明らかな副作用又は毒作用をなんら示さなかった。マウスの生存状態に関するパラメータ、例えば処置群の体重及び生存率での有意差は、処置を受けたマウスの腫瘍サイズが小さかったことを除けば、ネガティブコントロールのものとの比較で観察されなかった。上記のことから、ＣＰＴは腫瘍細胞に対して有意な選択的阻害効果を有し、ＣＰＴは正常組織の細胞のアポトーシスを引き起こさないことが示された。したがって、癌を処置するための有効かつ安全な医薬品として、ＣＰＴを使用することが可能である。ＣＰＴは、理論上及び産業上重要であり、その市場に明るい未来を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】異なる処置条件下でのヒト神経膠腫Ｕ２５１の腫瘍体積曲線を示す。
【図２】異なる処置条件下でのヒト神経膠腫Ｕ２５１の腫瘍サイズを示す。
【図３】異なる処置条件下でのヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０の腫瘍体積曲線を示す。
【図４】図４−１から図４−６は、異なる処置条件下でのヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０の組織病理学的切片を示す（ＨＥ染色、１００倍）。
【図５】異なる処置条件下でのヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０の腫瘍サイズを示す。
【図６】異なる処置条件下でのヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５の腫瘍体積曲線を示す。
【図７】図７−１から図７−５は、ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５を接種した後に異なる処置が施されたＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウスを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学及び薬理学の分野に関する。本発明は、組換えタンパク質、そのコード遺伝子、及び活性成分として上記組換えタンパク質を含む遺伝子組換え医薬品に関する。特に、本発明は抗癌作用を有する組換えタンパク質、それをコードする遺伝子、及び活性成分として上記組換えタンパク質を含む癌治療用遺伝子組換え医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
進化の過程で、哺乳類は、個々の細胞のプログラム細胞死を誘導することができるアポトーシスのための一連の情報伝達機構を徐々に確立した。根底をなす理論は、キラー細胞のリガンドが、細胞表面上にあるデスレセプターと相互作用し、細胞のアポトーシスを誘導するというものである。そのような有益なアポトーシスは、免疫応答の終わりにおける活性化されたリンパ球の排除や、ウイルス感染細胞及び腫瘍形成的にトランスフォーメーションした細胞の排除に、重要な生理学的役割を果たす。その例として、ＴＮＦ及び受容体であるＴＮＦＲの相互作用、ならびにＦａｓＬ及び受容体であるＦａｓ／Ａｐｏ１／ＣＤ９５の相互作用が挙げられる。
【０００３】
活性化されたデスレセプターは、細胞アポトーシスのカスケード反応に直接関与する。活性化されたデスレセプターは、種々の癌細胞のアポトーシスを誘導するものであり、潜在的な抗癌因子である。ＴＮＦ及びＦａｓＬは、癌細胞のアポトーシスを誘導することが可能ではあるけれども、それらは著しい毒性を有しており、抗癌療法で副作用を生じさせる。ＴＮＦの注射は、敗血症性ショックに類似の致命的な炎症反応をもたらす。この反応は、血管内皮細胞及びマクロファージ中に位置し、ＴＮＦによって活性化されるＮＦ−κＢ（プレ転写因子）によって、主に媒介される。抗Ｆａｓ抗体は、肝臓組織でのＦａｓ依存型細胞のアポトーシスを誘導し、致命的な肝障害を誘導する。
【０００４】
Ｗｉｌｅｙ他は、１９９５年に、ＴＮＦ及びＦａｓＬとの配列の同一性に基づいてＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を発見した。ＴＲＡＩＬは、デスレセプターＤＲ４又はＤＲ５と相互作用することで、アポトーシスを誘導する。ＴＮＦ及びＦａｓＬとは異なり、ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡは、多くの正常なヒト組織で構成的に発現している。このことは、ＴＲＡＩＬが正常細胞には影響を与えずに癌細胞のアポトーシスを誘導する生理学的機構を示唆する。これらのメカニズムとして、リガンドとの結合を巡ってＤＲ４及びＤＲ５と拮抗する抑制性受容体の発現、３種類の受容体ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、及びＤＰＧとＴＲＡＩＬとの相互作用能が挙げられる。したがって、ＴＲＡＩＬの毒性は、ＴＮＦ及びＦａｓＬよりも低い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗癌作用を有する組換えタンパク質と、該組換えタンパク質を有効成分として含み、癌を効果的に治療する医薬品とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にもとづく抗癌作用を有する組換えタンパク質は、
（１）配列表に示される配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と、
（２）配列番号２との配列相同性が９０％を超え、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（３）配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（４）配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（５）配列番号２のアミノ酸配列にある１残基又は数残基のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
からなる群から選択されるものである。
【０００７】
配列表に示される配列番号２のタンパク質は、１６６残基のアミノ酸残基からなるヒト組換え環状置換ＴＲＡＩＬ（ＣＰＴ；ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔｅｄ ＴＲＡＩＬ）である。
【０００８】
本発明によって提供される癌治療用医薬品の有効成分（ＣＰＴ）は、上述したタンパク質の一つである。
【０００９】
必要に応じて、一種類以上の医薬的に許容される担体を上記医薬品に添加することが可能である。担体として、医薬の分野で一般に用いられる希釈剤、賦形剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸着剤担体、及び潤滑剤が挙げられる。必要に応じて、香料及び甘味料等も添加してもよい。
【００１０】
本発明にもとづく医薬品を種々の形態に製剤化することが可能であり、該形態として注射剤、錠剤、粉末、顆粒、カプセル、経口投与流体、軟膏、及びクリームが挙げられる。医薬品の上記調剤形態のいずれも製薬分野で通常用いられる方法によって調製可能である。
【００１１】
本発明によって提供される癌治療用医薬品の有効成分（タンパク質）（ＣＰＴ）のコード配列は、
（１）配列表に示す配列番号１と、
（２）配列表に示す配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、
（３）配列番号１によって定義されるＤＮＡ配列との配列相同性が９０％を超え、かつ配列番号１によってコードされるタンパク質の活性と同等の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、
（４）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、上記配列番号２に由来するタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質の活性と同等の活性を有するタンパク質である、ＤＮＡ配列と、
（５）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、上記配列番号２に由来するタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質の活性と同等の活性を有するタンパク質である、ＤＮＡ配列と、
（６）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、上記配列番号２に由来するタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列にある１残基又は数残基のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質の活性と同等の活性を有するタンパク質である、ＤＮＡ配列と、
からなる群から選択されるものである。
【００１２】
配列表にある配列番号１は、５０１塩基対からなる。そのリーディング・フレームは、５’末端側からヌクレオチド１〜４９８である。
【００１３】
本発明の遺伝子を含む発現ベクター及び細胞株（例えば、大腸菌及び酵母発現系）は、本発明の範囲内である。
【実施例１】
【００１４】
＜ヒト組換え環状置換ＴＲＡＩＬをコードする遺伝子の構築及び発現＞
ヒトＴＲＡＩＬの１２１残基から２８１残基にあるアミノ酸残基をコードする、遺伝子配列を、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーから得た。ヒトＴＲＡＩＬの１２１残基〜２８１残基のアミノ酸残基をコードする遺伝子を、ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をテンプレートとして用いて、通常行われるＰＣＲ法によって生成した。つぎに、ＴＲＡＩＬのアミノ酸残基１２２残基〜１３５残基をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲ法によってＴＲＩＬの１３５〜３８１位にあるアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列の３’末端と結合させた。アミノ酸残基１３５残基〜２８１残基をコードするＤＮＡ配列とＴＲＡＩＬのアミノ酸残基１２２〜１３５をコードするＤＮＡ配列との間に、５個のグリシン残基をコードするＤＮＡ配列を挿入した。グリシンの柔軟性により、タンパク質の折り畳みを容易にすることができる。このようにして得られるＣＰＴコード遺伝子を、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩを用いてベクタープラスミドｐｅｔ２８ｂ（又は他のベクター）に連結して、発現ベクターとした。そのＤＮＡ配列は、塩基配列決定によって正しいことが確認された。
【００１５】
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換された大腸菌を、２０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種した。細胞を３７℃で１２時間にわたり振とう機上でインキュベートした。つぎに、１Ｌの２０μｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢ液体培地に１０ｍｌの培地を接種して、さらに培養を続けた。ＯＤ６００が０．６に達した時に、０．２ｍｌの１Ｍ ＩＰＴＧを１Ｌの培地に加えてタンパク質発現を誘導した。発現誘導を３時間おこなった後、遠心により細胞を回収した。ペレットを、１００ｍＭトリス（ｐＨ７．９）及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍｌの緩衝液に、懸濁した。
【００１６】
細胞を４℃の超音波処理で溶菌させ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ２０ローターを用いて１５，０００ｒｐｍで遠心した。発現タンパク質が金属キレート樹脂と結合可能であることから、金属キレート・クロマトグラフィーを用いて発現タンパク質の精製をおこなうことができる。遠心後、上清を固定化Ｎｉ２＋キレート・クロマトグラフィー・カラムに投入した。このカラムを、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．９）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、及び２００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液によって洗浄し、このカラムに吸着した夾雑タンパク質を除去した。つぎに、結合タンパク質を、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．９）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液によって溶出させた。溶出タンパク質をＰＢＳ緩衝液で透析した。
【００１７】
最後に、タンパク質を、ＡＫＴＡ・ＨＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に設置されたイオン交換カラム及びゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）によって精製した。タンパク質の分析は、そのようにして得られたタンパク質が本発明の抗癌作用を有する医薬品である配列番号２のアミノ酸配列を有することを示した。最終産物は、白色粉末であり、また水溶性であった。
【実施例２】
【００１８】
＜テトラゾリウム還元法（ＭＴＴ）を用いた癌細胞に対する本発明の医薬品の細胞毒性効果の測定＞
試薬：ＲＰＭ１６４０は、ＧＩＢＣＯ社から入手。ＭＴＴはＢｅｎｃｏ社から入手。ウシ胎児血清は、杭州四季青生物工程材料有限公司（中華人民共和国）から購入。
【００１９】
細胞株：ＣＯＬＯ２０５（ヒト大腸癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ヒト肺癌細胞）、ＲＰＭＩ８２２６（ヒト多発性骨髄腫細胞）、及びＵ２５１（ヒト脳神経膠腫細胞）は、米国ＡＴＣＣ社から入手。ＨＬ−６０（ヒト前骨髄性白血病細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト乳癌細胞）、ＳＣＬＣ（ヒト小細胞肺癌細胞）、Ｈ１２５（ヒト肺癌細胞）、及びＰＣ−３（ヒト膵臓癌細胞）。
【００２０】
発育が良い腫瘍細胞を集め、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地による細胞懸濁液（１×１０４／ｍｌ）を調製した。細胞懸濁液を９６穴プレートに接種して、各穴あたり１００μｌ（１，０００個の腫瘍細胞を含む）とした。３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間にわたってプレートを培養した後、医薬品を添加した。
【００２１】
ブランクコントロールと５−フルオロウラシル又はアドリアマイシンを用いたポジティブコントロールとを実験で採用した。ＣＰＴ試料の濃度を５通りにして、各濃度に対して３穴を対応させた。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２であるインキュベータで４日間にわたって培養した。次に、培地を取り除き、１００μｌのＭＴＴ溶液（ＲＰＭＩ−１６４０中、０．４ｍｇ／ｍｌ）を各穴に添加した。プレートをさらに４時間にわたって３７℃でインキュベートした。
【００２２】
上清を捨てた。フォマザン（Ｆｏｍａｚａｎ）粒状物を可溶化するために、１５０μｌのＤＭＳＯを各穴に添加した。穏やかに振とう後、ＯＤ値をＢＩＯＲＡＤ ５５０ ｅｎｚｙｍｅ ａｎａｌｙｚｅｒによって、検出波長を５４０ｎｍ、また参照波長を４５０ｎｍとして測定した。
【００２３】
用量反応曲線は、医薬品の細胞阻害率及び異なる濃度をプロットすることで得られ、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。結果を図１に示した。ヒト腫瘍細胞Ｕ２５１、ＣＯＬＯ２０５、ＮＣＩ−Ｈ４６０、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５に対して、ＣＰＴが非常に強い致死効果を有することがわかった（ＩＣ５０＜０．０１μｇ／ｍｌ）。ＣＰＴはまた、ＨＬ−６０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ−３、及びＨＬ１２５細胞に対して相当に強い致死効果を有する（ＩＣ５０＜０．１μｇ／ｍｌ）。ＣＰＴは、ＲＰＭＩ８２２６細胞に対して良好な効果を有する（ＩＣ５０＜１μｇ／ｍｌ）。また、それはＳＣＬＣ細胞の成長に対するある程度の阻害効果も示す。癌細胞のアポトーシスを誘導するＣＰＴの活性は、野生型ＴＲＡＩＬのものよりも６から１１倍強い。
【００２４】
【表１】
【実施例３】
【００２５】
＜ヌードマウスへのヒト癌異種移植片の増殖に対する本発明の医薬品の阻害効果＞
この実施例では、使用した動物はＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス、６〜８週齢であった。各々の実験に対して、全ての動物の性を同一にした。
【００２６】
腫瘍細胞株：ヒト脳神経膠腫Ｕ２５１、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０、ヒト大腸癌細胞株ＣＯＬＯ２０５を試験管内での培養からヌードマウスへ皮下接種し、腫瘍を二次培養して維持した。
【００２７】
実験手順：発育が良い腫瘍を担持する発育が良いヌードマウスを選択し、頚椎脱臼により安楽死させた。腫瘍を無菌的に取り出し、メスによって直径２〜３ｍｍの断片に切り刻んだ。この断片を、針を用いてヌードマウスの腋窩に皮下接種した。腫瘍を、約７〜１０日後、動物の腋窩に見出すことができた。腫瘍の長さ及び幅を副尺付きカリパスで測定した。つぎに、腫瘍サイズに基づいて動物のグループ分けをおこなった。各々の群は７から８匹の動物を含んだ。
【００２８】
腫瘍の長さ及び幅とマウスの体重とを週２回測定した。腫瘍体積（ＴＶ）及び相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を計算した。腫瘍サイズの変化を示すグラフをプロットした。この実験の最後に、マウスを安楽死させた後、腫瘍を取り出して重さを計り、腫瘍成長に対する医薬品の阻害率を計算した。
【００２９】
腫瘍体積（ＴＶ）を計算するための式は、
【数１】
である。
【００３０】
相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を計算するための式は、
【数２】
（式中、Ｖｏは投与開始時に測定されたＴＶ値であり、Ｖｔはその後に測定されたＴＶ値である）である。
【００３１】
Ｔ検定を用いて、異なる動物群間の腫瘍重量、腫瘍体積、ＲＴＶ等の統計学的差を測定した。抗腫瘍活性を評価するために用いた指標は、相対腫瘍成長率Ｔ／Ｃ（％）であり、その式は：
【数３】
である。
【００３２】
効率に関する評価基準は、
Ｔ／Ｃ（％）＞６０は、効果がない。
統計分析後のＴ／Ｃ（％）≦６０及びＰ＜０．０５は、有効である。
【００３３】
＜１．ヒト脳神経膠腫Ｕ２５１に対する阻害効果＞
カルムスチン（Ｒｅｎｍｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｉｎｃ．、天津、中華人民共和国）をポジティブコントロールとして用い、腹腔内注射によって一度だけ４０ｍｇ／ｋｇ投与した。ＣＰＴを、０．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内注射により、４つの群に投与した。処置では１０回の注射を行った。
【００３４】
実験結果を表１及び表２ならびに図１及び図２に示す。ヌードマウスに移植された腫瘍（ヒト脳神経膠腫Ｕ２５１）の成長に対する著しい阻害効果をＣＰＴが示したことが分かる。４つの処置群について体重により計算した腫瘍阻害率は、それぞれ３０．５％、４４．５％、６４．８％、及び８７．５％であった。対照群と比較して、処置群の腫瘍重量は、有意又は相当有意な統計差を示した。ＣＰＴの抗腫瘍効果は、有意に用量依存的であった。５．０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの群についての相対腫瘍成長率Ｔ／Ｃ（％）の値は、＜６０であった。１５ｍｇ／ｋｇの群についての相対腫瘍用量（ＲＴＶ）は、対照群のものと比較して統計学的に有意な差があった。
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】
＜２．ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０に対する阻害効果＞
シクロホスファミド（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｕａｌｉａｎ Ｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．、中華人民共和国）をポジティブコントロールとして用い、１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射により投与した。２週間後、８０ｍｇ／ｋｇでさらに１回注射をおこなった。ＣＰＴを、１．７ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、及び１５．０ｍｇ／ｋｇのそれぞれの用量で、３つの処置群に対して与え、１日１回、腹注により投与した。処置は、合計１０回の注射に及んだ。
【００３８】
実験結果を表４及び表５ならびに図３及び図５に示す。ヌードマウスに移植された腫瘍（ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０）の成長に対する著しい阻害効果をＣＰＴが示したことが分かる。３つの処置群について体重により計算した腫瘍阻害率は、それぞれ５２．２％、７４．５％、及び８７．０％であった。対照群と比較して、処置群の腫瘍重量は、有意又は相当有意な統計差を示した。５．０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの群についての相対腫瘍成長率（％）の値は、＜６０であった。相対腫瘍用量（ＲＴＶ）は、対照群のものと比較して統計学的に有意な差があった。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
組織病理学的試験の結果を図４−１から図４−６に示した。図４−１、図４−３、及び図４−５は、ネガティブコントロールのものであった。図４−１は、腫瘍組織が広がり、束のようになっていることを示した。大きな液化性のネクローシスが腫瘍の中心部分にあった。腫瘍は、薄い結合組織膜によって囲まれ、またリンパ球によってあまり浸潤されていなかった。図４−３は、腫瘍細胞が固まった束のような構造及び綱のような構造に配置されることを示した。腫瘍組織は、毛細血管が多く、リンパ球による浸透はおこらなかった。図４−５は、腫瘍細胞は円形又は多角であり、大きな核を有し、細胞質が少ししかないことを示した。クロマチンの凝縮状態はルーズであり、核小体が明瞭であって、２ないし３の核小体があるなど、細胞分裂を示す複数の兆候を示した。図４−２、図４−４、及び図４−６は、１５ｍｇ／ｋｇのＣＰＴにより処置された群に関するものであった。図４−２は、腫瘍組織が固まった束であり、シート状のネクローシスが中心部に現れたことを示した。腫瘍には非常に増殖した結合組織が存在し、又は腫瘍の周りに薄い結合組織包膜が存在した。腫瘍は、リンパ球による浸潤が不十分であった。図４−４では、腫瘍細胞が綱状構造に配置された。腫瘍組織は毛細血管が少なく、中央部分にネクローシスが現れていた。腫瘍組織は結合組織包膜によって囲まれ、わずかなリンパ球が浸透した。図４−６は、腫瘍細胞は円形又は多角であり、大きな核小体を有し、細胞質が少ししかないことを示した。クロマチンの凝縮状態はルーズであり、さらに細胞分裂の兆候を有した。腫瘍は、ほとんど毛細血管を持たず、多数の点状の小さなネクローシスの塊があった。
【００４２】
本発明の医薬品がヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に対して強い阻害効果を有していることが明らかである。
【００４３】
＜３．ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５の成長に対する阻害効果＞
注射用ヒドロキシカンプトセシン（商品名：喜素、Ｗｕｈａｎ Ｌｉｓｈｉｚｈｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、ならびにＨｕａｎｇｓｈｉ Ｌｉｓｈｉｚｈｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｇｒｏｕｐ、中華人民共和国）をポジティブコントロールとして用い、１日１回、１ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射により投与した。連続１５日間にわたる投与後に、投与を止めた。腫瘍の成長が著しいことが観察され、そのため、ヒドロキシカンプトセシンを８日後１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射によりさらに１週間投与した。２週間後、８０ｍｇ／ｋｇのヒドロキシカンプトセシンの１回投与をさらにおこなった。ＣＰＴを１日１回、腹腔内注射で、それぞれ１．７ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、及び１５．０ｍｇ／ｋｇの用量で３つの処置群に与えた。処置は、合計１５回の注射を含んだ。
【００４４】
実験結果を表６及び表７ならびに図６及び図７−１から図７−５に示した。ここで、図７−１はネガティブコントロール、図７−２は１５．０ｍｇ／ｋｇのＣＰＴによる処置群、図７−３は５．０ｍｇ／ｋｇのＣＰＴによる処置群、図７−４は１．７ｍｇ／ｋｇのＣＰＴによる処置群、さらに図７−５はヒドロキシカンプトセシンによるポジティブコントロールについてである。結果は、ヌードマウスでの移植された腫瘍（ヒト大腸菌ＣＯＬＯ２０５）の成長に対する有意な阻害をＣＰＴが表したことを示している。処置５日後に高用量のＣＰＴによって処置された群で、腫瘍のサイズが有意に減少した。いくつかの腫瘍は、投与回数が増すことで、さらに消失した。それらのマウスに対する観察を投与終了後４週間にわたっておこない、動物の１／３に何ら腫瘍は観られなかった。それらのマウスの全体的な解剖学的検査によって、皮膚下の接種のいくつかの徴候のみを見いだした。３つの処置群の重量による腫瘍の阻害率は、それぞれ７９．６％、９０．８％、及び９７．４％であった。対照群と比較して、処置群全ての腫瘍重量は、有意又は相当有意な統計学的差を示した。全ての処置群の相対腫瘍成長率Ｔ／Ｃ（％）値は、＜６０であった。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は、対照群のものと比較して統計学的に非常に有意な差があった。具体的には、高用量のＣＰＴで処置した群のＴ／Ｃ（％）値は＜１０であり、ＣＰＴがこの種の腫瘍に対して高い活性を有することを示している。
【００４５】
【表６】
【００４６】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００４７】
テトラゾリウム還元法（ＭＴＴ）アッセイを用いて、医薬品の抗癌作用を測定した。医薬品の細胞阻害率及び異なる濃度をプロットすることによって用量依存曲線を作り、さらに５０％の阻害率を示す濃度（ＩＣ５０）を計算した。多くのヒト腫瘍細胞株に対する観察は、ＣＰＴ製剤が腫瘍細胞の成長に対してかなり有意な阻害効果を持つことを証明する。ＣＰＴは、ヒト肺癌、大腸癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、神経膠腫、血液細胞癌、膀胱癌、精巣癌、直腸癌、子宮頸癌、及び脳腫瘍細胞を含む１０種類を越える腫瘍細胞に対して、かなり有意な試験管内での致死活性を生ずる。Ｕ２５１（ヒト脳神経膠腫細胞）、ＣＯＬＯ２０５（ヒト大腸癌細胞）、ＭＣＩ−Ｈ４６０（ヒト肺癌細胞）、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト乳癌細胞）に対するＣＰＴの５０％の阻害率を示す濃度（ＩＣ５０）は、＜０．０１μｇ／ｍｌである。ＨＬ−６０（ヒト前骨髄球性白血病細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌細胞）、ＰＣ−３（ヒト脾臓癌細胞）、及びＨ１２５（ヒト肺癌細胞）に対するＣＰＴのＩＣ５０は、＜０．１μｇ／ｍｌである。ＲＰＭＩ８２２６（ヒト多発性ミエローマ細胞）に対するＣＰＴのＩＣ５０は、＜１μｇ／ｍｌである。ＣＰＴはまた、ＳＣＬＣ（ヒト小細胞肺癌細胞）の成長に対してある程度の阻害効果を示す。
【００４８】
生体内実験結果は、１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でＣＰＴの腹腔内投与を１０〜１５日間連続しておこなうことで、ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５、ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０、ヒト神経膠腫Ｕ２５１等を含む腫瘍細胞の成長に対して、かなり有意な阻害効果を表したことを示す。
【００４９】
いずれの医薬品も投与されなかった陰性対照群と比較して、ＣＰＴは動物での腫瘍の成長を有意に遅くすることができ、移植腫瘍の成長初期段間での高用量投与は、腫瘍の容積を減少させるか、腫瘍を消し去ることさえも可能である。ＣＰＴの効果は、明らかに用量依存性である。また、その有効性は、ある程度、処置過程と関連している。ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５を移植されたヌードマウス・モデルでは、たとえ投与を止めてから４週間であっても投与前の腫瘍サイズよりも依然として腫瘍サイズが小さいことが観察された（マウスは１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でＣＰＴ注射を連続１５日間にわたって受けた）。腫瘍の存在は、１／３の動物で接種部位において確認することができず、接種によって生じた徴候のみが解剖学的分析の過程で観察された。
【００５０】
全てのデータは、ＣＰＴの投与がヌードマウスでの移植ヒト腫瘍の成長に対して有意な阻害効果を表したことを示した。対照群と比較して、Ｕ２５１に関しては、腫瘍重量に基づいた１５ｍｇ／ｋｇＣＰＴの阻害率がそれぞれ８７．５％及び８７．７％、ＮＣＩ−Ｈ４６０に関しては、阻害率がそれぞれ８７．０％及び８８．８％、ＣＯＬＯ２０５に関しては、阻害率がそれぞれ９７．４％及び９７．８％であり、統計学的に相当の有意差があることを示した。３つのモデルを用いて、この発明の実験をおこなった。結果は、３つの動物モデルの相対腫瘍体積（ＲＴＶ）がネガティブコントロールのものに対して統計学的な有意差を示し、ここでは動物に対してＣＰＴを１０〜１５日間にわたって５．０ｍｇ／ｋｇの用量で連続的に投与した。１５ｍｇ／ｋｇのＣＰＴによる処置を受けた群に関するデータは、ネガティブコントロールのものと比べて相当の有意差があり、ここでは全てのＴ／Ｃ（％）値が２５未満であり、しばしば１０未満であることもあり、このことはＣＰＴが高い抗腫瘍活性を有すること、また実験が良好な再現性を有することを示した。
【００５１】
ＣＰＴは、動物に対して明らかな副作用又は毒作用をなんら示さなかった。マウスの生存状態に関するパラメータ、例えば処置群の体重及び生存率での有意差は、処置を受けたマウスの腫瘍サイズが小さかったことを除けば、ネガティブコントロールのものとの比較で観察されなかった。上記のことから、ＣＰＴは腫瘍細胞に対して有意な選択的阻害効果を有し、ＣＰＴは正常組織の細胞のアポトーシスを引き起こさないことが示された。したがって、癌を処置するための有効かつ安全な医薬品として、ＣＰＴを使用することが可能である。ＣＰＴは、理論上及び産業上重要であり、その市場に明るい未来を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】異なる処置条件下でのヒト神経膠腫Ｕ２５１の腫瘍体積曲線を示す。
【図２】異なる処置条件下でのヒト神経膠腫Ｕ２５１の腫瘍サイズを示す。
【図３】異なる処置条件下でのヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０の腫瘍体積曲線を示す。
【図４】図４−１から図４−６は、異なる処置条件下でのヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０の組織病理学的切片を示す（ＨＥ染色、１００倍）。
【図５】異なる処置条件下でのヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０の腫瘍サイズを示す。
【図６】異なる処置条件下でのヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５の腫瘍体積曲線を示す。
【図７】図７−１から図７−５は、ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５を接種した後に異なる処置が施されたＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウスを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌作用を持つ組換えタンパク質であって、
（１）配列表に示す配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と、
（２）配列番号２との配列相同性が９０％を超え、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（３）配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（４）配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（５）配列番号２のアミノ酸配列にある１残基又は数残基のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、からなる群から選択される組換えタンパク質である、抗癌作用を持つ組換えタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が配列表に示す配列番号２である、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
抗癌作用を持つ組換えタンパク質をコードする遺伝子であって、
（１）配列表に示す配列番号１と、
（２）配列表に示す配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、
（３）配列番号１によって定義されるＤＮＡ配列との配列相同性が９０％を超え、かつ配列番号１によってコードされるタンパク質と同等の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、
（４）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、配列番号２に由来する前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質と同等の活性を有するＤＮＡ配列と、
（５）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、配列番号２に由来する前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質と同等の活性を有するＤＮＡ配列と、
（６）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、配列番号２に由来する前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列にある１残基又は数残基のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質と同等の活性を有するＤＮＡ配列と、からなる群から選択される遺伝子である、抗癌作用を持つ組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
前記遺伝子が配列表に示す配列番号１である、請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項１に記載の組換えタンパク質を活性成分として含む、癌を治療するための医薬品。
【請求項６】
前記タンパク質が配列表に示す配列番号２である、請求項５に記載の医薬品。
【請求項７】
ヒトに許容される薬学的に許容できる担体をさらに含む、請求項５又は６に記載の医薬品。
【請求項８】
請求項４に記載の遺伝子を含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項４に記載の遺伝子を含む、細胞株。
【請求項１０】
癌を治療するための医薬品に用いる、請求項１に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項１１】
癌を治療するための医薬品に用いる、請求項２に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項１】
抗癌作用を持つ組換えタンパク質であって、
（１）配列表に示す配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と、
（２）配列番号２との配列相同性が９０％を超え、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（３）配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（４）配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、
（５）配列番号２のアミノ酸配列にある１残基又は数残基のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって得られ、かつ配列番号２の活性と同等の活性を有する、配列番号２に由来するタンパク質と、からなる群から選択される組換えタンパク質である、抗癌作用を持つ組換えタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が配列表に示す配列番号２である、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
抗癌作用を持つ組換えタンパク質をコードする遺伝子であって、
（１）配列表に示す配列番号１と、
（２）配列表に示す配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、
（３）配列番号１によって定義されるＤＮＡ配列との配列相同性が９０％を超え、かつ配列番号１によってコードされるタンパク質と同等の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、
（４）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、配列番号２に由来する前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質と同等の活性を有するＤＮＡ配列と、
（５）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、配列番号２に由来する前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端での１５残基以下のアミノ酸残基の付加又は欠失によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質と同等の活性を有するＤＮＡ配列と、
（６）配列番号２に由来するタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、配列番号２に由来する前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列にある１残基又は数残基のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加によって得られ、かつ配列番号２によってコードされるタンパク質と同等の活性を有するＤＮＡ配列と、からなる群から選択される遺伝子である、抗癌作用を持つ組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
前記遺伝子が配列表に示す配列番号１である、請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項１に記載の組換えタンパク質を活性成分として含む、癌を治療するための医薬品。
【請求項６】
前記タンパク質が配列表に示す配列番号２である、請求項５に記載の医薬品。
【請求項７】
ヒトに許容される薬学的に許容できる担体をさらに含む、請求項５又は６に記載の医薬品。
【請求項８】
請求項４に記載の遺伝子を含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項４に記載の遺伝子を含む、細胞株。
【請求項１０】
癌を治療するための医薬品に用いる、請求項１に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項１１】
癌を治療するための医薬品に用いる、請求項２に記載の組換えタンパク質の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５３６８９１（Ｐ２００７−５３６８９１Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１００８６（Ｐ２００５−５１００８６）
【出願日】平成１５年１１月３日（２００３．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００３／０００９２８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４２７４４
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０６１５２８２９）北京沙東生物技術有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月３日（２００３．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００３／０００９２８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４２７４４
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５０６１５２８２９）北京沙東生物技術有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
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