抗癌剤増感剤
【課題】安全性および安定性に優れ、低濃度で癌細胞の抗癌剤感受性を増強する抗癌剤増感剤を提供すること。
【解決手段】本発明の抗癌剤増感剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンを有効成分として含有する。本発明はまた、抗癌剤増感剤と抗癌剤とを含有する、医薬用組成物を提供する。
【解決手段】本発明の抗癌剤増感剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンを有効成分として含有する。本発明はまた、抗癌剤増感剤と抗癌剤とを含有する、医薬用組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤増感剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高濃度の一酸化窒素（ＮＯ）はアポトーシスを誘導することが知られている。この現象を利用し、化学修飾によりＮＯを多量にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に付加して得られたＳ−ニトロソ基含有ＨＳＡ（ＳＮＯ−ＨＳＡ）を癌細胞に投与することにより、癌を治療する試みが報告されている（特許文献１）。ＨＳＡは内因性の物質であるため、ＳＮＯ−ＨＳＡを体内に投与しても、副作用が少なく、ニトロソ基も安定して存在することから、ＳＮＯ−ＨＳＡは有効な抗癌剤として期待されている。しかし、癌を効果的に治療するには１０ｍｇ／ｍＬ程度以上のＳＮＯ−ＨＳＡが必要とされる。
【０００３】
ところで、抗癌剤による癌の薬物療法において、多剤併用療法のように、副作用の異なる複数の抗癌剤を併用して各薬物の副作用を軽減するとともに、各薬物の使用量を少量に抑える試みが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−５７３１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性および安定性に優れ、低濃度で癌細胞の抗癌剤感受性を増強する抗癌剤増感剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミンが高い抗癌剤増感作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明の抗癌剤増感剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンを有効成分として含有する。
【０００８】
１つの実施態様では、上記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンは、２〜１０μＭの濃度で含有される。
【０００９】
本発明はまた、上記抗癌剤増感剤と抗癌剤とを含有する、医薬用組成物を提供する。
【００１０】
１つの実施態様では、上記抗癌剤増感剤に含有される上記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンは、ヒトに対して２〜１０ｍｇ／ｋｇ・回の量で投与される。
【００１１】
１つの実施態様では、上記抗癌剤増感剤と上記抗癌剤とは、同時にまたは別々に投与される。
【００１２】
１つの実施態様では、上記抗癌剤はドキソルビシンである。
【００１３】
１つの実施態様では、上記抗癌剤は、悪性リンパ腫、肺癌、消化器癌、乳癌、膀胱腫瘍、骨肉腫、脳腫瘍、皮膚癌からなる群より選択される少なくとも１種に適用される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、安全性および安定性に優れ、低濃度で癌細胞の抗癌剤感受性を増強する抗癌剤増感剤を提供することができる。本発明の抗癌剤増感剤と抗癌剤とを組み合わせることによって、高い抗癌作用を有する医薬品組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘに対するｄｘの増殖阻害効果を示すグラフである。
【図２】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘに対するｄｘおよび／またはＳＮＯ−ＨＳＡの増殖阻害効果を示すグラフである。
【図３】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘに対するＳＮＯ−ＨＳＡの増殖阻害効果を示すグラフである。
【図４】ｄｘおよび／またはＳＮＯ−ＨＳＡを投与したＫ５６２（ａ）およびＫ５６２／ｄｘ（ｂ）由来担癌マウスの癌の進行を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図５】ｄｘおよび／またはＳＮＯ−ＨＳＡを投与したＫ５６２およびＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスの癌組織におけるＨＥ染色およびアポトーシスが誘導された細胞を示すＴＵＮＥＬ染色の写真である。
【図６】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘに対するｄｘおよび／またはＳＮＯ−ＨＳＡおよび／またはＯＤＱの増殖阻害効果を示すグラフである。
【図７】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘの細胞内のｄｘの蓄積に対するＳＮＯ−ＨＳＡの効果を示すグラフである。
【図８】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘの細胞内のＰ−ｇｐの発現に対するＳＮＯ−ＨＳＡの効果を示すグラフである。
【図９】Ｋ５６２の細胞内のＨＩＦ−１αの発現に対するＳＮＯ−ＨＳＡの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗癌剤増感剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン（ＳＮＯ−ＨＳＡ）を有効成分として含有する。
【００１７】
本発明のＳＮＯ−ＨＳＡとは、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上のＳ−ニトロソ基が導入されているアルブミンをいう。
【００１８】
本発明におけるアルブミンは、天然のアルブミンであってもよいし、遺伝子組換え法によって生産されたアルブミンであってもよい。
【００１９】
天然のアルブミンとは、ヒトや哺乳動物などの体内に存在するアルブミンをいい、卵白アルブミンや筋アルブミン（ミオゲン）も含む。
【００２０】
遺伝子組換え法によって生産されたアルブミンは、天然のアルブミンと同等の機能を有する限り、天然のアルブミンのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるアルブミンも含む。例えば、天然のアルブミンのアミノ酸配列中の４１０番目のアルギニンをシステインに置換したアルブミンが挙げられる。
【００２１】
本発明のＳＮＯ−ＨＳＡは、天然のＳＮＯ−ＨＳＡであってもよいし、人為的にＳ−ニトロソ基をアルブミンに導入して得られたＳＮＯ−ＨＳＡであってもよい。
【００２２】
Ｓ−ニトロソ基は、アルブミンを構成するアミノ酸中に存在する硫黄原子、例えば、チオール基における硫黄原子がニトロソ基で置換されることにより、アルブミンに導入される。チオール基を含有するアミノ酸としては、例えば、システイン、シスチン、メチオニンが挙げられる。
【００２３】
通常、天然のアルブミンは３５個のシステインを含有し、そのうち３４個はアルブミンの二次構造の形成のためにジスルフィド結合を形成している。このため、例えば、天然のアルブミンにシステインのチオール基を介してＳ−ニトロソ基を導入する場合には、ジスルフィド結合に関与しない１個のシステインにＳ−ニトロソ基を導入することができる。
【００２４】
アルブミンのチオール基に人為的にＳ−ニトロソ基を導入する方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の方法が挙げられる。例えば、ニトロソ化試薬（亜硝酸イオン、イソアミルナイトライト、ｎ−ブチルナイトライトなど）を用いる方法が挙げられる。
【００２５】
アルブミンに人為的にチオール基を導入して、このチオール基にＳ−ニトロソ基を導入することもできる。アルブミンに人為的にチオール基を導入する方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の方法が挙げられる。例えば、チオール化試薬（２−イミノチオランまたはその塩など）を用いて、リジンのε−アミノ基にチオール基を導入する方法が挙げられる。
【００２６】
本発明の抗癌剤増感剤の投与経路としては、特に限定されないが、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜、経口、吸入が挙げられ、好ましくは非経口投与経路、より好ましくは注射による投与経路である。
【００２７】
本発明の抗癌剤増感剤の剤形としては、特に限定されないが、例えば、注射剤、パッチ剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、クリーム剤、ローション剤、粉剤が挙げられる。
【００２８】
特に、注射剤とする場合には、ＳＮＯ−ＨＳＡを含有する溶液または懸濁液とすればよく、さらに、例えば、ｐＨ調整剤、電解質、糖類、ビタミン類、薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸および／またはアミノ酸などの当該分野で通常用いられる添加剤を適宜添加してもよい。
【００２９】
溶液または懸濁液とする場合には、例えば、日本薬局方で規定される水（注射用水）、生理食塩水、各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）などを用いることができる。
【００３０】
ｐＨ調節剤としては、一般に注射剤のｐＨ調節剤として用いられるものであればよい。例えば、クエン酸、酒石酸、酢酸、乳酸などの有機酸、例えば、塩酸、リン酸などなどの無機酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどの無機塩基が挙げられる。
【００３１】
電解質としては、従来より輸液に用いられている各種水溶性塩を用いることができる。例えば、生体の機能や体液の電解質バランスを維持するうえで必要とされる各種無機成分（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン）の水溶性塩（例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩）が挙げられる。
【００３２】
糖類としては、従来より各種の輸液に用いられているものを用いることができる。例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類、ラクトース、マルトースなどの二糖類、グリセロールなどの多価アルコール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール、デキストラン４０またはデキストラン８０などのデキストラン類、蔗糖が挙げられる。
【００３３】
ビタミン類としては、水溶性／脂溶性の各種ビタミンを用いることができる。例えば、ビタミンＡ、プロビタミンＡ、ビタミンＤ、プロビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＢ６群、パントテン酸、ビオチン、ミオ−イノシトール、コリン、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＰまたはビタミンＵが挙げられる。
【００３４】
薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、ギ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、カプリル酸、コハク酸、リンゴ酸などの有機酸、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシククロヘキシルアミンなどの有機塩基が挙げられる。
【００３５】
アミノ酸としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられる。また、Ｎ−アセチルメチオニンなどのアミノ酸誘導体を添加してもよい。
【００３６】
本発明の抗癌剤増感剤は、通常の製剤学的方法に従って製造することができる。すなわち、水、各種緩衝液、一般に市販されている輸液（例えば、総合アミノ酸輸液、電解質輸液）またはそれらと同様の成分を含む水溶液などに、ｐＨが４．５〜８．７程度となるように、ＳＮＯ−ＨＳＡを希釈および／または溶解することによって製造することができる。
【００３７】
本発明の抗癌剤増感剤に含有されるＳＮＯ−ＨＳＡの濃度は、通常０．５〜１０μＭ、好ましくは２〜１０μＭである。
【００３８】
本発明の抗癌剤増感剤と併用する抗癌剤としては、特に限定されないが、例えば、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、シクロホスファミドが挙げられる。抗癌剤が適用される癌としては、特に限定されないが、例えば、悪性リンパ腫、肺癌、消化器癌、乳癌、膀胱腫瘍、骨肉腫、脳腫瘍、皮膚癌が挙げられる。
【００３９】
これらの抗癌剤の単独投与は、癌細胞において薬剤排出機能を有するＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現を誘導し、癌細胞が抗癌剤を細胞外に排出することにより抗癌剤耐性を獲得するが、本発明の抗癌剤増感剤の有効成分であるＳＮＯ−ＨＳＡは、癌細胞におけるＰ−ｇｐの発現を阻害し、癌細胞における抗癌剤の細胞外排出を阻害することにより、抗癌剤耐性を克服する。
【００４０】
本発明はまた、上記抗癌剤増感剤と抗癌剤とを含有する、医薬用組成物を提供する。本発明の医薬用組成物の剤形、製造方法などは、特に限定されず、本発明の抗癌剤増感剤に準じる。
【００４１】
本発明の医薬用組成物の投与において、抗癌剤増感剤は、有効成分のＳＮＯ−ＨＳＡがヒトに対して通常１〜１０ｍｇ／ｋｇ・回、好ましくは２〜１０ｍｇ／ｋｇ・回の量となるように投与される。抗癌剤増感剤は、ＳＮＯ−ＨＳＡがヒトに対して１０ｍｇ／ｋｇ・回の量となるように投与される場合、通常１〜２回／週、好ましくは２回／週投与される。
【００４２】
本発明の医薬用組成物の投与方法としては、特に限定されず、上記抗癌剤増感剤と抗癌剤とを同時に投与してもよく、抗癌剤増感剤と抗癌剤とを別々に投与してもよい。別々に投与する場合は、抗癌剤増感剤を先に投与し、抗癌剤を後に投与してもよいし、抗癌剤を先に投与し、抗癌剤増感剤を後に投与してもよい。上記抗癌剤増感剤の投与と抗癌剤の投与との間隔は、通常２〜６時間以内、好ましくは２〜３時間以内である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４４】
（参考例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）
ヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２）およびＫ５６２の抗癌剤ドキソルビシン（ｄｘ）耐性細胞株（Ｋ５６２／ｄｘ）（熊本大学医学薬学研究部細胞機能分子解析学分野にて作製した。Ｋ５６２を５００ｎＭのｄｘ（SIGMA社）存在下で６０日間培養し、生き残った細胞株をＫ５６２／ｄｘとした。）を培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／抗生物質−抗真菌剤混合溶液；ナカライテスク株式会社）に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にｄｘ（最終濃度：０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭおよび５０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴にＷＳＴ−８試薬（同仁化学株式会社）１０μＬを添加し、２〜３時間後に４５０ｎｍにて各穴の吸光度を測定した。コントロール（ｄｘ無添加）の吸光度に対する割合（％）を生存率として算出した。結果を図１に示す。
【００４５】
図１より明らかなように、１〜５０μＭのｄｘは、Ｋ５６２の増殖を阻害したが、５６２／ｄｘの増殖をほとんど阻害しなかった。このことから、Ｋ５６２／ｄｘはｄｘ耐性を有することが確認できた。
【００４６】
（調製例１：ＳＮＯ−ＨＳＡの調製）
特許文献１の実施例１に記載の方法により、アルブミン１分子あたりＳ−ニトロソ基が約７個導入されたＳ−ニトロソ基含有アルブミン（ＳＮＯ−ＨＳＡ）の濃度が１ｍＭの滅菌水溶液を調製した。
【００４７】
（実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘを培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／抗生物質−抗真菌剤混合溶液）に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴に上記調製例１で調製したＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）、０．５μＭ、５μＭおよび１０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２時間培養した。さらに、各穴にｄｘ（最終濃度：０μＭ（無添加）および５μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴にＷＳＴ−８試薬１０μＬを添加し、２〜３時間後に４５０ｎｍにて各穴の吸光度を測定した。コントロール（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加，ｄｘ無添加）の吸光度に対する割合（％）を生存率として算出した。結果を図２に示す。
【００４８】
図２より明らかなように、５μＭのｄｘはＫ５６２／ｄｘの増殖をほとんど阻害しなかったが、５μＭのｄｘと０．５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡとの併用はＳＮＯ−ＨＳＡの濃度依存的にＫ５６２／ｄｘの増殖を阻害した。
【００４９】
（比較例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘを培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／抗生物質−抗真菌剤混合溶液）に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭおよび５０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴にＷＳＴ−８試薬１０μＬを添加し、２〜３時間後に４５０ｎｍにて各穴の吸光度を測定した。コントロール（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加）の吸光度に対する割合（％）を生存率として算出した。結果を図３に示す。
【００５０】
図３より明らかなように、０〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡは、Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘの増殖をほとんど阻害しなかったが、１０〜５０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡは濃度依存的にＫ５６２／ｄｘの増殖を阻害した。
【００５１】
図２および図３より、０．５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡはＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性を克服し、ｄｘの抗癌効果を回復させることがわかった。
【００５２】
（実施例２：ｉｎ ｖｉｖｏ試験）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘそれぞれ２×１０７細胞を培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／抗生物質−抗真菌剤混合溶液）０．１ｍＬに懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Becton, Dickinson and Company社製）０．１ｍＬと混合後、ＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウス（４週齢、雌）の後肢皮下に移植して担癌マウスを作製した。
【００５３】
Ｋ５６２またはＫ５６２／ｄｘに由来する担癌マウスに対して、ｄｘ（４ｍｇ／ｋｇ；腹腔注射）、ＳＮＯ−ＨＳＡ（２ｍｇ／ｋｇ；静脈注射）、またはｄｘ（４ｍｇ／ｋｇ；腹腔注射）／ＳＮＯ−ＨＳＡ（２ｍｇ／ｋｇ；静脈注射）を投与し、経時的に癌の体積を測定した。結果を図４に示す。
【００５４】
図４より明らかなように、ｄｘのみの投与はＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスの癌の進行をほとんど阻害しなかったが、ｄｘとＳＮＯ−ＨＳＡとの併用投与はＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスの癌の進行を阻害した。このことから、ＳＮＯ−ＨＳＡはＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスのｄｘ耐性を克服し、ｄｘの抗癌効果を回復させることがわかった。
【００５５】
次に、抗癌剤を投与して４２日後のマウスから癌組織を取り出し、組織切片を調製し、アポトーシスが誘導された細胞を、ＴＵＮＥＬ染色キット（In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein, Boehringer Mannheim；Roche社）を用いて検出した。結果を図５に示す。
【００５６】
図５より明らかなように、ｄｘのみの投与はＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスでアポトーシスをほとんど誘導しなかったが、ｄｘとＳＮＯ−ＨＳＡとの併用投与はＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスでアポトーシスを誘導した。このことから、ＳＮＯ−ＨＳＡはＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性を克服し、ｄｘの抗癌効果を回復させることがわかった。
【００５７】
（実施例３：ＳＮＯ−ＨＳＡによるｄｘ耐性克服のメカニズム解析１）
Ｋ５６２／ｄｘを培地に懸濁し、１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）および１０μＭ）および１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾール［４，３−ａ］キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ）（SIGMA社）（最終濃度：０μＭ（無添加）、０．０１μＭ、１μＭおよび１００μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２時間培養した。さらに、各穴にｄｘ（最終濃度：０μＭ（無添加）および５μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴にＷＳＴ−８試薬１０μＬを添加し、２〜３時間後に４５０ｎｍにて各穴の吸光度を測定した。コントロール（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加，ＯＤＱ無添加，ｄｘ無添加）の吸光度に対する割合（％）を生存率として算出した。結果を図６に示す。
【００５８】
図６より明らかなように、ｃＧＭＰ経路の阻害剤であるＯＤＱがＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服を阻害したことから、ＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服にはｃＧＭＰ経路が関与していることが示唆された。
【００５９】
（実施例４：ＳＮＯ−ＨＳＡによるｄｘ耐性克服のメカニズム解析２）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘを培地に懸濁し、それぞれ５×１０５細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）、０．５μＭ、５μＭおよび１０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２時間培養した。さらに、各穴にｄｘ（最終濃度：５μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴から細胞を回収し、細胞内に蓄積したｄｘの蛍光をフローサイトメトリー（Becton Dickinson社製；励起波長：４８８ｎｍ；測定波長：５８５ｎｍ）で解析した。Ｋ５６２（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加，ｄｘ５μＭ）の蛍光強度に対する割合（％）を蛍光単位として算出した。結果を図７に示す。
【００６０】
図７より明らかなように、５μＭのｄｘと０．５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡとの併用はＳＮＯ−ＨＳＡの濃度依存的にＫ５６２／ｄｘ細胞内のｄｘの蓄積を誘導したことから、ＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服にはｄｘの細胞内蓄積が関与していることが示唆された。
【００６１】
（実施例５：ＳＮＯ−ＨＳＡによるｄｘ耐性克服のメカニズム解析３）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘを培地に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）、５μＭおよび１０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴から細胞を回収し、細胞内のＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現量をウェスタンブロッティングにより解析した。Ｐ−ｇｐの検出には、抗Ｐ−ｇｐマウス抗体（Santa Cruz Biotechnology社；sc-59591）を用いた。Ｋ５６２／ｄｘ（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加）のバンドの濃さに対する割合（％）を蛍光単位として算出した。結果を図８に示す。
【００６２】
図８より明らかなように、５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡはＳＮＯ−ＨＳＡの濃度依存的にＫ５６２／ｄｘでのＰ−ｇｐの発現を阻害したことから、ＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服にはＰ−ｇｐの発現阻害が関与していることが示唆された。
【００６３】
（実施例６：ＳＮＯ−ＨＳＡによるｄｘ耐性克服のメカニズム解析４）
Ｋ５６２を培地に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）、５μＭおよび１０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて、酸素濃度２０％（通常酸素濃度）または０．１％（低酸素濃度）の条件下で２４時間培養した。次いで、各穴から細胞を回収し、細胞内の低酸素誘導因子（Hypoxia Inducible Factor：ＨＩＦ−１α）の発現量をウェスタンブロッティングにより解析した。ＨＩＦ−１αの検出には、抗ＨＩＦ−１αマウス抗体（BD Transduction Laboratories社；610958）を用いた。Ｋ５６２（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加，低酸素濃度）のバンドの濃さに対する割合（％）を蛍光単位として算出した。結果を図９に示す。
【００６４】
図９より明らかなように、５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡはＳＮＯ−ＨＳＡの濃度依存的に低酸素下のＫ５６２でのＨＩＦ−１αの発現を阻害したことから、ＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服にはＨＩＦ−１αの発現阻害、すなわち低酸素条件の改善が関与していることが示唆された。
【００６５】
以上より、ＳＮＯ−ＨＳＡは、ｄｘ耐性のＫ５６２／ｄｘにおいて、ＨＩＦ−１αの発現阻害を介して、薬剤排出機能を有するＰ−ｇｐの発現を阻害することにより、ｄｘの細胞外排出を阻害し、ｄｘ耐性を克服することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、安全性および安定性に優れ、低濃度で癌細胞の抗癌剤感受性を増強する抗癌剤増感剤を提供することができる。本発明の抗癌剤増感剤と抗癌剤とを組み合わせることによって、高い抗癌作用を有する医薬品組成物を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤増感剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高濃度の一酸化窒素（ＮＯ）はアポトーシスを誘導することが知られている。この現象を利用し、化学修飾によりＮＯを多量にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に付加して得られたＳ−ニトロソ基含有ＨＳＡ（ＳＮＯ−ＨＳＡ）を癌細胞に投与することにより、癌を治療する試みが報告されている（特許文献１）。ＨＳＡは内因性の物質であるため、ＳＮＯ−ＨＳＡを体内に投与しても、副作用が少なく、ニトロソ基も安定して存在することから、ＳＮＯ−ＨＳＡは有効な抗癌剤として期待されている。しかし、癌を効果的に治療するには１０ｍｇ／ｍＬ程度以上のＳＮＯ−ＨＳＡが必要とされる。
【０００３】
ところで、抗癌剤による癌の薬物療法において、多剤併用療法のように、副作用の異なる複数の抗癌剤を併用して各薬物の副作用を軽減するとともに、各薬物の使用量を少量に抑える試みが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−５７３１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性および安定性に優れ、低濃度で癌細胞の抗癌剤感受性を増強する抗癌剤増感剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミンが高い抗癌剤増感作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明の抗癌剤増感剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンを有効成分として含有する。
【０００８】
１つの実施態様では、上記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンは、２〜１０μＭの濃度で含有される。
【０００９】
本発明はまた、上記抗癌剤増感剤と抗癌剤とを含有する、医薬用組成物を提供する。
【００１０】
１つの実施態様では、上記抗癌剤増感剤に含有される上記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンは、ヒトに対して２〜１０ｍｇ／ｋｇ・回の量で投与される。
【００１１】
１つの実施態様では、上記抗癌剤増感剤と上記抗癌剤とは、同時にまたは別々に投与される。
【００１２】
１つの実施態様では、上記抗癌剤はドキソルビシンである。
【００１３】
１つの実施態様では、上記抗癌剤は、悪性リンパ腫、肺癌、消化器癌、乳癌、膀胱腫瘍、骨肉腫、脳腫瘍、皮膚癌からなる群より選択される少なくとも１種に適用される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、安全性および安定性に優れ、低濃度で癌細胞の抗癌剤感受性を増強する抗癌剤増感剤を提供することができる。本発明の抗癌剤増感剤と抗癌剤とを組み合わせることによって、高い抗癌作用を有する医薬品組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘに対するｄｘの増殖阻害効果を示すグラフである。
【図２】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘに対するｄｘおよび／またはＳＮＯ−ＨＳＡの増殖阻害効果を示すグラフである。
【図３】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘに対するＳＮＯ−ＨＳＡの増殖阻害効果を示すグラフである。
【図４】ｄｘおよび／またはＳＮＯ−ＨＳＡを投与したＫ５６２（ａ）およびＫ５６２／ｄｘ（ｂ）由来担癌マウスの癌の進行を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図５】ｄｘおよび／またはＳＮＯ−ＨＳＡを投与したＫ５６２およびＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスの癌組織におけるＨＥ染色およびアポトーシスが誘導された細胞を示すＴＵＮＥＬ染色の写真である。
【図６】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘに対するｄｘおよび／またはＳＮＯ−ＨＳＡおよび／またはＯＤＱの増殖阻害効果を示すグラフである。
【図７】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘの細胞内のｄｘの蓄積に対するＳＮＯ−ＨＳＡの効果を示すグラフである。
【図８】Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘの細胞内のＰ−ｇｐの発現に対するＳＮＯ−ＨＳＡの効果を示すグラフである。
【図９】Ｋ５６２の細胞内のＨＩＦ−１αの発現に対するＳＮＯ−ＨＳＡの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗癌剤増感剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン（ＳＮＯ−ＨＳＡ）を有効成分として含有する。
【００１７】
本発明のＳＮＯ−ＨＳＡとは、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上のＳ−ニトロソ基が導入されているアルブミンをいう。
【００１８】
本発明におけるアルブミンは、天然のアルブミンであってもよいし、遺伝子組換え法によって生産されたアルブミンであってもよい。
【００１９】
天然のアルブミンとは、ヒトや哺乳動物などの体内に存在するアルブミンをいい、卵白アルブミンや筋アルブミン（ミオゲン）も含む。
【００２０】
遺伝子組換え法によって生産されたアルブミンは、天然のアルブミンと同等の機能を有する限り、天然のアルブミンのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるアルブミンも含む。例えば、天然のアルブミンのアミノ酸配列中の４１０番目のアルギニンをシステインに置換したアルブミンが挙げられる。
【００２１】
本発明のＳＮＯ−ＨＳＡは、天然のＳＮＯ−ＨＳＡであってもよいし、人為的にＳ−ニトロソ基をアルブミンに導入して得られたＳＮＯ−ＨＳＡであってもよい。
【００２２】
Ｓ−ニトロソ基は、アルブミンを構成するアミノ酸中に存在する硫黄原子、例えば、チオール基における硫黄原子がニトロソ基で置換されることにより、アルブミンに導入される。チオール基を含有するアミノ酸としては、例えば、システイン、シスチン、メチオニンが挙げられる。
【００２３】
通常、天然のアルブミンは３５個のシステインを含有し、そのうち３４個はアルブミンの二次構造の形成のためにジスルフィド結合を形成している。このため、例えば、天然のアルブミンにシステインのチオール基を介してＳ−ニトロソ基を導入する場合には、ジスルフィド結合に関与しない１個のシステインにＳ−ニトロソ基を導入することができる。
【００２４】
アルブミンのチオール基に人為的にＳ−ニトロソ基を導入する方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の方法が挙げられる。例えば、ニトロソ化試薬（亜硝酸イオン、イソアミルナイトライト、ｎ−ブチルナイトライトなど）を用いる方法が挙げられる。
【００２５】
アルブミンに人為的にチオール基を導入して、このチオール基にＳ−ニトロソ基を導入することもできる。アルブミンに人為的にチオール基を導入する方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の方法が挙げられる。例えば、チオール化試薬（２−イミノチオランまたはその塩など）を用いて、リジンのε−アミノ基にチオール基を導入する方法が挙げられる。
【００２６】
本発明の抗癌剤増感剤の投与経路としては、特に限定されないが、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜、経口、吸入が挙げられ、好ましくは非経口投与経路、より好ましくは注射による投与経路である。
【００２７】
本発明の抗癌剤増感剤の剤形としては、特に限定されないが、例えば、注射剤、パッチ剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、クリーム剤、ローション剤、粉剤が挙げられる。
【００２８】
特に、注射剤とする場合には、ＳＮＯ−ＨＳＡを含有する溶液または懸濁液とすればよく、さらに、例えば、ｐＨ調整剤、電解質、糖類、ビタミン類、薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸および／またはアミノ酸などの当該分野で通常用いられる添加剤を適宜添加してもよい。
【００２９】
溶液または懸濁液とする場合には、例えば、日本薬局方で規定される水（注射用水）、生理食塩水、各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）などを用いることができる。
【００３０】
ｐＨ調節剤としては、一般に注射剤のｐＨ調節剤として用いられるものであればよい。例えば、クエン酸、酒石酸、酢酸、乳酸などの有機酸、例えば、塩酸、リン酸などなどの無機酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどの無機塩基が挙げられる。
【００３１】
電解質としては、従来より輸液に用いられている各種水溶性塩を用いることができる。例えば、生体の機能や体液の電解質バランスを維持するうえで必要とされる各種無機成分（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン）の水溶性塩（例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩）が挙げられる。
【００３２】
糖類としては、従来より各種の輸液に用いられているものを用いることができる。例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類、ラクトース、マルトースなどの二糖類、グリセロールなどの多価アルコール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール、デキストラン４０またはデキストラン８０などのデキストラン類、蔗糖が挙げられる。
【００３３】
ビタミン類としては、水溶性／脂溶性の各種ビタミンを用いることができる。例えば、ビタミンＡ、プロビタミンＡ、ビタミンＤ、プロビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＢ６群、パントテン酸、ビオチン、ミオ−イノシトール、コリン、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＰまたはビタミンＵが挙げられる。
【００３４】
薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、ギ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、カプリル酸、コハク酸、リンゴ酸などの有機酸、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシククロヘキシルアミンなどの有機塩基が挙げられる。
【００３５】
アミノ酸としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられる。また、Ｎ−アセチルメチオニンなどのアミノ酸誘導体を添加してもよい。
【００３６】
本発明の抗癌剤増感剤は、通常の製剤学的方法に従って製造することができる。すなわち、水、各種緩衝液、一般に市販されている輸液（例えば、総合アミノ酸輸液、電解質輸液）またはそれらと同様の成分を含む水溶液などに、ｐＨが４．５〜８．７程度となるように、ＳＮＯ−ＨＳＡを希釈および／または溶解することによって製造することができる。
【００３７】
本発明の抗癌剤増感剤に含有されるＳＮＯ−ＨＳＡの濃度は、通常０．５〜１０μＭ、好ましくは２〜１０μＭである。
【００３８】
本発明の抗癌剤増感剤と併用する抗癌剤としては、特に限定されないが、例えば、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、シクロホスファミドが挙げられる。抗癌剤が適用される癌としては、特に限定されないが、例えば、悪性リンパ腫、肺癌、消化器癌、乳癌、膀胱腫瘍、骨肉腫、脳腫瘍、皮膚癌が挙げられる。
【００３９】
これらの抗癌剤の単独投与は、癌細胞において薬剤排出機能を有するＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現を誘導し、癌細胞が抗癌剤を細胞外に排出することにより抗癌剤耐性を獲得するが、本発明の抗癌剤増感剤の有効成分であるＳＮＯ−ＨＳＡは、癌細胞におけるＰ−ｇｐの発現を阻害し、癌細胞における抗癌剤の細胞外排出を阻害することにより、抗癌剤耐性を克服する。
【００４０】
本発明はまた、上記抗癌剤増感剤と抗癌剤とを含有する、医薬用組成物を提供する。本発明の医薬用組成物の剤形、製造方法などは、特に限定されず、本発明の抗癌剤増感剤に準じる。
【００４１】
本発明の医薬用組成物の投与において、抗癌剤増感剤は、有効成分のＳＮＯ−ＨＳＡがヒトに対して通常１〜１０ｍｇ／ｋｇ・回、好ましくは２〜１０ｍｇ／ｋｇ・回の量となるように投与される。抗癌剤増感剤は、ＳＮＯ−ＨＳＡがヒトに対して１０ｍｇ／ｋｇ・回の量となるように投与される場合、通常１〜２回／週、好ましくは２回／週投与される。
【００４２】
本発明の医薬用組成物の投与方法としては、特に限定されず、上記抗癌剤増感剤と抗癌剤とを同時に投与してもよく、抗癌剤増感剤と抗癌剤とを別々に投与してもよい。別々に投与する場合は、抗癌剤増感剤を先に投与し、抗癌剤を後に投与してもよいし、抗癌剤を先に投与し、抗癌剤増感剤を後に投与してもよい。上記抗癌剤増感剤の投与と抗癌剤の投与との間隔は、通常２〜６時間以内、好ましくは２〜３時間以内である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４４】
（参考例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）
ヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２）およびＫ５６２の抗癌剤ドキソルビシン（ｄｘ）耐性細胞株（Ｋ５６２／ｄｘ）（熊本大学医学薬学研究部細胞機能分子解析学分野にて作製した。Ｋ５６２を５００ｎＭのｄｘ（SIGMA社）存在下で６０日間培養し、生き残った細胞株をＫ５６２／ｄｘとした。）を培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／抗生物質−抗真菌剤混合溶液；ナカライテスク株式会社）に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にｄｘ（最終濃度：０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭおよび５０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴にＷＳＴ−８試薬（同仁化学株式会社）１０μＬを添加し、２〜３時間後に４５０ｎｍにて各穴の吸光度を測定した。コントロール（ｄｘ無添加）の吸光度に対する割合（％）を生存率として算出した。結果を図１に示す。
【００４５】
図１より明らかなように、１〜５０μＭのｄｘは、Ｋ５６２の増殖を阻害したが、５６２／ｄｘの増殖をほとんど阻害しなかった。このことから、Ｋ５６２／ｄｘはｄｘ耐性を有することが確認できた。
【００４６】
（調製例１：ＳＮＯ−ＨＳＡの調製）
特許文献１の実施例１に記載の方法により、アルブミン１分子あたりＳ−ニトロソ基が約７個導入されたＳ−ニトロソ基含有アルブミン（ＳＮＯ−ＨＳＡ）の濃度が１ｍＭの滅菌水溶液を調製した。
【００４７】
（実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘを培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／抗生物質−抗真菌剤混合溶液）に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴に上記調製例１で調製したＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）、０．５μＭ、５μＭおよび１０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２時間培養した。さらに、各穴にｄｘ（最終濃度：０μＭ（無添加）および５μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴にＷＳＴ−８試薬１０μＬを添加し、２〜３時間後に４５０ｎｍにて各穴の吸光度を測定した。コントロール（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加，ｄｘ無添加）の吸光度に対する割合（％）を生存率として算出した。結果を図２に示す。
【００４８】
図２より明らかなように、５μＭのｄｘはＫ５６２／ｄｘの増殖をほとんど阻害しなかったが、５μＭのｄｘと０．５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡとの併用はＳＮＯ−ＨＳＡの濃度依存的にＫ５６２／ｄｘの増殖を阻害した。
【００４９】
（比較例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘを培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／抗生物質−抗真菌剤混合溶液）に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭおよび５０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴にＷＳＴ−８試薬１０μＬを添加し、２〜３時間後に４５０ｎｍにて各穴の吸光度を測定した。コントロール（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加）の吸光度に対する割合（％）を生存率として算出した。結果を図３に示す。
【００５０】
図３より明らかなように、０〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡは、Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘの増殖をほとんど阻害しなかったが、１０〜５０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡは濃度依存的にＫ５６２／ｄｘの増殖を阻害した。
【００５１】
図２および図３より、０．５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡはＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性を克服し、ｄｘの抗癌効果を回復させることがわかった。
【００５２】
（実施例２：ｉｎ ｖｉｖｏ試験）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘそれぞれ２×１０７細胞を培地（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／抗生物質−抗真菌剤混合溶液）０．１ｍＬに懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Becton, Dickinson and Company社製）０．１ｍＬと混合後、ＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウス（４週齢、雌）の後肢皮下に移植して担癌マウスを作製した。
【００５３】
Ｋ５６２またはＫ５６２／ｄｘに由来する担癌マウスに対して、ｄｘ（４ｍｇ／ｋｇ；腹腔注射）、ＳＮＯ−ＨＳＡ（２ｍｇ／ｋｇ；静脈注射）、またはｄｘ（４ｍｇ／ｋｇ；腹腔注射）／ＳＮＯ−ＨＳＡ（２ｍｇ／ｋｇ；静脈注射）を投与し、経時的に癌の体積を測定した。結果を図４に示す。
【００５４】
図４より明らかなように、ｄｘのみの投与はＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスの癌の進行をほとんど阻害しなかったが、ｄｘとＳＮＯ−ＨＳＡとの併用投与はＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスの癌の進行を阻害した。このことから、ＳＮＯ−ＨＳＡはＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスのｄｘ耐性を克服し、ｄｘの抗癌効果を回復させることがわかった。
【００５５】
次に、抗癌剤を投与して４２日後のマウスから癌組織を取り出し、組織切片を調製し、アポトーシスが誘導された細胞を、ＴＵＮＥＬ染色キット（In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein, Boehringer Mannheim；Roche社）を用いて検出した。結果を図５に示す。
【００５６】
図５より明らかなように、ｄｘのみの投与はＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスでアポトーシスをほとんど誘導しなかったが、ｄｘとＳＮＯ−ＨＳＡとの併用投与はＫ５６２／ｄｘ由来担癌マウスでアポトーシスを誘導した。このことから、ＳＮＯ−ＨＳＡはＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性を克服し、ｄｘの抗癌効果を回復させることがわかった。
【００５７】
（実施例３：ＳＮＯ−ＨＳＡによるｄｘ耐性克服のメカニズム解析１）
Ｋ５６２／ｄｘを培地に懸濁し、１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）および１０μＭ）および１Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾール［４，３−ａ］キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ）（SIGMA社）（最終濃度：０μＭ（無添加）、０．０１μＭ、１μＭおよび１００μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２時間培養した。さらに、各穴にｄｘ（最終濃度：０μＭ（無添加）および５μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴にＷＳＴ−８試薬１０μＬを添加し、２〜３時間後に４５０ｎｍにて各穴の吸光度を測定した。コントロール（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加，ＯＤＱ無添加，ｄｘ無添加）の吸光度に対する割合（％）を生存率として算出した。結果を図６に示す。
【００５８】
図６より明らかなように、ｃＧＭＰ経路の阻害剤であるＯＤＱがＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服を阻害したことから、ＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服にはｃＧＭＰ経路が関与していることが示唆された。
【００５９】
（実施例４：ＳＮＯ−ＨＳＡによるｄｘ耐性克服のメカニズム解析２）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘを培地に懸濁し、それぞれ５×１０５細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）、０．５μＭ、５μＭおよび１０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２時間培養した。さらに、各穴にｄｘ（最終濃度：５μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴から細胞を回収し、細胞内に蓄積したｄｘの蛍光をフローサイトメトリー（Becton Dickinson社製；励起波長：４８８ｎｍ；測定波長：５８５ｎｍ）で解析した。Ｋ５６２（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加，ｄｘ５μＭ）の蛍光強度に対する割合（％）を蛍光単位として算出した。結果を図７に示す。
【００６０】
図７より明らかなように、５μＭのｄｘと０．５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡとの併用はＳＮＯ−ＨＳＡの濃度依存的にＫ５６２／ｄｘ細胞内のｄｘの蓄積を誘導したことから、ＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服にはｄｘの細胞内蓄積が関与していることが示唆された。
【００６１】
（実施例５：ＳＮＯ−ＨＳＡによるｄｘ耐性克服のメカニズム解析３）
Ｋ５６２およびＫ５６２／ｄｘを培地に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）、５μＭおよび１０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。次いで、各穴から細胞を回収し、細胞内のＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現量をウェスタンブロッティングにより解析した。Ｐ−ｇｐの検出には、抗Ｐ−ｇｐマウス抗体（Santa Cruz Biotechnology社；sc-59591）を用いた。Ｋ５６２／ｄｘ（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加）のバンドの濃さに対する割合（％）を蛍光単位として算出した。結果を図８に示す。
【００６２】
図８より明らかなように、５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡはＳＮＯ−ＨＳＡの濃度依存的にＫ５６２／ｄｘでのＰ−ｇｐの発現を阻害したことから、ＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服にはＰ−ｇｐの発現阻害が関与していることが示唆された。
【００６３】
（実施例６：ＳＮＯ−ＨＳＡによるｄｘ耐性克服のメカニズム解析４）
Ｋ５６２を培地に懸濁し、それぞれ１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種した。次いで、各穴にＳＮＯ−ＨＳＡ（最終濃度：０μＭ（無添加）、５μＭおよび１０μＭ）を添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて、酸素濃度２０％（通常酸素濃度）または０．１％（低酸素濃度）の条件下で２４時間培養した。次いで、各穴から細胞を回収し、細胞内の低酸素誘導因子（Hypoxia Inducible Factor：ＨＩＦ−１α）の発現量をウェスタンブロッティングにより解析した。ＨＩＦ−１αの検出には、抗ＨＩＦ−１αマウス抗体（BD Transduction Laboratories社；610958）を用いた。Ｋ５６２（ＳＮＯ−ＨＳＡ無添加，低酸素濃度）のバンドの濃さに対する割合（％）を蛍光単位として算出した。結果を図９に示す。
【００６４】
図９より明らかなように、５〜１０μＭのＳＮＯ−ＨＳＡはＳＮＯ−ＨＳＡの濃度依存的に低酸素下のＫ５６２でのＨＩＦ−１αの発現を阻害したことから、ＳＮＯ−ＨＳＡによるＫ５６２／ｄｘのｄｘ耐性克服にはＨＩＦ−１αの発現阻害、すなわち低酸素条件の改善が関与していることが示唆された。
【００６５】
以上より、ＳＮＯ−ＨＳＡは、ｄｘ耐性のＫ５６２／ｄｘにおいて、ＨＩＦ−１αの発現阻害を介して、薬剤排出機能を有するＰ−ｇｐの発現を阻害することにより、ｄｘの細胞外排出を阻害し、ｄｘ耐性を克服することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、安全性および安定性に優れ、低濃度で癌細胞の抗癌剤感受性を増強する抗癌剤増感剤を提供することができる。本発明の抗癌剤増感剤と抗癌剤とを組み合わせることによって、高い抗癌作用を有する医薬品組成物を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンを有効成分として含有する、抗癌剤増感剤。
【請求項２】
前記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンが、２〜１０μＭの濃度で含有される、請求項１に記載の抗癌剤増感剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗癌剤増感剤と抗癌剤とを含有する、医薬用組成物。
【請求項４】
前記抗癌剤増感剤に含有される前記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンが、ヒトに対して２〜１０ｍｇ／ｋｇ・回の量で投与される、請求項３に記載の医薬用組成物。
【請求項５】
前記抗癌剤増感剤と前記抗癌剤とが、同時にまたは別々に投与される、請求項３または４に記載の医薬用組成物。
【請求項６】
前記抗癌剤がドキソルビシンである、請求項３から５のいずれかの項に記載の医薬用組成物。
【請求項７】
前記抗癌剤が、悪性リンパ腫、肺癌、消化器癌、乳癌、膀胱腫瘍、骨肉腫、脳腫瘍、皮膚癌からなる群より選択される少なくとも１種に適用される、請求項３から６のいずれかの項に記載の医薬用組成物。
【請求項１】
Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンを有効成分として含有する、抗癌剤増感剤。
【請求項２】
前記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンが、２〜１０μＭの濃度で含有される、請求項１に記載の抗癌剤増感剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗癌剤増感剤と抗癌剤とを含有する、医薬用組成物。
【請求項４】
前記抗癌剤増感剤に含有される前記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミンが、ヒトに対して２〜１０ｍｇ／ｋｇ・回の量で投与される、請求項３に記載の医薬用組成物。
【請求項５】
前記抗癌剤増感剤と前記抗癌剤とが、同時にまたは別々に投与される、請求項３または４に記載の医薬用組成物。
【請求項６】
前記抗癌剤がドキソルビシンである、請求項３から５のいずれかの項に記載の医薬用組成物。
【請求項７】
前記抗癌剤が、悪性リンパ腫、肺癌、消化器癌、乳癌、膀胱腫瘍、骨肉腫、脳腫瘍、皮膚癌からなる群より選択される少なくとも１種に適用される、請求項３から６のいずれかの項に記載の医薬用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−２１９０５０（Ｐ２０１２−２１９０５０Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８５１０８（Ｐ２０１１−８５１０８）
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１０年１０月７日 日本薬物動態学会発行の「日本薬物動態学会第２５回年会 要旨集」および２０１０年１１月２５日 日本薬学会九州支部発行の「第２７回 日本薬学会九州支部大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２０１０年１０月７日 日本薬物動態学会発行の「日本薬物動態学会第２５回年会 要旨集」および２０１０年１１月２５日 日本薬学会九州支部発行の「第２７回 日本薬学会九州支部大会 講演要旨集」に発表
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
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