抗癌剤に対する癌細胞の感受性を検定する方法
癌患者から生検等により採取した癌細胞に発現している分子を調べることにより、本化合物に対する癌細胞の感受性を調べることができれば、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者のみに、本化合物を投与することが可能となり、治療効果を高め不要な副作用を軽減できることが期待された。詳しくは、「ｐＲＢ低発現」「ｐ１６発現陽性」「ｃｙｃｌｉｎＥ高発現」という特徴が、癌細胞の本化合物に対する高感受性のマーカーとして有用であることが明らかとなり、癌細胞のこれら性質を調べることにより、本化合物に対する癌細胞の感受性を予め調べることが可能となった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、抗癌剤として有用な式（Ｉ）の一般式で表される化合物（以下、本化合物と称す）に対する癌細胞の感受性を予測するための検定方法に関する。
【背景技術】
従来の癌化学療法においては、臓器癌種毎に効果の立証されている抗癌剤を、単剤またはそれらの併用で行ってきた。また、近年の盛んに行われている大規模な無作為比較試験を通して、特定の癌種においては標準治療が確立されている。しかしながら、これらの治療において達成される奏効率は、概して２０〜５０％程度であり、半数以上の患者においては治療効果を享受できないにも関わらず、副作用の危険性を伴う化学療法を施行するという状況である（ＪＡＣＲ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｎｏ．７，１０−１９，２００２）。
抗癌剤が効く患者と効かない患者を選別しようという試みは、従来から「薬剤感受性試験」という方法が試されてきた。抗癌剤感受性試験にはＳＤＩ法（Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８５：７６２−７６５，１９９４）、ＣＤ−ＤＳＴ法（Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９２：２０３−２１０，２００１）、ＨＤＲＡ法（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：３０５−３１１，１９９５）などがあり、いずれも患者から癌細胞を採り、抗癌剤を接触させて抗癌剤に対する感受性を調べる方法であることで共通している。しかしながら、これらの方法は、癌細胞を試験管内で生存させておく必要があることや、更に検査結果と臨床効果が必ずしも一致しないという問題などがあり、実施率も０．５％程度にとどまっている（制癌剤適応研究会集計アンケート１９９６）。
癌細胞に特異的な分子を標的とした分子標的薬剤の中には、ハーセプチンテストなどのように分子診断によって薬剤に対する感受性を予測することに成功している例も報告されている（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：１６６９−１６７５，２００１）。しかしながら、その他の薬剤においては単独の標的分子のみでは感受性を予測出来ず、複数の分子が感受性を規定している場合が多いと考えられている（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２４：２３６−２４４，２０００）。近年発展したｃＤＮＡマイクロアレイ技術は超多量遺伝子の発現解析を可能とし、感受性規定因子の包括的解析を可能にした。例えば、慢性骨髄性白血病治療薬のグリーベックの場合は、１５〜３０の遺伝子群の発現解析により治療効果の予測可能であることが、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析の結果から提唱されている（Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９３：８４９−５６，２００２）。
今後の癌化学療法で用いられる抗癌剤の開発は、治療前にその感受性を調べる診断法と組み合わせた提供を目指すべきであり、分子診断を可能にするためには開発する薬剤への感受性を予測できる分子を見出すことが重要となる。
【発明の開示】
本発明者らはＷＯ ０２／０６０８９０、ＷＯ ０３／０９９８１３及びＷＯ ０４／０１１６６１において、本化合物が、ヒト乳癌細胞株（ＢＳＹ−１）に対し極めて強い抗腫瘍効果を発現し、ヒト大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）に対しても強い抗腫瘍効果を発現することを見出した。
一方で、本化合物は小細胞性肺癌細胞株（Ｃａｌｕ−１）に対しては、上述した癌細胞株と比べて効果が弱いことを見出し、本化合物の抗腫瘍効果が、癌細胞により異なることが明らかとなった。
癌細胞の本化合物に対する感受性と関連する分子を明らかにし、生検等により癌患者から採取した癌細胞で、それら分子の発現を調べることにより、本化合物に対する癌細胞の感受性を予測することができれば、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者のみに、本化合物を投与することが可能となり、治療効果を高め不要な副作用を軽減できることが期待される。
本化合物に対する感受性の高いＢＳＹ−１株の分子的特徴を探索するにあたり、本発明者らは乳癌や肺癌において破綻していることが提唱されている細胞周期のＧ１／Ｓ移行を制御する分子群に着目した。癌抑制遺伝子であるｐ１６とｐＲＢ、及びそれらと拮抗する、またはそれらを負に制御するｃｙｃｌｉｎ Ｄ１とｃｙｃｌｉｎ Ｅの４分子に関して、蛋白質発現量を調べたところ、ＢＳＹ−１株にはｐＲＢの発現減少、ｐ１６発現陽性、ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という分子的特徴があることを見出した。
ＢＳＹ−１株、ＷｉＤｒ株及びＣａｌｕ−１株を含むヒト癌細胞株２５株について、ｐＲＢの発現減少若しくは変異（以下ｐＲＢ低発現と称す）、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べ、これら癌細胞を移植したマウスを用いて本化合物の抗腫瘍効果を比較検討したところ、これら特徴を一つでも有していたヒト癌細胞株の多くが本化合物に対する高い感受性を示したのに対し、有していない癌細胞株のほとんどは低感受性であった。
特にｐＲＢ低発現及びｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の特徴を有する７株、ｐ１６発現陽性及びｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の特徴を有する６株のうち、４株は本化合物投与により完全な腫瘍の消失を示し、１株は消失はしないまでも長期間にわたる腫瘍縮小の継続を示した。
癌細胞のｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べることにより、当該癌細胞の本化合物に対する感受性を予測できることが明らかとなり、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下に関する。
１．１）ｐＲＢの発現が減少している、
２）ｐ１６が発現している、
３）ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、
４）ｐＲＢの発現が減少しかつｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、または
５）ｐ１６が発現しかつｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、の何れか一つを指標とする、下記一般式１で表される化合物に対する癌細胞の感受性を検定する方法。
式（Ｉ）
［式中、Ｒ１は
１）水素原子または
２）水酸基
Ｒ３は
１）水素原子、
２）水酸基または
３）Ｃ１−６アルコキシ基
Ｒ２は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
４）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基
５）式（ＩＩ）
［式中、
Ａ）
ｎは０ないし４の整数、
Ｘは
ｉ）−ＣＨＲＮ４−、
ｉｉ）−ＮＲＮ５−または
ｉｉｉ）−Ｏ−、
ＲＮ１及びＲＮ２は同一または異なって、
ｉ）水素原子または
ｉｉ）Ｃ１−６アルキル基、
ＲＮ３及びＲＮ４は同一または異なって、
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
ｉｖ）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
ｖ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｖｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖｉｉ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
ｖｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
ｉｘ）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
ｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
ｘｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ｘｉｉ）−ＮＲＮ６ＲＮ７（ここにおいて、ＲＮ６およびＲＮ７は同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
ｘｉｉｉ）ＲＮ３及びＲＮ４が一緒になって結合する炭素原子と共に形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基（該非芳香族複素環式基は置換基を有していても良い）、
ＲＮ５は
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
ｉｖ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｖ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖｉ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
ｖｉｉ）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
ｖｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
ｉｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
ｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基または
ｘｉ）ＲＮ３及びＲＮ５が一緒になって結合する窒素原子と共に形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基（該非芳香族複素環式基は置換基を有していても良い）、
Ｂ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ３、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ１及びＲＮ２は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
Ｃ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ２、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ１及びＲＮ３は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基あるいは
Ｄ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ１、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ２及びＲＮ３は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
または
６）式（ＩＩＩ）
［式中、ＲＮ８及びＲＮ９は同一または異なって、
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｉｖ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基または
ｖｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基を表す］
を表す］
２．Ｒ２が
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基または
４）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基である１に記載の検定方法。
３．Ｒ２が下記式（ＩＶ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＩＶ）
［式中、ｎは０ないし４の整数、
ＲａＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲａＮ２は
１）水素原子
２）Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、
３）Ｎ，Ｎ−ジＣ１−６アルキルアミノ基、
４）エチルメチルアミノ基、
５）ピリジル基、
６）ピロリジン−１−イル基、
７）ピペリジン−１−イル基、
８）モルホリン−４−イル基または
９）４−メチルピペラジン−１−イル基を表す］
４．Ｒ２が下記式（Ｖ）で表される１に記載の検定方法。
式（Ｖ）
（式中、ｎ１及びｎ２は同一または異なって、０ないし４の整数、
Ｘｂは
１）−ＣＨＲｂＮ４−、
２）−ＮＲｂＮ５−または
３）−Ｏ−、
ＲｂＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｂＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｂＮ４は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
１１）−ＮＲｂＮ６ＲｂＮ７（ここにおいて、ＲｂＮ６およびＲｂＮ７は、同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
１２）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ＲｂＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
５）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
６）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
７）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
９）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
５．Ｒ２が下記式（ＶＩ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＶＩ）
［式中、ｎ３は１または２の整数、
ＲｃＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｃＮ５は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基を表す］
６．Ｒ２が下記式（ＶＩＩ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＶＩＩ）
（式中、ｎ１及びｎ２は同一または異なって、０ないし４の整数、
Ｘｄは
１）−ＣＨＲｄＮ４−、
２）−ＮＲｄＮ５−または
３）−Ｏ−、
ＲｄＮ２は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｄＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｄＮ４は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
１１）−ＮＲｄＮ６ＲｄＮ７（ここにおいて、ＲｄＮ６及びＲｄＮ７は同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
１２）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ＲｄＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
５）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
６）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
７）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
９）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
７．Ｒ２が下記式（ＶＩＩ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＶＩＩＩ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｅＮ４は
１）アミノ基、
２）Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、
３）ピロリジン−１−イル基、
４）ピペリジン−１−イル基または
５）モルホリン−４−イル基を表す］
８．Ｒ２が下記式（ＩＸ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＩＸ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｆＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｆＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
４）置換基を有していても良い３ないし８員環非芳香族複素環式基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良い５員環ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基を表す］
９．Ｒ２が下記式（Ｘ）で表される１に記載の検定方法。
式（Ｘ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｇＮ５は
１）水素原子、
２）置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、
３）置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、
４）置換されていてもよいＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
５）置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、
６）置換されていてもよいピリジル基または
７）置換されていてもよいテトラヒドロピラニル基を表す］
１０．一般式（Ｉ）で表される化合物が下記化合物の何れか一つの化合物である、１に記載の検定方法。
１）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−アセトキシ−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
２）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド、
３）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−７−（（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド及び
４）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
１１．ｐＲＢの発現の減少、ｐ１６の発現、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現の増強を、それぞれをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検定する、１に記載の検定方法。
１２．ｍＲＮＡ量を測定する方法が定量的ＲＴ−ＰＣＲ法である、１１に記載の検定方法。
１３．ｍＲＮＡ量を測定する方法がＤＮＡチップ法である、１１に記載の検定方法。
１４．ｐＲＢの発現の減少、ｐ１６の発現、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現の増強を、それぞれの蛋白質量を測定することにより検定する、１に記載の検定方法。
１５．蛋白質量を測定する方法がウエスタンブロット法である、１４に記載の検定方法。
１６．蛋白質量を測定する方法が免疫組織染色法である、１４に記載の検定方法。
１７．蛋白質量を測定する方法がＥＬＩＳＡ法である、１４に記載の検定方法。
１８．ｐＲＢ、ｐ１６またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ遺伝子の連続した少なくとも１５塩基の配列から成るプライマーを含んで成る、１２の検定方法に使用するキット。
１９．ｐＲＢ、ｐ１６またはｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する抗体を含んで成る、１５、１６または１７に記載の検定方法に使用するキット。
癌細胞のｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べることにより、癌細胞の本化合物に対する感受性を予め予見することが可能となり、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者のみに、本化合物を投与することが可能なった。治療効果を高め不要な副作用を軽減できることが期待された。
【発明を実施するための最良の形態】
本明細書中でｐＲＢとは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ０００３２１に記載の塩基配列でコードされる分子量約１１０ＫＤａの蛋白質である。ｐＲＢをコードするＲＢ遺伝子は、網膜芽細胞腫で変異を起こしている癌抑制遺伝子として単離され（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９０５９−９０６３，１９８７）、その後種々の悪性細胞での変異が確認されている。
ｐ１６とは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＨＭ００００７７に記載の塩基配列でコードされる分子量約１６ＫＤａの蛋白質である。ｐ１６は、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６と結合し、ＣＤＫ４／６によるｐＲＢのリン酸化を抑制してｐＲＢ活性保持に寄与している（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：４３６−４４０，１９９４）。
ｃｙｃｌｉｎ Ｅとは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７４０９３に記載の塩基配列でコードされる分子量約５２ＫＤａの蛋白質である。細胞周期のＧ１／Ｓ移行時に一過的に発現量が上昇することで細胞周期進行に中心的役割を果たしているが、癌化に伴って発現量の絶対量の上昇及び一過的上昇のパターンの破綻が報告されている（Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０４：３６９−７５，２００３）。
また、ｐ１６とｐＲＢの発現量の逆相関関係は多くの癌種において報告されていることから、ｐ１６の発現陽性とｐＲＢの低発現は同一の事象に起因していると考えられる（ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５０３−５１１，１９９５）。
本化合物は、ＷＯ ０２／０６０８９０、ＷＯ ０３／０９９８１３及びＷＯ ０４／０１１６６１に記載の方法により製造できる。また、本化合物が抗癌活性を有していることは、ＷＯ ０２／０６０８９０、ＷＯ ０３／０９９８１３及びＷＯ ０４／０１１６６１に記載されている。
本発明は、癌細胞のｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べることにより、本化合物に対する感受性を検定する方法であり、癌細胞は癌組織から採取した細胞であっても、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞であっても許されるが、好ましくは、生検により癌組織から取り出された癌組織の細胞であることが望ましく、更に好ましくは、その癌組織は癌の診断に際して生検により取り出された癌組織であることが望ましい。
本発明の方法により、高感受性と判断された癌細胞が採取された患者に対して、本化合物を投与することにより、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者を選択して、本化合物を投与することが可能なる。これにより、治療効果を高め不要な副作用を軽減できることが期待される。
本発明における癌細胞のｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べる方法としては、転写されたｍＲＮＡの量を測定しても、または翻訳された蛋白質の量を測定しても良い。ｍＲＮＡ量を測定する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法・ＤＮＡチップ法などが挙げられ、蛋白質量を測定する方法としては、ウエスタンブロット法・免疫組織染色法・ＥＬＩＳＡ法などが挙げられるが、発現量を測定する方法であれば良く、本発明がこれらの例に限定されるものではない。
また、突然変異によりこれら蛋白質が変異し（ｐＲＢの変異に関しては次の報告が有る：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９２２−６，１９９０：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６−１０，１９９０）発現が減少しているのと実質的に同等であることを、該ＤＮＡ・ｍＲＮＡの塩基配列や電気泳動度より解析して変異ＤＮＡ・ｍＲＮＡを検出した場合（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：１９１３−９，１９９３）、または変異を識別できる抗体若しくは電気泳動度により変異蛋白質を検出した場合も、本発明に含まれる。
以下に、採取した腫瘍組織からｐＲＢ、ｐ１６、ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現を測定する方法について詳しく説明するが、培養細胞からも同様の方法により発現を測定できるが、本発明はこれに限られない。
なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
１．ＲＴ−ＰＣＲ法：
採取した腫瘍組織から常法（実験医学増刊「ＰＣＲとその応用」８：１０６３−１０７１，１９９０）によりｍＲＮＡを調製する。調製したｍＲＮＡを鋳型にして、ＲＴ−ＰＣＲによりｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現量を測定することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、例えばＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｃｏｄｅ ＰＲ０３２Ａ）を用いて、逆転写反応とそれに引き続くＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うことが可能である。
ｍＲＮＡを定量して発現量を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲは定量的なＲＴ−ＰＣＲであることが好ましい。定量的なＲＴ−ＰＣＲとしては、様々な方法が報告されているが（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９８６−９９４，１９９６）、好ましくは同じプライマーにより増幅される既知量の競合鋳型ＲＮＡを共存させてＲＴ−ＰＣＲを行い、両増幅産物の量を比較して定量を行う競合ＲＴ−ＰＣＲが望ましい。
上記Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．に記載の配列情報を基にｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ ＥをコードするｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡと称す）を検出するためのプライマーを作製する。また定量のため、そのプライマーと相補的な配列を有するが、分子量または制限酵素切断部位が標的ｍＲＮＡとは異なる競合鋳型ＲＮＡを作製する。変異が高発する部位（ｐＲＢに関しては、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９２２−６，１９９０；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６−１０，１９９０に報告）にプライマーを設定することにより、変異蛋白質のみを、または正常蛋白質のみを定量することができる。
腫瘍組織から調製したｍＲＮＡ試料に、既知量の競合鋳型ＲＮＡを希釈したものを加え、プライマーを加えてＲＴ−ＰＣＲを行う。生成した増幅産物の分子量または制限酵素消化後の分子量により、生成増幅産物が標的ｍＲＮＡ由来であるか競合鋳型ＲＮＡ由来であるかを区別し、両増幅産物の量比、及び添加した競合鋳型ＲＮＡの量から標的ｍＲＮＡの定量値を計算する。ｍＲＮＡ量は普遍的に発現が認められるアクチンｍＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ等と比較した相対量として測定することも許される。高感受性及び低感受性の癌細胞のｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ ＥのｍＲＮＡ量を測定してカットオフ値を決め、カットオフ値との比較で高発現であるか低発現であるかを判断する。
また、標準細胞とは電気泳動度の異なるバンドが現れた場合、または変異蛋白質が検出された場合は、低発現であると判断する。
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、好ましくはｐＲＢ低発現かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合、またはｐ１６発現陽性かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
２．ＤＮＡチップ法：
採取した腫瘍組織から、例えば常法（実験医学増刊「ＰＣＲとその応用」８：１０６３−１０７１，１９９０）によりｍＲＮＡを抽出して、逆転写反応によって蛍光標識し、合成された標識ｃＤＮＡを癌関連遺伝子のＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅがスポットしてあるマイクロアレイＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣＨＩＰ Ｖｅｒ．４．０（タカラバイオ株式会社Ｘ１０２）上にハイブリダイズする（Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１；１０−１４；１９９９）。
その際、腫瘍組織サンプルと正常組織サンプルを別々の蛍光色素で，例えばＣｙ３（赤）とＣｙ５（緑）に標識することによって、どちらのサンプルで遺伝子が増えているかを判定する。コンピュータ解析ソフトにより、正常組織から得られた標識ｃＤＮＡをハイブリダイズした場合と比較して癌組織の方が多ければ例えば赤、同等ならば例えば黄、少なければ例えば緑として画像表示させることができる。このシグナルの強弱をコンピューター解析ソフトで数値化することで、両者における遺伝子発現比（Ｃｙ３＝癌組織／Ｃｙ５＝正常組織）のデーターを算出し、これらの発現比が２倍以上または１／２以下を、好ましくは３倍以上または１／３以下を有意として判定する。
ｐＲＢが緑、ｐ１６が黄若しくは赤、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅが赤の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。好ましくはｐＲＢが緑かつｃｙｃｌｉｎ Ｅが赤の場合、またはｐ１６が黄若しくは赤かつｃｙｃｌｉｎ Ｅが赤の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
３．ウエスタンブロット法：
以下のウエスタンブロット法、免疫組織染色法及びＥＬＩＳＡ法に用いる抗ｐＲＢ抗体・抗ｐ１６抗体・抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体は、市販の抗体を用いることができる。抗ｐＲＢ抗体は、例えばＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社からＲｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（カタログＮｏ．：９３０２）を、抗ｐ１６抗体は、例えばＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社からｐ１６（Ｃ−２０）（カタログＮｏ．：ｓｃ−４６８）を、抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体は、例えばＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社からＰｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ（カタログＮｏ．：５５４１８２）を入手できる。
また、抗体は上記Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．に記載の情報を基に作製された抗原を免疫して作製することも可能である。抗原は、上記Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．に記載の配列情報を基にｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ発現ベクターを作製し、該ベクターを導入した発現細胞からｐＲＢ−ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ蛋白を精製して得ることができる。これら蛋白質は精製が容易となるよう、融合蛋白質として発現させることが好ましい。また別法として、上記Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．に記載の配列情報を基にペプチドを合成し、キャリアー蛋白質と結合させて抗原とすることもできる。それら抗原を動物に免疫し、得られた血清から抗体を精製するか、または得られた抗体産生細胞からハイブリドーマを作製して、その培養液から抗体を精製することができる。
また、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ、特にｐＲＢの変異を検出するために、例えば、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９２２−６，１９９０；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６−１０，１９９０に記載の変異を有する変異蛋白質を発現させ、または変異部位を含むペプチドを合成して、それを動物に免疫し、変異蛋白質に特異的に反応する抗体を得ることができる。または逆に、正常蛋白質を免疫して、正常蛋白質は反応するが変異蛋白質には反応しない抗体も作製可能である。抗体の作製法はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２，ｐ６６３−６７９に記載されている。
採取した腫瘍組織より、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調整する。具体的には例えば、腫瘍組織を細胞調製液（好ましくは各種プロテアーゼ阻害剤及び１０％グリセロールを含む）を用いてホモゲナイズし、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを混合し９７℃で５分の熱処理を行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとする。ウエスタンブロット法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２，６７９−６８８に記載の方法により行うことができるが、具体的には例えば以下の通り行うことができる。
各サンプル一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画後、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜にトランスファーし、抗ｐＲＢ抗体・抗ｐ１６抗体・抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体を反応させた後、酵素標識した二次抗体を反応させ、酵素活性によりＨｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜にトランスファーされたｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６を検出する。好ましくは対照として、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が認められる標準細胞、好ましくは全ての発現が認められるＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞等を同時にアプライして、ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞での発現と比較して、高発現であるか低発現であるかを判断する。
また、標準細胞とは電気泳動度の異なるバンドが現れた場合、または変異蛋白質が検出された場合は、低発現であると判断する。
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、好ましくはｐＲＢ低発現かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合、またはｐ１６発現陽性かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
４．免疫組織染色法
免疫組織染色法は、例えば実験医学別冊（ポストゲノム時代の免疫染色、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、１９９７）に記載の方法により行うことができるが、具体的には例えば以下の通り行うことができる。
採取した腫瘍組織に埋包剤を浸透させてブロックを作製した後、２〜８μｍの厚さにスライスしてスライドガラスに貼り付けて組織標本を作製する。組織標本に、抗ｐＲＢ抗体や抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体、または抗ｐ１６抗体を反応させた後、アビジン−ビオチン−酵素抗体法にて染色する（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２７；１１３１−１１３９，１９７９）。染色した組織標本中の腫瘍組織のｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの染色度を正常組織と比較して、ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性あるいはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現を判断する。変異蛋白質が検出された場合は、低発現であると判断する。
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、好ましくはｐＲＢ低発現かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合、またはｐ１６発現陽性かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
５．ＥＬＩＳＡ法
ＥＬＩＳＡ法はＥｄ Ｈａｒｌｏｗら（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載の方法により行うことができるが、具体的には例えば以下の通り行うことができる。
採取した腫瘍組織より、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅを含む画分を調整する。具体的には例えば、腫瘍組織を細胞調製液（好ましくは各種プロテアーゼ阻害剤及び１０％グリセロールを含む）を用いてホモゲナイズし、そこに１％ＮＰ−４０を添加して可溶画分と残渣を得る。可溶画分をそのままＥＬＩＳＡ法に用いるか、もしくは残渣画分を０．５ＭのＮａＣｌを加え抽出操作を行った後、ＮａＣｌ濃度を０．１〜０．１５Ｍに下げてからＥＬＩＳＡ法に用いる。
可溶画分及びＮａＣｌ抽出画分を、抗ｐＲＢ抗体、抗ｐ１６抗体、または抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体がコートされている９６穴プレートに添加し抗体と反応させる。コートされた抗体に結合したｐＲＢ、ｐ１６、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅを、それぞれに対する酵素標識抗体でサンドイッチし、結合した酵素の活性を測定することにより腫瘍組織で発現しているｐＲＢ、ｐ１６、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅを定量する。
高感受性及び低感受性の癌細胞のｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの量を測定してカットオフ値を決め、カットオフ値との比較で高発現であるか低発現であるかを判断する。
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、好ましくはｐＲＢ低発現かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合、またはｐ１６発現陽性かつｃｙｃｌｉｎ Ｅが高発現の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
【図面の簡単な説明】
図１は、各ヒト癌細胞株におけるｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１のウエスタンブロットによる発現量解析結果である。
図２は、ＳＹ−１株及びＨ−５２６株，Ｈ−４６０株におけるｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの免疫組織染色よる発現量解析結果である。
図３は、子宮体癌の臨床標本におけるｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの免疫組織染色よる発現量解析結果である。
図４は、ｐ１６ ｍＲＮＡ量とＴ／Ｃ％、１６ ｍＲＮＡ量とｐ１６蛋白の発現量の関連を示したグラフである。
【実施例】
以下に、本発明の有用性を示すための例を示すが、これらは例示的なものであって、本発明は如何なる場合にも以下の具体例に制限されるものではない。
［実施例１］ＢＳＹ−１株及びＷｉＤｒ株を含むヒト癌細胞株２５株における細胞周期関連分子群の発現解析
ＷＯ ０２／０６０８９０において、下記式ＩＩで表される（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−アセトキシ−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（以下、化合物１と称す）に対して強い感受性を示したＢＳＹ−１株、及びＷＯ ０３／０９９８１３において一般式１で表される化合物のうちＲ１が水酸基である化合物群に対して感受性を示したＷｉＤｒ株を含む、ヒト癌細胞株２５株における細胞周期関連分子群ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現をウエスターンブロット法にて解析した。
２５株のヒト癌細胞株をヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で腫瘍を摘出、各種プロテアーゼ阻害剤（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，ｐ−ＡＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，ｏ−ＮａＶＯ４）及び１０％グリセロール含有の細胞調製液を用いてホモゲナイズした。その際、腫瘍サンプル重量あたりの細胞調製液量を一定にした。それぞれの細胞調製液に、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを混合し、９７℃で５分の熱処理を行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。各ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルの一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜にトランスファーした後、ｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１に対する抗体を反応させた。その後ＨＲＰ標識の二次抗体を反応させ化学発光基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ；ＰＩＥＲＣＥ社）を加えて、イメージマスターＶＤＳ−ＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１のｂａｎｄを検出した。
各癌細胞株におけるｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現量を相対的に比較するための対照として、全分子の発現が認められるＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞をすべてのＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライして同様に検出した。
その結果を図１に示した。強い感受性を示すＢＳＹ−１株にｐＲＢの欠失、ｐ１６の発現、ｃｙｃｌｉｎ Ｅの高発現という性質が有ることから、これら性質が、ｉｎ ｖｉｖｏでの本化合物への感受性に関連するか否かについて検討を行った。
図１において、Ａ〜Ｚ、Ｅ、Ａ１〜Ｅ１およびＥの各符号は、各々下記のヒト癌細胞株を示す。
［実施例２］ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｅｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現と本化合物への感受性の相関
実施例１でｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現を調べた２５株のヒト癌細胞株について、代表的な本化合物、下記式ＩＩＩで示される［（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド］（以下、化合物２と称す）に対する感受性を調べた。
培養フラスコ、またはヌードマウスの皮下において増殖させた２５種類のヒト癌細胞を、ヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で各群の腫瘍体積の平均が均一になるように群分けをし、対照群５匹、化合物２投与群５匹とした。投与群には１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように５日間静注し、対照群は無処理または媒体投与とした。投与開始日（Ｄａｙ１）からＤａｙ５，８，１２，１５と以下経時的に腫瘍体積を測定し、相対的な腫瘍体積比（Ｔ／Ｃ％）を求めた。
ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現と化合物２への感受性の相関を、表１に示した。実施例１で解析したヒト癌細胞株におけるｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現量を相対的に評価し、発現が認められないものを−、発現量が認められるものをその強度に応じて＋〜＋＋＋と表記して、腫瘍体積比（Ｔ／Ｃ％）の結果と並べて示した。また、ｐＲＢに関しては、変異型ｐＲＢの発現が報告されている小細胞肺癌株・卵巣癌株・前立腺癌株（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９，３３７５−３３７８，１９９４；Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２１，１４５−５２，１９９２；Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２３３，２３３−９，１９９７）に（ ）を付して記載した。
調べたヒト癌細胞株２５株中、ウエスタンブロット法でバンドが検出されない（「−」で表示）、または文献情報で変異や欠失が報告されている（括弧付きで表示）癌細胞株１１株がｐＲＢ低発現に分類され、このうちの７株（６４％）がＴ／Ｃ％≦１％であった。これに対しｐＲＢを発現している１４株にはＴ／Ｃ％≦１％となる癌細胞株は無く（ｐ＝０．０００６）、ｐＲＢ低発現により化合物２に対する感受性を検定できることが明らかとなった。
またｐ１６発現陽性の癌細胞１０株中７株（７０％）がＴ／Ｃ％≦１％であるのに対し、ｐ１６を発現していない１５株にはＴ／Ｃ％≦１％となる癌細胞株は無く（ｐ＝０．０００２）、ｐＲＢ低発現と同様、ｐ１６発現陽性により化合物２に対する感受性の検定が可能であった。
調べた２５の癌細胞株株の中で、１１株がｐＲＢ低発現（ウエスターンブロット法で検出されなかったか文献情報で変異や欠失が報告されている）に分類され、このうちの９株でｐ１６は発現していた。逆にｐ１６を発現している１０株中９株がｐＲＢ低発現であり、報告されている通り（ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５０３−５１１，１９９５）、ｐ１６発現陽性の癌細胞はｐＲＢ低発現の癌細胞とほぼ一致していた。
ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現については、高発現（＋＋＋）している９株中５株（５６％）がＴ／Ｃ％≦１％であるのに対し、高発現していない癌細胞では１６株中２株（１３％）がＴ／Ｃ％≦１％と、ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の癌細胞は明らかに感受性が高かった（ｐ＝０．０２）。
完全な腫瘍の消失（Ｔ／Ｃ％＝０％）を見た４株、及び消失はしないまでも長期間にわたる腫瘍縮小の継続を示したＮＣＩ−Ｈ１４６を合わせた５株に対する化合物２の効果は、治癒的効果と考えられ、これら全ての株はｐＲＢ低発現・ｐ１６発現・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という性質を示した。
そこで、ｐＲＢ低発現・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の２つの性質と、化合物２の治癒的効果の相関を見てみると、両方の性質を持つ癌細胞７株中５株（７１％）で治癒的効果を示したのに対し、それ以外の癌細胞株１８株中には治癒的効果を示した癌細胞株は見出されなかった（ｐ＝０．０００１）。また、ｐ１６発現陽性・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の両方の性質を持つ癌細胞では、両方の性質を持つ癌細胞６株中５株（８３％）で治癒的効果を示し、それ以外の癌細胞株１９株中には治癒的効果を示した癌細胞株は見出されなかった（ｐ＝０．００００２）。ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現は、ｐＲＢ低発現またはｐ１６発現陽性の指標と組み合わせることにより、更に有用な指標となった。
これらの結果より、ｐＲＢ低発現・ｐ１６発現・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の性質を調べることにより、癌細胞株の化合物２に対する感受性が予見できることが明らかとなった。
［実施例３］代表的な３化合物に対する癌細胞株の感受性検定
ＷＯ ０２／０６０８９０においてＢＳＹ−１株に対して高い抗腫瘍活性を示した化合物１、及びＷＯ ０３／０９９８１３においてＷｉＤｒ株に対して抗腫瘍活性を示した一般式Ｉで表される本化合物のうち代表的な化合物（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−７−（（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（下記式ＩＶ、以下化合物３と称す）、及び（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（下記式Ｖ、以下化合物４と称す）について、ヒト癌細胞株のｐＲＢ低発現・ｐ１６発現・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の性質と、感受性の相関について調べた。
培養フラスコ、またはヌードマウスの皮下において増殖させた癌細胞を、ヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で各群の腫瘍体積の平均が均一になるように群分けをし、対照群５匹、化合物投与群５匹とした。投与群には１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように５日間静注し、対照群は無処理または媒体投与とした。投与開始日（Ｄａｙ１）からＤａｙ５，８，１２，１５と以下経時的に腫瘍体積を測定し、相対的な腫瘍体積比（Ｔ／Ｃ％）を求めた。但し、化合物１の評価の際は原則としてＤａｙ１５までで実験を終了した。表２には、各癌細胞に対する化合物１，２，４、及び実施例２の化合物２のＴ／Ｃ％を示した。
表２に示す通り、化合物１のＴ／Ｃ％が多少大きな値を示すものの試験した化合物全てで抗腫瘍効果が認められ、各種ヒト癌細胞株のこれら化合物に対する感受性は同じ傾向を示した。化合物１，３，４で化合物２とのＴ／Ｃ％の相関を求めたところ、それぞれ０．７２４、０．９４８、０．９２３と高い相関を示した。このことから、一般式Ｉで表される化合物間において、各種癌細胞株の感受性が共通していることが示された。
［実施例４］ＢＳＹ−１株及びＨ−５２６株，Ｈ−４６０株におけるｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ発現の免疫組織染色による解析
化合物２に対して治癒するまでの強い感受性を示したＢＳＹ−１株、及び治癒には至らないまでも強い感受性を示したＨ５２６株、更には感受性が低かったＨ４６０株において、細胞周期関連分子群ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現を免疫組織染色法にて解析した。
上記３株のヒト癌細胞株をヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で腫瘍を摘出して、中和した１０％ホルマリンにて１日間固定してパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブロックを４μｍの厚さにスライスしてスライドグラスに貼り付けたものを、免疫組織染色用標本とした。免疫組織染色用標本は、脱パラフィン操作、恒温槽を用いた熱処理で抗原賦活化、内在性ペルオキシダーゼのブロッキングなどの操作を施した後に、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する一次抗体と室温で１時間反応させた。ペルオキシダーゼ標識した抗マウスあるいは抗ウサギ二次抗体を反応させて、ＤＡＢを発色基質としてそのペルオキシダーゼ活性を可視化して顕微鏡下観察した。
その結果を図２示した。ウエスタンブロット法で示された結果と同様の結果が、免疫組織染色においても得られることが明らかとなった。この結果から、臨床において繁用されるパラフィン包埋ブロックの標本を用いても、細胞周期関連分子群ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現解析が行える可能性が示された。
［実施例５］臨床標本におけるｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ発現の免疫組織染色による解析
ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より購入したパラフィン包埋の臨床標本（正常組織１２、癌組織１２）を用いて、免疫組織染色法による細胞周期関連分子群ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現解析を行った。
臨床パラフィン包埋標本を、実施例４と同様にｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する抗体で免疫組織染色を行った。その結果、正常組織において、ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの過剰発現は観察されなかったのに対し、一部の癌組織においてｐ１６（１２例中３例）、ｃｙｃｌｉｎ Ｅ（１２例中１例）の過剰発現が観察された。図３には、ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの両分子が過剰発現していた子宮体癌の染色結果を示した。この結果から、臨床パラフィン包埋ブロックの標本を用いても、細胞周期関連分子群ｐ１６及びｃｙｃｌｉｎ Ｅが過剰発現している癌組織を選別出来る可能性が示された。
［実施例６］臨床標本におけるｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ発現の免疫組織染色−２
実施例５に加え、更に多数の癌種（胃癌・食道癌・肺癌・大腸癌・甲状腺癌・腎癌・乳癌・肝癌・膀胱癌・卵巣癌・膵癌・前立腺癌・子宮内膜癌・胆嚢癌・喉頭癌・子宮頸癌・悪性リンパ腫・悪性メラノーマ、各１０サンプルの合計１８０サンプル）についてパラフィン包埋した臨床腫瘍標本をＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より購入し、実施例４、５と同様に、免疫組織染色法による細胞周期関連分子群ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現解析を行った。
臨床パラフィン包埋標本を、実施例４、５と同様に、ｐ１６，ｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する抗体で免疫組織染色を行ったところ、表２に示したとおり、「ｐ１６及びｃｙｃｌｉｎ Ｅの過剰発現」の特徴が、子宮頸癌において１０例中全例で観察されたのを筆頭に、卵巣癌で１０例中４例、乳癌で１０例中３例において認められた。臨床パラフィン包埋ブロックの標本を用いた「ｐ１６及びｃｙｃｌｉｎ Ｅの過剰発現」の癌組織を選別出来る可能性が確認されると共に、癌種によっては高率で「ｐ１６及びｃｙｃｌｉｎ Ｅの過剰発現」の特徴を持っている可能性があることが示された。
［実施例７］ＲＴ−ＰＣＲによるｐ１６過剰発現の検出
２８株のヒト癌細胞株をヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で腫瘍を摘出し、各癌種につき３例の腫瘍をプールした。それらの腫瘍を液体窒素で凍結後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＳＩＧＭＡ社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＯＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。Ｔａｑｍａｎ（Ｒ） ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＢＩ社）を用いてｃＤＮＡを合成後、プローブとしてｐ１６のＴａｑｍａｎ（Ｒ） ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（ＡＢＩ社）と反応試薬としてＴａｑｍａｎ（Ｒ） Ｇｏｌｄ ＲＴ−ＰＣＲ ｒｅａｇｅｎｔｓを用いてＳｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ（７９００ＨＴ、ＡＢＩ社）で各腫瘍のｐ１６ ｍＲＮＡ量を測定した。得られた数値を１８Ｓ ｒＲＮＡの値で補正してｐ１６ ｍＲＮＡの相対的な量を求めた。
表３に、実施例１においてウエスタンブロット法により求めたｐ１６蛋白の発現量を求め、実施例２において抗腫瘍効果Ｔ／Ｃ％を求めたヒト癌細胞株について、ｐ１６ ｍＲＮＡの相対的な量をまとめて示した。また、図４にｐ１６ ｍＲＮＡ量とＴ／Ｃ％、１６ ｍＲＮＡ量とｐ１６蛋白の発現量の関連をグラフに示した。
表３及び図４に示す通り、ｐ１６ ｍＲＮＡの相対量が０．３以上の高発現癌細胞１２株中６株（５０％）で、Ｔ／Ｃ％≦１％であるのに対し、０．３未満の１３株中ではＴ／Ｃ％≦１％となる癌細胞株は１株しか存在しなかった（ｐ＝０．０２）。ｐ１６ ｍＲＮＡ量の測定により、「ｐ１６過剰発現」の癌をスクリーニングし、化合物２に対する感受性を検定することが可能であることが明らかとなった。
また表３及び図４に示す通り、ｐ１６蛋白の発現量とｐ１６ ｍＲＮＡ量の間には相関が認められ、ｐ１６蛋白の過剰発現（＋＋）を認めた８株におけるｐ１６の相対的ｍＲＮＡ量が０．５７８６±０．３２５９であるのに対し、ｐ１６蛋白発現（＋）の２株では０．３６１０、ｐ１６蛋白が認められなかった１５株では０．２０７３±０．２４２４であった。ＲＴ−ＰＣＲ等のｐ１６ ｍＲＮＡを検出する方法によっても、ｐ１６蛋白発現を検出する方法と同様な結果を得ることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の特徴を調べることにより、本化合物に対する癌細胞の感受性を調べ、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者のみに本化合物を投与すれば、治療効果を高め不要な副作用を軽減することが可能である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【技術分野】
本発明は、抗癌剤として有用な式（Ｉ）の一般式で表される化合物（以下、本化合物と称す）に対する癌細胞の感受性を予測するための検定方法に関する。
【背景技術】
従来の癌化学療法においては、臓器癌種毎に効果の立証されている抗癌剤を、単剤またはそれらの併用で行ってきた。また、近年の盛んに行われている大規模な無作為比較試験を通して、特定の癌種においては標準治療が確立されている。しかしながら、これらの治療において達成される奏効率は、概して２０〜５０％程度であり、半数以上の患者においては治療効果を享受できないにも関わらず、副作用の危険性を伴う化学療法を施行するという状況である（ＪＡＣＲ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｎｏ．７，１０−１９，２００２）。
抗癌剤が効く患者と効かない患者を選別しようという試みは、従来から「薬剤感受性試験」という方法が試されてきた。抗癌剤感受性試験にはＳＤＩ法（Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８５：７６２−７６５，１９９４）、ＣＤ−ＤＳＴ法（Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９２：２０３−２１０，２００１）、ＨＤＲＡ法（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：３０５−３１１，１９９５）などがあり、いずれも患者から癌細胞を採り、抗癌剤を接触させて抗癌剤に対する感受性を調べる方法であることで共通している。しかしながら、これらの方法は、癌細胞を試験管内で生存させておく必要があることや、更に検査結果と臨床効果が必ずしも一致しないという問題などがあり、実施率も０．５％程度にとどまっている（制癌剤適応研究会集計アンケート１９９６）。
癌細胞に特異的な分子を標的とした分子標的薬剤の中には、ハーセプチンテストなどのように分子診断によって薬剤に対する感受性を予測することに成功している例も報告されている（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：１６６９−１６７５，２００１）。しかしながら、その他の薬剤においては単独の標的分子のみでは感受性を予測出来ず、複数の分子が感受性を規定している場合が多いと考えられている（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２４：２３６−２４４，２０００）。近年発展したｃＤＮＡマイクロアレイ技術は超多量遺伝子の発現解析を可能とし、感受性規定因子の包括的解析を可能にした。例えば、慢性骨髄性白血病治療薬のグリーベックの場合は、１５〜３０の遺伝子群の発現解析により治療効果の予測可能であることが、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析の結果から提唱されている（Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９３：８４９−５６，２００２）。
今後の癌化学療法で用いられる抗癌剤の開発は、治療前にその感受性を調べる診断法と組み合わせた提供を目指すべきであり、分子診断を可能にするためには開発する薬剤への感受性を予測できる分子を見出すことが重要となる。
【発明の開示】
本発明者らはＷＯ ０２／０６０８９０、ＷＯ ０３／０９９８１３及びＷＯ ０４／０１１６６１において、本化合物が、ヒト乳癌細胞株（ＢＳＹ−１）に対し極めて強い抗腫瘍効果を発現し、ヒト大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）に対しても強い抗腫瘍効果を発現することを見出した。
一方で、本化合物は小細胞性肺癌細胞株（Ｃａｌｕ−１）に対しては、上述した癌細胞株と比べて効果が弱いことを見出し、本化合物の抗腫瘍効果が、癌細胞により異なることが明らかとなった。
癌細胞の本化合物に対する感受性と関連する分子を明らかにし、生検等により癌患者から採取した癌細胞で、それら分子の発現を調べることにより、本化合物に対する癌細胞の感受性を予測することができれば、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者のみに、本化合物を投与することが可能となり、治療効果を高め不要な副作用を軽減できることが期待される。
本化合物に対する感受性の高いＢＳＹ−１株の分子的特徴を探索するにあたり、本発明者らは乳癌や肺癌において破綻していることが提唱されている細胞周期のＧ１／Ｓ移行を制御する分子群に着目した。癌抑制遺伝子であるｐ１６とｐＲＢ、及びそれらと拮抗する、またはそれらを負に制御するｃｙｃｌｉｎ Ｄ１とｃｙｃｌｉｎ Ｅの４分子に関して、蛋白質発現量を調べたところ、ＢＳＹ−１株にはｐＲＢの発現減少、ｐ１６発現陽性、ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という分子的特徴があることを見出した。
ＢＳＹ−１株、ＷｉＤｒ株及びＣａｌｕ−１株を含むヒト癌細胞株２５株について、ｐＲＢの発現減少若しくは変異（以下ｐＲＢ低発現と称す）、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べ、これら癌細胞を移植したマウスを用いて本化合物の抗腫瘍効果を比較検討したところ、これら特徴を一つでも有していたヒト癌細胞株の多くが本化合物に対する高い感受性を示したのに対し、有していない癌細胞株のほとんどは低感受性であった。
特にｐＲＢ低発現及びｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の特徴を有する７株、ｐ１６発現陽性及びｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の特徴を有する６株のうち、４株は本化合物投与により完全な腫瘍の消失を示し、１株は消失はしないまでも長期間にわたる腫瘍縮小の継続を示した。
癌細胞のｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べることにより、当該癌細胞の本化合物に対する感受性を予測できることが明らかとなり、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下に関する。
１．１）ｐＲＢの発現が減少している、
２）ｐ１６が発現している、
３）ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、
４）ｐＲＢの発現が減少しかつｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、または
５）ｐ１６が発現しかつｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、の何れか一つを指標とする、下記一般式１で表される化合物に対する癌細胞の感受性を検定する方法。
式（Ｉ）
［式中、Ｒ１は
１）水素原子または
２）水酸基
Ｒ３は
１）水素原子、
２）水酸基または
３）Ｃ１−６アルコキシ基
Ｒ２は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
４）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基
５）式（ＩＩ）
［式中、
Ａ）
ｎは０ないし４の整数、
Ｘは
ｉ）−ＣＨＲＮ４−、
ｉｉ）−ＮＲＮ５−または
ｉｉｉ）−Ｏ−、
ＲＮ１及びＲＮ２は同一または異なって、
ｉ）水素原子または
ｉｉ）Ｃ１−６アルキル基、
ＲＮ３及びＲＮ４は同一または異なって、
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
ｉｖ）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
ｖ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｖｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖｉｉ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
ｖｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
ｉｘ）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
ｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
ｘｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ｘｉｉ）−ＮＲＮ６ＲＮ７（ここにおいて、ＲＮ６およびＲＮ７は同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
ｘｉｉｉ）ＲＮ３及びＲＮ４が一緒になって結合する炭素原子と共に形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基（該非芳香族複素環式基は置換基を有していても良い）、
ＲＮ５は
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
ｉｖ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｖ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖｉ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
ｖｉｉ）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
ｖｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
ｉｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
ｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基または
ｘｉ）ＲＮ３及びＲＮ５が一緒になって結合する窒素原子と共に形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基（該非芳香族複素環式基は置換基を有していても良い）、
Ｂ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ３、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ１及びＲＮ２は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
Ｃ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ２、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ１及びＲＮ３は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基あるいは
Ｄ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ１、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ２及びＲＮ３は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
または
６）式（ＩＩＩ）
［式中、ＲＮ８及びＲＮ９は同一または異なって、
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｉｖ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基または
ｖｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基を表す］
を表す］
２．Ｒ２が
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基または
４）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基である１に記載の検定方法。
３．Ｒ２が下記式（ＩＶ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＩＶ）
［式中、ｎは０ないし４の整数、
ＲａＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲａＮ２は
１）水素原子
２）Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、
３）Ｎ，Ｎ−ジＣ１−６アルキルアミノ基、
４）エチルメチルアミノ基、
５）ピリジル基、
６）ピロリジン−１−イル基、
７）ピペリジン−１−イル基、
８）モルホリン−４−イル基または
９）４−メチルピペラジン−１−イル基を表す］
４．Ｒ２が下記式（Ｖ）で表される１に記載の検定方法。
式（Ｖ）
（式中、ｎ１及びｎ２は同一または異なって、０ないし４の整数、
Ｘｂは
１）−ＣＨＲｂＮ４−、
２）−ＮＲｂＮ５−または
３）−Ｏ−、
ＲｂＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｂＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｂＮ４は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
１１）−ＮＲｂＮ６ＲｂＮ７（ここにおいて、ＲｂＮ６およびＲｂＮ７は、同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
１２）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ＲｂＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
５）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
６）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
７）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
９）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
５．Ｒ２が下記式（ＶＩ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＶＩ）
［式中、ｎ３は１または２の整数、
ＲｃＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｃＮ５は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基を表す］
６．Ｒ２が下記式（ＶＩＩ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＶＩＩ）
（式中、ｎ１及びｎ２は同一または異なって、０ないし４の整数、
Ｘｄは
１）−ＣＨＲｄＮ４−、
２）−ＮＲｄＮ５−または
３）−Ｏ−、
ＲｄＮ２は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｄＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｄＮ４は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
１１）−ＮＲｄＮ６ＲｄＮ７（ここにおいて、ＲｄＮ６及びＲｄＮ７は同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
１２）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ＲｄＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
５）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
６）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
７）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
９）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
７．Ｒ２が下記式（ＶＩＩ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＶＩＩＩ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｅＮ４は
１）アミノ基、
２）Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、
３）ピロリジン−１−イル基、
４）ピペリジン−１−イル基または
５）モルホリン−４−イル基を表す］
８．Ｒ２が下記式（ＩＸ）で表される１に記載の検定方法。
式（ＩＸ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｆＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｆＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
４）置換基を有していても良い３ないし８員環非芳香族複素環式基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良い５員環ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基を表す］
９．Ｒ２が下記式（Ｘ）で表される１に記載の検定方法。
式（Ｘ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｇＮ５は
１）水素原子、
２）置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、
３）置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、
４）置換されていてもよいＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
５）置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、
６）置換されていてもよいピリジル基または
７）置換されていてもよいテトラヒドロピラニル基を表す］
１０．一般式（Ｉ）で表される化合物が下記化合物の何れか一つの化合物である、１に記載の検定方法。
１）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−アセトキシ−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
２）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド、
３）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−７−（（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド及び
４）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
１１．ｐＲＢの発現の減少、ｐ１６の発現、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現の増強を、それぞれをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検定する、１に記載の検定方法。
１２．ｍＲＮＡ量を測定する方法が定量的ＲＴ−ＰＣＲ法である、１１に記載の検定方法。
１３．ｍＲＮＡ量を測定する方法がＤＮＡチップ法である、１１に記載の検定方法。
１４．ｐＲＢの発現の減少、ｐ１６の発現、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現の増強を、それぞれの蛋白質量を測定することにより検定する、１に記載の検定方法。
１５．蛋白質量を測定する方法がウエスタンブロット法である、１４に記載の検定方法。
１６．蛋白質量を測定する方法が免疫組織染色法である、１４に記載の検定方法。
１７．蛋白質量を測定する方法がＥＬＩＳＡ法である、１４に記載の検定方法。
１８．ｐＲＢ、ｐ１６またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ遺伝子の連続した少なくとも１５塩基の配列から成るプライマーを含んで成る、１２の検定方法に使用するキット。
１９．ｐＲＢ、ｐ１６またはｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する抗体を含んで成る、１５、１６または１７に記載の検定方法に使用するキット。
癌細胞のｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べることにより、癌細胞の本化合物に対する感受性を予め予見することが可能となり、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者のみに、本化合物を投与することが可能なった。治療効果を高め不要な副作用を軽減できることが期待された。
【発明を実施するための最良の形態】
本明細書中でｐＲＢとは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ０００３２１に記載の塩基配列でコードされる分子量約１１０ＫＤａの蛋白質である。ｐＲＢをコードするＲＢ遺伝子は、網膜芽細胞腫で変異を起こしている癌抑制遺伝子として単離され（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９０５９−９０６３，１９８７）、その後種々の悪性細胞での変異が確認されている。
ｐ１６とは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＨＭ００００７７に記載の塩基配列でコードされる分子量約１６ＫＤａの蛋白質である。ｐ１６は、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６と結合し、ＣＤＫ４／６によるｐＲＢのリン酸化を抑制してｐＲＢ活性保持に寄与している（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：４３６−４４０，１９９４）。
ｃｙｃｌｉｎ Ｅとは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７４０９３に記載の塩基配列でコードされる分子量約５２ＫＤａの蛋白質である。細胞周期のＧ１／Ｓ移行時に一過的に発現量が上昇することで細胞周期進行に中心的役割を果たしているが、癌化に伴って発現量の絶対量の上昇及び一過的上昇のパターンの破綻が報告されている（Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０４：３６９−７５，２００３）。
また、ｐ１６とｐＲＢの発現量の逆相関関係は多くの癌種において報告されていることから、ｐ１６の発現陽性とｐＲＢの低発現は同一の事象に起因していると考えられる（ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５０３−５１１，１９９５）。
本化合物は、ＷＯ ０２／０６０８９０、ＷＯ ０３／０９９８１３及びＷＯ ０４／０１１６６１に記載の方法により製造できる。また、本化合物が抗癌活性を有していることは、ＷＯ ０２／０６０８９０、ＷＯ ０３／０９９８１３及びＷＯ ０４／０１１６６１に記載されている。
本発明は、癌細胞のｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べることにより、本化合物に対する感受性を検定する方法であり、癌細胞は癌組織から採取した細胞であっても、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞であっても許されるが、好ましくは、生検により癌組織から取り出された癌組織の細胞であることが望ましく、更に好ましくは、その癌組織は癌の診断に際して生検により取り出された癌組織であることが望ましい。
本発明の方法により、高感受性と判断された癌細胞が採取された患者に対して、本化合物を投与することにより、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者を選択して、本化合物を投与することが可能なる。これにより、治療効果を高め不要な副作用を軽減できることが期待される。
本発明における癌細胞のｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という特徴を調べる方法としては、転写されたｍＲＮＡの量を測定しても、または翻訳された蛋白質の量を測定しても良い。ｍＲＮＡ量を測定する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法・ＤＮＡチップ法などが挙げられ、蛋白質量を測定する方法としては、ウエスタンブロット法・免疫組織染色法・ＥＬＩＳＡ法などが挙げられるが、発現量を測定する方法であれば良く、本発明がこれらの例に限定されるものではない。
また、突然変異によりこれら蛋白質が変異し（ｐＲＢの変異に関しては次の報告が有る：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９２２−６，１９９０：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６−１０，１９９０）発現が減少しているのと実質的に同等であることを、該ＤＮＡ・ｍＲＮＡの塩基配列や電気泳動度より解析して変異ＤＮＡ・ｍＲＮＡを検出した場合（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：１９１３−９，１９９３）、または変異を識別できる抗体若しくは電気泳動度により変異蛋白質を検出した場合も、本発明に含まれる。
以下に、採取した腫瘍組織からｐＲＢ、ｐ１６、ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現を測定する方法について詳しく説明するが、培養細胞からも同様の方法により発現を測定できるが、本発明はこれに限られない。
なお、本明細書において引用した文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
１．ＲＴ−ＰＣＲ法：
採取した腫瘍組織から常法（実験医学増刊「ＰＣＲとその応用」８：１０６３−１０７１，１９９０）によりｍＲＮＡを調製する。調製したｍＲＮＡを鋳型にして、ＲＴ−ＰＣＲによりｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現量を測定することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、例えばＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｃｏｄｅ ＰＲ０３２Ａ）を用いて、逆転写反応とそれに引き続くＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うことが可能である。
ｍＲＮＡを定量して発現量を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲは定量的なＲＴ−ＰＣＲであることが好ましい。定量的なＲＴ−ＰＣＲとしては、様々な方法が報告されているが（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９８６−９９４，１９９６）、好ましくは同じプライマーにより増幅される既知量の競合鋳型ＲＮＡを共存させてＲＴ−ＰＣＲを行い、両増幅産物の量を比較して定量を行う競合ＲＴ−ＰＣＲが望ましい。
上記Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．に記載の配列情報を基にｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ ＥをコードするｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡと称す）を検出するためのプライマーを作製する。また定量のため、そのプライマーと相補的な配列を有するが、分子量または制限酵素切断部位が標的ｍＲＮＡとは異なる競合鋳型ＲＮＡを作製する。変異が高発する部位（ｐＲＢに関しては、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９２２−６，１９９０；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６−１０，１９９０に報告）にプライマーを設定することにより、変異蛋白質のみを、または正常蛋白質のみを定量することができる。
腫瘍組織から調製したｍＲＮＡ試料に、既知量の競合鋳型ＲＮＡを希釈したものを加え、プライマーを加えてＲＴ−ＰＣＲを行う。生成した増幅産物の分子量または制限酵素消化後の分子量により、生成増幅産物が標的ｍＲＮＡ由来であるか競合鋳型ＲＮＡ由来であるかを区別し、両増幅産物の量比、及び添加した競合鋳型ＲＮＡの量から標的ｍＲＮＡの定量値を計算する。ｍＲＮＡ量は普遍的に発現が認められるアクチンｍＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ等と比較した相対量として測定することも許される。高感受性及び低感受性の癌細胞のｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ ＥのｍＲＮＡ量を測定してカットオフ値を決め、カットオフ値との比較で高発現であるか低発現であるかを判断する。
また、標準細胞とは電気泳動度の異なるバンドが現れた場合、または変異蛋白質が検出された場合は、低発現であると判断する。
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、好ましくはｐＲＢ低発現かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合、またはｐ１６発現陽性かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
２．ＤＮＡチップ法：
採取した腫瘍組織から、例えば常法（実験医学増刊「ＰＣＲとその応用」８：１０６３−１０７１，１９９０）によりｍＲＮＡを抽出して、逆転写反応によって蛍光標識し、合成された標識ｃＤＮＡを癌関連遺伝子のＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅがスポットしてあるマイクロアレイＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣＨＩＰ Ｖｅｒ．４．０（タカラバイオ株式会社Ｘ１０２）上にハイブリダイズする（Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１；１０−１４；１９９９）。
その際、腫瘍組織サンプルと正常組織サンプルを別々の蛍光色素で，例えばＣｙ３（赤）とＣｙ５（緑）に標識することによって、どちらのサンプルで遺伝子が増えているかを判定する。コンピュータ解析ソフトにより、正常組織から得られた標識ｃＤＮＡをハイブリダイズした場合と比較して癌組織の方が多ければ例えば赤、同等ならば例えば黄、少なければ例えば緑として画像表示させることができる。このシグナルの強弱をコンピューター解析ソフトで数値化することで、両者における遺伝子発現比（Ｃｙ３＝癌組織／Ｃｙ５＝正常組織）のデーターを算出し、これらの発現比が２倍以上または１／２以下を、好ましくは３倍以上または１／３以下を有意として判定する。
ｐＲＢが緑、ｐ１６が黄若しくは赤、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅが赤の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。好ましくはｐＲＢが緑かつｃｙｃｌｉｎ Ｅが赤の場合、またはｐ１６が黄若しくは赤かつｃｙｃｌｉｎ Ｅが赤の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
３．ウエスタンブロット法：
以下のウエスタンブロット法、免疫組織染色法及びＥＬＩＳＡ法に用いる抗ｐＲＢ抗体・抗ｐ１６抗体・抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体は、市販の抗体を用いることができる。抗ｐＲＢ抗体は、例えばＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社からＲｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（カタログＮｏ．：９３０２）を、抗ｐ１６抗体は、例えばＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社からｐ１６（Ｃ−２０）（カタログＮｏ．：ｓｃ−４６８）を、抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体は、例えばＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社からＰｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ（カタログＮｏ．：５５４１８２）を入手できる。
また、抗体は上記Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．に記載の情報を基に作製された抗原を免疫して作製することも可能である。抗原は、上記Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．に記載の配列情報を基にｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ発現ベクターを作製し、該ベクターを導入した発現細胞からｐＲＢ−ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ蛋白を精製して得ることができる。これら蛋白質は精製が容易となるよう、融合蛋白質として発現させることが好ましい。また別法として、上記Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．に記載の配列情報を基にペプチドを合成し、キャリアー蛋白質と結合させて抗原とすることもできる。それら抗原を動物に免疫し、得られた血清から抗体を精製するか、または得られた抗体産生細胞からハイブリドーマを作製して、その培養液から抗体を精製することができる。
また、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ、特にｐＲＢの変異を検出するために、例えば、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６９２２−６，１９９０；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６−１０，１９９０に記載の変異を有する変異蛋白質を発現させ、または変異部位を含むペプチドを合成して、それを動物に免疫し、変異蛋白質に特異的に反応する抗体を得ることができる。または逆に、正常蛋白質を免疫して、正常蛋白質は反応するが変異蛋白質には反応しない抗体も作製可能である。抗体の作製法はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２，ｐ６６３−６７９に記載されている。
採取した腫瘍組織より、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調整する。具体的には例えば、腫瘍組織を細胞調製液（好ましくは各種プロテアーゼ阻害剤及び１０％グリセロールを含む）を用いてホモゲナイズし、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを混合し９７℃で５分の熱処理を行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとする。ウエスタンブロット法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２，６７９−６８８に記載の方法により行うことができるが、具体的には例えば以下の通り行うことができる。
各サンプル一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画後、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜にトランスファーし、抗ｐＲＢ抗体・抗ｐ１６抗体・抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体を反応させた後、酵素標識した二次抗体を反応させ、酵素活性によりＨｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜にトランスファーされたｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６を検出する。好ましくは対照として、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が認められる標準細胞、好ましくは全ての発現が認められるＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞等を同時にアプライして、ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞での発現と比較して、高発現であるか低発現であるかを判断する。
また、標準細胞とは電気泳動度の異なるバンドが現れた場合、または変異蛋白質が検出された場合は、低発現であると判断する。
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、好ましくはｐＲＢ低発現かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合、またはｐ１６発現陽性かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
４．免疫組織染色法
免疫組織染色法は、例えば実験医学別冊（ポストゲノム時代の免疫染色、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、１９９７）に記載の方法により行うことができるが、具体的には例えば以下の通り行うことができる。
採取した腫瘍組織に埋包剤を浸透させてブロックを作製した後、２〜８μｍの厚さにスライスしてスライドガラスに貼り付けて組織標本を作製する。組織標本に、抗ｐＲＢ抗体や抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体、または抗ｐ１６抗体を反応させた後、アビジン−ビオチン−酵素抗体法にて染色する（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２７；１１３１−１１３９，１９７９）。染色した組織標本中の腫瘍組織のｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの染色度を正常組織と比較して、ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性あるいはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現を判断する。変異蛋白質が検出された場合は、低発現であると判断する。
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、好ましくはｐＲＢ低発現かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合、またはｐ１６発現陽性かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
５．ＥＬＩＳＡ法
ＥＬＩＳＡ法はＥｄ Ｈａｒｌｏｗら（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載の方法により行うことができるが、具体的には例えば以下の通り行うことができる。
採取した腫瘍組織より、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅを含む画分を調整する。具体的には例えば、腫瘍組織を細胞調製液（好ましくは各種プロテアーゼ阻害剤及び１０％グリセロールを含む）を用いてホモゲナイズし、そこに１％ＮＰ−４０を添加して可溶画分と残渣を得る。可溶画分をそのままＥＬＩＳＡ法に用いるか、もしくは残渣画分を０．５ＭのＮａＣｌを加え抽出操作を行った後、ＮａＣｌ濃度を０．１〜０．１５Ｍに下げてからＥＬＩＳＡ法に用いる。
可溶画分及びＮａＣｌ抽出画分を、抗ｐＲＢ抗体、抗ｐ１６抗体、または抗ｃｙｃｌｉｎ Ｅ抗体がコートされている９６穴プレートに添加し抗体と反応させる。コートされた抗体に結合したｐＲＢ、ｐ１６、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅを、それぞれに対する酵素標識抗体でサンドイッチし、結合した酵素の活性を測定することにより腫瘍組織で発現しているｐＲＢ、ｐ１６、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅを定量する。
高感受性及び低感受性の癌細胞のｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの量を測定してカットオフ値を決め、カットオフ値との比較で高発現であるか低発現であるかを判断する。
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合に、好ましくはｐＲＢ低発現かつｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の場合、またはｐ１６発現陽性かつｃｙｃｌｉｎ Ｅが高発現の場合に、該癌細胞が本化合物に対して高感受性であると判断する。
【図面の簡単な説明】
図１は、各ヒト癌細胞株におけるｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１のウエスタンブロットによる発現量解析結果である。
図２は、ＳＹ−１株及びＨ−５２６株，Ｈ−４６０株におけるｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの免疫組織染色よる発現量解析結果である。
図３は、子宮体癌の臨床標本におけるｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの免疫組織染色よる発現量解析結果である。
図４は、ｐ１６ ｍＲＮＡ量とＴ／Ｃ％、１６ ｍＲＮＡ量とｐ１６蛋白の発現量の関連を示したグラフである。
【実施例】
以下に、本発明の有用性を示すための例を示すが、これらは例示的なものであって、本発明は如何なる場合にも以下の具体例に制限されるものではない。
［実施例１］ＢＳＹ−１株及びＷｉＤｒ株を含むヒト癌細胞株２５株における細胞周期関連分子群の発現解析
ＷＯ ０２／０６０８９０において、下記式ＩＩで表される（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−アセトキシ−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（以下、化合物１と称す）に対して強い感受性を示したＢＳＹ−１株、及びＷＯ ０３／０９９８１３において一般式１で表される化合物のうちＲ１が水酸基である化合物群に対して感受性を示したＷｉＤｒ株を含む、ヒト癌細胞株２５株における細胞周期関連分子群ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現をウエスターンブロット法にて解析した。
２５株のヒト癌細胞株をヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で腫瘍を摘出、各種プロテアーゼ阻害剤（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，ｐ−ＡＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，ｏ−ＮａＶＯ４）及び１０％グリセロール含有の細胞調製液を用いてホモゲナイズした。その際、腫瘍サンプル重量あたりの細胞調製液量を一定にした。それぞれの細胞調製液に、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーを混合し、９７℃で５分の熱処理を行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。各ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルの一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、Ｈｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜にトランスファーした後、ｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１に対する抗体を反応させた。その後ＨＲＰ標識の二次抗体を反応させ化学発光基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ；ＰＩＥＲＣＥ社）を加えて、イメージマスターＶＤＳ−ＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１のｂａｎｄを検出した。
各癌細胞株におけるｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現量を相対的に比較するための対照として、全分子の発現が認められるＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞をすべてのＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライして同様に検出した。
その結果を図１に示した。強い感受性を示すＢＳＹ−１株にｐＲＢの欠失、ｐ１６の発現、ｃｙｃｌｉｎ Ｅの高発現という性質が有ることから、これら性質が、ｉｎ ｖｉｖｏでの本化合物への感受性に関連するか否かについて検討を行った。
図１において、Ａ〜Ｚ、Ｅ、Ａ１〜Ｅ１およびＥの各符号は、各々下記のヒト癌細胞株を示す。
［実施例２］ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｅｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現と本化合物への感受性の相関
実施例１でｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現を調べた２５株のヒト癌細胞株について、代表的な本化合物、下記式ＩＩＩで示される［（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド］（以下、化合物２と称す）に対する感受性を調べた。
培養フラスコ、またはヌードマウスの皮下において増殖させた２５種類のヒト癌細胞を、ヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で各群の腫瘍体積の平均が均一になるように群分けをし、対照群５匹、化合物２投与群５匹とした。投与群には１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように５日間静注し、対照群は無処理または媒体投与とした。投与開始日（Ｄａｙ１）からＤａｙ５，８，１２，１５と以下経時的に腫瘍体積を測定し、相対的な腫瘍体積比（Ｔ／Ｃ％）を求めた。
ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現と化合物２への感受性の相関を、表１に示した。実施例１で解析したヒト癌細胞株におけるｐＲＢ・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現量を相対的に評価し、発現が認められないものを−、発現量が認められるものをその強度に応じて＋〜＋＋＋と表記して、腫瘍体積比（Ｔ／Ｃ％）の結果と並べて示した。また、ｐＲＢに関しては、変異型ｐＲＢの発現が報告されている小細胞肺癌株・卵巣癌株・前立腺癌株（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９，３３７５−３３７８，１９９４；Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２１，１４５−５２，１９９２；Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２３３，２３３−９，１９９７）に（ ）を付して記載した。
調べたヒト癌細胞株２５株中、ウエスタンブロット法でバンドが検出されない（「−」で表示）、または文献情報で変異や欠失が報告されている（括弧付きで表示）癌細胞株１１株がｐＲＢ低発現に分類され、このうちの７株（６４％）がＴ／Ｃ％≦１％であった。これに対しｐＲＢを発現している１４株にはＴ／Ｃ％≦１％となる癌細胞株は無く（ｐ＝０．０００６）、ｐＲＢ低発現により化合物２に対する感受性を検定できることが明らかとなった。
またｐ１６発現陽性の癌細胞１０株中７株（７０％）がＴ／Ｃ％≦１％であるのに対し、ｐ１６を発現していない１５株にはＴ／Ｃ％≦１％となる癌細胞株は無く（ｐ＝０．０００２）、ｐＲＢ低発現と同様、ｐ１６発現陽性により化合物２に対する感受性の検定が可能であった。
調べた２５の癌細胞株株の中で、１１株がｐＲＢ低発現（ウエスターンブロット法で検出されなかったか文献情報で変異や欠失が報告されている）に分類され、このうちの９株でｐ１６は発現していた。逆にｐ１６を発現している１０株中９株がｐＲＢ低発現であり、報告されている通り（ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５０３−５１１，１９９５）、ｐ１６発現陽性の癌細胞はｐＲＢ低発現の癌細胞とほぼ一致していた。
ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現については、高発現（＋＋＋）している９株中５株（５６％）がＴ／Ｃ％≦１％であるのに対し、高発現していない癌細胞では１６株中２株（１３％）がＴ／Ｃ％≦１％と、ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の癌細胞は明らかに感受性が高かった（ｐ＝０．０２）。
完全な腫瘍の消失（Ｔ／Ｃ％＝０％）を見た４株、及び消失はしないまでも長期間にわたる腫瘍縮小の継続を示したＮＣＩ−Ｈ１４６を合わせた５株に対する化合物２の効果は、治癒的効果と考えられ、これら全ての株はｐＲＢ低発現・ｐ１６発現・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現という性質を示した。
そこで、ｐＲＢ低発現・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の２つの性質と、化合物２の治癒的効果の相関を見てみると、両方の性質を持つ癌細胞７株中５株（７１％）で治癒的効果を示したのに対し、それ以外の癌細胞株１８株中には治癒的効果を示した癌細胞株は見出されなかった（ｐ＝０．０００１）。また、ｐ１６発現陽性・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の両方の性質を持つ癌細胞では、両方の性質を持つ癌細胞６株中５株（８３％）で治癒的効果を示し、それ以外の癌細胞株１９株中には治癒的効果を示した癌細胞株は見出されなかった（ｐ＝０．００００２）。ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現は、ｐＲＢ低発現またはｐ１６発現陽性の指標と組み合わせることにより、更に有用な指標となった。
これらの結果より、ｐＲＢ低発現・ｐ１６発現・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の性質を調べることにより、癌細胞株の化合物２に対する感受性が予見できることが明らかとなった。
［実施例３］代表的な３化合物に対する癌細胞株の感受性検定
ＷＯ ０２／０６０８９０においてＢＳＹ−１株に対して高い抗腫瘍活性を示した化合物１、及びＷＯ ０３／０９９８１３においてＷｉＤｒ株に対して抗腫瘍活性を示した一般式Ｉで表される本化合物のうち代表的な化合物（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−７−（（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（下記式ＩＶ、以下化合物３と称す）、及び（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド（下記式Ｖ、以下化合物４と称す）について、ヒト癌細胞株のｐＲＢ低発現・ｐ１６発現・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の性質と、感受性の相関について調べた。
培養フラスコ、またはヌードマウスの皮下において増殖させた癌細胞を、ヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で各群の腫瘍体積の平均が均一になるように群分けをし、対照群５匹、化合物投与群５匹とした。投与群には１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように５日間静注し、対照群は無処理または媒体投与とした。投与開始日（Ｄａｙ１）からＤａｙ５，８，１２，１５と以下経時的に腫瘍体積を測定し、相対的な腫瘍体積比（Ｔ／Ｃ％）を求めた。但し、化合物１の評価の際は原則としてＤａｙ１５までで実験を終了した。表２には、各癌細胞に対する化合物１，２，４、及び実施例２の化合物２のＴ／Ｃ％を示した。
表２に示す通り、化合物１のＴ／Ｃ％が多少大きな値を示すものの試験した化合物全てで抗腫瘍効果が認められ、各種ヒト癌細胞株のこれら化合物に対する感受性は同じ傾向を示した。化合物１，３，４で化合物２とのＴ／Ｃ％の相関を求めたところ、それぞれ０．７２４、０．９４８、０．９２３と高い相関を示した。このことから、一般式Ｉで表される化合物間において、各種癌細胞株の感受性が共通していることが示された。
［実施例４］ＢＳＹ−１株及びＨ−５２６株，Ｈ−４６０株におけるｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ発現の免疫組織染色による解析
化合物２に対して治癒するまでの強い感受性を示したＢＳＹ−１株、及び治癒には至らないまでも強い感受性を示したＨ５２６株、更には感受性が低かったＨ４６０株において、細胞周期関連分子群ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現を免疫組織染色法にて解析した。
上記３株のヒト癌細胞株をヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で腫瘍を摘出して、中和した１０％ホルマリンにて１日間固定してパラフィン包埋ブロックを作製した。パラフィンブロックを４μｍの厚さにスライスしてスライドグラスに貼り付けたものを、免疫組織染色用標本とした。免疫組織染色用標本は、脱パラフィン操作、恒温槽を用いた熱処理で抗原賦活化、内在性ペルオキシダーゼのブロッキングなどの操作を施した後に、ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する一次抗体と室温で１時間反応させた。ペルオキシダーゼ標識した抗マウスあるいは抗ウサギ二次抗体を反応させて、ＤＡＢを発色基質としてそのペルオキシダーゼ活性を可視化して顕微鏡下観察した。
その結果を図２示した。ウエスタンブロット法で示された結果と同様の結果が、免疫組織染色においても得られることが明らかとなった。この結果から、臨床において繁用されるパラフィン包埋ブロックの標本を用いても、細胞周期関連分子群ｐＲＢ・ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現解析が行える可能性が示された。
［実施例５］臨床標本におけるｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ発現の免疫組織染色による解析
ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より購入したパラフィン包埋の臨床標本（正常組織１２、癌組織１２）を用いて、免疫組織染色法による細胞周期関連分子群ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現解析を行った。
臨床パラフィン包埋標本を、実施例４と同様にｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する抗体で免疫組織染色を行った。その結果、正常組織において、ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの過剰発現は観察されなかったのに対し、一部の癌組織においてｐ１６（１２例中３例）、ｃｙｃｌｉｎ Ｅ（１２例中１例）の過剰発現が観察された。図３には、ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの両分子が過剰発現していた子宮体癌の染色結果を示した。この結果から、臨床パラフィン包埋ブロックの標本を用いても、細胞周期関連分子群ｐ１６及びｃｙｃｌｉｎ Ｅが過剰発現している癌組織を選別出来る可能性が示された。
［実施例６］臨床標本におけるｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅ発現の免疫組織染色−２
実施例５に加え、更に多数の癌種（胃癌・食道癌・肺癌・大腸癌・甲状腺癌・腎癌・乳癌・肝癌・膀胱癌・卵巣癌・膵癌・前立腺癌・子宮内膜癌・胆嚢癌・喉頭癌・子宮頸癌・悪性リンパ腫・悪性メラノーマ、各１０サンプルの合計１８０サンプル）についてパラフィン包埋した臨床腫瘍標本をＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より購入し、実施例４、５と同様に、免疫組織染色法による細胞周期関連分子群ｐ１６・ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現解析を行った。
臨床パラフィン包埋標本を、実施例４、５と同様に、ｐ１６，ｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する抗体で免疫組織染色を行ったところ、表２に示したとおり、「ｐ１６及びｃｙｃｌｉｎ Ｅの過剰発現」の特徴が、子宮頸癌において１０例中全例で観察されたのを筆頭に、卵巣癌で１０例中４例、乳癌で１０例中３例において認められた。臨床パラフィン包埋ブロックの標本を用いた「ｐ１６及びｃｙｃｌｉｎ Ｅの過剰発現」の癌組織を選別出来る可能性が確認されると共に、癌種によっては高率で「ｐ１６及びｃｙｃｌｉｎ Ｅの過剰発現」の特徴を持っている可能性があることが示された。
［実施例７］ＲＴ−ＰＣＲによるｐ１６過剰発現の検出
２８株のヒト癌細胞株をヌードマウスの体側皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上になった時点で腫瘍を摘出し、各癌種につき３例の腫瘍をプールした。それらの腫瘍を液体窒素で凍結後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＳＩＧＭＡ社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＯＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。Ｔａｑｍａｎ（Ｒ） ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＢＩ社）を用いてｃＤＮＡを合成後、プローブとしてｐ１６のＴａｑｍａｎ（Ｒ） ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（ＡＢＩ社）と反応試薬としてＴａｑｍａｎ（Ｒ） Ｇｏｌｄ ＲＴ−ＰＣＲ ｒｅａｇｅｎｔｓを用いてＳｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ（７９００ＨＴ、ＡＢＩ社）で各腫瘍のｐ１６ ｍＲＮＡ量を測定した。得られた数値を１８Ｓ ｒＲＮＡの値で補正してｐ１６ ｍＲＮＡの相対的な量を求めた。
表３に、実施例１においてウエスタンブロット法により求めたｐ１６蛋白の発現量を求め、実施例２において抗腫瘍効果Ｔ／Ｃ％を求めたヒト癌細胞株について、ｐ１６ ｍＲＮＡの相対的な量をまとめて示した。また、図４にｐ１６ ｍＲＮＡ量とＴ／Ｃ％、１６ ｍＲＮＡ量とｐ１６蛋白の発現量の関連をグラフに示した。
表３及び図４に示す通り、ｐ１６ ｍＲＮＡの相対量が０．３以上の高発現癌細胞１２株中６株（５０％）で、Ｔ／Ｃ％≦１％であるのに対し、０．３未満の１３株中ではＴ／Ｃ％≦１％となる癌細胞株は１株しか存在しなかった（ｐ＝０．０２）。ｐ１６ ｍＲＮＡ量の測定により、「ｐ１６過剰発現」の癌をスクリーニングし、化合物２に対する感受性を検定することが可能であることが明らかとなった。
また表３及び図４に示す通り、ｐ１６蛋白の発現量とｐ１６ ｍＲＮＡ量の間には相関が認められ、ｐ１６蛋白の過剰発現（＋＋）を認めた８株におけるｐ１６の相対的ｍＲＮＡ量が０．５７８６±０．３２５９であるのに対し、ｐ１６蛋白発現（＋）の２株では０．３６１０、ｐ１６蛋白が認められなかった１５株では０．２０７３±０．２４２４であった。ＲＴ−ＰＣＲ等のｐ１６ ｍＲＮＡを検出する方法によっても、ｐ１６蛋白発現を検出する方法と同様な結果を得ることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
ｐＲＢ低発現、ｐ１６発現陽性またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ高発現の特徴を調べることにより、本化合物に対する癌細胞の感受性を調べ、本化合物の抗腫瘍効果が期待できる癌患者のみに本化合物を投与すれば、治療効果を高め不要な副作用を軽減することが可能である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ｐＲＢの発現が減少している、
２）ｐ１６が発現している、
３）ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、
４）ｐＲＢの発現が減少しかつｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、または
５）ｐ１６が発現しかつｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、の何れか一つを指標とする、下記一般式Ｉで表される化合物に対する癌細胞の感受性を検定する方法。
式（Ｉ）
［式中、Ｒ１は
１）水素原子または
２）水酸基
Ｒ３は
１）水素原子、
２）水酸基または
３）Ｃ１−６アルコキシ基
Ｒ２は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
４）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基
５）式（ＩＩ）
［式中、
Ａ）
ｎは０ないし４の整数、
Ｘは
ｉ）−ＣＨＲＮ４−、
ｉｉ）−ＮＲＮ５−または
ｉｉｉ）−Ｏ−、
ＲＮ１及びＲＮ２は同一または異なって、
ｉ）水素原子または
ｉｉ）Ｃ１−６アルキル基、
ＲＮ３及びＲＮ４は同一または異なって、
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
ｉｖ）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
ｖ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｖｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖｉｉ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
ｖｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
ｉｘ）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
ｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
ｘｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ｘｉｉ）−ＮＲＮ６ＲＮ７（ここにおいて、ＲＮ６およびＲＮ７は同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
ｘｉｉｉ）ＲＮ３及びＲＮ４が一緒になって結合する炭素原子と共に形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基（該非芳香族複素環式基は置換基を有していても良い）、
ＲＮ５は
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
ｉｖ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｖ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖｉ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
ｖｉｉ）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
ｖｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
ｉｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
ｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基または
ｘｉ）ＲＮ３及びＲＮ５が一緒になって結合する窒素原子と共に形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基（該非芳香族複素環式基は置換基を有していても良い）、
Ｂ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ３、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ１及びＲＮ２は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
Ｃ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ２、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ１及びＲＮ３は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基あるいは
Ｄ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ１、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ２及びＲＮ３は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
または
６）式（ＩＩＩ）
［式中、ＲＮ８及びＲＮ９は同一または異なって、
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｉｖ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基または
ｖｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基を表す］
を表す］
【請求項２】
Ｒ２が
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基または
４）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基である請求項１に記載の検定方法。
【請求項３】
Ｒ２が下記式（ＩＶ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＩＶ）
［式中、ｎは０ないし４の整数、
ＲａＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲａＮ２は
１）水素原子
２）Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、
３）Ｎ，Ｎ−ジＣ１−６アルキルアミノ基、
４）エチルメチルアミノ基、
５）ピリジル基、
６）ピロリジン−１−イル基、
７）ピペリジン−１−イル基、
８）モルホリン−４−イル基または
９）４−メチルピペラジン−１−イル基を表す］
【請求項４】
Ｒ２が下記式（Ｖ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（Ｖ）
（式中、ｎ１及びｎ２は同一または異なって、０ないし４の整数、
Ｘｂは
１）−ＣＨＲｂＮ４−、
２）ＮＲｂＮ５−または
３）−Ｏ−、
ＲｂＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｂＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｂＮ４は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
１１）−ＮＲｂＮ６ＲｂＮ７（ここにおいて、ＲｂＮ６およびＲｂＮ７は、同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
１２）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ＲｂＮ５は
ｌ）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
５）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
６）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
７）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
９）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
【請求項５】
Ｒ２が下記式（ＶＩ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＶＩ）
［式中、ｎ３は１または２の整数、
ＲｃＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｃＮ５は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基を表す］
【請求項６】
Ｒ２が下記式（ＶＩＩ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＶＩＩ）
（式中、ｎ１及びｎ２は同一または異なって、０ないし４の整数、
Ｘｄは
１）−ＣＨＲｄＮ４−、
２）−ＮＲｄＮ５−または
３）−Ｏ−、
ＲｄＮ２は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｄＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｄＮ４は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
１１）−ＮＲｄＮ６ＲｄＮ７（ここにおいて、ＲｄＮ６及びＲｄＮ７は同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
１２）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ＲｄＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
５）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
６）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
７）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
９）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
１０）置換基を有していても良い５ないしｌ４員環非芳香族複素環式基を表す］
【請求項７】
Ｒ２が下記式（ＶＩＩＩ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＶＩＩＩ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｅＮ４は
１）アミノ基、
２）Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、
３）ピロリジン−１−イル基、
４）ピペリジン−１−イル基または
５）モルホリン−４−イル基を表す］
【請求項８】
Ｒ２が下記式（ＩＸ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＩＸ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｆＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｆＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
４）置換基を有していても良い３ないし８員環非芳香族複素環式基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良い５員環ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基を表す］
【請求項９】
Ｒ２が下記式（Ｘ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（Ｘ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｇＮ５は
１）水素原子、
２）置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、
３）置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、
４）置換されていてもよいＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
５）置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、
６）置換されていてもよいピリジル基または
７）置換されていてもよいテトラヒドロピラニル基を表す］
【請求項１０】
一般式（Ｉ）で表される化合物が下記化合物の何れか一つの化合物である、請求項１に記載の検定方法。
１）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−アセトキシ−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
２）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド、
３）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−７−（（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド及び
４）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
【請求項１１】
ｐＲＢの発現の減少、ｐ１６の発現、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現の増強を、それぞれをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検定する、請求項１に記載の検定方法。
【請求項１２】
ｍＲＮＡ量を測定する方法が定量的ＲＴ−ＰＣＲ法である、請求項１１に記載の検定方法。
【請求項１３】
ｍＲＮＡ量を測定する方法がＤＮＡチップ法である、請求項１１に記載の検定方法。
【請求項１４】
ｐＲＢの発現の減少、ｐ１６の発現、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現の増強を、それぞれの蛋白質量を測定することにより検定する、請求項１に記載の検定方法。
【請求項１５】
蛋白質量を測定する方法がウエスタンブロット法である、請求項１４に記載の検定方法。
【請求項１６】
蛋白質量を測定する方法が免疫組織染色法である、請求項１４に記載の検定方法。
【請求項１７】
蛋白質量を測定する方法がＥＬＩＳＡ法である、請求項１４に記載の検定方法。
【請求項１８】
ｐＲＢ、ｐ１６またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ遺伝子の連続した少なくとも１５塩基の配列から成るプライマーを含んで成る、請求項１２の検定方法に使用するキット。
【請求項１９】
ｐＲＢ、ｐ１６またはｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する抗体を含んで成る、請求項１５、１６または１７に記載の検定方法に使用するキット。
【請求項１】
１）ｐＲＢの発現が減少している、
２）ｐ１６が発現している、
３）ｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、
４）ｐＲＢの発現が減少しかつｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、または
５）ｐ１６が発現しかつｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現が増強している、の何れか一つを指標とする、下記一般式Ｉで表される化合物に対する癌細胞の感受性を検定する方法。
式（Ｉ）
［式中、Ｒ１は
１）水素原子または
２）水酸基
Ｒ３は
１）水素原子、
２）水酸基または
３）Ｃ１−６アルコキシ基
Ｒ２は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
４）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基
５）式（ＩＩ）
［式中、
Ａ）
ｎは０ないし４の整数、
Ｘは
ｉ）−ＣＨＲＮ４−、
ｉｉ）−ＮＲＮ５−または
ｉｉｉ）−Ｏ−、
ＲＮ１及びＲＮ２は同一または異なって、
ｉ）水素原子または
ｉｉ）Ｃ１−６アルキル基、
ＲＮ３及びＲＮ４は同一または異なって、
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
ｉｖ）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
ｖ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｖｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖｉｉ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
ｖｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
ｉｘ）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
ｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
ｘｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ｘｉｉ）−ＮＲＮ６ＲＮ７（ここにおいて、ＲＮ６およびＲＮ７は同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
ｘｉｉｉ）ＲＮ３及びＲＮ４が一緒になって結合する炭素原子と共に形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基（該非芳香族複素環式基は置換基を有していても良い）、
ＲＮ５は
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
ｉｖ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｖ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖｉ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
ｖｉｉ）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
ｖｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
ｉｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
ｘ）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基または
ｘｉ）ＲＮ３及びＲＮ５が一緒になって結合する窒素原子と共に形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基（該非芳香族複素環式基は置換基を有していても良い）、
Ｂ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ３、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ１及びＲＮ２は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
Ｃ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ２、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ１及びＲＮ３は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基あるいは
Ｄ）
Ｘ、ｎ、ＲＮ１、ＲＮ４及びＲＮ５は前記定義の基を表し、ＲＮ２及びＲＮ３は一緒になって形成する置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
または
６）式（ＩＩＩ）
［式中、ＲＮ８及びＲＮ９は同一または異なって、
ｉ）水素原子、
ｉｉ）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
ｉｉｉ）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
ｉｖ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
ｖ）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基または
ｖｉ）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基を表す］
を表す］
【請求項２】
Ｒ２が
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基または
４）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基である請求項１に記載の検定方法。
【請求項３】
Ｒ２が下記式（ＩＶ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＩＶ）
［式中、ｎは０ないし４の整数、
ＲａＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲａＮ２は
１）水素原子
２）Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、
３）Ｎ，Ｎ−ジＣ１−６アルキルアミノ基、
４）エチルメチルアミノ基、
５）ピリジル基、
６）ピロリジン−１−イル基、
７）ピペリジン−１−イル基、
８）モルホリン−４−イル基または
９）４−メチルピペラジン−１−イル基を表す］
【請求項４】
Ｒ２が下記式（Ｖ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（Ｖ）
（式中、ｎ１及びｎ２は同一または異なって、０ないし４の整数、
Ｘｂは
１）−ＣＨＲｂＮ４−、
２）ＮＲｂＮ５−または
３）−Ｏ−、
ＲｂＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｂＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｂＮ４は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
１１）−ＮＲｂＮ６ＲｂＮ７（ここにおいて、ＲｂＮ６およびＲｂＮ７は、同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
１２）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ＲｂＮ５は
ｌ）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
５）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
６）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
７）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
９）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基を表す］
【請求項５】
Ｒ２が下記式（ＶＩ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＶＩ）
［式中、ｎ３は１または２の整数、
ＲｃＮ１は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｃＮ５は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基を表す］
【請求項６】
Ｒ２が下記式（ＶＩＩ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＶＩＩ）
（式中、ｎ１及びｎ２は同一または異なって、０ないし４の整数、
Ｘｄは
１）−ＣＨＲｄＮ４−、
２）−ＮＲｄＮ５−または
３）−Ｏ−、
ＲｄＮ２は
１）水素原子または
２）Ｃ１−６アルキル基、
ＲｄＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｄＮ４は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ１−６アルコキシ基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
１０）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基、
１１）−ＮＲｄＮ６ＲｄＮ７（ここにおいて、ＲｄＮ６及びＲｄＮ７は同一または異なって、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表す）または
１２）置換基を有していても良い５ないし１４員環非芳香族複素環式基、
ＲｄＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良い不飽和Ｃ２−１０アルキル基、
４）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
５）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
６）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
７）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
８）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
９）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
１０）置換基を有していても良い５ないしｌ４員環非芳香族複素環式基を表す］
【請求項７】
Ｒ２が下記式（ＶＩＩＩ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＶＩＩＩ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｅＮ４は
１）アミノ基、
２）Ｎ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、
３）ピロリジン−１−イル基、
４）ピペリジン−１−イル基または
５）モルホリン−４−イル基を表す］
【請求項８】
Ｒ２が下記式（ＩＸ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（ＩＸ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｆＮ８は
１）水素原子、
２）Ｃ１−６アルキル基、
３）Ｃ６−１４アリール基または
４）Ｃ７−１０アラルキル基、
ＲｆＮ５は
１）水素原子、
２）置換基を有していても良いＣ１−６アルキル基、
３）置換基を有していても良いＣ３−８シクロアルキル基、
４）置換基を有していても良い３ないし８員環非芳香族複素環式基、
５）置換基を有していても良いＣ６−１４アリール基、
６）置換基を有していても良い５ないし１４員環ヘテロアリール基、
７）置換基を有していても良いＣ７−１０アラルキル基、
８）置換基を有していても良い５員環ないし１４員環ヘテロアラルキル基または
９）置換基を有していても良いＣ４−９シクロアルキルアルキル基を表す］
【請求項９】
Ｒ２が下記式（Ｘ）で表される請求項１に記載の検定方法。
式（Ｘ）
［式中、ｎ３は１ないし３の整数、
ＲｇＮ５は
１）水素原子、
２）置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、
３）置換されていてもよいＣ３−８シクロアルキル基、
４）置換されていてもよいＣ４−９シクロアルキルアルキル基、
５）置換されていてもよいＣ７−１０アラルキル基、
６）置換されていてもよいピリジル基または
７）置換されていてもよいテトラヒドロピラニル基を表す］
【請求項１０】
一般式（Ｉ）で表される化合物が下記化合物の何れか一つの化合物である、請求項１に記載の検定方法。
１）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−アセトキシ−３，６，２１−トリヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
２）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド、
３）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−７−（（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド及び
４）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−７−（（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド
【請求項１１】
ｐＲＢの発現の減少、ｐ１６の発現、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現の増強を、それぞれをコードするｍＲＮＡ量を測定することにより検定する、請求項１に記載の検定方法。
【請求項１２】
ｍＲＮＡ量を測定する方法が定量的ＲＴ−ＰＣＲ法である、請求項１１に記載の検定方法。
【請求項１３】
ｍＲＮＡ量を測定する方法がＤＮＡチップ法である、請求項１１に記載の検定方法。
【請求項１４】
ｐＲＢの発現の減少、ｐ１６の発現、またはｃｙｃｌｉｎ Ｅの発現の増強を、それぞれの蛋白質量を測定することにより検定する、請求項１に記載の検定方法。
【請求項１５】
蛋白質量を測定する方法がウエスタンブロット法である、請求項１４に記載の検定方法。
【請求項１６】
蛋白質量を測定する方法が免疫組織染色法である、請求項１４に記載の検定方法。
【請求項１７】
蛋白質量を測定する方法がＥＬＩＳＡ法である、請求項１４に記載の検定方法。
【請求項１８】
ｐＲＢ、ｐ１６またはｃｙｃｌｉｎ Ｅ遺伝子の連続した少なくとも１５塩基の配列から成るプライマーを含んで成る、請求項１２の検定方法に使用するキット。
【請求項１９】
ｐＲＢ、ｐ１６またはｃｙｃｌｉｎ Ｅに対する抗体を含んで成る、請求項１５、１６または１７に記載の検定方法に使用するキット。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６８１
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１７８２９（Ｐ２００５−５１７８２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００２０９１
【国際出願日】平成１７年２月４日（２００５．２．４）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【出願人】（０００００１９１５）メルシャン株式会社 (48)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００２０９１
【国際出願日】平成１７年２月４日（２００５．２．４）
【出願人】（５０６１３７１４７）エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 (215)
【出願人】（０００００１９１５）メルシャン株式会社 (48)
【Ｆターム（参考）】
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