抗真菌性の外用剤組成物
【課題】皮膚や粘膜に対する刺激が少なく優れた抗真菌症作用・抗炎症作用ならびにアトピー性皮膚炎に対して優れた抗炎症作用を示す外用剤組成物を提供する。
【解決手段】緑茶ポリフェノールの一種であるエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の高純度（９８％以上）組成物を、そのまま用いる。または、これを、一般的な抗真菌性の抗生物質と混合して用いる。
【解決手段】緑茶ポリフェノールの一種であるエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の高純度（９８％以上）組成物を、そのまま用いる。または、これを、一般的な抗真菌性の抗生物質と混合して用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンジダ症などの真菌症やアトピー性皮膚炎などの皮膚炎に治療効果を有する外用剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌による感染症を真菌症と云われているが、一般的な真菌症としては白癬菌による水虫や、カンジダによるカンジダ症、あるいはクリプトコッカスによるクリプトコッカス症などが知られている。この真菌症は体のどの部分が犯されるかによって患部が皮膚真皮に及ばない表在性真菌症と、患部が真皮以降の皮下組織や脳・肺・心臓などの臓器まで及ぶ深在性真菌症とに分類される。また、深在性真菌症は皮下組織感染型と全身感染型とに分けられ、さらに全身感染型は原発感染と日和見感染に大別されている。これらの病原菌は、多糖類からなるキチン質の強固な細胞壁を持っているのみならず、人体と同じ真核生物であるため菌類の細胞だけに損傷を与えて人体組織に害の少ない薬物は極めて限られたものになる。そのため、細菌のみに大きな損傷を与えられる抗生物質が多い細菌に対する感染症に比較して、真菌に対する副作用の低い薬物が少ないのが現状である。
【０００３】
真菌は毒素を分泌しないため、菌の増殖による組織の侵食と炎症反応により病変が生じる。ＨＩＶ感染により細胞免疫力が低下すると真菌に対する抵抗力が低下し、真菌症であるカンジダ症やクリプトコッカス症の頻度が高くなることが知られている。
【０００４】
真菌症治療薬には、真菌特有の細胞膜を標的とするポリエン（Polyene）系抗生物質種としてはアゾール（Azole）系抗真菌剤が存在する。PolyeneのアンホテリシンＢやニスタチンは細胞膜のステロールに結合し、AzoleであるClotrimazole，Miconazole，Ketoconazole，Fluconazole，Itraconazoleはエルゴステロールの合成を抑えると言われている。その他、核酸合成を阻害する5-Fluorocytosine（５ＦＵ）やマイクロチュブルの会合を抑えるGriseofulvinが知られている。
【０００５】
一方、茶に含まれているポリフェノールには、抗酸化作用、抗ウィルス作用、抗菌・殺菌作用および細菌毒素阻害作用など多くの生理活性が知られている。茶の苦味や、渋味の主体はタンニンと呼ばれているが、その主成分はカテキン類である。緑茶に含まれているカテキンは８種類あるが、その主なものは（−）−エピカテキン（ＥＣ; 茶葉全カテキン中の比率＝１０％）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ; ２２％）、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣＧ; １１％）、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ; ５４％）であり、これらの中でＥＧＣＧが主成分である。また、これらカテキンの中でＥＧＣＧが最も抗酸化活性が高いと言われている。
【０００６】
ＥＧＣＧ等のカテキン化合物は細菌に対する抗菌効果があることが報告されており（特許文献１〜３）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＣＡ）等に対する抗菌効果も報告されている。また、Ｂｌａｎｃｏ（非特許文献２）らは、緑茶ポリフェノールの主成分であるエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が細菌の酵素活性を抑制し細菌進入を減少させることができることを報告している。さらには、抗真菌作用に関する報告もある（特許文献３、及び非特許文献１）。なお、数種の他の天然物による抗真菌活性に対しても報告されている（非特許文献５〜７）。
【０００７】
しかし、カテキン化合物単独では、抗真菌作用等が不充分であるとされており（特許文献１〜２）、松樹皮から抽出して得たオリゴメリック・プロアントシアニジンを配合することや（特許文献１）、抗真菌性を向上させたカテキン誘導体を用いること（特許文献２）が提案されている。また、既存の抗生物質に組み合わせて補完的に用いることについても提案されている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の耐性を調節すべく、ＥＧＣＧをペニシリンと組み合わせて用いること（非特許文献３）が報告されている。また、アムホテリシンB（ＡＭＰＨ）や、フルコナゾール（ＦＬＣＺ）との混合物を用いることが提案されている（非特許文献４）。
【特許文献１】特開２００４−２８４９７５
【特許文献２】特開平９−１１０６１５
【特許文献３】特開２００２−２５５８１０
【非特許文献１】M. Hirasawa et al., J. Antimicrob. Chemother., 53, 225, 2004
【非特許文献２】A. R. Blanco, S. La Terra Mule, G. Babini, S. Garbisa, V. Enea, D. Rusciano, (-)Epigallocatechin-3-gallate inhibits gelatinase activity of some bacterial isolates from ocular infection,and limits their invasion through gelatine, Biochim. Biophys. Acta 1620(2003) 273-281.
【非特許文献３】P. D. Staplenton, P. W. Tayloy, Methiclillin resistance in Staphylococcus aureus: mechanisms and modulation, Sci. Prog. 85(2002) 57-72.
【非特許文献４】M. Hirasawa, K. Takada, Multiple effects of green tea catechin on the antifungal activity of antimycotics against Candida albicans, J. Antimicrob. Chemother. 53(2004) 225-229.
【非特許文献５】F. Mondello, F. De Bemardis, A. Girolamo, G. Salvatore, A. Cassone, In vitro and in vivo activity of tea tree oil against azole-susceptible and ≡resistant human pathogenic yeasts, J. Antimicrob. Chemother. 51(2003) 1223-9.
【非特許文献６】M. Donia, M. T. Hamann, Marine natural products and their potential applications as anti-infective agents, Lancet Infect. Dis. 3(2003) 338-48.
【非特許文献７】P. Lavermicocca, F Valerio, A. Viscnti, Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products, Appl. Environ. Microb. 69(2003) 624-40.
【非特許文献８】J. V. Higdon, B. Frei, Tea catechins and polyphenols: health effects, metabolism, and antioxidant functions, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 43(2003) 89-143.
【非特許文献９】J. Jodoin, M. Demeule, R. Beliveau, Inhibition of the multidrug resistance P-glycoproten activity by green tea polyphenols, Biochim. Biophys. Acta1 542(2002) 149-159
【非特許文献１０】S. Okubo, M. Toda, Y. Hara, T. Shimamura, Antifungal and fungicidal activities of tea extract and catechin against Trichophyton, Nippon Saikingaku Zasshi 46(1991) 509-14.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
過去数年間真菌感染の事例が増加しており、いろいろな新しい抗真菌剤が患者治療に使用されているが、カンジダ種と同じ薬剤耐性菌種が依然として増加する趨勢にある。アムホテリシンB（Amphotericin B; AMPH）はポリエン（Polyene）系抗生物質種の一つであり、フルコナゾール（Fluconazole; FLCZ）はアゾール（Azole）系抗真菌剤であるが、これらは、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対して強力な抗真菌活性を示すことが知られている。しかし、これら抗真菌剤は副作用があり、カンジダ種の中には抗真菌耐性臨床分離菌種が報告されている。
【０００９】
従って、効果的であると同時に安全な非抗生製剤の開発が抗生剤敏感及び抗生剤耐性カンジダ菌種の全てを除去する上でも切実な問題である。
【００１０】
本件発明者ら、上記問題点に鑑み、カテキン類その他の安全な天然化合物を用いて、抗生物質による抗真菌性外用剤を代替すべく鋭意検討を行った。その結果、偶然、純度９８％以上のＥＧＣＧを用いた場合に、非常に優れた抗真菌性が得られることを見出した。このような抗真菌性は、低純度のＥＧＣＧ（例えば純度９０％以下）では全く得られないものであり、その機構は不明である。
【００１１】
以上のように、本発明は、既存の一般的な抗生物質系の抗真菌性外用剤と同程度の抗真菌効果が得られ、かつ、副作用や耐性菌誘発の問題を生じない抗真菌性外用剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の外用剤組成物は、ポリフェノール化合物として、実質上、純度９８％以上のＥＧＣＧのみを含む。すなわち、ポリフェノール成分のうち、９８％以上がＥＧＣＧとなっている。他の態様において、本発明の外用剤組成物は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の純度が９８％以上であるポリフェノール成分と、抗真菌性の抗生物質とを、９９／１．０〜１．０／９９の重量比で含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
既存の一般的な抗生物質系の抗真菌性外用剤と同程度の抗真菌効果が得られ、かつ、副作用や耐性菌誘発の問題を生じない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の外用剤組成物は、高純度ＥＧＣＧ（純度９８％以上）としてのポリフェノール成分のみ、または、これと抗真菌性の抗生物質との混合物のみを、実質上の有効成分とするものである。但し、有効成分の効果を高めたり、その他の作用を行うための各種成分を含有することができる。
【００１５】
まず、希釈剤又は溶剤として、水、エタノール、油分等を含むことができる。すなわち、本発明の外用剤組成物は、ポリフェノール成分またはこれに抗生物質を混合した液体のままで用いることができる他、適宜に、希釈したり、水溶液、アルコール溶液、クリーム、含油エマルション等として用いることができる。
【００１６】
本発明の皮膚外用剤は、アスコルビン酸またはその誘導体を含有してもよい。アスコルビン酸は、抗酸化力を有するだけでなく、コラーゲンの合成を促進する作用および免疫力を高める作用があることが知られているため、真菌感染、特に白癬菌によって引き起こされる炎症および疼痛を抑制する効果、ならびに感染症を治癒する効果などが高められ、整肌作用が期待できる。アスコルビン酸またはその誘導体としては、食品添加物として用いられるアスコルビン酸またはその誘導体、例えば、アスコルビン酸グリコシド、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸マグネシウムなどが用いられる。本発明の皮膚外用剤は、その剤形、用途などに応じて、油分、水などを配合する他、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、香料、抗酸化剤、キレート剤、色素などの成分を適宜配合することができる。
【００１７】
以下、試験例について詳細に説明する。
【００１８】
＜比較用抗真菌剤、及び評価用菌株＞
高純度ＥＧＣＧ（純度９８％以上）の抗真菌性を、既存の６種類の抗真菌剤、すなわち、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ（ＡＭＰＨ）、ｆｌｕｃｏｎａｇｏｌｅ（ＦＬＣＺ）、ｆｌｕｃｙｔｏｓｉｎ（５ＦＣ）、ｉｔｒａｃｏｎａｇｏｌｅ（ＩＴＣＺ）、ｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ（ＭＣＦＧ）、及びｍｉｃｏｎａｇｏｌｅ（ＭＣＺ）と比較した。抗真菌性の評価は、カンジダ種に属する６種の臨床分離菌株に対する感受性を、それぞれの最小発育停止濃度（ＭＩＣ）を測定することにより行った。
【００１９】
臨床分離菌株としては酵母様真菌ＤＰ“栄研”（栄研化学社製）を用いた。詳しくは、カンジダ・アルビカン（Candida albicans NBRC 0583及び1388），カンジダ・グラブラタ（Candida glabrada NBRC 0005及び0622），及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis NBRC 0708及び0840）の各２種類、すなわち、総６種類の菌種を試験に使用した。これは、微量液体希釈法による感受性試験キットであり、本邦において深在性真菌症治療薬として承認された薬剤の全てに対する感受性の測定が可能なものである。
【００２０】
＜試薬＞
高純度ＥＧＣＧとしては、Rocheビタミン社（Basel, Switzerland）のTEAVIGO（RO-267624000, 純度９８％以上）をそのまま用いた。また、比較としてシグマ（Sigma-Aldrich）社のＥＧＣＧ（純度９５％以上）を用いた。ウェルプレート上の倍地には、ろ過滅菌したRPMI―1640培地(Sigma, USA)を全ての感受性試験に用いた。この倍地は、Ｌ−グルタミンと低濃度（２ｍｇ／ｍｌ）ブドウ糖を含んでいるが、フェノールレッドと重炭酸ナトリウムを含まず、緩衝溶液として0.165M 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (pH7.0)を使用したものである。
【００２１】
＜抗真菌性の評価方法＞
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定は、日本医真菌学会標準化委員会報告（抗真菌感受性試験法、真菌誌３６：６２〜６４．１９９５）による抗真菌剤感受性測定法に準じて行った。具体的には、全ての抗真菌感受性試験を、National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）にて発刊された文献Ｍ−２７Ａに準拠して行った。
【００２２】
高純度ＥＧＣＧであるTEAVIGO（純度９８％以上）、及び、シグマ製の純度９５％以上のＥＧＣＧは０．０６〜１６μｇ／ｍＬ濃度でテストに用いた。すなわち、この範囲内の種々の濃度で高純度ＥＧＣＧを含んでいるウエルプレートとしての乾板（dry plates）を用意した。また、同様に、上記６種類の抗真菌剤を、それぞれ、次の範囲の種々の濃度で含んでいるウエルプレートを用意した。ＡＭＰＨ：０.０３〜１６μｇ／ｍＬ，ＦＬＣＺ：０．１２５〜６４μｇ／ｍＬ，５ＦＣ：０．１２５〜６４μｇ／ｍＬ，ＩＴＣＺ：０．０１５〜８μｇ／ｍＬ，ＭＣＦＧ：０．０３〜１６μｇ／ｍＬ及びＭＣＺ：０．０６〜３２μｇ／ｍＬ。
【００２３】
一方、上記の全ての菌種は３５℃で２４時間ＰＤＡ（potato dextrose agar）培地で培養し、使用前４８時間の間隔で２回継代培養した。そして、予備培養した菌株をＲＰＭＩ―１６４０培地に蒔き２×１０3コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ濃度の懸濁液を準備した。この後、最終的には、１×１０3ｃｆｕ／ｍＬの接種濃度になるように希釈して菌株懸濁液を得た。
【００２４】
ＥＧＣＧ及び６種類の抗真菌剤をそれぞれ含有しているウエルプレートに各々１００μＬづつ菌株懸濁液を接種した。この際、薬剤を含有していない発育対照群を各々の試験群に含めた。この後、ウェルプレートを３５℃で培養しながら２４時間と４８時間後に発育阻害程度を酵素免疫測定器（ELISA reader，波長４５０ｎｍ）で測定した。薬剤がない対照群に対して５０％と９０％の発育阻害を生じた最小薬物濃度を、ＥＧＣＧ及び６種類の抗真菌剤のＭＩＣ値（各々ＭＩＣ50及びＭＩＣ90）と定義した。
【００２５】
＜評価結果＞
カンジダ種に属する臨床分離菌株のＥＧＣＧ及び６種類の抗真菌剤即ち、ＡＭＰＨ，ＦＬＣＺ，５ＦＣ，ＩＴＣＺ，ＭＣＦＧ，及びＭＣＺに対する感受性の評価結果を表１に示す。
【００２６】
菌株と菌種の種類によって異なるが、ＥＧＣＧのＭＩＣ範囲は全ての試験菌種で０．５ｍｇ／ｍｌ以上であり、１６ｍｇ／ｍｌを超える（"＞１６"）と評価されたものもあった。試験菌種としてカンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）を用いた場合、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対する感受性（ＭＩＣ50 ０．５〜１μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 １〜２μｇ／ｍｌ）は、ＦＬＣＺに対する感受性（ＭＩＣ50 １〜８μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ４〜８μｇ／ｍｌ）よりも顕著に敏感なものであった。高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対する感受性は、特に低い濃度でも副作用が著しいことで知られているＡＭＰＨに対する感受性（ＭＩＣ90 ０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ）と同程度の水準といえる。これに対して、シグマ製ＥＧＣＧ（純度９５％以上）では、感受性が低かった。
【００２７】
一方、菌種としてカンジダ・パラプシロシスを用いた場合、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対する感受性（ＭＩＣ50 １〜４μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ２〜１６μｇ／ｍｌ）は、カンジダ・グラブラタを用いた場合より低いものの、相当に鋭敏である。これら菌株のＥＧＣＧに対する感受性は、他の抗真菌剤に対する感受性に比べて多少、低い。
【００２８】
全般的な概要を述べるならば、比較用の抗真菌剤に対する感受性は、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対する感受性と同程度、または若干低いものであった。すなわち、ＡＭＰＨについてはＭＩＣ50 ０．１２５〜０．５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．２５〜２μｇ／ｍｌであり、５ＦＣについてはＭＩＣ50＜０．１２５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．１２５μｇ／ｍｌであり、ＭＣＦＧについてはＭＩＣ50及びＭＩＣ90 ０．０３μｇ／ｍｌであり、ＩＴＣＺについてはＭＩＣ50 ０．０６〜０．５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．５〜１μｇ／ｍｌであり、ＭＣＺについてはＭＩＣ50＜０．０６〜０．２５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．１２５〜２μｇ／ｍｌであった。
【００２９】
なお、本試験に使用した６種類の比較用の抗真菌剤のなかでＭＣＦＧ（ＭＩＣ50＜０．０３〜０．５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．５μｇ／ｍｌ）は、用いた菌株に関係なく、最も敏感な感受性を示した。
【００３０】
＜考察＞
ＥＧＣＧは緑茶抽出物に存在するカテキン類の代表的成分として抗菌作用及び特定抗生剤の効果を増強する機能を持つことが知られている。いくつかの病原性細菌に対するＥＧＣＧの抗菌作用は既に多数報告されている。（非特許文献２〜３、８〜９）
真菌に対しては大久保らは（非特許文献１０）２．５％紅茶抽出物がTrichophyton mentagrophytesとT. rubrumの発育を抑制するが、カンジダ・アルビカンあるいはCryptococus neoformansの発育は１０％濃度でも抑制できないと報告している。しかし、平沢らはＥＧＣＧを含んだカテキンに対するカンジダアルビカンの感受性を報告している（非特許文献４）。
【００３１】
以上のように、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）が３種類のカンジダ種で分類された６種の臨床分離菌株に対して抗真菌活性を現わすことを確認した（表１）。試験菌株のなかで、カンジダ・クラブラダ菌株はＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対して最も敏感な感受性を示した。これら菌株のＥＧＣＧに対する感受性は、たとえ他の抗真菌剤よりも若干低い感受性ではあるが、ＦＬＣＺよりも敏感であり、特に低い濃度でさえも副作用が著しいＡＭＰＨとは同程度である。このような結果は、カンジダ・グラブラタによって誘発されるカンジダ肺炎（Candida pneumonia）等のカンジダ症に対して高純度ＥＧＣＧが有効であることを示す。ＥＧＣＧの場合、抗生物質による抗真菌剤とは異なり、耐性菌や副作用を誘発することがない。
【００３２】
なお、具体的なデータは示さないが、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）を用いた場合、これら6種の既存の抗真菌剤と併用した場合にも相乗作用に基づく優れた効果が得られた。
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンジダ症などの真菌症やアトピー性皮膚炎などの皮膚炎に治療効果を有する外用剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌による感染症を真菌症と云われているが、一般的な真菌症としては白癬菌による水虫や、カンジダによるカンジダ症、あるいはクリプトコッカスによるクリプトコッカス症などが知られている。この真菌症は体のどの部分が犯されるかによって患部が皮膚真皮に及ばない表在性真菌症と、患部が真皮以降の皮下組織や脳・肺・心臓などの臓器まで及ぶ深在性真菌症とに分類される。また、深在性真菌症は皮下組織感染型と全身感染型とに分けられ、さらに全身感染型は原発感染と日和見感染に大別されている。これらの病原菌は、多糖類からなるキチン質の強固な細胞壁を持っているのみならず、人体と同じ真核生物であるため菌類の細胞だけに損傷を与えて人体組織に害の少ない薬物は極めて限られたものになる。そのため、細菌のみに大きな損傷を与えられる抗生物質が多い細菌に対する感染症に比較して、真菌に対する副作用の低い薬物が少ないのが現状である。
【０００３】
真菌は毒素を分泌しないため、菌の増殖による組織の侵食と炎症反応により病変が生じる。ＨＩＶ感染により細胞免疫力が低下すると真菌に対する抵抗力が低下し、真菌症であるカンジダ症やクリプトコッカス症の頻度が高くなることが知られている。
【０００４】
真菌症治療薬には、真菌特有の細胞膜を標的とするポリエン（Polyene）系抗生物質種としてはアゾール（Azole）系抗真菌剤が存在する。PolyeneのアンホテリシンＢやニスタチンは細胞膜のステロールに結合し、AzoleであるClotrimazole，Miconazole，Ketoconazole，Fluconazole，Itraconazoleはエルゴステロールの合成を抑えると言われている。その他、核酸合成を阻害する5-Fluorocytosine（５ＦＵ）やマイクロチュブルの会合を抑えるGriseofulvinが知られている。
【０００５】
一方、茶に含まれているポリフェノールには、抗酸化作用、抗ウィルス作用、抗菌・殺菌作用および細菌毒素阻害作用など多くの生理活性が知られている。茶の苦味や、渋味の主体はタンニンと呼ばれているが、その主成分はカテキン類である。緑茶に含まれているカテキンは８種類あるが、その主なものは（−）−エピカテキン（ＥＣ; 茶葉全カテキン中の比率＝１０％）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ; ２２％）、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣＧ; １１％）、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ; ５４％）であり、これらの中でＥＧＣＧが主成分である。また、これらカテキンの中でＥＧＣＧが最も抗酸化活性が高いと言われている。
【０００６】
ＥＧＣＧ等のカテキン化合物は細菌に対する抗菌効果があることが報告されており（特許文献１〜３）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＣＡ）等に対する抗菌効果も報告されている。また、Ｂｌａｎｃｏ（非特許文献２）らは、緑茶ポリフェノールの主成分であるエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が細菌の酵素活性を抑制し細菌進入を減少させることができることを報告している。さらには、抗真菌作用に関する報告もある（特許文献３、及び非特許文献１）。なお、数種の他の天然物による抗真菌活性に対しても報告されている（非特許文献５〜７）。
【０００７】
しかし、カテキン化合物単独では、抗真菌作用等が不充分であるとされており（特許文献１〜２）、松樹皮から抽出して得たオリゴメリック・プロアントシアニジンを配合することや（特許文献１）、抗真菌性を向上させたカテキン誘導体を用いること（特許文献２）が提案されている。また、既存の抗生物質に組み合わせて補完的に用いることについても提案されている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の耐性を調節すべく、ＥＧＣＧをペニシリンと組み合わせて用いること（非特許文献３）が報告されている。また、アムホテリシンB（ＡＭＰＨ）や、フルコナゾール（ＦＬＣＺ）との混合物を用いることが提案されている（非特許文献４）。
【特許文献１】特開２００４−２８４９７５
【特許文献２】特開平９−１１０６１５
【特許文献３】特開２００２−２５５８１０
【非特許文献１】M. Hirasawa et al., J. Antimicrob. Chemother., 53, 225, 2004
【非特許文献２】A. R. Blanco, S. La Terra Mule, G. Babini, S. Garbisa, V. Enea, D. Rusciano, (-)Epigallocatechin-3-gallate inhibits gelatinase activity of some bacterial isolates from ocular infection,and limits their invasion through gelatine, Biochim. Biophys. Acta 1620(2003) 273-281.
【非特許文献３】P. D. Staplenton, P. W. Tayloy, Methiclillin resistance in Staphylococcus aureus: mechanisms and modulation, Sci. Prog. 85(2002) 57-72.
【非特許文献４】M. Hirasawa, K. Takada, Multiple effects of green tea catechin on the antifungal activity of antimycotics against Candida albicans, J. Antimicrob. Chemother. 53(2004) 225-229.
【非特許文献５】F. Mondello, F. De Bemardis, A. Girolamo, G. Salvatore, A. Cassone, In vitro and in vivo activity of tea tree oil against azole-susceptible and ≡resistant human pathogenic yeasts, J. Antimicrob. Chemother. 51(2003) 1223-9.
【非特許文献６】M. Donia, M. T. Hamann, Marine natural products and their potential applications as anti-infective agents, Lancet Infect. Dis. 3(2003) 338-48.
【非特許文献７】P. Lavermicocca, F Valerio, A. Viscnti, Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products, Appl. Environ. Microb. 69(2003) 624-40.
【非特許文献８】J. V. Higdon, B. Frei, Tea catechins and polyphenols: health effects, metabolism, and antioxidant functions, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 43(2003) 89-143.
【非特許文献９】J. Jodoin, M. Demeule, R. Beliveau, Inhibition of the multidrug resistance P-glycoproten activity by green tea polyphenols, Biochim. Biophys. Acta1 542(2002) 149-159
【非特許文献１０】S. Okubo, M. Toda, Y. Hara, T. Shimamura, Antifungal and fungicidal activities of tea extract and catechin against Trichophyton, Nippon Saikingaku Zasshi 46(1991) 509-14.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
過去数年間真菌感染の事例が増加しており、いろいろな新しい抗真菌剤が患者治療に使用されているが、カンジダ種と同じ薬剤耐性菌種が依然として増加する趨勢にある。アムホテリシンB（Amphotericin B; AMPH）はポリエン（Polyene）系抗生物質種の一つであり、フルコナゾール（Fluconazole; FLCZ）はアゾール（Azole）系抗真菌剤であるが、これらは、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対して強力な抗真菌活性を示すことが知られている。しかし、これら抗真菌剤は副作用があり、カンジダ種の中には抗真菌耐性臨床分離菌種が報告されている。
【０００９】
従って、効果的であると同時に安全な非抗生製剤の開発が抗生剤敏感及び抗生剤耐性カンジダ菌種の全てを除去する上でも切実な問題である。
【００１０】
本件発明者ら、上記問題点に鑑み、カテキン類その他の安全な天然化合物を用いて、抗生物質による抗真菌性外用剤を代替すべく鋭意検討を行った。その結果、偶然、純度９８％以上のＥＧＣＧを用いた場合に、非常に優れた抗真菌性が得られることを見出した。このような抗真菌性は、低純度のＥＧＣＧ（例えば純度９０％以下）では全く得られないものであり、その機構は不明である。
【００１１】
以上のように、本発明は、既存の一般的な抗生物質系の抗真菌性外用剤と同程度の抗真菌効果が得られ、かつ、副作用や耐性菌誘発の問題を生じない抗真菌性外用剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の外用剤組成物は、ポリフェノール化合物として、実質上、純度９８％以上のＥＧＣＧのみを含む。すなわち、ポリフェノール成分のうち、９８％以上がＥＧＣＧとなっている。他の態様において、本発明の外用剤組成物は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の純度が９８％以上であるポリフェノール成分と、抗真菌性の抗生物質とを、９９／１．０〜１．０／９９の重量比で含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
既存の一般的な抗生物質系の抗真菌性外用剤と同程度の抗真菌効果が得られ、かつ、副作用や耐性菌誘発の問題を生じない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の外用剤組成物は、高純度ＥＧＣＧ（純度９８％以上）としてのポリフェノール成分のみ、または、これと抗真菌性の抗生物質との混合物のみを、実質上の有効成分とするものである。但し、有効成分の効果を高めたり、その他の作用を行うための各種成分を含有することができる。
【００１５】
まず、希釈剤又は溶剤として、水、エタノール、油分等を含むことができる。すなわち、本発明の外用剤組成物は、ポリフェノール成分またはこれに抗生物質を混合した液体のままで用いることができる他、適宜に、希釈したり、水溶液、アルコール溶液、クリーム、含油エマルション等として用いることができる。
【００１６】
本発明の皮膚外用剤は、アスコルビン酸またはその誘導体を含有してもよい。アスコルビン酸は、抗酸化力を有するだけでなく、コラーゲンの合成を促進する作用および免疫力を高める作用があることが知られているため、真菌感染、特に白癬菌によって引き起こされる炎症および疼痛を抑制する効果、ならびに感染症を治癒する効果などが高められ、整肌作用が期待できる。アスコルビン酸またはその誘導体としては、食品添加物として用いられるアスコルビン酸またはその誘導体、例えば、アスコルビン酸グリコシド、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸マグネシウムなどが用いられる。本発明の皮膚外用剤は、その剤形、用途などに応じて、油分、水などを配合する他、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、香料、抗酸化剤、キレート剤、色素などの成分を適宜配合することができる。
【００１７】
以下、試験例について詳細に説明する。
【００１８】
＜比較用抗真菌剤、及び評価用菌株＞
高純度ＥＧＣＧ（純度９８％以上）の抗真菌性を、既存の６種類の抗真菌剤、すなわち、ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ（ＡＭＰＨ）、ｆｌｕｃｏｎａｇｏｌｅ（ＦＬＣＺ）、ｆｌｕｃｙｔｏｓｉｎ（５ＦＣ）、ｉｔｒａｃｏｎａｇｏｌｅ（ＩＴＣＺ）、ｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ（ＭＣＦＧ）、及びｍｉｃｏｎａｇｏｌｅ（ＭＣＺ）と比較した。抗真菌性の評価は、カンジダ種に属する６種の臨床分離菌株に対する感受性を、それぞれの最小発育停止濃度（ＭＩＣ）を測定することにより行った。
【００１９】
臨床分離菌株としては酵母様真菌ＤＰ“栄研”（栄研化学社製）を用いた。詳しくは、カンジダ・アルビカン（Candida albicans NBRC 0583及び1388），カンジダ・グラブラタ（Candida glabrada NBRC 0005及び0622），及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis NBRC 0708及び0840）の各２種類、すなわち、総６種類の菌種を試験に使用した。これは、微量液体希釈法による感受性試験キットであり、本邦において深在性真菌症治療薬として承認された薬剤の全てに対する感受性の測定が可能なものである。
【００２０】
＜試薬＞
高純度ＥＧＣＧとしては、Rocheビタミン社（Basel, Switzerland）のTEAVIGO（RO-267624000, 純度９８％以上）をそのまま用いた。また、比較としてシグマ（Sigma-Aldrich）社のＥＧＣＧ（純度９５％以上）を用いた。ウェルプレート上の倍地には、ろ過滅菌したRPMI―1640培地(Sigma, USA)を全ての感受性試験に用いた。この倍地は、Ｌ−グルタミンと低濃度（２ｍｇ／ｍｌ）ブドウ糖を含んでいるが、フェノールレッドと重炭酸ナトリウムを含まず、緩衝溶液として0.165M 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (pH7.0)を使用したものである。
【００２１】
＜抗真菌性の評価方法＞
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定は、日本医真菌学会標準化委員会報告（抗真菌感受性試験法、真菌誌３６：６２〜６４．１９９５）による抗真菌剤感受性測定法に準じて行った。具体的には、全ての抗真菌感受性試験を、National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）にて発刊された文献Ｍ−２７Ａに準拠して行った。
【００２２】
高純度ＥＧＣＧであるTEAVIGO（純度９８％以上）、及び、シグマ製の純度９５％以上のＥＧＣＧは０．０６〜１６μｇ／ｍＬ濃度でテストに用いた。すなわち、この範囲内の種々の濃度で高純度ＥＧＣＧを含んでいるウエルプレートとしての乾板（dry plates）を用意した。また、同様に、上記６種類の抗真菌剤を、それぞれ、次の範囲の種々の濃度で含んでいるウエルプレートを用意した。ＡＭＰＨ：０.０３〜１６μｇ／ｍＬ，ＦＬＣＺ：０．１２５〜６４μｇ／ｍＬ，５ＦＣ：０．１２５〜６４μｇ／ｍＬ，ＩＴＣＺ：０．０１５〜８μｇ／ｍＬ，ＭＣＦＧ：０．０３〜１６μｇ／ｍＬ及びＭＣＺ：０．０６〜３２μｇ／ｍＬ。
【００２３】
一方、上記の全ての菌種は３５℃で２４時間ＰＤＡ（potato dextrose agar）培地で培養し、使用前４８時間の間隔で２回継代培養した。そして、予備培養した菌株をＲＰＭＩ―１６４０培地に蒔き２×１０3コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ濃度の懸濁液を準備した。この後、最終的には、１×１０3ｃｆｕ／ｍＬの接種濃度になるように希釈して菌株懸濁液を得た。
【００２４】
ＥＧＣＧ及び６種類の抗真菌剤をそれぞれ含有しているウエルプレートに各々１００μＬづつ菌株懸濁液を接種した。この際、薬剤を含有していない発育対照群を各々の試験群に含めた。この後、ウェルプレートを３５℃で培養しながら２４時間と４８時間後に発育阻害程度を酵素免疫測定器（ELISA reader，波長４５０ｎｍ）で測定した。薬剤がない対照群に対して５０％と９０％の発育阻害を生じた最小薬物濃度を、ＥＧＣＧ及び６種類の抗真菌剤のＭＩＣ値（各々ＭＩＣ50及びＭＩＣ90）と定義した。
【００２５】
＜評価結果＞
カンジダ種に属する臨床分離菌株のＥＧＣＧ及び６種類の抗真菌剤即ち、ＡＭＰＨ，ＦＬＣＺ，５ＦＣ，ＩＴＣＺ，ＭＣＦＧ，及びＭＣＺに対する感受性の評価結果を表１に示す。
【００２６】
菌株と菌種の種類によって異なるが、ＥＧＣＧのＭＩＣ範囲は全ての試験菌種で０．５ｍｇ／ｍｌ以上であり、１６ｍｇ／ｍｌを超える（"＞１６"）と評価されたものもあった。試験菌種としてカンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）を用いた場合、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対する感受性（ＭＩＣ50 ０．５〜１μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 １〜２μｇ／ｍｌ）は、ＦＬＣＺに対する感受性（ＭＩＣ50 １〜８μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ４〜８μｇ／ｍｌ）よりも顕著に敏感なものであった。高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対する感受性は、特に低い濃度でも副作用が著しいことで知られているＡＭＰＨに対する感受性（ＭＩＣ90 ０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ）と同程度の水準といえる。これに対して、シグマ製ＥＧＣＧ（純度９５％以上）では、感受性が低かった。
【００２７】
一方、菌種としてカンジダ・パラプシロシスを用いた場合、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対する感受性（ＭＩＣ50 １〜４μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ２〜１６μｇ／ｍｌ）は、カンジダ・グラブラタを用いた場合より低いものの、相当に鋭敏である。これら菌株のＥＧＣＧに対する感受性は、他の抗真菌剤に対する感受性に比べて多少、低い。
【００２８】
全般的な概要を述べるならば、比較用の抗真菌剤に対する感受性は、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対する感受性と同程度、または若干低いものであった。すなわち、ＡＭＰＨについてはＭＩＣ50 ０．１２５〜０．５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．２５〜２μｇ／ｍｌであり、５ＦＣについてはＭＩＣ50＜０．１２５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．１２５μｇ／ｍｌであり、ＭＣＦＧについてはＭＩＣ50及びＭＩＣ90 ０．０３μｇ／ｍｌであり、ＩＴＣＺについてはＭＩＣ50 ０．０６〜０．５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．５〜１μｇ／ｍｌであり、ＭＣＺについてはＭＩＣ50＜０．０６〜０．２５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．１２５〜２μｇ／ｍｌであった。
【００２９】
なお、本試験に使用した６種類の比較用の抗真菌剤のなかでＭＣＦＧ（ＭＩＣ50＜０．０３〜０．５μｇ／ｍｌ及びＭＩＣ90 ０．５μｇ／ｍｌ）は、用いた菌株に関係なく、最も敏感な感受性を示した。
【００３０】
＜考察＞
ＥＧＣＧは緑茶抽出物に存在するカテキン類の代表的成分として抗菌作用及び特定抗生剤の効果を増強する機能を持つことが知られている。いくつかの病原性細菌に対するＥＧＣＧの抗菌作用は既に多数報告されている。（非特許文献２〜３、８〜９）
真菌に対しては大久保らは（非特許文献１０）２．５％紅茶抽出物がTrichophyton mentagrophytesとT. rubrumの発育を抑制するが、カンジダ・アルビカンあるいはCryptococus neoformansの発育は１０％濃度でも抑制できないと報告している。しかし、平沢らはＥＧＣＧを含んだカテキンに対するカンジダアルビカンの感受性を報告している（非特許文献４）。
【００３１】
以上のように、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）が３種類のカンジダ種で分類された６種の臨床分離菌株に対して抗真菌活性を現わすことを確認した（表１）。試験菌株のなかで、カンジダ・クラブラダ菌株はＥＧＣＧ（TEAVIGO）に対して最も敏感な感受性を示した。これら菌株のＥＧＣＧに対する感受性は、たとえ他の抗真菌剤よりも若干低い感受性ではあるが、ＦＬＣＺよりも敏感であり、特に低い濃度でさえも副作用が著しいＡＭＰＨとは同程度である。このような結果は、カンジダ・グラブラタによって誘発されるカンジダ肺炎（Candida pneumonia）等のカンジダ症に対して高純度ＥＧＣＧが有効であることを示す。ＥＧＣＧの場合、抗生物質による抗真菌剤とは異なり、耐性菌や副作用を誘発することがない。
【００３２】
なお、具体的なデータは示さないが、高純度ＥＧＣＧ（TEAVIGO）を用いた場合、これら6種の既存の抗真菌剤と併用した場合にも相乗作用に基づく優れた効果が得られた。
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の純度が９８％以上であるポリフェノール成分からなることを特徴とする抗真菌性の外用剤組成物。
【請求項２】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の純度が９８％以上であるポリフェノール成分と、抗真菌性の抗生物質とを、９９／１．０〜１．０／９９の重量比で含むことを特徴とする抗真菌性の外用剤組成物。
【請求項１】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の純度が９８％以上であるポリフェノール成分からなることを特徴とする抗真菌性の外用剤組成物。
【請求項２】
（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の純度が９８％以上であるポリフェノール成分と、抗真菌性の抗生物質とを、９９／１．０〜１．０／９９の重量比で含むことを特徴とする抗真菌性の外用剤組成物。
【公開番号】特開２００８−７４６４（Ｐ２００８−７４６４Ａ）
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１８００３０（Ｐ２００６−１８００３０）
【出願日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５０６２２４２５２）株式会社バイオベルデ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５０６２２４２５２）株式会社バイオベルデ (12)
【Ｆターム（参考）】
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